ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΝΑΝΟΔΟΜΗΜΕΝΩΝ ΣΥΣΤΗΜΑΤΩΝ ΜΕΤΑΦΟΡΑΣ ΒΙΟΜΟΡΙΩΝ ΔΙΑ ΜΕΣΟΥ

ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΝΑΝΟΔΟΜΗΜΕΝΩΝ ΣΥΣΤΗΜΑΤΩΝ ΜΕΤΑΦΟΡΑΣ ΒΙΟΜΟΡΙΩΝ ΔΙΑ ΜΕΣΟΥ ΒΛΕΝΝΩΔΩΝ ΜΕΜΒΡΑΝΩΝ Ο. Καμμώνα 2, Κ. Καρύδη 2, Θ. Καραμανίδου 1, Ε. Σαμαρίδου 1, Β. Μπουργάνης 1, Κ. Κυπαρισσίδης 1,2 1 Τμήμα Χημικών Μηχανικών, Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης 2 Ινστιτούτο Χημικών Διεργασιών & Ενεργειακών Πόρων, ΕΚΕΤΑ ΠΕΡΙΛΗΨΗ Στην παρούσα εργασία περιγράφεται η σύνθεση νανοφορέων με «ολισθηρή» επιφάνεια (π.χ., νανοσωματιδίων πολύ(γαλακτικού-γλυκολικού) οξέος - πολυαιθυλενογλυκόλης (PLGA-PEG), συμπλόκων πολυακρυλικού οξέος - πολυλυσίνης (PAA/PLL) και πολυακρυλικού οξέος - πολυαργινίνης (PAA/PArg)) καθώς και διαφόρων τύπων λιποσωμάτων που φέρουν το βλεννολυτικό παράγοντα 4-μερκαπτοβενζοϊκό οξύ (4MBA)). Νανοσωματίδια PLGA-PEG με επιφανειακή διάταξη PEG τύπου «βούρτσας» ή «πυκνής βούρτσας» παρασκευάστηκαν επιτυχώς μεταβάλλοντας το μοριακό βάρος (MW) της PEG (π.χ., 2, 5 kda). Τα νανοσωματίδια PLGA-PEG παρουσίασαν αυξημένη διάχυση σε βλέννα που έχει εξαχθεί από εντερικό βλεννογόνο χοίρου σε σύγκριση με νανοσωματίδια PLGA. Από τα νανοσωματίδια PLGA-PEG, εκείνα που είχαν διάταξη PEG τύπου «πυκνής βούρτσας» (PEG MW = 5 kda) εμφάνισαν το υψηλότερο ποσοστό διαπερατότητας. Παράλληλα, το μέσο μέγεθος και το επιφανειακό φορτίο των συμπλόκων πολυηλεκτρολυτών (PECs) κατέστη δυνατό να ρυθμιστεί αποτελεσματικά, μεταβάλλοντας το λόγο φορτίου PAA/πολυκατιόντος, οδηγώντας έτσι στη σύνθεση ουδέτερων καθώς και θετικά ή αρνητικά φορτισμένων PECs. Tα αρνητικά φορτισμένα PECs παρουσίασαν την υψηλότερη διάχυση στη βλέννα, ακολουθούμενα από τα ουδέτερα και τα θετικά φορτισμένα. Τέλος, επετεύχθη ο εγκλεισμός του 4MBA σε ποσοστά μέχρι 18.43 wt% στα λιποσώματα, μεταβάλλοντας την αρχική συγκέντρωση του βλεννολυτικού παράγοντα. Ο εγκλεισμός του 4MBA στα λιποσώματα επέτρεψε την ελεγχόμενη αποδέσμευσή του (π.χ., αποδέσμευση του 3 wt% του 4MBA σε 45 min). Τα λιποσώματα που έφεραν 4MBA εμφάνισαν υψηλή ικανότητα διάχυσης στη βλέννα, η οποία βρέθηκε να εξαρτάται από τη σύσταση της φωσφολιπιδικής διπλοστοιβάδας. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η χορήγηση βιομορίων μέσω βλεννωδών μεμβρανών αποτελεί μια από τις μεγαλύτερες ερευνητικές προκλήσεις στον τομέα της μεταφοράς φαρμάκων καθώς τα βιομόρια είναι διαβόητα για τη χημική και βιολογική τους αστάθεια. Μέχρι σήμερα έχουν αναπτυχθεί διάφορα συστήματα μεταφοράς βιομορίων μέσω βλεννωδών μεμβρανών, από τα οποία όμως κανένα δεν εμφανίζει την ικανότητα να διαπερνά τη βλέννα σε ικανοποιητικό βαθμό. Ωστόσο, η χρήση νανοφορέων για τη χορήγηση βιομορίων μέσω του βλεννογόνου (π.χ., εντερικού, οφθαλμικού, ρινικού, κολπικού, πνευμονικού, κλπ) έχει νόημα μόνο εάν οι φορείς αυτοί μπορούν να διαπερνούν επιτυχώς τη βλέννα που αποτελεί και το πρώτο εμπόδιο που συναντούν. Μικρά μόρια μπορούν εύκολα να μετακινηθούν στο τρισδιάστατο δίκτυο των γλυκοπρωτεϊνών της βλέννας που καλύπτει τα επιθηλιακά κύτταρα, ενώ αντίθετα το δίκτυο αυτό είναι σχεδόν αδιαπέραστο για μακρομόρια και νανοσωματίδια. Οι συνήθεις τεχνολογίες για διάβαση της βλέννας οδηγούν σε διάρρηξη του συνολικού βλεννώδους ιστού κάτι το οποίο είναι ανεπιθύμητο από τοξικολογικής άποψης. Για το λόγο αυτό κρίνεται απαραίτητη η ανάπτυξη στρατηγικών που επικεντρώνονται στην τοπική και επιλεκτική διάρρηξη της βλέννας (π.χ., ανάπτυξη νανοσωματιδίων με «ολισθηρή» επιφάνεια, ελεγχόμενη αποδέσμευση βλεννολυτικών παραγόντων, κλπ) για την αποτελεσματική χορήγηση βιομορίων μέσω βλεννωδών μεμβρανών. Στην παρούσα μελέτη αναπτύχθηκαν διάφοροι τύποι νανοφορέων με ικανότητα να διαπερνούν τη βλέννα με βάση τις παραπάνω στρατηγικές. Πιο συγκεκριμένα παρασκευάστηκαν νανοφορείς με «ολισθηρή» επιφάνεια (π.χ., νανοσωματίδια PLGA-PEG και σύμπλοκα PAA/PLL, PAA/PArg). Σχετικά με τον εγκλεισμό βλεννολυτικών παραγόντων σε νανοφορείς, παρασκευάστηκαν λιποσώματα με διαφορετική σύσταση λιπιδίων (π.χ., 1,2-διπαλμιτοϋλ-sn-γλυκερο-3-φωσφατιδυλοχολίνη (DPPC), άλας νατρίου της 1,2-διμυριστοϋλ-snγλυκερο-3-φωσφο-rac-(1-γλυκερόλης) (DMPG), διδεκυλοδιμεθυλο βρωμιούχο αμμώνιο (DDAB), χοληστερόλη (CHOL), (1,2-διστεαροϋλ-sn-γλυκερο-3-φωσφοαιθανολαµίνη-Ν-φολικού(πολυαιθυλενογλυκόλη)-μαλεϊμίδιο (DSPE-PEG2 Maleimide)) που φέρουν το βλεννολυτικό παράγοντα 4-MBA. Τα νανοσωματίδια PLGA-PEG παρασκευάστηκαν με τη μέθοδο του διπλού γαλακτώματος κατόπιν της σύνθεσης συμπολυμερών PLGA-PEG μέσω αντίδρασης καρβοδιιμιδίου μεταξύ του PLGA (π.χ., RG52H, RG752H) και διαφόρων τύπων PEG (NH 2 - PEG-NH 2 (MW 3kDa), CH 3 O-PEG-NH 2 (MW 2 και 5 kda). Η επίδραση των τύπων PLGA (75:25, 5:5) και PEG (MW, λειτουργικές ομάδες) στην απόδοση της σύζευξης του PEG καθώς και στις ιδιότητες των παραγόμενων νανοσωματιδίων (π.χ., μέσο μέγεθος, ικανότητα διάχυσης στη βλέννα) μελετήθηκε πειραματικά.

Τα σύμπλοκα πολυηλεκτρολυτών (π.χ., PAA/PLL, PAA/PArg) συντέθηκαν με τη μέθοδο της ιοντικής συμπλοκοποίησης και μελετήθηκε η επίδραση διαφόρων παραμέτρων της διεργασίας (π.χ., λόγος φορτίου PAA/πολυκατιόντος, συγκέντρωση πολυηλεκτρολύτη) στο μέσο μέγεθος και στο ζ δυναμικό των παραγόμενων συμπλόκων καθώς και στην ικανότητά τους να διαπερνούν τη βλέννα. Τα λιποσώματα που φέρουν 4-MBA παρασκευάστηκαν με τη μέθοδο της ενυδάτωσης λεπτού υμενίου και μελετήθηκε η επίδραση της σύστασής τους στις ιδιότητές τους (π.χ., μέσο μέγεθος, απόδοση εγκλεισμού του βλεννολυτικού παράγοντα, αποδέσμευση του 4-MBA, ικανότητά τους να διαπερνούν τη βλέννα). Η δυνατότητα των διαφόρων τύπων νανοσωματιδίων να διαχέονται στη βλέννα μελετήθηκε πειραματικά σε βλέννα που έχει εξαχθεί από εντερικό βλεννογόνο χοίρου. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Νανοσωματίδια PLGA-PEG Τα νανοσωματίδια PLGA-PEG παρασκευάστηκαν με τη μέθοδο του διπλού γαλακτώματος [1] κατόπιν της σύνθεσης συμπολυμερών PLGA-PEG μέσω αντίδρασης καρβοδιιμιδίου [2,3] μεταξύ του PLGA (π.χ., RG52H, RG752H) και διαφόρων τύπων PEG (NH 2 -PEG-NH 2 (MW 3kDa), CH 3 O-PEG-NH 2 (MW 2 και 5 kda). Η σύσταση των συμπολυμερών PLGA-PEG μελετήθηκε με 1 H-NMR (Πίνακας 1). Η μέση διάμετρος των νανοσωματιδίων προσδιορίστηκε με δυναμική σκέδαση του φωτός και το ζ δυναμικό τους από μετρήσεις ηλεκτροφόρησης σε υδατικά διαλύματα (Malvern Nano ZS9, United Kingdom). Τέλος, η πυκνότητα του PEG στην επιφάνεια των νανοσωματιδίων υπολογίστηκε με βάση τις εξισώσεις [1-4], όπου R F είναι η ακτίνα Flory της αλυσίδας PEG, D είναι η απόσταση μεταξύ των αλυσίδων PEG [4], A είναι η επιφάνεια που καταλαμβάνει κάθε αλυσίδα PEG [5] και L είναι ο λόγος μήκους/πάχους του στρώματος PEG [4]: R F = αn 3/5 (1) όπου α είναι το μήκος του μονομερούς και N είναι ο αριθμός των μονομερών ανά αλυσίδα πολυμερούς D = 2 (A/π) 1/2 (2) A = 6M PEG /dn A fρ (3) όπου M PEG είναι το μοριακό βάρος των αλυσίδων PEG, d είναι η μέση διάμετρος των νανοσωματιδίων, N A είναι ο αριθμός Avogadro, f είναι το κλάσμα μάζας της PEG στα νανοσωματίδια PLGA-PEG και ρ είναι η πυκνότητα των νανοσωματιδίων. L = Nα 5/3 / D 2/3 (4) Όπως μπορεί να παρατηρηθεί στον Πίνακα 1, η αύξηση του αρχικού λόγου γραμμομορίων PEG:PLGA οδήγησε σε αύξηση του τελικού λόγου γραμμομορίων PEG:PLGA (δηλαδή του λόγου γραμμομορίων PEG:PLGA στο συντιθέμενο συμπολυμερές όπως υπολογίστηκε από 1 H-NMR). Επιπλέον μπορεί να παρατηρηθεί ότι για τον ίδιο αρχικό λόγο γραμμομορίων PEG:PLGA επετεύχθησαν υψηλότεροι τελικοί λόγοι γραμμομορίων όταν χρησιμοποιήθηκε η NH 2 -PEG-NH 2 σε σχέση με την CH 3 O-PEG-NH 2, ανεξάρτητα από τον τύπο του PLGA που χρησιμοποιήθηκε (π.χ., RG52H, RG752H). Πίνακας 1. Ιδιότητες των συντιθέμενων συμπολυμερών PLGA-PEG. PLGA Τύπος PEG Αρχικός Λόγος Γραμμομορίων PEG:PLGA Τελικός Λόγος Γραμμομορίων PEG:PLGA RG52H NH 2 -PEG3-NH 2 1..612 RG52H NH 2 -PEG3-NH 2 1.2 1.154 RG52H NH 2 -PEG3-NH 2 2. 1.88 RG752H NH 2 -PEG3-NH 2 1..75 RG752H NH 2 -PEG3-NH 2 1.2 1.93 RG52H CH 3 O-PEG2-NH 2 1..128 RG52H CH 3 O-PEG2-NH 2 1.2.558 RG52H CH 3 O-PEG2-NH 2 2..51 RG752H CH 3 O-PEG2-NH 2 1..29 RG752H CH 3 O-PEG2-NH 2 1.2.57 RG52H CH 3 O-PEG5-NH 2 1..251 RG752H CH 3 O-PEG5-NH 2 1..224

Αυτό μπορεί να αποδοθεί στο γεγονός ότι και οι δύο αμινομάδες της PEG αντέδρασαν με τα καρβοξύλια του PLGA, καθώς αυτές οι δύο αμινομάδες έχουν παρόμοια δραστικότητα. Από την άλλη πλευρά, ο τύπος του PLGA και το μοριακό βάρος της CH 3 O-PEG-NH 2 δε φάνηκε να έχουν σημαντική επίδραση στο λόγο γραμμομορίων PEG:PLGA του συντιθέμενου συμπολυμερούς καθώς δε σχετίζονταν άμεσα με τον αριθμό των δραστικών θέσεων (δηλαδή τον αριθμό των ελεύθερων καρβοξυλομάδων του PLGA και των αμινομάδων της PEG). Τα νανοσωματίδια που παρασκευάστηκαν από τα συντιθέμενα συμπολυμερή PLGA-PEG είχαν μέση διάμετρο 295.7-342.5 nm και αρνητικό ζ δυναμικό (-7.7 εώς -8.8 mv) (Πίνακας 2). Σε αυτό το σημείο θα πρέπει να σημειωθεί ότι μόνο τα συμπολυμερή PLGA-PEG που συντέθηκαν με χρήση της CH 3 O-PEG-NH 2 επιλέχθηκαν για την παρασκευή των νανοσωματιδίων, καθως τα NPs που παρασκευάστηκαν από συμπολυμερή PLGA-PEG με βάση το NH 2 -PEG-NH 2 παρουσίασαν συσσωμάτωση κατά τη διεργασία καθαρισμού τους. Πίνακας 2. Ιδιότητες νανοσωματιδίων PLGA-PEG (λόγος γραμμομορίων PEG:PLGA=1:1) και PLGA. Συμπολυμερές Μέσο Μέγεθος (nm) ζ Δυναμικό (mv) RG52H-PEG2 326.1±29-7.7±1.5 RG52H-PEG5 36.6±25-8.8±2.8 RG752H-PEG2 342.5±1.5-8.6±.96 RG752H-PEG5 295.7±8.8-7.7±1.9 RG52H 295.4±5.2-23.3±.1 RG752H 32.1±4.8-22.±1.6 Στον Πίνακα 2 παρουσιάζονται τα χαρακτηριστικά των νανοσωματιδίων PLGA-PEG σε σύγκριση με εκείνα των νανοσωματιδίων PLGA. Το αρνητικό ζ δυναμικό των νανοσωματιδίων PLGA (π.χ., -23.3 εως -22 mv) οφείλεται στα ελεύθερα καρβοξύλια που βρίσκονται στην επιφάνεια των νανοσωματιδίων PLGA, τα οποία είναι αρνητικά φορτισμένα σε φυσιολογικό ph. Στην περίπτωση των νανοσωματιδίων PLGA-PEG, το PLGA συζεύχθηκε επιτυχώς με την CH 3 O-PEG-NH 2, οδηγώντας στη μερική εξουδετέρωση των ελεύθερων ανιονικών καρβοξυλίων που βρίσκονται στην επιφάνεια των νανοσωματιδίων και κατά συνέπεια στη μείωση των απόλυτων τιμών ζ δυναμικού των νανοσωματιδίων PLGA-PEG (π.χ., -7.7 εως -8.8 mv). Σε αυτό το σημείο θα πρέπει να σημειωθεί ότι τα νανοσωματίδια PLGA-PEG είχαν αρνητικότερο φορτίο από -1 mv, το οποίο σε συνδυασμό με το MW της PEG (π.χ., 5 kda) ελαχιστοποιεί τις αλληλεπιδράσεις με τη βλέννα [6]. Στον Πίνακα 3 παρουσιάζονται οι παράμετροι που χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό της πυκνότητας της PEG στην επιφάνεια των νανοσωματιδίων PLGA-PEG και η διάταξη της PEG σε αυτή. Σε περιπτώσεις χαμηλής επιφανειακής κάλυψης (D>R F ), οι αλυσίδες της PEG έχουν μεγαλύτερη ελευθερία κινήσεων και βρίσκονται πιο κοντά στην επιφάνεια των νανοσωματιδίων εμφανίζοντας έτσι μία διάταξη τύπου «μανιταριού». Από την άλλη πλευρά, σε περιπτώσεις υψηλής επιφανειακής κάλυψης (η τιμή της D μειώνεται σε αυτή της R F ) η κίνηση των αλυσίδων PEG περιορίζεται σημαντικά και εμφανίζουν μία διάταξη τύπου «βούρτσας». Στις περιπτώσεις που L>2RF, η διάταξη τύπου «βούρτσας» ορίζεται ως διάταξη τύπου «πυκνής βούρτσας». Μία υψηλή επιφανειακή κάλυψη διασφαλίζει την κάλυψη της συνολικής επιφάνειας των νανοσωματιδίων αλλά επιφέρει μείωση της στερεοχημικής παρεμπόδισης, καθώς μειώνεται η κινητικότητα των αλυσίδων της PEG. Όπως μπορεί να παρατηρηθεί από τον Πίνακα 3, τα νανοσωματίδια PLGA-PEG με PEG MW = 5 kda εμφάνισαν διάταξη PEG τύπου «πυκνής βούρτσας», ενώ εκείνα με PEG MW = 2 kda εμφάνισαν διάταξη PEG τύπου «βούρτσας». Πίνακας 3. Παράμετροι που χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό της πυκνότητας της PEG στα νανοσωματίδια PLGA-PEG και τύπος διάταξης PEG. Συμπολυμερές R F D A L Διάταξη (nm) (nm) (nm 2 ) (nm) RG52H-PEG2 2.8 1.83 2.62 3.75 βούρτσα RG52H-PEG5 4.8 1.34 1.41 11.44 πυκνή βούρτσα RG752H-PEG2 2.8 1.28 1.29 4.74 βούρτσα RG752H-PEG5 4.8 1.29 1.3 11.68 πυκνή βούρτσα Η μελέτη της διάχυσης των νανοσωματιδίων PLGA-PEG στη βλέννα πραγματοποιήθηκε βάσει του πρωτοκόλλου της Friedl και των συνεργατών της [7]. Τα αποτελέσματα της μελέτης διάχυσης των νανοσωματιδίων PLGA-PEG στη βλέννα παρουσιάζονται στο Σχήμα 1 σε σύγκριση με τα αποτελέσματα της διάχυσης των νανοσωματιδίων PLGA. Όπως ήταν αναμενόμενο, τα νανοσωματίδια PLGA-PEG, τα οποία ήταν ειδικά σχεδιασμένα για αποτελεσματική διάχυση μέσα στη βλέννα (π.χ., συνδυασμός PEG MW 5 kda με επιφανειακό φορτίο μεταξύ -1 και -7 mv), εμφάνισαν αυξημένη διάχυση στη βλέννα σε σύγκριση με τα

νανοσωματίδια PLGA [6,8]. Επιπλέον, μελετήθηκε η επίδραση του MW της PEG στην ικανότητα των νανοσωματιδίων PLGA-PEG να διαπερνούν τη βλέννα. Παρατηρήθηκε ότι τα νανοσωματίδια PLGA-PEG με PEG MW = 5 kda εμφανίζουν ελαφρώς αυξημένη διαπερατότητα σε σύγκριση με εκείνα με PEG MW = 2 kda. Αυτό θα μπορούσε να αποδοθεί στις διαφορετικές επιφανειακές διατάξεις της PEG που παρατηρήθηκαν για τα διαφορετικά PEG MWs (διάταξη τύπου «βούρτσας» για PEG MW = 2 kda και τύπου «πυκνής βούρτσας» για PEG MW = 5 kda). Τα αποτελέσματα αυτά βρέθηκαν σε συμφωνία με την εργασία του Xu και των συνεργατών του [9] όπου μία επιφανειακή διάταξη PEG τύπου «πυκνής βούρτσας» επιτρέπει τη γρήγορη διάχυση των νανοσωματιδίων μέσα σε υψηλά ιξωδοελαστικές εκκρίσεις ανθρώπινης βλέννας, ελαχιστοποιώντας την προσκόλληση των νανοσωματιδίων στη βλέννα. Σχήμα 1. Μελέτη διάχυσης νανοσωματιδίων PLGA-PEG σε βλέννα που έχει εξαχθεί από εντερικό βλεννογόνο χοίρου. Επώαση των νανοσωματιδίων για 6h στους 37 C. % Permeated NPs 3 25 2 15 1 5 PLGA 5:5 PLGA 5:5-PEG2 PLGA 5:5-PEG5 PLGA 75:25 PLGA 75:25-PEG2 PLGA 75:25-PEG5 1 2 3 4 5 6 7 t (h) Σύμπλοκα πολυηλεκτρολυτών Διάφοροι τύποι συμπλόκων (π.χ., PAA/PLL, PAA/Parg) παρασκευάστηκαν με ανάμιξη υδατικών διαλυμάτων αντίθετα φορτισμένων πολυηλεκτρολυτών [1]. Η μέση διάμετρος των PECs προσδιορίστηκε με δυναμική σκέδαση του φωτός και το ζ δυναμικό τους από μετρήσεις ηλεκτροφόρησης σε υδατικά διαλύματα (Malvern Nano ZS9, United Kingdom). Τα PECs είχαν μέση διάμετρο ίση με 116-645 nm και ζ δυναμικό μεταξύ -41.4 και 32.5 mv. Παρατηρήθηκε ότι η μέση διάμετρος και το ζ δυναμικό των παραγόμενων PECs μπορεί να ρυθμιστεί αποτελεσματικά μεταβάλλοντας το λόγο φορτίου του PAA προς το αντίστοιχο πολυκατιόν. Η επίδραση του λόγου φορτίου του PAA προς το αντίστοιχο πολυκατιόν, στο μέσο μέγεθος και στο ζ δυναμικό των σχηματιζόμενων συμπλόκων PAA/PLL και PAA/Parg, απεικονίζεται στα Σχήματα 2α και 2β αντίστοιχα, για συγκέντρωση PAA (C PAA ) ίση με.1 w/v%. Όπως μπορεί να παρατηρηθεί, μία μείωση στο λόγο φορτίου PAA/πολυκατιόν οδήγησε σε αύξηση του ζ δυναμικού, τόσο για τα σύμπλοκα PAA/PLL όσο και για τα PAA/PArg (Σχήματα 2α και 2β). Αυτό μπορεί να εξηγηθεί ως εξής: η διεργασία ιοντικής συμπλοκοποίησης οδηγεί στο σχηματισμό συμπλόκων με μορφολογία πυρήνα-κελύφους [11]. Πιο συγκεκριμένα, ο σχηματισμός συμπλόκων, παρουσία ενός πολυηλεκτρολύτη υψηλού μοριακού βάρους σε περίσσεια (PAA) και ενός ομόλογου χαμηλού μοριακού βάρους (PLL ή PArg), λαμβάνει χώρα με ιοντική συμπλοκοποίηση κατά την οποία σχηματίζονται ουδέτερα τμήματα, λόγω εξουδετέρωσης των φορτίων τους. Εξαιτίας του ουδέτερου χαρακτήρα τους, τα τμήματα αυτά είναι περισσότερο υδρόφοβα και κατά συνέπεια αποτελούν τον εσωτερικό πυρήνα της νανοδομής, ενώ ο πολυηλεκτρολύτης που βρίσκεται σε περίσσεια σχηματίζει το εξωτερικό κέλυφος, ευνοώντας έτσι τη σταθερότητα του συμπλόκου [12,13]. Βάσει των παραπάνω, για λόγο φορτίου 1 (Σχήματα 2α και 2β), η επιφάνεια των σχηματιζόμενων συμπλόκων καλύπτεται κυρίως από PLL ή PArg (που βρίσκονται σε περίσσεια) και κατά συνέπεια είναι θετικά φορτισμένη. Από την άλλη πλευρά, για λόγο φορτίου >1, η επιφάνεια των συμπλόκων καλύπτεται από PAA (που βρίσκεται σε περίσσεια), οδηγώντας στη δημιουργία συμπλόκων με αρνητικές τιμές ζ δυναμικού (Σχήματα 2α και 2β) [13]. Σχετικά με την επίδραση του λόγου φορτίου PAA/πολυκατιόν στο μέσο μέγεθος των συμπλόκων, η μείωση του λόγου φορτίου οδήγησε στο σχηματισμό μεγαλύτερων PECs (Σχήματα 2α και 2β). Η τάση αυτή μπορεί να αποδοθεί στη σχέση ανάμεσα στο μήκος Debye (i.e., το μήκος πάνω από το οποίο εξουδετερώνονται οι ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις των σημείων φόρτισης) και τη συγκέντρωση του πολυηλεκτρολύτη. Καθώς η συγκέντρωση του PAA διατηρήθηκε σταθερή (π.χ., C PAA =.1 w/v%), η μείωση του λόγου φορτίου οφείλονταν στην αύξηση της συγκέντρωσης του πολυκατιόντος. Η τελευταία υποδήλωσε την απελευθέρωση ενός μεγάλου αριθμού αντίθετων ιόντων από τον πολυηλεκτρολύτη, εξαιτίας της διάστασης του (λ.χ., αυξημένη ιονική ισχύς). Αυτό οδήγησε στη μείωση του μήκους Debye και κατά συνέπεια στη μειωμένη ηλεκτροστατική απώθηση μεταξύ των πολυηλεκτρολυτών [14]. To αυξημένο μέσο μέγεθος που παρατηρήθηκε για τα σύμπλοκα PAA/PLL

και PAA/PArg για λόγο φορτίου ~ 1 (Σχήματα 2α και 2β) μπορεί να εξηγηθεί από την έλλειψη ηλεκτροστατικών απωθητικών δυνάμεων που οδηγεί σε συσσωμάτωση των PECs [12]. Σχήμα 2. Επίδραση των λόγων φορτίου των PAA/PLL και PAA/PArg στο μέσο μέγεθος και το ζ δυναμικό των PECs (MW PAA = 1 kda, MW PLL = 3-15 kda, MW PArg = 15-7 kda, C PAA =.1 %w/v). 1 7 size z-potential 6 Zeta potential (mv) Zeta potential (mv) -1-2 -3-4 5 4 3 2-5 1.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 PAA/PLL Charge Ratio (α) 4 35 Average size 2 Zeta potential 3-2 -4 25 2 15 Average Size (nm) Average Size (nm) -6 1 5 1 15 2 PAA/PArg Charge Ratio (β) Στο Σχήμα 3 απεικονίζονται τα αποτελέσματα της μελέτης διάχυσης ουδέτερων καθώς και θετικά και αρνητικά φορτισμένων PECs. Τα αρνητικά φορτισμένα PECs βρέθηκαν να εμφανίζουν το υψηλότερο ποσοστό διάχυσης ακολουθούμενα από τα ουδέτερα και τέλος τα θετικά φορτισμένα PECs. Η υψηλή πυκνότητα επιφανειακού φορτίου των PECs δημιουργεί πιθανώς μία υδρόφιλη επιφάνεια, μειώνοντας έτσι τις υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις τους με τη βλέννα και κατά συνέπεια διευκολύνοντας τη διάχυσή τους μέσα σε αυτή [15]. Επιπλέον, έχει παρατηρηθεί ότι το αρνητικό φορτίο του PAA είναι ουσιώδες για τη διάχυση στη βλέννα [16] ενώ η PLL έχει βρεθεί να εμφανίζει υψηλότερο ποσοστό διάχυσης σε σύγκριση με άλλα πολυκατιόντα όπως είναι η πολυαιθυλενοϊμίνη (PEI), η χιτοζάνη και η προταμίνη [17]. Λιποσώματα που φέρουν το βλεννολυτικό παράγοντα 4-ΜΒΑ Τα λιποσώματα (π.χ., DPPC-CHOL, DMPC-DMPG-CHOL, DMPC-DMPG-DDAB, DPPC-DSPE-PEG2- CHOL) που φέρουν 4-MBA, παρασκευάστηκαν με τη μέθοδο της ενυδάτωσης λεπτού υμενίου [18]. Η μέση διάμετρος των λιποσωμάτων προσδιορίστηκε με δυναμική σκέδαση του φωτός και το ζ δυναμικό τους από μετρήσεις ηλεκτροφόρησης σε υδατικά διαλύματα (Malvern Nano ZS9, United Kingdom). Προκειμένου να προσδιοριστεί το ποσοστό του 4MBA στα λιποσώματα, το υπολειπόμενο 4MBA διαχωρίστηκε από τα λιποσώματα με φυγοκέντρηση στα 19, rpm για 45 min στους 1 o C (Sorvall Discovery 1SE, Hitachi) και η συγκέντρωση του 4MBA προσδιορίστηκε στο υπερκείμενο με φασματοσκοπία υπεριώδους στα 275 nm (Perkin Elmer UV-Vis Lambda 35 spectrophotometer).

Σχήμα 3. Μελέτη διάχυσης PECs (C PAA =.1 w/v %) σε βλέννα που έχει εξαχθεί από εντερικό βλεννογόνο χοίρου. Επώαση των PECs για 6h στους 37 C. % Permeated PECs 8 7 6 5 4 3 2 1 PAA/PLL charge ratio = 1.77 PAA/PLL charge ratio = 1. PAA/PLL charge ratio =..59 1 2 3 4 5 6 7 8 t (h) Τα χαρακτηριστικά των λιποσωμάτων που φέρουν 4MBA συνοψίζονται στον Πίνακα 4. Όπως μπορεί να παρατηρηθεί, τα λιποσώματα έχουν μία μέση διάμετρο 151.4-246.3 nm. Οι παρατηρούμενες διαφορές στη μέση διάμετρο οφείλονται στη χρήση διαφορετικών τύπων λιπιδίων (λ.χ. ουδέτερα, ανιονικά και πεγκυλιωμένα). Όλα τα λιποσώματα που αποτελούνται από πεγκυλιωμένα ή ανιονικά λιπίδια εμφανίζουν μικρότερο μέσο μέγεθος σε σύγκριση με εκείνα που αποτελούνται από ουδέτερα (λ.χ., DPPC-CHOL) εξαιτίας των ισχυρών απωθητικών δυνάμεων ανάμεσα στα φορτισμένα σωματίδια και τη στερεοχημική παρεμπόδιση του ισχυρά ενυδατωμένου PEG [19]. Τα αντίστοιχα ποσοστά και η απόδοση εγκλεισμού του 4MBA παρουσιάζονται επίσης στον Πίνακα 4. Όπως μπορεί να παρατηρηθεί, οι αποδόσεις εγκλεισμού του 4MBA είναι υψηλές (π.χ., 85.86-89.69 wt%) ανεξάρτητα από τη συγκέντρωση των λιπιδίων, υποδεικνύοντας έτσι ότι ο υδρόφοβος βλεννολυτικός παράγοντας εγκλείστηκε επιτυχώς στη λιπιδική διπλοστοιβάδα [2,21]. Η ελάχιστα αυξημένη απόδοση εγκλεισμού που παρατηρήθηκε για τα DMPC-DMPG-DDAB (π.χ., 89.69 wt%) θα μπορούσε να αποδοθεί σε μία πιθανή ηλεκτροστατική αλληλεπίδραση μεταξύ του αρνητικά φορτισμένου 4MBA και του θετικά φορτισμένου DDAB [22]. Πίνακας 4. Ιδιότητες των λιποσωμάτων που φέρουν 4ΜΒΑ. Λιπόσωμα Μέσο Μέγεθος (nm) Ποσοστό 4MBA (wt%) Απόδοση Εγκλεισμού 4MBA (wt%) DPPC-CHOL 246.3±39.6 17.94±1.37 86.97±5.48 DMPC-DMPG-CHOL 151.4±19.3 18.27±.85 86.6±2.27 DMPC-DMPG-DDAB 229.5±13.5 18.43±1.6 89.69±1.62 DPPC-DSPE-PEG2-CHOL 187.3±53.9 17.45±.8 85.86±2.62 Η αποδέσμευση του βλεννολυτικού παράγοντα 4MBA από τα λιποσώματα μελετήθηκε με τη μέθοδο της μεμβράνης διαπίδυσης [23,24]. Οι κατατομές αποδέσμευσης του 4MBA από τα λιποσώματα σε PB (.2 M, ph 6.8) στους 37 o C απεικονίζονται στο Σχήμα 4. Όπως μπορεί να παρατηρηθεί, διαφορετικά ποσοστά 4MBA αποδεσμεύτηκαν από διαφορετικούς τύπους λιποσωμάτων. Πιο συγκεκριμένα, το υψηλότερο ποσοστό 4MBA αποδεσμεύτηκε από τα DMPC-DMPG-CHOL (π.χ., 31.7%). Μικρότερα ποσοστά 4MBA αποδεσμεύτηκαν σε φθίνουσα τάξη από τα DMPC-DMPG-DDAB (π.χ., 29.2%), DPPC-DSPE-PEG2-CHOL (π.χ., 23%) και DPPC-CHOL (π.χ., 13.2%). Τα παραπάνω αποτελέσματα θα μπορούσαν να εξηγηθούν ως εξής: η αποδέσμευση ενός δραστικού συστατικού από τα λιποσώματα εξαρτάται από τη διαπερατότητα της μεμβράνης, η οποία επηρεάζεται από τη ρευστότητα της λιπιδικής διπλοστοιβάδας, δηλαδή τη σχετική κινητικότητα του κάθε ξεχωριστού μορίου λιπιδίου στη διπλοστοιβάδα, και επομένως από τη σύσταση της μεμβράνης [25]. Η κινητικότητα των λιπιδίων επηρεάζεται σημαντικά από τη θερμοκρασία. Εάν η θερμοκρασία του περιβάλλοντος (T) είναι χαμηλότερη από τη θερμοκρασία μετάβασης φάσης (T m ) του κύριου λιπιδίου, τα λιπίδια διατάσσονται σε μορφή οργανωμένης γέλης, οπότε τα λιποσώματα παρουσιάζουν αυξημένη σταθερότητα και κατ επέκταση περιορισμένη αποδέσμευση του δραστικού συστατικού, ενώ αν T>T m, τα λιπίδια εμφανίζουν υγρή- κρυσταλλική δομή και τα λιποσώματα επιτρέπουν μία πιο γρήγορη αποδέσμευση του εγκλεισμένου μορίου [26,27]. Η συμπεριφορά αυτή παρατηρείται στο Σχήμα 4, καθώς T m,dppc > T m,dmpc =T m,dmpg > T m,ddab. Τα πειραματικά ευρήματα της παρούσας εργασίας βρέθηκαν σε συμφωνία με δημοσιευμένα αποτελέσματα που δείχνουν μείωση της σταθερότητας της μεμβράνης με αντικατάσταση του DPPC με DMPC [27].

Επιπλέον, όπως μπορεί να παρατηρηθεί στο Σχήμα 4, η κατατομή αποδέσμευσης του 4MBA χαρακτηρίζεται σε κάθε περίπτωση, από συνεχή αποδέσμευση του 4MBA για μία χρονική περίοδο περίπου 45 λεπτών. `Επειτα από αυτή τη χρονική στιγμή, η αποδέσμευση του 4MBA σχηματίζει πλατώ, υποδηλώνοντας ότι ένα μεγάλο ποσοστό του βλεννολυτικού παράγοντα, που μεταβάλλεται από 68% (DMPC-DMPG-CHOL) εώς 87% (DPPC-CHOL) δεν αποδεσμεύεται από τα λιποσώματα και παραμένει συνδεδεμένο με τη λιπιδική διπλοστοιβάδα. Αυτό θα μπορούσε να αποδοθεί στην υδρόφοβη φύση του 4MBA που ευνοεί τον εγκλεισμό του στη μεμβράνη των λιποσωμάτων και στο αυξημένο ποσοστό χοληστερόλης (DPPC-CHOL) το οποίο επηρεάζει επίσης το μικροϊξώδες των διπλοστοιβάδων και την αποδέσμευση των εγκλεισμένων μορίων [28]. Σχήμα 4. Κατατομές αποδέσμευσης του βλεννολυτικού παράγοντα 4MBA από λιποσώματα σε PB (.2M, ph 6.8) στους 37 o C. 4MBA released (%) 5 4 3 2 1 DPPC-CHOL DMPC-DMPG-CHOL DMPC-DMPG-DDAB DPPC-DSPE-PEG2-CHOL 2 4 6 8 1 12 14 t (min) Τα αποτελέσματα της διάχυσης των διαφόρων τύπων λιποσωμάτων, που περιέχουν ίδια ποσότητα 4MBA (π.χ., ~18wt%), στη βλέννα, απεικονίζονται στο Σχήμα 5. Όπως μπορεί να παρατηρηθεί, τα λιποσώματα DMPC- DMPG-CHOL εμφάνισαν αυξημένη διαπερατότητα σε σχέση με τους άλλους τρεις τύπους λιποσωμάτων, ακολουθούμενα από τα DMPC-DMPG-DDAB. Αυτό θα μπορούσε να αποδοθεί στις διαφορετικές ποσότητες 4MBA που απελευθερώνονται από τους διάφορους τύπους λιποσωμάτων (π.χ., >3% 4MBA απελευθερώθηκε από τα DMPC-DMPG-CHOL σε σύγκριση με ένα ποσοστό 4MBA <1% που απελευθερώθηκε από τα DPPC- CHOL, Σχήμα 5) καθώς και σε πιθανές αλληλεπιδράσεις των φωσφολιπιδίων με τη βλέννα. Οι αλληλεπιδράσεις των λιποσωμάτων με τη βλέννα εξαρτώνται από τους τύπους των φωσφολιπιδίων που αποτελούν τα λιποσώματα και από τη γραμμομοριακή τους σύσταση. Σχήμα 5. Μελέτη διάχυσης λιποσωμάτων που φέρουν 4MBA σε βλέννα που έχει εξαχθεί από εντερικό βλεννογόνο χοίρου. Επώαση των λιποσωμάτων για 6h στους 37 C. % Permeated Liposomes 5 4 3 2 1 DPPC-CHOL DMPC-DMPG-CHOL DMPC-DMPG-DDAB DPPC-DSPE-PEG2-CHOL 1 2 3 4 5 6 7 t (h) Παρατηρήθηκε (Σχήμα 5) ότι η χρήση των φωσφολιπιδίων DMPC και DMPG οδήγησε σε αυξημένη διαπερατότητα της βλέννας, ειδικά όταν συνδυάστηκαν με χοληστερόλη, ενώ η χρήση του DPPC δε φάνηκε να ενισχύει τη διάχυση στη βλέννα είτε σε συνδυασμό με χοληστερόλη ή με ένα πεγκυλιωμένο φωσφολιπίδιο. Η τελευταία παρατήρηση βρέθηκε σε συμφωνία με τον Hanes και τους συνεργάτες του [29] οι οποίοι έδειξαν ότι λιποσώματα αποτελούμενα από φωσφατίδυλοχολίνη (PC), χοληστερόλη και ροδαμίνη-pe (PC:CHOL:Rho-PE)

ακινητοποιούνται μέσα στη βλέννα εκτός αν φέρουν 1-2 mol% PEG, συγκεντρώσεις υψηλότερες από εκείνες που χρησιμοποιούνται τυπικά για το σχηματισμό πεγκυλιωμένων λιποσωμάτων (λ.χ., 6-7 mol%). Τέλος, η ελαφρώς αυξημένη διάχυση των DPPC-CHOL σε σύγκριση με τα DPPC-DSPE-PEG2-CHOL, που παρατηρείται στο Σχήμα 5, θα μπορούσε πιθανόν να οφείλεται στην αυξημένη δύναμη της βαρύτητας που εφαρμόστηκε στα μεγαλύτερα λιποσώματα (DPPC-CHOL) καθώς το συγκεκριμένο πείραμα πραγματοποιήθηκε σε κάθετη διάταξη. ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Η παρούσα έρευνα υποστηρίχθηκε οικονομικά από την Ευρωπαίκή `Ενωση (EU) υπό το Συνεργατικό Ερευνητικό `Εργο ALEXANDER (Grant Agreement No. NMP-211-1.2-2-28761) του 7 ου Προγράμματος Πλαισίου [FP7/27-213]. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ [1]. Hamdy S., Haddadi A., Somayaji V., Ruan D., Samuel J., J. Pharm. Biomed. Anal. 44:914 (27). [2]. Sanna V., Pintus G., Roggio A.M., Punzoni S., Posadino A.M., Arca A., Marceddu S., Bandiera P., Uzzau S., Sechi M., J. Med. Chem. 54:1321 (211). [3]. Betancourt T., PhD Dissertation, The University of Texas at Austin (27). [4]. Perry J.L., Reuter K.G., Kai M.P., Herlihy K.P., Jones S.W., Luft J.C., Napier M., Bear J.E., Nano Lett. 12:534 (212). [5]. Gref R., Luck M., Quellec P., Marchand M., Dellacherie E., Harnisch S., Blunk T., Müller R.H., Colloid Surface B 18:31 (2). [6]. Wang Y.-Y., Lai S.K., Suk J.S., Pace A., Cone R., Hanes J., Angew. Chem. Int. Ed. 47:9726 (28). [7]. Friedl H., Dunnhaupt S., Hintzen F., Waldner C., Parikh S., Pearson J.P., Wilcox M.D., Bernkop-Schnürch A., J. Pharm. Sci. 12(12):446 (213). [8]. Ensign L.M., Schneider C., Suk J.S., Cone R., Hanes J., Adv. Mater. 24:3887 (212). [9]. Xu Q., Boylan N.J., Shutian C., Miao B., Patel H., Hanes J., J. Control. Release 17:279 (213). [1]. Müller Μ., Reihs Τ., Ouyang W., Langmuir 21:465 (25). [11]. Hartig S.M., Carlesso G., Davidson J.M., Prokop A., Biomacromolecules 8(1):265 (27). [12]. Delair T., Eur. J. Pharm. Biopharm.78(1):1 (211). [13]. Oyarzun-Ampuero F.A, Goycoolea F.M., Torres D., Alonso M.J., Eur. J. Pharm. Biopharm. 79:54 (211). [14]. Müller M., Keßler B., Fröhlich J., Poeschla S., Torger B., Polymers 3(2):762 (211). [15]. Lai S.K., Wang Y.-Y., Hanes J., Adv. Drug Del. Rev. 61:158 (29). [16]. Laffleur F., Hintzen F., Shahnaz G., Rahmat D., Leithner K., Bernkop-Schnürch A., Nanomedicine (213) doi:1.2217/nnm.13.26. [17]. Granger D.N., Kvietys P.R., Perry M.A., Taylor A.E., 91:1443 (1986). [18]. Pantos A., Sideratou Z., Paleos C.M., J. Colloid Interf. Sci. 253:435 (22). [19]. Sriwongsitanont S., Ueno M., Colloid Polym Sci 282(7):753 (24). [2]. Muller-Goymann C.C., Eur. J. Pharm. Biopharm. 58:343 (24). [21]. Schwendener R.A., Schott H., in: Weissig V. (Ed.), Vol. 1: Pharmaceutical Nanocarriers, Series: Liposomes Methods in Molecular Biology 65:129 (21), Humana Press. [22]. Bowey K., Tanguay J.-F., Tabrizian M., Eur. J. Pharm. Biopharm. 86:369 (214). [23]. Panwar P., Pandey B., Lakhera P.C., Singh K.P., Int. J. Nanomedicine 5:11 (21). [24]. Tsukamoto T., Hironaka K., Fujisawa T., Yamaguchi D., Tahara K., Tozuka Y., Takeuchi H., Asian J. Pharm. Sci. 8(2):14 (213). [25]. Lindner L.H., Hossann M., Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 13(1):111 (21). [26]. Anderson M., Omri A., Drug Delivery 11:33 (24). [27]. Grit M., Crommelin D., Chem. Phys. Lipids 64(1-3):3 (1993). [28]. Nounou M.M., El-Khordagui L.K., Khalafallah N.A., Kkhalil S.A., Acta Pharm. 56:311 (26). [29]. Hanes J., Wai K., Chan Y., Mcmahon M.T., Yang M., Yu T., WO213166498 (Patent).