Δρ. Χηµείας, Επιβλέπων Καθηγητής Ελληνογαλλικής σχολής Jeanne D Arc. 1,2,3,4,5,6,7 Ελληνογαλλική Σχολή Jeanne D Arc 8

Προσδιορισµός φαρµακευτικών και ψυχοτρόπων ή µη φαρµάκων, καθώς και παρανόµως διακινούµενων εξαρτησιογόνων ουσιών και των µεταβολιτών στην θαλάσσια περιοχή της Ψυτάλλειας Βρουβάκη Ηρώ 1, Μαγκανάρης Δηµήτρης 2, Μάµαλη Αγγελίνα 3, Ντερτίµας Δηµήτρης 4, Ρουγγέρη Άννα 5, Στεφάνου Βαγγέλης 6, Φασκιώτη Ιωάννα 7, Μαρίνος Ιωάννου 8 1,2,3,4,5,6,7 Ελληνογαλλική Σχολή Jeanne D Arc 8 Δρ. Χηµείας, Επιβλέπων Καθηγητής Ελληνογαλλικής σχολής Jeanne D Arc 1 hro4ever@hotmail.com, 2 iron.maiden1997@windowslive.com, 3 angelina.mamali@gmail.com, 4 dirty.dimitris@gmail.com, 5 annarougeri@hotmail.com, 6 vagstefpao13@gmail.com, 7 ioanfaskiwti@gmail.com, 8 ioannoupir@gmail.com, Περίληψη Οι φαρµακευτικές αλλά και οι ψυχοτρόπες ή µη φαρµακευτικές, καθώς και οι παρανόµως διακινούµενες εξαρτησιογόνες ουσίες και οι µεταβολίτες τους αποτελούν πλέον τους σηµαντικότερους αναδυόµενους ρύπους του υδατικού περιβάλλοντος (ποτάµια, λίµνες, θάλασσα). Η κύρια πηγή ρύπανσης του υδατικού περιβάλλοντος είναι οι µονάδες επεξεργασίας αστικών λυµάτων, οι οποίες δέχονται λύµατα από διάφορες καθηµερινές ανθρωπογενείς δραστηριότητες, ωστόσο αδυνατούν να τις αποµακρύνουν σε σηµαντικό βαθµό. Έτσι η συνεχής απόρριψη στο περιβάλλον επεξεργασµένων λυµάτων που περιέχουν φαρµακολογικά ενεργές ενώσεις προκαλεί πλήθος (πολλές φορές ακόµα ανυπολόγιστων) προβληµάτων στο θαλάσσιο οικοσύστηµα. Είναι προφανές, ότι η συνεχής παρακολούθηση των συγκεντρώσεων των ενώσεων αυτών στα υδάτινα οικοσυστήµατα είναι απαραίτητη. Ο προσδιορισµός των φαρµάκων και ψυχοτρόπων καθώς και των παρανόµως διακινούµενων εξαρτησιογόνων ουσίων σε περιβαλλοντικά δείγµατα γίνεται µε χρήση ισχυρών φασµατοµέτρων µάζας συζευγµένων µε χρωµατογραφικά συστήµατα. Στα πλαίσια της διερεύνησης της ύπαρξης τέτοιων ρύπων στη θαλάσσια περιοχή του Σαρωνικού, η οποία δέχεται επεξεργασµένα λύµατα από το Κέντρο Επεξεργασίας Λυµάτων της Ψυτάλλειας, η οµάδα της Ελληνογαλλικής Σχολής Jeanne D Arc επισκέφτηκε το Εργαστήριο Αναλυτικής Χηµείας του Τµήµατος Χηµείας του Ε.Κ.Π.Α. και εκπαιδεύτηκε και συµµετείχε στην αναλυτική διαδικασία προσδιορισµού των ενώσεων αυτών σε θαλάσσια ύδατα. Επίσης επισκέφτηκε το Ελληνικό Κέντρο Θαλάσσιων Ερευνών (ΕΛ.ΚΕ.Θ.Ε.) και συµµετείχε σε δειγµατοληψία νερού. Η οµάδα στην προσπάθεια να κατανοήσει τη διαδικασία δειγµατοληψίας, επισκέφτηκε το Ωκεανογραφικό σκάφος «ΑΙΓΑΙΟ» και ξεναγήθηκε στους χώρους του και τα εργαστήριά του. Έχει προγραµµατιστεί συµµετοχή της οµάδας σε Ωκεανογραφικό πλόα που θα πραγµατοποιηθεί τον Μάρτιο από το ΕΛ.ΚΕ.Θ.Ε. στον Εσωτερικό Σαρωνικό κόλπο και τον κόλπο της Ελευσίνας µε έµφαση στην περιοχή της Ψυτάλλειας, λόγω της λειτουργίας σε αυτή του Κέντρου Επεξεργασίας Λυµάτων. 1

ΛΕΞΕΙΣ-ΚΛΕΙΔΙΑ: φαρµακευτικές ενώσεις, παρανόµως διακινούµενες ενώσεις, βιολογικός καθαρισµός, αναδυόµενοι ρύποι, φασµατοµετρία µάζας Εισαγωγή Αναδυόµενοι ρύποι προτεραιότητας Με την πολύ γενική έννοια, αναδυόµενοι ρύποι προτεραιότητας (emerging contaminants) είναι οι δυνητικά τοξικές ενώσεις, οπού η επίδρασή τους και η παρουσία τους δεν είναι επακριβώς γνωστή, είτε επειδή είναι καινούριες ενώσεις που αρχίζουν να διαδίδονται, είτε γιατί πολύ απλά υπήρχαν περιορισµοί στο παρελθόν της κατανόησης της τύχης και επίδρασης στο περιβάλλον κάποιων ήδη γνωστών ενώσεων (δεν είχαν µελετηθεί). Επί του παρόντος υπάρχει ένα πολύ µεγάλο κενό µεταξύ της γνώσης µας για τυχόν µακροχρόνιες επιδράσεις των ενώσεων αυτών και των κανονισµών που υπάρχουν για την ρύθµιση αυτών (στην ουσία δεν υπάρχουν). Ωστόσο, ο ενδεχόµενος κίνδυνος των µη ρυθµιζόµενων, από διάφορους κανονισµούς, ενώσεων, υπάρχει, και πρόσφατες εξελίξεις της επιστήµης έχουν οδηγήσει στην επίγνωση και κατανόηση αυτών. Έτσι είναι µέγιστης σηµασίας να καθοριστούν βάσεις και κριτήρια για την κατανόηση του πώς µια χηµική ένωση µπορεί να γίνει επικίνδυνη για το περιβάλλον και τους ανθρώπους και πώς µπορεί να προσδιοριστεί και να κατηγοριοποιηθεί ως αναδυόµενος ρύπος (Petrisor and Lazar, 2006). Κέντρο επεξεργασίας λυµάτων Αθήνας, Ψυτάλλεια Το Κέντρο Επεξεργασίας Λυµάτων της Ψυτάλλειας είναι το τελικό σηµείο συγκέντρωσης οικιακών λυµάτων και προ - επεξεργασµένων βιοµηχανικών λυµάτων της µείζονος περιοχής της Αθήνας, µε υδραυλική ικανότητα 27 m 3 /δευτερόλεπτο. Οι εγκαταστάσεις βρίσκονται στην περιοχή του Ακροκεράµου και στο νησί Ψυτάλλεια, 2 χλµ δυτικά του λιµανιού του Πειραιά. Οι εγκαταστάσεις επεξεργασίας λυµάτων εκτείνονται σε χώρο 63.000 m 2 στον Ακροκέραµο, ενώ οι εγκαταστάσεις βιολογικού καθαρισµού, τριτογενούς επεξεργασίας και επεξεργασίας ιλύος βρίσκονται στο νησί της Ψυτάλλειας, σε επιφάνεια 563.000 m 2. Οι επεξεργασµένες εκροές αποστέλλονται µέσω δύο υποθαλάσσιων αγωγών στο Σαρωνικό Κόλπο σε βάθος 63 m. Ο Βιολογικός Καθαρισµός των Αποβλήτων είναι από τους πιο αποτελεσµατικούς τρόπους αντιµετώπισης της ρύπανσης των υδάτινων αποδεκτών και επιτυγχάνει τον καθαρισµό (διαχωρισµό), των αστικών λυµάτων, από τα περιεχόµενα σ αυτά βλαβερά συστατικά και την ακίνδυνη διάθεση των λυµάτων στο περιβάλλον. Τα στάδια που περιλαµβάνει είναι: i. Ο Πρωτοβάθµιος Καθαρισµός που αποµακρύνει τα ογκώδη στερεά, την άµµο και τα αιωρούµενα στερεά (φυσική και χηµική επεξεργασία) ii. Ο Δευτεροβάθµιος (βιολογικός) Καθαρισµός που αποµακρύνει τα οργανικά συστατικά και τους παθογόνους µικροοργανισµούς (βιολογική επεξεργασία) iii. Ο Τριτοβάθµιος Καθαρισµός που αποµακρύνει τα θρεπτικά συστατικά (όπως φωσφόρος, άζωτο) (http://1lyk-karpen.eyr.sch.gr/biology/biological_cleaning.pdf). 2

Αναδυόµενοι ρύποι προτεραιότητας: Φαρµακευτικές, Ψυχοτρόπα ή µη φάρµακα, καθώς και παρανόµως διακινούµενες εξαρτησιογόνες ουσίες Μέχρι σήµερα ένας µεγάλος αριθµός αναδυόµενων ρύπων προτεραιότητας έχει ανιχνευτεί στα υγρά αστικά απόβλητα (Tchobanoglous et al., 2002; Schwarzenbach et al., 2006). Ωστόσο µεταξύ των διαφόρων κατηγοριών συνθετικών οργανικών ενώσεων που ανήκουν στη συγκεκριµένη κατηγορία µικρορυπαντών, σηµαντικό ενδιαφέρον παρουσιάζουν οι φαρµακευτικές ουσίες, τα ψυχοτρόπα ή µη φάρµακα, καθώς και οι παρανόµως διακινούµενες εξαρτησιογόνες ουσίες, οπού είναι και οι κατηγορίες των ενώσεων που θα µελετήσουµε στην παρούσα εργασία. Οι φαρµακευτικές ενώσεις που συναντώνται στα αστικά απόβλητα και επιλέχθηκαν προς µελέτη, καλύπτουν ένα µεγάλο φάσµα κατηγοριών (µη στεροειδή αντιφλεγµονώδη (NSAIDs), αντιυπερτασικά, αντιβιοτικά, αναλγητικά, διουρητικά, βρογχοδιασταλτικά). Από την άλλη τα τελευταία χρόνια διάφορες κατηγορίες ψυχοτρόπων και παρανόµως διακινούµενων εξαρτησιογόνων ενώσεων, όπως οπιούχα και οπιοειδή, διεγερτικά, ηρεµιστικά, παραισθησιογόνα, αντιψυχωσικά, αναισθητικά, και αντικαταθλιπτικά, έχουν αποτελέσει µαζί µε τις φαρµακευτικές ουσίες, οµάδες αναδυόµενων ρύπων προτεραιότητας, εξαιτίας της εµφάνισής τους στο υδάτινο περιβάλλον και των δυνητικών επιπτώσεων που µπορεί να έχουν σε αυτό (Castiglioni et al., 2011; Van Nuijs et al., 2011). Έρευνες που έχουν πραγµατοποιηθεί στο εξωτερικό αναφέρουν τη συχνή ανίχνευση αυτών των ουσιών στους υδατικούς αποδέκτες (Kolpin et al., 2002; Loos et al., 2009) και υποδεικνύουν ότι τα υγρά απόβλητα αποτελούν µία από τις σηµαντικότερες οδούς µεταφοράς τους στο περιβάλλον (Ashtona et al., 2004; Becker et al., 2008). Η µελέτη της παρουσίας και της τύχης των ενώσεων αυτών στο περιβάλλον, συνδέεται άµεσα µε τις πηγές από τις οποίες προέρχονται και τις οδούς που ακολουθούν στην συνέχεια (σχήµα 1). Μετά την κατανάλωση, οι συγκεκριµένες ουσίες µεταβολίζονται µερικώς και αποµακρύνονται από τον ανθρώπινο οργανισµό µε τα ούρα και τα περιττώµατα ως αρχικές ενώσεις ή ως µεταβολίτες. Ως αποτέλεσµα, τα υπολείµµατα των συγκεκριµένων ενώσεων να καταλήγουν στις Μονάδες Επεξεργασίας Υγρών Αστικών Αποβλήτων και στη συνέχεια στο υδατικό περιβάλλον (επιφανειακά, υπόγεια και θαλάσσια ύδατα) λόγω ατελούς αποµάκρυνσής τους κατά την επεξεργασία (Van Nuijs et al., 2011; Zuccato et al., 2009; Zuccato et al., 2008). Υπάρχει και η περίπτωση ωστόσο της άµεσης διάθεσης αυτών, δηλαδή άµεση εναπόθεση των ουσιών αυτών χωρίς να έχουν χρησιµοποιηθεί, όπως για παράδειγµα η ταφή απορριµµάτων ή η αλόγιστη χρήση φαρµάκων στη γεωργία. Σχήµα 1: Πηγές και ροές φαρµακευτικών ουσιών (εικόνα από εργαστήριο µηχανικής περιβάλλοντος ΓΑΙΑ, Φαρµακευτικές Ουσίες σε αστικά λύµατα ) 3

Οι διεργασίες τελικά που µας αφορούν άµεσα στην περίπτωση των οργανικών ενώσεων που θα µελετήσουµε στην παρούσα εργασία, είναι εκείνες της δευτεροβάθµιας επεξεργασίας των λυµάτων οι οποίες λαµβάνουν χώρα σε κάθε αερόβιο βιολογικό καθαρισµό και οδηγούν τελικά στη βιολογική σταθεροποίηση ή οξείδωση της οργανικής ύλης (ρύποι) των αποβλήτων. Οργανικό απόβλητο + Ενέργεια + Βιομάζα Μικροορανισμοί Παραγωγή Νέας Κυτταρικής Βιομάζας + Τελικά Προϊόντα + Βιοδιασπώμενα Συστατικά Λόγω των φυσικοχηµικών ιδιοτήτων των ενώσεων αυτών αλλά και της µη αποτελεσµατικής επεξεργασίας κατά την δεύτερη φάση επεξεργασίας των λυµάτων είναι δυνατόν να ανιχνεύσουµε κατάλοιπα των ουσιών αυτών στα υγρά επεξεργασµένα απόβλητα (ως τελικά προϊόντα ή µη βιοδιασπώµενα συστατικά), και µερικές φορές στα επιφανειακά ύδατα. Παρά το γεγονός ότι οι συγκεκριµένες ουσίες ανιχνεύονται σε χαµηλές συγκεντρώσεις (µg L -1 ή ng L -1 ), πολλές από αυτές παρουσιάζουν σηµαντικό ενδιαφέρον εξαιτίας των τοξικολογικών (πρόκληση ενδοκρινικών διαταραχών σε οργανισµούς, τάση για βιοσυσσώρευση, βιοµεγέθυνση) και χηµικών τους χαρακτηριστικών (ανθεκτικότητα, σχηµατισµός τοξικότερων µεταβολιτών) (Birkett and Lester, 2003). Συµπερασµατικά η παρακολούθησή τους στα εισερχόµενα και εξερχόµενα υγρά απόβλητα είναι αναγκαία ώστε να µελετηθεί η παρουσία τους, η συµπεριφορά τους και η τύχη τους στο περιβάλλον (Yu et al., 2011; Shao et al., 2009; Salgado et al., 2010). Περιβαλλοντικές επιπτώσεις από την µη αποµάκρυνση των ουσιών κατά την επεξεργασία αποβλήτων Η εµφάνιση των ενώσεων αυτών έχει αναφερθεί σε όλο τον κόσµο σε µια σειρά από υδάτινα περιβάλλοντα, όπως λίµνες, ποτάµια, λεκάνες απορροής γλυκού νερο, εκβολές ποταµών, δεξαµενές και τα θαλάσσια ύδατα και παρά τις µικρές συγκεντρώσεις που συναντώνται, οι επιπτώσεις αυτών στο περιβάλλον και στην ανθρώπινη υγεία, λόγο έκθεσης, δεν µπορούν να αποκλειστούν από την στιγµή που αυτά είναι σχεδιασµένα να έχουν κάποια βιολογική δράση. Ουσίες όπως η κοκαΐνη, η µορφίνη, οι διάφορες αµφεταµίνες όπως το ecstasy (ΜDΜΑ) έχουν ισχυρές φαρµακολογικές δράσεις και η παρουσία τους ως µίγµατα στα επιφανειακά νερά ενδέχεται να προκαλεί τοξικές επιπτώσεις στους υδρόβιους οργανισµούς, ωστόσο αυτές θα είναι χρόνιες παρά άµεσες (Zuccato et al., 2009). Οι φυσικοχηµικές ιδιότητες ορισµένων από αυτές τις ουσίες (π.χ. τιµές logk ow > 5 για ορισµένα κανναβινοειδή) συντελούν επίσης στη συσσώρευση τους στα ιζήµατα και στους οργανισµούς (Chiou, 2002). Οι συγκεντρώσεις των συγκεκριµένων ουσιών στα εισερχόµενα λύµατα συνήθως φθάνουν τα µερικά µg L -1 (Metcalfe et al., 2010) ενώ στα επεξεργασµένα απόβλητα και στα επιφανειακά νερά τα µερικές δεκάδες ng L -1 (Postigo et al., 2010). Η αποµάκρυνσή τους κατά τη δευτεροβάθµια επεξεργασία φαίνεται να κυµαίνεται µεταξύ 45% και 95% ανάλογα µε το είδος της ουσίας (Postigo et al., 2010), ωστόσο υπάρχουν αντικρουόµενα αποτελέσµατα στη βιβλιογραφία. Η carbamazepine και η fluoxetine έχουν εντοπιστεί σε ορισµένα δείγµατα από ποταµούς της Μαδρίτης, ενώ η venlafaxine έχει εντοπιστεί σε όλα τα δείγµατα των ποταµών (Gonzalez Alonso et al., 2010). Υπάρχει επίσης και η πληροφορία για βιοσυσσώρευση της fluoxetine, της sertraline και των µεταβολιτών τους 4

(νευροδραστικές ουσίες), όταν ανιχνεύτηκαν σε επίπεδα άνω των 0,1 ng/g σε όλους τους ιστούς ψαριών που έπλεαν σε ρεύµατα που υπήρχαν αστικά λύµατα στην Αµερική (Brooks et al., 2005). Στην Ισπανία παρατηρήθηκε ακόµα η παρουσία των ενώσεων αυτών και σε πόσιµο νερό (Huerta-Fontela et al., 2008). Αντίστοιχες περιπτώσεις συναντάµε και για τις φαρµακευτικές ουσίες. Για παράδειγµα πρόσφατες µελέτες έδειξαν την µεγάλη παρουσία ορµονών (οιστρογόνων) στο αστικό τµήµα του ποταµού Pearl (συνδέεται απευθείας µε την θάλασσα της Νότιας Κίνας) στη µεγαλύτερη πόλη του Δέλτα το Guangzhou (Yu et al., 2011). Στον Καναδά µελέτη σε υγρά απόβλητα από 8 µονάδες επεξεργασίας λυµάτων που βρίσκονται σε πέντε διαφορετικές πόλεις οδήγησε στον εντοπισµό 31 αντιµικροβιακών ουσιών που ανήκουν στις κατηγορίες των µακρολίδων, τετρακυκλινών, κινολονών, quinoxaline dioxide και σουλφοναµίδων (Miao et al.,2004). Πειραµατικό µέρος Σκοπός της παρούσας εργασίας είναι ο προσδιορισµός φαρµακευτικών ουσιών και ψυχοτρόπων ή µη φαρµάκων, καθώς και παρανόµως διακινούµενων εξαρτησιογόνων ουσιών και των µεταβολιτών τους σε θαλασσινό δείγµα νερού από τον Σαρωνικό κόλπο. Η τεχνική που εφαρµόστηκε για τον ταυτόχρονο προσδιορισµό όλων αυτών των ενώσεων ήταν µε υγροχρωµατογραφία-φασµατοµετρία µαζών, τεχνολογίας τριπλού τετραπόλου (LC-MS/MS) µε πηγή σε θετικό και αρνητικό ηλεκτροψεκασµό. Η υγροχρωµατογραφία συζευγµένη µε φασµατοµετρία µαζών (LC-MS/MS) σε σειρά είναι η πλέον χρησιµοποιούµενη τεχνική για τον προσδιορισµό φαρµακευτικών ουσιών, ψυχοτρόπων ή µη φαρµακευτικών, καθώς και παρανόµως διακινούµενων εξαρτησιογόνων ουσιών και των µεταβολιτών τους στο υδατικό περιβάλλον λόγω της ευαισθησίας, της ειδικότητας και της εκλεκτικότητας που παρουσιάζει. Για το στάδιο της προετοιµασίας του δείγµατος πριν την εισαγωγή του στο LC-MS/MS ακολουθήθηκε η τεχνική εκχύλισης στερεάς φάσης (Solid Phase Extraction, SPE). Δειγµατοληψία Πραγµατοποιήθηκαν δειγµατοληψίες, λυµάτων (έξοδος Δεξαµενών Δευτεροβάθµιας Καθίζησης, ΚΕΛ Ψυτάλλειας) για µία µέρα του Μαρτίου και συγκεκριµένα Σάββατο 9/3/2013 οπού πιθανόν να έχουµε αύξηση των εξαρτησιογόνων ουσιών (έξοδοι, διασκέδαση σε νυχτερινά κέντρα, ελεύθερος χρόνος) και θαλασσινού νερού από τον Σαρωνικό Κόλπο, σηµείο S7 στον χάρτη, χρησιµοποιώντας τις ωκεανογραφικές µπουκάλες Niskin. Τα δείγµατα υγρών αποβλήτων ήταν σύνθετα δείγµατα 24ώρου και λήφθηκαν µε αυτόµατο δειγµατολήπτη. Μετά τη δειγµατοληψία, τα δείγµατα, όγκου 1,5 και 3 L, µεταφέρθηκαν άµεσα στο Εργαστήριο Αναλυτικής Χηµείας του Πανεπιστηµίου Αθηνών υπό συνθήκες ψύξης και αποθηκεύτηκαν σε ψυγεία (4 ο C). Σχήµα 2: Χάρτης της περιοχής της Ψυτάλλειας, του Πειραιά και του σταθµού που έγινε η δειγµατοληψία του θαλασσινού νερού 5

Σύζευξη της υγροχρωµατογραφίας (HPLC) µε τη φασµατοµετρία µαζών (LC-MS) και εκχύλιση στερεάς φάσης (SPE) Η υγροχρωµατογραφία υψηλής απόδοσης (High-Performance Liquid Chromatography, HPLC) είναι µια από τις πολλές χρωµατογραφικές τεχνικές για το διαχωρισµό και την ανάλυση των χηµικών µειγµάτων. Η χρησιµοποιούµενη κινητή φάση είναι υγρή, ενώ η στατική φάση είναι στερεή. Ο διαχωρισµός ενός µίγµατος ουσιών βασίζεται στη διαφορετική αλληλεπίδραση του κάθε συστατικού µε την κινητή και τη στατική φάση, µε συνέπεια να απαιτείται διαφορετικός χρόνος για την έκλουση κάθε ουσίας από τη στήλη. Το χρωµατογράφηµα που λαµβάνουµε µετά την ανάλυση είναι χρήσιµο τόσο για ποιοτική όσο και για ποσοτική ανάλυση. Οι θέσεις των κορυφών ως προς τον άξονα του χρόνου εξυπηρετούν στην ταυτοποίηση των συστατικών του δείγµατος και το εµβαδόν της επιφάνειας ή το ύψος της κορυφής (που είναι ανάλογα µε τη συγκέντρωση ή τη µάζα της ουσίας) αποτελεί ποσοτικό µέτρο κάθε συστατικού. Η HPLC σε συνδυασµό µε το MS αποτελούν ένα ιδανικό εργαλείο ανάλυσης. Ο συνδυασµός της HPLC µε το MS επιτρέπει αρχικά τον διαχωρισµό των ουσιών µεταξύ τους βάσει του χρόνου ανάσχεσης και έπειτα την ταυτοποίησή τους (m/z), καθώς αυτές εισέρχονται διαχωρισµένες στο MS (Skoog et al., 2007). Η εκχύλιση στερεάς φάσεως (solid phase extraction) αποτελεί µια τεχνική προετοιµασίας ενός δείγµατος. Βασίζεται στην επιλεκτική προσρόφηση των ουσιών πάνω σε ειδικό στερεό υλικό, οι οποίες εν συνεχεία επανακτόνται µε την βοήθεια κατάλληλων διαλυτών (Κουππάρης, Τεχνικές Διαχωρισµού, 2008). Εργαστηριακός Εξοπλισµός, Αντιδραστήρια και Πρότυπες ουσίες Το σύστηµα υγρoχρωµατογραφίας διαδοχικό µε φασµατοµετρία µαζών ως σύστηµα ανίχνευσης που χρησιµοποιήθηκε ήταν της Thermo Scientific µαζί µε αυτό ήταν συνδεδεµένος και ένας ηλεκτρονικός υπολογιστής Dual Core της Dell (Λογισµικό καταγραφής και διαχείρισης δεδοµένων: Xcalibur Data System (2.1.0 SR1.1160), LCQuan 2.6.1, XReport 1.0)) µε τα απαραίτητα λογισµικά για την επεξεργασία των αποτελεσµάτων. Ο χρωµατογραφικός διαχωρισµός της µεθόδου έγινε σε αναλυτική στήλη Atlantis T3 (C18, αντίστροφης φάσης), (Waters) διαστάσεων 100 x 2,1 mm και µέγεθος σωµατιδίων 3,0 µm, παρουσία προστατευτικής στήλης C18 (phenomenex, USA) διαµέτρου 4 mm και µήκους 20 mm. Στον εργαστηριακό εξοπλισµό που χρησιµοποιήθηκε περιλαµβάνονται: 1. συσκευή διήθησης διαλυτών κινητής φάσης (Millipore, XX 15.04705), 2. συσκευή παραγωγής υπερκαθαρού νερού ειδικής αντίστασης 18,2 ΜΩ/cm (Millipore Direct-Q UV), αναδευτήρα περιδίνησης (Vortex-Velp Scientifica), 3. συσκευή για εκχύλιση στερεάς φάσης (Vac Elut SPS 24), 4. πεχάµετρο (MQ30d, HACH) και 5. θερµαινόµενη πλάκα µε υποδοχείς δοκιµαστικών σωλήνων αερίου αζώτου. 6. ογκοµετρικές φιάλες των 5, 10, 50, 100, 250 και 500 ml, 7. ογκοµετρικοί κύλινδροι των 10, 50 και των 100 ml, 8. πλαστικοί φυγοκεντρικοί σωλήνες µε πώµατα των 50 ml (SARSTEDT) 9. γυάλινες και πλαστικές πιπέττες Pasteur, 10. δοκιµαστικοί σωλήνες των 10 ml, 11. αυτόµατες πιπέττες µεταβλητού όγκου 1-10 µl, 10-100 µl και 100-1000 µl, 6

12. Τα δείγµατα για την ανάλυση στο φασµατόµετρο µαζών τοποθετήθηκαν σε γυάλινα φιαλίδια αυτόµατου δειγµατολήπτη (vials) των 1,5 ml χρησιµοποιώντας και κατάλληλους υποδοχείς των 150 µl (Waters). 13. Στον εργαστηριακό εξοπλισµό περιλαµβάνονται επίσης, φίλτρα σύριγγας 4 mm µε µέγεθος πόρων 0,2 µm (Phenomenex) και φίλτρα διήθησης υγρών αποβλήτων (µέγεθος πόρων: 0,7 µm, Millipore GLASS FIBRE). Οι διαλύτες που χρησιµοποιήθηκαν ήταν ακετονιτρίλιο (Fisher), µεθανόλη (Merck), καθώς και υπερκάθαρο νερό (18,2 ΜΩ/cm). Επίσης, παρασκευάστηκαν και χρησιµοποιήθηκαν: διάλυµα µυρµηκικού οξέος 0,05 % (v/v) από µυρµηκικό οξύ καθαρότητας 98% (HPLC-grade) από την Sigma Aldrich (Fluka, Germany), διάλυµα υδροχλωρίου 1Μ από πυκνό 37% από την Merck (Darmstadt, Germany), διάλυµα EDTA 5% (w/v) από την Quimica SA. Χρησιµοποιήθηκαν ακόµα πρότυπες ουσίες υψηλής καθαρότητας για καθεµία από τις ενώσεις και παρασκευαστήκαν πρότυπα διαλύµατα. Πειραµατική διαδικασία Η SPE διαδικασία για το Strata-Χ (200 mg / 6 ml) της Phenomenex (USA). ελήφθη από την εργασία του Gros et al. 2009 όµως έγιναν τροποποιήσεις στην µέθοδο. Σχήµα 3: Πειραµατική πορεία Αποτελέσµατα Η ποσοτικοποίηση των ενώσεων στα δείγµατα έγινε µε την µέθοδο γνωστής προσθήκης. Στον πίνακα 1 φαίνονται οι τιµές των συγκεντρώσεων για κάθε µία ένωση σε ένα δείγµα εξερχοµένου λύµατος ηµέρας Σάββατο και σε ένα δείγµα θαλασσινού νερού. Ακόµα λαµβάνοντας υπόψη τις παροχές επεξεργασµένων υγρών αποβλήτων του ΚΕΛ Ψυτάλλειας για την ηµέρα που έγινε δειγµατοληψία (και τις συγκεντρώσεις των ουσιών που ανιχνεύτηκαν στα επεξεργασµένα υγρά απόβλητα, υπολογίστηκαν οι µέσες ποσότητες των αναδυόµενων ρύπων που µέσω των επεξεργασµένων αποβλήτων καταλήγουν ηµερησίως στο υδατικό περιβάλλον (Σχήµα 4). Επίλογος συµπεράσµατα Από τις ψυχοτρόπες ουσίες, οι ενώσεις που φαίνεται να αποβάλλονται σε µεγαλύτερες ποσότητες µέσω των επεξεργασµένων λυµάτων είναι το βαλπροϊκό οξύ, η 7

εφεδρίνη, η καρβαµαζεπίνη και η τοπιραµάτη µε µέσες ηµερήσιες µάζες που ισούνται µε 1,58 Κg/day, 0,78 Κg/day, 0,54 Κg/day και 0,52 Κg/day, αντίστοιχα. Από τις υπόλοιπες ουσίες, σε µέσες ηµερήσιες ποσότητες µεγαλύτερες των 100 g/day. Από τις φαρµακευτικές ουσίες στην κορυφή βρίσκονται το σαλικυλικό οξύ (µεγάλη η χρήση του σε δερµατολογικά φάρµακα, αντιµυκητιασικά, αντιφλεγµονώδη) και η βαλσαρτάνη (µεγάλη χρήση σε φάρµακα για τις παθήσεις του κυκλοφοριακού συστήµατος, αντιυπερτασικό), µε 5,01 Κg/day και 3,39 Κg/day, αντίστοιχα. Οι υψηλές συγκεντρώσεις αυτές σίγουρα οφείλονται στη µη αποτελεσµατική πρωτοβάθµια και δευτεροβάθµια επεξεργασία των λυµάτων, παρόλα αυτά δεν είναι και ο µοναδικός λόγος αφού αυτό παρατηρείται συστηµατικά στις φαρµακευτικές ενώσεις είναι που σχηµατίζουν ισχυρά γλουκορουνίδια, τα οποία υδρολύονται στη συνέχεια κατά την επεξεργασία λυµάτων και έτσι απελευθερώνουν την αρχική δραστική ουσία στα επεξεργασµένα λύµατα. Επίσης µια άλλη προαναφερθείσα παράµετρος είναι και η απευθείας αποµάκρυνση άθικτων σκευασµάτων στο περιβάλλον. Σχήµα 4: Ηµερήσια φορτία (9/3/2013) των υπό µελέτη ενώσεων στα επεξεργασµένα λύµατα που καταλήγουν στο υδάτινο περιβάλλον, (>100 g/ηµέρα). g/ημέρα 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 Φορτία ενώσεων g/ηµέρα Σαλικυλικό οξύ Βαλσαρτάνη Μεφαιναμικό οξύ Βαλπροϊκό οξύ Φουροσεμίδη Ιβουπροφαίνη Εφεδρίνη Θεοφυλλίνη Καρβαμαζεπίνη Τοπιραμάτη Τραμαδόλη Υδροχλωροθειαζίδη Ναπροξένη Σιπροφλοξασίνη Ατενολόλη Μετοπρολόλη Καφεΐνη Βενλαφαξίνη Λαμοτριγίνη Παρακεταμόλη Λιδοκαΐνη Γεμφιβροζίλη Νιφλουμικό οξύ Μεταβολίτης Σιταλοπράμη Μετρονιδαζόλη Δικλοφαινάκη Κωδεΐνη Πίνακας 1: Συγκεντρώσεις των υπό µελέτη ενώσεων την ηµέρα Σάββατο 9/3/2013, σε επεξεργασµένα λύµατα του ΚΕΛ Ψυτάλλειας. Κατηγορία Ουσία Εξερχόµενα λύµατα (ng/l) Θαλασσινό νερό (ng/l) Κατηγορία Ουσία Εξερχόµενα λύµατα (ng/l) Θαλασσινό νερό (ng/l) Οπιοειδή /Οπιούχα Διεγερτικά (κοκαΐνη και κύριος µεταβολίτης) Μεταβολίτης της κάνναβης Βενζοδιαζεπίνη (ηρεµιστικά) Μορφίνη 3,9 0,28 Κωδεΐνη 125 Δικλοφαινάκη 219 1,43 Κετοπροφαίνη 88,3 1,05 Κοκαΐνη 5,8 0,11 Νιφλουµικό οξύ 267 0,62 Βενζοϋλοεκγονίνη 35,8 0,09 NSAIDs-ΜΣΑΦ Ιβουπροφαίνη 1095 7,11 Μεταβολίτης Κανναβης (THCA) Λοραζεπάµη 77,6 241 5,98 Μεφαιναµικό οξύ 2373 Ναπροξένη 580 Αναισθητικά Λιδοκαΐνη 296 0,81 Σαλικυλικό οξύ 6129 50,4 Αντιεπιληπτικά Καρβαµαζεπίνη 663 1,18 Λαµοτριγίνη 329 Αντιυπερτασικά Ατενολόλη 456 1,08 Προπανολόλη 51,1 8

SSRIs (Αναστολείς Επαναπρόσληψης Σεροτονίνης) SNRIs (Αναστολείς Επαναπρόσληψης Σεροτονίνης- Νορεπινεφρίνης) Τοπιραµάτη 637 Μετοπρολόλη 428 Βαλπροϊκό οξύ 1932 55,4 Βαλσαρτάνη 4149 4,10 Σιταλοπράµη 234 0,48 Βενλαφαξίνη 368 3,78 Συµπαθοµιµητικά Εφεδρίνη 964 Διουρητικά Αντιβιοτικά (φθοροκινολόνη) Αντιβιοτικά (µύκητες και αναερόβια βακτήρια) Αναλγητικά (αλκαλοειδές ξανθίνης) Σιπροφλοξασίνη 519 3,62 Μετρονιδαζόλη 225 0,09 Καφεΐνη 386 50,7 Φουροσεµίδη 1121 2,9 Αναλγητικό Παρακεταµόλη 324 47,0 Υδροχλωροθειαζίδη 618 Βρογχοδιασταλτικό Θεοφυλλίνη 847 5,37 Βιβλιογραφικές αναφορές Αναλγητικά (οποιοειδές) Ρυθµιστικός παράγοντας των λιπιδίων Τραµαδόλη 624 0,69 Γεµφιβροζίλη 280 Petrisor I. G., Lazar I., (2006), Emerging Contaminants The Problem, Examples and Bioremediation Alternatives Part I, Roumanian Biotechnological Letters, 11, 3, 2693-2701. Tchobanoglous G., Burton F. L., Stensel H. D., (2002), Wastewater Engineering: Treatment and Reuse, 4th ed., Mc Graw-Hill Science Engineering. Schwarzenbach R. P., Escher B. I., Fenner K., Hofstetter T. B., Johnson C. A., Von Gunten U., Wehrli B., (2006), The challenge of micropollutants in aquatic systems, Science 25, 1072-1077. Kolpin D., Furlong E., Meyer M., Thurman E. M. l., Zaugg St., (2002), Pharmaceuticals, hormones and other organic wastewater contaminants in U.S. Streams, 1999 2000: A National Reconnaissance, Environmental Science & Technology, 36, 1202-1211. Loos R., Gawlik B. M., Locoro G., Rimaviciute E., Contini S., Bidoglio G., (2009), EUwide survey of polar organic persistent pollutants in European river waters. Environmental Pollution, 157, 561-568. Ashton D., Hilton M., Thomas K. V., (2004), Investigating the environmental transport of human pharmaceuticals to streams in the United Kingdom, Science of the Total Environment, 333, 167-184. Becker A. M., Gerstmann S., Frank H., (2008), Perfluoroctane surfactants in waste waters, the major source of river pollution, Chemosphere 72, 115-121. Birkett J. W., Lester J. N., (2003), Endocrine disruptοrs in wastewater and sludge treatment processes, CRC Press LLC, Lewis Pub. 9

Castiglioni S., Zuccato E., Fanelli R., eds. (2011), ILLICIT DRUGS IN THE ENVIRONMENT, Occurrence, analysis and the fate using mass spectrometry, Willey. Van Nuijs A. L. N., Mougel J. F., Taracomnicu I., Bervoets L., Blust R., Jorens Ph. G., Neels H., Covaci A., (2011), A one year investigation of the occurrence of illicit drugs in wastewater from Brussels, Belgium, Journal of Environmental Monitoring, 13, 1008-1016. Zuccato E., Castiglioni S., (2009), Philosophical Transactions of the Royal Society A: Mathematical, Physical and Engineering Sciences 367, 3965-3978. Zuccato E., Castiglioni S., Bagnati R., Chiabrando Ch., Grassi P., Fanelli R., (2008), Illicit drugs, a novel group of environmental contaminants, Water Research, 42, 961-968. Yu Y., Huang Q., Wang Z., Zhang K., Tang C., Cui J., Fenga J., Peng X., (2011), Occurrence and behaviour of pharmaceuticals, steroid hormones, and endocrinedisrupting personal care products in wastewater and the recipient river water of the Pearl River Delta, South China, Journal of Environmental Monitoring Cite, 13, 871. Salgado R., Noronha J. P., Oehmen A., Carvalho G., M. Reis M. A., (2010), Analysis of 65 pharmaceuticals and personal care products in 5 wastewater treatment plants in Portugal using a simplified analytical methodology, Water Science & Technology, 62 (12), 2862-2871. Εργαστήριο χανικής Περιβάλλοντος ΓΑΙΑ, Τµήµα Πολιτικών χανικών- χανικών Περιβάλλοντος, Φαρµακευτικές Ουσίες σε αστικά λύµατα. http://www.eng.ucy.ac.cy/gaia/files/leflets/info_pharmaceuticals.pdf (τελευταία επίσκεψη 15/10/2013). Daughton C. G., Whitacre D. M. (editor), (2011), Illicit Drugs: Contaminants in the Environment and Utility in Forensic Epidemiology, Reviews of Environmental Contamination and Toxicology, Springer Science and Business Media, LLC U.S. Environmental Protection Agency. Chiou C. T., (2002), Partition and adsorption of organic contaminants in environmental systems, John Wiley and Sons. Metcalfe C., Tindale K., Li H., Rodayan A., Yargeau V., (2010), Illicit drugs in Canadian municipal wastewater and estimates of community drug use, Environmental Pollution 158, 3179-3185. Postigo C., López de Alda M. J., Barceló D., (2010), Drugs of abuse and their metabolites in the Ebro River basin: Occurrence in sewage and surface water, sewage treatment plants removal efficiency, and collective drug usage estimation, Environment International 36, 75-84. 10

Gonzalez Alonso S., Catala M., Romo Maroto R., Gill J. L. R., De Miguel A. G., Valcarcel Y., (2010), Pollution by psychoactive pharmaceuticals in the Rivers of Madrid metropolitan area (Spain), Environment international, 36, 195-201. Brooks B. W., Chambliss C. K., Stanley J. K., Ramirez A., Banks K. E., Johnson R. D., Lewis R. J., (2005), Determination of select antidepressants in fish from an effluentdominated stream, Environmental Toxicology and Chemistry, 24 (2), 464-469. Huerta-Fontela M., Galceran M. T., Ventura F., (2008), Stimulatory drugs of abuse in surface waters and their removal in a conventional drinking water treatment plant, Environmental technology, 42, 6809-6816. Miao X.S., Bishay F., Chen M., Metcalfe C. D, (2004), Occurrence of Antimicrobials in the Final Effluents of Wastewater Treatment Plants in Canada, Environmental Science and Technology, 38, 3533-3541. http://www.aktor.gr/article.asp?catid=20042&subid=2&pubid=13245318 http://1lyk-karpen.eyr.sch.gr/biology/biological_cleaning.pdf Skoog D. A., Holler F. J., Nieman T. A., (2007), Αρχές της Ενόργανης Ανάλυσης, Μτφ: Μ. Ι. Καραγιάννης, Κ. Η. Ευσταθίου, Ν. Χανιωτάκης, Εκδόσεις Κωσταράκη. Μ. A. Κουππάρης, Τεχνικές Διαχωρισµού, Διαπανεπιστηµιακό Πρόγραµµα Μεταπτυχιακών Σπουδών: Χηµική Ανάλυση-Έλεγχος Ποιότητας, Αθήνα, 2008. Gros M., Petrovic M., Barcelo D., (2009), Tracing Pharmaceutical Residues of Different Therapeutic Classes in Environmental Waters by Using Liquid Chromatography/Quadrupole-Linear Ion Trap Mass Spectrometry and Automated Library Searching, Analytical Chemistry, 81, 898 912. 11