ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ ΤΡΟΦΙΜΩΝ

1 ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ ΤΡΟΦΙΜΩΝ Πέτρος Σ. Ταούκης Εθνικό Μετσόβιο Πολυτεχνείο, Σχολή Χηµικών Μηχανικών Εργαστήριο Χηµείας και Τεχνολογίας Τροφίµων 1 ιασφάλιση της Ποιότητας (quality) & Ασφάλειας (Safety) 2 Κλασσική φιλοσοφία έλεγχος του τελικού προϊόντος Κλασσικές Μικροβιολογικές Αναλύσεις 2

3 Οι κλασσικές τεχνικές µέτρησης (π.χ. Τρυβλία, πιο πιθανός αριθµός κτλ) του µικροβιακού πληθυσµού στα τρόφιµα είναι πολύ απλές. 3 4 Χρονοβόρα (Time consuming) Ετεροχρονισµένα αποτελέσµατα (Retrospective results), υνατότητα ελέγχου µικρού αριθµού δειγµάτων (Few samples) Περιορισµένη επαναληψιµότητα (Limited reproducibility), Όρια προσδιορισµού ανεπαρκή ιδιαίτερα για τους παθογόνους (Detection limits e.g. insufficient for the reliable detection of low levels of organisms) 4

5 Πολλές φορές σε πολλά είδη τροφίµων (π.χ. Αποστειρωµένο γάλα) η ύπαρξηενόςκαιµόνο κυττάρου είναι ικανή να προκαλέσει µικροβιολογικά προβλήµατα (αλλοιώσεις ή ανάπτυξη παθογόνων) Οι κλασσικές µικροβιολογικές αναλύσεις αδυνατούν να µας πληροφορήσουν επαρκώς την κατάλληλη χρονική στιγµή για να αντιµετωπίσουµε το γεγονός 5 ιασφάλιση της Ποιότητας (quality) & Ασφάλειας (Safety) Κλασσική φιλοσοφία έλεγχος του τελικού προϊόντος Κλασσικές Μικροβιολογικές Αναλύσεις Ν έ ε ς Π ρ ο σ ε γ γ ί σ ε ι ς 6 6

7 Ταχείες µικροβιολογικές µέθοδοι Τα τελευταία 20 χρόνια, η µεγαλύτερη προσπάθεια έχει συγκεντρωθεί στην εξέλιξη ταχέων µικροβιολογικών µεθόδων για τον έλεγχο των τελικών προϊόντων, των συστατικών, του εξοπλισµού και του περιβάλλοντος κατά την διαδικασία παραγωγής. Οι ταχείες µικροβιολογικές µέθοδοι βασίζονται σε ενόργανες και βιοτεχνολογικές µεθόδους. Οι µέθοδοι αυτές διευκολύνουν σηµαντικά ελέγχους ρουτίνας, αλλά απαιτούν σηµαντικά αυξηµένη ευαισθησία της µεθοδολογίας, η οποίασυχνάσυγκρούεταιµε την απαιτούµενη ταχύτητα. Ένας αναλυτής αναζητά τουλάχιστον πέντε στοιχεία στις µεθόδους που αποσκοπούν στην εκτίµηση της µικροβιολογικής ακεραιότητας δειγµάτων τελικών προϊόντων ή της συµµόρφωσης των δειγµάτων γραµµής µε κάποια πρότυπα υγιεινής. Τα στοιχεία αυτά είναι: (1) ευκολία, (2) ταχύτητα, (3) αξιοπιστία, (4) πραγµατικές εγγυήσεις για την αποφυγή λαθών και (5) µηχανοποίηση ή και αυτοµατοποίηση. 7 Ταχείες µικροβιολογικές µέθοδοι Μέθοδοι χαρακτηρισµού/αναγνώρισης 8 Αλυσιδωτή Αντίδραση της Πολυµεράσης (PCR): Βασίζεται στην παρουσία πολλαπλών αντιγράφων ορισµένων ακολουθιών νουκλεοτιδίων του χρωµοσώµατος. Η αντίδραση PCR ενισχύει µια συγκεκριµένη ακολουθία-στόχο του χρωµοσώµατος, τα δύο άκρα της οποίας ορίζονται από δύο µικρά τµήµατα DNA, που καλούνται primers, ένα για κάθε κλώνο. Επειδή η ακολουθία αυτή δεν είναι µοναδική µέσα στο χρωµόσωµα, η αντίδραση PCR ενισχύει όχι µόνο τη στενή ακολουθία-στόχο αλλά και ευρύτερες περιοχές. Με αυτό τον τρόπο παράγονται τεµάχια διαφορετικού µεγέθους, που διαχωρίζονται µε ηλεκτροφόρηση, δηµιουργώντας ένα αποτύπωµα πάνω σε ταινία, το οποίο είναι χαρακτηριστικό για κάθε στέλεχος. 8

Ταχείες µικροβιολογικές µέθοδοι Μέθοδοι χαρακτηρισµού/αναγνώρισης Ανιχνευτές DNA: Πρόκειται για µικρού µήκους επισηµασµένα τµήµατα DNA, τα οποία υβριδίζονται ή ζευγαρώνουν µε συµπληρωµατικές ακολουθίες DNA, που έχουν εξαχθεί από µικροβιακές καλλιέργειες των προς εξέταση δειγµάτων. Το ζευγάρωµα γίνεται όπως και στο δίκλωνο DNA. ΑνηακολουθίατωνβάσεωντουDNAανιχνευτή συµπληρώνει µια ειδική ακολουθία του µικροοργανισµού-στόχου, τότε ο ανιχνευτής προσδένεται µόνο µε το µικροοργανισµό αυτό. 9 9 Ταχείες µικροβιολογικές µέθοδοι Μέθοδοι χαρακτηρισµού/αναγνώρισης Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA): Η τεχνική περιλαµβάνει τη σύλληψη του αντιγόνου από ένα αντίσωµα, που βρίσκεται ακινητοποιηµένο πάνω σε στερεή µήτρα. Μετά το πλύσιµο για τον καθαρισµό των µη προσδεδεµένων υλικών, προστίθεται ένα δεύτερο αντίσωµα, που αναγνωρίζει ένα διαφορετικό τµήµα του συλληφθέντος αντιγόνου και αφήνεται να αντιδράσει µε το σύµπλεγµα αντισώµατοςαντιγόνου. Εάν το δεύτερο αντίσωµα είναιεπισηµασµένο µε ένα ένζυµο, το υπόστρωµα του ενζύµου προστίθεται µετά το ξέπλυµα της περίσσειας του δεύτερου αντισώµατος, που δεν έχει προσδεθεί, και ο αναλυτής παρατηρεί οπτικά το σχηµατισµό χρώµατος ή τον ποσοτικοποιεί φασµατοφωτοµετρικά. 10 10

11 Ταχείες µικροβιολογικές µέθοδοι Μέθοδοι χαρακτηρισµού/αναγνώρισης ELISA 11 Ταχείες µικροβιολογικές µέθοδοι Μέθοδοι απαρίθµησης 12 - Αλλαγές στην αντίσταση (ή την αγωγιµότητα ή το ηλεκτρικό φορτίο): Καθώς τα βακτήρια πολλαπλασιάζονται σε µία καλλιέργεια, οι µεταβολικές τους δραστηριότητες προκαλούν αλλαγές στη χηµική σύσταση του µέσου. Αυτές οι αλλαγές µπορούν να παρακολουθούνται συνεχώς, χρησιµοποιώντας ηλεκτρόδια για τη µέτρηση της αντίστασης που παρουσιάζεται σε ένα εναλλασσόµενο ρεύµα πουεφαρµόζεται στο µέσο. Ο χρόνοςπου απαιτείται για µια ανάλυση ποικίλλει ανάλογα µε τον αρχικό αριθµό των µικροοργανισµών στο δείγµα. Όσο περισσότεροι µικροοργανισµοί παρευρίσκονται στο εξεταζόµενο δείγµα, τόσο µικρότερος είναι ο χρόνος που χρειάζεται για να σηµειωθούν ανιχνεύσιµες µεταβολές. 12

13 Η αγωγιµοµετρία (Impedimetric method) αναγνωρίζεται ως µία πολλά υποσχόµενη εναλλακτική µέθοδος για την ταχεία καταµέτρηση του µικροβιακού πληθυσµού στα τρόφιµα. Bactometer (biomjrieu, UK Ltd), BacTrac (Sy-lab, Vertriesbsges.mbH, Austria), Malthus (Malthus Instrument Ltd, UK) and Rabit (Don Whitley Scientific Ltd, UK) 13 14 14

15 RABIT MALTHUS 15 16 16

17 Η δραστηριότητα των µ/ων έχει ως αποτέλεσµα τηνδιάσπαση ενώσεων µεγάλου µοριακού βάρους (ΜΒ) (π.χ πρωτείνες, σάκχαρα) σε µικρού ΜΒ ενώσεις (π.χαµινοξέα οργανικά οξέα κτλ). Η διαδικασία αυτή επιδρά στην αύξηση των ιόντων στο υπόστρωµα ανάπτυξης και µεταβάλει την αγωγιµότητα του, σηµαντικά 17 18 (1) Viable counts (2) Impedance µs Detection time Slope ma. dµs/dt Time Ηανάπτυξητωνµικρο/σµων στο µέσο ανάπτυξης καταγράφεται κάθε 6 min. Ως χρόνος επισήµανσης (detection time) αναφέρεται ο χρόνος που απαιτείται για να αλλάξει καθοριστικά η αγωγιµότητα του µέσου. 18

Έχει χρησιµοποιηθεί για το προσδιορισµό Total Viable Count, specific spoilage bacteria e.g. P. phosphereum, pseudomonads, µικρ/σµοί δείκτες (π.χ, Enterobacteriaceae, coliforms, Esch. coli, Enterococci), 19 19 20 Enumeration Enterobacter sakazakii I N I T I A L 20

21 Enumeration Serratia marcenscens 21 Έχει χρησιµοποιηθεί για το προσδιορισµό Παθογόνων Salmonella spp., Listeria spp., Campylobacter spp., clostridia) καθαρών καλλιεργειών e.g. lactic acid bacteria starter cultures (Silley and Forsythe 1996) 22 22

Ταχείες µικροβιολογικές µέθοδοι Μέθοδοι απαρίθµησης 23 ΑΤΡ-Bιοφωτεινότητα (ΑΤΡ-Bioluminescence): Η µέθοδος αυτή βασίζεται στο γεγονός ότι όλοι οι ζωντανοί οργανισµοί περιέχουν τριφωσφορική αδενοσίνη (ΑΤΡ), η οποία αποτελεί την πηγή ενέργειας όλων των µεταβολικών δράσεων. Παρουσία ΑΤΡ, το οργανικό συστατικό λουσιφερίνη οξειδώνεται σε οξυλουσιφερίνη, εκπέµποντας φωτόνια ως ένα από τα προϊόντα της αντίδρασης. Το ένζυµο που συµµετέχει είναι η λουσιφεράση. Οι αντιδράσεις του παραπάνω ενζύµου είναι ταχείες, ολοκληρώνονται µέσα σε λίγα λεπτά και ποσοτικοποιώντας µε ένα φωτόµετρο το ποσό των εκπεµπόµενων φωτονίων είναι δυνατόν να υπολογιστεί ο αριθµός των βακτηριακών κυττάρων στο δείγµα. 23 Ταχείες µικροβιολογικές µέθοδοι Μέθοδοι απαρίθµησης 24 Τεχνική του άµεσα επιφθορίζοντος φίλτρου (Direct Epifluorescent Filter Technique -DEFT): Κατά τη µέθοδο αυτή, το προς εξέταση δείγµα υφίσταται µια προκατεργασία, ώστε να µπορεί να φιλτραριστεί. Στη συνέχεια, το δείγµα φιλτράρεται πάνω σε πολυανθρακικές µεµβράνες, χρωµατίζεται µε τη φθορίζουσα χρωστική acridine orange, και εξετάζεται µε µικροσκόπιο φθορισµού. Η ακριδίνη, όταν προσδένεται µε DNA -κυρίαρχη αντίδραση στα νεκρά κύτταραεκπέµπει πράσινο φθορισµό, ενώ όταν προσδένεται µε RNA, το οποίο αφθονεί στα ζωντανά κύτταρα, φθορίζει πορτοκαλί χρώµα. Ο αριθµός των ζωντανών µικροοργανισµών προσδιορίζεται από τον αριθµό των πορτοκαλοκίτρινων κυττάρων που µετρούνται πάνω στο φίλτρο. 24

Ταχείες µικροβιολογικές µέθοδοι Μέθοδοι χαρακτηρισµού/αναγνώρισης Ανιχνευτές DNA: Πρόκειται για µικρού µήκους επισηµασµένα τµήµατα DNA, τα οποία υβριδίζονται ή ζευγαρώνουν µε συµπληρωµατικές ακολουθίες DNA, που έχουν εξαχθεί από µικροβιακές καλλιέργειες των προς εξέταση δειγµάτων. Το ζευγάρωµα γίνεται όπως και στο δίκλωνο DNA. ΑνηακολουθίατωνβάσεωντουDNAανιχνευτή συµπληρώνει µια ειδική ακολουθία του µικροοργανισµού-στόχου, τότε ο ανιχνευτής προσδένεται µόνο µε το µικροοργανισµό αυτό. 25 25 26 Γρήγορη καταµέτρηση Παθογόνων βακτηρίων Ειδικά µαγνητικά σφαιρίδια που προσκολλούνται σε συγκεκριµένα βακτήρια - στόχους ανοσοµαγνητικές Βακτήρια Προσθήκη ειδικών σφαιριδίων Επώαση προσκόλληση 2-3 min Μαγνητικός - ιαχωρισµός Προσδιορισµός/ καταµέτρηση 26

27 ΒΙΟΑΙΣΘΗΤΗΡΕΣ-Biosensors Βιολογικός ανιχνευτής είγµα Μεταγωγέας Όργανο Μέτρησης µύτη Οσφρητική µεµβράνη Νευρικό κυτταρο Εγκέφαλος Εφαρµογές: Κρέας ψάρι, (διαβήτης) 27 28 Συσχέτιση µεταξύ της συγκέντρωσης γαλακτικού & µυρµηκικού οξέος και της διάρκειας ζωής στο ράφι κουτσοµούρας (Red Mullet) συντηρήθηκε σε διάφορες θερµοκρασίες η τροποποιηµένες ατµόσφαιρες Lactic Acid (%area) 400 350 300 250 200 150 100 Air Formic Acid (%area) 3500 3000 2500 2000 1500 1000 0 o C 50 500 0 0 50 100 150 200 250 300 350 400 Time (h) 0 0 100 200 300 400 500 600 700 800 Time (h) 28

29 29 ΦΑΣΕΙΣ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ ΜΙΚΡΟΒΙΑΚΟΥ ΠΛΗΘΥΣΜΟΥ 30 Α.Φάση προσαρµογής ή λανθάνουσα lag phase B. Εκθετική φάση eponential phase Γ. Φάση στασιµότητας stationary phase. Φάση κάµψης decline phase ανώτερη ασύµπτωτη 11 9 διαφορά Log cfu/g κατώτερη ασύµπτωτη 7 4 2 1 log κύκλος=3,32 διπλασιασµοί Χρόνος για 3,32 διπλασιασµούς 0 0 5 10 15 20 25 30 Χρόνος Προσαρµογής TIME (h) 30

Συνθήκες ανάπτυξης των µικροβίων στα τρόφιµα 31 Οι διάφορες πηγές µόλυνσης των τροφίµων είναι οι εξής: 1) ο άνθρωπος, 2) το πεπτικό σύστηµα αγροτικώνζώων, 3) τα έντοµα (µύγες, κολεόπτερα), 4) τα τρωκτικά, 5) τα σπλάχνα και τα βράγχια θαλασσινών, 6) τα αστικά λύµατα, 7) η κοπριάτων ζώων, 8) η σκόνη, 9) το έδαφος, 10) το νερό. Η µόλυνση όµως του τροφίµου µε µικροργανισµούς δεν συνεπάγεται αναγκαστικά και την αλλοίωσή του. Για να αλλοιώσουν το τρόφιµο που έχουν µολύνει, θα πρέπει τα µικρόβια να αυξηθούν σε αριθµό (να πολλαπλασιαστούν). Για να είναι εφικτός όµως ο πολλαπλασιασµός των µικροβίων πρέπει να συντρέξουν ορισµένες προϋποθέσεις και να εξασφαλισθούν ορισµένες περιβαλλοντικές συνθήκες. 31 32 Γενικά οι παράγοντες που επηρεάζουν τον µεταβολισµόκαι κατ' επέκταση τον πολλαπλασιασµό τωνµικροβίων στα τρόφιµα διακρίνονταισε: α) ενδογενείς, που σχετίζονται µε τη σύσταση του τροφίµου (ph, Eh, aw, θρεπτικά συστατικά, αντιµικροβιακοί παράγοντες, ανταγωνιστική χλωρίδα) και β) εξωγενείς, που σχετίζονται µε τις συνθήκες συντήρησης (Τ, RH, P, P, P CO 2 O2 κ.τ.λ) Οι παράγοντες που προσδιορίζουν το ρυθµό πολλαπλασιασµού των µικροβιακών κυττάρων, βρίσκονται σε συνεχή µεταξύ τους αλληλεξάρτηση και αλληλεπίδραση. Έτσι, το τελικό αποτέλεσµα δεν εξαρτάται µόνο από την απόλυτη τιµή καθενός από τους υπεύθυνους για την ανάπτυξη των µικροβίων παράγοντες, αλλά και από τον βαθµό στον οποίο ο παράγοντας αυτός επηρεάζει ή επηρεάζεται από όλους τους άλλους. 32

33 Για κάθε παράγοντα που επηρεάζει τον πολλαπλασιασµό των κυττάρων οποιουδήποτε µικροβίου, έχουν προσδιορισθεί τρεις τιµές, η ελάχιστη(minimum), η άριστη(optimum) και η µέγιστη (maimum). 33 Παράγοντες που επηρεάζουν την ανάπτυξη, επιβίωση 34 Σε άριστες συνθήκες οι µικ/οί αναπτύσσονται ταχύτατα (ορισµένοι έχουν χρόνο γενεάς µικρότερο από 15-20 λεπτά) Οι µικ/οί µπορούν να αναπτυχθούν και σε συνθήκες εκτός των άριστων αλλά µε µεγαλύτερη φάση προσαρµογής και µικρότερο ρυθµό ανάπτυξης Σε παρεµποδιστικές συνθήκες οι µικ/οί µπορείαπλάναεπιβιώνουν Σε ακραία παρεµποδιστικές συνθήκες οι µικ/οί πεθαίνουν 34

Παράγοντες που επηρεάζουν την ανάπτυξη, επιβίωση 35 Συµπεριφορά της L. monocytogenes ως συνάρτηση του ph ph 7.0 ph 5.0 Log cfu/g ph 4.4 ph 3.5 Χρόνος (ηµέρες) 35 Παράγοντες που επηρεάζουν την ανάπτυξη, επιβίωση 36 εξωγενείς Ατµόσφαιρα (κενό, παρουσία άλλων αερίων) a w Αντιµικροβιακές ουσίες Μικροβιακές Αλληλεπιδράσεις ενδογενείς Θερµοκρασία οµή Μερική Πίεση Σχετική Υγρασία E h Θρεπτικά Συστατικά (Σύσταση) ph Πρόσθετα 36

Παράγοντες που επηρεάζουν την ανάπτυξη, επιβίωση 37 Επηρεάζει: Θερµοκρασία Το µέγεθος του κυττάρου Το µεταβολισµό Τιςαπαιτήσειςσεθρεπτικάσυστατικά Τις ενζυµικές αντιδράσεις Τη χηµική σύσταση του κυττάρου 37 Παράγοντες που επηρεάζουν την ανάπτυξη, επιβίωση 38 Θερµοκρασία Καθορίζει τη ανάπτυξη, επιβίωση και το θάνατο των µικ/ων Οι µικ/οί αναπτύσσονται σε θερµοκρασίες που το νερό βρίσκεται σε υγρή µορφή Σε συνθήκες ανάπτυξης η αύξηση της θερµοκρασίας συνεπάγεται µείωση της φάσης προσαρµογής και αύξηση του ρυθµού ανάπτυξης Σε συνθήκες θανάτου η αύξηση της θερµοκρασίας συνεπάγεται αύξηση του ρυθµού θανάτου 38

Παράγοντες που επηρεάζουν την ανάπτυξη, επιβίωση 39 Θερµοκρασία Κατάταξη των µικ/ών µε βάση την επίδραση την θερµοκρασίας Minimum Optimum Maimum Ψυχρόφιλα -5 µε +5 10-30 20-40 Υποχρεωτικά Ψυχρόφιλα -5 µε 0 10-20 20-22 Προαιρετικά Ψυχρόφιλα -5 µε +5 10-30 30-40 Ψυχρότροφα -5 µε +5 20-30 30-40 Μεσόφιλα +5 µε +15 30-40 40-50 Θερµόφιλα +40 µε +45 55-65 60-90 39 Παράγοντες που επηρεάζουν την ανάπτυξη, επιβίωση 40 Θερµοκρασία Ανάπτυξη του Clostridium botulinum τύπου A και B σε διάφορες θερµοκρασίες Θερµοκρασία ( o C) 12.5 15 17.5 20 25 30 37 42.5 45 Φ. προσαρµογής (h) ND 160 63 32 20 8 5 8 ND Χρόνος Γενεάς (h) 89 28 8 4 2 1 0.7 1 2 40

Παράγοντες που επηρεάζουν την ανάπτυξη, επιβίωση 41 Θερµοκρασία Επίδραση της θερµοκρασίας στο ρυθµό ανάπτυξης των µικ/ων Ρυθµός ανάπτυξης Ελάχιστη θερµοκρασία ανάπτυξης Άριστη θερµοκρασία ανάπτυξης Μέγιστη θερµοκρασία ανάπτυξης Θερµοκρασία ο C 41 Παράγοντες που επηρεάζουν την ανάπτυξη, επιβίωση Θερµοκρασία 42 42

Παράγοντες που επηρεάζουν την ανάπτυξη, επιβίωση 43 ph/οξύτητα Κάτω από ph 4.0 οι περισσότεροι µικ/οί δεν µπορούν να αναπτυχθούν Κάτω από ph 5.0 οι ζύµες και µύκητες κυριαρχούν των βακτηρίων Το ελάχιστο, µέγιστο και άριστο ph των µικ/ων εξαρτάται από τους υπόλοιπους περιβαλλοντικούς παράγοντες καθώς και το είδος του οξέος Τα περισσότερα τρόφιµα οφείλουν την οξύτητά τους σε ασθενή οργανικά οξέα πχ. γαλακτικό, οξικό, προπιονικό 43 Παράγοντες που επηρεάζουν την ανάπτυξη, επιβίωση 44 Ενεργότητα νερού/a w Ησηµασία του a w για του µικροοργανισµούς Το κυτταρόπλασµα είναι ένα υδατικό περιβάλλον στο οποίο εκτελούνται όλες οι µεταβολικές διεργασίες του κυττάρου. Μέσω της κυτταρικής µεµβράνης γίνεται συνεχής ανταλλαγή µορίων νερού µε το περιβάλλον (εισαγωγή θρεπτικών συστατικών και εξαγωγή «αποβλήτων» To νερό συµµετέχει σε µεγάλο αριθµό χηµικών αντιδράσεων ως µέσο, αντιδραστήριο ή προϊόν ιαλύει τις περισσότερες ουσίες από οποιοδήποτε άλλο διαλύτη 44

Παράγοντες που επηρεάζουν την ανάπτυξη, επιβίωση 45 Μεταβολή της Ενεργότητας νερού/a w Ισοτονικό Υποτονικό Υπερτονικό 45 Παράγοντες που επηρεάζουν την ανάπτυξη, επιβίωση 46 Μεταβολή της Ενεργότητας νερού/a w Πλασµόλυση: Συρίκνωση της µεµβράνης λόγω απώλειας νερού 46

Παράγοντες που επηρεάζουν την ανάπτυξη, επιβίωση 47 Ενεργότητα νερού/a w και Μικροοργανισµοί Ταχύτερη µικροβιακή ανάπτυξη: a w 0.995-0.980 a w των περισσοτέρων εργαστηριακών υποστρωµάτων: 0.999-0.990 Όσο το a w µειώνεται: Η φάση προσαρµογής αυξάνεται ορυθµός ανάπτυξης µειώνεται το µέγιστο επίπεδο του πληθυσµού µειώνεται Σε πολύ χαµηλά a w ηφάσηπροσαρµογήςγίνεταιάπειρηκαιηανάπτυξησταµατάει Οι περισσότεροι µικ/οί αναπτύσσονται σε a w >0.90 εν υπάρχει ανάπτυξη µικ/ών σε a w <0.60 47 Παράγοντες που επηρεάζουν την ανάπτυξη, επιβίωση 48 Ενεργότητα νερού/a w και Μικροοργανισµοί Οι µικ/οί που αναπτύσσονται σε χαµηλά a w ονοµάζονται: αλλόφιλοι, ξηρόφιλοι, ωσµόφιλοι Αλλόφιλοι: Κυρίως βακτήρια που δεν µπορούν να αναπτυχθούν χωρίς παρουσία αλατιού σε σηµαντική συγκέντρωση Ξηρόφιλοι: Ζύµες και µύκητες που αναπτύσσσονται καλύτερα σε a w <0.85 Ωσµόφιλοι: Κυρίως ζύµες ανθεκτικές στη ζάχαρη που µπορούν να ναπτυχθούν σε υψηλή ωσµωτική πίεση Είναι σηµαντικό να γνωρίζουµε ταόριαανάπτυξηςa w των µικ/ών 48

Παράγοντες που επηρεάζουν την ανάπτυξη, επιβίωση 49 Ενεργότητα νερού/a w και Μικροοργανισµοί Οµάδα µικροοργανισµών α w -------------------------------------------------------------- Gram αρνητικά βακτήρια 0.97 Gram θετικά βακτήρια 0.90 Ζύµες 0.88 Μύκητες 0.80 Αλόφιλα βακτήρια 0.75 Ξηρόφιλοι µύκητες 0.61 49 Παράγοντες που επηρεάζουν την ανάπτυξη, επιβίωση 50 Ενεργότητα νερού/a w και Μικροοργανισµοί Gram-αρνητικά βακτήρια: Pseudomonas 0.96 Enterobacteriaceae 0.93 Salt-tolerant Enterobacter 0.90 Gram-θετικά: Lactobacillaceae 0.94 Micrococcaceae 0.90 Staphylococcus aureus 0.86-0.85 enterotoin 0.93 Clostridium botulinum 0.97-0.94 Halophilic/Xerophilic/Osmophilic: Grow only at reduced a w /fail to grow at high a w 50

Παράγοντες που επηρεάζουν την ανάπτυξη, επιβίωση 51 Όρια Ενεργότητας νερού/a w για διάφορους Μικροοργανισµούς Μικροοργανισµοί Pseudomonas Clostridium botulinum type E, Pseudomonas fluorescens Flavobacterium, Klebsiella, Proteus, Pseudomonas, Shigella, Lactobacillus Bacillus cereus, Clostridium perfringens, Escherichia coli, Lactobacillus viridescens, Salmonella, Serratia, Vibrio, Pseudomonas, Alcaligenes, Citrobacter, Enterobacter, Escherichia, Bacillus a w 0.98 0.97 0.96 0.95 51 Παράγοντες που επηρεάζουν την ανάπτυξη, επιβίωση 52 Όρια Ενεργότητας νερού/a w για διάφορους Μικροοργανισµούς Μικροοργανισµοί Clostridium botulinum type A and B, Lactobacillus plantarum, Pediococcus cerevisiae, Enterobacter aerogenes, Vibrio parahaemolyticus, Microbacterium, Streptococcus Bacillus stearothermophilus, Micrococcus luteus, Lactobacillus, Streptococcus, Vibrio, Rhizopus, Mucor Rhodotorula, Pichia Corynebacterium, Staphylococcus/anaerobic Streptococcus a w 0.94 0.93 0.92 0.91 52

Παράγοντες που επηρεάζουν την ανάπτυξη, επιβίωση 53 Όρια Ενεργότητας νερού/a w για διάφορους Μικροοργανισµούς Μικροοργανισµοί Bacillus subtilis, Micrococcus, Pediococcus, Saccharomyces, Hansenula Candida, Torulopsis, Cladosporium Debaryomyces Staphylococcus aureus/aerobic, Vibrio costicolus Penicillium Halobacterium halobium Aspergillus a w 0.90 0.88 0.87 0.86 0.85 0.75 0.65 53 Παράγοντες που επηρεάζουν την ανάπτυξη, επιβίωση 54 υναµικό οξειδοαναγωγής (Eh) Ησχέσητωνµικροοργανισµών µε τοo 2 & Eh, επιτρέπει την παρακάτω κατάταξη: Yποχρεωτικά ή αυστηρά αερόβιοι: οι µικροοργανισµοί (πχ. pseudomonads) αυτοί χρειάζονται O 2 άρα αναπτύσσονται σε τρόφιµα µε υψηλόeh (+350 - +500 mv). Υποχρεωτικά αναερόβιοι: µικροοργανισµοί (πχ. Clostridium),αναπτύσσονται σε τρόφιµα µε πολύχαµηλό Eh <-150mV (πχ σε κονσέρβες, ήτρόφιµα συσκευασµένα σε κενό) Προαιρετικά αναερόβιοι: οι µικροοργανισµοί που αναπτύσσονται είτε παρουσία είτε απουσία Ο 2 πχ. Lactobacillaceae, Enterobacteriaceae, Corynebacteriaceae. Κυρίως αλλοιώνουν τρόφιµα µε χαµηλό Eh (100-350 mv). Μικροαερόφιλοι: χρειάζονται περίπου 5% οξυγόνο (π.χ Campylobacter) 54

Παράγοντες που επηρεάζουν την ανάπτυξη, επιβίωση 55 Ατµόσφαιρα Συσκευασίας Επιδρά στο Eh Καθορίζει τους µικ/ούς που κυριαρχούν Επιδρά στο ρυθµό ανάπτυξης O 2 : αερόβιοι Κενό: προαιρετικά αναερόβιοι, αναερόβιοι, µικροαερόφιλοι CO 2: Αντιµικροβιακή δράση, διάφορες ανθεκτικότητες Τροποποιηµένες Ατµόσφαιρες: µίγµατα αερίων για την παρεµπόδιση των µικ/ών και τη διατήρηση των οργανοληπτικών χαρακτηριστικών 55 Παράγοντες που επηρεάζουν την ανάπτυξη, επιβίωση 56 Αντιµικροβιακές Ουσίες Τρόποι ράσης ρούν στο κυτταρικό τοίχωµα και τις µεµβράνες Επηρεάζουν το γενετικό υλικό Επηρεάζουν τη δράση των ενζύµων Παρεµποδίζουν τη µεταφορά των θρεπτικών συστατικών εσµεύουν τα θρεπτικά συστατικά 56

Παράγοντες που επηρεάζουν την ανάπτυξη, επιβίωση 57 Βενζοϊκό Αντιµικροβιακές Ουσίες Σορβικό, προπιονικό Θειώδη, νιτρώδη άλατα Αντιµικροβιακές Ουσίες φυτικής προέλευσης Αιθέρια έλαια Ευγενόλη (γαρύφαλο) Αλλισίνη (σκόρδο) Αλδεύδες και ευγενόλη στην κανέλα Θυµόλη και καρβακρόλη στη ρίγανη Άλλες φαινόλες, αλκαλοειδή, φυτοαλεξίνες κλπ. 57 Παράγοντες που επηρεάζουν την ανάπτυξη, επιβίωση 58 Βιολογικές δοµές Σε πολλά τρόφιµα υπάρχουν φυσικές βιολογικές δοµές που παρεµποδίζουν την είσοδο και την ανάπτυξη των µικ/ων Φλοιός φρούτων Κέλυφος σπόρων Κέλυφος αυγών έρµα ζώων 58

«φωλιά» βιοθέση γαλακτοβακίλλων που βρίσκονται στη λογαριθµική φάση ανάπτυξης τους σε ζυµούµενο αλλαντικό 59 59 Νέες προσεγγίσεις µικροβιολογίας τροφίµων 60 Συµβατές µε τη φιλοσοφία της πρόληψης και της διασφάλισης ποιότητας µέσω κατάλληλων διαδικασιών και όχι µε έλεγχο του τελικού προϊόντος Τεχνολογία εµποδίων συνεργιστική επίδραση παραµέτρων συντήρησης (εµποδίων) που διαταράσσουν την οµοιοστασία των µικροοργανισµών Προρρητική µικροβιολογία Ποσοτικοποίηση παραγόντων καθοριστικών για τη µικροβιακή ανάπτυξη 60