Σεμινάριο Ειδικά Βιοχημείας Θέμα: Η σταθεροποίηση της αλληλεπίδρασης μεταξύ πρωτεϊνών (PPI) στην ανακάλυψη νέων φαρμάκων. 1. Εισαγωγή Οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ των πρωτεϊνών ή αλλιώς PPIs (Protein protein interactions) συμβαίνουν όταν πρωτεΐνες έρχονται σε φυσική επαφή μεταξύ τους μέσω ηλεκτροστατικών δυνάμεων, συμπεριλαμβανομένων των υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων και είναι ζωτικής σημασίας στην φυσιολογική λειτουργία του κυττάρου και του τρόπου με τον οποίο αυτό επικοινωνεί με το περιβάλλον. Η ύπαρξη, ή η απουσία, ή οι μη φυσιολογικές πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις είναι παράγοντες που εμπλέκονται σε κάθε νόσημα, ενώ η ρύθμιση τους από μικρά μόρια στα πλαίσια του πότε και πως συμβαίνουν αυτές οι αλληλεπιδράσεις, θα μπορούσε στο μέλλον να αποτελέσει σημαντικό εργαλείο και προοπτική ανάπτυξης νέων θεραπευτικών μέσων. Γενικότερα, υπάρχουν δύο στρατηγικές χρήσης αυτών των αλληλεπιδράσεων στην βιοιατρική. Α) Η αποφυγή/αναστολή των PPIs και Β) η σταθεροποίηση των PPIs. Τόσο η βιομηχανία, όσο και η πανεπιστημιακή κοινότητα έχουν εμπλακεί ενεργά στην ταυτοποίηση και χρήση μορίων της πρώτης κατηγορίας, των αναστoλέων των PPIs, ενώ οι προσπάθειες για εύρεση και χρήση μορίων της δεύτερης κατηγορίας είναι σαφώς πιο περιορισμένες. Η αναφορά μας καταπιάνεται με τη δεύτερη κατηγορία, αυτή των σταθεροποιητών. Στη συνέχεια περιγράφουμε αντιπροσωπευτικά παραδείγματα των δύο κυριότερων υποκατηγοριών αυτών των μορίων ενώ ταυτόχρονα εξηγούμε τη λειτουργία, τους περιορισμούς και τις μελλοντικές προοπτικές στην έρευνα αυτών των μορίων. Οι υποκατηγορίες αυτές είναι: 1) Οι σταθεροποιητές PPIs φυσικής προέλευσης, 2Α) Οι συνθετικοί σταθεροποιητές PPIs, που εξυπηρετούν άλλο θεραπευτικό σκοπό πρωτίστως και 2Β) Οι συνθετικοί σταθεροποιητές PPIs, που ανακαλύφθηκαν ώστε αυτή να είναι η κύρια χρήση τους. Με τους τελευταίους δε θα ασχοληθούμε καθόλου διότι είναι πάρα πολύ λίγοι και η βασική τους λειτουργία μπορεί πολύ καλύτερα να παρουσιαστεί με παραδείγματα της υποκατηγορίας 2Α. 2. Σταθεροποιητές PPI φυσικής προέλευσης Αυτοί οι σταθεροποιητές, είναι κυρίως μόρια που είτε μιμούνται τη λειτουργία της πρωτεΐνης gelsolin (που συνδέεται με την ακτίνη), είτε μόρια που στοχεύουν στη φυσιολογική 1 P a g e
λειτουργία της ίδιας της ακτίνης. Το παράδειγμα που θα εξετάσουμε, μιμείται το ρόλο της gelsolin και ονομάζεται Swinholide A. Η ακτίνη και ο πολυμερισμός της, κατέχει σημαντικό ρόλο στην δημιουργία του κυτταροσκελετού του κυττάρου. Η αναδιαμόρφωση της ακτίνης συνδέεται συχνά με κακοήθεις φαινοτύπους, όπως συμβαίνει και στην περίπτωση του καρκίνου. Η ιδιότητα αυτή, φέρνει πρόσφορο έδαφος για την χρησιμοποίηση της σαν φαρμακευτικό στόχο. Οι φυσικές ουσίες που δρουν σαν σταθεροποιητές της ακτίνης, πιθανών να έχουν προέλθει από φυσική εξέλιξη με στόχο την προστασία του οργανισμού. Η Swinholide A αποτελεί κυτταροτοξική θαλάσσια μακρολίδη με 44 άτομα άνθρακα προερχόμενη από τον θαλάσσιο σπόγγο Theonella swinhoei. Η ουσία δρα στα νημάτια ακτίνης, καταστρέφοντας τα και σταθεροποιώντας την G-ακτίνη σε ένα μη-φυσιολογικό σύμπλεγμα ομοδιμερών με στοιχειομετρία 2:1. Αποτελείται από μακροκυκλική δομή με 44 άτομα άνθρακα και η συμμετρία που εμφανίζει το σχηματιζόμενο σύμπλοκο αποτελεί το σημαντικό σημείο της δράσης της. Εικόνα 1 Α. Στερεοδιαμόρφωση στο χώρο δύο μορίων G- ακτίνης ενωμένα με ένα μόριο Swinholide σε στοιχειομετρία 2:1. B. Στερεοδιαμόρφωση ενός μορίου Swinholide και C. Χημική δομή. Εικόνα 2 Στερεοδιαμόρφωση στο χώρο δύο μορίων G-ακτίνης ενωμένα με ένα μόριο Swinholide σε στοιχειομετρία 2:1 Τα φυσικά προϊόντα που δρουν σαν σταθεροποιητές μας δίνουν σήμερα το έναυσμα για την χρήση τους περαιτέρω στην δημιουργία στοχευόμενων φαρμάκων. Έχει καταγραφεί μεγάλη ποικιλία ουσιών, από μεγάλου μήκους, μικρές υδρόφοβες ή υδρόφιλες, ενώ πολλές από αυτές αποτελούν τερπένια ή πεπτίδια. Με εξαίρεση την ταξόλη που έχει 2 P a g e
αλλοστερική δράση, οι υπόλοιπες ενώνονται στα σημεία επαφής ανάμεσα της μιας πρωτεΐνης και της έτερης στόχου την οποία και σταθεροποιούν. Η ιδιότητα αυτή προσδίδει στους σταθεροποιητές μεγάλη εξειδίκευση του στόχου και ενισχύει την πρόθεση χρήσης του στη φαρμακολογία. 3. Συνθετικοί Σταθεροποιητές (PPI) Παρά τη έλλειψη ενδιαφέροντος που είχαν μέχρι τώρα οι συνθετικοί σταθεροποιητές, ο αριθμός του παρουσιάζεται όλο και αυξανόμενος. Τα υπόλοιπα πέντε των έξι παραδειγμάτων μας παρακάτω, αφορούν συνθετικούς σταθεροποιητές της 2Α κατηγορίας, που λειτουργούν σταθεροποιώντας ένα σύμπλεγμα δύο ή περισσοτέρων πρωτεϊνών των οποίων είναι γνωστές οι δομικές τους πληροφορίες. 1. Tafamidis Συνθετικός σταθεροποιητής PPI (post doc) Φάρμακο για: Νευρολογικά νοσήματα Οι αμυλοειδώσεις χαρακτηρίζονται από την εναπόθεση συσσωματωμάτων πρωτεϊνών (ίνες αμυλοειδούς). Μία από αυτές τις νόσους αποτελεί και η αμυλοείδωση της τρανσθυρετίνης (ATTR), η οποία χαρακτηρίζεται από την συσσωμάτωση της τρανσθυρετίνης (TTR). Η νόσος αυτή είναι θνησιγόνος εντός των 10 ετών. Εικόνα 3 Εικόνα 4 Το τετραμερές των ΤΤRs Λεπτομέρεια του σημείου επαφής των TTRs Εικόνα 5 Εικόνα 6 To άνω τμήμα ενός τετραμερούς To κάτω τμήμα ενός τετραμερούς 3 P a g e
Η TTR συναντάται σαν τετραμερές και η αποσυναρμολόγηση του σε μικρότερα ολιγομερή ή η λανθασμένη αναδίπλωση τους οδηγεί σε συσσωμάτωση της TTR και την εμφάνιση ATTR. Η θυρεοειδική ορμόνη Τ4, αποτελεί αναστολέας της TTR συσσωμάτωσης και σταθεροποιητής του TTR τετραμερούς. Το tafamidis, μιμείται την δράση της αυτή μέσω πρόσδεσης της στην επιφάνεια των δύο εν λόγω πρωτεϊνών και αναστέλλοντας την δημιουργία ινιδίων. Σημαντικό είναι το γεγονός ότι δρα και στις μεταλλαγμένες μορφές της πρωτεϊνης (V30M και V122I) που παρουσιάζονται στα πρώιμα στάδια της ATTR. Εικόνα 7. Α. Στερεοδιαμόρφωση της αλληλεπίδρασης του τετραμερούς TTR με 2 μόρια Tafamidis Β. Μεγένθυνση της αλληλεπίδρασης 2. Pleconaril Συνθετικός σταθεροποιητής PPI (post doc) Φάρμακο για: αντι-ιική εφαρμογή To Pleconaril, ανήκει στην οικογένεια των πίκορνα-ιών αναστολέων, οι οποίοι προέρχονται από την ισοξαζόλη (isoxazole). Δρα με δύο τρόπους. Προσδένεται και σταθεροποιεί το ιικό καψίδιο, ενώ παράλληλα δρα σαν αναστολέας του ICAM-1, ιικού μεσολαβητή για την επισύναψη του στον ξενιστή. Το καψίδιο των πίκορνα-ιών αποτελείται από επαναλήψεις τεσσάρων ιικών πρωτεϊνών (VP1-VP4), για τη δημιουργία ενός εικοσαέδρου. Το πρωτεϊνικό τετραμερές περιλαμβάνει και τον τόπο πρόσδεσης του ιού, για την επισύναψη του στο ICAM-1. 4 P a g e
Το Pleconaril δρα με την ένωση του στο τετραμερές VP1- VP4 πρωτεϊνικό σύμπλοκο σε μια «εσοχή» κάτω από τη θέση πρόσδεσης στο ICAM-1, γνωστή και ως «φαράγγι». Η ουσία ουσιαστικά ενώνεται σε ένα υδροφοβικό βαρέλι, ανάμεσα στην VP1 κάνοντας επαφή με την Εικόνα 8. VP3 μέσω μιας αλανίνης (Ala24) ή μιας βαλίνης (Val24). Η VP1 -VP3 επαφή δεν είναι ακόμα σίγουρο ότι βοηθά στην σταθεροποίηση. Ένωση του Pleconaril με το πρωτεινικό σύμπλοκο VP1-VP4 του ιού 3. RO-2443 Ενεργοποιεί την καρκινική πρωτεΐνη καταστολέα p53, μέσω της αναστολής της PPI της p53, με τον αρνητικό ρυθμιστή της, την MDM2. Η ουσία είναι πολλά υποσχόμενη για την αντιμετώπιση του καρκίνου. Άλλες μέχρι τώρα προσεγγίσεις ήταν αναποτελεσματικες σε κύτταρα με φυσιολογική έκφραση MDM2, αφού η MDMX φαίνεται να παίρνει τον ρόλο της MDM2 καταστέλλοντας την ενεργότητα της p53. Νέος συνδυασμός φαρμάκων που θα αναστέλλουν τόσο την MDM2 όσο και την MDMX είναι ο επόμενος στόχος. Με γνώμονα αυτό, η RO-2443 ανευρέθη σε μία βιβλιοθήκη μορίων όπου υπάκουε στο κριτήριο να αποτελεί καταστολέα τόσο για την MDM2 και για την MDMX, όπου 2 μόρια ενώνονται με δύο MDM2 ή MDMX ή με από ένα εκ των δύο σε αναλογία 2:2 δημιουργώντας ένα τετραμερές. Αυτό επιτυγχάνεται καθότι η RO-2443 καταλαμβάνει τη θέση της p53 στο κοίλωμα που σχηματίζεται στην ένωση του εκάστοτε ομοδιμερούς, στις λέγόμενες «τσέπες» Phe19, Trp23 and Leu26. Η ένωση της RO-2443 οδηγεί το καρκινικό κύτταρο σε απόπτωση. Εικονα 9 Εικόνα 10 Ένα σύμπλοκο δύο MDM2 πρωτεινών Το ίδιο σύμπλοκο με τις αλληλεπιδράσεις που με το μόριο RO-2443 αναπτύσσονται με το περιβάλλον του 5 P a g e
4. Trifluoperazine Οι S100A4 πρωτεΐνες έχει αποδειχθεί ότι σε υψηλές συγκεντρώσεις εμπλέκονται στην εξάπλωση μεταστατικών καρκίνων αλλά και σε πληθώρα άλλων ασθενειών όπως οι νευροεκφυλιστικές νόσοι, η Ρευματοειδής Αρθρίτιδα, οι ινώσεις του νεφρού και η καρδιακή υπερτροφία. Αυτό έχει σαν αποτέλεσμα, αυτές οι πρωτεΐνες να αποτελούν ενδιαφέροντες φαρμακολογικούς στόχους. Κατά κύριο λόγο εμφανίζονται στην ομοδιμερισμένη τους μορφή ενώ η λειτουργία τους διαμεσολαβείται από ιόντα Ca 2+ που συνδέονται με τις πρωτεΐνες. Μετά από αναζήτηση σε κατάλληλες βιβλιοθήκες, τρία μόρια της οικογένειας των phenothiazines άρχισαν να εξετάζονται ως πιθανά φαρμακευτικά μόρια. Το trifluoperazine (TFP) βρέθηκε λοιπόν, ότι όχι μόνο συνδέεται με τις S100A4 πρωτεΐνες και αναστέλλει τη δράση της μυοσύνης ΙΙ, αλλά επάγει επιπλέον το σχηματισμό πενταμερών των S100A4 όπου οι περισσότερες επαφές μεταξύ των μονομερών του πενταμερούς στα σημεία επαφής, είχαν υποκατασταθεί από δύο μόρια TFP. Στις φωτογραφίες που ακολουθούν, φαίνονται με λεπτομέρεια οι δομές και τα σημεία αλληλεπιδράσεων. Εικόνα 11 Εικόνα 12 Χρωματισμός με βάση τα μονομερη Σύμπλοκο S100A4 πρωτεινών, TFP και ιόντων Ca2+ (πράσινα σφαιρίδια) Εικόνα 13 Εικόνα 14 Απεικόνιση των θέσεων που καταλαμβάνουν το TFP και τα ιόντα Ca2+ Λεπτομέρεια των σημείων επαφής των μονομερών 6 P a g e
5. BMS-202 Η ανοσοθεραπεία του καρκίνου θεωρείται ευρέως ως μία στρατηγική στην ογκολογία όπου κατά την εφαρμογή της, το ίδιον ανοσοποιητικό σύστημα του ασθενή διεγείρεται να πολεμήσει τον όγκο του. Αρκετά φάρμακα τα προηγούμενα χρόνια που έχουν σαν βάση τους αντισώματα (checkpoint inhibitors) στον τρόπο δράσης τους, έχουν λάβει άδεια κυκλοφορίας και χρησιμοποιούνται στην ιατρική πρακτική. Τα επιφανειακά μόρια των T λεμφοκυττάρων και των αντίστοιχων καρκινικών κατά τη μεταξύ τους επαφή όμως, καταφέρνουν να αποτρέπουν, έως ένα βαθμό που εξαρτάται από διάφορους παράγοντες, την ευεργετική δράση αυτών των φαρμάκων. Τα εμπλεκόμενα Εικόνα 15 επιφανειακά μόρια είναι το CTLA4 (T-lymphocyte- Το ομοδιμερές των PD-L1 και η associated antigen 4, στα T λεμφοκύτταρα), PD-1 σύνδεση του BMS-202 (programmed cell death protein 1, στα Τ λεμφοκύττταρα) και PD-L1 (ligand-programmed cell death protein 1 Ligand, στα καρκινικά κύτταρα). Αυτά τα μόρια αναστέλλουν όταν συνδεθούν μεταξύ τους (PD-1/ PD-L1) την ενεργοποίηση των Τ λεμφοκυττάρων και έτσι τα καρκινικά κύτταρα προστατεύονται από τις επιθέσεις του ανοσοποιητικού συστήματος. To BMS-202 προέρχεται από μία κλάση μορίων που καταφέρνουν τον διμερισμό των PD-L1 μορίων στην επιφάνεια των καρκινικών κυττάρων και έτσι εμποδίζουν την αλληλεπίδρασή τους με τα αντίστοιχα μόρια PD-1 των λεμφοκυττάρων. Συμπεράσματα Τα παραδείγματα που περιγράψαμε παραπάνω, αντικατοπτρίζουν το ενδιαφέρον που υπάρχει σήμερα για την κατασκευή νέων σταθεροποιητών PPI. Η κατασκευή και η δοκιμή αρκετών εξ αυτών ( πχ pleconaril φάση ΙΙ κλινικών δοκιμών, tafamidis εγκεκριμένο ήδη στη ΕΕ και την Ιαπωνία, trifluoperazine), αποδεικνύει ότι η σταθεροποίηση μέσω αλληλεπιδράσεων πρωτεϊνών δεν είναι μόνο προνόμιο της φύσης. Οι περίπου 300.000 εκτιμώμενες αλληλεπιδράσεις που επισυμβαίνουν στο ανθρώπινο κύτταρο και η εμπλοκή τους στις φυσιολογικές λειτουργίες του, δίνουν εύφορο έδαφος στην δημιουργία νέων συνθετικών φαρμάκων. 7 P a g e
Παρόλα αυτά, υπάρχουν ακόμα σημαντικά εμπόδια που πρέπει να ξεπεραστούν για την ανάπτυξη αυτού του πεδίου. Αρχικά, οι επιφάνειες τις οποίες πρέπει να δράσουν τα μικρά μόρια του φαρμάκου είναι μεγάλες και η διάσπαση του γρήγορη, με αποτέλεσμα να μην είναι αποδοτικό. Επιπλέον, πολλές φορές κάποια από τα μόρια τα οποία συμμετέχουν στην αλληλεπίδραση πρωτεϊνών δεν είναι καλά χαρακτηρισμένα, με αποτέλεσμα να απαιτείται περισσότερη έρευνα (RO-2443). Ακόμα, υπάρχει σήμερα, μικρή χρηματοδότηση για την έρευνα ανακάλυψης σταθεροποιητών PPI σαν κυρίαρχο σκοπό. Οι περισσότερες από τις ουσίες που αφορούν σταθεροποιητές PPIs, έχουν ανακαλυφθεί τυχαία κατά τη διεξαγωγή πειράματος για άλλο σκοπό. Συμπεραίνεται έτσι ότι υπάρχει η απαίτηση νέων τεχνολογικών μεθόδων για την πλήρη κατανόηση αυτών των αλληλεπιδράσεων, προκειμένου να κατασκευάσουμε πιο εξειδικευμένα και σταθερά φάρμακα. Εν κατακλείδι, στο μέλλον, ο τομέας των αλληλεπιδράσεων PPI μπορεί να δώσει τη βάση για την δημιουργία περισσότερων νέων φαρμάκων. Ενώ η μεθοδολογία του High throughput Screening, η δυνατότητα πρόσβασης σε στόχους που πριν ήταν άγνωστοι και η ανάπτυξη της τεχνολογίας, φαίνεται να είναι βασικές προϋποθέσεις για την ανάπτυξη του πεδίου. 8 P a g e