QUANTA Lite TM OMP Plus ELISA 704530 Για In Vitro Διαγνωστική Χρήση CLIA σύνθετος: ψηλός

QUANTA Lite TM OMP Plus ELISA 704530 Για In Vitro Διαγνωστική Χρήση CLIA σύνθετος: ψηλός Σκοπό Χρήση Το κιτ QUANTA Lite TM OMP Plus αποτελεί μια ενζυμική ανοσοπορροφητική ανάλυση (ELISA) για τον ημιποσοτικό εντοπισμό αντισωμάτων αντι-omp της τάξης IgA στον ανθρώπινο ορό. Προορίζεται για χρήση σε συνδυασμό με συστήματα δοκιμασίας αντισώματος αντι-saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) (ASCA) IgG ή/και IgA. Η παρουσία των αντισωμάτων IgA OMP (πρωτεΐνες εξωτερικής μεμβράνης), σε συνδυασμό με κλινικά ευρήματα και άλλες εργαστηριακές δοκιμασίες, μπορεί να βοηθήσει στη διάγνωση ασθενών με νόσο του Crohn. Περιληψη Και Αρχη Μεθοδου Φλεγμονώδης νόσος των εντέρων (IBD) είναι ένας γενικός όρος που χρησιμοποιείται για την περιγραφή παθήσεων που προκαλούν φλεγμονή των εντέρων. Η νόσος του Crohn (CD) και η ελκώδης κολίτιδα (UC) αποτελούν τις δύο κύριες μορφές IBD. 1-3 Τόσο η νόσος του Crohn όσο και η ελκώδης κολίτιδα είναι χρόνιες παθήσεις, επηρεάζουν άνδρες και γυναίκες περίπου σε ίσα ποσοστά και παρατηρούνται συχνότερα στη βόρεια Ευρώπη και στη Βόρεια Αμερική. Κατά προσέγγιση 20% των πασχόντων από τη νόσο του Crohn έχουν εξ αίματος συγγενή με κάποια μορφή IBD. Η ηλικία εμφάνισης της νόσου του Crohn είναι συνήθως μεταξύ 15-30 ετών ενώ μία δεύτερη μικρότερη κορυφή εμφάνισης παρατηρείται μεταξύ των ηλικιών 50-70 ετών. Την τελευταία δεκαετία, διάφορες μελέτες έχουν σημειώσει αύξηση του επιπολασμού της νόσου του Crohn σε διάφορες γεωγραφικές περιοχές. 4-6 Αν και υπάρχουν πολλές θεωρίες σχετικά με τα αίτια της νόσου του Crohn και της ελκώδους κολίτιδας, καμία δεν έχει αποδειχθεί. Καθώς πολλά από τα συμπτώματα της νόσου του Crohn και της ελκώδους κολίτιδας είναι όμοια, η διάγνωση είναι συχνά δύσκολη, χρονοβόρα και επεμβατική. Περίπου το 10-12% των περιπτώσεων δεν μπορούν να ταξινομηθούν εξ αρχής και χαρακτηρίζονται ως "ακαθόριστη κολίτιδα". Με την πάροδο του χρόνου, το 50% περίπου των ασθενών ταξινομείται τελικά ως CD ή UC. 7, 8 Τα αντισώματα αντι-saccharomyces cerevisiae (ASCA) βρέθηκε ότι είναι σημαντικά περισσότερα σε ασθενείς με νόσο του Crohn σε σύγκριση με ασθενείς με ελκώδη κολίτιδα ή σε υγιή άτομα ελέγχου. 8-10 Αυτά τα αντισώματα, τα οποία μπορεί να περιλαμβάνουν αντισώματα τάξεων IgG και IgA, φαίνεται να στρέφονται έναντι ακολουθιών μαννόζης στη μανάζη που προέρχεται από το κυτταρικό τοίχωμα των Saccharomyces cerevisiae. Η παρουσία ASCA IgG ή IgA αποδείχθηκε ότι έχει υψηλή ειδικότητα για τη νόσο του Crohn. Ο εντοπισμός ASCA μπορεί να είναι χρήσιμος για τη διαφοροποίηση της νόσου του Crohn από την ελκώδη κολίτιδα σε ορισμένους ασθενείς. 7, 8 Ορισμένοι ασθενείς με νόσο του Crohn έχουν βρεθεί με αντισώματα που στρέφονται έναντι αντιγόνων που προέρχονται από διάφορα βακτήρια. Τα περιγραφόμενα αντισώματα περιλαμβάνουν όσα στοχεύουν στην πρωτεΐνη C (OMP C) της εξωτερικής μεμβράνης E.coli, πρωτεΐνες από Pseudomonas fluorescens (I2), και ορισμένα αντιγόνα μυκοβακτήριων. 11,12 Καθώς αντισώματα σε ορισμένα από αυτά τα αντιγόνα φαίνεται να εμφανίζονται σε υποομάδα ασθενών με νόσο του Crohn που είναι αρνητικοί σε ASCA και η παρουσία τους συσχετίζεται με πιο περίπλοκο φαινότυπο της νόσου, αναπτύχθηκαν αναλύσεις για τον εντοπισμό αυτών των αντιμικροβιακών αντισωμάτων που είναι σχετικά με IBD. 13,14 Ενσωματώνοντας ένα ειδικό λύμα της εξωτερικής μεμβράνης και συσχετισμένες πρωτεΐνες που προέρχονται από δύο είδη βακτηριών τα οποία απομονώνονται από ασθενείς με νόσο του Crohn στο υπόστρωμα της ανάλυσης, η ανάλυση QUANTA Lite OMP Plus ELISA έχει σχεδιαστεί για να εντοπίζει μεγαλύτερο εύρος αντιμικροβιακών αντισωμάτων σε σύγκριση με τις αναλύσεις ενός αντιγόνου. Αρχη Μεθοδου Ένα ειδικό λύμα, που αποτελείται εν μέρει από κεκαθαρμένη εξωτερική μεμβράνη και συσχετισμένες πρωτεΐνες (OMP) που προέρχονται από 2 είδη βακτηρίων τα οποία απομονώνονται από ασθενείς με νόσο του Crohn, δεσμεύεται στα πηγαδάκια μιας πλάκας μικροκοιλοτήτων πολυστυρενίου. Προαραιωμένοι οροί ελέγχου και αραιωμένοι οροί ασθενών προστίθενται σε ξεχωριστά πηγαδάκια, επιτρέποντας στα παρόντα αυτοαντισώματα OMP να δεσμευθούν στο ακινητοποιημένο αντιγόνο. Το μη δεσμευμένο δείγμα απομακρύνεται με πλύση και ένα σύζευγμα αντι-ανθρώπινης IgA σημασμένης με ένζυμο προστίθεται σε κάθε πηγαδάκι. Μια δεύτερη επώαση επιτρέπει της δέσμευση της αντι-ανθρώπινης IgA που είναι σημασμένη με ένζυμο σε αντισώματα ασθενών, τα οποία προσκολλούνται στις μικροκοιλότητες. Κατόπιν απομάκρυνσης με πλύση της μη δεσμευμένης αντι-ανθρώπινης IgA με σήμανση ενζύμου, μετρείται η δραστηριότητα του εναπομένοντος ενζύμου με την προσθήκη χρωμογόνου υποστρώματος και μετρώντας την ένταση του χρώματος που εμφανίζεται. Η ανάλυση μπορεί να αξιολογηθεί με φασματοφωτομετρία μετρώντας και συγκρίνοντας τη χρωματική ένταση που αναπτύσσεται στα πηγαδάκια των ασθενών με το χρώμα στα πηγαδάκια ελέγχου. Αντιδραστηρια 1. Πλάκα μικροκοιλοτήτων πολυστυρενίου ELISA επικαλυμμένη με αντιγόνο OMP Plus (12-1 x 8 κοιλότητες), με θήκη σε αλουμινένια συσκευασία που περιέχει αφυγραντικά 2. ELISA Negative Αρνητικός πρότυπος ορος ελέγχου (1 φιαλίδιο (έτοιμο για χρήση) 1.2ml αραιωμένου διαλύματος χωρίς ανθρώπινα αντισώματα OMP) 1

3. OMP Plus ELISA Low Positive (χαμηλό θετικό), 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει συντηρητικό και αντισώματα ανθρώπινου ορού σε ανασυνδυασμένο ανθρώπινο OMP, προαραιωμένο, (έτοιμο για χρήση) 1.2ml 4. OMP Plus ELISA High Positive (υψηλό θετικό), 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει συντηρητικό και αντισώματα ανθρώπινου ορού σε ανασυνδυασμένο ανθρώπινο OMP, προαραιωμένο, (έτοιμο για χρήση) 1.2ml 5. HRP Sample Diluent, 1 φιαλίδιο χρώματος ροζ, που περιέχει Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα, Tween 20, σταθεροποιητές πρωτεΐνης και συντηρητικό, 50mL 6. HRP Wash Concentrate, 1 φιαλίδιο των 40x συμπυκνωμάτων χρώματος κόκκινου, που περιέχει Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα και Tween 20, 25mL. Ανατρέξτε στο Τμήμα Μεθόδων για οδηγίες αραίωσης. 7. HRP Conjugate IgA (αίγας), αντι-ανθρώπινη IgA, 1 φιαλίδιο χρώματος κίτρινος, που περιέχει ρυθμιστικό διάλυμα, σταθεροποιητές πρωτεΐνης και συντηρητικό, 10mL 8. TMB Chromogen, 1 φιαλίδιο που περιέχει σταθεροποιητές, 10mL 9. HRP Stop Soulution, 0.344M θειικό οξύ, 1 φιαλίδιο άχρωμο, 10mL Προσοχή 1. ΠΡΟΕΙΔΟΠΟΙΗΣΗ: Αυτό το προϊόν περιέχει ένα χημικό (0.02% chloramphenicol) στο αραιωτικό δείγματος, στους ορούς ελέγχου και στο σύζευγμα, το οποίο είναι γνωστό στην Πολιτεία της Καλιφόρνιας ότι προκαλεί καρκίνο. 2. Όλα τα αντιδραστήρια ανθρώπινης προέλευσης κατά τη διάρκεια της προετοιμασίας των μαρτύρων αυτού του προϊόντος έχουν ελεγχθεί και είναι αρνητικά για αντισώματα έναντι HIV, Σύφιλη, HBsAg, HCV όπως ορίζεται από τους κανονισμούς του FDA. Καμία μέθοδος πάντως δεν είναι σε θέση να αποκλείσει την παντελή απουσία μολυσματικών παραγόντων όπως και για HIV, HBV, HCV. Γι αυτό και όλοι οι ανθρώπινης προέλευσης μάρτυρες θα πρέπει να χρησιμοποιούνται ως δυνητικά μολυσματικά υλικά. 15 3. Το αζίδιο του νατρίου χρησιμοποιείται ως συντηρητικό. Το αζίδιο του νατρίου είναι δηλητήριο και μπορεί να είναι τοξικό σε περίπτωση κατάποσης. Το αζίδιο νατρίου μπορεί να αντιδράσει με μολύβδινες ή χάλκινες σωληνώσεις με αποτέλεσμα την πρόκληση δυνητικά εκρηκτικών μεταλλικών ενώσεων αζιδίων. Αν για την απόρριψη του αντιδραστηρίου χρησιμοποιούνται λεκάνες απόπλυσης, η συγκέντρωση των αζιδίων μπορεί να αποφευχθεί ξεπλένοντας με άφθονο νερό. 4. Το σύζευγμα περιέχει μια δηλητηριώδη/διαβρωτική χημική ουσία η οποία μπορεί να είναι τοξική εάν γίνει κατάποσή της σε μεγάλες ποσότητες. Aποφύγετε πιθανά εγκαύματα αποφεύγετε επαφή με τα μάτια και το δέρμα. 5. Το TMB χρωμογόνο περιέχει μία ερεθιστική ουσία που μπορεί να είναι επικίνδυνη εάν την εισπνεύσετε εάν καταποθεί ή εάν απορροφηθεί από το δέρμα. Αποφύγετε κάποιο τραυματισμό, την εισπνοή, κατάποση και επαφή με το δέρμα ή τα μάτια. 6. Το διάλυμα διακοπής της αντίδρασης (Stop Solution) περιέχει θειικό οξύ το οποίο είναι δηλητηριώδες, διαβρωτικό και τοξικό. Για να αποφύγετε χημικά εγκαύματα αποφύγετε την επαφή του με το δέρμα και τα μάτια. 7. Να χρησιμοποιείτε τον κατάλληλο προστατευτικό εξοπλισμό όταν δουλεύετε με τα αντιδραστήρια. 8. Αντιδραστήρια που έχουν χυθεί πρέπει να καθαρίζονται αμέσως. Τηρείτε όλους τους ομοσπονδιακούς, εθνικούς και τοπικούς περιβαλλοντικούς κανονισμούς για την απόρριψη αποβλήτων. Ειδικα Μετρα 1. Αυτό το προϊόν είναι γδια διαγνωστική χρήση In Vitro. 2. Η αντικατάσταση συστατικών με διαφορετικά από τα παρεχόμενα σε αυτό το σύστημα μπορεί να οδηγήσει σε ανακριβή αποτελέσματα. 3. Ανεπαρκές πλύσιμο της μικροπλάκας ή αναποτελεσματική αφαίρεση των διαλυμάτων στα ενδιάμεσα στάδια μπορεί να επηρεάσει την ακρίβεια της μεθόδου. 4. Η λειτουργία αυτής της μεθόδου σε αυτόματο αναλυτη καί άλλες συσκευές διανομής, μπορεί να δώσει διαφορετικά αποτελέσματα απο αυτά που αποκτώνται στη χειρωνακτική διαδικασία. Είναι στήν ευθύνη του κάθε εργαστηρίου να καθορίσει τις αποδεκτές τιμές και όρια της αυτόματης διαδικασίας. 5. Μια ποικιλία παραγόντων μπορεί να επηρεάσει την απόδοση της μεθόδου: Η θερμοκρασία των αντιδραστηρίων, η θερμοκρασία του εργαστηριακού χώρου, η ακρίβεια και επαναληψιμότητα του πιπεταρίσματος, η πλύση και η αφαίρεση των διαλυμάτων από τη μικροπλάκα, η ποιότητα του φωτόμετρου, οι χρόνοι επώασης. Προσεκτική τήρηση της διαδικασίας είναι απαραίτητη για ακριβή και επαναλήψιμα αποτελέσματα. 6. Συνιστάται η ακριβής τήρηση του πρωτοκόλλου. 7. Ανεπαρκής συντήρηση της μικροπλάκας (κλείσιμο της αχρησιμοποίητης πλάκας) μπορεί να προκαλέσει αποδομή του συνδεδεμένου αντιγόνου και αποτελέσματα χαμηλής ακρίβειας. 8. Μη αποδεκτές χαμηλές τιμές απορρόφησης μπορεί να παρατηρηθούν αποδύο η περισσότερες χρήσεις της σφαιρίνης απο το ίδιο φιαλίδιο. Είναι σημαντικό να ακολουθείτε τις οδηγίες χρήσης της σφαιρίνης. 9. Χημική μόλυνση της σφαιρίνης μπορεί να προέλθει απο ανεπαρκή καθαρισμό των τμημάτων διανομής των αναλυτών. Κατάλοιπα απο εργαστηριακά χημικά όπως φορμαλίνη, χλωρίνη, εθανόλη, η απορρυπαντικά θα προκαλέσουν υποβιβασμό της σφαιρίνης με το χρόνο. Συνιστάται ο καθαρισμός των οργάνων και συσκευών μετα τη χρήση χημικών καθαριστικών. 2

Αποθήκευση 1. Αποθηκεύσατε τα αντιδραστήρια στους 2-8 ο C. Να μήν παγώνουν. Είναι σταθερά για χρήση μέχρι τη λήξη τους εάν αποθηκεύονται συμφωνα με τις οδηγίες. 2. Οι μη χρησιμοποιούμενες σειρές επικαλυμένων με αντιγόνο πηγαδιών πρέπει να ασφαλίζονται στην αλουμινένια συσκευασία τους, η οποία περιέχει απορροφητικό υγρασίας, και να φυλάσονται στούς 2-8 ο C. 3. Το αραιωμένο διάλυμα πλύσης είναι σταθερό για μία εβδομάδα στούς 2-8 ο C. Δείγματα Η διαδικασία μπορεί να πραγματοποιηθεί μόνο με δείγματα ορού. Η προσθήκη αζιδίου η άλλων συντηριτικών στο υποό έλεγχο δείγμα μπορεί να επιρεάσει τα αποτελέσματα. Μικροβιακή μόλυνση, θέρμανση η δείγματα περιέχοντα ορατά ξένα στοιχεία δέν πρέπει να χρησιμοποιούνται. Αιμολυθέντα η λιπαιμικά δείγματα η ορός πρέπει να αποφεύγονται. Μετά τη συλλογή του δείγματος, ο ορός θα πρέπει να διαχωρίζεται άμεσα από το ολικό αίμα. CLSI (NCCLS) Document H18-A3 προτείνει τις παρακάτω συνθήκες συντήρησης και αποθήκευσης των δειγμάτων: Τα δείγματα πρέπει να διατηρούνται σε θερμοκρασία δωματίου όχι περισσότερο από 8 ώρες. Σε περίπτωση που η δοκιμασία δεν πραγματοποιηθεί άμεσα, τότε τα δείγματα μπορούν να διατηρηθούν σε θερμοκρασία συντήρησης (2 8 ο C) μέχρι 48 ώρες. Για μεγαλύτερο διάστημα, τα δείγματα θα πρέπει να καταψυχθούν στους 20 ο C. Τα κατεψυγμένα δείγματα πρέπει να αναμιχθούν καλά μετά την απόψυξη και πριν από την εξέταση. Διαδικασία Υλικά που παρέχονται 1 OMP Plus ELISA μικροπλάκα (12-1x8 πηγαδάκια), με βάση 1 1.2ml αραιωμένος ELISA Αρνητικός πρότυπος ορός ελέγχου (έτοιμος προς χρήση) 1 1.2ml αραιωμένος OMP Plus Low Θετικός πρότυπος ορός ελέγχου (έτοιμος προς χρήση) 1 1.2ml αραιωμένος OMP Plus High Ρυθμιστής (έτοιμος προς χρήση) 1 50ml HRP Sample Diluent, HRP Αραιωτικό δείγματος 1 25ml HRP Wash Concentrate, HRP Συμπύκνωμα πλύσης, 40x συμπυκνωμάτων 1 10ml HRP Conjugate, HRP Σύζευγμα IgA (αίγας), 1 10ml TMB Chromogen, TMB Χρωμογόνο 1 10ml HRP Stop Solution, HRP Διάλυμα διακοπής, 0.344M θεεινικό οξύ Αντιδραστήρια και εξοπλισμός που δεν συμπεριλαμβάνονται Μικροπιπέτες ρυθμιζόμενου όγκου 5, 100, 200 300 και 500 μl Απορριπτόμενα ρύγχη για μικροπιπέττες Σωληνάρια για την διάλυση δειγμάτων των ασθενών όγκου 4 ml Αποσταγμένο ή μη ιονισμένο νερό 1L δοχείο για το διάλυμα HRP Wash Concentrate (Διάλυμα πλυσίματος) Φωτόμετρο μέτρησης της μικροπλάκας με δυνατότητα φίλτρου στα 450 και 620 nm Μεθοδολογια Πριν ξεκινήσετε 1. Όλα τα αντιδραστήρια και τα δείγματα θα πρέπει να βρίσκονται σε θερμοκρασία δωματίου (20 26 C) και να έχουν αναδευτεί καλά. 2. Αραιώστε το συμπυκνωμένο HRP διάλυμα πλύσεων 1:40 προσθέτοντας το περιεχόμενο του φιαλιδίου σε 975 ml απεσταγμένου νερού. Σε περίπτωση που δέν θα χρησιμοποιήσετε ολόκληρη τη μικροπλάκα μπορείτε να χρησιμοποιήσετε μικρότερη ποσότητα ετοιμάζοντας 2 ml συμπυκνωμένου Wash και 78 ml απεσταγμένου νερού για κάθε 16 πηγαδάκια. Το αραιωμένο υπόστρωμα είναι σταθερό για μία εβδομάδα στους 2-8 C. 3. Ετοιμάστε τις αραιώσεις 1:101 των δειγμάτων υπό εξέταση προσθέτοντας 5 μl ορού σε 500μl αραιωτικό δείγματος. Η προετοιμασία των δειγμάτων θα πρέπει να γίνεται εντός 8 ωρών. Οι θετικος και ο αρνητικός πρότυποι οροί δεν χρειάζονται αραίωση. 4. Για την αποτελεσματικότερη ακρίβεια των αποτελεσμάτων προτείνεται η εις διπλούν τοποθέτηση όλων των διαλυμάτων αναφοράς, πρότυπων ορών ελέγχου και δειγμάτων. Συνιστάται η επανάληψη της εξέτασης των δειγμάτων. Διαδικασία 1. Όλα τα αντιδραστήρια και τα δείγματα θα πρέπει να βρίσκονται σε θερμοκρασία δωματίου (20 26 C) και να έχουν αναδευτεί καλά. Υπολογίστε τον απαραίτητο αριθμό πηγαδιών που απαιτούνται, και φυλάξτε τις υπόλοιπες στην ειδική θήκη την οποία θα πρέπει να την κλείσετε καλά ώστε να προστατέψετε την μικροπλάκα από την υγρασία. 2. Προσθέστε 100 μl πρότυπων ορών ελέγχου, υψηλού, χαμηλού, αρνητικού και των υπό έλεγχο αραιωμένων δείγματων στις προκαθορισμένες θέσεις. Καλύψτε την μικροπλάκα και επωάστε για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Ο χρόνος επώασης ξεκινάει με τη προσθήκη του τελευταίου δείγματος. 3

3. Πλύση: Ξεπλύνετε καλά κάθε πηγαδάκι από τα περιεχόμενα. Προσθέστε 200-300µL αραιωμένου ρυθμιστικού διαλύματος πλύσης HRP σε όλα τα πηγαδάκια και ξεπλύνετε. Επαναλάβετε τη διαδικασία δύο ακόμα φορές, για τρεις πλύσεις συνολικά. Αναποδογυρίστε την μικροπλάκα και τινάξτε την σε απορροφητικό υλικό για να αφαιρέσετε το εναπομείναν υγρό κατόπιν της τελικής πλύσης. Είναι σημαντικό κάθε πηγαδάκι να είναι εντελώς άδειο μετά από κάθε πλύση. Ακολουθήστε την ίδια διαδικασία για την πλύση όπως και για την προσθήκη των δειγμάτων. 4. Προσθέστε 100 μl HRP IgA συζεύγματος σε όλες τις πηγαδάκια. Το σύζευγμα πρέπει να αφαιρεθεί από τα φιαλίδια χρησιμοποιώντας τυπικές ασηπτικές συνθήκες και καλές εργαστηριακές πρακτικές. Αφαιρέστε από το φιαλίδιο την ποσότητα συζεύγματος που είναι απαραίτητη για την ανάλυση. ΠΡΟΣ ΑΠΟΦΥΓΗ ΕΝΔΕΧΟΜΕΝΗΣ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΚΗΣ Ή/ΚΑΙ ΧΗΜΙΚΗΣ ΜΟΛΥΝΣΗΣ, ΔΕΝ ΠΡΕΠΕΙ ΠΟΤΕ ΝΑ ΕΙΣΑΓΕΤΕ ΞΑΝΑ ΣΤΟ ΦΙΑΛΙΔΙΟ ΤΗΝ ΠΟΣΟΤΗΤΑ ΣΥΖΕΥΓΜΑΤΟΣ ΠΟΥ ΔΕΝ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΗΘΗΚΕ. Πραγματοποιήστε επώαση στα πηγαδάκια για 30 λεπτά, όπως στο βήμα 2. 5. Πλύση: Επαναλάβετε το βήμα 3. 6. Προσθέστε 100 μl TMB χρωμογόνου. Επωάστε τη μικροπλάκα για 30 λεπτά σε σκοτεινό μέρος. 7. Προσθέστε 100µL διαλύματος διακοπής αντίδρασης (HRP Stop Solution) σε κάθε πηγαδάκι. Ακολουθήστε την ίδια διαδικασία και πρόγραμμα του πρόσθετου διαλύματος διακοπής της αντίδρασης (HRP Stop Solution) όπως χρησιμοποιήθηκε για το χρωμογόνο TMB. Τινάξτε ελαφρά την μικροπλάκα με το δάκτυλο, για να αναμιχθούν εκτενώς τα πηγαδάκια. 8. Η μέτρηση της οπτικής πυκνότητας των δειγμάτων θα πρέπει να γίνει εντός μίας ώρας από το τέλος της διαδικασίας, σε φωτόμετρο στα 450 nm με φίλτρο αναφοράς 620 nm προαιρετικά. Ποιοτικός έλεγχος 1. Οι θετικοί και ο αρνητικός πρότυποι οροί ελέγχου θα πρέπει να χρησιμοποιούνται σε κάθε ανοσοενζυμική διαδικασία έτσι ώστε να εξασφαλίζεται ότι τα αντιδραστήρια και οι διαδικασίες λειτουργούν σωστά. 2. Οι θετικοί και ο αρνητικός πρότυποι οροί ελέγχου είναι ήδη αραιωμένοι. Γι αυτό το λόγο δεν μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως μέτρο ελέγχου της διαδικασίας αραίωσης των δειγμάτων. 3. Επιπλέον κατάλληλοι οροί, μάρτυρες, θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν από δείγματα ρουτίνας τα οποία θα αποθηκεύονται στη βαθιά κατάψυξη. πολιτειακών και\ ή των ομοσπονδιακών κανονισμών ή επικυρωμένων οργανισμών. Μπορείτε να ετοιμάσετε επιπλέον απαραίτητο ορό μάρτυρα διαιρώντας σε ίσα μέρη τα δείγματα ανθρώπινου ορού που βρίσκεται στα πηγαδάκια και φυλάσσοντας στους -20 C. 4. Για να θεωρηθούν τα αποτελέσματα έγκυρα θα πρέπει να ισχύουν τα παρακάτω κριτήρια. Στη περίπτωση που κάποιο κριτήριο δεν ισχύσει τότε θα πρέπει να επαναληφθεί η διαδικασία. α. Η απορρόφηση του υψηλού θετικού πρότυπου ορού ελέγχου (high positive) θα πρέπει να είναι μεγαλύτερη από την απορρόφηση του χαμηλού θετικού πρότυπου ορού ελέγχου (low positive) η οποία θα πρέπει να είναι μεγαλύτερη από την απορρόφηση του αρνητικού πρότυπου ορού ελέγχου. β. Η απορρόφηση του υψηλού θετικού πρότυπου ορού ελέγχου (high positive) θα πρέπει να είναι μεγαλύτερη από 1.0 ενώ η απορρόφηση του αρνητικού πρότυπου ορού ελέγχου δεν θα πρέπει να υπερβαίνει το 0.2. γ. Η απορρόφηση του χαμηλού θετικού πρότυπου ορού ελέγχου (low positive) θα πρέπει είναι μεγαλύτερη από το διπλάσιο της απορρόφησης του αρνητικού πρότυπου ορού ελέγχου ή μεγαλύτερη από 0.20. δ. Ο αρνητικός και ο υψηλός έλεγχοι δείχνουν την εγκυρότητα της διαδικασίας. Ο υψηλός θετικός δέν αντιστοιχεί στό σημείο αποκοπής της μεθόδου. ε. Ο χρήστης μπορεί να απευθυνθεί στό έγγραφο C24-A2 toυ CLSI (NCCLS) για περισσότερα στοιχεία του ποιοτικού ελέγχου. Υπολογισμός Αποτελεσμάτων Ο μέσος όρος απορροφητικότητας (O.A.) για κάθε διπλό δείγμα πρέπει πρώτα να υπολογισθεί. Η αντίδραση για κάθε δείγμα μπορεί μετά να υπολογισθεί διαιρώντας το μέσο όρο απορροφητικότητας του δείγματος με το μέσο όρο απορροφητικότητας του OMP Plus ELISA Low, και πολλαπλασιάζοντας το αποτέλεσμα με την τιμή του OMP Plus ELISA Low. Η τιμή του OMP Plus ELISA Low σε (units) φαίνεται στην ετικέτα του φιαλιδίου, που είναι 25 μονάδες. Τιμή δείγματος Ο.A. δείγματος (μονάδες) = X OMP Plus oρού ελέγχου (25 μονάδες) O.A. OMP Plus ορού ελέγχου Η αντιδραστικότητα σχετίζεται με την ποσότητα του παρόντος αντισώματος σε ένα μη-γραμμικό τρόπο. Ενώ οι αυξήσεις και οι μειώσεις στις συγκεντρώσεις των αντισωμάτων του ασθενή θα αντικατοπτρίσουν μια ανταποκρινόμενη άνοδο ή πτώση στην αντιδραστικότητα, η αλλαγή δεν είναι ανάλογη (π.χ. ένας διπλασιασμός της συγκέντρωσης του αντισώματος δεν θα διπλασιάσει την αντιδραστικότητα). Αν απαιτείται ακριβέστερη ποσοτικοποίηση των αντισωμάτων του εξεταζόμενου, πρέπει να γίνουν διαδοχικές αραιώσεις του δείγματος και η τελευταία αραίωση που θα μετρηθεί ως θετική στην ανάλυση θα αναφερθεί ως ισχύς διαλύματος αντισωμάτων του ασθενούς. 4

Ερμηνεία των Αποτελεσμάτων Η τεχνική ELISA είναι πολύ ευαίσθητη και ικανή να ανιχνεύει μικρές διαφορές στον ασθενή πλυθησμό. Οι κατωτέρω είναι ενδεικτικές τιμές. Κάαθε εργαστήριο πρέπει να καθορίσει τίς δικές του τιμές αναφοράς βάσει τών τεχνικών, ελέγχων, πλυθισμού κ.λ.π. Τα δείγματα ερμηνεύονται ως αρνητικά (αρνητικά για το αντίσωμα IgA έναντι OMP), ισότιμα ή θετικά (εντοπίζεται αντίσωμα IgA έναντι OMP) σύμφωνα με τον παρακάτω πίνακα. Μονάδες Αρνητικό 0.00 20.0 Αμφίβολα 20.1 24.9 Θετικό > 25 1. Το θετικό αποτέλεσμα δηλώνει την παρουσία αντισωμάτων IgA έναντι OMP και υποδηλώνει το ενδεχόμενο νόσου του Crohn. 2. Ένα δείγμα με αμφίβολες συγκεντρώσεις αντισωμάτων OMP Plus δεν μπορεί να αξιολογηθεί για την κατάσταση των αντισωμάτων. Αν τα αποτελέσματα παραμένουν αμφίβολα μετά την επαναληπτική δοκιμασία, το αποτέλεσμα πρέπει να αναφερθεί ως αμφίβολο ή/και πρέπει να ληφθεί πρόσθετο δείγμα. 3. Το αρνητικό δείγμα δηλώνει ότι δεν υπάρχει αντίσωμα IgA έναντι OMP ή ότι υπάρχουν συγκεντρώσεις κάτω από το όριο εντοπισμού της ανάλυσης. 4. Τα δείγματα που παρέχουν μετρήσεις Ο.Α. πάνω από τις μετρήσιμες τιμές του φωτόμετρου μικροπλάκας μπορεί να αναφερθούν ως μεγαλύτερες από την υψηλότερη μετρήσιμη Ο.Α. δια της μικρότερης θετικής Ο.Α. επί 25 ή μπορούν να αραιωθούν, να εξεταστούν ξανά και να επιτευχθεί μια υπολογισμένη τιμή. 5. Συνιστάται τα αποτελέσματα που αναφέρει το εργαστήριο να περιλαμβάνουν τα εξής: "Τα παρακάτω αποτελέσματα ελήφθησαν με την ανάλυση INOVA QUANTA Lite TM OMP Plus ELISA. Οι τιμές OMP που λαμβάνονται με μεθόδους ανάλυσης άλλων κατασκευαστών ενδεχομένως να μην μπορούν να χρησιμοποιηθούν κατ εναλλαγήν. Το μέγεθος των αναφερόμενων επιπέδων δεν μπορεί να συσχετιστεί με ένα τίτλο τελικού σημείου." Περιορισμοί της Μεθόδου 1. Η εύρεση αρνητικού αποτελέσματος για OMP Plus δεν αποκλείει την παρουσία νόσου του Crohn. 2. Η εύρεση αρνητικού αποτελέσματος για αντίσωμα OMP Plus δεν αποκλείει την παρουσία αντισωμάτων OMP επειδή η συγκέντρωση του αντισώματος μπορεί να είναι κατώτερη από το όριο εντοπισμού της ανάλυσης. 3. Το θετικό αποτέλεσμα της δοκιμής δηλώνει μόνο την παρουσία του αντισώματος έναντι OMP και όχι απαραίτητα νόσο του Crohn. 4. Για τη διάγνωση της νόσου του Crohn απαιτείται συγκεντρωτική τεκμηρίωση των δημογραφικών στοιχείων του ασθενούς, η κλινική παρουσίαση και άλλες διαγνωστικές δοκιμές. 5. Η απόδοση αυτής της ανάλυσης δεν έχει καθοριστεί για παιδιατρικό πληθυσμό. 6. Τα αποτελέσματα αυτής της μεθόδου δέν έχουν ελεγχθεί σάν ακριβεί γιά δείγματα εκτός ορού. 7. Ασθενείς με σύνδρομο του ευερέθιστου εντέρου δεν αξιολογήθηκαν με αυτήν την ανάλυση. Αναμενόμενες Τιμές Οι εκτιμήσεις επιπολασμού της νόσου του Crohn διαφέρουν σημαντικά από 10 έως 198/100.000. Η νόσος του Crohn είναι πιο συνηθισμένη στους πληθυσμούς της βόρειας Ευρώπης και της Βόρειας Αμερικής. Επηρεάζει άνδρες και γυναίκες περίπου σε ίσα ποσοστά και περίπου το 20% των ασθενών με νόσο του Crohn έχουν εξ αίματος συγγενή με κάποια μορφή IBD. Ο επιπολασμός της νόσου του Crohn είναι 3-8 φορές μεγαλύτερους στους Εβραίους Ashkenzai σε σχέση με το γενικό πληθυσμό. Την τελευταία δεκαετία, ένας αριθμός μελετών έχουν καταγράψει αύξηση του επιπολασμού της νόσου του Crohn σε διάφορες γεωγραφικές περιοχές. 5, 6 Φυσιολογικές Τιμές Τα δείγματα που συλλέγονται από 500 εμφανώς υγιή άτομα από United States (250 άνδρες και 250 γυναίκες) με μέση ηλικία τα 41 έτη (ηλικιακό εύρος 18-80 έτη) δοκιμάζονται με το QUANTA Lite TM OMP Plus ELISA. Η μέση τιμή που ελήφθη ήταν 12,5 μονάδες. Η οριακή τιμή ορίστηκε στις 25 μονάδες. Το αποτέλεσμα ήταν ειδικότητα της τάξεως του 94% (468/500). Ένα σύνολο 1186 ορών που αποτελούνται από 365 δείγματα από ασθενείς με νόσο του Crohn και 821 ασθενείς από ασθενείς χωρίς νόσο του Crohn, συμπεριλαμβανομένων δειγμάτων από 234 ασθενείς με ελκώδη κολίτιδα και 587 υγιή άτομα, δοκιμάστηκαν με την ανάλυση QUANTA Lite OMP Plus ELISA και την επιβεβαιωτική ανάλυση QUANTA Lite ASCA IgG ELISA. Δημογραφικές πληροφορίες για τον πληθυσμό ασθενών δεν ήταν διαθέσιμες. Τα δείγματα CD, UC και φυσιολογικά δείγματα για τη σύγκριση κλινικών μεθόδων ήταν Ευρωπαϊκής και Καναδικής προέλευσης. 5

Μελέτη Aληλεπίδρασης QUANTA Lite ASCA IgG ELISA Θετικό Αμφίβολα Σύνολο Θετικό 117 83 200 QUANTA Lite Αμφίβολα 201 785 986 OMP Plus ELISA Σύνολο 318 868 1186 Αμφίβολα αποτελέσματα μετρούμενα ως αρνητικά (δηλ. όχι θετικά) Ποσοστό συμφωνίας θετικών: 36.8% (117/318) Ποσοστό συμφωνίας αρνητικών: 90.4% (785/868) Γενική συμφωνία: 76.1% (117 + 785/1186) Κλινικές Ευαισθησία και Ειδίκευση Ένα σύνολο 1186 ορών που αποτελούνται από 365 δείγματα από ασθενείς με νόσο του Crohn και 821 ασθενείς από ασθενείς χωρίς νόσο του Crohn (συμπεριλαμβανομένων δειγμάτων από 234 ασθενείς με ελκώδη κολίτιδα και 587 υγιή άτομα) δοκιμάστηκαν με την ανάλυση QUANTA Lite TM OMP Plus ELISA και τα κιτ QUANTA Lite TM ASCA IgG και ASCA IgA ELISA. Διαφοροποίηση δειγμάτων νόσου του Crohn από δείγματα μη-crohn (ελκώδης κολίτιδα και φυσιολογικός μάρτυρας) Crohn s Ασθενείς χωρίς Σύνολο Ασθένεια νόσο του Crohn N =1186 Ασθένεια QUANTA Lite TM OMP Plus ELISA Θετικό 137 63 200 Αρνητικό 228 758 986 Σύνολο 365 821 1186 Αμφίβολα αποτελέσματα μετρούμενα ως αρνητικά (δηλ. όχι θετικά) Κλινικές Ευαισθησία: 37.5% (137/365) (95% CI, 0.325 to 0.427) Κλινικές Ειδίκευση: 92.3% (758/821) (95% CI, 0.903 to 0.941) Διαφοροποίηση δειγμάτων νόσου του Crohn από δείγματα ελκώδους κολίτιδας N = 599 Crohn s Ασθένεια Έλκώδης κολίτιδα Σύνολο QUANTA Lite TM OMP Plus ELISA Θετικό 137 26 163 Αρνητικό 228 208 436 Σύνολο 365 234 599 Αμφίβολα αποτελέσματα μετρούμενα ως αρνητικά (δηλ. όχι θετικά) Κλινικές Ευαισθησία: 37.5% (137/365) (95% CI, 0.325 to 0.427) Κλινικές Ειδίκευση: 88.9% (208/234) (95% CI, 0.841 to 0.926) Η χρήση των αποτελεσμάτων των OMP Plus IgA, ASCA IgG και ASCA IgA έδειξαν ότι ένα θετικό αποτέλεσμα και για τους τρεις δείκτες (τριπλό θετικό) σχετίστηκε με ευαισθησία 25.5% (93/365), αλλά με ειδικότητα 99.5% (817/821) και συνεπώς μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τον αποκλεισμό της νόσου του Crohn. Τουλάχιστον 1 δείκτης Τουλάχιστον 2 δείκτες 3 δείκτες θετικοί θετικός θετικοί Ευαισθησία Ειδίκευση Ευαισθησία Ειδίκευση Ευαισθησία Ειδίκευση 72.1% (263/365) 79.2% (652/821) 46% (168/365) 96.3% (791/821) 25.5% (93/365) 99.5% (817/821) Μελέτη Aληλεπίδρασης Οι οροί από 36 ασθενείς με διάφορες αυτοάνοσες ή μολυσματικές νόσους που είναι θετικοί για συσχετισμένα αντισώματα, περιλαμβανόμενων 8 με ρευματοειδή αρθρίτιδα, 2 με διαλυτό ηπατικό αντιγόνο (SLA), 2 με ηπατικό μικρόσωμα νεφρού (LKM), 2 με χρωματίνη, 2 με Jo-1.2 με κεντρομερές, 1 με SS-A, 2 με SS-B, 2 με αντι-μιτοχονδριακό αντίσωμα (AMA), 2 με ιστική τρανσγλουταμινάση (ttg), 1 με Scl-10, 1 με RNP, 3 με σπειραματική βασική μεμβράνη (GBM), 2 με μεγαλοκυτταροϊό (CMV), 2 με ιό ερυθράς, 2 με ιό έρπη γεννητικών οργάνων (HSV), εξετάστηκαν με την ανάλυση QUANTA Lite TM OMP Plus ELISA για την αξιολόγηση της ειδικότητας της ανάλυσης. Κανένα δείγμα δεν ερμηνεύθηκε ως θετικό και μόνο ένα δείγμα (ένας ασθενής με αυτοάνοση ηπατίτιδα που είναι θετικός σε SLA) ερμηνεύθηκε ως αμφίβολο σε 22.2 μονάδες με την ανάλυση OMP Plus ELISA. Πρόσθετες δοκιμασίες έδειξαν ότι το δείγμα ήταν ήπια θετικό για ASCA IgG (76.1 μονάδες) και είχε αμφίβολο επίπεδο αντισωμάτων ASCA IgA. Οροί από 226 ασθενείς με κοιλιακή νόσο εξετάστηκαν με την ανάλυση OMP Plus IgA ELISA και το 27% βρέθηκε θετικό. Στην ίδια κοόρτη, το 27% ήταν θετικό για ASCA IgA και το 31% για αντισώματα ASCA IgG. 14 (6.2%) ασθενείς με κοιλιακή νόσο ήταν τρεις φορές θετικοί (στα OMP Plus IgA, ASCA IgG και ASCA IgA). 6

Ακρίβεια και Επαναληψιμότητα Η απόδοση εντός της ανάλυσης αξιολογήθηκε για την ανάλυση QUANTA Lite TM OMP Plus ELISA ελέγχοντας 8 δείγματα και τον υψηλό θετικό ορό ελέγχου (HPC) του κιτ 8 φορές το καθένα. Απόδοση εντός της ανάλυσης του QUANTA Lite TM OMP Plus ELISA Spec. A Spec. B Spec. C Spec. D Spec. E Spec. F Spec. G Spec. H Μέσες Μονάδες 46.2 26.9. 45.5 26.3 41.8 24.5 23.9 21.8 Τυπική απόκλιση 1.17 0.78 2.91 0.72 0.93 0.86 0.83 0.46 Συντελεστής διακύμανσης % 2.5 2.9 6.4 2.8 2.2 3.5 3.5 2.1 Η απόδοση μεταξύ των αναλύσεων αξιολογήθηκε ελέγχοντας εις διπλούν 8 δείγματα, τον υψηλό θετικό ορό ελέγχου (HPC) του κιτ δύο φορές καθημερινά (μία φορά το πρωί και μία φορά το απόγευμα) για 3 ημέρες. Απόδοση ανάμεσα των αναλύσεων για το QUANTA Lite TM OMP Plus ELISA HPC Spec. 1 Spec. 2 Spec. 3 Spec. 4 Spec. 5 Spec. 6 Spec 7 Spec 8 Μέσες Μονάδες 69.8 50.0 26.6 54.1 29.2 46.2 27.3 24.7 23.5 Τυπική απόκλιση 2.35 0.74 0.89 2.23 1.07 1.63 1.14 1.07 0.89 Συντελεστής διακύμανσης % 3.4 1.5 3.4 4.1 3.7 3.5 4.2 4.3 3.8 Βιβλιογραφία 1. Merck Manual of Diagnosis and Therapy. 1999. Whitehouse Station, NJ. (www.merck.com/pubs/mmanual). 2. National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK). Crohn s Disease. NIH Publication No. 98-3410, 1998. (www.niddk.nih.gov/health/digest/pubs/crohns/crohns.htm). 3. Coche, J.-C. & Colombel, J.-F. Heterogeneity of Inflammatory Bowel Disease: Clinical Subgroups of Patients. Res. Clin. Forums 20, 135-145 (1998). 4. Bernstein, C. N., Blanchard, J. F., Rawsthorne, P. & Wajda, A. Epidemiology of Crohn's disease and ulcerative colitis in a central Canadian province: a population-based study. Am J Epidemiol 149, 916-24 (1999). 5. Loftus, E. V., Jr. et al. Crohn's disease in Olmsted County, Minnesota, 1940-1993: incidence, prevalence, and survival. Gastroenterology 114, 1161-8 (1998). 6. Niv, Y., Abuksis, G. & Fraser, G. M. Epidemiology of Crohn's disease in Israel: a survey of Israeli kibbutz settlements. Am J Gastroenterol 94, 2961-5 (1999). 7. Joossens, S. et al. The value of serologic markers in indeterminate colitis: a prospective follow-up study. Gastroenterology 122, 1242-7 (2002). 8. Rutgeerts, P. & Vermeire, S. Clinical value of the detection of antibodies in the serum for diagnosis and treatment of inflammatory bowel disease. Gastroenterology 115, 1006-9 (1998). 9. Norman, G. Anti- Saccharomyces cerevisiae antibodies in inflammatory bowel disease. Clin Applied Immunol Rev 2, 45-63 (2001). 10. Sendid, B. et al. Anti-Saccharomyces cerevisiae mannan antibodies in familial Crohn's disease. Am J Gastroenterol 93, 1306-10 (1998). 11. Landers, C. J. et al. Selected loss of tolerance evidenced by Crohn's disease-associated immune responses to auto- and microbial antigens. Gastroenterology 123, 689-99 (2002). 12. Sutton, C. L. et al. Identification of a novel bacterial sequence associated with Crohn's disease. Gastroenterology 119, 23-31 (2000). 13. Papp, M., et al. New Serological Markers for Inflammatory Bowel Disease are Associated with Earlier Age at Onset, Complicated Disease Behavior, Risk for Surgery, and NOD2/CARD15 Genotype in a Hungarian IBD Cohort. Am J. Gastroenterol 102:1-17 (2007). 14 Ferrante, M. et al. New Serological Markers in inflammatory Bowel Disease are associated with complicated disease behaviour. Gut 56: 1394-1403 (2007). 15. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control and Prevention/National Institutes of Health, Fifth Edition, 2007. Κατασκευαστής: Technical Service 888-545-9495 INOVA Diagnostics, Inc. 624530GRC November 2008 9900 Old Grove Road Revision 1 San Diego, CA 92131 United States of America Aντιπροσωπευτικός: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D-66386 St. Ingbert, Germany Tel.: +49-6894-581020 Fax.: +49-6894-581021 www.mt-procons.com 7