رو شهای همسانه سازی ژن بدون آنزیم لیگاز

ر شهای همسانه سازی ژن بدن آنزیم لیگاز فنآری زیستی در کشارزی/ جلد یازدهم/ شماره ال/ تابستان 19 Gene Cloning Methods Without Ligase Enzyme *9 اصغر میرزائی اصل محمد رضا عبداللهی چکیده همسانهسازی قطعه مردنظر داخل یک ناقل پالسمیدی یکی از مراحل تکنلژی نترکیب است. در رشهای معمل برای همسانهسازی به آنزیم لیگاز آنزیمهای برشی نیاز است که با محددیتهایی ماجه هستند. راهکارهای متعددی برای ایجاد اتصال د قطعه مستقل بدن استفاده از آنزیم لیگاز تسعه یافتهاند که از مفقترین آنها فناریهای گیتی یزرفرندلی هستند. فناری گیتی رشی سریع مؤثر برای همسانهسازی بر اساس خصصیتهای ناحی یژه نترکیبی باکتریفاژ المبدا است. در این فناری اجزای سیستم نترکیب این یرس برای ایجاد یک سیستم کارآمدتر تغییر یافتهاند. نترکیبی بین ناحی یژه اتصال رخ میدهد که د طرف قطعه را احاطه میکنند. در این فناری تالی مرد نظر ابتدا در یک ناقل به نام ناقل ردی همسانهسازی میشد. پس از ایجاد کلن ردی انتقال قطعه به ناقلهای دیگر با اکنش نترکیبی یک ساعته بدن استفاده از آنزیمهای برشی آنزیمهای اتصال دهنده لیگاز بهراحتی انجام میگیرد. در فناری یزرفرندلی از آغازگرهایی استفاده می- شد که دارای تالی ناقل هستند یک نکلئتید داکسی اریدین دارند هدف را با پلیمرازی نظیر تک پلیمراز تکثیر میکنند. محصل PCR با مخلط آنزیمی یژهای تیمار میشدکه انتهای 3 تک رشتهای بر ری قطعات تکثیر شده با PCR ایجاد می- کند. با این عمل قطعات داری دنبالههای تک رشتهای طیلتر از محصالتی هستند که با آنزیمهای برشی ایجاد میشند برای اتصال به ناقل به آنزیم لیگاز نیازی نیست. با تغییر در طراحی آغازگرها در این رش همسانهسازی به راحتی دستکاریهای مختلف امکانپذیر است. در این مقاله به جنبههای کلیدی مزایای این رشها پرداخته شده است. کلمات کلیدی: همسانهسازی ژن فناری گیتی فناری یزرفرندلی 5. استادیار گره بیتکنلژی دانشکده کشارزی دانشگاه بعلی سینا. استادیار گره زراعت اصالح نباتات دانشکده کشارزی دانشگاه بعلی سینا همدان *: نیسنده مسل 15 Email: a.mirzaie@basu.ac.ir

ر شهای همسانه سازی ژن بدن آنزیم لیگاز مقدمه همساانهساازی یاک قطعاه داخال یاک ناقال پالسمیدی یکی از مراحل معمل تکنلژی نترکیاب است. در رشهای معمل همسانهسازی به آنزیم لیگااز نیااز است که باهطار کالنسای انتهاای ساازگار قطعاه پالسمید خطی شده را باه هام متصال کناد یاک ملکال حلقی تشکیل دهد تا قادر به تکثیر در داخل سالل میزباان شد. چنانچه همسانه سازی محصل PCR مرد نظر باشاد میتان آغازگرهایی طراحی نمد که سایتهای برشی آنزیم- های خاصی را داشته باشد پس از هضام آنزیمای محصال PCR قطعات با انتهای چسبنده را به ناقل هدف منتقل نمد. همسانهسازی با انتهاای صااف محصاالت PCR نیاز ممکان است اما اغلاب کاارایی همساانه ساازی پاایین حتای کاار سختتر است چرا که اغلب یک نکلئتید اضافی در انتهای 3 محصالت PCR جد دارد ( 1990; Jong, Aslanidis and de.)clark, 1988 برای حذف نکلئتید اضاافی از انتهاای 3 باه استفاده از قطعه کلنا پلیماراز نیااز اسات. همچناین ضرری است که مانع از تلید ناقلهای غیر نترکیب با تیمار الکالین فسفاتاز شد.)Maniatis et al., 1982( از طرفی فرایند همسانهسازی نیاز به استفاده از آنزیمهای برشی دارد هضام آنزیمی در همسانهسازی با محددیت ماجه اسات. از جملاه اینکه از هر آنزیم نمیتان استفاده کرد چرا که ممکن اسات داخل ژن را برش دهد. عاله بر آن کارایی همساانهساازی باا بزرگ بدن اندازه ژن اغلب پایین میآید. بسیاری از پلیمرازهاای نظیار تاک پلیماراز در انتهای 3 قادر به اضاافه کاردن یاک نکلئتیاد باه دنبالاه 3 انتهای صاف قطعات هستند. آنزیم تک پلیماراز (Taq polymerase) بااه انتهااای 3 د رشااته ای از طریااق فعالیت شبیه ترمینال ترانسفرازی نکلئتید آدنازین اضاافه می کند.)Clark, 1988 and Hu, 1993( PCR بیشاتر محصاالت بهسیله آنزیم تک پلیماراز تلیاد مایشاند بناابراین دارای دنباله 3 باز آدنین خاهناد باد. بارای همساانهساازی مستقیم این محصالت PCR رشی پیشنهاد شد که نیااز باه استفاده از ناقلهای خطی T PGEMT-T است. در ایان رش ناقالهاای PGEM-T Easy Vector باا آنازیم EcoRV برش داده میشند به د انتهاای 3 آنهاا تیمیادین اضاافه میشند. مکمل بدن دنبالههای محصل PCR ناقل امکان اتصال محصل PCR را به ناقل T فراهم میسازد که این راه- کاار باه همساانهساازی TA معارف اسات ( تغییراتی این رش بهطر عممی قابل استفاده در همساانه- سازی شده اسات.)Zhou et al., 1995( هماه قطعاات بهجز آنهایی که دارای دنباله 3 هستند با تیمار با آنزیم تک- پلیمراز در حضر هر چهار dntp انتهای باا دنبالاه 3 آدناین بهدست خاهند آرد. قطعات حاصل از هضام آنزیمای که دارای دنباله انتهای 3 هستند ابتدا با آنزیم پلیمراز T4 انتهای آنها صاف میشد سپس با آنازیم تاک پلیماراز تیمار میشند. رشهای همسانهسازی بدن استفاده از آنازیم لیگااز نیز معرفی شدهاند. در این رشها قطعات با دنبالههای 3 بلند )51 تا 5 نکلئتید( بر ری محصالت PCR ایجاد میشد کا ه با هطا ر اختصاصای با ه تا الی مکمال در ناقال پالسمیدی متصل میشند. محصل حاصل بهطر مستقیم به ساللهاای مساتعد ارد مایشاند. در ایان رشهاا باه آغازگرهای طالنی تغییرات آنزیمی نیاز اسات )آساالندیز Li دی یانگ Hsiao, 1993 1990 Kaluz and Flint, 1994 Oster and Phillips, 2011 and Elledge, 2012 1995, Rashtchian ز گماز ساانچز 2000(. د فنااری گیتی )Walhout et al. 2000( یزرفرندلی Bitinaite et ( )al., 2007 از رشهایی هستند که با مفقیت تجاری ساازی شدهاند در تحقیقات متعددی از آنها استفاده شده است که در این مقاله به هر یک از آنها پرداخته میشد. فناری گیتی یترژن همسانهسازی فناری گیتی (Gateway) (Invitrogen) از بین میبرد. که تسط شرکت این- ارایه شده است محددیتها را در در این سیستم تالی مرد نظر ابتدا در یک ناقل به نام ناقل ردی همسانهسازی میشد. پس از ایجاد کلن ردی (Entry clone) انتقال قطعه به ناقلهای دیگر با اکنش نترکیبی یک ساعته بدن استفاده از آنزیمهای برشی آنزیمهای اتصال دهنده لیگاز به راحتی انجام میگیرد. پرتئینهایی انجام میگیرد اکنش نترکیبی در حضر تالیه یا که به خاصی) att ( متصل میشند آنها را برش داده اتصال کالنسی با دارند مجب نترکیبی میشند. فناری گیتی رشی سریع مؤثر برای همسانهسازی بر اساس خصصی- های ناحی یژه نترکیبی باکتریفاژ المبدا است Hartley (.)et al., 2000 در این فناری اجزای سیستم نترکیب این یرس برای ایجاد یک سیستم کارآمدتر تغییر یافتهاند. ملکل باکتریفاژ المبدا در مسیر لیزژنیک در اثر Holton and Graham, 1991; Marchuk et al., 1991; Mead et al.,.)1991; Zhou and Gomez-Sanchez, 2000 بااا انااد 1

فنآری زیستی در کشارزی/ جلد یازدهم/ شماره ال/ تابستان 19 عمل نترکیبی ارد کرمزم سلل میزبان میشد که در این عمل تالیهای خاصی از فاژ (attp) (attb) یکسان دخالت دارند. 51 معرف هستند. کرمزم باکتری این د تالی دارای ناحیههای کتاه جفت بازی میباشند که به البته مرکزی نیز برای عمل رد تالیهای مرکزی تالیهای اضافی در د طرف تالی فاژ به کرمزم باکتری الزم هستند. برای انجام عمل نترکیبی بین این تالیها به جد یکی از محصالت ژن فاژ المبدا به نام اینتگراز پرتئینهای دیگر میزبان (int) (Integration Host Factor) است. آنزیم اینتگراز بهطر اختصاصی تالی میکند attp )Thompson et al., 1987( attp attb مرکزی( در نتیجه از یکدیگر متفات هستند میشد که با هر یک از تالیه یا از آنجا که نیاز را شناسایی تالیه یا )بهجز تالی ناحیه نترکیبی بین آنها د تالی تلید attp attb ناحیه مرکزی متفات است. این تالیها به نامهای در د طرف attl attr شناخته میشند. پرتئین ژن اینتگراز که مجب عمل نترکیبی اختصاصی جایگاههای انجام نترکیبی بین attb attp attl attr میشد قادر به نیست لذا نمیتاند سبب برش پرفاژ جدایی آن از کرمزم باکتریایی شد. زمانیکه مسیر لیزژنیک متقف شده فاژ ارد چرخه لیتیک میشد هدف محصل ژن دیگری (Excisionase) int با پرتئین اکنش داده سبب تغییر در اختصاصیت آن میگردد. بهطری که منجر به نترکیبی د تالی attl attr میشد ه یا میشند که باعث جداسازی.)Dale and Park, 2004( فاژ از ژنم باکتریایی این اکنشه یا LR پایه فناری کلنینگ گیتی هستند. در این فناری تالی- تالی اکنش اکنش یافته att تغییر attp به گنهای است که تالی attb فقط با اکنش میدهد برای مثال یا میدهد فقط با attb1 attp1 فقط با attl1 attr1 میدهد. اکنش در حضر پرتئینهای اینتگراز فاژ المبدا پرتئنهای فاکتر الحاقی میزبان به نام مخلط آنزیمی کلناز اکنش LR های فاکتر الحاقی میزبان اکسیژناز کلناز در حضر اینتگراز فاژ المبدا پرتئین- (XIS) LR به نام مخلط انجام میگیرد. سه نع ناقل در این رش طراحی شده در دسترس است. ناقل بخشنده دارای تالی احاطه شده با (Donor vector) attp است که برای کلن کردن محصل تالیهیا که PCR attb (Entry vector) که دارای تالیه یا بهکار میرد. attl ناقل ردی است که برای کلن کردن قطعات ناقل مقصد اکنش تالیهیا فاقد att (Destination vector) LR.)5 استفاده میگردد. که با ناقل ردی در یک نترکیب میشد تا ناقل بیانی ایجاد شد )شکل ناقلهای مقصد عناصر الزم برای بیان ژن هدف در باکتریها گیاهان یا پستانداران را دارند Anonymus, (.)2006 برای ایجاد کلن ردی د تالی باید attb2 attb1 به آغازگرهای اختصاصی که برای تکثیر ژن مرد نظر استفاده میشند اضافه شاند. قطعاه باا یاک ناقال بخشانده ترکیب میشاد کاه دارای تاالیهاای در د attp2 attp1 طرف یک ژن گزینشگار ccdb مایباشاد. باا اضاافه کاردن مخلط آنزیمی کلنااز باه اکانش کلان ردی ایجااد میشاد. محصاالت اکانش عبارتناد از ناقال ردی دارای قطعه مرد نظر که د طرف آن را تالیه یا کردهاند همچنین ژن گزینشگر L1 L2 ccdb که تالیه یا احاطاه R1 R2 در د طرف آن میباشند. حضر ژن ccdb امکان انتخاب منفای ناقالهاای بخشانده مقصاد در E. coli را بادنبال نترکیبی تراریختی فراهم میسازد. پرتئین CcdB با آنزیم گیراز باکتری E. coli شد تاا بسایاری از سایههاا نظیار ژن بر همکانش دارد مجاب مای- رشاد TOP10 DH5α نکنند. هنگامیکه نترکیبی در فناری گیتی رخ میدهاد ccdb با ژن مرد نظر جایگزین میشد. سللهایی کاه ناقلهای غیرنترکیب را دریافت نمدهاند یا ملکال دارای ژن ccdb را حمل میکنند رشد نخاهند کارد ایان شرایط امکان کلنینگ با کارایی زیاد را امکانپذیر مایساازد. این انتخاب منفی همراه با انتخاب مثبت برای نشانگر مقامت به آنتی بیتیکی است که اجازه رشد به سللهاایی مایدهاد که ناقل ردی یا ناقل بیانی را دریافت کرده باشند. att تالیهای باشند. هنگامیکه جهت تالی پالینادرمی نباده دارای جهات مای att سمت داخل قطعه نشان داده نشد باا r باه گناهای باشاد کاه باه مشاخ مایگاردد. محصل اکنشهای زنجیره ای پلیمرازی که بارای مثاال باا attbr3 )شکل احاطه شده است در کلن ردی attr3 خاهاد باد (. پس از ایجاد ناقل ردی انتقال قطعه مرد نظر از پالسمیدی به پالسمید دیگر تهیه ناقلهای بیانی به- طر مؤثر انجام خاهد گرفت.)Anonymus, 2006( 1

ر شهای همسانه سازی ژن بدن آنزیم لیگاز شکل 5 : اکنش LR رخ میدهد. نترکیبی بین تالیه یا در سیستم گیتی. A) اکنش پایه attb attp تلید تالیه یا بین ناقل دهنده محصل PCR یا سایر کلنهای دارای تالیه یا attl attr می کند. B) اکنش LR بین کلن ردی ناقل attp attr attl attb مقصد رخ میدهد. نترکیبی بین سایتهای تلید سایتهای attb در پالسمیدهای حاصل میکند. کلن بیانی که دارای محصل PCR است در سیستم بیانی استفاده میشد پالسمیدی که محصل فرعی است دارای ژن گزینشگر ccdb است نام 2006(. مانع از رشد سللهای مستعد سیه mach1 میشد که آن را در تراریختی دریافت کرده باشند یب ( Figure1. and LR reactions in Gateway technology. A) The reaction is the basis for the reaction between the donor vector (pdonr ) and PCR products or other clones containing attb sites. Recombination between attb and attp sites yields attl and attr sites. B) The LR reaction is the basis for the entry clone(s) destination vector reaction.recombination between attl and attr sites yields attb and attp sites on the resulting plasmids. The expression clone containing the PCR product is used in your expression system. The by-product plasmid contains the ccdb gene and prevents growth if taken up by Mach1 T1R competent cells after transformation (Anonymous, 2006). attbr شکل : سه محصل اکنش زنجیرهای پلیمراز که با تالیهای attb یا احاطه شدهاند سه ناقل گیتی برای اکنش جداگانه برای ایجاد کلنهای ردی به کار رفتهاند. کلنیهای ردی ایجاد شده یک ناقل هدف در اکنش LR برای ایجاد یک کلن بیانی استفاده شدهاند ( یب 2006(. نام Figure 2. Three PCR products flanked by specific attb or attbr sites and three MultiSite Gateway Pro Donor vectors are used in separate recombination reactions to generate three entry clones. The three entry clones and a destination vector are used together in a MultiSite Gateway Pro LR recombination reaction to create your expression clone containing three elements (Anonymous, 2006). 15

فنآری زیستی در کشارزی/ جلد یازدهم/ شماره ال/ تابستان 19 گیتی چندگانه ساخت بسایار ماؤثر ساریع یاک کلن بیاانی از د ساه یاا چهاار قطعاه مارد نظار را تسااهیل ماایکنااد. فناااری گیااتی چندگانااه امکااان همسانهسازی همزمان چند قطعه باهترتیاب مشاخ شده منظم را فراهم میسازد. برای این کاار نیااز باه ایجااد کلنهای ردی به تعداد قطعات مرد نظار اسات. در شکل گیتی سه تایی نشاان داده شاده اسات. ابتادا ساه کلن ردی ایجاد میشد که با ناقال مقصاد بااهم در یاک اکنش نترکیبی LR شرکت مییابند. برای ایجاد هر یاک از کلنهای ردی از اکنش نترکیبی استفاده میشد که برای انجام این کار ابتدا تالی مرد نظر با یکی از اناع تالیه یا attb ناقل بخشنده دارای تالیهای احاطه شده ساپس در یاک اکانش attp باا شرکت مینمایند. به این- ترتیب کلنهای ردی دارای قطعه ال با تالیهای احاطاه کننده L1-L4 سم با تالیهاای قطعه دم باا تاالیهاای R3r-R4r L4-L2 قطعاه ایجااد مایشاند. ایان ساه کلان ردی در یک اکنش LR با ناقل هدف با تالهاای R1-R2 قرار گرفته هر سه قطعه در یک اکانش باا هام ارد ناقال دگانه میشند ( یب نام فناری یزر فرندلی.)2006 فناری یزر فرندلی نیز ابسته به آنازیمهاای برش یا نیست به آنزیم لیگااز بارای ارد کاردن محصال PCR باه داخل ناقل نیاز ندارد. در عض از آغازگرهاایی اساتفاده مای- شد که تالی ناقل را شامل میشند یک نکلئتید داکسی اریدین دارند هدف را باا آنازیم تاکپلیماراز تکثیار میکنند. اکنش PCR بایاد باا آنازیم پلیمارازی نظیار تاک پلیمراز (USER enzyme) انجام شد که بتاند یاک داکسای آدنین در مقابل بازهای اراسیل قرار دهد. محصال PCR باا آنزیم یزر تیمار میشد تا در انتهای 3 تک رشتهای شاند. این آنزیم نکلئتیدهای داکسای اریادینهاا را بارای ایجااد انتهای 3 تک رشتهای بر ری قطعات تکثیار شاده باا PCR حذف میکند. آنزیم یازر مخلاطی از آنازیم اراسایل گلیکاالز انادنکلئاز بااکتری VIII E. coli.)jiang et al., 1997; Lindahl et al., 1977( اسات ایان د آنازیم یک شکاف در الیگنکلئتید د رشتهای دارای یاک داکسای اریدین جفت شده با داکسی آدنین ایجاد مایکنناد. باا ایان عمل دنبالههای تک رشتهای ایجاد میگردد کاه طیالتار از محصالتی هستند که با آنزیمهای برشی ایجاد میشند. تاک رشته ایجاد شده مکمل خدش نیست همچنین تک رشته- ایهای د طرفه قطعه نیز نسبت به همدیگر مکمال نیساتند تا شرایط اتصال غیر اختصاصای ناحیاه تاک رشاتهای فاراهم گردد. همانطر که در شکل نشان داده شاده اسات هدف بهعناان د قطعاه اساطه هامپشاان در د اکانش جداگانه تکثیر میشاند. آغاازگر P1 تکثیر قطعه سمت راست آغاازگر P2 آغاازگر راسات بارای آغاازگر چا بارای تکثیر قطعه سمت چ نیاز است. آغازگرهای همپشان P1 P2 میتانند در محلی از تالی انتخاب شند که ایجاد متاسین در آن محل مرد نظر باشاد باهنحای کاه تاالی مرد نظر تغییر یابد. د آغازگر P1 P2 از رشتههای مخاالف هدف مجب اکنش میشند در 6 تا 51 نکلئتیاد انتهای 13 همدیگر را میپشانند. هر آغاازگر همپشاان دارای یک نکلئتید داکسی اریدین است کاه تساط ناحیاه هام- پشان در طرف 3 احاطاه شاده اسات. بارای ایجااد قطعاات سازگار با ناقل آغازگرهای چ راست باا هشات نکلئتیاد اضافی در انتهای 13 طراحی میشاند. ایان هشات نکلئتیاد مشابه تک رشتههاای ایجااد شاده در ناقالهاای ساازگار باا یزرفرندلی نظیر ناقل pneb206a هستند )شکل ( بهجاز اینکه بهجای نکلتید داکسای تیماین انتهاای 3 در تاالی آغازگر نکلئتید داکسای اراسایل جاایگازین شاده اسات. پایین دست این هشت نکلئتید مطابق با تاالی اختصاصای هدف است. پلیمرازها یاک آدناین باه رشاته در حاال ساخت مخالف باز اراسیل رشته الگ متصل میکنند. قطعات تکثیر یافته در اکنش PCR با آنزیم یزر در بازهای اراسیل برش مییابند قطعاتی که در د انتهای خد 3 تک رشتهای دارند بهدسات مایآیاد. ناقال خطای شاده pneb206a قطعات PCR بهطر مستقیم بهم متصل میشاند ملکال مرد نظر حاصل میشد بهطریکه دنبالاههاای 3 قطعاات PCR از داخل مکمل یکدیگر هستند از خارج انتهای 3 تک رشتهای قطعات مکمل تک رشتههای ناقل خطی هستند. به- دلیل 6 تا 51 نکلئتیدی بدن محل اتصال نیازی باه آنازیم لیگاز نیست اکنش اتصال تلید محصل زیااد نترکیاب تضمین شده با کارایی بااالیی انجاام مایشاد )بیتینیات همکاران.) 112 این رش همسانهسازی باه راحتای قابال تطبیاق باا دستکاریهای مختلف است. در این حالت تنها چیازی که تغییر مییابد طراحی آغازگرها است بقیه مراحال بارای دستکاریهای یکسان است. با طراحی آغازگرهای هم- پشان P2 P1 بهطریکه دارای متاساین نقطاهای مارد نظار باشاند )شاکل 5( مایتاان تاالی هادف را باا ایجااد 11

ر شهای همسانه سازی ژن بدن آنزیم لیگاز متاسین نقطهای بطر همزمان کلن نمد. همچناین مای- تان به تالی هدف بخشی را اضافه یا حذف نمد یا اینکه د قطعه غیر همپشان را به هم متصل نمد )شکل 5(. p1 p2 شکل : شکل شماتیک رش مهندسی بهرش یزفرندلی خطط با ن پیکان آغازگرها هستند. خطط ضخیم در آغازگرهای محصل PCR تالیهای همپشان هستند. مثلثهای سیاه در آغازگرها به متاسینهای نقطهای اشاره دارند مثلثهای سفید نتیجه متاسین در محصل PCR هستند. نکلئتید داکسی اریدین با U مشخ شده است. تالی اختصاصی GGAGACAU در آغازگر چ تالی GGGAAAGU در آغازگر راست برای سازگاری با تالی ناقل pneb206a طراحی شدهاند )بیتینیت همکاران (. 112 Figure 3: Schematic description of the USER friendly Engineering method. Lines with the arrowheads symbolize PCR primers. Boldface lines within the P1 and P2 primers and PCR products symbolize complementary overlapping sequences. Black triangles refer to the point mismatches in the primers and white triangles refer to the resulting mutations in the PCR products. du is indicated by U. The specific sequences GGAGACAU in the left primer and GGGAAAGU in the right primer are designed for their compatibility with the vector pneb206a sequence (Bitinaite et al., 2007). 16

فنآری زیستی در کشارزی/ جلد یازدهم/ شماره ال/ تابستان 19 شکل 5: آغازگرهای PCR برای دستکاریهای مختلف طراحی شدهاند )بیتینیت همکاران (. 112 دستکاریهای با مراحل 5 تا 5 شکل کامل میشد. (A) پایین دست باز اراسیل در داخل آغازگر یا متاسین اختصاصی: تالی مرد نظر تغییر یافته با مثلث سیاه نشان داده شده است که در معرفی میشد. نع دیگر متاسین در شکل نشان داده شده است که در ناحیه (C) حذف P2 P1 همپشان د آغازگر قرار دارد. (B) تالی نکلئتیدی: ناحیه همپشان د آغازگر ارد کردن تالی نکلئتیدی: تالی مرد نظر به انتهای 13 هر د آغازگر اضافه شده است. P1 P2 درست از مجار ناحیه حذفی )محلی که با نقطه چین مشخ شده است( (D) سر هستند. انتهای 13 آغازگر P1 مکمل آغازگر P2 به انتهای 13 آغازگر دیگر است هم کردن تالی: برای ایجاد همپشانی مکمل تالی انتهای 13 یک آغازگر اضافه میشد که برای اتصال د قطعه مستقل ضرری است. Figure 4: PCR primer design for various manipulations. The indicated manipulations are completed by performing steps 1 4 shown in Figure 3. (A) Site-specific mutagenesis. The desired sequence change, shown as a black triangle, is introduced downstream of du into either of the overlapping primers P1 or P2. An alternative is shown in Figure 3 where sequence changes are introduced into the overlap sequence of both primers. (B) Nucleotide sequence insertion. The desired non-priming sequences are added to the 5 ends of both primers (shown as angled lines). The overlapping sequence is created from the 5 terminal 6 10 nucleotides of the insertion sequences (C) Nucleotide sequence deletion. The overlapping primers P1 and P2 prime distant locations precisely adjacent to the targeted deletion region (shown as a dotted line). To create the overlapping sequence, the 5 end of one primer (P2) is supplemented by a non-priming sequence complementary to the 5 end sequence of the other primer (P1). (D) Sequence assembly. A complimentary copy of the 5 terminal sequence of one primer (P1) is added to the 50 terminus of the other primer (P2) to create the overlapping sequence necessary for joining two independent s (Bitinaite et al., 2007). (P2) (P1) Greagg et al. ( Vent یا هیچیاک از پلیمرازهاای طبیعای نظیار نمیتانند از آغازگرهاایی کاه دارای بااز اراسیل هستند محصل PCR تلید کنناد al. 1996.)1999 and Lasken et این پلیمرازهاا یاک ناحیاه Pfu Deep- Vent 12

ر شهای همسانه سازی ژن بدن آنزیم لیگاز اتصال بااز اراسایل دارندکاه اداماه پلیمریزاساین را بعاد از PCR یریدین بلکه می کند )گریج همکاران Fogg et 1999.)al. 2002 PfuCx است. آنزیم در رش یزرفرنادلی از پلیماراز تصاحین کنناده استفاده میشدکه میزان اشتباه PCR آن بسیار ناادر Pfu مشتق شاده از پلیمراز PfuCx اسات که از طریق دستکاری ژنتیکی بهدست آماده اسات )فااگ همکاران.)2002 عاله بر آنزیم PfuCx پلیماراز دیگاری کاه با یزرفرندلی سازگار است آنزیم تک پلیمراز است. اگار چاه آنزیم تک پلیمراز میزان اشتباه زیادی دارد اماا در آزماایش- های متعددی از ایجاد متاسین نقطاهای اتصاال ژنهاا باا رش یزرفرندلی با مفقیت استفاده شده است. بیشترین تعداد قطعات PCR که با مفقیات در یاک اکنش به هم متصل شدهاند هفت قطعه بده اسات. کاارایی سرهم کردن قطعات PCR تا حاد زیاادی بساتگی باه یگاناه بدن تالیهای نکلئتیدی در محال اتصاال دارد. در برخای مارد انتخاب محل اتصال به دلیل محتای ناخاسته آدناین/ تیمین در هدف محدد است. قتیکه بیش از 1 قطعه در یک اکنش سرهم میشند احتماال زیاادی جاد دارد که محل اتصالها به هم شباهت داشته باشند قطعاات نادرست به هم متصل شند. یک سری از ناقلهای سازگار باا یزرفرنادلی معرفای شاده اسات. در ایان ناقالهاا از گارههاای شاکاف دهناده اندنکلئازی استفاده شده اسات کاه فقاط یاک رشاته از د رشته را در محل اختصاصی برش میدهند. تاالی اختصاصای این آنزیمها برای ایجاد محل رد قطعه به ناقل استفاده می- شد. ناقل pneb206a رشتهای به سایتهای )شاکل 1( باا اتصاال یاک تاالی د ناقل PmeI PacI pneb193 حاصال شده است در این ناقل تالی اختصاصی آنزیم شکاف دهناده Nt.BbvCI قرار دارد که هفت جفت باز CC TGAGG مای- باشد این آنزیم فقط یک شاکاف در تاک رشاته دارای تاالی شناسایی ایجاد میکند. تالی شناسایی این آنازیم در تاالی- های ناقلهای همسانهسازی مجد نیست. هضام آنزیمای در ناقال pneb206a باا د آنازیم ناقال را XbaI Nt.BbvCI خطاای نمااده آماااده باارای اکاانش اتصااال مااینمایااد. شکل 1 : شکل شماتیک ناقل همسانهسازی pneb206a )بنیتیت همکاران )A در 2007(. ناقل pneb206a Nt.BbvCI با خط محلهای برش با فلش مشخ شده است. (B برای همسانهسازی یزرفرندلی ناقل با د آنزیم تالی شناسایی XbaI XbaI Nt.BbvCI هضم آنزیمی میشند تا ناقل خطی با تک رشتههای 3 در د طرف ایجاد شد. Figure 5: Schematic representation of the pneb206a cloning vector. (A) Within the cassette, XbaI and Nt.BbvCI recognition sequences are underlined;cleavage sites are shown by arrows. (B) For USER friendly cloning, pneb206a is double-digested with XbaI and Nt.BbvCI to produce linearized vector flanked by 3 single-stranded extensions on both ends. 15

فنآری زیستی در کشارزی/ جلد یازدهم/ شماره ال/ تابستان 19 بحث انتقال ژن از طریق اگرباکتریم تمهفاسینس (Agrobacterium tumefaciens) رشی مثر در بسیاری از گنههای گیاهی قارچی است. در این رش ژنها بین د ناحیه راست چ T- ناقلهای دتایی کلن میشند. این ناقلها معمال بزرگ بده همسانهسازی آنها قتگیر است. تکنیکهای جدیدی برای رفع این مشکل ایجاد شده در حال تسعه هستند. فناری گیتی پتانسیل زیادی برای همسانه سازی راحتتر سریعتر فراهم نمده است. کریمی همکاران )2002( مجمعهای از ناقلهای دگانه سازگار با فناری گیتی تهیه کردهاند )کریمی همکاران این ناقلها از پالسمید الیه.)2002 Hajdukiewicz et ( ppzp200 )al. 1994 به تکثیر در همکاران طراحی شدهاند که پالسمید کچکی است قادر E. coli.)2002 آگرباکتریم میباشد )کریمی به کارگیری این مجمعه از ناقلها انتقال ژن به گیاهان را سادهتر خاهد نمد امکان استفاده از گیتی چندگانه را نیز فراهم میسازد. کارایی سادگی کار با این فناری تسط میرزائی اصل خدائی (2010) سه قطعه پیشبر القا شنده با اتانل ژن گزارشگر خاتمه دهنده با انتقال GUS OCS به طل تقریبی 6211bp بهطر همزمان با اکنش گیتی چندتایی به ناقل دگانه آگرباکتریمی بررسی شده است. در مقایسه با رشهای مرسم با استفاده از آنزیمهای برشی آنزیمهای اتصال دهنده لیگاز بسیار راحتتر سریعتر انجام میگیرد. ناقلهای ردی متعددی با اهداف مختلف ارایه شده است. همچنین ناقلهای مقصد متنعی برای آنالیز بیان عملکرد ژنها در سیستمهای مختلف معرفی شده است. ناقلهای مقصد دارای پیشبر برای بیان ژن در میزبان هستند. مزیت دیگر این فناری ایجاد کتابخانه گیتی است. با همسانهسازی تالی مرد نظر ایجاد کلن ردی میتان آنرا به هر سیستم بیانی با یک اکنش ساده بدن استفاده از آنزیمهای برشی لیگاز منتقل نمد با نگهداری ناقلهای تهیه شده میتان امکان استفاده از آنها را در سایر برنامههای همسانهسازی فراهم ساخت. در حال حاضر در مقالههای متعددی استفاده از این فناری گزارش شده است )اکبری همکاران 2009.)Borges et al., 2010 فناری گیتی گرایش جدیدی در بیلژی ملکلی است که مشکالت سازگاری کارایی مطابقت همسانهسازی مرسم را از بین میبرد. این رشها امکان انتقال قطعه به ناقل جابهجایی آن از ناقلی به ناقل دیگر را به راحتی فراهم میسازد. مهمترین مزیت فناری یزرفرندلی این استکه هم- زمان با همسانهسازی دستکاریهای مختلف امکان- پذیر است. یکی از راهکارهای گسترش همپشانی بهکارگیری PCR د مرحلهایست. د قطعه PCR اسطه با همپشانی در تالیهای انتهایی تکثیر میشند سپس از طریق اتصال تالیهای همپشان گسترش مییابند تکثیر میشند. در فناری یزرفرندلی برای ایجاد متاسین در تالی هدف تنها چیزی که تغییر مییابد طراحی آغازگرها است. با طراحی آغازگرهای همپشان که دارای متاسین نقطهای مرد نظر هستند با این کار میتان تالی هدف را با ایجاد متاسین نقطهای بهطر همزمان کلن نمد )شکل 5(. رشهای همسانهسازی گیتی یزر فرندلی معرفی شده در این مرر میتانند زمینه الزم را برای مطالعه ژنم مجدات دستاردهای بیشتر برای پژهشگران فراهم ساخته تا بتانند راحتتر به بررسی عمل ژنها بپردازند. 15

ر 2012 شهای No.1,,11 همسانه Vol. سازی ژن بدن آنزیم لیگاز BIOTECHNOLOGY, Summary AGRICULTURAL Gene Cloning Methods Without Ligase Enzyme Mirzaie-asl 1*, A. and Abdollahi 2, M. R. Abstract The cloning of a fragment into a plasmid vector is a procedure in recombinant technology. The most common methods for cloning require the use of ligase and restriction enzymes which are less efficient. Different Ligation-free cloning methods have been developed in which of them, Gateway and USER friendly technologies have been commercialized. Gateway technology is a rapid and efficient method of cloning base on bacteriophage lambda site-specific recombination system. The components of the lambda recombination system are modified to improve the efficiency of the system. Recombination occurs between site-specific attachments. In this technology, a target fragment is cloned into a entry vector. Transfer of from entry vector to other vectors easily can be done without any restriction enzymes and ligase in one hour recombination reaction. In the USER (uracil-specific excision reagent) Friendly Cloning, vector-specific PCR primers which contain one uracil per primer are designed and the target is amplified with Taq polymerase. The resulting PCR products are treated with the special enzyme to create unique 3 single-stranded extensions which can then anneal to the supplied linearized vector without ligation enzyme. By varying the design of the PCR primers, the protocol is easily adapted to perform manipulations. In this review key aspects and advantages of these methods are discussed. Keywords: Gene cloning, Gateway Technology, USER Friendly Technology References Akbari, O. S., Oliver, D., Eyer, K. and Pai, C. Y. 2009. An Entry/Gateway cloning system for general expression of genes with molecular tags in Drosophila melanogaster. BMC Cell Biology 10:10-8 Anonymus. 2006. MultiSite Gateway Pro: Using Gateway Technology to simultaneously clone multiple fragments. User Manual (Invitrogen Corporation.(. Aslanidis, C. and de Jong, P. J. 1990. Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR). Nucleic Acids Research 18:6069-6074. Bitinaite, J., Rubino, M., Varma, K. H., Schildkraut, I., Vaisvila, R. and Vaiskunaite, R. 2007. USER friendly engineering and cloning method by uracil excision. Nucleic Acids Research 35:1992-2002. Borges, J. P., Culerrier, R., Aldon, D., Barre, A., Benoist, H., Saurel, O., Milon,A., Didier, A. and Rouge, P. 2010. GATEWAY technology and E. coli recombinant system produce a properly folded and functional recombinant allergen of the lipid transfer protein of apple (Mal d 3). Protein Expression & purification 70:277-282. Clark, J. M. 1988.Novel non-templated nucleotide addition reactions catalyzed by procaryotic and eucaryotic polymerases. Nucleic Acids Research 16:9677-9686. Dale, J., and Park, S. 2004. Molecular Genetics of Bacteria, 4 edn: Wiley. Fogg, M. J., Pearl, L. H. and Connolly, B. A. 2002. Structural basis for uracil recognition by archaeal family B polymerases. Nature Structural Biology 9:922-927. Greagg, M. A., Fogg, M. J., Panayotou, G., Evans, S. J., Connolly, B. A. and Pearl, L. H. 1999. A read-ahead function in archaeal polymerases detects promutagenic template-strand uracil. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 96:9045-9050. Hajdukiewicz, P., Svab, Z. and Maliga, P. 1994. The small, versatile ppzp family of Agrobacterium binary vectors for plant transformation. Plant Moleular Biology 25:989-994. Hartley, J. L., Temple, G. F. and Brasch, M. A. 2000. cloning using in vitro site-specific recombination. Genome Research 10:1788-1795. Holton, T. A. and Graham, M. W. 1991. A simple and efficient method for direct cloning of PCR products using ddttailed vectors. Nucleic Acids Res 19: 1156. Hsiao, K. 1993. Exonuclease III induced ligase-free directional subcloning of PCR products. Nucleic Acids Research 21:5528-5529. Hu, G. X. 1993. Polymerase-Catalyzed Addition of Nontemplated Extra Nucleotides to the 3' End of a Fragment. Cell Biol 12: 763-770. 1. Assistant Professor, Department of Biotechnology, Faculty of Agriculture, Bu-Ali sina University, Hamedan. 2. Assistant Professor, Department of Agronomy and Plant breeding, Faculty of Agriculture, Bu-Ali sina University, Hamedan. *: Corresponding author Email: a.mirzaie@basu.ac.ir 61 13

19 Summary فنآری زیستی در کشارزی/ جلد یازدهم/ شماره ال/ تابستان AGRICULTURAL BIOTECHNOLOGY, Vol.,11 No.1, 2012 Jiang, D., Hatahet, Z., Melamede, R. J., Kow, Y. W. and Wallace, S. S. 1997. Characterization of Escherichia coli endonuclease VIII. Journal of Biological Chemistry 272:32230-32239. Kaluz, S. and Flint, A. P. 1994. Ligation-independent cloning of PCR products with primers containing nonbase residues. Nucleic Acids Research 22:4845. Karimi, M., Inze, D. and Depicker, A. 2002. GATEWAY vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation. Trends in Plant Science 7:193-195. Lasken, R. S., Schuster, D. M. and Rashtchian, A. 1996. Archaebacterial polymerases tightly bind uracilcontaining. Journal of Biological Chemistry 271: 17692-17696. Li, M. Z. and Elledge, S. J. 2012. SLIC: a method for sequence- and ligation-independent cloning. Methods in Molecular Biology 852: 51-59. Lindahl, T., Ljungquist, S., Siegert, W., Nyberg, B. and Sperens, B. 1977. N-glycosidases: properties of uracil- glycosidase from Escherichia coli. Journal of Biological Chemistry 252:3286-3294. Maniatis,T., Fritsch, E. F. and Sambrook, J. 1982. Molecular Cloning:A Laboratory Manual: Cold Spring Harbor,New York. Marchuk, D., Drumm, M., Saulino, A. and Collins, F. S. 1991. Construction of T-Vectors, a Rapid and General System for Direct Cloning of Unmodified Pcr Products. Nucleic Acids Research 19: 1154-1154. Mead, D. A., Pey, N. K., Herrnstadt, C., Marcil, R. A. and Smith, L. M. 1991. A universal method for the direct cloning of PCR amplified nucleic acid. Biotechnology (N Y) 9:657-663. Mirzaie-asl, A. and Khodaei, L. 2010. Application of multisite Gateway in a binary vector construct In 2nd National Biology Congress on Young Researchers. Oster, C. J. and Phillips, G. J. 2011. Vectors for ligation-independent construction of lacz gene fusions and cloning of PCR products using a nicking endonuclease. Plasmid 66(3):180-185 Rashtchian, A. 1995. Novel methods for cloning and engineering genes using the polymerase chain reaction. Current Opinion in Biotechnology 6:30-36. Thompson, J. F., Moitoso de Vargas, L., Koch,C., Kahmann, R. and Landy, A. 1987. Cellular factors couple recombination with growth phase: characterization of a new component in the lambda site-specific recombination pathway. Cell 50: 901-908. Walhout, A. J., Temple, G. F., Brasch, M. A., Hartley, J. L., Lorson, M. A., van den Heuvel, S. and Vidal, M. 2000. GATEWAY recombinational cloning: application to the cloning of large numbers of open reading frames or ORFeomes. Methods in Enzymology 328:575-592. Zhou, M. Y., Clark, S. E. and Gomezsanchez, C.E. 1995. Universal Cloning Method by Ta Strategy. Biotechniques 19:34-35. Zhou, M. Y. and Gomez-Sanchez, C. E. 2000. Universal TA cloning. Current Issues in Molecular Biology 2:1-7. 65 14