كاهش خطا و افزايش دقت در تشخيص بيماري هاي ژنتيكي فاطمه ظفرقندي مطلق كارشناس ارشد ژنتيک سوپروايزر بخش PND آزمايشگاه ژنتيک دكتر زينلي
انواع خطا بر اساس شدت تاثير سرنوشت ساز: خطا در آناليز خطا در نمونه گيري از مراجعين و جنين خطا در تشخيص ژن درگير خطا در تعيين جهش عامل بيماری خطا در گزارش نهايي وضعيت جنين و... با تاثير اندك: خطا در تايپ اسامي و شماره پرونده در گزارش نهايي و يا نوع جهش )فرد قطعا ناقل است و جهش مشخص شده ولی زمان تايپ جهش ديگری نوشته شده است( و...
احتمال بروز خطا در... گزارش دهي واحد پذيرش واحد آناليز مشاوره نمونه گيري استخراج DNA واحد PND
پيشگيري از بروز خطا در واحد پذيرش - ثبت دقيق اطالعات حين تشكيل پرونده - ثبت التين نام هايي كه ابهام ايجاد مي كنند - دريافت تعهد نامه از مراجعين - ارجاع به آزمايشگاه مرجع )تاالسمي( جهت دريافت معتبر CBC - لزوم شفاف سازي و راهنمايي دقيق مراجعين Color Coding پذيرش يک خانواده توسط يک کارشناس در آن واحد
پيشگيري از بروز خطا در واحد مشاوره و نمونه گيري دريافت نتايج گزاشات باليني ازمراجعين جهت تاييد - صحت ادعاي انجام شده نمونه كارت هموفيلي, جواب, BH4, PAH - برگه سونوگرافي و... و عدم پذيرش مراجعين بدون انجام رسم شجره - مشاوره ژنتيك - تطبيق نام فرد در پرونده و ليبل دريافت شده با پرسش نام فرد حاضر -تائيد هويت افراد براي نمونه گيري و آغاز مراحل تشخيص -جلوگيري از ازدحام مراجعين در هنگام نمونه گيري ليبل زدن بر روي لوله خون پس از خونگيري - استفاده از بارکودينگ -
پيشگيري از بروز خطا در واحد تخليص DNA استفاده از كارت نگه داري DNA و سعی در جايگزينی روشهايی با کمترين جابجايی و تعويض لوله انجام دابل چك تهيه بانك از نمونه ها Color Coding هر فرد فقط با نمونه های يک خانواده در آن واحد کار می کند
کارت DBC
پيشگيري از بروز خطا در واحد تخليص DNA
پيشگيري از بروز خطا در واحد PND - مطالعه دقيق گزارشات باليني و نتايج مشاوره ژنتيك - مطالعه دقيق پرونده بررسي دقيق Electrophorese,CBC و يا ديگر اطالعات بالينی بيمار PND مراحل PCR استفاده از DNA Control - انجام دابل چك Colour Coding- - استفاده از روش مستقيم و غير مستقيم به صورت همزمان - انجام ژل الكتروفورز عالمت گذاري ژل مستند سازي و ثبت تصاوير مربوط به هر ژل - -
پيشگيري از بروز خطا در PND
انواع خطا در تشخيص نمونه جنيني و راه هاي كنترل آن لزوم چك كردن CVS لزوم رفع شبه نمونه جنين از مادر لزوم تعيين هويت جنين لزوم بررسي والدين به همراه جنين -1-2 -3-4
پيشگيري از بروز خطا درهنگام كار با نمونه جنيني
مالحظات هنگام بررسی نمونه جنينی عدم بررسی 2 يا چند نمونه جنينی توسط يک کارشناس در ان واحد درج شماره پرونده جنين بر روی پليت و مطابقت آن با شماره روی فالکون نمونه جنينی استفاده از رنگ های متفاوت جهت درج شماره پرونده ها توسط کارشناسان مختلف رعايت فاصله مناسب کارشناسان در هنگام بررسی همزمان چند نمونه جنينی در يک محل دابل چک شماره پرونده روی فالکون نمونه جنينی و تيوب های حاوی نمونه جنينی ذخيره يا بانک کردن مناسب نمونه ها برای آينده
پيشگيري از بروز خطا در آناليز نتايج عدم اعتماد صرف به يك گزارشات يك Database نتايج گزارش شده چقدر قابل اعتماد هستند نتايج بيوانفورماتيک داخلی چقدر قابل اعتماد هستند
پيشگيري از بروز خطا در گزارش دهي انجام مراحل کار پرونده توسط کارشناس بخش تشخيص پيش از تولد هر يک از مراحل تشخيص با نظارت سوپروايزر بخش انجام می شود در نهايت مسئول فنی ازمايشگاه مراحل کار را بازبينی و پرونده را امضا می نمايد بررسی مجدد پرونده از ابتدا تا انتها توسط سوپروايزر بخش بررسی غلطهای احتمالی تايپی توسط واحد پزيرش بررسی پرونده توسط پزشک مشاور مرکز پيش از ارائه به بيمار
مثال هاي عيني از موارد خطا
MCV MCV MC H MC H Hb Hb HbA 2 HbA 2 HbF P 63.4 19.7 15.1 2.5 0.3 M 65.4 20.9 12.5 5.5 0.8 HbF P 59.1 19.9 11.8 2.5 0 M 65.4 20.9 12.5 5.5 0.8 اهميت پرونده های Alpha/Beta 3 Ψβ AvaII β HinfI β XmnI 5 Ψβ ϒG P -/- +/+ +/+ -/- -/- -/- M -/- +/+ -/- -/- -/- Fetus -/+? IVSI-5/N 1.HBB gene sequencing for P 2.HBA genes sequencing 3.HBA MLPA Normal 13W+4d?
4-HBB MLPA A Heterozygote deletion from probe 2-7
افلا سنارتو سيس /CBCياطخ HbA HbF HbA2 Hb MCH MCV RBC 97.3 0 2.7 13.7 19.9 64.6 6.8 P 96.4 1.3 2.3 10.6 20.3 63.9 5.21 M ----- ----- ------ 16 28.3 81.8 5.66 PP ----- ------- ------ 13.6 25.7 79.8 5.29 PM ------ ------ ------ 16 28.9 83.4 5.53 MP ------ ------ ------ 10.2 19.4 66 5.29 MM
Alpha Multiplex for P>>>>>>Normal حذف M>>>>>> 20.5 Alpha Multiplex for HBA genes sequencing for P>>>>>> Normal جواب پرونده: احتمال H خفيف و عدم ضرورت PND
مراجعه خانواده 3 سال بعد جهت بررسی جنين دوم بررسی مجدد P وM در مولتيپلکس آلفا به همراه جنين P حذف 20.5 دارد
اشتباه کارشناس در بررسی حذف نمونه ی P
MCV خطاي CBC MCH Hb HbA2 HbF HbS P 83.6 27.4 14.8 2.1 0.3 17.6 M 78.2 25.8 12.1 2.0 0.2 16.8 P,M,F Normal for HbS تكرار CBC HBB seq for P,M 82.9 27.4 15.1 2.0 0 0 88.7 28.3 11.1 2.1 0 0 Normal?
? عدم تطابق CBC با نتايج تعيين توالي)لزوم دابل چك( MCV MCH Hb HbA2 HbH P 58.1 17.5 11.4 1.2 0.5 M 64.1 19.8 12 3.1 0 PP 64.6 20.5 14 -------------- ------------- PM 76.8 26.4 12.4 -------------- ------------- MP 81.8 26.8 14.7 2.3 ------------- MM 71.5 17.2 12.8 2.7 -------------- P M -- Med /αα - 3.7 / αα HBA Gene Sequencing Normal HBA MLPA - 3.7 / αα Normal HBB MLPA
HBA Gene Sequencing Repeated Cd34 Leu>Pro Homozygote اشتباه آناليزور
اهميت بررسي هموگلوبين MCV MCH Hb HbA2 HbF p 58.5 19.1 11.8 5.3 1.2 M 58.6 18.8 9.9 5.7 4.2 تکرار CBC خانم پس از مصرف قرص آهن )خانم باردار می باشد( P Cd30 /N M IvsII-I/N MCV MCH Hb HbA2 HbF M 63 19 7.5 --------- ------------- M HBA MLPA Alpha Triplication M:Intermedia
اهميت بررسي هموگلوبين عموی فرد مبتال به تاالسمی در شجره مقابل جهت پيوند مغز استخوان مراجعه کرده است MCV MCH Hb HbA2 HbF RBC 63.6 18.2 9.6 5.2 2.7 5.2 تعيين موتاسيون ژن بتا<<<<< IVSI-5 Heterozygote موتاسيون پايين بودن هموگلوبين MLPA Alpha Alpha Triplication
MCV MCH Hb HbA2 P 63.4 19.7 10.6 5.2 M 86.6 29.2 14.0 2.2 AC AC >>>>>> IVSII-I / IVSII-I M >>>>>> N / N P >>>>>> IVSII-I / N?
HBB
Phenptype Genotype Infprmative RFLPs P Carrier IVSI-5/HbD Not Informative M Carrier HbS/N Fetus Carrier HbS/N Fetus is carrier
تعيين هويت P و AC رد ابوت
اهميت بررسی واريانت ها RBC MCV MCH Hb HbA2 HbA1 HbF HbX P 6.2 63.4 20.3 12.6 5.2 94.5 0.3 M 5.0 74.6 23.5 11.9 3.6 52.3 1.1 43.0 Phenotype Genotype Informative RFLPs Sequencing P Carrier IVSI-110/N - M Normal Cd 6(Hb Leiden)/N M Alpha sequencing: Hetrozygot 5nt No PND
مراجعه بعد از 2 سال RBC MCV MCH Hb HbA2 HbF AC 3.24 67.6 18.8 6.1 Phenotype Genotype Informative RFLPs Sequencin g AC Affected IVSI-110/Cd6 (Hb Leiden)
بيماري زايي موتاسيون/ تشخيص باليني دقيق پذيرش بيمار با شجره ی روبرو مشاوره و تشکيل پرونده ی دوشن MLPAبررسی نمونه ی فرد مبتال با روش عدم وجود حذف و اضافه شدگی تعيين توالی ژن ديستروفين
CGG>CAG(Arg>Gln) cd 2937 بصورت همی زيگوت در فرد مبتال و بصورت هتروزيگوت در مادر فرد مبتال تشخيص موتاسيون دو سال بعد تشکيل پرونده برای خواهر ديگر فرد مبتال وجود موتاسيون بصورت هموزيگوت در ايشان?
مشاوره مجدد بيمار و بررسی دقيقتر عالئم بالينی مشکوک شدن به بيماری Limb Girdle Muscular Dystrophy بررسی STR ژنهای درگير در بيماری Limb Girdle Muscular Dystrophy تعيين توالی ژن SGCB وجود موتاسيون IVS5+1 G>A به صورت هومو زيگوت در فرد مبتال و به صورت هتوروزيگوت در پدر مادر و خواهر فرد مبتال
پرونده PKU ارسالی با شجره روبرو که در آن ژن PAH درگير می باشد تعيين توالی فرد مبتال انجام شد نتيجه بررسی VNTR?
تخليص مجدد از نمونه ها<<<<< تکرار <<<<< VNTR نتايج قبل تاييد می شود جابجايی خون M و AC
لزوم مشاوره دقيق پرونده هموفيلی A: موتاسيون فرد مبتال<<<< Inversion22 Hemizygote موتاسيون مادر فرد مبتال<<<< Inversion22 Heterozygote?
مشاوره مجدد با بيمار درخواست کاريوتايپ مبتال بودن به سندرم ترنر
کاربرد هاپلوتايپينگ در کاهش خطا و تشخيص دقيق تر
پرونده دوشن
جابجايی نمونه MP و MB AC >>>> DMD MLPA >>>> Dup 33-43 M >>>> DMD MLPA >>>>Normal
كاربرد هاپلوتايپينگ AC>>>>>> F8 Sequencing>>>>>>Cd2282 TCC>CCC Hemizygote MM>>>>>> F8 Sequencing >>>>>>Cd2282 TCC>CCC Heterozygote M >>>>>> F8 Sequencing>>>>>>Normal
F8 بررسی پرونده به روش غير مستقيم جهت تاييد روش مستقيم انجام شد و نتايج روبرو بدست آمد?
عدم اکتفا به روش مستقيم تکرار M Sequencing Cd2282 TCC>CCC Heterozygote خطای آناليزور
MCV MCH Hb HbA2 HbF کاربرد هاپلوتايپينگ P 59.8 19.7 14.4 5.5 1.6 M 71 21.6 13.6 5.1 1 Phenotype Genotype MLPA Sequencing P Carrier Fr8-9/N M Carrier? HBB Seq Normal HBB MLPA Normal?
MCV MCH Hb HbA2 HbF MP 84 28.4 15.6 2.9 0 MM 71.9 22.5 12.2 4.6 0
MCV MCH Hb HbA2 HbF P 72.7 23.5 14.9 4.3 0 M 64.2 22 13.4 4 0.3 P Carrier? Phenotype Genotype MLPA Sequencing M Carrier IVSI-6/N HBB Seq Normal HBB MLPA Normal?
MCV MCH Hb HbA2 HbF PP 85.7 29.8 15 2.7 0.4 PM 72.1 22.7 13.2 3.7 0 PS 90.5 28.3 12.5 MP 87.7 28.2 14.2 MM 73.1 21.6 12.4
استفاده از هاپلوتايپينگ در تعيين ژن درگير کاربرد ديگر هاپلوتايپينگ در تشخيص بيماری های چند ژنی می باشد مخصوصا در مواردی که خانم باردار است و زمان کمی برای تشخيص ژن مورد نظر و تشخيص پيش از تولد وجود دارد هزينه ی تشخيص بسيار کاهش می يابد درشجره مقابل کودک مبتال به بيماری MSUD است
BCKDHB BCKDHA DBT DLD
با بررسی STRهای چهار ژن درگير در بيماری MSUD هموزايگوسيتی در ژن DBT تعيين توالی موتاسيون مشخص گرديد. ديده شد و با انجام AC>>>>>> Haplotyping>>>>>> DBT gene sequencing>>>>c.1070 C>T(p.P357R) Homozygote P>>>>>> Haplotyping>>>>>> DBT gene sequencing>>>>c.1070 C>T(p.P357R) Heterozygote M>>>>>> Haplotyping>>>>>> DBT gene sequencing>>>>c.1070 C>T(p.P357R) Heterozygote
خانواده ای با فرزند Sever MR فرد مبتال تحت رژيم نمی باشد و مشکوک به PKU مراجعه کرده اند اطالعات تکميلی درموردپرونده موجود نمی باشد
SPR PAH GCH PCBD PTS QDPR
تعيين توالی ژن QDPR برای <<< AC نرمال تعيين توالی ژن PAH برای <<< AC نرمال NGS تععين توالی ديگر ژنها
عدم اكتفا به نتايج Database ارسال نمونه فرد مبتال به بيماری فاکتور 7 و همزمان نمونه ی جنينی به دليل هفته ی بارداری باالی مادر: تعيين توالی فرد مبتال انجام و موتاسيون زير بصورت هموزيگوت در فرد مبتال و جنين و بصورت هتروزيگوت در پدر و مادر فرد مبتال مشخص گرديد: بررسی STRهای افراد جهت تاييد روش مستقيم انجام شد.
بررسی ديگر اگزون های ژن فاکتور 7 ادامه يافت و موتاسيون زير در فرد مبتال به صورت هوموزيگوت و در پدر مادر و جنين به صورت هتروزيگوت ديده شد. اين موتاسيون بصورت موتاسيون بيماريزا در Databaseها مطرح نشده اما احتمال بيماريزايی آن بسيار باالست.
عدم اكتفا به روش مستقيم پذيرش بيمار مبتال به هموفيلی A تعيين توالی فرد مبتال و مشخص شدن موتاسيون زير بصورت همی زيگوت و بصورت هتروزيگوت در مادر وی تعيين توالی جنين در همان اگزون<<<<< نرمال
تعيين توالی مجدد جنين<<<<<< موتاسيون به صورت همی زيگوت ديده شد خطای آناليزور
شجره مقابل مربوط به پرونده pku ارسالی می باشد ( ژن PTS درگير می باشد( AC برای PTS توالی ژن <<<<<<تعيين c.317c>t Heterozygote جهش ديگری يافت نشد >>>>>>ادامه تعيين توالی برای AC P برای PTS توالی ژن <<<<<<تعيين c.317c>t Homozygote M برای PTS توالی ژن <<<<<<تعيين c.317c>t Heterozygote بررسی هاپلوتايپ ژن PTS
?
رابطه مادر فرزندی رد و رابطه پدر فرزندی تاييد شد جابجايی خون P و AC
پرونده ارسالی جهت بررسی ژن PAH تعيين توالی ژن PAH برای فرد مبتال<<<< c.1114a>t (p.t372s) Homozygote بررسی موتاسيون فوق برای c.1114a>t (p.t372s) Heterozygote >>>> P بررسی موتاسيون فوق برای c.1114a>t (p.t372s) Homozygote >>>> M?
بررسی STR های ژن PAH تخليص مجدد نمونه ها تکرار تعيين توالی بررسی STR ها تاييد نتايج قبلی
مشاوره مجدد با خانواده و بررسی سطح فنيل آالنين در مادر مادر مبتال به PKU کالسيک می باشد
دوقلويی جنين دوقلو ارسالی جهت بررسی ژن PAH موتاسيون فرد مبتال <<<< Homozygote C252(p.R252W) موتاسيون P وM C252(p.R252W) Heterozygote >>>> موتاسيون قل باال راست <<<< Normal موتاسيون قل پايين چپ Heterozygote>>>> C252(p.R252W) تاييد نتايج روش مستقيم توسط روش غير مستقيم
بررسی VNTR?
بررسی STRs
نمونه قل چپ پايين به همراه پدر و مادر تعيين هويت گرديد
تعيين هويت نمونه قل چپ پايين به همراه نمونه قل راست باال تعيين هويت گرديد آلودگی قل چپ پايين به قل راست باال تاييد می گردد نمونه گيری مجدد از قل چپ پايين قل چپ پايين مبتال می باشد
چالش 1 MCV MC H Hb HbA2 HbF P 61.7 19.9 12.7 5.7 0.8 M 67.1 21.7 12.5 2.5 0 M: Normal for Common Alpha deletions and point mutations
5-35 Normal Borderline:35-60 CF:60-200 Sweat Test Result for a 2 month child Sweat Weight Sodium Sweat Clorid Sweat 132mg 78meq/l 80meq/l چالش 2