ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΚΑΙ ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΜΙΑΣ ΜΑΝΝΑΝΑΣΗΣ ΑΠΟ ΤΟ ΜΥΚΗΤΑ Myceliophthora thermophila ΣΤΗΝ ΥΔΡΟΛΥΣΗ ΤΗΣ ΛΙΓΝΙΝΟΚΥΤΤΑΡΙΝΟΥΧΑΣ ΒΙΟΜΑΖΑΣ

Transcript

1 ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΚΑΙ ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΜΙΑΣ ΜΑΝΝΑΝΑΣΗΣ ΑΠΟ ΤΟ ΜΥΚΗΤΑ Myceliophthora thermophila ΣΤΗΝ ΥΔΡΟΛΥΣΗ ΤΗΣ ΛΙΓΝΙΝΟΚΥΤΤΑΡΙΝΟΥΧΑΣ ΒΙΟΜΑΖΑΣ Κ. Κατσίµπουρας, Π. Πετρόπουλος & Ε. Τόπακας Εργαστήριο Βιοτεχνολογίας, Σχολή Χηµικών Μηχανικών, Εθνικό Μετσόβιο Πολυτεχνείο, Ηρώων Πολυτεχνείου 5, Ζωγράφου, Αθήνα 15780, Ελλάδα Π. Χριστακόπουλος Biochemical I Process Engineering, Division of Chemical Engineering, Department of Civil, Environmental and Natural Resources Engineering, Luleå University of Technology, SE Luleå, Sweden ΠΕΡΙΛΗΨΗ Στην παρούσα µελέτη µια ένδο-β-1,4-µαννανάση (MtMan26a) της οικογένειας GH26 από το θερµόφιλο µύκητα Myceliophthora thermophila εκφράστηκε επιτυχώς στη µεθυλότροφη ζύµη Pichia pastoris X33. Η ανασυνδυασµένη πρωτεΐνη, το µοριακό βάρος της οποίας προσδιορίστηκε στα 58 kda, έχει βέλτιστο ph 6.0 και βέλτιστη θερµοκρασία 60 ο C ενώ επιδεικνύει σηµαντική σταθερότητα σε ευρύ φάσµα θερµοκρασιών µέχρι 50 ο C και σε εύρος ph από 4.0 µέχρι 11.0 µετά από 24 h επώασης, καθιστώντας έτσι το ένζυµο έναν ισχυρό υποψήφιο για πολλές βιοτεχνολογικές εφαρµογές όπου απαιτείται καταλυτική σταθερότητα. Η MtMan26a δρα συνεργιστικά µε εµπορικά σκευάσµατα κυτταρινασών για την αποδοτικότερη υδρόλυση της λιγνινοκυτταρινούχου βιοµάζας. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η λιγνινοκυτταρινούχα βιοµάζα αποτελεί µια οικονοµική και άφθονη πηγή για τη παραγωγή βιοαιθανόλης και άλλων ενώσεων στα πλαίσια του βιοδιυλιστηρίου. Η ενζυµική µετατροπή της σε ζυµώσιµα σάκχαρα είναι ίσως το κυριότερο εµπόδιο της διεργασίας εξαιτίας της ανθεκτικότητας και της ετερογένειας του φυτικού κυτταρικού τοιχώµατος [1]. Μέρος της παρεµπόδισης της υδρόλυσης της κυτταρίνης οφείλεται όχι µόνο στη λιγνίνη αλλά και στις ηµικυτταρίνες οι οποίες είναι κυρίως ετερογενείς πολυσακχαρίτες οι οποίοι αποτελούνται από διάφορες µονάδες σακχάρων, µε βασικότερες τις ξυλάνες και τις µαννάνες [2]. Επιπλέον, ηπιότερες συνθήκες προκατεργασίας, µε σκοπό τη µείωση του κόστους, οδηγούν σε υλικά µε υψηλότερα ποσοστά ηµικυτταρίνης καθιστώντας τα δυσκολότερους στόχους για τις κυτταρινάσες. Η στρατηγική η οποία προτείνεται περιλαµβάνει τη χρήση ηµικυτταρινασών, όπως οι ξυλανάσες και οι µαννανάσες, σε συνδυασµό µε κυτταρινάσες µε αποτέλεσµα την παρασκευή αποδοτικότερων ενζυµικών κοκτέιλ. Εποµένως, η παραγωγή θερµοάντοχων ηµικυτταρινασών από θερµόφιλους µικροοργανισµούς αποτελεί θέµα υψηλού βιοτεχνολογικού και βιοµηχανικού ενδιαφέροντος καθώς µετά τις πρωτεάσες, οι κυτταρινάσες και οι ηµικυτταρινάσες αποτελούν τα ένζυµα µε το εντονότερο βιοµηχανικό ενδιαφέρον [3]. Οι β-µαννανάσες είναι ηµικυτταρινάσες οι οποίες προσβάλλουν τους εσωτερικούς γλυκοζιτικούς δεσµούς της κύριας αλυσίδας της µαννάνης απελευθερώνοντας β-1,4-µαννοολιγοσακχαρίτες. Οι µαννάνες αποτελούν το κυριότερο συστατικό του κλάσµατος της ηµικυτταρίνης στους ξυλώδεις φυτικούς ιστούς (softwoods) και είναι σύµπλοκα βιοπολυµερή τα οποία αποτελούνται από µια κύρια αλυσίδα µονάδων β-1,4-d-µαννόζης ή έναν ετερογενή συνδυασµό µονάδων β-1,4-d-µαννόζης και β-1,4-d-γλυκόζης και η οποία µπορεί να είναι υποκατεστηµένη σε διάφορα σηµεία. Οι µικροβιακές µαννανάσες είναι κυρίως εξωκυτταρικές και δρουν σε ένα ευρύ φάσµα τιµών ph και θερµοκρασιών βρίσκοντας εφαρµογή στις βιοµηχανίες χάρτου, φαρµάκων, τροφίµων, ζωοτροφών και στην κλωστοϋφαντουργία. Επιπλέον, ενζυµικά κοκτέιλ που εµπεριέχουν κυτταρινάσες σε συνδυασµό µε ηµικυτταρινάσες, όπως ξυλανάσες και µαννανάσες, συνεισφέρουν στην αποτελεσµατική υδρόλυση λιγνινοκυτταρινούχας φυτικής βιοµάζας για την παραγωγή βιοαιθανόλης [2]. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΚΛΩΝΟΠΟΙΗΣΗ ΤΟΥ ΓΟΝΙΔΙΟΥ em26a Το γονίδιο em26a συντέθηκε αριστοποιηµένο ως προς τα κωδικόνια για έκφραση στη µεθυλότροφη ζύµη P. pastoris και κλωνοποιήθηκε στον πλασµιδιακό φορέα puc57 (Genscript, USA). Το EasySelect Pichia Expression kit και ο πλασµιδιακός φορέας ppiczαc ήταν της εταιρείας Invitrogen (Η.Π.Α.) ενώ τα περιοριστικά ένζυµα της Takara (Ιαπωνία). Η προµήθεια των GenElute gel extraction kit και GenElute plasmid mini prep kit πραγµατοποιήθηκε από την Sigma-Aldrich (Η.Π.Α.). Τα υποστρώµατα γαλακτοµαννάνη χαρουπιού, γλυκοµαννάνη, β-γλουκάνη και αραβινοξυλάνη αποκτήθηκαν από τη Megazymes (Ιρλανδία). Τα εµπορικά ενζυµικά σκευάσµατα Celluclast 1.5L και Novozyme 188 ήταν προσφορά της Novozymes (Δανία). Όλα τα υπόλοιπα αντιδραστήρια ήταν αναλυτικού βαθµού.

2 Για την κλωνοποίηση του γονιδίου της ένδο-1,4-β-µαννανάσης από τον µύκητα M. thermophila χρησιµοποιήθηκαν κύτταρα E. coli TOP10 (Invitrogen, Η.Π.Α.) και ο πλασµιδιακός φορέας ppiczαc. Το στέλεχος της P.pastoris X33 χρησιµοποιήθηκε για την πρωτεϊνική έκφραση. Τα κύτταρα E.coli αναπτύχθηκαν στους 37 ο C σε θρεπτικό µέσο Luria-Bertani µε προσθήκη του αντιβιοτικού ζεοσίνη σε συγκέντρωση 25 µg/ml για την επιλογή των µετασχηµατισµένων κλώνων. Η ζύµη P.pastoris αναπτύχθηκε σε φιάλες στους 30 ο C και υπό ανάδευση σε θρεπτικό µέσο BMGY ή σε BMMY µε προσθήκη 0.5% (v/v) µεθανόλης σύµφωνα µε τις οδηγίες του EasySelect Pichia Expression kit. Τα στερεά θρεπτικά µέσα που χρησιµοποιήθηκαν ήταν YPD και YPD µε προσθήκη 1 Μ σορβιτόλης (YPDS) και 100 µg/ml ζεοσίνης σε τελική συγκέντρωση για την επιλογή των µετασχηµατισµένων κλώνων. Προκειµένου να επιτευχθεί η έκκριση της ανασυνδυασµένης πρωτεΐνης MtMan26a στον εξωκυττάριο χώρο χρησιµοποιήθηκε ο πλασµιδιακός φορέας ppiczαc ο οποίος περιέχει τον υποκινητή της αλκοολικής οξειδάσης (AOX1) και τη σηµατοδοτική αλληλουχία a-factor από τη ζύµη Saccharomyces cerevisae. Η σύνθεση του γονιδίου για την έκφραση της ανασυνδυασµένης πρωτεΐνης MtMan26a (protein ID: 99077, chromosome_1: ) πραγµατοποιήθηκε µε αριστοποίηση κωδικονίων για έκφραση σε P.pastoris και κλωνοποιήθηκε σε πλασµιδιακό φορέα puc57 από την Genscript (Η.Π.Α.). Ακολούθησε πλήρης πέψη του πλασµιδίου puc57 µε τα περιοριστικά ένζυµα Cla1 και Xba1και έλεγχος του κατατετµηµένου τµήµατος em26a σε ηλεκτροφόρηση πηκτώµατος αγαρόζης. Ο καθαρισµός του επιθυµητού τµήµατος DNA πραγµατοποιήθηκε µε απευθείας αποκοπή του τµήµατος της αγαρόζης που το περιείχε. Τα µονόκλωνα κολώδη άκρα που δηµιουργήθηκαν στο em26a από τη δράση των περιοριστικών ενδονουκλεασών, ενώθηκαν µε τον πλασµιδιακό φορέα ppiczαc και το ανασυνδυασµένο πλασµίδιο ppiczαc/em26a πολλαπλασιάστηκε µε τη χρήση επιδεκτικών κυττάρων E.coli TOP10. Τα µετασχηµατισµένα κύτταρα επιλέχθηκαν µε βάση την αντίστασή τους στη ζεοσίνη (25 µg/ml). Η ύπαρξη του ανασυνδυασµένου πλασµιδίου ppiczαc/em26a επιβεβαιώθηκε, επίσης, µε περιοριστική πέψη και η νουκλεοτιδική του αλληλουχία προσδιορίσθηκε από την VBC-Biotech services (Αυστρία). ΜΕΤΑΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟΣ ΚΥΤΤΑΡΩΝ P.pastoris ΚΑΙ Η ΕΠΙΛΟΓΗ ΤΟΥΣ Το ανασυνδυασµένο πλασµίδιο ppiczαc/em26a γραµµικοποιήθηκε µε πέψη από την περιοριστική ενδονουκλεάση Sac1 σε µοναδική θέση αναγνώρισης στην αλληλουχία 5ΆΟΧ1 του πλασµιδίου. Ακολούθησε µετασχηµατισµός επιδεκτικών κυττάρων P.pastoris µε ηλεκτροδιάτρηση και καλλιέργεια των θετικά µετασχηµατισµένων αποικιών σε κωνικές φιάλες υπό ανάδευση σύµφωνα µε το πρωτόκολλο EasySelect Pichia Expression kit. Οι µετασχηµατισµένες αποικίες ελέγχθηκαν για την έκφραση της επιθυµητής ενδοµαννανάσης. Ειδικότερα, 32 αποικίες µεταφέρθηκαν σε δύο τρυβλία µε θρεπτικό υλικό παρουσία µεθανόλης (ΜΜ), 1.34% (w/v) ΥΝΒ, 4x10-5 % (w/v) βιοτίνης, 0.5% (v/v) µεθανόλης και 1% γαλακτοµαννάνης σε πυκνότητα 1 αποικία/cm 2. Έπειτα από 24 h επώασης σε θερµοκρασία 30 ο C, τα τρυβλία επιστρώθηκαν µε διάλυµα βαφής 1% Congo Red σε ρυθµιστικό διάλυµα κιτρικών-φωσφορικών 100 mm ph 5.0. Μετά το πέρας 30 min, η βαφή αποχύθηκε και ακολούθησαν διαδοχικές εκπλύσεις µε απιονισµένο νερό και διάλυµα 1 Μ NaOH προκειµένου να εµφανιστούν άχρωµες κυκλικές ζώνες σε κόκκινο υπόβαθρο οι οποίες µαρτυρούν ενζυµική ενεργότητα και είναι ενδεικτικές της υδρόλυσης της γαλακτοµαννάνης. Από τις αποικίες που παρουσίασαν ενζυµική ενεργότητα, επιλέχθηκε αυτή που επέδειξε την υψηλότερη και χρησιµοποιήθηκε για υγρές καλλιέργειες µεγάλης κλίµακας σύµφωνα µε τους Topakas et al. (2012). Το υπερκείµενο των καλλιεργειών µετά από φυγοκέντριση συλλέχθηκε, προκειµένου να συµπυκνωθεί και να αποµονωθεί η ανασυνδυασµένη πρωτεΐνη MtMan26a από τις υπόλοιπες εκκρινόµενες πρωτεΐνες της ζύµης. Αρχικά, το φυγοκεντρηµένο υπερκείµενο διηθήθηκε υπό κενό ώστε να αποµακρυνθούν τυχόν κυτταρικά θραύσµατα και στη συνέχεια συµπυκνώθηκε µε χρήση της συσκευής υπερδιήθησης Stirred Cell Model 8400 και µεµβράνες PM-10 (Amicon, Millipore, Η.Π.Α.). Η αποµόνωση της ανασυνδυασµένης πρωτεΐνης πραγµατοποιήθηκε µε τη χρήση στήλης χρωµατογραφίας συγγένειας ακινητοποιηµένου µετάλλου (Clontech) σύµφωνα µε τους Karnaouri et al. [4]. Το µοριακό βάρος της πρωτεΐνης, καθώς και ο βαθµός καθαρότητας που προέκυψε από την διαδικασία αποµόνωσής της, προσδιορίστηκαν µε ηλεκτροφόρηση πηκτής πολυακρυλαµιδίου (SDS-PAGE), ενώ για την εµφάνιση των πρωτεϊνικών µορίων χρησιµοποιήθηκε η χρωστική Coomassie Brilliant Blue G-250. Ο προσδιορισµός του ισοηλεκτρικού σηµείου της ανασυνδυασµένης πρωτεΐνης MtMan26a πραγµατοποιήθηκε µε τη µέθοδο της ισοηλεκτρικής εστίασης σε πήκτωµα πολυακρυλαµιδίου (IEF-PAGE) για εύρος τιµών ph από 3.0 έως ΜΕΤΡΗΣΗ ΕΝΖΥΜΙΚΗΣ ΕΝΕΡΓΟΤΗΤΑΣ Η ενεργότητα της ενδοµαννανάσης προσδιορίστηκε µετά από επώαση του ενζύµου µε 0.5% γαλακτοµαννάνη για 15 min σε ρυθµιστικό διάλυµα κιτρικών-φωσφορικών 0.1 Μ και ph 6.0. Η συγκέντρωση των αναγωγικών σακχάρων, τα οποία απελευθερώθηκαν από το υπόστρωµα γαλακτοµαννάνης, προσδιορίστηκαν µε τη µέθοδο του 3,5-δινιτροσαλικυλικού οξέος (DNS) [5]. Η µαννόζη χρησιµοποιήθηκε για την κατασκευή της καµπύλης αναφοράς. Ως µονάδα ενζυµικής δραστικότητας (Unit, U) ορίζεται η ποσότητα του ενζύµου που απαιτείται για την απελευθέρωση 1 µmol προϊόντος ανά min, σε θερµοκρασία 60 ο C. Η συγκέντρωση της ανασυνδυασµένης

3 πρωτεΐνης προσδιορίστηκε µετρώντας την απορρόφηση του ενζυµικού διαλύµατος στα 280 nm χρησιµοποιώντας µοριακό συντελεστή απορροφητικότητας Μ -1 cm. Ο συντελεστής απορρόφητικότητας υπολογίζεται µε το υπολογιστικό εργαλείο ProtParam (ExPASy, SIB Bioinformatics Resource Portal). ΒΙΟΧΗΜΙΚΟΣ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΜΟΣ Η µελέτη της βέλτιστης θερµοκρασίας δράσης για την ανασυνδυασµένη µαννανάση έγινε µετρώντας την ενεργότητά της σε ένα εύρος θερµοκρασιών από 30 έως 90 ο C για 15 min σε ρυθµιστικό διάλυµα κιτρικώνφωσφορικών 0.1 Μ ph 5.0 χρησιµοποιώντας ως υπόστρωµα τη γαλακτοµαννάνη. Η σταθερότητα του ενζύµου σε διαφορετικές τιµές θερµοκρασίας, υπολογίστηκε µετρώντας την εναποµένουσα ενεργότητα µετά από επώαση του ενζυµικού διαλύµατος για διαφορετικά χρονικά διαστήµατα σε ένα εύρος θερµοκρασιών από 30 έως 70 ο C σε ph 8.0 (Tris-HCl 0.1 M) απουσία υποστρώµατος. Το βέλτιστο ph της ενζυµικής δράσης εξετάστηκε µετρώντας την ενεργότητα της µαννανάσης σε εύρος τιµών ph από 3.0 έως 11.0 για 15 min σε θερµοκρασία 60 ο C χρησιµοποιώντας ρυθµιστικά διαλύµατα κιτρικών-φωσφορικών για ph , Tris-HCl για ph και γλυκίνης- NaOH για ph Η σταθερότητα του ενζύµου σε διαφορετικές τιµές ph, µελετήθηκε µετά από επώασή του σε θερµοκρασία 4 ο C για 24 h. Ακολούθησε µέτρηση της εναποµένουσας ενεργότητας της µαννανάσης για 15 min στους 60 ο C και ph 6.0. Η επίδραση διαφόρων ιόντων µετάλλων και άλλων χηµικών ενώσεων (Ca 2+, Co 2+, Ni 2+, Zn 2+, Na +, Cu 2+, Ag +, Mg 2+, Mn 2+, EDTA, Ουρία, Triton X-100) στην ενεργότητα του ανασυνδυασµένου ενζύµου προσδιορίστηκε µετά από επώαση του ενζυµικού διαλύµατος σε διαλύµατα συγκέντρωσης 5 mm από κάθε ένωση και 1% από το τασιενεργό Triton X-100 για 2 h σε θερµοκρασία δωµατίου και ph 8.0 (Tris-HCl 0.1 M). Η εναποµένουσα ενεργότητα προσδιορίστηκε στις γνωστές συνθήκες παρουσία των µεταλλικών ιόντων και άλλων ενώσεων. ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΣΥΝΕΡΓΙΣΤΙΚΗΣ ΔΡΑΣΗΣ ΤΗΣ MtMan26a ΜΕ ΕΜΠΟΡΙΚΟ ΕΝΖΥΜΙΚΟ ΣΚΕΥΑΣΜΑ Εξετάστηκε η δράση του ενζύµου πάνω σε φυσικό υπόστρωµα προκατεργασµένης βιοµάζας µε ταυτόχρονη παρουσία εµπορικών ενζύµων που χρησιµοποιούνται για την υδρόλυση της λιγνινοκυτταρινούχου βιοµάζας. Πραγµατοποιήθηκαν αντιδράσεις µε διαφορετικές συγκεντρώσεις εµπορικών ενζύµων και MtMan26a, καθώς και αντιδράσεις ελέγχου µε Αλβουµίνη Βόειου Ορού (BSA, Bovine Serum Albumin). Οι αντιδράσεις πραγµατοποιήθηκαν σε τελικό όγκο 1.5 ml µε 6% (β/β) ξηρής βιοµάζας. Τα εµπορικά ένζυµα που χρησιµοποιήθηκαν ήταν τα Celluclast 1.5L και Novozyme 188 σε αναλογία 5:1 (ο/ο). Το υπόστρωµα Lignocel ήταν ευγενική χορηγία του Δρ. Άγγελου Λάππα του Ινστιτούτου Χηµικών Διεργασιών και Ενεργειακών Πόρων. Οι αντιδράσεις πραγµατοποιήθηκαν σε ph 5 και θερµοκρασία 50 C. Ο έλεγχος της προόδου της αντίδρασης πραγµατοποιήθηκε µε λήψη οµοιογενών δειγµάτων ανά τακτά χρονικά διαστήµατα. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ Ο Myceliophthora thermophila (γνωστός και ως Sporotrichum thermophile) είναι ένας θερµόφιλος µονοκύτταρος ασκοµύκητας, ο οποίος απαντάται στο χώµα και ιδιαίτερα σε σωρούς αποσυντιθέµενης οργανικής ύλης. Αναπτύσσεται βέλτιστα σε θερµοκρασίες C και είναι ανθεκτικός σε όξινα περιβάλλοντα, χαρακτηριστικά τα οποία τον καθιστούν ενδιαφέρον για βιοτεχνολογικές εφαρµογές σχετικές µε την αποδόµηση της λιγνινοκυτταρινούχας βιοµάζας. O M. thermophila διαθέτει µια µεγάλη γκάµα ενζύµων που αποδοµούν διάφορα κλάσµατα φυτικής οργανικής ύλης, τα οποία ενδιαφέρουν ιδιαίτερα την βιοµηχανία παραγωγής βιοκαυσίµων. Το ενδιαφέρον αυτό πηγάζει από το γεγονός ότι, λόγω των αντίξοων συνθηκών ανάπτυξής του, τα ένζυµά του παρουσιάζουν ενεργότητα, αλλά και σταθερότητα, σε υψηλές θερµοκρασίες και χαµηλά ph. Το γονιδίωµα του M. thermophila έχει πλήρως προσδιοριστεί από το DOE Joint Genome Institute το 2012 και περιλαµβάνει 9099 γονίδια σε 7 χρωµοσώµατα. Το γονίδιο που εκφράζει την µελετώµενη µαννανάση εντοπίστηκε µε τεχνικές βιοπληροφορικής ανάλυσης από τους Berka et al. [6] στα πλαίσια µια γενοµικής σύγκρισης των δυο θερµόφιλων µυκήτων M. thermophila και Thielavia terrestris. Το γονίδιο βρίσκεται στο χρωµόσωµα 1 στις θέσεις µε και περιέχει 4 εξώνια. Η ανάλυση οµοιότητας (BLASTP του National Center for Biotechnology Information) της παραγόµενης πολυπεπτιδικής αλυσίδας, υποδεικνύει την ύπαρξη των εξής γνωστών δοµών: ενός πολυπεπτιδίου σήµατος (signal peptide) της M. thermophila στις θέσεις 1-21 της πρωτεΐνης, µιας περιοχής µε χαρακτηριστικά της µονάδας πρόσδεσης σε υδατάνθρακες (CBM, carbohydrate binding molecule) οικογένειας 6 και οικογένειας 35 στις θέσεις και µιας περιοχής µε λειτουργία γλυκοζιτικής υδρολάσης της οικογένειας 26 στις θέσεις Η στοίχιση της ακολουθίας της πρωτεΐνης µε άλλες ακολουθίες της βάσης δεδοµένων οδήγησε σε εντοπισµό

4 10ο ΠΑΝΕΛΛΗΝΙΟ ΕΠΙΣΤΗΜΟΝΙΚΟ ΣΥΝΕΔΡΙΟ ΧΗΜΙΚΗΣ ΜΗΧΑΝΙΚΗΣ, ΠΑΤΡΑ, 4-6 ΙΟΥΝΙΟΥ, µεγάλου βαθµού οµολογίας (75%), µεταξύ άλλων και, µε µια χαρακτηρισµένη β-1,4-µανναναση του Podospora Anserina (PaMan26a), της οποίας είναι γνωστή και η δοµή (PDB ID: 3ZM8, [6]) (Σχήµα 1). Σχήµα 1. Στοίχιση ακολουθιών µεταξύ αυτής της ενδοµαννανάσης MtMan26a (ένζυµο της παρούσας µελέτης) του M.thermophila και της PaMan26a του P.anserina (75% οµοιότητα). ΚΛΩΝΟΠΟΙΗΣΗ ΚΑΙ ΕΚΦΡΑΣΗ ΤΗΣ MtMan26a Μετά τον πολλαπλασιαµό και την αποµόνωση του πλασµιδίου puc57/mtman26a πραγµατοποιείται πέψη µε τα περιοριστικά ένζυµα ClaI, XbaI, ώστε να αποµονωθεί το επιθυµητό γονίδιο. Παρατηρούνται λωρίδες DNA µεγέθους 2710bp (puc57) και 1398 bp (MtMan26a) (Σχήµα 2). Η λωρίδα που περιέχει το γονίδιο αποµονώνεται µε χρήση κιτ. Στη συνέχεια µε χρήση του πλασµιδιακού φορέα ppiczac και αφού συνδεθεί σε αυτόν το γονίδιο της ενδοµαννανάσης, ακολουθεί ο µετασχηµατισµός κυττάρων P.pastoris X-33 και τα επιτυχώς µετασχηµατισµένα κύτταρα ελέγχονται µε χρήση δοκιµής τρυβλίου µε υπόστρωµα γαλακτοµαννάνης 1% (β/ο). Η βαφή του τρυβλίου µε Congo Red (1% β/ο) υπέδειξε τις αποικίες που εµφανίζουν ενεργότητα στο Σχήµα 2. Ηλεκτροφόρηση πηκτής υπόστρωµα αυτό (Σχήµα 3). αγαρόζης στην αντίδραση πέψης του Επιλέχθηκαν 32 αποικίες για τη δοκιµή τρυβλίου (καθώς και 4 αποικίες puc57/mtman26a µε Cla1/Xba1. µη-µετασχηµατισµένων κυττάρων P.pastoris X-33, ως δείγµατα αναφοράς) οι οποίες παρουσίασαν όλες ενεργότητα στο υπόστρωµα γαλακτοµαννάνης. Από τις αποικίες πραγµατοποιήθηκε ανακαλλιέργεια αυτών µε την υψηλότερη ενεργότητα για αποθήκευση και χρήση στις καλλιέργειες µεγάλης κλίµακας. Σχήµα 3. Έλεγχος ενεργότητας µετασχηµατισµένων κυττάρων P.pastoris µε δοκιµή τρυβλίου και βαφή Congo Red 1% (β/ο) σε υπόστρωµα γαλακτοµαννάνης 1% (β/ο) Προσδιορίστηκε η ανάπτυξη της βιοµάζας στην καλλιέργεια διάρκειας 7 ηµερών (µετρούµενη ως οπτική πυκνότητα στα 600nm) καθώς και η ενεργότητα του υγρού της καλλιέργειας µε χρήση της γνωστής δοκιµής ενεργότητας (Σχήµα 4).

5 10ο ΠΑΝΕΛΛΗΝΙΟ ΕΠΙΣΤΗΜΟΝΙΚΟ ΣΥΝΕΔΡΙΟ ΧΗΜΙΚΗΣ ΜΗΧΑΝΙΚΗΣ, ΠΑΤΡΑ, 4-6 ΙΟΥΝΙΟΥ, Σχήµα 4. Ενεργότητα ενδοµαννανάσης (µπάρες) και βιοµάζα (σηµεία) σε σχέση µε το χρόνο από την καλλιέργεια των µετασχηµατισµένων κυττάρων P.pastoris. Το µοριακό βάρος της πρωτεΐνης, καθώς και ο βαθµός καθαρότητας που προέκυψε από τη διαδικασία αποµόνωσής της, προσδιορίστηκαν µε τη µέθοδο της ηλεκτροφόρησης σε πήκτωµα πολυακρυλαµιδίου (SDSPAGE). Το µοριακό βάρος της ανασυνδυασµένης πρωτεΐνης προσδιορίστηκε στα 60 kda περίπου, µετά από σύγκριση µε διάλυµα πρωτεϊνών γνωστού µοριακού βάρους. Για τον προσδιορισµό του ισοηλεκτρικού σηµείου της ενδοµαννανάσης χρησιµοποιήθηκε η µέθοδος της ισοηλεκτρικής εστίασης (IEF-PAGE) για εύρος τιµών ph 3-9 και προσδιορίστηκε στο 3.6 (Σχήµα 5). (A) 1 2 (B) Σχήµα 5. (Α) SDS-PAGE και (Β) IEF της ανασυνδυασµένης MtMan26a. Στήλη 1, πρότυπο διάλυµα πρωτεϊνών γνωστού µοριακού βάρους, στήλη 2, δείγµα MtMan26a. Στήλη 3, πρότυπο διάλυµα πρωτεϊνών εύρους pi 3-9, στήλη 4, δείγµα MtMan26a ΒΙΟΧΗΜΙΚΟΣ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΜΟΣ Η επίδραση του ph και της θερµοκρασίας στην δράση και τη σταθερότητα της ανασυνδυασµένης πρωτεΐνης MtMan26a µελετήθηκε χρησιµοποιώντας γαλακτοµαννάνη χαρουπιού ως υπόστρωµα. Το ένζυµο παρουσίασε µια σχετικά ευρεία περιοχή τιµών ph από 5.0 έως 7.0 διατηρώντας πάνω από το 90% της µέγιστης ενεργότητάς του µε βέλτιστη την τιµή ph 6.0, ενώ η δραστικότητα του ενζύµου µειώθηκε δραστικά για τιµές ph µικρότερες του 4.0 και µεγαλύτερες του 9.0. Επιπλέον, η πρωτεΐνη παρουσίασε επαρκή ευστάθεια σε εύρος τιµών ph από 4.0 έως 10.0 µετά από 24 h επώαση, διατηρώντας πάνω από το 88% της αρχικής της ενεργότητας. Η βέλτιστη θερµοκρασία δράσης της MtMan26a προσδιορίστηκε στους 60 C, ενώ το ένζυµο έχασε γρήγορα την ενεργότητά του για θερµοκρασίες µεγαλύτερες των 65 C. Η σταθερότητα της ενδοµαννανάσης ήταν σηµαντική σε θερµοκρασίες έως και 50 C για 24 h (Σχήµα 6). Επιπροσθέτως, πραγµατοποιήθηκε µελέτη της επίδραση ιόντων µετάλλων και άλλων χηµικών ενώσεων στην ενεργότητα της MtMan26a. Η ενζυµική δραστικότητα παρεµποδίστηκε ολοκληρωτικά από Ag2+, παρεµποδίστηκε µερικώς Zn2+ και ενισχύθηκε από τα Co2+, Ni2+ και Cu2+ κατά 18.4, 12.7 και 17.2% αντίστοιχα. Η παρουσία άλλων ενώσεων και ιόντων (Ca2+, Na+, Mg2+, Mn2+, Urea, και EDTA) παρουσίασε µικρή επίδραση ή και καθόλου στην ενεργότητα του ενζύµου.

6 Σχήµα 6. Επίδραση του ph και της θερµοκρασίας στην ενεργότητα ( ) και στη σταθερότητα (, ) της MtMan26a. Η επώαση ήταν 24 και 4 h για τις δοκιµές σταθερότητας του ph και της θερµοκρασίας αντίστοιχα. Συνεργιστική δράση µε εµπορικά ενζυµικά σκευάσµατα σε λιγνινοκυτταρινούχα βιοµάζα Η συνεργιστική δράση της MtMan26a µε το µίγµα των εµπορικών σκευασµάτων Celluclast 1.5L και Novozyme 188 µελετήθηκε σε φυσικό ξυλώδες λιγνινοκυτταρινούχο υπόστρωµα Lignocel το οποίο έχει προηγουµένως υποστεί προκατεργασία (wet oxidation). Οι αντιδράσεις της ενζυµικής υδρόλυσης πραγµατοποιηθήκαν σε συγκέντρωση στερεών 6% (β/β) και συνολικό ενζυµικό φορτίο 12 mg/g (6 mg/g Ξ.Β. εµπορικά ένζυµα + 6 mg/g Ξ.Β. MtMan26a) ξηρής βιοµάζας (Ξ.Β.) στους 50 C για 24 h. Η προσθήκη της ανασυνδυασµένης ενδοµαννανάσης αύξησε την απελευθέρωση γλυκόζης κατά 10% (Σχήµα 7). Σχήµα 7. Απελευθέρωση γλυκόζης και ολικών αναγωγικών σακχάρων (ΟΑΣ) σε σχέση µε το χρόνο για τις ενζυµικές υδρολύσεις µε (γκρι µπάρες) και χωρίς (µαύρες µπάρες) την προσθήκη του ανασυνδυασµένου ενζύµου MtMan26a. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Στην παρούσα µελέτη πραγµατοποιήθηκε επιτυχώς η ετερόλογη έκφραση µιας ενδοµαννανάσης της οικογένειας 26 από το θερµόφιλο µύκητα Myceliophthora thermophila στη µεθυλότροφη ζύµη Pichia pastoris. Το µοριακό της βάρος προσδιορίστηκε στα 60 kda ενώ επέδειξε µέγιστη δραστικότητα σε θερµοκρασία 60 C και ph 6.0. Ο βιοχηµικός χαρακτηρισµός του ανασυνδυασµένου ενζύµου αποδεικνύει την δυνατότητα χρήσης του σε βιοτεχνολογικές εφαρµογές βιοµηχανικού ενδιαφέροντος όπως στη διαδικασία παραγωγής βιοκαυσίµων από ξυλώδη λιγνινοκυτταρινούχα βιοµάζα. Η συνεργιστική δράση της MtMan26a µε το εµπορικά διαθέσιµο ενζυµικό µίγµα Celluclast 1.5L και Novozyme 188 αύξησε την απελευθέρωση ζυµώσιµων σακχάρων κατά 10% δείχνοντας το ρόλο που παίζουν οι µαννανάσες, ως ηµικυτταρινάσες, στην ενζυµική υδρόλυση της λιγνινοκυτταρινούχας βιοµάζας. ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Η παρούσα µελέτη χρηµατοδοτήθηκε από τη Γενική Γραµµατεία Ερευνας και Τεχνολογίας (ΓΓΕΤ) Ελλάδα- ΕΣΠΑ (πρόγραµµα SIMPLE, ΣΥΝΕΡΓΑΣΙΑ 2011, 11ΣΥΝ_7_1579). Τα εµπορικά ένζυµα Celluclast 1.5L και Novozyme 188 ήταν προσφορά της εταιρείας Novozymes A/S (Δανία). Το προκατεργασµένο υπόστρωµα Lignocel ήταν ευγενική χορηγία του Ινστιτούτου Χηµικών Διεργασιών και Ενεργειακών Πόρων (ΙΔΕΠ).

7 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ [1]. Couturier M., Haon M., Coutinho P.M., Henrissat B., Lesage-Meesen L., Berrin J.G., App Env Microbiol. 77: (2011) [2]. Varnai A., Huikko L., Pere J., Siika-aho M., Viikari L., Biores Technol. 102: (2011) [3]. Dhawan S., Kaur J., Crit Rev Biotechnol. 27(4): (2007) [4]. Karnaouri A., Topakas E., Christakopoulos P., Appl Microbiol Biotechnol. 98: [5]. Miller G.L., Anal Chem. 31: [6]. Berka et al., Nature Biotechnol 10: