ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΚΑΙ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΜΟΣ ΕΝΟΣ ΘΕΡΜΟΦΙΛΟΥ ΕΝΖΥΜΟΥ ΠΟΥ ΕΜΠΛΕΚΕΤΑΙ ΣΤΗΝ ΑΠΟΙΚΟΔΟΜΗΣΗ ΤΗΣ ΚΥΤΤΑΡΙΝΟΥΧΟΥ ΒΙΟΜΑΖΑΣ

Transcript

1 ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΚΑΙ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΜΟΣ ΕΝΟΣ ΘΕΡΜΟΦΙΛΟΥ ΕΝΖΥΜΟΥ ΠΟΥ ΕΜΠΛΕΚΕΤΑΙ ΣΤΗΝ ΑΠΟΙΚΟΔΟΜΗΣΗ ΤΗΣ ΚΥΤΤΑΡΙΝΟΥΧΟΥ ΒΙΟΜΑΖΑΣ Α. X. Καρναούρη, Ε. Τόπακας, Π. Χριστακόπουλος Σχολή Χημικών Μηχανικών, Ε.Μ.Π., Ηρώων Πολυτεχνείου 9, Αθήνα ΠΕΡΙΛΗΨΗ Η κυτταρίνη αποτελεί το αφθονότερο οργανικό πολυμερές που συναντάται στη φύση, γεγονός που την καθιστά κατάλληλη ως φτηνά αξιοποιήσιμη πηγή άνθρακα και πρώτη ύλη για ποικίλες βιοτεχνολογικές εφαρμογές, όπως η παραγωγή στερεών και υγρών βιοκαυσίμων. Ως εκ τούτου, η απομόνωση νέων ενζύμων με δράση που στοχεύει στην αποικοδόμηση ή την τροποποίηση των κυτταρινούχων υλικών κρίνεται απαραίτητη. Οι θερμόφιλοι οργανισμοί αποτελούν σημαντική πηγή κυτταρινολυτικών ενζύμων με πολλές βιοτεχνολογικές εφαρμογές, καθώς οι διεργασίες αυτές συνήθως απαιτούν συνθήκες υψηλής θερμοκρασίας. Ο Myceliophthora thermophila είναι ένας θερμόφιλος αερόβιος μύκητας, ο οποίος παράγει πολλά θερμοσταθερά ένζυμα, που έχουν απομονωθεί και χαρακτηριστεί και χρησιμοποιούνται στη βιομηχανία σε βιοδιεργασίες που απαιτούν υψηλές θερμοκρασίες. Στόχος της παρούσας εργασίας είναι η απομόνωση και ετερόλογη έκφραση ενός γονιδίου που κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη με ενεργότητα β-1,4 ενδογλουκανάσης από το μύκητα Myceliophthora thermophila, καθώς και η παραγωγή και ο καταλυτικός χαρακτηρισμός του ανασυνδυασμένου ενζύμου. Ακολούθως, μελετάται η σταθερότητα του ενζύμου και η ικανότητά του να προκαλεί τη ρευστοποίηση πολυσακχαριτικών υποστρωμάτων, όπως το προκατεργασμένο άχυρο σίτου. Δείγματα της αντίδρασης της υδρόλυσης μελετώνται με ηλεκτρονική μικροσκοπία σάρωσης, με σκοπό να διερευνηθεί η δράση του ενζύμου στο συγκεκριμένο υπόστρωμα. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Τα βιοκαύσιμα αποτελούν ένα σημαντικό άξονα της ενεργειακής στρατηγικής της Ευρωπαϊκής κοινότητας, που στοχεύει ευρύτερα στην εξασφάλιση της διάθεσης ενέργειας συμβατής με τις περιβαλλοντικές δεσμεύσεις. Τα λιγνινοκυτταρινούχα υλικά είναι οι κύριες πρώτες ύλες που μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την παραγωγή στερεών και υγρών βιοκαυσίμων. Με τον όρο λιγνινοκυτταρινούχα υλικά αναφέρονται οι υπολειμματικές μορφές βιομάζας, όπως τα υπολείμματα γεωργικών καλλιεργειών, τα υπολείμματα επεξεργασίας γεωργικών προϊόντων, η βιομάζα δασικής προέλευσης και τέλος διάφορα ενεργειακά φυτά. Η σύσταση των λιγνινοκυτταρινούχων υλικών διαφοροποιείται ανάλογα με την προέλευσή τους. Γενικά, αποτελούνται από κυτταρίνη σε εκατοστιαία κατά βάρος περιεκτικότητα ίση με 35-50%, ημικυτταρίνη σε ποσοστό 20-35% και λιγνίνη σε ποσοστό 10-25% [1]. Η κυτταρίνη αποτελεί το αφθονότερο οργανικό πολυμερές που συναντάται στα λιγνινοκυτταρινούχα υλικά, συνεπώς αποτελεί μια φτηνά αξιοποιήσιμη πρώτη ύλη που μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την παραγωγή βιοκαυσίμων. Πρόκειται για ένα γραμμικό ομοπολυμερές αποτελούμενο από μονομερή D-γλυκόζης, συνδεδεμένα με β-1,4- γλυκοζιτικούς δεσμούς, με μέσο βαθμό πολυμερισμού από 100 έως [2]. Η διαδικασία μετατροπής της κυτταρίνης σε μορφή κατάλληλη για αξιοποίηση ως βιοκαύσιμο, περιλαμβάνει την αποικοδόμηση του μορίου προς παραγωγή μονάδων γλυκόζης και την επακόλουθη ζύμωση των σακχάρων σε βιοαιθανόλη. Η ενζυμική υδρόλυση της κυτταρίνης καταλύεται από ένζυμα της κατηγορίας των κυτταρινασών (cellulases), τα οποία μπορούν να παραχθούν από βακτήρια και μύκητες. Οι κυτταρινάσες αποτελούν ένα πολυσύνθετο

2 ενζυμικό σύστημα, με διαφορετικούς τύπους ενζυμικής ενεργότητας να εμπλέκονται και να συνεργάζονται στη διεργασία υδρόλυσης της κυτταρίνης. Οι β-1,4-ενδογλουκανάσες (ΕG, EC ) είναι ένζυμα που δρουν κατά τα πρώτα στάδια της αποικοδόμησης της κυτταρίνης και προσβάλλουν περιοχές του μορίου με χαμηλή κρυσταλλικότητα, υδρολύοντας τους β-1,4- γλυκοζιτικούς δεσμούς και δημιουργώντας ελεύθερα άκρα στην αλυσίδα (αναγωγικά και μη αναγωγικά). Ως εκ τούτου είναι τα ένζυμα εκείνα που αποδιοργανώνουν αρχικά την οργάνωση των ινιδίων κυτταρίνης και μειώνουν το ιξώδες, προκαλώντας ρευστοποίηση του πολυσακχαριτικού υποστρώματος. Το στάδιο αυτό είναι πολύ σημαντικό, καθώς με αυτό τον τρόπο δημιουργείται ένα περιβάλλον ευνοϊκό για τη δράση των υπόλοιπων κυτταρινολυτικών ενζύμων [3]. Η ενζυμική υδρόλυση της κυτταρίνης εξαρτάται από πολλούς παράγοντες, μεταξύ των οποίων η συγκέντρωση και η ειδική ενεργότητα του ενζύμου, η θερμοκρασία, η τιμή ph και η ποσότητα του νερού του περιβάλλοντος της αντίδρασης. Καθώς οι βιοτεχνολογικές διεργασίες συνήθως απαιτούν υψηλές θερμοκρασίες και υψηλές αρχικές συγκεντρώσεις υποστρώματος, ώστε να μεγιστοποιηθεί η παραγωγή γλυκόζης, νέες ενδογλουκανάσες με υψηλή θερμοσταθερότητα και ικανότητα ρευστοποίησης των υποστρωμάτων αναζητώνται σε θερμόφιλους μύκητες που αναπτύσσουν κυτταρινολυτικό σύστημα. Ο Myceliopthora thermophila είναι ένας θερμόφιλος αερόβιος μύκητας, ο οποίος αυξάνεται με μέγιστο ρυθμό σε θερμοκρασίες ο C, μπορεί να καλλιεργηθεί σε θερμακρασίες ο C και μπορεί ν αντέξει σε σύντομη έκθεση στους 59 ο C [4]. Ο ρυθμός ανάπτυξης του S. thermophile σε θρεπτικό υπόστρωμα γλυκόζης (0.1h -1 ) είναι παρόμοιος με εκείνον που παρατηρείται όταν ο μύκητας αυξάνεται σε υπόστρωμα κυτταρίνης ( h -1 ), γεγονός που τον χαρακτηρίζει ως ισχυρό κυτταρινολυτικό οργανισμό [5]. Ο μύκητας παράγει πολλά θερμοσταθερά ένζυμα τα οποία έχουν απομονωθεί και χαρακτηριστεί και χρησιμοποιούνται στη βιομηχανία σε βιοδιεργασίες που απαιτούν υψηλές θερμοκρασίες, όπως εστεράσες του φερουλικού οξέος [6]. Τα παραπάνω, σε συνδυασμό με το γεγονός ότι πρόσφατα έγινε η χαρτογράφηση του γονιδιώματος του μύκητα [7], άνοιξε το δρόμο για την ανακάλυψη νέων ενζύμων. Στόχος της παρούσας εργασίας είναι η ετερόλογη έκφραση, η παραγωγή και ο χαρακτηρισμός ενός ενζύμου με ενεργότητα ενδογλουκανάσης. Η αναζήτηση των νουκλεοτιδικών αλληλουχιών που κωδικοποιούν πρωτεΐνες με πιθανή δράση β-1,4 ενδογλουκανάσης στο γονιδίωμα του M. thermophila, το οποίο βρίσκεται διαθέσιμο στη βάση δεδομένων Genome Portal του Join Genome Institute, University of California ( απέδωσε 22 αλληλουχίες. Επτά από αυτές παρουσίαζαν υψηλό ποσοστό ομοιότητας κατά τη στοίχισή τους με τον υπολογιστικό αλγόριθμο BLAST ( με γνωστές β-1,4 ενδογλουκανάσες, ενώ οι υπόλοιπες 15 παρουσίαζαν χαμηλότερο ποσοστό ομοιότητας. Από τις επτά αλληλουχίες, επιλέχθηκε η αλληλουχία MtEG7a 66950, η οποία παρουσίαζε υψηλή ομοιότητα με ενδογλουκανάσες της οικογένειας GH7 (Glycoside Hydrolase 7) και περιείχε την περιοχή πρόσδεσης σε κυτταρίνη CBM (cellulose binding module). Η αλληλουχία επιλέχθηκε τόσο για την υψηλή ομοίοτητά της με ενδογλουκανάσες και την ύπαρξη της περιοχής CBM, όσο και για την απουσία εσωνίου, γεγονός που καθιστά την περαιτέρω ανάλυση απλούστερη και λιγότερο επισφαλή. Στη συνέχεια, ενισχύθηκε, κλωνοποιήθηκε στον κατάλληλο φορέα και η ετερόλογη έκφραση πραγματοποιήθηκε αρχικά στην E. coli και τελικά στο ζυμομύκητα P. pastoris. Ως ευκαρυωτικός οργανισμός, η ζύμη P. pastoris έχει τα πλεονεκτήματα των ανώτερων ευκαρυωτικών συστημάτων έκφρασης, όπως είναι η ικανότητα μεταμεταφραστικών τροποποιήσεων, οι οποίες είναι σημαντικές για την επεξεργασία των πρόδρομων πρωτεϊνικών μορίων, η δημιουργία δισουλφιδικών δεσμών και η γλυκοζυλίωση. Η P. pastoris διαθέτει έναν ισχυρό υποκινητή, που επάγει την παραγωγή

3 πρωτεΐνης μετά την προσθήκη μεθανόλης, επιτρέποντας την ελεγχόμενη έκφραση ετερόλογων πρωτεϊνών και μπορεί να αναπτύσσεται με μεθανόλη ως μόνη πηγή άνθρακα στο υλικό καλλιέργειας. Ένα ακόμα πλεονέκτημα του συστήματος που αποδείχθηκε καθοριστικό για την πορεία της παρούσας μελέτης είναι τα πολύ χαμηλά επίπεδα φυσικών εκκρινόμενων πρωτεϊνών του μύκητα. Όπως αποδείχθηκε, η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη αποτελεί το συντριπτικό ποσοστό του συνολικού πρωτεϊνικού περιεχομένου στο υπερκείμενο καλλιέργειας. Στην P. pastoris έχει πραγματοποιηθεί με επιτυχία η ετερόλογη έκφραση πολλών πρωτεϊνών, μεταξύ των οποίων αρκετές ενδογλουκανάσες [8]. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Η νουκλεοτιδική αλληλουχία που κωδικοποιεί την προς μελέτη πρωτεΐνη ενισχύθηκε με την τεχνική αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR, polymerase chain reaction) χρησιμοποιώντας το γονιδιακό DNA του θερμόφιλου μύκητα M. thermophila, με τη χρήση κατάλληλα σχεδιασμένων μορίων εκκινητών. Αφού επιβεβαιώθηκε η ύπαρξη του επιθυμητού γονιδίου με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης 1% w/v, το τμήμα του πηκτώματος που περιείχε την ενισχυμένη αλληλουχία κόπηκε και υποβλήθηκε σε διαδικασία καθαρισμού από τα τεμάχια αγαρόζης, αλλά και οτιδήποτε άλλο είχε προσδεθεί σε αυτό κατά την αντίδραση PCR. Μετά τον καθαρισμό, ακολούθησε αντίδραση συνένωσης του τμήματος DNA με το πλασμίδιο pcr Blunt (Invitrogen) και ακολούθως μετασχηματισμός βακτηριακών κυττάρων E.coli TOP10, με διαδικασία σύντομης έκθεσης σε πολύ υψηλή θερμοκρασία (θερμικό σοκ). Στη συνέχεια, τα κύτταρα επιστρώθηκαν σε στερεό θρεπτικό μέσο σε τρυβλίο Petri, παρουσία κατάλληλου αντιβιοτικού (50 μg/ml καναμυκίνη) για επιλογή των ανασυνδυασμένων αποικιών. Μερικές από τις αποικίες που αναπτύχθηκαν, χρησιμοποιήθηκαν για απομόνωση του πλασμιδιακού DNA με κατάλληλο τυποποιημένο πακέτο αντιδραστηρίων (Fermentas). Η επιτυχία του ανασυνδυασμού ελέχθηκε μετά από πέψη του πλασμιδίου με τα περιοριστικά ένζυμα ClaI και XbaI και εφαρμογή ηλεκτροφόρησης σε πήκτωμα αγαρόζης. Μόλις επιβεβαιώθηκε η ύπαρξη του γονιδίου που έχει εισαχθεί, δείγμα καθαρού πλασμιδιακού DNA στάλθηκε για ανάλυση της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας του DNA. Μετά την ανάλυση της νουκλεοτιδικής αλληλλουχίας και την επιβεβαίωση της ύπαρξης του γονιδίου ΜtEG7a, η αλληλουχία απομονώθηκε με τη χρήση των περιοριστικών ενζύμων ClaI / XbaI, εισήχθησε στον πλασμιδιακό φορέα ppiczac και χρησιμοποιήθηκε για να μετασχηματίσει βακτηριακά κύτταρα E.coli TOP10F, με τη διαδικασία θερμικού σοκ. Η επιτυχία του ανασυνδυασμού ελέχθηκε μετά από πέψη του πλασμιδίου με τα περιοριστικά ένζυμα ClaI και XbaI και εφαρμογή ηλεκτροφόρησης σε πήκτωμα αγαρόζης περιεκτικότητας 1% w/v. Μετά την επιβεβαίωση της ύπαρξης του γονιδίου ΜtEG7a, επιλέχθηκαν δυο ανασυνδυασμένα πλασμίδια ppiczac που έφεραν το γονίδιο, για το μετασχηματισμό κυττάρων ζύμης P. pastoris. Τα κύτταρα ζύμης Χ33 αναπτύχθηκαν σε θρεπτικό υλικό με εκχύλισμα ζύμης, πεπτόνη και γλυκόζη και προετοιμάστηκαν κατάλληλα για να καταστούν επιδεκτικά, σύμφωνα με το πρωτόκολλο της εταιρείας Invitrogen. Στη συνέχεια, εναιώρήμα επιδεκτικών κυττάρων X33 αναμείχθηκε με το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο ppiczαc και ακολούθησε μετασχηματισμός με τη διαδικασία της ηλεκτροδιάτρησης. Μετά την εφαρμογή ηλεκτρικού παλμού προστέθηκε σορβιτόλη, η οποία αυξάνει το ποσοστό βιωσιμότητας των κυττάρων ευνοώντας την αναγέννηση του κυτταρικού τοιχώματος, και ακολούθησε επώαση στους 30 C. Για την επιλογή των ανασυνδυασμένων αποικιών, έγινε επίστρωση σε στερεό θρεπτικό υλικό με ζεοσίνη και επώαση στους 30 C. Τα κύτταρα που είχαν προσλάβει το πλασμίδιο εμφάνισαν ανθεκτικότητα στη ζεοσίνη και αναπτύχθηκαν ικανοποιητικά σε 3-4 μέρες.

4 Η έκφραση του ανασυνδυασμένου γονιδίου ελέχθηκε με την προσθήκη ειδικού για την πρωτεΐνη υποστρώματος και μελέτη της δράσης του ενζύμου σε αυτό. Στην περίπτωση του γονιδίου ΜtEG7a, όπου στόχος είναι η ανίχνευση ενεργότητας ενδογλουκανάσης, το υπόστρωμα που χρησιμοποιήθηκε είναι ένα παράγωγο κυτταρίνης με καρβοξυμεθυλομάδες (- CH 2 COOH) ενωμένες στις ομάδες υδροξυλίου των μονομερών της γλυκόζης που σχηματίζουν τον σκελετό του μορίου (carboxy-methyl-cellulose, CMC). Έτσι, τα τρυβλία επιστρώθηκαν με διάλυμα άγαρος 1% (w/v), το οποίο περιείχε το υπόστρωμα (καρβοξυλεθυλ-κυτταρίνη, 0,4% w/v). Ακολούθησε χρώση με διάλυμα χρωστικής Congo Red 1% w/v και αποχρωματισμός με διάλυμα NaCl. Γύρω από τις ανασυνδυασμένες αποικίες σχηματίστηκαν ορατές κηλίδες που υποδεικνύουν τη διάσπαση του υποστρώματος από το ένζυμο που εκκρίνεται εξωκυτταρικά. Οι αποικίες με τα ποιοτικά υψηλότερα ποσοστά έκφρασης της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης απομονώθηκαν από τα τρυβλία MD για περαιτέρω ανακαλλιέργεια και επεξεργασία. Οι αποικίες αυτές ανακαλλιεργήθηκαν σε θρεπτικό μέσο YPDS με ζεοσίνη και φυλάχθηκαν στους 4 ο C. Aπό τα παραπάνω τρυβλία, επιλέxθηκαν κάποιες αποικίες για περαιτέρω μελέτη της έκφρασης του ανασυνδυασμένου γονιδίου. Για την παραγωγή μεγάλης ποσότητας της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης, πραγματοποιήθηκαν μεγάλης κλίμακας καλλιέργειες σε θρεπτικό υλικό κατάληλο για την ανάπτυξη της ζύμης. Μετά από επώαση 4 ημερών, χρονικό διάστημα το οποίο κρίθηκε κατάλληλο από άποψη ικανοποιητικής κυτταρικής ανάπτυξης και επαρκούς παραγωγής της πρωτεΐνης από μελέτες σε καλλιέργειες μικρής κλίμακας, συλλέχθηκε το υπερκείμενο προκειμένου να συμπυκνωθεί και να απομονωθεί η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη από τις υπόλοιπες εκκρινόμενες πρωτεΐνες της ζύμης. Το υπερκείμενο διηθήθηκε υπό κενό για να απομακρυνθούν τυχόν κυτταρικά θραύσματα και συμπυκνώθηκε με τη χρήση συσκευής υπερδιήθησης. Μετά την υπερδιήθηση, στο εσωτερικό της συσκευής παρέμεινε το συμπυκνωμένο διάλυμα όγκου περίπου 30 ml που περιείχε τις πρωτεΐνες με μοριακό βάρος μεγαλύτερο από 10 kda. Στη συνέχεια, η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη που περιέχει τα κατάλοιπα ιστιδίνης (6xHis-tag) απομονώθηκε με χρωματογραφία συγγενείας ακινητοποιημένου μετάλλου (IMAC) σε στήλη κοβαλτίου, παρουσία αυξανόμενης συγκέντρωσης ιμιδαζολίου. Η διαδικασία καθαρισμού είχε ως αποτέλεσμα την παραγωγή της καθαρής ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης ΜtEG7a. Η καθαρή ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη εξισορροπήθηκε προς αφαλάτωση με το ρυθμιστικό διάλυμα Tris - HCl 30mM ph 8.0, με τη μέθοδο διαπίδυσης από ημιπερατές μεμβράνες κυτταρίνης. Το μέγεθος της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης προσδιορίστηκε με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE), ενώ ο ποσοτικός προσδιορισμός του καθαρού ενζύμου έγινε με δύο μεθόδους: τη μέθοδο Bradford [9] και με μέτρηση της οπτικής απορρόφησης του διαλύματος σε μήκος κύματος 280 nm. Το ισοηλεκτρικό σημείο της πρωτεΐνης προσδιορίστηκε με ηλεκτροφόρηση ισοηλεκτρικής εστίασης (IEF-PAGE). Για τη μελέτη της ενεργότητας της ανασυνδυασμένης ενδογλουκανάσης χρησιμοποιήθηκαν τα πολυσακχαριτικά υποστρώματα καρβοξυμεθυλ-κυτταρίνη (carboxymethylcellulose, CMC, SIGMA), β-γλουκάνη κριθαριού (barley b-glucan, MEGAZYME), λιχενάνη (lichenan, SIGMA), υδροξυαιθυλ-κυτταρίνη (hydroxyethyl-cellulose, HEC, SIGMA), υδροξυπροπυλμεθυλ-κυτταρίνη (hydroxypropyl-methylcellulose, SIGMA), λαμιναρίνη (laminarin, SIGMA), διηθητικό χαρτί (filter paper Whatman No 1), υπόστρωμα μικροκρυσταλλικής κυτταρίνης (Avicel, Macherey - Nagel) και ο υποκατεστημένος πυρανοζίτης pnpg (pnp glycopyranoside, SIGMA). Ακόμη, εξετάστηκε η παρουσία ενεργότητας ξυλανάσης σε διάφορες ξυλάνες, όπως ξυλάνη βρώμης (oat spelt xylan, SIGMA), ξυλάνη οξιάς (beechwood xylan, SIGMA), ξυλάνη σημύδας (birchwood xylan, ROTH), αραβινοξυλάνη πίτυρου (wheat arabinoxylan, MEGAZYME), αλλά και σε υπόστρωμα pnp ξυλοπυρανοζίτη (pnp

5 xylopyranoside, SIGMA). Η ενζυμική ενεργότητα του ανασυνδυασμένου ενζύμου μετρήθηκε με την ποσότητα των απελευθερούμενων σακχάρων από αντίδραση σε πολυσακχαριτικά υποστρώματα με τη μέθοδο του δινιτροσαλικυλικού οξέος. Ως μονάδα ενζυμικής δραστικότητας (unit, U) ορίστηκε η ποσότητα του ενζύμου που καταλύει το σχηματισμό 1 μmol προϊόντος (ανηγμένα σάκχαρα) από το αντίστοιχο υπόστρωμα στη μονάδα του χρόνου (min), στους 50 ο C. Ακόμη, μελετήθηκε η ενζυμική ενεργότητα του ενζύμου σε υποστρώματα κελλο-ολιγοσακχαριτών (κελλοτριόζη, κελλοτετραόζη, κελλοπενταόζη). Η απελευθέρωση των ολιγοσακχαριτών που προέκυψαν αναλύθηκε ποιοτικά χρησιμοποιώντας το σύστημα χρωματογραφίας υψηλής διαχωριστικής ικανότητας HPLC (Jasco PU 1580i) με βαθμιδωτή έκλουση τριών διαλυτών. Η ανίχνευση έγινε με έναν αμπερομετρικό ανιχνευτή παλμού (PAD, DIONEX) εφοδιασμένο με ηλεκτρόδιο χρυσού. Ο όγκος του προς μέτρηση δείγματος ήταν 20 μl. Οι κορυφές καταγράφηκαν με χρόνο ανάλυσης 50 λεπτά, ενώ η ολοκλήρωση των κορυφών επιτεύχθηκε μέσω του λογισμικού Clarity Version Τα προϊόντα των αντιδράσεων ταυτοποιήθηκαν και οι συγκεντρώσεις αυτών μετρήθηκαν μετά από σύγκριση με δείγματα ολιγοσακχαριτών γνωστής συγκέντρωσης. Η μελέτη της βέλτιστης θερμοκρασίας ενεργότητας για την ανασυνδυασμένη ενδογλουκανάση έγινε μετρώντας την ενεργότητα του ενζύμου σε διάφορες θερμοκρασίες στο εύρος ο C για 15 λεπτά, χρησιμοποιώντας ως υπόστρωμα την καρβοξυμεθυλκυτταρίνη (CMC, 1% w/v χαμηλού ιξώδους). Σε όλες τις περιπτώσεις, το ρυθμιστικό διάλυμα που χρησιμοποιήθηκε ήταν το κιτρικό - φωσφορικό 100 mm ph 5.0, όπου το συγκεκριμένο ένζυμο φάνηκε να εμφανίζει ικανοποιητική ενεργότητα. Για τη μελέτη της σταθερότητας του ενζύμου, πραγματοποιήθηκε επώαση των ενζυμικών διαλυμάτων για διαφορετικά χρονικά διαστήματα (4, 8 και 24 ώρες) σε ένα εύρος θερμοκρασιών ο C σε ph 5.0 (κιτρικό φωσφορικό 100 mm) απουσία υποστρώματος. Στη συνέχεια μετρήθηκε η ενεργότητα των διαλυμάτων για 15 λεπτά, χρησιμοποιώντας ως υπόστρωμα την καρβοξυμεθυλ-κυτταρίνη (CMC, 1% w/v χαμηλού ιξώδους). Το βέλτιστο ph δράσης μελετήθηκε μετρώντας την ενεργότητα σε διάφορες τιμές ph για το εύρος , για 15 λεπτά, χρησιμοποιώντας ως υπόστρωμα την καρβοξυμεθυλ-κυτταρίνη (CMC, 1% w/v χαμηλού ιξώδους). Τα ζεύγη αλάτων που χρησιμοποιήθηκαν ως ρυθμιστικά διαλύματα (100 mm) για τα παραπάνω ph ήταν τα εξής: (α) Κιτρικό Φωσφορικό (ph ), (β) Tris HCl (ph ) και (γ) Γλυκίνη NaOH ( ). Για τη μέτρηση της σταθερότητας του ενζύμου σε διάφορες τιμές ph, πραγματοποιήθηκε επώαση ενζυμικών διαλυμάτων στους 4 ο C,στα προαναφερθέντα διαλύματα διαφορετικού ph, για διαφορετικά χρονικά διαστήματα (4, 8 και 24 ώρες). Ακολούθησε μέτρηση της ενεργότητας για 15 λεπτά, σε καρβοξυμεθυλ-κυτταρίνη (CMC, 1% w/v χαμηλού ιξώδους), σε ph 5.0 (κιτρικό φωσφορικό 100 mm). Στη συνέχεια μελετήθηκε η ικανότητα της ενδογλουκανάσης να προκαλεί μέιωση του ιξώδους και ρευστοποίηση του προκατεργασμένου άχυρου σίτου, ενός φυσικού λιγνινοκυτταρινούχου υποστρώμάτος (Triticum aestivum L.; PWS, Inbicon A/S, Denmark). Οι αντιδράσεις υδρόλυσης του αχύρου πραγματοποιήθηκαν σε μια κατακόρυφη κυκλική συσκευή διαμέτρου 25 cm και πάχους 6 cm, υπό ανάδευση, σε θερμοκρασίες ο C για 6 ώρες, με αρχική συγκέντρωση ξηρού βάρους υποστρώματος 18% (w/w) και συγκέντρωση ενζύμου 5 mg/g ξηρού βάρους αχύρου. Κατά τη διάρκεια της αντίδρασης, δείγματα λήφθησαν τόσο για τη μέτρηση ανηγμένων σακχάρων, όσο και για τη μέτρηση του ιξώδους με με ιξωδομετρία ταλάντωσης (oscillation viscometric measurement method). Η συγκεκριμένη μέθοδος χρησιμοποιείται ικανοποιητικά για τη μέτρηση του ιξώδους υλικών που εμφανίζουν ιξωδοελαστικές ιδιότητες, όπως τα λιγνινοκυτταρινούχα υλικά [10]. Δείγματα των αντιδράσεων μελετήθηκαν με ηλεκτρονική μικροσκοπία σάρωσης (SEM) για

6 να προσδιοριστούν οι δομικές αλλαγές που συμβαίνουν στα ινίδια της κυτταρίνης του υλικού κατά τη διάρκεια της κατεργσίας με την ανασυνδυασμένη ενδογλουκανάση. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ Μετά την ενίσχυση της αλληλουχίας με την τεχνική PCR και την απομόνωση του νουκλεοτιδικού τμήματος από το πήκτωμα αγαρόζης, διαδοχικές διαδικασίες μοριακών χειρισμών και μετασχηματισμών βακτηριακών κυττάρων και κυττάρων ζύμης, όπως περιγράφεται αναλυτικά στο Πειραματικό Μέρος της εργασίας, είχαν ως αποτέλεσμα τη δημιουργία ενός ανασυνδυασμένου στελέχους ζύμης P. pastoris με δυνατότητα παραγωγής της ενδογλουκανάσης MtEG7a. Η ζύμη αναπτύχθηκε σε υγρό θρεπτικό μέσο προς παραγωγή της ανασυνδυασμένης πρωτεϊνης στο υπερκείμενο της καλλιέργειας (Σχήμα 1). Μετά τον καθαρισμό, το μέγεθος της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης προσδιορίστηκε στα 65kDa, με ηλεκτροφόρηση SDS-PAGE, ενώ η συγκέντρωση της πρωτεΐνης προσδιορίστηκε στα 2,8 mg/ml. Το ισοηλεκτρικό σημείο της πρωτεΐνης προσδιορίστηκε με ηλεκτροφόρηση ισοηλεκτρικής εστίασης σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου (IEF-PAGE). Στο πήκτωμα εμφανίστηκαν περισσότερες από μια ζώνες που αντιστοιχούν σε περιοχές pi μεταξύ 3.8 και 4.5 και αντιπροσωπεύουν ισομορφές της πρωτεΐνης MtEG7a (Σχήμα 2). Οι ισομορφές της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης προέρχονται από διαφορετικά πρότυπα γλυκοζυλίωσης από το σύστημα μετα-μεταφραστικών τροποποιήσεων της P. pastoris. Έχει αναφερθεί πως η διαδικασία της γλυκοζυλίωσης έχει ως αποτέλεσμα την παραγωγή ενός ετερογενούς πληθυσμού μορίων ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης, αφού ακόμη και στο ίδιο κύτταρο ζύμης, στο ίδιο σύμπλεγμα Golgi, δύο διαφορετικά μόρια της ίδιας πρωτεΐνης είναι πιθανό να εμφανίσουν διαφορετικά πρότυπα γλυκοζυλίωσης. Αυτή η ετερογένεια οφείλεται στην αφθονία διαφορετικών τύπων, μήκους και ιδιοτήτων των ολιγοσακχαριτών που βρίσκονται στο κυτταρόπλασμα και συνεπώς δημιουργούν μικροπληθυσμούς κυττάρων που διαφέρουν ελάχιστα ως προς τις ικανότητες και τα πρότυπα γλυκοζυλίωσης [11]. Ειδική ενεργότητα MtEG7a OD (600 nm) Ειδική ενεργότητα MtEG7a (U/mL) OD (600 nm) Χρόνος (ώρες) Σχήμα 1. Απεικόνιση της αύξησης της βιομάζας της ζύμης P.pastoris σε θρεπτικό μέσο ΒΜΜΥ και της ενεργότητας ενδογλουκανάσης στο υπερκείμενο καλλιέργειας όγκου 50 ml. Η καλλιέργεια πραγματοποιήθηκε σε γυάλινες κωνικές φιάλες Erlenmeyer όγκου 250 ml. Η ανάπτυξη προσδιορίστηκε με μέτρηση της οπτικής πυκνότητας του δείγματος στα 600 nm, ενώ η ενεργότητα ανιχνεύθηκε με δοκιμή της ενζυμικής δραστικότητας σε υπόστρωμα CMC 1% w/v και μέτρηση των απελευθερούμενων από τη διάσπαση σακχάρων με τη μέθοδο DNS.

7 Σχήμα 2. (Α) Απεικόνιση των αποτελεσμάτων της ηλεκτροφόρησης SDS-PAGE σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου δειγμάτων από τα στάδια καθαρισμού της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης, όπου 1: δείγμα από το διάλυμα που προέκυψε μετά από συμπύκνωση του υπερκείμενου της καλλιέργειας στη συσκευή υπερδιήθησης και 2: δείγμα από το διάλυμα που εκλούθηκε από τη στήλη χρωματογραφίας. Το πρότυπο διάλυμα μίγματος πρωτεϊνών γνωστών μοριακών βαρών είναι της εταιρείας Fermentas. (Β) Προσδιορισμός του ισοηλεκτρικού σημείου της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης ΜtEG7a. Το πρότυπο διάλυμα μίγματος πρωτεϊνών γνωστών ισοηλεκτρικών σημείων είναι της εταιρείας Pharmacia. Πίνακας 1. Ενζυμική ενεργότητα της ενδογλουκανάσης MtEG7a. Στα υποστρώματα pnpγλυκοπυρανοζίτης, pnpξυλοπυρανοζίτης, HPMC, λαμιναρίνη και αραβικό κόμμι, το ένζυμο δεν εμφανίζει ενεργότητα. Υπόστρωμα Ειδική ενεργότητα, Units/mg πρωτεΐνης β-γλουκάνη κριθαριού 1% 298 ± 9.2 CMC 4% χαμηλού ιξώδους 230 ± 4.2 CMC 1% χαμηλού ιξώδους 177 ± 5.8 CMC 1% υψηλού ιξώδους 106 ± 8.3 λιχενάνη 1% 26 ± 0 ξυλάνη βρώμης 1% 10 ± 0.2 αραβινοξυλάνη πίτυρου 1% 5 ± 0.2 ξυλάνη οξιάς 1% 5 ± 0 ξυλάνη σημύδας 1% 4 ± 0.1 διηθητικό χαρτί 5 ± 0.3 HEC 1% 2 ± 0 Avicel 2% 0,24 ± 0.1 Δοκιμές ενεργότητας σε πολυσακχαριτικά υποστρώματα έδειξαν ότι η ενδογλουκανάση ΜtEG7a παρουσιάζει υψηλότερη ειδική ενεργότητα στη β-γλουκάνη κριθαριού (298 U/mg πρωτεΐνης) και αρκετά υψηλή ειδική ενεργότητα στη λιχενάνη (25.68 U/mg πρωτεΐνης), υποστρώματα που περιέχουν μονάδες γλυκόζης ενωμένες με 1,3 και 1,4 γλυκοζιτικούς δεσμούς (Πίνακας 1). Εφόσον το ένζυμο παρουσιάζει κάποια ιδιαίτερη προτίμηση δράσης σε

8 αυτά τα υποστρώματα, θα μπορούσε να κατηγοριοποιηθεί ως 1,3 1,4 γλουκανάση [12], αλλά η απουσία δραστικότητας σε υπόστρωμα λαμιναρίνη, που περιέχει αποκλειστικά 1,3 και 1,6 γλυκοζιτικούς δεσμούς, καταδεικνύει την ΜtEG7a ως 1,4 γλουκανάση. Οι δοκιμές σε υποστρώματα ξυλάνης, έδειξαν πως το ένζυμο παρουσιάζει υψηλότερη ειδική ενεργότητα σε ξυλάνη του σκληρού ξύλου (ξυλάνη βρώμης) σχετικά με την αραβινοξυλάνη και τις ξυλάνες μαλακού ξύλου (ξυλάνη οξιάς και ξυλάνη σημύδας). Η δράση ξυλανάσης είναι χαρακτηριστική για τις ενδογλουκανάσες της οικογένειας GH7. Η ενζυμική ενεργότητα του ανασυνδυασμένου ενζύμου προσδιορίστηκε με αντιδράσεις σε υποστρώματα κελλοολιγοσακχαριτών (κελλοτριόζη, κελλοτετραόζη, κελλοπενταόζη). Από τα αποτελέσματα, διαπιστώθηκε ότι η ενδογλουκανάση MtEG7a έχει την ικανότητα να διασπά την κελλοπενταόζη σε κελλοτριόζη και κελλοβιόζη, την κελλοτετραόζη σε κελλοβιόζη και την κελλοτριόζη σε γλυκόζη και κελλοβιόζη. Το ένζυμο δε διασπά την κελλοβιόζη και συνεπώς, δεν εμφανίζει ενεργότητα β-γλυκοσιδάσης. Η μελέτη της βέλτιστης θερμοκρασίας και του βέλτιστου ph δραστικότητας για την ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη, αλλά και οι δοκιμές εκτίμησης της σταθερότητας του ενζύμου μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ως υπόστρωμα την καρβοξυμεθυλ-κυτταρίνη (CMC, 1% w/v χαμηλού ιξώδους). Τα αποτέλεσμα έδειξαν πως η πρωτεΐνη MtEG7a παρουσιάζει τη μεγαλύτερη ενεργότητα σε ph 5,0 και σε θερμοκρασία 60 ο C. Οι δοκιμές σταθερότητας σε διάφορες τιμές θερμοκρασίας έδειξαν πως παρατηρείται απώλεια της ενεργότητας μετά από επώαση 8 ωρών σε διάφορες θερμοκρασίες, ωστόσο το ένζυμο διατηρεί to 40% της ενεργότητάς του στους 80 ο C. Οι χρόνοι ημιζωής είναι 9.96 ώρες στους 70 ο C και 6.5 ώρες στους 80 ο C. Οι δοκιμές σταθερότητας σε διάφορες τιμές ph έδειξαν πως το ένζυμο διατηρεί περισσότερο από το 90% της σταθερότητάς του σε τιμές ph 3-7 μετά από 24 ώρες επώασης (Σχήμα 3). % Σχετική ενεργότητα % Σχετική ενεργότητα Τιμή ph Θερμοκρασία ( 0 C) Σχήμα 3. (A) Απεικόνιση της τιμής ph όπου παρατηρείται η μέγιστη ενεργότητα του ενζύμου ΜtEG7a σε υπόστρωμα CMC 1% w/v χαμηλού ιξώδους και σταθερότητα του ενζύμου σε διάφορες τιμές ph για χρονικό διάστημα 8 ωρών. Για τις τιμές ph 7.0 και 9.0 χρησιμοποιήθηκαν δυο ρυθμιστικά διαλύματα (ph 7a: κιτρικό-φωσφορικό, 7b: Tris-HCl, 9a: Tris-HCl και 9b: γλυκίνη-naoh). Η μέτρηση των σακχάρων έγινε με τη μέθοδο DNS. (Β) Απεικόνιση της θερμοκρασίας όπου παρατηρείται η υψηλότερη ενεργότητα του ενζύμου ΜtEG7a σε υπόστρωμα CMC 1% w/v χαμηλού ιξώδους και σταθερότητα του ενζύμου σε διάφορες τιμές θερμοκρασίας για χρονικό διάστημα 8 ωρών. Η μέτρηση των σακχάρων έγινε με τη μέθοδο DNS. Η υδρόλυση προκατεργασμένου αχύρου με την προσθήκη της ενδογλουκανάσης έδειξε την υψηλή ικανότητα του ενζύμου να προκαλεί ρευστοποίηση του υποστρώματος, καθώς το ιξώδες μειώθηκε αρκετά στα πρώτα 90 λεπτά της αντίδρασης. Η δράση του ενζύμου ήταν πιο ικανοποιητική στους 55 ο C, καθώς αφενός το ιξώδες μειώθηκε από 1773 σε 302 Pa s στις 3

9 πρώτες ώρες της αντίδρασης, αφετέρου τα επίπεδα των απελευθερούμενων σακχάρων ήταν πολύ περισσότερα σε σχέση με εκείνα που παρατηρήθηκαν στις άλλες θερμοκρασίες (Σχήμα 4). Οι εικόνες από την ηλεκτρονική μικροσκοπία σάρωσης έδειξαν ότι αρχικά τα ινίδια κυτταρίνης του υλικού εμφανίζουν μια συμπαγή και οργανωμένη δομή, ενώ 6 ώρες μετά την προσθήκη του ενζύμου, εμφανίζονται ίχνη διάβρωσης της επιφάνειας των ινιδίων, δημιουργούνται σχισμές και εγκοπές, ενώ το υλικό φαίνεται πιο αποδιοργανωμένο (Σχήμα 5). Ιξώδες (Pa.s) 45 C 50 C 55 C Δ 60 C Συγκέντρωση ανηγμένων σακχάρων (mg αναλόγων γλυκόζης / g ξ.βάρους υποστρώματος 45 C 50 C 55 C Δ 60 C Χρόνος (ώρες) Χρόνος (ώρες) Σχήμα 4. (A) Απεικόνιση της μείωσης του ιξώδους του προκατεργασμένου άχυρου σίτου μετά την προσθήκη της ενδογλουκανάση MtEG7a σε διάφορες θερμοκρασίες. (Β) Απεικόνιση της συγκέντρωσης ανηγμένων σακχάρων που απελευθερώνονται από τη δράση της ενδογλουκανάσης. Οι αντιδράσεις πραγματοποιήθηκαν με αρχική συγκέντρωση υποστρώματος 18% (w/w) και συγκέντρωση ενζύμου 5 mg/ g ξηρής μάζας υποστρώματος. Σχήμα 5. (A) Εικόνα ηλεκτρονικής μικροσκοπίας σάρωσης (SEM) που απεικονίζει τα ινίδια κυτταρίνης πριν (Α) και 6 ώρες μετά (Β) τη δράση της ενδογλουκανάσης (μεγέθυνση 3000X). ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Συνοψίζοντας τα παραπάνω, το ανανδυασμένο ένζυμο ΜtEG7a που παράχθηκε ετερόλογα από τη μεθυλοτροφική ζύμη P. pastoris είναι μια πρωτεΐνη με κυρίαρχη ενεργότητα ενδογλουκανάσης, η οποία υδρολύει σε μικρά ποσοστά υποστρώματα ξυλανών, γεγονός που την καθιστά χρήσιμη στις διεργασίες αποικοδόμησης της λιγνινοκυτταρινούχου βιομάζας προς παραγωγή βιοκαυσίμων, εφόσον υδρολύει μερικώς και την ημικυτταρίνη. Η χρήση ενός τέτοιου ενζύμου, θα μπορούσε να οδηγήσει στην παράκαμψη του σταδίου της προκατεργασίας της βιομάζας που στοχεύει στην απομάκρυνση των καταλοίπων της ημικυτταρίνης. Το ένζυμο παρουσιάζει μέγιστη ενεργότητα σε θερμοκρασία 60 ο C και σε τιμή ph 5.0 και παρουσιάζει υψηλή ικανότητα ρευστοποίησης φυσικών λιγνινοκυτταρινούχων υποστρωμάτων, όπως το προκατεργασμένο άχυρο σίτου. Τέλος, είναι εξαιρετικά σταθερό σε διάφορες συνθήκες θερμοκρασίας και ph, γεγονός που επισφραγίζει τη δυνατότητα χρήσης

10 του σε βιομηχανικές διεργασίες που απαιτούν ακραίες φυσικοχημικές συνθήκες (βιομηχανία τροφίμων, ποτών, υφασμάτων και απορρυπαντικών). ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Η παρούσα εργασία πραγματοποιήθηκε στο Εργαστήριο Βιοτεχνολογίας της Σχολής Χημικών Μηχανικών του Ε.Μ.Π., υπό την επίβλεψη του Καθηγητή Π. Χριστακόπουλου και του Λέκτορα Ε. Τόπακα και χρηματοδοτόθηκε από το Ίδρυμα Κρατικών Υποτροφιών (Ι.Κ.Υ.). Οι συγγραφείς ευχαριστούν τον Υποψ. Διδάκτορα Πάσχο Θωμά για τη συμβολή του στη διεξαγωγή των πειραμάτων του προκατεργασμένου αχύρου. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ [1] Saha B.C., J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 30: (2003) [2] Zhang Y.H. and Lynd L.R., Biotechnol. Bioeng. 88: (2004) [3] Szijártó N., Siika-aho M., Sontag-Strohm T., Viikari L., Biores. Techn. 102: (2011) [4] Bhat K.M. and Maheshwari R., Appl. Environ. Microbiol. 53: (1987) [5] Maheshwari R., Bharadwaj G., Bhat M.K., Microbiol. Mol. Biol. Rev. 64: (2000) [6] Topakas E., Vafiadi C., Christakopoulos P., Process biochemistry 42: (2007) [7] Berka R.M., Grigoriev I.V., Otillar R., et al. Nat. Biotechnol. 29: (2011) [8] Shumiao Z., Huang J., Zhang C., Deng L., Hu N., Liang Y., J. Microbiol. Biotechn. 20: (2010) [9] Bradford M.M., Anal. Biochem. 72: (1976) [10] Rosgaard L., Andric P., Dam-Johansen K., Pedersen S., Meyer A.S., Appl. Biochem. Biotechnol. 143: (2007) [11] Herscovics A., Orlean P., The FASEB journal. 7: (1993) [12] Henrissat B., Cellulose 1: (1994)