ΧΑΡΟΚΟΠΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΤΜΗΜΑ ΕΠΙΣΤΗΜΗΣ ΔΙΑΙΤΟΛΟΓΙΑΣ ΔΙΑΤΡΟΦΗΣ

Transcript

1 ΧΑΡΟΚΟΠΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΤΜΗΜΑ ΕΠΙΣΤΗΜΗΣ ΔΙΑΙΤΟΛΟΓΙΑΣ ΔΙΑΤΡΟΦΗΣ Έλεγχος εμφάνισης αντιμικροβιακής δράσης αφεψημάτων από βότανα της ελληνικής χλωρίδας Investigation of antimicrobial activity of Greek herbal infusions Ρούντα Μαρία (Α.Μ.: 20928) Τριμελής Επιτροπή Επιβλέπουσα: Αδαμαντίνη Κυριακού Μέλη: Νικόλαος Καλογερόπουλος, Ανδριάνα Καλιώρα

2 Ευχαριστίες, Μετά το πέρας της παρούσας μελέτης θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά τα μέλη της τριμελούς μου επιτροπής την Επίκουρη Καθηγήτρια Αδαμαντίνη Κυριακού, τον Αναπληρωτή Καθηγητή Νικόλαο Καλογερόπουλο και την Επίκουρη Καθηγήτρια Ανδριάνα Καλιώρα για την κατανόηση, την υποστήριξη, το ενδιαφέρον που έδειξαν και την μεγάλη προθυμία τους να με βοηθήσουν σε όλη τη διάρκεια της συνεργασίας μας, για την οποία αισθάνομαι πραγματικά ευγνώμων. Ιδιαιτέρως ένα πολύ μεγάλο ευχαριστώ θα ήθελα να εκφράσω στο πρόσωπο της επιβλέπουσας μου, κ. Αδαμαντίνης Κυριακού, η οποία πίστεψε σε μένα, με ενθάρρυνε, με αγκάλιασε σαν άνθρωπο και με στήριξε πρακτικά και ηθικά μέχρι το τέλος. Επιπλέον θα ήθελα να ευχαριστήσω την υποψήφια διδάκτορα Δήμητρα Κογιάννου για την εμπιστοσύνη που μου έδειξε και τη βοήθεια που μου προσέφερε καθ όλη διάρκεια της μελέτης. Για την ένταξή μου στο εργαστηριακό περιβάλλον, την εκμάθηση ορθών εργαστηριακών χειρισμών καθώς και τη συνεχόμενη βοήθεια που μου προσέφερε ευχαριστώ θερμά την υποψήφια διδάκτορα Ευδοκία Μήτσου που με την συνεχή φιλική, βοηθητική και ενθαρρυντική της στάση συνέβαλε ουσιαστικά στην προσπάθεια μου. Για την πολύτιμη φιλική της συμπεριφοράς και τη συμβολή σε όλη τη διάρκεια διεξαγωγής των πειραμάτων επίσης θα ήθελα να ευχαριστήσω την Βιολόγο MSc Τσάπατου Άννη. Επίσης, θα ήθελα να ευχαριστήσω το μέλος Ε.Ε.Δ.Ι.Π του Χαροκοπείου Πανεπιστήμιου κ. Μαρία Κώτσου για τη βοήθεια της στην πειραματική διαδικασία. Τέλος θα ήθελα να εκφράσω την ευγνωμοσύνη και την αμέριστη αγάπη μου για την οικογένεια μου και όλα τα αγαπημένα μου πρόσωπα που στέκονται δίπλα μου και με στηρίζουν με όλα τους τα μέσα. [1]

3 Περίληψη Το οικοσύστημα της Μεσογείου και ειδικά της Ελλάδας ευνοεί την ανάπτυξη αρωματικών και φαρμακευτικών φυτών. Τα αφεψήματά τους, που παραδοσιακά καταναλώνονται από τους μεσογειακούς λαούς, έχουν ενταχθεί στο μεσογειακό πρότυπο διατροφής λόγω της πληθώρας των ευεργετικών δράσεών τους στην υγεία του ανθρώπου. Τα βιοδραστικά συστατικά των βοτάνων έχουν συγκεντρώσει το ενδιαφέρον της επιστημονικής κοινότητας και ως προς την αντιμικροβιακή δράση τους. Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η διερεύνηση της αντιμικροβιακής ικανότητας αφεψημάτων από βότανα της ελληνικής χλωρίδας. Χρησιμοποιήθηκαν αφεψήματα 13 βοτάνων (αντωναΐδα, δενδρολίβανο, δίκταμο, θρύμπα, θυμάρι, μαντζουράνα, ρίγανη, σπαθόχορτο, τσάι του βουνού, φασκόμηλο, φλισκούνι, χαμομήλι, μελισσόχοτρο), τα οποία παρασκευάστηκαν παραδοσιακά (3g βοτάνου σε 250ml νερό), και εξετάστηκαν ως προς 12 τροφογενή παθογόνα στελέχη, εκ των οποίων τα 6 ήταν Gram αρνητικά (Salmonella choleriasuis DSMZ 554, Salmonella enteritidis, Escherichia coli CIP 54127, Escherichia coli ATCC 25922, Helicobacter pylori CCUG 38771, Helicobacter pylori CCUG 38772), ενώ τα άλλα 6 Gram θετικά (Clostridium difficile ATCC 9689, Listeria monocytogenes DSM 12464, Staphylococcus aureus ATCC 6538 Staphylococcus aureus ATCC 25923, Enterococcus faecalis ATCC 51299, Enterococcus faecalis ATCC 29212). Η εξέταση έγινε με δύο μεθόδους: αρχικά με τη μέθοδο της διάχυσης σε πηγάδι από άγαρ (Agar Well Diffusion) του λυοφιλιωμένου αφεψήματος (200mg/ml νερό) και για όσα αφεψήματα βρέθηκε ότι ασκούν αντιβακτηριακή δράση, προσδιορίστηκε η ελάχιστη συγκέντρωση (MIC) στην οποία εμφανίζουν αναστολή. Τα αποτελέσματα έδειξαν από τα Gram αρνητικά βακτήρια μόνο για το H. pylori παρατηρήθηκε αναστολή της ανάπτυξής του. Τα Gram θετικά βακτήρια έδειξαν μεγαλύτερη ευαισθησία προς τα αφεψήματα, αφού η ανάπτυξη και των 6 στελεχών παρεμποδίστηκε από κάποια από αυτά. [2]

4 Abstract The Mediterranean and in particular Greek ecosystem is characterized by a great biodiversity of aromatic and medical plants. Their herbal infusions, which are traditionally used, have been included to the Mediterranean dietary pattern due to their healthy impacts. Therefore, scientists interest focuses on the antimicrobial, antioxidant, anticancer, antiathirogenic potential of herb s bioactive compounds. The aim of this study was to investigate the antimicrobial activity of Greek herbal infusions. For this purpose 13, traditionally prepared (3g of dried herb infused in 250ml of water) herbal infusions, were tested against 12 food-borne pathogens. The list of herbs consists of Cretan marjoram, rosemary, Cretan dittany, pink savory, thyme, marjoram, oregano, Saint John s wort, mountain tea, sage, pennyroyal, chamomile and lemon balm. The pathogens were separated into 2 groups: Gram negative bacteria (Salmonella choleriasuis DSMZ 554, Salmonella enteritidis, Escherichia coli CIP 54127, Escherichia coli ATCC 25922, Helicobacter pylori CCUG 38771, Helicobacter pylori CCUG 38772) and Gram positive bacteria (Clostridium difficile ATCC 9689, Listeria monocytogenes DSM 12464, Staphylococcus aureus ATCC 6538 Staphylococcus aureus ATCC 25923, Enterococcus faecalis ATCC 51299, Enterococcus faecalis ATCC 29212). The antimicrobial activity was tested firstly by the Agar Well Diffusion Assay (200mg/ml lyophilized infusion dissolved in water), and then by the determination of the Minimum Inhibitory Concentration (MIC) of the effective ones. The results have shown that among the Gram negative bacteria only the growth of H. pylori was inhibited by the herbal infusions. The Gram positive bacteria have proved to be more sensitive towards the infusions since their growth was inhibited by some of them. [3]

5 Περιεχόμενα Περίληψη... 1 Abstract... 3 Κεφάλαιο Ι Θεωρητικό Μέρος Εισαγωγή Βότανα Οικογένεια Lamiaceae Οικογένεια Clusiaceae Οικογένεια Asteraceae Βιολογικές δράσεις βοτάνων Αντιμικροβιακή δράση Αντιοξειδωτική δράση Άλλες δράσεις Βιοδραστικά συστατικά Πολυφαινόλες Τερπένια Γαστρεντερική οδός του ανθρώπου Παθογόνα του γαστρεντερικού Helicobacter pylori Ευκαιριακά παθογόνα Clostridium difficile Enterococcus faecalis Τροφογενή παθογόνα Escherichia coli Salmonella spp. (S. enteritidis, S. choleriasuis) [4]

6 5.3.3 Listeria monocytogenes Staphylococcus aureus Σκοπός Κεφάλαιο ΙΙ Υλικά και Μέθοδοι Φυτά Εκχύλιση βοτάνων και παραλαβή των αφυδατωμένων αφεψημάτων Μικροβιακά στελέχη Θρεπτικά υποστρώματα Πειραματικές πορείες Μέθοδος διάχυσης σε πηγάδι από άγαρ (Agar Well Diffusion) Προετοιμασία μικροοργανισμών Προετοιμασία αντιβιοτικών Αναδιάλυση λιωφιλιωμένων αφεψημάτων Η πειραματική πορεία αναλυτικά Προσδιορισμός ελάχιστης συγκέντρωσης αναστολής (MIC) Προετοιμασία μικροβιακών στελεχών Προετοιμασία διαλυμάτων βοτάνων Προετοιμασία αντιβιοτικών Κεφάλαιο ΙΙΙ Αποτελέσματα/Συζήτηση Προετοιμασία των βακτηριακών καλλιεργειών για τον έλεγχο αντιμικροβιακής δράσης των βοτάνων με τη μέθοδο διάχυσης σε πηγάδι από άγαρ Αποτελέσματα της αντιμικροβιακής δράσης των βοτάνων με τη μέθοδο διάχυσης σε πηγάδι από άγαρ (Agar Well Difusion) Προετοιμασία των βακτηριακών καλλιεργειών για τον προσδιορισμό της ελάχιστης συγκέντρωσης αναστολής των βοτάνων Αποτελέσματα του προσδιορισμού ελάχιστης συγκέντρωσης αναστολής (MIC) των βοτάνων σε βακτηριακά στελέχη [5]

7 5 Συζήτηση Βιβλιογραφία [6]

8 Κεφάλαιο Ι Θεωρητικό Μέρος [7]

9 1 Εισαγωγή Σχετικά πρόσφατα, (2010) το Ίδρυμα Μεσογειακής Διατροφής με τη συνεργασία πολλών διεθνών οργανισμών, εμπειρογνωμόνων στη διατροφή, την ανθρωπολογία, την κοινωνιολογία και τη γεωργία δημοσίευσαν μια νέα εμπλουτισμένη μεσογειακή πυραμίδα που περιλαμβάνει περισσότερες πτυχές του σύγχρονου τρόπου ζωής. (Bach-Faig et al., 2011) Οι προσθήκες που έγιναν δίνουν έμφαση στην εποχικότητα, τη βιοποικιλότητα, φιλικότητα προς το περιβάλλον, στα παραδοσιακά και τοπικά προϊόντα έτσι ώστε η αναθεωρημένη μεσογειακή διατροφή να είναι βιώσιμη για τους λαούς και τις συνθήκες της Μεσογείου. Άμεση σχέση με την βιοποικιλότητα έχει και η έμφαση που δίνεται στην κατανάλωση βοτάνων και εκχυλισμάτων αυτών σε καθημερινή βάση. Το έδαφος της Μεσογείου αποτελεί κλιματολογικά και γεωλογικά ιδανικό τόπο ανάπτυξης ενδημικών φυτών, φιλοξενώντας περίπου είδη (Myers et al., 2000), εκ των οποίων περίπου τα ευδοκιμούν στην Ελλάδα (GEORGHIOU & DELIPETROU, 2010). [8]

10 2 Βότανα Η χλωρίδα της Ελλάδας βρίθει φαρμακευτικών φυτών, που χρησιμοποιούνταν παραδοσιακά στην ιατρική και αναφορές τους παραπέμπουν στις απαρχές της ιατρικής και της φαρμακευτικής. Τα πιο σημαντικά ανήκουν στις οικογένειες Lamiaceae, Cluciaceae και Asteraceae. 2.1 Οικογένεια Lamiaceae Η οικογένεια με τον μεγαλύτερο αριθμό αρωματικών φυτών στην Ελλάδα είναι η οικογένεια Lamiaceae (Χειλανθή), η οποία περιλαμβάνει είδη που φύονται σε περιοχές με ξηρό και θερμό κλίμα. Και δεν είναι χρήσιμα μόνο ως αρωματικά αλλά και ως φαρμακευτικά, αρτυματικά, καλλωπιστικά και μελισσοτροφικά. Τα πιο κοινά είναι: το θυμάρι ( Thymus vulgaris), η θρύμπα ή θρούμπι (Satureja thymbra), το φασκόμηλο (Salvia officinalis), η ρίγανη (Origanum vulgare), το δίκταμο (Origanum dictamnus), το μελισσόχορτο (Melissa officinalis), το δενδρολίβανo (Rosmarinus officinalis), το τσάι του βουνού (Sideritis syriaca), η αντωναΐδα (Origanum microphyllum), το φλισκούνι (Mentha pulegium) η λεβάντα (Lavandula stoechas), η μέντα (Mentha spicata) και η μαντζουράνα ( Origanum majorana) (Μπαμπαλώνας & Κοκκίνη, 2004). 2.2 Οικογένεια Clusiaceae Άλλη μια οικογένεια με κύριο εκπρόσωπο το σπαθόχορτο (Hypericum perforatum) για τον ελλαδικό χώρο. Το συγκεκριμένο είδος απαντάται σχεδόν σε όλο τον κόσμο με εξαίρεση τροπικές περιοχές, ερήμους και αρκτικές περιοχές. Τα είδη του γένους μπορεί να αποτελούνται από μικρά ετήσια φρυγανώδη φυτά ύψους 5-10cm, θάμνους και δέντρα που φτάνουν τα 12m ύψος. 2.3 Οικογένεια Asteraceae Η οικογένεια Αsteraceae (Αστεροειδή) γνωστή ως οικογένεια των σύνθετων (Compositae) είναι μια από τις μεγαλύτερες οικογένειες αγγειόσπερμων. Τα περισσότερα μέλη της οικογένειας Asteraceae είναι ποώδη, αλλά εμφανίζονται και ως θάμνοι, αμπέλια, ή δέντρα. Η οικογένεια έχει παγκόσμια κατανομή και είναι πιο συχνή σε άνυδρες και ημι-άνυδρες περιοχές των υποτροπικών και εύκρατων γεωγραφικών πλατών. Γνωστοί εκπρόσωποι της οικογένειας είναι το χαμομήλι, η μαργαρίτα, το χρυσάνθεμο και ο ηλίανθος. [9]

11 3 Βιολογικές δράσεις βοτάνων Τα φώτα της επιστημονικής κοινότητας έχουν τελευταία στραφεί στη μελέτη των ευεργετικών ιδιοτήτων των αρωματικών και φαρμακευτικών φυτών και πώς αυτές μπορούν να γίνουν μέρος της πρόληψης αλλά και θεραπείας διαφόρων ασθενειών. Ευρήματα ερευνών θέλουν αυτά τα φυτά να παρουσιάζουν αντιοξειδωτική, αντιφλεγμονώδη, αντιμικροβιακή, αντικαρκινική, αντιδιαβητική, αντιαλλεργική και αντικαταθλιπτική δράση. 3.1 Αντιμικροβιακή δράση Η απειλητική προς την υγεία του ανθρώπου ανθεκτικότητα των παθογόνων παραγόντων στα αντιβιοτικά, το αυξημένο κόστος νοσηλείας λόγω λοίμωξης από ανθεκτικά παθογόνα καθώς και τα αυξημένα ποσοστά θνησιμότητας έχουν αυξήσει το ενδιαφέρον της επιστημονικής κοινότητας για νέους αντιμικροβιακούς παράγοντες. Πέρα όμως από τα ανθεκτικά παθογόνα που κατά κύριο λόγο ευδοκιμούν σε περιβάλλοντα νοσηλείας, υψίστης σημασίας για τη δημόσια υγεία είναι και η μικροβιολογική ασφάλεια των τροφίμων με την ελαχιστοποίηση των τροφογενών παθογόνων (Almajano et al., 2008). Η παρουσία και η ανάπτυξη των μικροοργανισμών στα τρόφιμα, καθώς και οι λάθος χειρισμοί αποθήκευσης και κατανάλωσής τους, μπορεί να επιβαρύνουν τόσο τη δημόσια υγεία όσο και την οικονομία. Έχουν προταθεί διαφορετικοί μηχανισμοί δράσεις των αντιμικροβιακών παραγόντων που περιέχονται στα εκχυλίσματα των βοτάνων και συνοψίζοντας αυτοί είναι: (i) αποσύνθεση κυτταροπλασματικής μεμβράνης, (ii) συσσώρευση πρωτεϊνών πάνω στην μεμβράνη, (iii) διαταραχή ή απενεργοποίηση της λειτουργίας της εξωτερικής μεμβράνης των Gram (-) βακτηρίων, του στρώματος δηλαδή των λιποπολυσακχαριτών του κυτταρικού τους τοιχώματος (iv) αύξηση της διαπερατότητας ιόντων, (v) πήξη του κυτταροπλάσματος, και τέλος (vi) παρεμπόδιση της παραγωγής ενζύμων (Farzaneh & Carvalho, 2015). Οι δράσεις των αιθέριων ελαίων και των εκχυλισμάτων των βοτάνων έγκειται στην χημική δομή των ουσιών και στην δομή της κυτταρικής μεμβράνης του οργανισμού. [10]

12 Ευρήματα θέλουν τα βιοδραστικά συστατικά των εκχυλισμάτων να οδηγούν σε λύση και απόρριψη του κυτταρικού περιβλήματος (Amensour et al., 2010). Συστατικά των αιθέριων ελαίων όπως η ευγενόλη, η τερπινόλη και το τερπινένιο φαίνεται να ασκούν τις αντιμικροβιακές τους δράσεις έναντι βακτηρίων με διαφορετικής δομής κυτταρικά τοιχώματα. Ωστόσο αναφέρεται ότι τα Gram αρνητικά βακτήρια δείχνουν μεγαλύτερη αντοχή στις βιοδραστικές ενώσεις σε σχέση με τα Gram θετικά. Ο λόγος αυτού του διαχωρισμού είναι ότι η δομή του κυτταρικού τοιχώματος των αρνητικών κατά Gram βακτηρίων αποτελείται κυρίως από πολυσακχαρίτες και λιποπρωτεΐνες που εμποδίζουν την διείσδυση του υδρόφοβου ελαίου, αποτρέποντας επίσης και τη συσσώρευση ενώσεών του στην κυτταρική μεμβράνη των βακτηρίων (Taheri et al., 2012). Επιπλέον φαίνεται να υπάρχει συσχέτιση ως προς το είδος του μέσου εκχύλισης του βοτάνου. Έρευνες θέλουν τα εκχυλίσματα των οργανικών διαλυτών όπως η αιθανόλη, η μεθανόλη και η ακετόνη να έχουν πιο ισχυρές αντιμικροβιακές δυνατότητες, συγκριτικά με τα υδατικά εκχυλίσματα. Ο λόγος της διάκρισης αυτής είναι το γεγονός ότι οι οργανικοί διαλύτες που αναφέρθηκαν έχουν την δυνατότητα να εκχυλίζουν αιθέρια έλαια σε μεγαλύτερο βαθμό καθώς και άλλα μη πολικά συστατικά (Farzaneh & Carvalho, 2015). Μελέτες έχουν δείξει ότι τα φαινολικά συστατικά έχουν αντιμικροβιακές δραστηριότητες (Almajano et al., 2008). Αιθέρια έλαια θυμαριού και ρίγανης αποδείχτηκε να έχουν ανασταλτική δράση έναντι στελεχών του E. coli, Salmonella enteritidis, Salmonella choleriasuis, δεδομένα που συσχετίστηκαν με τα περιεχόμενα φαινολικά θυμόλη και καρβακρόλη (PENALVER et al., 2005). Οι ταννίνες φαίνεται να παρεμποδίζουν την αύξηση του Helicobacter pylori, βακτήριο που κατηγορείται για πληθώρα δυσλειτουργιών του στομάχου όπως έλκη, δυσπεψία, γαστρίτιδες ακόμη και καρκίνο (Funatogawa et al., 2004) (Edris, 2007). Επίσης πολλές μελέτες έχουν ερευνήσει την επίδραση των πολυφαινολών επί εντερικών παθογόνων, όπου φαίνεται ότι εξαρτάται τόσο από το βακτηριακό είδος αλλά και από τη δομή της πολυφαινόλης (Campos, Couto & Hogg, 2003) (Taguri, Tanaka & Kouno, 2004). Πρέπει να τονιστεί το γεγονός ότι η περιεκτικότητα των εκχυλισμάτων σε βιοενεργά συστατικά [11]

13 μπορεί να επηρεαστεί από την ποικιλία των φυτών, την προέλευση του φυτού από γεωγραφικής άποψης, την ηλικία του, από το μέρος του φυτού που χρησιμοποιείται στην εκχύλιση, από τις μεθόδους συγκομιδής και ξήρανσης, τη συσκευασία και τις συνθήκες συντήρησής του. 3.2 Αντιοξειδωτική δράση Ο όρος «αντιοξειδωτικό» αναφέρεται σε οποιοδήποτε μόριο ικανό να σταθεροποιήσει ή να απενεργοποιήσει τις ελεύθερες ρίζες που δημιουργούνται για διάφορους λόγους στον οργανισμό, πριν επιτεθούν στα υγιή κύτταρα. Αντιοξειδωτικά ωστόσο θεωρούνται και ενώσεις που περιέχονται στην διατροφή και παρόλο που εξουδετερώνουν τις ελεύθερες ρίζες, συμμετέχουν ενισχύοντας το ενδογενές σύστημα κατανάλωσης αυτών (Kaliora, Dedoussis & Schmidt, 2006). Η στροφή προς την χρήση φυσικών αντιοξειδωτικών τα οποία περιέχονται στη τροφή, έγκειται στην υψηλή δραστικότητα και χαμηλή τοξικότητά τους έναντι όσων χρησιμοποιούνται στη βιομηχανία τροφίμων (Lizcano et al., 2010). Οι πιο γνωστές ομάδες ενώσεων με αντιοξειδωτική αποτελεσματικότητα που περιέχονται στα βότανα είναι βιταμίνες, όπως η βιταμίνη Ε και C, οι πολυφαινόλες, τα φλαβονοειδή καθώς επίσης και χρωστικές μεταξύ των οποίων τα καροτενοειδή και οι ανθοκυανίνες. Αρκετές μελέτες παρουσιάζουν τις φαινολικές ενώσεις, ως τα βασικότερα φυτοχημικά με αντιοξειδωτική δραστηριότητα και αποδεδειγμένα πλεονεκτήματα στην υγεία (Javanmardi, 2003). Συστατικό των βοτάνων με σπουδαία αντιοξειδωτική δράση αποτελεί το ροσμαρινικό οξύ, φαινολικό συστατικό που απομονώθηκε από το δενδρολίβανο αλλά και άλλα φυτά της οικογένειας Lamiaceae. Επίσης συστατικά πληθώρας φυτών της ίδιας οικογένειας με εξίσου σπουδαίες δράσεις αποτελούν η καρβακρόλη και η θυμόλη (Tsimidou and Boskou, 1994). 3.3 Άλλες δράσεις Η μεγάλη κυτταροτοξικότητα και οι παρενέργειες των αγωγών χημειοθεραπείας έχει στρέψει το ενδιαφέρον των επιστημόνων στην ποικιλόμορφη θεραπευτική δυνατότητα των αιθέριων ελαίων αλλά και των εκχυλισμάτων των βοτάνων κατά του καρκίνου (Rajesh, Stenzel and Howard, 2003). Κυτταρικές σειρές [12]

14 επίσης έδειξαν να αναστέλλονται από εκχυλίσματα βοτάνων όπως το δενδρολίβανο, το δίκταμο, το φασκόμηλο, το σπαθόχορτο, η μαντζουράνα και το θυμάρι (Kaliora et al., 2014). Συστατικά που έχουν βρεθεί να διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην έναρξη, την εξέλιξη και τη μετάσταση του καρκίνου, λόγω της βιολογικής τους δραστικότητας, είναι τα φλαβονοειδή, οι προανθοκυανιδίνες καθώς και άλλα φαινολικά συστατικά όπως τα τερπενοειδή (Pan, Ghai and Ho, 2008). Tο μεβαλονικό οξύ, απαραίτητο για την καρκινογένεση, φαίνεται να αναστέλλεται από την δράση των μονοτερπενίων των αιθέριων ελαίων (Eng et al., 2001). Επιπλέον η μπισαμπολόλη, κύρια σεσκιτερπενική αλκοόλη του χαμομηλιού φαίνεται να ενισχύει την απόπτωση καρκινικών κυττάρων (Cavalieri et al., 2004). Και η γερανιόλη έδειξε να επιδρά στα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου(carnesecchi et al., 2004). Σημαντική είναι η αντιαθηρογόνος δράση των βοτάνων, άμεσα συνδεδεμένη με την αντιοξειδωτική αφού κύρια αιτία δημιουργίας της αθηρωματικής πλάκας είναι η οξείδωση των LDL λιποπρωτεϊνών. Υψηλή πρόσληψη αντοξειδωτικών φαίνεται να αναστέλλει ή να παρεμποδίζει την οξείδωση της LDL χοληστερόλης και επακόλουθα και την αθηρογένεση. Αιθέρια έλαια πλούσια σε φαινολικά συστατικά όπως η ευγενόλη και η θυμόλη παρουσιάζουν υψηλή δραστικότητα έναντι της οξείδωσης των LDL (Naderi et al., 2004). 4 Βιοδραστικά συστατικά Σε αυτή την ενότητα θα γίνει αναφορά σε συστατικά των αρωματικών και φαρμακευτικών φυτών τα οποία μπορεί να μην κατατάσσονται στα θρεπτικά συστατικά, ωστόσο έχουν συσχετιστεί με ευεργετικές δράσεις στην ανθρώπινη υγεία. Το ενδιαφέρον θα επικεντρωθεί περισσότερο σε αυτές τις ουσίες που φαίνεται να έχουν αντιμικροβιακή δράση. Βότανα και μπαχαρικά τα οποία εμφανίζουν αντιμικροβιακή δράση, περιλαμβάνουν βιοδραστικά συστατικά όπως οι φαινόλες και φαινολικά οξέα, κουμαρίνες, τερπενοειδή, και αλκαλοειδή (Cowan, 1999) (Bergonzelli et al., 2003). [13]

15 4.1 Πολυφαινόλες Οι πολυφαινόλες είναι δευτερογενείς μεταβολίτες φυτών που εμπλέκονται στην άμυνα έναντι της υπεριώδους ακτινοβολίας ή τη μόλυνση από παθογόνους μικροοργανισμούς. Αυτές οι ενώσεις μπορούν να ταξινομηθούν σε διαφορετικές ομάδες ανάλογα με τον αριθμό των φαινολικών δακτυλίων που περιέχουν και τα δομικά στοιχεία που συνδέουν τους δακτυλίους. Έτσι σύμφωνα με τα παραπάνω οι πολυφαινόλες μπορούν να διακριθούν σε φαινολικά οξέα, φλαβονοειδή, στιλβένια, και λιγνάνες. Η αντιμικροβιακή δράση των πολυφαινολών που υπάρχουν σε φυτικά τρόφιμα και φαρμακευτικά φυτά έχει ερευνηθεί εκτενώς ενάντια σε ένα ευρύ φάσμα μικροοργανισμών. Μεταξύ των πολυφαινολών, οι φλαβαν-3-όλες, οι φλαβονόλες, και οι τανίνες έλαβαν μεγαλύτερη προσοχή λόγω της μεγάλης αντιμικροβιακής δραστικότητας που εμφανίζουν, σε σύγκριση με άλλες πολυφαινόλες, δρώντας ακόμα και συνεργικά με τα αντιβιοτικά. Ορισμένες κατηγορίες φαινολών έχουν προταθεί για την ανάπτυξη νέων συντηρητικών των τροφίμων (Rodríguez Vaquero et al., 2010), λόγω της αυξανόμενης πίεσης των καταναλωτών να αποφεύγονται τα συνθετικά συντηρητικά. Ακόμη συζητάται η χρήση τους στην ανάπτυξη καινοτόμων θεραπειών για τη θεραπεία διαφόρων μικροβιακών λοιμώξεων (Jayaraman, 2010) (Saavedra et al., 2010), λαμβάνοντας υπόψη την αύξηση της μικροβιακής αντοχής έναντι των συμβατικών αντιβιοτικών. [14]

16 Εικόνα 4.1: Χημικές δομές κατηγοριών πολυφαινολών και δράση ενάντια σε μικροοργανισμούς 4.2 Τερπένια Μεγάλη ποικιλία τερπενίων περιέχονται στα αιθέρια έλαια των βοτάνων. Τα αιθέρια έλαια αποτελούνται από πτητικά, χαμηλού μοριακού βάρους, τερπένια. Τα τερπένια είναι υδρογονάνθρακες φυτικής προέλευσης με ανθρακικό σκελετό ισοπρενίου H2C=C(CH3)-CH=CH2 (2-μεθυλοβουταδιένιο1,3) ανοικτής αλύσου ή κυκλικό (μόνο- ή δικυκλικό). Ανάλογα με τον αριθμό ισοπρενικών ομάδων στο μόριο τους ταξινομούνται σε ημιτερπένια (1 ομάδα), μονοτερπένια (2 ομάδες), σεσκιτερπένια (3 ομάδες), διτερπένια (4 ομάδες), σεσκιρτερπένια (5 ομάδες), [15]

17 τριτερπένια (6 ομάδες), τετρατερπένια (8 ομάδες), πολυτερπένια (>8 ισοπρενικές ομάδες) (Connolly and Hill, 2007) (Hyldgaard, Mygind and Meyer, 2012). Με πολυμερισμό του ισοπρενίου σε κατάλληλες συνθήκες μπορεί να πραγματοποιηθεί χημική σύνθεση των τερπενίων. Για το λόγο αυτό τα τερπένια ονομάζονται και ισοπρενοειδή. Αρκετές προηγούμενες εκθέσεις επικεντρώθηκαν στις αντιμικροβιακές ιδιότητες των αιθέριων ελαίων και κυρίως των μονοτερπενίων που βρέθηκαν ανάμεσα στα συστατικά τους. Στην πραγματικότητα, πολλά τερπένια είναι γνωστό ότι είναι δραστικά έναντι μιας ευρείας ποικιλίας μικροοργανισμών, συμπεριλαμβανομένων των Gram-θετικών και Gram-αρνητικών βακτηρίων και μυκήτων (Cox et al., 2000). Η αντιμικροβιακή δράση των αιθέριων ελαίων και των τερπενοειδών συστατικών τους έχει να κάνει με τη διατάραξη των λιπιδίων των μεμβρανών των βακτηρίων. Παραδείγματα τερπενοειδών είναι: θυμόλη, καρβακρόλη, η λιναλοόλη, η κιτρονελλάλη, πιπεριτόνη, μενθόλη και γερανιόλη (Hyldgaard, Mygind and Meyer, 2012). Τα τερπενοειδή φαίνεται πως ενσωματώνονται στην μεμβράνη με αποτέλεσμα να δημιουργείται αυξημένη ρευστότητα και διαπερατότητα της μεμβράνης, διατάραξη των πρωτεϊνών της και αλλοίωση των διαδικασιών μεταφοράς ιόντων (Sikkema, J. et al, 1994). Η αντιμικροβιακή δράση των αιθέριων ελαίων μπορεί συχνά να συσχετιστεί με το περιεχόμενό τους σε φαινολικά συστατικά (Aligiannis et al., 2001) (Rhayour et al., 2003). Ο πρόδρομος της καρβακρόλης, το π-κυμένιο είναι ένα μονοτερπένιο που έχει έναν δακτύλιο βενζολίου χωρίς λειτουργικές ομάδες σε πλευρικές αλυσίδες. Το π-κυμένιο δεν αποτελεί αποτελεσματική αντιμικροβιακή ένωση, όταν χρησιμοποιείται μόνο (Aligiannis et al., 2001) (Bagamboula, Uyttendaele and Debevere, 2004), αλλά ενισχύει τη δραστικότητα ενώσεων όπως η καρβακρόλη (Ultee, Bennik and Moezelaar, 2002) (Rattanachaikunsopon and Phumkhachorn, 2010). Η αντιμικροβιακή δράση ενός αιθέριου ελαίου μπορεί να εξαρτάται μόνο σε ένα ή δύο από τα κύρια συστατικά που το συνθέτουν. Ωστόσο, δεδομένα [16]

18 υποδεικνύουν ότι η εγγενής δραστηριότητα των αιθέριων ελαίων δεν μπορεί να στηριχθεί αποκλειστικά στην αναλογία των κύριων ενεργών συστατικών, αλλά στις αλληλεπιδράσεις μεταξύ όλων των συστατικών τους (Trombetta et al., 2005) (García-García, López-Malo and Palou, 2011). 5 Γαστρεντερική οδός του ανθρώπου Ο γαστρεντερικός σωλήνας είναι το όργανο που δέχεται και επεξεργάζεται όλο τον όγκο της καταναλισκόμενης τροφής που δέχεται ο ανθρώπινος οργανισμός καθημερινά. Έχει μήκος 5m και ξεκινά από τη στοματική κοιλότητα, τον φάρυγγα, τον οισοφάγο, το στομάχι, το λεπτό έντερο, το παχύ έντερο και καταλήγοντας στον πρωκτό. Στο πεπτικό σύστημα ενεργό ρόλο παίζουν και οι προσαρτημένοι, στον γαστρεντερικό σωλήνα, αδένες (σιελογόνοι αδένες, ήπαρ, πάγκρεας, χοληδόχος κύστη) που δρουν επικουρικά στην διαδικασία της πέψης(vander et al., 2001). Ο γαστρεντερικός σωλήνας είναι σε συνεχή επαφή με το εξωτερικό περιβάλλον λόγω της εισόδου, της διέλευσης και της πέψης της τροφής. Αμέσως μετά τη γέννηση του νεογνού, αποικίζεται σταδιακά από ένα πυκνό και πολύπλοκο σύνολο μικροοργανισμών που διαφέρει ως προς τη σύσταση και την ποσότητα στα διαφορετικά τμήματά του (Mandar and Mikelsaar, 1996). Στο Σχήμα που ακολουθεί παρουσιάζεται η πολυπλοκότητα του μικροβιόκοσμου που εποικίζει τον γαστρεντερικό σωλήνα: [17]

19 Εικόνα 1: Χωρικές και χρονικές διαστάσεις του εντερικού μικροβιόκοσμου. Α: Μεταβολή των μικροβιακών πληθυσμών και της σύστασης του εντερικού μικροβιόκοσμου κατά μήκος της γαστρεντερικής οδού. Β: διαμήκεις μεταβολές στην μικροβιακή σύνθεση του εντέρου. C: χρονικές διαστάσεις της εγκατάστασης του μικροβιόκοσμου και των παραγόντων που επηρεάζουν την μικροβιακή σύνθεση (Sekirov et al., 2010) Ο μικροβιόκοσμος του γαστρεντερικού σωλήνα αναλαμβάνει πολύ σημαντικές λειτουργίες όπως η διάσπαση των άπεπτων φυτικών ινών, ο καταβολισμός μεταβολιτών των βακτηρίων, η συμβολή στον κύκλο εντεροηπατικής κυκλοφορίας με τον καταβολισμό των χολικών αλάτων και της χοληστερόλης και η παραγωγή βιταμινών Β12 και Κ. Φυσικά αναμφισβήτητη είναι η συμβολή του στην άμυνα του οργανισμού μέσω της παρεμπόδισης της εγκατάστασης παθογόνων βακτηρίων (Sekirov et al., 2010). Παρά το γεγονός ότι ο φυσιολογικός μικροβιόκοσμος αναστέλλει την αύξηση παθογόνων, πολλά από τα μέλη του μπορεί να φανούν επιβλαβή για τον ανθρώπινο οργανισμό. Τα αναερόβια βακτήρια της εντερικής οδού είναι οι κύριοι παράγοντες εμφάνισης ενδοκοιλιακών αποστημάτων και περιτονίτιδας. Μεγάλη είναι η σημασία του εντερικού μικροβιόκοσμου στην κλινική πράξη αφού εμπλέκεται σε φλεγμονώδεις και όχι μόνο παθήσεις του εντέρου, στον ορθοκολικό αλλά και εξω-γαστρεντερικό καρκίνο, στην παχυσαρκία & το [18]

20 μεταβολικό σύνδρομο, σε αλλεργίες ακόμα και στο φάσμα των αυτιστικών διαταραχών (Clemente et al., 2012). 5.1 Παθογόνα του γαστρεντερικού Με το όρο παθογόνα εννοούμε κάθε μικροοργανισμό που έχει την εγγενή ικανότητα να διασχίζει τα ανατομικά εμπόδια, να αντιστέκεται στην άμυνα του ξενιστή και να προκαλεί βλάβες σ αυτόν (Dorland, 2007) Helicobacter pylori Το γένος Helicobacter ανήκει στα Πρωτεοβακτήρια, στη τάξη των Campylobacterales, και την οικογένεια Helicobacteraceae. Συγκεκριμένα το ελικοβακτηρίδιο του πυλωρού είναι ένα κατά Gram αρνητικό, ραβδόμορφο βακτήριο που αποικεί κατά κύριο λόγο στον αυλό του στομάχου. Το ελικοειδές του σχήμα καθώς και τα μαστίγια που φέρει το ευνοούν στην προώθηση του στη βλέννα. Έχει μάκρος 3 μm και διάμετρο 0,5 μm περίπου. Για την ανάπτυξή του απαιτεί μικροαερόφιλες συνθήκες, συγκεντρώσεις O2 (3-5%), αισθητά πιο χαμηλές από αυτές της ατμόσφαιρας. Παρόλο που ο ακριβής μηχανισμός μετάδοσης του ελικοβακτηριδίου είναι ασαφής πολλά είναι τα δεδομένα σχετικά με τις επιπτώσεις του μικροοργανισμού στην ανθρώπινη υγεία. To H. pylori έχει συνδεθεί με την εμφάνιση δυσπεψίας, θεωρείται υπεύθυνο για το 70-85% των πεπτικών ελκών, την οξεία και χρόνια γαστρίτιδα, αναφέρεται επίσης ως αιτία γαστρικού αδενοκαρκινώματος και του λεμφώματος MALT, καθώς και με πληθώρα εξωγαστρικών μολύνσεων όπως το ορθοκολικό αδενοκαρκίνωμα (Testerman, 2014). Ο WHO έχει κηρύξει το H. pylori ως πρώτης τάξης καρκινογόνο παράγοντα, αφού φαίνεται ότι ο αποικισμός του αυξάνει 10 φορές τον κίνδυνο εμφάνισης καρκίνου του στομάχου. Η καθιερωμένη θεραπεία πρώτης γραμμής είναι μία «τριπλή θεραπεία» διάρκειας μιας εβδομάδας και αποτελείται από αναστολείς της αντλίας πρωτονίων, όπως η ομεπραζόλη και τα αντιβιοτικά κλαριθρομυκίνη και αμοξυκιλλίνη. Την κλινική πράξη δυσχεραίνει η ανθεκτικότητα του βακτηρίου σε αντιβιοτικά λόγω της θέσης του μέσα στη βλέννα. Απαραίτητος κρίνεται ο [19]

21 έλεγχος εκρίζωσης του βακτηρίου, μετά από 4 εβδομάδες θεραπείας, με δοκιμασία αναπνοής(malfertheiner et al., 2012). 5.2 Ευκαιριακά παθογόνα Ως ευκαιριακά ή δυνητικά παθογόνα χαρακτηρίζονται οι μικροοργανισμοί που είναι κανονικά συμβιωτικοί ή δεν βλάπτουν τον ξενιστή τους, αλλά μπορεί να προκαλέσουν ασθένεια όταν η αντίσταση του ξενιστή είναι χαμηλή όπως σε περιπτώσεις που ο φυσιολογικός μικροβιόκοσμος έχει καταστραφεί από παρατεταμένη χρήση αντιβιοτικών, ή όταν το ανοσοποιητικό σύστημα έχει κατασταλεί από φαρμακευτική αγωγή ή άλλες ασθένειες (Centers for Disease Control and Prevention, 2015) Clostridium difficile Πρόκειται για μέλος του γένους Clostridium, που περιλαμβάνει βακίλλους με αυτόνομη κίνηση. Τα κύτταρα του C. difficile είναι Gram-θετικά και αναπτύσσονται σε συνθήκες απουσίας οξυγόνου και παράγουν τοξίνες. Σε ακραίες καταστάσεις παράγουν ενδοσπόρια (Moreno, Furtner and Rivara, 2013). Η λοίμωξη από το C. difficile έχει αναχθεί στην κύρια αιτία ενδονοσοκομειακών λοιμώξεων με αποτέλεσμα να ανεβάζει κατακόρυφα το κόστος νοσηλείας (Sun and Hirota, 2015). Η παρατεταμένη χρήση αντιβιοτικών είναι ο πιο σημαντικός παράγοντας κινδύνου για την εμφάνιση της λοίμωξης από το παθογόνο (Rupnik, Wilcox and Gerding, 2009) (Loo et al., 2005), αφού διαταράσσει την ισορροπία των μικροβιακών πληθυσμών στον εντερικό αυλό. Η κλινική εμφάνιση της λοίμωξης από C. difficile είναι εξαιρετικά μεταβλητή, από ασυμπτωματικούς φορείς, ήπια διάρροια, σε πιο σοβαρή ψευδομεμβρανώδη κολίτιδα που μπορεί εξελιχθεί σε τοξικό μεγάκολο, μια κατάσταση που μπορεί να χρειαστεί χειρουργική παρέμβαση. Το πιο κοινό σύμπτωμα είναι η διάρροια, ενώ άλλα κλινικά συμπτώματα περιλαμβάνουν κοιλιακό άλγος, κράμπες, αύξηση της θερμοκρασίας και λευκοκυττάρωση (Karen C. and John G., 2011) (Keel and Songer, 2006) (McFee and Abdelsayed, 2009). Τα παθογόνα στελέχη του μικροοργανισμού παράγουν πολλαπλές τοξίνες όπως η εντεροτοξίνη (τοξίνη Α) και κυτταροτοξίνη (τοξίνη Β), η συνεργία των οποίων μπορεί να προάγει τη [20]

22 φλεγμονή και τα συμπτώματα στους ασθενείς που έχουν μολυνθεί, προκαλώντας μεταβολές στο επιθήλιο του παχέος εντέρου (Carter et al., 2007). Παρόλα τα υγειονομικά μέτρα που λαμβάνονται για την αποφυγή της μετάδοσης του παθογόνου, τα ενδοσπόρια μπορούν να επιβιώσουν για μεγάλες χρονικές περιόδους και να καλλιεργηθούν σε οποιαδήποτε επιφάνεια. Έτσι γίνεται δυνατή η κατάποση τους και τελικά η ανάπτυξη τους στο κόλον, προσπερνώντας το όξινο περιβάλλον του στομάχου Enterococcus faecalis Πρόκειται για Gram θετικούς κόκκους του γένους Enterococcus, αρνητικούς στην καταλάση που δεν σχηματίζουν σπόρια. Το συγκεκριμένο βακτήριο αναπτύσσεται στο πλούσιο σε θρεπτικά και φτωχό σε οξυγόνο, περιβάλλον του εντερικού σωλήνα του ανθρώπου και άλλων θηλαστικών. Μορφολογικά, είναι ωοειδείς κόκκοι, μεμονωμένοι, σε ζεύγη ή αλυσίδες, οι οποίοι δεν παρουσιάζουν συνήθως αυτόνομη κίνηση. Οι εντερόκοκκοι αποτελούν ένα σημαντικό κομμάτι του μόνιμου μικροβιόκοσμου του ανθρώπου και των ζώων. Στον άνθρωπο μπορούν να απομονωθούν σε συγκεντρώσεις από 10 5 έως 10 7 CFU/γραμμάριο κοπράνων (Eckburg, 2005). Όπως και άλλα είδη του γένους Enterococcus, το Ε. faecalis μπορεί να προκαλέσει απειλητικές για τη ζωή λοιμώξεις σε ανθρώπους όπως η πρόκληση ενδοκαρδίτιδας, λοίμωξης των χειρουργικών τραυμάτων, βακτηριαιμίας, λοιμώξεων στο ουροποιητικό σύστημα, μηνιγγίτιδα (Hidron et al., 2008), ειδικά στο νοσοκομειακό περιβάλλον, όπου παρατηρούνται υψηλά επίπεδα ανθεκτικότητας του μικροοργανισμού στα αντιβιοτικά (Wood and Murray, 2000). H αντιβιοτική θεραπεία μειώνει τα επίπεδα των πληθυσμών του εντερικού μικροβιόκοσμου με αποτέλεσμα να μην λειτουργούν ως προστατευτική ασπίδα απέναντι σε παθογόνα. Επίσης λόγω της μειωμένης ποικιλομορφίας του εντερικού μικροβιόκοσμου δίνεται η δυνατότητα στα ανθεκτικά βακτηριακά στελέχη στα αντιβιοτικά να πολλαπλασιαστούν ανεξέλεγκτα (Lawley and Walker, 2012). [21]

23 Οι εντερόκοκκοι λόγω της απόρριψης με τα κόπρανα, έχουν την δυνατότητα να μεταφερθούν στο έδαφος, στο νερό, σε φυτά και λαχανικά και εύκολα να περάσουν στα τρόφιμα. Μπορούν ακόμη να περάσουν στα τρόφιμα μέσω της τελικής επεξεργασίας τους και να προκαλέσουν αλλοιώσεις, γεγονός που διευκολύνεται από τον ανθεκτικό χαρακτήρα τους σε ακραίες τιμές θερμοκρασίας, ph και αλατότητας (Giraffa, 2002). 5.3 Τροφογενή παθογόνα Τροφογενή ονομάζονται τα παθογόνα που μπορεί να προκαλέσουν τροφογενή λοίμωξη στον άνθρωπο μετά από την κατανάλωση μολυσμένου τροφίμου ή ποτού Escherichia coli Το Escherichia coli είναι ένα Gram-αρνητικό, προαιρετικά αναερόβιο, ραβδόμορφο βακτήριο της οικογένειας Enterobacteriaceae, που συνήθως εντοπίζεται στο κατώτερο πεπτικό του ανθρώπου και άλλων θηλαστικών. Τα περισσότερα στελέχη είναι αβλαβή, αποτελώντας μέρος του φυσιολογικού μικροβιόκοσμου του εντέρου και μπορεί να ωφελήσουν τους ξενιστές τους από την παραγωγή πολύτιμων βιομορίων όπως η βιταμίνη Κ (Schweder, Hofmann and Hecker, 1995) (Hudault, 2001). Ωστόσο μερικοί ορότυποι μπορεί να προκαλέσουν σοβαρή τροφική δηλητηρίαση και διαρροϊκά επεισόδια σε ξενιστές τους, όταν μεταφερθούν στον ξενιστή μέσω μολυσμένων τροφίμων ή νερού. Τα στελέχη που προκαλούν διάρροια κατατάσσονται σε 4 κατηγορίες (Μπεζιρτζόγλου, 2004) (Robins- Browne et al., 2004): 1)το εντεροτοξικογόνο E. coli (ETEC) [συνδέεται με παραγωγή τοξινών, προκαλείται από μολυσμένα τρόφιμα και νερό και είναι υπεύθυνο για την διάρροια των ταξιδιωτών] 2)το εντεροδιεισδυτικό E.coli (EIEF) [προσβολή των επιθηλιακών κυττάρων του κόλον, προκαλεί έλκος και φλεγμονή] [22]

24 3)το εντεροπαθογόνο E.coli (EPEC) [βλάβες στις εντερικές λάχνες, συνοδεύεται από διάρροια και έμετο] 4) το εντεροαιμοραγικό E.coli (EHEC)[E.coli O157:H7, κράμπες, αιμορραγία κατώτερου πεπτικού, απειλή προς την ζωή]. Επειδή ο μικροοργανισμός ζει στη γαστρεντερική οδό των ζώων, η μόλυνση του ανθρώπου μπορεί να προκύψει από την άμεση επαφή με τα ζώα ή με την κατανάλωση μολυσμένων ζωικών προϊόντων. Τα κρεατοσκευάσματα μπορεί να μολυνθούν κατά τη σφαγή του ζώου ή κατά τη διάρκεια της επεξεργασίας. Άλλες γνωστές πηγές της λοίμωξης περιλαμβάνουν την κατανάλωση μη παστεριωμένου γάλακτος και χυμού, την κατανάλωση μολυσμένων φρέσκων λαχανικών όπως το σπανάκι, το μαρούλι αλλά και την κατάποση μολυσμένου νερού. Επομένως απαραίτητη είναι η τήρηση κανόνων προσωπικής υγιεινής κατά την διαχείριση τροφίμων (Μπεζιρτζόγλου, 2004). Το E.coli μπορεί επίσης να λειτουργήσει ως ευκαιριακό παθογόνο αφού δύναται να προκαλέσει σηψαιμία, λοιμώξεις ουροποιητικού και πνευμονία σε ανοσοκατασταλμένους ασθενείς και μηνιγγίτιδα σε νεογνά (Kim, 2012) (Mellata, 2013) Salmonella spp. (S. enteritidis, S. choleriasuis) Το Salmonella είναι ένα γένος της οικογένειας των Enterobacteriaceae. μη σπορογόνο, με αυτόνομη κίνηση (μαστίγια που βρίσκονται σε όλο το κύτταρο). Ανάμεσα στα στελέχη που προκαλούν τροφογενείς λοιμώξεις είναι το S. enteritidis και η S. choleriasuis που κυρίως απαντάται σε ζώα όπως ο χοίρος. Οι μολύνσεις από Salmonella προκαλούν εντερίτιδα, η οποία μπορεί να κυμανθεί από ήπια έως σοβαρή, είναι επίσης υπεύθυνη για διεισδυτικές λοιμώξεις που μπορεί να απειλήσουν την ανθρώπινη ζωή. Οι μικροοργανισμοί μπορούν να επιζήσουν της οξύτητας του στομάχου, να προσκολληθούν στα επιθηλιακά κύτταρα, να παράξουν εντεροτοξίνες και να δημιουργήσουν φλεγμονή με συμπτώματα όπως πυρετός, κοιλιακές κράμπες και διάρροια. [23]

25 Στους ηλικιωμένους, στα βρέφη και στα άτομα με εξασθενημένο ανοσοποιητικό σύστημα μπορεί να εξελιχθεί σε πιο σοβαρή ασθένεια. Σε αυτούς τους ασθενείς, η μόλυνση μπορεί να εξαπλωθεί από το έντερο σε άλλες περιοχές του σώματος και μπορεί να προκαλέσει θάνατο. Τα αυγά όπως και τα πουλερικά έχουν αναχθεί ως τα κυριότερα μέσα μετάδοσης του βακτηρίου μεταξύ των τροφίμων, αν αυτά καταναλωθούν ωμά ή μερικώς μαγειρεμένα. Άλλες πηγές, περιλαμβάνουν το νωπό γάλα, χοιρινό, βοδινό κρέας, τα ωμά λαχανικά κ.α. (Μπεζιρτζόγλου, 2004) (Braden, 2006) (Madigan, Martinko and Parker, 2003) Listeria monocytogenes Το L. monocytogenes είναι ένα Gram-θετικό, προαιρετικά αναερόβιο βακτήριο, με ραβδόμορφο σχήμα που δεν σχηματίζει σπόρια. Έχει την ικανότητα να κινείται μέσω μαστιγίου σε θερμοκρασία 30 ο C και κάτω, ενώ δεν παρουσιάζει κίνηση στους 37 ο C (Farber and Peterkin, 1991). Πρόκειται για το βακτήριο που προκαλεί τη λιστερίωση, την τρίτη μεγαλύτερη αιτία θανάτου μεταξύ των τροφιμογενών παθογόνων στην Αμερική, με το 18% των ασθενών που έχουν μολυνθεί να καταλήγουν σε θάνατο(silk et al., 2012). Έχει συνδεθεί με τρόφιμα όπως το νωπό γάλα, το παστεριωμένο γάλα, τυριά (μαλακά ζυμωμένα τυριά, π.χ. μπρι), το παγωτό, τα ωμά λαχανικά, λουκάνικα, ωμά και μαγειρεμένα πουλερικά, τα ακατέργαστα κρέατα, και τα ωμά και καπνιστά ψάρια. Η ανθεκτικότητα που εμφανίζει σε συνθήκες επεξεργασίας τροφίμων (αυξημένη οξύτητα και αλατότητα, χαμηλές θερμοκρασίες αποθήκευσης), καθιστά το Listeria ένα από τα πιο ισχυρά τροφογενή παθογόνα (Harwig et al., 1991) (Μπεζιρτζόγλου, 2004). Ο οργανισμός αυτός βρίσκεται ευρέως στην φύση, δηλαδή στο έδαφος, τη βλάστηση και τα ζώα. Η κύρια οδός μετάδοσης πιστεύεται ότι είναι μέσω της κατανάλωσης μολυσμένων τροφίμων αν και δεν αποκλείεται η μόλυνση απευθείας από το ζώο στον άνθρωπο, είτε και από άνθρωπο σε άνθρωπο (Vivant, Garmyn and Piveteau, 2013). [24]

26 Το L. monocytogenes προκαλεί δύο μορφές λιστερίωσης: την μη διηθητική και την διηθητική λιστερίωση. Σε υγιή άτομα, η μη διηθητική λιστερίωση εμφανίζεται με τυπικά συμπτώματα ίωσης με πονοκέφαλο, κλπ. Ενώ σε ανοσοκατεσταλμένους, όπως οι ηλικιωμένοι και οι ασθενείς που λαμβάνουν ανοσοκατασταλτική αγωγή, η λιστερίωση μπορεί να εκδηλωθεί με σηψαιμία ή μηνιγγοεγκεφαλίτιδα. Διηθητική λιστερίωση μπορεί επίσης να μεταδοθεί στο έμβρυο από τη μητέρα του μέσω του πλακούντα Η περιγεννητική λιστερίωση μπορεί να οδηγήσει σε αποβολή ή πολλαπλών μορφών λοιμώξεις για το νεογνό (Allerberger and Wagner, 2010) Staphylococcus aureus Πρόκειται για θετικά κατά Gram, αρνητικά στην καταλάση, μικρά σφαιρικά βακτήρια, τα οποία στο χώρο σχηματίζουν μορφές αντίστοιχες του σταφυλιού όπως μαρτυρά και το όνομά τους. Ο χρυσίζον σταφυλόκοκκος φυσιολογικά απαντάται στην μικροχλωρίδα του δέρματος και των αεροφόρων οδών, ενώ δυνητικά μπορεί να προκαλέσει παθογένεια. Ο S. aureus προκαλεί τροφικές δηλητηριάσεις λόγω των εξωτοξινών που παράγει. Είναι υπεύθυνος για την παραγωγή επτά διαφορετικών εξωτοξινών ( A, B, C1, C2, C3, D & E). Όλες οι τοξίνες αυτές είναι ανθεκτικές στις πρωτεάσες του εντέρου, θερμοσταθερές και αδρανοποιούνται μόνο με παρατεταμένο βρασμό. Οι σταφυλοκοκκικής αιτιολογίας δηλητηριάσεις αντιμετωπίζονται σχετικά σύντομα από το ίδιο τον οργανισμό, ενώ η χρήση αντιβιοτικών δεν φαίνεται να είναι αποτελεσματική, αφού οι δηλητηριάσεις οφείλονται στις εντεροτοξίνες που απελευθερώνονται στα τρόφιμα. Στα τρόφιμα που εμπλέκονται συνήθως με την μόλυνση συμπεριλαμβάνονται το γάλα, η κρέμας γάλακτος, τα παρασκευάσματα ζαχαροπλαστικής, το βούτυρο, τα τυριά, τα αλλαντικά, τα κονσερβοποιημένα κρεατοσκευάσματα, σαλάτες, μαγειρευτά φαγητά (Wieneke, Roberts and Gilbert, 1993) (Argudín, Mendoza and Rodicio, 2010). Στο πλαίσιο της πρόληψης της μόλυνσης περιλαμβάνεται η σχολαστικότητα και η τήρηση της υγιεινής στους χειριστές τροφίμων, και η τήρηση των [25]

27 απαραίτητων συνθηκών αποθήκευσης των τροφίμων, ειδικότερα των ευπαθών στο βακτήριο (Μπεζιρτζόγλου, 2004)(Madigan, Martinko and Parker, 2003) (Le Loir, Baron and Gautier, 2003). 6 Σκοπός Στη παρούσα μελέτη εξετάστηκε η αντιμικροβιακή ικανότητα υδατικών εκχυλισμάτων βοτάνων, αυτοφυών της ελληνικής χλωρίδας. Τα αφεψήματα εξετάστηκαν έναντι θετικών και αρνητικών κατά Gram βακτηρίων, που αποτελούν παθογόνα ή ευκαιριακά παθογόνα του ανθρώπου. [26]

28 Κεφάλαιο ΙΙ Υλικά και Μέθοδοι [27]

29 1 Φυτά Στη μελέτη εξετάστηκαν 13 βότανα της Ελληνικής χλωρίδας. Όλα τα βότανα προέρχονταν από τη Νύβριτο Ηρακλείου Κρήτης με εξαίρεση το Σπαθόχορτο, το οποίο ήταν τυποποιημένο από το Σύλλογο Γυναικών Άνω Πορρόϊας του νομού Σερρών και το Μελισσόχορτο, το οποίο προερχόταν από βιολογικές καλλιέργειες της Αιτωλοακαρνανίας. Τα βότανα παραλήφθηκαν τυποποιημένα σε συσκευασίες των 250g. Πίνακας 2.1: Βότανα ελληνικής χλωρίδας Κοινή ονομασία Επιστημονική ονομασία(είδος, γένος) Οικογένεια 1. Αντωναΐδα Origanum microphyllum Lamiaceae 2. Δενδρολίβανο Rosmarinus officinallis Lamiaceae 3. Δίκταμο Origanum dictamnus Lamiaceae 4. Θρύμπα Satureja thymbra Lamiaceae 5. Θυμάρι Thymus vulgaris Lamiaceae 6. Μαντζουράνα Origanum majorana Lamiaceae 7. Ρίγανη Origanum vulgare Lamiaceae 8. Σπαθόχορτο Hypericum perforatum Clusiaceae 9. Τσάι βουνού Sideritis syriaca Lamiaceae 10. Φασκόμηλο Salvia officinallis Lamiaceae 11. Φλισκούνι Mentha pulegium Lamiaceae 12. Χαμομήλι Matricaria chamomilla Asteraceae 13. Μελισσόχορτο Melissa officinalis Lamiaceae 1.1 Εκχύλιση βοτάνων και παραλαβή των αφυδατωμένων αφεψημάτων Διαλύτες συσκευές: Αναλυτικός ζυγός ακρίβειας τεσσάρων δεκαδικών ψηφίων Εστία βρασμού [28]

30 Καταψύκτης (-40 ο C) Συσκευή λυοφιλίωσης (Heto Lab 3000) Γυάλινο σκεύος βρασμού Ογκομετρικός κύλινδρος 250mL Πλαστικά δοχεία όγκου 100ml (ουροσυλλέκτες) Εμφιαλωμένο φυσικό μεταλλικό νερό (ΖΑΓΟΡΙ) Διηθητικό χαρτί Γυάλινο χωνί Parafilm Αιχμηρό αντικείμενο Μεταλλική σπάτουλα Φιαλίδια με βιδωτό πώμα καλυμμένο με Teflon, όγκου 10mL Αναλυτική Πορεία: Η διαδικασία ξεκινά με την ζύγιση 3g ξερού βοτάνου στον αναλυτικό ζυγό. Ακολουθεί η ογκομέτρηση 250ml μεταλλικό νερό ΖΑΓΟΡΙ και η ανάμιξή του με τα 3g του βοτάνου σε πυρίμαχο σκεύος. Στην συνέχεια το πυρίμαχο σκεύος τοποθετείται σε θερμαντική πλάκα μέχρι βρασμού του περιεχομένου και για διάστημα επιπλέον 3 λεπτών μετά την παρατήρηση του. Αφού το μίγμα αποσυρθεί από την θερμαντική πλάκα, αφήνεται σε συνθήκες περιβάλλοντος για ακόμη 2 λεπτά. Μετά το πέρας των 2 λεπτών ακολουθεί η διήθηση του μίγματος, μέχρι παραλαβής 200ml αφού κατά τον βρασμό εκτιμάται πως χάθηκαν περίπου 50ml λόγω εξάτμισης. Αφού το διήθημα κρυώσει τοποθετείται ανά 50ml σε προζυγισμένα και σημασμένα πλαστικά δοχεία (ουροσυλλέκτες), σφραγίζεται με τα καπάκια και τοποθετείται σε κατάψυξη θερμοκρασίας -20 ο C για 24 ώρες. Στη συνέχεια, αφαιρούνται τα πώματα από τα δοχεία και αυτά σφραγίζονται με parafilm στο οποίο ανοίγονται μικρές τρύπες με αιχμηρό αντικείμενο για διευκόλυνση της λυοφιλίωσης και τα δοχεία τοποθετούνται για ακόμη 24 ώρες σε κατάψυξη - 80 ο C. Την επόμενη μέρα τα δείγματα τοποθετούνται στη συσκευή της λυοφιλίωσης για 72 ώρες, μετά τις οποίες γίνεται η παραλαβή του αφυδατωμένου αφεψήματος. Για λήψη τις τιμής των περιεχόμενων στα αφεψήματα αλάτων, δείγμα νερού ΖΑΓΟΡΙ τοποθετήθηκε για λυοφιλίωση ακολουθώντας τις ίδιες συνθήκες με τα αφεψήματα. [29]

31 Μετά το τέλος της λυοφιλίωσης τα πλαστικά δοχεία ζυγίζονται χωρίς το καπάκι ώστε να γίνει η καταγραφή της απόδοσης της λυοφιλίωσης και να υπολογιστεί η ποσότητα του περιεχόμενου άλατος. Την ζύγιση ακολουθεί η ενοποίηση του στερεού υπολείμματος σε γυάλινα φυαλίδια και η αποθήκευση τους σε σκοτεινό μέρος σε συνθήκες κατάψυξης. 2 Μικροβιακά στελέχη Στο πλαίσιο της παρούσας εργασίας μελετήθηκαν παθογόνα και εν δυνάμει παθογόνα του γαστρεντερικού αυλού του ανθρώπου. Κάποια από αυτά ήταν Gram θετικά και κάποια Gram αρνητικά. Πίνακας 2.2: Μικροβιακά στελέχη Μικροβιακά στελέχη Κατάταξη κατά Gram (- αρνητικό, + θετικό) Δοκιμασία καταλάσης (- αρνητικό, + θετικό) 1. Salmonella choleriasuis DSMZ Salmonella enteritidis Clostridium difficile ATCC Listeria monocytogenes DSM Enterococcus faecalis ATCC Enterococcus faecalis ATCC Escherichia coli CIP Escherichia coli ATCC Staphylococcus aureus ATCC Staphylococcus aureus ATCC Helicobacter pylori CCUG Helicobacter pylori CCUG [30]

32 3 Θρεπτικά υποστρώματα Παρακάτω παρουσιάζονται όλα τα θρεπτικά υλικά που χρησιμοποιήθηκαν για κάθε μικροβιακό στέλεχος καθώς και οι συνθήκες επώασης τους. Πίνακας 2.3: Συνθήκες επώασης μικροβιακών στελεχών Μικροβιακά στελέχη Θρεπτικό υπόστρωμα Διάρκεια επώασης (h) Θερμοκρασία επώασης ( o C) Συνθήκες περιβάλλοντος 1. Salmonella choleriasuis DSMZ Salmonella enteritidis 3. Clostridium difficile ATCC 9689 Nutrient Agar, Brain heart infusion broth Nutrient Agar, Brain Heart Infusion broth Columbia Blood Agar(ενισχυμένο με υδροχλωρική μονοϋδρική L- κυστεΐνη 0,05%), Brain heart Infusion broth (ενισχυμένο με υδροχλωρική μονοϋδρική L- κυστεΐνη 0,05%) Αερόβια Αερόβια Αναερόβια 4. Listeria monocytogenes DSM Enterococcus faecalis ATCC Enterococcus faecalis ATCC Escherichia coli CIP Nutrient Agar, Nutrient broth Nutrient Agar, Brain heart infusion, Brain Hurt Infusion broth Nutrient Agar, Brain heart infusion, Brain Hurt Infusion broth Nutrient Agar, Brain Heart Αερόβια Αερόβια Αερόβια Αερόβια [31]

33 8. Escherichia coli ATCC Staphylococcus aureus ATCC Staphylococcus aureus ATCC Helicobacter pylori CCUG Helicobacter pylori CCUG Infusion Nutrient Agar, Brain Heart Infusion Nutrient Agar, Brain Heart Infusion, Brain Heart Infusion broth Nutrient Agar, Brain Heart Infusion, Brain Heart Infusion broth Blood Agar, Wilkins Chalgren Agar (ενισχυμένο με Vitox) Blood Agar, Wilkins Chalgren Agar (ενισχυμένο με Vitox) Αερόβια Αερόβια Αερόβια Μικροαερόφιλα Μικροαερόφιλα Nutrient Agar (NA): Το ΝΑ αποτέλεσε υπόστρωμα που ευνόησε την αναβίωση, ανάπτυξη και απομόνωση καθαρών αποικιών από τα περισσότερα στελέχη που πήραν μέρος στην μελέτη. Και συγκεκριμένα αυτών του γένους Salmonella, Listeria, Enterococcus, Escherichia και Staphylococcus. Συστατικά: προϊόντα πέψης ζωικών ιστών (5,0g/l), χλωριούχο νάτριο (5,0g/l), εκχύλισμα βοδινού (1,5g/l), εκχύλισμα μαγιάς (1,5g/l), άγαρ(15,0g/l) Παρασκευή: σε 1000 ml αποσταγμένου νερού γίνεται διάλυση 28 γραμμαρίων. Το μίγμα θερμαίνεται μέχρι βρασμού, ώστε να διαλυθεί. Ακολουθεί η αποστείρωση του εναιωρήματος στους 121 C για 15 λεπτά και στη συνέχεια αυτό μοιράζεται σε τρυβλία Petri(90mm) (MacFaddin, 2000). [32]

34 Brain Hurt Infusion (BHI): Το BHI χρησιμοποιήθηκε ως μέσο αναβίωσης και ανάπτυξης των γενών: Salmonella, Enterococcus, Escherichia και Staphylococcus. Συστατικά: εκχύλισμα εγκεφάλου μοσχαριού(200.0 g/l), εκχύλισμα βόειας καρδιάς (250.0 g/l), πεπτόνη πρωτεόζης (10.0 g/l), δεξτρόζη (2.0 g/l), χλωριούχο νάτριο (5,0 g/l), φωσφορικό δινάτριο (2.5 g/l), άγαρ 15.0 g/l) Παρασκευή: σε 1000 ml αποσταγμένου νερού διαλύουμε 52 γραμμάρια υλικού. Αφού θερμανθεί μέχρι βρασμού για να διαλυθεί εντελώς το μέσο, αποστειρώνεται στους 121 C για 15 λεπτά. Αφού αναδευτεί επαρκώς μοιράζεται σε τρυβλία Petri(90mm) (Murray et al., 2003). Wilkins-Chalgren Agar (ενισχυμένο με 7% Horse blood & 1% Vitox): Το WC, ιδανικό μέσο για την καλλιέργεια αναερόβιων βακτηρίων, χρησιμοποιήθηκε για την αναβίωση και ανάπτυξη του γένους Helicobacter. Το μέσο ενισχύθηκε με 7% Horse blood defibrinated και 1% Vitox. Το Vitox είναι ένα στείρο λυοφιλοποιημένο συμπύκνωμα βασικών παραγόντων ανάπτυξης(βιταμίνη B12, L-γλουταμίνη, αδενίνη, γουανίνη, p-αμινοβενζοϊκό οξύ, L-κυστεΐνη, NAD,κ.ά.)(Oxoid.com, 2015). Συστατικά WC: τρυπτόνη(10,0g/l), πεπτόνες ζελατίνης (10,0g/l), εκχύλισμα μαγιάς(5.0g/l), γλυκόζη(1.0g/l), χλωριούχο νάτριο (5.0g/l), L-αργινίνη (1.0g/l), πυροσταφυλικό νάτριο(1.0g/l), μεναδιόνη(0.0005g/l), αιμίνη(0.005g/l), άγαρ (10.0g/l). Παρασκευή: στα 1000ml διαλύματος τα 70ml είναι Horse Blood και 10ml Vitox. Επομένως σε 920ml αποσταγμένου νερού προστίθενται 43g υλικού WC. Θερμαίνεται μέχρι βρασμού και αποστειρώνεται στους 121 C για 15 λεπτά. Αφού το διάλυμα κρυώσει, ογκομετρούνται 70ml Horse Blood και προστίθενται στο διάλυμα. Στη συνέχεια γίνεται η ανάμιξη του υγρού μέσου με το αφυδατωμένο στερεό του Vitox και προστίθενται 10ml αυτού στο διάλυμα. Στη [33]

35 συνέχεια το υλικό μοιράζεται σε τρυβλία Petri(90mm). Η όλη διαδικασία γίνεται κάτω από ασηπτικές συνθήκες (Wilkins and Chalgren, 1976). Columbia Blood Agar(ενισχυμένο με υδροχλωρική μονοϋδρική L-κυστεΐνη 0,05%, Horse Blood 7%): Χρησιμοποιήθηκε για την αναβίωση και ανάπτυξη μικροοργανισμών του γένους Clostridium. Συστατικά Columbia Agar Base: μίγμα πεπτόνων Columbia (23.0g/l), άμυλο καλαμποκιού (1.0g/l), χλωριούχο νάτριο (5.0g/l) και άγαρ Νο.2 (12,0g/l). Παρασκευή: Σε 950 ml απιονισμένου νερού διαλύθηκαν 41 g Columbia agar base, 5 g άγαρ Νο.2 (LabM) και 0,5g L- υδροχλωρική κυστεΐνη. Ακολούθησε αποστείρωση στους 121 o C για 15 λεπτά. Αφού η θερμοκρασία του μίγματος έπεσε κοντά στους o C, γίνεται προσθήκη 50 ml Horse Blood defibrinated με τη βοήθεια αποστειρωμένου ογκομετρικού σωλήνα και διανομή του υλικού σε τρυβλία Petri (90 mm) (Ellner et al., 1966). Blood Agar Base(7% Horse Blood): Το υπόστρωμα χρησιμοποιήθηκε για την αναβίωση και ανάπτυξη του γένους Helicobacter. Το υπόστρωμα εμπλουτίζεται με 7% αίμα αλόγου. Συστατικά: πρωτεόζη πεπτόνης(15.0g/l), προϊόντα πέψης ήπατος (2.5 g/l), εκχύλισμα μαγιάς (5.0 g/l), χλωριούχο νάτριο (5.0 g/l), άγαρ (12.0g/l) Παρασκευή: από τα 1000ml υγρού μέσου τα 70ml θα είναι defibrinated Horse Blood. Οπότε σε 930ml αποσταγμένου νερού προστίθενται 40g στερεού υλικού. Το μίγμα φέρεται σε βρασμό για να διαλυθεί πλήρως. Αποστειρώνεται στους 121 C για 15 λεπτά. Αφήνεται να ψυχθεί στους C και προστίθεται 70ml αποστειρωμένο αίμα. Έπειτα από καλή ανάδευση το μίγμα μοιράζεται σε τρυβλία Petri(90mm). [34]

36 Agar No2: Χρησιμοποιήθηκε για την σταθεροποίηση των υγρών υποστρωμάτων, που χρησιμοποιήθηκαν σαν άνω στρώση κατά την πειραματική διαδικασία της μεθόδου διάχυσης σε πηγάδι από άγαρ (Agar Well Diffusion). Στα υγρά υποστρώματα, κατάλληλα για κάθε μικροοργανισμό έγινε προσθήκη κατάλληλης ποσότητας μέσου ώστε να επιτευχθεί συγκέντρωση αυτού 0,7%. Brain Hurt Infusion broth: Χρησιμοποιήθηκε σαν υγρό μέσο ανάπτυξης για τα γένη: Salmonella, Listeria, Enterococcus, Escherichia, Staphylococcus. Συστατικά: Μείγμα εκχυλισμάτων εγκεφάλου-καρδιάς (17.5g/l), τρυπτόζη (10.0g/l), γλυκόζη (2.0g/l), χλωριούχο νάτριο (5,0g/l), όξινο φωσφορικό δινάτριο (2.5g/l). Παρασκευή: διασπορά 37 γραμμαρίων σκόνης σε 1 λίτρο αποσταγμένου νερού. Αφού σταθεί για 10 λεπτά, το μίγμα διαλύεται σε ήπια θερμοκρασία. Διανέμεται σε δοκιμαστικούς σωλήνες (5ml/δ.σ.), οι οποίοι στη συνέχεια αποστειρώνονται στους 121 C για 15 λεπτά (Rosenow, 1919). Brain Hurt Infusion broth( ενισχυμένο με L-μονοϋδρική υδροχλωρική κυστεΐνη 0,05%): Το ενισχυμένο αυτό μέσο χρησιμοποιήθηκε για τις υγρές ανακαλλιέργιες του γένους Clostridium. Παρασκευή: η παρασκευή του είναι η ίδια με αυτή του BHI broth με την διαφορά ότι στο συγκεκριμένο προστίθενται 0,5g (L-Cysteine hydrochloride monohydrate BioChemica A3698) στο 1 λίτρο αποσταγμένου νερού. 4 Πειραματικές πορείες Στο πλαίσιο της παρούσας εργασίας ακολουθήθηκαν 2 πειραματικές πορείες για τον έλεγχο της αντιμικροβιακής δράσης των 13 αφεψημάτων. [35]

37 Η πρώτη ήταν η μέθοδος διάχυσης σε πηγάδι από άγαρ (Agar Well Diffusion) και η δεύτερη αφορούσε την ανάδειξη της ελάχιστης συγκέντρωσης αφεψήματος που μπορεί να αναστείλει την ανάπτυξη των μικροοργανισμών (Minimum Inhibitory Concentration). 4.1 Μέθοδος διάχυσης σε πηγάδι από άγαρ (Agar Well Diffusion) Προετοιμασία μικροοργανισμών Οι μικροοργανισμοί που χρησιμοποιήθηκαν στα πειράματα προήλθαν από καλλιέργειες (stock cultures) αποθηκευμένες σε διάλυμα γλυκερόλης (30%) σε κατάλληλο θρεπτικό υλικό στην υπερ-κατάψυξη (-80 o C). Για την αναβίωση των μικροοργανισμών πραγματοποιήθηκαν διαδοχικές ανακαλλιέργειες σε κατάλληλο στερεό θρεπτικό υλικό, μέχρι παρατήρησης αντιπροσωπευτικών καθαρών αποικιών. Οι ανακαλλιέργειες ελέχγονται οπτικά σε στερεοσκόπιο, με χρώση Gram, με δοκιμή καταλάσης και παρατήρηση των κυττάρων στο μικροσκόπιο για επιβεβαίωση απουσίας επιμολύνσεων. Από τις στερεές καλλιέργειες διαλέγουμε κατάλληλο πληθυσμό και εμβολιάζουμε κατάλληλο υγρό θρεπτικό υλικό. Αφού πραγματοποιηθούν 2 διαδοχικές ανακαλλιέργειες και η δεύτερη ανακαλλιέργεια είναι ικανοποιητικής ανάπτυξης και καθαρότητας προχωράμε στην προετοιμασία παρασκευής του εμβολίου που θα χρησιμοποιηθεί στο τελικό πείραμα. Οπότε και εμβολιάζουμε 5ml κατάλληλου υγρού θρεπτικού υλικού με 50μl από την δεύτερη υγρή ανακαλλιέργεια και έτσι παραλαμβάνουμε εμβόλιο συγκέντρωσης 1% το οποίο επωάζεται σε κατάλληλες συνθήκες για 24h. Στον πίνακα (2.3) φαίνονται οι μικροοργανισμοί που χρησιμοποιήθηκαν, οι συνθήκες επώασής τους και τα θρεπτικά υλικά που χρησιμοποιήθηκαν για τον καθένα Προετοιμασία αντιβιοτικών Για την ορθή ερμηνεία του πειράματος απαραίτητη ήταν η χρήση ενός θετικού και ενός αρνητικού δείκτη εμφάνισης αντιμικροβιακής δράσης. Ο αρνητικός δείκτης ήταν το απεσταγμένο αποστειρωμένο νερό, το οποίο δεν αναμένεται να [36]

38 έχει αντιμικροβιακή δράση, ενώ ως θετικός χρησιμοποιήθηκε κατάλληλο αντιβιοτικό, ώστε ο κάθε μικροοργανισμός να μην εμφανίζει ανθεκτικότητα σε αυτό. Πίνακας 2.4: τα αντιβιοτικά που χρησιμοποιήθηκαν ανά στέλεχος Μικροβιακά στελέχη Αντιβιοτικό ( mg/ml) 1. Salmonella choleriasuis DSMZ 554 Στρεπτομυκίνη, 1mg/mL 2. Salmonella enteritidis Στρεπτομυκίνη, 1mg/mL 3. Clostridium difficile ATCC 9689 Στρεπτομυκίνη, 1mg/mL 4. Listeria monocytogenes DSM Στρεπτομυκίνη, 1mg/mL 5. Enterococcus faecalis ATCC Τεϊκοπλανίνη, 1mg/mL 6. Enterococcus faecalis ATCC Στρεπτομυκίνη, 1mg/mL 7. Escherichia coli CIP Στρεπτομυκίνη, 1mg/mL 8. Escherichia coli ATCC Στρεπτομυκίνη, 1mg/mL 9. Staphylococcus aureus ATCC 6538 Στρεπτομυκίνη, 1mg/mL 10. Staphylococcus aureus ATCC Στρεπτομυκίνη, 1mg/mL 11. Helicobacter pylori CCUG Στρεπτομυκίνη, 1mg/mL 12. Helicobacter pylori CCUG Στρεπτομυκίνη, 1mg/mL Στρεπτομυκίνη( Streptomycin sulfate, Calbiochem): Η στρεπτομυκίνη είναι υδατοδιαλυτή αμινογλυκοσίδη που παράγεται από τον Streptomyces griseus και κυκλοφορεί με τη μορφή του θειικού άλατος. Σαν αντιβιοτικό είναι αποτελεσματικό εναντίον Gram-θετικών και Gram-αρνητικών βακτηρίων. Η μικροβιοκτόνος δράσης της έγκειται στην αναστολή έναρξης, επιμήκυνσης και τερματισμού της πρωτεϊνοσύνθεσης στα προκαρυωτικά κύτταρα, με αποτέλεσμα την εσφαλμένη ανάγνωση του γενετικού κώδικα και τελικά τη λύση των κυττάρων. [37]

39 Παρασκευή: Σε 1ml αποσταγμένου και αποστειρωμένου νερού γίνεται διάλυση (με τη βοήθεια vortex και short spin)62,4mg Streptomycin sulfate οπότε και προκύπτει stock solution 50mg/ml. Το stock solution αραιώνεται διαδοχικά και έτσι καταλήγει στο διάλυμα εργασίας συγκέντρωσης 1mg/ml. Η ποσότητα χωρίζεται σε eppendorf και αποθηκεύεται στους -20 o C (Lech and Brent, 1995) (Maniatis et al., 1989) (MODOLELL and DAVIS, 1969). Τεϊκοπλανίνη(Targocid, 200mg Teicoplanin, Marrion Merrel): Η τεϊκοπλανίνη (teicoplanin) είναι ένα γλυκοπεπτίδιο, το οποίο έχει κυρίως βακτηριοκτόνο δράση. Είναι δραστική έναντι τόσο των αναερόβιων όσο και έναντι των αερόβιων Gram-θετικών βακτηρίων. Η τεϊκοπλανίνη αναστέλλει τον πολυμερισμό της πεπτιδογλυκάνης, με αποτέλεσμα την αναστολή της σύνθεσης του βακτηριακού κυτταρικού τοιχώματος και τον κυτταρικό θάνατο (Parenti, 1986). Η τεϊκοπλανίνη χρησιμοποιήθηκε για το στέλεχος Enterococcus faecalis ATCC 51299, το οποίο εμφάνισε ανθεκτικότητα στην στρεπτομυκίνη. Παρασκευή: γίνεται διάλυση 0.05g αντιβιοτικού σε 1ml αποστειρωμένου, αποσταγμένου νερού. Αναδεύεται επαρκώς με τη βοήθεια vortex και short spin. Το διάλυμα που προέκυψε είναι συγκέντρωσης 50mg/ml. Μετά από 2 διαδοχικές αραιώσεις προκύπτει το διάλυμα εργασίας συγκέντρωσης 1mg/ml Αναδιάλυση λιωφιλιωμένων αφεψημάτων Για την πραγματοποιήση των πειραμάτων απαραίτητη είναι η αναδιάλυση των αφεψημάτων που έχουμε παραλάβει από την λυοφιλίωση. Στην παρούσα πειραματική πορεία το μέσο αναδιάλυσης είναι το νερό. Η συγκέντρωση αφεψήματος που χρησιμοποιήθηκε στην πειραματική διαδικασία ήταν 200mg/ml, μέγιστη δυνατή όπως προέκυψε ύστερα από δοκιμή. Αντιδραστήρια-Όργανα: Αποστειρωμένο αποσταγμένο νερό [38]

40 Αυτόματες πιπέττες ( μL), tips Αναλυτικός ζυγός ακριβείας τεσσάρων δεκαδικών Μεταλλική σπάτουλα Πλαστικοί δοκιμαστικοί σωλήνες (10mL) με πλαστικά πώματα Αποστειρωμένα φυαλίδια McCartney Αποστειρωμένα φιαλίδια eppendorf, χωρητικότητας 1,5mL Αποστειρωμένα φίλτρα (0.20μm) Αποστειρωμένες σύριγγες (5mL) Sonicator water bath Θάλαμος νηματικής ροής (Laminar Flow) Καταψύκτης (-20 ο C) Αναλυτική πορεία: Στους πλαστικούς δοκιμαστικούς σωλήνες ζυγίζεται κατάλληλη ποσότητα λυωφιλιωμένου αφεψήματος. Στη συνέχεια προστίθεται με την αυτόματη πιπέττα κατάλληλη ποσότητα αποσταγμένου νερού ώστε η συγκέντρωση να είναι 200mg/mL, και αναδεύεται ελαφρώς. Οι δοκιμαστικοί σωλήνες τοποθετούνται σε λουτρό υπερήχων για διάστημα 5 λεπτών επί 2 φόρες και όχι για 10 λεπτά συνεχόμενα για να μην αυξηθεί η θερμοκρασία. Με τη βοήθεια σύριγγας κάθε δείγμα περνά από αποστειρωμένο φίλτρο (0,20μm). Το αποστειρωμένο πια διάλυμα μεταφέρεται σε επίσης αποστειρωμένο φυαλίδιο McCartney και από εκεί μοιράζεται σε αποστειρωμένα eppendorf (1,5mL) και αποθηκεύεται σε κατάσταση κατάψυξης (-20 ο C) μέχρι τη χρήση του Η πειραματική πορεία αναλυτικά Αντιδραστήρια-Όργανα: Αποστειρωμένο αποσταγμένο νερό Αυτόματες πιπέττες ( μL), tips Αναδιαλυμένα αφεψήματα [39]

41 Προπαρασκευασμένα διαλύματα αντιβιοτικών Φελλοτρυπητήρας Τρυβλία Petri ( 150mm & 90mm) Θάλαμος νηματικής ροής (Laminar Flow) Αερόβιος επωαστικός θάλαμος 37 ο C Αναερόβιος επωαστικός θάλαμος 37 ο C Δοχείο επώασης για μικροαερόφιλες συνθήκες Φάκελοι με ειδικό μίγμα ουσιών για μικροαερόφιλες συνθήκες Γυάλινες ράβδοι επίστρωσης Αναλυτική πορεία: Εφόσον όλες οι επιμέρους διαδικασίες έχουν προετοιμαστεί, προχωράει η σύνθεση του τελικού πειράματος. Αρχικά σε τρυβλία Petri διαμέτρου 150mm επιστρώνονται 20ml άγαρ (1,2%). Μέχρι αυτά να στερεοποιηθούν, γίνεται η προετοιμασία του εμβολίου. Σε 45ml κατάλληλου θρεπτικού υποστρώματος, συγκέντρωσης 0,7% σε άγαρ(soft Agar) και θερμοκρασίας περίπου 40 ο C, προστίθενται 700μl υγρής καλλιέργειας 24 ωρών και συγκέντρωσης 1% σε εμβόλιο, αναμιγνύονται και προστίθενται στο τρυβλίο μετά την στερεοποίηση του κάτω στρώματος. Αφού μεσολαβήσει η πλήρης στερεοποίηση και του άνω στρώματος, πραγματοποιείται η διάνοιξη των πηγαδιών (διαμέτρου 5mm) με την βοήθεια φελλοτρυπητήρα. Συνολικά δημιουργήθηκαν 15 πηγάδια, 13 για καθένα από τα αντίστοιχα αφεψήματα(συγκέντρωσης 200mg/ml), 1 για τον θετικό δείκτη (κατάλληλο αντιβιοτικό για κάθε μικροοργανισμό) και 1 για τον αρνητικό δείκτη (αποσταγμένο νερό). Τα πηγάδια αυτά εμβολιάστηκαν με 40μl αφεψήματος, αντιβιοτικού και νερού αντίστοιχα και στη συνέχεια παρέμειναν σε θερμοκρασία δωματίου μέχρι τα διαλύματα να διαχυθούν στο υπόστρωμα. Μετά την ολοκλήρωση της διάχυσης τα τρυβλία επωάστηκαν σε κατάλληλες συνθήκες. Για κάθε μικροβιακό στέλεχος πραγματοποιήθηκαν 3 επαναλήψεις. Εξαίρεση στην όλη διαδικασία αποτελεί η μεταχείριση των Gram - στελεχών Helicobacter pylori CCUG και CCUG Η πειραματική πορεία που [40]

42 ακολουθήθηκε για τα συγκεκριμένα στελέχη βασίστηκε σε αυτή του Δ. Σγούρα και των συνεργατών (2004). Στην προκειμένη περίπτωση οι ανακαλλιέργειες των στελεχών έγιναν αποκλειστικά σε αιματούχο στερεό θρεπτικό υλικό. Η επώαση έγινε στους 37 ο C για 24h σε φιάλη μικροαερόφιλων συνθηκών (με τη βοήθεια φακέλου που δημιουργεί τις συνθήκες αυτές). Στο τελικό πείραμα αντί για τρυβλία Petri διαμέτρου 150mm, χρησιμοποιήθηκαν τρυβλία διαμέτρου 90mm για λόγους χωρητικότητας στη φιάλη. Άλλη μια διαφοροποίηση αποτελεί ο εμβολιασμός, ο οποίος έγινε με επίστρωση του εμβολίου στο θρεπτικό υλικό. Το εμβόλιο όπως σε όλες τις περιπτώσεις είναι 1%, εδώ λόγω αδυναμίας ανάπτυξης του μικροοργανισμού σε κατάλληλο υγρό θρεπτικό υπόστρωμα, αυτό δεν προέρχεται από υγρή ανακαλλιέργεια 24h. Έτσι κατασκευάζεται πρότυπο διάλυμα Mc Farland 0,5(1,5*10 8 CFU/ ml). Στη συνέχεια σε 3ml φυσιολογικού ορού διαλύονται μεμονωμένες τυπικές αποικίες από τρυβλίο που έχει επωαστεί για 24h, μέχρι θολερότητας αντίστοιχης αυτής του προτύπου. Και έτσι 100μl από το εμβόλιο που παρασκευάστηκε με αυτό τον τρόπο, επιστρώνεται με ειδική γυάλινη ράβδο σε κάθε τρυβλίο. Μέτα την επίστρωση συνεχίζεται η διαδικασία κανονικά. 4.2 Προσδιορισμός ελάχιστης συγκέντρωσης αναστολής (MIC) Μετά τον έλεγχο εμφάνισης αντιμικροβιακής δράσης με την μέθοδο διάχυσης σε πηγάδι από άγαρ, θεωρήθηκε σκόπιμο να μελετηθεί και η ελάχιστη συγκέντρωση στην οποία τα υδατικά διαλύματα των βοτάνων πραγματοποιούν την ανασταλτική τους δράση. Γι αυτό το σκοπό πραγματοποιήθηκε νέα πειραματική πορεία. Τα στελέχη που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα πειραματική διαδικασία είναι τα ίδια με αυτά της πρώτης, όπως και τα αφεψήματα που παραλήφθηκαν μέσω της ίδιας πορείας (λυοφιλίωση, βλ. κεφάλαιο1.2) [41]

43 Πίνακας 2.5: Στελέχη βακτηρίων και βότανα ως προς τα οποία ελέχθησαν για τον προσδιορισμό της MIC Μικροβιακά στελέχη Βότανα C. difficile ATCC 9689 L. monocytogenes DSM S. aureus DSMZ 6784 S. aureus DSMZ E. faecalis ATCC E. feacalis ATCC Δίκταμο Θρύμπα Θυμάρι Μαντζουράνα Ρίγανη Σπαθόχορτο Τσάι του βουνού Φασκόμηλο Μελισσόχορτο Δεντρολίβανο Προετοιμασία μικροβιακών στελεχών Για την παρούσα πειραματική πορεία απαιτείται οι καλλιέργειες των μικροοργανισμών να βρίσκονται σε υγρή μορφή. Έτσι όλοι οι μικροοργανισμοί επωάζονται σε κατάλληλο στερεό θρεπτικό υλικό σε 2 ανακαλλιέργειες 24 ωρών έτσι ώστε να λάβουμε μεμονωμένες αποικίες. Στη συνέχεια παρασκευάζεται εναιώρημα για κάθε μικροοργανισμό δείκτη με την προσθήκη αποικιών από την στερεή καλλιέργεια στο αντίστοιχο υγρό θρεπτικό υλικό. Το τελικό εμβόλιο που θα χρησιμοποιηθεί θα πρέπει να είναι 1%. Για να έχει το εναιώρημα την επιθυμητή συγκέντρωση συγκρίνεται με McFarland 0,5 και γίνεται προσθήκη κυττάρων μέχρι επιθυμητής θολερότητας. [42]

44 4.2.2 Προετοιμασία διαλυμάτων βοτάνων Για τον προσδιορισμό της ελάχιστης συγκέντρωσης αναστολής τα λυοφιλιωμένα αφεψήματα αναδιαλύονται στο αντίστοιχο θρεπτικό υλικό που απαιτείται για το εκάστοτε στέλεχος (όπως φαίνεται στον πίνακα 2.6). Η διαδικασία αναδιάλυσης δεν διαφέρει σε τίποτα από εκείνη της πρώτης πειραματικής πορείας που είχε ως μέσο διάλυσης το νερό (βλ. κεφάλαιο 4.1.3). Παρασκευάζεται ένα αρχικό πυκνό διάλυμα εργασίας απ το οποίο προκύπτουν όλες οι προς μελέτη αραιώσεις. Εφόσον η συγκέντρωση 200mg/ml δοκιμάστηκε στην προηγούμενη πειραματική πορεία, εδώ ξεκινάμε με την αμέσως επόμενη πυκνότερη 100mg/ml. Πίνακας 2.6: Στελέχη και συνθήκες για τον προσδιορισμό των MIC. Μικροβιακά στελέχη Clostridium difficile ATCC 9689 Listeria monocytogenes DSM Staphylococcus aureus DSMZ 6784 Staphylococcus aureus DSMZ Enterococcus faecalis ATCC Enterococcus feacalis ATCC Υγρό θρεπτικό υπόστρωμα Brain heart Infusion broth (ενισχυμένο με μονοϋδρική κυστεΐνη 0,05%) Nutrient Broth Brain Heart Infusion broth Brain Heart Infusion broth Brain Heart Infusion broth Brain Heart Infusion broth Αντιβιοτικό Στρεπτομυκίνη, 1mg/mL Στρεπτομυκίνη, 1mg/mL Στρεπτομυκίνη, 1mg/mL Στρεπτομυκίνη, 1mg/mL Στρεπτομυκίνη, 1mg/mL Τεϊκοπλανίνη, 1mg/mL [43]

45 4.2.3 Προετοιμασία αντιβιοτικών Και στην παρούσα πειραματική πορεία απαραίτητη κρίνεται η χρήση θετικού και αρνητικού δείκτη αναφοράς. Θετικό δείκτη στην προκειμένη περίπτωση αποτελεί το εκάστοτε θρεπτικό υλικό χωρίς αυτό να εμβολιαστεί με τον μικροοργανισμό. Ενώ αρνητικό δείκτη αποτελεί και πάλι το κατάλληλο αντιβιοτικό για τον κάθε μικροοργανισμό. Όμως στην συγκεκριμένη περίπτωση, ως μέσο διάλυσής του χρησιμοποιείται το αντίστοιχο υγρό θρεπτικό υπόστρωμα κάθε φορά. Διαλύεται τέτοια ποσότητα αντιβιοτικού(streptomycin, teicoplanin) ώστε να έχουμε συγκέντρωση 1mg/ml. Η πειραματική πορεία αναλυτικά: Αντιδραστήρια όργανα: Αυτόματες πιπέττες ( μL), tips Plate reader Biotek,TECAN Αναδιαλυμένα αφεψήματα στα κατάλληλα υγρά υποστρώματα McFarland 0,5 Προπαρασκευασμένα διαλύματα αντιβιοτικών Θάλαμος νηματικής ροής (Laminar Flow) Αερόβιος επωαστικός θάλαμος 37 ο C Αναερόβιος επωαστικός θάλαμος 37 ο C Πλακίδια 96 βοθρίων Η διαδικασία ξεκινά με την παρατήρηση του προς μελέτη μικροοργανισμού στην 2 η εικοσιτετράωρη ανακαλλιέργειά του στο κατάλληλο στερεό θρεπτικό υπόστρωμα. Εφόσον η εικόνα του είναι τυπική και χωρίς επιμολύνσεις η πειραματική διαδικασία συνεχίζεται με την αναδιάλυση του λιωφιλιωμένου αφεψήματος με την ίδια διαδικασία όπως στο κεφάλαιο 4.1.3, αλλά χρησιμοποιώντας ως μέσο διάλυσης αποστειρωμένο υγρό θρεπτικό υλικό, κατάλληλο για κάθε μικροοργανισμό που μελετάται. Όλοι οι χειρισμοί γίνονται ασηπτικά και εντός του θαλάμου νηματικής ροής. [44]

46 Σε ειδικό πλακίδιο 96 βοθρίων (plate) τοποθετούνται: Στη σειρά A(1-6) 200μl διαλυμένου βοτάνου συγκέντρωσης 100mg/ml, στις σειρές B-G 100μl υγρού θρεπτικού υλικού. Και στην σειρά H 100μl αντιβιοτικού διαλυμένου σε θρεπτικό υλικό. Από την σειρά Α μετά από ανάδευση με την πιπέττα, μεταφέρονται 100μl στο αντίστοιχο βοθρίο της σειράς Β. Το tip αλλάζει και γίνεται ανάδευση στην σειρά Β και μεταφορά 100μl στην σειρά C. Η διαδικασία συνεχίζει με τον ίδιο τρόπο μέχρι και την σειρά F. Οι σειρές G και H χρησιμοποιούνται σαν control, η G περιέχει θρεπτικό υλικό ενώ η H αντιβιοτικό. Στο τέλος της διαδικασίας κάθε βοθρίο έχει περιεχόμενο 100μl. Ακολουθεί ο εμβολιασμός με 5μl εμβολίου 1%. Χρησιμοποιούνται 3 επαναλήψεις (βοθρία) για κάθε εμβολιασμό και 3 επαναλήψεις σαν αρνητικοί μάρτυρες που δεν εμβολιάζονται., Δηλαδή εμβολιάζονται τα (1-3) βοθρία κάθε σειράς Α-Η, ενώ τα (4-6) παραμένουν χωρίς εμβολιασμό. Πίνακας 2.7: συγκέντρωση αφεψήματος σε κάθε σειρά του plate Σειρά A B C D E F Συγκέντρωση αφεψήματος 100mg/ml 50mg/ml 25mg/ml 12.5mg/ml 6.25mg/ml 3.125mg/ml Μετά το εμβολιασμό τα πλακίδια μεταφέρονται στο plate reader και μετράται η οπτική πυκνότητα των βοθρίων (t=0) σε μήκος κύματος 600nm. Στη συνέχεια επωάζονται στους 37 ο C για 24h αερόβια ή αναερόβια αναλόγως τον μικροοργανισμό. Μετά την επώασή τους γίνεται οπτική παρατήρηση καθώς και ξανά μέτρηση της οπτικής πυκνότητας στο plate reader. [45]

47 Κεφάλαιο ΙΙΙ Αποτελέσματα/Συζήτηση [46]

48 1 Προετοιμασία των βακτηριακών καλλιεργειών για τον έλεγχο αντιμικροβιακής δράσης των βοτάνων με τη μέθοδο διάχυσης σε πηγάδι από άγαρ Όλες οι καλλιέργειες αναβιώνονται από την υπερ-κατάψυξη (-80 o C) και μεταφέρονται σε στερεό υπόστρωμα. Οι ανακαλλιέργειες ελέχγονται οπτικά σε στερεοσκόπιο, με δοκιμή καταλάσης, με χρώση Gram και παρατήρηση των κυττάρων στο μικροσκόπιο για επιβεβαίωση απουσίας επιμολύνσεων. Πίνακας 3.1: Αποτελέσματα χρώσης Gram και δοκιμής καταλάσης Μικροβιακά στελέχη Χρώση Gram (- αρνητικό, + θετικό) Δοκιμασία καταλάσης (- αρνητικό, + θετικό) 1. Salmonella choleriasuis DSMZ Salmonella enteritidis Clostridium difficile ATCC Listeria monocytogenes DSM Enterococcus faecalis ATCC Enterococcus faecalis ATCC Escherichia coli CIP Escherichia coli ATCC Staphylococcus aureus ATCC Staphylococcus aureus ATCC Helicobacter pylori CCUG Helicobacter pylori CCUG [47]

49 Ακολουθούν δύο συνεχείς 24h υγρές καλλιέργειες του κάθε στελέχους. Στη συνέχεια προετοιμάζεται το εμβόλιο που θα ενσωματωθεί στα τρυβλία στα οποία θα διανοιχθούν τα πηγάδια και θα γίνει ο έλεγχος της αντιμικροβιακής δράσης των βοτάνων (Κεφ. ΙΙ 4.1.4). 2 Αποτελέσματα της αντιμικροβιακής δράσης των βοτάνων με τη μέθοδο διάχυσης σε πηγάδι από άγαρ (Agar Well Difusion) Κατά την μέθοδο διάχυσης σε πηγάδι από άγαρ, η διάμετρος του πηγαδιού που δημιουργήθηκε μέσω φελλοτρυπητήρα, είναι 5mm και συμπεριλαμβάνεται στην διάμετρο που δημιούργησαν τα αφεψήματα των βοτάνων ή του αντιβιοτικού. Στην συγκεκριμένη μέθοδο για όλα τα αφεψήματα χρησιμοποιήθηκε συγκέντρωση 200mg/ml. Το εύρος της ζώνης που καταγράφεται παρακάτω αποτελεί τον μέσο όρο που τριών επαναλήψεων που πραγματοποιήθηκαν για κάθε μικροοργανισμό. Επίσης πρέπει να σημειωθεί πως δεκτές έγιναν μόνο οι διαυγείς ζώνες παρεμπόδισης. Στους πίνακες που παρατίθενται παρουσιάζονται οι διάμετροι (σε mm) των ζωνών αναστολής των κατά Gram αρνητικών και Gram θετικών βακτηρίων που χρησιμοποιήθηκαν. Πίνακας 3.2: Αποτελέσματα της Μεθόδου διάχυσης σε πηγάδι από άγαρ για τα Gram αρνητικά βακτήρια ( διάμετρος ζώνης σε mm) Βότανο (200mg/ml) Gram αρνητικά (-) βακτήρια S. choleriasuis DSMZ 554 S. enteritidis E. coli CIP E. coli ATCC H. pylori CCUG H. pylori CCUG Αντωναΐδα Δενδρολίβανο Δίκταμο Θρύμπα Θυμάρι Μαντζουράνα [48]

50 Ρίγανη Σπαθόχορτο Τσάι βουνού Φασκόμηλο Φλισκούνι Χαμομήλι Μελισσόχορτο Αντιβιοτικό 1mg/ml Πίνακας 3.3: Αποτελέσματα Μεθόδου διάχυσης σε πηγάδι από άγαρ για τα Gram θετικά βακτήρια (διάμετρος ζώνης σε mm) Βότανο (200mg/ml) Gram Θετικά (+) βακτήρια C. difficile ATCC 9689 L. monocytogenes DSM S. aureus DSMZ 6784 S. aureus DSMZ E. faecalis ATCC E. feacalis ATCC Αντωναΐδα Δενδρολίβανο Δίκταμο Θρύμπα Θυμάρι Μαντζουράνα Ρίγανη Σπαθόχορτο Σε όλα τα Gram αρνητικά βακτήρια χρησιμοποιήθηκε ως θετικός δείκτης παρεμπόδισης το αντιβιοτικό στρεπτομυκίνη σε συγκέντρωση 1mg/ml. [49]

51 Τσάι βουνού Φασκόμηλο Φλισκούνι Χαμομήλι Μελισσόχορτο Αντιβιοτικό 1mg/ml Ακολουθούν χαρακτηριστικές φωτογραφίες των τρυβλίων, κάποιων από τα βακτήρια που χρησιμοποιήθηκαν. Στις φωτογραφίες εμφανίζεται η ανάπτυξη του μικροοργανισμού καθώς και η κατά τόπους παρεμπόδισή της εξ αιτίας της δράσης των αφεψημάτων ή των αντιβιοτικών. Εικόνα 3.1: Η μέθοδος διάχυσης σε πηγάδι από Άγαρ για το Gram (+) Clostridium difficile 2 Στα Gram θετικά βακτήρια χρησιμοποιήθηκε ως θετικός δείκτης παρεμπόδισης το αντιβιοτικό στρεπτομυκίνη σε συγκέντρωση 1mg/ml, σε όλα εκτός από Enterococcus faecalis ATCC 51299, στο οποίο θετικός δείκτης ήταν το αντιβιοτικό τεϊκοπλανίνη σε συγκέντρωση 1mg/ml [50]

52 Εικόνα 3.2: Η μέθοδος διάχυσης σε πηγάδι από άγαρ για το Gram (+) Listeria monocytogenes Εικόνα 3.3: Η μέθοδος διάχυσης σε πηγάδι από άγαρ για το Gram (+) Staphylococcus aureus DSMZ 6784 [51]

53 Εικόνα 3.4: Η μέθοδος διάχυσης σε πηγάδι από άγαρ για το Gram (+) Staphylococcus aureus DSMZ Όπως παρατηρούμε από τους πίνακες των αποτελεσμάτων, τα αφεψήματα έδειξαν μεγαλύτερη ανασταλτική δράση έναντι των Gram θετικών βακτηρίων σε σύγκριση με τα Gram αρνητικά. Από τα Gram αρνητικά βακτήρια, τα αφεψήματα φάνηκαν να είναι περισσότερο παρεμποδιστικά έναντι των δύο στελεχών του γένους Helicobacter. Στην περίπτωση του γένους Helicobacter μάλιστα παρατηρούνται και τα μεγαλύτερα εύρη διαμέτρων ζωνών μεταξύ όλων των βακτηρίων που εξετάστηκαν. Γεγονός που φανερώνει αυξημένη ευαισθησία των στελεχών προς τα υδατικά εκχυλίσματα των βοτάνων. Στη περίπτωση των υπόλοιπων Gram αρνητικών βακτηρίων παρατηρήθηκε η τάση δημιουργίας ζώνης περιμετρικά του σημείου της έγχυσης για κάποια αφεψήματα, χωρίς όμως να παρατηρείται διαύγεια. Αυτό που παρατηρήθηκε ήταν μειωμένη ανάπτυξη σε σύγκριση με την ανάπτυξη του μικροοργανισμού στα υπόλοιπα σημεία του τρυβλίου. Το φαινόμενο μάλιστα εμφανίστηκε και [52]