ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΣΤΙΣ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΕΣ ΕΠΙΣΤΗΜΕΣ ΚΑΙ ΤΗΝ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΜΕ KATEΥΘΥΝΣΗ

Transcript

1 ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΣΤΙΣ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΕΣ ΕΠΙΣΤΗΜΕΣ ΚΑΙ ΤΗΝ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΜΕ KATEΥΘΥΝΣΗ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΑ ΦΥΣΙΚΑ ΠΡΟΙΟΝΤΑ Εποχιακή ανάλυση αιθέριου ελαίου και πολυφαινολών σε φύλλα κλαδίσκων των ειδών Salvia pomifera & Salvia fruticosa τα οποία καλλιεργούνται στον Βοτανικό Κήπο ΑΝΑΣΤΑΣΟΠΟΥΛΟΣ ΓΙΑΝΝΗΣ ΓΕΩΠΟΝΟΣ MSc ΠΑΤΡΑ 2018

2 ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Φωτεινή Λάμαρη (επιβλέπουσα καθηγήτρια) Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Τμήματος Φαρμακευτικής Πανεπιστημίου Πατρών Βασιλική Μαγκαφά Επίκουρη καθηγήτρια Τμήματος Φαρμακευτικής Πανεπιστημίου Πατρών Γεώργιος Πάιρας Αναπληρωτής Καθηγητής Τμήματος Φαρμακευτικής Πανεπιστημίου Πατρών ii

3 Η παρούσα ΜΔΕ αφιερώνεται στην οικογένεια μου που με στηρίζει όλα αυτά τα χρόνια και στη μητέρα μου, η οποία μου δίδαξε πως τα εμπόδια στη ζωή είναι για να ξεπερνιούνται iii

4 Ευχαριστίες H παρούσα διπλωματική μελέτη εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Φαρμακογνωσίας και Χημείας Φυσικών Προϊόντων του Τμήματος Φαρμακευτικής του Πανεπιστημίου Πατρών, στο πλαίσιο του Μεταπτυχιακού Προγράμματος Σπουδών στις Φαρμακευτικές Επιστήμες & στην Τεχνολογία. Κατά το διάστημα της φοίτησής μου πήρα τα εφόδια της γνώσης, της υπομονής και της επιμονής καθώς και ανέπτυξα κριτικό πνεύμα, στοιχεία απαραίτητα για τον σύγχρονο επιστήμονα που ασχολείται όχι μόνο με την εργαστηριακή έρευνα αλλά και με κάθε προέκταση αυτού που καλείται επιστήμες της ζωής και θετικές επιστήμες. Κατάφερα να σκέφτομαι ευρύτερα και συμπληρωματικά με τις προηγούμενες γνώσεις και εμπειρίες μου ως γεωπόνος, αναλύοντας σε βάθος κάθε τι, γιατί και πώς, έχοντας κατά νου ότι ο μεγαλύτερος αντίπαλος είναι ο ίδιος μας ο εαυτός και ο μεγαλύτερος σύμμαχος για να κάνουμε ένα βήμα μπροστά η συνεχής προετοιμασία. Για όλα αυτά και για πολλά περισσότερα τα οποία δεν μπορούν να αποδοθούν επιτυχώς σε έναν πρόλογο, θα ήθελα να ευχαριστήσω από καρδιάς την επιβλέπουσα καθηγήτριά μου κ. Φωτεινή Λάμαρη τόσο για την άψογη συνεργασία που είχαμε όσο και για το ενδιαφέρον, την εμπιστοσύνη και την στήριξη που μου έδειξε. Οικεία φυσιογνωμία με πολλές γνώσεις ήταν πάντα εκεί όταν την είχα ανάγκη για κάθε ερώτηση που είχα να κάνω. Η παρουσία της και οι συμβουλές της ήταν καταλυτικές για την εξέλιξή μου στις αναλύσεις φυτών. Ακολούθως, θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά την κ. Βασιλική Μαγκαφά η οποία πάντα εξέφραζε το ενδιαφέρον της και την στοργή της συνδεδεμένα με την πολύτιμη βοήθεια σε τυχόν καθημερινά προβλήματα του εργαστηρίου ή του επικουρικού έργου που άσκησα. Επιπλέον θα ήθελα να ευχαριστήσω τον κάθε ένα που γνώρισα και συνεργάστηκα. Την κ. Πέγκυ Λεονταρίτου η οποία με εισήγαγε στον κόσμο των αναλύσεων του GC- MS και της οργάνωσης των πειραματικών δεδομένων. Με δίδαξε με τεράστια επιμονή και εργατικότητα και της χρωστάω πολλά καθώς ήταν πάντα παράδειγμα θετικής αύρας και μεταδοτικότητας των γνώσεων. Την κ. Βιργινία Δημάκη η οποία πάντα ήταν πρόθυμη να απαντήσει στις απορίες μου και να μου εξηγήσει τυχόν χημικές έννοιες άγνωστες σε εμένα. Την κ. Κωνσταντίνα Ζέλιου η οποία με βοήθησε πολύ στα αρχικά μου βήματα στο HPLC αλλά και σε στατιστικές έννοιες ως πολύ πιο iv

5 ώριμη ερευνητικά. Θα ήθελα πολύ να ευχαρισοτήσω επίσης τις κυρίες Κατερίνα Μπακογιάννη, Χριστίνα Λυμπεροπούλου και Φωτεινή Βούκλιζα οι οποίες με βοήθησαν στα αρχικά μου βήματα στο εργαστήριο και ήταν πάντα έτοιμες να απαντήσουν με χιούμορ σε κάθε ερώτηση. Η λίστα είναι ακόμα πιο μεγάλη καθώς κάθε συνεργάτης ασκούσε επίδραση σε εμένα όπως και εγώ σε αυτόν, οπότε ευχαριστώ ξεχωριστά όσους σεβάστηκαν τη δουλειά μου και περάσαμε στιγμές στο εργαστήριο και έξω από αυτό. Συμπληρωματικά να ευχαριστήσω θερμά τις προπτυχιακές φοιτήτριες κ.κ. Ελένη Ταρνάρη, Μαρία Σταμάτη και Μαρία Λουκά οι οποίες βοήθησαν σε ένα μεγάλο μέρος των αναλύσεων όταν χρειάστηκε και αναγνωρίζω το άριστο ήθος και την εργατικότητά τους. Τέλος ευχαριστώ τον κ. Γεώργιο Πάιρα για τη συναίνεσή του στην τριμελή επιτροπή αλλά και για το ενδιαφέρον που έδειξε στα πλαίσια συνεργασίας που είχα με το εργαστήριο του και τυχόν τεχνικές δυσκολίες ή ελλείψεις αναλώσιμων που πάντα αντιμετώπιζε με καλή διάθεση. Από την λίστα αυτή δεν θα μπορούσε να λείψει ο κ. Δημήτρης Βαχλιώτης και το Κέντρο Ενόργανης Ανάλυσης του Πανεπιστημίου Πατρών, καθώς συνέβαλε στις αναλύσεις με άψογο τρόπο, όπως επίσης και όσοι καθηγητές του τμήματος φαρμακευτικής με δίδαξαν πολύ χρήσιμα πράγματα κατά τις παραδόσεις τους στα μαθήματα κορμού αυτού του ΜΠΣ. v

6 Περιεχόμενα ΠΕΡΙΛΗΨΗ xv ABSTRACT xvii 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Τα αρωματικά φυτά Τα αιθέρια έλαια Ιστορική αναδρομή Το γένος Salvia Η χρήση του φασκόμηλου στο πέρασμα των αιώνων Τα είδη Salvia στην Ελλάδα Διασπορά των φυτών Μορφολογία Χημική σύσταση αιθέριου ελαίου φυτών Salvia Παραλλακτικότητα αιθέριων ελαίων Εποχική παραλλακτικότητα Γεωγραφική παραλλακτικότητα Γενετική παραλλακτικότητα Παραλλακτικότητα λόγω ηλικίας φυτού Πολυφαινόλες της Salvia Εποχική διακύμανση Φαρμακευτικές ιδιότητες και θεραπευτική δράση Αντιμικροβιακή και μυκοστατική δράση Αντιική δράση Αντιοξειδωτική, αντιφλεγμονώδης δράση & παρεμπόδιση ογκογένεσης Αντιμεταλλαξιογόνος δράση Αντισπασμωδική δράση Υπογλυκαιμική δράση Εντομοαπωθητική δράση Τοξικότητα ΣΚΟΠΟΣ ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Υλικά και αντιδραστήρια Φυτικό υλικό Χημικά αντιδραστήρια και διαλύτες Όργανα και σκεύη 35 vi

7 3.2 Πειραματικές πορείες Απόσταξη-ανάλυση αιθερίου ελάιου με GC-MS Εκχύλιση φύλλων φασκόμηλου με τη βοήθεια υπερήχων In vitro αναλύσεις Προσδιορισμός ολικών φαινολών (ΤPC) με τη μέθοδο Folin Ciocalteu Προσδιορισμός ολικών φλαβονοειδών (TFC) με την μέθοδο AlCl Προσδιορισμός αντιοξειδωτικής ικανότητας ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ Εποχικότητα φαινολικών ενώσεων στο φασκόμηλο Ολικά φαινολικά Περιεκτικότητα σε Φλαβονοειδή Ικανότητα δέσμευσης ελευθέρων ριζών (DPPH μέθοδος) Αναγωγική ικανότητα (FRAP μέθοδος) Συσχέτιση in vitro αποτελεσμάτων Εποχικότητα αιθέριου ελαίου Απόδοση αιθέριου ελαίου και εποχική σύγκριση Ποιοτική και ποσοτική σύσταση ελαίου ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ 95 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 114 vii

8 Περιεχόμενα πινάκων Πίνακας 1: Πρόγραμμα ανάλυσης GC-MS που ακολουθήθηκε για το αιθέριο έλαιο S. fruticosa. Πίνακας 2: Πρόγραμμα ανάλυσης GC-MS που ακολουθήθηκε για το αιθέριο έλαιο S. pomifera. Πίνακας 3: Συγκέντρωση ολικών φαινολικών (ΜΟ ± Τυπική Απόκλιση) για κάθε άτομο φασκόμηλου (mg GA/mg DW ξηρού εκχυλίσματος) σε κάθε εποχή (n=3) και για κάθε πληθυσμό (n=4, n=5, n=5). Πίνακας 4: Συγκέντρωση φλαβονοειδών (mg Que/mg DW ξηρού εκχυλίσματος ) για κάθε άτομο φασκόμηλου (n=3) σε κάθε εποχή. Δίνεται ο μέσος όρος (ΜΟ) ± τυπική απόκλιση (T.A.) για κάθε πληθυσμό και συνολικά για όλα τα φυτά. Πίνακας 5: Αποτελέσματα από τις μετρήσεις με τη μέθοδο DPPH για κάθε καλοκαιρινό δείγμα φασκόμηλου Τα IC50 (μg/ml) υπολογίστηκαν με το πρόγραμμα Graphpad (Ν=3). Πίνακας 6: Αποτελέσματα ανάλυσης αντιοξειδωτικών με τη μέθοδο FRAP. Πίνακας 7: Συσχέτιση μεταξύ των μεθόδων ανάλυσης που πραγματοποιήθηκαν για τα καλοκαιρινά δείγματα φασκόμηλου. Πίνακας 8: Συσχέτιση των αποτελεσμάτων ΤPC & TFC για κάθε εποχή. Πίνακας 9: Απόδοση αιθέριου ελαίου (ml/100 g ξηρής δρόγης) για κάθε άτομο του πληθυσμού S. fruticosa της Αχαΐας σε κάθε εποχή. Πίνακας 10: Απόδοση αιθέριου ελαίου (ml/100 g ξηρής δρόγης) για τον πληθυσμό Μεσσηνίας για κάθε εποχή. Πίνακας 11: Απόδοση αιθέριου ελαίου (ml/100 g DW ) για τον πληθυσμό Αρκαδίας σε κάθε εποχή. Πίνακας 12: Κύρια συστατικά S. fruticosa κατά την καλοκαιρινή περίοδο συγκομιδής για τους πληθυσμούς Αχαΐας & Μεσσηνίας. viii

9 Πίνακας 13: Κύρια συστατικά αιθέριου ελαίου του πληθυσμού Αρκαδίας (S. pomifera) κατά την καλοκαιρινή συγκομιδή. Πίνακας 14: Ποσοστά % των κύριων συστατικών ανά εποχή (Μ.Ο., ±Τ.Α, n=5) για τον πληθυσμό Αχαΐας. Πίνακας 15 : Ποσοστά % των κύριων συστατικών ανά εποχή (Μ.Ο., ±Τ.Α, n=5) για τον πληθυσμό Μεσσηνίας. Πίνακας 16 : Ποσοστά % των κυριότερων συστατικών μεταξύ των πληθυσμών Αχαΐας Μεσσηνίας κατά την καλοκαιρινή συγκομιδή (Μ.Ο., ±Τ.Α, n=5). Πίνακας 17: Ποσοστά % των κύριων συστατικών ανά εποχή (Μ.Ο., ±T.A, n=4) για τον πληθυσμό Αρκαδίας. Περιεχόμενα εικόνων Εικόνα 1: Διασπορά των ειδών Salvia στη Μεσόγειο. Εικόνα 2: Salvia fruticosa. Διακρίνονται τα ανοικτόχρωμα πράσινα φύλλα του με τρίπτυχο σχηματισμό φυλλαρίων. Βοτανικός κήπος Πανεπιστημίου Πατρών. Εικόνα 3: Salvia pomifera ssp calycina. Διακρίνονται τα κυματοειδή φύλλα του με έντονες εγκολπώσεις. Βοτανικός κήπος Πανεπιστημίου Πατρών. Εικόνα 4: Το φυτό Salvia officinalis. Εικόνα 5: Ποσοστά (%) κύριων συστατικών σε διαφορετικά είδη φασκόμηλου στην Ελλάδα. Εικόνα 6: Κύρια συστατικά (%) του αιθέριουελαίου S. fruticosa από 15 ενδιαιτήματα. Εικόνα 7: Κύρια συστατικά (%) S. pomifera ssp calycina από το όρος Πάρνηθας κατά το καλοκαίρι. Εικόνα 8: Τα κυριότερα φαινολικά συστατικά του φασκόμηλου Εικόνα 9: Φαινολικά οξέα φασκόμηλου. ix

10 Εικόνα 10: Φαινολικά συστατικά από πληθυσμούς S. pomifera & S. fruticosa. Εικόνα 11: Αέριος χρωματογράφος συνδεδεμένος με φασματοφωτόμετρο μαζών (Agilent Technologies). Εικόνα 12: Διάταξη απόσταξης φασκόμηλου με συσκευή Clevenger. Εικόνα 13: Δείγμα αιθέριου ελαίου φασκόμηλου κατόπιν φυγοκέντρησης. Εικόνα 14: Διάταξη εκχύλισης με USE μεθοδολογία. Εικόνα 15: Συμπυκνωτής με εκχύλισμα φασκόμηλου προς συμπύκνωση. Εικόνα 16: Αντίδραση φαινόλης με το αντιδραστήριο Folin-Ciocalteu και τα προϊόντα της αντίδρασης. Εικόνα 17: Μέθοδος Folin-Ciocalteu. Μικροπλάκα μετά από επώαση 30 min. Τα μεθανολικά εκχυλίσματα φασκόμηλου έχουν αντιδράσει και έδωσαν μπλέ χρώμα, ενώ αντίθετα τα κελία με το τυφλό δείγματος (χωρίς αντιδραστήριο F-C) είναι σχεδόν άχρωμα. Εικόνα 18: Κέντρα πρόσδεσης αντιδραστηρίου στο σκελετό φλαβονοειδών στη μέθοδο AlCl3. Εικόνα 19: Μέθοδος προσδιορισμού φλαβονοειδών. Μικροπλάκα μετά από επώαση 45 min. Τα κελία με το μεθανολικό εκχύλισμα φασκόμηλου έχουν αντιδράσει δίνοντας κίτρινο χρώμα. Αντίθετα τα τυφλά δείγματος (χωρίς AlCl3) είναι σχεδόν διαφανή. Εικόνα 20: Αναγωγή του συμπλόκου Fe 3+ -ΤPTZ σε Fe 2+ -ΤPTZ παρουσία αντιοξειδωτικού. Εικόνα 21: Μικροπλάκα μετά από επώαση 5 min με τη μέθοδο FRAP. Τα κελία με το μεθανολικό εκχύλισμα φασκόμηλου έχουν αντιδράσει δίνοντας μπλε χρώμα. Αντίθετα τα τυφλά δείγματος (Blank δείγμα) είναι σχεδόν διαφανή. Εικόνα 22: Η ρίζα του DPPH αρχικά σε μορφή διφαινυλοπικρυλοϋδραζίνης και σε μορφή ελεύθερης ρίζας (ρίζα διφαινυλοπικρυλοϋδράζυλο-ρίζα). x

11 Εικόνα 23: Μικροπλάκα μετά από επώαση 30 min με τη μέθοδο DPPH. Τα κελία με το μεθανολικό εκχύλισμα φασκόμηλου έχουν αντιδράσει δίνοντας κίτρινο χρώμα. Οι μεγαλύτερες συγκεντρώσεις δείγματος (καλύτερη αντιοξειδωτική δράση) βρίσκονται στα αριστερα της πλάκας με κίτρινους χρωματισμούς. Οι αραιότερες είναι αυτές που παρέμειναν μωβ (χρώμα αντιδραστηρίου). Εικόνα 24: Πρότυπη καμπύλη για τη μέθοδο F-C με την πρότυπη ένωση γαλλικό οξύ. Οι συγκεντρώσεις που χρησιμοποιήθηκαν ήταν: 0,250 mg/ml 0,200 mg/ml 0,150 mg/ml 0,125 mg/ml 0,100mg/mL και 0,050 mg/ml στα 620 nm. Εικόνα 25: Εποχική σύγκριση του φαινολικού φορτίου (TPC σε mg GA/mg DW ξηρού εκχυλίσματος) για κάθε άτομο (n=3) σε κάθε εποχή (αντιστοιχεί στον πίνακα 1). Με σχόλια [f1]: Γιάννη, Με έχει κουράσει ο έλεγχος της αρίθμησης των εικόνων γιατί πρέπει να συμφωνεί και με το κείμενο. Κάνε το προσεχτικά όλο. Εικόνα 26: Εποχική σύγκριση κατά μέσο όρο του φορτίου πολυφαινολών (TPC) όλων των φυτών για κάθε εποχή. Τα όμοια γράμματα δηλώνουν την έλλειψη στατιστικώς σημαντικής διαφοράς (p<0,05). Τα φυτά της ανοιξιάτικης συγκομιδής έχουν τη μέγιστη τιμή σε TPC ακολουθούν κατά σειρά ο χειμώνας, το καλοκαίρι και το φθινόπωρο.. Εικόνα 27: Eποχική διακύμανση ΤPC μεταξύ των πληθυσμών φασκόμηλου ανά εποχή συγκομιδής. Δεν παρατηρείται στατιστικώς σημαντική διαφορά σε επίπεδο σημαντικότητας p<0,05 (n=5 για τους πληθυσμούς Αχαΐας-Μεσσηνίας ενώ n=4 για τον πληθυσμό Αρκαδίας). Εικόνα 28: Πρότυπη καμπύλη κερσετίνης (Que) για τη μέθοδο AlCl3. Οι συγκεντρώσεις που χρησιμοποιήθηκαν ήταν: 1,0 mg/ml 0,8 mg/ml 0,5 mg/ml 0,3 mg/ml 0,2 mg/ml 0,1 mg/ml. Εικόνα 29: Eποχική σύγκριση φλαβονοειδών (mg que/mg DW ξηρού εκχυλίσματος) (TFC) για κάθε άτομο ανά εποχή (αντιστοιχεί στον Πίνακα 2, n=3). Εικόνα 30: Εποχική σύγκριση κατά μέσο όρο των φλαβονοειδών (TFC) όλων των φυτών για κάθε εποχή.τα όμοια γράμματα δηλώνουν την έλλειψη στατιστικώς σημαντικής διαφοράς.(p<0,05) Η άνοιξη έχει τη μέγιστη τιμή, ακολουθούν κατά σειρά χειμώνας, καλοκαίρι, φθινόπωρο. xi

12 Εικόνα 31: Eποχική διακύμανση ΤFC μεταξύ των πληθυσμών φασκόμηλου. Δεν παρατηρείται διαφορά σε επίπεδο σημαντικότητας p<0.05 (n=5 για τους πληθυσμούς Αχαΐας-Μεσσηνίας ενώ n=4 για τον πληθυσμό Αρκαδίας). Εικόνα 32: Τιμές IC50 από τη μέθοδο DPPH για κάθε άτομο φασκόμηλου κατά την καλοκαιρινή περίοδο συγκομιδής (n=3). Εικόνα 33: Tιμές IC50 από τη μέθοδο DPPH ανά πληθυσμό φυτών κατά την καλοκαιρινή περίοδο συγκομιδής (n=4 Αρκαδία, n=5 Αχαΐα & Μεσσηνία). Eικόνα 34: Καμπύλη πρότυπου αντιοξειδωτικού BHT=11,62±1,03 σε συγκεντρώσεις: 100, 80, 50, 30, 20, 10, 5, 2,5, 1,25 μg/ml, (n=3). Eικόνα 35: Καμπύλη πρότυπου αντιοξειδωτικού VitC=8,77±4,92 σε συγκεντρώσεις: 100, 80, 50, 30, 20, 10, 5, 2,5, 1,25 μg/ml, (n=3). Εικόνα 36: Καμπύλη IC50 των καλοκαιρινώνδειγμάτων φασκόμηλου σε συγκεντρώσεις 100, 80, 50, 30, 20, 10, 5, 2,5, 1,25 μg/ml,( n=3). Εικόνα 37: Σύγκριση καμπύλης IC50 για τον κάθε πληθυσμό φυτών. Εικόνα 38: Πρότυπη καμπύλη θειικού σιδήρου η οποία χρησιμοποιήθηκε στην μέθοδο Ferric Reducing Antioxidant Power. Οι συγκεντρώσεις που χρησιμοποιήθηκαν ήταν: 2,000 mg/ml, 1,200 mg/ml, 0,700 mg/ml, 0,350 mg/ml 0,175 mg/ml και 0,087 mg/ml. Eικόνα 39: Tιμές αντιοξειδωτικού δυναμικού από τη μέθοδο FRAP ανά άτομο φασκόμηλου για την καλοκαιρινή περίοδο συγκομιδής (n=3). Eικόνα 40: Τιμές αντιοξειδωτικού δυναμικού από τη μέθοδο FRAP ανά πληθυσμό φασκόμηλου κατά την καλοκαιρινή περίοδο συγκομιδής (n=3). Εικόνα 41: Εποχική σύγκριση αιθέριου ελαίου μεταξύ πληθυσμού Αχαΐας (ml/100 g DW) (S. fruticosa) a: ο χειμώνας διαφέρει με την άνοιξη και b: η άνοιξη διαφέρει από το καλοκαίρι για p<0,05. Εικόνα 42: Εποχική σύγκριση αιθέριου ελαίου για τον πληθυσμό Μεσσηνίας (ml/100 g DW) (S. fruticosa), a: ο χειμώνας διαφέρει από την άνοιξη και b: η άνοιξη διαφέρει από το καλοκαίρι για p<0,05. xii

13 Εικόνα 43: Εποχική σύγκριση αιθέριουελαίου (ml/100 g DW) για τον πληθυσμό Αρκαδίας (S.pomifera) (n=4 άτομα), a: ο χειμώνας διαφέρει από το καλοκαίρι, b: η άνοιξη διαφέρει από το καλοκαίρι, c: το καλοκαίρι διαφέρει από το φθινώπορο για p<0,05. Εικόνα 44: Σύγκριση απόδοσης αιθέριουελαίου μεταξύ των 3 πληθυσμών για το καλοκαίρι. Τα αποτελέσματα είναι στατιστικώς σημαντικά για p<0,05 *: ο πληθυσμός Αρκαδίας διαφέρει από τον πληθυσμό Αχαίας,**: ο πληθυσμός Αρκαδίας διαφέρει από εκείνον της Μεσσηνίας. Εικόνα 45: Χρωματογράφημα του δείγματος Ν12 καλοκαίρι (S. fruticosa, πληθυσμός Μεσσηνίας. Εικόνα 46: Χρωματογράφημα του δείγματος Ν14 καλοκαίρι (S. pomifera, πληθυσμός Aρκαδίας). Eικόνα 47: Τερπενοειδή συστατικά από το αιθέριο έλαιο S. fruticosa & S.pomifera. Εικόνα 48: Εποχική διακύμανση συστατικών αιθέριου ελαίου για τον πληθυσμό Αχαΐας με εκείνα των οποίων οι διαφορές μεταξύ εποχών ήταν στατιστικά σημαντικές σεp<0,05, wi=χειμώνας, sp=άνοιξη, su=καλοκαίρι, au=φθινόπωρο, *στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ pinene-a, **στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ eucalyptol, ***στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ thujone-trans,!στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ caryophyllene-z,!! στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ caryophyllene oxide. Εικόνα 49: Εποχική διακύμανση συστατικών αιθέριου ελαίου για τον πληθυσμό Μεσσηνίας, των οποίων οι διαφορές μεταξύ εποχών ήταν στατιστικά σημαντικές σε P<0.05, wi=χειμώνας, sp=άνοιξη, su=καλοκαίρι, au=φθινόπωρο, *στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ pinene-a, **στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ camphene, *** στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ pinene-β, #στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ eucalyptol,!στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ thujone-cis,!!στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ thujone-trans, Øστατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ caryophyllene-z, στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ caryophyllene oxide. xiii

14 Εικόνα 50: Σύγκριση συστατικών αιθέριουελαίου για τους 2 πληθυσμούς (Αχαΐα- Μεσσηνία) κατά το καλοκαίρι των οποίων οι διαφορές ήταν στατιστικά σημαντικές (p<0,05). *σύγκριση pinene-α, **σύγκριση camphene, ***σύγκριση eucalyptol,!σύγκριση terpinene-γ,!!σύγκριση camphor, #σύγκριση terpineol-δ, ##σύγκριση caryophyllene oxide. Εικόνα 51: Εποχική διακύμανση συστατικών αιθέριου ελαίου για τον πληθυσμό Αρκαδίας, με εκείνα των οποίων οι διαφορές μεταξύ εποχών ήταν στατιστικά σημαντικές σε P<0.05, wi=χειμώνας, sp=άνοιξη, su=καλοκαίρι, au=φθινόπωρο, *στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ cubebene-α, **στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ copaene-α, *** στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ caryophyllene-e,!στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ cubebol,!!στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ cadinene-δ. xiv

15 Περίληψη Οι τάσεις της εποχής προστάζουν στροφή προς τα φυσικά προϊόντα ή προϊόντα γενικώς που προέρχονται από προγράμματα ολοκληρωμένης-βιολογικής διαχείρισης φυτών, με σκοπό τη χρήση τους ως συμπληρώματα διατροφής, βελτιωτικά γεύσης και αρώματος, θεραπευτικά μέσα, μέσα αύξησης της συντηρησιμότητας των τροφίμων αλλά και ως αγροχημικά. Το φασκόμηλο είναι ένα από τα πιο χαρακτηριστικά φαρμακευτικά φυτά της οικογένειας Lamiaceae. Χρησιμοποιείται στη μαγειρική αλλά είναι κυρίως γνωστό για τις θεραπευτικές του χρήσεις επί χιλιετίες. Το όνομά του γένους Salvia δηλώνει την θεραπευτική του δράση καθώς στα λατινικά σημαίνει σώζω. Η μελέτη της χημικής σύστασης των φαρμακευτικών φυτών είναι πολύ σημαντική για την εκτίμηση της ασφάλειας και της τοξικότητας, της αποτελεσματικότητας αλλά και πιθανών νοθειών. Έρευνες των τελευταίων δεκαετιών δείχνουν τη βιολογική δράση του φυτού ως αντιμικροβιακό, αντιοξειδωτικό, αντιφλεγμονώδες, χημειοπροστατευτικό, εντομοαπωθητικό κ.ά. Εξηγούν δε αυτές τις δράσεις ως αποτέλεσμα της χημικής σύστασης του φυτού πλούσιας σε πολυφαινολικές ενώσεις και τερπενοειδή. Επιπροσθέτως το αιθέριο έλαιο του φυτού κατέχει και αυτό υψηλή βιολογική δράση. Αποτελείται κυρίως από τερπενοειδή και άλλα παράγωγά τους και παρουσιάζει μεγάλη παραλλακτικότητα μεταξύ διαφορετικών ειδών φασκόμηλου αλλά και στο ίδιο είδος σε επίπεδο πληθυσμών. Στην παρούσα μελέτη μελετήθηκαν φυτά φασκόμηλου από την Δυτική Ελλάδα των ειδών S. fruticosa και S. pomifera. Πιο συγκεκριμένα, κλωνίσκοι από τρεις διαφορετικούς πληθυσμούς (Αχαΐας-Μεσσηνίας-Αρκαδίας) καλλιεργήθηκαν στον Βοτανικό Κήπο και αναλύθηκαν εποχικά ως προς τη σύσταση και την απόδοση του αιθέριουελαίου τους καθώς και για τις ποσότητες πολυφαινολών (TPC) αλλά και φλαβονοειδών τους (TFC). Επιπλέον, έγινε εκτίμηση του αντιοξειδωτικού δυναμικού τους με τις μεθόδους FRAP και DPPH κατά την καλοκαιρινή περίοδο συγκομιδής η οποία συμπίπτει με την καθιερωμένη εποχή συγκομιδής στην περιοχή μας. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το TPC και το TFC διέφεραν μεταξύ των εποχών και είχαν μέγιστη τιμή κατά την άνοιξη. Η ανάλυση αντιοξειδωτικού φορτίου με DPPH έδειξε ότι τα δείγματα είχαν κατά το καλοκαίρι καλό αντιοξειδωτικό προφίλ (IC50=19,98±6,13 μg/ml) συγκρινόμενα με τις πρότυπες αντιοξειδωτικές ενώσεις xv

16 BHT και βιταμίνη C (IC50=11,62±1,03 και 8,77±4,92 μg/ml, αντίστοιχα). Συμπληρωματικά η FRAP ανάλυση έδωσε τιμή κατά μέσο όρο 9,69±1,29 mmol FeSO4/g ξηρού εκχυλίσματος. Αναφορικά με το αιθέριο έλαιο των φυτών η μέγιστη απόδοση παρατηρήθηκε κατά το καλοκαίρι ενώ η ελάχιστη κατά την άνοιξη. Τα βασικά συστατικά του S. fruticosa για όλες τις εποχές ήταν η ευκαλυπτόλη (30,38-41,87%), η καμφορά (4,99-9,13%), η βιριδιφλορόλη (2,27-6,51%), το καρυοφυλλένιο-β (3,44-6,37%), η μανοόλη (1,71-6,28%), το πινένιο-β (2,44-5,33%) και το πινένιο-α (2,25-4,39%). Αντίθετα για το S. pomifera ήταν η θυϊόνη-β (11,6-33,48%), η ευκαλυπτόλη (3,72-13,11%), η κουμπεμπόλη (3,98-9,82%), το καρυοφυλλένιο-ε (3,44-6,37%), το μυρκένιο (5,24-7,46%), το κουμπεμπένιο-α (2,59-5,69%) και το μουρολένιο-γ (1,45-5,09%). Τα έλαια διέφεραν τόσο μεταξύ των διαφορετικών ειδών όσο και σε επίπεδο πληθυσμών αλλά και κατά το πέρας των εποχών. Το έλαιο του S. pomifera παρουσίασε υψηλά επίπεδα θυϊόνης πράγμα το οποίο εφιστά την προσοχή του καταναλωτή καθώς πρόκειται για νευροτοξική ουσία. Συμπερασματικά η καλύτερη περίοδος συγκομιδής του φασκόμηλου ως προς την απόδοση αιθέριου ελαίου για την περιοχή μας ήταν αυτή του καλοκαιριού, ενώ η άνοιξη δείχνει να έρχεται πρώτη σε σύνολο πολυφαινολικών ουσιών και φλαβονοειδών με έντονο αντιοξειδωτικό δυναμικό. Σε κάθε περίπτωση το φασκόμηλο μπορεί να αποτελέσει ένα πολλά υποσχόμενο φυτό για καλλιέργεια με χαμηλές εισροές και μεγάλη υπεραξία των δευτερογενών προϊόντων του μεταβολισμού του. xvi

17 Αbstract Recently, a trend towards the use of organic products or products derived from an integrated-biological farming management system has been observed amongst consumers. Such products range from food supplements and therapeutics to preservatives and pesticides. One of the most prominent examples of plants used for such purposes is sage. Although it is often used in cooking nowadays, its therapeutical value has been known for centuries. Actually, its scientific name Salvia derives from the Latin word salvere which means savior. Studying the chemical composition of medicinal plants is very important in order to assess their safety, toxicity and quality. Studies in the past decades have shown that sage has many biological properties such as antibacterial, antioxidant, anti-inflammatory, chemoprotective, insect repellent, etc. These traits are a result of the plants chemical compounds, as it is rich in polyphenolics and terpenoids constituents. Moreover, the essential oils of the plant are also of high biological value. It contains mainly terpenoids and other derivatives and has high variability among different species of sage and in same species as well (interand intra-species variation). In this thesis, Salvia plants from Western Greece, S. fruticosa and S. pomifera, were studied. Three different natural populations (Achaias-Messeneas-Arcadias) were cultivated in the Botanical garden and examined with respect to their composition, their essential oil yield and the total phenolic content (TPC) and total flavonoid content (TFC) as well. Moreover, its antioxidant capacity was assessed using the methods FRAP και DPPH, during the summer months which coincides with the established harvest season in our region and the highest oil yield. Results showed that quantities of TPC and of TFC vary among seasons, reaching their peak values during spring. The antioxidant profile of samples collected in summer using the DPPH method were very promising (IC50=19,98±6,13 μg/ml) in reference to BHT and vitamin C (IC50=11,62±1,03 and 8,77±4,92 μg/ml, respectively). FRAP analysis resulted in values of 9,69±1,29 mmol FeSO4/g of dry sample The highest yields in essential oil in all plants were observed during summer while the lowest yields were observed during spring. The main components of S. fruticosa for all seasons were eucalyptol (30,38-41,87%), camphor (4,99-9,13%), viridiflorol (2,27-6,51%), caryophyllene-β (3,44-6,37%), manool (1,71-6,28%), pinene-β (2,44- xvii

18 5,33%) and pinene-α (2,25-4,39%). Concerning the S. pomifera, the main components were thujone-β (11,6-33,48%), eucalyptol (3,72-13,11%), cubebol (3,98-9,82%), caryophyllene-ε (3,44-6,37%), myrcene (5,24-7,46%), cubebene (2,59-5,69%) and muurolene-γ (1,45-5,09%). Essential oil analysis showed differences among species as well as in the same population and seasonal variation. The essential oil of S. pomifera was high in thujone, which must be considered before any use since thujone is a neurotoxin. In conclusion the optimum harvest season in order to obtain high yields in essential oil is summer in our area, while spring seems ideal for high polyphenolic content. In any case, sage plant seems to be a promising plant to cultivate, even in extreme conditions, with low input and high price values of its secondary metabolites. xviii

19 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1.1 Τα αρωματικά φυτά Η Ελλάδα είναι η τρίτη πλουσιότερη σε χλωρίδα περιοχή παγκοσμίως. Φιλοξενεί το 50% της βιοποικιλότητας της Eυρώπης και το 80% της Βαλκανικής χερσονήσου. Στον χώρο αυτό φύονται περί τα είδη φυτών εκ των οποίων τα είναι αρωματικά φυτά (aromatics) (ΕΘΙΑΓΕ 2013). Το χαρακτηριστικό άρωμα των φυτών αυτών οφείλεται στην παρουσία αιθέριων ελαίων τα οποία είναι πτητικά και αναδύουν συχνά ευχάριστη οσμή. Περιέχονται δε σε ειδικούς εκκριτικούς αδένες, αγωγούς, ιδιόβλαστα κύτταρα ή σε κοιλότητες που βρίσκονται σε διάφορα τμήματα του φυτού ανάλογα με το είδος και την μορφολογία του. Φαρμακευτικό φυτό (medicinal plant) καλείται κάθε φυτό το οποίο περιέχει ένα ή περισσότερα δραστικά συστατικά, τα οποία έχουν την δυνατότητα να προλάβουν, να ανακουφίσουν ή να θεραπεύσουν ασθένειες (Σαρλής 1994). Διεθνώς τα φυτά αυτά ονομάζονται ως «Φαρμακευτικά & αρωματικά φυτά» (medicinal & aromatic plants, MAPs). Όλα τα φυτά που είναι αρωματικά είναι και φαρμακευτικά, αντιθέτως μερικά φαρμακευτικά φυτά δεν είναι αρωματικά (βαλσαμόχορτο, μπελαντόνα, κ.α). Τα φαρμακευτικά φυτά, που δεν είναι και αρωματικά αποτελούν μικρό αριθμό συγκριτικά με τα φυτά που φέρουν διττό χαρακτήρα (Κουτσός 2006). Οι θεραπευτικές τους ιδιότητες παρατηρήθηκαν από αρχαιοτάτων χρόνων και συνόδευσαν τον άνθρωπο σε όλη την εξέλιξή του. Ο πατέρας της ιατρικής Ιπποκράτης (460 π.χ), αργότερα ο Θεόφραστος (347 π.χ), και ο Διοσκουρίδης (1 ος αιώνας π.χ) στο έργο του «Περί ύλης ιατρικής», αναφέρθηκαν στη θεραπευτική σημασία αυτών των φυτών και τα κατέγραψαν. Εξέχουσα αξία είχαν τα αρωματικά φυτά και σε άλλους πολιτισμούς εκτός του ελληνικού, όπως στους Κινέζους, τους Αιγύπτιους, τους Βαβυλώνιους και τους Σουμέριους. Τα αρωματικά φυτά που ανήκουν στις οικογένειες Lamiaceae, Iridaceae, Rutaceae, Rosaceae, Apiaceae, Asteraceae, Μyrtaceae χαίρουν σημαντικής εμπορικής αξίας. Φυτά που ανήκουν στις εν λόγω οικογένειες και χρησιμοποιούνται ευρέως είναι ο 1

20 βασιλικός (Ocimum basilicum), το φασκόμηλο (Salvia sps.), η λεβάντα (Lavandula sps.), το θυμάρι (Thymus spp.), ο δίκταμος (Origanum dictamus), ο κρόκος (Crocus sativus), το τσάι του βουνού (Sideritis sps.), ο γλυκάνισος (Pimpinella anisum), το μελισσόχορτο (Melissa officinalis), το χαμομήλι (Μatricaria chamomilla), ο ευκάλυπτος (Eucalyptus spp.), ο μάραθος (Foeniculum vulgare), η μαντζουράνα (Origanum majorana), η μέντα (Mentha piperita). Τα αρωματικά φυτά έχουν μεγάλη ζήτηση παγκοσμίως διότι τα τελευταία χρόνια παρατηρείται αλλαγή του τρόπου ζωής και των διατροφικών συνηθειών με στροφή προς το «εύ ζην». Αποτέλεσμα αυτού, είναι η χρήση τους για την διατήρηση των τροφίμων χωρίς συνθετικές χημικές ουσίες ή πρόσθετα, τα οποία σύμφωνα με πρόσφατες έρευνες (Dai & Mumper 2010) έχουν καρκινογόνο δράση (π.χ. βουτυλιωμένο υδροξυτολουόλιο, BHT) και πιθανόν οδηγούν σε παθογενείς καταστάσεις. Επιπλέον χρησιμοποιoύνται ευρέως στην αρωματοποιία, στα καλλυντικά, ακόμα και σε συμπληρωματικές θεραπείες για ορισμένες παθήσεις (εκφυλιστικές) εξαιτίας των αντιμικροβιακών και αντιοξειδωτικών ιδιοτήτων τους. Τέλος τις τελευταίες δεκαετίες, μελετάται διεξοδικά η χρήση των αιθέριων ελαίων τους ως καπνιστικά σκευάσματα ενάντια σε παθογόνα εδάφους αλλά και αποθηκών καθώς έχουν ένα καλό προφίλ μυκοστατικήςεντομοστατικής-ακαρεοκτόνου δράσης και είναι φιλικά προς τον χρήστη και το περιβάλλον. Το τελευταίο αποτελεί βασικό γνώρισμα των σκευασμάτων εκείνων τα οποία εντάσσονται στη βιολογική γεωργία, η οποία δείχνει να προτιμάται από τις ανεπτυγμένες χώρες που ακολουθούν την σύγχρονη ολοκληρωμένη αντιμετώπιση εχθρών των φυτών (Integrated Pest Management). Ενδεικτικά η Ευρωπαϊκή Ένωση θεωρείται ως η μεγαλύτερη αγορά αρωματικών και φαρμακευτικών φυτών στον κόσμο από άποψης οργανωμένης εμπορικής δομής. Η Κίνα και η Ινδία εκτιμώνται ως οι μεγαλύτερες αγορές από άποψη ποσότητας παραγωγής άλλα σημαντικό μέρος του εμπορίου τους είναι άτυπο και μη εμπορευματοποιημένο. Κατά τις δύο τελευταίες δεκαετίες παρατηρήθηκε σημαντική αύξηση του συνολικού εμπορίου (εισαγωγές εξαγωγές) στα αιθέρια έλαια από τα 616 εκ. $ για το έτος 1990 στα 3,6 δισ. $ για το έτος 2005 (ΕΛ.ΣΤΑΤ 2011). Στην Ε.Ε. φαίνεται να κυριαρχούν δύο τάσεις στην παραγωγή αρωματικών και φαρμακευτικών φυτών. Από την μία η παραγωγή φτηνών προϊόντων μεγάλης κλίμακας φαίνεται να είναι σε κάμψη και αντικαθίσταται από εισαγόμενα και από την άλλη φαίνεται να προωθείται η εξειδικευμένη παραγωγή ορισμένων φυτών και με κανόνες βιολογικής 2

21 γεωργίας. Τα τοπικά προϊόντα δείχνουν να προτιμούνται αφού η παραγωγή τους μπορεί να ελεγχθεί από τους μεγάλους αγοραστές. Συχνό φαινόμενο αποτελεί για τις περισσότερες εταιρείες η εισαγωγή φυτικού υλικού από αναπτυσσόμενες χώρες (χαμηλής αξίας) και η ανάμειξή του με φυτικά υλικά ποιότητας τα οποία τηρούν προδιαγραφές βιολογικής γεωργίας (Τσόγας 2005). Στην Ελλάδα σύμφωνα με στοιχεία του Υπουργείου Αγροτικής Ανάπτυξης και Τροφίμων, η καλλιεργούμενη έκταση αρωματικών φυτών κατά το 2006 και 2007 ανήλθε στα και στρέμματα αντίστοιχα. Κατά τις ίδιες περιόδους η παραγωγή τους ανήλθε σε 1301,1 και 1149,5 τόνους αντιστοίχως. Τα κύρια φυτά ήταν η ρίγανη και ο κρόκος. Παρόλα αυτά από τα έτη 2009 έως 2013 παρατηρείται μείωση των καλλιεργούμενων εκτάσεων με αρωματικά φυτά στην Ελλάδα παρότι υπάρχει αυξανόμενη ζήτηση. Αποτέλεσμα οι εισαγωγές να είναι μεγαλύτερες από τις εξαγωγές, ενώ πρόκειται για καλλιέργεια η οποία θα μπορούσε να αξιοποιήσει αρκετές περιοχές της Ελλάδας (διάφοροι τύποι εδαφών-ορεινές εκτάσεις) και να παράξει ποιοτικό προϊόν υψηλής αξίας για τις εγχώριες και διεθνείς αγορές Τα αιθέρια έλαια Τα αιθέρια έλαια προσδίδουν με το χαρακτηριστικό τους άρωμα την ευχάριστη οσμή στα φυτά και παίρνουν το όνομά τους συνήθως από το φυτό από το οποίο προήλθαν π.χ ροδέλαιο από το ρόδο (τριαντάφυλλο). Σύμφωνα με τους Κατσιώτη και Χατζοπούλου (2010) οι δευτερογενείς μεταβολίτες (συνεπώς και τα αιθέρια έλαια) χρησιμεύουν στα φυτά ως μέσα προσαρμογής στις διακυμάνσεις των συνθηκών θερμοκρασίας και φωτός, στην καταπόνηση, στη μόλυνση ή ως μηχανισμός άμυνας κατά των φυτοφάγων ζώων. Αποτελούνται από μια μεγάλη ομάδα πολυσύνθετων φυσικών προϊόντων, διαφορετικών κατηγοριών (κυρίως παράγωγα φαινυλοπροπανίου και τερπενίων) και όχι έλαια, αν και το όνομα αιθέρια έλαια παραπλανεί ως προς την σύσταση αυτής της κατηγορίας ενώσεων. Βρίσκονται συνήθως στις αδενώδεις (αποκλειστικά υπεύθυνες για την παραγωγή των αιθέριων ελαίων) και στις μη αδενώδεις τρίχες των φυτών και είναι διαυγή άχρωμα ή υποκίτρινα ελαιώδη υγρά σε θερμοκρασία δωματίου (εξαίρεση το χαμομήλι-κυανόχρωμο). Τα περισσότερα από τα αιθέρια έλαια έχουν υψηλό δείκτη διαθλάσεως και είναι οπτικώς ενεργά, με εξαίρεση 3

22 την αρτεμισία, ιδιότητα η οποία χρησιμοποιείται στην ταυτοποίηση της γνησιότητας των ελαίων σε βιομηχανικό επίπεδο. Διαλύονται δε εύκολα σε οργανικούς διαλύτες καθώς πρόκειται για λιπόφιλες ουσίες με μικρή πυκνότητα. Εξαιτίας της μοριακής δομής τους (διπλοί δεσμοί, αλδεϋδομάδες, υδροξυλομάδες, εστερομάδες) είναι ασταθή και οξειδώνονται εύκολα για αυτό φυλάσσονται σε σκοτεινά ερμητικά κλεισμένα γυάλινα δοχεία (Kofidis et al. 2003), (Skold et al 2006). 1.2 Ιστορική αναδρομή Τα αιθέρια έλαια συνοδεύουν τους ανθρώπινους πολιτισμούς για χιλιετίες. Στα πρώιμα χρόνια η χρήση τους συνδέθηκε με τη θρησκεία τον μυστικισμό και την μαγεία. Οι αρχαίοι προγονοί μας περί το 5000 π.χ έκαιγαν αρωματικά βότανα, ξύλα εμποτισμένα με αιθέρια έλαια για να εκδιώξουν τα δαιμονικά πνεύματα από άλλους ανθρώπους. Πιθανόν αυτοί ήταν ασθενείς με κάποια ψυχιατρική νόσο και δυστυχώς η μόνη θεραπεία ήταν το νερό η φωτιά και ο καπνισμός. Ενδιαφέρον είναι ότι η λέξη perfume προέρχεται από το λατινικό per femum το οποίο σε ελεύθερη μετάφραση σημαίνει δια μέσω καπνού. Το βιβλίο του κίτρινου αυτοκράτορα Ηuang-Ti (Κίνα 2697 π.χ.) είναι το αρχαιότερο φαρμακευτικό βιβλίο που έχει διασωθεί στην Κίνα. Περιέχει πληροφορίες για τις φαρμακευτικές ιδιότητες για πάνω από 300 είδη φυτών γεγονός που δείχνει ότι μάλλον οι κινέζοι προηγήθηκαν στην γνώση των αρωματικών φυτών από τους Αιγύπτιους. Παρότι στην Ινδία και στην Αμερική χρησιμοποιούνταν τα αρωματικά φυτά φαίνεται ότι στην Μέση Ανατολή και στην Κίνα υπάρχουν οι καλύτερες καταγραφές. Με αυτές της Μέσης Ανατολής να δείχνουν να προηγούνται σύμφωνα με γραπτά κείμενα και έργα τέχνης πολιτισμών των Ασσύριων και των Σουμέριων περι το 2800 π.χ. Κατά την 3η Δυναστεία ( π.χ) αλλά και αργότερα στη Αίγυπτο, χρησιμοποιήθηκαν πολύ τα αιθέρια έλαια στην ταρίχευση των νεκρών και στην αναζήτηση για την αιώνια ζωή. Οι ιερείς παρατήρησαν ότι το εκχύλισμα κέδρου και μύρων αναστέλλει την σήψη ενώ ξεκίνησαν πρώτοι τις εκχυλίσεις φυτών θερμαίνοντας πήλινα σκεύη και έφτιαξαν το Kyphi ένα μείγμα 16 συστατικών από 4

23 αρωματικά φυτά. Οι Αιγύπτιοι τα χρησιμοποίησαν εκτός από θρησκευτικούς σκοπούς και ως θεραπευτικά μέσα αλλά και για καλλωπισμό. Αργότερα ο Ιπποκράτης ( π.χ) απέρριψε την αιγυπτιακή πεποίθηση ότι η ασθένεια προκύπτει από υπεράνθρωπα αίτια. Πίστευε ότι ο γιατρός έπρεπε να βρίσκει τα φυσικά αίτια της ασθένειας μετά από στενή παρακολούθηση του ασθενούς. Μελέτησε και κατέγραψε πάνω από 200 φυτά ενώ χρησιμοποιούσε ως θεραπείες λουτρά και μασάζ με μείγματα αρωματικών φυτών ή συνταγές με βότανα και κριθάρι. Μετά την είσοδο του Μ. Αλεξάνδρου στην Αίγυπτο (3 ος αιώνας π.χ), η χρήση των αρωματικών φυτών έγινε πιο δημοφιλής στην Ελλάδα. Μεγάλη η συμβολή του Θεόφραστου, Αθηναίος φιλόσοφος και μαθητής του Αριστοτέλη, με το έργο του «Περί Φυτών ιστορίας». Μεταγενέστερα ο Διοσκουρίδης (40-90 μ.χ), ο οποίος θεωρείται «πατέρας» της φαρμακολογίας, υπηρέτησε στο ρωμαϊκό στρατό και ακολουθώντας τις εκστρατείες γνώρισε και μελέτησε βότανα και αρωματικά φυτά καθώς και πως αυτά πρέπει να προετοιμάζονται για την καλύτερη χρήση τους. Στο έργο του De Materia Medica περιέχονται 1000 διαφορετικές συνταγές αρωματικών φυτών με ευεργετική δράση και 600 απεικονίσεις τους. Ακολούθησε ο Γαληνός ( μ.χ.) ο οποίος θεράπευε τους μονομάχους με φαρμακευτικά φυτά και μάλιστα ήταν τόσο καλός που έγινε ο προσωπικός φυσιοθεραπευτής του αυτοκράτορα Μάρκου Αυρήλιου. Στα επόμενα χρόνια οι Πέρσες έπαιξαν κάποιο ρόλο στην εξέλιξη της γνώσης για τα αρωματικά-φαρμακευτικά φυτά και τα αιθέρια έλαια με τους Αl-razi ( μ.χ) και Ibn Sina ή πιο γνωστό Avicenna ( μ.χ). Έπειτα φτάνουν τα χρόνια του Μεσαίωνα 13 ος -14 ος αιώνας μ.χ όπου την γνώση των φαρμακευτικών φυτών διαχειρίστηκε η καθολική εκκλησία με την αντίληψη ότι οι ασθένειες ήταν τιμωρία του θεού. Τότε τα αιθέρια έλαια επιστρατεύτηκαν ενάντια στις επιδημίες πανούκλας και χολέρας. Τον 16 ο αιώνα πρωτοεμφανίζεται ο όρος αιθέρια έλαια και η πρώτη απόσταξη ως μέθοδος παραλαβής του αιθέριου ελαίου πραγματοποιήθηκε από τον Ελβετό Bombastus Paracelsus von Honhehheim πατέρα της τοξικολογίας ( μ.χ). 5

24 Τέλος μέχρι τον 18 αιώνα πολλοί ερευνητές ασχολήθηκαν και περιέγραψαν μεθόδους παραλαβής αιθέριων ελαίων ενώ μέχρι σήμερα έχει γίνει τεράστια έρευνα στην παραγωγή, παραλαβή και ανάλυση των αιθέριων ελαίων τα οποία προμηθεύονται εύκολα από τον καταναλωτή ακόμα και μέσω διαδικτύου (Kintzios 2000, Σκαλτσά 2015) 1.3 Το γένος Salvia Το όνομα του γένους αυτής της μεγάλης οικογένειας φυτών των Χειλανθών (Lamiaceae-Labiatae) προέρχεται από το λατινικό salvere που σημαίνει σώζω λόγω των θεραπευτικών ιδιοτήτων αυτών των φυτών. Το όνομα πιθανόν να είναι παράφραση των λέξεων sauge και sauja (Γαλλική μορφή) στα παλαιά Αγγλικά Sawge με σημερινή μορφή αυτή του sage (Grieve 1984) Η χρήση του φασκόμηλου στο πέρασμα των αιώνων Το φασκόμηλο ή ελελίφασκος αποτελούσε ένα από τα σημαντικότερα φαρμακευτικά φυτά από τα αρχαία χρόνια αφού είχε την φήμη ότι έδιωχνε το κακό. Εθεωρείτο ότι ήταν αποτελεσματικό ενάντια στο δάγκωμα φιδιού και την εκδίωξη κακών πνευμάτων (Ceres 1982). Στην αρχαία Αίγυπτο χρησιμοποιούνταν για να αυξήσει τη γονιμότητα των γυναικών (Schaueenberg & Ferdinard 1990). Κατά τον Θεόφραστο υπάρχουν 2 είδη: το ένα με την ονομασία σφακός είναι άγριο και το άλλο παρόμοιο αλλά καλλιεργήσιμο με το όνομα ελελίφασκος (Dweck 2000). O Πλίνιος ο πρεσβύτερος αναφέρει ότι ο ελελίφασκος προσφωνείται από τους ρωμαίους salvia και χρησιμοποιείται ως διουρητικό, εμμηναγωγό, τοπικό αναισθητικό, στυπτικό καθώς και σε περιπτώσεις δυσεντερίας. Επιπροσθέτως, κατά τους Διοσκουρίδη και Γαληνό το φασκόμηλο έχει αιμοστατική, διουρητική, τονωτική και εμμηναγωγό δράση. Το γεγονός ότι κατά το μεσαίωνα υπήρχε η φράση cur moriatur homo cui Salvia crescit in horto που σημαίνει γιατί κάποιος να πεθαίνει εφόσον έχει φασκόμηλο στον κήπο του ή ακριβέστατα He that would live for aye, 6

25 must eat Sage in May ενισχύει την αξία που είχε αυτό το φυτό- πολυφάρμακο στη λαϊκή θεραπευτική. Επιπλέον, το φασκόμηλο, γνωστό τότε και ως S. salvatrix (Sage the Saviour) (Grieve 1984), αποτελούσε ένα από τα συστατικά του σκευάσματος Marseilles vinegar, το οποίο χρησιμοποιούνταν κατά της πανώλης. Σύμφωνα με το μύθο δημιουργήθηκε το 1630 από τέσσερις κλέφτες με καταγωγή από την Τουλούζη. Αυτοί περίμεναν να θαφτούν τα θύματα τους προσβεβλημένα από πανώλη και μετά λήστευαν τα σπίτια τους. Παρατήρησαν ότι έμεναν ανέπαφοι από την ασθένεια λόγω της χρήσης του μείγματος τους και χρησιμοποίησαν την επινόησή αυτή ως εισιτήριο για την ελευθερία τους, αφού δεν θανατώθηκαν για όσα είχαν κάνει με τον όρο να αποκαλύψουν την συνταγή του σκευάσματός τους. (Gattefose & Tisserand 1937, Kintzios 2000) Τα είδη Salvia στην Ελλάδα To γένος Salvia αποτελεί ένα από τα μεγαλύτερα γένη της οικογένειας Labiatae και περιλαμβάνει 900 είδη με σχεδόν κοσμοπολίτικη κατανομή. Τα μεγαλύτερα κέντρα προέλευσης αποτελούν η νοτιοδυτική και κεντρική Ασία (Hedge 1992, Greuter 1986). Η ελληνική χλωρίδα περιλαμβάνει 23 taxa του γένους Salvia με κατανομή: Πέντε taxa με πολύ μικρή διασπορά φύονται μόνο στην Ελλάδα (S.eichleriana Halacsy, S. pomifera L. ssp. pomifera, και S. teddii Turrill) ενώ κάποια μόνο Ελλάδα και Τουρκία (S. napifolia Jacq. S. pomifera L. ssp. calycina (Sm. Hayek) Τρία taxa απαντώνται κυρίως στην Βαλκανική χερσόνησο και σε μικρό μέρος της Μικράς Ασίας ( S.amplexicaulis Lam., S. forskahlii L.) ή στην Ιταλία (S. officinalis L.) Δύο taxa έχουν μεγαλύτερο εύρος κατανομής στη Μεσογειακή λεκάνη (S. argentea L. και S. fruticosa Miller) Δεκατρία σε αριθμό taxa έχουν ευρύτερη εξάπλωση στον Παλαιό κόσμο (S. aethiopsis L., S. candidissima Vahl., S. glutinosa L., S. pinnata L., S. prutensis L., S. ringens Sm., S. sclarea L., S. sylvestris, L., S. tomentosa Miller, 7

26 S.verbenaca L., S. verticillata L. ssp. Verticillata, S. virgata Jaq. και S. viridis L. (Hedge 1982, Greuter et al. 1986) Στην Ελλάδα τα είδη που χρησιμοποιούνται είναι κυρίως τρία, τόσο στη διατροφή όσο και στη λαϊκή θεραπευτική. Πιο συγκεκριμένα, το S. fruticosa (ελληνικό φασκόμηλο), S. pomifera (κρητικό φασκόμηλο) και S. officinalis (φαρμακευτικό, κοινό ή Δαλματικό φασκόμηλο). (Kokkini et. al 1989, Kokkini 1994, Karousou & Kokkini 1997, Skoula 1992, Karousou et al. 1998a.) Διασπορά των φυτών S. fruticosa Miller: Πρόκειται για ενδημικό είδος της Ανατολικής Μεσογείου. Απαντάται από την Λιβύη (Cyrenaica-Pentapolis) την Σικελία και την Νότια Ιταλία έως το νοτιότερο τμήμα την βαλκανικής χερσονήσου και την δυτική Συρία (Pignatti 1982, Hedge 1982, Greuter 1986). Ως καλλιεργούμενο φυτό μπορεί να απαντηθεί στην Μάλτα, την Ισπανία και την Πορτογαλία (Greuter 1986). Το είδος αυτό πιθανότατα έφτασε για καλλιέργεια στην ιβηρική χερσόνησο από τους αρχαίους Έλληνες και Φοίνικες (Kintzios 2000). Στην Ελλάδα είναι το πιο διαδεδομένο είδος φασκομηλιάς και αυτοφύεται εκτεταμένα σε παράκτιες περιοχές του κυρίως ελληνικού κορμού καθώς και στα νησιά του Ιονίου και του Αιγαίου στα οικοσυστήματα φρύγανων και μακκίας. Αναπτύσσονται σε υψόμετρα μικρότερα των 1000 m και σχεδόν έως τα 1350 m. Σε περιοχές της νότιας Πελοποννήσου και σε μερικά νησιά του Αιγαίου συνυπάρχουν με τo είδος S. pomifera (Halacsy 1908, Rechinger 1949, Gianitsas 1963). S. officinalis L.: Η διασπορά αυτού του είδους περιορίζεται στο δυτικό τμήμα της βαλκανικής χερσονήσου (Αλβανία, Πρώην Γιουγκοσλαβία, Ελλάδα και βόρεια Ιταλία) (Pignatti 1982, Greuter et al. 1986), μπορεί όμως να βρεθεί σε όλη την Ευρώπη εάν καλλιεργηθεί, όπου και πιθανότατα έφτασε από τους Ρωμαίους τα αρχαία χρόνια ή από μοναχούς κατά το μεσαίωνα. (Gams 1927). Στην Ελλάδα φύεται μόνο στο βορειότερο τμήμα του ηπειρωτικού κορμού σε υψόμετρα μεταξύ 600 και 900 m. Κυρίως δηλαδή στα βουνά Βόρρας, Πίνοβο, Βέρμιο, Βουρίνος, Σμόλικας 8

27 Μιτσικέλι και Τύμφη με κατώτερο άκρο την πόλη της Άρτας (Karousou et al. 1998a, Karousou & Kokkini 1997, Kokkini 1994). Salvia pomifera L.: Το είδος αυτό απαντάται στην Ελλάδα και στα παράλια της Μικράς Ασίας (Hedge 1982, Greuter et al. 1986). Στον ελλαδικό χώρο ευρίσκεται σε τμήματα την νοτιοανατολικού κορμού και σε κάποια νησιά του Αιγαίου σε υψόμετρα χαμηλότερα των 1350 m. Εκεί δημιουργεί εκτεταμένη βλάστηση στα οικοσυστήματα μακκίας και φρύγανων καθώς και σε δάση πεύκων όπου βέβαια η αραιωμένη βλάστηση των δέντρων το επιτρέπει (Karousou et al. 1998b, Hanlidou 1996). Εικόνα 1: Διασπορά των ειδών Salvia στη Μεσόγειο. Πηγή: Kintzios S.E ( 2000), CRC Press. 9

28 1.3.4 Μορφολογία Γενικά στην οικογένεια των Χειλανθών (Lamiaceae-Labiateae) περιλαμβάνονται φυτά ποώδη ή θαμνώδη ετήσια ή πολυετή, τα οποία παράγουν αιθέρια έλαια μέσω αδενωδών και μη αδενωδών τριχών. Αναγνωρίζονται δε από τον τετράγωνο βλαστό, τα συνήθως αντίθετα φύλλα, τον ακτινόμορφο ή δίχειλο κάλυκα με 4-5 οδόντες και την συμπέταλη συνήθως δίχειλη στεφάνη (Karousou 1995). Τα άνθη είναι ερμαφρόδιτα ή αρρενόστειρα (μόνο το θηλυκό είναι λειτουργικό) και φέρονται μεμονωμένα ή πολλά μαζί στις μασχάλες των φύλλων (κατά διχασία) ή επάκρια (κατά βότρεις ή στάχεις). Ο καρπός είναι σχιζοκάρπιο και αποτελείται από τέσσερα μονόσπερμα κάρυα. Προτιμούν να ευδοκιμούν σε ξηρά και θερμά κλίματα και σε ένα εύρος εδαφών. S. fruticosa, η μέχρι πρόσφατα ονομασία του S. triloba L. fil. (τρίλοβη) περιγράφει ένα φυτό με 3 λοβούς στο σχήμα των φύλλων του. Ωστόσο επειδή το φυτό αυτό έχει μεγάλη ποικιλομορφία ανάλογα με την γεωγραφική του τοποθεσία, το επίθετο τρίλοβη προκαλεί σύγχυση στους μελετητές που βρίσκουν φυτά με ενιαίο σχήμα φύλλου και τα κατατάσσουν ως άλλο είδος ενώ ανήκουν στο ίδιο. Το χαρακτηριστικό μορφολογικό μοτίβο αυτού του είδους φανερώνεται στην γηγενή περιοχή του, το νησί της Κρήτης (Karousou 1995, Karousou & Kokkini 1997). Εκεί στο δυτικό τμήμα του νησιού τα φύλλα είναι ενιαία χωρίς λοβούς, επίπεδα και σκούρα με πράσινη την άνω επιφάνειά τους. Αντίθετα, ανατολικά του νησιού τα φύλλα έχουν μικρότερο μέγεθος με έντονο τριμελή σχηματισμό (3 λοβοί), πρασινοκίτρινο χρώμα και κατσαρά περιθώρια. Από μελέτες ερευνητών φαίνεται μάλλον ότι το κλίμα σχετίζεται με τη μορφολογία των φύλλων. Πιο συγκεκριμένα τα κυματοειδή φύλλα έχουν 6 βαθμούς χαμηλότερη θερμοκρασία από τα ενιαία φύλλα. Η εμφάνιση των φύλλων με 3 λοβούς ίσως είναι μια επιπλέον προσαρμογή για τις ξηροθερμικές συνθήκες και για την ταχύτερη εξάτμιση νερού άρα και της θερμότητας από το φύλλωμα (Fitter & Hay 1987). 10

29 S. pomifera, και αυτό το είδος έχει μεγάλη ποικιλομορφία. Ο χαρακτηρισμός pomifera (φέρω μήλα = pomi) δηλώνει τον συχνό σχηματισμό κηκίδων-όγκων μετά από το τσίμπημα από ένα είδος σφήκας (Οικ. Cynipidae) με σκοπό την δημιουργία καταφύγιου για τα ευπαθή στάδια του εντόμου αυτού. Συχνά αυτά τα μήλα αποτελούν είδος λιχουδιάς και βράζονται με ζάχαρη ως κέρασμα κατά τον Μάη μήνα. Κάποιοι λαοί, όπως οι Άραβες, τα χρησιμοποιούν για να ξεδιψούν (Λάζαρη). Το είδος αυτό διακρίνεται σε viz. S. pomifera L. και S. calycina Sm. (Kintzios 2000, Halacsy 1902, Rechinger 1943). O Hedge (1982) τα κατατάσσει στο ίδιο είδος και τα δύο ενώ άλλοι ερευνητές τα θεωρούν διαφορετικά υποείδη σύμφωνα με την Καρούσου. Τα δύο είδη ξεχωρίζουν κυρίως από το σχήμα των φύλλων τους. Το υποείδος pomifera έχει επίμηκεςγραμμικό επίμηκες σχήμα και κυματοειδή, κατσαρά, ωοειδή ή υπόκαρδιόσχημα στη βάση τους φύλλα, ενώ το υποείδος calycina είναι ευρέως ωοειδές-επίμηκες με επίπεδα στρογγυλά-καρδιόσχημα στην βάση τους φύλλα. Το υποείδος pomifera είναι καθαρά ενδημικό ελληνικό είδος περιορισμένο στο νότιο τμήμα έκτασης αυτού. Μεγαλώνει μόνο δυτικά του νησιού της Κρήτης και στα Κύθηρα. Το υποείδος calycina έχει ευρύτερη εξάπλωση και συναντάται στο ανατολικό και νότιο τμήμα του ελληνικού κορμού, τα νησιά του Αιγαίου και στην δυτική Μ.Ασία (Ηalacsy 1902, Rechinger 1943, Ganiatsas 1963, Hedge 1982). Μορφές υβριδισμού των δύο ειδών έχουν αναφερθεί σύμφωνα με τους Greuter (1967) και Rechinger (1967) στα Κύθηρα και στην αντίπερα αυτών Ν. Πελοπόννησο. S. officinalis σε αντίθεση με τα προηγούμενα είναι σταθερό είδος μορφολογικά και ξεχωρίζει από τα επιμήκη και πάντα ενιαία σε σχήμα φύλλα του. 11

30 Eικόνα 2: Salvia fruticosa. Διακρίνονται τα ανοιχτόχρωμα πράσινα φύλλα του με τρισχιδή σχηματισμό φυλλαρίων. Βοτανικός κήπος Πανεπιστημίου Πατρών, προσωπική συλλογή. 12

31 Εικόνα 3: Salvia pomifera ssp calycina. Διακρίνονται τα κυματοειδή φύλλα του με έντονες εγκολπώσεις. Βοτανικός κήπος Πανεπιστημίου Πατρών, προσωπική συλλογή. 13

32 Εικόνα 4: Tο φυτό Salvia officinalis. Προσωπική συλλογή 14

33 1.4 Χημική σύσταση αιθέριου ελαίου φυτών Salvia Τα τρία είδη που απαντώνται στην Ελλάδα παρουσιάζουν σημαντική παραλλακτικότητα ως προς την απόδοση αιθέριουελαίου: S. fruticosa, 1,0-5,5% (ml 100 g -1 DW) (Catsiotis & Iconomou 1984, Harvala et al. 1987, Kokkini et al. 1989, Karousou 1995, Karousou & Kokkini 1997, Karousou et al. 1998). S. officinalis, 0,9-2,3 % (Kokkini et al 1989, Hanlidou 1996). S. pomifera, 1,3-4,2 % (Kokkini 1989, Bellomaria et al. 1992, Skoula 1992, Karousou 1995, Karousou et al. 1998). Αυτή η διακύμανση που παρουσιάζεται σε κάθε είδος οφείλεται σε εποχικούς και γεωγραφικούς παράγοντες. Σύμφωνα με τον Μάνου και τους συνεργάτες του (1990) έχει βρεθεί ότι το αιθέριο έλαιο της σάλβια φτάνει το μέγιστο σε απόδοση κατά το καλοκαίρι ενώ το ελάχιστο τον χειμώνα ή νωρίς την άνοιξη. Γεωγραφικά μιλώντας, κινούμενοι από την πραγματικά μεσογειακή ζώνη προς βορειότερες περιοχές, έχουμε αλλαγή στην απόδοση αιθέριου ελαίου συνοδευόμενη από μορφολογικές διαφοροποιήσεις στα φυτά. Όσον αφορά την ποιοτική ανάλυση των αιθέριων ελαίων της σάλβια και τα 3 είδη του ελληνικού χώρου, έχουν παρόμοια χημική σύσταση ως προς τα κύρια συστατικά τους. Δηλαδή την ευκαλυπτόλη (1,8-κινεόλη), την θυϊόνη (α- και β-θυιόνη) και την καμφορά (καμφορά), τα οποία αποτελούν το 54,4-83,4 % του αιθέριου ελαίου (Casiotis & Ikonomou 1984, Harvala et al. 1987, Bellomaria et al 1992, Skoula 1992, Karousou 1995, Hanlidou 1996, Karousou et al. 1998). Ωστόσο παρατηρείται διαφοροποίηση μεταξύ ειδών και μεταξύ του ίδιου είδους ως προς την συμμετοχή των συστατικών στο αιθέριο έλαιο. Έτσι, η ποσότητα της ευκαλυπτόλης είναι υψηλή στα έλαια του S. fruticosa, 66% του συνόλου του ελαίου, ενώ χαμηλότερη (16%) στα άλλα δύο είδη. Η ποσότητα θυϊόνης (α και β) είναι πάντα ανεβασμένη στο S. pomifera συνήθως πάνω από 58,7% ενώ η υψηλότερη ποσότητα καμφοράς καταγράφτηκε στα S. officinalis 38,1%, σύμφωνα με τους Lawrence (1979) και Boelens (1997). Επίπεδα θυϊόνης άνω του 60% είναι σπάνιο για το φασκόμηλο και 15

34 παρατηρείται μόνο σε κάποια έλαια S. officinalis. Ακολουθεί Πίνακας με τα σημαντικότερα συστατικά του αιθέριου ελαίου των φυτών σάλβια. Eικονα 5: Ποσοστά (%) κύριων συστατικών σε διαφορετικά είδη φασκόμηλου στην Ελλάδα. Πηγή Σ.Κίντζιος, 2000,The Genus Salvia.,Ηarwood Εικόνα 6: Κύρια συστατικά (%) του αιθέριου ελαίου S. fruticosa από 15 ενδιαιτήματα. Πηγή: Pitarokili D, Tzakou O, Loukis A, Harvala C. Volatile Metabolites from Salvia fruticosa as Antifungal Agents in Soil Borne Pathogens. J. Agric. Food Chem., 2003; 51:

35 Εικόνα 7: Κύρια συστατικά (%) S. pomifera ssp calycina από το όρος Πάρνηθα κατά το καλοκαίρι (Ιούνιος 1996). Πηγή: Composition and Antifungal Activity of the Essential Oil of Salvia pomifera subsp. calycina Growing Wild in Greece (1999) Pitarokili D., Tzakou O. Couladis M., Verykokidou E., Journal of Essential Oil Research, 11:5, Παραλλακτικότητα αιθέριων ελαίων 17

36 Αρκετοί ερευνητές έχουν μελετήσει την παραλλακτικότητα, δηλαδή την τάση να παραλλάσουν η σύσταση και η απόδοση των αιθέριων ελαίων σε επίπεδο διαφορετικών ειδών αλλά και στο ίδιο είδος στα αρωματικά και φαρμακευτικά φυτά. Η απόδοση των αρωματικών και φαρμακευτικών φυτών σε αιθέριο έλαιο καθώς και η χημική σύσταση, ποικίλουν από είδος σε είδος, στο ίδιο είδος (σε επίπεδο καλλιεργητικής ποικιλίας) και από περιοχή σε περιοχή, ανάλογα με τις εδαφοκλιματικές συνθήκες και του τόπου προέλευσης (Burkart & Βuhler 1997, Vokou et al. 1993, Karousou et al. 2005). H επιρροή του φυσικού περιβάλλοντος στη συγκέντρωση σε έλαιο και την χημική σύσταση αυτού έχει αναφερθει σε μελέτες αρωματικών φυτών της Κρήτης (Karousou et al. 2005) και στη Νίσυρο (Vokou et al. 1993). Οι Vokou et al. (1993) αναφέρουν πως δεδομένου ότι το αιθέριο έλαιο είναι μεταβολικό προϊόν των φυτικών κυττάρων, η παραλλακτικότητα που παρουσιάζει στην ποσότητα και την χημική του σύσταση μπορεί να αποδοθεί σε περιβαλλοντικούς παράγοντες όπως το έδαφος και το κλίμα. Κατά τους Burkart & Βuhler (1997), οι διαφοροποιήσεις στη χημική σύσταση του αιθέριου ελαίου είναι αποτέλεσμα αλληλεπίδρασης του τύπου της αρωματικής βλάστησης και αρκετών περιβαλλοντικών παραγόντων. Παράδειγμα αποτελεί το φυτό της οικογένειας Lamiaceae, Τhymus vulgaris, το οποίο, κατά τους Vernet et al. (1986), όταν βρισκόταν σε ξηρικά οικοσυστήματα εξέφραζε τους πιο σύνθετους χημειότυπους και παρουσίαζε μικρή γενετική παραλλακτικότητα. Αντίθετα, σε λιγότερο ευνοϊκά περιβάλλοντα (π.χ. μεγαλύτερη υγρασία) υπήρχε μεγαλύτερη γενετική παραλλακτικότητα και εμφανίζονταν και άλλοι χημειότυποι. Σε αυτό το σημείο, σκόπιμο είναι να αναφερθεί ο όρος του χημειότυπου. Κατά τους Sangwan et al. (2001), ο χημειότυπος ορίζει την ύπαρξη ενός χημικά ξεχωριστού πληθυσμού ιδίου είδους φυτών ή μικροοργανισμών, το οποίο όμως παρουσιάζει διαφορές στη σύνθεση δευτερογενών μεταβολιτών. Στην περίπτωση των αιθερίων ελαίων συνήθως περιγράφονται με το όνομα του τερπενίου που υπερτερεί ποσοστικά στο έλαιο (π.χ χημειότυπου ευκαλυπτόλης). Γίνεται κατανοητό πως η επίδραση της φυσιογεωγραφίας έχει ως αποτέλεσμα μια συγκεκριμένη χημική σύσταση και κατανομή των αρωματικών φυτών στο χώρο. Στο φασκόμηλο (S. officinalis) 18

37 υπάρχουν τουλάχιστον δύο χημειότυποι, ο ένας με μικρό ποσοστό θυϊόνης (4-8%) και ο άλλος με υψηλό, σχετικά, ποσοστό (16-32%) (Βoelens & Βοelens 1997). Επιπλέον, το σύνολο θυϊόνης και καμφοράς στη σάλβια αποτελεί σημαντικό κριτήριο για να ξεχωρίσει κάποιος τα είδη S. fruticosa (4,8-15,9%) και S. Officinalis (45-68%) (Kintzios 2000) Εποχική παραλλακτικότητα Διάφορες έρευνες που έχουν γίνει κατά καιρούς αποδεικνύουν πως το στάδιο της ανθοφορίας είναι (συνήθως) για το φυτό το στάδιο εκείνο με την υψηλότερη περιεκτικότητα σε αιθέριο έλαιο (Baser et al. 2000). Είναι σημαντικό ότι τα είδη Salvia spp. χρησιμοποιούνται για τα φύλλα τους και όχι για όλο το φυτό. Μεταξύ βιομάζας και παραγωγής αιθέριουελαίου υπάρχει αντίθετη σχέση με την υψηλότερη απόδοση να παραλαμβάνεται όταν ολοκληρώνεται η ανθοφορία και έπειτα (Pitaveric et al. 1984, Putievsky et al. 1986a, Hay 1993). Κατά τους Mueller-Riebau et al. (1997) η ιδανική εποχή συγκομιδής είναι ο Ιούλιος. Επιπλέον ο Perry et al. (1996) σε πειράματα που έκανε προσδιορισμό συστατικών σε S. officinalis παρατήρησε ότι στα φυτά που είχαν ανθίσει υπήρχε μεγαλύτερη απόδοση αιθέριου ελαίου (0,23%) από τα μη ανθισμένα (0,14%). Επιπροσθέτως, τα ανθισμένα φυτά υπερτερούσαν σε θυϊόνη, β-καριοφυλένιο και βιριντιφλορόλη. Προς αυτή την κατεύθυνση συμφωνούν και οι Yoshida και Sawasaki (1978). Σύμφωνα με τον Μάργαρη (Margaris & Mooney, 1981) κατά την περίοδο ανθοφορίας σε φυτά Lamiaceae (ξηροθερμικές συνθήκες ) το αιθέριο έλαιο ήταν περισσότερο έναντι της βλαστικής ανάπτυξης των φυτών (υγρασία και χαμηλές θερμοκρασίες). Σε πειράματα που έκανε ο Yan Li et al. (1996) σε S. officinalis και Thymus vulgaris απέδειξε ότι το αιθέριο έλαιο φυτών που δέχθηκαν διαφορετική ένταση φωτός είχε διαφορετική απόδοση και σύσταση. Συγκεκριμένα, σε 45% έντασης φωτός 19

38 παρατηρήθηκε η μέγιστη απόδοση στη σάλβια με υψηλότερα επίπεδα θυϊόνης και χαμηλότερα καμφοράς. Σε γενικές γραμμές η εποχική παραλλακτικότητα υπακούει στις μεταβολές των περιβαλλοντικών συνθηκών όπως τη διαθεσιμότητα εδαφικής υγρασίας, τη διαθεσιμότητα θρεπτικών στοιχείων την φωτοπερίοδο, και το μήκος της ημέρας (Trivino & Johnson 2000) Γεωγραφική παραλλακτικότητα Η φυσιογεωγραφία και η τοποθεσία των αρωματικών φυτών φαίνεται πως επηρεάζει με τον δικό της τρόπο την απόδοση και τη σύσταση των αιθέριων ελαίων. Εξάλλου στην Ελλάδα υπάρχουν μεγάλες διαφορές γεωμορφολογίας και κλίματος με αποτέλεσμα διαφορετικό μικροκλίμα σε κάθε περιοχή και άλλες συνθήκες ανάπτυξης για τα τοπικά είδη φυτών. Σύμφωνα με τον Κουτσό (2006), όσο το υψόμετρο και το γεωγραφικό πλάτος μεγαλώνουν, τόσο περιορίζεται το καλοκαίρι με αποτέλεσμα τη μείωση του χρόνου της φωτοσύνθεσης και των προϊόντων αυτής, ανάμεσα στα οποία είναι και τα συστατικά του αιθέριου ελαίου. Παρομοίως, ο Ντάφης (1986) αναλύει την θετική επίδραση της θερμοκρασίας ως μια από τις κυριότερες κλιματικές παραμέτρους, εξηγώντας ότι σε περιοχές με υψηλές θερμοκρασίες, η εξάτμιση του εδαφικού νερού εντείνεται με αποτέλεσμα την έντονη διαπνοή των φυτών και κατ επέκταση την αύξηση της απόδοσης του ελαίου. Επιπλέον οι Aminzadeh et al. (2010) αναφέρουν ότι το υψόμετρο, θρεπτικά στοιχεία (κάλιο, ιχνοστοιχεία, ανθρακικό ασβέστιο) και το ph παίζουν σημαντικό ρόλο στην παραγωγή αιθέριων ελαίων από τα φυτά. Το φυτό S. fruticosa παρουσιάζει πολλούς χημειότυπους στην Ελλάδα. Βόρεια επικρατεί αυτός της ευκαλυπτόλης σε ποσοστά μεγάλα (90%) ενώ σε χαμηλότερο ποσοστό ακολουθούν τα συστατικά καμφορά και α,β-θυϊόνη. Νοτιότερα στην περιοχή της Κρήτης (κεντρική & ανατολική), επικρατεί χημειότυπος με ευκαλυπτόλη 20

39 αλλά με μείωση (50%) και υπάρχει αύξηση των δύο άλλων συστατικών θυϊόνης και καμφοράς. Πάντως ακόμα και στο επίπεδο ενός τόπου, π.χ. στην Κρήτη, παρατηρούνται διαφορές στον χημειότυπο των φυτών στο ίδιο είδος φυτού. Δυτικά επικρατεί αυτός με ανεβασμένα επίπεδα ευκαλυπτόλης και μικρά ποσοστά θυϊόνης και καμφοράς, ενώ στην κεντρική Κρήτη παρατηρείται υψηλότερο ποσοστό καμφοράς και ακολουθεί η ευκαλυπτόλη με την θυϊόνη. Τέλος, στο ανατολικό τμήμα της Κρήτης τα ποσοστά της θυϊόνης είναι υψηλότερα και ακολουθούν η ευκαλυπτόλη με την καμφορά. Οι αλλαγές αυτές συνοδεύονται και από μορφολογικές μεταβολές (Kokkini 1994). Το S. pomifera ssp. calycina παρουσιάζει χημειότυπο με αυξημένη θυϊόνη (50%) και καθόλου καμφορά. Ομοίως, στην Κρήτη το S. pomifera ssp pomifera έχει χημειότυπo θυϊόνης στα ίδια ποσοστά. Τέλος, στην βόρειο Ελλάδα τα S.officinalis έχουν χημειότυπο θυϊόνης ή καμφοράς Γενετική παραλλακτικότητα Μέχρι πρόσφατα η παραλλακτικότητα στα αιθέρια έλαια ήταν γνωστό ότι οφειλόταν σε περιβαλλοντικούς παράγοντες, όπως το φως, τα θρεπτικά συστατικά και η εποχή. Γενικά ισχύει ότι ο φαινότυπος είναι το αποτέλεσμα γονότυπου και περιβάλλοντος οπότε αυτή η εξίσωση βρίσκει και εδώ εφαρμογή. H σύνθεση αιθέριων ελαίων στα είδη Abies, Achillea, Clarkia, Cupressus, Juniperus, Perilla, Pinus, Thymus και Salvia είναι σε ένα βαθμό γενετικά προκαθορισμένη (Liber et al. 2011). Για παράδειγμα σε είδη μέντας (Lamiaceae) βρέθηκαν δύο είδη γενότυπων CC και Cc οι οποίοι προάγουν την μετατροπή της α-τερπινεόλης σε λιμονένιο και την οξείδωσή του σε καρβόνη. Ο γονότυπος cc παρήγαγε μενθαδένιο στα φυτά το οποίο μετατρεπόνταν σε πουλεγόνη και μενθόλη Ένας άλλος παράγοντας που καθορίζει αλλαγές στην παραγωγή των αιθέριων ελαίων και την σύσταση είναι η φυσική επιλογή. Συγκεκριμένα περιστατικά, όπως για παράδειγμα, η αναπαραγωγή των φυτών από ένα είδος εντόμου μπορεί να μεταβάλλει 21

40 τη σύσταση των αιθέριων ελαίων του ώστε να το έλκουν για την περίοδο που το φυτό είναι δεκτικό στην γύρη για επικονίαση από το συγκεκριμένο έντομο. Οι Dujakovic et al. (2012) παρατήρησαν αλλαγές στον χημειότυπο σε έξι από τα οχτώ κύρια συστατικά του ελαίου. Στην θυϊόνη υπήρχε διαφορά και ως προς την αναλογία cis/trans και αφού τα φυτά καλλιεργήθηκαν στον ίδιο τόπο και με ίδιες συνθήκες κάνουν λόγο για γενετικούς παράγοντες. Παρομοίως, οι Liber et al. (2011) σε 27 ποικιλίες O. basilicum (βασιλικός) βρήκαν διαφορές με πέντε χημειότυπους να έχουν γενετική σχέση μεταξύ τους και συγκεκριμένα μορφολογικά χαρακτηριστικά. Η Skoula (1999) παρατήρησε ότι διαφορές στη σύσταση του ελαίου μπορεί να οφείλονται σε γενετικούς παράγοντες. Σε 3 πληθυσμούς φυτών S. fruticosa που εξετάστηκαν, παρατήρησε ότι οι δύο ήταν πιο κοντά γενετικά και είχαν παραπλήσια σύσταση σε αιθέρια έλαια Παραλλακτικότητα λόγω ηλικίας φυτού Κατά πολλούς ερευνητές το στάδιο συλλογής των φυτών (φαινολογικό στάδιο) έχει σημασία για το αιθέριο έλαιο που θα παραχθεί (Franz 1993). Τα μεταβολικά μονοπάτια που ακολουθούνται στο φυτό όπως είναι λογικό αλλάζουν κατά την ηλικία του, επομένως και οι μεταβολίτες του θα είναι διαφορετικοί. Οι Lakusic et al. (2013) σε πειράματα που έκαναν με φυτά από S. officinalis ξεχώρισαν τα φύλλα σε νέα, ώριμα και παλαιά. Παρατήρησαν ότι υπήρχε διαφορά στη σύσταση του αιθέριου ελαίου, ανάλογα με το είδος των φύλλων που χρησιμοποιήθηκαν. Πιο συγκεκριμένα, τα νεαρά φύλλα ανήκαν στον χημειότυπο α- χουμουλενίου ενώ τα παλαιά σε αυτόν της θυϊόνης ή καμφοράς. Σε έρευνα των Mirjalili et al. (2006) σημειώθηκε επίσης διαφορετική σύσταση αλλά και ποσοστά απόδοσης σε διαφορετικά στάδια του κύκλου των φυτών σάλβια που εξετάστηκαν. Δηλαδή το μεγαλύτερο ποσοστό απόδοσης παρατηρήθηκε στην άνθηση (floral budding) 0,9% ενώ το μικρότερο κατά την ωρίμανση του φυτού (ripen fruit) 22

41 0,2%. Επιπροσθέτως, κατόπιν ποιοτικής ανάλυσης δείχθηκε ότι τα επίπεδα α-θυϊόνης ήταν υψηλά στο στάδιο ώριμου καρπού (ripen fruit) ενώ η ευκαλυπτόλη (1,8-cineole) και το β-πινένιο αυξάνονταν από το βλαστικό στάδιο των φυτών έως την άνθηση και έπειτα υφίσταντο μείωση. Το α-πινένιο ήταν χαμηλότερο στο βλαστικό στάδιο και αυξανόταν σταδιακά μέχρι την πλήρη άνθηση του φυτού. Τέλος, η βορνεόλη και το α-χουμουλένιο αυξάνονταν κατά την διάρκεια σχηματισμού καρπού δηλαδή κατόπιν άνθησης. 1.5 Πολυφαινόλες της Salvia Το γένος Salvia περιέχει μια μεγάλη ποικιλία πολυφαινολικών συστατικών, με περισσότερες από 160 ταυτοποιημένες ενώσεις. Κάποιες αυτές είναι μοναδικές για το γένος αυτό. Μεγάλος αριθμός αυτών είναι παράγωγα του καφεϊκού οξέος. Από τα φλαβονοειδή μεγαλύτερη θέση κατέχουν οι φλαβόνες, οι φλαβονόλες, και οι γλυκοσίδες (γλυκοζίτες) αυτών. Ενδεικτικά αναφέρονται: Για το είδος S. officinalis: ροσμαρινικό οξύ, φερουλικό οξύ, συρινγκικό οξύ, κουμαρινικό οξύ, καφεϊκό οξύ, α,β -ρεσβερατρόλη, αστρινγινίνη, κατεχίνη, επικατεχίνη, καμφερόλη, κερσετίνη, γλυκοζίτες της κερσετίνης κ.ά. 23

42 Εικόνα 8: Τα κυριότερα φαινολικά συστατικά του φασκόμηλου. Πηγή. Seasonal var of phenolic compounds and biological properties in sage (S. officinalis), Ivana Generalic et al, CHEMISTRY & BIODIVERSITY Vol. 9 (2012). (1. ροσμαρινικό οξύ, 2. συρινγκικό οξύ, 3. π-κουμαρικό οξύ, 4. καφεικό οξύ, 5. α,β-ρεσβερατρόλη, 6. αστριγκίνη, 7.κατεχίνη, 8. επικατεχίνη, 9. καμφερόλη, 10. κερσετίνη, 11. κερσετίνη-4-γλυκοζίτης. Για το είδος S. fruticosa: Φλαβόνες: λουτεολίνη, 5,7,4 -OH-6,3 -OMe (τζασεοσιντίνη), 5-OH-6,7,4 -OMe (σαλβιγενίνη), Ο-γλυκοζίτες φλαβονών: 5,7,4 -OH-7-O-β-D-γλυκοζίτης (κυναροζίτης), 5,7,3,4-ΟΗ-7-Οβ-D-γλυκουρονίδιο,5,7,3,4-ΟΗ-3 -Ο-β-γλυκοζίτης- 7-γλυκουρονίδιο, 5,7,4 -ΟΗ-6-ΟΜe-7-Ο-β-D-γλυκουρονίδιο, 5,7,3,4 -ΟΗ-7-Ο-βγλυκοβιοσίδης, 5,7,3,4 -ΟΗ-7-Ο-β-D-γλυκουρονίδιο (χρυσοεριόλη), 5,6,7,4 -ΟΗ-6- μεθυλαιθέρας-7-γλυκοσίδης (ομοπλανταγενίνη) 24

43 Eικόνα 9: Φαινολικά οξέα φασκόμηλου. Πηγή: Volatile Metabolites from Salvia fruticosa as Antifungal Agents in Soil Borne Pathogens,Pitarokili D, Tzakou O, Loukis A, Harvala C.. J. Agric. Food Chem., 2003; 51: Εικόνα 10:Φαινολικα συστατικά από πληθυσμούς S pomifera & S fruticosa. Πηγή: Cvetkovikj et al. Polyphenolic characterization and chromatographic methods for fast assessement of culinary salvia species from s. Europe, Journal of Chromatography A, 1282 (2013) 38 45, Εlsevier 25

44 1.5.1 Εποχική διακύμανση Φαινολικών Είναι αναμενόμενο πως όπως και τα αιθέρια έλαια ως προϊόντα μεταβολισμού έτσι και τα φαινολικά προϊόντα θα υπόκεινται σε περιβαλλοντικές και γενετικές επιδράσεις. Πιο συγκεκριμένα σε εποχιακή μελέτη εκχυλισμάτων από S. officinalis διαφορετικών εποχών συγκομιδής φάνηκε πως προς την εποχή άνθησης το ποσοστό ολικών φαινολικών (Total Phenolic Content) των εκχυλισμάτων, ήταν μέγιστο καθώς και το ολικό ποσοστό φλαβονοειδών (Total Flavonoid Content) ενώ το ροσμαρινικό οξύ είχε μέγιστη συγκέντρωση τον Νοέμβρη δηλαδή σε στάδιο βλάστησης του φυτού. Τα ίδια αποτελέσματα βρήκαν σε παρόμοια φυτικά είδη (ίδιας οικογένειας ) οι Luis & Johnson (2005) σε δεντρολίβανο. Πιθανόν, προς την αναπαραγωγική φάση παράγονται περισσότερα φλαβονοειδή για την άνθηση. Ενώ κατόπιν αυτής και με το ξεκίνημα της βλαστικής ανάπτυξης τα ποσοστά ροσμαρινικού αυξάνονται (Generalic et al. 2012). Σε άλλη μελέτη παρόμοια αποτελέσματα βρέθηκαν για δύο φυτά (S. fruticosa, R. officinalis). Δηλαδή το πρώτο έτος μελέτης είχαν μέγιστο TPC πριν την άνθηση (Φλεβάρη) ενώ το δεύτερο έτος είχαν μέγιστο TPC κατά την βλαστική ανάπτυξη (Αύγουστο). Τα ποσοστά κερσιτρίνης και λουτεολίνης παρουσίασαν μέγιστες τιμές κατά την εποχή άνθησης. Το ροσμαρινικό οξύ είχε μέγιστη τιμή πριν την άνθηση (Φλεβάρης), τα φερουλικό και 3,4-υδροξυβενζοϊκό οξύ δεν ακολούθησαν κάποια συγκεκριμένη πορεία. Αυτά τα αποτελέσματα πιθανόν οφείλονται σε συνδυασμό περιβαλλοντικών παραγόντων (θερμοκρασίας, υγρασίας, βροχόπτωσης). Φαίνεται ότι το στάδιο ανάπτυξης του φυτού παίζει σημαντικό ρόλο στην παραγωγή φαινολικών ενώσεων (Papageorgiou et al. 2008). 1.6 Φαρμακευτικές ιδιότητες και θεραπευτική δράση Μέχρι την ανακάλυψη των αντιβιοτικών, το φασκόμηλο αποτελούσε σύνηθες συστατικό σε αφεψήματα και συστηνόταν σε ασθενείς με φυματίωση για να παρεμποδίσει την εφίδρωση (Kintzios 2000) 26

45 Το αιθέριο έλαιο του φασκόμηλου χρησιμοποιείται έως και σήμερα για βελτιωτικό γεύσης-αρώματος στις βιομηχανίες τροφίμων, ποτών, καλλυντικών κ.ά. Εκτός όμως από τις χρήσεις του ως παράγοντας βελτίωσης γεύσεως και οσμής κατέχει ένα ευρύ φάσμα βιολογικών ιδιοτήτων όπως αντιβακτηριδιακές, μυκητοστατικές, ιοστατικές, στυπτικές, αντιοξειδωτικές, υποτασικές, κατασταλτικές του ΚΝΣ κ.ά. (Πιταροκοίλη & Τζάκου 2005) Αντιμικροβιακή και μυκοστατική δράση Συχνά τα αιθέρια έλαια με τα πτητικά τους μονοτερπένια ως κύρια συστατικά, αναφέρονται να έχουν αντιβακτηριακή δράση. Γενικώς, τα αρνητικά κατά Gram βακτήρια δεν είναι ή είναι λιγότερο ευαίσθητα στο αιθέριο έλαιο συγκρινόμενα με τα θετικά κατά gram βακτήρια, ενώ υπάρχουν και ερευνητές οι οποίοι υποστηρίζουν πως απουσιάζει η συσχέτιση μεταξύ αυτού (Yousef & Tawil 1980, Πιταροκοίλη & Τζάκου). Το έλαιο του φασκόμηλου δείχνει να έχει δράση σε πολλά βακτήρια της στοματικής κοιλότητας όπως υποχρεωτικά αναερόβια (Fusobacterium nucleatum, Peptostreptococcus anaerobius, Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola, Τreponema vincentii) αλλά και σε καπνόφιλα μικροαερόφιλα (Actinobacillus actinomy, Capnocytophaga spp., Eikenella corrodens) σε συγκέντρωση 0,06% w/v και 0,2% w/v. (Πιταροκοίλη & Τζάκου, 2005). Για αυτό το λόγο μάλιστα χρησιμοποιούνται σε προϊόντα στοματικής υγιεινής όπως οδοντόκρεμες και διαλύματα πλύσεων αφού καταπολεμούν την οδοντική πλάκα, την τερηδόνα και άλλες φλεγμονές της στοματικής περιοχής (Willershausen 1991). Σύμφωνα με τους Kustrak και Pepeljniak (1989), η αντιμικροβιακή δράση του φασκόμηλου οφείλεται στη σύσταση του σε 1,8-κινεόλη, p-κυμένιο, α,β-θυϊόνη, και καμφορά καθώς και την μεταξύ τους σχέση. Ενώ το Δαλματικό (κοινό) φασκόμηλο στην περιεκτικότητα του σε θυϊόνη. Το έλαιο του S. fruticosa κατά κάποιους ερευνητές δεν έχει (ή έχει πολύ μικρή) μυκοτοξική δράση εναντίων παθογόνων εδάφους όπως Fusarium oxysporum, 27

46 Fusarium moniliforme Macrophominia phaseolus, ή σε παθογόνα φυλλώματος (Βotrytis cinerea, Exserohilum turcicum) (Shimoni 1993). Προσφάτως όμως (Πιταροκoίλη 2003) φαίνεται να έχει καλή δράση εναντίων των R. solani f. sp. Curcubitae, R. solani, S. sclerotiorum και μικρότερη για τα F. Oxysporum f. Sp. dianthi και F. proliferatum. Παρομοίως το έλαιο από το S. officinalis περιόρισε τον μύκητα Aspergilus parasiticus κατά 87,6% σε συγκέντρωση 2 mg/ml και την δημιουργία αφλατοξινών παραπάνω από 96% (Farag 1986) ενώ έδειξε πολύ καλή δράση και κατά του μύκητα Βotrytis cinerea. Πρόσφατα άρχισαν να μελετώνται προς αυτή την κατεύθυνση και τα εκχυλίσματα του φυτού (διτερπενοειδή, φλαβονοειδή). Για παράδειγμα το ξηρό μεθανολικό εκχύλισμα από S. officinalis (50 mg/ml DMSO) είχε παρεμποδιστική δράση ενάντια σε Staphylococcus aureus ενώ καμία δράση σε Ε. coli και Pseudomonas aeruginosa (Baricevic et al. 1996). Ενώ είναι γνωστό ότι το καρνοσικό οξύ του εκχυλίσματος φασκόμηλου, έχει αντιβακτηριδιακή δράση κατά τους Dobrynin (1976) και Pavlenko (1989) Αντιική δράση Πιθανή δράση ενάντια σε ιούς από εκχύλισμα φυτού φασκόμηλου (S. officinalis) οφείλεται σε δύο διτερπενοειδή τύπου αβιετανίου. Το σαφινικολίδιο (safficinolide) και η σαγεόνη (sageone) τα οποία απομονώθηκαν από εναέρια μέρη του φυτού και είχαν δράση ενάντια του VSV (Vesicular Stomatitis Virus) και HSV (Ηerpes Simplex Virus type 1) αντίστοιχα (Tada et al. 1994, Πιταροκοίλη & Τζάκου 2005). Επιπλέον, οι Sivrοpoulou et al. (1997) αναφέρονται στην ισχυρή δράση του αιθέριου ελαίου του S. fruticosa ενάντια στον HSV (Herpes Simplex Virus 1). Τέλος, σύμφωνα με τους Βούλγαρους ερευνητές Baricevic et al. (1996) τα υδατικά και αλκοολικά εκχυλίσματα του φυτού S. officinalis έδρασαν σε περιπτώσεις γρίπης, έρπητα και δαμαλήτιδας (Manolova et al. 1995) και κυκλοφορούν για κλινική χρήση στη Βουλγαρία. 28

47 1.6.3 Αντιοξειδωτική, αντιφλεγμονώδης δράση & παρεμπόδιση ογκογένεσης Την τελευταία δεκαετία διερευνάται η σημασία των ελεύθερων ριζών στην αιτιολογία των ασθενειών. Έτσι, υπάρχει μια νέα προσέγγιση για τα βιοχημικά φαινόμενα που εμπλέκονται στην μεταλλαξιμότητα, την ογκογένεση και την εν γένει δημιουργία καρκίνων. Οι βιομεμβράνες είναι πλούσιες σε πολυακόρεστα λιπαρά οξέα, τα οποία όμως είναι πολύ ευαίσθητα στην υπεροξείδωση (peroxidative damage) ένα φαινόμενο που προκύπτει από τις ελεύθερες ρίζες. Αυτές γεννιούνται από μεταβολικά μονοπάτια τα οποία υπάρχουν στο σώμα ή από μετατροπή συγκεκριμένων ξενοβιωτών μορίων και περιβαλλοντικών μολυντών. Τα φυσικά αντιοξειδωτικά τα οποία υπάρχουν σε μια ισορροπημένη διατροφή δρουν ως προστατευτικοί παράγοντες ενάντια στις ελεύθερες ρίζες και αν υπάρχουν σε επαρκή ποσότητα, δεσμεύοντας τις ελεύθερες ρίζες προλαμβάνουν τις βλάβες των ιστών (Deighton et al. 1993). Τα φύλλα του S. officinalis είναι γνωστά για τα συστατικά με φαινολική δομή και το αντιοξειδωτικό δυναμικό που κατέχουν (Cuvelier 1994), (Exarchou et al. 2002). Τα κύρια συστατικά του φασκόμηλου που δείχνουν υψηλή αντιοξειδωτική δράση είναι τα φαινολικά διτερπένια, καρνοσικό οξύ (carnosic acid-ασταθές), και τα παράγωγά του, καρνοσόλη (carnosol), ροσμανόλη (rosmanol), επιροσμανόλη (epirosanol), 7- μεθυλοεπιροσμανόλη (7-methyl-epirosmanol), 9-αιθυλεθέρας της ροσμανόλης (rosmanol9-ethylether) και το ροσμαρινικό οξύ (rosmarinic acid) του οποίου η δράση ανταγωνίζεται αυτή του ασκορβικού οξέος. Κάποια ισχυρά φυσικά αντιοξειδωτικά όπως η καρνοσόλη (carnosοl) αποδείχθηκαν να φέρουν αντιφλεγμονώδη και παρεμποδιστική δράση σχετικά με την διεργασία δημιουργίας όγκων σε πρωτόκολλα ερευνών με ποντίκια (Huang et al. 1994). Επιπλέον, κάποια συστατικά του φασκόμηλου όπως το ουρσολικό οξύ (ursolic acid) και το ολεανολικό οξύ (oleanolic acid), έδειξαν αντιφλεγμονώδη δράση και παρεμπόδισαν την ογκογένεση σε δέρμα ποντικιών (Tokuda et al. 1986, Huang et al. 1994) Επίσης, εκχυλίσματα από S. officinalis παρεμπόδισαν το επαγόμενο οίδημα σε δέρμα ποντικιών το οποίο προέκυψε από λάδι κρώτονα. Το πιθανότερο συστατικό που εμπλέκεται σε αυτή την δράση είναι το ουρσολικό οξύ κατά τον Baricevic (2000). Τέλος, από άλλες μελέτες το ουρσολικό οξύ έδειξε σημαντική κυτταροτοξική 29

48 δράση σε καρκινικά λεμφατικά κύτταρα λευχαιμίας (lymphatic leukemia) P-388 όπως και σε κύτταρα ανθρώπινου καρκινώματος πνευμόνων (A-549), ενώ αμφότερα τα ουρσολικό οξύ και η καρνοσόλη συγκρίνονται με το ρετινοϊκό οξύ (retinoic acid RA) το οποίο είναι γνωστό ότι φέρει ογκο-παρεμποδιστική δράση (Lee et al. 1988, Huang et al. 1994, Tokuda et al. 1986, Πιταροκοίλη & Τζάκου 2005) Αντιμεταλλαξιογόνος δράση Περί τα τέλη του 1980, υδατικά εκχυλίσματα του φασκόμηλου S. officinalis δοκιμάστηκαν για την ιδιότητά τους ενάντια στην Salmonella typhimurium TA 98 της Trp-p2, ένα καρκινογόνο βακτήριο το οποίο υπάρχει σε κάποια τρόφιμα. Κάποια υδατικά εκχυλίσματα κατέστειλαν την μεταλαξιμότητα κατά 90% (Natake et al. 1989). Από τότε έγιναν πολλές έρευνες και φαίνεται ότι τα εκχυλίσματα τα οποία περιείχαν καμφορά είχαν την καλύτερη δράση σε συγκεκριμένα πειραματικά μοντέλα με UV επαγόμενες μεταλλάξεις σε E. coli (Simic et al. 1997) Αντισπασμωδική δράση Έχει αναφερθεί τέτοια δράση για εκχυλίσματα S. officinalis & S. fruticosa, in vitro, τα οποία αναστέλλουν τη σύσπαση λείων μυϊκών ινών συστολής επαγόμενης από ακετυλοχολίνη, ισταμίνη, σεροτονίνη, και χλωρίδιο του βαρίου σε ποσοστά 60 με 80%. Ωστόσο τα συστατικά αιθέριου ελαίου, όπως το πινένιο ή η βορνεόλη, έδειξαν σπασμογενή (spasmogenic) δράση per se, σε δοσοεξαρτώμενες συγκεντρώσεις (Kintzios 2000). 30

49 1.6.6 Υπογλυκαιμική δράση Με βάση τα δεδομένα της εθνοφαρμακευτικής αλλά και φαρμακολογικών μελετών τα S. officinalis και S. fruticosa και άλλα είδη κατέχουν ισχυρή υπογλυκαιμική δράση σε πειραματικά μοντέλα διαβητικών ποντικιών. Τα υδατικά εκχυλίσματα φύλλων από S. fruticosa χρησιμοποιούνταν στην παράδοση ανατολικών μεσογειακών χωρών ως ισχυρά υπογλυκαιμικά σκευάσματα. Αυτό βεβαιώνουν και έρευνες σε διαβητικά ποντίκια από τους Perfumi et al. (1991) Εντομοαπωθητική δράση Τα αρωματικά φυτά και τα αιθέρια έλαια τους θεωρούνται από τις πιο αποτελεσματικές, νέες δραστικές και οικολογικές προσεγγίσεις για τον έλεγχο εντομολογικών εχθρών όπως τετρανύχων, νηματωδών, κ. ά. (Barisevic & Bartol 2002). Η δράση αυτή οφείλεται κυρίως στα μονοτερπένια τα οποία είναι και οι δραστικές ουσίες των αιθέριων ελαίων. Η δράση μπορεί να είναι καπνιστική ή τοπική-επαφής (S. fruticosa). Επιπλέον, αντιτροφική ή απωθητική (S. officinalis, S. fruticosa) ανάλογα με τη δοσολογία (Konstantopoulou et al. 1992, Lee et al. 1997) Τοξικότητα Το φαινόμενο των επιπλοκών στο κεντρικό νευρικό σύστημα του ανθρώπου από σκευάσματα Salvia είναι γνωστό πάνω από έναν αιώνα (Cadeac & Meunier 1881). Πολλές είναι οι περιπτώσεις ανθρώπινης δηλητηρίασης με συμπτώματα σπασμών, από υπερδοσολογία αυτού του «πολυφαρμάκου» (Muller et al. 1981). Προφανώς, οι κετόνες θυϊόνη και καμφορά (κετονικά τερπένια) είναι υπεύθυνες, οπότε το έλαιο δεν πρέπει να καταναλώνεται ούτε συστήνεται προς αρωματοθεραπεία. Η LD50 είναι 2,6 g/kg (εκ του στόματος χορηγήσεως-oral rats) και 5 g/kg (διαδερμικά-intradermal rabbit) (Newall et al. 1996). 31

50 2. ΣΚΟΠΟΣ Το γένος Salvia της οικογένειας Lamiaceae περιλαμβάνει σχεδόν 900 είδη με κοσμοπολίτικη κατανομή σε όλο το κόσμο, συνοδευόμενα από μορφολογικές και γενετικές διαφορές ανάλογα με τη γεωγραφική προέλευσή τους. Στην ελληνική χλωρίδα περιλαμβάνονται 23 taxa του γένους αυτού από τα οποία τα πιο διαδεδομένα και χρησιμοποιούμενα είναι τα S. officinalis, S. fruticosa και S. pomifera. Αρκετές μελέτες έχουν δείξει ότι τα αιθέρια έλαια καθώς και τα αλκοολικά και υδατικά εκχυλίσματα των φυτών αυτών παρουσιάζουν βιολογικές δράσεις όπως αντιβακτηριακές, αντιμικροβιακές, αντιμυκητιακές, αντικαρκινικές, αντιοξειδωτικές κ.α. Αυτές οι βιολογικές δράσεις οφείλονται στα προϊόντα δευτερογενούς μεταβολισμού του φασκόμηλου που ανήκουν στις κατηγορίες των τερπενοειδών και των πολυφαινολικών κυρίως. Η χημική σύσταση των αιθέριων ελαίων του Salvia spp. εξαρτάται από το εκάστοτε είδος και παρουσιάζει μεγάλη παραλλακτικότητα. Ακόμα όμως και στο κάθε είδος, το αιθέριο έλαιο επηρεάζεται σημαντικά από γενετικούς και περιβαλλοντικούς παράγοντες, από το όργανο του φυτού που συγκομίστηκε, από την ηλικία των φυτών (φαινολογία της καλλιέργειας), το κλίμα της περιοχής, την εποχή, τις καλλιεργητικές τεχνικές καθώς και από τις μεθόδους παραλαβής του ελαίου που ακολουθήθηκαν. Αποτέλεσμα των παραπάνω είναι πολλές φορές τα αιθέρια έλαια των φυτών αυτών να μην έρχονται σε απόλυτη συμφωνία με διεθνή πρότυπα διαπίστευσης (ISO 9909), δημιουργώντας αναστάτωση στις αγορές και την εμπορία των αιθερίων ελαίων. Ομοίως, οι πολυφαινόλες είναι ένα άθροισμα προϊόντων δευτερογενούς μεταβολισμού των φυτών με μεγάλη ετερογένεια σχεδόν 8000 διαφορετικών δομών μέχρι σήμερα. Σχετίζονται με διάφορες ευεργετικές δράσεις, μία εκ των οποίων είναι και η αντιοξειδωτική, με βασικό γνώρισμα αυτής τη δέσμευση των ελεύθερων ριζών. Οι ελεύθερες ρίζες προκαλούν οξείδωση των λιπιδίων στα βιολογικά συστήματα, γεγονός που οδηγεί σε παθογενείς καταστάσεις στους οργανισμούς ή ακόμα υποβάθμιση των τροφίμων στις βιομηχανίες τροφίμων. Επιπλέον, τα τελευταία χρόνια υπάρχει μια τάση προς αλλαγή των συνθετικών αντιοξειδωτικών ουσιών τα οποία χρησιμοποιούνταν παραδοσιακά για τη συντήρηση των τροφίμων, προς προϊόντα φυσικής προέλευσης λόγω ανεπιθύμητων δράσεων προς τον καταναλωτή. 32

51 Υπό αυτές τις συνθήκες το φασκόμηλο ίσως αποτελέσει μια διέξοδο για την παραλαβή ουσιών με έντονο αντιοξειδωτικό προφίλ. Σκοπός σε αυτή την διπλωματική μελέτη ήταν η εποχική ανάλυση της ποσοτικής και ποιοτικής σύστασης του αιθέριου ελαίου τριών πληθυσμών φυτών φασκόμηλου τα οποία καλλιεργήθηκαν στο βοτανικό κήπο του Πανεπιστημίου Πατρών. Θελήσαμε να διερευνήσουμε αν τα βασικά συστατικά του αιθέριου ελαίου για τον κάθε πληθυσμό φυτών διαφοροποιούνται μεταξύ διαφορετικών εποχών συγκομιδής και αν έχουμε μεταξύ των πληθυσμών στατιστικά σημαντικές διαφορές ανά εποχή για κάθε είδος, συμπεριλαμβανομένης της καλοκαιρινής περιόδου συγκομιδής η οποία είναι και η καθιερωμένη εποχή συλλογής φασκόμηλου στην περιοχή μας αλλά και αυτή με τη μέγιστη απόδοση ελαίου. Επιπλέον υπολογίστηκε η απόδοση αιθέριου ελαίου μεταξύ των διαφορετικών περιόδων συγκομιδής ώστε να διευκρινιστεί πότε είναι η καλύτερη εποχή για τη συγκομιδή του φασκόμηλου στην περιοχή μας με μέγιστη παραγωγή σε έλαιο και με ποιά σύσταση στην κάθε περίπτωση. Επιπροσθέτως, έγινε εκτίμηση ανά εποχή συγκομιδής για το ολικό φορτίο πολυφαινολών και των φλαβονοειδών (ΤPC & TFC) και συμπληρωματικά με αυτό μετρήθηκε το αντιοξειδωτικό δυναμικό των φυτών κάθε πληθυσμού με τις μεθόδους DPPH και FRAP. Η δέσμευση των ελεύθερων ριζών από τις αντιοξειδωτικές ενώσεις είναι ένας μόνο μηχανισμός παρεμποδισμού της λιπιδικής υπεροξείδωσης στα βιολογικά συστήματα. Οι μέθοδοι που υπολογίζουν την αντιοξειδωτική ικανότητα διαφέρουν ως προς τον τρόπο που δημιουργούν τις ελεύθερες ρίζες, τις συνθήκες, καθώς και τον τρόπο εκτίμησης των αποτελεσμάτων. Για αυτούς τους λόγους χρησιμοποιήσαμε παραπάνω από μία μέθοδο εκτίμησης αντιοξειδωτικού φορτίου, ευρέως διαδεδομένες και οι δυο στην ανάλυση φυσικών προϊόντων. Τέλος, έγινε συσχέτιση των αποτελεσμάτων όλων των μεθόδων για να εξακριβωθούν τυχόν σχέσεις μεταξύ τους καθώς και αδυναμίες λόγω μη εκλεκτικότητας κάποιων μεθόδων. 33

52 3. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 3.1 Υλικά και αντιδραστήρια Φυτικό υλικό Για τις πειραματικές αναλύσεις επιλέχθηκαν 14 άτομα φασκόμηλου από δύο είδη του γένους Salvia, τα S. pomifera spp. calycina και S. fruticosa. Τα άτομα αυτά προήλθαν από καλλιέργεια μοσχευμάτων 2 ετών των μητρικών αυτοφυών φυτών (3 πληθυσμοί, διαφορετικών γονοτύπων μεταξύ τους), των οποίων η καταγραφή, η συλλογή και η δημιουργία έγινε από την υποψήφια διδάκτορα Παναγιώτα Λεονταρίτου, υπό την επίβλεψη του Ομότιμου Καθηγητού Γρηγορίου Ιατρού. Πιο συγκεκριμένα, τα υπ αριθμόν 2, 3, 6, 14 φυτά ανήκαν στο είδος S. pomifera spp. calycina από την Αρκαδία. Τα 7, 8, 9, 16, 17 ανήκαν στον πληθυσμό S. fruticosa από την Αχαΐα, ενώ τα 10, 11, 12, 15 και 18 ανήκαν στον πληθυσμό S. fruticosa από τη Μεσσηνία. Η καλλιέργεια έγινε υπό τις ίδιες καλλιεργητικές συνθήκες στο βοτανικό κήπο του Πανεπιστημίου Πατρών (συντεταγμένες: 38 17' 53.4" N 21 48' 03.3" E). Η συγκομιδή των φυτών έγινε σε τέσσερα διακριτά χρονικά σημεία κατά τη διάρκεια ενός έτους. Η πρώτη συλλογή έγινε τον χειμώνα του 2015 (20 Δεκεμβρίου), ακολούθησε η συλλογή της άνοιξης 2016 (13 Απριλίου), του καλοκαιριού 2016 (21 Ιουλίου) και τέλος του φθινοπώρου 2016 (19 Οκτωβρίου). Τα δείγματα κατόπιν συλλογής αριθμούνταν και ξηραίνονταν υπό σκιά σε καλώς αεριζόμενο χώρο. Έπειτα, συσκευάζονταν σε πλαστικές σακούλες μιας χρήσης και αφήνονταν σε σκοτεινό χώρο μέχρι να αναλυθούν. Ο χρόνος αυτός δεν ξεπερνούσε τους 6 μήνες για την ανάλυση του GC-MS Χημικά αντιδραστήρια και διαλύτες Οι οργανικοί διαλύτες που χρησιμοποιήθηκαν ήταν μεθανόλη και πετρελαϊκός αιθέρας (>90 % καθαρότητα) και αναλυτικού βαθμού από την ChemLab (Zedelgem, Belgium). Το νερό ήταν υπερκάθαρο (αγωγιμότητας <18 ΜΩ) από συσκευή παραγωγής υπερκάθαρου νερού Millipore (Merck Millipore, Germany). Το οξικό οξύ 34

53 (CH3COOH) ήταν παγόμορφο από την Αpplichem (Darmstadt, Germany). To πυκνό υδροχλωρικό οξύ ήταν αναλυτικού βαθμού καθαρότητας από την Merck S.A. (Athens, Greece). To θειικό οξύ Η2SO4 είχε 95-97% καθαρότητα. Το υγρό άζωτο ήταν της Linde, και το αντιδραστήριο Folin-Ciocalteu ήταν της Applichem. Από τα στερεά αντιδραστήρια χρησιμοποιήθηκαν χλωριούχο νάτριο (analytical grade), άνυδρο θειικό νάτριο, βουτυλιωμένο υδροξυτολουόλιο, οξικό νάτριο, 2,4,6- τριπυριδυλο-s-τριαζίνη (ΤPTZ), ο εξαϋδρίτης χλωριούχου σιδήρου (FeCl3 *6H2O) και ο εξαϋδρίτης χλωριούχου αργιλίου από τη Sigma-Aldrich, 2,2-διφαινυλο-1- πυκρυλυδραζύλιο, πρότυπο κερσετίνης (quercetin dehydrate >90%, Extrasynthese), πρότυπο γαλλικού οξέος (GA >90%, Extrasynthese), επταένυδρος θειϊκός σίδηρος FeSO4x7H2O (Riedel-de Haen) Όργανα και σκεύη Η ανάλυση των αιθερίων ελαίων πραγματοποιήθηκε με το σύστημα Αέριας Χρωματογραφίας-Φασματομετρίας Μάζας (Gas Chromatography-Mass Spectrometry, GC-MS) με τα εξής χαρακτηριστικά: i) Aέριος Χρωματογράφος 6890 Ν GC: τριχοειδής στήλη ΗP-5 MS capillary column (30 mx 0.25 mm, 0.25 μm), φέρον αέριο ήλιο (Ηe) υψηλής καθαρότητας και ii) Φασματόμετρο Μάζας 5975Β inertmsd της εταιρίας Αgilent Technologies (U.S.A). Το λογισμικό που χρησιμοποιήθηκε ήταν το Agilent MSD Chem. Οι GC-MS αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν στο σύνολό τους στο Κέντρο Ενόργανης Ανάλυσης (ΚΕΑ) του Πανεπιστημίου Πατρών. Η επεξεργασία των φασμάτων του GC-MS έγινε με τη βοήθεια του προγράμματος ΑMDIS και η ταυτοποίηση των συστατικών με τη βοήθεια της φασματικής βιβλιοθήκης Nist MS Search v Για τα in vitro πειράματα μελέτης του ξηρού μεθανολικού εκχυλίσματος του φυτού προς υπολογισμό αντιοξειδωτικής δράσης, φλαβονοειδών, φαινολικών, χρησιμοποιήθηκαν πλαστικές πλάκες 96 κελίων (96 wellplates). Οι φωτομετρικές αναλύσεις έγιναν με το φωτόμετρο του εργαστηρίου φαρμακογνωσίας Sunrise TM της εταιρείας TECAN και την χρήση υπολογιστικού προγράμματος XFLuoR4. Για αυτές τις αναλύσεις χρησιμοποιήθηκαν φίλτρα για τα μήκη κύματος 405, 540, 595, 35

54 620 nm. Για την φόρτωση των μικροπλακών χρησιμοποιήθηκαν μηχανικές πιπέτες labopette και labnet ενώ για την εκχύλιση USE χρησιμοποιήθηκε λουτρό υπερήχων Isolab (Frequency: 40kHz & Ultrasonic power: 180W). Επιπλέον χρησιμοποιήθηκαν: Συσκευή υδροαπόσταξης Clevenger, μανδύες θέρμανσης, συσκευή συμπύκνωσης Buchi, συσκευή λυοφιλοποίησης Labconco, συσκευή φυγοκεντρικής εξάτμισης Labconco, φυγόκεντρος Selecta, ηλεκτρονικό phμετρο Consort, αναλυτικοί ζυγοί ακριβείας Kern, περιστροφικοί μαγνητικοί αναδευτήρες, eppendorf 1,5 & 2 ml, Falcon 15 & 50 ml, σπάτουλες μεταλλικές, κωνικές φιάλες γυάλινες, σφαιρικές φιάλες, vials γυάλινα, πιπέτες γυάλινες, ψυκτήρες, πουάρ, παγομηχανή, γουδί και πιάτο πορσελάνης για την ομογενοποίηση των φυτικών δειγμάτων. 3.2 Πειραματικές πορείες Aπόσταξη-ανάλυση αιθερίου ελαίου με GC-MS H εμφάνιση της Αέριου Χρωματογραφίας έγινε αρχικά το 1941 και η πειραματική της αξία οδήγησε στην απονομή του βραβείου Nobel Xημείας το 1952 στους Martin και Synge, ενώ 12 βραβεία Nobel από το δόθηκαν σε ερευνητές οι οποίοι ασχολήθηκαν με χρωματογραφικές τεχνικές. Σήμερα, η αέριος χρωματογραφία πρόκειται για ένα βασικό εργαλείο στα χέρια του ερευνητή με πολλές προεκτάσεις στις θετικές επιστήμες και σχετικά απλότητα εφαρμογής αφού έχει γίνει αυτοματοποιημένη. Στην Αέριο Χρωματογραφία η κινητή φάση είναι ένα αδρανές αέριο (όπως N2, H2, He, Ar) και η στατική φάση μπορεί να είναι στερεή (Gas-Solid-Chromatography) ή υγρή ακινητοποιημένη στην επιφάνεια ενός αδρανούς αερίου (Gas-Liquid Chromatography, GLC). H διαδικασία γίνεται με διάλυση του προς ανάλυση δείγματος σε ένα πτητικό διαλύτη (π.χ. εξάνιο, διαιθυλαιθέρα) και εγχέεται με τη βοήθεια μιας μικροσύριγγας στην βαλβίδα εισαγωγής του δείγματος η οποία 36

55 βρίσκεται πριν την στήλη. Το αδρανές αέριο έπειτα της έγχυσης του δείγματος, φέρεται στη στήλη και συμπαρασύρει το δείγμα. Για καλύτερο διαχωρισμό των συστατικών του δείγματος φαίνεται ότι σημαντικό ρόλο παίζει η θερμοκρασία. Επομένως, η στήλη είναι τοποθετημένη σε κλίβανο, η θερμοκρασία του οποίου ρυθμίζεται ανάλογα με το επιθυμητό θερμοκρασιακό πρόγραμμα. Το θερμοκρασιακό πρόγραμμα μπορεί να είναι ισοκρατικό, δηλαδή με σταθερή θερμοκρασία καθόλη την πορεία ή διαβαθμιζόμενο με χρονικές μεταβολές. Μετά την στήλη τα διαχωριζόμενα συστατικά του δείγματος φέρονται προς τον ανιχνευτή του σήματος και καταγράφονται ως χρωματογράφημα. Κάθε κορυφή του χρωματογραφήματος αντιστοιχεί σε ένα συστατικό και μπορεί να εύκολα να ταυτοποιηθεί και να ποσοτικοποιηθεί. Η ταυτοποίηση γίνεται μέσω του χρόνου έκλουσης (Retention time, tr) που αντιστοιχεί στο χρονικό διάστημα από τη στιγμή της έγχυσης του δείγματος και της εμφάνισης της κορυφής του, ενώ η ποσοτικοποίηση γίνεται μέσω του εμβαδού που περικλείει η κάθε κορυφή. Η στήλη περιέχει την στατική φάση και υπάρχουν 2 είδη: οι πληρωμένες (packed) και οι ανοικτού σωλήνα (open tubular) ή τριχοειδείς (capillary). Κατασκευάζονται από ανοξείδωτο χάλυβα, ύαλο, τετηγμένο πυρίτιο, ή Teflon, ενώ το υλικό πληρωσής τους μπορεί να είναι πολυ-(διμεθυλο)-σιλοξάνιο, πολυ-(φαινυλομεθυλο)-σιλοξάνιο και πολυ-(δικυανοαλλυλοδιμεθυλο)-σιλοξάνιο. Το μήκος τους κυμαίνεται από 1-2 m για τις πληρωμένες στήλες και αρκετών εκατοντάδων μέτρων για τις τριχοειδείς. Η διαχωριστική ικανότητα της στήλης μπορεί να βελτιωθεί με την αύξηση του μήκους της, οδηγώντας έτσι και στην αύξηση του χρόνου διαχωρισμού των συστατικών του δείγματος. Η συγκεκριμένη μέθοδος μπορεί να χρησιμοποιηθεί μόνο στην ανάλυση πτητικών ενώσεων ή παραγώγων τους. Στα πλεονεκτήματα της μεθόδου συγκαταλέγεται η υψηλή διαχωριστική ικανότητα και η υψηλή ικανότητα ανίχνευσης των αναλυόμενων συστατικών που κυμαίνεται σε μερικά δισεκατομμυριοστά του γραμμαρίου (ng) και κάποιες περιπτώσεις φθάνει τα μερικά τρισεκατομμυριοστά του γραμμαρίου (pg). Στους σύγχρονους αεριοχρωματογράφους υπάρχει η δυνατότητα σύνδεσής τους με ένα φασματόμετρο με σκοπό την καλύτερη ανάλυση δειγμάτων τα οποία είναι 37

56 απαλλαγμένα από τυχόν προσμίξεις οι οποίες θα δυσκόλευαν την ανάλυση σε μια τεχνική MS. Έτσι με κατάλληλη συνδεσμολογία μετά την στήλη του αέριου χρωματογράφου τα διαχωρισμένα συστατικά του δείγματος διέρχονται από το φασματόμετρο μάζας. Εκεί το κάθε ένα συστατικό θραυσματοποιείται και τελικώς λαμβάνεται ένα χρωματογράφημα που δείχνει το λόγο μάζας προς φορτίο (m/z) των θραυσμάτων που προκύπτουν του καθενός συστατικού (Κitson et al. 1996, Hubschmann 2001, Skoog et al. 2007, McMaster 2008). Εικόνα 11: Αέριος χρωματογράφος συνδεδεμένος με φασματοφωτόμετρο μαζών (Agilent Τechnologies). Πηγή: προσωπικό αρχείο. Πειραματική πορεία απόσταξης Για την εξαγωγή του αιθέριου ελαίου και την παραλαβή του σε ικανοποιητική απόδοση πραγματοποιήθηκε τεμαχισμός και τυχαία επιλογή των φύλλων από το κάθε άτομο φασκόμηλου, με σκοπό την αύξηση της επιφάνειας η οποία είναι πλούσια σε ελαιοφόρους αδένες και διευκολύνει την συλλογή των αιθέριων ελαίων αλλά και την μη συλλογή φύλλων συγκεκριμένου φαινολογικού σταδίου (γηραιά ή νεαρά). 38

57 Στη συνέχεια για κάθε φυτικό είδος ζυγίστηκαν ποσότητες μικρότερες των 15 g ξηρής δρόγης σε ζυγό ακριβείας τριών δεκαδικών ψηφίων και μεταφέρθηκαν σε γυάλινη εσμυρισμένη σφαιρική φιάλη χωρητικότητας 2 L. Εκεί προστέθηκε εικοσαπλάσια ποσότητα νερού βρύσης και αμέσως μετά η φιάλη τοποθετήθηκε σε θερμαινόμενο μανδύα και συνδέθηκε με την γυάλινη αποστακτική συσκευή Clevenger. Στο σημείο αυτό προστέθηκαν ελάχιστα ml νερού από την προηγούμενη ποσότητα ώστε το σύστημα να έρθει σε υδροστατική ισορροπία και το νερό να φτάσει σε μια νοητή ευθεία γραμμή (αρχή συγκοινωνούντων). Η ποσότητα της φυλλικής μάζας ελέγχθηκε ότι βρισκόταν σε άμεση επαφή με το νερό και η κατόπιν αυτού παροχή θερμότητας ρυθμίστηκε για να ξεκινήσει η θέρμανση του συστήματος. Ακολούθως, αφού επιτεύχθηκε θερμοκρασία βρασμού του μείγματος ο χρόνος απόσταξης μετρήθηκε κατόπιν της πρώτης υγροποίησης των ατμών και ήταν ίσος με 2 ώρες. Τέλος, το σύστημα αφηνόταν να κρυώσει για 15 λεπτά και το έλαιο συλλεγόταν αφού καταγραφόταν πρώτα η ποσότητά του. Ακολουθούσε προσθήκη άνυδρου θειικού νατρίου για δέσμευση τυχών υπολειμμάτων νερού και φυγοκέντρηση για να εξασφαλίσει ότι το έλαιο θα συλλεγόταν και θα αποθηκευόταν με ασφάλεια χωρίς άλλες προσμίξεις. Εικόνα 12: Διάταξη απόσταξης με συσκευή Clevenger. Εικόνα 13: Δείγμα αιθέριου ελαίου φασκόμηλου κατόπιν φυγοκέντρησης. 39

58 Πειραματικό πρωτόκολλο GC-MS Κατόπιν υδροαπόσταξης με συσκευή Clevenger της δρόγης φασκόμηλου, το παραλαμβανόμενο αιθέριο έλαιο αποθηκευόταν στην κατάψυξη (-18 o C) και στη συνέχεια στελνόταν για ανάλυση με αραίωση 1:40 σε διαλύτη οξικό αιθυλεστέρα αναλυτικής καθαρότητας με χρήση οκτανίου ως εσωτερικό πρότυπο (τελική συγκέντρωση 0,25 mg/ml). Μετά από ποιοτικά πειράματα της κ. Παναγιώτας Λεονταρίτου και της κ. Βιργινίας Δημάκη, το πρόγραμμα ανάλυσης είχε ως εξής: S. fruticosa: Η αρχική θερμοκρασία του προγράμματος ανάλυσης ρυθμίζεται στους 50 C όπου διατηρείται σταθερή για τα πρώτα 4 λεπτά. Έπειτα φθάνει στους 60 C όπου παραμένει για 10 λεπτά. Η αύξηση θερμοκρασίας συνεχίζεται σε διαφορετικά στάδια ώστε να φτάσει στους 301 C όπου παραμένει για 3 λεπτά. Καθόλη τη διάρκεια του προγράμματος, το δείγμα εισάγεται στη στήλη προς ανάλυση εξ ολοκλήρου από την αρχή (splitless). Πίνακας 1: Πρόγραμμα ανάλυσης GC-MS που ακολουθήθηκε για το αιθέριο έλαιο S. fruticosa. Αρχικός χρόνος (4.00 min) Βήμα Αρχική θερμοκρασί α (50 C) Ρυθμός ( C/min) Μέθοδος splitless Τελική θερμοκρασία ( C) Χρόνος τελικός (min) S. pomifera: Η αρχική θερμοκρασία του προγράμματος ανάλυσης, και εδώ όπως στο S. fruticosa, ρυθμίζεται στους 50 C όπου διατηρείται σταθερή για το πρώτο λεπτό. Έπειτα φθάνει στους 59 o C όπου παραμένει για 3 λεπτά. Η αύξηση θερμοκρασίας συνεχίζεται σε διαφορετικά στάδια ώστε να φτάσει στους 300 C όπου παραμένει για 40

59 2 λεπτά. Καθόλη την διάρκεια του προγράμματος το δείγμα εισάγεται στη στήλη προς ανάλυση εξ ολοκλήρου από την αρχή (splitless). Πίνακας 2: Πρόγραμμα ανάλυσης GC-MS που ακολουθήθηκε για το αιθέριο έλαιο S. pomifera Αρχικός χρόνος (1.00 min) Βήμα Αρχική θερμοκρασί α (50 C) Ρυθμός ( C/min) Μέθοδος splitless Τελική θερμοκρασία ( C) Χρόνος τελικός (min) Εκχύλιση φύλλων φασκόμηλου με τη βοήθεια υπερήχων Η εκχύλιση πρόκειται για μια συνηθισμένη μέθοδο διαχωρισμού και βασίζεται στην κατανομή μιας ένωσης μεταξύ δύο φάσεων οι οποίες αναμειγνύονται ελάχιστα μεταξύ τους. Η απλούστερη μορφή της είναι αυτή μεταξύ ενός μείγματος στερεών και κάποιου διαλύτη. Σε αυτή την περίπτωση ο διαλύτης ανάλογα με το είδος του (πολικός ή μη) απορροφά τα χημικά συστατικά του στερεού μείγματος (πολικά ή μη). Πολλές προσπάθειες έχουν γίνει για να μειωθεί ο χρόνος εκχύλισης καθώς και για να αυξηθεί η απόδοσή της. Από τις σύγχρονες μεθόδους εκχύλισης η τεχνική της εκχύλισης με τη βοήθεια υπερήχων (Ultrasound Assisted Extraction) ακολουθεί αυτή την κατεύθυνση αυξημένης αποτελεσματικότητας ανάλογα βέβαια με την χρήση του εκάστοτε διαλύτη. Η εφαρμογή της USE προς αύξηση της εκχυλιστικής απόδοσης ξεκίνησε τη δεκαετία του 1950 (Vinarotu 2001). Από τότε μέχρι σήμερα έχουν συμβεί πολλές αλλαγές και η συνεχής έρευνα καθιέρωσε την χρήση αυτής της τεχνικής σε αρκετά πρωτόκολλα 41

60 παραλαβής βιοδραστικών ενώσεων από φυσικά προϊόντα καθώς και στην παραλαβή αιθέριων ελαίων από αρωματικά φυτά (Vinarotu 2001, Toma et al. 2001, Vilkhu et al. 2008). O μηχανισμός δράσης αυτής της μεθόδου δεν είναι απόλυτα γνωστός, ωστόσο η εφαρμογή των υπερήχων προκαλεί κυτταρική λύση του φυτικού υλικού με αποτέλεσμα την καλύτερη διείσδυση του διαλύτη και ως επακόλουθο την αύξηση της απόδοσης εκχύλισης. Η αποτελεσματικότητα αυτής της τεχνικής κρίνεται από το φαινόμενο της σπηλαίωσης μηχανικές και θερμικές διεργασίες. To φαινόμενο της σπηλαίωσης, αναφέρεται στην διαδικασία δημιουργίας φυσαλίδων (σπηλαίας ατμού), σε ένα ρέον υγρό, στο σημείο όπου η πίεσή του ελαττώνεται φτάνοντας σε επίπεδα χαμηλότερα από την πίεση των ατμών του. Φυσικό επακόλουθο είναι εσωτερικές ρήξεις των φυσαλίδων οι οποίες βοηθούν στο να εκθέτουν νέα φυτικά τμήματα στο διαλύτη εκχύλισης. Κατά την χρήση αποξηραμένου φυτικού υλικού (όπως και το φασκόμηλο που χρησιμοποίησα) η διαβροχή της δρόγης από τον διαλύτη, διευκολύνει την διόγκωση των πόρων στα κυτταρικά τοιχώματα με αποτέλεσμα την καλύτερη είσοδο του διαλύτη σε αυτά. Κατόπιν αυτού έχουμε φαινόμενα διάχυσης και ώσμωσης ενώ η χρήση μικροσκοπίου έδειξε ότι οι υπερηχητικές δονήσεις ασκούν έντονες μηχανικές επιδράσεις στο σύνολο των κυτταρικών δομών της δρόγης με αποτέλεσμα την πλήρη αποδιάταξή τους (Vinarotu 2001, Toma et al. 2001, Romanik et al. 2007, Vilkhu et al. 2008, Shotipruk et al. 2001). Πειραματικό πρωτόκολλο USE Κατά τη διαδικασία αυτή σκοπός ήταν αρχικά να γίνει απομάκρυνση των λιπόφιλων συστατικών (defatting) από τη δρόγη. Το παρακάτω πρωτόκολλο εκχύλισης βασίστηκε στη μελέτη των Nikolova και συνεργατών (Nikolova et al. 2007) ως προς τη χρήση των διαλυτών (πετρελαϊκό αιθέρα και 70% μεθανόλη) αλλά με αρκετές τροποποιήσεις ως προς την πειραματική διαδικασία. Λεπτομερώς, 1 g δρόγης (φύλλα μόνο) τοποθετούνταν στο πορσελάνινο πιάτο και με προσεκτική προσθήκη υγρού αζώτου συνθλιβόταν με το γουδί σε μικρά τεμάχια για αύξηση της επιφάνειας φυτικού υλικού προς εκχύλιση. Αυτά εκχυλίστηκαν αρχικά με 20 ml πετρελαϊκού 42

61 αιθέρα σε σφαιρική φιάλη σε λουτρό υπερήχων για 20 λεπτά. H διαδικασία επαναλήφθηκε για άλλες δύο φορές. Σε κάθε τέλος του κύκλου εκχύλισης, το εκχύλισμα συλλεγόταν διαμέσου διηθητικού χαρτιού, συμπυκνωνόταν και αποθηκευόταν σε σφαιρική φιάλη. Αυτό το εκχύλισμα περιείχε τα λιπόφιλα συστατικά και φυλάχθηκε στην κατάψυξη. Η δρόγη, κατόπιν τριών κύκλων εκχύλισης με πετρελαϊκό αιθέρα, τοποθετήθηκε σε σφαιρική φιάλη με 70% μεθανόλη (aq.) και εκχυλίστηκε σε ίδιες συνθήκες για συνολικά τρεις φορές. Κατά την πορεία της διαδικασίας, η θερμοκρασία δεν υπερέβαινε τους 40 C με τη χρήση πάγου, ενώ κάθετος ψυκτήρας είχε προσαρτηθεί ώστε να μην εξατμιστούν οι διαλύτες. Κατά το τέλος της διαδικασίας έγινε διήθηση με νέο διηθητικό χαρτί και συλλογή του μεθανολικού εκχυλίσματος. Κατόπιν ακολούθησε συμπύκνωση και αποθήκευση του υλικού στην κατάψυξη. Η διαδικασία ολοκληρωνόταν με λυοφιλοποίηση των δειγμάτων ώστε να αναχθούν σε ξηρή μάζα (DW). Δηλαδή, τοποθετούνταν σε κλάσματα μέσα σε σωλήνες πλαστικούς (falcon των 15 ml) και μετά από χειρισμό με υγρό άζωτο ακολουθούσε λυοφιλοποίηση. Το ξηρό εκχύλισμα αποθηκευόταν στην κατάψυξη (-18 C) σε πλαστικούς σωλήνες τύπου falcon. Εικόνα 14: Διάταξη εκχύλισης με USE μεθοδολογία Εικόνα 15: Συμπυκνωτής με εκχύλισμα φασκόμηλου προς συμπύκνωση 43

62 3.3 In vitro αναλύσεις Προσδιορισμός ολικών φαινολών (ΤPC) με τη μέθοδο Folin Ciocalteu Λόγω της ετερογένειας των φαινολικών (phenolics) τα οποία περιέχονται στα φυτικά προϊόντα, έχουν προταθεί μέχρι σήμερα πολλές μέθοδοι για τον καθορισμό τους, χωρίς καμία από αυτές να είναι τέλεια (Prior et al. 2005). Η μέθοδος Folin-Ciocalteu αποτελεί μια τυποποιημένη διαδικασία ρουτίνας με χαμηλό κόστος, καλή επαναληψιμότητα, κατάλληλη για χρήση σε πολλά δείγματα, και για αυτό άλλωστε προτιμάται ευρέως σε αναλύσεις φυσικών προϊόντων και τροφίμων. Ως μειονέκτημα της μεθόδου αναφέρεται η χαμηλή εκλεκτικότητα που έχει, καθώς μπορεί και αντιδρά με ενώσεις που περιέχουν άζωτο, με θειόλες, βιταμίνες και άλλες ενώσεις, και αυτό πρέπει να λαμβάνεται υπόψιν στην ανάλυση και την ερμηνεία των αποτελεσμάτων. Η μέθοδος Folin-Ciocalteu βασίζεται στη μεταφορά ηλεκτρονίων από τα φαινολικά συστατικά προς φωσφο-μολυβδαινικά και φωσφο-βολφραμικά ετεροπολυμερή οξέα. Η αντίδραση πραγματοποιείται σε αλκαλικές συνθήκες με τελικό προϊόν χρώματος μπλε, το οποίο απορροφά στο ορατό (760 nm) και είναι ένα σύμπλεγμα μολυβδαινίου-βολφραιμίου (Mo-W). Για την ποσοτικοποίηση των αποτελεσμάτων χρησιμοποιείται ως πρότυπη ουσία το γαλλικό οξύ (Singleton & Rossi 1965, Ainsworth & Grillespie 2007, Xu et al. 2015). Εικόνα 16: Αντίδραση Φαινόλης με το αντιδραστήριο Folin-Ciocalteau και τα προϊόντα της αντίδρασης 44

63 Πειραματικό πρωτόκολλο για F-C Στα κελιά των μικροπλακών τοποθετήθηκαν οι ακόλουθες ποσότητες αντιδραστηρίων και δείγματος προς υπολογισμό του ολικού φορτίου πολυφαινολών (Τotal Phenolic Content, TPC). Οι συγκεντρώσεις του δείγματος ήταν 0,800 0,500 0,250 mg/ml ενώ οι συγκεντρώσεις της πρότυπης ένωσης (γαλλικού οξέος) ήταν 0,250 mg/ml 0,200 mg/ml 0,150 mg/ml 0,125 mg/ml 0,100 mg/ml 0,050 mg/ml 0,025 mg/ml. Οι επαναλήψεις πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν για κάθε συγκέντρωση δείγματος. Η μέτρηση λήφθηκε κατόπιν επώασης σε θερμοκρασία δωματίου μετά από 30 min στα 620 nm και απουσία φωτός βάσει τροποποιήσεων των μεθόδων Singleton & Rossi (1965) και Ainsworth & Gillespie (2007). Πιο συγκεκριμένα 18 μl δείγματος αντέδρασαν με 144 μl υδατικό διάλυμα Na2CO3 7,5 % w/v και αντιδραστήριο F-C ενώ ως τυφλό χρησιμοποιήθηκε ddh2o. O προσδιορισμός του ΤPC έγινε με βάση την πρότυπη καμπύλη γαλλικού οξέος. Εικόνα 17: Μέθοδος Folin-Ciocalteu. Μικροπλάκα μετά από επώαση 30 min. Τα μεθανολικά εκχυλίσματα φασκόμηλου έχουν αντιδράσει και έδωσαν μπλε χρώμα, ενώ αντίθετα τα κελία με το τυφλό δείγματος (χωρίς αντιδραστήριο F-C) είναι σχεδόν άχρωμα Προσδιορισμός ολικών φλαβονοειδών (TFC) με την μέθοδο AlCl3 Τα φλαβονοειδή αποτελούν ένα μέρος της οικογένειας των φαινολικών συστατικών, η βασική δομή των οποίων περιλαμβάνει 15 άτομα άνθρακα διατεταγμένα σε δύο αρωματικούς δακτυλίους που ενώνονται μεταξύ τους με μια γέφυρα τριών ανθράκων. 45

64 Στα φλαβονοειδή περιλαμβάνονται πάρα πολλές ενώσεις (4000 μέχρι σήμερα) και απαντώνται στα ανώτερα φυτά (Ignat et al. 2011). Ουσίες όπως οι φλαβονόλες, φλαβόνες, φλαβανόνες, κατεχίνες, ανθοκυανιδίνες, ισοφλαβόνες ανήκουν σε αυτή την μεγάλη οικογένεια φυσικών προϊόντων και προκύπτουν από την ποικίλη υποκατάσταση των δακτυλίων του βασικού σκελετού Α, Β, και C (Tsao 2010). Η χρωματομετρική μέθοδος αυτή βασίζεται στη δημιουργία σταθερών συμπλόκων μεταξύ του τριχλωριούχου αργιλίου (AlCl3) και των υδροξυλομάδων ή κετονομάδων των φλαβονοειδών παρουσία όξινων συνθηκών. Συγκεκριμένα το αλκαλικό ph που δημιουργείται από την προσθήκη οξικού καλίου (CH3COOΚ) ευνοεί την συμπλοκοποίηση των ιόντων αργιλίου (Al 3+ ) με τα μόρια των φλαβονοειδών, δίνοντας ένα κίτρινο προϊόν. Και σε αυτή τη μέθοδο τα αποτελέσματα λαμβάνονται κατόπιν φωτομέτρησης και ποσοτικοποιούνται σε ανάλογα κερσετίνης (EQ-que) συνήθως στα nm (Chang 2002). Εικόνα 18: Κέντρα πρόσδεσης αντιδραστηρίου στο σκελετό φλαβονοειδών στη μέθοδο AlCl3. Πειραματικό πρωτόκολλο για την μέθοδο AlCl3 Οι συγκεντρώσεις του δείγματος που χρησιμοποιήθηκε είναι 5,0 mg/ml και 2,5 mg/ml ενώ της πρότυπης ένωσης (κερσετίνης) 2,0 mg/ml, 1,0 mg/ml, 0,8 mg/ml, 0,5 mg/ml, 0,3 mg/ml, 0,2 mg/ml και 0,1 mg/ml. Η εισαγωγή των ποσοτήτων έγινε με τρεις επαναλήψεις για την κάθε μία ουσία. Η επώαση της μικροπλάκας πραγματοποιήθηκε απουσία φωτός σε θερμοκρασία δωματίου στα 405 nm έπειτα από 46

65 πέρας χρόνου 45 min (τροποποιημένο πρωτόκολλο εργαστηρίου). Πιο συγκεκριμένα 25 μl δείγμα φασκόμηλου, 5 μl υδατικό διάλυμα AlCl3, 5 μl διάλυμα CH3COOK και 140 μl ddh2o αντέδρασαν δίνοντας κίτρινα προϊόντα. Ως τυφλό χρησιμοποιήθηκε ddh2o και ΜeOH 95%. Για τον προσδιορισμό του φορτίου φλαβονοειδών (Total Flavonoid Content, TFC) χρησιμοποιήθηκε η πρότυπη καμπύλη κερσετίνης. Εικόνα 19: Μέθοδος προσδιορισμού φλαβονοειδών. Μικροπλάκα μετά από επώαση 45 min. Τα κελία με το μεθανολικό εκχύλισμα φασκόμηλου έχουν αντιδράσει δίνοντας κίτρινο χρώμα. Αντίθετα τα τυφλά δείγματος (χωρίς AlCl3) είναι σχεδόν διαφανή Προσδιορισμός αντιοξειδωτικής ικανότητας Υπάρχει μια πλειάδα αναλυτικών μεθόδων οι οποίες μετρούν την αντιοξειδωτική δραστικότητα των συστατικών φυτικής προελεύσεως (Miller et al. 1994, Re et al. 1999, Zielinski et al. 1999, Schwarz et al. 2000, Gramza et al. 2016). Αυτό γίνεται επειδή η αντιοξειδωτική δράση δεν πρέπει να εκτιμάται με μία μόνο μέθοδο καθώς σε κάθε μέθοδο μετρώνται διαφορετικά πράγματα σε διαφορετικές συνθήκες, όπως δέσμευση ριζών, αναγωγική ικανότητα, αναστολή της υπεροξείδωσης των λιπιδίων κ.ά, συνεπώς η εκτίμηση δεν θα ήταν ολοκληρωμένη ( Alam et al. 2012, Prior & Cao 1999b). Η δέσμευση των ελεύθερων ριζών από τις αντιοξειδωτικές ενώσεις είναι ένας μόνο μηχανισμός παρεμποδισμού της λιπιδικής υπεροξείδωσης (Frankel 1998, Squadriato 47

66 & Peyor 1998). Οι μέθοδοι που μετρούν την αντιοξειδωτική ικανότητα διαφέρουν ως προς τον τρόπο που δημιουργούν τις ελεύθερες ρίζες, τις συνθήκες, καθώς και τον τρόπο εκτίμησης των αποτελεσμάτων κάνοντας δύσκολο να συγκριθούν τα αποτελέσματα μεταξύ των ερευνητών. Αμφότερες η FRAP και η DPPH, χρησιμοποιούνται ευρέως για την μελέτη αντιοξειδωτικού δυναμικού φυσικών προϊόντων και μη, με πολλές παραλλαγές αφού αποτελούν στο σύνολό τους απλές τεχνικές, γρήγορες και χωρίς την ανάγκη ακριβού εργαστηριακού εξοπλισμού. Η σημαντικότερη διαφορά αυτών των μεθόδων μεταξύ τους είναι ότι στην μέθοδο FRAP εκτιμάται άμεσα η αναγωγική ικανότητα των αντιοξειδωτικών ενώσεων, θεωρώντας την αναγωγική ικανότητα και την αντιοξειδωτική δράση ισοδύναμες έννοιες (Benzie & Strain 1996) αντίθετα στην DPPH μέθοδο εκτιμάται η ικανότητα των αντιοξειδωτικών ενώσεων στην εξουδετέρωση των συνθετικών ελεύθερων ριζών του αντιδραστηρίου DPPH (Brand-Williams et al. 1995). Μέθοδος FRAP: Στηρίζεται στην αναγωγή του τρισθενούς σιδήρου στο σύμπλοκο Fe(III) + -TPZ [2,4,6-τρι-(2-πυριδυλο)-S-τριαζίνη] κατά την παρουσία κάποιου αντιοξειδωτικού σε όξινο μέσο (ph 3,6) και στο σχηματισμό συμπλόκου Fe(II) + - TPTZ, το οποίο έχει μπλε χρώμα. Δυστυχώς, αυτή η μέθοδος δεν συνυπολογίζει τις ουσίες εκείνες που δεν έχουν την ικανότητα να ανάγουν το Fe(III) + αλλά παρόλα αυτά διαθέτουν αντιοξειδωτικές ιδιότητες (Gramza et al. 2006). i. ii. Eικόνα 20: Αναγωγή του συμπλόκου Fe 3+ -ΤPTZ σε Fe 2+ -ΤPTZ παρουσία αντιοξειδωτικού (Huang et al. 2005) 48

67 Πειραματικό πρωτόκολλο για FRAP στο φασκόμηλο Σε αυτή τη μέθοδο χρησιμοποιήθηκαν οι εξής συγκεντρώσεις δείγματος (με τρεις επαναλήψεις στο κάθε κελί): 0,078 mg/ml, 0,039 mg/ml, 0,019mg/mL ενώ για την πρότυπη FeSO4x7H2O (σε ddη2ο) είχαν ως εξής: 2,000mg/mL, 1,200mg/mL 0,700mg/mL, 0,350mg/mL, 0,175 mg/ml και 0,087 mg/ml. Το διάλυμα FRAP παρασκευάστηκε με 75 ml ρυθμιστικό διάλυμα οξικού οξέος 300 mm, ph 3,6, και 15 ml διαλύματος TPTZ (37,4 mg σε 20 ml διαλύματος ΗCL 0,04M) και 15 ml διάλυμα FeCl3 0,02 M. H φωτομέτρηση έγινε στα 595 nm. Συγκεκριμένα 60 μl δείγμα αντέδρασε με 55μL ρυθμιστικό διάλυμα οξικού οξέος και 80 μl αντιδραστήριο FRAP δίνοντας μπλε χρώματος προϊόντα ενώ ως τυφλό χρησιμοποιήθηκε ddh2o. Εικόνα 21: Μικροπλάκα μετά από επώαση 5 min με τη μέθοδο FRAP. Τα κελία με το μεθανολικό εκχύλισμα φασκόμηλου έχουν αντιδράσει δίνοντας μπλε χρώμα. Αντίθετα τα τυφλά δείγματος (Blank δείγμα) είναι σχεδόν διαφανή. Μέθοδος DPPH: Το μόριο του 1,1-διφαινυλο-2-πικρυλοϋδραζυλίου (αντιδραστήριο DPPH) χαρακτηρίζεται ως σταθερή ελεύθερη ρίζα αφού λόγω του απεντοπισμού του ζεύγους ηλεκτρονίων από τα άτομα αζώτου δεν διμερίζεται όπως άλλες ελεύθερες ρίζες (Alam et al. 2012). Υπό την παρουσία ενός δότη Η, η ένωση αυτή μεταχρωματίζεται από μωβ σε κίτρινο χρώμα. Ο αποχρωματισμός μπορεί να μετρηθεί στα 512 nm (συνήθως) με φωτόμετρο και δηλώνεται με μείωση στην απορρόφηση (Brand Williams et al. 1995). 49

68 Εικόνα 22: Η ρίζα του DPPH αρχικά σε μορφή διφαινυλοπικρυλουδραζίνης και σε μορφή ελεύθερης ρίζας (ρίζα διφαινυλοπικρυλοϋδράζυλο-ρίζα). Πηγή: Philip Molyneux 2004 The use of the stable free radical DPPH for estimating antioxidant activity, Songklanakarin J. Sci. Technol. Vol. 26 No. 2 Mar.-Apr Πειραματικό πρωτόκολλο για DPPH στο φασκόμηλο Οι συγκεντρώσεις του δείγματος που χρησιμοποιήθηκαν εις τριπλούν σε κάθε κελί της μικροπλάκας είναι: 100 μg/ml, 80 μg/ml, 50 μg/ml, 30 μg/ml, 20 μg/ml, 10 μg/ml, 5 μg/ml, 2,5 μg/ml και 1,25 μg/ml. Η επώαση έγινε σε θερμοκρασία δωματίου για 30 min και σε μήκος κύματος 540 nm. O υπολογισμός των αποτελεσμάτων έγινε με τη βοήθεια του μαθηματικού τύπου στο πρόγραμμα Graphpad: Δέσμευση DPPH % =[1-(Asample-Ablank)/(Acontrol-Ablank)]*100 Ακολουθήσαμε το πρωτόκολλο των Nisha et al. (2009) & Molyneux (2004) με κάποιες τροποποιήσεις σε αναλογίες αντιδραστηρίου και δείγματος. Έτσι, 100μL δείγμα αντέδρασε με 0,3 Μ διάλυμα DPPH σε μεθανόλη ενώ για το τυφλό χρησιμοποιήθηκε μόνο μεθανόλη. 50

69 Εικόνα 23: Μικροπλάκα μετά από επώαση 30min με τη μέθοδο DPPH. Τα κελία με το μεθανολικό εκχύλισμα φασκόμηλου έχουν αντιδράσει δίνοντας κίτρινο χρώμα. Οι μεγαλύτερες συγκεντρώσεις δείγματος (καλύτερη αντιοξειδωτική δράση) βρίσκονται στα αριστερά της πλάκας με κίτρινους χρωματισμούς. Οι αραιότερες είναι αυτές που παρέμειναν μωβ (χρώμα αντιδραστηρίου) 51

70 4. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ 4.1 Εποχικότητα φαινολικών ενώσεων στο φασκόμηλο Τo γένος Salvia περιέχει μια μεγάλη ποικιλία δευτερογενών μεταβολιτών, με περισσότερες από 160 ταυτοποιημένες ενώσεις στις τάξεις των τερπενοειδών, φλαβονοειδών και φαινολικών οξέων (Li et al. 1999, Tonaka et al. 1996, Tonaka et al. 1997, Lu & Foo 1999). Συνεπώς το φασκόμηλο αποτελεί ένα από τα φυτά με μεγάλες δυνατότητες παραγωγής φυσικών αντιοξειδωτικών (Chipault et al. 1956). Κάποιες από αυτές είναι μοναδικές για το γένος αυτό. Μεγάλος αριθμός αυτών είναι παράγωγα του καφεϊκού οξέος. Από τα φλαβονοειδή μεγαλύτερη θέση κατέχουν οι φλαβόνες, οι φλαβονόλες, και οι γλυκοζίτες αυτών. Τα παρακάτω αποτελέσματα (TPC, TFC) προσμετρούν πολλά από αυτά τα συστατικά που περιέχονται στο φυτό δίνοντας μια πρώτη εκτίμηση για ενώσεις με αντιοξειδωτικό χαρακτήρα Ολικά φαινολικά (Folin-Ciocalteu μέθοδος) Στον Πίνακα 3 παρουσιάζονται οι ποσότητες πολυφαινολών σε ισοδύναμα γαλλικού οξέος (mg GA/mg DW ξηρού εκχυλίσματος) για κάθε άτομο (δείγμα) φασκόμηλου ανά εποχή συγκομιδής καθώς και ο μέσος όρος του φορτίου πολυφαινολών (TPC) ανά πληθυσμό φυτών, ενώ στην Εικόνα 24 φαίνεται η πρότυπη καμπύλη γαλλικού οξέος η οποία λήφθηκε υπόψιν για τον υπολογισμό των αναλόγων σε GA του ΤPC για κάθε δείγμα. Τέλος, στην Εικόνα 25 προβάλλεται με γράφημα η εκτίμηση του φορτίου πολυφαινολών σε ισοδύναμα GA για κάθε άτομο φασκόμηλου ανά εποχή συγκομιδής. 52

71 Πίνακας 3: Συγκέντρωση ολικών φαινολικών (ΜΟ ± Τυπική Απόκλιση) για κάθε άτομο φασκόμηλου (mg GA/mg ξηρού εκχυλίσματος) σε κάθε εποχή (n=3) και για κάθε πληθυσμό. Περιοχήείδος Αρκαδία S.pomifera Αχαΐα S.fruticosa Μεσσηνία S.fruticosa Συνολικό No δείγματος Άνοιξη Καλοκαίρι Φθινόπωρο Χειμώνας N2 0,347±0,012 0,238±0,019 0,162±0,012 0,258±0,071 N3 0,329±0,023 0,228±0,042 0,195±0,031 0,249±0,053 N6 0,315±0,042 0,176±0,025 0,238±0,013 0,229±0,022 N14 0,304±0,024 0,251±0,013 0,102±0,014 0,233±0,061 ΜΟ±Τ.Α 0,324±0,025 0,223±0,032 0,174±0,061 0,242±0,025 N7 0,308±0,051 0,226±0,023 0,114±0,022 0,184±0,018 N8 0,226±0,062 0,195±0,032 0,189±0,023 0,236±0,019 N9 0,253±0,033 0,178±0,032 0,235±0,011 0,269±0,025 N16 0,253±0,019 0,225±0,061 0,236±0,023 0,273±0,024 N17 0,307±0,022 0,242±0,093 0,188±0,023 0,254±0,012 ΜΟ±Τ.Α 0,269±0,041 0,213±0,034 0,192±0,051 0,243±0,041 N10 0,251±0,012 0,255±0,041 0,194±0,011 0,235±0,062 N11 0,238±0,024 0,222±0,012 0,167±0,053 0,233±0,044 N12 0,258±0,031 0,245±0,024 0,242±0,023 0,328±0,054 N15 0,286±0,082 0,201±0,032 0,172±0,091 0,196±0,081 N18 0,337±0,014 0,268±0,041 0,229±0,023 0,286±0,051 ΜΟ±Τ.Α 0,274±0,040 0,238±0,030 0,201±0,030 0,256±0,050 Μέσος όρος 0,287 0,225 0,190 0,247 Τυπική απόκλιση ± 0,040 0,028 0,045 0,036 1,2 1 0,8 0,6 0,4 y = 3,7506x + 0,0725 R² = 0,9846 0, ,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 Εικόνα 24: Πρότυπη καμπύλη για τη μέθοδο F-C με την πρότυπη ένωση γαλλικό οξύ. Οι συγκεντρώσεις που χρησιμοποιήθηκαν ήταν: 0,250 mg/ml 0,200 mg/ml 0,150 mg/ml 0,125 mg/ml 0,100mg/mL και 0,050 mg/ml. 53

72 Εικόνα 25: Εποχική σύγκριση του φαινολικού φορτίου (TPC σε mg GA/mg ξηρού εκχυλίσματος) για κάθε άτομο (n=3) σε κάθε εποχή (αντιστοιχεί στον Πίνακα 1). Παρατηρώντας τις μετρήσεις που έγιναν για TPC και στους τρείς πληθυσμούς (Πίνακας 3 και Εικόνα 24) βλέπουμε ότι τα ποσοστά φαινολικού φορτίου της άνοιξης είναι γενικώς υψηλότερα για τα δείγματα φασκόμηλου σε σύγκριση με τις άλλες εποχές. Ο μέσος όρος αυτών των παρατηρήσεων αναλύθηκε σε στατιστικό πρόγραμμα και έδειξε ότι ακολουθεί κανονική κατανομή και διαφέρει σημαντικά (p<0,05) μεταξύ των εποχών (Εικόνα 25). Επιπλέον, στατιστικοί έλεγχοι έδειξαν ότι το TPC άνοιξης διαφέρει σημαντικά (p<0,05) από αυτό του καλοκαιριού και του φθινοπώρου, ενώ το TPC φθινοπώρου διαφέρει από εκείνο του χειμώνα. Τα υπόλοιπα δεν διέφεραν μεταξύ τους βάσει Tukey s test που έγινε με πολλαπλές συγκρίσεις στο στατιστικό πρόγραμμα Graphpad. 54

73 b a b c Εικόνα 26: Εποχική σύγκριση του μέσου όρου του φορτίου πολυφαινολών (TPC) όλων των φυτών για κάθε εποχή.τα όμοια γράμματα δηλώνουν έλλειψη στατιστικώς σημαντικής διαφοράς (p<0,05). Τα φυτά της ανοιξιάτικης συγκομιδής έχουν τη μέγιστη τιμή σε TPC ακολουθούν κατά σειρά ο χειμώνας,το καλοκαίρι και το φθινόπωρο. Για τον στατιστικό έλεγχο χρησιμοποιήθηκε το πρόγραμμα Graphpad, n=14 παρατηρήσεις. Σε επίπεδο πληθυσμού δεν παρατηρήθηκαν διαφορές για p<0,05 μεταξύ των πληθυσμών Αρκαδίας, Αχαΐας και Μεσσηνίας για κάθε εποχή (Εικόνα 27). Η ποσότητα των ολικών φαινολικών φαίνεται να είναι συγκεκριμένη για την κάθε περίοδο συγκομιδής αν σκεφτεί κανείς ότι τα φαινολογικά στάδια του φυτού, οι αβιοτικοί παράγοντες (θερμοκρασία, υγρασία, κλίμα κ.α), οι βιοτικοί (πίεση παθογόνων, ανταγωνισμός φυτών κ.α), οι μετασυλλεκτικοί χειρισμοί (εκχύλιση, απόσταξη, ξήρανση κ.α) και το γενετικό προφίλ του εκάστοτε φυτού επηρεάζουν την παραγωγή πολυφαινολών άρα και την αντιοξειδωτική δράση για αρκετά φυτά (Xu et al. 2010, Nieto et al. 2011, Muller-Riebau et al. 1997). Σε πειράματα άλλων ερευνητών υψηλότερο TPC βρέθηκε κατά το στάδιο καρπόδεσης (μετά την άνθηση) (Ben Farhat et al. 2013, Papageorgioy et al. 2008) ενώ κατά την Generalic et al. (2012) το μέγιστο TPC βρέθηκε στα εκχυλίσματα Μαΐου. Η βιβλιογραφία δίδει γενικά και σε άλλα φυτά (Τhrymba spicata, Satureja thymbra) τα υψηλότερα επίπεδα φαινολών κατά την περίοδο της άνθησης (Muller-Riebaeu et al. 1997). H αύξηση της θερμοκρασίας μπορεί να έχει άμεση επίδραση στη συγκέντρωση των πολυφαινολών ως απόκριση του φυτού σε εχθρικό περιβάλλον (αύξηση UV, οξείδωση κυττάρων 55

74 φύλλων σε διάφορα οργανίδια ) όπως έχει παρατηρηθεί και σε άλλα φυτά (Toor et al. 2006). Εικόνα 27: Eποχική διακύμανση ΤPC μεταξύ των πληθυσμών φασκόμηλου ανά εποχή συγκομιδής. Δεν παρατηρείται στατιστικώς σημαντική διαφορά σε επίπεδο σημαντικότητας p<0,05 (n=5 για τους πληθυσμούς Αχαΐας-Μεσσηνίας ενώ n=4 για τον πληθυσμό Αρκαδίας) Φλαβονοειδή Στον Πίνακα 4 παρουσιάζονται οι ποσότητες σε ισοδύναμα κερσετίνης (mg Que/mg DW ξηρού εκχυλίσματος) για κάθε άτομο (δείγμα) φασκόμηλου ανά εποχή συγκομιδής καθώς και ο μέσος όρος του φορτίου TFC ανά πληθυσμό φυτών, ενώ στην Εικόνα 28 φαίνεται η πρότυπη καμπύλη κερσετίνης που λήφθηκε υπόψιν για τον υπολογισμό των αναλόγων σε Que του ΤFC για κάθε δείγμα. Τέλος στην Εικόνα 29 προβάλλεται η εκτίμηση του φορτίου ΤFC σε ισοδύναμα Que για κάθε άτομο φασκόμηλου ανά εποχή συγκομιδής. 56

75 Πίνακας 4: Συγκέντρωση φλαβονοειδών(mgque/mg ξηρού εκχυλίσματος ) για κάθε άτομο φασκόμηλου (n=3) σε κάθε εποχή. Δίνεται ο μέσος όρος(μο) ± τυπική απόκλιση(t.a.) για κάθε πληθυσμό και συνολικά για όλα τα φυτά. Περιοχήείδος Αρκαδία S.pomifera Αχαΐα S.fruticosa Μεσσηνία S.fruticosa Νο δείγματος Άνοιξη Καλοκαίρι Φθινόπωρο Χειμώνας N2 0,219±0,080 0,117±0,042 0,087±0,031 0,153±0,045 N3 0,182±0,050 0,099±0,031 0,102±0,022 0,117±0,051 N6 0,144±0,060 0,099±0,040 0,084±0,013 0,095±0,024 N14 0,160±0,061 0,110±0,033 0,079±0,016 0,133±0,053 MO±T.A 0,177±0,032 0,106±0,090 0,088±0,011 0,124±0,021 N7 0,125±0,041 0,120±0,031 0,079±0,036 0,119±0,024 N8 0,154±0,090 0,099±0,042 0,107±0,022 0,116±0,062 N9 0,159±0,053 0,103±0,025 0,101±0,020 0,141±0,070 N16 0,214±0,051 0,106±0,036 0,100±0,036 0,131±0,064 N17 0,253±0,031 0,096±0,017 0,067±0,015 0,123±0,033 MO±T.A 0,181±0,051 0,105±0,091 0,091±0,021 0,126±0,017 N10 0,185±0,051 0,122±0,024 0,105±0,013 0,132±0,080 N11 0,131±0,032 0,095±0,025 0,112±0,015 0,072±0,023 N12 0,165±0,112 0,121±0,041 0,088±0,045 0,168±0,016 N15 0,115±0,051 0,114±0,036 0,072±0,014 0,087±0,061 N18 0,225±0,022 0,114±0,032 0,103±0,051 0,150±0,033 MO±T.A 0,164±0,041 0,113±0,013 0,096±0,022 0,122±0,041 Μέσος όρος 0,174 0,108 0,092 0,124 Συνολικό Τυπική απόκλιση ± 0,041 0,010 0,014 0,026 Εικόνα 28: Πρότυπη καμπύλη κερσετίνης(que) για τη μέθοδο AlCl3.Οι συγκεντρώσεις που χρησιμοποιήθηκαν ήταν : 1,0 mg/ml 0,8 mg/ml 0,5 mg/ml 0,3 mg/ml 0,2 mg/ml 0,1 mg/ml 57

76 Παρατηρώντας τις μετρήσεις που έγιναν για TFC συνολικά και για τους 3 πληθυσμούς (Πίνακας 4 και Εικόνα 29) βλέπουμε ότι τα ποσοστά φλαβονοειδών της άνοιξης είναι υψηλότερα και σε αυτή την περίπτωση για τα δείγματα σε σχέση με τις άλλες εποχές. Ο μέσος όρος αυτών των παρατηρήσεων αναλύθηκε σε στατιστικό πρόγραμμα (με ίδιες δοκιμασίες όπως και στην προηγούμενη μέθοδο) και έδειξε ότι διαφέρει σημαντικά (p<0,05) μεταξύ των εποχών (Εικόνα 30). Σε επόμενο στατιστικό έλεγχο με πολλαπλές συγκρίσεις (Tukey s test) βρέθηκε ότι το TFC άνοιξης διαφέρει σημαντικά από εκείνα του καλοκαιριού του φθινοπώρου και του χειμώνα (p<0,05). Επίσης το TFC καλοκαιριού διαφέρει από του φθινοπώρου και το TFC φθινοπώρου από εκείνο του χειμώνα. Τέλος το TFC χειμώνα δεν διέφερε από εκείνο του καλοκαιριού. Σε επίπεδο πληθυσμού και σε αυτή τη μέθοδο δεν παρατηρήθηκαν διαφορές για p<0,05 μεταξύ των πληθυσμών Αρκαδίας, Αχαΐας και Μεσσηνίας για κάθε εποχή (Εικόνα 31). Τα δεδομένα αυτά συμφωνούν με την βιβλιογραφία και επιπλέον φαίνεται πως καθώς ο βιολογικός κύκλος του φυτού κινείται προς την αναπαραγωγή, βιοσυνθετικά μιλώντας, η παραγωγή των φαινολικών οξέων και συγκεκριμένα του ροσμαρινικού το οποίο είναι και το βασικότερο ποσοτικά, ελαττώνεται δίνοντας προτεραιότητα παραγωγής σε άλλες ουσίες οι οποίες ανήκουν στα φλαβονοειδή (έγχρωμα) με σκοπό την άνθηση (Fletcher et al. 2010, Li et al. 2005). Εικόνα 29: Eποχική σύγκριση φλαβονοειδών (mg Que/mg ξηρού εκχυλίσματος) (TFC) για κάθε άτομο ανά εποχή (αντιστοιχεί στον Πίνακα 2, n=3) 58

77 b a b c Εικόνα 30: Εποχική σύγκριση κατά μέσο όρο των φλαβονοειδών (TFC) όλων των φυτών για κάθε εποχή.τα όμοια γράμματα δηλώνουν την έλλειψη στατιστικώς σημαντικής διαφοράς (p,0,05) Η άνοιξη έχει τη μέγιστη τιμή, ακολουθούν κατά σειρά χειμώνας, καλοκαίρι, φθινόπωρο. Για τον στατιστικό έλεγχο χρησιμοποιήθηκε το πρόγραμμα Graphpad. Εικόνα 31: Eποχική διακύμανση ΤFC μεταξύ των πληθυσμών φασκόμηλου. Δεν παρατηρείται διαφορά σε επίπεδο σημαντικότητας p<0.05 (n=5 για τους πληθυσμούς Αχαΐας-Μεσσηνίας ενώ n=4 για τον πληθυσμό Αρκαδίας). 59

78 4.1.3 Iκανότητα δέσμευσης ελευθέρων ριζών (DPPH μέθοδος) Ο προσδιορισμός των αντιοξειδωτικών έγινε για την εποχή του καλοκαιριού, επειδή αυτή είναι η εποχή συλλογής της δρόγης στην Ελλάδα. Συγκεκριμένα η πρώτη συλλογή φυτών ξεκινά τον Μάιο μήνα και τελειώνει τον Ιούλιο ανάλογα με το κλίμα της εκάστοτε περιοχής (Σκρουμπής 1998). Στον πίνακα 5 φαίνονται οι τιμές IC50, δηλαδή η συγκέντρωση που προκαλεί το 50% της δέσμευσης της ρίζας και υπολογίστηκαν μετά από την κατασκευή ημιλογαριθμικής καμπύλης της % δέσμευσης της DPPH έναντι της συγκέντρωσης. Στον Πίνακα 5 και Εικόνα 32 δίνονται όλες οι τιμές IC50 για κάθε άτομο φασκόμηλου καθώς και ο μέσος όρος ανά πληθυσμό για την εποχή συγκομιδής του καλοκαιριού( εικόνα 33). Στις εικόνες 34 και 35 φαίνονται οι καμπύλες για τα πρότυπα αντιοξειδωτικά (BHT & Vit C). 60

79 Πίνακας 5: Aποτελέσματα από τις μετρήσεις με τη μέθοδο DPPH για κάθε καλοκαιρινό δείγμα φασκόμηλου. Τα IC50 (μg/ml) υπολογίστηκαν με το πρόγραμμα Graphpad (Ν=3) εποχή Καλοκαίρι περιοχήδείγμα Αρκαδία S. pomifera Aχαΐα S. fruticosa Mεσσηνία S. fruticosa # αριθμός δείγματος μέτρηση DPPH (IC 50,μg/mL) N2 13,93±1,20 N3 21,15±1,73 N6 21,24±1,15 N14 15,40±2,90 Μ.Ο±ΤΑ 17,93±3,82 N7 20,81±1,50 N8 24,86±1,82 N9 12,18±3,50 N16 14,62±1,90 N17 16,07±4,20 Μ.Ο±ΤΑ 17,71±5,10 N10 16,11±3,70 N11 22,82±3,02 N12 23,69±1,09 N15 36,16±2,96 N18 20,78±5,43 Μ.Ο±ΤΑ 23,91±7,45 Συνολικό Μέσος όρος±t.a 19,98±6,13 61

80 Εικόνα 32: Τιμές IC50 από τη μέθοδο DPPH για κάθε άτομο φασκόμηλου κατά την καλοκαιρινή περίοδο συγκομιδής (n=3) Εικόνα 33: Tιμές IC50 από τη μέθοδο DPPH ανά πληθυσμό φυτών κατά την καλοκαιρινή περίοδο συγκομιδής (n=4, Αρκαδία, n=5, Aχαία & Μεσσηνία) 62

81 Από τις μετρήσεις του Πίνακα 5, φαίνεται ότι το εκχύλισμα από τα φύλλα του φασκόμηλου κατά την περίοδο συγκομιδής του καλοκαιριού, κατέχει ισχυρή αντιοξειδωτική δράση καθώς έχει κατά μέσο όρο IC50=19,98±6,13 μg/ml, ενώ η πρότυπη αντιοξειδωτική ουσία ΒΗΤ είχε ΙC50=11,62±1,03 μg/ml και η Vit C είχε IC50=8,77±4,92 μg/ml (Εικόνα 34 & Εικόνα 35). Κατά την βιβλιογραφία φαίνεται ότι το BHT έχει ασθενέστερη δράση ως αντιοξειδωτικό από την Vit C σε μεθόδους μέτρησης αντιοξειδωτικών (π.χ Raj et al. 2010, Lee & Kim 2010) λόγω χημικής δομής (ελεύθερα υδροξύλια) πράγμα που επιβεβαιώνεται και στην περίπτωσή μας από την τιμή της μέτρησης ΙC50. Ωστόσο αυτό το συμπέρασμα δεν είναι πάγιο καθώς η μέθοδος αντιοξειδωτικού προσδιορισμού που χρησιμοποιείται έχει σημασία. Ανά πληθυσμό δεν βρέθηκαν στατιστικές διαφορές κατά μέσο όρο των τιμών IC50 παρότι φαίνονται να διαφέρουν μεταξύ τους και αυτό παρουσιάζεται στο γράφημα της Εικόνας 33. Τέλος παραθέτονται οι καμπύλες IC50 για κάθε φυτό αλλά και ανά πληθυσμό που μελετήθηκαν (Εικόνα 36 & 37). Eικόνα 34: Καμπύλη πρότυπου αντιοξειδωτικού BHT (IC50=11,62±1,03) σε συγκεντρώσεις: 100, 80, 50, 30, 20, 10, 5, 2,5, 1,25 μg/ml, (n=3) 63

82 Eικόνα 35: Καμπύλη πρότυπου αντιοξειδωτικού VitC (IC50=8,77±4,92) σε συγκεντρώσεις: 100, 80, 50, 30, 20, 10, 5, 2.5, 1.25 μg/ml, (n=3) 64

83 Εικόνα 36: Καμπύλη IC50 των καλοκαιρινών δειγμάτων φασκόμηλου σε συγκεντρώσεις 100, 80, 50, 30, 20, 10, 5, 2,5, 1,25 μg/ml,(n=3). 65

84 Εικόνα 37: Σύγκριση καμπύλης IC50 για τον κάθε πληθυσμό φυτών. 66

85 4.1.4 Aναγωγική ικανότητα (FRAP μέθοδος) Ομοίως με την προηγούμενη μέθοδο τα αποτελέσματα από την ανάλυση αντιοξειδωτικών με την μέθοδο FRAP φαίνονται στον πίνακα 6. Στην Εικόνα 39 δίνονται οι τιμές ανά άτομο φασκόμηλου καθώς και ανά πληθυσμό..ο υπολογισμός των τιμών έγινε με τη βοήθεια της πρότυπης καμπύλης θειικού σιδήρου (Εικόνα 38). Όπως και στην προηγούμενη μέθοδο ανάλυσης με DPPH έτσι και εδώ δεν παρατηρήθηκε στατιστικά ημαντική διαφορά μεταξύ των πληθυσμών Αρκαδίας, Aχαΐας και Μεσσηνίας (Εικόνα 40). 67

86 Πίνακας 6: Αποτελέσματα ανάλυσης αντιοξειδωτικών με τη μέθοδο FRAP εποχή περιοχήδείγμα Αρκαδία S. pomifera #αριθμός δείγματος mmol FeSO 4/g ξηρού δείγματος N2 11,54±1,60 N3 9,29±1,27 N6 8,85±1,52 N14 10,38±1,77 Μ.Ο±T.A 10,02±1,20 καλοκαίρι Aχαΐα S. fruticosa N7 9,70±1,61 N8 9,15±1,33 N9 9,08±1,24 N16 11,31±1,76 N17 9,20±1,54 Μ.Ο±T.A 9,69±0,94 Mεσσηνία S. fruticosa N10 12,05±1,36 N11 9,52±1,89 N12 10,10±1,40 N15 7,38±1,30 N18 8,17±1,00 Μ.Ο±T.A 9,44±1,81 Συνολικό MΟ±Τ.Α 9,69±1,29 68

87 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0-0,2 πρότυπη FeSO4*7H2O 0 0,5 1 1,5 y = 1,0864x - 0,1143 R² = 0,9891 Εικόνα 38: Πρότυπη καμπύλη θειικού σιδήρου η οποία χρησιμοποιήθηκε στην μέθοδο Ferric Reducing Antioxidant Power. Οι συγκεντρώσεις που χρησιμοποιήθηκαν ήταν: 2,000 mg/ml 1,200 mg/ml 0,700 mg/ml 0,350 mg/ml 0,175 mg/ml 0,087 mg/ml Eικόνα 39: Tιμές αντιοξειδωτικού δυναμικού από τη μέθοδο FRAP ανά άτομο φασκόμηλου για την καλοκαιρινή περίοδο συγκομιδής (n=3) 69

88 Eικόνα 40: Τιμές αντιοξειδωτικού δυναμικού από τη μέθοδο FRAP ανά πληθυσμό φασκόμηλου κατά την καλοκαιρινή περίοδο συγκομιδής (n=3) Συσχέτιση in vitro αποτελεσμάτων Έχοντας υπόψιν όλες αυτές τις μετρήσεις θεωρήσαμε σκόπιμο να γίνει συσχέτιση μεταξύ των αποτελεσμάτων κατά την καλοκαιρινή περίοδο συγκομιδής η οποία συμπίπτει με την καθιερωμένη περίοδο συγκομιδής του φασκόμηλου στην περιοχή μας, αλλά και με αυξημένη παραγωγή αιθέριου ελαίου για την διερεύνηση τυχόν σχέσεων. Τα αποτελέσματα φαίνονται παρακάτω. Να θυμίσουμε ότι ο συντελεστής γραμμικής συσχέτισης r [-1,1] δίνει ένα μέτρο του μεγέθους της γραμμικής συσχέτισης μεταξύ δύο μεταβλητών. Εάν r= ±1 υπάρχει τέλεια γραμμική συσχέτιση. Εάν -0,3<r<0,3 δεν υπάρχει γραμμική συσχέτιση. Αυτό όμως δεν σημαίνει ότι δεν υπάρχει άλλου είδους συσχέτισης μεταξύ των μεταβλητών. Για παράδειγμα : Αν -0,5<r -0,3 ή 0,3 r<0,5 υπάρχει ασθενής γραμμική συσχέτιση Αν -0,7 <r 0,5 ή 0,5 r<0,7 υπάρχει μέση γραμμική συσχέτιση Αν -0,8 <r - 0,7 ή 0,7 r< 0,8 υπάρχει ισχυρή γραμμική συσχέτιση Τέλος, αν -1<r -0,8 ή 0,8 r<1 υπάρχει πολύ ισχυρή γραμμική συσχέτιση 70

89 Σε κάθε περίπτωση η ύπαρξη συσχέτισης δεν δηλώνει απαραίτητα αιτιότητα όπως επίσης και η μη ύπαρξη γραμμικής συσχέτισης δεν δηλώνει απουσία κάποιας άλλης σχέσης των μεταβλητών. Μεταξύ των μεθόδων γενικά δεν παρατηρήθηκε ισχυρή συσχέτιση(πίνακας 7). Εξαίρεση αποτελεί η συσχέτιση μεταξύ FRAP και DPPH όπου παρατηρήθηκε αρνητική μέση συσχέτιση (αναμενόμενο λόγω του αντίστροφου τρόπου δράσης των μεθόδων ως προς την εκτίμηση αντιοξειδωτικού φορτίου). Πιθανόν τα αποτελέσματα των μεθόδων F-C και AlCl3 να εμπλέκουν και άλλα συστατικά λόγω έλλειψης εκλεκτικότητας οπότε να αδυνατούν να περιγράψουν κάποια σχέση με τις μεθόδους εκτίμησης αντιοξειδωτικών. Εξάλλου η F-C μέθοδος είναι γνωστό ότι προσδιορίζει ουσίες ευκόλως οξειδούμενες χωρίς απαραίτητα να ανήκουν στα φαινολικά συστατικά (Escapa & Gonzalez 2001). Ωστόσο η συσχέτιση μεταξύ F-C και AlCl3 έδωσε μέση γραμμική συσχέτιση υποδηλώνοντας πιθανόν κάτι που έπρεπε να ερευνηθεί περαιτέρω. Δεδομένου ότι τα φλαβονοειδή αποτελούν ένα υποσύνολο των πολυφαινολών τα αποτελέσματα των μεθόδων που προσμετρούν τα φορτία ολικών πολυφαινολών (TPC) καθώς και εκείνα των ολικών φλαβονοειδών (TFC) πολύ πιθανόν να παρουσιάζουν κάποια σχέση μεταξύ τους. Για αυτό το λόγο έγινε συσχέτιση μεταξύ των F-C και ΑlCl3 ανά εποχή συγκομιδής (Πίνακας 8). Ο συντελεστής συσχέτισης έδειξε ασθενή γραμμική συσχέτιση μεταξύ των εποχών εκτός από εκείνη του χειμώνα κατά την οποία παρατηρήθηκε ισχυρή γραμμική συσχέτιση. Πίνακας 7: Συσχέτιση μεταξύ των μεθόδων ανάλυσης που πραγματοποιήθηκαν για τα καλοκαιρινά δείγματα φασκόμηλου. Συντελεστής συσχέτισης r FRAP DPPH Folin- Ciocalteu DPPH -0, ,148 Folin-Ciocalteu 0,396-0,148 - AlCl3 0,348-0,122 0,479 71

90 Πίνακας 8: Συσχέτιση των αποτελεσμάτων ΤPC & TFC για κάθε εποχή Συντελεστής συσχέτισης r TPC spring TPC summer TPC autumn TPC winter TFC spring 0, TFC summer - 0, TFC autumn - - 0,354 - TFC winter , Εποχικότητα αιθέριου ελαίου Απόδοση αιθέριουελαίου και εποχική σύγκριση Από τους πίνακες 9, 10, 11 και με βάση στατιστική ανάλυση διαπιστώνεται ότι υπάρχει διακύμανση της ποσότητας του αιθέριουελαίου ανά περίοδο συγκομιδής των φυτών. Πιο συγκεκριμένα, για τον πληθυσμό Αχαΐας κατά μέσο όρο το καλοκαίρι έχουμε την μεγαλύτερη παραγωγή σε έλαιο (2,59±0,36 ml/100 g DW) ενώ ακολουθούν κατά σειρά ο χειμώνας (1,8±0,31) το φθινόπωρο (1,52±0,65) και τέλος η άνοιξη (1,15±0,23). Ωστόσο μόνο η σύγκριση χειμώνα με άνοιξη και άνοιξη με καλοκαίρι ήταν στατιστικά σημαντική (p<0,05) κατόπιν ανάλυσης Anova και πολλαπλών συγκρίσεων τύπου Tukey (Πίνακας 9, Εικόνα 41). 72

91 Πίνακας 9: Απόδοση αιθέριου ελαίου (ml/100 g ξηρής δρόγης) για κάθε άτομο του πληθυσμού S. fruticosa της Αχαΐας σε κάθε εποχή. ΔΕΙΓΜΑ ΠΕΡΙΟΧΗ ΧΕΙΜΩΝΑΣ ΑΝΟΙΞΗ ΚΑΛΟΚΑΙΡΙ ΦΘΙΝΟΠΩΡΟ 7 ΑΧΑΪΑ 1,96 1,32 2,81 2,10 8 ΑΧΑΪΑ 2,07 1,37 2,52 2,82 9 ΑΧΑΪΑ 1,39 1,07 3,05 1,41 16 ΑΧΑΪΑ 2,04 1,18 2,51 1,52 17 ΑΧΑΪΑ 1,55 0,79 2,12 2,71 M.O. 1,81 1,15 2,59 1,52 ± Τ.Α 0,31 0,23 0,35 0,65 b a b a Εικόνα 41: Εποχική σύγκριση αιθέριουελαίου μεταξύ πληθυσμού Αχαίας (ml/100 g DW), Ν=5 άτομα. για τον πληθυσμό Αχαΐας (S. fruticosa) a: ο χειμώνας διαφέρει με την άνοιξη και b:η άνοιξη διαφέρει από το καλοκαίρι για p<0,05. Για τα φυτά του πληθυσμού Μεσσηνίας τα αποτελέσματα δείχνουν ότι μεγαλύτερη ποσότητα αιθέριουελάιου έδωσε η συγκομιδή του καλοκαιριού (2,18±0,65) και έπειτα διαδοχικά του φθινοπώρου (1,88±0,94), του χειμώνα (1,58 ±0,30) και τέλος της άνοιξης (1,02±0,14). Ομοίως, με παραπάνω οι ποσότητες αιθέριουελαίου που 73

92 διέφεραν σε επίπεδο σημαντικότητας p<0,05 ήταν αυτές των εποχών χειμώνας με άνοιξη και άνοιξη με καλοκαίρι (Πίνακας 10, Εικόνα 42). Πίνακας 10: Αποστάξεις αιθέριουελαίου (ml/100 gdw)για τον πληθυσμό Μεσσηνίας για κάθε εποχή, Ν=5 ΔΕΙΓΜΑ ΕΙΔΟΣ ΠΕΡΙΟΧΗ ΧΕΙΜΩΝΑΣ ΑΝΟΙΞΗ ΚΑΛΟΚΑΙΡΙ ΦΘΙΝΟΠΩΡΟ 10 S. fruticosa ΜΕΣΣΗΝΙΑ 2,12 1,17 2,98 3,41 11 S. fruticosa ΜΕΣΣΗΝΙΑ 1,61 0,95 2,14 2,12 12 S. fruticosa ΜΕΣΣΗΝΙΑ 1,38 0,83 1,22 1,23 15 S. fruticosa ΜΕΣΣΗΝΙΑ 1,45 1,15 2,13 1,11 18 S. fruticosa ΜΕΣΣΗΝΙΑ 1,36 0,98 2,5 1,61 Μ.Ο 1,58 1,02 2,18 1,88 Τ.Α ± 0,30 0,14 0,65 0,93 b a b a Εικόνα 42: Εποχική σύγκριση αιθέριουελαίου (ml/100 g DW)για τον πληθυσμό Μεσσηνίας Ν=5 άτομα (S. fruticosa), a: ο χειμώνας διαφέρει από την άνοιξη και b: η άνοιξη διαφέρει από το καλοκαίρι. 74

93 Τέλος, για τον πληθυσμό Αρκαδίας φαίνεται ότι μέγιστο είχε η εποχή της καλοκαιρινής συγκομιδής (3,72 ±0,52) και ακολούθησαν κατά διαδοχή το φθινόπωρο (2,19±0,78), ο χειμώνας (1,72 ± 0,28) και τέλος η άνοιξη (1,27± 0,21) (Πίνακας 11, Εικόνα 43). Επιπλέον, κατόπιν πολλαπλών συγκρίσεων τύπου Tukey s test τα αποτελέσματα χειμώνα με καλοκαίρι ήταν στατιστικά σημαντικά όπως και της άνοιξης με το καλοκαίρι αλλά και του καλοκαιριού με το φθινόπωρο δείχνοντας ότι οι διαφορές που παρατηρήθηκαν ήταν σε επίπεδο εμπιστοσύνης p<0,05. Συμπερασματικά, το καλοκαίρι κατείχε μέγιστη απόδοση αιθέριου ελαίου και για τους 3 πληθυσμούς ενώ η άνοιξη είχε το ελάχιστο. Προς αυτή την κατεύθυνση συμφωνούν και οι Muller et al. (1997). Επιπλέον, έγιναν συγκρίσεις μεταξύ κάθε πληθυσμού για την κάθε περίοδο συλλογής φυτών δείχνοντας ότι κατά την καλοκαιρινή περίοδο τα αποτελέσματα διέφεραν στατιστικώς σημαντικά (Εικόνα 44) με τον πληθυσμό Αρκαδίας να έχει τη μεγαλύτερη απόδοση αιθέριου ελαίου. Πίνακας 11: Απόδοση αιθέριου ελαίου (ml/100 g DW ) για τον πληθυσμό Aρκαδίας σε κάθε εποχή ΔΕΙΓΜΑ ΕΙΔΟΣ ΠΕΡΙΟΧΗ ΧΕΙΜΩΝΑΣ ΑΝΟΙΞΗ ΚΑΛΟΚΑΙΡΙ ΦΘΙΝΟΠΩΡΟ 2 S.pomifera ΑΡΚΑΔΙΑ 1,33 1,04 3,24 2,45 3 S.pomifera ΑΡΚΑΔΙΑ 1,99 1,21 3,45 2,66 6 S.pomifera ΑΡΚΑΔΙΑ 1,82 1,54 3,79 1,00 14 S.pomifera ΑΡΚΑΔΙΑ 1,73 1,29 4,42 2,65 Μ.Ο 1,72 1,27 3,72 2,19 Τ.Α± 0,27 0,20 0,51 0,79 75

94 a b c a c b Εικόνα 43: Εποχική σύγκριση αιθέριουελαίου (ml/100 g DW) για τον πληθυσμό Αρκαδίας (S.pomifera) (Ν=4 άτομα), a:ο χειμώνας διαφέρει από το καλοκαίρι, b:η άνοιξη διαφέρει από το καλοκαίρι, c:το καλοκαίρι διαφέρει από το φθινώπορο για p<0,05. ** * * ** Εικόνα 44: Σύγκριση απόδοσης αιθέριου ελαίου μεταξύ των 3 πληθυσμών για το καλοκαίρι. Τα αποτελέσματα είναι στατιστικώς σημαντικά για p<0,05 *: ο πληθυσμός Αρκαδίας διαφέρει από τον πληθυσμό Αχαίας, **: ο πληθυσμός Αρκαδίας διαφέρει από εκείνον της Μεσσηνίας. 76

95 4.2.2 Ποιοτική και ποσοτική σύσταση ελαίου Στην παρούσα διπλωματική μελέτη ο διαχωρισμός και η ταυτοποίηση των επιμέρους συστατικών των αιθέριων ελαίων έγινε με την μέθοδο της Αέριας Χρωματογραφίας συζευγμένης με Φασματομετρία Μάζας (GC-MS). Τα αποτελέσματα της ανάλυσης αυτής αποτυπώνονται στο χρωματογράφημα και αποθηκεύονται σε ηλεκτρονική μορφή στον υπολογιστή. Ακολούθως με τη χρήση βιβλιογραφικών δεδομένων (π.χ. ADAMS) και επικυρωμένων ηλεκτρονικών βιβλιοθηκών, οι οποίες περιλαμβάνουν φάσματα μάζας ορισμένων ουσιών (π.χ. Nist Library) πιστοποιήθηκε η ταυτότητα των οργανικών ενώσεων που περιλαμβάνονται στο αιθέριο έλαιο. Η εφαρμογή του προγράμματος ΑΜDIS και WSEARCH συνέβαλαν στη συλλογή τόσο ποιοτικών όσο και ποσοτικών αποτελεσμάτων για τη σύσταση των αιθέριων ελαίων κάθε ατόμου φασκόμηλου. Στην Εικόνα 45, φαίνεται το χρωματογράφημα από το δείγμα Ν12 φασκόμηλου, το οποίο ανήκει στο είδος S. fruticosa, κατά την καλοκαιρινή συγκομιδή. Αντίθετα στην Εικόνα 46 φαίνεται το χρωματογράφημα για το Ν14 που ανήκει στο είδος S. pomifera επίσης για την περίοδο του καλοκαιριού. Στους Πίνακες 12 και 13 παρουσιάζεται η χημική σύσταση των φυτών που ανήκουν στο είδος S. fruticosa και S. pomifera αντίστοιχα. Σε αυτόν τον πίνακα για κάθε συστατικό του αιθέριου ελαίου αναγράφονται συνοπτικά τα κύρια χαρακτηριστικά του όπως ο χημικός τύπος και το μοριακό βάρος (Μ.Β). Επιπλέον αναφέρονται ο χρόνος κατακράτησης (tr) της εκάστοτε ένωσης στη στήλη του αεριοχρωματογράφου και οι κορυφές των θραυσμάτων (m/z) που είναι αποτέλεσμα του ηλεκτρονιακού ιοντισμού. Τέλος, για κάθε ουσία αντιστοιχεί ένα ξεχωριστό ΑΙ το οποίο υπολογίστηκε μέσω συγκεκριμένου αλγορίθμου με την χρήση των πρότυπων αλκανίων. Στην Εικόνα 47 παρουσιάζονται ενδεικτικά κάποιες δομές τερπενοειδών συστατικών από τα αιθέρια έλαια και των 3 πληθυσμών φυτών. Όπως θα αναφερθεί και παρακάτω τα συστατικά διαφέρουν μεταξύ των 2 ειδών. Συγκεκριμένα τα κουμπεμπένιο, κοπαένιο, μπουρμπονένιο, ελεμένιο, μουρολένιο, κουμπεμπόλη, επικουμπεμπόλη, δεν υπάρχουν στο S. fruticosa ενώ τα υπόλοιπα είναι κοινά και 77

96 στα δύο είδη με ποσοτικές διαφορές, όμως στην επί τοις εκατό συμμετοχή στο αιθέριο έλαιο. Εικόνα 45: Χρωματογράφημα του δείγματος Ν12 καλοκαίρι (S. fruticosa, πληθυσμός Μεσσηνίας). 78

97 Πίνακας 12: Κύρια συστατικά S. fruticosa κατά την καλοκαιρινή περίοδο συγκομιδής για τους πληθυσμούς Αχαΐας & Μεσσηνίας. Κορυφές Συστατικά Χημικός τύπος Μ.Β Rt (min) AI m/z 1 α-πινένιο C 7H , ,65,77,91,92 2 καμφένιο C 10H , ,67,77,79,91,93,105,107,121,136 3 β-πινένιο C 10H , ,93,105,107,121,136 4 μυρκένιο C 10H , ,79,91,93,121,136 5 ευκαλυπτόλη C 10H 18O , ,68,71,79,81,84,93,108,111,136,139,154 6 γ-τερπινένιο C 10H , ,91,93,105,121,136 7 α-θυϊόνη C 10H 16O , ,67,68,79,81,95,110,152 8 β-θυϊόνη C 10H 16O , ,67,79,81,95,110,152 9 καμφορά C 10H 16O , ,81,95,108,119, βορνεόλη C 10H 18O , ,110, δ-τερπινεόλη C 10H 18O , ,81,93,111,136, τερπινέν-4-όλη C 10H 18O , ,81,93,121, α-τερπινεόλη C 10H 18O , ,81,93,121, καρυοφυλλένιοβ C 15H , ,93,105,130,133,147, αρωμαδενδρένιο C 15H , ,79,91,105,119,133,147,161,189, α-χουμουλένιο C 15H , ,107,121,133,147, βιριδιφλορένιο C 15H , ,107,119,161,189, σπαθουλενόλη C 15H 24O , ,79,91,105,119,159, Οξείδιο του καρυοφυλλενίου C 15H 24O , ,93,91,121,149,177,202, βιριδιφλορόλη C 15H 26O , ,81,93,105,109,121,161,189, μανουόλη C 20H 34O , ,95,137, λαβδ-7,13-διεν- 15-όλη C 20H 34O , ,109,204,272 79

98 Εικόνα 46: Χρωματογράφημα του δείγματος Ν14 καλοκαίρι (S. pomifera, πληθυσμός Αρκαδίας). 80

99 Κορυφή Πίνακας 13: Κύρια συστατικά αιθέριου ελαίου του πληθυσμού Αρκαδίας (S.pomifera) κατά την καλοκαιρινή συγκομιδή. Συστατικά Χημικός τύπος Μ.Β Rt (min) AI m/z 1 α-θυϊένιο C 10H , ,67,77,91,93,136 2 α-πινένιο C 7H , ,65,77,91,92 3 καμφένιο C 10H , ,67,77,79,91,93,105,107,121,136 4 β-πινένιο C 10H , ,93,105,107,121,136 5 μυρκένιο C 10H , ,79,91,93,121,136 6 π-κυμένιο C 10H , ,103,119,134 7 λεμονένιο C 10H , ,68,79,93,107,121,136 8 ευκαλυπτόλη C 10H 18O , ,68,71,79,81,84,93,108,111,136,1 39,154 9 γ-τερπινένιο C 10H , ,91,93,105,121, α-θυϊόνη C 10H 16O , ,67,68,79,81,95,110, β-θυϊόνη C 10H 16O , ,67,79,81,95,110, καμφορά C 10H 16O , ,81,95,108,119, βορνεόλη C 10H 18O , ,110, τερπινεν-4-όλη C 10H 18O , ,81,93,121, α-τερπινεόλη C 10H 18O , ,81,93,121, α-κουμπεμπένιο C 15H , ,91,105,119,161, α-γιαλανγκένιο C 15H , ,105,119,161,189, α-κοπαένιο C 15H , ,105,119,161, β-μπουρμπονένιο C 15H , ,81,123,161,189, καρυοφυλλένιο C 15H , ,93,105,130,133,147, γ-ελεμένιο C 15H , ,107,121,133,161, α-χουμουλένιο C 15H , ,107,121,133,147, γ-μουρολένιο C 15H , ,105,119,147,161,189, επι-κουμπεμπόλη C 15H 24O , ,105,119,161,204, κουμπεμπόλη C 15H 26O , ,93,105,119,161,189,204, β-καλαμενένιο C 15H , ,129,144,159, δ-καδινένιο C 15H , ,105,119,134,161,189, οξείδιο του καρυοφυλλενίου C 15H 24O , ,93,91,121,149,177,202,220 81

100 Μονοτερπενικοί υδρογονάνθρακες πινένιο-α μυρκένιο λεμονένιο πινένιο-β καμφένιο Οξυγονωμένα μονοτερπένια ευκαλυπτόλη θυϊόνη-α θυιόνη-β καμφορά βορνεόλη 82

101 Σεσκιτερπενικοί υδρογονάνθρακες καρυοφυλλένιο-ζ μπουρμπονένιο-β βιριδιφλορένιο αρωμαδενδρένιο καδινένιο-δ κοπαένιο-α χουμουλένιο-α κουμπεμπένιο-β Οξυγονωμένα σεσκιτερπένια μουρολένιο-γ οξείδιο του καρυοφυλλενίου βιριδιφλορόλη κουμπεμπόλη επι-κουμπεμπόλη 83

102 Διτερπένια μανουόλη Eικόνα 47: Τερπενοειδή συστατικά από το αιθέριο έλαιο S. fruticosa & S. pomifera Εποχικότητα S. fruticosa Στο αιθέριο έλαιο των ατόμων του πληθυσμού Αχαΐας ανιχνεύθηκαν 28 συστατικά. Αυτά αποτελούν το 81,89-88,12% του συνόλου του αιθέριου ελαίου μεταξύ των τεσσάρων εποχών συγκομιδής. Τα βασικά συστατικά καθόλες τις περιόδους συγκομιδής (Πίνακας 14) ήταν η ευκαλυπτόλη (30,38-41,87%), η καμφορά (4,99-9,13%), η βιριδιφλορόλη (2,27-6,51%), το καρυοφυλλένιο-β (3,44-6,37%), η μανουόλη (1,71-6,28%), το πινένιο-β (2,44-5,33%) και το πινένιο-α (2,25-4,39%). Σε μικρότερες ποσότητες βρέθηκαν η θυϊόνη-β (1,43-4,51%), η θυϊόνη-α (0,93-3,86%), το μυρκένιο (3,23-3,91%), το καμφένιο (1,13-3,75%), η τερπινεόλη-α (2,6-3,65%), το οξείδιο του καρυοφυλλενίου (0,60-2,17%), το χουμουλένιο-α (1,14-2,02%), η βορνεόλη (0,92-1,31%) και το αρωμαδενδρένιο (0,39-1,58%). Τα αποτελέσματα αυτά είναι σε συμφωνία με παλαιότερες μελέτες σχετικές με την σύνθεση του αιθέριου ελαίου του S.fruticosa (Skoula et al. 1999, Papageorgiou et al. 2008, Muller-Riebau et al. 1997). 84

103 Πίνακας 14: Ποσοστά (%) των κύριων συστατικών του αιθέριου ελαίου ανά εποχή (Μ.Ο., ±Τ.Α., n=5) για τον πληθυσμό Αχαΐας. ΣΥΣΤΑΤΙΚΑ Άνοιξη Καλοκαίρι Φθινόπωρο Χειμώνας pinene-a 2,25±1,03 3,86±0,73 4,39±0,63 2,85±0,53 camphene 1,13±0,75 2,32±2,29 3,75±2,80 2,30±1,90 pinene-b 2,44±0,71 5,21±0,49 5,33±1,00 3,82±1,46 myrcene 3,46±1,76 3,91±0,92 3,23±2,11 3,79±1,96 eucalyptol 30,38±5,55 41,87±4,82 36,28±6,12 32,51±3,06 terpinene-γ 0,50±0,19 0,60±0,16 0,45±0,11 0,47±0,13 thujone-cis 0,93±1,15 2,96±1,06 3,86±3,24 2,35±2,53 thujone-trans 1,43±1,08 2,72±0,81 4,51±1,58 2,93±1,46 camphor 6,79±5,76 4,99±4,18 9,13±6,21 7,61±5,81 borneol 1,15±0,50 0,92±1,56 1,31±1,22 1,08±0,87 terpineol-δ 1,05±0,08 1,01±0,08 0,82±0,10 1,01±0,21 terpinen-4-ol 0,57±0,13 0,41±0,13 0,34±0,11 0,51±0,26 terpineol-a 3,65±0,15 3,06±1,05 2,6±0,83 3,50±0,62 caryophyllene-β 6,13±0,64 4,02±1,79 3,44±1,32 6,37±1,30 aromadendrene 1,58±1,20 0,54±0,48 0,39±0,18 1,09±0,72 humulene-a 1,69±1,51 1,14±0,56 1,41±1,12 2,02±1,06 caryophyllene oxide 2,17±1,48 0,60±0,23 0,89±0,34 0,85±0,47 viridiflorol 6,51±3,84 2,27±0,64 2,65±0,86 5,34±2,82 manool 6,28±1,51 1,71±0,28 2,65±0,85 2,54±1,87 Επιπλέον παρατηρήθηκε ότι για τους μονοτερπενικούς υδρογονάνθρακες πινένιο-α, πινένιο-β και μυρκένιο υπήρχε η τάση αύξησης κατά το καλοκαίρι και το φθινόπωρο. Τα οξυγονωμένα μονοτερπένια ευκαλυπτόλη και θυϊόνη-α,β είχαν ανοδική τάση από την άνοιξη μέχρι το καλοκαίρι-φθινόπωρο. Οι θυϊόνες παρουσίαζαν μέγιστη τιμή κατά την φθινοπωρινή συγκομιδή γεγονός που συμφωνεί με την βιβλιογραφία και άλλους ερευνητές (Sarrou 2016). Για τον εκπρόσωπο των σεσκιτερπενικών υδρογονανθράκων καρυοφυλλένιο-β παρατηρήθηκε μείωση κατά την εποχή συγκομιδής του καλοκαιριού και του φθινοπώρου. Αναφορικά με τα οξυγονωμένα σεσκιτερπένια, βιριντιφλορόλη και μανουόλη, παρουσιάστηκε τάση μείωσης από την εποχή της ανοιξιάτικης συγκομιδής μέχρι το φθινόπωρο. Ωστόσο κατά την στατιστική επεξεργασία (Εικόνα 48) δεν βρέθηκαν σημαντικές διαφορές σε όλα τα 85

104 παραπάνω συστατικά. Πιο συγκεκριμένα, μόνο στο πινένιο-α, στην ευκαλυπτόλη, στην θυϊόνη-β, στο καρυοφυλλενιο-β και στο οξείδιο του καρυοφυλλενίου καταγράφηκαν σε επίπεδο σημαντικότητας p<0,05 στατιστικές διαφορές μεταξύ των εποχών. Η αυξημένη παραλλακτικότητα των συστατικών αυτών, ακόμα και στο ίδιο είδος φυτών και σε επίπεδο διαφορετικών ατόμων (διαφορές γενοτύπων) ενός πληθυσμού, σε συνδυασμό με την περιορισμένη, λόγω συνθηκών, δειγματοληψία φυτών, πιθανόν συνετέλεσε προς αυτή την κατεύθυνση. Εικόνα 48: Εποχική διακύμανση συστατικών αιθέριου ελαίου για τον πληθυσμό Αχαΐας,με εκείνα των οποίων οι διαφορές μεταξύ εποχών ήταν στατιστικά σημαντικές σε P<0,05, wi=χειμώνας,sp=άνοιξη, su=καλοκαίρι, au=φθινόπωρο, *στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ pinene-a, **στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ eucalyptol, *** στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ thujone-trans,!στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ caryophyllene-z,!! Στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ caryophyllene oxide. 86

105 Στην περίπτωση του πληθυσμού της Μεσσηνίας, ομοίως, ανιχνεύθηκαν 28 τερπενοειδή συστατικά στο αιθέριο έλαιο των φυτών. Αυτά αποτελούν το 82,90-89,40% του συνόλου του αιθέριου ελαίου μεταξύ των τεσσάρων εποχών συγκομιδής. Τα βασικά συστατικά καθόλες τις περιόδους συγκομιδής (Πίνακας 15) ήταν η ευκαλυπτόλη (24,12-35,78%), η καμφορά (5,95-13,63%), το καρυοφυλλένιο-β (3,85-11,39%), η βιριδιφλορόλη (1,82-6,63%), το πινένιο-β (2,87-6,70%), η μανουόλη (2,06-5,14%) και το πινένιο-α (1,32-5,03%). Σε μικρότερες ποσότητες βρέθηκαν το καμφένιο (0,86-5,14%), το μυρκένιο (2,75-3,62%), το οξείδιο του καρυοφυλλενίου (0,99-4,86%), η θυϊόνη-α (0,72-3,48%), η τερπινεόλη-α (2,18-3,71%), το αρομαδενδρένιο (0,73-2,85%), η θυϊόνη-β (1,34-2,79%), το χουμουλένιο-α (0,76-1,65%), και η βορνεόλη (0,94-1,34%). Πίνακας 15: Ποσοστά % των κύριων συστατικών του αιθέριουελαίου ανά εποχή (Μ.Ο.,±Τ.Α,n=5) για τον πληθυσμό Μεσσηνίας. ΣΥΣΤΑΤΙΚΑ Άνοιξη Καλοκαίρι Φθινόπωρο Χειμώνας pinene-a 1,32±0,69 5,03±0,25 4,52±1,38 3,08±1,11 camphene 0,86±0,65 5,14±1,04 4,46±2,77 3,62±1,24 pinene-b 2,87±1,49 5,27±0,95 6,7±1,11 5,58±1,29 myrcene 2,98±1,70 3,62±0,81 2,75±0,84 3,33±0,66 eucalyptol 24,12±5,34 33,05±2,06 35,78±5,54 30,94±2,40 terpinene-γ 0,37±0,10 0,40±0,08 0,36±0,05 0,28±0,02 thujone-cis 0,72±0,50 2,62±1,27 3,48±0,85 1,80±0,27 thujone-trans 1,34±0,37 2,01±0,61 2,79±0,75 1,86±0,43 camphor 5,95±3,82 13,63±4,59 9,15±6,43 7,83±5,00 borneol 1,24±0,77 1,33±0,23 1,34±0,63 0,94±0,55 terpineol-δ 1,09±0,13 0,76±0,07 0,84±0,11 1,35±1,20 terpinen-4-ol 0,50±0,11 0,45±0,08 0,43±0,09 0,41±0,10 terpineol-a 3,71±0,43 2,18±0,88 2,60±1,19 2,55±0,74 caryophyllene-β 11,39±1,40 3,85±0,83 5,82±1,68 9,47±4,04 aromadendrene 2,85±0,56 0,81±0,23 0,73±0,44 1,65±1,00 humulene-a 1,65±0,59 0,76±0,26 1,45±0,64 1,61±1,10 viridiflorene 0,58±0,20 0,28±0,08 0,35±0,20 0,65±0,40 spathulenone 2,29±0,57 0,46±0,08 0,45±0,15 0,90±0,50 caryophyllene oxide 4,86±1,13 0,99±0,20 1,06±0,50 1,43±0,42 viridiflorol 6,63±2,98 1,85±0,57 1,82±0,46 3,29±1,13 manool 5,14±2,12 2,34±1,91 2,06±1,04 3,76±1,92 87

106 Παρατηρήθηκε ότι για τους μονοτερπενικούς υδρογονάνθρακες πινένιο-α, πινένιο-β, μυρκένιο και καμφένιο υπήρχε η τάση αύξησης από την άνοιξη προς το καλοκαίρι και το φθινόπωρο. Τα οξυγονωμένα μονοτερπένια ευκαλυπτόλη και θυϊόνη-α,β είχαν ομοίως ανοδική τάση από την άνοιξη μέχρι το καλοκαίρι-φθινόπωρο. Οι θυϊόνες-α,β παρουσίαζαν μέγιστη τιμή κατά την φθινοπωρινή συγκομιδή και εδώ όπως και στον προηγούμενο πληθυσμό. Για το καρυοφυλλένιο-β παρατηρήθηκε μεγάλη μείωση κατά την εποχή συγκομιδής του καλοκαιριού και του φθινοπώρου σε σχέση με την άνοιξη. Αναφορικά με τα οξυγονωμένα σεσκιτερπένια βιριδιφλορόλη και μανουόλη παρουσιάστηκε τάση ελάττωσης από την εποχή της ανοιξιάτικης συγκομιδής μέχρι το φθινόπωρο. Οι προηγούμενες διαφοροποιήσεις των συστατικών του αιθέριου ελαίου συμφωνούν σε γενικές γραμμές με αυτές του πληθυσμού Αχαΐας, κατά την στατιστική επεξεργασία (Εικόνα 49) δεν βρέθηκαν σημαντικές διαφορές σε όλα τα παραπάνω συστατικά, φαίνεται όμως ότι οι διαφορές ήταν σε περισσότερα συστατικά από τον στατιστικό έλεγχο που έγινε στον προηγούμενο πληθυσμό. Πιο συγκεκριμένα, μόνο στο πινένιο-α, στο καμφένιο, στο πινένιο-β, στην ευκαλυπτόλη, στην θυιόνη-α,β, στο καρυοφυλλενιο-β και στο οξείδιο του καρυοφυλλενίου καταγράφηκαν σε επίπεδο σημαντικότητας (p< 0,05) στατιστικές διαφορές μεταξύ των εποχών. Επιπροσθέτως, έγινε σύγκριση μεταξύ των τερπενοειδών συστατικών και για τους δύο πληθυσμούς (Αχαΐας-Μεσσηνίας) κατά την περίοδο συγκομιδής του καλοκαιριού (Πίνακας 16) η οποία είχε και ανοδική τάση για τα περισσότερα βασικά συστατικά του αιθέριου ελαίου. Τα αποτελέσματα φαίνονται στο γράφημα της Εικόνας 50. Γίνεται αντιληπτό ότι παρότι τα συστατικά γενικώς παραλάσσουν, μόνο το πινένιο-α, το καμφένιο, η ευκαλυπτόλη, το τερπινένιο-γ, η καμφορά, η τερπινεόλη δ και το οξείδιο του καρυοφυλλενίου είχαν στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ των δύο αυτών πληθυσμών. 88

107 Εικόνα 49: Εποχική διακύμανση συστατικών αιθέριου ελαίου για τον πληθυσμό Μεσσηνίας,με εκείνα των οποίων οι διαφορές μεταξύ εποχών ήταν στατιστικά σημαντικές σε P<0,05, wi=χειμώνας, sp=άνοιξη, su=καλοκαίρι, au=φθινόπωρο, *στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ pinene-a, **στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ camphene, *** στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ pinene-β, #στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ eucalyptol,! Στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ thujone-cis,!!στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ thujonetrans, Ø στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ caryophyllene-z, στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ caryophyllene oxide. 89

108 Πίνακας 16: Ποσοστά % των κυριότερων συστατικών μεταξύ των πληθυσμών Αχαΐας Μεσσηνίας κατά την καλοκαιρινή συγκομιδή (Μ.Ο., ±T.A, n=5) ΣΥΣΤΑΤΙΚΑ Καλοκαίρι Αχαΐα Καλοκαίρι Μεσσηνία pinene-a 3,86±0,73 5,03±0,24 camphene 2,32±2,29 5,14±1,04 pinene-b 5,21±0,49 5,27±0,95 myrcene 3,90±0,91 3,62±0,82 eucalyptol 41,87±4,81 33,05±2,10 terpinene-γ 0,60±0,16 0,40±0,08 thujone-cis 2,96±1,06 2,62±1,27 thujone-trans 2,72±0,80 2,01±0,61 camphor 4,99±4,18 13,63±4,60 borneol 0,92±1,56 1,33±0,23 terpineol-δ 1,01±0,08 0,76±0,07 terpinen-4-ol 0,41±0,12 0,45±0,08 terpineol-a 3,06±1,05 2,18±0,08 caryophyllene-z 4,02±1,79 3,85±0,83 aromadendrene 0,54±0,48 0,81±0,23 humulene-a 1,14±0,56 0,76±0,26 caryophyllene oxide 0,60±0,23 0,99±0,20 viridiflorol 2,27±0,64 1,86±0,57 manool 1,71±0,27 2,34±1,91 90

109 Εικόνα 50: Σύγκριση συστατικών αιθέριου ελαίου για τους δύο πληθυσμούς (Αχαΐα-Μεσσηνία) κατά το καλοκαίρι, των οποίων οι διαφορές ήταν στατιστικά σημαντικές (p<0,05) *σύγκριση pinene-α, ** σύγκριση camphene, ***σύγκριση eucalyptol,!σύγκριση terpinene-γ,!! σύγκριση camphor, # σύγκριση terpineol-δ, ## σύγκριση caryophylleneoxide. 91

110 Εποχικότητα S. pomifera Στο αιθέριο έλαιο των ατόμων του πληθυσμού Αρκαδίας ο οποίος ανήκε σε ξεχωριστό είδος φυτών (S. pomifera) ανιχνεύθηκαν 28 συστατικά. Αυτά αποτελούν το 71,78-84,61% του συνόλου του αιθέριου ελαίου μεταξύ των τεσσάρων εποχών συγκομιδής. Τα βασικά συστατικά καθόλες τις περιόδους συγκομιδής (Πίνακας 17) ήταν η θυϊόνη-β (11,6-33,48%), η ευκαλυπτόλη (3,72-13,11%), η κουμπεμπόλη (3,98-9,82%), το καρυοφυλλένιο-ε, το μυρκένιο (5,24-7,46%), το κουμπεμπένιο-α (2,59-5,69%) και το μουρολένιο-γ (1,45-5,09%). Σε μικρότερες ποσότητες βρέθηκαν το κοπαένιο-α (1,04-3,22%), η έπικουμπεμπόλη (1,42-2,83%), το καδινένιο-δ (1,10-2,69%), η θυϊόνη-α (0,69-2,38%), η καμφορά (0,46-2,40%) το μπουρμπουνένιο-β (0,48-1,98%) και το ελεμένιο-γ (1,15-1,68%). Επιπλέον καταγράφηκαν τα συστατικά: πινένιο-α (0,31-1,53%), καμφένιο (0,23-1,35%), πινένιο-β (0,58-1,95%), βορνεόλη (0,32-1,53%) και χουμουλένιο-α (0,80-3,59%). Τα δεδομένα αυτά έρχονται σε συμφωνία με τη βιβλιογραφία (Pitarokili et al. 2011, Glamoclija et al. 2006) για τη σύνθεση του αιθέριου ελαίου των φυτών αυτού του είδους. Είναι φανερό πως η σύσταση μεταξύ S. pomifera και S. fruticosa διαφέρει ως προς τα κύρια συστατικά (π.χ θυϊόνη, μυρκένιο, ευκαλυπτόλη) κατά την αναλογία που αυτά καταλαμβάνουν από το συνολικό αιθέριο έλαιο, αλλά και ως προς την παρουσία εντελώς διαφορετικών τερπενοειδών (π.χ κουμπεμπόλη, μουρολένιο-γ, μπουρμπονένιο-β). Δεδομένης της αυξημένης συγκέντρωσης του φυτού αυτού σε θυϊόνη, πρέπει να ελέγχεται η χρήση του σε ποσότητες ασφαλείς για τον χρήστη καθώς πρόκειται για νευροτοξική ουσία. 92

111 Πίνακας 17: Ποσοστά % των κύριων συστατικών του αιθέριουελαίου ανά εποχή (Μ.Ο.,±Τ.Α,n=4) για τον πληθυσμό Aρκαδίας. Συστατικά Άνοιξη Καλοκαίρι Φθινόπωρο Χειμώνας α-pinene 0,31±0,21 1,53±1,21 1,34±0,59 0,71±0,31 camphene 0,23±0,07 1,35±1,45 1,26±1,03 0,57±0,45 β-pinene 0,58±0,20 1,95±1,18 1,91±0,60 1,28±0,49 myrcene 5,38±0,13 5,24±1,29 7,46±3,85 5,64±2,14 Limonene 0,53±0,05 0,34±0,21 0,57±0,43 1,24±0,95 eucalyptol 3,72±2,24 13,11±8,34 12,01±1,00 9,27±4,90 thujone <cis> 0,69±0,55 2,38±1,12 0,97±0,68 1,36±1,14 thujone <trans> 11,6±6,95 33,48±14,50 19,50±3,07 27,67±13,54 camphor 0,46±0,04 1,71±1,88 2,40±0,45 1,54±1,45 borneol 0,32±0,17 1,50±1,64 1,53±0,83 1,35±0,82 terpineol-α 0,23±0,07 0,68±0,33 0,67±0,45 0,73±0,51 cubebene <α-> 5,69±1,75 3,23±1,50 3,38±0,60 2,59±0,33 copaene -α 3,22±0,53 1,04±1,18 1,49±0,04 1,35±0,16 bourbonene-b 1,98±1,52 2,10±1,35 0,65±0,81 0,48±0,41 caryophyllene <(E)-> 8,62±2,17 1,31±1,42 4,36±0,09 3,77±0,71 elemene -γ 1,29±1,82 1,68±2,21 1,38±1,86 1,15±1,93 α-humulene 3,59±4,88 0,80±0,99 2,08±2,89 1,76±2,12 muurolene -γ 5,09±2,69 1,45±0,98 3,74±1,37 4,36±2,33 cubebol-epi 2,83±0,47 1,42±0,90 2,12±0,53 1,97±0,47 cubebol 9,82±2,65 3,98±2,23 7,70±1,09 6,88±1,50 cadinene -δ 2,69±0,77 1,10±0,40 1,12±0,35 1,28±0,47 caryophyllene oxide 1,24±0,39 0,41±0,36 0,77±0,40 1,01±0,39 Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι για τους μονοτερπενικούς υδρογονάνθρακες πινένιο-α, πινένιο-β, μυρκένιο και καμφένιο υπήρχε η τάση αύξησης από την άνοιξη προς το καλοκαίρι και το φθινόπωρο, ομοίως, με τους προηγούμενους πληθυσμούς. Τα οξυγονωμένα μονοτερπένια, ευκαλυπτόλη και θυϊόνη-α,β, είχαν, ομοίως, ανοδική τάση από την άνοιξη μέχρι το καλοκαίρι-φθινόπωρο. Για το καρυοφυλλένιο, το κοπαένιο και το κουμπεμπένιο παρατηρήθηκε μείωση κατά την εποχή συγκομιδής 93

112 του καλοκαιριού και του φθινοπώρου σε σχέση με την άνοιξη. Αναφορικά με τα οξυγονωμένα σεσκιτερπένια, κουμπεμπόλη, επι-κουμπεμπόλη, καδινένιο-δ και οξείδιο του καρυοφυλλενίου, εμφανίζεται, αντίστοιχα, μείωση σε σχέση με την άνοιξη σε ποσοστό των συστατικών. Οι προηγούμενες διαφοροποιήσεις των συστατικών του αιθέριου ελαίου συμφωνούν σε γενικές γραμμές με αυτές του πληθυσμού Αχαΐας. Κατά την στατιστική επεξεργασία (Εικόνα 51) δεν βρέθηκαν σημαντικές διαφορές σε όλα τα παραπάνω συστατικά. Δείχθηκε ότι τα συστατικά που διέφεραν σε επίπεδο στατιστικώς σημαντικό ήταν τα: κουμπεμπένιο-α, κοπαένιο-α, καρυοφυλλένιο, κουμπεμπόλη και καδινένιο-δ. Εικόνα 51: Εποχική διακύμανση συστατικών αιθέριου ελαίου για τον πληθυσμό Αρκαδίας,με εκείνα των οποίων οι διαφορές μεταξύ εποχών ήταν στατιστικά σημαντικές σε P<0,05, wi=χειμώνας, sp=άνοιξη, su=καλοκαίρι, au=φθινόπωρο, *στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ cubebene-α, **στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ copaene-α, *** στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ caryophyllene-e,!στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ cubebol,!! Στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ cadinene-δ. 94