ΣΧΟΛΕΣ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΚΑΙ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑΤΑ ΧΗΜΕΙΑΣ, ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΚΑΙ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ

Transcript

1 ΣΧΟΛΕΣ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΚΑΙ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑΤΑ ΧΗΜΕΙΑΣ, ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΚΑΙ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΔΙΑΤΜΗΜΑΤΙΚΟ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΣΠΟΥΔΩΝ «ΙΑΤΡΙΚΗ ΧΗΜΕΙΑ: ΣΧΕΔΙΑΣΜΟΣ ΚΑΙ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ» ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ «Μελέτη της υπεριώδους ακτινοβολίας και των υπερήχων στην επιβίωση μικροοργανισμών» Νικολόπουλος Γεώργιος ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ: Βανταράκης Απόστολος (Αν. Καθηγητής Υγιεινής του Τμήματος Ιατρικής) ΠΑΤΡΑ

2 2

3 SCHOOLS OF NATURAL ΑΝD HEALTH SCIENCES DEPARTMENTS OF CHEMISTRY, MEDICINE AND PHARMACY POSTGRADUATE PROGRAM «MEDICINAL CHEMISTRY: DRUG DISCOVERY AND DESIGN» MASTER THESIS «Study of ultraviolet radiation and ultrasound in the survival of microorganisms» Nikolopoulos Georgios SUPERVISOR: Vantarakis Apostolos (Associate Professor of Public Health in the Department of Medicine) PATRAS

4 4

5 Επιβλέπων: Βανταράκης Απόστολος Αναπληρωτής καθηγητής Τριμελής Εξεταστική Επιτροπή: Βανταράκης Απόστολος Παπαχατζοπούλου Αδαμαντία Τσέλιος Θεόδωρος Αναπληρωτής καθηγητής Αναπληρώτρια καθηγήτρια Αναπληρωτής καθηγητής Supervisor: Vantarakis Apostolos Assοciate Professor Examiners Committee: Vantarakis Apostolos Papachatzopoulou Adamantia Τselios Theodoros Assοciate Professor Assοciate Professor Assοciate Professor 5

6 6

7 Στην οικογένεια μου... 7

8 8

9 ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Η παρούσα διπλωματική εργασία εκπονήθηκε στο εργαστήριο Υγιεινής του Τμήματος Ιατρικής του Πανεπιστημίου Πατρών στο πλαίσιο απόκτησης μεταπτυχιακού διπλώματος ειδίκευσης του διατμηματικού προγράμματος σπουδών με τίτλο Ιατρική Χημεία: σχεδιασμός και ανάπτυξη φαρμακευτικών προϊόντων, των τμημάτων Χημείας, Φαρμακευτικής και Ιατρικής του Πανεπιστήμιου Πατρών. Με την εργασία αυτή, μου δόθηκε η δυνατότητα να μελετήσω τον τομέα της περιβαλλοντικής μικροβιολογίας και συγκεκριμένα να διευρύνω τις γνώσεις μου στον τομέα της μικροβιολογίας του νερού. Πρώτα απ όλα, θα ήθελα να ευχαριστήσω τον επιβλέποντα της διπλωματικής εργασίας μου, Αναπληρωτή Καθηγητή κο. Βανταράκη Απόστολο για την καθοδήγηση και την άμεση και ουσιαστική βοήθεια που μου παρείχε κατά τη διάρκεια της εκπόνησης αυτής της διπλωματικής εργασίας. Επίσης, θα ήθελα να ευχαριστήσω και τα υπόλοιπα μέλη της εξεταστικής επιτροπής, κα. Παπαχαντζοπούλου Αδαμαντία και κο. Τσέλιο Θεόδωρο για τις πολύτιμες υποδείξεις τους. Επίσης θα ήθελα να ευχαριστήσω όλα τα μέλη του εργαστήριου, Εύη, Αφροδίτη, Γαβριήλ και Έλενα για την άψογη συνεργασία και ηθική στήριξη. Τέλος, θα ήθελα να ευχαριστήσω τους γονείς μου για την στήριξη και για όλα όσα µου έχουν προσφέρει όλα αυτά τα χρόνια. 9

10 10

11 Συντομεύσεις -Ακρωνύμια Br Bromine (Βρώμιο) CFU Colony forming unit Cl Chlorine (Χλώριο) DBP Disinfection by-products (παραπροϊόντα απολύμανσης) DNA Deoxyribonucleic Acid (δεσοξυριβονουκλεϊνικό οξύ) E. coli Escherichia coli (Κολοβακτηρίδιο) E. faecalis Enterococcus faecalis (Εντερόκοκκος) EEA European Economic Area EFTA European Free Trade Association EHEC-VTEC Enterohemorrhagic - verotoxigenic E. coli (Εντεροαιμοραγικά - Veroτοξινογόνα στελέχη) EIEC Enteroinvasive E. coli (Εντεροδιεισδυτικά στελέχη) EPEC Enteropathogenic E. coli (Εντεροπαθογόνα στελέχη) ETEC Enterotoxigenic E. coli (Εντεροτοξινογόνα στελέχη) gr Gram (Γραμμάρια) h Hour (Ώρα) HAAs Haloacetic acids (αλογονοξικά οξέα) Hz Hertz I Iodine (Ιώδιο) J Joule khz Kilohertz LAB Lactic Acid bacteria LT (toxin) Heat-Labile Toxin Ltr - l Litre (Λίτρο) MF Membrane filtration (Μέθοδος διήθησης δια μεμβρανών) mg Milligram (χιλιοστόγραμμο) MHz Megahertz min Minutes (Λεπτά) ml mili litre (Χιλιοστόλιτρο) MRD Multiple drug resistance nm nanometre (νανόμετρο) O3 Οzone (Όζον) o C Celsius scale (κλίμακα Κελσίου) P. aeruginosa Pseudomonas aeruginosa (Ψευδομονάδα πυοκυανική) ppm parts per million RNA Ribonucleic acid (ριβονουκλεϊκό οξύ) rrna Ribosomal ribonucleic acid (Ριβοσωμικό RNA) S. aureus Staphylococcus aureus (Σταφυλόκοκκος χρυσίζων) 11

12 atm HUS ST (toxin) THMs TTHMs US UV W WHO ΟΜΧ π.χ π.χ Meas. Atmosphere Hemolytic-Uremic Syndrome - αιμολυτικό ουραιμικό σύνδρομο Heat stable enterotoxin Trihalomethanes (τριαλογονομεθάνια) Total trihalomethanes (Ολικά τριαλογονομεθάνια) Ultrasound (υπέρηχοι) Ultraviolet (υπεριώδης ακτινοβολία) Watt (Βατ) World health organization (Παγκόσμιος οργανισμός υγείας) Total Mesophilic Flora (Ολική μεσόφιλη χλωρίδα) Παραδείγματος χάρη Προ Χριστού Measurement (Μέτρηση) 12

13 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ...9 ΠΕΡΙΛΗΨΗ...15 ABSTRACT...17 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 Ο :ΕΙΣΑΓΩΓΗ-Κολυμβητικές δεξαμενές Ιστορία των κολυμβητικών δεξαμενών Ορισμοί-τύποι κολυμβητικών δεξαμενών Νομοθεσία κολυμβητικών δεξαμενών Αδυναμίες της ελληνικής υγειονομικής διάταξης Ισορροπία του νερού ph Ολική αλκαλικότητα Σκληρότητα ασβεστίου Θερμοκρασία Ολικά διαλυμένα στερεά Απολύμανση του νερού Απολύμανση με χλώριο Απολύμανση με όζον Απολύμανση με ιώδιο Απολύμανση με βρώμιο Παραπροϊόντα απολύμανσης Παραπροϊόντα απολύμανσης - επιπτώσεις στην υγεία Απολύμανση με υπεριώδη ακτινοβολία (UV) Aπολύμανση με υπέρηχους Βακτήρια Ταξινόμηση και μορφολογία Κύκλος ζωής και ανάπτυξης των βακτηρίων Ολική μεσόφιλη χλωρίδα (ΟΜΧ) Εντεροβακτηριοειδή Escherichia coli Σταφυλόκοκκος χρυσίζων - Staphylococcus aureus Ψευδομονάδα πυοκυανική - Pseudomonas aeruginosa Εντερόκοκκος Enterococcus faecalis Σκοπός της μελέτης...57 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 Ο : Υλικά και μέθοδοι

14 2.1 Υλικά Εξοπλισμός σκεύη Αναλώσιμα Βακτηριακά στελέχη Εξοπλισμός πιλοτικού μοντέλου δεξαμενής Θρεπτικά υλικά διαλύματα και αντιδραστήρια Παρασκευή θρεπτικών υλικών και διαλυμάτων Μέθοδοι Άσηπτες μέθοδοι εργασίας Μέθοδος spread plate (Επιφανειακής επίστρωσης) Μέθοδος διαδοχικών αραιώσεων Μέθοδος αναζωογόνησης lenticule Μέθοδος Διήθησης από μεμβράνες (Mf) Πειραματικό μέρος (Α). Απολύμανση με υπεριώδη ακτινοβολία σε πιλοτικό μοντέλο δεξαμενής Γενικά στοιχεία Στάδια πειραματικής διαδικασίας UV Στάδια πειραματικής διαδικασίας - Επιβίωση των μικροοργανισμών στο νερό, χωρίς UV Πειραματικό μέρος (Β). Απολύμανση με υπέρηχους (US) σε λουτρό Στάδια πειραματικής διαδικασίας- Απολύμανση με υπέρηχους (US)...78 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 Ο : Αποτελέσματα Αποτελέσματα πειραμάτων control Αποτελέσματα πειραμάτων με την χρήση υπεριώδους ακτινοβολίας (UV) Αποτελέσματα πειραμάτων με την χρήση υπερήχων (US) ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 Ο : Συμπεράσματα και συζήτηση ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ

15 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Μέχρι σήμερα, ο μόνος αποτελεσματικός τρόπος απολύμανσης του νερού των κολυμβητικών δεξαμενών είναι η προσθήκη χημικών ουσιών (κυρίως χλωρίου), αλλά με σημαντικά μειονεκτήματα (παραγωγή παραπροϊόντων) για τον άνθρωπο και το περιβάλλον. Δυο εναλλακτικές, πολλά υποσχόμενες και φιλικές προς το περιβάλλον μέθοδοι απολύμανσης είναι η χρήση του υπεριώδους φωτός (UV) και των υπερήχων (US). Σκοπός της μελέτης αυτής ήταν να αξιολογήσει τις επιπτώσεις της χρήσης UV και US σε διάφορους παθογόνους μικροοργανισμούς σε υδάτινο περιβάλλον. Αξίζει να αναφερθεί ότι η έρευνα η οποία πραγματοποιήθηκε αποτελεί πρωτογενή μελέτη. Η καινοτομία της συγκεκριμένης μελέτης έγκειται στο ότι δεν έχει πραγματοποιηθεί απολύμανση με υπεριώδη ακτινοβολία σε ανάλογο πιλοτικό μοντέλο κολυμβητικής δεξαμενής που να συνδυάζεται η ελληνική νομοθεσία και τα διεθνή πρωτόκολλα. Για την αξιολόγηση της υπεριώδους ακτινοβολίας (UV) χρησιμοποιήθηκε ένα πιλοτικό μοντέλο δεξαμενής το οποίο προσομοίωνε μια πραγματική κολυμβητική δεξαμενή ολυμπιακών διαστάσεων και κατασκευάστηκε από υλικό plexiglas, σε κλίμακα 1: 250. Τα βακτηριακά στελέχη που χρησιμοποιήθηκαν ήταν τα Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa και Enterococcus faecalis. Δείγματα λαμβάνονταν σε διαφορετικά χρονικά διαστήματα κατά τη διάρκεια της διεργασίας, η οποία διήρκησε δύο ημέρες. Για την αξιολόγηση της μικροβιοκτόνου δράσης των υπέρηχων (US) χρησιμοποιήθηκε υδατόλουτρο υπερήχων το οποίο ρυθμίστηκε στα 80 kηz. Τα βακτηριακά στελέχη που χρησιμοποιήθηκαν ήταν δυο, ένα gram θετικό και ένα gram αρνητικό. Συγκεκριμένα, τα Escherichia coli και Staphylococcus aureus. Η ανάλυση των αποτελεσμάτων πραγματοποιήθηκε με τη βοήθεια της στατιστικής ανάλυσης του προγράμματος Microsoft Excel. Από τα στοιχεία που προέκυψαν κατά τη διάρκεια της μελέτης, όλοι οι μικροβιακοί δείκτες που χρησιμοποιήθηκαν παρουσίασαν αξιοσημείωτη ποσοστιαία μεταβολή. Συνεπώς, τόσο η υπεριώδης ακτινοβολία (UV) όσο και οι υπέρηχοι (US) μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την απολύμανση του νερού των κολυμβητικών δεξαμενών αντικαθιστώντας ή συμπληρώνοντας τις συμβατικές μεθόδους απολύμανσης που χρησιμοποιούνται. Λέξεις Κλειδιά: Υπεριώδης ακτινοβολία (UV), Υπέρηχοι (US), Κολυμβητικές δεξαμενές, Νερό, Μικροοργανισμοί. 15

16 16

17 ABSTRACT Until now, the only effective way to disinfect water in swimming pools is to add chemicals (mainly chlorine), but with significant drawbacks (the creation of By-products) for humans and the environment. Two alternative, promising and environmentally friendly disinfection methods are the use of ultraviolet (UV) and ultrasound (US). The aim of this study was to assess the effects of UV and US use on various pathogenic microorganisms in aquatic environments. It is worth mentioning that the research carried out is the first of its kind. The innovation of this study lies in the fact that no UVdisinfection has been carried out in a similar pilot model swimming pool, that combines Greek legislation and international protocols. For the evaluation of ultraviolet radiation (UV), a pilot tank model was used which simulated an actual swimming pool of Olympic dimensions and was constructed from Plexiglas material, in scale 1 : 250. The bacterial strains used were: Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa και Enterococcus faecalis. Samples were taken at different time intervals during the process, which lasted two days. For ultrasonic germicidal evaluation (US), an ultrasonic water bath was used which was set at 80 khz. Two bacterial strains were used, a gram positive and a gram negative. In particular, Escherichia coli and Staphylococcus aureus. The analysis of the results was carried out using the statistical analysis of Microsoft Excel. From the data obtained during the study, all the microbial markers used showed a remarkable percentage change. Consequently, both Ultraviolet radiation (UV) and ultrasound (US) can be used to decontaminate swimming pool water by replacing or supplementing the conventional disinfection methods used. Keywords: Ultraviolet radiation (UV), Ultrasound (US), Swimming tanks, Water, Microorganisms. 17

18 18

19 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 Ο ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΚΟΛΥΜΒΗΤΙΚΕΣ ΔΕΞΑΜΕΝΕΣ 19

20 20

21 1.1 Ιστορία των κολυμβητικών δεξαμενών. Η ιστορία των κολυμβητικών δεξαμενών είναι μεγάλη και φθάνει έως το 3000 π.χ. που χρονολογούνται τα πρώτα λουτρά στην κοιλάδα του Ινδού. Το 500 π.χ. οι Έλληνες έχτισαν κολυμβητικές δεξαμενές για αθλητικούς σκοπούς ενώ την ίδια περίοδο στο αρχαίο Ισραήλ χρησιμοποιούσαν δημόσια λουτρά για τελετουργικό πλύσιμο. Οι Ρωμαίοι έχτισαν εκατοντάδες συγκροτήματα λουτρών σε όλη την επικράτεια της αυτοκρατορίας τους. Το τυπικό συγκρότημα περιελάμβανε κολυμβητικές δεξαμενές, ζεστές μπανιέρες, αμμόλουτρα και εγκαταστάσεις αναψυχής. Με την πτώση της Ρωμαϊκής αυτοκρατορίας οι κολυμβητικές κατασκευές μειώθηκαν στους δυτικούς πολιτισμούς του τότε κόσμου. Ωστόσο παρέμειναν δημοφιλείς σε ανατολικούς πολιτισμούς όπως Τουρκία, Ινδία, Ιαπωνία κ.α. (Gabrielsen, 1986,Olsen, 2007). Αργότερα οι Άγγλοι μετέφεραν από τους ανατολικούς πολιτισμούς τα μοντέρνα λουτρά και τα διέδωσαν σε όλη την Αγγλία και την Ευρωπαϊκή ήπειρο. Τα επόμενα χρόνια οι κολυμβητικές δεξαμενές αρχίσαν να παίρνουν τη σημερινή μορφή τους (Love, 2008). Τη δεκαετία του 1860 στις ΗΠΑ διαδόθηκαν τα λουτρά με αλατόνερο, ενώ τις επόμενες δεκαετίες ο αριθμός των κολυμβητών αυξανόταν όλο και περισσότερο σε Ευρώπη και Αμερική. Η Βικτοριανή εποχή ήταν μια περίοδος όπου η ιατρική, η βιομηχανική τεχνολογία και γενικότερα οι δημόσιες υποδομές έθεσαν το βιοτικό επίπεδο για εκατομμύρια ανθρώπους. Ωστόσο η ιατρική επιστήμη αδυνατούσε να αποτρέψει εκδηλώσεις ασθενειών όπως ο τυφοειδής πυρετός, η χολέρα, η δυσεντερία και άλλες ασθένειες. Στις μεγαλύτερες πόλεις του 19 ου αιώνα οι φτωχοί δεν είχαν πρόσβαση σε κολυμβητικές εγκαταστάσεις (Thornton, 1991). Τη δεκαετία του 1890 τόσο σε Ευρώπη όσο και σε ΗΠΑ εισήχθησαν υγειονομικές μεταρρυθμίσεις με στόχο την προώθηση της υγείας μέσω της καθαριότητας και προσωπικής υγιεινής. Πολλές δημόσιες κολυμβητικές δεξαμενές με ντούζ και γκαρνταρόμπα δημιουργήθηκαν για όλους. Αρχές της δεκαετίας του 1930 αξίζει να σημειωθεί ότι το 42% των γυμνασίων των ΗΠΑ είχαν κολυμβητική δεξαμενή. Κατά τη διάρκεια του Β Παγκοσμίου πολέμου οι οικιακές κολυμβητικές δεξαμενές αυξήθηκαν κάτι το οποίο αποτελούσε προνόμιο μόνο των πλουσίων. Το νερό των κολυμβητικών δεξαμενών άρχισε να διηθείται (τεχνολογία φιλτραρίσματος με άμμο) ούτως ώστε να αποφεύγεται η θολερότητα στην όψη ενώ όλες οι κολυμβητικές δεξαμενές ήταν χτισμένες σε επικλινές έδαφος για να διευκολύνεται η αποστράγγιση τους (Wiltse, 2007). Από τις αρχές του 1900 έχοντας όλοι εκτιμήσει την αξία της κολύμβησης και με την παραγωγή του χλωρίου να βρίσκεται σε άνθηση, έγιναν οι πρώτες προσπάθειες 21

22 απολύμανσης του νερού. Η χλωρίωση του νερού εφαρμόστηκε αρχικά για το πόσιμο νερό και στη συνέχεια για τις κολυμβητικές δεξαμενές παρουσιάζοντας εξαιρετικά αποτελέσματα. Μέχρι και σήμερα, η χλωρίωση για την απολύμανση του νερού, κυριαρχεί (Olsen, 2007). 1.2 Ορισμοί - Τύποι κολυμβητικών δεξαμενών. Κολυμβητική δεξαμενή ή κολυμβητήριο: καλείται κάθε τεχνητή δεξαμενή η οποία τροφοδοτείται από νερό κατάλληλης πηγής υδροληψίας και η οποία χρησιμοποιείται για ομαδική κολύμβηση και αναψυχή. Δημόσιας χρήσης κολυμβητική δεξαμενή: καλείται η δεξαμενή που χρησιμοποιείται από το κοινό ή από ομάδες πληθυσμού όπως μέλη συλλόγων, μέλη εκπαιδευτικών ιδρυμάτων, ενοίκους ξενοδοχείων, ενοίκους πολυκατοικίας κτλ. ανεξαρτήτως ιδιοκτησίας. Αθλητική κολυμβητική δεξαμενή: καλείται η δεξαμενή η οποία χρησιμοποιείται κατά κύριο λόγο για αθλητικά αγωνίσματα, προπόνηση ή για εκπαίδευση αθλητών. Εσωτερική κολυμβητική δεξαμενή: καλείται η δεξαμενή η οποία βρίσκεται σε κλειστό στεγασμένο χώρο. Εξωτερική κολυμβητική δεξαμενή ή υπαίθρια: καλείται η δεξαμενή η οποία βρίσκεται σε υπαίθριο περιφραγμένο χώρο. Ιδιωτική κολυμβητική δεξαμενή: καλείται η δεξαμενή που χρησιμοποιείται αποκλειστικά από τα μέλη μιας οικογένειας, συγγενείς ή φιλικά πρόσωπα. Δεξαμενή υδρομάλαξης και αναζωογόνησης (Spa, Whirlpool spa, jacuzzi): καλείται η δεξαμενή η κατασκευή της οποίας εξασφαλίζει ότι οι χρήστες της μπορούν να κάθονται και να επιδρά επάνω τους το υπό πίεση νερό και οι φυσαλίδες αέρα, παρά να κολυμπούν. (ΦΕΚ 87/Β/ ,Μαυρίδου και συν., 2014). 1.3 Νομοθεσία κολυμβητικών δεξαμενών. Σύστημα ανακυκλοφορίας του νερού Το σύστημα ανακυκλοφορίας του νερού εξασφαλίζει την ανανέωση του νερού της κολυμβητικής δεξαμενής με συγκεκριμένο ρυθμό. Στόχος του συστήματος αυτού είναι η συγκέντρωση της μόλυνσης της δεξαμενής στο σύστημα φίλτρανσης και στη 22

23 συνέχεια στο σύστημα απολύμανσης. Σύμφωνα με την ελληνική νομοθεσία συνιστάται 24 ωρη λειτουργία του συστήματος ανακυκλοφορίας έτσι ώστε να εξασφαλίζεται η διαύγεια του νερού. Η πλήρη ανακυκλοφορία του νερού πρέπει να εξασφαλίζεται σε διάστημα 4 ωρών και σε καμία περίπτωση μεγαλύτερο αυτού. (ΦΕΚ 87/Β/ ). Ισορροπία του νερού Σε όλες τις κολυμβητικές δεξαμενές των οποίων το νερό θερμαίνεται τεχνητώς η θερμοκρασία αυτού θα πρέπει να διατηρείται μεταξύ C. Η τιμή ph του νερού της κολυμβητικής δεξαμενής θα πρέπει να διατηρείται μεταξύ 7,20 έως 8,20. Η αλκαλικότητα του ύδατος πρέπει να είναι τουλάχιστον 50 mg/l και να μετράται μέσω πορτοκαλόχρου του μεθυλίου. (ΦΕΚ 87/Β/ ). Μικροβιολογικός έλεγχος του νερού Η ελληνική υγειονομική διάταξη καθορίζει τους εξής δείκτες μικροβιολογικής ποιότητας του νερού των κολυμβητικών δεξαμενών: Ολικός αριθμός της μεσόφιλης χλωρίδας (OMX) στους 37 0 C για 24 ώρες (<200/ml) Ολικά κολοβακτηριοειδή (<15/100ml) Απουσία κοπρανωδών κολοβακτηριοειδών (E.coli/100ml).(ΦΕΚ 87/Β/ ). Απολύμανση Για την απολύμανση του νερού της κολυμβητικής δεξαμενής πρέπει να χρησιμοποιείται χλώριο ή οποιαδήποτε άλλη μέθοδος απολύμανσης εγκεκριμένη από υγειονομική υπηρεσία. Για απολύμανση μέσω χλωρίου συνήθως χρησιμοποιείται αέριο χλώριο ή υποχλωριώδες ασβέστιο ή νάτριο ή χλώριο παραγόμενο δια ηλεκτρολύσεως. Το νερό των δεξαμενών πρέπει να απολυμαίνεται συνεχώς μέσω αυτόματων συσκευών και το υπολειμματικό χλώριο στο νερό θα πρέπει να είναι από 0,4 έως 0,7 mg/l (ΦΕΚ 87/Β/ ) Αδυναμίες της ελληνικής υγειονομικής διάταξης Παρόλο που η ελληνική υγειονομική διάταξη ήταν πρωτοποριακή για την εποχή έκδοσης της και καλύπτει ένα μεγάλο εύρος όσον αφορά την ασφάλεια των κολυμβητικών δεξαμενών- κολυμβητηρίων παρουσιάζει ορισμένες ελλείψεις. 23

24 Δεν περιλαμβάνει την καταμέτρηση του μικροοργανισμού P. aeruginosa ως υποχρεωτικής παραμέτρου ποιότητας και του S. aureus ως συμπληρωματικού δείκτη. Σύμφωνα με την διεθνή βιβλιογραφία απαιτείται μεταβολή του επιτρεπτού ορίου ph από 7,2-8,2 σε 7,2-7,6 για καλύτερη απολύμανση μέσω χλωρίου (WHO, 2006). Δεν υπάρχει παράμετρος ελέγχου για την παρακολούθηση των παραπροϊόντων απολύμανσης (DBP). Δεν προβλέπεται παρακολούθηση του αέρα των εσωτερικών κολυμβητικών δεξαμενών (Μαυρίδου και συν., 2014). Ερευνητές που ασχολούνται με την ασφάλεια των κολυμβητηρίων προτείνουν εκτός από τους εντερικούς δείκτες, οι οποίοι προβλέπονται ήδη από την ελληνική διάταξη, την καθιέρωση μικροβιακών δεικτών που προέρχονται από το ρινοφαρυγγικό σύστημα και το δέρμα όπως ο S. aureus, ο οποίος παρουσιάζει αυξημένη αντοχή στη χλωρίωση. Επιπλέον προτείνουν και τον μικροβιακό δείκτη P. aeruginosa ο οποίος πολλαπλασιάζεται σε υδάτινα περιβάλλοντα και παρουσιάζει επίσης αντοχή στη χλωρίωση (Παπαπετροπούλου & Μαυρίδου, 1995). 1.4 Ισορροπία του νερού Η ισορροπία του νερού εξαρτάται από τους παρακάτω παράγοντες: ph Ολική αλκαλικότητα Σκληρότητα ασβεστίου Θερμοκρασία Ολικά διαλυμένα στερεά ph Η έννοια του ph υπάρχει εδώ και 110 χρόνια περίπου. Ο Δανικής καταγωγής S.P.L. Sorensen ήταν ο πρώτος που εισήγαγε την έννοια του ph. Τόσο οι βιολόγοι όσο και οι χημικοί χρησιμοποιούν σήμερα παγκοσμίως το σύμβολο του ph για την ανίχνευση και ένδειξη της οξύτητας ή της αλκαλικότητας ενός διαλύματος. Μετριέται σε λογαριθμική κλίμακα από 1,0 έως 14,0 με την τιμή 7,0 να αντιπροσωπεύει το ουδέτερο. Όταν το ph είναι μικρότερο του 7,0 τότε είναι όξινο ενώ όταν είναι πάνω από 7,0 αλκαλικό (Boyd, 24

25 2015). Με την έννοια ph συμβολίζεται ο αρνητικός δεκαδικός λογάριθμος της συγκέντρωσης υδροξωνίων σε διαλύματα. Δηλαδή: Επεκτείνοντας την έννοια του ph με τη χρήση της ενεργότητας, δημιουργείται ακριβέστερος ορισμός: (Myers, 2009). Το καθαρό νερό δεν αποτελείται αποκλειστικά από μόρια νερού, αλλά και από τα ιόντα H30 + (οξώνιο) και OH - (υδροξείδιο) τα οποία προκύπτουν λόγω ιοντισμού του νερού (Χρυσικόπουλος, 2008). Το ph του νερού μιας κολυμβητικής δεξαμενής θα πρέπει να ελέγχεται ώστε να εξασφαλίζεται: (1) αποτελεσματική απολύμανση, (2) προστασία του εξοπλισμού και (3) προστασία των κολυμβητών. Η συχνότητα της μέτρησης του, προτείνεται να γίνεται αυτόματα. Εάν αυτό δεν είναι δυνατόν καλό είναι να παρακολουθείται αρκετές φορές ημερησίως, κυρίως τις ώρες λειτουργίας της κολυμβητικής δεξαμενής. Σε περίπτωση που απαιτείται διόρθωση του ph, προσθέτουμε οξύ (π.χ HCl) για μείωση ενώ εφόσον απαιτείται αύξηση μια βάση (π.χ NaH2CO3). Σε κάθε περίπτωση, πριν τη διόρθωση του ph μιας κολυμβητικής δεξαμενής πρέπει να ελέγχονται τα επίπεδα της ολικής αλκαλικότητας. Τέλος, το ph φαίνεται να έχει άμεσο αντίκτυπο στους χρήστες κολυμβητικών δεξαμενών. Σε ακραίες τιμές μπορεί να έχει επιπτώσεις στο δέρμα και τα ματιά των κολυμβητών (WHO, 2006) Ολική αλκαλικότητα Η ολική αλκαλικότητα αποτελεί μέτρο εκτίμησης του ποσού των αλκαλικών αλάτων που υπάρχουν στο νερό. Δεν πρέπει να συνδέεται με το ph αν και η σχέση τους είναι αλληλένδετη. Το ph δείχνει εάν ένα διάλυμα είναι όξινο, αλκαλικό ή ουδέτερο. Η ολική αλκαλικότητα δρα ως απορροφητικός παράγοντας για τη μείωση της διακύμανσης της τιμής του ph. Δηλαδή όσο πιο υψηλή είναι η αλκαλικότητα τόσο πιο ανθεκτικό είναι το νερό σε διακυμάνσεις του ph. (WHO, 2006). Το διττανθρακικό νάτριο (NaHCO3) αυξάνει την αλκαλικότητα μεταβάλλοντας αμελητέα το ph. Αντίθετα το ανθρακικό νάτριο (Na2CO3) αυξάνει την αλκαλικότητα αλλά αυξάνει και το ph. Γενικότερα προτιμώνται οι μικρές και συχνές τροποποιήσεις της αλκαλικότητας αντί των μεγάλων 25

26 σε αραιά χρονικά διαστήματα (Boyd, 2015). Το συνιστάμενο επίπεδο για το νερό μιας κολυμβητικής δεξαμενής είναι ppm. Στην παρακάτω εικόνα παρουσιάζονται συνοπτικά κάποια από τα προβλήματα που μπορεί να δημιουργηθούν από ακραίες τιμές αλκαλικότητας. Εικόνα 1. Ολική αλκαλικότητα-σχετιζόμενη με προβλήματα κολυμβητικών δεξαμενών. Πηγή (NSW,2013) Σκληρότητα ασβεστίου Το νερό των κολυμβητικών δεξαμενών χαρακτηρίζεται συχνά ως μαλακό ή σκληρό και ο χαρακτηρισμός αυτός έχει σχέση με την περιεκτικότητα σε άλατα ασβεστίου και μαγνησίου (Okafor, 2011). Το μαλακό νερό έχει συνήθως λιγότερο από 50 mg/l από αυτά τα άλατα εκφραζόμενα ως CaCO3, ενώ το σκληρό νερό περιέχει περισσότερα από 300 mg/l από αυτά τα άλατα εκφραζόμενα ως CaCO3. Η πολύ χαμηλή σκληρότητα ασβεστίου προκαλεί σημαντικές φθορές στον εξοπλισμό μια κολυμβητικής δεξαμενής. Είναι δυνατόν να παρατηρηθεί διάβρωση στα πλακάκια, θέρμανση στο σύστημα ανακυκλοφορίας καθώς και σε όλο τον εξοπλισμό. Η αύξηση της σκληρότητας του ασβεστίου επιτυγχάνεται με την προσθήκη χλωριούχου ασβεστίου (CaCl2) ή θειικού ασβεστίου (CaSO4). Σε περιπτώσεις όπου η σκληρότητα του ασβεστίου παραμένει χαμηλή καλό 26

27 είναι να χρησιμοποιούνται απολυμαντικά βασισμένα στο ασβέστιο. Η ελάττωση της σκληρότητας του ασβεστίου επιτυγχάνεται με αραίωση του νερού της δεξαμενής. Εάν η σκληρότητα της κολυμβητικής δεξαμενής παραμένει υψηλή καλό είναι να αποφεύγονται απολυμαντικά βασισμένα στο ασβέστιο και να προτιμώνται απολυμαντικά που βασίζονται στο νάτριο. Σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της σκληρότητας του ασβεστίου διαδραματίζει η θερμοκρασία, η οποία πρέπει να λαμβάνεται υπόψιν. Όσο αυξάνεται η θερμοκρασία τόσο μειώνεται η διαλυτότητα του ασβεστίου στο νερό (Κουρέα - Κρεμαστινού & Χατζηχριστοδούλου, 2004) Θερμοκρασία Η θερμοκρασία των κολυμβητικών δεξαμενών διαφέρει ανάλογα με το εάν είναι εσωτερική ή εξωτερική καθώς και για ποιους λόγους χρησιμοποιείται. Οι υψηλές θερμοκρασίες σε κολυμβητικές δεξαμενές ενδέχεται να δημιουργήσουν προβλήματα. Σε υψηλές θερμοκρασίες η ανάπτυξη των μικροοργανισμών είναι ταχύτερη με αποτέλεσμα να επιμολύνονται συνεχώς τα φίλτρα και άλλες υποδομές των δεξαμενών. Η επίδραση της θερμοκρασίας στο σώμα των κολυμβητών έχει ως αποτέλεσμα να αυξάνονται οι εκκρίσεις από τους σμηγματογόνους και ιδρωτοποιούς αδένες. Οι υψηλές θερμοκρασίες των κολυμβητικών δεξαμενών φαίνεται να είναι υπαίτιες για δερματικά προβλήματα σε συνδυασμό με άλλους παράγοντες όπως ακραίες τιμές ph. Επιπλέον παρουσιάζεται και ως αιτιολογικός παράγοντας για τους πνιγμούς καθώς οι υψηλές θερμοκρασίες ευνοούν τη δημιουργία αποπνικτικής ατμόσφαιρας και υπνηλίας. Συνήθως, κολυμβητικές δεξαμενές με υψηλές θερμοκρασίες χρησιμοποιούνται για άτομα που έχουν κινητικά προβλήματα και χρήζουν αποθεραπείας και αποκατάστασης. (WHO,2006, Κουρέα - Κρεμαστινού & Χατζηχριστοδούλου, 2004). Ολοκληρώνοντας, όπως αναφέρθηκε και πιο πάνω η θερμοκρασία είναι ο μεγαλύτερος κίνδυνος δημιουργίας ιζημάτων διότι μειώνεται η διαλυτότητα του ασβεστίου ενώ σε χαμηλότερες θερμοκρασίες αυξάνεται η διαλυτότητα με αποτέλεσμα να μειώνεται η ολική σκληρότητα Ολικά διαλυμένα στερεά. Σημαντικό ρόλο στην ισορροπία νερού διαδραματίζουν τα ολικά διαλυμένα στερεά, τα οποία είναι μέσο μέτρησης όλων των διαλυμένων στοιχείων στο νερό της δεξαμενής (άλατα, χημικές ουσίες απολύμανσης). Τα ολικά διαλυμένα στερεά αυξάνονται με την παρουσία χημικών και αλάτων που προέρχονται από τους κολυμβητές. Η σημασία των 27

28 ολικών διαλυμένων στερεών αναγνωρίστηκε τα τελευταία χρόνια, όταν διαπιστώθηκε ότι αποτελεί ένδειξη του εάν το νερό είναι κορεσμένο σε χημικές ουσίες και γενικά αποτελεί ένδειξη του χρόνου που δεν έχει γίνει ανανέωση του νερού δεξαμενής. Το νερό της δεξαμενής συνιστάται να αραιώνεται τακτικά με την προσθήκη νέου. Επιπλέον, τα φίλτρα της κολυμβητικής δεξαμενής πρέπει να πλένονται τακτικά ώστε να απομακρύνονται ιζήματα που προσκολούνται στην επιφάνεια τους με αποτέλεσμα να εμποδίζεται η σωστή φίλτρανση του νερού. Γενικά, η μείωση των ολικών διαλυμένων στερεών αποτελεί βασική προτεραιότητα όταν η τιμή πλησιάζει το μέγιστο 3000 mg/l, καθώς σε αυτή την περίπτωση το νερό είναι δυνατόν να αποκτήσει αλμυρή γεύση, θολή εμφάνιση και διαβρωτική ικανότητα (Binnie et al., 2002, NSW, 2013). 1.5 Απολύμανση του νερού Η απολύμανση του νερού είναι υψίστης σημασίας, τόσο του πόσιμου όσο και εκείνου των κολυμβητικών δεξαμενών για την εξασφάλιση της δημόσιας υγείας. Απολύμανση του νερού είναι η απομάκρυνση, απενεργοποίηση ή θανάτωση των παθογόνων μικροοργανισμών. Οι μικροοργανισμοί καταστρέφονται ή απενεργοποιούνται με αποτέλεσμα τον τερματισμό της ανάπτυξης και αναπαραγωγής τους. Στο δεύτερο μισό του 19 ου αιώνα έγινε αντιληπτή η αιτία ασθενειών από μολυσμένο νερό οπότε η ανάγκη για απολύμανση του νερού έγινε επιτακτική. Στην ουσία, η απολύμανση αποτελεί ένα από τα σημαντικότερα επιτεύγματα του 20 ου αιώνα. Μέσω αυτής οι ασθένειες που οφείλονταν σε υδατογενείς λοιμώξεις μειώθηκαν θεαματικά (Schoenen, 2002). Η απολύμανση του νερού μπορεί να πραγματοποιηθεί τόσο με φυσικά όσο και με χημικά απολυμαντικά. Τα απολυμαντικά δεν θα πρέπει μόνο να είναι ικανά να θανατώσουν τους παθογόνους μικροοργανισμούς αλλά να έχουν και υπολειμματική δράση, ούτως ώστε να προστατεύουν το νερό από μελλοντική μόλυνση. Μερικά από τα πιο διαδεδομένα χημικά απολυμαντικά του νερού είναι: Χλώριο (Cl) και παράγωγα αυτού. Όζον (O3). Βρώμιο (Br2) Ιώδιο (I) Αρκετά οξέα και βάσεις. 28

29 Για απολύμανση του νερού με φυσικό τρόπο μπορούν να χρησιμοποιηθούν τα ακόλουθα απολυμαντικά: Υπεριώδη ακτινοβολία (UV) Υπέρηχοι (US) Ακτίνες γάμα (AWWA, 1999) Ένα απολυμαντικό μέσο του νερού πρέπει να είναι ιδιαίτερα αποτελεσματικό έναντι των παθογόνων μικροοργανισμών αλλά ταυτόχρονα να εξασφαλίζεται και η ασφάλεια του χρήστη. Έτσι λοιπόν τα χαρακτηριστικά του ιδανικού απολυμαντικού είναι: Μη τοξικό για τον άνθρωπο και τα ζώα. Μη τοξικό για τα υδάτινα οικοσυστήματα. Αποτελεσματικό στη θανάτωση ή αδρανοποίηση των παθογόνων μικροοργανισμών. Εύκολη παρακολούθηση κατά τη διάρκεια της απολύμανσης. Χαμηλό κόστος. Αποτελεσματικό σε μεγάλο εύρος θερμοκρασίας και ph. Τα απολυμαντικά μέσα δε δρουν όλα με τους ίδιους μηχανισμούς. Ωστόσο, οι σημαντικότεροι μηχανισμοί δράσεις των απολυμαντικών ουσιών έναντι των παθογόνων μικροοργανισμών είναι: Καταστροφή του κυτταρικού τοιχώματος των μικροοργανισμών. Μεταβολή της διαπερατότητας του κυττάρου. Παρεμπόδιση της σύνθεσης των πρωτεϊνών. Παρεμπόδιση της σύνθεσης νουκλεϊκών οξέων. Παρεμπόδιση της δράσης των ενζύμων. (Cheremisinoff, 1995). Οι σημαντικότεροι παράγοντες που επηρεάζουν τη δράση μιας απολυμαντικής ουσίας είναι: Η συγκέντρωση του απολυμαντικού. Το είδος του απολυμαντικού. Ο χρόνος επαφής του. Η συγκέντρωση των διαλυμένων στερεών. Το είδος του μικροοργανισμού. 29

30 Η φάση που βρίσκεται ο μικροοργανισμός. Η θερμοκρασία. Το ph. Η θολερότητα (Cheremisinoff, 1995, AWWA, 1999). Ο χρόνος επαφής σε σχέση με τη δράση των απολυμαντικών ουσιών έχει εκφραστεί με το νόμο του Chick: Nt=Noe-kt Όπου Nt και N0 είναι, αντίστοιχα, οι συγκεντρώσεις βιώσιμων μικροοργανισμών στο χρόνο t και το χρόνο 0. t: είναι ο χρόνος επαφής. k: είναι η σταθερά δράσης. Οι πιο διαδεδομένες μέθοδοι απολύμανσης στηρίζονται σε χημικά απολυμαντικά μέσα όπως το χλώριο. Ωστόσο, οι μέθοδοι αυτοί έχουν σημαντικά μειονεκτήματα καθώς δημιουργούν παραπροϊόντα απολύμανσης στο νερό τα οποία είναι ιδιαιτέρως επικίνδυνα για την υγεία του ανθρώπου. Στη σύγχρονη εποχή η ανάγκη για απολύμανση του νερού χωρίς χημικά έχει οδηγήσει στην ανάπτυξη και τη χρήση νέων τεχνολογιών απολύμανσης όπως είναι η υπεριώδης ακτινοβολία (UV). (AWWA, 1999) Απολύμανση με χλώριο. Χλωρίωση είναι η διαδικασία κατά την οποία προστίθεται στο νερό το στοιχείο χλώριο έτσι ώστε να απαλλαχθεί από παθογόνους μικροοργανισμούς και να είναι κατάλληλο για ανθρώπινη χρήση. Η χλωρίωση είναι η πιο ευρέως Εικόνα 2. Πηγή: WHO, 2003 χρησιμοποιούμενη μέθοδος απολύμανσης του νερού, συνήθως μέσω αέριου χλωρίου, υποχλωριώδους νατρίου ή ασβεστίου αλλά και άλλων χλωριωμένων ισοκυανουρικών. Όλες αυτές οι κατηγορίες στον κόσμο των κολυμβητικών δεξαμενών ονομάζονται απολύμανση με χλώριο. Ελεύθερο ή υπολειμματικό χλώριο ορίζεται το χλώριο στην μοριακή του μορφή (Cl2) και τα παράγωγα του, δηλαδή το υποχλωριώδες οξύ (HOCl) 30

31 και τα υποχλωριώδη ιόντα (OCl). Το ελεύθερο χλώριο είναι οξειδωτικό και η απολυμαντική του δράση μειώνεται κατά σειρά Cl2 > HOCl > OCl -. Η περιεκτικότητα μιας ουσίας σε ελεύθερο χλώριο ονομάζεται δραστικό χλώριο. Όταν το Cl2 εισαχθεί στο νερό και το ph είναι όξινο το Cl2 παραμένει στη μοριακή του μορφή. Σε ουδέτερο pη το Cl2 αντιδρά με το νερό και δημιουργείται υποχλωριώδες οξύ: Cl2 + H2O = HCl + HOCl Σε αλκαλικό ph το HOCl διασπάται σε ιόντα: HOCl = H + + OCl - Σε περίπτωση που στο νερό υπάρχει αμμωνία τότε δημιουργούνται χλωραμίνες: HOCl + ΝΗ3 = H2O + NH2Cl (monochloramine) HOCl + NH2Cl = H2O + NHCl2 (dichloramine) HOCl + NHCl2 = H2O + NCl3 (trichloramine) Οι χλωραμίνες που δημιουργούνται αποτελούν το συνδεδεμένο χλώριο. Το σύνολο του ελεύθερου και του συνδεδεμένου χλωρίου στο νερό καλείται ολικό χλώριο. Οι χλωραμίνες οξειδώνονται και δίνουν άζωτο και ιόντα χλωρίου (Παπαπετροπούλου και Μαυρίδου, 1995, Black & Veatch, 2010, Okafor, 2011, Spellman, 2008). Οι πρακτικές χλωρίωσης διαφέρουν ανά τον κόσμο όπως και τα επίπεδα του ελεύθερου χλωρίου που είναι επαρκή για την απολύμανση του νερού μίας κολυμβητικής δεξαμενής. Για παράδειγμα, τα επίπεδα ελευθέρου χλωρίου κάτω από 1mg/l θεωρούνται αποδεκτά σε ορισμένες χώρες ενώ σε άλλες τα επιτρεπόμενα επίπεδα μπορεί να είναι σημαντικά υψηλότερα. Συνήθως, σε θερμά λουτρά (υδρομασάζ) τα επίπεδα του χλωρίου σε παγκόσμιο επίπεδο τείνουν να είναι υψηλότερα σε σχέση με τις κολυμβητικές δεξαμενές. Επίσης, τα επίπεδα του χλωρίου είναι δυνατόν να μειωθούν όταν συνδυάζονται και με άλλες μεθόδους απολύμανσης όπως UV ακτινοβολία (WHO, 2006) Απολύμανση με όζον (O3) Το όζον (Ο3) ανακαλύφθηκε το 1783 από τον Van Marum και ονομάστηκε από τον Christian Friedrich Schonbein το Το 1857 κατασκευάστηκε η πρώτη συσκευή παραγωγής όζοντος με ηλεκτρική εκφόρτιση ενώ το 1893 εφαρμόστηκε πρώτη φορά ως απολυμαντικό του ποσίμου νερού στο Qudshoom της Ολλανδίας. (AWWA, 1999). 31

32 Το όζον είναι ένα ισχυρό οξειδωτικό και έχει πολλές χρήσεις στην επεξεργασία του νερού συμπεριλαμβανομένης της οξείδωσης οργανικών χημικών ουσιών. Μπορεί να χρησιμοποιηθεί και ως πρωταρχικό απολυμαντικό αλλά και ως δευτερεύον. Το αέριο του όζοντος (Ο3) σχηματίζεται με τη διέλευση ξηρού αέρα ή οξυγόνου μέσω ενός ηλεκτρικού πεδίου υψηλής τάσης. Ο αέρας που προκύπτει είναι εμπλουτισμένος με όζον και δοσολογείται απευθείας μέσα στο νερό. Η διάλυση τουλάχιστον 80% του εφαρμοζόμενου όζοντος πρέπει να είναι δυνατή, με το υπόλοιπο να καταλήγει στα απορρίμματα αφού πρώτα διέλθει από τον καταστροφέα όζοντος. Η απόδοση της οζόνωσης βασίζεται στην επίτευξη της επιθυμητής συγκέντρωσης μετά από μια περίοδο επαφής. Για την οξείδωση των οργανικών χημικών όπως μερικά οξειδώσιμα παρασιτοκτόνα συνήθως χρησιμοποιείται ένα υπόλειμμα περίπου 0.5 mg/l μετά από ένα χρόνο επαφής περίπου 20 λεπτά. Οι δόσεις που απαιτούνται για να επιτευχθεί αυτό ποικίλλουν ανάλογα με τον τύπο του ύδατος. Συνήθως, όμως απαιτούνται δόσεις 2-5 mg/l. Το μεγαλύτερο μειονέκτημα του όζοντος είναι ότι δεν αφήνει απολυμαντικό υπόλοιπο όπως συμβαίνει με το χλώριο (WHO, 2008). Ο χρόνος ζωής του όζοντος εξαρτάται από πολλές μεταβλητές συμπεριλαμβανομένου του ph, της θερμοκρασίας, της συνολικής συγκέντρωσης του οργανικού άνθρακα και των συγκεντρώσεων διττανθρακικού και ανθρακικού άλατος. Το ανθρακικό άλας αυξάνει την διάρκεια ζωής του όζοντος (AWWA, 1999). Η απολύμανση μέσω του όζοντος αποτελεί μία χρήσιμη εναλλακτική μορφή απολύμανσης κολυμβητικών δεξαμενών. Πέραν του ότι είναι ιδιαίτερα αποτελεσματικό έναντι βακτηρίων και ιών δεν παράγει παραπροϊόντα απολύμανσης που σχετίζονται με το χλώριο (Rossi et al., 2010). Το απολυμαντικό παραπροϊόν που συνδέεται με την απολύμανση μέσω όζοντος είναι το βρωμοφόρμιο το οποίο μπορεί να σχηματιστεί όταν στο νερό περιέχονται ιόντα βρώμιου. (WHO, 2000). Επιπλέον μέσω της απολύμανσης με όζον είναι δυνατόν να προκύψουν και υποπροϊόντα μερικής οξείδωσης. Ωστόσο, δεν υπάρχουν μελέτες που να τα ενοχοποιούν για πρόκληση ασθενειών στον άνθρωπο (Rossi et al., 2010). Τέλος, οι τοξικές επιδράσεις του όζοντος μπορούν να επηρεάσουν το δέρμα των κολυμβητών. Ορισμένες μελέτες δείχνουν ότι δόσεις 0,8 mg/l όζοντος είναι ικανές να προκαλέσουν κυτταρικό στρες στις ανώτερες και κατώτερες κεράτινες στοιβάδες του δέρματος. (Cotovio et al., 2001, Al-Haddad et al., 2005, Valacchi et al., 2003). Η εισπνοή 32

33 με υψηλή συγκέντρωση όζοντος φαίνεται να έχει νευρολογικές επιδράσεις όπως γενική κόπωση, λήθαργο, κεφαλαλγία και διαταραχή του ύπνου. (Lagerkvist et al., 2004) Απολύμανση με ιώδιο (Ι). Το ιώδιο ανακαλύφθηκε το 1811 από τον Bernard Courtois και κατατάσσεται στα πιο σπάνια στοιχεία. Χρησιμοποιείται ως τοπικό αντιμολυσματικό και έχει απολυμαντικές ιδιότητες. Είναι ένας ισχυρός οξειδωτικός παράγοντας και έχει άμεση δράση στα κύτταρα με την κατακρήμνιση των πρωτεϊνών. Η έκθεση του ανθρώπου σε αυτό μπορεί να συμβεί με την εισπνοή, την κατάποση ή τη δερματική ή οφθαλμική επαφή. Η κατάποση μεγάλων ποσοτήτων ιωδίου μπορεί να προκαλέσει καύση στομάχου, στόματος, λαιμού καθώς και κοιλιακό άλγος, ναυτία, διάρροια και εμετό. (Zimmermann, 2014). Το ιώδιο ανήκει στην οικογένεια των αλογόνων και είναι στερεό σε κανονική θερμοκρασία ενώ η διαλυτότητα του στο νερό είναι χαμηλή σε σχέση με το χλώριο και το βρώμιο. Το ιώδιο είναι καλό απολυμαντικό του νερού με υψηλά μικροβιοκτόνα χαρακτηριστικά καθώς πέραν των βακτηρίων, καταστρέφει σπόρια, κύστεις και ιούς. Η ανησυχία για το ιώδιο δεν έχει να κάνει τόσο με τα παραπροϊόντα απολύμανσης όσο με την ίδια τη δράση του χημικού προϊόντος. Παρόλο που το ιώδιο είναι απαραίτητο για τη σύνθεση των ορμονών του θυρεοειδούς αδένα, μεγάλα ποσά ιωδίου μπορεί να οδηγήσουν σε ιωδισμό ή αλλεργική κατάσταση. Δημιουργεί παραπροϊόντα απολύμανσης στο νερό, ωστόσο λόγω του χαμηλότερου δυναμικού οξείδωσης και της χαμηλότερης αντιδραστικότητας του, παράγει λιγότερα σε σχέση με τα υπόλοιπα αλογόνα απολυμαντικά. Οι μέθοδοι για τον προσδιορισμό της περιεκτικότητας του νερού σε ιώδιο είναι η αμπερομετρική τιτλοδότηση και η φασματοφωτομετρία (WHO, 2003,2016). Το ιώδιο ως απολυμαντικό κολυμβητικών δεξαμενών χρησιμοποιείται ελάχιστα σε σχέση με το χλώριο μιας και είναι φορές πιο ακριβό (WHO, 2000). Για να επιτευχθεί ικανοποιητική απολύμανση μιας κολυμβητικής δεξαμενής μέσω ιωδίου απαιτούνται δόσεις περίπου 1,0-2,0 mg/l. Τέτοιου είδους συγκεντρώσεις μεταφράζονται σε υπολειμματική συγκέντρωση περίπου 0,2 ppm (AWWA,1999, WHO,2016). Σύμφωνα με έρευνες που έχουν πραγματοποιηθεί το ιώδιο ως απολυμαντικό μέσω κολυμβητικών δεξαμενών προκαλεί λιγότερους ερεθισμούς των οφθαλμών. Έρευνα που πραγματοποιήθηκε στο πανεπιστήμιο του Stanford σε κολυμβητικές δεξαμενές που χρησιμοποιούν ως απολυμαντικό το ιώδιο κατέληξε στο συμπέρασμα ότι το 33

34 συγκεκριμένο απολυμαντικό είναι ασφαλές, αποτελεσματικό και ανώτερο από το χλώριο μιας και παράγει λιγότερα παραπροϊόντα απολύμανσης και προκαλεί λιγότερους ερεθισμούς (Byrd et al., 1963). Τέλος τα πλεονεκτήματα του έναντι του χλωρίου είναι ότι παρέχει προστασία σε ένα ευρύτερο φάσμα ph και φαίνεται να αντιδρά λιγότερo με αζωτούχες ενώσεις (WHO, 2016) Απολύμανση με βρώμιο (Br). Το βρώμιο (Br) είναι ένα από τα αλογόνα στοιχεία. Στη στοιχειακή του κατάσταση το βρώμιο βρίσκεται ως το διατονικό μόριο Br2. Είναι ένα τοξικό διαβρωτικό κόκκινο -καφέ υγρό. Το βρώμιο μαζί τον υδράργυρο είναι τα μονά στοιχεία που είναι σε υγρή μορφή υπό κανονικές συνθήκες. Η εξαιρετική τοξική φύση του Br2 οφείλεται στην παραγωγή υδροβρωμικών οξέων κατά την επαφή του με το νερό (Brown, 2014). Ως μέλος της οικογένειας των αλογόνων το βρώμιο έχει μεγάλες ομοιότητες με το χλώριο και λειτουργεί σχεδόν παρόμοια. Σε επαφή με το νερό διαλύεται και παράγει υποβρωμικό οξύ (HOBr) όπως το χλώριο υποχλωριώδες οξύ (HOCl). Η απολυμαντική ισχύς του βρώμιου θεωρείται αρκετά ισχυρή. Το σημαντικότερο μειονέκτημα του είναι το ίδιο με εκείνο του χλωρίου, η παραγωγή παραπροϊόντων απολύμανσης (WHO, 2003). Το βρώμιο χρησιμοποιείται για την απολύμανση των κολυμβητικών δεξαμενών ενώ παλαιότερα είχε χρησιμοποιηθεί σε κάποιες περιοχές και για την απολύμανση του πόσιμου νερού. Στις μέρες μας δε συνίσταται η απολύμανση του πόσιμου νερού με βρώμιο (AWWA, 1999). Μελέτες έχουν δείξει ότι κολυμβητικές δεξαμενές που χρησιμοποιούν το βρώμιο ως απολυμαντικό μέσο, έχουν λιγότερη οσμή του νερού και λιγότερους ερεθισμούς των οφθαλμών των κολυμβητών σε σχέση με τις χλωριωμένες (WHO, 2000). To 1935 ο Henderson βραβεύτηκε με δίπλωμα ευρεσιτεχνίας για την απολύμανση του νερού με βρώμιο. Οι έρευνες του Henderson έδειξαν ότι μια δόση βρώμιου 0,25-0,5 ppm σε επιμολυσμένο νερό με Bacillus coli ήταν ισοδύναμη με 1,5-2,0 ppm χλωρίου (Nalepa, 2004). 34

35 1.5.5 Παραπροϊόντα απολύμανσης (DBP) Τα παραπροϊόντα απολύμανσης (DBP) αποτελούν κυρίαρχο στοιχείο στο νερό. Tα DBP σχηματίζονται με την αντίδραση των απολυμαντικών με τη φυσική οργανική ύλη και αποτελούν ακούσια συνέπεια της προσπάθειας θανατωθούν παθογόνοι να οι μικροοργανισμοί του νερού. Πάνω από 600 DBP έχουν εντοπιστεί σε πόσιμο νερό και νερό κολυμβητικών δεξαμενών και πολλά από αυτά είναι μεταλλαξιογόνα ή καρκινογόνα. Τα παραπροϊόντα απολύμανσης εμφανίζονται σε υψηλότερες συγκεντρώσεις στις κολυμβητικές δεξαμενές σε σχέση με το πόσιμο νερό. Τα κυριότερα DBP που ανευρίσκονται σε κολυμβητικά περιβάλλοντα είναι τα τριαλογομεθάνια (THMs) και τα αλογόνο - οξικά οξέα (HAAs) (Richardson, 1998, Richardson. et., al 2007). Ένα από τα πιο διαδεδομένα DBP σε κολυμβητικές δεξαμενές που χρησιμοποιούν ως απολυμαντικό μέσο το χλώριο είναι τα TMHs. Είναι χημικές ενώσεις στις οποίες τα τρία από τα τέσσερα άτομα υδρογόνου, το μεθάνιο (CH4) αντικαθίσταται από ένα άτομο αλογόνου. Tα TMHs σχηματίζονται ως παραπροϊόν του νερού όταν το χλώριο ή βρώμιο χρησιμοποιούνται ως απολυμαντικά μέσα. Το βρώμιο αντιδρά με την οργανική ύλη που περιέχεται στο νερό και σχηματίζει βρωμιωμένα τριαλογομεθάνια ενώ το χλώριο αντιδρώντας με την οργανική ύλη σχηματίζει χλωροφόρμιο. Η συνολική ποσότητα τέτοιου είδους οργανικών ενώσεων που περιέχεται σε ένα δείγμα νερού αποτελεί τα ολικά Εικόνα 3. Παραπροϊόντα απολύμανσης που απαντώνται τακτικά σε δείγματα από κολυμβητικές δεξαμενές. Πηγή: C&EN Chemical and engineering news. THMs (TTMHs). Μερικές από τις πιο συχνές μορφές των THMs είναι το 35

36 χλωροφόρμιο CHCl3, το διχλωροβρωμομεθάνιο CHBrCl2, το διβρωμοχλωρομεθάνιο CHBr2CL και το βρωμοφόρμιο CHBr3. (Judd & Jeffrey, 1995). Τα αλογόνο - οξικά οξέα (HAAs) είναι ένα ακόμη σημαντικό είδος παραπροϊόντων απολύμανσης. Αποτελούνται από τρία άτομα υδρογόνου τα οποία είναι σταθερά σε μία ομάδα -COOH. Είναι μη πτητικές ενώσεις οι οποίες ανευρίσκονται συχνά σε δείγματα νερού, τόσο πόσιμου όσο και κολυμβητικών δεξαμενών. Τυπικά αποτελεί την μεγαλύτερη ομάδα παραπροϊόντων απολύμανσης. Τα HAAs διακρίνονται σε χλωριούχα, βρωμιούχα και φθοριούχα (Roberts et al. 2002, Nikolaou et al. 2004). Τα αλογόνο-οξικά οξέα είναι δυνατόν να ανευρίσκονται και εκτός νερού. Σε έρευνες που έχουν πραγματοποιηθεί σε κλειστά κολυμβητήρια έχουν βρεθεί HAAs και στον αέρα τους (Christopher et al. 2012). Η παρουσία οργανικών ουσιών που περιέχουν άζωτο οδηγεί στο σχηματισμό αζωτούχων παραπροϊόντων απολύμανσης όπως είναι οι χλωραμίνες (Μονοχλωραμίνη, διχλωραμίνη, τριχλωραμίνη), αλογονοακετονιτριλία και νιτροζαμίνες. (Weaver et al. 2009, Walse & Mitch, 2008, Jurado-Sanchez et al., 2010) Παραπροϊόντα απολύμανσης (DBP) - Επιπτώσεις στην υγεία. Οι κολυμβητικές δεξαμενές αποτελούν περιβάλλον με υψηλό επίπεδο DBP, καθώς στο νερό τους ανευρίσκονται συνήθως μεγάλα ποσά οργανικής ύλης (ούρα, ιδρώτας, τρίχες, καλλυντικά, κύτταρα του δέρματος κ.α.) που αφήνουν με την παραμονή τους σε αυτές οι κολυμβητές. Η ποσότητα τους στο νερό είναι ανάλογη με τον αριθμό των κολυμβητών (Santa Marina et al., 2009). Η εισπνοή και η δερματική απορρόφηση αποτελούν τις πρωταρχικές οδούς έκθεσης των κολυμβητών σε DBP κατά τη διάρκεια της κολύμβησης. Οι μηχανισμοί για τη δράση όλων των παραπροϊόντων απολύμανσης δεν είναι γνωστοί και σχετικά λίγες έρευνες έχουν πραγματοποιηθεί παρά τις ανησυχίες για τη δημόσια υγεία (Kim et al. 2002, La Kind et al., 2010). Η τριχλωραμίνη και άλλες πτητικές χημικές ουσίες που ανευρίσκονται σε κολυμβητικές δεξαμενές είναι ιδιαίτερα ερεθιστικές για την αναπνοή. Έχει συσχετιστεί με το άσθμα και άλλες αναπνευστικές παθήσεις ιδίως σε αθλητές κολυμβητές και εργαζόμενους σε κολυμβητήρια (Goodman & Hay, 2008, Jacobs et al., 2007, Stav & Stav, 2005). Οι επιδημιολογικές μελέτες έχουν επικεντρωθεί κυρίως, σε τρείς συγκεκριμένους πληθυσμούς: α) σε εργαζόμενους σε κολυμβητήρια, β) σε επαγγελματίες κολυμβητές και 36

37 γ) σε παιδιά. Οι εργαζόμενοι και οι επαγγελματίες κολυμβητές είναι δύο κατηγορίες που είναι ιδιαίτερα εκτεθειμένες ενώ τα παιδιά είναι πιο ευάλωτα. Ναυαγοσώστες, εκπαιδευτές κολύμβησης και επαγγελματίες κολυμβητές είναι αυτοί που σύμφωνα με τις έρευνες έχουν συχνά αναπνευστικά προβλήματα που οφείλονται σε DBP. (Massin et al., 1998). Άλλες έρευνες υποστηρίζουν ότι οι ναυαγοσώστες εμφανίζουν συχνότερα άσθμα και βήχα και ως αιτιολογικός παράγοντας ενοχοποιούνται τα DBP. Η έκθεση παιδιών σε τέτοια περιβάλλοντα προκαλεί ιδιαίτερη ανησυχία τα τελευταία χρόνια. Οι μελέτες για τα παιδιά είναι αντικρουόμενες. Αναπνευστικές παθήσεις παιδιών και ιδίως άσθμα φαίνεται να επιδεινώνονται από έκθεση σε DBP. Παιδιά που ασχολούνται με την κολύμβηση είτε σε εξωτερική κολυμβητική δεξαμενή είτε σε εσωτερική έχουν μεγάλες πιθανότητες να αποκτήσουν αναπνευστικά προβλήματα ιδίως άσθμα (Uyan et al. 2009,Weisel et al 2009). Παρόμοια μελέτη στο Βέλγιο έδειξε ότι δεν αυξήθηκαν τα ποσοστά άσθματος σε παιδιά που χρησιμοποιούν κολυμβητικές δεξαμενές. Από την άλλη πλευρά τα οφέλη της κολύμβησης είναι ιδιαίτερα σημαντικά για τα παιδιά. Μάλιστα σε μελέτες, η κολύμβηση φαίνεται να επιδρά θετικά σε παιδιά με άσθμα, βελτιώνοντας τα συμπτώματα τους (Goodman & Hay, 2008). Η χρόνια έκθεση σε παραπροϊόντα απολύμανσης μέσω διάφορων οδών έχει συσχετιστεί με αυξημένο κίνδυνο για καρκίνο. (Villanueva et al., 2007). Τα επιδημιολογικά στοιχεία δείχνουν ότι η έκθεση σε THM έχει αυξημένο κίνδυνο για καρκίνο της ουροδόχου κύστης (Costet et al., 2010, Villanueva, 2004). Σημαντικό κίνδυνο για την υγεία σε σχέση με DBP διατρέχουν και οι έγκυες γυναίκες καθώς μικρά μόρια παραπροϊόντων απολύμανσης είναι δυνατόν να εισέλθουν από την μητέρα στο έμβρυο μεσώ του πλακούντα. (Villanueva et al., 2012). Τέλος, στοιχεία από έρευνες σε πειραματόζωα δείχνουν μια σειρά από ανεπιθύμητες αναπαραγωγικές επιδράσεις, όπως α) τοξικότητα σπέρματος β) τερατογενέσεις γ) μειωμένης ανάπτυξης έμβρυο (Tardiff RG. et al., 2006). 37

38 1.5.6 Απολύμανση με υπεριώδη ακτινοβολία (UV). Η υπεριώδη ακτινοβολία είναι μέρος του ηλεκτρομαγνητικού φάσματος που εκπέμπεται από τον ήλιο και υποδιαιρείται σε τρείς τύπους : UV A: ( nm) UV Β: ( nm) UV C: ( nm) (Timmermann et al., 2015). Η χρήση της υπεριώδους ακτινοβολίας Εικόνα 4. Ηλεκτρομαγνητικό φάσμα.(timmermann L.F. et al., 2015). ως απολυμαντικό δεν είναι καινούργια, είναι γνωστή εδώ και πολλά χρόνια και έχει χρησιμοποιηθεί για την απολύμανση νερού και λυμάτων (Darby. et al., 1995). Η πρώτη απολύμανση του νερού με υπεριώδη ακτινοβολία εφαρμόστηκε το 1910 στη Marseille της Γαλλίας (Cotton et al., 2005). Ωστόσο, η γενική εφαρμογή της παρεμποδίστηκε λόγω του υψηλού κόστους, της κακής αξιοπιστίας, του εξοπλισμού και των προβλημάτων συντήρησης (Hoyer, 2004). Τα επόμενα χρόνια λόγω των αυξανόμενων πληροφοριών Εικόνα 5. DNA/διμερή πυριμιδίνης. (Timmermann L.F et al., 2015). σχετικά με την παραγωγή επικίνδυνων παραπροϊόντων απολύμανσης κατά τη διάρκεια της χλωρίωσης του νερού, η υπεριώδης ακτινοβολία άρχισε να γίνεται μια ενδιαφέρουσα εναλλακτική μέθοδος απολύμανσης. Το μεγαλύτερο πλεονέκτημα είναι ότι δεν παράγει καθόλου παραπροϊόντα ενώ εξασφαλίζει υψηλού επιπέδου απολύμανση του νερού (Hijnen et al, 2006). 38

39 Το μήκος κύματος με την μεγαλύτερη απολυμαντική (μικροβιοκτόνο) δράση είναι στα 254 nm. (Bolton & Linden, 2003, Cassan et al., 2006). Η απενεργοποίηση των μικροοργανισμών με UV ακτινοβολία βασίζεται στη βλάβη που προκαλείται στα νουκλεϊκά οξέα (DNA/RNA) του κυττάρου ή του ιού. Όταν το γενετικό υλικό των κυττάρων απορροφά Εικόνα 6. Επιπτώσεις υπεριώδους ακτινοβολίας στο γενετικό υλικό του μικροοργανισμού. (Trojan UV). ενέργεια από την υπεριώδη ακτινοβολία σχηματίζονται διμερή πυριμιδίνης μεταξύ των βάσεων πυριμιδίνης στην ίδια αλυσίδα DNA. Ο σχηματισμός διμερών πυριμιδίνης αναστέλλουν την αντιγραφή και μεταγραφή του μικροοργανισμού με αποτέλεσμα να παρεμποδίζεται ο πολλαπλασιασμός τους. Έτσι ο μικροοργανισμός γίνεται αβλαβής και θανατώνεται. (Guerrero & Bardosa., 2004, Von Sonntag et al., 2004, Velez-Colmenares et al., 2011). Η ένταση της υπεριώδους ακτινοβολίας συνήθως εκφράζεται σε W/cm 2 και η δόση της ακτινοβολίας εκφράζεται σε J/m 2. H UV - C δόση ορίζεται ως: D=I254 nm *t Όπου D είναι η δόση J/m 2. I254 nm είναι η ένταση W/cm 2 t είναι ο χρόνος επαφής σε δευτερόλεπτα (Bintsis et al., 2000). Η τεχνολογία απολύμανσης με υπεριώδη ακτινοβολία παρουσιάζει αυξανόμενο ενδιαφέρον τόσο για τη βιομηχανία ύδατος όσο και για τα νερά αναψυχής, δεδομένου ότι έχει αποδειχθεί ότι είναι ιδιαίτερα αποτελεσματική έναντι των κύστεων Cryptosporidium και Giardia δύο παθογόνων μικροοργανισμών μείζονος σημασίας για την ασφάλεια του νερού. Τα παθογόνα αυτά παρουσιάζουν ανθεκτικότητα στη χλωρίωση και γενικότερα στα αλογόνα απολυμαντικά. Η απολύμανση του νερού μίας κολυμβητικής δεξαμενής με υπεριώδη ακτινοβολία εξασφαλίζει ασφαλές περιβάλλον καθώς το νερό περνά μέσα από θάλαμο επεξεργασίας. Η απολύμανση αυτή ενδείκνυται για ανθρώπους με ευαισθησία - αλλεργίες στα χημικά απολυμαντικά. (π.χ. χλώριο). (Hijnen et al., 2006). 39

40 1.5.7 Απολύμανση με υπέρηχους (US). Οι υπέρηχοι είναι κύματα ήχου που δημιουργούνται από ενέργεια σε συχνότητες πάνω από 20 khz. Συγκεκριμένα πρόκειται για μηχανικά κύματα με συχνότητα μεγαλύτερη από αυτή που δύναται να αντιληφθεί η ανθρώπινη ακοή. Το εύρος των υπέρηχων που μπορεί να αντιληφθεί το ανθρώπινο αυτί είναι από 20 Hz έως 20 khz. Ο όρος infrasound αναφέρεται σε ηχητικά κύματα με συχνότητα κάτω από αυτή που αντιλαμβάνεται ο άνθρωπος, ενώ ο όρος ultrasound αναφέρεται σε ηχητικά κύματα από 20 khz έως 1 MHz. Ο τύπος του ηχητικού κύματος καθορίζεται από τη συχνότητα (Hao et al., 2011). Εικόνα 7. Το φάσμα του ήχου.(hao Feng et al.,2011). Η τεχνολογία των υπέρηχων έχει αναγνωριστεί ως μια μη χημική μέθοδος για την απενεργοποίηση των παθογόνων μικροοργανισμών και τη μείωση του σχηματισμού βιολογικών μεμβρανών. Μελέτες με υπέρηχους στον τομέα της απολύμανσης του νερού και των τροφίμων έδειξαν ότι οι μικροοργανισμοί καθίστανται αδρανείς και διαταράσσονται τα κυτταρικά τους τοιχώματα. Η απενεργοποίηση των μικροοργανισμών φαίνεται να εξαρτάται από τη διάρκεια / χρόνο της υπερήχησης, από τη συχνότητα, από το επίπεδο της έντασης και από τον ίδιο τον μικροοργανισμό (Azuonwu et al., 2015). Η βακτηριοκτόνος δράση των υπερήχων φαίνεται να αποδίδεται στο φαινόμενο της σπηλαίωσης. Η σπηλαίωση διακρίνεται σε δυο κατηγορίες: τη σταθερή (stable) και την παροδική (transient). Στη σταθερή σπηλαίωση παράγονται φυσαλίδες αέρα οι οποίες κατά τη φάση συμπιέσεως και αραίωσης του ήχου ταλαντώνονται. Στο υδάτινο περιβάλλον δημιουργούνται μικρορεύματα τα οποία αποδομούν την κυτταρική μεμβράνη των μικροοργανισμών προκαλώντας τους ανεπανόρθωτη βλάβη. Στην παροδική σπηλαίωση το μέγεθος των φυσαλίδων αυξάνει ταχέως εντός ολίγον κύκλων ταλαντώσεων και στη συνέχεια καταρρέουν με ένα εύρος εντάσεων (Bilek & Turantas, 2013). 40

41 Για την απολύμανση του νερού, στις περισσότερες μελέτες οι υπέρηχοι χρησιμοποιούνται σε συνεργασία με άλλο απολυμαντικό μέσο, συνήθως χημικό. Μέσω της συνέργειας των υπερήχων και των άλλων απολυμαντικών ενισχύεται η απολυμαντική δράση (Dong et al., 2012, Phull et al., 1997). Ωστόσο έρευνες όπου οι υπέρηχοι χρησιμοποιήθηκαν μόνοι τους έδειξαν ότι είναι ικανοί να θανατώσουν μικροοργανισμούς σε σημαντικό ποσοστό (Broekman S., 2010). 41

42 1.6 Βακτήρια - Ταξινόμηση και μορφολογία. Με τον όρο "μικροοργανισμό" νοείται ένα σύνολο έμβιων όντων από διάφορες ταξινομικές ομάδες με ορισμένα κοινά χαρακτηριστικά. Οι μικροοργανισμοί δεν είναι ορατοί με γυμνό οφθαλμό. Πρόκειται για μονοκύτταρους οργανισμούς ή πολυκύτταρους. Οι μικροοργανισμοί κατατάσσονται στα πρώτιστα, τα οποία διακρίνονται σε δύο μεγάλες κατηγορίες στα ευκαρυωτικά (φύκη, πρωτόζωα, μύκητες) και στα προκαρυωτικά (βακτήρια, κυανοπράσινα φύκη, μυκοπλάσματα) (Μαργαρίτης και συν., 2008). Η μορφολογία των βακτηρίων έχει διάφορα σχήματα, όπως σφαιρικό (κοκκώδες), ραβδόμορφο ή σπειροειδές. (Alberts, 2006). Η ονοματολογία των βακτηρίων, στηρίζεται στο διωνυμικό σύστημα του Λινναίου. Στο όνομα του μικροβίου αναφέρεται πρώτα το γένος και στη συνέχεια το είδος. Οι ταξινομικές βαθμίδες, είναι: Στέλεχος (strain): αναφέρεται σε καθαρή καλλιέργεια, προέρχεται από μία μόνο αποικία του μικροβίου. Ποικιλία: όταν παρουσιάζονται σε ορισμένο είδος μεταβολές που αφορούν αρκετά στελέχη. Είδος (species): αναφέρεται σε σύνολο στελεχών με μεγάλο βαθμό ομοιότητας φαινοτυπικών χαρακτήρων. Γένος (genus): περιλαμβάνει συγγενή, από απόψεως χαρακτήρα είδη. Οικογένεια (family): αποτελείται από ένα ή περισσότερα γένη. Τάξη (order): αποτελείται από μια ή περισσότερες οικογένειες. Ομάδα (group): Αναφέρονται σε βακτήρια που δεν έχουν οριστικά ταξινομηθεί (Αντωνιάδης, 2000, Αγγελής, 2007) Κύκλος ζωής και ανάπτυξης των βακτηρίων. Υπό ευνοϊκές συνθήκες ένας αναπτυσσόμενος βακτηριακός πληθυσμός διπλασιάζεται ανά τακτά χρονικά διαστήματα. Η ανάπτυξη πραγματοποιείται με γεωμετρική πρόοδο. Το ένα βακτηριακό κύτταρο δίνει δυο, τα δυο δίνουν τέσσερα κτλ. Αυτό ονομάζεται εκθετική ανάπτυξη. Στην πραγματικότητα η εκθετική ανάπτυξη είναι μόνο ένα μέρος του 42

43 βακτηριακού κύκλου ζωής και δεν αντιπροσωπεύει το φυσιολογικό πρότυπο ανάπτυξης των βακτηριών στη φύση. Για να κατανοηθεί η ανάπτυξη ενός συγκεκριμένου βακτηρίου τα κύτταρα τοποθετούνται σε ένα υγρό μέσο, στο οποίο τα θρεπτικά συστατικά και οι περιβαλλοντικές συνθήκες ελέγχονται. Εάν το μέσο παρέχει όλα τα απαραίτητα θρεπτικά συστατικά και οι περιβαλλοντικοί παράμετροι είναι οι βέλτιστοι, η βακτηριακή μάζα μπορεί να μετρηθεί ως μια συνάρτηση του χρόνου για την επίτευξη μιας καμπύλης ανάπτυξης. Σε μία μικροβιακή καλλιέργεια ο πολλαπλασιασμός των βακτηρίων δεν είναι συνεχώς εκθετικός και ακολουθεί διάφορα στάδια. Στην παρακάτω εικόνα παρουσιάζεται μια τυπική καμπύλη βακτηριακής ανάπτυξης (Παπαπετροπούλου και συν Maier,2004). Εικόνα 8. Καμπύλη βακτηριακής ανάπτυξης.(raina M. Maier, 2004) Αναγνωρίζονται τέσσερις χαρακτηριστικές φάσεις του κύκλου ανάπτυξης, οι οποίες είναι: Φάση αδράνειας (Lag phase). Αμέσως μετά τον εμβολιασμό των κυττάρων σε καλλιεργητικό μέσο ο πληθυσμός παραμένει προσωρινά αμετάβλητος. Η διάρκεια αυτής της φάσης εξαρτάται από διαφόρους παράγοντες όπως π.χ την προέλευση του δείγματος που εμβολιάζεται. Τα στελέχη που μετακομίζουν από ένα περιβάλλον σε ένα άλλο χρειάζονται ένα χρόνο προσαρμογής έτσι ώστε να παραχθούν από το κύτταρο ένζυμα ικανά να μεταβολίσουν τις οργανικές ουσίες του νέου υποστρώματος. 43

44 Εκθετική φάση (Exponential phase). Η εκθετική φάση ανάπτυξης είναι ένα μοτίβο ισορροπημένης ανάπτυξης όπου όλα τα κύτταρα διαιρούνται τακτικά με σχάση και αυξάνονται γεωμετρική πρόοδο. με Στατική φάση Εικόνα 9. Εκθετική κυτταρική διαίρεση. Κάθε διαίρεση έχει ως αποτέλεσμα τον διπλασιασμό του αριθμού του κύτταρου. (Raina M. Maier,2004) (Stationary phase). Η εκθετική ανάπτυξη δεν μπορεί να συνεχιστεί για πάντα. Κατά τη διάρκεια αυτής της φάσης ο αριθμός των βακτηρίων με την πάροδο του χρόνου παραμένει σταθερός και τα κύτταρα διατηρούν τη ζωτικότητα τους. Φάση θανάτου (Death phase). Μετά την στατική φάση ακολουθεί η φάση θανάτου, στην οποία ο πληθυσμός των βιώσιμων κυττάρων μειώνεται. Τα βακτήρια εξαντλούν τις διαθέσιμες θρεπτικές ουσίες και εν ελλείψει βιολογικού χώρου επέρχεται ο κυτταρικός θάνατος. Κατά τη διάρκεια της φάσης θανάτου ο αριθμός των βιώσιμων κυττάρων μειώνεται εκθετικά. Ουσιαστικά συμβαίνει το αντίστροφο της φάσης ανάπτυξης κατά τη διάρκεια της λογαριθμικής φάσης (Παπαπετροπούλου και συν., 1995, Maier, 2004, Willey et al., 2013) Ολική μεσόφιλη χλωρίδα (ΟΜΧ). Μέσω της καταμέτρησης της ΟΜΧ ανιχνεύεται ένα ευρύ φάσμα ετερότροφων μικροοργανισμών όπως βακτήρια και μύκητες. Αναπτύσσεται σε πλούσια θρεπτικά υλικά στα οποία δεν υπάρχουν ανασταλτικοί ή εκλεκτικοί παράγοντες. Ο μόνος ανασταλτικός παράγοντας είναι η επίδραση της θερμοκρασίας. Ένα ευρύ φάσμα μη εκλεκτικών υλικών χρησιμοποιείται και οι θερμοκρασίες επώασης ποικίλλουν από 20 0 C έως και 37 0 C για λίγες ώρες έως και μία εβδομάδα. Η ΟΜΧ έχει μικρή αξία ως δείκτης παθογόνων μικροοργανισμών, όμως είναι ιδιαίτερα χρήσιμος για την παρακολούθηση της επεξεργασίας και απολύμανσης του νερού. 44

45 Εικόνα 10. (ΟΜΧ) plate count agar Η καταμέτρηση της ολικής μικροβιολογικής χλωρίδας είναι μια από τις βασικότερες αναλύσεις που γίνονται σε νερό, τρόφιμα, κ.α. για να υπάρχει μια γενική εικόνα της μικροβιακής τάσης του δείγματος και εκφράζεται συνήθως σε cfu/ml όπου cfu είναι ο αριθμός σχηματιζόμενων αποικιών (cfu) Colony Forming Units) (Μαυρίδου και συν., 2014) Εντεροβακτηριοειδή Escherichia coli. Η οικογένεια των εντεροβακτηριοειδών περιλαμβάνει μια μεγάλη ομάδα μικροοργανισμών, οι οποίοι συχνά απομονώνονται από ανθρώπινες λοιμώξεις. Παρά την ονομασία τους δεν είναι όλα παράσιτα του εντέρου. Δύναται να ζουν και σε άλλες περιοχές του ανθρώπινου σώματος, στα φυτά και στο έδαφος. Η οικογένεια αυτή έχει gram αρνητικά βακτηρίδια, τα οποία αναπτύσσονται αεροβίως και προαιρετικά αναεροβίως. Είναι κινητά ή ακίνητα, άσπορα και ζυμώνουν τη γλυκόζη. Παράγουν καταλάση και δεν παράγουν οξειδάση ενώ ανάγουν τα νιτρικά άλατα σε νιτρώδη. Τα εντεροβακτηριακά με βάση τη διάσπαση της λακτόζης χωρίζονται σε δυο μεγάλες ομάδες. Στην πρώτη ομάδα ανήκουν εκείνα που είναι λακτόζη θετικά (τη διασπούν) και στη δεύτερη ομάδα τα λακτόζη αρνητικά (δεν τη διασπούν) (Δημητρακόπουλος 1993). Εικόνα 11. Ε. coli σε εκλεκτικό θρεπτικό υλικό. (chromocult) Το πρώτο βακτήριο E. coli απομονώθηκε το 1885 από το Γερμανό μικροβιολόγο Theodor escherich από περιττώματα παιδιού (Πόγγας & Χάρβαλου, 2012). Τα στελέχη του E.coli και των σχετικών gram αρνητικών κολοβακτηριδίων κυριαρχούν στην εντερική χλωρίδα ανθρώπων και ζώων. Αυτά τα βακτήρια είναι ευρέως διαδεδομένα και είναι παρόντα όπου υπάρχει περιττωματική μόλυνση. Αυτό είναι ένα φαινόμενο το οποίο 45

46 μπορεί να αξιοποιηθεί από τους μικροβιολόγους δημόσιας υγείας ως δείκτης μόλυνσης των πηγών νερού, του πόσιμου νερού και των τροφίμων. Το είδος περιλαμβάνει μια ποικιλία στελεχών τα οποία διαθέτουν ή συνδυάζουν μηχανισμούς που τους επιτρέπουν να προκαλούν ασθένεια στον άνθρωπο και στα ζώα (Greenwood. et al., 2002). Μορφολογικά η E. coli είναι ασπορογόνο, αερόβιο gram αρνητικό βακτήριο με μήκος 1,5-3μm περίπου. Συνήθως, είναι κινητό αλλά υπάρχουν και ακίνητα στελέχη. Διαθέτει ένα λεπτό έλυτρο το οποίο είναι παχύτερο στα ακίνητα στελέχη. Όλα τα στελέχη διαθέτουν-παράγουν ινίδια τόσο προσκολλητικά όσο και συζευκτικά (Αρσένη, 1994). Η καλλιέργεια του μικροοργανισμού γίνεται τόσο σε κοινά όσο και σε εκλεκτικά θρεπτικά υλικά. Αναπτύσσεται συνήθως σε αερόβιες συνθήκες και προαιρετικά σε αναερόβιες. Η ιδανική θερμοκρασία ανάπτυξης του βακτηρίου είναι οι 37 0 C. Ωστόσο μπορεί να αναπτυχθεί και σε θερμοκρασίες από 10 έως κα 45 0 C. Το ιδανικό ph ανάπτυξης του είναι κοντά στο ουδέτερο. Ζυμώνει τη λακτόζη και τη γλυκόζη, παράγει ινδόλη και δίνει θετική τη δοκιμασία ερυθρού του μεθυλίου. O μικροοργανισμός παρόλο που συμβιώνει στον ανθρώπινο οργανισμό και είναι γενικά ακίνδυνος μπορεί να προκαλέσει διάφορες ασθένειες, συνήθως σε άτομα εξασθενημένα ή ανοσοκατεσταλμένα. Τα στελέχη αυτά χωρίζονται σε τέσσερις ομάδες: Εντεροτοξινογόνα στελέχη (ETEC): συνήθως απομονώνονται από τα κόπρανα ταξιδιωτών που πάσχουν από διάρροιες στις υπό ανάπτυξη αφρικανικές ή ασιατικές χώρες. Παράγουν δύο εντεροτοξίνες, μια θερμοανθεκτική (ST heatstable enterotoxin) και μια θερμοευαίσθητη (LT heat-labile). Η τοξίνη ST είναι ανθεκτική σε θερμοκρασίες έως C και προκαλεί ταχύτερα διάρροια από ότι η LT. Η τοξίνη LT καταστρέφεται στους C και προκαλεί διαρροϊκό σύνδρομο ενώ άξιο αναφοράς είναι ότι μοιάζει με τη χολερική τοξίνη (cholera toxin) τόσο ως προς την αντιγονικότητα όσο και στις βιολογικές ιδιότητες. Κάθε στέλεχος μπορεί να παράγει τη μία ή και τις δύο τοξίνες. Η παραγωγή τους πραγματοποιείται από ένα πλασμίδιο το οποίο όταν παύει να υφίσταται η παραγωγή τους είναι αδύνατη (Greenwood et al., 2002, Αρσένη, 1994, Cabral, 2010). Εντεροπαθογόνα στελέχη (EPEC): συνήθως ανευρίσκονται σε κόπρανα βρεφών που πάσχουν από γαστρεντερίτιδα και ανήκουν σε συγκεκριμένους ορότυπους O, K και Η οι οποίοι ενδημούν σε χώρες με ανεπαρκής συνθήκες υγιεινής. Στις 46

47 ανεπτυγμένες χώρες έχει σχεδόν εξαφανιστεί. Από το 1971 και μετά, ελάχιστες επιδημίες οφείλονταν σε αυτά τα στελέχη τόσο στην Αγγλία όσο και στις ΗΠΑ. Προσβάλλει τα παιδιά και τα νεογνά με ηλικία έως δυο ετών. Τα συνήθη συμπτώματα είναι διάρροια και πυρετός, ενώ η μετάδοση γίνεται με άμεση ή έμμεση επαφή με κόπρανα παιδιού που πάσχει από το παθογόνο στέλεχος. Δεν παράγουν εντεροτοξίνη ενώ ο μηχανισμός δράσεως αυτών των στελεχών παραμένει άγνωστος (Greenwood et al., 2002, Αρσένη 1994, Cabral, 2010). Εντεροδιεισδυτικά στελέχη (EIEC): τα στελέχη αυτά έχουν την ικανότητα να διεισδύουν στα επιθηλιακά κύτταρα του παχέος εντέρου και να προκαλούν κλινικό σύνδρομο σχεδόν ταυτόσημο με εκείνον που προκαλείται από τον μικροοργανισμό Shigella spp. Δεν παράγει ειδικές τοξίνες ενώ σαν στέλεχος ταυτοποιείται σχετικά δύσκολα στο εργαστήριο. Προκαλούν διάρροια, πυρετό και κοιλιακά άλγη. Τέλος τα στελέχη αυτά είναι ικανά να προσβάλουν όλες τις ηλικιακές ομάδες από βρέφη μέχρι και ενήλικες (Greenwood et al., 2002, Αρσένη, 1994, Cabral, 2010). Εντεροαιμορραγικά (EHEC) ή Vero-τοξινογόνα (VTEC) στελέχη: Η κατηγορία αυτή αναγνωρίστηκε από την παθογόνο δράση του στελέχους στα Vero-κύτταρα, η οποία ήταν διαφορετική από αυτή που προκαλούσε LT τοξίνη των ETEC. Τα συμπτώματα της λοίμωξης από εντεροαιμορραγικό στέλεχος ποικίλλουν από άνθρωπο σε άνθρωπο και συνήθως περιλαμβάνουν κοιλιακά άλγη, εμετούς και συχνά αιμορραγικές διάρροιες. Ο συχνότερος ορότυπος της ομάδας των εντεροαιμορραγικών είναι ο Escherichia coli O157:H7 ο οποίος ταυτοποιείται εύκολα διότι δε ζυμώνει τη σορβιτόλη (Greenwood et al., 2002, Αρσένη, 1994, Cabral, 2010). Ο E.coli O157:Η7 αναγνωρίστηκε για πρώτη φορά ως παθογόνο το 1982 κατά τη διάρκεια της έρευνας για την αιμορραγική κολίτιδα. Η μόλυνση από E.coli O157:Η7 μπορεί να οδηγήσει σε αιμολυτικό σύνδρομο (HUS) που χαρακτηρίζεται από αιμολυτική αναιμία, θρομβοπενία και νεφρική βλάβη. Το 1995 το συγκεκριμένο στέλεχος αναγνωρίστηκε ευρέως ως σημαντικό και απειλητικό παθογόνο. Υπολογίζεται ότι ασθενείς που οφείλονται σε λοίμωξη από E.coli O157:Η7 εμφανίζονται κάθε χρόνο στις ΗΠΑ (Josefa et al., 2005). 47

48 Οι περισσότερες εστίες έχουν συσχετιστεί με την κατανάλωση μολυσμένων ή ανεπαρκώς ελεγμένων τροφών (κυρίως βοοειδών). Αναφορές επίσης υπάρχουν για επιδημίες που σχετίζονται με το πόσιμο νερό και το νερό των κολυμβητικών δεξαμενών. Ένας από τους πιο συνηθισμένους τρόπους με τον οποίο εισάγεται το στέλεχος σε καλλιέργειες τροφίμων είναι μέσο του μολυσμένου νερού άρδευσης. Επιπλέον, η διάδοση του στελέχους έχει συνδεθεί με την απορροή του εδάφους που έχει μολυνθεί με κοπριά βοοειδών. Τέλος, το E. coli O157:Η7 μπορεί να επιβιώσει σε διάφορους οικότοπους κάτω από ένα ευρύ φάσμα συνθηκών π.χ. αλλαγές στο ph, αλλαγές στη διαθεσιμότητα θρεπτικών ουσιών, θερμοκρασία κ.α. (Duffitt et al., 2011). Στην Ελλάδα, σύμφωνα με το ΚΕΕΛΠΝΟ, σε έρευνα που πραγματοποιήθηκε από το 2004 έως το 2013 δηλώθηκαν συνολικά οκτώ κρούσματα, δηλαδή 0,07 κρούσματα ανά πληθυσμού ενώ στις χώρες της Ευρωπαϊκής Ένωσης και στις χώρες της EEA/EFTA (European Economic Area/European Free Trade Association) το 2011 ήταν 25,4 κρούσματα ανά πληθυσμού Έτος Αριθμός κρουσμάτων Σύνολο 8 Πίνακας 1. Κατανομή των δηλωθέντων κρουσμάτων λοίμωξης από εντεροαιμορραγικό κολοβακτηρίδιο (EHEC) στην Ελλάδα. (ΚΕΕΛΠΝΟ 2014) Σταφυλόκοκκος χρυσίζων - Staphylococcus aureus Το γένος Staphylococcus ανήκει στην οικογένεια των Micrococcaceae. Είναι gram θετικοί κόκκοι διαμέτρου περίπου 0,8-1 μm, που διατάσσονται σε σχηματισμούς σαν τσαμπιά σταφυλιού. Είναι ακίνητοι, σπορογόνοι, αερόβιοι και προαιρετικά αναερόβιοι κόκκοι. Θετικοί στην καταλάση και αρνητικοί στην οξειδάση. Σπάνια μερικά υποείδη σταφυλόκοκκων είναι αναερόβια και κάποια απαιτούν την παρουσία 2-10% CΟ2 ή κάποιους μεταβολίτες για την ανάπτυξη τους. Στο κυτταρικό τους τοίχωμα έχουν ένα 48

49 στρώμα πεπτιδογλυκάνης και τειχοϊκό οξύ. Είναι ανθεκτικά στην παρουσία του χλωριούχου νατρίου και αναπτύσσονται σε υλικά με 7% ή και 10% NaCl. Οι σταφυλόκοκκοι δείχνουν αντοχή στην θερμότητα και ανθεκτικότητα σε υψηλές συγκεντρώσεις άλατος (Harris et al., 2002). Στο γένος των σταφυλόκοκκων περιλαμβάνονται κατά τον Bergey s Manual 19 είδη ενώ με τις σύγχρονες ταξινομήσεις 27 και 7 υποείδη (Αρσένη, 1994). Staphylococcus aureus S. aureus subsp. anaerobius Ομάδα Staphylococcus epidermidis: S. epidermidis S. warneri S. capitis S. haemolyticus S. ureolyticus S. hominis S. caprae S. lugdunensis S. saccharolyticus S. schleiferi Ομάδα Staphylococcus simulans: S. simulans S. carnosus Ομάδα Staphylococcus sciuri: S. sciuri S. lentus Ομάδα Staphylococcus saprophyticus: S. saprophyticus S. arlettae S. cohnii S. equorurum S. cohnii subsp. Ureolyticus S. gallinarium S. xylosus S. kloossii Ομάδα απροσδιόριστων: S. auricularis S. caseolyticus S. intermedius S. delphini S. hyicus S. chromogenes Ο Alexander Ogston ένας Σκωτσέζος χειρούργος έδειξε το 1880 ότι πολλές πυρετογόνες ασθένειες στον άνθρωπο σχετίζονταν με ένα μικροοργανισμό ο οποίος σχημάτιζε ένα 49

50 ιδιόμορφο σύμπλεγμα. Εισήγαγε το όνομα Staphylococcus (Greek: staphyle = bunch of grapes, kokkos= grain or berry) (Greenwood et al., 2002). Το είδος που έχει ξεχωριστούς φαινοτυπικούς και γενετικούς χαρακτήρες είναι ο S.aureus, ο οποίος είναι ο πιο παθογόνος και ο μόνος που παράγει κοαγκουλάση. Εκτός από τον S. aureus τα είδη S. epidermidis και S. saprophyticus σχετίζονται με νόσους του ανθρώπου (Μαυρίδου και συν., 2014). Ο S. aureus είναι ανθεκτικός σε αρκετά αντιμικροβίακα φάρμακα και αντιβιοτικά, π.χ. στις πενικιλίνες (Klein et.al, 2007). Μορφολογικά ο S. aureus είναι gram θετικός κόκκος, διαμέτρου 1μm που διατάσσεται ακανόνιστα σε μικρές ομάδες σαν τσαμπί σταφυλιού. Είναι μη κινητός, μη σπορογόνος, καταλάση και πηκτάση θετικός. Είναι αερόβιος συνήθως, αλλά και αναερόβιος. Αναπτύσσεται στα κοινά θρεπτικά υλικά. Οι αποικίες του στο άγαρ είναι κυκλικές, σχετικά μεγάλες με διάμετρο 1-3 mm μετά από 24 ωρη επώαση στους 37 o C. Το χρώμα των αποικιών είναι κρέμο-κίτρινο έως πορτοκαλί. Στο αιματούχο άγαρ οι αποικίες περιβάλλονται από ζώνη αιμολύσεως ενώ στο MacConkey αναπτύσσονται με ένα ελαφρώς ροζ χρώμα. Στο chapman (εκλεκτικό υλικό) έχουμε ανάπτυξη μετά από h και χρησιμοποιείται όταν υπάρχουν πολυμικροβιακά δείγματα. Οι αποικίες του σταφυλόκοκκου στην μαννιτόλη έχουν χαρακτηριστικό κίτρινο χρώμα (Αρσένη, 1994). Ο S. aureus συνδιαμορφώνει με άλλους Εικόνα 12. S. aureus σε mannitol agar. Πηγή: American Society for Microbiology (ASM). μικροοργανισμούς την ανθρώπινη μικροχλωρίδα, ωστόσο μπορεί να προκαλέσει νόσο με δύο διαφορετικούς μηχανισμούς. Ο ένας βασίζεται στην ικανότητα του να πολλαπλασιάζεται και να διαδίδεται ευρέως στους ιστούς και ο άλλος στην ικανότητα του να παράγει εξωκυττάρια ένζυμα και τοξίνες (Μαυρίδου και συν., 2014, Plata et.al, 2009). Ο S.aureus είναι μια από τις κυριότερες νοσοκομειακές και εξωνοσοκομειακές λοιμώξεις που μπορεί να οδηγήσει σε σοβαρές συνέπειες - ασθένειες (Plata et.al,, 2009). O χρυσίζων σταφυλόκοκκος είναι η πιο συχνή αιτία βακτηριαιμίας σε όλο τον κόσμο και σχετίζεται με σημαντική νοσηρότητα και θνησιμότητα (Knudsen 2016). Οι πιο κοινές νόσοι από σταφυλόκοκκο είναι: δερματικές σταφυλοκοκκιάσεις, αποστήματα, 50

51 σταφυλοκοκκική πνευμονία, σηψαιμία, ενδοκαρδίτιδα, μηνιγγίτιδα και τροφική δηλητηρίαση (Αρσένη, 1994). Η επαφή με τα χέρια είναι μέχρι στιγμής ο πιο κοινός τρόπος μετάδοσης του S.aureus ενώ οι ανεπαρκείς συνθήκες υγιεινής μπορούν να οδηγήσουν σε μόλυνση νερού και τροφίμων. Τρόφιμα όπως αλλαντικά, πουλερικά, πατάτες, σαλάτες, αυγά που διατηρούνται σε κλειστό χώρο ή σε υψηλή θερμοκρασία, προσφέρουν ιδανικό περιβάλλον για τον πολλαπλασιασμό του μικροοργανισμού και την απελευθέρωση τοξινών (τροφική δηλητηρίαση). Ο μικροοργανισμός αν και συναντάται στο νερό δεν μεταδίδεται με την κατανάλωση του. Είναι ελαφρώς πιο ανθεκτικός στο χλώριο από ότι η E. coli. Έχει διαπιστωθεί ότι ο S. aureus αποκολλάται από τον ανθρώπινο οργανισμό και μπορεί να μολύνει το νερό μιας κολυμβητικής δεξαμενής. Στελέχη S. aureus ανθρώπινης προέλευσης έχουν βρεθεί και σε χλωριωμένες κολυμβητικές δεξαμενές. Η παρουσία του μικροοργανισμού σε κολυμβητικές δεξαμενές πιστεύεται ότι έχει οδηγήσει σε δερματικά εξανθήματα, λοιμώξεις του ουροποιητικού συστήματος, λοιμώξεις του οφθαλμού, λοιμώξεις τραυμάτων, εξωτερική ωτίτιδα κ.α. (Μαυρίδου και συν 2014) Ψευδομονάδα πυοκυανική - Pseudomonas aeruginosa Οι ψευδομονάδες ανήκουν στην οικογένεια των Pseudomonadaceae. Στην οικογένεια αυτή εκτός του γένους Pseudomonas ανήκουν και τα γένη Xanthomonas, Fratenria και Zoogloea. Οι ψευδομονάδες είναι gram αρνητικά βακτηρίδια κινούμενα με μια ή περισσότερες πολικές βλεφαρίδες και με σώμα ελαφρά κυρτό ή ίσιο. Δεν διασπούν τη λακτόζη, ωστόσο διασπούν τη γλυκόζη και μερικά άλλα οξειδωτικά σάκχαρα. Είναι αυστηρά αερόβια και δεν αναπτύσσονται σε όξινο περιβάλλον. Είναι θετικά στην οξειδάση και θετικά στην καταλάση. Στο γένος ψευδομονάδα ανήκουν πολλά είδη που είναι παθογόνα για τον άνθρωπο, τα ζώα και τα φυτά. Είναι μικρόβια του φυσικού περιβάλλοντος και αποικίζουν παροδικά το σώμα των ανθρώπων, των ζώων και των φυτών (Αρσένη. 1994). Περισσότερα από 120 είδη ψευδομονάδων έχουν διαχωρισθεί και ταυτοποιηθεί αλλά λίγα ενδιαφέρουν την κλινική μικροβιολογία σαν αποικιστές του ανθρώπινου σώματος, σαν συμπαράγοντες νόσων ή σαν καθαρά παθογόνοι παράγοντες. (Streeter & Katouli., 2016). 51

52 Η P. aeruginosa είναι βακτήριο gram αρνητικό, ευκαιριακό παθογόνο, με ελαφρά κάμψη του σώματος, κινούμενο με μια πολική βλεφαρίδα. Διατάσσεται κατά μόνας ή κατά ζεύγη ή σε κοντές αλυσίδες. Φέρει στον κορμό του προκλητικά ινίδια. (Αlhazmi, 2015). Αναπτύσσεται εύκολα στα κοινά πεπτονούχα θρεπτικά υλικά όπως θρεπτικός ζωμός και θρεπτικό άγαρ. Στο αιματούχο άγαρ μερικά στελέχη προκαλούν αιμόλυση. Αναπτύσσεται επίσης και σε θρεπτικά υλικά όπως το MacConkey όπου παράγει άχρωμες αποικίες. Αναπτύσσεται δύσκολα σε εκλεκτικά υλικά που είναι κατάλληλα για άλλα βακτήρια. Ειδικά υλικά για την P. aeruginosa είναι το Cetrimide και το Pseudomonas άγαρ, στα οποία παρατηρούνται πράσινες-φθορίζουσες αποικίες σε λάμπες UV. Η P. aeruginosa έχει χαρακτηριστική οσμή στην καλλιέργεια. Ευνοϊκή θερμοκρασία ανάπτυξης είναι οι C. Δεν αναπτύσσεται σε θερμοκρασίες από 4 0 C και χαμηλότερες. Εικόνα 13. P. aeruginosa. Πηγή: American Society for Microbiology (ASM). Οι ψευδομονάδες είναι μικρόβια του φυσικού περιβάλλοντος, ζουν, αναπτύσσονται και πολλαπλασιάζονται στο φτωχό φυσικό περιβάλλον των νερών, του εδάφους, των φυτών και το εχθρικό των υπονόμων γιατί επιβιώνουν στις χαμηλές θερμοκρασίες του φυσικού περιβάλλοντος και γιατί διαθέτουν πλούσιο ενζυμικό σύστημα που τις επιτρέπει να συνθέτουν τις απαραίτητες ουσίες για τη διατροφή και το μεταβολισμό τους από τις απλούστερες ενώσεις που βρίσκουν στο φυσικό περιβάλλον. Στα νοσοκομεία επιζούν και πολλαπλασιάζονται σε όλα τα νοσηλευτικά υγρά και τις υγρές επιφάνειες διαφόρων σωληνώσεων, καθετήρων, αναρροφητήρων, ενδοσκοπικών οργάνων κ.α. Είναι μαζί με το σταφυλόκοκκο το συχνότερο αίτιο των ενδονοσοκομειακών λοιμώξεων (Αρσένη,1994). Ο κύριος τρόπος μετάδοσης των ψευδομονάδων είναι η έκθεση τραυμάτων του δέρματος και των βλεννογόνων σε μολυσμένο νερό ή μολυσμένα χειρουργικά εργαλεία (Αρσένη, 1994). 52

53 Η P.aeruginosa είναι το γένος που προκαλεί-συνδέεται με ανθρώπινες λοιμώξεις (Streeter et al., 2016, Alhazmi, 2015). Αποτελεί σοβαρό κίνδυνο ενδονοσοκομειακών λοιμώξεων ιδίως για τους ανοσοκατεσταλμένους ασθενείς. Ο μικροοργανισμός αυτός δείχνει μια αξιοσημείωτη ικανότητα να αντιστέκεται στα αντιβιοτικά, αναπτύσσοντας νέους μηχανισμούς αντίστασης εναντίον τους (Mesaros. et al., 2007). Στον παρακάτω πίνακα παρουσιάζονται μερικές από τις λοιμώξεις που προκαλεί το συγκεκριμένο βακτήριο. Σημείο μόλυνσης Ειδικές παθολογίες Εμφάνιση (σε πληθυσμό κινδύνου) Αναπνευστικής Οξεία πνευμονία Συχνές (νοσοκομειακή ΜΕΘ) οδού Χρόνιες λοιμώξεις του κατώτερου αναπνευστικού συστήματος (Κυστική ίνωση) Αίμα Ουρολοίμωξη Αυτί Μολύνσεις του δέρματος και των μαλακών μορίων Μάτι Κεντρικό νευρικό σύστημα Βακτηριαιμία και σηψαιμία Οξεία λοιμώξεις Χρόνιες λοιμώξεις Οτίτιδα εξωτερική ('αυτί του κολυμβητή') Eξωτερική ωτίτιδα Χρόνια φλεγμονώδης μέση ωτίτιδα Δερματίτιδα Μολύνσεις τραύματος Σήψη του τραύματος Γάγγραινα Πυοδερμία Θυλακίτιδα Μορφές ακμής vulgaris Κερατίτιδα (έλκος του κερατοειδούς) Ενδοφθαλμίτιδα Νεογνική οφθαλμία Μηνιγγίτιδα Συχνά Σχετικά συχνή (επιπλοκή που οφείλεται στην παρουσία ξένων σωμάτων) Συχνά Σχετικά συχνά (Τραύμα) (Ασθενείς με ουδετεροπενία) Σπάνια (δευτερογενώς από τραύμα) Σπάνιες (δευτερογενείς στη νευροχειρουργική ή στο τραύμα) Απόστημα εγκεφάλου Καρδιά Ενδοκαρδίτιδα Σπάνια (τοξικομανείς) Οστικές λοιμώξεις Οστεοαρθρική Σπάνια πυάθρορωση Σπονδυλική οστεομυελίτιδα Λοίμωξη από Symphysis pubis 53

54 Γαστρεντερικός σωλήνας Οστεοχονδρίτιδα του ποδιού Χρόνια γειτονική οστεομυελίτιδα Νεκρωτική εντεροκολίτιδα Περιτοναϊκές μολύνσεις Σπάνια Πίνακας 2. Λοιμώξεις από P. aeruginosa. (N.Mesaros et al., 2007). Η P. aeruginosa αποτελεί σημαντική απειλή για τη δημόσια υγεία. Οι κολυμβητικές δεξαμενές μολύνονται συχνά με το συγκεκριμένο ευκαιριακό παθογόνο. Παρά τις συνεχείς βελτιώσεις στην ποιότητα του νερού των κολυμβητικών δεξαμενών και την παρακολούθηση των χημικών απολυμαντικών (Κεφ 1.5), εξακολουθούν να αντιμετωπίζουν σημαντική μικροβιακή μόλυνση. Ο συγκεκριμένος μικροοργανισμός είναι ένας από τους πιο συχνά απομονωμένους σε κολυμβητικές δεξαμενές και υδρομασάζ. Είναι δυνατόν να προέρχεται από ανθρώπινες και μη ανθρώπινες πηγές. Οι εξωτερικές κολυμβητικές δεξαμενές είναι πιο ευάλωτες στην μόλυνση από P. aeruginosa (πτηνά, τρωκτικά και οργανική ύλη) (Scott et al, 2012). Έχει την ικανότητα να σχηματίζει biofilm και μπορεί να επιβιώσει στο επεξεργασμένο νερό με επίπεδα χλωρίου >1 mg/l (Guida et al, 2016). Οι Lutz & Lee μελέτησαν την επικράτηση των ανθεκτικών στα αντιβιοτικά στελεχών P.aeruginosa από διάφορες κολυμβητικές δεξαμενές και υδρομασάζ. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το 96% των απομονώσεων τους ήταν MRD (δηλαδή αντοχή σε τουλάχιστον τρία αντιβιοτικά). Σε παρόμοια έρευνα ο Tirodimos και οι συνεργάτες του βρήκαν αντίσταση μόνο στο 20% αυτών των αντιβιοτικών. Γενικότερα τα περιβαλλοντικά στελέχη P. aeruginosa δείχνουν μία σχετικά μικρή αντίσταση στα αντιβιοτικά. Μια σημαντική πηγή ανθεκτικών στελεχών στα αντιβιοτικά είναι από ανεπεξέργαστα νοσοκομειακά λύματα (Streeter & Katouli, 2016) Εντερόκοκκος Enterococcus faecalis Το όνομα εντερόκοκκος (enterocoque) χρησιμοποιήθηκε για πρώτη φορά το 1899 από τον Thiercelin στη Γαλλία για να υποδηλωθεί η εντερική προέλευση του μικροοργανισμού. Οι επιστήμονες εκείνης της εποχής παρατήρησαν ότι ο μικροοργανισμός βρισκόταν σε αφθονία στους υπονόμους και επισήμαναν ότι θα μπορούσε να αποτελέσει ένα χρήσιμο στοιχείο για τον προσδιορισμό της μόλυνσης του νερού με ανθρώπινα κόπρανα (Stiles & Holzapfel, 1997). 54

55 Ο Enterococcus είναι gram θετικό, αερόβιο και προαιρετικά αναερόβιο βακτήριο που μπορεί να εμφανιστεί τόσο ως μονός κόκκος ή σε αλυσίδες. Οι εντερόκοκκοι ανήκουν σε μια ομάδα οργανισμών γνωστών ως βακτήρια γαλακτικού οξέος (LAB) τα οποία παράγουν βακτηριοκίνες (Fisher and Phillips., 2009). Δεν υπάρχουν φαινοτυπικά χαρακτηριστικά για τη διάκριση των ειδών του enterococcus από άλλα gram θετικά και αρνητικά στην καταλάση κόκκο-βακτήρια. Για πολλά χρόνια τα είδη του Enterococcus θεωρείτο ότι ήταν ακίνδυνα-αβλαβή για τον άνθρωπο και ασήμαντα ιατρικά (Moreno et al., 2006). Η ταξινόμηση και η οικολογία του μικροοργανισμού εξετάστηκαν από τον Klein. Έχουν γίνει πολλές προσπάθειες για τη διάκριση των ειδών Enterococcus από τα είδη Streptococcus. Το 1937 ο υποομάδες: Faecal streptococci (enterococci) Dairy streptococci Viridans group Pyogenous streptococci Sherman ταξινόμησε τα είδη Streptococcus σε τέσσερις Ωστόσο, παρέμειναν ερωτηματικά σχετικά με το ποιο από τα είδη Streptococcus ανήκε πράγματι στο γένος Enterococcus (Klein, 2003). Το 1984 η ταξινόμηση των στρεπτόκοκκων έχει υποστεί ριζική αλλαγή και έχουν χωριστεί σε τρία γένη: Στρεπτόκοκκος, Εντερόκοκκος και Λακτόκοκκος. Με τη χρήση της υβριδοποίησης του DNA και της αλληλουχίας του 16SrRNA διαπιστώθηκε ότι τα είδη Streptococcus faecalis και faecium ήταν επαρκώς διακριτά για να χαρακτηρίσουν ένα νέο γένος Εντερόκοκκου (Moreno et al., 2006). Οµάδα Οµάδα avium Οµάδα Οµάδα ιαφορετικά είδη faecium gallinarum cecorum E. faecium E. avium E. gallinarum E. cecorum E. faecalis E. mundii E. raffinosus E.casseliflavus E.columbae E. dispar E. durans E. malodoratus E. sulfureus E. hirae E.pseudoavium E. solitarius E. saccharoliticus E. flavescens Πίνακας 3. Ομάδες εντεροκόκκων σύμφωνα με την αλληλουχία 16SrRNA 55

56 Τα είδη του εντερόκοκκου Faecalis και Faecium αναπτύσσονται σε ένα εύρος θερμοκρασιών από C καθώς και σε ένα ευρύ φάσμα ph από 4,6-9,9 με βέλτιστο να είναι το ουδέτερο. Τόσο το E. faecalis όσο και το Ε. Faecium μπορούν να επιβιώσουν στη θερμοκρασία των 60 C για 30 λεπτά, καθιστώντας τα είδη Enterococcus διακριτά από άλλα στενά συγγενή γένη όπως ο Streptococcus. Ο E. faecalis διαθέτει όλες τις χαρακτηριστικές ιδιότητες του γένους (Van den Berghe et al., 2006, Moreno et al., 2006). Πρόσφατα οι εντερόκοκκοι έχουν γίνει ένα από τα πλέον κοινά νοσοκομειακά παθογόνα με υψηλά ποσοστά θνησιμότητας έως και 61%. Στις μέρες μας, αποτελούν το δεύτερο αίτιο λοίμωξης χειρουργικών τραυμάτων και ουρολοιμώξεων και το τρίτο αίτιο νοσοκομειακών βακτηριαιμιών στις ΗΠΑ. Προσβάλλουν κυρίως το ουροποιητικό σύστημα, το ενδοκάρδιο, το αίμα ενώ προκαλούν λοιμώξεις μετά από εγκαύματα (Low. et al., 2001, Donlan and. Casterton., 2002). Από το γένος των εντερόκοκκων εκείνο που απομονώνεται συχνότερα ως αιτία λοίμωξης είναι ο E. faecalis και ακολουθεί ο E. faecium o οποίος παρουσιάζει αυξανόμενη συχνότητα απομόνωσης από κλινικά δείγματα τα τελευταία χρόνια (Torell et al., 2003). Το 2005 υπήρχαν 7,066 περιπτώσεις βακτηριαιμίας που προκλήθηκαν από είδη εντερόκοκκου στο Ηνωμένο Βασίλειο, αύξηση 8% σε σχέση με το Το 28% των συγκεκριμένων στελεχών ήταν ανθεκτικά σε ένα ευρύ φάσμα αντιβιοτικών. Η σημαντική αυτή αύξηση, της ανθεκτικότητας στα αντιβιοτικά, υπογραμμίζει την ανάγκη για μεγαλύτερη κατανόηση του συγκεκριμένου είδους (Fisher et. al, 2009). Τέλος, οι εντερόκοκκοι χρησιμοποιούνται ως δείκτες κοπρανώδους μόλυνσης του νερού. Τα περισσότερα είδη αυτής της κατηγορίας μικροοργανισμών δεν πολλαπλασιάζονται στο νερό. Ένα από τα πιο σημαντικά πλεονεκτήματα των εντερόκοκκων είναι ότι ζουν περισσότερο στο νερό σε σχέση με το E. coli, ενώ είναι πιο ανθεκτικοί στην ξηρασία και στη χλωρίωση. Από επιδημιολογικές μελέτες έχει αποδειχθεί πολύ αξιόπιστος δείκτης για την αξιολόγηση των νερών αναψυχής (Μαυρίδου και συν., 2014). Εικόνα 14. E. faecalis σε θρεπτικό υλικό slanetz and bartley 56

57 1.7 Σκοπός της μελέτης. Πολλοί άνθρωποι χρησιμοποιούν τις κολυμβητικές δεξαμενές για αθλητισμό, αναψυχή ή ιατρικές δραστηριότητες. Η κολύμβηση τα τελευταία χρόνια γίνεται όλο και πιο δημοφιλής τόσο στην Αμερική όσο και στην Ευρώπη. Η άσκηση και η τέρψη που προσφέρει η κολύμβηση αποτελεί μια σημαντική κοινωνική υπηρεσία που προάγει την υγεία και την ευημερία όλων των ηλικιών. Πολλοί από τους οργανισμούς δημόσιας υγείας αλλά και υγειονομικές αρχές σε επίπεδο κρατών ασχολούνται με την ασφάλεια των κολυμβητικών δεξαμενών. Πάρα τις συνεχείς βελτιώσεις στην ποιότητα του νερού και την παρακολούθηση των απολυμαντικών, οι κολυμβητικές δεξαμενές εξακολουθούν να αντιμετωπίζουν μικροβιακή και χημική μόλυνση. Το πιο διαδεδομένο και ευρέως χρησιμοποιούμενο απολυμαντικό κολυμβητικών δεξαμενών είναι το χλώριο και τα παράγωγα του. Το χλώριο είναι ιδιαίτερα αποτελεσματικό όπως και τα περισσότερα αλογόνα απολυμαντικά. Έχουν την ικανότητα να θανατώνουν ένα ευρύ φάσμα μικροοργανισμών επιφέροντας σχεδόν άριστη απολύμανση του νερού. Το χλώριο όμως φαίνεται αναποτελεσματικό έναντι των Cryptosporidium και Giardia. Ωστόσο, τα μεγαλύτερα προβλήματα με τα χημικά απολυμαντικά μέσα είναι αλλεργίες, ερεθισμοί οφθαλμών και η δημιουργία παραπροϊόντων απολύμανσης. Τα παραπροϊόντα αυτά έχουν ενοχοποιηθεί τα τελευταία χρόνια για πολλές ασθένειες όπως καρκίνο, τοξικότητα, τερατογενέσεις κ.α Έτσι λοιπόν, όλο και περισσότερο δημιουργείται η ανάγκη, η οποία επισημαίνεται από τους επιστήμονες που ασχολούνται με την ποιότητα του νερού, για την ανάπτυξη και διερεύνηση νέων τεχνολογιών. Οι νέες τεχνολογίες για την επεξεργασία του νερού θα πρέπει να είναι φιλικές προς το περιβάλλον, ασφαλείς και οικονομικά συμφέρουσες. Στο πλαίσιο της παρούσας διπλωματικής εργασίας πραγματοποιήθηκε απολύμανση του νερού με τη χρήση υπεριώδους ακτινοβολίας και υπερήχων. Για την απολύμανση του νερού με υπεριώδη ακτινοβολία χρησιμοποιήθηκε πιλοτικό μοντέλο κολυμβητικής δεξαμενής ενώ για την απολύμανση με υπέρηχους, υδατόλουτρο υπερήχων. Χρησιμοποιήθηκαν μερικοί από τους πιο κοινούς μικροοργανισμούς που δύναται να ανευρεθούν σε κολυμβητικές δεξαμενές όπως Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa και Enterococcus faecalis. Και οι δυο μέθοδοι απολύμανσης είναι ιδανικές καθώς τίποτα δεν προστίθεται στο νερό και δεν δημιουργούνται 57

58 παραπροϊόντα απολύμανσης, γεύσεις και οσμές. Επιπλέον, πέραν της απόδοσης τους σαν μέθοδοι είναι απλές και απαιτούν μικρή συντήρηση. Σκοπός της παρούσας μελέτης αποτέλεσε η διερεύνηση και η ανάλυση των επιπτώσεων της υπεριώδους ακτινοβολίας και των υπερήχων στην επιβίωση διαφόρων μικροοργανισμών. Στόχος της παρούσας μελέτης ήταν η απόδειξη ότι και οι δυο πράσινες μέθοδοι έχουν ισχυρή απολυμαντική δράση και κατά συνέπεια μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την απολύμανση των κολυμβητικών δεξαμενών αντικαθιστώντας τις συμβατικές μεθόδους. Η διερεύνηση εναλλακτικών μεθόδων απολύμανσης (UV & US) αποτελεί αντικείμενο της παρούσας διπλωματικής εργασίας. Η εφαρμογή νέων εναλλακτικών μεθόδων απολύμανσης θα βοηθήσει σημαντικά στην προστασία της δημόσιας υγείας και τη μείωση των σημαντικών επιπτώσεων που έχουν οι συμβατικές τεχνολογίες. 58

59 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 Ο ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 59

60 60

61 2.1 ΥΛΙΚΑ Εξοπλισμός-σκεύη Τα εργαστηριακά σκεύη και ο ειδικός εργαστηριακός εξοπλισμός που χρησιμοποιήθηκε κατά τη διάρκεια της πειραματικής διαδικασίας, παρουσιάζεται παρακάτω σε αλφαβητική σειρά. Επιπροσθέτως, κατά τη διάρκεια της πειραματικής διαδικασίας η χρήση εργαστηριακής ποδιάς και γαντιών ήταν υποχρεωτική τόσο για τη διασφάλιση των άσηπτων συνθηκών που απαιτούνται σε ένα μικροβιολογικό εργαστηριακό περιβάλλον όσο και για την προσωπική μας ασφάλεια. Αναδευτήρας Vortex (Genie 2, Scientific Industries, INC, K) Αποστειρωμένοι ογκομετρικοί κύλινδροι, 100 ml, 500 ml Αυτόματες πιπέτες 100 μl μl (Eppendorf ) Γυάλινες κωνικές φιάλες 200 ml, 500 ml, 1000 ml, 5000 ml Επωαστικός κλίβανος 37 0 C (memmer) Ηλεκτρονική πιπέτα (SWIFTRET PRO) Ηλεκτρονικό πεχάμετρο (ph consort C830) Ηλεκτρονικός ζυγός ακριβείας (Phoenix) Θάλαμος υπεριώδους ακτινοβολίας (Uvitec) (Καταμέτρηση αποικιών P. aeruginosa) Θερμαινόμενος ηλεκτρονικός αναδευτήρας Καταψύκτης (Tropical Ariston) (-20 0 C) Κλίβανος ξηρής αποστείρωσης (ΤΕΧΝΟΔΙΑΓΝΩΣΗ ΕΠΕ) Κλίβανος υγρής αποστείρωσης (Υamato) 61

62 Λαβίδα μεταλλική Λουτρό υπερήχων (US Elmasonic P) Λύχνος Bunsen Μεταλλικό κουτάλι Πλυντήριο (Miele Μiele bro G7783) Ποτήρια ζέσεως Pyrex Συσκευές (scohott gerate)-στήλες για την παραγωγή απεσταγμένου νερού Συσκευή διήθησης νερού Συσκευή μέτρησης αποικιών, (BZG 30) Spreader μεταλλικά Υδατόλουτρο, (GFL) Φλόγιστρο (γκαζάκι) Φούρνος μικροκυμάτων (Delonghi) Ψυγείο 5 ± 3ο C (Frigorex Fv 650) Αναλώσιμα Στην συνέχεια παρουσιάζονται σε αλφαβητική σειρά τα αναλώσιμα που χρησιμοποιήθηκαν κατά τη διάρκεια της πειραματικής πορείας. Αλουμινόχαρτο Απεσταγμένο νερό Διηθητικές μεμβράνες 0,45 μm (Sterile MCE Gridded Membrane) 62

63 Ταινία ελέγχου αποστείρωσης Ρύγχη πιπετών αποστειρωμένα (Biosphere filter tips) Τρυβλία Petri αποστειρωμένα, διαμέτρου 9cm και 6cm (Athal) Falcons 10 ml (Athal) Βακτηριακά στελέχη Escherichia coli (NCTC 9001) Staphylococcus aureus (NCTC 6571) Pseudomonas aeruginosa (NCTC 10662) Enterococcus faecalis (NCTC 775) Εξοπλισμός πιλοτικού μοντέλου δεξαμενής Μοντελοποιημένη κολυμβητική δεξαμενή ολυμπιακών προδιαγραφών σε κλίμακα 1:250. (Υλικό κατασκευής Plexiglass). Λάμπα υπεριώδους ακτινοβολίας T5 UV-C της εταιρείας Deltec, Type 101, δυναμικότητας 10 Watt στα 254 nm, με μέγιστη ικανότητα απολύμανσης του νερού 500 ltr/h. Περισταλτική αντλία της εταιρείας Seco, Type NPR18. Σωλήνες σιλικόνης διαμέτρου Φ 12 mm. Θερμοστάτης της εταιρείας Sera 50 Watt. 63

64 Στις επόμενες εικόνες παρατηρούμε μερικές από τις εργαστηριακές συσκευές που χρησιμοποιήθηκαν. Εικόνα 15. Υδατόλουτρο GFL Εικόνα 16. Κλίβανος επώασης Εικόνα 17. Ηλεκτρονικό πεχάμετρο Εικόνα 18. Πιπέτες ακριβείας Εικόνα 19. Κλίβανος υγρής αποστείρωσης Εικόνα 20. Λουτρό υπερήχων 64

65 Στις επόμενες εικόνες παρατηρούμε τον εξοπλισμό του πιλοτικού μοντέλου δεξαμενής που χρησιμοποιήθηκε για την απολύμανση του νερού με υπεριώδη ακτινοβολία. Εικόνα 21. Πιλοτικό μοντέλο κολυμβητικής δεξαμενής Εικόνα 22. Λάμπα UV, T5 UV-C, Type 101. Εικόνα 23. Περισταλτική αντλία της εταιρείας Seco, Type NPR18. Εικόνα 24. Θερμοστάτης, Sera 50 Watt. 65

66 2.1.5 Θρεπτικά υλικά, διαλύματα και αντιδραστήρια Θρεπτικό υλικό ονομάζεται κάθε υγρό ή στερεό υλικό που χρησιμοποιείται σε εργαστηριακό επίπεδο για την ανάπτυξη των μικροοργανισμών. Κάθε θρεπτικό υπόστρωμα περιέχει όλα τα απαραίτητα συστατικά που πληρούν τις θρεπτικές απαιτήσεις του κάθε μικροοργανισμού. Στη συνέχεια παρουσιάζονται τα θρεπτικά υποστρώματα και αντιδραστήρια που χρησιμοποιήθηκαν κατά τη διάρκεια της πειραματικής διαδικασίας για τους μικροοργανισμούς που χρησιμοποιήθηκαν, συνοδευόμενα από την προμηθεύτρια εταιρία και τη σύσταση τους. Chromocult (coliform agar) for microbiology (Merck) Το θρεπτικό υλικό που χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση και καταμέτρηση του E. coli ήταν το chromocult. Στις οδηγίες του υλικού δίνεται η πληροφορία ότι σε 1000 ml απεσταγμένου νερού προσθέτουμε 26.5 gr υλικού. Στην συνέχεια θερμαίνουμε την κωνική φιάλη με το διάλυμα μας έως ότου διαλυθεί εντελώς το υλικό μας στο απεσταγμένο νερό. Τοποθετούμε την κωνική φιάλη με το διάλυμα στο υδατόλουτρο στους 50 ºC περίπου και μοιράζουμε το υπόστρωμα σύμφωνα με τις οδηγίες (κεφ ). Το συγκεκριμένο θρεπτικό υλικό δεν χρειάζεται αποστείρωση σύμφωνα με τις οδηγίες που δίνονται από την κατασκευάστρια εταιρία. Στο παρακάτω πίνακα δίνονται πληροφορίες για τη σύσταση του υλικού. Peptones 3.0 Tergitol sodium chloride 5.0 Sorbitol 1.0 sodium dihydrogen phosphate 2.2 Agar-agar 10.0 disodium hydrogen phosphate chloro-3-indoxyl-beta-D-galactopyranoside 0.2 tryptophan 1.0 isopropyl-beta-d-thiogalactopyranoside 0.1 sodium pyruvate bromo-4-chloro-3-indoxyl-D-glycuronic acid 0.1 Τυπική σύνθεση gr/liter Mannitol salt agar (Oxoid) Το θρεπτικό υλικό που χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση και καταμέτρηση του S. aureus ήταν το Mannitol salt agar. Στις οδηγίες του υλικού δίνεται η πληροφορία ότι σε 1000 ml απεσταγμένου νερού προσθέτουμε 111gr υλικού. Στη συνέχεια θερμαίνουμε την κωνική φιάλη με το διάλυμα μας έως ότου διαλυθεί εντελώς το υλικό μας στο απεσταγμένο νερό. Ακολουθεί αποστείρωση στον κλίβανο στους 121ºC για 15 λεπτά υπό πίεση 1 atm σύμφωνα με τις οδηγίες της κατασκευάστριας εταιρίας και όταν τελειώσει η διαδικασία, τοποθετούμε τη φιάλη στο υδατόλουτρο στους 50 ºC περίπου. 66

67 Μοιράζουμε το υπόστρωμα σύμφωνα με τις οδηγίες (κεφ ). Στον παρακάτω πίνακα δίνονται πληροφορίες για τη σύσταση του υλικού. Lab-Lemco powder 1.0 Sodium chloride 75.0 Peptone 10.0 Phenol red Mannitol 10.0 Agar 15.0 Τυπική σύνθεση gr/liter Slanetz and Bartley medium (Himedia) Το θρεπτικό υλικό που χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση και καταμέτρηση του E. faecalis ήταν το Slanetz and Bartley medium. Στις οδηγίες του υλικού δίνεται η πληροφορία ότι σε 1000 ml απεσταγμένου νερού προσθέτουμε 46.5 gr υλικού. Στη συνέχεια θερμαίνουμε την κωνική φιάλη με το διάλυμα μας έως ότου διαλυθεί εντελώς το υλικό μας στο απεσταγμένο νερό. Τοποθετούμε την κωνική φιάλη με το διάλυμα στο υδατόλουτρο στους 50 ºC περίπου και μοιράζουμε το υπόστρωμα σύμφωνα με τις οδηγίες (κεφ ). Το συγκεκριμένο θρεπτικό υλικό δε χρειάζεται αποστείρωση σύμφωνα με τις οδηγίες που δίνονται από την κατασκευάστρια εταιρία. Στον παρακάτω πίνακα δίνονται πληροφορίες για τη σύσταση του υλικού. Tryptose Sodium azide Yeast extract ,3,5-Triphenyl tetrazolium chloride Dextrose Agar Disodium phosphate Τυπική σύνθεση gr/liter Pseudomonas agar base (Oxoid) Το θρεπτικό υλικό που χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση και καταμέτρηση του P. aeruginosa ήταν το Pseudomonas agar base. Στις οδηγίες του υλικού δίνεται η πληροφορία ότι σε 500 ml απεσταγμένου νερού προσθέτουμε 24.2gr υλικού καθώς και 5 ml γλυκερόλης. Στη συνέχεια θερμαίνουμε την κωνική φιάλη με το διάλυμα μας έως ότου διαλυθεί εντελώς το υλικό μας στο απεσταγμένο νερό. Ακολουθεί αποστείρωση στον κλίβανο στους 121ºC για 15 λεπτά σύμφωνα με τις οδηγίες της κατασκευάστριας εταιρίας και όταν τελειώσει η διαδικασία, τοποθετούμε τη φιάλη στο υδατόλουτρο στους 50ºC περίπου. Παράλληλα ετοιμάζουμε το συμπλήρωμα (supplement) που απαιτείται το οποίο ονομάζεται Pseudomonas CN Selective Supplement. Για την παρασκευή 500 ml θρεπτικού υλικού, προσθέτουμε ένα φιαλίδιο 67

68 από τα συμπληρώματα (supplements). Για την προετοιμασία του supplement, προσθέτουμε με αποστειρωμένη πιπέτα 1 ml αιθανόλης και 1 ml αποστειρωμένου νερού. Γίνεται ανακίνηση του φιαλιδίου και στη συνέχεια ρίχνουμε το συμπλήρωμα (supplement) στην κωνική φιάλη με το θρεπτικό υλικό μας. Ανακινούμε καλά και μοιράζουμε το υπόστρωμα σύμφωνα με τις οδηγίες (κεφ ). Στους παρακάτω πίνακες δίνονται πληροφορίες για τη σύσταση του υλικού καθώς και του συμπληρώματος (supplement). Gelatin peptone 16.0 Magnesium chloride 1.4 Casein hydrolysate 10.0 Agar 11.0 Potassium sulphate 10.0 Τυπική σύνθεση gr/liter (Pseudomonas agar base) Cetrimide mg Sodium nalidixate 7.5mg Τυπική σύνθεση mg/vial (Pseudomonas CN selective supplement) Nutrient Agar (Oxoid) Το συγκεκριμένο θρεπτικό υλικό χρησιμοποιήθηκε για την απαρίθμηση των αποικιών μετά την αναζωογόνηση των μικροοργανισμών από τα Lenticule. Στις οδηγίες του θρεπτικού υλικού δίνετε η πληροφορία ότι 28 gr υλικού προστίθενται σε 1 ltr απεσταγμένου νερού. Στην συνεχεία θερμαίνουμε έως βρασμού προκειμένου να διαλυθεί πλήρως το υλικό. Ακολουθεί αποστείρωση στον κλίβανο στους 121ºC για 15 λεπτά σύμφωνα με τις οδηγίες της κατασκευάστριας εταιρίας και όταν τελειώσει η διαδικασία, τοποθετούμε τη φιάλη στο υδατόλουτρο στους 50ºC περίπου. Μοιράζουμε το υπόστρωμα συμφώνα με τις οδηγίες που δόθηκαν παραπάνω. παρακάτω πίνακα δίνονται πληροφορίες για την σύσταση του υλικού. Lab-Lemco Powder 1.0 Sodium chloride 5.0 Yeast extract 2.0 Agar 15.0 Peptone 5.0 Στο Τυπική σύνθεση gr/liter 68

69 Peptone Saline για αναζωογόνηση των μικροοργανισμών (Merck) Το θρεπτικό υλικό που χρησιμοποιήθηκε για την αναζωογόνηση των μικροοργανισμών ήταν το Peptone saline 1%. Για την παρασκευή του συγκεκριμένου διαλύματος διαλύουμε 8.5 gr NaCl και 1 gr Bacteriological Peptone σε 1000 ml απεσταγμένου νερού. Ρυθμίζεται το ph στο 7, +/- 0.2 με τη χρήση διαλύματος 1M HCI. Ακολουθεί αποστείρωση του διαλύματος σε αυτόκαυστο στους 121 ºC για 15 λεπτά Παρασκευή θρεπτικών υλικών και διαλυμάτων Για την προετοιμασία των θρεπτικών υλικών που χρησιμοποιούμε για κάθε μικροοργανισμό ακολουθούμε την εξής διαδικασία: Διαβάζουμε με προσοχή τις οδηγίες παρασκευής του εκάστοτε θρεπτικού υλικού που αναγράφονται στη συσκευασία και ελέγχουμε κάποια βασικά χαρακτηριστικά όπως η ημερομηνία λήξης, η ημερομηνία ανοίγματος. Εάν είναι απαραίτητο, ανατρέχουμε σε τυχόν επιπρόσθετο φυλλάδιο με οδηγίες. Στη συνέχεια, λαμβάνεται ποσότητα θρεπτικού υλικού όπου ζυγίζεται και διαλύεται σε συγκεκριμένη ποσότητα απεσταγμένου νερού σύμφωνα με τις οδηγίες που αναγράφονται στη συσκευασία του εκάστοτε υλικού. Πριν τη χρήση του ηλεκτρονικού ζυγού ακριβείας, ελέγχουμε την επιφάνεια του η οποία πρέπει να είναι καθαρή έτσι ώστε να μην οδηγηθούμε σε εσφαλμένη μέτρηση. Έπειτα ο ηλεκτρονικός ζυγός μηδενίζεται και με μεταλλικό κουτάλι ζυγίζουμε με ακρίβεια το υλικό. Με ογκομετρικό κύλινδρο μετράμε τον όγκο του νερού που θα χρειαστούμε και το ρίχνουμε σε κωνική φιάλη. Προσθέτουμε την σκόνη του θρεπτικού υλικού σιγά σιγά ανακινώντας πολύ καλά ώστε να διαλυθεί εντελώς. Η κωνική φιάλη πωματίζεται και θερμαίνεται μέχρι την πλήρη διάλυση του υλικού. Έπειτα, τοποθετούμε την κωνική φιάλη με το διάλυμα στον κλίβανο αποστείρωσης στη θερμοκρασία και το χρόνο που αναγράφονται στην ετικέτα του θρεπτικού υλικού. Κάποια θρεπτικά υλικά δεν χρειάζονται αποστείρωση ενώ κάποια άλλα καταστρέφονται σε πολύ υψηλές θερμοκρασίες. Συνήθως, η αποστείρωση διαρκεί για 15 λεπτά στους C υπό πίεση 1 atm. Μετά την αποστείρωση τοποθετούμε την κωνική φιάλη με το διάλυμα στο υδατόλουτρο (συνήθως στους C για 30 λεπτά περίπου). 69

70 Στη συνέχεια καθαρίζουμε με αιθανόλη τον πάγκο όπου θα εργαστούμε ώστε να ελαχιστοποιηθεί ο κίνδυνος επιμόλυνσης. Είναι απαραίτητο να έχουμε άσηπτες συνθήκες σε όλες τις μικροβιολογικές εργασίες. Με ήπιες κινήσεις ανακινούμε την κωνική φιάλη με το υλικό, αφαιρούμε το πώμα και αποστειρώνουμε το στόμιο της καίγοντας την στο λύχνο Bunsen. Αφού έχουμε ετοιμάσει τα κενά τρυβλία, ανοίγουμε το καπάκι κάθε τρυβλίου υπό γωνία 45 0 περίπου και ρίχνουμε ml υλικού. Μετά κλείνουμε το καπάκι, καίμε το στόμιο της φιάλης και επαναλαμβάνουμε την παραπάνω διαδικασία έως ότου μοιράσουμε το διάλυμα μας σε όλα τα τρυβλία. Αφήνουμε για μερικές ώρες τα τρυβλία μας ακίνητα ώστε να πήξει το υλικό μας. Τέλος, τοποθετούμε τα τρυβλία μας σε ειδική σακούλα και στη συνέχεια στο ψυγείο αφού πρώτα γράψουμε το είδος του υλικού και την ημερομηνία παρασκευής του. 2.2 ΜΕΘΟΔΟΙ Άσηπτες μέθοδοι εργασίας Σε όλες τις μικροβιολογικές αναλύσεις είναι απαραίτητη η τήρηση ορισμένων κανόνων για την προστασία του αναλυτή-ερευνητή καθώς και για την αποφυγή επιμόλυνσης των προς ανάλυση δειγμάτων. Για την εξασφάλιση ενός καθαρού περιβάλλοντος εργασίας καθώς και για τη μείωση του κίνδυνου επιμόλυνσης κατά τη διάρκεια διαφόρων μεθόδων καλλιέργειας χρησιμοποιούμε την άσηπτη τεχνική. Για την ορθή εφαρμογή της, είναι απαραίτητα τουλάχιστον τα εξής προαπαιτούμενα: Απολύμανση των εργαστηριακών πάγκων. Αποστείρωση του εργαστηριακού εξοπλισμού (λαβίδες, κρίκοι κτλ.). Σωστός χειρισμός εργαστηριακών μεσών και υλικών σύμφωνα με τα διεθνή πρωτόκολλα Μέθοδος Spread (Επιφανειακής επίστρωσης) Spread plate count είναι η επιφανειακή ανάπτυξη των μικροοργανισμών σε τρυβλία με θρεπτικό υλικό. Σύμφωνα με την τεχνική αυτή το αποστειρωμένο άγαρ απλώνεται σε τρυβλία petri και αφού κρυώσει και μονιμοποιηθεί είναι έτοιμο προς χρήση. Συνήθως, λαμβάνεται ποσότητα 0,1 ml και με τη βοήθεια του αποστειρωμένου spreader διανέμουμε το δείγμα με τους μικροοργανισμούς σε όλη την επιφάνεια του θρεπτικού μέσου. Αυτό το στάδιο είναι σημαντικό διότι πρέπει το υλικό μας να ομοιοκατανεμηθεί για να αναπτυχθούν μεμονωμένες, διακριτές, μετρήσιμες αποικίες. Στη συνέχεια, τα 70

71 τρυβλία τοποθετούνται στους κλιβάνους επώασης σε συγκεκριμένη θερμοκρασία και για συγκεκριμένο χρόνο ανάλογα με το είδος του μικροοργανισμού (Wise k., 2013). Εικόνα 25. Μέθοδος spread-plate. (Brock microbiology of microorganisms 11/e, Pearson prentice Hall) Μέθοδος διαδοχικών αραιώσεων Η μέθοδος αυτή πραγματοποιείται με σκοπό την απομόνωση ενός μικροοργανισμού σε καθαρή καλλιέργεια. Το αρχικό δείγμα κατά τη μέθοδο αυτή εμβολιάζεται συνήθως με τη χρήση πιπέτας και στη συνέχεια αραιώνεται όπως ακριβώς περιγράφεται στην παρακάτω εικόνα σε δοκιμαστικούς σωλήνες. Μετά από κάθε αραίωση ο κάθε δοκιμαστικός σωλήνας θα περιέχει το 1/10 μικροοργανισμών σε σχέση με τον προηγούμενο. Στη συνέχεια, δείγμα από κάθε αραίωση λαμβάνεται και ενοφθαλμίζεται σε τρυβλίο petri με το κατάλληλο θρεπτικό υλικό. Τέλος, η μέθοδος των διαδοχικών αραιώσεων χρησιμοποιείται έτσι ώστε οι αποικίες στα τρυβλία μας να είναι μετρήσιμες (Σαμολάδα & Κουτσουμάνης, 2011). Εικόνα 26. Μέθοδος διαδοχικών αραιώσεων. (Brock microbiology of microorganisms 11/e, Pearson prentice Hall). 71

72 2.2.4 Μέθοδος αναζωογόνησης Lenticule Η μέθοδος αυτή πραγματοποιείται έτσι ώστε να αναζωογονηθούν οι μικροοργανισμοί που βρίσκονται στην κατάψυξη αποθηκευμένοι και να χρησιμοποιηθούν για τον εμβολιασμό δειγμάτων κατά τη διάρκεια μίας πειραματικής διαδικασίας. Αρχικά, βγάζουμε το Lenticule από την κατάψυξη και το αφήνουμε για 15 λεπτά έτσι ώστε να αποκτήσει θερμοκρασία δωματίου. Στη συνέχεια, τοποθετούμε το Lenticule σε πωματισμένο δοκιμαστικό σωλήνα που περιέχει 10 ml peptone saline και το αφήνουμε για 30 λεπτά. Με το πέρας των 30 λεπτών κάνουμε καλό vortex έτσι ώστε να ομογενοποιηθεί πλήρως το διάλυμα μας με τον μικροοργανισμό. Τέλος, κάνουμε τις κατάλληλες αραιώσεις σύμφωνα με το πρωτόκολλο εργασίας μας Μέθοδος διήθησης από μεμβράνες (MF) Τα φίλτρα μεμβράνης που χρησιμοποιούνται στην μικροβιολογία του νερού είναι λεπτά, πορώδη προκαθορισμένου μεγέθους (0,45 μm). Χρησιμοποιώντας την τεχνική φίλτρου μεμβράνης το δείγμα διέρχεται διάμεσου της μεμβράνης, χρησιμοποιώντας χοάνη διηθήσεως και σύστημα κενού. Όλοι οι μικροοργανισμοί που περιέχονται στο δείγμα συγκεντρώνονται στην επιφάνεια της μεμβράνης. Στη συνέχεια, η μεμβράνη με τους παγιδευμένους μικροοργανισμούς τοποθετείται σε στερεό θρεπτικό υπόστρωμα σε τρυβλίο petri. Η διέλευση των θρεπτικών ουσιών μέσω της μεμβράνης κατά την επώαση διευκολύνει την ανάπτυξη των μικροοργανισμών με την μορφή αποικιών (cfu) στην ανώτερη επιφάνεια της μεμβράνης. Οι αποικίες που σχηματίζονται μπορούν εύκολα να μεταφερθούν σε μέσα επιβεβαίωσης. Η μέθοδος διήθησης από μεμβράνη είναι ιδιαίτερα αποτελεσματική και περιλαμβάνει λιγότερη προετοιμασία σε σχέση με τις άλλες μεθόδους. Τέλος, η μέθοδος αυτή χρησιμοποιείται σε βιομηχανίες νερού καθώς και σε βιομηχανίες φαρμάκων, καλλυντικών, τροφίμων και ποτών (Bartram & Ballance 1996, Harrigan, 1998). Εικόνα 27. Μέθοδος διήθησης από μεμβράνη. (Willey Joanne et al., 2013). 72

73 2.3 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ (Α) ΑΠΟΛΥΜΑΝΣΗ ME ΥΠΕΡΙΩΔΗ ΑΚΤΙΝΟΒΟΛΙΑ (UV) ΣΕ ΠΙΛΟΤΙΚΟ ΜΟΝΤΕΛΟ ΔΕΞΑΜΕΝΗΣ Γενικά στοιχεία Όγκος νερού δεξαμενής: 45 L. Η ένταση της UV λάμπας: 10W στα 254nm. Μία περισταλτική αντλία επανακυκλοφορούσε το νερό με ταχύτητα ροής 18L/h. Χρόνος πλήρους ανακυκλοφορίας νερού: 2,5h (Σύμφωνα με τη νομοθεσία περί κολυμβητικών δεξαμενών (ΦΕΚ 87/Β/ ) εξασφαλίζεται η πλήρης ανανέωση του νερού σε χρόνο λιγότερο των 4 ωρών). Τα δείγματα παραλαμβάνονταν από βρύση μεταξύ της εξόδου από την λάμπα UV και της εισόδου στην περισταλτική αντλία. Παραλαβή δειγμάτων: 7 cm κάτω από την επιφάνεια νερού. Καθ όλη τη διάρκεια του πειράματος η θερμοκρασία παρέμενε σταθερή με τη βοήθεια θερμοστάτη στους C. Το ph του νερού ρυθμιζόταν να βρίσκεται μεταξύ των τιμών 7,20 και 8,20 (ΦΕΚ 87/Β/ ) Στάδια πειραματικής διαδικασίας (UV). 1 η Ημέρα Προετοιμασία θρεπτικών υλικών και διαλυμάτων που χρησιμοποιήθηκαν κατά την πειραματική διαδικασία. Πλήρωση της δεξαμενής μας με 45 ltr απεσταγμένο νερό μέσω αποστειρωμένων σκευών και αποστειρώσαμε με τη μέθοδο της υγρής αποστείρωσης 1,8 ltr νερού τα οποία χρησιμοποιήθηκαν κατά τη διάρκεια του πειράματος. 2 η Ημέρα Ρυθμίστηκε το pη της δεξαμενής, το οποίο έπρεπε να κυμαίνεται από 7,2 έως 8,2 καθ όλη τη διάρκεια του πειράματος. Στη συνέχεια, κάναμε αναζωογόνηση του Lenticule ανάλογα με τον μικροοργανισμό που θα χρησιμοποιούσαμε. 73

74 Αναζωογόνηση lenticule E.coli Χρησιμοποιήθηκαν 3 lenticule. E. coli NCTC 9001 (1 lenticule = 2,5 *10 5, Range 1,1*10 5-5,9*10 5 ). Τοποθετήθηκαν τα 3 lenticule σε 10 ml peptone saline και πραγματοποιήθηκε μια αραίωση, δηλαδή από το αρχικό διάλυμα ελήφθησε 1 ml και τοποθετήθηκε σε 9 ml peptone saline. Ολοκληρώνοντας ρίξαμε την τελευταία αραίωση στην δεξαμενή μας. Αναμέναμε στα 45 L νερού της δεξαμενής να έχουμε ~75000 cfu. Αναμέναμε να έχουμε ~166 cfu/100 ml αρχικού δείγματος. Αναζωογόνηση lenticule S.aureus Χρησιμοποιήθηκαν 5 lenticule. S. aureus NCTC 6571 (1 lenticule =1,6*10 4, Range 7,2*10 3-3,4*10 4 ). Τοποθετήθηκαν τα 5 lenticule σε 10 ml peptone saline και δεν πραγματοποιήθηκαν αραιώσεις. Στη συνέχεια ρίξαμε το διάλυμα στη δεξαμενή μας. Αναμέναμε στα 45 L νερού της δεξαμενής να έχουμε cfu. Αναμέναμε να έχουμε ~177 cfu/100 ml αρχικού δείγματος. Αναζωογόνηση lenticule P. aeruginosa Χρησιμοποιήθηκαν 2 lenticule. P. aeruginosa NCTC (1 lenticule =8,2*10 3, Range 4,0*10 3-1,7*10 4 ). Τοποθετήθηκαν τα 2 lenticule σε 10 ml peptone saline και δεν πραγματοποιήθηκαν αραιώσεις. Στη συνέχεια ρίξαμε το διάλυμα στη δεξαμενή μας. Αναμέναμε στα 45 L νερού της δεξαμενής να έχουμε cfu. Αναμέναμε να έχουμε ~36 cfu/100 ml αρχικού δείγματος. Αναζωογόνηση lenticule E. faecalis Χρησιμοποιήθηκαν 6 lenticule. E. faecalis NCTC 775 (1 lenticule = 1,1*10 4, Range 5.5*10 3-2,6*10 4 ). 74

75 Τοποθετήθηκαν τα 6 lenticule σε 10 ml peptone saline και δεν πραγματοποιήθηκαν αραιώσεις. Στη συνέχεια ρίξαμε το διάλυμα στη δεξαμενή μας. Αναμέναμε στα 45 L νερού της δεξαμενής να έχουμε cfu. Αναμέναμε να έχουμε ~146 cfu/100 ml αρχικού δείγματος. Πάντα από την τελευταία αραίωση λαμβάναμε ποσότητα 0,1 ml με πιπέτα ακριβείας και κάναμε spread σε nutrient άγαρ για να επιβεβαιώσουμε την αναζωογόνηση των μικροοργανισμών. Στη συνέχεια, μετά την επιμόλυνση του νερού της δεξαμενής με τον εκάστοτε μικροοργανισμό, γινόταν η έναρξη λειτουργίας της ανακυκλοφορίας του νερού με κλειστή τη λάμπα UV για 2,5 ώρες, με σκοπό την πλήρη ανάμιξη του νερού με τον μικροοργανισμό. Μετά το πέρας των 2,5 ωρών άρχιζε η λειτουργία της λάμπας UV για 3 ώρες. Η παραλαβή των δειγμάτων πραγματοποιούνταν πάντα σε αποστειρωμένο μπουκάλι. Όλα τα δείγματα αμέσως μετά την παραλαβή τους από την δεξαμενή αναλύθηκαν σύμφωνα με τη μέθοδο της διήθησης από μεμβράνες (MF). Σε όλα τα δείγματα έγιναν δυο διηθήσεις από 100 ml η κάθε μια (Measurement 1&2). Μετά από την κάθε δειγματοληψία προστέθηκε ίδιος όγκος αποστειρωμένου νερού στη δεξαμενή μας. Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν δυο φορές για τον κάθε μικροοργανισμό. Στον παρακάτω πίνακα παρουσιάζονται αναλυτικά ο αριθμός των δειγματοληψιών που πραγματοποιήθηκαν κατά την πρώτη ημέρα του πειράματος καθώς και τα χρονικά διαστήματα μεταξύ τους. Αριθμός Ανακυκλοφορία Συνολικός όγκος E. coli ή Δειγματοληψιών /UV δειγματοληψίας/προσθήκης αποστειρωμένου νερού S. aureus ή P. aeruginosa ή E. faecalis 1 η Μετά από 2,5 h 200 ml 200 ml 0 min 2 η Ναι/ 15 min 200 ml 200 ml 3 η Ναι/ 30 min 200 ml 200 ml 4 η Ναι/ 1h 200 ml 200 ml 5 η Ναι/ 2h 200 ml 200 ml 6 η Ναι/ 3h 200 ml 200 ml Πίνακας 4. Πίνακας δειγματοληψίας-πρώτη ημέρα.(uv) 75

76 3 η Ημέρα Την επόμενη ημέρα πραγματοποιήθηκε παραλαβή του αρχικού δείγματος 200 ml με κλειστή την ανακυκλοφορία του νερού καθώς και της λάμπας UV, με ταυτόχρονη προσθήκη ίδιου όγκου αποστειρωμένου νερού. Στη συνέχεια, ξεκίνησε η λειτουργία της ανακυκλοφορίας του νερού καθώς και της λάμπας UV. Η παραλαβή των δειγμάτων έγινε σύμφωνα με τον παρακάτω πίνακα. Αριθμός Ανακυκλοφορία Συνολικός όγκος E. coli ή Δειγματοληψιών /UV δειγματοληψίας/προσθήκης αποστειρωμένου νερού S. aureus ή P. aeruginosa ή E. faecalis 1 η Όχι/Κλειστή/ 200 ml 200 ml 0 min 2 η Ναι/ 2,5 h 200 ml 200 ml 3 η Ναι/ 5 h 200 ml 200 ml Πίνακας 5. Πίνακας δειγματοληψίας-δεύτερη ημέρα.(uv) Όλα τα δείγματα αναλύθηκαν με τη μέθοδο διήθησης από μεμβράνη ακολουθώντας τα διεθνή πρωτόκολλα. Οι αναλύσεις για τον μικροοργανισμό E. coli πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με πρότυπο ISO :2000. Επώαση σε κλίβανο στους 37 0 C για 24 h. Οι αναλύσεις για τον μικροοργανισμό E. faecalis πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με πρότυπο ISO /2000. Επώαση σε κλίβανο στους 37 0 C για 48 h. Οι αναλύσεις για τον μικροοργανισμό P. aeruginosa πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με πρότυπο ISO 16266:2006. Επώαση σε κλίβανο στους 37 0 C για 48h. Για την απαρίθμηση των αποικιών χρησιμοποιήθηκε και συσκευή υπεριώδους ακτινοβολίας. Οι αναλύσεις για τον μικροοργανισμό S. aureus πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με πρότυπο HPA (2005). Επώαση σε κλίβανο στους 37 0 C για 48 h. 76

77 2.3.3 Στάδια πειραματικής διαδικασίας - Επιβίωση των μικροοργανισμών στο νερό, χωρίς UV. Για να προσδιοριστεί ακριβώς ποιες ήταν οι επιπτώσεις της υπεριώδους ακτινοβολίας στους μικροοργανισμούς πραγματοποιήθηκαν και πειράματα control, δηλαδή ακολουθήθηκε η πειραματική διαδικασία που αναφέρθηκε παραπάνω χωρίς να χρησιμοποιηθεί η λάμπα UV. Με τα πειράματα αυτά καθορίστηκε η επιβίωση των μικροοργανισμών στο νερό της δεξαμενής μας στις συγκεκριμένες συνθήκες. Τα πειράματα control πραγματοποιήθηκαν δύο φορές για τον κάθε μικροοργανισμό όπως και με την UV ακτινοβολία. Από τα αποτελέσματα που προέκυψαν από τα πειράματα control βγάλαμε τον μέσο όρο (Experiment 1&2), ούτως ώστε να υπάρχει ένα control για τον κάθε μικροοργανισμό. 77

78 2.4 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ (Β) ΑΠΟΛΥΜΑΝΣΗ ME ΥΠΕΡΗΧΟΥΣ (US) ΣΕ ΛΟΥΤΡΟ Στάδια πειραματικής διαδικασίας- Απολύμανση με υπέρηχους (US). Χρησιμοποιήθηκε ένα ποτήρι ζέσεως το οποίο πληρώθηκε με 500 ml αποστειρωμένου νερού. Ρυθμίστηκε το ph. μεταξύ των τιμών 7,2-8,2. Το λουτρό υπερήχων ρυθμίστηκε στα 80 KHz και στο 100% της ισχύος του. Η θερμοκρασία του λουτρού υπερήχων ρυθμίστηκε στους 30 0 C. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε αναζωογόνηση του Lenticule ανάλογα με τον μικροοργανισμό που χρησιμοποιήθηκε. Αναζωογόνηση lenticule E. coli Χρησιμοποιήθηκε 1 lenticule. E. coli NCTC 9001 (1 lenticule = 2,5 *10 5, Range 1,1*10 5-5,9*10 5 ) Τοποθετήθηκε το lenticule σε 10 ml peptone saline και πραγματοποιήθηκε μια αραίωση, δηλαδή από το αρχικό διάλυμα ελήφθησε 1ml και τoποθετήθηκε σε 9 ml peptone Saline. Έπειτα έγινε άλλη μια αραίωση, παίρνοντας 1 ml από την προηγούμενη αραίωση και τοποθετώντας την σε 9 ml peptone saline. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε αραίωση ½, δηλαδή ελήφθησαν 5 ml από την προηγουμένη αραίωση και τοποθετήθηκαν σε 5 ml peptone saline. Τέλος έγινε άλλη μία αραίωση ½, δηλαδή ελήφθησαν 5 ml από την προηγουμένη αραίωση και τοποθετήθηκαν σε 5 ml peptone saline. Ολοκληρώνοντας ρίξαμε την τελευταία αραίωση στο ποτήρι ζέσεως το οποίο περιείχε 490 ml απεσταγμένο νερό (490 ml ddh2o + 10 ml peptone saline = 500ml). Αναμέναμε να έχουμε 625 cfu στα 500 ml νερού. Αναμέναμε να έχουμε ~125 cfu/100 ml αρχικού δείγματος. Αναζωογόνηση lenticule S. aureus Χρησιμοποιήθηκε 1 lenticule. S. aureus NCTC 6571 (1 lenticule =1,6*10 4, Range 7,2*10 3-3,4*10 4 ). Τοποθετήθηκε το lenticule σε 10 ml peptone saline και πραγματοποιήθηκε μια αραίωση, δηλαδή από το αρχικό διάλυμα ελήφθησε 1ml και τoποθετήθηκε σε 9 78

79 ml peptone Saline. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε άλλη μια αραίωση ½ δηλαδή ελήφθησαν από την προηγουμένη αραίωση 5 ml και τοποθετήθηκαν σε 5 ml peptone saline. Ολοκληρώνοντας, ρίξαμε την τελευταία αραίωση στο ποτήρι ζέσεως το οποίο περιέχει 490 ml απεσταγμένο νερό.(490 ml ddh2o + 10 ml peptone saline = 500ml) Αναμέναμε να έχουμε ~800 cfu στα 500 ml νερού. Αναμέναμε να έχουμε ~160 cfu/100 ml αρχικού δείγματος. Στον παρακάτω πίνακα παρουσιάζονται αναλυτικά ο αριθμός των δειγματοληψιών που πραγματοποιήθηκαν κατά τη διάρκεια του πειράματος καθώς και τα χρονικά διαστήματα μεταξύ τους. Αριθμός Υπέρηχοι (US) Συνολικός όγκος E. coli ή S. aureus Δειγματοληψιών νερού/δειγματοληψία 1 η ΟΧΙ / 0 min 100 ml 100 ml 2 η ΝΑΙ / 15 min 200 ml 200 ml 3 η ΝΑΙ / 30 min 200ml 200 ml Πίνακας 6. Πίνακας δειγματοληψίας (US) Πραγματοποιήθηκαν πειράματα για δυο μικροοργανισμούς. Έναν gram + και έναν gram -. (E. coli & S. aureus). Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν δυο φορές για τον κάθε μικροοργανισμό. Όλα τα δείγματα αναλύονται με την μέθοδο διήθησης από μεμβράνη ακολουθώντας τα διεθνή πρωτόκολλα. Οι αναλύσεις για τον μικροοργανισμό E. Coli πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με πρότυπο ISO :2000. Επώαση σε κλίβανο στους 37 0 C για 24 h. Οι αναλύσεις για τον μικροοργανισμό S. aureus πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με πρότυπο HPA (2005). Επώαση σε κλίβανο στους 37 0 C για 48 h. 79

80 80

81 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 81

82 82

83 3.1 Αποτελέσματα πειραμάτων control. Για να προσδιοριστεί ακριβώς η βακτηριοκτόνος δράση της υπεριώδους ακτινοβολίας πραγματοποιήθηκαν πειράματα control. Ακολουθήθηκε δηλαδή η πειραματική διαδικασία χωρίς τη χρήση της λάμπας UV, προσδιορίζοντας έτσι την επιβίωση των μικροοργανισμών στο νερό στις συγκεκριμένες συνθήκες. DAY MINUTES TEMPERATURE EXP1 EXP2 EXPAVERAGE LOG LOG REDUCTION C ,77 0,00 0,00% C ,76-0,01-0,85% C ,74-0,03-1,72% C ,71-0,06-3,57% C ,69-0,08-4,55% C ,65-0,12-6,64% % Πίνακας 7. E. coli - Πείραμα control H20 % 0,00% -1,00% -2,00% -3,00% -4,00% -5,00% -6,00% -7,00% 1 η Ημέρα 0,00% -0,85% -1,72% -3,57% -4,55% -6,64% minutes Γράφημα 1. Ποσοστιαία μείωση του μικροοργανισμού E. coli κατά την πρώτη ημέρα του πειράματος control Όπως παρατηρούμε και στον πίνακα 7 / γράφημα 1, ο μικροοργανισμός Ε. coli παρουσίασε μείωση κατά 6,64% σε σχέση με το αρχικό φορτίο κατά την πρώτη ημέρα διεξαγωγής του πειράματος. 83

84 DAY MINUTES TEMPERATURE EXP1 EXP2 EXPAVERAGE LOG LOG REDUCTION C ,45-0,32-18,28% C ,46-0,31-17,42% C ,40-0,37-21,06% % Πίνακας 8. E. coli - Πείραμα control H20 0,00% 2 η Ημέρα -5,00% -10,00% % -15,00% -20,00% -18,28% -17,42% -21,06% -25,00% minutes Γράφημα 2. Ποσοστιαία μείωση του μικροοργανισμού E. coli κατά την δεύτερη ημέρα του πειράματος control Τη δεύτερη ημέρα διεξαγωγής του πειράματος η μείωση του μικροοργανισμού E. coli συνεχίστηκε όπως παρατηρούμε και στον πίνακα 8 / γράφημα 2. Στο τέλος της δεύτερης ημέρας η μείωση έφτασε 21.06% σε σχέση με το αρχικό φορτίο. 84

85 % DAY MINUTES TEMPERATURE EXP1 EXP2 EXPAVERAGE LOG LOG REDUCTION C ,76 0,00 0,00% C ,73-0,03-1,76% C ,72-0,05-2,69% C ,68-0,08-4,66% C ,64-0,12-6,80% C ,63-0,13-7,37% % Πίνακας 9. S. aureus -Πείραμα control H2O 0,00% -1,00% -2,00% -3,00% -4,00% -5,00% -6,00% -7,00% -8,00% 1 η Ημέρα 0,00% -1,76% -2,69% -4,66% -6,80% -7,37% minutes Γράφημα 3. Ποσοστιαία μείωση του μικροοργανισμού S. aureus κατά την πρώτη ημέρα διεξαγωγής του πειράματος control Ο μικροοργανισμός S. aureus, όπως παρατηρούμε και στον πίνακα 9 / γράφημα 3 παρουσίασε μείωση κατά 7,37% σε σχέση με το αρχικό φορτίο κατά την πρώτη ημέρα διεξαγωγής του πειράματος control. 85

86 % DAY MINUTES TEMPERATURE EXP1 EXP2 EXPAVERAGE LOG LOG REDUCTION C ,36-0,40-22,78% C ,28-0,45-25,72% C ,20-0,51-29,03% % Πίνακας 10. S. aureus - Πείραμα control H2O 0,00% -5,00% -10,00% -15,00% 2 η Ημέρα -20,00% -25,00% -30,00% -22,78% -25,72% -29,03% -35,00% minutes Γράφημα 4. ποσοστιαία μείωση του μικροοργανισμού S.aureus κατά την δεύτερη ημέρα διεξαγωγής του πειράματος control Ο μικροοργανισμός S.aureus κατά τη δεύτερη ημέρα διεξαγωγής του πειράματος control παρουσίασε μείωση όπως παρατηρούμε στον πίνακα 10 / γράφημα 4. Η μείωση έφτασε το 29,03% σε σχέση με το αρχικό φορτίο. 86

87 DAY MINUTES TEMPERATURE EXP1 EXP2 EXPAVERAGE LOG LOG REDUCTION C ,14 0,00 0,00% C ,15 0,01 0,43% C ,16 0,02 0,86% C ,19 0,04 2,08% C ,19 0,05 2,34% C ,21 0,07 3,10% % Πίνακας 11. P. aeruginosa - Πείραμα control H20 3,50% 3,00% 1η Ημέρα 3,10% % 2,50% 2,00% 1,50% 2,08% 2,34% 1,00% 0,50% 0,43% 0,86% 0,00% 0,00% minutes Γράφημα 5. Ποσοστιαία μεταβολή του μικροοργανισμού P. aeruginosa κατά την πρώτη ημέρα διεξαγωγής του πειράματος control. Ο μικροοργανισμός P. aeruginosa, όπως παρατηρούμε και στον πίνακα 11 / γράφημα 5 παρουσίασε ανάπτυξη κατά 3,10% σε σχέση με το αρχικό φορτίο κατά την πρώτη ημέρα διεξαγωγής του πειράματος. 87

88 DAY MINUTES TEMPERATURE EXP1 EXP2 EXPAVERAGE LOG LOG REDUCTION C ,28 0,14 6,33% C ,29 0,14 6,76% C ,30 0,16 7,27% % Πίνακας 12. P. aeruginosa - Πείραμα control H20 7,40% 7,20% 7,00% 2η Ημέρα 7,27% % 6,80% 6,60% 6,76% 6,40% 6,20% 6,33% 6,00% 5,80% minutes Γράφημα 6. Ποσοστιαία μεταβολή του μικροοργανισμού P. aeruginosa κατά την δεύτερη ημέρα διεξαγωγής του πειράματος control. Στον πίνακα 12 και στο γράφημα 6 παρατηρούμε ότι η ανάπτυξη του μικροοργανισμού P.aeruginosa συνεχίστηκε και τη δεύτερη ημέρα φτάνοντας το 7,27 % σε σχέση με το αρχικό φορτίο. 88

89 DAY MINUTES TEMPERATURE EXP1 EXP2 EXPAVERAGE LOG LOG REDUCTION C ,07 0,00 0,00% C ,07 0,00 0,00% C ,06-0,01-0,55% C ,05-0,02-1,11% C ,04-0,03-1,49% C ,02-0,05-2,47% % Πίνακας 13. E. faecalis - Πείραμα control H20 0,00% 0,00% 0,00% 1 η Ημέρα -0,50% -0,55% -1,00% -1,11% % -1,50% -1,49% -2,00% -2,50% -2,47% -3,00% minutes Γράφημα 7. Ποσοστιαία μείωση του μικροοργανισμού E. faecalis κατά την πρώτη ημέρα διεξαγωγής του πειράματος control Όσον αφορά το μικροοργανισμό E. faecalis, όπως παρατηρούμε και στον πίνακα 13 / γράφημα 7 παρουσίασε μείωση κατά 2,47% σε σχέση με το αρχικό φορτίο κατά την πρώτη ημέρα διεξαγωγής του πειράματος. 89

90 DAY MINUTES TEMPERATURE EXP1 EXP2 EXPAVERAGE LOG LOG REDUCTION C ,92-0,14-6,96% C ,90-0,17-7,98% C ,88-0,19-9,06% % Πίνακας 14. E. faecalis - Πείραμα control H20 % 0,00% -1,00% -2,00% -3,00% -4,00% -5,00% -6,00% -7,00% -8,00% -9,00% -10,00% 2 η Ημέρα -6,96% -7,98% -9,06% minutes Γράφημα 8. Ποσοστιαία μείωση του μικροοργανισμού Ε. faecalis κατά την δεύτερη ημέρα διεξαγωγής του πειράματος control. Ο μικροοργανισμός E. faecalis και τη δεύτερη ημέρα διεξαγωγής του πειράματος παρουσίασε μείωση όπως παρατηρούμε στον πίνακα 14/ γράφημα 8. Η μείωση έφτασε στο 9,06% σε σχέση με το αρχικό φορτίο. Στα πειράματα control που πραγματοποιήθηκαν όλοι οι μικροοργανισμοί παρουσίασαν μείωση στις συγκεκριμένες συνθήκες εκτός από τον μικροοργανισμό P. aeruginosa ο οποίος παρουσίασε ανάπτυξη. Την μικρότερη μείωση παρουσίασε ο μικροοργανισμός E. faecalis ενώ η μεγαλύτερη μείωση παρατηρήθηκε στο βακτήριο S. aureus. 90

91 % 3.2 Αποτελέσματα πειραμάτων με την χρήση υπεριώδους ακτινοβολίας (UV). DAY MINUTES TEMPERATURE Meas.1 Meas.2 AVERAGE LOG LOG REDUCTION C ,48 0 0,00% C ,38-0,10-6,55% C ,2-0,27-18,45% C ,04-0,44-29,44% C ,9-0,57-38,79% C ,3-1,18-79,47% % Πίνακας 15. E. coli - Πείραμα 1 - Ultraviolet disinfection. 0% -10% -20% -30% -40% -50% 1η ημέρα 0,00% 0% -0,85% -6,55% -1,72% -3,57% -4,55% -18,45% -29,44% -38,79% -6,64% -60% -70% -80% e.coli uv e.coli control -79,47% -90% minutes Γράφημα 9. Ποσοστιαία μείωση του μικροοργανισμού E. coli με υπεριώδη ακτινοβολία μετά από 180 λεπτά, κατά την πρώτη ημέρα διεξαγωγής του πειράματος 1. Όπως βλέπουμε και στο πίνακα 15 / γράφημα 9 ο μικροοργανισμός E.coli κατά την πρώτη ημέρα, στο πείραμα 1 παρουσίασε μείωση 79,47% μετά από τρείς ώρες υπεριώδους ακτινοβολίας. Στο ποσοστό αυτό εμπεριέχεται και η φυσιολογική θανάτωση του μικροοργανισμού, οπότε αφαιρώντας το ποσοστό από τα πειράματα control παρατηρούμε ότι η ουσιαστική μείωση από την υπεριώδη ακτινοβολία είναι 72,35%. 91

92 DAY MINUTES TEMPERATURE Meas.1 Meas.2 AVERAGE LOG LOG REDUCTION C ,00-1,48-100% C ,00-1,48-100% C ,00-1,48-100% % Πίνακας 16. E. coli - Πείραμα 1 - Ultraviolet disinfection. 0% 2η Ημέρα -20% -18,28% -17,42% -21,06% -40% % -60% e.coli uv e.coli control -80% -100% -100% -100% -100% -120% minutes Γράφημα 10. Ποσοστιαία μείωση του μικροοργανισμού E. coli με υπεριώδη ακτινοβολία μετά από 300 λεπτά κατά την δεύτερη ημέρα διεξαγωγής του πειράματος 1. Όπως παρατηρούμε και στον πίνακα 16 / γράφημα 10 τη δεύτερη ημέρα ο μικροοργανισμός E. coli δεν παρουσίασε καμία μεταβολή καθώς καθόλη τη διάρκεια του πειράματος οι τιμές ήταν μηδενικές. 92

93 DAY MINUTES TEMPERATURE Meas.1 Meas.2 AVERAGE LOG LOG REDUCTION C ,62 0,00 0,00% C ,60-0,02-1,43% C ,53-0,09-6,20% C ,41-0,21-14,07% C ,20-0,42-28,31% C ,60-1,02-68,99% % Πίνακας 17. E. coli - Πείραμα 2 - Ultraviolet disinfection. 1η Ημέρα 0% -10% -20% 0,00% 0% -1,43% -0,85% -1,72% -6,20% -3,57% -4,55% -14,07% -6,64% -30% -28,31% % -40% -50% -60% -70% e.coli uv e.coli control -68,99% -80% minutes Γράφημα 11. Ποσοστιαία μείωση του μικροοργανισμού E. coli με υπεριώδη ακτινοβολία μετά από 180 λεπτά κατά την πρώτη ημέρα διεξαγωγής του πειράματος 2. Όπως βλέπουμε και στο πίνακα 17 / γράφημα 11 ο μικροοργανισμός E.coli κατά την πρώτη ημέρα, στο πείραμα 2 παρουσίασε μείωση 68,99% μετά από τρείς ώρες υπεριώδους ακτινοβολίας. Στο ποσοστό αυτό εμπεριέχεται και η φυσιολογική θανάτωση του μικροοργανισμού, οπότε αφαιρώντας το ποσοστό από τα πειράματα control παρατηρούμε ότι η ουσιαστική μείωση από την υπεριώδη ακτινοβολία είναι 62,35%. 93

94 DAY MINUTES TEMPERATURE Meas.1 Meas.2 AVERAGE LOG LOG REDUCTION C ,78-0,85-52,47% C ,00-1,62-100,00% C ,00-1,62-100,00% % Πίνακας 18. E. coli - Πείραμα 2 - Ultraviolet disinfection. 0,00% 2η Ημέρα -20,00% -18,28% -17,42% -21,06% -40,00% % -60,00% -52,47% -80,00% -100,00% -120,00% -100,00% -100,00% e.coli uv e.coli control minutes Γράφημα 12. Ποσοστιαία μείωση του μικροοργανισμού E. coli με υπεριώδη ακτινοβολία μετά από 300 λεπτά κατά την δεύτερη ημέρα διεξαγωγής του πειράματος 2. Όπως παρατηρούμε και στον πίνακα 18 / γράφημα 12 κατά τη δεύτερη ημέρα του πειράματος 2, ο μικροοργανισμός E. coli μειώθηκε 100% μετά από 150 λεπτά σε σχέση με το αρχικό φορτίο. Αφαιρώντας το ποσοστό από το πείραμα control παρατηρούμε ότι η ουσιαστική μείωση ήταν 82,58% μετα από 5,5 ώρες υπεριώδους ακτινοβολίας (UV). 94

95 DAY MINUTES TEMPERATURE Meas.1 Meas.2 AVERAGE LOG LOG REDUCTION C ,66 0,00 0,00% C ,61-0,05-3,01% C ,57-0,09-5,70% C ,38-0,28-17,02% C ,26-0,41-24,55% C ,60-1,06-63,90% % Πίνακας 19. S. aureus - Πείραμα 1 - Ultraviolet disinfection. 0,00% -10,00% 0,00% 1η Ημέρα -3,01% -1,76% -2,69% -5,70% -4,66% -6,80% -7,37% % -20,00% -30,00% -40,00% -17,02% -24,55% -50,00% -60,00% -70,00% s.aureus uv s.aureus control -63,90% minutes Γράφημα 13. Ποσοστιαία μείωση του μικροοργανισμού S. aureus με υπεριώδη ακτινοβολία μετά από 180 λεπτά κατά την πρώτη ημέρα διεξαγωγής του πειράματος 1. Όπως βλέπουμε και στο πίνακα 19 / γράφημα 13 ο μικροοργανισμός S.aureus κατά την πρώτη ημέρα, στο πείραμα 1 παρουσίασε μείωση 63,90% μετά από τρείς ώρες υπεριώδους ακτινοβολίας. Στο ποσοστό αυτό εμπεριέχεται και η φυσιολογική θανάτωση του μικροοργανισμού, οπότε αφαιρώντας το ποσοστό από τα πειράματα control παρατηρούμε ότι η ουσιαστική μείωση από την υπεριώδη ακτινοβολία είναι 56,53%. 95

96 DAY MINUTES TEMPERATURE Meas.1 Meas.2 AVERAGE LOG LOG REDUCTION C ,00-1,66-100,00% C ,00-1,66-100,00% C ,00-1,66-100,00% % Πίνακας 20. S. aureus - Πείραμα 1 - Ultraviolet disinfection 0,00% 2η Ημέρα -20,00% -22,78% -25,72% -29,03% -40,00% % -60,00% s.aureus uv s.aureus control -80,00% -100,00% -100,00% -100,00% -100,00% -120,00% minutes Γράφημα 14. Ποσοστιαία μείωση του μικροοργανισμού S.aureus με υπεριώδη ακτινοβολία μετά από 300 λεπτά κατά την δεύτερη ημέρα διεξαγωγής του πειράματος 1. Όπως παρατηρούμε και στον πίνακα 20 / γράφημα 14 τη δεύτερη ημέρα του πειράματος 1, ο μικροοργανισμός S. aureus δεν παρουσίασε καμία μεταβολή καθώς καθόλη τη διάρκεια του πειράματος οι τιμές ήταν μηδενικές. 96

97 DAY MINUTES TEMPERATURE Meas.1 Meas.2 AVERAGE LOG LOG REDUCTION C ,56 0,00 0,00% C ,52-0,04-2,42% C ,41-0,14-9,06% C ,32-0,23-15,01% C ,11-0,44-28,36% C ,85-0,71-45,59% % Πίνακας 21. S. aureus - Πείραμα 2 - Ultraviolet disinfection 1η Ημέρα % 0,00% -5,00% -10,00% -15,00% -20,00% -25,00% -30,00% -35,00% -40,00% -45,00% -50,00% 0,00% -2,42% -1,76% -2,69% -4,66% -6,80% -7,37% -9,06% -15,01% -28,36% s.aureus uv s.aureus control -45,59% minutes Γράφημα 15. Ποσοστιαία μείωση του μικροοργανισμού S. aureus με υπεριώδη ακτινοβολία μετά από 180 λεπτά κατά την πρώτη ημέρα διεξαγωγής του πειράματος 2. Όπως βλέπουμε και στον πίνακα 21 / γράφημα 15 ο μικροοργανισμός S. aureus κατά την πρώτη ημέρα, στο πείραμα 2 παρουσίασε μείωση 45,59% μετά από τρείς ώρες υπεριώδους ακτινοβολίας. Στο ποσοστό αυτό εμπεριέχεται και η φυσιολογική θανάτωση του μικροοργανισμού, οπότε αφαιρώντας το ποσοστό από τα πειράματα control παρατηρούμε ότι η ουσιαστική μείωση από την υπεριώδη ακτινοβολία είναι 38,22%. 97

98 DAY MINUTES TEMPERATURE Meas.1 Meas.2 AVERAGE LOG LOG REDUCTION C ,00-1,56-100% C ,00-1,56-100% C ,00-1,56-100% % Πίνακας 22. S. aureus - Πείραμα 2 - Ultraviolet disinfection. 2η Ημέρα 0% -20% -22,78% -25,72% -29,03% -40% % -60% -80% s.aureus uv s.aureus control -100% -100% -100% -100% -120% minutes Γράφημα 16. Ποσοστιαία μείωση του μικροοργανισμού S.aureus με υπεριώδη ακτινοβολία μετά από 300 λεπτά κατά την δεύτερη ημέρα διεξαγωγής του πειράματος 2. Όπως παρατηρούμε και στον πίνακα 22 / γράφημα 16 τη δεύτερη ημέρα του πειράματος 2, ο μικροοργανισμός S. aureus δεν παρουσίασε καμία μεταβολή καθώς καθόλη τη διάρκεια του πειράματος οι τιμές ήταν μηδενικές. 98

99 DAY MINUTES TEMPERATURE Meas.1 Meas.2 AVERAGE LOG LOG REDUCTION C ,19 0,00 0,00% C ,17-0,02-0,78% C ,18-0,01-0,52% C ,18-0,01-0,39% C ,15-0,04-1,88% C ,10-0,09-4,27% % Πίνακας 23. P. aeruginosa - Πείραμα 1 - Ultraviolet disinfection. 1η Ημέρα 4,00% 3,00% 2,00% 2,08% 2,34% 3,10% % 1,00% 0,00% -1,00% -2,00% -3,00% -4,00% -5,00% 0,00% 0,43% 0,86% -0,78% -0,52% -0,39% -1,88% p.aeruginosa uv p.aeruginosa control -4,27% minutes Γράφημα 17. Ποσοστιαία μείωση του μικροοργανισμού P.aeruginosa με υπεριώδη ακτινοβολία μετά από 180 λεπτά κατά την πρώτη ημέρα διεξαγωγής του πειράματος 1. Όπως παρατηρούμε στον πίνακα 23 / γράφημα 17 ο μικροοργανισμός P. aeruginosa παρουσίασε μείωση 4,27% μετά από τρείς ώρες υπεριώδους ακτινοβολίας (UV) κατά την πρώτη ημέρα διεξαγωγής του πειράματος 1. Ο μικροοργανισμός P. aeruginosa ήταν ο μόνος ο οποίος παρουσίασε αύξηση στα πειράματα control. Οπότε προσθέτοντας τα ποσοστά από τα πειράματα control παρατηρούμε ότι η ουσιαστική μείωση του μικροοργανισμού από την υπεριώδη ακτινοβολία (UV) ήταν 7,37%. 99

100 DAY MINUTES TEMPERATURE Meas.1 Meas.2 AVERAGE LOG LOG REDUCTION C ,26 0,06 2,97% C ,17-0,02-0,78% C ,11-0,08-3,80% % Πίνακας 24. P. aeruginosa - Πείραμα 1 - Ultraviolet disinfection. 2η Ημέρα 8,00% 6,00% 6,33% 6,76% 7,27% % 4,00% 2,00% 0,00% -2,00% -4,00% 2,97% p.aeruginosa uv -0,78% p.aeruginosa control -3,80% -6,00% 0 minutes Γράφημα 18. Ποσοστιαία μείωση του μικροοργανισμού P.aeruginosa με υπεριώδη ακτινοβολία μετά από 300 λεπτά κατά την δεύτερη ημέρα διεξαγωγής του πειράματος 1. Όπως παρατηρούμε στον πίνακα 24 / γράφημα 18 ο μικροοργανισμός P. aeruginosa παρουσίασε μείωση 3.80% κατά τη δεύτερη ημέρα διεξαγωγής του πειράματος 1. Προσθέτοντας τα ποσοστά από τα πειράματα control, λόγω της αύξησης που σημειώθηκε, παρατηρούμε ότι η ουσιαστική μείωση του μικροοργανισμού από την υπεριώδη ακτινοβολία (UV) ήταν %. 100

101 DAY MINUTES TEMPERATURE Meas.1 Meas.2 AVERAGE LOG LOG REDUCTION C ,27 0,00 0,00% C ,26-0,01-0,42% C ,26-0,01-0,42% C ,25-0,02-0,85% C ,23-0,04-1,73% C ,19-0,07-3,26% % Πίνακας 25. P. aeruginosa - Πείραμα 2 - Ultraviolet disinfection 4,00% 1η Ημέρα 3,00% 3,10% 2,00% 2,08% 2,34% % 1,00% 0,00% -1,00% 0,00% 0,43% 0,86% -0,42% -0,42% -0,85% -2,00% -3,00% -4,00% -1,73% p.aeruginosa uv p.aeruginosa control -3,26% minutes Γράφημα 19. Ποσοστιαία μείωση του μικροοργανισμού P.aeruginosa με υπεριώδη ακτινοβολία μετά από 180 λεπτά κατά την πρώτη ημέρα διεξαγωγής του πειράματος 2. Όπως παρατηρούμε στον πίνακα 25 / γράφημα 19 ο μικροοργανισμός P. aeruginosa παρουσίασε μείωση 3,26% μετά από τρείς ώρες υπεριώδους ακτινοβολίας (UV) κατά την πρώτη ημέρα διεξαγωγής του πειράματος 2. Ο μικροοργανισμός P. aeruginosa ήταν ο μόνος ο οποίος παρουσίασε αύξηση στα πειράματα control. Οπότε προσθέτοντας τα ποσοστά από τα πειράματα control παρατηρούμε ότι η ουσιαστική μείωση του μικροοργανισμού από την UV ακτινοβολία ήταν 6,36%. 101

102 DAY MINUTES TEMPERATURE Meas.1 Meas.2 AVERAGE LOG LOG REDUCTION C ,27 0,00 0,00% C ,20-0,06-2,64% C ,15-0,12-5,29% % Πίνακας 26. P. aeruginosa - Πείραμα 2 - Ultraviolet disinfection. 8,00% 6,00% 6,33% 2η Ημέρα 6,76% 7,27% 4,00% 2,00% % 0,00% 0,00% p.aeruginosa uv p.aeruginosa control -2,00% -4,00% -6,00% -2,64% -5,29% minutes Γράφημα 20. Ποσοστιαία μείωση του μικροοργανισμού P.aeruginosa με υπεριώδη ακτινοβολία μετά από 300 λεπτά κατά την δεύτερη ημέρα διεξαγωγής του πειράματος 2. Όπως παρατηρούμε στον πίνακα 26 / γράφημα 20 ο μικροοργανισμός P. aeruginosa παρουσίασε μείωση 5,29% κατά τη δεύτερη ημέρα διεξαγωγής του πειράματος 2. Προσθέτοντας τα ποσοστά από τα πειράματα control, λόγω της αύξησης που σημειώθηκε, παρατηρούμε ότι η ουσιαστική μείωση του μικροοργανισμού από την υπεριώδη ακτινοβολία (UV) ήταν 12,56%. 102

103 DAY MINUTES TEMPERATURE Meas.1 Meas.2 AVERAGE LOG LOG REDUCTION C ,06 0,00 0,00% C ,97-0,09-4,48% C ,92-0,14-6,62% C ,86-0,20-9,87% C ,75-0,31-15,17% C ,66-0,40-19,32% % Πίνακας 27. E. Faecalis - Πείραμα 1 - Ultraviolet disinfection. 1η Ημέρα 0,00% -5,00% -10,00% % -15,00% 0,00% 0,00% -0,55% -1,11% -1,49% -4,48% -6,62% -9,87% -15,17% -2,47% -20,00% E.faecalis uv E.faecalis control -19,32% -25,00% minutes Γράφημα 21. Ποσοστιαία μείωση του μικροοργανισμού E. faecalis με υπεριώδη ακτινοβολία μετά από 180 λεπτά κατά την πρώτη ημέρα διεξαγωγής του πειράματος 1. Όπως βλέπουμε και στον πίνακα 27 /γράφημα 21 ο μικροοργανισμός E. faecalis κατά την πρώτη ημέρα, στο πείραμα 1 παρουσίασε μείωση 19,32% μετά από τρείς ώρες υπεριώδους ακτινοβολίας. Στο ποσοστό αυτό εμπεριέχεται και η φυσιολογική θανάτωση του μικροοργανισμού, οπότε αφαιρώντας το ποσοστό από τα πειράματα control παρατηρούμε ότι η ουσιαστική μείωση από την υπεριώδη ακτινοβολία (UV) είναι 16.85%. 103

104 DAY MINUTES TEMPERATURE Meas.1 Meas.2 AVERAGE LOG LOG REDUCTION C ,65-0,41-19,78% C ,26-0,81-39,10% C ,85-1,22-59,01% % Πίνακας 28. E. Faecalis - Πείραμα 1 - Ultraviolet disinfection. 0,00% 2η Ημέρα -10,00% -6,96% -7,98% -9,06% -20,00% -19,78% % -30,00% -40,00% -39,10% -50,00% -60,00% E. faecalis uv E.faecalis control -59,01% -70,00% minutes Γράφημα 22. Ποσοστιαία μείωση του μικροοργανισμού E. faecalis με υπεριώδη ακτινοβολία μετά από 300 λεπτά κατά την δεύτερη ημέρα διεξαγωγής του πειράματος 1. Όπως παρατηρούμε και στον πίνακα 28 / γράφημα 22 ο μικροοργανισμός E. faecalis τη δεύτερη ημέρα διεξαγωγής του πειράματος 1, παρουσίασε μείωση 59,01% μετά από 480 λεπτα έκθεσης σε υπεριώδη ακτινοβολία (UV). Αφαιρώντας το ποσοστό από τα πειράματα control παρατηρούμε ότι η ουσιαστική μείωση από την υπεριώδη ακτινοβολία (UV) είναι 49,95%. 104

105 DAY MINUTES TEMPERATURE Meas.1 Meas.2 AVERAGE LOG LOG REDUCTION % C ,09 0,00 0,00% C ,04-0,05-2,34% C ,99-0,10-4,76% C ,91-0,18-8,51% C ,80-0,29-13,73% C ,72-0,37-17,72% Πίνακας 29. E. Faecalis - Πείραμα 2 - Ultraviolet disinfection. 1η Ημέρα 0,00% -2,00% -4,00% -6,00% 0,00% 0,00% -2,34% -0,55% -4,76% -1,11% -1,49% -2,47% -8,00% % -10,00% -8,51% -12,00% -14,00% -13,73% -16,00% E.faecalis uv E.faecalis control -18,00% -17,72% -20,00% minutes Γράφημα 23. Ποσοστιαία μείωση του μικροοργανισμού E. faecalis με υπεριώδη ακτινοβολία μετά από 180 λεπτά κατά την πρώτη ημέρα διεξαγωγής του πειράματος 2. Όπως βλέπουμε και στον πίνακα 29 / γράφημα 23 ο μικροοργανισμός E. faecalis κατά την πρώτη ημέρα, στο πείραμα 2 παρουσίασε μείωση 17,72% μετά από τρείς ώρες υπεριώδους ακτινοβολίας. Στο ποσοστό αυτό εμπεριέχεται και η φυσιολογική θανάτωση του μικροοργανισμού, οπότε αφαιρώντας το ποσοστό από τα πειράματα control παρατηρούμε ότι η ουσιαστική μείωση από την υπεριώδη ακτινοβολία (UV) είναι 15,25%. 105

106 DAY MINUTES TEMPERATURE Meas.1 Meas.2 AVERAGE LOG LOG REDUCTION C ,68-0,41-19,38% C ,36-0,72-34,67% C ,00-1,09-51,98% % Πίνακας 30. E. Faecalis - Πείραμα 2 - Ultraviolet disinfection. 0,00% 2η Ημέρα -10,00% -6,96% -7,98% -9,06% -20,00% -19,38% % -30,00% -40,00% -34,67% -50,00% E.faecalis uv E.faecalis control -51,98% -60,00% minutes Γράφημα 24. Ποσοστιαία μείωση του μικροοργανισμού E. faecalis με υπεριώδη ακτινοβολία μετά από 300 λεπτά κατά την δεύτερη ημέρα διεξαγωγής του πειράματος 2. Όπως παρατηρούμε και στον πίνακα 30 / γράφημα 24 ο μικροοργανισμός E. faecalis τη δεύτερη ημέρα διεξαγωγής του πειράματος 2, παρουσίασε μείωση 51.98% μετά από 480 λεπτά έκθεσης σε υπεριώδη ακτινοβολία. Αφαιρώντας το ποσοστό από τα πειράματα control παρατηρούμε ότι η ουσιαστική μείωση από την υπεριώδη ακτινοβολία είναι 42,92%. 106

107 3.3 Αποτελέσματα πειραμάτων με την χρήση υπερήχων (US). DAY MINUTES TEMPERATURE Meas.1 Meas.2 AVERAGE LOG LOG REDUCTION C ,15 0, C ,01-0, C ,74-0,41 % 0,00% -6,51% -19,07% Πίνακας 31. E. coli - Πείραμα 1 Ultrasound. 0,00% 0,00% -5,00% -6,51% % -10,00% -15,00% -20,00% -19,07% -25,00% minutes Γράφημα 25. Ποσοστιαία μείωση του μικροοργανισμού E. coli με υπέρηχους μετά από 30 λεπτά (Πείραμα 1). Όπως παρατηρούμε και στον πίνακα 31 / γράφημα 25 ο μικροοργανισμός E. coli μετά από 30 λεπτά απολύμανσης με υπέρηχους (US) στο πρώτο πείραμα, παρουσίασε μείωση 19.07% σε σχέση με το αρχικό φορτίο. 107

108 DAY MINUTES TEMPERATURE Meas.1 Meas.2 AVERAGE LOG LOG REDUCTION C ,31 0,00 0,00% C ,16-0,16-6,86% C ,03-0,28-12,14% % Πίνακας 32. E. coli - Πείραμα 2 Ultrasound 0,00% 0,00% -2,00% -4,00% % -6,00% -8,00% -6,86% -10,00% -12,00% -14,00% -12,14% minutes Γράφημα 26. Ποσοστιαία μείωση του μικροοργανισμού E. coli με υπέρηχους μετά από 30 λεπτά (Πείραμα 2). Όπως παρατηρούμε και στον πίνακα 32 / γράφημα 26 ο μικροοργανισμός E. coli μετά από 30 λεπτά απολύμανσης με υπέρηχους (US) στο δεύτερο πείραμα, παρουσίασε μείωση 12,14% σε σχέση με το αρχικό φορτίο. 108

109 DAY MINUTES TEMPERATURE Meas.1 Meas.2 AVERAGE LOG LOG REDUCTION C ,77 0,00 0,00% C ,62-0,15-8,34% C ,90-0,87-49,03% % Πίνακας 33. S. aureus Πείραμα 1 Ultrasound 0,00% 0,00% -10,00% -8,34% -20,00% % -30,00% -40,00% -50,00% -49,03% -60,00% minutes Γράφημα 27. Ποσοστιαία μείωση του μικροοργανισμού S.aureus με υπέρηχους μετά από 30 λεπτά (Πείραμα 1). Όπως παρατηρούμε και στον πίνακα 33 / γράφημα 27 ο μικροοργανισμός S. aureus μετά από 30 λεπτά απολύμανσης με υπέρηχους στο πρώτο πείραμα, παρουσίασε μείωση 49.03% σε σχέση με το αρχικό φορτίο. 109

110 DAY MINUTES TEMPERATURE Meas.1 Meas.2 AVERAGE LOG LOG REDUCTION C ,83 0,00 0,00% C ,41-0,42-22,82% C ,85-0,99-53,96% % Πίνακας 34. S. aureus - Πείραμα 2 - Ultrasound 0% 0% -10% -20% -22,82% % -30% -40% -50% -60% -53,96% minutes Γράφημα 28. Ποσοστιαία μείωση του μικροοργανισμού S. aureus με υπέρηχους μετά από 30 λεπτά (Πείραμα 2). Όπως παρατηρούμε και στον πίνακα 34 / γράφημα 28 ο μικροοργανισμός S. aureus μετά από 30 λεπτά απολύμανσης με υπέρηχους (US) στο δεύτερο πείραμα, παρουσίασε μείωση 53,96% σε σχέση με το αρχικό φορτίο. 110

111 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 Ο Συμπεράσματα και συζήτηση 111

112 112

113 Συμπεράσματα γενικές διαπιστώσεις Η απολύμανση του νερού είναι υψίστης σημασίας για όλους τους τύπους κολυμβητικών δεξαμενών, είτε είναι δημόσιες είτε ιδιωτικές. Η αποδοτική απολύμανση του νερού των κολυμβητικών δεξαμενών είναι σημαντική καθώς όλοι οι κολυμβητές έχουν δικαίωμα για άσκηση και ψυχαγωγία σε ασφαλείς και υγειονομικά αποδεκτές εγκαταστάσεις που δε δημιουργούν υγειονομικό κίνδυνο. Στη σύγχρονη εποχή τα χημικά απολυμαντικά (π.χ χλώριο) είναι εκείνα που κατά κόρον χρησιμοποιούνται για την απολύμανση του νερού επιφέροντας απολύμανση υψηλού επιπέδου. Ωστόσο προκαλούν παραπροϊόντα απολύμανσης (DBPs) με δυσάρεστες συνέπειες για τον ανθρώπινο οργανισμό. Στην παρούσα μελέτη διερευνήθηκαν και αναλύθηκαν οι επιπτώσεις της υπεριώδους ακτινοβολίας και των υπέρηχων στην επιβίωση διάφορων παθογόνων μικροοργανισμών σε υδάτινο περιβάλλον. Σκοπός της έρευνας ήταν η ανάδειξη των μεθόδων της υπεριώδους ακτινοβολίας και των υπερήχων ως ισχυρά απολυμαντικά τα οποία μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την απολύμανση του νερού των κολυμβητικών δεξαμενών αντικαθιστώντας τις συμβατικές μεθόδους. Πράγματι, όπως θα δούμε και παρακάτω αποδείχθηκε πως και οι δυο μέθοδοι (UV στα 254 nm και US στα 80 khz) εμφανίζουν ισχυρή απολυμαντική δράση και είναι ικανές να απολυμάνουν σε ικανοποιητικό βαθμό το νερό απαλλάσσοντας το από παθογόνους μικροοργανισμούς. Η υπεριώδης ακτινοβολία χρησιμοποιείται εκτενώς τα τελευταία χρόνια τόσο για την απολύμανση του πόσιμου νερού όσο και για εκείνο των κολυμβητικών δεξαμενών, με συνεχείς βελτιώσεις στους UV-εξοπλισμούς κάνοντας τους πιο αποτελεσματικούς και οικονομικούς. Όσον αφορά τους υπέρηχους, παρόλο που χρησιμοποιούνται στη χειρουργική και στην οδοντιατρική για την απολύμανση των εργαλείων (Jatzwauk., et al. 2001) και παρουσιάζουν έντονο ενδιαφέρον από την βιομηχανία τροφίμων (Piyasena P. et al., 2003) δε χρησιμοποιούνται εκτενώς για την απολύμανση του νερού παρόλο που αρκετοί ερευνητές επισημαίνουν την απολυμαντική μη τοξική τους δράση. Η εφαρμογή των υπερήχων θεωρείται αρκετά κοστοβόρος, ενώ γίνονται προσπάθειες για την μείωση του κόστους με την χρήση νέων εξελιγμένων τεχνολογιών (Vasilyak. 2010). Τα πλεονεκτήματα της απολύμανσης των κολυμβητικών δεξαμενών με υπεριώδη ακτινοβολία είναι πολλά μεταξύ των οποίων είναι τα ακόλουθα: 113

114 Η υπεριώδης ακτινοβολία δεν παράγει τοξικά ή μη τοξικά παραπροϊόντα απολύμανσης. Δεν υπάρχει κίνδυνος υπερδοσολογίας. Δεν υπάρχουν εκπομπές πτητικών οργανικών ενώσεων η τοξικές ατμοσφαιρικές εκπομπές. Δεν δημιουργεί γεύσεις και οσμές στο νερό. Απαιτεί μικρό χώρο για τον εξοπλισμό. Μικρό κόστος συντήρησης του εξοπλισμού. Μικρή κατανάλωση ενεργείας. Τα μειονεκτήματα της υπεριώδους ακτινοβολίας είναι τα εξής: Η UV ακτινοβολία δεν είναι κατάλληλη για το νερό με υψηλά επίπεδα αιωρούμενων στερεών καθώς μειώνεται η απολυμαντική της δράση. Δεν έχει απολυμαντική δράση και εξαρτάται πλήρως από την ανακυκλοφορία όταν εφαρμόζεται σε κολυμβητικές δεξαμενές (Okafor, 2011). Τα πλεονεκτήματα και τα μειονεκτήματα των υπέρηχων για την απολύμανση του νερού είναι σχεδόν τα ίδια με εκείνα της υπεριώδους ακτινοβολίας που αναφέρθηκαν παραπάνω. Οι μόνες διαφορές είναι ότι οι υπέρηχοι καταναλώνουν περισσότερη ενέργεια ενώ φαίνεται να μην επηρεάζονται σημαντικά από τα επίπεδα αιωρούμενων στερεών. Σε έρευνα που πραγματοποιήθηκε σε λύματα φαίνεται να ενισχύεται η απολυμαντική δράση της υπεριώδους ακτινοβολίας όταν συνδυάζεται με υπέρηχους καθώς οι τελευταίοι μέσω της σπηλαίωσης διαλύουν αιωρούμενα σωματίδια που παρεμποδίζουν την αποδοτικότητά της (Gibson et al., 2008). Το μεγαλύτερο μειονέκτημα και των δυο μεθόδων είναι η παραμένουσα υπολειμματική δράση. Για το λόγο αυτό, παρόλο που και οι δυο μέθοδοι είναι ιδιαίτερα αποτελεσματικές συνίσταται από πολλές εταιρίες και ερευνητές που τις προτείνουν να χρησιμοποιούνται σε συνδυασμό μικρές ποσότητες χλωρίου ή άλλων χημικών απολυμαντικών με παραμένουσα υπολειμματική δράση (WHO 2006). Για τη διερεύνηση των επιπτώσεων της υπεριώδους ακτινοβολίας σε παθογόνους μικροοργανισμούς χρησιμοποιήθηκε πιλοτικό μοντέλο κολυμβητικής δεξαμενής. Εξετάστηκαν τέσσερις μικροοργανισμοί (E. coli, S. aureus, P. aeruginosa, E. faecalis) η επιλογή των οποίων δεν ήταν τυχαία καθώς τόσο η Ελληνική νομοθεσία όσο και ο 114

115 Παγκόσμιος οργανισμός υγείας (WHO) προτείνουν την ανίχνευση τους σε κολυμβητικές δεξαμενές. Για τη διερεύνηση των επιπτώσεων των υπέρηχων σε παθογόνους μικροοργανισμούς χρησιμοποιήθηκε υδατόλουτρο υπέρηχων και εξετάστηκαν δύο μικροοργανισμοί ένας gram αρνητικός (E. coli) και ένας gram θετικός (S. aureus). Συμπεράσματα UV- πιλοτικό μοντέλο κολυμβητικής δεξαμενής Για να προσδιοριστεί με ακρίβεια η βακτηριοκτόνος δράση της υπεριώδους ακτινοβολίας πραγματοποιήθηκαν πειράματα control. Ακολουθήθηκε δηλαδή η πειραματική πορεία χωρίς την χρήση UV προσδιορίζοντας έτσι την επιβίωση των μικροοργανισμών στο νερό στις συγκεκριμένες συνθήκες. Η επιβίωση των βακτηρίων εξαρτάται από ορισμένους περιβαλλοντικούς παράγοντες όπως η υγρασία και η ικανότητα συγκράτησης της, η θερμοκρασία, το ph, η παρουσία οξυγόνου και θρεπτικών συστατικών, η διαθεσιμότητα της οργανικής ύλης και ο ανταγωνισμός από την μικροχλωρίδα (Aung et al., 2016). Παρόλο που έχουν εντοπιστεί πολλοί παράγοντες που επηρεάζουν την επιβίωση ενός μικροοργανισμού, φαίνεται ότι υπάρχουν αρκετοί που παραμένουν άγνωστοι (Sampson et al., 2006). Η αντοχή και η επιβίωση των βακτηρίων στο νερό έχει συνδεθεί κατά κύριο λόγο με την θερμοκρασία. Σε μελέτη που πραγματοποιήθηκε σε αποστειρωμένες φιάλες νερού σε εργαστηριακό επίπεδο διαπιστώθηκε ότι o μικροοργανισμός E.coli θα μπορούσε να επιβιώσει σε θερμοκρασία δωματίου (27 0 C) έως και 8 ημέρες (Aung et al., 2016). Σε άλλες έρευνες αναφέρεται ότι οι θερμοκρασίες ψυχρότερων υδάτων μπορούν να αυξήσουν την ικανότητα επιβίωσης του βακτηρίου E.coli σε ποικίλες υδρόβιες συνθήκες. Σύμφωνα με τους Wcislo & Chrost (2000), διαπιστώνεται ότι η επιβίωση του Ε.coli στο νερό ενισχύεται σε χαμηλότερες θερμοκρασίες. Σε έρευνα των Bogosian et al., (1996) παρατηρήθηκε ότι σε νερό ποταμού το βακτήριο E. coli ήταν ικανό να επιβιώσει για 6 ημέρες στους 37 0 C για 8 στους 20 0 C και για 12 στους 4 0 C. Όσον αφορά το βακτήριο P. aeruginosa στην έρευνα μας ήταν το μόνο από τους τέσσερις μικροοργανισμούς που παρουσίασε ανάπτυξη. Η P. aeruginosa έχει την ικανότητα όχι μόνο να επιβιώνει για σχετικά μεγάλο χρονικό διάστημα στο υδάτινο ολιγοτροφικό περιβάλλον αλλά και να αναπτύσσεται. Οι διατροφικές απαιτήσεις της είναι ελάχιστες με αποτέλεσμα να παρουσιάζει μεγάλη ανθεκτικότητα και ικανότητα να αναπτύσσεται και στο 115

116 απεσταγμένο νερό (Campa et al. 1993, Wainwright, 1999, Whitacre, 2009, Mitscherlich & Marth 1984). Η υπεριώδης ακτινοβολία είναι κατάλληλη για την απολύμανση των λυμάτων και παρουσιάζει αυξανόμενο ενδιαφέρον για τη βιομηχανία επεξεργασίας του νερού αφού έχει αποδειχθεί ιδιαίτερα αποτελεσματική έναντι των παθογόνων μικροοργανισμών (Hijnen et al., 2006, Koutchma. et al., 2009). Δυο παθογόνοι μικροοργανισμοί, Cryptosporidium και Giardia, τεράστιας σημασίας για την ασφάλεια των υδάτων παρουσιάζουν ιδιαίτερη ευαισθησία στην υπεριώδη ακτινοβολία σε σχέση με τα αλογόνα απολυμαντικά. Η υπεριώδη ακτινοβολία είναι λιγότερο αποτελεσματική κατά των σπορίων και των ιών ενώ η σειρά κατάταξης τους ως προς την ευαισθησία τους στην υπεριώδη ακτινοβολία είναι η ακόλουθη: Cryptosporidium και Giardia > βακτήρια > σπόρια > ιοί (Koutchma et al., 2009, Clancy et al.,1998, Morita et al., 2002, Shin et al., 2005). Τα βακτήρια ως βλαστικά κύτταρα θεωρούνται σχετικά ευαίσθητα στην υπεριώδη ακτινοβολία αν και οι χρόνοι απενεργοποίησης τους διαφέρουν ανάλογα με το είδος και το στέλεχος. Μερικά από τα πιο μελετημένα βακτήρια είναι τα Bacillus subtilis, Clostridium perfringens (Hijnen et al., 2004), Camphylobacter jejuni (Wilson et al., 1992), Escherichia coli (Zimmer & Slawson, 2002, Oguma et al., 2004), Salmonella typhi και Shigella disenteriae (Wilson et al., 1992). Διαφορετικά στελέχη ενός είδους μπορεί να έχουν διαφορετική ευαισθησία στην υπεριώδη ακτινοβολία, όπως αποδείχθηκε για το βακτήριο E. coli από τους Sommer et al.,1998, Sommer et al., 2000 και Malley et al. (2004). Η ευαισθησία στην υπεριώδη ακτινοβολία, διαφορετικών στελεχών του E. coli σε αυτές τις μελέτες ποικίλλει ως προς τον απαιτούμενο χρόνο απενεργοποίησης του μικροοργανισμού. Η τελευταία μελέτη κατέδειξε υψηλότερη ευαισθησία του E. coli O157:H7 σε σύγκριση με μη παθογόνα τοξικά στελέχη. Όσον αφορά τους ιούς και τους βακτηριοφάγους έχουν μελετηθεί αρκετά και παρουσιάζουν ιδιαίτερη αντοχή στην υπεριώδη ακτινοβολία ενώ πιο ανθεκτικοί ιοί είναι οι αδενοϊοί. Ο Yates et al. (2006) παρέχουν μια πολύ καλή ανασκόπηση της αντοχής των αδενοϊών στην απολύμανση με UV. Το επίπεδο ανθεκτικότητας των αδενοϊών μελετήθηκε χρησιμοποιώντας λάμπες UV χαμηλής πίεσης στα 254 nm. Η απόδοση της απολύμανσης των λυμάτων με υπεριώδη ακτινοβολία επηρεάζεται σε μεγάλο βαθμό από την ποιότητα των λυμάτων. Αρκετές μελέτες έχουν αποδείξει την 116

117 αποτελεσματικότητα της για την απολύμανση των δευτερογενών και τριτογενών επεξεργασμένων αποβλήτων (Blatchley et al., 1996, Oppenheimer et al., 1997). Ωστόσο, η παρουσία σωματιδίων που συνδέονται με μικροοργανισμούς στα λύματα που υποβάλλονται σε απολύμανση με υπεριώδη ακτινοβολία ενδέχεται να έχει αρνητική επίδραση. Οι Loge et al., (2001) έδειξαν ότι το υπεριώδες φως δεν είναι δυνατόν να διεισδύσει σε στερεά υλικά με αποτέλεσμα οι μικροοργανισμοί να προστατεύονται πίσω από αυτά όταν υπάρχουν στο νερό ή στα λύματα. Η επίδραση της ποιότητας του νερού στην αποτελεσματικότητα της απολύμανσης με υπεριώδη ακτινοβολία μπορεί να αποδειχθεί με τη σύγκριση των αποτελεσμάτων των μελετών πόσιμου νερού με τις μελέτες λυμάτων που διενεργήθηκαν υπό παρόμοιες συνθήκες. Οι δοκιμές με εμβολιασμένους ιούς πολιομυελίτιδας σε εκροή δευτερογενών λυμάτων με υψηλή θολερότητα δημοσιεύτηκαν από τους Oppenheimer et al. (1995) και Watercare (2002). Και στις δυο μελέτες παρατηρήθηκε χαμηλότερη αδρανοποίηση στα λύματα σε σχέση με τις μελέτες του πόσιμου νερού. Στη δική μας μελέτη χρησιμοποιήθηκε απεσταγμένο νερό για όλα τα πειράματα οπότε συμπεραίνουμε ότι δεν επηρεάστηκε η UV απολύμανση από την ποιότητα του νερού. Σε παρόμοια έρευνα με τη δική μας, χρησιμοποιήθηκε κλειστό σύστημα ανακυκλοφορίας νερού, το οποίο απολυμάνθηκε με UV ακτινοβολία. Για την επιμόλυνση του νερού χρησιμοποιήθηκαν στελέχη legionella από κέντρο ελέγχου νόσων, στελέχη P. aeruginosa εργαστηριακά και περιβαλλοντικά, απομονωμένα από δημόσια κολυμβητική δεξαμενή και υδρομασάζ. Η λάμπα UV που χρησιμοποιήθηκε ήταν στα 254 nm και δείγματα ελήφθησαν, όπως και στην δική μας μελέτη σε δυο ημέρες σε διάφορα χρονικά διαστήματα. Από τα αποτελέσματα προέκυψε ότι το βακτήριο legionella θανατώθηκε την πρώτη ημέρα και δεν παρουσίασε καμία ανάπτυξη τη δεύτερη. Όσον αφορά το βακτήριο P. aeruginosa, όπως αναμενόταν παρουσίασε μεγαλύτερη ανθεκτικότητα το περιβαλλοντικό στέλεχος σε σχέση με το εργαστηριακό. Την πρώτη ημέρα παρουσίασαν υψηλή μείωση και τα δυο στελέχη μετά από 240 λεπτά UV ακτινοβολίας, ενώ παρουσίασαν ανάπτυξη κατά τη δεύτερη ημέρα η οποία μειώθηκε πάλι μετά από απολύμανση με UV ακτινοβολία. Στο τέλος του πειράματος και μετά από δέκα πλήρη ανακυκλοφορίες του νερού μέσα από την λάμπα UV σημειώθηκε μείωση που έφτασε 5 log. (Gilpin et al. 1985). Παρόμοια αποτελέσματα είχαμε και στην δική μας έρευνα όσον αφορά το βακτήριο P.aeruginosa. Την πρώτη ημέρα παρουσίασε σημαντική μείωση (6,36% - 7,37%) μετά από τρεις ώρες UV ακτινοβολίας ενώ τη δεύτερη ημέρα 117

118 παρουσίασε ανάπτυξη όσο η λάμπα UV ήταν κλειστή. Στο τέλος του πειράματος μετά από σχεδόν τρεις πλήρη ανακυκλοφορίες του νερού μέσα από την λάμπα UV σημειώθηκε σημαντική βακτηριακή μείωση (11,07% - 12,56%). Σε άλλη έρευνα, χρησιμοποιήθηκαν τα βακτήρια E. coli, S. aureus, S. sonnei, S. typhi, E. faecalis ως μικροβιακοί δείκτες ενώ ως απολυμαντικό μέσο χρησιμοποιήθηκε η υπεριώδη ακτινοβολία. Από τα αποτελέσματα που προέκυψαν όλοι οι μικροοργανισμοί παρουσίασαν παρόμοια αντίσταση στην υπεριώδη ακτινοβολία πλην του E. faecalis ο οποίος απαίτησε μεγαλύτερο χρόνο επαφής για την απενεργοποίηση του (Chang et al., 1985). Στη δική μας μελέτη παρατηρήθηκαν παρόμοια αποτελέσματα. Οι μικροοργανισμοί E. coli και S. aureus παρουσίασαν παρόμοια ποσοστιαία μεταβολή στο ίδιο χρονικό διάστημα ενώ ο E. faecalis δεν απενεργοποιήθηκε πλήρως κατά την διάρκεια του πειράματος απαιτώντας μεγαλύτερο χρόνο έκθεσης στην υπεριώδη ακτινοβολία. Σε άλλη μελέτη, αξιολογήθηκε συσκευή υπεριώδους ακτινοβολίας 254 nm για την απολύμανση του νερού. Το νερό τοποθετήθηκε σε φιάλες διαφόρων σχημάτων και χωρητικότητας που χρησιμοποιούν οι ταξιδιώτες. Το νερό επιμολύνθηκε με τρεις διαφορετικούς μικροοργανισμούς (E.coli, S.aureus, Geobacillus stearothermophilus) και απολυμάνθηκε με UV ακτινοβολία σε διάφορα χρονικά διαστήματα. Από τα αποτελέσματα που προέκυψαν αποδεικνύεται ότι η υπεριώδης ακτινοβολία είναι ικανή να απενεργοποιήσει τα συγκεκριμένα βακτήρια σε ποσοστό που φτάνει το 100% μετά από 90 δευτερόλεπτα εφαρμογής σε 1 λίτρο νερού. Αν και δεν μπορούμε να συγκρίνουμε άμεσα τα αποτελέσματα με τη δική μας έρευνα, λόγο διαφορών ως προς το χρόνο και τον τρόπο εφαρμογής, παρατηρούμε ότι η UV ακτινοβολία είναι ικανή να εξαλείψει δυο από τα πιο σημαντικά υδατογενή μικρόβια (E.coli & S.aureus) σε σημαντικό ποσοστό (Timmermann et al., 2015) Σε έρευνα των Nikaeen & Mirhendi (2008) εξετάστηκε η αποδοτικότητα της υπεριώδους ακτινοβολίας ενάντια σε μύκητες. Ως μικροβιακός δείκτης χρησιμοποιήθηκαν σπόρια του μύκητα Aspergillus flavus, υπαίτιος για σημαντικές νοσοκομειακές λοιμώξεις. Για την πειραματική διαδικασία χρησιμοποιήθηκε αντιδραστήρας απολύμανσης νερού UV και μικροβιακό εναιώρημα για την επιμόλυνση του νερού. Από τα αποτελέσματα προέκυψε ότι η UV ακτινοβολία είναι ικανή να αδρανοποιήσει το μικροοργανισμό σε 118

119 ποσοστό 100%. Σημαντικό ρόλο στην αποτελεσματικότητα της λάμπας UV διαδραματίζει ο χρόνος επαφής με το νερό καθώς και η ένταση της σε watt. Όπως παρατηρήθηκε τόσο από τα αποτελέσματα της έρευνας μας όσο και από την ανασκόπηση στην βιβλιογραφία η υπεριώδης ακτινοβολία είναι ικανή να επιφέρει ουσιαστική απολύμανση σε μια κολυμβητική δεξαμενή, θανατώνοντας -αδρανοποιώντας ένα μεγάλο εύρος μικροοργανισμών, μέρος των οποίων παρουσιάζει εξαίρετη αντοχή στα χημικά απολυμαντικά. Ωστόσο συνίσταται να συνδυάζεται με μικρές δόσης χημικών απολυμαντικών με παραμένουσα υπολειμματική δράση. Έτσι εξασφαλίζεται ένα υγιεινότερο κολυμβητικό περιβάλλον, με λιγότερα χημικά και λιγότερα παραπροϊόντα απολύμανσης, που στηρίζεται σε εναλλακτικούς, πράσινους τρόπους απολύμανσης. Συμπεράσματα US Αρκετές έρευνες έχουν πραγματοποιηθεί για να προσδιοριστεί η αποτελεσματικότητα των υπέρηχων στην απολύμανση του νερού χωρίς ωστόσο να έχει αποσαφηνιστεί πλήρως στα πόσα khz επιτυγχάνεται η μέγιστη δυνατή απολύμανση. Υπάρχουν μελέτες που υποστηρίζουν ότι σε χαμηλότερα khz επιτυγχάνεται ουσιαστική απολύμανση. Ωστόσο δεν είναι λίγες και εκείνες που υποστηρίζουν ότι σε υψηλοτέρα khz εξασφαλίζεται η μέγιστη δυνατή απολύμανση του νερού. Σε μελέτη όπου εξετάστηκε η απολυμαντική δράση των υπέρηχων για την απολύμανση του νερού σε συνεργασία με χλώριο διαπιστώθηκε ότι οι υπέρηχοι υψηλών συχνοτήτων 800 khz είναι πιο αποδοτικοί από ότι εκείνοι των 20 khz. To 75% των βακτηρίων που χρησιμοποιήθηκαν έδειξε να επιβιώνουν στη χαμηλή συχνότητα ενώ στην υψηλή μόνο το 20 % επιβίωσε (Phull et al., 1997). Σε μελέτη που διερευνήθηκαν οι επιπτώσεις των υπέρηχων σε βακτήρια και χημική ρύπανση όπως π.χ χλωροφαινόλη διαπιστώθηκε ότι οι υπέρηχοι υψηλών συχνοτήτων 512 khz και 850 khz ήταν ιδιαίτερα αποτελεσματικοί για τη χημική μόλυνση εν αντιθέσει με τα βακτήρια τα οποία παρουσίασαν μεγαλύτερη ευαισθησία στους υπέρηχους χαμηλών συχνοτήτων 20 khz (Paniwnyk et al., 2010). Σε άλλη έρευνα των Azuonwu O. et al., 2015 χρησιμοποιήθηκαν τέσσερα βακτηριακά στελέχη, δύο gram αρνητικά και δύο gram θετικά, τα οποία υποβλήθηκαν σε υπερήχηση 20 khz σε διάφορους χρόνους έως 30 λεπτά. Από τα αποτελέσματα προέκυψε σημαντική 119

120 μείωση για όλους τους μικροοργανισμούς, με τους gram θετικούς να παρουσιάζουν ελαφρώς μεγαλύτερη ικανότητα επιβίωσης. Στη δική μας έρευνα παρόλο που και οι δυο μικροοργανισμοί παρουσίασαν μείωση, δεν παρατηρήθηκε μεγαλύτερη ανθεκτικότητα του gram θετικού μικροοργανισμού (S. aureus) σε σχέση με τον gram αρνητικό (E. coli). Αυτό ίσως οφείλεται στα διαφορετικά khz που χρησιμοποιήθηκαν ή στη διαφορά των στελεχών. Μια ακόμη έρευνα που οι υπέρηχοι συνδυάστηκαν με όζον για την απολύμανση του νερού παρουσιάστηκε σημαντική μείωση του βακτηρίου E.coli αναδεικνύοντας την συνεργατική ικανότητα των δυο απολυμαντικών. Οι υπέρηχοι που χρησιμοποιήθηκαν ήταν στα 612 khz και όταν εφαρμόστηκαν μόνοι τους, το βακτήριο E. coli παρουσίασε μείωση 24% μετά από 16 λεπτά. Παρόμοια αποτελέσματα ως προς τη μείωση του μικροοργανισμού έδειξε και η δική μας μελέτη αν και δεν μπορούμε να τα συγκρίνουμε πλήρως καθώς χρησιμοποιήθηκε διαφορετικό στέλεχος και διαφορετική συχνότητα υπέρηχων (Al-Hashimi et al., 2015). Τέλος, σε παρόμοια έρευνα με τη δική μας χρησιμοποιήθηκαν διάφοροι όγκοι νερού όπως 200 ml, 400ml, 600ml, το βακτήριο E. coli ως δείκτης μόλυνσης και υδατόλουτρο υπέρηχων 42 khz για απολύμανση. Από τα αποτελέσματα προέκυψε ότι η αύξηση του χρόνου των υπέρηχων δείχνει να έχει σημαντική επίδραση στη βακτηριακή θανάτωση ενώ δεν παρατηρήθηκαν ουσιαστικές διαφορές ανάμεσα στους διαφορετικούς όγκους νερού. Η μείωση του βακτηρίου έφτασε 99,80% μετά από 90 λεπτά υπερήχησης ενώ στα 30 λεπτά παρουσιάστηκε μείωση σχεδόν 87% (Dehghani, 2005). Όπως παρατηρήθηκε τόσο από τη δική μας έρευνα όσο και από άλλες που έχουν πραγματοποιηθεί οι υπέρηχοι είναι ικανοί να επιφέρουν ουσιαστική απολύμανση ενός υδάτινου περιβάλλοντος καταστρέφοντας παθογόνους μικροοργανισμούς και διασπώντας αιωρούμενα σωματίδια. Ωστόσο, θα πρέπει να αποσαφηνιστεί πλήρως η συχνότητα στην οποία είναι αποδοτικότεροι ώστε να υπάρξουν βελτιώσεις στους εξοπλισμούς υπερήχησης και να αποτελέσουν μια οικονομικά συμφέρουσα λύση για την απολύμανση τόσο του πόσιμου όσο και του νερού των κολυμβητικών δεξαμενών. 120

121 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 121

122 122

123 ΑΓΓΛΙΚΗ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ Alberts B., Bray D., Hopkin K., Johnson A., Lewis J., Raff M., Roberts K., Walter P. (2006). Βασικές αρχές κυτταρικής βιολογίας, 2η έκδοση, Ιατρικές εκδόσεις Πασχαλίδη. Al-Haddad KSH, Al-Qassemi RAS, Robinson RK (2005) The use of gaseous ozone and gas packaging to control populations of Salmonella infants and Pseudomonas aeruginosa on the skin of chicken portions. Food Control 16: Al-Hashimi A. M., Mason T.M., and Joyce E.M.. (2015). Combined Effect of Ultrasound and Ozone on Bacteria in Water. Environmental Science & Technol., 49 (19), pp American Chemical Society. Alhazmi A. (2015). Pseudomonas aeruginosa Pathogenesis and Pathogenic Mechanisms. International Journal of Biology. Vol. 7, No. 2. American Society for Microbiology (ASM). ( Aung T. S., Binti J.B. Rayaji, Oo K.S., Lin Z., Masandid H. (2016). The Study on the Survival of Escherichia Coli in Water at Room Temperature. Borneo Journal of Medical Sciences. volume 10, issue 1, pp: AWWA, American Water Works Association. (1999) WATER QUALITY AND TREATMENT. A Handbook of Community Water Supplies. Azuonwu O., Azuonwu G., Obire O. (2015). Impact of low frequency ultrasound on pathogens in polluted potable water. Scholars Academic and Scientific Publisher. (An International Publisher for Academic and Scientific Resources). Bartram J. Ballance R. (1996). Water Quality Monitoring. A practical guide to the design and implementation of freshwater quality studies and monitoring programmes. United Nations Environment Programme. Bilek S.E., Turantas F. (2013). Decontamination efficacy of high power ultrasound in the fruit and vegetable industry. A review. International Journal of Food Microbiology.166,

124 Binnie C., Smethurst G., Kimber M. (2002). Basic Water Treatment - Third Edition. Thomas Telford Publishing. Bintsis T., Litopoulou-Tzanetaki E., Robinson K. (2000). Existing and potential applications of ultraviolet light in the food industry A critical review. Journal of the science of food and agriculture. Volume 80, Issue 6. Pages Black & Veatch. (2010). White s Handbook of Chlorination and Alternative Disinfectants. (Fifth Edition). John Wiley & Sons. Blatchley E.R., Bastian K.C., Duggirala R.K., Alleman J.E., Moore M. & Schuerch P. (1996). Ultraviolet irradiation and chlorination/ dechlorination for municipal wastewater disinfection. Water Environmental Resources 68(2): Bogosian G, Sammons L E, Morris P J L, O neil J P et al. (1996). Death of the Escherichia coli K12 Strain W3110 in Soil and Water. Applied and Environmental Microbiology 62: Bolton R. James and Linden G. Karl. (2003). Standardization of Methods For fluence (UV Dose). Determination in Bench-Scale UV Experiments, Journal of Environmental Engineering, Vol. 129, No 3. Boyd C. E. (2015). Water Quality: An Introduction. Second edition. Springer. Brock T. Madigan M.T., Martinko J.M. (2006). Brock biology of microorganisms. 11th edition. Pearson Prentice Hall. Broekman S., Pohlmanna O., Beardwooda E.S. and Meulenaer E.C. (2010). Ultrasonic treatment for microbiological control systems. Ultrasonics Sonochemistry, 17: Brown D. (2014). Manchester University College of Pharmacy. Reference Module in Biomedical Sciences. Encyclopedia of Toxicology (Third Edition), Pages Byrd O.E., Harold M. M., Reed G. B. Wilson H. W. (1963). Safety of Iodine as a Disinfectant in Swimming Pools. 124

125 Cabral J. (2010) Water Microbiology. Bacterial Pathogens and Water. International Journal of Environmental Research and Public Health. Campa M., Bendinelli M., Friedman H. (1993) Pseudomonas aeruginosa as an Opportunistic Pathogen. Springer Science & Business Media. Cassan Delphine, Mercier Beatrice, Castex Francoise, Rambaud Andre. (2006). Effects of medium-pressure UV lamps radiation on water quality in a chlorinated indoor swimming pool. Chemosphere 62: Chang J., Ossoff S., Lobe D, Dorfman M., Dumais C., Qualls R, and Johnson D. (1985) UV Inactivation of Pathogenic and Indicator Microorganisms. Applied and Environmental Microbiology, p Chemical & Engineering News. (cen.acs.org/magazine). Cheremisinoff. P.N. (1995). Handbook of Water and Wastewater Treatment Technologies. New York: M. Dekker. Christopher J., Sa. A., Boaventura RA., Pereira IB. (2012). Analysis of haloacetic acids in water and air (aerosols) from indoor swimming pools using HS- SPME/GC/ECD. Journal Environmental Science and Health. Clancy J.L., Hargy T.M., Marshall M.M. & Dyksen J.E. (1998). UV light inactivation of Cryptosporidium oocysts. Journal of American Water Works Association 90(9): Costet N, Villanueva CM, Jaakkola JJ, Kogevinas M, Cantor KP, King WD, Lynch CF, Nieuwenhuijsen MJ, Cordier S. (2010). Water disinfection byproducts and bladder cancer: is there a European specificity? A pooled and metaanalysis of European case-control studies. Occupational and Environmental Medicine. 68(5): Cotovio J., Onno L., Justine P., Lamure S., Catroux P. (2001). Generation of oxidative stress in human cutaneous models following in vitro ozone exposure. Toxicology Vitro. 15:

126 Cotton C., Passantino L., Owen D., Bishop M., Valade M. (2005). Integrating UV Disinfection into Existing Water Treatment plants. American Water Works Research Foundation (AWWA). Darby J., M. Heath J., Jacangelo F., Loge P., Swaim and G. Tchobanoglous. (1995). Comparison of UV Irradiation to Chlorination: Guidance for Achieving Optimal UV Performance. Water Environment Research Foundation. Alexandria, Virginia. Dehghani M.H. (2005). Effectiveness of Ultrasound on the Destruction of E. coli. American Journal of Environmental Sciences 1 (3): Science Publications. Dong C., Sanjay K. Sharma, Mudhoo A. (2012). Handbook on Applications of Ultrasound: Sonochemistry for Sustainability. Donlan R.M., Casterton J.W. (2002) Biofilms Survival mechanisms of clinically relevant microorganisms. Clinical Microbiology. Apr Duffitt, R. Ashley D. Reber, Whipple Andrew, Chauret C (2011). Gene Expression during Survival of Escherichia coli O157:H7 in Soil and Water. Hindawi Publishing Corporation. International Journal of Microbiology Volume. Fisher K. and Phillips C. (2009) The ecology, epidemiology and virulence of Enterococcus. (Review). Microbiology, 155, Gabrielsen M. Α. (1986). Swimming Pools: A Guide to Their Planning, Design, and Operation. Human Kinetics,4th Edition. Gibson Η. John, Darrell Hai Nien Yong, Ramin R. Farnood, and Peter Seto. (2008). A Literature Review of Ultrasound Technology and Its Application in Wastewater Disinfection. Water Quality. Research. Volume 43, No. 1, Gilpin S.B. Dillon R, Keyser P., Androkites A., Berube M, Carpendale N., Skorina J., Hurley J, Kaplan A. (1985). Disinfection of circulating water systems by ultraviolet light and halogenation. Water Research. Volume 19, Issue 7, Pages Goodman M., & Hays S. (2008). Asthma and swimming: a metaanalysis. Journal of Asthma. 45:

127 Greenwood D., Slack R, Peutherer J. (2002). Medical microbiology, Sixteenth Edition. Guerrero B.J.A. Bardosa C. (2004). Advantages and limitations on processing foods by UV light. Review. Food science and technology international, volume 21(4), pages Guida M, Di Onofrio D., Gallè F., Gesuele R., Valeriani F., Liguori R., Romano Spica V. Liguori G. (2016) Pseudomonas aeruginosa in Swimming Pool Water: Evidences and Perspectives for a New Control Strategy. International Journal Environment. Res. Public Health. Hao F., Gustavo V. Barbosa-Cánovas, Jochen W. (2011). Ultrasound Technologies for Food and Bioprocessing. Food Engineering Series. Harrigan W. (1998). Laboratory methods in food microbiology. Third edition. Academic press. Harris L.G.., Foster S.J., and Richards R.G. (2002). An introduction to Staphylococcus aureus, and techniques for identifying and quantifying S. aureus adhesins in relation to adhesion to biomaterials: review. European cells and materials vol. 4. (pages 39-60). Hijnen W.A., Beerendonk E.F., Medema G.J. (2006). Inactivation credit of UV radiation for viruses, bacteria and protozoan (oo)cysts in water: a review. Water Research. Volume 40, Issue 1, Pages Hijnen W.A.M., van der Veer A.J., Beerendonk E.F. & Medema G.J. (2004). Increased resistance of environmental anaerobic spores to inactivation by UV. Water Science and Technology:Water Supply 4(2): Hoyer O. (2004). Water disinfection with UV radiation-requirements and realization. In: Proccedings of the European conference UV Karlsruhe, UV radiation. Effects and technologies. HPA (2005). (W10). Enumeration of Staphylococcus aureus by membrane filtration technique. 127

128 ISO 16266:2006. Water quality. Detection and enumeration of Pseudomonas aeruginosa. Method by membrane filtration. ISO :2000. Water quality. Detection and enumeration of intestinal enterococci. Membrane filtration method. ISO :2000. Water quality. Detection and enumeration of Escherichia coli and coliform bacteria. Membrane filtration method. Jacobs JH, Spaan S, van Rooy GB, Meliefste C, Zaat VA, Rooyackers JM, et al. (2007). Exposure to trichloramine and respiratory symptoms in indoor swimming pool workers. Eur, Respir. J. 29: Jatzwauk L., H. Schöne, H. Pietsch. (2001). How to improve instrument disinfection by ultrasound. Journal of Hospital Infection.Volume 48, Supplement A, Pages S80-S83. Josefa M. Rangel, Phyllis H. Sparling, Collen Crowe, Patricia M. Griffin, and David L. Swerdlow. Emerging Infectious Diseases Vol. 11, No. 4, (April 2005). Epidemiology of Escherichia coli O157:H7 Outbreaks, United States, Judd S, Jeffrey J.A. (1995). Trihalomethane formation during swimming pool water disinfection using hypobromous and hypochlorous acids. Water Res 29: Jurado-Sanchez B, Ballesteros E, Gallego M. (2010) Screening of N-nitrosamines in tap and swimming pool waters using fast gas chromatography. 33(4-5): Kim H., Shim J., Lee S. (2002). Formation of disinfection by- products in chlorinated swimming pool water. Chemosphere 46: Klein E., Smith D., Laxminarayan R. (2007). Hospitalizations and Deaths Caused by Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus, United States, Vol. 13, No. 12. Klein, G. (2003). Taxonomy, ecology and antibiotic resistance of enterococci from food and the gastro-intestinal tract. International Journal Food Microbiology 88,

129 Knudsen T. Skov R., Petersen A., Larsen A., and Benfield T. (2016). Increased Age-Dependent Risk of Death Associated With lukf-pv-positive Staphylococcus Aureus Bacteremia. Koutchma T., Forney L.J. & Moraru C.I. (2009). Ultraviolet light in food technology: Principles and applications. Contemporary Food Engineering, CRC Press, ISBN , La Kind J.S., Richardson SD., Blount BC. (2010). The good, the bad, and the volatile: can we have both healthy pools and healthy people? Environmental Science Technology 44: Lagerkvist B.J., Bernard A., Blomberg A., Bergstrom E., Forsberg B. (2004) Pulmonary epithelial integrity in children: Relationship to ambient ozone exposure and swimming pool attendance. Loge F.J., Emerick R.W., Ginn T.R. & Darby J.L. (2001). Association of coliform bacteria with wastewater particles: impact of operational parameters of the activated sludge process. Water Research 36(1): Love C. (2008). A Social History of Swimming in England, Splashing in the Serpentine. Low D.E., Keller N., Barth A., Jones R.N. (2001). Clinical prevalence, antimicrobial susceptibility, and geographic resistance patterns of enterococci: Results from SENTRY Antimicrobial Surveillance Program, Clinical Infectious Diseases. 32 (Suppl. 2): 5: Maier, I.L. Raina M. Pepper, C. Gerba P. (2004). Environmental Microbiology. Second edition. Academic press. Elsevier. Malley, J. P., N. A. Ballester, A. B. Margolin, K. G. Linden, A. Mofidi, J. R. Bolton, G. Crozes, J. M. Laine, and M. L. Janex. (2004). Inactivation of pathogens with innovative UV technologies. AWWARF, Denver CO, US. Massin N., Bohadana AB, Wild P, Héry M, Toamain JP, Hubert G. (1998). Respiratory symptoms and bronchial responsiveness in lifeguards exposed to nitrogen trichloride in indoor swimming pools. Occupational and Environmental Medicine. 55(4):

130 Mesaros N., P. Nordmann, P. Ple siat, M. Roussel-Delvallez, J. Van Eldere, Y. Glupczynski, Y. Van Laethem, F. Jacobs, P. Lebecque, A. Malfroot, P. M. Tulkens and F. Van Bambeke. (2007). Pseudomonas aeruginosa: resistance and therapeutic options at the turn of the new millennium. Clinical Microbiology and Infection. 13: Mitscherlich, E. & Marth, E.H. (1984). Microbial Survival in the Environment. Bacteria and Rickettsiae Important in Human and Animal Health. Moreno F., M. R., Sarantinopoulos, P., Tsakalidou, E., De Vuyst, L. (2006). The role and application of enterococci in food and health. International Journal Food Microbiology 106, Morita Sh., Namikoshi A., Hirata T., Oguma K., Katayama H., Ohgaki S., Motoyama N. & Fujiwara M. (2002). Efficacy of UV irradiation in inactivating Cryptosporidium parvum oocysts. Applied Environmental Microbiology 68(11): Myers R.J. (2009). One-Hundred Years of ph. Journal of Chemical Education. Vol. 87 No.1 Nalepa C. J. (2004).25 Years of Bromine Chemistry in Industrial Water Systems: A Review Nikaeen M., Mirhendi H. (2008). Inactivation of Aspergillus flavus Spores in Water by Ultraviolet Irradiation. World Applied Sciences Journal 4 (4): Nikolaou A.D., Lekkas T.D., Golfinopoulos S.K. (2004), Kinetics of the formation and decomposition of chlorination by-products in surface waters, Chemical Engineering Journal, 100/1-3, NSW (2013). Public Swimming Pool and Spa Pool Advisory Document. Health Protection. Oguma K., Katayama H. & Ohgaki S. (2004). Photoreactivation of Legionella pneumophila after inactivation by low or medium pressure ultraviolet lamp. Water Resources 38(11): Okafor Nd. (2011) Environmental Microbiology of Aquatic and Waste Systems. Springer Science & Business Media. 130

131 Olsen K. (2007). Clear waters and a green gas: a history of chlorine as a swimming pool sanitizer in the united states. Montclair State University. Bull. Hist. Chem., VOLUME 32, Number 2. Oppenheimer A.J., Jacangelo J.G., Lane J.M. & Hoagland J.E. (1997). Testing the Equivalency of Ultraviolet Light and Chlorine for Disinfection of Wastewater to Reclamation Standards. Water Environmental Resources 69(1): Oppenheimer, J. A., J. G. Jacangelo, J. M. Laîné, and J. E. Hoagland. (1995). Equivalency testing of ultraviolet disinfection for wastewater reclamation. Presented at the American Water Works Association Water Quality Technology Conference, New Orleans US, November Paniwnyk L., O. Larpparisudthi, T. J. Mason. (2010). Degradation of water pollutants using ultrasound. Proceedings of 20th International Congress on Acoustics, August 2010, Sydney, Australia. Phull S.S., Newman A.P., Lorimer J.P., Pollet B., Mason T.J. (1997). The development and evaluation of ultrasound in the biocidal treatment of water. Ultrasonics Sonochemistry. Volume 4, Issue 2, April 1997, Pages Piyasena P., Mohareb E., R.C McKellar. (2003). Inactivation of microbes using ultrasound: a review. International Journal of Food Microbiology. Volume 87, Issue 3, 1, Pages Plata Κ., Rosato Α., Węgrzyn1 G. (2009). Staphylococcus aureus as an infectious agent: overview of biochemistry and molecular genetics of its pathogenicity. Biochimica Polonica. vol Richardson SD, Plewa MJ, Wagner ED, Schoeny R, De Marini DM. (2007). Occurrence, genotoxicity, and carcino genicity of regulated and emerging disinfection by-products in drinking water: a review and roadmap for research. Mutation Research. 636: Richardson SD. (1998). Drinking Water Disinfection By-products. In: The Encyclopedia of Environmental Analysis and Remediation, Vol 3 (Meyers RA, ed). New York: Wiley,

132 Roberts MG, Singer PC, Obolensky A. (2002). Comparing total HAA and total THM concentrations using ICR data. J. Am. Water Works Assoc. 94: Rossi G., Comuzzi C, Barbone F. and Goi D. (2010). Experimental Tests for Ozone Disinfection Treatment in a Small Backyard Swimming-Pool. Journal of Waste Water Treatment & Analysis. Sampson R W, Swiatnicki S A, Osinga V L., Supita J L, Mc Dermott C M and Kleinheinz G T. (2006). Effects of temperature and sand on E. coli survival in a northern lake water microcosm. Journal of Water and Health 4: Santa Marina L., Ibarluzea J., Basterrechea M., Goni F, Ulibarrena E., Artieda J. (2009). Indoor air and bathing water pollution in indoor swimming pools in Guipuzcoa. (Spain). Schoenen D. (2002). Role of disinfection in suppressing the spread of pathogens with drinking water: possibilities and limitations. Water Research. Scott A. R., van den Akker B., Roser P.D. (2012). A risk assessment of Pseudomonas aeruginosa in swimming pools: a review. Journal of water and health. Shin G., Bohrerova Z., Linden K.G. & Faubert G. (2005). DNA repair of UVirradiated Giardia lamblia cysts detected by both infectivity and molecular biological assays. In: Proceedings of the Third International Congress on Ultraviolet Technologies, May 24 27, Whistler, BC, Canada, Sommer, R., M. Lhotsky, T. Haider, and A. Cabaj. (2000). UV inactivation, liquid holding recovery, and photoreaction of Escherichia coli OH157 and other pathogenic Escherichia coli strains in water. Jour. Food Prot. 63: Sommer, R., T. Haider, A. Cabaj, W. Pribil, and M. Lhotsky. (1998). Time fluence reciprocity in UV disinfection of water. Wat. Sci. Tech. 38: Spellman F.R. (2008). The science of water. Concepts and Applications, second edition. CRC Press. Stav D, Stav M. (2005). Asthma and whirlpool baths. The New England Journal of Medicine. 353:

133 Stiles M. E. & Holzapfel W. H. (1997). Lactic acid bacteria of foods and their current taxonomy. International Journal Food Microbiology. 36, Streeter Κ, Katouli Μ. (2016). Pseudomonas aeruginosa: A review of their Pathogenesis and Prevalence in Clinical Settings and the Environment. Infect Epidemiology. Med. Volume 2, Issue 1: Tardiff R.G., Carson M.L., Ginevan M.E. (2006) Updated weight of evidence for an association between adverse reproductive and developmental effects and exposure to disinfection byproducts. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 45(2): Thornton W. M. (1991). Washing "the Great Unwashed" Public Baths in Urban America, (Urban Life and Urban Landscape Series). Timmermann Lisa F., Ritter Klaus, Hillebrand David, Kupper Thomas. (2015). Drinking water treatment with ultraviolet light for travelers Evaluation of a mobile lightweight system. Travel Medicine and Infectious Disease. Volume 13, Issue 6, Pages Torell E., Kühn I., Olsson-Lijequist B., Haeggman S., Hoffman B.M., Lindahl C., and Burman L.G. (2003). Clonality among ampicillin resistant. Enterococcus faecium isolates in Sweden and relation to ciprofloxacin resistance. Clinical. Microbes Infection. 9: Trojan UV. UV treatment technology for water and wastewater. ( Uyan ZS, Carraro S., Piacentini G., Baraldi E. (2009). Swimming pool, respiratory health, and childhood asthma: should we change our beliefs. Pediatric Pulmonology. 44:31-7. Valacchi G., Pagnin E., Okamoto T., Corbacho AM, Olano E., et al. (2003) Induction of stress proteins and MMP-9 by 0.8ppm of ozone in murine skin. Biochemical and Biophysical Research Communications 305: Van den Berghe, De Winter, T. De Vuyst, L. (2006). Enterocin A production by Enterococcus faecium FAIR-E 406 is characterized by a temperature- and ph- 133

134 dependent switch-off mechanism when growth is limited due to nutrient depletion. International Journal Food Microbiology. 107, Vasilyak L. M. (2010). Ultrasound Application in Systems for the Disinfection of Water. Surface Engineering and Applied Electrochemistry, Vol. 46, No. 5, pp Allerton Press, Inc. Velez-Colmenares J.G., Acevedo A., Nebot E. (2011). Effect of recirculation and initial concentration of microorganisms on the disinfection kinetics of Escherichia coli. Desalination Villanueva C.M., Cantor K.P., Cordier S, Jaakkola JJ, King WD., Lynch CF., Porru S., Kogevinas M. (2004). Disinfection byproducts and bladder cancer: a pooled analysis. Epidemiology. 15(3): Villanueva C.M., Cantor K.P., Grimalt JO, Malats N., Silverman D., Tardon A., et al. (2007). Bladder cancer and exposure to water disinfection by-products through ingestion, bathing, showering and swimming pool attendance. American Journal Epidemiology. 165: Villanueva Cristina M. and Laia Font-Ribera. (2012) Health impact of disinfection by-products in swimming pools. Centre for Research in Environmental Epidemiology (CREAL). Von Sonntag C., Kolch A., Gebel J., Oguma K., Sommer R. (2004). The photochemical basis of UV disinfection. In Proc. European Conference UV Karlsruhe, UV radiation. Effects and technologies. Wainwright M. (1999). An Introduction to Environmental Biotechnology. Springer Science & Business Media. Walse SS. & Mitch WA. (2008). Nitrosamine carcinogens also swim in chlorinated pools. Environmental Science Technology. 42(4): Watercare. (2002). Pilot plant investigations, surrogate study, results and recommendations. Disinfection review group report Water Care Services Ltd., New Sealand. 134

135 Wcislo R, Chrost RJ. (2000). Survival of Escherichia coli in Freshwater. Polish Journal of Environmental Studies 9: Weaver WA, Li J, Wen Y, Johnston J, Blatchley MR, Blatchley ER, III. (2009). Volatile disinfection by-product analysis from chlorinated indoor swimming pools. Water Research. 43(13): Weisel CP., Richardson SD., Nemery B., Aggazzotti G., Baraldi E, Blatchley ER III, Blount BC., Carlsen KH., Eggleston PA., Frimmel FH. (2009). Childhood asthma and environmental exposures at swimming pools: state of the science and research recommendations. Environ Health Perspect. 117: Whitacre M. D. (2009). Reviews of Environmental Contamination and Toxicology. Volume 277. Springer Science & Business Media. WHO (World Health Organization) Geneva Guidelines for Drinking-water Quality. THIRD EDITION INCORPORATING THE FIRST AND SECOND ADDENDA Volume 1 Recommendations. WHO (World Health Organization). (2000). Guidelines for Safe Recreationalwater Environments Final Draft for Consultation Vol. 2: Swimming Pools, Spas and Similar Recreational-water Environments. WHO (World Health Organization). (2003) Guidelines for safe recreational water environments. Volume 1, Coastal and fresh waters. WHO (World Health Organization). (2006). Guidelines for safe Guidelines for safe recreational water environments recreational water environments. Volume 2. WHO (World Health Organization). (2016). Iodine as a drinking water disinfectant Draft Document 5.4, 24 Version for Public (Review). WHO (World Health Organization) WATER DISINFECTION. Pan American Center for Sanitary Engineering and Environmental Sciences. Pan American Health Organization Regional Office of the World Health Organization. Willey J., Sherwood L., Woolverton C.J. (2013). Prescott s Microbiology. 9th Edition. McGraw-Hill Education. 135

136 Wilson B.R., Roessler P.F., van Dellen E., Abbaszadegan M. & Gerba C.P. (1992). Coliphage MS2 as a UV water disinfection efficacy test surrogate for bacterial and viral pathogens. In: Proceedings of the American Water Works Association Water Quality Technology Conference, November 15 19, Toronto, Canada. Wiltse J. (2007). Contested Waters: A Social History of Swimming Pools in America. The university of North Carolina press. Wise K. (2013). Preparing Spread Plates Protocols. American Society for Microbiology, ASM Microbe Library. Yates M., Malley J., Rochelle P. & Hoffman R. (2006). Effect of adenovirus resistance on UV disinfection requirements: report on the state of adenovirus science. American Water Works Association Journal 98(1) Zimmer J.L. & Slawson R.M. (2002). Potential repair of Escherichia coli DNA following exposure to UV radiation from both medium- and low-pressure UV sources used in drinking water treatment. Applied Environmental Microbiology 68(7): Zimmermann M. (2014). Swiss Federal Institute of Technology (ETH), Switzerland. Reference Module in Biomedical Sciences. Encyclopedia of Human Nutrition (Third Edition), Pages ΕΛΛΗΝΙΚΗ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ Αγγελής Γ. (2007) Μικροβιολογία και Μικροβιακή Τεχνολογία. Εκδόσεις: Αθανάσιος. Σταμούλης. Αντωνιάδης Α.Γ., Καρτάλη Σ., Λεγάκης Ν.Ι., Μανιάτης Α.Ν, Τσελέντης Ι. (2000) Ιατρική μικροβιολογία. 1η έκδοση Ιατρικές Εκδόσεις Π.Χ. Πασχαλίδη, Αθήνα. Αρσένη Α.(1994). Κλινική Μικροβιολογία και εργαστηριακή διάγνωση των λοιμώξεων. Εκδόσεις ΖΗΤΑ. 136

137 Δημητρακόπουλος Γ.(1993) Ιατρική βακτηριολογία. Ιατρικές εκδόσεις Πασχαλίδης. Κέντρο Ελέγχου & Πρόληψης Νοσημάτων (ΚΕΕΛΠΝΟ). ( Κουρέα - Κρεμαστινού Τ., Χατζηχριστοδούλου Χ. (2004). Οδηγίες καλής λειτουργίας κολυμβητικών δεξαμενών. Υπουργείο Υγείας & Κοινωνικής Αλληλεγγύης. ΕΣΔΥ, Εθνική Σχολή Δημόσιας υγείας. Μαργαρίτης Λ. Χ., Β.Κ. Γαλανόπουλος, Κ.Ε. Κεραμάρης, Ε.Σ Μαρίνος, Ι.Σ. Παπασιδέρη, Δ.Ι. Στραβοπόδης, Ι.Π. Τρουγκάκος. Βιολογία κυττάρου. Τέταρτη έκδοση. Ιατρικές εκδόσεις Λίτσας. (2008). Μαυρίδου Α., Βανταράκης Α., Ευστρατίου Μ.Α., Αρβανιτίδου-Βαγιωνά Μ.(2014). Μικροβιολογία και επιδημιολογία νερού, θεωρία και τεχνικές. Πασχαλίδης. Παπαπετροπούλου Μαρία, Αθηνά Μαυρίδου.(1995). Μικροβιολογία του υδάτινου περιβάλλοντος-βασικές αρχές. Εκδόσεις: Π.Τραυλος-Ε. Κωσταράκη. Πόγγας Ν., Χάρβαλου A.(2011) Ιατρική μικροβιολογία, βακτηριολογία, ιολογία, παρασιτολογία, μυκητολογία. Εκδόσεις Οδυσσέας. Σαμολάδα Μ., Κουτσουμάνης Κ. (2011). Εργαστηριακές Ασκήσεις Γενικής Μικροβιολογίας, Ανώτατη Γεωπονική Σχολή Θεσσαλονίκης ΦΕΚ 87/Β/ Περί κολυμβητικών δεξαμενών µετά οδηγιών κατασκευής και λειτουργίας αυτών. Χρυσικόπουλος Κ. (2008). Καθαρισμός του νερού. Πανεπιστημιακές σημειώσεις- Πανεπιστήμιο Πατρών. 137

138 138

139 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ 139

140 140

141 Μέρος των αποτελεσμάτων της παρούσας έρευνας παρουσιάστηκαν με προφορική ομιλία στο 7 ο Διεθνές Συνέδριο Κολυμβητικών Δεξαμενών, λουτρών ευεξίας και υδροθεραπείας που πραγματοποιήθηκε 2-5 Μάιου 2017 στο νησί της Κω. 141

142 THE EFFECTS OF ULTRAVIOLET ON BACTERIAL VIABILITY IN A LABORATORY SWIMMING POOL MODEL. Nikolopoulos G., Birmpa A. and Vantarakis A. Department of Public Health, Medical School, Patras, Greece Aims Swimming pools are an ideal place for exercise, amusement and relaxation. But they are also an ideal place for bacteria to grow, which may cause illness to humans. Until now, the only effective way, to disinfect the water, was the addition of chemicals (mainly chlorine), but with major drawbacks (production of trihalomethanes) for humans and the environment. An alternative, promising and environmentally friendly disinfection method is the use of UV light. Using UV for disinfection lowers the chemical cost and usage, lowers disinfection by-products and provide for less intensive maintenance. The aim of this study was to evaluate the effects of UV exposure (UV-C) on various microorganisms by using a laboratory model of a swimming pool which simulates the conditions of an actual swimming pool. Materials & methods The model pool simulated an actual swimming pool of Olympic dimensions and was constructed from Plexiglas material, in scale 1:250. The tank dimensions where 33x25x2 cm and the maximum capacity was 45 liters. A peristaltic pump circulated the water at a flow rate of 18L/h. A 10-watt UV lamp (set at 254 nanometers wavelength) with maximum purification capacity of 500 liters per hour was used. A thermostat was placed at the center of the model pool to keep the temperature at 25 C. Throughout the course of the experiments the ph ranges from 7.2 to 8.2. The bacterial strains used were: Escherichia coli NCTC 9001, Staphylococcus aureus NCTC 6571, Pseudomonas aeruginosa NCTC and Enterococcus faecalis NCTC 775. These bacteria are mainly used as indicators in swimming pools. The water was circulated for two and a half hours with the UV light turned off, to allow the system to settle in the pool. At that time a sample was collected, and then the UV light was turned on. Samples were collected at varying intervals up to two days. All water samples were analyzed by membrane filtration technique. Standard techniques used always during sampling. The microbiological treatment performed according to ISO 16266:2006 for Pseudomonas aeruginosa, ISO :2000 for Enterococcus faecalis and ISO :2000 for Escherichia coli. DAY NUMBER OF SAMPLING RECIRCULATION/UV 1 1 st AFTER 2.5h/0 min 200 ml 1 2 nd Yes/15 min 200 ml 1 3 rd Yes/30 min 200 ml 1 4 th Yes/60 min 200 ml 1 5 th Yes/120 min 200 ml 1 6 th Yes/180 min 200 ml 2 7 th No/0 min 200 ml 2 8 th Yes/150 min 200 ml 2 9 th Yes/300 min 200 ml Table 1. Sample collection of 1 st and 2nd day SAMPLING VOLUME/ADDITION OF STERILE TAP WATER 142