ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΕΝΗ ΠΡΩΤΕΪΝΙΚΗ ΚΙΝΑΣΗ MuSK ΚΑΙ ΧΡΗΣΗ ΤΗΣ ΓΙΑ ΤΗΝ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΑΝΤΙΓΟΝΟΕΙΔΙΚΗΣ ΘΕΡΑΠΕΙΑΣ ΤΗΣ MuSK- ΕΞΑΡΤΩΜΕΝΗΣ ΒΑΡΙΑΣ ΜΥΑΣΘΕΝΕΙΑΣ ΣΚΡΙΑΠΑ ΛΑΜΠΡΙΝΗ ΒΙΟΧΗΜΙΚΟΣ-ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΟΣ ΠΑΤΡΑ

2 Επταμελής Εξεταστική Επιτροπή 1. Αναπληρωτής Καθηγητής Κωνσταντίνος Πουλάς (Επιβλέπων) 2. Ομότιμος Καθηγητής Σωκράτης Τζάρτος 3. Αναπληρωτής Καθηγητής Γεώργιος Πατρινός 4. Καθηγητής Χρήστος Κοντογιάννης 5. Αναπληρωτής Καθηγήτρια Ευαγγελία Παπαδημητρίου 6. Αναπληρωτής Καθηγητής Γρηγόρης Σιβολαπένκο 7. Επίκουρος Καθηγητής Σταύρος Τοπούζης H παρούσα έρευνα έχει συγχρηματοδοτηθεί από την Ευρωπαϊκή Ένωση (Ευρωπαϊκό Κοινωνικό Ταμείο - ΕΚΤ) και από εθνικούς πόρους μέσω του Επιχειρησιακού Προγράμματος «Εκπαίδευση και Δια Βίου Μάθηση» του Εθνικού Στρατηγικού Πλαισίου Αναφοράς (ΕΣΠΑ) Ερευνητικό Χρηματοδοτούμενο Έργο: ΘΑΛΗΣ. Επένδυση στην κοινωνία της γνώσης μέσω του Ευρωπαϊκού Κοινωνικού Ταμείου. 2

3 ΠΙΝΑΚΑΣ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΩΝ Πρόλογος Η παρούσα διατριβή εκπονήθηκε στο εργαστήριο Μοριακής Νευροβιολογίας και Ανοσολογίας του Ελληνικού Ινστιτούτου Παστέρ σε συνεργασία με το εργαστήριο Μοριακής Βιολογίας και Ανοσολογίας του τμήματος Φαρμακευτικής, του Πανεπιστημίου Πατρών, κατά το χρονικό διάστημα Αρχικά, θα ήθελα να ευχαριστήσω τον ομότιμο καθηγητή κ. Σωκράτη Τζάρτο, για την επιστημονική καθοδήγηση σε όλη την πορεία της εργασίας και για την ευκαιρία που μου παρείχε να αποκομίσω σημαντικές εμπειρίες στην έρευνα δουλεύοντας στο εργαστήριό του. Επιπλέον, θα ήθελα να εκφράσω τις θερμές ευχαριστίες μου στον αναπληρωτή καθηγητή κ. Κωνσταντίνο Πουλά για την πολύτιμη και πάντα αισιόδοξη υποστήριξη του σε οτιδήποτε χρειάστηκα όλα αυτά τα χρόνια. Ιδιαίτερα ευχαριστώ την κα Παρασκευή Ζησιμοπούλου για την καθοδήγηση και την επίβλεψη της σε όλα τα στάδια της εργασίας. Η υποστήριξη και η βοήθειά της ήταν καταλυτική για την ολοκλήρωση της προσπάθειας μου. Επίσης, θα ήθελα να ευχαριστήσω τις κτηνιάτρους κα Ειρήνη Φραγκιαδάκη και κα Μαρία Λινού για την άψογη συνεργασία μας και την πολύτιμη βοήθειά τους. Καθώς και την νεφρολόγο κα Ειρήνη Γράψα για την βοήθεια της στα πειράματα με το μηχάνημα Cobe Spectra. Ευχαριστώ πολύ τον κ. Νίκο, τον Πέτρο, τον Μάριο, τον Νίκο, τον Κώστα, τη Μαρία, τον Χρήστο, τη Δάφνη, τη Γιώτα, τον Λευτέρη, τον Τάσο και την Ειρήνη για τη συναδελφικότητα, τη φιλική συμπεριφορά καθώς επίσης και για τις στιγμές γέλιου που μοιραστήκαμε αυτά τα τέσσερα χρόνια στο εργαστήριο. Τέλος, θα ήθελα να πω ένα πολύ μεγάλο ευχαριστώ από καρδιάς στους αγαπημένους μου γονείς, στον αδερφό μου και στον άντρα μου για την παρουσία τους δίπλα μου σε κάθε εύκολη ή δύσκολη στιγμή και για τη συνεχή ενθάρρυνσή τους καθ όλη την πορεία των σπουδών μου. Αφιερώνω σε αυτούς τους τέσσερις ανθρώπους τη διατριβή μου διότι ξεχωριστά ο καθένας συνέβαλλε ανεκτίμητα και με διαφορετικό τρόπο για την πραγματοποίησή της. 3

4 ΠΙΝΑΚΑΣ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΩΝ Πρόλογος... 3 Πίνακας Περιεχομένων... 4 Πίνακας Συντομογραφιών Εισαγωγή Νευρομυϊκή σύναψη (NMJ) Ο υποδοχέας της ακετυλοχολίνης (AChR) Ειδική μυϊκή κινάση (MuSK) Δομή της MuSK Ο ρόλος της MuSK στη νευρομυϊκή σύναψη Μυασθένεια Gravis Ιστορική αναδρομή Επιδημιολογία της νόσου Κλινικά χαρακτηρηστικά της νόσου Ετερογένεια της νόσου Παθοφυσιολογία της νόσου Γενετική της μυασθένειας Παθογένεια της νόσου Διάγνωση της νόσου Θεραπευτικές προσεγγίσεις για τη μυασθένεια Σύγχρονες θεραπείες Αντιχολινεστερικά φάρμακα Θεραπευτικές προσεγγίσεις με στόχο το ανοσοποιητικό σύστημα Θεραπείες σε κλινικό στάδιο και πειραματικές θεραπευτικές προσεγγίσεις MuSK μυασθένεια Gravis Στόχος της διδακτορικής διατριβής Υλικά και Μέθοδοι Υλικά Εργαστηριακός εξοπλισμός Αναλώσιμα Αντιδραστήρια Αντισώματα Κυτταρικές σειρές Ζώα εργαστηρίου Διαλύματα και Θρεπτικά Υλικά

5 ΠΙΝΑΚΑΣ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΩΝ Πλασμιδιακός φορέας κλωνοποίησης (cloning vector) pbluescript και βακτήρια Εscherichia coli Πλασμιδιακός φορέας κλωνοποίησης (cloning vector) ppiczα και μύκητας Pichia Pastoris Πλασμιδιακός φορέας κλωνοποίησης (cloning vector) pcdna3.1/myc-his και κυτταρικές σειρές COS-7 και HEK Πλασμιδιακός φορέας κλωνοποίησης (cloning vector) pet-15b και βακτήρια Εscherichia coli Μέθοδοι Αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης (PCR) Υγρές και στερεές καλλιέργειες βακτηριακών κυττάρων Escherichia coli Μετασχηματισμός βακτηρίων Υποκλωνοποίηση (subcloning) δίκλωνου τμήματος DNA σε πλασμιδιακό φορέα Πέψη DNA µε περιοριστικές ενδονουκλεάσες (Restriction reaction) Αποφωσφορυλίωση γραµµικού πλασµιδιακού DNA (DNA dephosphorylation) Αντίδραση σύνδεσης (ligation) Παρασκευή πλασµιδιακού DNA από καλλιέργειες βακτηρίων Παρασκευή πλασµιδιακού DNA σε μικρή κλίµακα (mini-prep) Παρασκευή πλασµιδιακού DNA σε µεγάλη κλίµακα (maxi-prep) Καθαρισμός πλασμιδιακού DNA (DNA purification) Με εκχύλιση με οργανικούς διαλύτες Με συστηματοποιημένες χρωματογραφικές μεθόδους Κατακρήµνιση του DNA (DNA precipitation) Ποσοτική ανάλυση δείγματος DNA Ποιοτική ανάλυση δείγµατος DNA Έκφραση της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης σε βακτήρια Escherichia coli Υγρές και στερεές καλλιέργειες κυττάρων P. pastoris Μετασχηµατισµός κυττάρων P. pastoris με ηλεκτροδιάτρηση (electroporation) Έκφραση των ανασυνδυασµένων πρωτεϊνών από μετασχηματισμένα κύτταρα P. pastoris (Protein expression) Απομόνωση των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών από υπερκείµενο καλλιέργειας P. pastoris (Protein isolation) Έκφραση πρωτεϊνών στη κυτταρική σειρά COS Παροδική επιμόλυνση COS-7 κυττάρων για έκφραση πρωτεϊνών Σταθερή έκφραση πρωτεϊνών στη κυτταρική σειρά COS Έκφραση πρωτεϊνών στη κυτταρική σειρά HEK Παροδική επιμόλυνση ΗΕΚ293 κυττάρων για την έκφραση της MuSK-ECD f. 79 5

6 ΠΙΝΑΚΑΣ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΩΝ Καθαρισµός ανασυνδυασµένων πρωτεϊνών (Protein purification) Καθαρισμός πρωτεϊνών με υγρή χρωματογραφία συγγένειας (Affinity chromatography) από στήλη Ni-ΝΤΑ αγαρόζης Καθαρισμός πρωτεϊνών με υγρή χρωµατογραφία µοριακής διήθησης (Size exclusion chromatography) Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών υπό αποδιατακτικές συνθήκες (SDS-PAGE electrophoresis Ανοσοαποτύπωση πρωτεϊνών (Western blotting) Χρωµατοµετρική μέθοδος Bradford για την ποσοτικοποίηση πρωτεϊνών In vitro απογλυκοζυλίωση πρωτεϊνών Κυτταρικές σειρές Σήμανση πρωτεΐνης με 125Ι με τη μέθοδο της χλωραμίνης Τ Παρασκευή στηλών σεφαρόζης με ανασυνδυασμένα πολυπετίδια Ανοσοπροσρόφηση MuSK αντισωμάτων από ορούς MuSK μυασθενών Αναγέννηση των ανοσοπροσροφητών και έκλουση των MuSK αντισωμάτων Ραδιοανοσολογικός (RIA) προσδιορισμός MuSK αντισωμάτων Καθορισμός υποτάξεων των MuSK αντισωμάτων IgG Απομόνωση IgG ανοσοσφαιρινών απο πλάσμα MuSK μυασθενών Ανοσοποίηση ζώων Ενεργητική ανοσοποίηση κουνελιών με MuSK-ECD Aνοσοποίηση ποντικιών μέσω παθητικής μεταφοράς ανθρώπινων αντισωμάτων Ex-vivo πειράματα ανοσοπροσρόφησης Χρώση ολόκληρων ιστών ποντικών Αποτελέσματα Έκφραση του ολόκληρου εξωκυτταρικού τμήματος της MuSK (MuSK-ECD f ) στον P. pastoris Απομόνωση της MuSK-ECD f πρωτεΐνης Χαρακτηρισμός της MuSK-ECD f πρωτεΐνης με χρωματογραφία μοριακής διήθησης Ποσοτική ανάλυση της MuSK-ECD f πρωτεΐνης Έκφραση του εξωκυτταρικού τμήματος της MuSK χωρίς την κυστεϊνική περιοχή (MuSK-ECD ΔFz ) στον P. pastoris Σχεδιασμός και κατασκευή του MuSK-ECDΔFz και του ανασυνδυασμένου πλασμιδίου για έκφραση στον P. pastoris Μετασχηματισμός των X33 κυττάρων του P. pastoris με το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο ppiczαa το οποίο φέρει το MuSK-ECD ΔFz Έλεγχος έκφρασης της MuSK-ECD ΔFz πρωτεΐνης στο στέλεχος X33 του P. pastoris σε καλλιέργειες μικρής κλίμακας

7 ΠΙΝΑΚΑΣ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΩΝ Έκφραση της MuSK-ECD ΔFz πρωτεΐνης και απομόνωση από καλλιέργειες μεγάλης κλίμακας Απομόνωση της MuSK-ECD ΔFz πρωτεΐνης Χαρακτηρισμός της MuSK-ECD ΔFz πρωτεΐνης με χρωματογραφία μοριακής διήθησης Ποσοτική ανάλυση της απομονωμένης MuSK-ECD ΔFz πρωτεΐνης Έκφραση του εξωκυτταρικού τμήματος της MuSK χωρίς την κυστεϊνική περιοχή (MuSK-ECD ΔFz ) στη κυτταρική σειρά ΗΕΚ Έκφραση του ολόκληρου εξωκυτταρικού τμήματος της MuSK (MuSK-ECD f ) στη κυτταρική σειρά ΗΕΚ Έκφραση του MuSK-ECDf στη κυτταρική σειρά COS Έκφραση του εξωκυτταρικού τμήματος της MuSK σε βακτηριακά κύτταρα E. Coli Χρήση της βακτηριακής MuSK-ECD f στην αντιγονοειδική θεραπευτική προσέγγιση για τη μυασθένεια: Πείραμα ανταγωνισμού Χρήση της βακτηριακής MuSK-ECD f στην αντιγονοειδική θεραπευτική προσέγγιση για τη μυασθένεια: Ανοσοπροσρόφηση των MuSK αντισωμάτων από ορούς MuSK-μυασθενών Τιτλοδότηση των στηλών ανοσοπροσρόφησης Χρήση των MuSK-ECD f και MuSK-ECD ΔFz πρωτεϊνών από καλλιέργειες P.pastoris στην αντιγονοειδική θεραπευτική προσέγγιση για τη μυασθένεια Ανοσοπροσρόφηση των MuSK αντισωμάτων από ορούς MuSK-μυασθενών Χαρακτηρισμός των στηλών MuSK-ECD f και MuSK-ECD ΔFz Ειδικότητα των στηλών ανοσοπροσρόφησης Χρόνος επώασης για την αφαίρεση των MuSK-αντισωμάτων Τιτλοδότηση των στηλών ανοσοπροσρόφησης Ανακύκλωση ανοσοπροσροφητών Σταθερότητα των ανοσοπροσροφητών κατά τη διάρκεια της αντίδρασης ανοσοπροσρόφησης Σταθερότητα του MuSK-ECD f ανοσοπροσροφητή κατά την αποθήκευσή του Πειράματα ανοσοπροσρόφησης σε μέτρια κλίμακα Ex vivo πειράματα ανοσοπροσρόφησης Παθητική μεταφορά MuSK αντισωμάτων σε ποντίκια Συζήτηση Περίληψη Abstract Βιβλιογραφία Παράρτημα

8 ΠΙΝΑΚΑΣ ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΩΝ Πίνακας Συντομογραφιών αbtx: a-bungarotoxin: α-βουγκαροτοξίνη ACh: acetylcholine: ακετυλοχολίνη AChR: acetylcholine receptor: νικοτινικός υποδοχέας της ακετυλοχολίνης BSA: Bovine Serum Albumin: Βόειος ορός-αλβουμίνη cdna: complementary DΝΑ: συμπληρωματικό δεοξυριβονουκλεϊκό οξύ cpm: counts per minute: κρούσεις ανά λεπτό CNBr:cyanogen bromide: κυανοβρομίδιο EAMG: Experimental Autoimmune Myasthenia Gravis: Πειραματική Αυτοάνοση Βαριά Μυασθένεια ECD: extracellular domain: εξωκυτταρική περιοχή FBS: Foetal Bovine Serum: ορός από έμβρυο βοός Fc: Fragment: σταθερή περιοχή αντισώματος HLA: Human Lymphocyte Antigens: ανθρώπινα λευκοκυτταρικά αντιγόνα HRP: horseradish peroxidase: υπεροξειδάση της ραπανίδος 125 I-αBTX: 125 I-labeled abtx : α-βουγκαροτοξίνη σημασμένη με 125 Ι Ig: immunoglobulin: ανοσοσφαιρίνη IPTG: Isopropyl-l-thio-α-D-galactosidase: Ισοπροπυλ-β-θειο-δ-γαλακτοσίδιο MG: Myasthenia Gravis: βαριά μυασθένεια MHC: Major Histocompatibility Complex: Μείζον σύμπλεγμα ιστοσυμβατότητας MIR: Main Immunogenic Region: Κύρια Ανοσογόνος Περιοχή mrna: messenger RNA: αγγελιοφόρο ριβονουκλεϊκό οξύ MuSK: Muscle Specific Kinase: ειδική μυϊκή κινάση Νi-NTA: σφαιρίδια νικελίου αγαρόζης NMJ: Neuromuscular Junction: νευρομυϊκή σύναψη O.D: Optical Density: οπτική πυκνότητα PBS: Phosphate Buffer Saline: ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών PCR: polymerase chain reaction: αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης PEG: polyethylene glycol: πολυαιθυλενική γλυκόλη Protein A or G: πρωτεΐνη Α ή G rpm: στροφές ανά λεπτό 8

9 Εισαγωγή

10 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1. Εισαγωγή 1.1 Νευρομυϊκή σύναψη (NMJ) Οι αλληλεπιδράσεις που αναπτύσσονται μεταξύ των κινητικών νευρικών αξόνων και των μυϊκών ινιδίων, έχουν ως αποτέλεσμα τον σχηματισμό μιας πολύπλοκης σύναψης μεταξύ τους, η οποία ονομάζεται νευρομυϊκή σύναψη. Η νευρομυϊκή σύναψη αποτελείται από τρία βασικά μέρη (Εικόνα 1.1): το προσυναπτικτικό τελικό κινητικό νεύρο, όπου ο νευροδιαβιβαστής ακετυλοχολίνη συντίθεται και αποθηκεύεται, τη συναπτική σχισμή και τη μετασυναπτική μυϊκή μεμβράνη, η οποία περιέχει τους υποδοχείς της ακετυλοχολίνης (AChRs). Η μετάδοση του νευρομυϊκού σήματος ξεκινά όταν νευρικά δυναμικά δράσης εφαρμόζονται στο τελικό κινητικό νεύρο και οδηγούν στην απελευθέρωση της ακετυλοχολίνης. Έτσι, τα ιοντικά κανάλια ασβεστίου ανοίγουν και η εισροή ιόντων Ca ++ οδηγεί στη σύντηξη των συναπτικών κυστιδίων, τα οποία περιέχουν την ακετυλοχολίνη, με τη μεμβράνη και τελικά στην απελευθέρωση της ακετελοχολίνης στη συναπτική σχισμή (Heuser et al., 1979). Η ακετυλοχολίνη διαχέεται μέσα στη συναπτική σχισμή ώσπου αλληλεπιδρά με τους AChRs στη μετασυναπτική μυϊκή μεμβράνη (άνοιγμα του ιοντικού πόρου του AChR) προκαλώντας μία τοπική εκπόλωση η οποία αποτελεί το δυναμικό της τελικής κινητικής πλάκας (endplate potential, EPP). Σε φυσιολογικές νευρομυϊκές συνάψεις, το EPP υπερβαίνει την ουδό ενεργοποίησης με αποτέλεσμα τη διέγερση των μυϊκών ινών. Τελικά, η δράση της ακετυλοχολίνης στη μετασυναπτική μεμβράνη θα τερματιστεί από τη δράση της ακετυλοχολινεστεράσης. Σε μη φυσιολογικές μυϊκές συνάψεις, όπως αυτές που εμφανίζονται σε ασθένειες όπως η Βαριά μυασθένεια (myasthenia Gravis), η οποία θα αναλυθεί στη συνέχεια εκτενέστερα, η μείωση των λειτουργικών AChRs οδηγεί σε μειωμένο εύρος του EPP, το οποίο βρίσκεται κάτω από το όριο που είναι απαραίτητο για τη διέγερση των μυϊκών ινών μετά από επαναλαμβανόμενες εκπολώσεις, με τελικό αποτέλεσμα την αποτυχία της νευρομυϊκής μετάδοσης (Vincent et al., 2000). 10

11 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Εικόνα 1.1: Σχηματική απεικόνιση της νευρομυϊκής σύναψης και των μορίων που συμμετέχουν στη συναπτική διαβίβαση (Meriggioli and Sanders 2009), τροποποιημένη) Ο υποδοχέας της ακετυλοχολίνης (AChR) Ο υποδοχέας της ακετυλοχολίνης (AChR) είναι μία διαμεμβρανική γλυκοπρωτεΐνη, η οποία αποτελείται από 5 υπομονάδες και συναντάται σε δύο ισομορφές (Lindstrom et al., 2008). Ο AChR στους ενηλίκους αποτελείται από δύο α-υπομονάδες και ένα αντίγραφο από κάθε μία από τις β-, δ- και ε-υπομονάδες (Εικόνα 1.2Α), σε αντίθεση με τον εμβρυϊκό υποδοχέα, ο οποίος περιέχει μια γ- αντί της ε-υπομονάδας (Martinou and Merlie 1991; Missias et al., 1996). Παρόλα αυτά, ο υποδοχέας εμβρυϊκού τύπου, διατηρείται σε ορισμένους ενήλικους μυϊκούς ιστούς όπως τα μυοειδή κύτταρα του θύμου αδένα και κάποιους εξωτερικούς οφθαλμικούς μύες (Horton et al., 1993; Missias et al., 1996; Gattenlohner et al., 2002). H αλλαγή στη σύνθεση των υπομονάδων του υποδοχέα μεταβάλλει τα ηλεκτροφυσιολογικά χαρακτηριστικά του, όπως για παράδειγμα την αγωγιμότητα του ιοντικού διαύλου, καθώς επίσης και τα φαρμακολογικά και μεταβολικά χαρακτηριστικά του (Bouzat et al., 1994; Yumoto et al., 2005). Μεταξύ των υπομονάδων του AChR υπάρχει υψηλή ομολογία στην αλληλουχία των αμινοξέων, με κάθε μία υπομονάδα να περιέχει τέσσερις α-έλικες (M1-M4) οι οποίες εκτείνονται στην κυτταροπλασματική μεμβράνη (Εικόνα 1.2Α). Η ακετυλοχολίνη συνδέεται στην εξωτερική επιφάνεια του εξωκυτταρικού τμήματος της α-υπομονάδας του AChR. Το κανάλι του υποδοχέα για να ανοίξει συνήθως απαιτεί σύνδεση με δύο μόρια ακετυλοχολίνης. Η εξωκυττάρια 11

12 ΕΙΣΑΓΩΓΗ επιφάνεια του AChR του σκελετικού μυός περιέχει πολλούς επιτόπους για σύνδεση με αντισώματα και έχει την ικανότητα να διευκολύνει την ταυτόχρονη δέσμευση διαφορετικών αντισωμάτων (Hughes et al., 2004). Η κύρια ανοσογόνος περιοχή (MIR) βρίσκεται στην ανώτερη εξωτερική θέση της εξωκυττάριας μοίρας της α- υπομονάδας του AChR και είναι η περιοχή όπου κατευθύνονται τα περισσότερα αντισώματα στην κλινική και πειραματική αυτοάνοση μυασθένεια (Tzartos et al., 1985; Tzartos et al., 1998). Εικόνα 1.2: Σχηματική αναπαράσταση της δομής του υποδοχέα της ακετυλοχολίνης. Α) Ο υποδοχέας συνίσταται από πέντε υπομονάδες, διευθετημένες γύρω από έναν κεντρικό άξονα Β) Κάθε υπομονάδα συγκροτείται από μια αμινοτελική εξωκυττάρια περιοχή, τέσσερις διαμεμβρανικές περιοχές (Μ1-Μ4) και μια κυτταροπλασματική περιοχή μεταξύ της Μ3 και Μ4 έλικας (Karlin 2002) Ειδική μυϊκή κινάση (MuSK) Η ειδική μυϊκή κινάση (muscle specific kinase, MuSK) είναι μία διαμεμβρανική πρωτεΐνη, η οποία διαδραματίζει ένα σημαντικό ρόλο στη μετάδοση του σήματος μεταξύ των κινητικών νευρώνων και των σκελετικών μυών. Η MuSK εκφράζεται στα κύτταρα των σκελετικών μυών και όταν ενεργοποιείται εκκινεί μονοπάτια τα οποία: συσσωματώνουν και αγκυροβολούν τους AChR και επιπρόσθετες μυϊκές πρωτεΐνες οι οποίες είναι σημαντικές για τη συναπτική διαβίβαση, ενισχύουν τη μεταγραφή γονιδίων τα οποία κωδικοποιούν για συναπτικές πρωτεΐνες 12

13 ΕΙΣΑΓΩΓΗ επάγουν την παραγωγή ανάστροφων σημάτων τα οποία ενεργοποιούν την προσυναπτική διαφοροποίηση. Όταν η MuSK πρωτεΐνη απουσιάζει, οι νευρομυϊκές συνάψεις αποτυγχάνουν να σχηματιστούν (DeChiara et al., 1996). Μεταλλάξεις οι οποίες επηρεάζουν την ενεργοποίηση της MuSK ή τα σηματοδοτικά βήματα που ακολουθούν μετά την ενεργοποίησή της προκαλούν συγγενή μυασθένεια η οποία χαρακτηρίζεται από δομικά και λειτουργικά ελλατωματικές συνάψεις, οδηγώντας σε μυϊκή αδυναμία και κούραση (Beeson et al., 2006; Muller et al., 2007; Selcen et al., 2008) Δομή της MuSK Το γονίδιο της MuSK του ποντικιού αποτελείται από τουλάχιστον 15 εξώνια τα οποία βρίσκονται σε διαφορετικές θέσεις πάνω στο χρωμόσωμα 4 (Valenzuela et al., 1995). Το ανθρώπινο ορθόλογο είναι το χρωμόσωμα 9. Η παρουσία πολλαπλών τόπων έναρξης της μεταγραφής, καθώς και διαφορετικών ρυθμιστικών αλληλουχιών στον υποκινητή της MuSK προϋποθέτει τη δυνατότητα ελέγχου έκφρασης της MuSK με διάφορα ρυθμιστικά συστήματα. Η εκφρασμένη MuSK αποτελείται από 860 έως 893 αμινοξέα, με προβλεπόμενο μοριακό βάρος 95,6-99,6 kda ανάλογα με την ισομορφή. Η MuSK αποτελείται από μία εξωκυτταρική περιοχή η οποία περιέχει τρεις περιοχές τύπου-ανοσοσφαιρίνης (Ig-like) και μία περιοχή πλούσια σε κυστεΐνες παρόμοια με αυτή των Wnt-υποδοχέων (Frizzled-like CRD), μία διαμεμβρανική και μία κυτταροπλασματική περιοχή η οποία περιέχει την καταλυτική περιοχή της κινάσης (Εικόνα 1.3A). Η πρώτη περιοχή τύπου-ανοσοσφαιρίνης (Ig1) σχηματίζει ένα ομοδιμερές. Μεταλλάξεις στην υδροφοβική επιφάνεια διμερισμού ή ακόμη και έλλειψη ολόκληρης της πρώτης περιοχής τύπου-ανοσοσφαιρίνης αποτρέπουν την ενεργοποίηση της MuSK από την αγρίνη (Zhou et al., 1999; Stiegler et al., 2006). Επίσης, η περιοχή αυτή εμπλέκεται στη σύνδεση της MuSK με την LRP4 όπου μεταλλάξεις σε κατάλοιπα της διαλυτής περιοχής της, αποτρέπουν την αλληλεπίδραση των δύο πρωτεϊνών και μπλοκάρουν την ενεργοποίηση της MuSK από την αγρίνη (Stiegler et al., 2006; Zhang et al., 2011). Τα παραπάνω 13

14 ΕΙΣΑΓΩΓΗ αποτελέσματα ενισχύουν την πιθανότητα η σύνδεση της MuSK στην LRP4 να κατευθύνει την υδροφοβη επιφάνεια διμερισμού και να επάγει τον σηματισμό ή τη σταθερότητα του ομοδιμερούς της MuSK. Η περιοχή πλούσια σε κυστεΐνες (Frizzled-like CRD) αποτελείται από 10 κατάλοιπα κυστεϊνών, τα οποία σχηματίζουν πέντε δισουλφιδικούς δεσμούς (Masiakowski and Yancopoulos 1998; Xu and Nusse 1998). Η περιοχή αυτή δεν απαιτείται για την ενεργοποίηση της MuSK από την αγρίνη αλλά είναι πιθανό να συνδέεται με διαφορετικούς προσδέτες, όπως οι Wnts, και να ενεργοποιεί έτσι τη MuSK (Zhou et al., 1999; Jing et al., 2009). Η κυτταροπλασματική περιοχή αποτελείται από μία παραμεμβρανική περιοχή περιοχή 52 αμινοξέων, μία τυπική περιοχή κινάσης η οποία περιέχει τρία κατάλοιπα τυροσίνης μέσα στη θηλιά ενεργοποίησης και μια καρβοξυτελική αλληλουχία 8 αμινοξέων (Jennings et al., 1993; Valenzuela et al., 1995; Till et al., 2002). Συνολικά 4 κατάλοιπα τυροσίνης, τρία στη θηλιά ενεργοποίησης και ένα στη παραμεμβρανική περιοχή αποτελούν τις κύριες θέσεις φωσφορυλίωσης της MuSK (Watty et al., 2000; Till et al., 2002). Εικόνα 1.3: A. Η MuSK αποτελείται από μία εξωκυτταρική, μία διαμεμβρανική και μία κυτταροπλασματική περιοχή η οποία περιέχει την καταλυτική περιοχή της κινάσης. B. Το σηματοδοτικό μονοπάτι συνάθροισης των υποδοχέων ακετυλοχολίνης στη μεμβράνη. (Burden et al., 2013). 14

15 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Ο ρόλος της MuSK στη νευρομυϊκή σύναψη Η δράση της MuSK είναι απαραίτητη για το σχηματισμό και τη διατήρηση της νευρομυϊκής σύναψης (Jennings et al., 1993; Valenzuela et al., 1995; DeChiara et al., 1996). H MuSK δρα σε δύο φάσεις για το σχηματισμό των συνάψεων: 1. Παρευρίσκεται στην υποψήφια συναπτική περιοχή του μυός πριν τη νεύρωση 2. Αποκρίνεται στη νευρονική αγρίνη για να σχηματίσει και να σταθεροποιήσει τις συνάψεις. Πριν από τη νεύρωση, οι AChRs και άλλες συναπτικές πρωτεΐνες εκφράζονται και συγκεντρώνονται επιλεκτικά στην υποψήφια συναπτική περιοχή του μυός με ένα τρόπο που είναι ανεξάρτητος των διάφορων νευρικών σημάτων που λαμβάνονται αλλά εξαρτώμενος από τη MuSK (Lin et al., 2001; Yang et al., 2001; Burden 2011). Όταν η MuSK απουσιάζει, οι AChRs εκφράζονται άναρχα μέσα στο μυ και οι κινητικοί άξονες ενώ φτάνουν στο μυ, αποτυγχάνουν να τερματίσουν και διαχέονται άσκοπα χωρίς το σχηματισμό νευρομυϊκών συνάψεων (DeChiara et al., 1996). Αν και η MuSK παρευρίσκεται στο μυ (Kim and Burden 2008), δεν είναι ακόμη πλήρως κατανοητό πώς η έκφραση και η ενεργοποίηση της MuSK περιορίζεται στην υποψήφια συναπτική περιοχή. Η αγρίνη απελευθερώνεται από τους νευρώνες, συνδέεται άμεσα στην LRP4 και η σύνδεση αυτή ενεργοποιεί περαιτέρω την αλληλεπίδραση μεταξύ της MuSK και της LRP4 και τελικά αυξάνει τη φωσφορυλίωση της MuSK (Kim and Burden 2008; Zhang et al., 2008; Zhang et al., 2011). Όταν η MuSK φωσφορυλιωθεί, ενεργοποιείται το σηματοδοτικό μονοπάτι όπου τελικά η ραψίνη ενεργοποιείται και συνδέεται με τους AChRs για την αγκυροβόλησή τους στη μεμβράνη (Εικόνα 1.3B). Επίσης, με το ίδιο μονοπάτι εκτός από τη συσσωμάτωση των AChRs στη μεμβράνη επάγεται και η έκφραση γονιδίων τα οποία σχετίζονται με τη σύναψη. Η MuSK δεν απαιτείται μόνο για το σχηματισμό της νευρομυϊκής σύναψης κατά τη διάρκεια της εμβρυογένεσης αλλά είναι, επίσης, απαραίτητη και για τη διατήρηση της νευρομυϊκής σύναψης στους ενήλικες. Η μείωση της έκφρασης της MuSK σε ενήλικα ποντίκια, είτε μέσω παρεμβολής του RNA ή μέσω απενεργοποίησης του γονιδίου της MuSK οδηγεί σε αποσυναρμολόγηση της μετασυναπτικής μεμβράνης και αποσταθεροποίηση της σύναψης (Kong et al., 2004; Hesser et al., 2006). 15

16 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1.2 Μυασθένεια Gravis Ιστορική αναδρομή Η μυασθένεια περιγράφηκε για πρώτη φορά το 1672 από τον ιατρό Thomas Willis, ο οποίος περιέγραψε την περίπτωση μιας ασθενούς με διαλείπουσα αδυναμία στους σκελετικούς μύες των άκρων, σταδιακή αδυναμία στους μύες της γλώσσας με αποτέλεσμα δυσκολίες στην ομιλία αλλά και αυξομειώσεις στην ένταση των συμπτωμάτων κατά τη διάρκεια της ημέρας. Μεταξύ άλλων αναφορών, το 1985 ο Jolly περιέγραψε δύο περιπτώσεις ασθενών με παρόμοια κλινικά συμπτώματα και έδωσε στη νόσο αυτή, το όνομα Myasthenia gravis pseudoparalytica. Τους όρους myasthenia και pseudoparalytica τους άντλησε από την ελληνική γλώσσα, ενώ ο όρος gravis είναι λατινικός και σημαίνει οξύς, επιθετικός (Thanvi and Lo 2004). Το 1934, η Mary Walker παρατήρησε ότι τα συμπτώματα της μυασθένειας είναι παρόμοια με εκείνα της δηλητηρίασης από κουράριο, τα οποία θεραπεύονταν με φυσοστιγμίνη (physostigmine), έναν αναστολέα της χολινεστεράσης και έδειξε ότι η αγωγή με φυσοστιγμίνη βελτιώνει τα συμπτώματα της νόσου (Walker 1935). Την ίδια χρονιά, οι Dale και Feldberg ανακάλυψαν την ακετυλοχολίνη, ως νευροδιαβιβαστή, στην τελική κινητική πλάκα και άνοιξαν το δρόμο για την κατανόηση της παθογένεσης της μυασθένειας (Dale and Feldberg 1934). Το 1960 προτάθηκε, για πρώτη φορά, ότι η μυασθένεια ανήκει στην κατηγορία των αυτοάνοσων νοσημάτων (Thanvi and Lo 2004) και το 1976 ανακαλύφθηκαν αυτοαντισώματα, τα οποία κατευθύνονται στον μυϊκό υποδοχέα της ακετυλοχολίνης (Lindstrom et al., 1976), καθώς επίσης και το ότι ο μυϊκός υποδοχέας είναι το κύριο αυτοαντιγόνο που εμπλέκεται στη νόσο. Μετά από αυτήν την ανακάλυψη, πολλές μελέτες έδειξαν μία αυτοάνοση απάντηση έναντι του AChR στη μυασθένεια και το ρόλο των AChR αντισωμάτων στη δομική και λειτουργική καταστροφή της νευρομυϊκής σύναψης. Αρκετά αργότερα, περιγράφηκαν αντισώματα έναντι της MuSK. Αυτά τα αντισώματα εμφανίζονται σε ένα μεγάλο ποσοστό μυασθενών οι οποίοι δεν φέρουν αντισώματα έναντι του μυϊκού υποδοχέα (Hoch et al., 2001). Πολύ πρόσφατα, περιγράφηκε η ύπαρξη και άλλων αυτοαντισωμάτων στη μυασθένεια όπως τα 16

17 ΕΙΣΑΓΩΓΗ αντισώματα έναντι της LRP4 (Low Density Lipoprotein Receptor Related Protein 4) και της αγρίνης (Shen et al., 2013; Gasperi et al., 2014) Επιδημιολογία της νόσου Η μυασθένεια είναι μια σχετικά σπάνια νόσος, η οποία προσβάλει όλες τις ηλικίες. Επιδημιολογικές μελέτες συνιστούν ότι η συχνότητα της ασθένειας συνεχώς αυξάνεται. Η χρήση εμπορικά διαθέσιμων τεχνικών για την ανίχνευση κυρίως των AChR αντισωμάτων αλλά και η βελτιωμένη επιδημιολογική μέθοδος που χρησιμοποιείται είναι οι κύριες εξηγήσεις για την παρατηρούμενη αυξημένη συχνότητα. Σε μία έρευνα η οποία συμπεριέλαβε 44 επιδημιολογικές μελέτες για τη μυασθένεια, ο αριθμός νέων περιπτώσεων ανά έτος (επίπτωση της νόσου) ποικίλει ανάμεσα σε 1,7 και 21,3 ανά ένα εκατομμύριο άτομα, εξαρτώμενος από την τοποθεσία της εκάστοτε μελέτης ενώ ο επιπολασμός της νόσου (συχνότητα εμφάνισης) κυμαίνεται μεταξύ 15 και 179 ανά ένα εκατομμύριο άτομα (Carr et al., 2010). Στην Αμερική, η συχνότητα εμφάνισης υπολογίστηκε σε περίπου 200 ανά ένα εκατομμύριο άτομα (Meriggioli and Sanders 2009) ενώ στην Ελλάδα έχει αυξηθεί σε περίπου 70 ανά ένα εκατομμύριο άτομα (Poulas et al., 2001). Αν και η μυασθένεια μπορεί να παρουσιαστεί σε οποιαδήποτε ηλικία, το φύλο και η ηλικία φαίνεται να επηρεάζουν μερικώς τα περιστατικά εμφάνισης της νόσου. Οι μυασθενείς κατηγοριοποιούνται ανάλογα με την ηλικία εμφάνισης της νόσου. Πριν από την ηλικία των 50 ετών, εκτεταμένες μελέτες δείχνουν ότι αυτή η γρήγορης-εμφάνισης μυασθένεια (early-onset MG, EOMG) χαρακτηρίζεται από την κυριαρχία των γυναικών (60 70%), ενώ ανάμεσα στα 50 και 60, δεν παρατηρείται φυλετική διαφορά (Carr et al., 2010). Η όψιμης-εμφάνισης μυασθένεια (late-onset MG, LOMG) εμφανίζεται μετά την ηλικία των 60 ετών και χαρακτηρίζεται από την ξεκάθαρη κυριαρχία των ανδρών (Alkhawajah and Oger 2013). Ανάλογα αποτελέσματα αποτυπώθηκαν σε μία Ελληνική έρευνα, όπου φάνηκε ότι σε ηλικίες κάτω των 40 ετών το ποσοστό γυναικών: ανδρών είναι περίπου 3:1. Ωστόσο μεταξύ 40 και 50 ετών αλλά και κατά τη διάρκεια της εφηβείας, τα ποσοστά είναι περίπου ίσα. Σε ηλικίες άνω των 50 ετών, η νόσος φαίνεται να προσβάλλει κυρίως τους άνδρες (Poulas et al., 2001). 17

18 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η παιδική μυασθένεια στην Ευρώπη και στη Βόρεια Αμερική είναι ασυνήθιστη και εμφανίζεται σε μόλις 10-15% των Καυκάσιων ασθενών της μυασθένειας (Eymard 1991) ενώ στην Ασία εμφανίζεται αρκετά συχνότερα και φτάνει και στο 50% των μυασθενών στην Κίνα, με τα οφθαλμικά συμπτώματα να ξεκινούν πριν από την ηλικία των 15 ετών (Zhang et al., 2007) Κλινικά χαρακτηριστικά της νόσου Τα τυπικά κλινικά χαρακτηριστικά της νόσου είναι η αδυναμία και η έντονη κόπωση των σκελετικών μυών, με επιδείνωση μετά από έντονη επαναλαμβανόμενη άσκηση και η ανάκτηση της μυϊκής δύναμης με την ανάπαυση (Drachman et al., 1998). Τα συμπτώματα ποικίλουν κατα τη διάρκεια της νόσου ενώ έχουν βρεθεί διάφοροι παράγοντες οι οποίοι σχετίζονται με την εξέλιξη της νόσου όπως η άσκηση, οι υψηλές θερμοκρασίες, οι μολύνσεις, οι συναισθηματικές διαταραχές αλλά και η χρήση συγκεκριμένων φαρμάκων (Grob et al., 1987; Vincent et al., 2001; Thanvi and Lo 2004). Τα αρχικά και παράλληλα πιο κοινά συμπτώματα της μυασθένειας, είναι η συμμετρική ή μη προσβολή των οφθαλμικών μυών, που οδηγεί σε πτώση των βλεφάρων και παροδική διπλωπία (Εικόνα 1.4). Η ασθένεια μπορεί να περιορίζεται σε ένα μόνο μυ και η αδυναμία να παραμένει εστιασμένη αλλά στις περισσότερες περιπτώσεις (85% των μυασθενών) η αδυναμία επεκτείνεται, και οι επόμενοι μύες που επηρεάζονται είναι οι προσωπικοί και οι περιοφθαλμικοί (Grob et al., 1987). Στην περίπτωση αυτή, οι ασθενείς εμφανίζουν δυσκολίες στην ομιλία, στη μάσηση, στη κατάποση αλλά και γενικότερα στις εκφράσεις του προσώπου (Grob et al., 1987). Στα επόμενα στάδια της νόσου παρατηρείται γενικευμένη αδυναμία η οποία μπορεί να είναι ήπιας, ενδιάμεσης ή βαριάς μορφής και αξιολογείται ανάλογα με τη βαρύτητα των κλινικών συμπτωμάτων του ασθενούς. Στην περίπτωση αυτή, επηρεάζονται σε μικρότερο ή μεγαλύτερο βαθμό οι μύες των άκρων του κορμού. Σε ορισμένους μυασθενείς, όταν προσβληθούν οι μύες του αναπνευστικού συστήματος, εκδηλώνονται μυασθενικές κρίσεις, οι οποίες εάν είναι τεταμένες, μπορούν να αποβούν θανατηφόρες (Oosterhuis 1989). 18

19 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Εικόνα 1.4 Μυασθενής με βλεφαρόπτωση Ετερογένεια της νόσου Η μυασθένεια είναι μια νόσος με υψηλή ετερογένεια και μπορεί να ταξινομηθεί σε διάφορες κατηγορίες ανάλογα με την ηλικία εκδήλωσης της ασθένειας, την παρουσία ή απουσία αντισωμάτων στον ορό των ασθενών αλλά και τη σοβαρότητα των κλινικών συμπτωμάτων. Ανάλογα με την ηλικία εμφάνισης της νόσου, η μυασθένεια μπορεί να ταξινομηθεί ως παροδική εμβρυϊκή μυασθένεια, παιδική μυασθένεια, μυασθένεια με πρώιμη εκδήλωση και μυασθένεια με όψιμη εκδήλωση (Vincent et al., 2001; Thanvi and Lo 2004). Η παροδική εμβρυϊκή μυασθένεια προκαλείται από τα μητρικά αντισώματα έναντι του υποδοχέα, όπου μέσω του πλακούντα, μεταφέρονται στο νεογέννητο και αλληλεπιδρούν με τους υποδοχείς του. Μόνο το 10-15% των νεογέννητων τα οποία φέρουν τέτοιου είδους αντισώματα εμφανίζουν συμπτώματα μυασθένειας τις πρώτες ώρες μετά τη γέννηση (Oosterhuis 1989; Newsom-Davis 1998). Η παιδική μυασθένεια είναι σπάνια νόσος και εμφανίζεται σε ηλικία μικρότερη των 15 ετών. Η μυασθένεια με πρώιμη εκδήλωση (early onset MG) εκδηλώνεται σε ηλικίες μικρότερες των 40 χρόνων, εμφανίζεται συνήθως στις γυναίκες, χαρακτηρίζεται από υπερπλασία του θύμου και οι περισσότεροι ασθενείς αυτού του τύπου μυασθένειας εμφανίζουν AChR αντισώματα. Στην μυασθένεια με όψιμη εκδήλωση (late onset MG), η ηλικία εκδήλωσης είναι μεγαλύτερη των 40 χρόνων, εμφανίζεται συνήθως στους άνδρες και χαρακτηρίζεται από ατροφία του θύμου. Μία διαφορετική κατηγοριοποίηση των μυασθενών προκύπτει από την ύπαρξη των διαφορετικών αντισωμάτων στον ορό τους. Οι ασθενείς με AChR αντισώματα αποτελούν το 85%-90% των ασθενών με γενικευμένη μυασθένεια και το 50-60% αυτών με οφθαλμική μυασθένεια. Η κατηγορία αυτή είναι η πιο κοινή και 19

20 ΕΙΣΑΓΩΓΗ καλύτερα μελετημένη (Vincent et al., 2000). Ένα ποσοστό περίπου 5-8% των ασθενών με γενικευμένη μυασθένεια παρουσιάζουν στον ορό τους αντισώματα έναντι της πρωτεΐνης MuSK (Hoch et al., 2001). Στο υπόλοιπο ποσοστό των μυασθενών δεν ανιχνεύονταν μέχρι πρόσφατα αντισώματα και για το λόγο αυτό χαρακτηρίζονταν ως οροαρνητικοί μυασθενείς. Πρόσφατα, ανιχεύτηκαν, σε μυασθενείς, αντισώματα έναντι της LRP4 αποκαλύπτοντας ένα νέο αυτοαντιγόνο για την μυασθένεια (Higuchi et al., 2011; Zhang et al., 2011; Pevzner et al., 2012; Zisimopoulou et al., 2013). Εκτός της LRP4, σε οροαρνητικούς μυασθενείς, έχουν βρεθεί αντισώματα έναντι των πρωτεϊνών αγρίνη και ColQ (υπομονάδα της ακετυλοχολινεστεράσης με ουρά κολλαγόνου) της νευρομυϊκής σύναψης (Weatherbee et al., 2006; Gasperi et al., 2014). Οι πρωτεΐνες αυτές φαίνεται να λειτουργούν επίσης ως αυτοαντιγόνα στη μυασθένεια. Τέτοια αντισώματα πιθανόν να έχουν παθογόνο ρόλο, αλλά προς το παρόν υπάρχουν λίγες διαθέσιμες πληροφορίες για τη δράση τους. Είναι ενδιαφέρον ότι κάποιοι μυασθενείς εμφανίζουν παράλληλα με τα AChR αντισώματα και αντισώματα τα οποία προσδένονται με ένα χαρακτηριστικό μοτίβο σε τομές σκελετικών και καρδιακών μυών. Είναι γνωστά ως αντισώματα έναντι των γραμμωτών μυών (anti-striational antibodies) και αναγνωρίζουν επιτόπους σε μια σειρά πρωτεϊνών των σκελετικών μυών όπως η μυοσίνη, η ακτίνη και η φιλαμίνη. Δύο τύποι ραβδωτών αντισωμάτων, κατευθύνονται έναντι των πρωτεϊνών της νευρομυϊκής σύναψης τιτίνη (titin) και υποδοχέα της ρυανοδίνης (RyR). Τέτοια αυτοαντισώματα εντοπίζονται στο 95% των μυασθενών με θύμωμα και στο 50% των μυασθενών με όψιμη εκδήλωση (Romi et al., 2005; Skeie et al., 2006). Ένας τρίτος τρόπος κατηγοριοποίησης της μυασθένειας πραγματοποιείται σύμφωνα με τη σοβαρότητα εκδήλωσης των κλινικών συμπτωμάτων. Το 2000 προτάθηκε από το Αμερικάνικό Ίδρυμα για τη μυασθένεια (Myasthenia Gravis Foundation of America) μια κλινική ταξινόμηση της νόσου η οποία είναι ιδιαιτέρως χρήσιμη στους κλινικούς γιατρούς για την αξιολόγηση των ασθενών και μπορεί να συμπληρώσει ή να αντικαταστήσει τις υπάρχουσες ταξινομήσεις (Πίνακας 1.1). Η κλίμακα αυτή βασίζεται στην κλίμακα Osserman (Osserman et al., 1958) στην οποία αναφέρεται ότι ως 1 η βαθμίδα θεωρείται όταν η νόσος εμφανίζεται εστιασμένη συνήθως στους οφθαλμικούς μύες. Η 2 η βαθμίδα χαρακτηρίζει τη γενικευμένη μορφή της νόσου, η οποία είναι είτε ελαφριάς μορφής είτε ενδιάμεσης μορφής. Στην 3 η 20

21 ΕΙΣΑΓΩΓΗ βαθμίδα κατατάσσεται η βαριάς μορφής γενικευμένη μυασθένεια ενώ στη 4 η κατατάσσονται ασθενείς με μυασθενική κρίση και αναπνευστική ανεπάρκεια. Πίνακας 1.1: Κλινική ταξινόμηση του Αμερικανικού Ιδρύματος για τη μυασθένεια (MGFA) (Jaretzki, et al, 2000) Ι ΙΙ Οποιαδήποτε μυϊκή αδυναμία οφθαλμικών μυών. Μπορεί να υπάρχει αδυναμία στη σύγκλιση των οφθαλμών. Η μυϊκή ισχύς σε όλους τους άλλους μύες είναι φυσιολογική. Ήπια μυϊκή αδυναμία που αφορά μη οφθαλμικούς μύες. Μπορεί να υπάρχει αδυναμία οφθαλμικών μυών όποιας βαρύτητας. ΙΙa ΙΙb Κυρίως προσβολή μυών των άκρων, αξονικών μυών ή και τα δύο. Μπορεί να υπάρχει μικρότερη προσβολή στοματοφαρυρυγγικών μυών. Κυρίως προσβολή στοματοφαρυγγικών, αναπνευστικών μυών ή και τα δύο. Μπορεί να υπάρχει μικρότερη ή ίση προσβολή μυών των άκρων, αξονικών μυών ή και τα δύο. III Μέτρια μυϊκή αδυναμία που αφορά μη οφθαλμικούς μύες Μπορεί να υπάρχει αδυναμία οφθαλμικών μυών όποιας βαρύτητας. IIIa Κυρίως προσβολή μυών των άκρων, αξονικών μυών ή και τα δύο. Μπορεί να υπάρχει μικρότερη προσβολή στοματοφαρυγγικών μυών. IIIb Κυρίως προσβολή στοματοφαρυγγικών, αναπνευστικών μυών ή και τα δύο. Μπορεί να υπάρχει μικρότερη ή ίση προσβολή μυών των άκρων, αξονικών μυών ή και τα δύο. IV Σοβαρή μυϊκή αδυναμία που αφορά μη οφθαλμικούς μύες. Μπορεί να υπάρχει αδυναμία οφθαλμικών μυών όποιας βαρύτητας. IVa IVb Κυρίως προσβολή μυών των άκρων και/ ή αξονικών μυών. Μπορεί να υπάρχει μικρότερη προσβολή στοματοφαρυγγικών μυών. Κυρίως προσβολή στοματοφαρυγγικών, αναπνευστικών μυών ή και τα δύο. Μπορεί να υπάρχει μικρότερη ή ίση προσβολή μυών των άκρων, αξονικών μυών ή και τα δύο. V Διασωλήνωση με ή χωρίς μηχανικό αερισμό, εκτός από την περίπτωση που αυτή πραγματοποιείται στη διάρκεια συνήθους μετεγχειρητικής 21

22 ΕΙΣΑΓΩΓΗ αντιμετώπισης. Η χρήση σωλήνα διατροφής χωρίς διασωλήνωση θέτει τον ασθενή στην κατηγορία IVb Παθοφυσιολογία της νόσου Οι βασικές ανωμαλίες της μυασθένειας εντοπίζονται στη νευρομυϊκή σύναψη και κυρίως στη μετασυναπτική μεμβράνη η οποία φέρει βαθιές πτυχώσεις, όπου βρίσκονται πολύ στενά πακεταρισμένοι οι μυϊκοί νικοτινικοί υποδοχείς της ακετυλοχολίνης. Με μελέτες έχει αποδειχθεί ότι όταν μειώνεται ο αριθμός των λειτουργικών AChR στη μετασυναπτική μεμβράνη (Fambrough et al., 1973; Pestronk et al., 1985), μειώνεται ο αριθμός των μετασυναπτικών πτυχών και αυξάνεται η απόσταση μεταξύ προσυναπτικής και μετασυναπτικής μεμβράνης (Engel et al., 1976; Engel 1984). Οι μορφολογικές αυτές αλλοιώσεις καθώς και η μείωση των διαθέσιμων υποδοχέων έχει διαπιστωθεί ότι οφείλονται στα AChR αυτοαντισώματα που παράγονται. (Vincent and Newsom-Davis 1985; Lindstrom et al., 1988). Μελέτες έχουν δείξει ότι η πλειοψηφία των AChR αντισωμάτων στοχεύουν μια συγκεκριμένη περιοχή της κάθε α1 υπομονάδας, η οποία ονομάζεται κύρια ανοσογόνος περιοχή (main immunogenic region, MIR) (Tzartos and Lindstrom 1980; Tzartos et al., 1982; Tzartos et al., 1988; Tzartos et al., 1998). Το MIR συνιστά μια εξωκυτταρική θηλιά, η οποία περιλαμβάνει ένα σύνολο επιτόπων τοποθετημένων στην άκρη της κάθε α1 υπομονάδας. Τον πυρήνα του MIR αποτελούν τα α67-76 αμινοξικά κατάλοιπα (Tzartos et al., 1988). Mελέτες με χιμαιρικές κατασκευές υπέδειξαν ότι η κύρια ανοσογόνος περιοχή δεν αποτελεί έναν απλό επίτοπο, αλλά συνίσταται από μια ομάδα γειτονικών και επικαλυπτόμενων επιτόπων (Lindstrom et al., 2008). Τα AChR αντισώματα ανήκουν κυρίως στις υποτάξεις IgG1 και IgG3 και προκαλούν μείωση των διαθέσιμων υποδοχέων στις νευρομυϊκές συνάψεις μέσω των παρακάτω μηχανισμών: i) Αντιγoνική τροποποίηση (Εικόνα 1.5Ι): Έγκειται στην ικανότητα των αυτοαντισωμάτων να συνδέονται ταυτόχρονα σε δύο γειτονικά μόρια του AChR με τελικό αποτέλεσμα την ενδοκυττάρωση του σχηματιζόμενου συμπλόκου. Έχει δειχθεί ότι οι οροί των μυασθενών επιταχύνουν το ρυθμό ενδοκυττάρωσης του υποδοχέα 22

23 ΕΙΣΑΓΩΓΗ (Kao and Drachman 1977; Loutrari et al., 1992). Μελέτες έχουν δείξει ότι καθαρά αντισώματα που απομονώθηκαν από ορούς μυασθενών και στοχεύουν διαφορετικές υπομονάδες του νικοτινικού υποδοχέα προκαλούν δοσο-εξαρτώμενη απώλεια υποδοχέων κατά την προσθήκη τους σε κυτταροκαλλιέγειες (Sideris et al., 2007). ii) Λύση της μετασυναπτικής μεμβράνης μέσω δράσης του συμπληρώματος (Εικόνα 1.5ΙΙ): Σε μελέτες ηλεκτρονικής μικροσκοπίας έχουν εντοπιστεί μορφολογικές αλλοιώσεις στη μετασυναπτική μεμβράνη της νευρομυϊκής σύναψης μυασθενών (Engel et al., 1976). Με χρήση τεχνικών ανοσοϊστοχημείας ανιχνεύθηκαν συστατικά του συμπληρώματος στις νευρομυϊκές συνάψεις (Engel et al., 1979; Engel and Arahata 1987). Επίσης, πειράματα σε ποντίκια στα οποία είχε απαλειφθεί το γονίδιο που κωδικοποιεί το C3 ή το C4 συστατικό του συμπληρώματος, έδειξαν ότι το κλασικό μονοπάτι του συμπληρώματος πιθανότατα είναι αυτό που εμπλέκεται στη πρόκληση της πειραματικής μυασθένειας (experimatnal autoimmnune myasthenia gravis, EAMG, (Tuzun et al., 2003). iii) Άμεση παρεμπόδιση του νικοτινικού υποδοχέα της ακετυλοχολίνης (Εικόνα 1.5ΙΙΙ): Μικρό ποσοστό μυασθενών, διαθέτουν στον ορό τους AChR αντισώματα τα οποία εμποδίζουν την πρόσδεση της ακετυλοχολίνης λόγω στερεοχημικής παρεμπόδισης (Donnelly et al., 1984; Fels et al., 1986; Lang et al., 1988; Morel et al., 1988; Burges et al., 1990; Bufler et al., 1998). Ωστόσο, ο ρόλος των MuSK και LRP4 αντισωμάτων δεν είναι ξεκάθαρος για το κατά πόσο αλλά και με ποιο τρόπο πλήττουν την νευρομυϊκή διαβίβαση προκαλώντας μυϊκή αδυναμία στους μυασθενείς. Φαίνεται όμως ότι όπως τα MuSK έτσι και τα LRP4 αντισώματα, δεν εμπλέκονται άμεσα στη συναπτική διαβίβαση αλλά παίζουν σημαντικό ρόλο στη δημιουργία και την ανάπτυξη της συναπτικής σχισμής (Vincent et al., 2003; Weatherbee et al., 2006; Cole et al., 2010). 23

24 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Εικόνα 1.5: Μηχανισμοί δράσης των AChR. Ι) Αντιγονική τροποποίηση. ΙΙ) Λύση της μετασυναπτικής μεμβράνης μέσω της δράσης του συμπληρώματος. γ) Άμεση παρεμπόδιση της λειτουργίας του υποδοχέα της ακετυλοχολίνης. J Clin Invest. 116, (2006). 24

25 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Γενετική της μυασθένειας Για την αιτιολογία της μυασθένειας έχουν προταθεί διάφοροι γενετικοί, περιβαλλοντικοί και λοιμογόνοι παράγοντες (Vincent et al., 2000). Έως σήμερα, δεν έχουν αναφερθεί σαφείς περιβαλλοντικές ή μολυσματικές αιτίες ενώ υπάρχουν πολλές, καλά τεκμηριωμένες περιπτώσεις μυασθένειας σε περισσότερα από ένα μέλη μιας οικογένειας. Με βάση τα παραπάνω, οι ερευνητές θεωρούν πιθανή την γενετική προδιάθεση της νόσου. Μελέτες που αφορούν στην γενετική προδιάθεση της νόσου υποδεικνύουν την εμπλοκή του HLA συμπλέγματος (Human Leukocytes Antigens) Το πιο σημαντικό εύρημα είναι η συσχέτιση των HLA-DR3 και Β8 αλληλομόρφων, με την πρώιμη έναρξη της μυασθένειας αλλά και με την υπερπλασία του θύμου αδένα. Η όψιμης έναρξης μυασθένεια σχετίζεται περισσότερο με το μόριο HLA-DR7 (παρουσία αντισωμάτων αντι-τιτίνης) (Giraud et al., 2001). Πολλά μη-hla γονίδια (PTPN22, FCGR2, CHRNA1) έχουν επίσης βρεθεί ότι σχετίζονται με τη μυασθένεια. Κάποια σχετίζονται και με άλλες αυτοάνοσες ασθένειες με μοναδική εξαίρεση το CHRNA1 γονίδιο, το οποίο κωδικοποιεί την α υπομονάδα του AChR και θα μπορούσε να δώσει σημαντικές πληροφορίες για την παθογένεια της μυασθένειας. Για τη διαλεύκανση των γενετικών αιτιών της αυτοάνοσης μυασθένειας είναι απαραίτητη περαιτέρω έρευνα. Καλύτερη κατανόηση της γενετικής της νόσου μπορεί να οδηγήσει σε καλύτερες θεραπείες αλλά κυρίως σε καλύτερη πρόληψη Παθογένεια της νόσου Εκτός από την γενετική προδιάθεση, ορισμένες άλλες υποθέσεις οι οποίες έχουν διατυπωθεί για την παθογένεση της νόσου είναι η επίδραση διαφόρων περιβαλλοντικών παραγόντων (Vincent et al., 2000), η εμπλοκή του θύμου αδένα αλλά και ο μηχανισμός της μοριακής μίμησης. Ο θύμος αδένας φαίνεται να διαδραματίζει έναν πολύ σημαντικό ρόλο στην εκδήλωση και στη διατήρηση της χρόνιας κατάστασης της μυασθένειας αφού 50-60% των μυασθενών παρουσιάζουν υπερπλασία του θύμου και 10% των μυασθενών θύμωμα. Μια περαιτέρω απόδειξη στηρίζεται στο γεγονός ότι η θυμεκτομή γενικά 25

26 ΕΙΣΑΓΩΓΗ φαίνεται να έχει ευεργετικά αποτελέσματα στην κλινική εικόνα των μυασθενών (Sanders and Siddiqi 2008). Σε μελέτες έχει βρεθεί ότι τα Τ- και Β- λεμφοκύτταρα, που απομονώνονται από το θύμο αδένα μυασθενών, είναι περισσότερο ευαίσθητα σε απόκριση κατά του υποδοχέα της ακετυλοχολίνης, σε σχέση με λεμφοκύτταρα που απομονώνονται από το περιφερικό αίμα (Sommer et al., 1990). Επίσης, έχει αναφερθεί ότι ο θύμος αδένας των μυασθενών φέρει σημαντικό αριθμό Β-λεμφοκυττάρων και παρουσιάζει παραγωγή αντισωμάτων, κυρίως κατά του υποδοχέα της ακετυλοχολίνης (Scadding et al., 1981; Levinson and Wheatley 1996). Επίσης, κάποια βλάβη στον ανοσοποιητικό μηχανισμό ή κάποια αλλοίωση στα μυοειδή κύτταρα του θύμου αδένα μπορεί να τα κάνει ευάλωτα στην ανοσολογική επίθεση των λεμφοκυττάρων (Drachman 1994). Είναι πιθανό τα κύτταρα αυτά να είναι υπεύθυνα για την έναρξη της αυτοάνοσης απόκρισης. Σε επιθηλιακά κύτταρα μυασθενών με θύμωμα έχει εντοπιστεί το πολυπεπτίδιο p153, το οποίο αν και δεν σχετίζεται με τον υποδοχέα της ακετυλοχολίνης, διαθέτει έναν επίτοπο 10 αμινοξικών καταλοίπων κοινό με την α υπομονάδα του υποδοχέα. Ο επίτοπος αυτός ίσως ευθύνεται για την έναρξη της αυτοάνοσης απόκρισης, η οποία στη συνέχεια γενικεύεται και στρέφεται κατά ολόκληρου του μορίου του υποδοχέα (Marx et al., 1990). Το φαινόμενο της μοριακής μίμησης είναι πιθανό να εμπλέκεται στη παθογένεση της μυασθένειας. Στη περίπτωση αυτή, είναι πιθανόν ένας εξωτερικός μολυσματικός παράγοντας που διαθέτει κάποια αντιγονική δομή παρόμοια με τη δομή του υποδοχέα, να ενεργοποιεί την ανοσολογική απόκριση κατά του υποδοχέα, όταν εισέλθει στον οργανισμό. Έχει δειχθεί ότι μια αλληλουχία αμινοξέων του ιού του απλού έρπητα εμφανίζει σημαντικό ποσοστό ομολογίας με αλληλουχία της α1 υπομονάδας του υποδοχέα (Dieperink and Stefansson 1989; Schwimmbeck et al., 1989). Επιπλέον, πειράματα με ορούς μυασθενών κατέληξαν ότι ένα ποσοστό από αυτούς αναγνώριζαν τη συγκεκριμένη αλληλουχία της α1 υπομονάδας και παράλληλα την αντίστοιχη αλληλουχία του ιού. Παρόμοιες μελέτες δείχνουν ότι μονοκλωνικά αντισώματα κατά του μυϊκού υποδοχέα αντιδρούν και με επιτόπους από διάφορα βακτηριακά στελέχη (Stefansson et al., 1985; Schwimmbeck et al., 1989). Θα πρέπει επίσης να αναφερθεί ότι στην εμφάνιση και ανάπτυξη της ασθένειας πιθανόν να ενέχονται ορισμένες ανωμαλίες της ανοσολογικής ρύθμισης. Η μυασθένεια συνδέεται με μεγάλο αριθμό αυτοάνοσων νοσημάτων σε αρκετούς 26

27 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ασθενείς καθώς και σε μέλη της οικογενειάς τους, γεγονός που μπορεί να υποδηλώνει ότι στην ασθένεια εμπλέκονται σε κάποιο βαθμό και κληρονομικά χαρακτηριστικά (Pirskanen 1977; Oh et al., 1987). Τέλος, εξωγενείς παράγοντες, όπως για παράδειγμα η χρήση του φαρμάκου D-πενικιλλαμίνη, μπορούν να προκαλέσουν μυασθένεια (Kuncl et al., 1986). Ωστόσο, σε αυτή τη περίπτωση, η μυασθένεια είναι αναστρέψιμη ακόμα και μέσα σε μερικές εβδομάδες μετά τη διακοπή του συγκεκριμένου φαρμάκου Διάγνωση της νόσου Οι μέθοδοι που χρησιμοποιούνται για τη διάγνωση της μυασθένειας είναι η φαρμακολογική δοκιμασία εδροφωνίου, οι ηλεκτροδιαγνωστικές μέθοδοι και η ραδιοανοσοχημική ανίχνευση αντισωμάτων. Αρχικά, παρατηρείται το ιστορικό αδυναμίας και εύκολης μυϊκής κόπωσης του ασθενούς με σκοπό τη διάγνωση της μυασθένειας. Έπειτα, χορηγούνται φάρμακα τα οποία αναστέλλουν τη δράση της ακετυλοχολινεστεράσης και επιτρέπουν στην ακευτυλοχολίνη να παρατείνει την αλληλεπίδραση της με τους υποδοχείς που έχουν απομείνει στη νευρομϋική σύναψη των ασθενών, προκαλώντας μυϊκή ενδυνάμωση. Διαγνωστικό δείκτη της νόσου αποτελεί η θετική απόκριση του ασθενούς (αύξηση της μυϊκής ισχύος) στη χορήγηση του φαρμάκου (εδροφώνιο). Σε αυτήν την περίπτωση, η απόκριση στο φάρμακο είναι άμεση (σε περίπου 30 δευτερόλεπτα) αλλά το αποτέλεσμα είναι βραχείας διάρκειας (περίπου 5 λεπτά) (Daroff 1986). Το ηλεκτρομυογράφημα μονήρους ίνας είναι μία από τις ηλεκτροδιαγνωστικές μεθόδους που χρησιμοποιούνται για τη διάγνωση της μυασθένειας. Σε αυτήν την περίπτωση, καταγράφονται τα δυναμικά ενέργειας μεμονωμένων μυϊκών ινών που ανήκουν στην ίδια κινητική μονάδα με σκοπό την ανίχνευση της καθυστέρησης ή της αποτυχίας της νευροδιαβίβασης. Στις μυϊκές ίνες εφαρμόζονται ειδικά ενδομϋικά ηλεκτρόδια για την καταγραφή των δυναμικών ενέργειας. Σε ασθενείς με μυασθένεια, η φυσιολογική διακύμανση της χρονικής διαφοράς μεταξύ των δυναμικών ενέργειας των μυϊκών ινών μιας κινητικής μονάδας αυξάνεται σημαντικά, κυρίως λόγω του χαμηλού ύψους και του μεγάλου χρόνου ανόδου των δυναμικών τελικής κινητικής πλάκας (Stalberg 1979). 27

28 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η μέθοδος του επαναληπτικού ερεθισμού του νεύρου πραγματοποιείται με την επίδραση ηλεκτρικών παλμών με ρυθμό περίπου 3 παλμούς/δευτερόλεπτο στο νεύρο και καταγραφή των δυναμικών ενέργειας στην επιφάνεια του μυός. Στα υγιή άτομα, οι διαδοχικοί ερεθισμοί του νεύρου προκαλούν μια αργή και ασήμαντη ελάττωση του πλάτους των δυναμικών ενέργειας που καταγράφονται στο μυ. Στους μυασθενείς, η ελάττωση είναι πολύ μεγαλύτερη και εμφανίζεται πολύ πιο σύντομα (Keesey 1989). Ακολουθεί η εργαστηριακή διάγνωση, με την ανίχνευση αντισωμάτων έναντι του υποδοχέα της ακετυλοχολίνης, της MuSK ή της LRP4 Η διάγνωση των αντισωμάτων έναντι του υποδοχέα της ακετυλοχολίνης πραγματοποιείται με ραδιοανοσοχημικό προσδιορισμό των αντισωμάτων, με χρήση σημασμένης με ιώδιο μπουγκαροτοξίνης προσδεδεμένης σε απομονωμένο υποδοχέα (Lindstrom et al., 1976; Zisimopoulou et al., 2013) ενώ στην περίπτωση της MuSK χρησιμοποιείται σημασμένη με ιώδιο MuSK (Matthews et al., 2004; Zisimopoulou et al., 2013). Στις μεθόδους αυτές, ο σημασμένος μυϊκός υποδοχέας της ακετυλοχολίνης με 125 I-μπουγκαροτοξίνη, προέρχεται είτε από ανθρώπινους μυες, είτε από την ανθρώπινη μυελοβλαστική κυτταρική σειρά (TE671), η οποία εκφράζει μυϊκού τύπου AChR, ενώ η σημασμένη με 125 I MuSK προέρχεται από έκφραση στην κυτταρική σειρά COS-7. Τα αντισώματα που υπάρχουν στον ορό των ασθενών προσδένονται στις σημασμένες πρωτεΐνες όπου με προσθήκη αντι-ανθρώπινης IgG τα προκύπτοντα ανοσοσυμπλέγματα καθιζάνουν. Το ποσό της ραδιενέργειας στο ίζημα είναι ευθέως ανάλογο προς τη συγκέντρωση των αντισωμάτων έναντι του υποδοχέα της ακετυλοχολίνης (Lindstrom et al., 1976) ή της MuSK κινάσης στο δείγμα του ορού (McConville et al., 2004). Πρόσφατα, αναπτύχθηκε μία πιο βελτιωμένη μέθοδος για την ανίχνευση MuSK αντισωμάτων (Trakas et al., 2011) η οποία βασίζεται στην ακινητοποίηση της MuSK σε ένα αδιάλυτο υπόστρωμα, ακολουθούμενη από την επώαση με μεγάλους όγκους του προς εξέταση ορού και την επακόλουθη απελευθέρωση των προσδεδεμένων αντισωμάτων με μικρό όγκο διαλύματος χαμηλού ph, τα οποία στη συνέχεια ανιχνεύονται και τιτλοδοτούνται με απλό ραδιοανοσοχημικό προσδιορισμό. Αυτή η μέθοδος καθιστά εφικτή τη χρήση μεγάλων όγκων ορού (π.χ. 0,1-1ml) έτσι ώστε να είναι δυνατή η ανίχνευση χαμηλού τίτλου αντισωμάτων. 28

29 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Ακόμα πιο πρόσφατα, εντάχθηκε στη διάγνωση η ανίχνευση αντισωμάτων έναντι της LRP4 πρωτεΐνης. Η διάγνωση πραγματοποιείται με ανοσοκυτταρική μέθοδο κατά την οποία, κύτταρα που εκφράζουν το αντιγόνο επωάζονται με τον προς έλεγχο ορό και τα προσδεμένα στα κύτταρα αντισώματα ανιχνεύονται με τη χρήση δεύτερων φθοριζόντων αντισωμάτων (Zisimopoulou et al., 2013). Όλα τα παραπάνω εργαστηριακά ευρήματα θα πρέπει να αξιολογηθούν από τον νευρολόγο του προς εξέταση ατόμου για τη διάγνωση της νόσου. Αν ένας ασθενής με συμπτώματα χρόνιας μυϊκής αδυναμίας και εύκολης κόπωσης δώσει θετικά δείγματα για κάποιο από τα παραπάνω αντιγόνα, τότε η διάγνωση για τη μυασθένεια είναι θετική (Lindstrom et al., 1976; Appel et al., 1977; Vincent and Newsom-Davis 1985; Vincent et al., 2003) Θεραπευτικές προσεγγίσεις για τη μυασθένεια Σύγχρονες θεραπείες Η θεραπεία των μυασθενών θα πρέπει να είναι εξατομικευμένη, σύμφωνα με τα κλινικά χαρακτηριστικά του ασθενούς με κύριο στόχο να αποκαταστήσει ή, τουλάχιστον, να προσεγγίσει τη φυσιολογική λειτουργία της νευρομυϊκής σύναψης μειώνοντας τυχον παρενέργειες στον ασθενή. Οι θεραπείες για τη μυασθένεια χωρίζονται σε δύο βασικές κατηγορίες: στις θεραπείες που στοχεύουν στην άμεση καταπολέμηση των συμπτωμάτων της μυασθένειας (συμπτωματική θεραπεία) ανεξάρτητα από την αιτία που την προκαλεί (αντιχολινεστερασικά φάρμακα) και στις θεραπευτικές προσεγγίσεις οι οποίες στοχεύουν στο ανοσοποιητικό σύστημα και διακρίνονται σε βραχυπρόθεσμες (πλασμαφαίρεση, ενδοφλέβια ανοσοσφαιρίνη) και μακροπρόθεσμες (κορτικοστεροειδή φάρμακα, μη στεροειδείς ανοσοκατασταλτικοί παράγοντες, ανοσοκατασταλτικά φάρμακα) ανοσολογικές θεραπείες με κύριο στόχο την ελάττωση του αριθμού των παθογόνων αντισωμάτων. Η μυασθένεια αντιμετωπίζεται χειρουργικά με τη θυμεκτομή. Στον Πίνακα 1.2 συνοψίζονται οι θεραπευτικές προσεγγίσεις για την αντιμετώπιση της μυασθένειας. 29

30 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Πίνακας 1.2 Θεραπευτικές προσεγγίσεις για τη μυασθένεια. Συμπτωματική θεραπεία Δοσολογίες και συχνότητα Σχόλια Πυριδοστιγμίνη mg κάθε 4-6 ώρες Προκαλεί επιδείνωση σε κάποιους MuSK μυασθενείς Βραχυπρόθεσμες ανοσοθεραπείες Πλασμαφαίρεση 4-6 αφαιρέσεις σε διαφορετικές ημέρες Θεραπευτική επιλογή για μυασθενικές κρίσεις Ενδοφλέβια ανοσοσφαιρίνη 1-2 g/kg (πάνω από 2-5 ημέρες) Χρησιμοποιείται σε μυασθενείς σε κρίσεις AChR ανοσοπροσρόφηση Μακροπρόθεσμες ανοσοθεραπείες Πρεδνισόνη Δεν έχει χρησιμοποιηθεί ακόμη Πιθανόν πιο αποτελεσματική/ ασφαλέστερη από την πλασμαφαίρεση Πρώτης σειράς θεραπεία, χρησή υψηλών δόσεων για μικρά χρονικά διαστήματα, συχνά εμφάνιση παρενεργειών Αζαθειοπρίνη 2-3 mg/kg ημερησίως Πρώτης σειράς θεραπεία κορτικοστεροειδών Mycophenolate mofetil 2-2,5 g ημερησίως Πρώτης σειράς θεραπεία κορτικοστεροειδών, διαδεδομένο στις ΗΠΑ Κυκλοσπορίνη 4-6 mg/kg ημερησίως Χρησιμοποιείται σε ασθενείς μη ανεκτικούς ή χωρίς ανταπόκριση στην αζαθειοπρίνη ή το mycophenolate mofetil Tacrolimus 3-5 mg ημερησίως Χρησιμοποιείται σε ασθενείς μη ανεκτικούς ή χωρίς ανταπόκριση στην αζαθειοπρίνη, το mycophenolate mofetil ή την κυκλοσπορίνη 30

31 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Κυκλοφωσφαμίδη 500 mg/m2 ή 4x 50 mg/kg Χρησιμοποιείται σε βαριάς μορφής μυασθένεια Rituximab 2x1000 mg ενδοφλέβια (διακόπτεται κάθε δύο εβδομάδες) Χρησιμοποιείται σε βαριάς μορφής μυασθένεια Αντιχολινεστερικά φάρμακα Σε αυτή τη κατηγορία ανήκουν οι αναστολείς της ακετυλοχολινεστεράσης, οι οποίοι επιβραδύνουν την υδρόλυση της ακετυλοχολίνης με αποτέλεσμα την αύξηση της συγκέντρωσης της διαθέσιμης ακετυλοχολίνης στη νευρομυϊκή σύναψη παρέχοντας προσωρινή βελτίωση στη μυϊκή δύναμη των μυασθενών. Η πυριδοστιγμίνη και η νεοστιγμίνη είναι τα πιο διαδεδομένα φάρμακα αυτής της κατηγορίας και χορηγούνται στα αρχικά στάδια της μυασθένειας. Οι αναστολείς της ακετυλοχολινεστεράσης σπάνια επάγουν πλήρη ή διατηρούμενη ανακούφιση στα συμπτώματα των μυασθενών και δεν επηρεάζουν την πρόοδο της ασθένειας. Παρ όλα αυτά μπορεί η συγκεκριμένη θεραπευτική προσέγγιση να είναι αποτελεσματική σε συγκεκριμένους ασθενείς με ήπια - μη προοδευτική μυασθένεια. Αξίζει να αναφερθεί ότι οι ασθενείς με MuSK μυασθένεια μπορεί να εμφανίσουν επιδείνωση μετά τη λήψη των συγκεκριμένων φαρμάκων Θεραπευτικές προσεγγίσεις με στόχο το ανοσοποιητικό σύστημα Ι. Μακροπρόθεσμες ανοσολογικές θεραπείες Κορτικοστεροειδή Τα κορτικοστεροειδή είναι τα πρώτα ανοσοκατασταλτικά φάρμακα τα οποία χρησιμοποιήθηκαν στη μυασθένεια και παραμένουν τα πιο συχνά χρησιμοποιούμενα φάρμακα έναντι του ανοσοποιητικού συστήματος. Χορηγούνται σε ασθενείς με οφθαλμική ή γενικευμένη μυασθένεια και ειδικά σε εκείνους με μη ικανοποιητικά 31

32 ΕΙΣΑΓΩΓΗ αποτελέσματα μετά από χορήγηση αναστολέων της ακετυλοχολινεστεράσης. Η δράση αυτών των φαρμάκων έγκειται στην ελάττωση των AChR αντισωμάτων με μείωση της παραγωγής των φλεγμονωδών κυτταροκινών και των περιφερικών λεμφοκυττάρων (Tindall 1980; Richman and Agius 2003). Οι αρνητικές επιπτώσεις των κορτικοστεροειδών είναι πολυάριθμες (υπέρταση, διαβήτης, υπερλιπιδιαιμία, γλαύκωμα, κ.α.) καλά χαρακτηρισμένες και σε μεγάλο βαθμό, δοσο-εξαρτώμενες (Juel and Massey 2007). Μη στεροειδείς ανοσοκατασταλτικοί παράγοντες Η αζαθιοπρίνη είναι ένας αντι-μεταβολίτης πουρινών, ο οποίος αναστέλλει τη σύνθεση τους με συνέπεια την αναστολή αρχικά της σύνθεσης των νουκλεοτιδίων και στη συνέχεια τον πολλαπλασιασμό των Τ-λεμφοκυττάρων (Mertens et al., 1969; Elion 1972). Σε σύγκριση με τα κορτικοστεροειδή, η αζαθιοπρίνη εμφανίζει αρκετά λιγότερες αρνητικές επιπτώσεις και είναι καταλληλότερη για μακροχρόνια χρήση. Η καθυστέρηση της βελτίωσης των κλινικών συμπτωμάτων των ασθενών, σε τέσσερις έως ακόμη, και οχτώ μήνες από την έναρξη της θεραπείας, αποτελεί το μεγαλύτερο πρόβλημα, ειδικά για τους ασθενείς με εξελισσόμενη νόσο ή λειτουργικά συμπτώματα. Στην περίπτωση που απαιτείται ανοσοκατασταλτική θεραπεία επί μακρόν, συνίσταται η χορήγηση στεροειδών σε συνδυασμό με αζαθιοπρίνη (Vincent et al., 2001; Skeie et al., 2006). Η κυκλοσπορίνη αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των Τ-λεμφοκυττάρων διαταράσσοντας το σηματοδοτικό μονοπάτι της καλσινευρίνης το οποίο μπλοκάρει την σύνθεση της ιντερλευκίνης-2 καθώς και άλλων πρωτεϊνών απαραίτητων για τη λειτουργία των CD4 Τ λεμφοκυττάρων (Drachman et al., 1998). Αν και είναι αρκετά αποτελεσματικό φάρμακο, η χρήση της για τη μυασθένεια έχει περιοριστεί αρκετά εξαιτίας της νεφροτοξικότητας που προκαλεί. H κυκλοφοσφαμίδη είναι ένα δυνατό ανοσοκατασταλτικό και δρα στο DNA αναστέλλοντας τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, επιδρώντας κυρίως στα Β- και όχι στα Τ-λεμφοκύτταρα. Το φάρμακο αυτό είναι το ίδιο αποτελεσματικό με τα κορτικοστεροείδη, ωστόσο οι παρενέργειες είναι πιο σοβαρές από τις γενικότερες επιπτώσεις των κορτικοστεροειδών οι οποίες αναφέρονται παραπάνω (Perez et al., 1981; Niakan et al., 1986). 32

33 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΙΙ. Βραχυπρόθεσμες ανοσολογικές θεραπείες Πλασμαφαίρεση H πλασμαφαίρεση αποτελεί μια θεραπευτική προσέγγιση η οποία εφαρμόζεται κυρίως σε σοβαρές καταστάσεις, όπως είναι η μυασθενική κρίση, και είναι αποτελεσματική αλλά παροδική (Dalakas 2004). Η διαδικασία της πλασμαφαίρεσης συνίσταται στην απομάκρυνση μέρους του πλάσματος του ασθενούς το οποίο περιέχει τα παθογόνα αντισώματα και στην αντικατάσταση του με φυσιολογικό πλάσμα ή συστατικά του πλάσματος που έχουν αφαιρεθεί (Batocchi et al., 2000). Η απομάκρυνση των αντισωμάτων από την κυκλοφορία επιτυγχάνει την γρήγορη βελτίωση της κλινικής εικόνας των μυασθενών. Το βασικότερο μειονέκτημα της πλασμαφαίρεσης είναι ότι αφαιρεί ανεξαιρέτως όλες τις πρωτεΐνες του πλάσματος και η αντικατάσταση αυτών, αυξάνει, όχι μόνο το κόστος της θεραπείας αλλά και τις παρενέργειες στους ασθενείς αφού μπορεί να προκαλέσει αλλεργικές αντιδράσεις, ενεργοποίηση του συμπληρώματος και λοιμώξεις κατά την μετάγγιση (Kuks and Skallebaek 1998). Ενδοφλέβιες ανοσοσφαιρίνες Οι ενδοφλέβιες ανοσοσφαιρίνες είναι ευρέως εφαρμόσιμες σε ασθενείς με οξυμένη μυασθένεια ή μυασθενικές κρίσεις δείχνοντας παρόμοια αποτελεσματικότητα με την πλασμαφαίρεση. Αν και ο μηχανισμός με τον οποίο οι ενδοφλέβιες ανοσοσφαιρίνες βελτιώνουν την κατάσταση των ασθενών δεν είναι ξεκάθαρος, έχουν διατυπωθεί δύο διαφορετικές υποθέσεις οι οποίες υποστηρίζουν ότι οι ανοσοσφαιρίνες ανταγωνίζονται με τα παθογόνα αντισώματα ή συνδέονται στον Fc-υποδοχέα (Samuelsson et al., 2001). Σχετικά πρόσφατα, έχει δειχθεί ότι οι ανοσοσφαιρίνες μειώνουν την έκφραση προ-φλεγμονοδών κυτταροκινών και αυξάνουν την έκφαση αντι-φλεγμονοδών κυτταροκινών (Zhu et al., 2006). Η θεραπεία με ανοσοφαιρίνες παρουσιάζει λιγότερες παρενέργειες από την πλασμαφαίρεση, ωστόσο το κόστος της είναι αυξημένο. 33

34 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΙΙΙ. Θυμεκτομή Τα ευεργετικά αποτελέσματα της χειρουργικής αφαίρεσης του θύμου αδένα (θυμεκτομή) οφείλονται είτε στην απομάκρυνση των Β λεμφοκυττάρων που εκκρίνουν τα παθογόνα αντισώματα είτε στην απομάκρυνση των μυοειδών κυττάρων του θύμου αδένα (Kao and Drachman 1977; Drachman et al., 1998). O ρόλος του θύμου στην παθογένεση της μυασθένειας δεν έχει διασαφηνιστεί πλήρως αλλά η ευεργετική δράση της θυμεκτομής είναι εμφανής μετά το πέρας του πρώτου χρόνου (Perlo et al., 1966). Συστήνεται σε ασθενείς με πρώιμη εκδήλωση της νόσου, ενώ είναι απαραίτητη σε ασθενείς με θύμωμα (Zielinski et al., 2004). Στους ασθενείς με MuSK μυασθένεια, δεν έχουν αναφερθεί περιπτώσεις θυμώματος μέχρι σήμερα, ενώ τα οφέλη της θυμεκτομής παραμένουν αμφιλεγόμενα (Evoli et al., 2003; Sanders et al., 2003) Θεραπείες σε κλινικό στάδιο και πειραματικές θεραπευτικές προσεγγίσεις Όλες οι θεραπείες οι οποίες αναφέρθηκαν παραπάνω, αν και είναι αρκετά αποτελεσματικές προκαλούν αρκετές αρνητικές επιδράσεις στους ασθενείς κυρίως εξαιτίας της περιορισμένης εξειδίκευσης τους. Σήμερα, οι θεραπευτικές προσπάθειες έχουν ως στόχο περισσότερο ειδικές θεραπείες οι οποίες αφ ενός θα είναι περισσότερο αποτελεσματικές και αφ ετέρου θα παρουσιάζουν λιγότερες παρενέργειες στους ασθενείς. Επιπλέον, η πρόοδος στην κατανόηση της παθοφυσιολογίας των διαφόρων τύπων μυασθένειας παρέχει τη δυνατότητα ανάπτυξης νέων δραστικότερων και με μεγαλύτερη ισχύ θεραπειών. Η επανεκκίνηση του ανοσοποιητικού συστήματος είναι μια νέα θεραπευτική στρατηγική η οποία εφαρμόστηκε σε ασθενείς οι οποίοι δεν ανταποκρίνονταν στις συμβατικές θεραπείες. Το μεγαλύτερο ποσοστό των ασθενών παρουσίασε σημαντική βελτίωση ενώ κάποιοι από τους ασθενείς άρχισαν να ανταποκρίνονται σε ανοσοκατασταλτικές θεραπείες. Κατά τη διάρκεια της θεραπείας, εφαρμόστηκαν στους ασθενείς υψηλές δόσεις κυκλοφοσφαμίδης (200 mg/kg), η οποία εξουδετερώνει το ώριμο ανοσοποιητικό σύστημα, αλλά δεν επιδρά στα πρόδρομα αιμοποιητικά κύτταρα (Drachman et al., 2008). 34

35 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η ουσία Mycophenolate mofetil (MMF) είναι ένας σχετικά νέος μηστεροειδής ανοσο-ρυθμιστής ο οποίος επιλεκτικά αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των Τ και Β λεμφοκυττάρων μπλοκάροντας τη σύνθεση των πουρινών αποκλειστικά στα λεμφοκύτταρα. Κλινικές μελέτες έδειξαν ότι η MMF βελτίωσε τη μυϊκή δύναμη των μυασθενών (Chaudhry et al., 2001). Επίσης, έχει δειχθεί ότι προκαλεί ελάχιστη τοξικότητα (Sollinger 1995). Αν και η αποτελεσματικότητα της MMF είναι ακόμη αμφιλεγόμενη αφού πιο πρόσφατες κλινικές μελέτες έδειξαν ότι δεν υπήρχε κανένα όφελος από τη χρήση του φαρμάκου σε μυασθενείς (Sanders and Siddiqi 2008), η ουσία Mycophenolate mofetil χρησιμοποιείται εκτενώς για τη θεραπεία της μυασθένειας. Στην κατηγορία των μη-στεροειδών ανήκει επίσης και το φάρμακο Tacrolimus (FK506) το οποίο εμφανίζεται να έχει τον ίδιο μηχανισμό δράσης και την ίδια αποτελεσματικότητα με τη κυκλοσπορίνη αλλά λιγότερες αρνητικές επιδράσεις στους ασθενείς (Tada et al., 2006). Ακόμα πιο πρόσφατες κλινικές μελέτες δείχνουν τα ευεργετικά αποτελέσματα του φαρμάκου (Ponseti et al., 2008). Το rituximab είναι ένα χειμερικό μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι του CD20 στην επιφάνεια των Β λεμφοκυττάρων με αποτέλεσμα την αποτελεσματική μείωση του αριθμού των Β-λεμφοκυττάρων που εμφανίζονται στη κυκλοφορία. Αν και κλινικές μελέτες δείχνουν ότι οι μυασθενείς, ακόμη και οι MuSK μυασθενείς, εμφανίζουν θετικά αποτελέσματα από το rituximab, χρειάζονται περαιτέρω μελέτες για να καθοριστεί ο ρόλος του στη μυασθένεια. Αν και το rituximab όπως και άλλα φάρμακα όπως το mitoxantrone (αναστέλλει την ενεργοποίηση των Τ βοηθητικών κυττάρων και ορισμένων κυτταροκινών, (Dalakas 2006) και το belimumab (αναστέλλει τον BAFF παράγοντα ενεργοποίησης την Β-κυττάρων με αποτέλεσμα την αναστολή της διαφοροποίησης και της ωρίμανσης των Β-κυττάρων και των πλασματοκυττάρων, (Ragheb et al., 2008) είναι ελπιδοφόρα για τη θεραπευτική τους χρήση για τη μυασθένεια, παρ όλα αυτά δεν έχει ξεκαθαριστεί ακόμη η αποτελεσματικότητα τους στους μυασθενείς. H χρήση τμημάτων μονοκλωνικών αντισωμάτων (Sophianos and Tzartos 1989) και ανθρωποποιημένων μονοκλωνικών αντισωμάτων (Papanastasiou et al., 2000) φέρεται να προστατεύει το μυϊκό υποδοχέα από τα παθογόνα αντισώματα. Τα αντισώματα αυτά θα πρέπει να είναι μονοσθενή, ώστε να μην προκαλούν αποδόμηση των υποδοχέων μέσω αντιγονικής τροποποίησης και επιπλέον να απουσιάζει η θέση 35

36 ΕΙΣΑΓΩΓΗ πρόσδεσης του συμπληρώματος, ώστε να μην προκαλούν την ενεργοποίησή του. Ο τρόπος δράσης των τμημάτων έγκειται στον ανταγωνισμό με τα παθογόνα αντισώματα ως προς την πρόσδεσή τους στον νικοτινικό υποδοχέα. Έχει προταθεί μια νέα θεραπευτική προσέγγιση η οποία συνίσταται στη δημιουργία γενετικά τροποποιημένων αντιγονοπαρουσιαστικών κυττάρων, τα οποία αλληλεπιδρώντας με Τ λεμφοκύτταρα, δραστικά έναντι του μυϊκού υποδοχέα, τα εξωθούν στην καταστροφή μέσω πυροδότησης της αποπτωτικής οδού (Drachman et al., 2003). Σύμφωνα με πρόσφατες μελέτες, μέσω αποσιώπησης της έκφρασης του σχετικού γονιδίου, η έκφραση της ακετυλοχολινεστεράσης παρεμποδίζεται με τη χρήση αντινοηματικών νουκλεοτιδίων. Τα αποτελέσματα από την εφαρμογή της μεθόδου σε πειραματόζωα φαίνεται να είναι αρκετά ενθαρρυντικά (Boneva et al., 2006). Μια διαφορετική προσέγγιση εστιάζει στην αφαίρεση των αντισωμάτων από τον ορό των μυασθενών (ανοσοπροσρόφηση). Οι πιο πρόσφατες προσπάθειες έχουν στόχο την ειδική αφαίρεση των παθογόνων αντισωμάτων σε αντίθεση με άλλες γενικότερες θεραπείες όπως η πλασμαφαίρεση, χρησιμοποιώντας ανοσοπροσροφητικές στήλες που φέρουν ακινητοποιημένο το αντιγόνο-στόχο. Στην περίπτωση της AChR μυασθένειας, η εφαρμογή της τεχνικής αυτής συναντά δυσκολίες λόγω της περιορισμένης διαθέσιμης ποσότητας του υποδοχέα. Στην περίπτωση των Takamori και Maruta το 2001, οι οποίοι χρησιμοποίησαν μικρά και συνθετικά πεπτίδια για να καλύψουν αυτήν την έλλειψη, οι στήλες παρουσίασαν ικανοποιητικά αποτελέσματα ανοσοπροσρόφησης των αντισωμάτων αλλά μόνο για συγκεκριμένη κατηγορία ασθενών (Takamori and Maruta 2001). Η ετερόλογη έκφραση ανθρώπινων υπομονάδων του μυϊκού υποδοχέα της ακετυλοχολίνης σε διαλυτή γλυκοζυλιωμένη μορφή, οι οποίες αναγνωρίζονται από αντισώματα έναντι του μυϊκού υποδοχέα της ακετυλοχολίνης από τον ορό μυασθενών, συνιστά μια εναλλακτική υποσχόμενη προσέγγιση (Psaridi-Linardaki et al., 2005; Kostelidou et al., 2007; Zisimopoulou et al., 2008). Οι προσπάθειες ανάπτυξης αντιγονοειδικής θεραπείας εστιάζουν στην βελτίωση της δομής, της διαλυτότητας και των επιπέδων έκφρασης των υπομονάδων του μυϊκού υποδοχέα της ακετυλοχολίνης, έτσι ώστε να είναι εφικτή η χρήση τους ως ανοσοπροσροφητές. Ανάλογες προσπάθειες πραγματοποιούνται και για την έκφραση της MuSK κινάσης με σκοπό τη χρήση της ως ανοσοπροσροφητή. 36

37 ΕΙΣΑΓΩΓΗ MuSK μυασθένεια Gravis Περίπου 10-15% των μυασθενών δεν εμφανίζουν AChR αντισώματα. Περίπου 0-64% αυτών των μυασθενών εμφανίζουν αντισώματα έναντι της MuSK πρωτεΐνης (Scuderi et al., 2002; Sanders et al., 2003). Μέχρι σήμερα παραμένει άγνωστος ο κύριος μηχανισμός παθογένειας της MuSK μυασθένειας. Επίσημα επιδημιολογικά δεδομένα για τη MuSK μυασθένεια είναι διαθέσιμα μόνο σε δύο περιοχές της Ευρώπης, με επιπολασμό της νόσου (συχνότητα εμφάνισης) 2,9 περιπτώσεις ανά ένα εκατομμύριο στην Ελλάδα και 1,9 ανά ένα εκατομμύριο στη νότια Ολλανδία (Niks et al., 2007; Carr et al., 2010). Η MuSK μυασθένεια παρουσιάζει μία ιδιαίτερη προτίμηση στις γυναίκες αφού σχεδόν το 90% των μυασθενών είναι γυναίκες (Evoli et al., 2003; Illa et al., 2005; Stickler et al., 2005). Η κατά μέσο όρο ηλικία έναρξης των συμπτωμάτων είναι περίπου τα 30 έτη και εμφανίζεται να είναι μικρότερη σε σχέση με μυασθενείς με άλλου τύπου μυασθένεια (Evoli et al., 2003; Zhou et al., 2004). Η ασθένεια ενδέχεται να παρουσιάζει περιβαλλοντικές αλλά και γενετικές αιτίες. Πιο συγκεκριμένα, έχει βρεθεί συσχέτιση του HLA-DR14-DQ5 αλληλομόρφου με τη MuSK μυασθένεια (Niks et al., 2006). Στους MuSK μυασθενείς έχουν εμφανιστεί τρεις διαφορετικοί φαινότυποι: 1. Ένας τύπος μη διακριτός με την AChR μυασθένεια, με γενικευμένη αδυναμία 2. Ένας πιο προσωπικός τύπος με μυϊκή αδυναμία σε λαιμό, ώμο και αναπνοή 3. Ένας πιο σοβαρός τύπος μυασθένειας, με μόνιμη οφθαλμική αδυναμία και συχνές αναπνευστικές κρίσεις (Illa et al., 2005; Evoli et al., 2008; Chang et al., 2009; Guptill and Sanders 2010). Τα MuSK αντισώματα είναι μονοσθενή (van der Neut Kolfschoten et al., 2007; Klooster et al., 2012) και ανήκουν κυρίως στην IgG4 υποτάξη σε αντίθεση με τα IgG1 αντισώματα στη μυασθένεια έναντι του υποδοχέα. Τα IgG4 αντισώματα δεν μπορούν να ενεργοποιήσουν το συμπλήρωμα με αποτέλεσμα να απορρίπτεται το σενάριο της ενδεχόμενης εμπλοκής του συμπληρώματος στην καταστροφή της νευρομυϊκής σύναψης (McConville et al., 2004). Τα ευρήματα αυτά ενισχύονται από το γεγονός ότι σε μυϊκές βιοψίες δεν φαίνεται να υπάρχει εναπόθεση του συμπληρώματος. Ένα ίσως από τα σημαντικότερα χαρακτηριστικά των MuSK 37

38 ΕΙΣΑΓΩΓΗ μυασθενών αποτελεί η συσχέτιση του τίτλου των MuSK αντισωμάτων με τα συμπτώματα της νόσου (Bartoccioni et al., 2006; Vincent 2006). Ο ρόλος του θύμου αδένα στη MuSK μυασθένεια και στην παθογένεση της νόσου παραμένει αμφιλεγόμενος. Συνήθως, οι MuSK μυασθενείς έχουν φυσιολογικό θύμο αδένα ή κάποια ελάχιστη θυλακοειδή υπερπλασία (Zhou et al., 2004; Leite et al., 2005; Evoli et al., 2008) και επίσης, το θύμωμα είναι εξαιρετικά σπάνιο (Saka 2005). Την παρατήρηση επιβεβαιώνει το γεγονός ότι δεν παρατηρούνται σημαντικές ιστολογικές αλλαγές στον θύμο αδένα στους MuSK μυασθενείς (Lauriola et al., 2005; Leite et al., 2005). Η απουσία ενεργοποίησης του συμπληρώματος στις βιοψίες MuSK μυασθενών (Selcen et al., 2004) οδήγησε στο ερώτημα για το αν τα MuSK αντισώματα είναι η κύρια αιτία για τη MuSK μυασθένεια. Οι περισσότερες απαντήσεις δόθηκαν με τη χρήση ζωικών μοντέλων. Η παθογονικότητα των MuSK αντισωμάτων δείχθηκε από πειράματα παθητικής μεταφοράς IgG αντισωμάτων από μυασθενείς (Cole et al., 2008; Viegas et al., 2012) αλλά και IgG4 αντισωμάτων (Klooster et al., 2012) αλλά και από πειράματα ενεργητικής μεταφοράς σε ποντίκια (Jha et al., 2006; Mori et al., 2012; Viegas et al., 2012) και κουνέλια (Shigemoto et al., 2006; Shigemoto et al., 2008) πολλά από τα οποία εμφάνισαν κλινική αδυναμία. Πιο συγκεκριμένα, σε ποντίκια ανοσοποιημένα είτε με MuSK πρωτεΐνη είτε με ορό MuSK μυασθενούς το μέγεθος των AChR μειώνεται, το σχήμα τους αλλάζει και η νευρομυϊκή σύναψη καταστρέφεται. Πολύ πρόσφατα δείχθηκε ότι τα MuSK αντισώματα συνδέονται στην πρώτη περιοχή τύπου-ανοσοσφαιρίνης της MuSK αποτρέποντας τη σύνδεση της LRP4 άρα και την εξαρτώμενη από την αγρίνη MuSK φωφσορυλίωση αποδεικνύοντας τον κύριο μηχανισμό με τον οποίο τα MuSK IgG4 αντισώματα αποτρέπουν τη μετάδοση του μηνύματος που συμμετέχει η MuSK προκαλώντας έτσι τα συμπτώματα της μυασθένεια (Huijbers et al., 2013). Οι MuSK μυασθενείες συνήθως δεν ανταποκρίνονται θετικά στους αναστολείς της ακετυλοχολινεστεράσης (Evoli et al., 2008, Hatanaka et al., 2005). Αν και αρχικά η πλασμαφαίρεση και η ενδοφέβλια ανοσοσφαιρίνη φαινόταν να έχουν παρόμοια αποτελεσματικότητα στους MuSK μυασθενείς (Evoli et al., 2008), πρόσφατες μελέτες δείχνουν ότι οι μυασθενείες ανταποκρίνονται καλύτερα στην ενδοφέβλια ανοσοσφαιρίνη (Pasnoor et al., 2010). Η θυμεκτομή φαίνεται να μην είναι κατάλληλη (Evoli et al., 2008; Bartoccioni et al., 2009) για τους MuSK μυασθενείς ενώ διάφορα 38

39 ΕΙΣΑΓΩΓΗ κορτικοστεροειδή φαίνονται να επιδρούν θετικά στα συμπτώματα τους (Drachman et al., 2003; Lin et al., 2006). 39

40 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1.3 ΣΤΟΧΟΙ ΤΗΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗΣ ΔΙΑΤΡΙΒΗΣ Η MuSK πρωτεΐνη εκφράζεται στους σκελετικούς μύες και είναι απαραίτητη για τη συναπτική διαφοροποίηση αλλά και για τη διατήρηση της λειτουργίας της νευρομυϊκής σύναψης (DeChiara et al., 1996; Burden et al., 2013). Στη μυασθένεια gravis περίπου 80-85% των μυασθενών εμφανίζουν αντισώματα έναντι του υποδοχέα της ακετυλοχολίνης ενώ περίπου το 40% των υπόλοιπων μυασθενών εμφανίζουν αντισώματα έναντι της MuSK πρωτεΐνης (Hoch et al., 2001). Αν και ο ακριβής μηχανισμός της παθογένειας της MuSK μυασθένειας παραμένει άγνωστος, αρκετές μελέτες αναφέρουν μυϊκή αδυναμία και ανωμαλίες στις νευρομυϊκές συνάψεις ζώων τα οποία έχουν ανοσοποιηθεί είτε με MuSK πρωτεΐνη είτε με MuSK αντισώματα (Cole et al., 2010; Klooster et al., 2012; Mori et al., 2012; Viegas et al., 2012). Επιπλέον, πρόσφατα δείχθηκε ότι τα MuSK αντισώματα αναστέλλουν τη σύνδεση της MuSK με την LRP4 πρωτεΐνη (Huijbers et al., 2013). Όλα αυτά τα δεδομένα συνηγορούν στην υπόθεση ότι τα MuSK αντισώματα είναι ο παθογενετικός παράγοντας της ασθένειας. Οι πιο συνηθισμένες θεραπευτικές προσεγγίσεις για τη μυασθένεια περιλαμβάνουν τη χρήση αναστολέων ακετυλοχολινεστεράσης και ανοσοκατασταλτικών παραγόντων που όμως συχνά δεν είναι αποτελεσματικά για την αντιμετώπιση των MuSK-μυασθενών. Άλλες μέθοδοι όπως η χρήση ενδοφλέβιων ανοσοσφαιρινών και η πλασμαφαίρεση είναι περισσότερο αποτελεσματικές αλλά δεν είναι ειδικές προκαλώντας αρκετές παρενέργειες στους ασθενείς (Meriggioli and Sanders 2009). Πιο συγκεκριμένα, η πλασμαφαίρεση αφαιρεί τα MuSK αντισώματα αλλά επίσης αφαιρεί και απαραίτητα συστατικά του πλάσματος όπως πρωτεΐνες πλάσματος και προστατευτικά αντισώματα. Για το λόγο αυτό, η χρήση υγρού αντικατάστασης είναι απαραίτητη, αυξάνοντας τον κίνδυνο αλλεργικών αντιδράσεων, θρόμβωσης αλλά και μολύνσεων λόγω των μεταγγίσεων που πραγματοποιούνται (Gajdos et al., 1997; Kuks and Skallebaek 1998; Szczepiorkowski et al., 2007). Μία ενδιαφέρουσα θεραπευτική προσέγγιση θα ήταν η ειδική αφαίρεση των MuSK αντισωμάτων κατά την οποία δεν θα αφαιρούνται άλλα συστατικά του αίματος. Η αρχή αυτής της εξωσωματικής μεθόδου βασίζεται στην ακινητοποίηση της εξωκυτταρικής περιοχής της MuSK η οποία φέρει τις περιοχές αναγνώρισης των MuSK αντισωμάτων, πάνω σε σταθερό υπόστρωμα, κατασκευάζοντας με αυτόν τον 40

41 ΕΙΣΑΓΩΓΗ τρόπο στήλες ανοσοπροσρόφησης. Στη συνέχεια, το πλάσμα του ασθενούς το οποίο φέρει τα MuSK αντισώματα θα διαπερνά τις στήλες με αποτέλεσμα την ειδική αφαίρεση των MuSK αντισωμάτων. Έχουν ήδη πραγματοποιηθεί επιτυχημένες προσπάθειες έκφρασης της εξωκυτταρικής περιοχής της MuSK (MuSK-ECD f ) στο εργαστήριο ως εκκρινόμενη πρωτεΐνη χρησιμοποιώντας ως σύστημα ετερόλογης έκφρασης το ζυμομύκητα Pichia Pastoris (Trakas et al., 2011). O P.pastoris, ως ευκαρυωτικός οργανισμός εμφανίζει τα πλεονεκτήματα των ανώτερων ευκαρυωτικών συστημάτων έκφρασης, δίνοντας τη δυνατότητα παραγωγής διαλυτών, σωστά διαμορφωμένων ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών, οι οποίες έχουν υποστεί όλες τις απαραίτητες μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις που απαιτούνται για τη λειτουργικότητά τους. Ο P.pastoris εκκρίνει ελάχιστες δικές του πρωτεΐνες έτσι ώστε καθιστά εύκολη την απομόνωση των ετερόλογα εκφραζόμενων πρωτεϊνών, οι οποίες εκκρίνονται στο μέσο της καλλιέργειας (Daly and Hearn 2005). Γενικότερα, αποτελεί ένα γρήγορο, εύκολο και με χαμηλό κόστος σύστημα ετερόλογης έκφρασης πρωτεϊνών που δίνει συνήθως υψηλότερα επίπεδα έκφρασης συγκριτικά με άλλα ευκαρυωτικά συστήματα (Cereghino and Cregg 2000). Το πρώτο μέρος της παρούσας ερευνητικής εργασίας αφορά τη βελτίωση της παραγόμενης MuSK-ECD f από τον P.pastoris αλλά και την προσπάθεια έκφρασης της σε άλλα ευκαρυωτικά συστήματα με στόχο την παραγωγή της πρωτεΐνης σε μεγαλύτερες ποσότητες αλλά κυρίως σε καλύτερη ποιότητα. Επιπλέον, θα πραγματοποιηθούν προσπάθειες έκφρασης της εξωκυτταρικής περιοχής της MuSK από την οποία θα έχει αφαιρεθεί η κυστεϊνική περιοχή (MuSK-ECD ΔFz ) στον P.pastoris αλλά και σε άλλα ευκαρυωτικά συστήματα. Η επιλογή των νέων συστημάτων έκφρασης από αυτό του P.pastoris με σκοπό την παραγωγή των δύο πρωτεϊνών, κρίθηκε ενδιαφέρουσα, καθώς οι κυτταρικές σειρές οι οποίες θα χρησιμοποιηθούν παρέχουν ένα σύστημα μετα-μεταφραστικών τροποποιήσεων το οποίο προσεγγίζει περισσότερο το σύστημα των θηλαστικών και πιθανόν οι παραγόμενες πρωτεΐνες να εμφανίζονται με μία καλύτερη διαμόρφωση. Μετά την έκφραση τους οι δύο πρωτεΐνες θα απομονωθούν και θα χαρακτηριστούν περαιτέρω αλλά κυρίως θα ελεγχθεί η ικανότητά τους ως ανοσοπροσροφητές, δηλαδή η δυνατότητά τους να αφαιρούν τα MuSK αντισώματα από ορούς μυασθενών. Η αξιολόγηση των εκφραζόμενων μορίων που θα προκύψουν θα πραγματοποιηθεί 41

42 ΕΙΣΑΓΩΓΗ αρχικά με χρωματογραφία μοριακής διήθησης ώστε να ελεγχθεί το μοριακό βάρος, η καθαρότητα και τα επίπεδα έκφρασης των μορίων. Επιπλέον, οι ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες θα εξεταστούν ως προς την καθαρότητα τους με δοκιμασίες ανοσοαποτύπωσης. Στη συνέχεια, οι πρωτεΐνες θα ακινητοποιηθούν πάνω σε ένα σταθερό υπόστρωμα και θα ακολουθήσει ο έλεγχος της αντιγονικότητας τους ως προς την απομάκρυνση MuSK αντισωμάτων από ορούς MuSK-μυασθενών αλλά και άλλων χαρακτηριστικών των ανοσοπροσροφητών τα οποία είναι απαραίτητα για την αξιολόγηση τους ως υποψήφιους ανοσοπροσροφητές στην ανάπτυξη της αντιγονοειδικής θεραπευτικής προσέγγισης για τη μυασθένεια. Στο δεύτερο μέρος της εργασίας θα πραγματοποιηθούν πειράματα σε κουνέλια με σκοπό να εξακριβωθεί η δυνατότητα χρήσης των ανοσοπροσροφητών για την αφαίρεση MuSK αντισωμάτων από σχετικά μεγάλες ποσότητες πλάσματος αλλά και να πραγματοποιηθεί έλεγχος σχετικά με την τοξικότητα των ανοσοπροσροφητών στα ζώα μετά από τη χρήση τους σε πειράματα ανοσοπροσρόφησης. Τα κουνέλια επιλέχθηκαν κυρίως διότι είναι πολύ ευαίσθητα ζώα και θα ήταν ευδιάκριτη οποιαδήποτε αλλαγή στην υγεία τους λόγω των πειραμάτων ανοσοπροσρόφησης. Επιπλέον, ο συνολικός όγκος του πλάσματος του ζώου που πρόκειται να καθαριστεί από τα MuSK αντισώματα είναι πολύ μεγαλύτερος από αυτόν που έχει χρησιμοποιηθεί έως τώρα για ανοσοπροσρόφηση και συγχρόνως αρκετά μεγάλος για να προσομοιαστεί η διαδικασία με τις πραγματικές συνθήκες της προτεινόμενης θεραπευτικής προσέγγισης. Πιο συγκεκριμένα, τα κουνέλια πρόκειται να ανοσοποιηθούν με MuSK πρωτεΐνη και μετά την εμφάνιση αντισωμάτων θα πραγματοποιηθούν πειράματα ανοσοπροσρόφησης για την αφαίρεση των MuSK αντισωμάτων από το πλάσμα του κουνελιού. Στη συνέχεια, θα ελεγχθούν αφ ενός ο τίτλος των αντισωμάτων για την αποτελεσματικότητα της ανοσοπροσρόφησης και αφ ετέρου διάφοροι παράμετροι οι οποίοι θα δείξουν την επίδραση της χρήσης των ανοσοπροσροφητών στα κουνέλια. Τέλος, η ειδικότητα των ανοσοπροσροφητών ως προς τα MuSK αντισώματα θα ελεγχθεί με πειράματα παθητικής μεταφοράς απομονωμένων MuSK αντισωμάτων από στήλες ανοσοπροσρόφησης σε ποντίκια με τον επακόλουθο έλεγχο των νευρομυϊκών συνάψεων των διαφραγμάτων των ζώων. Ο κύριος στόχος της παρούσας διδακτορικής διατριβής είναι η ανάπτυξη κατάλληλων ανοσοπροσροφητών για την χρήση τους σε μία νέα εξωσωματική και αντιγονο-ειδική θεραπευτική προσέγγιση για τη μυασθένεια. Η θεραπευτική 42

43 ΕΙΣΑΓΩΓΗ προσέγγιση θα μπορούσε μελλοντικά να αντικαταστήσει την πλασμαφαίρεση, η οποία αν και είναι από τις σύγχρονες θεραπευτικές προσεγγίσεις για τη μυασθένεια, μειονεκτεί σημαντικά ως προς τη μη ειδική αφαίρεση των αυτοαντισωμάτων. 43

44 Υλικά-Μέθοδοι

45 ΥΛΙΚΑ-ΜΕΘΟΔΟΙ 2. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 2.1 ΥΛΙΚΑ Εργαστηριακός εξοπλισμός Για την εκπόνηση της παρούσας εργασίας, οι συσκευές και τα όργανα που χρησιμοποιήθηκαν αναφέρονται παρακάτω: Συσκευή PCR (Θερμικός κυκλοποιητής, Applied Biosystems verity 96 well thermocycler) Επωαστήρας για καλλιέργειες βακτηρίων υπό ανάδευση (GALLENKAMP) Ψυχόμενοι επωαστήρες για καλλιέργειες ζυμομυκήτων υπό ανάδευση (GALLENKAMP, MRC) Επωαστικός θάλαμος για καλλιέργειες ζυμομυκήτων (CDR ICN100DG) Φασματοφωτόμετρο (BIORAD SmartSpec Plus) Αυτόκαυστο (Trade Raypa) Κλίβανος ξηρής αποστείρωσης (Bourdon, West MC30) Σύστημα τριών συσκευών για μετασχηματισμό κυττάρων ζύμης με ηλεκτροδιάτρηση ( gene pulser, pulse transformer, pulse controller και gene transformer BIORAD) Ψυχόμενη φυγόκεντρος (KUBOTA 7780, κεφαλές AG-580CA AG-5006) Μικροφυγόκεντρος (Eppendorf MiniSpin) Επιτραπέζιες ψυχόμενοι φυγόκεντροι (Hettich Mikro200R, Rotina 420R και Juan CR422) Θερμαινόμενος αναδευτήρας (Eppendorf thermomixer R) Συσκευές οριζόντιας ηλεκτροφόρησης αγαρόζης (Thermo. CSSU911 submarine gel system) Συσκευή κάθετης ηλεκτροφόρησης πρωτεϊνών (Mini-Protean tetracell BIORAD) Συσκευή μεταφοράς πρωτεϊνών σε νιτροκυτταρίνη (MiniTrans-Blot BIORAD) Τροφοδοτικό ρεύματος (BIORAD 100/500) 45

46 ΥΛΙΚΑ-ΜΕΘΟΔΟΙ Ηλεκτρονικός ζυγός ακριβείας για μέτρηση μικρών ποσοτήτων (Shimadzu AX80) Ηλεκτρονικός ζυγός (Kern EW) Αναδευτήρες (Vortex: Heidolph Reaxtop, Spyramix: Selecta Movil-Rod, οριζόντιοι: Heidolph Unimax1010 και μαγνητικοί αναδευτήρες : Cimarec 3, Labinco L32 και Heidolph MR1000) Μετρητής ph (HANNA HI2110) Σύστημα υπερδιήθησης διαλυμάτων (Millipore Minitan system, περιλαμβάνει κασσέτα PALL Corp. Ultrasette, με μεμβράνες που αποκλείουν την είσοδο μορίων με μοριακή μάζα >10 kda) Περισταλτική αντλία (Millipore/Masterflex) Υδατόλουτρα (Memmert και Digiterm ) Συσκευή υπερήχων (Sonicator ELMA S30, Elmasonic) Αντλία κενού WELTC, Gemini Μετρητής γ-αντινοβολίας (Perkin Elmer Wizard και LB 2111 Multi Crystal Berthold Technologies) Συσκευή FPLC ACTA purifier 90 και 10 (Amersham Biosciences) Ζυγός μέτρησης βάρους κουνελιών και ποντικιών Sartorious CP2201 Ψηφιακό Θερμόμετρο για μέτρηση θερμοκρασίας κουνελιών (OMRON) Πιπέτες (Orange) Επωαστικός θάλαμος κυτταροκαλιεργειών CO 2 (Galaxy 170S, New Brunswick) Εστία κάθετης νηματικής ροής τύπου ΙΙ (Telstar AV-100) Οπτικό μικροσκόπιο (MBL 3200, KRUSS OPTRONIC, Germany) Συνεστιακό μικροσκόπιο (Leica TCS-SP) Μηχάνημα αφαίρεσης πλάσματος (Cobe Spectra Apheresis System, TERUMO group) Αναλώσιμα Τρυβλία petri για στερεές καλλιέργειες βακτηρίων και ζυμομυκήτων (GreinerBio-One) Κωνικές φιάλες 500 ml, 1 L, 2 L (ISOLAB) 46

47 ΥΛΙΚΑ-ΜΕΘΟΔΟΙ Πλαστικοί σωλήνες φυγοκέντρησης 250 ml, 500 ml (Corning) Δοκιμαστικοί σωλήνες πολυπροπυλενίου μιας χρήσης 15 και 50 ml (Corning) Πλαστικοί σωλήνες μιας χρήσης 1,5 ml (GreinerBio-One) Πλαστικοί σωλήνες μιας χρήσης 0,25 ml (Costar) Πλαστικά ακρορύγχια και πλαστικές αποστειρωμένες πιπέτες 1, 2, 5, 10 και 25 ml ( Costar) Πλαστικά ακρορύγχια (tips) για επαναληπτική πιπέτα (Eppendorf) Γυάλινες σύριγγες (ROTH) Κυψελίδες για ηλεκτροδιάτρηση 0.1 cm (BIORAD) και 0.2 cm (Invotrogen) Πλαστικές κυψελίδες μιας χρήσης (SARSTEDT) Γυάλινες κενές στήλες (BIORAD) Φίλτρα με διάμετρο πόρου 0.22 και 0.45 μμ, profilter Millipore Μεμβράνες νιτροκυτταρίνης Hybond C-extra, Hybond P (Amersham Biosciences) Χαρτί διήθησης 3 ΜΜ (Whatmann) Φιαλίδια αίματος για βιοχημικό έλεγχο αίματος (BD Vacutainer) και γενικής αίματος με EDTA (SARSTEDT) Φλεβοκαθετήρες InfuVein TM PROIV 20G και 22 G (Kruuse) 100 mm πιάτα καλλιέργειας (Corning) Πλάκες καλλιέργειας 6-θέσεων (Corning) Καθετήρες αιμοκάθαρσης δύο εισόδων (medcomp) Σύνολο (Set) αποστειρωμένων σωληνακίων για το μηχάνημα αφαίρεσης Cobe Spectra (TERUMO) Αντιδραστήρια Χημικά αντιδραστήρια αναλυτικού βαθμού καθαρότητας (Sigma, Merck, B.D.H. Chemicals Ltd, Fluka, Apllichem) Αγαρόζη (Sigma) Taq DNA πολυμεράση (Minotech Molecular Biology Products, IMMB) Εναρκτήρια μόρια (MWG) dntps (Promega) Περιοριστικές ενδονουκλεάσες (Roche, Fermentas, New England Biolabs) 47

48 ΥΛΙΚΑ-ΜΕΘΟΔΟΙ Μάρτυρας μοριακών μεγεθών DNA: 1 kb (Fermentas) Αλκαλική φωσφατάση (CIAP, 26 U/μΙ, Gibco BRL) T4 DNA λιγάση (1U/μλ, Fermentas) Λυσοζύμη (Applichem) RNase A (Sigma) Ενδογλυκοζιδάσες PNGaseF και EndoH f (New England Biolabs) Bacto-tryptone, Bacto-peptone, Bacto-yeast extract και Bacto-agar (BD) Αμπικιλλίνη (Bristol Mayer Squib) Ζεοσίνη (Invitrogen) Ν,Ν,Ν,Ν-τετραμεθυλαιθυλενοδιαμλινη (TEMED), περοξυδιθεικό αμμώνιο (APS), 3,3 διαμινοβενζιδίνη (DAB) (Sigma, Applichem) Αλβουμίνη από ορό βοδιού (BSA) (Applichem) Έγχρωμος μάρτυρας πρωτεϊνών μοριακών μεγεθών kda (Fementas) Ni 2+- NTA αγαρόζη (QIAGEN Inc) Πακεταρισμένες στήλες Superose 12 (Amersham Biosciences) CNBr-activated Sepharose σφαιρίδια (GE Healthcare) Protein G-Agarose fast flow Streptococcus sp (Sigma) Protein A-Agarose fast flow (Sigma) Adjuvant Complete Freund (DIFCO) Adjuvant Incomplete Freund (DIFCO) M.Tuberculosis H37Ra (DIFCO) Κυκλοφωσφαμίδη (Sigma) Κολλαγενάση (Sigma) Μυοχαλαρωτικό ενέσιμο διάλυμα Rompun (Bayer) Ηρεμιστικό ενέσιμο διάλυμα Ketaset (Pfizer) Ηπαρίνη Clexane (Sanofi Aventis) Τοπική αναισθητική κρέμα Emla 5% (AstraZeneca) Θρεπτικό υλικό DMEM (Dulbecco s MEM, Invitrogen) Θρεπτικό υλικό μειωμένης περιεκτικότητας ορόυ Opti-MEM (Invitrogen) Ορός εμβρύου βοός (FBS, Invitrogen) Διάλυμα θρυψίνης/edta 0.25% (Invitrogen) Lipofectamine 2000 (Invitrogen) Αντιβιοτικό geneticin (G418, Invitrogen) 48

49 ΥΛΙΚΑ-ΜΕΘΟΔΟΙ Διάλυμα περιέχων πενικιλίνη unit/ml και μg/ml (PEN/STREP, Invitrogen) Διάλυμα φορμαλίνης (Invitrogen) Αντιθρομβωτικό διάλυμα κιτρικών με δεξτρόζη (ACD, Sol A, TERUMO) Φυσιολογικός ανθρώπινος ορός (Fresenius Kabi) Προ-συσκευασμένα αντιδραστήρια: QIAquick Gel Extraction kit που περιλαμβάνει στήλες QIAquick spin, ρυθμιστικά διαλύματα PB και PE (QIAGEN Inc.) QIAquick Gel Purification kit που περιλαμβάνει στήλες QIAquick spin, ρυθμιστικά διαλύματα PB και PE (QIAGEN Inc.) AChRAb RIA kit που περιλαμβάνει 125 Ι AChR, Goat anti-human IgG, φυσιολογικό ανθρώπινο ορό(nhs), washing solution, reconstitution buffer, precipitation enhancer (RSR Ltd) MuSKAb RIA kit που περιλαμβάνει 125 ΙMuSK, Goat anti-human IgG, φυσιολογικό ανθρώπινο ορό(nhs), washing solution, reconstitution buffer, precipitation enhancer (RSR Ltd) Ραδιενεργά αντιδραστήρια: Na 125 I για σήμανση MuSK (Perkin Elmer) Αντισώματα Μονοκλωνικό αντίσωμα 9E10, που προέρχεται από την υβριδωματική σειρά ποντικού ATCC CRL 1729 και αναγνωρίζει τον c-myc επίτοπο Μονοκλωνικό αντίσωμα anti-6xhis συζευγμένο με το ένζυμο υπεροξειδάση της ραπανίδος, με απαίτηση για ελεύθερο καρβοξυλικό άκρο για αναγνώριση (Invitrogen) Πολυκλωνικό αντίσωμα goat anti-mouse-hrp (συζευγμένο με το ένζυμο υπεροξειδάση της ραπανίδος) (Darko, Denmark) 49

50 ΥΛΙΚΑ-ΜΕΘΟΔΟΙ Αντίσωμα ανοσοσφαιρινών αναπτυγμένων σε κουνέλι έναντι γ- ανοσοσφαιρινών ποντικού (DakoCytomation) α-μπουγκαροτοξίνη, Alexa Fluor 488 conjugate (Life technologies) Αντίσωμα anti-synaptophysin αναπτυγμένων σε κουνέλι (Sigma) Αντίσωμα Alexa Fluor 568 anti-rabbit IgG αναπτυγμένων σε κατσίκα (Life technologies) Anti Human IgG αναπτυγμένων σε κατσίκα (RSR ltd) Anti Human IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 αναπτυγμένων σε πρόβατο (The binding site) Anti Human IgM αναπτυγμένων σε πρόβατο (The binding site) Αντίσωμα ανοσοσφαιρινών αναπτυγμένων σε κουνέλι έναντι γ- ανοσοσφαιρινών προβάτου (Sigma) Κυτταρικές σειρές COS-7 κύτταρα (ATCC) HEK293 κύτταρα (ATCC) Ζώα εργαστηρίου Λευκά θηλυκά κουνέλια του υποείδους New Zealand, 2-3 μηνών, χρησιμοποιήθηκαν για την ενεργητική μεταφορά MuSK-ECD με σκοπό την επαγωγή πειραματικής μυασθένειας. Ποντίκια C57BL/6 έξι εβδομάδων χρησιμοποιήθηκαν για την παθητική μεταφορά MuSK αντισωμάτων Διαλύματα και Θρεπτικά Υλικά Η αποστείρωση των θρεπτικών υλικών για τις καλλιέργειες βακτηρίων E.coli και μύκητα P.Pastoris καθώς και των ρυθμιστικών διαλυμάτων που χρησιμοποιήθηκαν στις τεχνικές μοριακής βιολογίας πραγματοποιήθηκε σε υγρό 50

51 ΥΛΙΚΑ-ΜΕΘΟΔΟΙ κλίβανο για 40 min σε 15 lb/in 2 ή με διήθηση απο στείρο φίλτρο με διάμετρο πόρου 0,2 μm. Για την παρασκευή όλων των διαλυμάτων χρησιμοποιήθηκε δις-απεσταγμένο και απιονισμένο νερό (ddh 2 O). Θρεπτικά υλικά LB 1% w/v NaCl, 1% w/v πεπτόνη, 0,5% w/v εκχύλισμα ζύμης, pη 7,0 LB- άγαρ ± ampicillin LB που περιέχει 1,5% w/v άγαρ ± 100 μg/ml αμπικιλλίνη YPD ± zeocin 1% w/v εκχύλισμα ζύμης, 2% w/v πεπτόνη, 2% w/v δεξτρόζη, ± 25 μg/ml ζεοσίνη YPD-άγαρ ± zeocin YPD που περιέχει 1,5% w/v άγαρ ± 25 μg/ml ζεοσίνη YPDS ± zeocin 1% w/v εκχύλισμα ζύμης, 2% w/v πεπτόνη, 2% w/v δεξτρόζη, 1 Μ σορβιτόλη ± 25 μg/ml ζεοσίνη YPDS-άγαρ ± zeocin BMGY YPDS που περιέχει 1,5% w/v άγαρ ± 25 μg/ml ζεοσίνη 1% w/v εκχύλισμα ζύμης, 2% w/v πεπτόνη, 100 mm ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών, pη 6,0, 1,34% w/v ΥΝΒ, 4x10-5% w/v βιοτίνη, 1% (v/v) γλυκερόλη ΒΜΜΥ 1% w/v εκχύλισμα ζύμης, 2% w/v πεπτόνη, 100 mm ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών, pη 6,0, 1,34% w/v ΥΝΒ, % w/v βιοτίνη, 0,5% (v/v) μεθανόλη 51

52 ΥΛΙΚΑ-ΜΕΘΟΔΟΙ Ρυθμιστικά διαλύματα TBE 89 mm Tris-H 3 BO 3, 2 mm EDTA, pη 8,0 TE (10:1) 10 mm Tris-HCl, 1 mm EDTA, pη 8,0 PBS 60 mm ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών ( PB), 137 mm (0,8% w/v) NaCl, 2,7 mm (0,02% w/v) KCl, pη 7,4 PBST 60 mm PB, 137 mm (0,8% w/v) NaCl, 2,7 mm (0,02% w/v) KCl 0.1% v/v Tween-20, pη 7,4 GTE 50 mm γλυκόζη, 25 mm Tris-HCl, 10 mm EDTA, ph 8,0 Ηλεκτροφόρησης πρωτεΐνών 25 mm Tris-base, 200 mm γλυκίνη, 1% w/v SDS, pη 8,5 Ηλεκτρομεταφοράς πρωτεΐνών 25 mm Tris-base, 200 mm γλυκίνη, 20% w/v μεθανόλη, pη 8,5 Αποφωσφορυλίωσης 0,1 Μ Tris-HCl, 0,1 Μ MgCl 2, pη 7,5 Άλλα διαλύματα Χρωματισμού πηκτής πολυακρυλαμιδίου 0,1% w/v Coomassie R % v/v. μεθανόλη, 10% v/v CH 3 COOH Αποχρωματισμού πηκτής πολυακρυλαμιδίου Διάλυμα εμφάνισης με υπόστρωμα DAB 10% v/v CH 3 COOH, 40% v/v μεθανόλη 0,03% w/v DAB, 0,03% w/v NiC1 2, 0,009% v/v Η 2 Ο 2 σε PBS 52

53 ΥΛΙΚΑ-ΜΕΘΟΔΟΙ «Φόρτωσης» δείγματος πρωτεϊνών 45 mm Tris-HCl, pη 6,8, 10% v/v. γλυκερόλη, 1% w/v SDS, 0,01% w/v κυανούν της βρωμοφαινόλης, 5% v/v β- μερκαπτοαιθανόλη Storage Buffer 11 mm Na 3 C 6 H 5 O 7, 40 mm C 2 H 3 NaO 2, 83 mm NaCl, 8 mm Na 2 HPO 4, 2 mm KH 2 PO 4, ph 7 Όπου PB είναι ρυθμιστικό διάλυμα από μείγμα δισόξινων και μονόξινων φωσφορικών αλάτων καλίου (K 2 HPO 4 και KH 2 PO 4 ) Πλασμιδιακός φορέας κλωνοποίησης (cloning vector) pbluescript και κυτταρικό στέλεχος Εscherichia coli Το στέλεχος Ε. coli που χρησιμοποιήθηκε ήταν το TOP10F, το οποίο δεν έχει την ικανότητα ανασυνδυασμού (reca1 - ) και δεν παράγει ενδονουκλεάση (enda1 - ). Ο πλασμιδιακός φορέας κλωνοποίησης των cdna μορίων της εξωκυτταρικής περιοχής της ανθρώπινης MuSK ήταν ο pbluescript (Εικόνα 2.1). Εικόνα 2.1: Χάρτης του φορέα κλωνοποίησης pbluescript. Διακρίνονται: (i) ο υποκινητής του οπερονίου λακτόζης (P lac), (ii) το οπερόνιο λακτόζης (lacz ), (iii) η 53

54 ΥΛΙΚΑ-ΜΕΘΟΔΟΙ περιοχή πολλαπλών σημείων κλωνοποίησης (MCS), (iv) το γονίδιο που προσδίδει ανθεκτικότητα στο αντιβιοτικό αμπικιλλίνη (ampicillin) και (v) το σημείο έναρξης της αντιγραφής (puc ori) του πλασμιδιακού DNA [από pbluescript II phagemid vector, instruction manual, revision version A.01 (cat. no. #212205, #212206, #212207, #212208)] Πλασμιδιακός φορέας κλωνοποίησης (cloning vector) ppiczα και μήκυτας Pichia Pastoris Το σύστημα που χρησιμοποιήθηκε για την ετερόλογη έκφραση των ανθρώπινων MuSK-ECD μορίων, ήταν η ζύμη Ρichia pastoris. Ο ζυμομύκητας είναι ένας ευκαρυωτικός, μονοκύτταρος μεθυλοτροφικός οργανισμός, ο οποίος διαθέτει την ικανότητα μεταμεταφραστικών τροποποιήσεων, που οδηγούν σε επεξεργασία και αναδίπλωση των παραγόμενων πρωτεϊνικών μορίων. Σε σχέση με άλλα ευκαρυωτικά συστήματα ετερόλογης έκφρασης πρωτεϊνών η Ρ. pastoris είναι ένα σύστημα πιο γρήγορο, ευκολότερο, χαμηλότερου κόστους και υψηλότερου επιπέδου έκφρασης ετερόλογων πρωτεϊνών. Επιπλέον, οι υδατανθρακικές αλυσίδες που προστίθενται σε ομάδες αζώτου των πρωτεϊνών είναι υψηλής περιεκτικότητας σε μανόζη ακολουθώντας το πρότυπο γλυκοζυλίωσης ανώτερων ευκαρυωτικών κυττάρων ενώ το μήκος τους είναι πολύ μικρότερο με αποτέλεσμα να μην οδηγεί σε υπεργλυκοζυλίωση των εκκρινόμενων ετερόλογων πρωτεϊνών υπερτερώντας έναντι του S. Cerevisiae. (Cereghino and Cregg 2000). Επίσης, ένα από τα σημαντικότερα πλεονεκτήματα είναι ότι η Ρ. pastoris παρουσιάζει φορές υψηλότερα επίπεδα έκφρασης ετερόλογων πρωτεϊνών σε σχέση με το S. Cerevisiae εξακολουθώντας να είναι το ίδιο εύκολο στη χρήση του για τεχνικές γενετικής και μοριακής βιολογίας. Η Ρ. pastoris μπορεί να αναπτύσσεται σε υλικό που περιέχει μεθανόλη ως μόνη πηγή άνθρακα. Το πρώτο βήμα στο μεταβολισμό της μεθανόλης είναι η οξείδωσή της από μοριακό οξυγόνο σε φορμαλδεϋδη και υπεροξείδιο του υδρογόνου, η οποία καταλύεται από το ένζυμο της αλκοολικής οξειδάσης. Επειδή η αλκοολική οξειδάση έχει χαμηλή συγγένεια για το μοριακό οξυγόνο, το σύστημα της P. pastoris αναγκάζεται να παράγει μεγάλες ποσότητες αυτού του ενζύμου, όταν υπάρχει αυξημένη ποσότητα μεθανόλης στο θρεπτικό μέσο. Κατά την ανάπτυξη των κυττάρων σε μεθανόλη, η αλκοολική οξειδάση μπορεί να παράγει περίπου το 5% των συνολικών κυτταρικών πρωτεϊνών. Γενικότερα, η Ρ. pastoris εκκρίνει πολύ λίγες 54

55 ΥΛΙΚΑ-ΜΕΘΟΔΟΙ δικές της πρωτεΐνες οπότε είναι εύκολη η απομόνωση εκκρινόμενων, ετερόλογα εκφρασμένων πρωτεϊνών (Daly and Hearn 2005). Αν και υπάρχουν δύο γονίδια που κωδικοποιούν την αλκοολική οξειδάση: τα ΑΟΧΙ και ΑΟΧ2 (παρουσιάζουν 97% ομολογία), το ΑΟΧΙ είναι υπεύθυνο για το μεγαλύτερο μέρος της δράσης της αλκοολικής οξειδάσης στο κύτταρο. Ο υποκινητής που ρυθμίζει τη μεταγραφή του ΑΟΧΙ είναι και αυτός που χρησιμοποιείται για την ετερόλογη έκφραση πρωτεϊνών. Στην παρούσα εργασία, χρησιμοποιήθηκε το άγριου τύπου στέλεχος Χ33 της Ρ. pαstoris. Ως φορέας έκφρασης, χρησιμοποιήθηκε το πλασμίδιο ppiczαα (Εικόνα 2.2), το οποίο διαθέτει τον υποκινητή του γονιδίου ΑΟΧΙ, καθώς και το γονίδιο που κωδικοποιεί το πεπτίδιο-οδηγό (α-factor) του S. cerevisiae, προκειμένου να γίνεται έκκριση της ετερόλογα εκφρασμένης πρωτεΐνης. Εικόνα 2.2: Χάρτης του πλασμιδίου έκφρασης ppiczα. Διακρίνονται: (i) ο υποκινητής του γονιδίου ΑΟΧΙ (ii) το σημείο έναρξης της αντιγραφής (puc ori), (iii) το γονίδιο που προσδίδει ανθεκτικότητα στο αντιβιοτικό ζεοσίνη (Zeocin), (iv) το γονίδιο του πεπτιδίου οδηγού (α-factor) για την έκκριση της ετερόλογης πρωτεΐνης (v) η περιοχή με τα πολλαπλά σημεία κλωνοποίησης (vi) το γονίδιο κωδικοποίησης έξι συνεχόμενων καταλοίπων ιστιδίνης (6 His) και (νii) το γονίδιο κωδικοποίησης του c- myc επίτοπου (c-myc epitope) [από EasySelect Pichia expression kit, manual, version G (cat. no. K )]. 55

56 ΥΛΙΚΑ-ΜΕΘΟΔΟΙ Πλασμιδιακός φορέας κλωνοποίησης (cloning vector) pcdna3.1/myc-his και κυτταρικές σειρές COS-7 και HEK293 Η κυτταρική σειρά HEK (Human embryonic kidney) χρησιμοποιείται ευρέως για την έκφραση ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών. Προέρχεται από επιθηλιακά και συνήθως οι πρωτεΐνες που παράγονται φέρουν τις περισσότερες μετα-μεταγραφικές τροποποιήσεις οι οποίες απαιτούνται για τη δημιουργία λειτουργικών, ώριμων πρωτεϊνών. Είναι δημοφιλές σύστημα για την παροδική έκφραση πρωτεϊνών (transient expression), αλλά χρησιμοποιείται επίσης και για τη σταθερή έκφραση πρωτεϊνών για τη μελέτη διάφορων κυτταρο-βιολογικών ερωτημάτων, κυρίως, στη νευροβιολογία. Τα κύρια χαρακτηριστικά τους τα οποία τα καθιστούν ιδιαίτερα δημοφιλή είναι η γρήγορη και εύκολη αναπαραγωγή τους, η συμβατότητά τους με μία μεγάλη ποικιλία μεθόδων για επιμόλυνση, η υψηλή αποδοτικότητα στην επιμόλυνση και στην έκφραση πρωτεϊνών και η αξιόπιστη μετάφραση και επεξεργασία των πρωτεϊνών. Εικόνα 2.3: Χάρτης του πλασμιδίου έκφρασης pcdna3.1/myc-his. Διακρίνονται: (i) ο υποκινητής του γονιδίου CMV (P CMV ), (ii) το σημείο έναρξης της αντιγραφής (puc), (iii) τa γονίδιa που προσδίδουν ανθεκτικότητα στα αντιβιοτικά αμπικιλλίνη (Ampicillin) και νεομυκίνη (Neomycin), (iv) η περιοχή με τα πολλαπλά σημεία κλωνοποίησης, (v) το γονίδιο κωδικοποίησης έξι συνεχόμενων καταλοίπων ιστιδίνης (6 His) και (vi) το γονίδιο κωδικοποίησης του -myc επίτοπου (myc epitope) [από pcdna3.1/myc-his, manual, (cat. no. V ]. 56

57 ΥΛΙΚΑ-ΜΕΘΟΔΟΙ Η κυτταρική σειρά COS-7 προέρχεται από επιθηλιακά κύτταρα νεφρού αφρικανικού πράσινου πιθήκου (Cercopithecus aethiops) και η εμφάνισή τους προσομοιάζει με αυτή των ινοβλαστών στους ανθρώπους. Τα COS-7 κύτταρα αποτελούν ένα σημαντικό εργαλείο για πειράματα επιμόλυνσης χρησιμοποιώντας ανασυνδυασμένα πλασμίδια ή πειράματα επιμόλυνσης με σκοπό την έκφραση ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών. Σε σχέση με τη HEK κυτταρική σειρά, η έκφραση των πρωτεϊνών φαίνεται να είναι καλύτερη μετά από σταθερή επιμόλυνση των κυττάρων. Ο πλασμιδιακός φορέας κλωνοποίησης των cdna μορίων της εξωκυτταρικής περιοχής της ανθρώπινης MuSK και για τους δύο τύπους κυττάρων ήταν ο pcdna3.1/myc-his (Εικόνα 2.3) Πλασμιδιακός φορέας κλωνοποίησης (cloning vector) pet-15b και βακτήρια Εscherichia coli Για την έκφραση του επιθυμητού γονιδίου στο βακτηριακό στέλεχος BL21(DE3) plyss, ο πλασμιδιακός φορέας pet-15b χρησιμοποιεί τον Τ7 υποκινητή, οποίος αναγνωρίζεται μόνο απο την Τ7 RNA πολυμεράση (πολυμεράση του βακτηριοφάγου Τ7). Ακριβώς μετά τον Τ7 υποκινητή του πλασμιδιακού φορέα εισάγεται το γονίδιο-στόχος. Η βακτηριακή πολυμεράση η οποία μεταγράφει το mrna για την έκφραση όλων των απαραίτητων πρωτεϊνών του βακτηρίου δεν μπορεί να αναγνωρίσει τον υποκινητή μπροστά από το γονίδιο-στόχος. Ο lac καταστολέας συνδέεται σε μια ειδική αλληλουχία του Τ7 υποκινητή και μπλοκάρει τη σύνδεση της Τ7 RNA πολυμεράσης στον υποκινητή του γονιδίου. Όταν προστίθεται 1 mm β-ισοπροπυλο-1-θειο-β-d-γαλακτοζιδίου (IPTG) στο υλικό της καλλιέργειας τότε αυτό συνδέεται στον lac καταστολέα επάγοντας μια δομική αλλαγή η οποία μειώνει τη συγγένειά του με το DNA, έτσι ώστε η Τ7 RNA πολυμεράση μπορεί να συνδεθεί στον Τ7 υποκινητή και να ξεκινήσει η μεταγραφή του γονιδίου-στόχου. 57

58 ΥΛΙΚΑ-ΜΕΘΟΔΟΙ Α Β Εικόνα 2.4: Α) Χάρτης του πλασμιδίου έκφρασης pet-15b και Β) Αναπαράσταση βακτηριακού κυττάρου BL21(DE3) plyss, μετασχηματισμένο με πλασμίδιο της σειράς pet, στο οποίο έχει κλωνοποιηθεί το γονίδιο-στόχος. (από Novagen, pet vector, instruction manual, version TB055 11th Edition 01/06). 58

59 ΥΛΙΚΑ-ΜΕΘΟΔΟΙ 2.2 ΜΕΘΟΔΟΙ Αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης (PCR) Κατα την αντίδραση PCR, ενισχύεται μια νουκλεοτιδική αλληλουχία μεταξύ δύο περιοχών μιας μήτρας DNA (DNA template) γνωστής αλληλουχίας. Οι συνθετικές αντιδράσεις πραγματοποιούνται με τη βοήθεια δύο ολιγονουκλεοτιδίων, που χρησιμοποιούνται ως εναρκτήρια μόρια (primers) για τον πολυμερισμό συμπληρωματικών προς τη μήτρα DNA, αλυσίδων, και μίας ανθεκτικής σε υψηλές θερμοκρασίες DNA πολυμεράσης (Chien et al., 1976), η οποία καταλύει τη σύνθεση, παρουσία δεοξυριβονουκλεοτιδίων (Mullis et al., 1986; Mullis and Faloona 1987; Saiki et al., 1988). Κάθε ολιγονουκλεοτίδιο είναι συμπληρωματικό με μία διαφορετική αλυσίδα της μήτρας DNA και το ελεύθερο υδροξύλιο (-OH-) χρησιμοποιείται για τη δημιουργία φωσφοδιεστερικού δεσμού με τα ελεύθερα νουκλεοτίδια. Με αυτό τον τρόπο, η αλυσίδα συντίθεται από το 5 - στο 3 -άκρο. Το κύριο προϊόν της σειράς των συνθετικών αντιδράσεων είναι ένα τμήμα δίκλωνου DΝΑ, του οποίου τα άκρα ορίζονται από τα 5 -άκρα των δύο ολιγονουκλεοτιδίων, ενώ το μέγεθός του ορίζεται από την απόσταση μεταξύ των δύο εναρκτήριων μορίων στη μήτρα DNA. Στην παρούσα μελέτη, η PCR χρησιμοποιήθηκε για την ενίσχυση αλληλουχίων DNA για υποκλωνοποίησή τους σε κατάλληλους πλασμιδιακούς φορείς. Η αντίδραση λαμβάνει χώρα παρουσία μοριακής περίσσειας των δύο εναρκτήριων μορίων και των τεσσάρων dntps. Αρχικά, πραγματοποιείται αποδιάταξη της μήτρας του δίκλωνου DNA με θέρμανση, ώστε να παραχθούν μονόκλωνα μόρια DNA. Ακολουθεί ψύξη του μείγματος της αντίδρασης σε θερμοκρασία που επιτρέπει την υβριδοποίηση των εναρκτήριων μορίων με τις συμπληρωματικές αλυσίδες της μήτρας DNA και τέλος, πραγματοποιείται επιμήκυνση των νέων αλυσίδων DNA με την DNA πολυμεράση. Ο κύκλος των αντιδράσεων αποδιάταξη-υβριδοποίηση-επιμήκυνση επαναλαμβάνεται πολλές φορές και τα προϊόντα κάθε κύκλου ενίσχυσης χρησιμοποιούνται ως μήτρα DNA στον επόμενο κύκλο. Έτσι, σε κάθε κύκλο, θεωρητικά διπλασιάζεται η ποσότητα του επιθυμητού προϊόντος DNA, ώστε στο τέλος n κύκλων, το διάλυμα της αντίδρασης περιέχει θεωρητικά 2n μόρια DNA-αντίγραφα της αλληλουχίας η οποία εντοπίζεται μεταξύ των εναρκτήριων μορίων. 59

60 ΥΛΙΚΑ-ΜΕΘΟΔΟΙ Στην παρούσα μελέτη, για την ενίσχυση cdna αλληλουχιών της εξωκυτταρικής περιοχής της MuSK με PCR, χρησιμοποιήθηκαν γενικά οι παρακάτω συνθήκες, εκτός αν ορίζονται διαφορετικά στις επιμέρους περιπτώσεις: Σε κάθε αντίδραση χρησιμοποιήθηκαν ng μήτρας DNA και 10 pmoles έκαστου εναρκτήριου μορίου και τα dntps προστέθηκαν στο μείγμα της αντίδρασης σε τελική συγκέντρωση 0,2 mm το καθένα. Η αντίδραση πραγματοποιήθηκε σε τελικό όγκο 50 μl ρυθμιστικού διαλύματος 20 mm Tris-HCl, 10 mm KCl, 10 mm (NH4)2SΟ4, 2 mm MgS04, 0,1 % v/v. Triton Χ-100, pη 8,8. Χρησιμοποιήθηκε 1 U Taq DNA ή Pfu πολυμεράσης/αντίδραση. Τα ολιγονουκλεοτίδια που χρησιμοποιήθηκαν, είχαν σχεδιαστεί ώστε να διαθέτουν αλληλουχίες αναγνώρισης από κατάλληλα περιοριστικά ένζυμα, προκειμένου η προς ενίσχυση αλληλουχία DNA να μπορεί κατόπιν να κλωνοποιηθεί σε κατάλληλο πλασμιδιακό φορέα έκφρασης. Οι αντιδράσεις πραγματοποιήθηκαν σε θερμικό κυκλοποιητή όπου αρχικά, τα δείγματα θερμάνθηκαν στους 95 C για 2 min, προκειμένου να αποδιαταχθεί πλήρως το δίκλωνο μόριο του πλασμιδιακού DNA. Ακολούθησαν 25 κύκλοι ενίσχυσης με τις ακόλουθες συνθήκες (εκτός αν κατά περίπτωση ορίζονται διαφορετικά): αποδιάταξης 95 C, 30s υβριδοποίησης 56 C, 30s πολυμερισμού 72 C, 1,5 min Μετά την ολοκλήρωση των 25 κύκλων ενίσχυσης, τα προϊόντα της PCR (5 μl από κάθε δείγμα) αναλύθηκαν με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα 1% w/v αγαρόζης ( 2.2.6) Υγρές και στερεές καλλιέργειες βακτηριακών κυττάρων Escherichia coli Για την παρούσα εργασία χρησιμοποιήθηκαν στελέχη TOP10 F' και BL21(DE3)pLysS της E. coli, τα οποία καλλιεργήθηκαν σε υγρό ή στερεό θρεπτικό μέσο LB παρουσία κατάλληλου αντιβιοτικού. Η ανάπτυξή τους πραγματοποιήθηκε στους 37 C, σε επωαστικούς θαλάμους. Για τις υγρές καλλιέργειες, η επώαση πραγματοποιήθηκε υπό ανάδευση (200 rpm) σε αποστειρωμένους πλαστικούς σωλήνες μιας χρήσης των 15 ml ή σε υάλινες κωνικές φιάλες των 2L (καλλιέργειες 60

61 ΥΛΙΚΑ-ΜΕΘΟΔΟΙ σε μεγάλη κλίμακα). Για όλες τις καλλιέργειες πραγματοποιήθηκε επώαση για 16h. Τα μετασχηματισμένα και μη μετασχηματισμένα βακτήρια διατηρούνται για μεγάλα χρονικά διαστήματα στους -80 C στο κατάλληλο θρεπτικό μέσο παρουσία 20% γλυκερόλης. Οι στερεές καλλιέργειες διατηρούνται στους 4 ο C για διάστημα αρκετών ημερών έως και μερικών εβδομάδων Μετασχηματισμός βακτηρίων Η χημική μέθοδος μετασχηματισμού βακτηριακών κυττάρων στηρίζεται στην απόδοση θετικού φορτίου στο τοίχωμά τους μετά από έκθεσή τους σε CaCl 2, έτσι ώστε να πραγματοποιείται η έλξη των αρνητικά φορτισμένων φωσφορικών ομάδων του ανασυνδυασμένου πλασμιδιακού DNA (Sambrook et al., 1989) και να διευκολύνεται με αυτό τον τρόπο η είσοδός τους στο βακτηριακό κύτταρο. Τα μετασχηματισμένα κύτταρα απομονώνονται σε θρεπτικό υλικό επιλογής (π.χ. εμποτισμένου με κατάλληλο αντιβιοτικό). Η ικανότητα μετασχηματισμού με τη μέθοδο αυτή είναι περίπου 0,5-2, βακτήρια/μg υπερελικωμένου πλασμιδιακού DNA, η οποία είναι μικρότερη από τη μέθοδο μετασχηματισμού με ηλεκτροδιάτρηση. Ωστόσο, παραμένει ικανοποιητική για τις συνήθεις περιπτώσεις κλωνοποίησης σε πλασμίδια. Η πορεία μετασχηματισμού των βακτηρίων με αυτή τη μέθοδο περιλαμβάνει τα εξής δύο στάδια: A. Προετοιμασία επιδεκτικών κυττάρων (competent cells) βακτηρίων με χρήση χλωριούχου ασβεστίου (CaCl2) 5 ml θρεπτικού υλικού εμβολιάζονται με μία αποικία βακτηρίων TOP10F και επωάζονται υπό ανάδευση, στους 37 o C για περίπου 16h. Στη συνέχεια, η παραπάνω καλλιέργεια μεταφέρεται σε 500 μl LB, τα οποία επωάζονται υπό ανάδευση στους 37 o C, έως O.D.600 = 0,6-0,9 (~2 h). Ακολουθεί μεταφορά της καλλιέργειας, σε πάγο (0 C), όπου παραμένει για 30 min και στη συνέχεια, φυγοκεντρείται (4.000 rpm, 10 min, 4 C). Το ίζημα των βακτηρίων αναδιαλύεται σε 25 ml στείρου παγωμένου διαλύματος 50 mμ CaCl 2. Ακολουθεί, φυγοκέντρηση (4.000 rpm, 10 min, 4 C) και το ίζημα των βακτηρίων αναδιαλύεται σε 5 ml στείρου παγωμένου διαλύματος 50 mμ CaCl 2. Έπειτα, το εναιώρημα τοποθετείται στον πάγο για 2-3h. Στη συνέχεια, είτε ο μετασχηματισμός των επιδεκτικών πλέον βακτηριακών κυττάρων μπορεί να 61

62 ΥΛΙΚΑ-ΜΕΘΟΔΟΙ πραγματοποιηθεί άμεσα ή αυτά να καταψυχθούν ανά 100 μl στους -80 ºC παρουσία 20% γλυκερόλης για μελλοντική χρήση. B. Μετασχηματισμός επιδεκτικών κυττάρων βακτηρίων Αρχικά, 2 μl κατάλληλα αραιωμένου με ddh 2 0 ανασυνδυασμένου πλασμιδιακού DNA (~5 ng/μl) από το μείγμα της αντίδρασης σύνδεσης αναμειγνύονται με 100 μl εναιωρήματος επιδεκτικών βακτηρίων και επωάζονται στον πάγο (0 ºC) για 45 min. Έπειτα, τα κύτταρα επώαση στους 42 ºC (μέσα σε υδατόλουτρο) αυστηρά για 90s (θερμικό σοκ). Το μείγμα τοποθετείται αμέσως σε πάγο και επωάζεται για 5 min. Στη συνέχεια, προστίθεται στο μείγμα 1 ml LB και επωάζονται υπό ανάδευση (850 rpm) στους 37ºC για 1h. Έπειτα, τα βακτήρια επιστρώνονται σε στερεό θρεπτικό μέσο LB σε τρυβλίο Petri, παρουσία κατάλληλου αντιβιοτικού και επωάζονται για ~16h στους 37ºC, οπότε και εμφανίζονται αποικίες επιτυχώς μόνο μετασχηματισμένων βακτηρίων Υποκλωνοποίηση (subcloning) δίκλωνου τμήματος DNA σε πλασμιδιακό φορέα Πέψη DNA µε περιοριστικές ενδονουκλεάσες (Restriction reaction) Οι περιοριστικές ενδονουκλεάσες απομονώνονται από φυσικές πηγές (βακτήρια), αναγνωρίζουν μικρές αλληλουχίες DNA, και πέπτουν το δίκλωνο DNA σε συγκεκριμένες θέσεις εντός της αλληλουχίας αναγνώρισης ή σε γειτονικό της σημείο. Μια μονάδα (1U) περιοριστικής ενδονουκλεάσης ορίζεται ως η ποσότητα του ενζύμου που απαιτείται για την πλήρη πέψη 1 μg καθαρού DNA. Για την αποτελεσματική δράση των ενζύμων, απαιτούνται καθαρά δείγματα DNA, απαλλαγμένα από προσμίξεις. Γενικά, η σχέση που χρησιμοποιήθηκε ήταν 2-3 U περιοριστικού ενζύμου / 1 μg DNA / 20 μl (τελικός όγκος αντίδρασης). Οι αντιδράσεις πέψης πραγματοποιoύνται σε συγκεντρώσεις άλατος και θερμοκρασίες που αναγράφονται κάθε φορά στα συνοδευτικά φυλλάδια των ενζύμων της κατασκευάστριας εταιρείας. Ωστόσο, κάποιες περιοριστικές ενδονουκλεάσες είναι δραστικές και σε διαφορετικές συγκεντρώσεις άλατος. Τέτοια ένζυμα 62

63 ΥΛΙΚΑ-ΜΕΘΟΔΟΙ χρησιμοποιήθηκαν αποτελεσματικά για διπλή πέψη στο ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα. Τα ένζυμα προστέθηκαν σε όγκο που δεν ξεπερνούσε κάθε φορά το 1/10 του τελικού όγκου της αντίδρασης, ώστε η τελική συγκέντρωση της γλυκερόλης, που περιέχεται στο διάλυμα αποθήκευσης του ενζύμου, να παραμένει χαμηλή και να μην μπορεί να επηρεάσει την αντίδραση. Ο έλεγχος των αντιδράσεων πέψης έγινε με ηλεκτροφόρηση δείγματος από το διάλυμα της αντίδρασης σε πήκτωμα αγαρόζης 1% w/v ( 2.2.6) Αποφωσφορυλίωση γραµµικού πλασµιδιακού DNA (DNA dephosphorylation) Σε ορισμένες περιπτώσεις κλωνοποίησης, όπου το μόριο του πλασμιδιακού DNA έχει κοπεί με ένα περιοριστικό ένζυμο που δημιουργεί συμπληρωματικά κολλώδη άκρα (cohesive ends) ή ισοτελή άκρα (blunt ends), υπάρχει η πιθανότητα κατά την αντίδραση σύνδεσης (ligation) με το προς κλωνοποίηση τμήμα DNA, τα άκρα αυτά να επανασυνδεθούν (self-ligation), αποκλείοντας έτσι την κλωνοποίηση. Σε αυτή τη περίπτωση προηγείται της αντίδρασης σύνδεσης, αποφωσφορυλίωση του γραμμικού μορίου DNA με χρήση του ενζύμου της αλκαλικής φωσφατάσης από έντερο μοσχαριού (calf intestinal alkaline phosphatase, CIAP), το οποίο αποφωσφορυλιώνει τα 5 -άκρα του γραμμικού πλασμιδιακού DNA. Το προς κλωνοποίηση μόριο DNA μπορεί και συνδέεται με το αποφωσφορυλιωμένο πλασμίδιο, σχηματίζοντας σε κάθε άκρο φωσφοδιεστερικό δεσμό στη μία από τις δύο αλυσίδες. Στη συνέχεια το βακτήριο Ε. coli επιδιορθώνει τα αποσφωφορυλιωμένα άκρα, οπότε δημιουργούνται οι δεσμοί και στις δύο αλυσίδες και το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο διπλασιάζεται πλέον κανονικά. Η πορεία της αποφωσφορυλίωσης γραμμικού πλασμιδιακού DNA είναι η εξής: Γίνεται ανάμειξη 50 μl διαλύματος 10 mm Tris-HCl, pη 8,3 περιέχοντος 10 μg καθαρού (καθαρισμένου από στήλη QIAquick, ) γραμμικού πλασμιδιακού DNA με 10 μl ρυθμιστικού διαλύματος αποφωσφορυλίωσης. Στη συνέχεια προστίθενται 5 μl (0,5 U) διαλύματος CIAP (Gibco BRL) και 35 μl ddh 2 O και το μίγμα επωάζεται στους 37 o C, για 20 min. Ακολουθεί επώαση στους 65 C για 10 min, ώστε να σταματήσει η αντίδραση, και καθαρισμός με στήλη QIAquick ( ). 63

64 ΥΛΙΚΑ-ΜΕΘΟΔΟΙ Αντίδραση σύνδεσης (ligation) Για την αντίδραση σύνδεσης των μορίων DNA με μόρια πλασμιδιακού DNA χρησιμοποιούνται 100 ng από το κάθε ένα και 2 μl (1U/μl) Τ4 DNA λιγάσης σε τελικό όγκο 22 μl ρυθμιστικού διαλύματος 50 mm Tris-HCl, pη 7,6, 10 mm MgCl2, 1 mm ΑΤΡ, 1 mm DTT, 5% w/v ΡΕG Στη συνέχεια τα δείγματα επωάζονται σε θερμοκρασία δωματίου για 1h. Τα προϊόντα της αντίδρασης σύνδεσης χρησιμοποιούνται άμεσα για το μετασχηματισμό βακτηρίων Παρασκευή πλασµιδιακού DNA από καλλιέργειες βακτηρίων Παρασκευή πλασµιδιακού DNA σε μικρή κλίµακα (mini-prep) Η μέθοδος χρησιμοποιείται για την απομόνωση καθαρισμένου πλασμιδιακού DNA σε μικρή ποσότητα από υγρές καλλιέργειες μετασχηματισμένων βακτηρίων. Το καθαρισμένο DNA χρησιμοποιείται για πέψη με περιοριστικές ενδονουκλεάσες, με σκοπό τον εντοπισμό κλώνων που φέρουν το επιθυμητό ανασυνδυασμένο πλασμίδιο. Η διαδικασία που πραγματοποιείται είναι η εξής: Τα κύτταρα μίας αποικίας μετασχηματισμένων βακτηρίων χρησιμοποιούνται για τον εμβολιασμό 5 ml θρεπτικού υλικού LB με το κατάλληλο αντιβιοτικό και ακολουθεί επώαση υπό ανάδευση, στους 37 C, 16 h. Στη συνέχεια, 3 ml από την παραπάνω καλλιέργεια φυγοκεντρούνται στις rpm, 1 min, σε θερμοκρασία δωματίου και το ίζημα των βακτηριακών κυττάρων αναδιαλύεται σε 100 μl ρυθμιστικού διαλύματος GTE υπό ανάδευση και το εναιώρημα τοποθετείται σε πάγο. Για την καταστροφή του χρωμοσωμικού DNA και των κυτταρικών μεμβρανών, προστίθενται 200 μl πρόσφατα παρασκευασμένου διαλύματος 0,2 Μ NaOH, l % w/v SDS, υπό ανάδευση, και το μείγμα επωάζεται στον πάγο για 10 min. Ακολουθεί προσθήκη 150 μl 3Μ ρυθμιστικού διαλύματος οξικών (CH 3 COOH/CH 3 COOK), pη 5,5 και μετά από ανάδευση το μείγμα επωάζεται στον πάγο για 10 min. Το ίζημα των κυτταρικών υπολειμμάτων (μεμβρανικά θραύσματα, πρωτεΐνες, χρωμοσωμικό DΝΑ και RNA) απομακρύνεται με φυγοκέντρηση στις rpm, 10 min, 4 C. Στο υπερκείμενο προστίθεται ισοπροπανόλη ποσότητας ίσης προς 0,8 V διαλύματος για την κατακρήμνιση του πλασμιδιακού DNA και του RNA. Ακολουθεί φυγοκέντρηση στις 64

65 ΥΛΙΚΑ-ΜΕΘΟΔΟΙ rpm, 10 min και απομάκρυνση του υπερκειμένου. Tο ίζημα ξεπλένεται με αιθανόλη 70% v/v και έπειτα από την πλήρη εξάτμισή της ακολουθεί αναδιάλυση σε 50 μl διαλύματος TE-RNAάσης. Στη συνέχεια, γίνεται πέψη 10 μl διαλύματος του πλασμιδιακού DNA με περιοριστικές ενδονουκλεάσες και ανάλυση των προϊόντων της πέψης με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης Παρασκευή πλασµιδιακού DNA σε µεγάλη κλίµακα (maxi-prep) Η μέθοδος χρησιμοποιείται για την απομόνωση μεγάλης ποσότητα υψηλής καθαρότητας πλασμιδιακού DNA (της τάξεως των mg), που απαιτείται για κλωνοποίηση τμημάτων DNA και μετασχηματισμό βακτηριακών κυττάρων ή κυττάρων ζύμης. Η πορεία αυτής της διαδικασίας είναι η εξής: Αρχικά, 5 ml θρεπτικού υλικού LB με 100 μg/ml αμπικιλλίνη εμβολιάζονται με μία αποικία μετασχηματισμένων με πλασμίδιο βακτηρίων και επωάζονται υπό ανάδευση στους 37 ºC για 16 h. Από την παραπάνω καλλιέργεια, χρησιμοποιείται 1 ml για τον εμβολιασμό 1 L αντίστοιχου θρεπτικού υλικού και ακολουθεί επώαση υπό ανάδευση στους 37 ºC για 16 h. Μετά το τέλος της επώασης, τα κύτταρα φυγοκεντρούνται στις rpm, 15 min, 4 ºC και το ίζημα των βακτηριακών κυττάρων αναδιαλύεται σε 40 ml ρυθμιστικού διαλύματος GTE υπό ανάδευση και το εναιώρημα τοποθετείται σε πάγο για την αναστολή της δράσης των ενζύμων, τα οποία ελευθερώνονται στο επόμενο στάδιο. Για τη λύση των κυτταρικών τοιχωμάτων, προστίθενται 200 mg λυσοζύμης υπό ήπια ανάδευση και ακολουθεί επώαση για 5 min, σε θερμοκρασία δωματίου. Για την καταστροφή του χρωμοσωμικού DNA και των κυτταρικών μεμβρανών, προστίθενται 80 ml πρόσφατα παρασκευασμένου διαλύματος 0,2 N NaOH, l% w/v SDS υπό ανάδευση και το μείγμα επωάζεται στον πάγο για 10 min. Στη συνέχεια, προστίθενται 60 ml ρυθμιστικού διαλύματος 3 Μ οξικών (CH3COOH/CH3COOK), pη 5,5 και ακολουθεί ανάδευση και επώαση στον πάγο, για 10 min. Το ίζημα των κυτταρικών υπολειμμάτων (μεμβρανικά θραύσματα, πρωτεΐνες, χρωμοσωμικό DΝΑ και μέρος του RNA) απομακρύνεται με φυγοκέντρηση ( rpm, 10 min, 4 C). Το υπερκείμενο διηθείται από υαλοβάμβακα και μεταφέρεται σε καθαρό σωλήνα. Τα νουκλεϊκά οξέα κατακρημνίζονται με την προσθήκη ισοπροπανόλης (0,6 όγκος υπερκείμενου), και μετά από ανάδευση, ακολουθεί επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για 15 min και φυγοκέντρηση ( rpm, θερμοκρασία δωματίου, 15 65

66 ΥΛΙΚΑ-ΜΕΘΟΔΟΙ min) για το σχηματισμό του ιζήματος (πλασμιδιακό DNA). Στη συνέχεια, στο ίζημα προστίθενται 6 ml διαλύματος αιθανόλης 70% v/v και το διάλυμα φυγοκεντρείται εκ νέου ( rpm, θερμοκρασία δωματίου, 5 min). Έπειτα, γίνεται απόχυση του υπερκείμενου και στέγνωμα του ιζήματος σε θερμοκρασία δωματίου, ώστε να εξατμισθεί κάθε ίχνος αιθανόλης. Στη συνέχεια, το ίζημα (πλασμιδιακό DNA) αναδιαλύεται σε 16 ml ρυθμιστικού διαλύματος ΤΕ (10:1) και μεταφέρεται σε προψυγμένο σωλήνα. Ακολουθεί προσθήκη 6 ml προψυγμένου διαλύματος 5 Μ LiCl για την κατακρήμνιση του RNA, ανάδευση και φυγοκέντρηση ( rpm, 10 min, 4 C). Το υπερκείμενο μεταφέρεται στη συνέχεια σε καθαρό σωλήνα όπου προστίθεται ίσος όγκος ισοπροπανόλης και το μείγμα αναδεύεται και υποβάλλεται σε εκ νέου φυγοκέντρηση ( rpm, 10 min, θερμοκρασία δωματίου). Ακολουθεί προσθήκη 8 ml διαλύματος αιθανόλης 70% v/v στο ίζημα του DNA, φυγοκέντρηση ( rpm, 10 min, θερμοκρασία δωματίου) και απόχυση του υπερκείμενου. Στη συνέχεια το ίζημα στεγνώνει σε θερμοκρασία δωματίου και έπειτα αναδιαλύεται σε 1 ml ΤΕ (10:1) περιέχοντος παγκρεατική ριβονουκλεάση (RNase) σε συγκέντρωση 25 μg/ml. Ακολουθεί επώαση για 30 min, σε θερμοκρασία δωματίου. Στη συνέχεια, προστίθεται 1 ml διαλύματος 1,6 Μ NaCl, 13% w/v PEG 8.000, ανάδευση και φυγοκέντρηση στις rpm, για 5 min, στους 4 C. Τέλος, το ίζημα (πλασμιδιακό DNA) αναδιαλύεται σε 800 μl ΤΕ (10:1) Καθαρισμός πλασμιδιακού DNA (DNA purification) Με εκχύλιση με οργανικούς διαλύτες Κατά την εκχύλιση με βασικό διάλυμα φαινόλης, οι πρωτεΐνες απομακρύνονται στην οργανική φάση, ενώ το καθαρό DNA παραλαμβάνεται στην υδατική φάση. Η μέθοδος είναι γρήγορη, εύκολη και με χαμηλό κόστος. Επειδή τα προϊόντα οξείδωσης της φαινόλης μπορεί να καταστρέψουν τα νουκλεϊκά οξέα, επιβάλλεται η χρήση εξισσοροπημένης φαινόλης. Η διαδικασία αυτή έχει ως εξής: Το υδατικό διάλυμα DNA εκχειλίζεται με διαδοχική προσθήκη ίσων όγκων διαλύματος φαινόλης, φαινόληςχλωροφορμίου/ισοαμυλικής αλκοόλης 1:1 και χλωροφορμίου/ισοαμυλικής αλκοόλης. 66

67 ΥΛΙΚΑ-ΜΕΘΟΔΟΙ Οι δύο φάσεις αναμιγνύονται με έντονη ανάδευση και διαχωρίζονται μετά από σύντομη φυγοκέντρηση ( rpm, 5 min, θερμοκρασία δωματίου) Με συστηματοποιημένες χρωματογραφικές μεθόδους Ο διαχωρισμός του πλασμιδιακού DNA, από τις προσμίξεις άλλων μορίων, βασίζεται στις διαφορετικές φυσικές τους ιδιότητες. Tο μεγάλο μέγεθος του πλασμιδιακού DNA επιτρέπει το διαχωρισμό του από μικρού μοριακού βάρους προσμίξεις με χρωματογραφία μοριακής διήθησης ενώ το αρνητικό φορτίο των νουκλεϊκών οξέων, επιτρέπει την απομάκρυνση των προσμίξεων με χρήση ανιοανταλλακτικής χρωματογραφίας. Για εμπορικούς λόγους, οι ειδικές ιδιότητες για τις επί μέρους μήτρες που παρέχονται από τους προμηθευτές είναι άγνωστες, τυπικά όμως εκμεταλλεύονται μία από τις παραπάνω ιδιότητες. Οι πακεταρισμένες στήλες που παρέχονται από τις εταιρείες έχουν συγκεκριμένη χωρητικότητα, η οποία δεν ξεπερνά τα 10 μg πλασμιδιακού DNA. Με τη μέθοδο QIAquick Gel Extrαction Kit (Qiagen) Το προς καθαρισμό DΝΑ δεσμεύεται σε προπακεταρισμένη στήλη (QIAquick spin column), από όπου εκλούεται με προσθήκη υδατικού διαλύματος, αφού έχει προηγηθεί απομάκρυνση των προσμίξεων, που επίσης έχουν δεσμευτεί στη στήλη, κατά την έκλουση με ρυθμιστικό διάλυμα χαοτροπικών αλάτων GC. Η πορεία αυτής της μεθόδου είναι η ακόλουθη: Από το πήκτωμα αγαρόζης κόβεται και ζυγίζεται η επιθυμητή ζώνη DΝΑ. Προστίθεται ρυθμιστικό διάλυμα GC (η σύνθεση του οποίου δεν αναφέρεται από τον κατασκευαστή) σε όγκο τριπλάσιο από τη μάζα του πηκτώματος αγαρόζης (π.χ. για κάθε 100 mg πηκτώματος προστίθενται 300 μl διαλύματος GC) και το μείγμα επωάζεται στους 55 C, 10 min, προκειμένου να διαλυθεί η αγαρόζη. Το διάλυμα τοποθετείται στη στήλη QIAquick spin και ακολουθεί φυγοκέντρηση ( rpm, 60s), κατά την οποία το DΝΑ δεσμεύεται στη στήλη. Το έκλουσμα απομακρύνεται και ακολουθεί έκπλυση της στήλης με 0,75 ml ρυθμιστικού διαλύματος ΡΕ (η σύνθεση του οποίου δεν αναφέρεται από τον κατασκευαστή), το οποίο περιέχει 80% v/v αιθανόλη. Ακολουθεί φυγοκέντρηση στις rpm, 60s και απομάκρυνση του εκλούσματος περιέχοντος προσμίξεις. Η έκλουση του καθαρού DΝΑ από τη στήλη πραγματοποιείται στη 67

68 ΥΛΙΚΑ-ΜΕΘΟΔΟΙ συνέχεια σε ρυθμιστικό διάλυμα 10 mm Tris/HCl, pη 8,0, με φυγοκέντρηση στις rpm, 60s. Οι στήλες QIAquick που χρησιμοποιούνται είναι ικανές να δεσμεύσουν μέχρι 10 μg dsdna, μεγέθους 70 bp 10 kbp. Το καθαρό DΝΑ που ανακτάται αντιστοιχεί στο 70-80% της αρχικής ποσότητας που χρησιμοποιήθηκε. Με τη μέθοδο QIAquick PCR purίficαtion Kit (Qiagen) Μετά από ενίσχυση PCR τα προϊόντα της αντίδρασης καθαρίζονται από τα εναρκτήρια μόρια, τα ελεύθερα μονονουκλεοτίδια και την πολυμεράση. Το προς καθαρισμό DΝΑ δεσμεύεται σε προπακεταρισμένη στήλη QIAquick και μετά την απομάκρυνση των προσμίξεων, εκλούεται με προσθήκη υδατικού διαλύματος. Η πορεία αυτής της μεθόδου είναι η εξής: Σε έναν όγκο διαλύματος αντίδρασης PCR προστίθενται 5 όγκοι διαλύματος ΡΒ (η σύνθεση του οποίου δεν αναφέρεται από τον κατασκευαστή) και το δείγμα τοποθετείται στη στήλη. Ακολουθεί απομάκρυνση του εκλουόμενου κλάσματος με φυγοκέντρηση ( rpm, 60s, θερμοκρασία δωματίου). Στη συνέχεια, η στήλη εκπλένεται με 0,75 ml διαλύματος ΡΕ και ακολουθεί φυγοκέντρηση στις rpm για 60s, σε θερμοκρασία δωματίου. Το κλάσμα έκπλυσης (που περιέχει τις ανεπιθύμητες προσμίξεις) απομακρύνεται και το DNA εκλούεται με προσθήκη στη στήλη 55 μl ρυθμιστικού διαλύματος 10 mm Tris-HCl, pη 8,0 και φυγοκέντρηση στις rpm, για 60s, σε θερμοκρασία δωματίου Κατακρήµνιση του DNA (DNA precipitation) Για την κατακρήμνιση των νουκλεϊκών οξέων χρησιμοποιούνται παράγοντες οι οποίοι μειώνουν τη διαλυτότητα των μορίων των νουκλεϊκών οξέων, όπως: η χαμηλή θερμοκρασία, τα κατιόντα (αυξάνουν την ιοντική ισχύ του διαλύματος) και η αιθανόλη (απομακρύνει τα μόρια νερού από τα μόρια του νουκλεϊκού οξέος ως αφυδατικό μέσο). Η πορεία που ακολουθείται είναι η εξής: Γίνεται προσθήκη 1/10 του όγκου διαλύματος του απομονωμένου DNA διαλύματος 3 Μ οξικού νατρίου, pη 4,8 και διπλάσιου όγκου προψυγμένης απόλυτης αιθανόλης. Ακολουθεί φυγοκέντρηση στις 68

69 ΥΛΙΚΑ-ΜΕΘΟΔΟΙ rpm, 5 min, 4 C και έκπλυση του ιζήματος με διάλυμα αιθανόλης 70% v/v για την απομάκρυνση αλάτων. Μετά την εξάτμιση του διαλύτη μέσω παραμονής στους 37 ο C, το ίζημα αναδιαλύεται στον επιθυμητό όγκο ρυθμιστικού διαλύματος ΤΕ (10 :1) Ποσοτική ανάλυση δείγματος DNA Η συγκέντρωση (C) διαλύματος δίκλωνου DNA προσδιορίζεται φωτομετρικά με μέτρηση της απορρόφησης του διαλύματος στην περιοχή του υπεριώδους (260 nm, Α260), όπου απορροφούν οι αζωτούχες βάσεις του DNA (Kozutsumi et al., 1989). Μετά τη μέτρηση της απορρόφησης η συγκέντρωση προσδιορίζεται με τη χρήση της εξίσωσης: cdna (μg/μl) = (Α παράγοντας αραίωσης)/1000 (Shirley et al., 1995). Η καθαρότητα του DNA στο παρασκεύασμα προσδιορίζεται από το λόγο Α260/Α280, ο οποίος για καθαρά παρασκευάσματα είναι ίσος προς 1, Ποιοτική ανάλυση δείγµατος DNA Λόγω του ιονισμού των φωσφορικών τους ομάδων, τα μόρια DΝΑ είναι ομοιόμορφα αρνητικά φορτισμένα. Έτσι, υπό την επίδραση ηλεκτρικού πεδίου σε οριζόντιο πήκτωμα αγαρόζης (φυσικός πολυσακχαρίτης), τα μόρια DNA μετακινούνται προς το θετικό πόλο με ταχύτητα αντιστρόφως ανάλογη προς το μέγεθός τους (McDonell et al., 1977; Southern 1979). Άλλες παράμετροι, που επηρεάζουν τη μετανάστευση, είναι το μέγεθος των πόρων του πηκτώματος, η εφαρμοζόμενη διαφορά δυναμικού, το ρυθμιστικό διάλυμα ηλεκτροφόρησης και η διαμόρφωση των νουκλεϊκών οξέων. Μετά το πέρας της ηλεκτροφόρησης, η θέση μετανάστευσης κάθε μορίου DNA προσδιορίζεται κατά την έκθεση του πηκτώματος σε υπεριώδη ακτινοβολία ( nm), λόγω της ενσωμάτωσης πορτοκαλοκόκκινης φθορίζουσας χρωστικής (βρωμιούχο αιθίδιο) ανάμεσα στις αζωτούχες βάσεις της διπλής έλικας του DNA. Η μέθοδος παρέχει υψηλή ανάλυση και χρησιμοποιείται για την ταυτοποίηση, το διαχωρισμό και την απομόνωση μορίων DNA με βάση το μέγεθός τους. Μπορεί να χρησιμοποιηθεί για αναλυτικούς ή παρασκευαστικούς σκοπούς. 69

70 ΥΛΙΚΑ-ΜΕΘΟΔΟΙ Παρασκευή πηκτώματος αγαρόζης Αρχικά, κατάλληλη ποσότητα αγαρόζης για τελική συγκέντρωση 1 % w/v, διαλύεται πλήρως σε ρυθμιστικό διάλυμα ΤΒΕ με θέρμανση. Στη συνέχεια, ακολουθεί προσθήκη βρωμιούχου αιθίδιου σε τελική συγκέντρωση 0,5 μg/ml, ανάδευση του διαλύματος και απόχυσή του σε καλούπι σε κατάλληλη συσκευή, όπου αφήνεται να πήξει σε θερμοκρασία δωματίου. Ηλεκτροφόρηση DNA Μετά από προσθήκη διαλύματος "φόρτωσης" δείγματος DNA, τα δείγματα τοποθετούνται σε οριζόντιο πήκτωμα αγαρόζης. Ακολουθεί ηλεκτροφόρηση σε ρυθμιστικό διάλυμα ΤΒΕ με ρεύμα σταθερής τάσης 100 V, σε θερμοκρασία δωματίου. Παράλληλα με τα προς εξέταση δείγματα, αναλύεται κατάλληλος μάρτυρας γνωστών μοριακών μεγεθών DNA. Μετά το πέρας της ηλεκτροφόρησης, το πήκτωμα εκτίθεται σε υπεριώδη ακτινοβολία ( nm), οπότε διακρίνονται φθορίζουσες ζώνες στις θέσεις όπου έχουν μεταναστεύσει τα μόρια DNA. Το πήκτωμα αγαρόζης φωτογραφίζεται με ψηφιακή φωτογραφική μηχανή Έκφραση της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης σε βακτήρια E.coli Το επιθυμητό τμήμα εισάγεται στον πλασμιδιακό φορέα pet-15b (Novagen) στην κατάλληλη θέση περιορισμού και ακολουθεί μετασχηματισμός των BL21(DE3)pLysS βακτηρίων ( 2.2.9). Αρχικά, 10 ml LB θρεπτικού υλικού με 50 μg/μl χλωραμφενικόλη και 100 mg αμπικιλλίνη, εμβολιάζονται με μία αποικία μετασχηματισμένων βακτηρίων BL21(DE3)pLysS και επωάζονται για περίπου 16 h, υπό ανάδευση. Στη συνέχεια, 1 lt θρεπτικού υλικού LB με 100 mg αμπικιλλίνη και 50 μg/ml χλωραμφενικόλη εμβολιάζεται με 1 ml από την παραπάνω καλλιέργεια και τα ακολουθεί επώαση στους 37 C, υπό ανάδευση, μέχρι η O.D.590 = 0,6. Ακολουθεί προσθήκη IPTG σε τελική συγκέντρωση 1 mm και επώαση της καλλιέργειας στους 37 C για 4 h. Μετά το πέρας της επώασης, η καλλιέργεια φυγοκεντρείται στις 5000 rpm για 15 min στους 4 C, το υπερκείμενο απομακρύνεται και το ίζημα πλένεται με PBS. Πραγματοποιείται λύση του βακτηριακού τοιχώματος σταδιακά με τρεις κύκλους 70

71 ΥΛΙΚΑ-ΜΕΘΟΔΟΙ βαθιάς-τήξης, την προσθήκη διαλύματος με 100 mm NaH 2 PO 4, 10 mm Tris-HCl και 8 Μ ουρία, ph 8 και τη χρήση υπερήχων για 6 περιόδους διαρκείας 10 sec η καθεμία και το πέρασμα από 18G σύριγγα-βελόνα. Το διάλυμα που προκύπτει και περιέχει το σύνολο των βακτηριακών πρωτεϊνών (μαζί με την ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη) σε αποδιαταγμένη μορφή, μπορεί να φυλαχτεί σε θερμοκρασία δωματίου μέχρι τη διαδικασία του καθαρισμού της πρωτεΐνης με Ni-NTA χρωματογραφία συγγένειας ( ) χρησιμοποιώντας το διάλυμα 50 mm HEPES, 300 mm NaCl, 0,1% glycerol, pη 8,0 για την έκλουση της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης Υγρές και στερεές καλλιέργειες κυττάρων P. pastoris Για την παρούσα εργασία χρησιμοποιήθηκε το στέλεχος Χ-33 του P. pastoris. Το στέλεχος X33 αναπτύσσεται σε θρεπτικό υλικό YPD. Η ανάπτυξη των στελεχών αυτών σε υγρά και στερεά θρεπτικά μέσα επιτυγχάνεται με επώαση στους 30 C. Ο χρόνος διπλασιασμού τους στη λογαριθμική φάση ανάπτυξης είναι ~2h. Για τη διατήρηση μετασχηματισμένων και μη στελεχών της Ρ. pastoris για μεγάλα χρονικά διαστήματα, τα στελέχη αναπτύσσονται σε υλικό YPD στους 30 C για 16h και φυλάσσονται στους -80 C, παρουσία 15% v/v γλυκερόλης. Οι στερεές καλλιέργειες διατηρούνται στους 4 C για διάστημα αρκετών ημερών έως και μερικών εβδομάδων Μετασχηµατισµός κυττάρων P. pastoris με ηλεκτροδιάτρηση (electroporation) Η εισαγωγή του πλασμιδίου ppiczαα ( 2.1.9) στο εσωτερικό του κυττάρου πραγματοποιείται σε κατάλληλα επεξεργασμένα κύτταρα ζύμης τα οποία γίνονται διαπερατά σε πλασμίδια μετά από την εφαρμογή ρεύματος υψηλής τάσης. Για μεγαλύτερη ικανότητα μετασχηματισμού, το πλασμίδιο γίνεται γραμμικό (linearization) με πέψη σε μοναδική θέση αναγνώρισης στην αλληλουχία 5 ΑΟΧ1 των πλασμιδίων (Εικόνα 2.2), πριν τη διαδικασία της ηλεκτροδιάτρησης. Η γραμμικότητα του πλασμιδίου θα ενισχύσει την πιθανότητα ομόλογου ανασυνδυασμού με την ομόλογη και συντηρημένη αλληλουχία ΑΟΧ1 του χρωμοσώματος της Ρ. pαstοrίs και η ενσωμάτωση των πλασμιδίων στο χρωμοσωμικό 71

72 ΥΛΙΚΑ-ΜΕΘΟΔΟΙ DNA της P. pastoris είναι περισσότερο πιθανή. Η μέθοδος έχει ικανότητα μετασχηματισμού κύτταρα/μg γραμμικού DNA, χωρίς να καταστρέφει το κυτταρικό τοίχωμα της Ρ. Ραstοrίs. Περιλαμβάνει τα εξής στάδια: A. Προετοιμασία επιδεκτικών κυττάρων P. pastoris Αρχικά, 10 ml θρεπτικού υλικού YPD εμβολιάζονται με κυττάρα μιας αποικίας του στέλεχους Χ33 που έχουν αναπτυχθεί σε στερεό θρεπτικό υλικό YPD και επωάζονται υπό ανάδευση για περίπου 16h στους 30 C. Στη συνέχεια, 50 μl από την παραπάνω καλλιέργεια χρησιμοποιούνται για τον εμβολιασμό 500 ml YPD και επωάζονται υπό ανάδευση στους 30 C, μέχρι O.D. 600 = 1,3 (~16 h). Ακολουθούν τέσσερις διαδοχικές φυγοκεντρήσεις (1500g, 5 min, 4 C) και αναδιάλυση του πρώτου ιζήματος σε 500 ml στείρου και προψυγμένου ddh 2 Ο, του δεύτερου ιζήματος σε 250 ml στείρου και προψυγμένου ddh 2 Ο, του τρίτου ιζήματος σε 20 ml 1 M προψυγμένου διαλύματος σορβιτόλης και τέλος του τέταρτου ιζήματος σε προψυγμένου διαλύματος 1 ml σορβιτόλης 1 M, οπότε προκύπτει εναιώρημα των κυττάρων τελικού όγκου περίπου 1,5 ml. Το εναιώρημα αυτό χρησιμοποιείται για το μετασχηματισμό κυττάρων εντός 24 ωρών. B. Μετασχηματισμός επιδεκτικών κυττάρων Ρ. pαstoris Ποσότητα 80 μl εναιωρήματος των επιδεκτικών κυττάρων X33 αναμειγνύεται με 5-10 μg γραμμικoύ ανασυνδυασμένου πλασμιδιακού DNA, τα οποία έχουν υποστεί πέψη με ενδονουκλεάση σε μοναδική θέση αναγνώρισης ώστε να προκύψει γραμμικό μόριο (Εικόνα 2.2). Το μείγμα μεταφέρεται σε προψυγμένη κυψελίδα 0,2 cm (ειδική για ηλεκτροδιάτρηση) και επώαση σε 4 C για 5 min. Στη συνέχεια, πραγματοποιείται μετασχηματισμός με ηλεκτροδιάτρηση στη συσκευή Biorad Gene Pulser που έχει ρυθμιστεί σε 25 μf και 1,5 kv ενώ η συσκευή Pulse Controller έχει ρυθμιστεί στα 200 Ohms. Μετά την εφαρμογή ηλεκτρικού παλμού διάρκειας 4,4 4,6 ms, προστίθεται αμέσως 1 ml διαλύματος 1 Μ σορβιτόλης και τα κύτταρα μεταφέρονται σε στείρο σωλήνα 1,5 ml και επωάζονται, χωρίς ανάδευση, στους 30 C για 1h. Μετά το πέρας της επώασης τα κύτταρα επιστρώνονται σε στερεό θρεπτικό υλικό YPD που περιέχει 100 μg/ml ζεοσίνη. Μετά από επώαση στους 30 ο C, για 48-72h αναπτύσσονται αποικίες. 72

73 ΥΛΙΚΑ-ΜΕΘΟΔΟΙ Έκφραση των ανασυνδυασµένων πρωτεϊνών από μετασχηματισμένα κύτταρα P. pastoris (Protein expression) Η έκφραση των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών, τα γονίδια των οποίων έχουν υποκλωνοποιηθεί σε pριcζα πλασμίδια, ώστε η μεταγραφή τους να βρίσκεται υπό τον έλεγχο του υποκινητή του γονιδίου της αλκοολικής οξειδάσης (ΑΟΧ1), επάγεται με την προσθήκη μεθανόλης στην καλλιέργεια. Η μεθανόλη ενεργοποιεί τον υποκινητή ΑΟΧ1 και οι ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες οδηγούνται από το πεπτίδιο οδηγό («παράγοντας α» από S. cerevisiae) προς έκκριση στο θρεπτικό υλικό, από το οποίο συλλέγονται. Ο προκαταρκτικός έλεγχος της έκφρασης πραγματοποιείται σε καλλιέργειες μικρής κλίμακας. Από τον έλεγχο αυτό επιλέγονται οι ισχυροί κλώνοι για έκφραση σε καλλιέργεια μεγάλης κλίμακας. Α. Έκφραση σε καλλιέργειες μικρής κλίμακας (small scale cultures) Μεμονωμένες αποικίες μετασχηματισμένων κυττάρων Χ33 του P.pαstoris που φέρουν το γονίδιο της πρωτεΐνης για ετερόλογη έκφραση, χρησιμοποιούνται για τον εμβολιασμό 5 ml θρεπτικού υλικού BMGY σε στείρους δοκιμαστικούς σωλήνες μιας χρήσης των 50 ml. Οι καλλιέργειες επωάζονται στους 30 C, 16-20h υπό ανάδευση. Έπειτα, το θρεπτικό υλικό απομακρύνεται με φυγοκέvτρηση (2.500 rpm, 10 min, 20 C) και τα κύτταρα επαναδιαλύονται σε 1 ml θρεπτικού υλικού ΒΜΜΥ και κατάλληλη ποσότητα μεταφέρεται σε 5 ml θρεπτικού υλικού ΒΜΜΥ, έτσι ώστε η αρχική O.D. 600 = 1,0, για να ξεκινήσει η επαγωγή της έκφρασης. Πραγματοποιείται επώαση στους 30 C, 48h υπό ανάδευση, με προσθήκη μεθανόλης σε 24 h σε τελική συγκέντρωση 0,5% v/v. Μετά το πέρας της επώασης το υπερκείμενο των καλλιεργειών συλλέγεται με φυγοκέντρηση (6.000 rpm, 30 min, 4 C) και πραγματοποιείται έλεγχος της έκφρασης της πρωτεΐνης με ανοσοαποτύπωση σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης υπό μη αποδιατακτικές συνθήκες (dot-blot, ), χρησιμοποιώντας κατάλληλα αντισώματα. H επιλογή των κλώνων (screening of clones) για έκφραση σε μεγαλύτερη κλίμακα στηρίζεται στην ένταση του σήματος ανοσοαποτύπωσης. 73

74 ΥΛΙΚΑ-ΜΕΘΟΔΟΙ Β. Έκφραση σε καλλιέργειες μεγάλης κλίμακας (large scale cultures) 5 ml θρεπτικού υλικού BMGY εμβολιάζονται με μεμονωμένες αποικίες μετασχηματισμένων κλώνων Χ33 και επωάζονται στους 30 C, 16h υπό ανάδευση. Ακολουθεί εμβολιασμός 0,5 ml της παραπάνω καλλιέργειας σε 500 ml BMGY και επώαση στους 30 C, 280 rpm. Όταν O.D. 600 = 4,0 οι καλλιέργειες φυγοκεντρούνται (2.500 rpm, 10 min, 20 C) και τα κύτταρα αναδιαλύονται σε 4 x 500 ml (2 L) ΒΜΜΥ, ώστε αρχική O.D. 600 = 1,0 για να ξεκινήσει η επαγωγή της έκφρασης, η οποία διαρκεί 48h, με την προσθήκη 0,5 % v/v μεθανόλης 24h μετά.. Στην παρούσα εργασία χρησιμοποιήθηκαν κωνικές φιάλες χωρητικότητας 2L και πώματα από διπλή γάζα για καλλιέργειες των 500 ml διότι για την ανάπτυξη των κυττάρων του ζυμομύκητα P. pastoris απαιτείται καλός αερισμός της καλλιέργειας. Μετά το πέρας της επαγωγής της έκφρασης έγινε συλλογή του υπερκειμένου της καλλιέργειας, μέσα στο οποίο περιέχονται οι εκκρινόμενες πρωτεΐνες, με φυγοκέντρηση (5.000 rpm, 15 min, 4 C) Απομόνωση των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών από υπερκείµενο καλλιέργειας P. pastoris (Protein isolation) Μετά τη συλλογή του υπερκειμένου των καλλιεργειών των μετασχηματισμένων κυττάρων X33 προστίθενται νατραζίδιο (ΝαΝ 3 ) και φαινυλμεθυλ-σουλφονυλ-φθορίδιο (PMSF) σε τελικές συγκεντρώσεις 0,05 % w/v και 0,1 mm αντίστοιχα. Ακολουθεί η απομόνωση των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών, με μία διαδικασία, η οποία χωρίζεται στα ακόλουθα δύο διακριτά στάδια: Α. Μικροδιήθηση (Microfiltration) Το συλλεγμένο υπερκείμενο της καλλιέργειας μετασχηματισμένων κυττάρων ζύμης X33 μεταφέρεται σε μεταλλικό αποστειρωμένο καζάνι, το οποίο κλείνει ερμητικά. Γίνεται σύνδεση του καζανιού αυτού με φιάλη παροχής αέριου αζώτου, υπό πίεση, μέσω ενός λάστιχου (με εσωτερικό πόρο κατάλληλης διατομής), το οποίο εφαρμόζει σε ειδική οπή του άνωθεν μέρους του μεταλλικού καζανιού. Από μία άλλη αντιδιαμετρική οπή γίνεται σύνδεση, επίσης μέσω λάστιχου, με το άνωθεν τμήμα 74

75 ΥΛΙΚΑ-ΜΕΘΟΔΟΙ μίας μεταλλικής συσκευής μικροδιήθησης (Millipore), μέσα στην οποία έχουν τοποθετηθεί, σε οριζόντια διάταξη και από πάνω προς τα κάτω, διηθητικό χαρτί Watmann 3 ΜΜ, γάζα, φίλτρο με διάμετρο πόρου 0,45 μm, γάζα και φίλτρο με διάμετρο πόρου 0,2 μm. Σε μία οπή στο κάτω μέρος της συσκευής αυτής συνδέεται επίσης ένα λάστιχο, το οποίο καταλήγει σε μία μεγάλη κωνική φιάλη (10 L), προκειμένου να γίνει η συλλογή του φιλτραρισμένου πλέον υπερκειμένου των καλλιεργειών (μέσα στο οποίο βρίσκονται οι εκκρινόμενες ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες), έπειτα από την διοχέτευση αέριου N 2 υπό πίεση ~1 Atm στο αρχικό τμήμα συνδεσμολογίας του συστήματος. Β. Υπερδιήθηση (Ultrafiltration) Μετά το φιλτράρισμα του υπερκειμένου των καλλιεργειών, ακολουθεί η συμπύκνωσή του μέσω συσκευής εφαπτόμενης συνεχούς ροής της Millipore, στο εσωτερικό της οποίας υπάρχει μεμβράνη με συγκεκριμένη διάμετρο, ώστε να αποκλείεται η διέλευση μορίων μεγέθους > 10 kda. Η ροή του προς συμπύκνωση,πρωτεϊνικού διαλύματος εφάπτεται στην ειδική αυτή μεμβράνη, ενώ η συνεχής ροή εξασφαλίζεται μέσω περισταλτικής αντλίας. Η μεμβράνη συγκρατεί μόρια μεγαλύτερα από τη διάμετρο των πόρων της, ενώ τα μικρότερα μόρια διαφεύγουν της μεμβράνης μαζί με το διάλυμα. Διατηρώντας σταθερή ογκομετρική ροή εξόδου ~35 ml/min, επιτυγχάνεται η συμπύκνωση του πρωτεϊνικού διαλύματος όγκου 1L σε τελικό όγκο ~100 ml σε διάρκεια 25 min. Πριν τη χρήση της, η συσκευή ξεπλένεται με 2L ddh 2 Ο χωρίς ανακύκλωση, ώστε να απομακρυνθεί το διάλυμα 0,5 M NaOH αποθήκευσης της συσκευής. Στη συνέχεια, πραγματοποιείται η ροή του πρωτεϊνικού διαλύματος διαμέσου της συσκευής υπερδιήθησης με ανακύκλωση, μέσω περισταλτικής αντλίας ρυθμιζόμενης ογκομετρικής παροχής. Στο τέλος της διαδικασίας συμπύκνωσης του αρχικού διαλύματος, πραγματοποιείται διαπίδυση έναντι 2L ρυθμιστικού διαλύματος 50 mm HEPES, 300 mm NaCl, 0,1% glycerol, pη 8,0 για κάθε 1L αρχικού υπερκειμένου και εκ νέου συμπύκνωση. Ακολουθεί έκπλυση της συσκευής πρώτα με 2L ddh 2 0 και στη συνέχεια με 2L 0,5 Μ NaOH και αποθήκευσή της μέχρι την επόμενη χρήση στους 4 C. 75

76 ΥΛΙΚΑ-ΜΕΘΟΔΟΙ Έκφραση πρωτεϊνών στη κυτταρική σειρά COS-7 Για τα πειράματα έκφρασης χρησιμοποιήθηκε η κυτταρική σειρά COS-7. Τα COS-7 κύτταρα είναι επιθηλιακά κύτταρα νεφρού αφρικανικού πράσινου πιθήκου (Cercopithecus aethiops). Στη καλλιέργεια, τα COS-7 κύτταρα εμφανίζονται να προσκολλούνται κατά την ανάπτυξή τους σε γυάλινες ή πλαστικές επιφάνειες. Τα κύτταρα αναπτύσσονται σε πλήρες θρεπτικό υλικό DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium, Invitrogen) υψηλής γλυκόζης (4,5g/l D-Glucose) εμπλουτισμένο με 10% v/v ορό FBS (Invitrogen) παρουσία αντιβιοτικών 1% v/v στρεπτομυκίνη και πενικιλίνη (Invitrogen) (πλήρες θρεπτικό υλικό) σε 100 mm τρυβλία κυτταροκαλλιεργειών (Corning). Όταν τα κύτταρα καλύπτουν το % της επιφάνειας του τρυβλίου (2-3 ημέρες στους 37 o C και ατμόσφαιρα 5% CO 2 ), γίνεται αποκόλλησή τους και επίστρωση σε νέο πιάτο χρησιμοποιώντας διάλυμα τρυψίνης/edta, με αραίωση 1:4 έως 1:8 και αντίστοιχη αύξηση του αριθμού της γενιάς τους (p). Όλη η διαδικασία της καλλιέργειας των κυττάρων πραγματοποιείται σε άσηπτες συνθήκες μέσα σε θάλαμο νηματικής ροής Παροδική επιμόλυνση COS-7 κυττάρων για έκφραση πρωτεϊνών Την προηγούμενη μέρα της επιμόλυνσης και αφού τα κύτταρα έχουν αναπτυχθεί πλήρως σε τρυβλίο καλλιέργειας 100 mm (7,5*10 6 ), μεταφέρονται σε νέο τρυβλίο καλλιέργειας 6 θέσεων (Corning) με αραίωση 1:8 χρησιμοποιώντας το πλήρες θρεπτικό υλικό. Την επόμενη μέρα, στα κύτταρα τα οποία θα επιμολυνθούν αφαιρείται το προηγούμενο θρεπτικό υλικό και προστίθεται DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium, Invitrogen) εμπλουτισμένο με 10% v/v ορό FBS (Invitrogen) αλλά χωρίς αντιβιοτικό. Αρχικά αναμειγνύονται 4 μg του φορέα έκφρασης που φέρει το γονίδιοστόχος για κάθε μία θέση της πλάκας καλλιέργειας που θα χρησιμοποιηθεί για την επιμόλυνση και 250 μl Optimem (Invitrogen) για κάθε θέση, αντίστοιχα, και επωάζονται για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά το πέρας της επώασης προστίθενται 15 μl λιποφεκταμίνης (Invitrogen) και 250 μl optimem για κάθε θέση 76

77 ΥΛΙΚΑ-ΜΕΘΟΔΟΙ και όλο το μείγμα επωάζεται για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τελικά, σε κάθε μία θέση της πλάκας καλλιέργειας προστίθεται 500 μl από το μείγμα. Σχεδόν 6 ώρες μετά την επιμόλυνση πραγματοποιείται αλλαγή του θρεπτικού υλικού με πλήρες θρεπτικό υλικό. 24 ώρες μετά την επιμόλυνση, το θρεπτικό υλικό που υπάρχει στα κύτταρα αφαιρείται και προστίθεται DMEM (Invitrogen) με 1% v/v στρεπτομυκίνη και πενικιλίνη (Invitrogen) αλλά χωρίς καθόλου ορό. Μετά από άλλες 24 ώρες, το υπερκείμενο συλλέγεται, φυγοκεντρείται σε 1000 rpm για 5 min στους 4 ο C και φιλτράρεται με φίλτρο 0,22 μm (Millipore, ΗΠΑ). Στη συνέχεια, με τη χρήση φίλτρων υπερδιήθησης Amicon με διάμετρο πόρων 10 kda (Millipore, ΗΠΑ) και διαδοχικές φυγοκεντρήσεις σε επιτραπέζια φυγόκεντρο (2.500 rpm, 10 min, 4ºC) πραγματοποιήθηκε συμπύκνωση του υπερκειμένου περίπου στο 1/6 του αρχικού όγκου και σύγχρονη αντικατάσταση του υλικού καλλιέργειας με 50 mm HEPES, 300 mm NaCl, 0,1% glycerol, pη 8,0. Στη συνέχεια, γίνεται προσθήκη της κατάλληλης ποσότητας ενεργοποιημένων σφαιριδίων Νi-ΝΤΑ-αγαρόζης ( ) μέσα σε πλαστικό σωλήνα 1,5 ml, στον οποίο βρίσκεται ήδη τοποθετημένο το διάλυμα του υπερκειμένου της καλλιέργειας (0,5 ml καθαρών σφαιριδίων / 4 ml αρχικής καλλιέργειας) και ακολουθεί επώαση υπό ήπια ανάδευση για 2h στους 4ºC προκειμένου να επιτευχθεί η πρόσδεση των πρωτεϊνών στα σφαιρίδια Νi-ΝΤΑαγαρόζης. Μετά το πέρας της επώασης, το διάλυμα φυγοκεντρείται σε rpm για 5 min στους 4 ºC. Το υπερκείμενο απομακρύνεται, ενώ το ίζημα αναδιαλύεται σε 20 πλάσιο όγκο διαλύματος πλύσης (50 mm HEPES, 300 mm NaCl, 0,1% glycerol, pη 8,0 20 mμ ιμιδαζόλιο). Στη συνέχεια, προστίθεται επίσης, 20 πλάσιος όγκος διαλύματος με 50 mm HEPES, 300 mm NaCl, 0,1% glycerol, pη 8,0 και 50 mμ ιμιδαζόλιο και το υπερκείμενο συλλέγεται. Ακολουθεί προσθήκη 4 πλάσιου όγκου 50 mm HEPES, 300 mm NaCl, 0,1% glycerol, pη 8,0 με 150 mμ ιμιδαζόλιο και το υπερκείμενο συλλέγεται. Ομοίως, χρησιμοποιείται διάλυμα με 250 mμ ιμιδαζόλιο και τελικά με 1Μ ιμιδαζόλιο. Όλα τα βήματα πλύσεων και έκλουσης πραγματοποιούνται με φυγοκντρήσεις σε rpm για 5 min στους 4 ºC. Η παρουσία πρωτεϊνικών μορίων στα διαλύματα έκλουσης πιστοποιείται με τη μέθοδο της ανοσοαποτύπωσης (dot blot, ). 77

78 ΥΛΙΚΑ-ΜΕΘΟΔΟΙ Σταθερή έκφραση πρωτεϊνών στη κυτταρική σειρά COS-7 Με σκοπό τη δημιουργία μίας σταθερής κυτταρικής σειράς η οποία παράγει συνεχώς την επιθυμητή πρωτεΐνη, η επιμόλυνση των κυττάρων πραγματοποιείται όπως αναγράφεται στην προηγούμενη παράγραφο ( ) αλλά στις 48 h μετά την επιμόλυνση το υπερκείμενο απομακρύνεται και προστίθεται πλήρες θρεπτικό υλικό εμπλουτισμένο με 0,5 ml/50 ml αντιβιοτικού γενετισίνης (G418, Invitrogen). Για σχεδόν 1 μήνα πραγματοποιούνται αλλαγές του θρεπτικού υλικού έως την εμφάνιση κλώνων στις θέσεις της πλάκας κυτταροκαλλιέργειας. Ακολουθεί επιλογή των κλώνων και καλλιέργεια τους σε 100 mm τρυβλία καλλιέργειας για άλλες 10 ημέρες. Πραγματοποιείται έλεγχος της έκφρασης της πρωτεΐνης μετά από 2,3,5,7,9,11,13,15 και 17 ημέρες καλλιέργειας με πλήρες θρεπτικό υλικό εμπλουτισμένο με 0,5 ml/50 ml γενετισίνη (G418, Invitrogen) με τη μέθοδο της ανοσοαποτύπωσης (dot blot, ) Έκφραση πρωτεϊνών στη κυτταρική σειρά HEK293 Τα HEK293 είναι εμβρυονικά κύτταρα προερχόμενα από ανθρώπινο νεφρό. Τα κύτταρα αναπτύσσονται σε θρεπτικό υλικό DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium, Invitrogen) υψηλής γλυκόζης (4,5g/L D-Glucose) εμπλουτισμένο με 10% v/v ορό FBS (Invitrogen) παρουσία αντιβιοτικών 1% v/v στρεπτομυκίνη και πενικιλίνη (Invitrogen) (πλήρες θρεπτικό υλικό) σε 100 mm τρυβλία κυτταροκαλλιεργειών (Corning). Όταν τα καλύπτουν το % της επιφάνειας των πιάτων (2-3 ημέρες στους 37oC και ατμόσφαιρα 5% CO2), γίνεται αποκόλλησή τους με αραίωση 1:10 και αντίστοιχη αύξηση του αριθμού της γενιάς τους (p). Με αυτόν τον τρόπο τα κύτταρα συντηρούνται μέχρι την p16, οπότε γίνεται έναρξη νέας καλλιέργειας από κύτταρα χαμηλής γενιάς που φυλάσσονται υπό κρυογονικές συνθήκες. Όλη η διαδικασία της καλλιέργειας των κυττάρων πραγματοποιείται σε άσηπτες συνθήκες μέσα σε θάλαμο νηματικής ροής. 78

79 ΥΛΙΚΑ-ΜΕΘΟΔΟΙ Παροδική επιμόλυνση ΗΕΚ293 κυττάρων για την έκφραση της fmusk- ECD Την προηγούμενη μέρα της επιμόλυνσης και αφού τα κύτταρα έχουν αναπτυχθεί πλήρως σε τρυβλία καλλιέργειας 100 mm (7,5*10 6 ), μεταφέρονται σε νέα τρυβλία καλλιέργειας 100 mm (Corning) με αραίωση 1:5 χρησιμοποιώντας το πλήρες θρεπτικό υλικό. Την επόμενη μέρα, στα κύτταρα τα οποία θα επιμολυνθούν αφαιρείται το προηγούμενο θρεπτικό υλικό και προστίθεται DMEM (Invitrogen) εμπλουτισμένο με 10% v/v ορό FBS (Fetal bovine serum, Invitrogen) αλλά χωρίς αντιβιοτικό. Αρχικά, αναμειγνύονται 24 μg πλασμιδιακού φορέα που φέρει το γονίδιο στόχος με 1,5 ml Optimem (Invitrogen) για κάθε ένα τρυβλίο καλλιέργειας 100 mm (Corning) και επωάζονται για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά το πέρας της επώασης προστίθενται 60 μl λιποφεκταμίνης (Invitrogen) και 1,5 ml optimem (Invitrogen) για κάθε τρυβλίο και όλο το μείγμα επωάζεται για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τελικά, σε κάθε τρυβλίο καλλιέργειας 100 mm (Corning) προστίθενται 3 ml από το μείγμα. Σχεδόν 5 ώρες μετά την επιμόλυνση πραγματοποιείται αλλαγή του θρεπτικού υλικού με DMEM (Invitrogen) εμπλουτισμένο με 10% v/v ορό FBS (Invitrogen) αλλά χωρίς αντιβιοτικό. Τα κύτταρα επωάζονται για 48 ώρες στους 37 ο C ή στους 30 ο C για την έκφραση της πρωτεΐνης. Μετά από 48 ώρες, το υπερκείμενο συλλέγεται, φυγοκεντρείται σε 3000 rpm για 10 min στους 4 ο C και φιλτράρεται με φίλτρο με διάμετρο πόρου 0,22 μm (Millipore, ΗΠΑ). Η παρουσία πρωτεΐνης στο υπερκείμενο της καλλιέργειας πιστοποιείται με τη μέθοδο της ανοσοαποτύπωσης (dot blot, ). Στη συνέχεια, πραγματοποιείται ρύθμιση του ph του διαλύματος που περιέχει την πρωτεΐνη σε ph 8 και τελικά προστέθηκαν 200 μl ενεργοποιημένων σφαιριδίων Ni-ΝΤΑ-αγαρόζης για το υπερκείμενο που αντιστοιχεί σε ένα πιάτο καλλιέργειας 100 mm (Corning) και ακολουθεί επώαση υπό ήπια ανάδευση για 16 h στους 4ºC προκειμένου να επιτευχθεί η πρόσδεση των πρωτεϊνών στα σφαιρίδια Ni- ΝΤΑ αγαρόζης. Η παρουσία πρωτεΐνης στα διαλύματα έκλουσης, η οποία πραγματοποιήθηκε όπως στη παράγραφο , πιστοποιείται με τη μέθοδο της ανοσοαποτύπωσης (dot blot, ). 79

80 ΥΛΙΚΑ-ΜΕΘΟΔΟΙ Καθαρισµός ανασυνδυασµένων πρωτεϊνών (Protein purification) Καθαρισμός πρωτεϊνών με υγρή χρωματογραφία συγγένειας (Affinity chromatography) από στήλη Ni-ΝΤΑ αγαρόζης Το πρώτο στάδιο καθαρισμού των πρωτεϊνών βασίζεται στην ύπαρξη έξι συνεχόμενων καταλοίπων ιστιδίνης (6xHis-tag) στο άμινο- ή στο καρβοξυ-τελικό άκρο τους. Σε αλκαλικό περιβάλλον, οι πρωτεΐνες αυτές προσδένονται με υψηλή συγγένεια σε στήλη ρητίνης συζευγμένης με ιόντα νικελίου (Ni2+), λόγω των αρνητικά φορτισμένων δακτυλίων ιμιδαζολίου των ιστιδινών (Hochuli et al., 1987). Η έκλουση των προσδεδεμένων στη στήλη Ni-NTA, πρωτεϊνών, πραγματοποιείται με χρήση αυξανόμενων συγκεντρώσεων ιμιδαζολίου, το οποίο ανταγωνίζεται τα ιμιδαζόλια των ιστιδινών της πρωτεΐνης για πρόσδεση στα ιόντα Ni2+ της στήλης. Η πορεία που ακολουθείται για αυτό το πρώτο στάδιο καθαρισμού των πρωτεϊνών είναι η ακόλουθη: Κατάλληλος όγκος εναιωρήματος που περιέχει 50% v/v σφαιρίδια Νi-ΝΤΑαγαρόζης (Qiagen),τοποθετείται μέσα σε πλαστικούς δοκιμαστικούς σωλήνες 50 ml (Corning) με αναλογία 1 ml σφαιριδίων καθαρών Νi-ΝΤΑ-αγαρόζης / L αρχικής καλλιέργειας και φυγοκεντρείται σε επιτραπέζια φυγόκεντρο Rotina (1000 rpm, 5 min, 4οC). Ακολουθεί προσεκτική απομάκρυνση του υπερκείμενου και εξισορρόπηση των σφαιριδίων Νi-ΝΤΑ-αγαρόζης με 50 mm HEPES, 300 mm NaCl, 0,1% glycerol, pη 8,0, υπό ήπια ανάδευση. Ακολουθούν δυο πλύσεις των σφαιριδίων με το παραπάνω διάλυμα με φυγοκέντρηση στις ίδιες συνθήκες. Μετά την τελευταία φυγοκέντρηση γίνεται αναδιάλυση του ιζήματος σε κατάλληλο όγκο 50 mm HEPES, 300 mm NaCl, 0,1% glycerol, pη 8,0. Στη συνέχεια γίνεται προσθήκη της κατάλληλης ποσότητας αναδιαλυμένων σφαιριδίων Νi-ΝΤΑ-αγαρόζης μέσα σε πλαστικό σωλήνα 250 ml, στον οποίο βρίσκεται ήδη τοποθετημένο το διάλυμα του υπερκειμένου των καλλιεργειών και ακολουθεί επώαση υπό ήπια ανάδευση σε 4 ºC κατά τη διάρκεια της νύκτας, προκειμένου να επιτευχθεί η πρόσδεση των πρωτεϊνών στα σφαιρίδια Νi-ΝΤΑ-αγαρόζης. Για να αποφευγφθεί η με ειδική δέσμευση άλλων συστατικών εκτός της επιθυμητής πρωτεϊνης στα σφαιρίδια αγαρόζης, προστίθεται ιμιδαζόλιο σε τελική συγκέντρωση 10 mm κατά τη διάρκεια της επώασης. Την επομένη το διάλυμα φυγοκεντρείται σε επιτραπέζια φυγόκεντρο Juan (2.500 rpm, 5 min, 4 ºC). Το υπερκείμενο απομακρύνεται, ενώ το ίζημα αναδιαλύεται 80

81 ΥΛΙΚΑ-ΜΕΘΟΔΟΙ σε 10-πλάσιο όγκο διαλύματος πλύσης (50 mm HEPES, 300 mm NaCl, 0,1% glycerol, pη 8,0, 20 mμ ιμιδαζόλιο). Ακολουθεί η απόχυση του αναδιαλυμένου αυτού διαλύματος σφαιριδίων Νi-ΝΤΑ-αγαρόζης με τα προσδεμένα πλέον μόρια πρωτεΐνης σε υάλινη στήλη χρωματογραφίας. Με τη χρήση του διαλύματος πλύσης αφ ενός απομακρύνονται οι ασθενώς μη ειδικά προσδεδεμένες προσμίξεις και αφ ετέρου επιτυγχάνεται το πακετάρισμα της στήλης των σφαιριδίων. Ακολουθεί μία επιπλέον πλύση με τη χρήση τεσσάρων όγκων στήλης με διάλυμα 50 mm HEPES, 300 mm NaCl, 0,1% glycerol, pη 8,0, 30 mμ ιμιδαζόλιο και στη συνέχεια οι πρωτεΐνες εκλούονται σε τέσσερις όγκους στήλης διαλύματος έκλουσης 50 mm HEPES, 300 mm NaCl, 0,1% glycerol, pη 8,0, 150 mμ ιμιδαζόλιο. Η έκλουση τελειώνει με τη χρήση τεσσάρων όγκων στήλης διαλύματος 50 mm HEPES, 300 mm NaCl, 0,1% glycerol, pη 8,0, 1 Μ ιμιδαζόλιο για την απομάκρυνση πρωτεϊνικών μορίων τα οποία είναι προσδεδεμένα εξαιρετικά ισχυρά. Η πρωτεϊνών στα διαλύματα έκλουσης πιστοποιείται με SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών ( ) και τελικά προσδιορίζεται η συγκέντρωση της απομονωμένης πρωτεΐνης ( ) Καθαρισμός πρωτεϊνών με υγρή χρωµατογραφία µοριακής διήθησης (Size exclusion chromatography) Το δεύτερο στάδιο καθαρισμού των πρωτεϊνικών μορίων πραγματοποιείται με χρωματογραφία μοριακής διήθησης σε σύστημα υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης (FPLC). Το διαφορετικό μέγεθος και το σχήμα των πρωτεϊνών σε σχέση με άλλα μόρια-προσμίξεις τα οποία βρίσκονται στα διαλύματα έκλουσης από τη στήλη Νi-ΝΤΑ-αγαρόζης οδηγούν στη διαφορετική διέλευση τους από υλικό με συγκεκριμένη διάμετρο πόρων. Μόρια με μέγεθος μεγαλύτερο από τη διάμετρο των πόρων δεν διέρχονται από το υλικό πλήρωσης της στήλης και εκλούονται πρώτα. Μόρια με μικρότερα μεγέθη, καθυστερούν περισσότερο μέσα στο υλικό πλήρωσης και εκλούονται αργότερα. Η στήλη μοριακού αποκλεισμού που χρησιμοποιήθηκε για τη συγκεκριμένη διαδικασία ήταν η Superose 12 (Amersham Biosciences), με διάμετρο πόρων 12 μm και με διαχωριστική ικανότητα μορίων με μοριακό μέγεθος kda. Η διαδικασία που ακολουθήθηκε ήταν η εξής: Τα εκλούσματα της στήλης Νi- ΝΤΑ-αγαρόζης, τα οποία περιέχουν την πρωτεΐνη, ενώθηκαν και συμπυκνώθηκαν σε 81

82 ΥΛΙΚΑ-ΜΕΘΟΔΟΙ τελικό όγκο 0,5 ml με τη χρήση φίλτρων υπερδιήθησης Amicon με διάμετρο πόρων 10 kda (Millipore, ΗΠΑ) με διαδοχικές φυγοκεντρήσεις σε επιτραπέζια φυγόκετρο (2.500 rpm, 10 min, 4 ºC). Μετά το φιλτράρισμα του δείγματος μέσω φίλτρου διαμέτρου πόρων 0,2 μm (Millipore, ΗΠΑ) ακολούθησε η εισαγωγή του με κατάλληλη σύριγγα στο σύστημα, το οποίο είχε ήδη εξισορροπηθεί με το διάλυμα 50 mm HEPES, 300 mm NaCl, 0,1% glycerol, pη 8,0 (φιλτραρισμένο μέσω φίλτρων 0,2 μm και απαερωμένο με χρήση λουτρού υπερήχων). Ακολούθησε χρωματογραφία μοριακής διήθησης με σταθερή ροή διαλύματος χρωματογραφίας μοριακού αποκλεισμού ίση με 0,5 ml/min και συλλογή κλασμάτων όγκου 0,5 ml έκαστο. Η ανίχνευση της εκλουόμενης πρωτεΐνης από τα διάφορα κλάσματα της στήλης πραγματοποιήθηκε με την ανοσοενζυμική μέθοδο ανίχνευσης κατά Western ( ) ενώ ο καθαρισμός της επιβεβαιώθηκε με SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση ( ) ακολουθούμενη από Coomassie Brilliant Blue χρώση ( ). Η συγκέντρωση πρωτεΐνης καθορίστηκε με τη δοκιμασία Bradford (Bio-Rad, ) Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών υπό αποδιατακτικές συνθήκες (SDS-PAGE electrophoresis Με ηλεκτροφόρηση σε κάθετο πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου, παρουσία θειικού δωδεκυλικού νατρίου (SDS) επιτυγχάνεται ο διαχωρισμός και η ταυτοποίηση των πρωτεϊνών με βάση το μοριακό τους βάρος (Laemmli 1970). Μετά απο έκθεση σε αρνητικά φορτισμένο απορρυπαντικό SDS οι πρωτεΐνες αποκτούν αρνητικό φορτίο (σε κάθε αμινοξύ μιας πρωτεΐνης δεσμεύεται περίπου ένα μόριο SDS) και μετακινούνται προς το θετικό πόλο με ταχύτητα αντιστρόφως ανάλογη προς το μέγεθός τους. Κατά τη μέθοδο της κάθετης ηλεκτροφόρησης, οι πρωτεΐνες τοποθετούνται αρχικά σε πήκτωμα χαμηλής περιεκτικότητας σε ακρυλαμίδιο (πήκτωμα συμπύκνωσης), ενώ ο διαχωρισμός πραγματοποιείται, αφού οι πρωτεΐνες περάσουν σε πήκτωμα υψηλής περιεκτικότητας σε ακρυλαμίδιο (πήκτωμα διαχωρισμού). 82

83 ΥΛΙΚΑ-ΜΕΘΟΔΟΙ Α. Παρασκευή πηκτώματος πολυακρυλαμιδίου Το πήκτωμα συμπύκνωσης (stacking gel) περιέχει Μ Tris-HCl, pη 6.8, 0,1% w/v SDS και 4% w/v ακρυλαμίδιο. Το πήκτωμα διαχωρισμού (separating gel), περιέχει 0,375 Μ Tris-HCl, pη 8,8, 0,1% w/v SDS και 10% w/v ακρυλαμίδιο. Ο πολυμερισμός των πηκτωμάτων πραγματοποιείται με προσθήκη 1% w/v APS και 0,04% w/v TEMED ως καταλύτη πολυμερισμού του ακρυλαμιδίου. Β. Προετοιμασία δειγμάτων για ηλεκτροφόρηση Τα προς ηλεκτροφόρηση δείγματα αναμειγνύονται με διάλυμα "φόρτωσης" πρωτεϊνών ( ), το οποίο περιέχει SDS και β-μερκαπτοαιθανόλη και επωάζονται για 7 min στους 97 C. Ο βρασμός παρουσία SDS έχει ως αποτέλεσμα τη διάσπαση δεσμών (υδρογόνου, ιοντικών, υδρόφοβων και Van der Waals αλληλεπιδράσεων), ενώ η β-μερκαπτοαιθανόλη προκαλεί αναγωγή των ομοιοπολικών δισουλφιδικών δεσμών. Έτσι, οι πρωτεΐνες αποδιατάσσονται. Παράλληλα με τα προς εξέταση δείγματα, γίνεται ανάλυση μείγματος πρωτεϊνών γνωστού μοριακού βάρους, που χρησιμοποιούνται ως μάρτυρες μοριακών μεγεθών. Γ. Ηλεκτροφόρηση και ανίχνευση των ζωνών Η ηλεκτροφόρηση πραγματοποιείται υπό σταθερή τάση 120 Volts, σε ρυθμιστικό διάλυμα ηλεκτροφόρησης πρωτεϊνών, το οποίο περιέχει 0,1% w/v SDS. Οι ζώνες των πρωτεϊνών εμφανίζονται μετά από χρώση του πηκτώματος σε διάλυμα χρωματισμού το οποίο περιέχει τη χρωστική Coomassie R-250, με ήπια ανάδευση για 30 min στους 37oC και μετέπειτα αποχρωματισμό με συνεχείς πλύσεις σε διάλυμα αποχρωματισμού και σε θερμοκρασία δωματίου, έως ότου απομακρυνθεί η περίσσεια χρωστικής Ανοσοαποτύπωση πρωτεϊνών (Western blotting) Οι πρωτεΐνες, μετά από το διαχωρισμό τους σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου, μεταφέρονται σε σταθερό μεμβρανικό υπόστρωμα νιτροκυτταρίνης με εφαρμογή ηλεκτρικού πεδίου κάθετα προς τις δύο επιφάνειες. Οι πρωτεΐνες που έχουν 83

84 ΥΛΙΚΑ-ΜΕΘΟΔΟΙ μεταναστεύσει στη μεμβράνη νιτροκυτταρίνης ανιχνεύονται με προσθήκη αντισώματος, το οποίο δεσμεύεται ειδικά σε αυτές (Burnette 1981). Έπειτα, το προκύπτον σύμπλοκο αντιγόνου-αντισώματος ανιχνεύεται με προσθήκη ενός δεύτερου αντισώματος, ειδικού για το πρώτο, που φέρει ένα ομοιοπολικά συζευγμένο ένζυμο. Μετά την προσθήκη κατάλληλου υποστρώματος, το ένζυμο καταλύει μια αντίδραση, που δίνει έγχρωμο προϊόν, με αποτέλεσμα να γίνεται ορατή η ζώνη της πρωτεΐνης, στο σημείο όπου αυτή έχει μετακινηθεί κατά την ηλεκτροφόρηση. Η τεχνική αυτή χρησιμοποιείται για την ανίχνευση ακόμα και ίχνους μίας πρωτεΐνης σε ένα πρωτεϊνικό μείγμα (της τάξης των ng), καθώς και για τον προσδιορισμό της ταυτότητας ή του μεγέθους μιας πρωτεΐνης. Η πορεία αυτής της μεθόδου είναι η ακόλουθη: Α. Μεταφορά των πρωτεϊνών Για τη μεταφορά των πρωτεϊνών από το πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου στη μεμβράνη νιτροκυτταρίνης, χρησιμοποιείται κατάλληλο ρυθμιστικό διάλυμα ηλεκτρομεταφοράς (transfer buffer) με ph 8,5 ( 2.1.7). Σε pη 8,5, οι πρωτεΐνες αποκτούν αρνητικό φορτίο και μετακινούνται μέσα στο ηλεκτρικό πεδίο προς το θετικό πόλο. Αρχικά, κόβονται ένα κομμάτι μεμβράνης νιτροκυτταρίνης (Hybond-P, Amersham) και δύο κομμάτια απορροφητικού χαρτιού Whatman 3 ΜΜ σε μέγεθος λίγο μεγαλύτερο από αυτό του πηκτώματος και μαζί με το πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου και δύο σφουγγαράκια προκαθορισμένου και ίδιου μεγέθους, τα οποία συνοδεύουν τη συσκευή ηλεκτρομεταφοράς εμβαπτίζονται στο διάλυμα ηλεκτρομεταφοράς. Στη συνέχεια, στην πλευρά της συσκευής (μαύρου χρώματος) όπου θα εφαρμοστεί ο αρνητικός πόλος του τροφοδοτικού, τοποθετούνται κατά σειρά: ένα σφουγγαράκι, ένα απορροφητικό χαρτί Whatmann 3 ΜΜ, το πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου, η νιτροκυτταρίνη, ένα απορροφητικό χαρτί Whatmann 3 ΜΜ, ένα σφουγγαράκι, η αναδιπλούμενη πλευρά της συσκευής (κόκκινου χρώματος) και τέλος, ένα κομμάτι πάγου στο εξωτερικό μέρος της κόκκινης πλευράς της συσκευής, στην οποία θα εφαρμοσθεί ο θετικός πόλος του τροφοδοτικού. Η τοποθέτηση γίνεται προσεκτικά, ώστε να αποφευχθεί ο εγκλωβισμός φυσαλίδων αέρα, που δύναται να εμποδίσουν τη μεταφορά. Η μεταφορά των πρωτεϊνών πραγματοποιείται με διαβίβαση ρεύματος σταθερής έντασης 300 ma, 4 C για συνήθως 1h. Η διάρκεια της ηλεκτρομεταφοράς καθορίζεται από το μέγεθος των πρωτεϊνών. Πρωτεΐνες με μάζα 84

85 ΥΛΙΚΑ-ΜΕΘΟΔΟΙ ~30 kda, χρειάζονται περίπου 1 h για τη μεταφορά τους από το πήκτωμα στη νιτροκυτταρίνη. Εάν χρησιμοποιούνται έγχρωμοι μάρτυρες μοριακών βαρών, η επιτυχής μεταφορά των πρωτεϊνών μπορεί να ελεγχθεί άμεσα από την παρουσία των μαρτύρων στη μεμβράνη νιτροκυτταρίνης. Β. Ανοσοενζυμική ανίχνευση των πρωτεϊνών Όταν ολοκληρωθεί η ηλεκτρομεταφορά, ακολουθεί επώαση της μεμβράνης νιτροκυτταρίνης σε διάλυμα PBS με 5% w/v λυοφιλιωμένου γάλακτος, υπό ανάδευση σε θερμοκρασία δωματίου για 45 min. Με τη διαδικασία αυτή γίνεται δέσμευση των ελεύθερων θέσεων της μεμβράνης νιτροκυτταρίνης από τις πρωτεΐνες του γάλακτος, έτσι ώστε να παρεμποδιστεί η επακόλουθη μη ειδική πρόσδεση των χρησιμοποιούμενων αντισωμάτων στις θέσεις αυτές. Ακολουθεί επώαση υπό ανάδευση της μεμβράνης με το πρώτο αντίσωμα, το οποίο είναι κατάλληλα αραιωμένο σε διάλυμα PBS σε θερμοκρασία δωματίου για 2 h ή σε 4 ºC κατά τη διάρκεια της νύκτας. Ως πρώτο αντίσωμα χρησιμοποιείται το αντι-myc. Μετά την επώαση πραγματοποιούνται τρεις διαδοχικές πλύσεις με PBS, διάρκειας 10 min έκαστη. Ακολουθεί επώαση της μεμβράνης για 2 h, σε θερμοκρασία δωματίου και υπό ανάδευση με το δεύτερο αντίσωμα αντι-mοuse IgG-HRP (συζευγμένο με υπεροξειδάση της ραπανίδος (HRP) αραιωμένο 1:2.000 σε PBS. Στη συνέχεια, πραγματοποιούνται τρεις διαδοχικές πλύσεις με PBS, διάρκειας 10 min έκαστη. Ακολουθεί επώαση της μεμβράνης νιτροκυτταρίνης σε ρυθμιστικό διάλυμα εμφάνισης με υπόστρωμα DΑΒ. Η DΑΒ δρα ως υπόστρωμα για το ένζυμο της υπεροξειδάσης, και παρουσία Η2Ο2, οξειδώνεται προς σκούρο καφέ ίζημα. Η αντίδραση πραγματοποιείται παρουσία ιόντων Ni2+ (NiCl2), τα οποία αυξάνουν την ευαισθησία της, με αποτέλεσμα την παραγωγή εντονότερου χρώματος. Οι ζώνες των πρωτεϊνών εμφανίζονται ~40s μετά την εμβάπτιση της νιτροκυτταρίνης στο ρυθμιστικό διάλυμα εμφάνισης. Η αντίδραση διακόπτεται με εμβάπτιση της μεμβράνης σε ddh2ο, οπότε αποφεύγεται περαιτέρω μη ειδική χρώση της μεμβράνης. Ακολουθεί αποθήκευση της μεμβράνης σε ηλεκτρονική μορφή μέσω ηλεκτρονικού σαρωτή (scanner) και στέγνωμά της με εναπόθεση σε χαρτί Whatmann 3 ΜΜ. 85

86 ΥΛΙΚΑ-ΜΕΘΟΔΟΙ Σε μια παραλλαγή της μεθόδου, η ανοσοαποτύπωση μπορεί να πραγματοποιηθεί σε δείγμα πρωτεϊνών προσροφημένων σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης υπό μη αποδιατακτικές συνθήκες (dot blot). Στην περίπτωση αυτή, η προσρόφηση πραγματοποιείται σε ειδική συσκευή, υπό κενό και η ανίχνευση των πρωτεϊνών γίνεται όπως περιγράφηκε παραπάνω. Η μέθοδος αυτή είναι πολύ χρήσιμη κατά την επιλογή ισχυρών μετασχηματισμένων κλώνων κατά την έκφραση σε καλλιέργειες μικρής κλίμακας Χρωµατοµετρική μέθοδος Bradford για την ποσοτικοποίηση πρωτεϊνών Η μέθοδος στηρίζεται στην ιδιότητα της όξινης χρωστικής Coomassie Brilliant Blue G-250 να προσδένεται κυρίως σε βασικά και αρωματικά αμινοξικά κατάλοιπα και ειδικότερα σε κατάλοιπα αργινίνης (Arg), παράγοντας έγχρωμο προϊόν, έντασης ανάλογης της συγκέντρωσης της πρωτεΐνης (Bradford 1976). Η τιμή της συγκέντρωσης της πρωτεΐνης προκύπτει από την τιμή απορρόφησης του συμπλόκου πρωτεΐνη- χρωστική στα 595 nm και τη σύγκριση της μετρούμενης αυτής τιμής με πρότυπη καμπύλη που έχει προκύψει από τιμές απορρόφησης στα 595 nm συμπλόκου χρωστικής με γνωστές συγκεντρώσεις αλβουμίνης ορού βοός (BSA). H πειραματική πορεία αυτής της μεθόδου είναι η ακόλουθη: Αρχικά κατασκευάζεται μία πρότυπη καμπύλη βαθμονόμησης με χρήση διάφορων συγκεντρώσεων BSA. Η γραμμική περιοχή της καμπύλης είναι μεταξύ 0,2 και 0,9 mg/ml. Για την καμπύλη βαθμονόμησης παρασκευάζονται 100 μl διαλυμάτων 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8 και 1 mg/ml BSA σε ddh20. Στη συνέχεια, 20 μl των παραπάνω δειγμάτων προστίθενται σε 980 μl διαλύματος Biorad protein assay, αραιωμένου 1:4 με ddh2o, και μετράται η απορρόφηση των διαλυμάτων αυτών στα 595 nm μετά από 5 min. Ακολουθεί η κατασκευή πρότυπης καμπύλης που συσχετίζει τις μετρούμενες τιμές Α595 με τις γνωστές συγκεντρώσεις των δειγμάτων BSA. Τέλος, 20 μl του κατάλληλα αραιωμένου και προς μέτρηση δείγματος προστίθενται σε 980 μl αραιωμένου διαλύματος Biorad protein assay και από την τιμή απορρόφησης στα 595 nm υπολογίζεται και η συγκέντρωση (mg/ml) του πρωτεϊνικού δείγματος με τη χρήση της πρότυπης καμπύλης αναφοράς. 86

87 ΥΛΙΚΑ-ΜΕΘΟΔΟΙ In vitro απογλυκοζυλίωση πρωτεϊνών Τα MuSK-ECD μόρια διαθέτουν δύο σημεία Ν-γλυκοζυλίωσης, τα οποία είναι τρία αμινοξικά κατάλοιπα ασπαραγίνης (Asn) που βρίσκονται στις θέσεις 222 και 338 του ώριμου μορίου MuSK και ανήκουν στο πρότυπο Ν-γλυκοζυλίωσης, αφού συμμετέχουν στο σχηματισμό της χαρακτηριστικής αλληλουχίας Asn-X-Ser (X είναι οποιοδήποτε αμινοξικό κατάλοιπο). Κατά την έκφραση των MuSK-ECD μορίων σε P. pastoris ενδέχεται να συμβαίνει διαφορετικού βαθμού γλυκοζυλίωση, η οποία οδηγεί σε ετερογένεια των εκφραζόμενων μορίων. Προκειμένου να παραχθούν MuSK-ECD μόρια υψηλού βαθμού ομοιογένειας, έγινε απογλυκοζυλίωση των παραγόμενων αυτών πρωτεϊνών με τη χρήση της ενδογλυκοσιδάσης PNGase F και EndoHf (New EngIand Biolabs). Η διαδικασία που ακολουθείται για την απογλυκοζυλίωση των πρωτεϊνικών μορίων ήταν η εξής: Γίνεται προσθήκη κατάλληλης ποσότητας του ενζύμου EndoHf ( units/ml) σε γλυκοζυλιωμένα μόρια, μετά το δεύτερο στάδιο καθαρισμού με στήλη Superose 12, σε τελικό όγκο αντίδρασης 20 μl ρυθμιστικoύ διαλύματος 50 mm HEPES, 300 mm NaCl, 0,1% glycerol, pη 8,0 και ακολουθεί επώαση κατά τη διάρκεια της νύκτας στους 4 C. Η ποσότητα του χρησιμοποιούμενου κάθε φορά ενζύμου καθορίζεται από την ποσότητα της προς απογλυκοζυλίωση πρωτεΐνης, αφού δέκα μονάδες ενζύμου (10 unit) απογλυκοζυλιώνουν ~0,8 μg πρωτεΐνης. Ο έλεγχος της επιτυχούς απογλυκοζυλίωσης γίνεται με SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση ( ) των δειγμάτων και ανίχνευση με ανοσοαποτύπωση (Western blotting, ) Σήμανση πρωτεΐνης με 125 Ι με τη μέθοδο της χλωραμίνης Τ Η ιωδίωση της MuSK, πραγματοποιείται παρουσία χλωραμίνης Τ (McConahey and Dixon 1980) η οποία δρα ως οξειδωτικό για την οξείδωση του Na 125 I σε 125 Ι 2, το οποίο στη συνέχεια μπορεί και συνδέεται με αμινοξικά κατάλοιπα τυροσίνης. Στο τέλος της αντίδρασης, προστίθεται διάλυμα τυροσίνης, το οποίο δεσμεύει και σταθεροποιεί το ελεύθερο 125 Ι 2. 87

88 ΥΛΙΚΑ-ΜΕΘΟΔΟΙ Η πορεία αυτής της διαδικασίας έχει ως εξής: Α. Αντίδραση σήμανσης Τα αντιδραστήρια που χρησιμοποιήθηκαν είναι: 100 mci/ml Νa 125 I σε NaOH ph 7-11 (Amersham IMS 30, 100 mci/ml) 1 mg/ml πρωτεΐνη σε 0,3 Μ PB, ph 7,4 4 mg/ml χλωραμίνη-τ σε διάλυμα ΡΒ 4 mg/ml μεταθειϊκό νάτριο σε απεσταγμένο νερό Κορεσμένο υδατικό διάλυμα τυροσίνης 2 mg/ml αλβουμίνης ορού βοδιού (BSA) σε 0,02 Μ PB Σε 10 μl διαλύματος πρωτεΐνης/pb προστίθενται διαδοχικά 5 μl διαλύματος Na 125 I και 2,7 μl διαλύματος χλωραμίνης-τ, στους 4 ºC. Μετά από επώαση διάρκειας 5 min γίνεται διακοπή της αντίδρασης με προσθήκη 2,7 μl διαλύματος μεταθειϊκού νατρίου. Για τη σταθεροποίηση του ελεύθερου 125 I 2 προστίθενται 10 μl διαλύματος τυροσίνης και τέλος προστίθενται 400 μl διαλύματος PB-BSA για εμπλουτισμό σε πρωτεΐνη. B. Απομόνωση σημασμένης τοξίνης Ο διαχωρισμός της ιωδιωμένης πρωτεΐνης από το ελεύθερο 125 Ι 2 γίνεται με στήλη μοριακής διήθησης Sephadex G-50. Το διάλυμα της αντίδρασης σήμανσης τοποθετείται στο επάνω μέρος της στήλης και στη στήλη διοχετεύεται διάλυμα 0,2 mg/ml BSA σε 0,02 M PB. Συλλέγονται κλάσματα όγκου 0,5 ml. Από τη στήλη εκλούεται πρώτα η ιωδιωμένη πρωτεΐνη και αργότερα το μικρό μοριακού βάρους ελεύθερο 125 Ι. Η μέτρηση της ραδιενέργειας γίνεται σε μετρητή γ ακτινοβολίας και εκφράζεται σε cpm/l. Τα κλάσματα έκλουσης που περιέχουν την ιωδιωμένη πρωτεΐνη ενώνονται, και το παρασκεύασμα φυλάσσεται ανά 100 μlστους -20 ºC για 8-12 εβδομάδες, καθώς ο χρόνος ημιζωής του 125 Ι είναι 60 ημέρες. Γ. Υπολογισμός συγκέντρωσης (pmoles/μl) και ειδικής ενεργότητας (cpm/pmol) της ιωδιωμένης πρωτεΐνης Προκειμένου να εξαχθεί η συγκέντρωση της απομονωμένης ιωδιωμένης MuSK υπολογίζεται ο λόγος cpm πρωτεΐνης/σcpm, όπου cpm πρωτεΐνης είναι η 88

89 ΥΛΙΚΑ-ΜΕΘΟΔΟΙ συνολική ραδιενέργεια των κλασμάτων που περιέχουν την ιωδιωμένη πρωτεΐνη και Σcpm είναι η συνολική ραδιενέργεια όλων των κλασμάτων που έχουν συλλεχθεί από τη στήλη. Το γινόμενο του λόγου cpm πρωτεΐνης/σcpm με την ποσότητα της πρωτεΐνης (pmoles) που έχει χρησιμοποιηθεί για την αντίδραση, είναι η τελική ποσότητα (pmoles) της πρωτεΐνης που έχει ιωδιωθεί. Μετά την μέτρηση του συνολικού όγκου του παρασκευάσματος της ιωδιωμένης πρωτεΐνης, υπολογίζεται η συγκέντρωση της ιωδιωμένης πρωτεΐνης σε pmoles/μl. Στη συνέχεια, μετράται η ραδιενέργεια (cpm/μl) του παρασκευάσματος της πρωτεΐνης σε μετρητή γ- ακτινοβολίας και με απλή αναγωγή υπολογίζεται η ειδική ενεργότητα σε cpm/pmol Παρασκευή στηλών σεφαρόζης με ανασυνδυασμένα πολυπετίδια Για την παρασκευή στηλών ανοσοσοπροσρόφησης χρησιμοποιούνται 0,1 mg πρωτεΐνης αναμεμειγμένα με 0,9 mg BSA και 0,1 g σφαιρίδια ενεργοποιημένης CNBr-σεφαρόζης (GE Healthcare), σύμφωνα με το πρωτόκολλο που συνίσταται από τον κατασκευαστή. Εν συντομία, η ακινητοποίηση των πρωτεϊνών πραγματοποιείται με παρουσία του ρυθμιστικού διαλύματος ζεύξης (0,1 M NaHCO 3, 0,5 Μ NaCl, ph 8.3) μετά από επώαση για 12h στους 4 o C. Στη συνέχεια, οι εναπομείναντες ενεργές μονάδες μπλοκάρονται με 0,1M NaHCO 3, 1Μ αιθανολαμίνη, ph 8.3 και ακολουθεί πλύσιμο με τέσσερις εναλλασσόμενους κύκλους 0,1 Μ οξικού Νa, 0,5 M NaCl, ph 4,0 και 0,1 M NaHCO 3, 0,5 M NaCl, ph 8,3. Στο τέλος της διαδικασίας, τα σφαιρίδια που φέρουν την πρωτεΐνη επαναδιαλύονται σε διάλυμα κιτρικών, ph 7 ( 2.1.7), σε συνολικό όγκο 12 ml. Συγχρόνως, παρασκευάζεται στήλη ανοσοπροσρόφησης με 1 mg BSA σε 0.1 g σφαιρίδια ενεργοποιημένης CNBr-σεφαρόζης, η οποία χρησιμοποιείται ως αρνητικός ανοσοπροσροφητής άρα ως θετικός έλεγχος για τα πειράματα ραδιοανοσοπροσδιορισμού κάθε ορού Ανοσοπροσρόφηση MuSK αντισωμάτων από ορούς MuSK μυασθενών Οι οροί MuSK-μυασθενών γνωστού τίτλου αντισωμάτων οι οποίοι χρησιμοποιούνται για τα πειράματα ανοσοπροσρόφησης, αραιώνονται σε ρυθμιστικό διάλυμα PBS/0,2% BSA και προστίθεται σε αυτούς ανθρώπινος φυσιολογικός ορός 89

90 ΥΛΙΚΑ-ΜΕΘΟΔΟΙ με τελική αραίωση συνολικού ορού 1:10. Η ποσότητα του MuSK-MG ορού που χρησιμοποιείται διαφέρει ανάλογα με τη συγκέντρωση των MuSK αντισωμάτων στον κάθε ορό. Για την αντίδραση ανοσοπροσρόφησης, επωάζονται 20 fmoles MuSK αντισωμάτων (βρίσκονται σε όγκο 40 μl) με 1 μg ακινητοποιημένης MuSK σε στήλη σεφαρόζης (βρίσκεται σε όγκο 120 μl) για 2 h στους 4 ο C, υπό ανάδευση. Συγχρόνως, επωάζεται η ίδια ποσότητα αντισωμάτων με 1 μg BSA σε στήλη σεφαρόζης. Στη συνέχεια, το μείγμα της αντίδρασης φυγοκεντρείται και το υπερκείμενο με τα MuSK αντισώματα τα οποία δεν προσδέθηκαν στη στήλη χρησιμοποιείται σε πειράματα ραδιοανοσοπροσδιορισμού (RIA). Η εκατοστιαία μείωση MuSK αντισωμάτων μεταξύ του δείγματος που επωάζεται με τη στήλη που περιέχει BSA και εκείνου που επωάζεται με τη στήλη που περιέχει MuSK ορίζεται ως ανοσοπροσρόφηση. Η σχέση που χρησιμοποιείται για να υπολογιστεί η ανοσοπροσρόφηση είναι η εξής: 100 x [(Δcpm ιζήματος μετά από επώαση με στήλη σεφαρόζης BSA) (Δcpm ιζήματος μετά από επώαση με στήλη σεφαρόζης MuSK)] / ( Δcpm ιζήματος μετά από επώαση με στήλη σεφαρόζης BSA) Αναγέννηση των ανοσοπροσροφητών και έκλουση των MuSK αντισωμάτων Τα σφαιρίδια σεφαρόζης τα οποία περιέχουν 1 μg MuSK-ECD επωάζονται με ορό MuSK μυασθενούς με σκοπό την αφαίρεση των MuSK αντισωμάτων από τους ανοσοπροσροφητές. Μετά το πέρας της επώασης, τα σφαιρίδια πλένονται δύο φορές με 1 ml PBS, επαναδιαλύονται με PBS σε τελικό όγκο 100 μl και επωάζωνται για 3 min σε θερμοκρασία δωματίου μετά την προσθήκη 100 μl 0,2 Μ διαλύματος γλυκίνης ph 2,4. Μετά την προσθήκη 20 μl 1,5 M διαλύματος Tris, ph 8,8 (για εξουδετέρωση) τα εκλουσμένα MuSK αντισώματα απομακρύνονται μετά από σύντομη φυγοκέντρηση και τα σφαιρίδια πλένονται με PBS/0.2% BSA και επαναδιαλύονται σε 120 μl τελικό όγκο με διάλυμα κιτρικών, έως ότου χρησιμοποιούν ξανά. 90

91 ΥΛΙΚΑ-ΜΕΘΟΔΟΙ Ραδιοανοσολογικός (RIA) προσδιορισμός MuSK αντισωμάτων Η δοκιμασία η οποία χρησιμοποιείται για την ανίχνευση MuSK αντισωμάτων στη μυασθένεια Gravis βασίζεται στη μέθοδο RIA, η οποία χρησιμοποιεί ολόκληρο το εξωκυτταρικό τμήμα της ανθρώπινης MuSK, εκφρασμένο σε COS κυτταρική σειρά, διαλυμένο σε απορρυπαντικό και απ ευθείας σημασμένο με 125 Ι (Matthews et al., 2004), το οποίο είναι διαθέσιμο με εμπορική διαγνωστική συσκευασία (RSR Ltd). Πιο αναλυτικά, στη δοκιμασία αυτή, 50 μl διαλυμένης ιωδιωμένης ανθρώπινης MuSK ( cpm) επωάζεται με 40 μl υπερκειμένου ανοσοπροσρόφησης για 2 h σε θερμοκρασία δωματίου. Στη συνέχεια, για την κατακρήμνιση των ανοσοσφαιρινών μαζί με την δεσμευμένη επισημασμένη MuSK ακολουθεί προσθήκη ορού κατά ανθρώπινης ανοσοσφαιρίνης (50 μl) και επώαση για 2 h στους 4 ο C. Ακολουθεί προσθήκη 1 ml διαλύματος έκπλυσης (PBS/0.5 % Triton X-100, ph 7,4) και φυγοκέντρηση 20 min, στους 4 ο C, στα 1500g. Έπειτα, μετά τη δεύτερη έκπλυση του ιζήματος που δημιουργείται μετά τη φυγοκέντρηση η ραδιενέργεια που δεσμεύτηκε στο ίζημα μετράται σε μετρητή γ-ακτινοβολίας. Για τη μέτρηση του τίτλου των MuSK αντισωμάτων στον ορό κουνελιών χρησιμοποιείται η τεχνική της RIA. Αναλυτικότερα, 5 μl από τον υπό διερεύνηση ορό κουνελιού αναμειγνύονται με 50 μl διαλύματος το οποίο περιείχε 50,000 cpm 125 I-σημασμένης ανθρώπινης MuSK και επωάζονται για 2h σε θερμοκρασία δωματίου. Στη συνέχεια, προστίθενται 10 μl μείγματος ακινητοποιημένων πρωτεϊνών Α και G σε σεφαρόζη (παρέχονται έτοιμα προς χρήση από την Sigma- Aldrich) σε αναλογία 1:1 και μετά από επώαση για 2 h στους 4 C τα δείγματα πλένονται δύο φορές με 1 ml of PBS/0,5% Triton X-100, ph 7.4. Η ραδιοενεργότητα στα πλυμένα σφαιρίδια σεφαρόζης μετράται σε γ-μετρητή και ο τίτλος των MuSK αντισωμάτων του ορού υπολογίζεται σε nm (nmol bound MuSK /liter serum) Καθορισμός υποτάξεων των MuSK αντισωμάτων IgG Ο καθορισμός των υποτάξεων των MuSK αντισωμάτων πραγματοποιείται με ανοσοκατακρήμνιση. Συγκεκριμένα, 50 μl διαλύματος το οποίο περιείχε 50,000 cpm 125 I-σημασμένης ανθρώπινης MuSK, επωάζεται με 1,5 μl από τον υπό διερεύνηση ορό. Στη συνέχεια, προστίθενται 1,5 μl αντισωμάτων έναντι των ανθρώπινων IgG1, 91

92 ΥΛΙΚΑ-ΜΕΘΟΔΟΙ IgG2, IgG3 ή IgG4 (1 mg/ml) (Binding Site, Birmingham, UK) και επωάζονται για 2h σε θερμοκρασία δωματίου με σκοπό το σχηματισμό συμπλόκων. Στο πείραμα, συμπεριλαμβάνεται και φυσιολογικός ανθρώπινος ορός για αρνητικός μάρτυρας. Τα δημιουργούμενα σύμπλοκα των αντισωμάτων κατακρημνίζονται με την προσθήκη 10 μl αντι-ορού έναντι των IgG αντισωμάτων που παράχθηκαν σε πρόβατο (Sigma- Aldrich). Μετά το τέλος της επώασης, το σχηματιζόμενο ίζημα πλένεται δύο φορές με 1 ml PBS/0,5% Triton X-100, ph 7,4 και τελικά η ραδιοενεργότητα του ιζήματος μετράται σε γ-μετρητή. Τα συνολικά IgG μετρούνται με την κλασική RIA όπως περιγράφεται στην παράγραφο χρησιμοποιώντας 1,5 μl ορού Απομόνωση IgG ανοσοσφαιρινών απο πλάσμα MuSK μυασθενών Η μέθοδος στηρίζεται στην ιδιότητα των πρωτεϊνών να καθιζάνουν όταν αυξάνεται η ιοντική ισχύς του μέσου στο οποίο βρίσκονται με την προσθήκη ορισμένων αλάτων (εξαλάτωση). Η εξαλάτωση οφείλεται σε αφυδάτωση των υδρόφιλων ομάδων της πρωτεΐνης και συνεπώς σε μείωση της διαλυτότητάς της. Για την απομόνωση των αντισωμάτων στη δική μας περίπτωση χρησιμοποιήθηκε το θειικό αμμώνιο. Τα IgG αντισώματα γνωρίζουμε ότι κατακρημνίζονται όταν βρεθούν σε διάλυμα 33%-40% κορεσμένου θειικού αμμωνίου. Το δείγμα του πλάσματος που προορίζεται για καθίζηση αραιώνεται σε ίσο όγκο (V) PBS με αργή μαγνητική ανάδευση σε θρυμματισμένο πάγο. Συγκεκριμένος όγκος διαλύματος (x) του κορεσμένου θειϊκού αμμωνίου (NH 4 ) 2 SO 4 προστίθεται σταδιακά στον αραιωμένο ορό που βρίσκεται σε συνεχή ανάδευση με βάση την εξίσωση: x/x+2v=40/100. Το διάλυμα παραμένει για 10 min στους 4 ο C και φυγοκεντρείται σε g, 20 min, 4 ο C. Το σχηματισθέν ίζημα επαναδιαλύεται σε όγκο V χρησιμοποιώντας 40% (NH 4 ) 2 SO 4 και στη συνέχεια φυγοκεντρείται όπως προηγουμένως. Το ίζημα επαναδιαλύεται σε PBS, όγκου ίσου προς το ¼ του αρχικού όγκου V. Έπειτα, το διάλυμα κλείνεται σε μεμβράνη διαπίδυσης η οποία τοποθετείται σε δοχείο με PBS και αφήνεται υπό ανάδευση σε αυτό για 16 h στους 4 ο C. Τέλος, εάν ο τελικός όγκος ξεπερνά τον επιθυμητό ακολουθεί συμπύκνωση με πολυαιθυλογλυκόλη

93 ΥΛΙΚΑ-ΜΕΘΟΔΟΙ Ανοσοποίηση ζώων Ενεργητική ανοσοποίηση κουνελιών με MuSK-ECD Λευκά θηλυκά κουνέλια 2-3 μηνών του υποείδους New Zealand ανοσοποιούνται με 250 μg of MuSK-ECD τα οποία είχαν αναμιχθεί με πλήρες ανοσοενισχυτικό (complete Freud adjuvant) με σκοπό την επαγωγή πειραματικής μυασθένειας. Οι ενέσεις πραγματοποιούνται στη πλάτη και με την πάροδο 15 ημερών πραγματοποιούνται επαναληπτικές ανοσοποίησεις με 200 μg MuSK-ECD αναμιγμένα με μη πλήρες ανοσοενισχυτικό (incomplete Freud adjuvant) Aνοσοποίηση ποντικιών μέσω παθητικής μεταφοράς ανθρώπινων αντισωμάτων PBS, ολικά IgGs, IgGs με προηγούμενη αφαίρεση των MuSK αντισωμάτων ή απομονωμένα MuSK αντισώματα χορηγούνται ενδοπεριτοναϊκά σε ποντίκια C57BL/6 έξι εβδομάδων για επαγωγή πειραματικής μυασθένειας και μελέτη της δράσης τους για 7 ή 14 συνεχόμενες ημέρες. Πριν από κάθε ένεση, ελέγχεται καθημερινά το βάρος κάθε ποντικιού. Με σκοπό να κατασταλεί οποιαδήποτε αντίδραση έναντι ανθρώπινης πρωτεΐνης, τα ποντίκια ενύονται ενδοπεριτοναϊκά με κυκλοφωσφαμίδη (300 mg/kg, Sigma), 24h μετά την πρώτη ένεση (Toyka et al., 1977). Στη συνέχεια, 15 ή 8 ημέρες μετά από καθημερινές ενέσεις αντισωμάτων, τα ζώα θανατώνονται με CO 2 και λαμβάνεται το διάφραγμα με σκοπό τη μορφολογική ανάλυση των νευρομυϊκών συνάψεων χρησιμοποιώντας τεχνικές ανοσοφθορισμού Ex-vivo πειράματα ανοσοπροσρόφησης Αρχικά, με σκοπό την ηρέμηση των ζώων, ενύονται ενδομυϊκά 5 mg/kg Ξυλαζίνης και 5 mg/kg Κεταμίνης. Από την αρτηρία του αφτιού των κουνελιών συλλέγονται 50 ml αίματος τα οποία διαχωρίζονται σε 25 ml πλάσμα και 25 ml κύτταρα αίματος. Στη συνέχεια, το κλάσμα του πλάσματος περνάει από μία στήλη ανοσοπροσρόφησης με MuSK-ECD και το καθαρισμένο πλάσμα αναμειγνύεται με 93

94 ΥΛΙΚΑ-ΜΕΘΟΔΟΙ τα κύτταρα του αίματος και επιστρέφεται τελικά πίσω στο κουνέλι. Έπειτα, τη μέρα διεξαγωγής του πειράματος και 8 ημέρες μετά, πραγματοποιείται αιματολογικός βιοχημικός έλεγχος καθώς και μέτρηση θερμοκρασίας και βάρους. Επίσης, τις ίδιες μέρες προσδιορίζεται και ο τίτλος των MuSK αντισωμάτων στα ανοσοποιημένα κουνέλια με MuSK-ECD. Το πείραμα πραγματοποιείται και σε ζώο ανοσοποιημένο με PBS (control) Χρώση ολόκληρων ιστών ποντικών Αρχικά, τα διαφράγματα εμβαπτίστηκαν σε PBS και επωάστηκαν με 1 mg/ml κολλαγενάση (Type IA, Sigma-Aldrich) αραιωμένη σε PBS για 15 min σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά την επώαση, ακολούθησε πλύση με PBS και οι ιστοί μονιμοποιήθηκαν με 4 % παραφορμαλδεΰδη (PFA, Sigma-Aldrich) για 30 min σε θερμοκρασία δωματίου. Στη συνέχεια, αφού τα διαφράγματα κομματιάστηκαν με ειδική λαβίδα ακολούθησε επώαση με PBS/0,1 Μ γλυκίνη για 1h και τα κύτταρα των ιστών έγιναν διάτρητα αφού επωάστηκαν με PBS/0,5 % Triton X-100. Τα δείγματα μπλοκαρίστηκαν με 2,5 % BSA, 5 % φυσιολογικό ορό κατσίκας σε PBS/0,5 % Triton X-100 για 4 h σε θερμοκρασία και στη συνέχεια επωάστηκαν με α-βουγκαροτοξίνη σημασμένη με Alexa Fluor 488 (1:1000) για 16 h στους 4 C. Στη συνέχεια, αφού τα διαφράγματα πλύθηκαν με PBS/0,5 % Triton X-100 και με PBS, τελικά μονιμοποιήθηκαν με Mowiol (Sigma). Ακολούθησε παρατήρηση των δειγμάτων σε συνεστιακό μικροσκόπιο. 94

95 Αποτελέσματα

96 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 3.1 Έκφραση του ολόκληρου εξωκυτταρικού τμήματος της MuSK (MuSK- ECD f ) στον P. pastoris Στο παρελθόν, είχε κατασκευαστεί και εκφραστεί στο εργαστήριο μας το εξωκυτταρικό τμήμα της ανθρώπινης MuSK χρησιμοποιώντας το στέλεχος X33 του ζυμομύκητα P. pastoris. Η εκφραζόμενη πρωτεΐνη (MuSK-ECD f ) φέρει στο καρβοξυτελικό άκρο το ολιγοπεπτίδιο επίτοπο myc και ένα εξαπεπτίδιο ιστιδίνης. Η απομόνωση της ανασυνδυασμένης αγρίου τύπου ανθρώπινης MuSK πρωτεΐνης απαιτεί γενικά δύσκολους χειρισμούς, ενώ ως διαμεμβρανική πρωτεΐνη, μπορεί να απομονωθεί σε ποσότητες οι οποίες δεν αρκούν για τις ανάγκες της παρούσας εργασίας. Για το λόγο αυτό, χρησιμοποιείται το εξωκυτταρικό τμήμα της πρωτεΐνης το οποίο φέρει την κύρια ανοσογόνο περιοχή, τον κύριο στόχο δηλαδή των MuSK αντισωμάτων των ασθενών που πάσχουν από MuSK μυασθένεια (Huijbers et al. 2013) Απομόνωση της MuSK-ECD f πρωτεΐνης Το πρώτο στάδιο απομόνωσης και καθαρισμού των πρωτεϊνών με τη χρήση Ni-NTA χρωματογραφίας συγγένειας ( ) πραγματοποιήθηκε υπό μη αποδιατακτικές συνθήκες και βασίστηκε στη πολυ-ιστιδινική περιοχή (6xHis) η οποία βρίσκεται στο καρβοξυτελικό άκρο της πρωτεΐνης. Η ανάλυση SDS-PAGE ( ) και η χρώση με Coomassie blue ( ) μετά από αυτό το στάδιο καθαρισμού έδειξε μία διάχυτη ζώνη στα kda για την MuSK-ECD f πρωτεΐνη πιθανότατα λόγω του ποικίλου βαθμού γλυκοζυλίωσης [N222, N338]. Το Western blot με χρήση αντί-myc μονοκλωνικού αντισώματος ( ) αποκάλυψε την ίδια διάχυτη ζώνη (Εικόνα 3.1Α). 96

97 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Α Β Εικόνα 3.1 SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση της απομονωμένης πρωτεΐνης. Η MuSK-ECD f πρωτεΐνη διαχωρίστηκε σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου και ακολούθησε χρώση με Coomassie (1) ή Western blot (2) με τη χρήση αντι-myc αντισώματος A) μετά από χρωματογραφία συγγένειας και B) μετά από απογλυκοζυλίωση των εκλουσμάτων από τη χρωματογραφία μοριακής διήθησης Χαρακτηρισμός της MuSK-ECD f πρωτεΐνης με χρωματογραφία μοριακής διήθησης Με σκοπό τον περαιτέρω καθαρισμό αλλά και τη μελέτη του ακριβούς μοριακού βάρους της πρωτεΐνης, πραγματοποιήθηκε χρωματογραφία μοριακής διήθησης χρησιμοποιώντας τη στήλη Superose 12 ( ). Παράλληλα, αναλύθηκαν στην ίδια στήλη και υπό τις ίδιες συνθήκες μάρτυρες μοριακών βαρών που εκλούονται σε παρόμοια μοριακά βάρη. Σύμφωνα με το χρωματογράφημα της πρωτεΐνης (Εικόνα 3.2), η πρωτεΐνη εκλούεται από τη στήλη δίνοντας ένα φάσμα μοριακών βαρών κυρίως από διμερή και συσσωματώματα. Μετά τη χρωματογραφία μοριακής διήθησης, όλα τα εκλουόμενα κλάσματα εξετάστηκαν με τη μέθοδο της ανοσοαποτύπωσης (dot blot, ), χρησιμοποιώντας το μονοκλωνικό αντίσωμα anti-myc. Συγχρόνως, όλα τα εκλουόμενα κλάσματα των πρωτεϊνών ελέγχθηκαν με SDS-PAGE και ακολούθησε χρώση με Coomassie καθώς επίσης και ανοσοαποτύπωση σε μεμβράνη (Westernblot, ) χρησιμοποιώντας και πάλι το μονοκλωνικό αντίσωμα anti-myc. Έτσι, επιβεβαιώθηκε ότι η πρωτεΐνη εκλούεται σχηματίζοντας διμερή και συσσωματώματα. Στην Εικόνα 3.2, παρουσιάζονται τα αποτελέσματα από το SDS-PAGE όπου φαίνεται ότι σε όλα τα κλάσματα του χρωματογραφήματος εκλούεται η πρωτεΐνη αλλά 97

98 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ μεγαλύτερη ποσότητα εκλούεται στα κλάσματα τα οποία αντιστοιχούν στους όγκους έκλουσης 10,5 έως 11,5 ml όπου εμφανίζονται τα διμερή. Στη συνέχεια, με τη χρήση των κλασμάτων που αντιστοιχούν στους όγκους έκλουσης 10,5 έως 11,5 ml, πραγματοποιήθηκε αντίδραση απογλυκοζυλίωσης της πρωτεΐνης με τη χρήση του ενζύμου EndoHF ( ). Όπως φαίνεται στην Εικόνα 3.1Β, η απογλυκοζυλίωση με την EndoHF ενδονουκλεάση οδήγησε αφ ενός στην εξαφάνιση της διάχυτης ζώνης και αφ ετέρου στην αναμενόμενη μείωση του μοριακού βάρους των παραγόμενων ολιγομερών σε σχέση με τα γλυκοζυλιωμένα ολιγομερή. Το μοριακό βάρος των απογλυκοζυλιωμένων ολιγομερών φαίνεται να αντιστοιχεί σε ~70 kda, το οποίο εν τούτοις είναι μεγαλύτερο από το αναμενόμενο των 55 kda. Εικόνα 3.2 Χρωματογράφημα μοριακής διήθησης της MuSK-ECD f πρωτεΐνης με τη χρήση στήλης Superose 12 σε σύστημα Akta FPLC purifier. Τα τόξα δείχνουν τους όγκους έκλουσης πρωτεϊνών-μαρτύρων με γνωστά μοριακά βάρη. Στο κάτω μέρος του χρωματογραφήματος απεικονίζεται το dot blot της ανάλυσης των εκλουσμάτων από τη στήλη υπό μη αποδιατακτικές συνθήκες με τη χρήση αντι-myc αντισώματος και κατάλληλης ποσότητας δείγματος από το κάθε έκλουσμα. Τα ενθέματα απεικονίζουν την SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση (1) και το Western blot του MuSK-ECD f (2) ομοίως με τη χρήση αντι-myc αντισώματος του εκλούσματος που αντιστοιχεί στα 10,5 ml όγκου έκλουσης. 98

99 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Ποσοτική ανάλυση της MuSK-ECD f πρωτεΐνης Μετά την απομόνωση της πρωτεΐνης και με τα δύο στάδια καθαρισμού, χρησιμοποιήθηκε η χρωματομετρική μέθοδος Bradford ( ) με σκοπό την ποσοτικοποίηση της πρωτεΐνης. Χρησιμοποιώντας την εξίσωση ευθείας, η οποία προέκυψε από την πρότυπη καμπύλη που είχε κατασκευαστεί, έγινε η ποσοτικοποίηση της πρωτεΐνης η οποία εκλούεται στα κλάσματα τα οποία αντιστοιχούν στους όγκους έκλουσης 10,5 έως 11,5 ml. Το επίπεδο έκφρασης της πρωτεΐνης ήταν περίπου 0,4 mg/λίτρο κυτταρικής καλλιέργειας. 3.2 Έκφραση του εξωκυτταρικού τμήματος της MuSK χωρίς την κυστεϊνική περιοχή (MuSK-ECD ΔFz ) στον P. pastoris Σχεδιασμός και κατασκευή του MuSK-ECD ΔFz και του ανασυνδυασμένου πλασμιδίου για έκφραση στον P. pastoris Το επιθυμητό εξωκυτταρικό τμήμα χωρίς την περιοχή η οποία είναι πλούσια σε κυστεΐνες βρίσκεται σε ένα πλασμίδιο έκφρασης από άλλα μέλη του εργαστηρίου. Επειδή το συγκεκριμένο πλασμίδιο δεν είναι κατάλληλο για έκφραση σε X33 κύτταρα θα πρέπει να μεταφέρουμε το επιθυμητό τμήμα στο πλασμίδιο-φορέα έκφρασης ppiczαa ( 2.1.9). Αρχικά πραγματοποιείται πέψη ( ) του φορέα που περιέχει το επιθυμητό ένθεμα με τα ένζυμα περιορισμού XhoI και XbaI. Μετά το τέλος της πέψης, ακολούθησε ηλεκτροφόρηση σε 1% w/v πήκτωμα αγαρόζης και καθαρισμός των προϊόντων με QIA quick gel extraction kit ( ). Παράλληλα, με τα ίδια ένζυμα περιορισμού πραγματοποιήθηκε και η πέψη του πλασμιδίου-φορέα έκφρασης ppiczαa. Το προϊόν της πέψης ελέγχθηκε με ηλεκτροφόρηση σε 1% w/v πήκτωμα αγαρόζης και ακολούθησε καθαρισμός με QIA quick PCR purification kit ( ) και αποφωσφορυλίωση του γραμμικού πλασμιδιακού DNA ( ). Έπειτα, για να πραγματοποιηθεί η σύνδεση του ενθέματος με το γραμμικό πλασμίδιο ppiczαa ακολούθησε αντίδραση σύνδεσης με την Τ4 DNA λιγάση ( ). Το τελικό ανασυνδυασμένο πλασμίδιο, εισήχθη σε στελέχη TOP10F βαστηρίων E.Coli ( ). Για την επιλογή των βακτηριακών αποικιών τα οποία έχουν επιτυχώς μετασχηματιστεί, χρησιμοποιήθηκε το αντιβιοτικό ζεοσίνη. Αφού 99

100 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ επιλέχθηκαν 12 κλώνοι, ακολούθησαν καλλιέργειες βακτηρίων μικρής κλίμακας με σκοπό την απομόνωση του ανασυνδυασμένου πλασμιδίου με τη μέθοδο της αλκαλικής λύσης (mini-prep, ). Η σύνδεση των ενθεμάτων με το πλασμίδιο ελέγχθηκε με πέψη ( ) με τις περιοριστικές ενδονουκλεάσες ClaI και SalI και στη συνέχεια έλεγχος με ηλεκτροφόρηση σε 1% w/v πήκτωμα αγαρόζης ( 2.2.6). Επιλέχθηκαν δύο θετικοί κλώνοι και ακολούθησε απομόνωση του ανασυνδυασμένου πλασμιδίου από καλλιέργειες βακτηρίων μεγάλης κλίμακας, με τη μέθοδο της αλκαλικής λύσης (maxi-prep, ). Τελικά, παράχθηκε μεγάλη ποσότητα εξαιρετικά καθαρού DNA (2.5 mg/ml) που περιέχει το επιθυμητό ένθεμα και αφού η σωστή ακολουθία των βάσεων ελέγχθηκε με αλληλούχιση των DNAs (Lark Technologies), το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο χρησιμοποιήθηκε στα περαιτέρω πειράματα Μετασχηματισμός των X33 κυττάρων του P. pastoris με το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο ppiczαa το οποίο φέρει το MuSK-ECD ΔFz Μετά την κατασκευή του πλασμιδίου και την απομόνωση μεγάλης ποσότητας από καλλιέργεια βακτηρίων, ακολούθησε ο μετασχηματισμός των X33 κυττάρων του ζυμομύκητα P. pastoris με το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο. Μετά από πέψη του πλασμιδίου με το ένζυμο PmeI προέκυψαν γραμμικά μόρια DNA όπως διαπιστώθηκε με ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της πέψης σε 1% w/v πήκτωμα αγαρόζης ( 2.2.6). Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε απομόνωση του ευθυγραμμισμένου πλασμιδίου ( ). Παράλληλα, παρασκευάστηκαν επιδεκτικά κύτταρα X33 του ζυμομύκητα P. pastoris ( ) και ακολούθησε ο μετασχηματισμός των επιδεκτικών κυττάρων με τα γραμμικά αυτά μόρια με ηλεκτροδιάτρηση ( ), προκειμένου να εισαχθούν τα ανασυνδυασμένα πλασμίδια στα επιδεκτικά κύτταρα Έλεγχος έκφρασης της MuSK-ECD ΔFz πρωτεΐνης στο στέλεχος X33 του P. pastoris σε καλλιέργειες μικρής κλίμακας Μετά το μετασχηματισμό των κυττάρων του P. pastoris ακολούθησαν καλλιέργειες μικρής κλίμακας ( ), με σκοπό να εντοπισθούν οι θετικοί κλώνοι 100

101 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ που εκφράζουν την πρωτεΐνη. Η επαγωγή των κλώνων διήρκησε 48 h, ενώ η μεθανόλη ανανεώθηκε μετά από 24 h επαγωγής. Ο έλεγχος των κλώνων πραγματοποιήθηκε σε όλες τις περιπτώσεις με ανοσοαποτύπωση σε μεμβράνη (dot blot, ), όπου προσροφήθηκαν 200 μl δείγματος από τα υπερκείμενα των καλλιεργειών (Εικόνα 3.3). Για τον εντοπισμό των θετικών κλώνων χρησιμοποιήθηκε το αντίσωμα αντι-myc, έναντι του c-myc επιτόπου που φέρει το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο. Μετά τον προκαταρκτικό έλεγχο, επιλέχθηκαν δύο θετικοί κλώνοι οι οποίοι παρουσίαζαν μεγαλύτερα επίπεδα έκφρασης, προκειμένου να ακολουθήσει παραγωγή της πρωτεΐνης σε μεγάλη κλίμακα. Επιπλέον, οι δύο κλώνοι που επιλέχθηκαν διατηρήθηκαν στους -80 ο C, μετά από καλλιέργειά τους σε θρεπτικό μέσο ( ) Εικόνα 3.3 Ανοσοαποτύπωση πρωτεϊνών υπερκειμένου καλλιεργειών μικρής κλίμακας σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης υπο μη αποδιατακτικές συνθήκες (dot blot) με τη χρήση αντι-myc αντισώματος. Σε αυτή την εικόνα απεικονίζονται οι κηλίδες ανοσοαποτύπωσης με χρήση 200 μl δείγματος υπερκειμένου από 26 διαφορετικούς μετασχηματισμένους κλώνους. Το πλαίσιο με τον αριθμό 3 αντιπροσωπεύει ίδια ποσότητα δείγματος υπερκειμένου από κλώνο ο οποίος χρησιμοποιείται για την έκφραση της MuSK-ECD f γνωστών επιπέδων έκφρασης. Οι άχρωμες κηλίδες στο πλαίσιο 4, αντιστοιχούν σε ίδια ποσότητα σκέτου θρεπτικού υλικού BMMY με αυτή των δειγμάτων υπερκειμένων, στο οποίο δεν υπάρχει έκφραση MuSK-ECD ΔFz και χρησιμοποιείται ως αρνητικός μάρτυρας για την μη ειδική δέσμευση του αντι-myc αντισώματος σε μόρια που δεν φέρνουν το c-myc επίτοπο. Στο συγκεκριμένο αντιπροσωπευτικό παράδειγμα, οι κλώνοι στα πλαίσια 1 και 2 επιλέγχθηκαν για έκφραση σε καλλιέργειες μεγάλης κλίμακας Έκφραση της MuSK-ECD ΔFz πρωτεΐνης και απομόνωση από καλλιέργειες μεγάλης κλίμακας Οι θετικοί κλώνοι που επιλέχθηκαν από τη καλλιέργεια μικρής κλίμακας, δοκιμάστηκαν σε καλλιέργειες μεγάλης κλίμακας ( ) για να ακολουθήσει η 101

102 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ποσοτικοποίηση της παραγόμενης πρωτεΐνης και η μελέτη των χαρακτηριστικών της. Το υπερκείμενο της καλλιέργειας που φέρει την πρωτεΐνη, συλλέχθηκε ( ) και συμπυκνώθηκε ( ) για να ακολουθήσει η απομόνωση της Απομόνωση της MuSK-ECD ΔFz πρωτεΐνης Το πρώτο στάδιο απομόνωσης και καθαρισμού των πρωτεϊνών με τη χρήση Ni-NTA χρωματογραφίας συγγένειας πραγματοποιήθηκε υπό μη αποδιατακτικές συνθήκες και βασίστηκε στη πολυ-ιστιδινική περιοχή (6xHis) η οποία βρίσκεται στο καρβοξυτελικό άκρο της πρωτεΐνης. Η ανάλυση SDS-PAGE της πρωτεΐνης ( ) και η χρώση με Coomassie blue ( ) μετά από αυτό το στάδιο καθαρισμού έδειξε μία διάχυτη ζώνη στα kda πιθανότατα λόγω του ποικίλου βαθμού Α Β Εικόνα 3.4 SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση της απομονωμένης πρωτεΐνης. Η MuSK-ECD ΔFz πρωτεΐνη διαχωρίστηκε σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου και ακολούθησε χρώση με Coomassie (1) ή Western blot (2) με τη χρήση αντι-myc αντισώματος A) μετά από χρωματογραφία συγγένειας και B) μετά από απογλυκοζυλίωση των εκλουσμάτων από τη χρωματογραφία μοριακής διήθησης. γλυκοζυλίωσης [N222]. Η ζώνη που εμφανίζεται για την MuSK- ECD ΔFz πρωτεΐνη είναι σαφώς μικρότερη από αυτή για την MuSK-ECD f πρωτεΐνη πιθανόν εξαιτίας της 102

103 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ύπαρξης μιας παραπάνω θέσης γλυκοσυλίωσης στην MuSK-ECD f πρωτεΐνη. Το Western blot με χρήση αντί-myc μονοκλωνικού αντισώματος αποκάλυψε την ίδια διάχυτη ζώνη ( , Εικόνα 3.4) Χαρακτηρισμός της MuSK-ECD ΔFz πρωτεΐνης με χρωματογραφία μοριακής διήθησης Με σκοπό τον περαιτέρω καθαρισμό αλλά και τη μελέτη του ακριβούς μοριακού βάρους της πρωτεΐνης, πραγματοποιήθηκε χρωματογραφία μοριακής διήθησης χρησιμοποιώντας τη στήλη Superose 12 ( ). Παράλληλα, αναλύθηκαν στην ίδια στήλη και υπό τις ίδιες συνθήκες μάρτυρες μοριακών βαρών που εκλούνται σε παρόμοια μοριακά βάρη. Σύμφωνα με το χρωματογράφημα της πρωτεΐνης (Εικόνα 3.5), η πρωτεΐνη εκλούεται από τη στήλη ως διμερές. Μετά τη χρωματογραφία μοριακής διήθησης, όλα τα εκλουόμενα κλάσματα εξετάστηκαν με τη μέθοδο της ανοσοαποτύπωσης (dot blot, ) χρησιμοποιώντας το μονοκλωνικό αντίσωμα anti-myc. Συγχρόνως, όλα τα εκλουόμενα κλάσματα των πρωτεϊνών ελέγχηκαν με SDS-PAGE και ακολούθησε χρώση με Coomassie καθώς επίσης και ανοσοαποτύπωση σε μεμβράνη (Westernblot, ) χρησιμοποιώντας και πάλι το μονοκλωνικό αντίσωμα anti-myc. Έτσι, επιβεβαιώθηκε ότι η πρωτεΐνη εκλούεται σχηματίζοντας διμερή και συσσωματώματα. Στην Εικόνα 3.5, παρουσιάζονται τα αποτελέσματα από το SDS-PAGE όπου φαίνεται ότι σε όλα τα κλάσματα του χρωματογραφήματος εκλούεται η πρωτεΐνη αλλά μεγαλύτερη ποσότητα εκλούεται στον όγκο έκλουσης που αντιστοιχεί στα διμερή (11 έως 12 ml). Στη συνέχεια, με τη χρήση των κλασμάτων που αντιστοιχούν στους όγκους έκλουσης 11 έως 12 ml, προχωρήσαμε στην απογλυκοζυλίωση της πρωτεΐνης με τη χρήση του ενζύμου EndoHF ( ). Όπως φαίνεται στην Εικόνα 3.1 Β, η απογλυκοζυλίωση με την EndoHF ενδονουκλεάση οδήγησε αφ ενός στην μείωση της διάχυτης ζώνης και αφ ετέρου στην αναμενόμενη μείωση του μοριακού βάρους των παραγόμενων ολιγομερών σε σχέση με τα γλυκοζυλιωμένα ολιγομερή. 103

104 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Εικόνα 3.5 Χρωματογράφημα μοριακής διήθησης της MuSK-ECD ΔFz πρωτεΐνης με τη χρήση στήλης Superose 12 σε σύστημα Akta FPLC purifier. Τα τόξα δείχνουν τους όγκους έκλουσης πρωτεϊνών-μαρτύρων με γνωστά μοριακά βάρη. Στο κάτω μέρος του χρωματογραφήματος απεικονίζεται το dot blot της ανάλυσης των εκλουσμάτων από τη στήλη υπό μη αποδιατακτικές συνθήκες με τη χρήση αντι-myc αντισώματος και κατάλληλης ποσότητας δείγματος από το κάθε έκλουσμα. Τα ενθέματα απεικονίζουν την SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση (1) και το Western blot της πρωτεΐνης (2) ομοίως με τη χρήση αντι-myc αντισώματος του εκλούσματος που αντιστοιχεί στα 11 ml όγκου έκλουσης Ποσοτική ανάλυση της απομονωμένης MuSK-ECD ΔFz πρωτεΐνης Μετά την απομόνωση της πρωτεΐνης και με τα δύο στάδια καθαρισμού, χρησιμοποιήθηκε η χρωματομετρική μέθοδος Bradford ( ) με σκοπό την ποσοτικοποίηση της πρωτεΐνης. Χρησιμοποιώντας την εξίσωση ευθείας, η οποία προέκυψε από την πρότυπη καμπύλη που είχε κατασκευαστεί υπολογίστηκε ότι το επίπεδο έκφρασης της πρωτεΐνης ήταν περίπου 2,7 mg/λίτρο κυτταρικής καλλιέργειας. 104

105 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 3.3 Έκφραση του εξωκυτταρικού τμήματος της MuSK χωρίς την κυστεϊνική περιοχή (MuSK-ECD ΔFz ) στη κυτταρική σειρά ΗΕΚ293 Μετά την κατάλληλη προετοιμασία των κυττάρων ακολούθησε η επιμόλυνση ( ) με το πλασμίδιο pcdna 3.1 ( ) το οποίο περιέχει το εξωκυτταρικό τμήμα της MuSK χωρίς την κυστεϊνική περιοχή. Τα κύτταρα επωάστηκαν για 48 h σε δύο διαφορετικές θερμοκρασίες (30 ο C και 37 o C) με σκοπό την έκφραση της πρωτεΐνης στη βέλτιστη θερμοκρασία. Μετά το πέρας της επώασης, το υπερκείμενο συλλέχθηκε ( ) και ελέγχθηκε η παραγωγή της πρωτεΐνης με τη μέθοδο της ανοσοαποτύπωσης (dot blot, ) χρησιμοποιώντας το αντίσωμα αντι-myc, έναντι του c-myc επιτόπου που φέρει το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο έκφρασης, όπου φάνηκε ότι η πρωτεΐνη δεν εκφράστηκε σε καμία από τις δύο θερμοκρασίες. 3.4 Έκφραση του ολόκληρου εξωκυτταρικού τμήματος της MuSK (MuSK- ECD f ) στη κυτταρική σειρά ΗΕΚ293 Αρχικά, πραγματοποιήθηκε επιμόλυνση των κυττάρων ( ) με το πλασμίδιο pcdna 3.1 το οποίο περιέχει ολόκληρο το εξωκυτταρικό τμήμα της MuSK με τη σηματοδοτική της αλληλουχία (έχει σχεδιαστεί και κατασκευαστεί στο παρελθόν). Μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα επωάστηκαν για 48 h σε δύο διαφορετικές θερμοκρασίες (30 ο C και 37 o C) με σκοπό την βέλτιστη έκφραση της πρωτεΐνης. Μετά το πέρας της επώασης, το υπερκείμενο της καλλιέργειας συλλέχθηκε ( ) και ελέγχθηκε η παραγωγή της πρωτεΐνης με τη μέθοδο της ανοσοαποτύπωσης (dot blot, ) χρησιμοποιώντας το αντι-myc αντίσωμα, έναντι του c-myc επιτόπου που φέρει το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο έκφρασης όπου φάνηκε ότι η πρωτεΐνη εκφράζεται στους 37 ο C (Εικόνα 3.6Α). Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκαν προσπάθειες καθαρισμού της παραγόμενης πρωτεΐνης από το υπερκείμενο της καλλιέργειας χρησιμοποιώντας Ni-NTA χρωματογραφία συγγένειας ( ) αλλά τελικά δεν ήταν δυνατή η απομόνωση της πρωτεΐνης αφού σε κανένα από τα εκλούσματα ιμιδαζολίου τα οποία λήφθηκαν από τη διαδικασία δεν εμφανίστηκε η πρωτεΐνη (Εικόνα 3.6Β). Πιθανόν η πρωτεΐνη να βρίσκεται σε μία διαμόρφωση η οποία δεν αφήνει τα κατάλοιπα ιστιδίνης τα οποία 105

106 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ περιέχει να εμφανιστούν και να αναγνωριστούν από τα ιόντα νικελίου κατά τη διάρκεια της χρωματογραφίας. Α Β Εικόνα 3.6 Ανοσοαποτύπωση πρωτεϊνών υπερκειμένου καλλιεργειών κυττάρων HEK293 στους 37 o C σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης υπό μη αποδιατακτικές συνθήκες (dot blot) με τη χρήση αντι-myc αντισώματος. Α) Σε αυτή την εικόνα απεικονίζονται οι κηλίδες ανοσοαποτύπωσης με χρήση 200, 400 ή 800 μl δείγματος υπερκειμένου. Η στήλη 1 αντιπροσωπεύει υπερκείμενα καλλιεργειών κυττάρων τα οποία έχουν επιμολυνθεί με το κατάλληλο πλασμίδιο ενώ στη στήλη 2 απεικονίζονται οι αντίστοιχες ποσότητες υπερκείμενου καλλιεργειών κυττάρων τα οποία δεν έχουν επιμολυνθεί με κάποιο πλασμίδιο. Β) Ανοσοαποτύπωση των πρωτεϊνών που περιέχονται στα εκλούσματα ιμιδαζολίου τα οποία λήφθηκαν από τη χρωματογραφία συγγένειας. 3.5 Έκφραση του MuSK-ECD f στη κυτταρική σειρά COS-7 Τα κύτταρα προετοιμάστηκαν κατάλληλα και ακολούθησε επιμόλυνση ( ) με το πλασμίδιο pcdna 3.1 το οποίο περιέχει ολόκληρο το εξωκυτταρικό τμήμα της MuSK με τη σηματοδοτική της αλληλουχία (έχει σχεδιαστεί και κατασκευαστεί στο παρελθόν). 48 ώρες μετά την επιμόλυνση, το υπερκείμενο συλλέχθηκε ( ) και με τη χρήση Ni-NTA χρωματογραφία συγγένειας ( ) πραγματοποιήθηκαν προσπάθειες για την απομόνωση της παραγόμενης πρωτεΐνης. Τελικά, τα εκλούσματα μετά τον καθαρισμό ελέχθησαν με τη μέθοδο της ανοσοαποτύπωσης (dot blot, ) χρησιμοποιώντας το αντίσωμα αντι-myc, έναντι του c-myc επιτόπου που φέρει το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο έκφρασης, όπου φάνηκε ότι η πρωτεΐνη δεν υπάρχει στο υπερκείμενο της καλλιέργειας.. 106

107 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Συγχρόνως, πραγματοποιήθηκαν προσπάθειες για την σταθερή έκφραση των κυττάρων του MuSK-ECD f από κύτταρα COS-7 ( ) όπου μετά τον έλεγχο με τη μέθοδο της ανοσοαποτύπωσης (dot blot, ) όλων των κλώνων που εμφανίστηκαν στην καλλιέργεια φάνηκε ότι τελικά η πρωτεΐνη δεν εμφανίζεται στο υπερκείμενο των κυττάρων. Είναι πιθανόν, και στις δύο περιπτώσεις, η απουσία των πρωτεϊνών από το υπερκείμενο των καλλιεργειών να οφείλεται στην αδυναμία τους να πάρουν τη σωστή διαμόρφωση, η οποία θα τις καταστήσει ικανές να περάσουν στο εξωτερικό των κυττάρων. 3.6 Έκφραση του εξωκυτταρικού τμήματος της MuSK σε βακτηριακά κύτταρα E. Coli Από παλαιότερες προσπάθειες έκφρασης της MuSK-ECD f στα βακτήρια (Trakas et al., 2011) γνωρίζαμε ότι η πρωτεΐνη ανιχνεύεται σε κυτταρικά έγλειστα. Έτσι, η MuSK-ECD f απομονώθηκε υπό αποδιατακτικές συνθήκες σε 8 Μ ουρία ( 2.2.9). Για τον καθαρισμό της χρησιμοποιήθηκε Ni-NTA χρωματογραφία συγγένειας ( ), η οποία βασίζεται στην ύπαρξη της πολυ-ιστιδινικής περιοχής (6xHis) στο αμινοτελικό άκρο. Η ανάλυση της καθαρισμένης MuSK-ECD f με SDS- PAGE ( ) έδειξε ότι αποτελείται κυρίως από μία πρωτεΐνη με φαινομενικό μοριακό βάρος περίπου 55 kda (Εικόνα 3.7), παρόμοιο με αυτό που υπολογίζεται σύμφωνα με το Proteomics πρόγραμμα ExPASy, της Swiss-Prot βάσης δεδομένων. Η απόδοση της κυτταρικής καλλιέργειας σε πρωτεΐνη ήταν περίπου 14 mg/λίτρο καλλιέργειας. 107

108 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Εικόνα 3.7 SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση των πρωτεΐνών των κλασμάτων έκλουσης (1-4) τα οποία λήφθηκαν χρησιμοποιώντας διαβαθμιζόμενες συγκεντρώσεις ιμιδαζολίου Χρήση της βακτηριακής MuSK-ECD f στην αντιγονοειδική θεραπευτική προσέγγιση για τη μυασθένεια: Πείραμα ανταγωνισμού Αρχικά, για να διαπιστωθεί αν η πρωτεΐνη που παράχθηκε στα βακτηριακά κύτταρα είναι κατάλληλη για να χρησιμοποιηθεί σε πειράματα ανάπτυξης θεραπείας για την MuSK-μυασθένεια, πραγματοποιήθηκε ένα προκαταρκτικό πείραμα στο οποίο δοκιμάστηκε αν η συγκεκριμένη πρωτεΐνη μπορεί να δεσμεύσει MuSK αντισώματα από ορούς MuSK-μυασθενών τα οποία προσδένονται με την εμπορικά διαθέσιμη 125 I-MuSK, η οποία εκφράζεται σε COS7 κύτταρα (Matthews et al., 2004). Έτσι, 1 μg της βακτηριακής MuSK-ECD f, προ-επωάστηκε για 30 λεπτά στους 4 ο C με 5 fmoles τριών ορών MuSK-μυασθενών και στη συνέχεια, προστέθηκαν cpm 125 I-MuSK εκφρασμένης σε COS7 κύτταρα και ακολούθησε RIA ( ) για να υπολογιστεί το ποσοστό αναστολής δέσμευσης της 125 I-MuSK. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 3.8, η βακτηριακή MuSK-ECD f, αναστέλλει αποτελεσματικά τη δέσμευση των αντισωμάτων από την εμπορική 125 Ι-σημασμένη MuSK και για τους τρεις ορούς, οπότε το καθιστά πιθανό για χρήση σε θεραπευτικούς σκοπούς. 108

109 % Αναστολή δέσμευσης αντισωμάτων ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ MuSK-MG οροί Εικόνα 3.8: Ανταγωνισμός μεταξύ του εκφρασμένου σε E.Coli MuSK-ECD f και της σημασμένης με 125 I-MuSK, εκφρασμένης σε COS7 κύτταρα. 1 μg της βακτηριακής MuSK-ECD f, προ-επωάστηκε με τρεις ορούς MuSK-μυασθενών γνωστού τίτλου αντισωμάτων και στη συνέχεια, προστέθηκε 125 I-MuSK εκφρασμένης σε COS7 κύτταρα και ακολούθησε RIA για να υπολογιστεί το ποσοστό αναστολής δέσμευσης της 125 I-MuSK Χρήση της βακτηριακής MuSK-ECD f στην αντιγονοειδική θεραπευτική προσέγγιση για τη μυασθένεια: Ανοσοπροσρόφηση των MuSK αντισωμάτων από ορούς MuSK-μυασθενών Το επόμενο βήμα ήταν η ακινητοποίηση της βακτηριακής MuSK-ECD f σε σφαιρίδια σεφαρόζης ( ) για τη δοκιμή της ικανότητας της να αφαιρεί MuSK αντισώματα από ορούς MuSK-μυασθενών. Σταθερή ποσότητα ακινητοποιημένης MuSK (1 μg) επωάστηκε με σταθερό όγκο ορού MuSK-μυασθενών με γνωστή ποσότητα MuSK αντισωμάτων (20 fmol, ). Μετά το τέλος της επώασης ακολούθησε RIA των MuSK αντισωμάτων ( ) τα οποία δεν δεσμεύτηκαν στην ακινητοποιημένη πρωτεΐνη και παρέμειναν στο υπερκείμενο. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 3.9, η ακινητοποιημένη MuSK-ECD f ανοσοπροσροφά MuSK αντισώματα από όλους τους ορούς αλλά τα ποσοστά μεταξύ των ορών κυμαίνονται σημαντικά από 45% έως 95%. Αν και τα ποσοστά των 109

110 % Aνοσοπροσρόφηση ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ανοσοπροσροφήσεων δεν είναι πολύ ευνοϊκά για όλους τους ορούς, παρ όλα αυτά προχωρήσαμε στη τιτλοδότηση των στηλών MuSK-MG οροί Εικόνα 3.9: Ανοσοπροσρόφηση των MuSK αντισωμάτων από 11 ορούς MuSKμυασθενών χρησιμοποιώντας τη βακτηριακή MuSK-ECD f πρωτεΐνη. Σταθερή ποσότητα ακινητοποιημένης MuSK (1 μg) επωάστηκε με σταθερό όγκο ορού MuSKμυασθενών με γνωστή ποσότητα MuSK αντισωμάτων (20 fmol). Μετά το τέλος της επώασης, τα MuSK αντισωμάτα τα οποία δεν δεσμεύτηκαν στην ακινητοποιημένη πρωτεΐνη και παρέμειναν στο υπερκείμενο, μετρήθηκαν με RIA και υπολογίστηκε το ποσοστό ανοσοπροσρόφησης Τιτλοδότηση των στηλών ανοσοπροσρόφησης Ο σκοπός παρασκευής των στηλών ανοσοπροσρόφησης είναι να χρησιμοποιηθούν για την αντιγονοειδική θεραπεία της MuSK μυασθένειας. Για τον υπολογισμό της ποσότητας της πρωτεΐνης που απαιτείται για τον καθαρισμό του πλάσματος ενός MuSK-μυασθενούς σε μία συνεδρία ανοσοπροσρόφησης, μετρήθηκε η μέγιστη χωρητικότητα της στήλης με τη βακτηριακή MuSK-ECD f πρωτεΐνη. Έτσι, 1 μg του βακτηριακού MuSK-ECD f ανοσοπροσροφητή επωάστηκε για 2h στους 4 ο C χρησιμοποιώντας αυξανόμενες ποσότητες ορού MuSK-μυασθενών. Η Εικόνα 3.10 δείχνει ότι ο MuSK-ECD f ανοσοπροσροφητής εκφρασμένος σε βακτηριακά κύτταρα δεν έχει την δυνατότητα να αφαιρεί μεγάλες ποσότητες 110

111 % Ανοσοπροσρόφηση ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ αντισωμάτων από τον ορό MuSK-μυασθενών οπότε δεν είναι κατάλληλος για χρήση στην αντιγονο-ειδική θεραπεία για τη MuSK μυασθένεια MG αντισώματα (fmol) Εικόνα 3.10 Τιτλοδότηση της βακτηριακής MuSK-ECD f στήλης. Το ακινητοποιημένο ECD (1 μg) επωάστηκε με αυξανόμενες ποσότητες ορού MuSK-μυασθενούς για 2h στους 4 ο C. Τα υπερκείμενα μετά την επώαση εξετάστηκαν με RIA για τη μέτρηση των μη δεσμευμένων MuSK αντισωμάτων και υπολογίστηκε το ποσοστό ανοσοπροσρόφησης υπολογίζοντας τελικά την ποσότητα των MuSK αντισωμάτων τα οποία μπορούν να αφαιρεθούν από 1 μg ακινητοποιημένης πρωτεΐνης. 3.7 Χρήση των MuSK-ECD f και MuSK-ECD ΔFz πρωτεϊνών από καλλιέργειες P.pastoris στην αντιγονοειδική θεραπευτική προσέγγιση για τη μυασθένεια Ανοσοπροσρόφηση των MuSK αντισωμάτων από ορούς MuSK-μυασθενών Ένας από τους κύριους σκοπούς της έκφρασης των δύο πρωτεϊνών είναι η χρήση τους στην ανάπτυξη μιας θεραπευτικής προσέγγισης για τη μυασθένεια, η οποία αφορά στην ειδική απομάκρυνση των MuSK αντισωμάτων από ορούς MuSKμυασθενών. Η ικανότητα ακινητοποιημένης MuSK-ECD f να δεσμεύει MuSK αντισώματα έχει δειχθεί από προηγούμενες μελέτες στο εργαστήριο (Trakas et al., 2011). Με πειράματα ανοσοπροσρόφησης αποδείχθηκε η ικανότητα της MuSK- ECD ΔFz να απορροφά MuSK αντισώματα. Στη συνέχεια, ελέγχθηκε η δυνατότητα αφαίρεσης των MuSK αντισωμάτων από έναν σχετικά μεγάλο αριθμό ορών MuSK-μυασθενών χρησιμοποιώντας τους δύο ανοσοπροσροφητές. Για το λόγο αυτό, οι ανοσοπροσροφητές επωάστηκαν με 111

112 % Ανοσοπροσρόφηση ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ σταθερού όγκου ορό MuSK-μυασθενών με γνωστή ποσότητα MuSK αντισωμάτων (20 fmol, ). Αφού οι οροί επωάστηκαν με MuSK-ECD f ή MuSK-ECD ΔFz ή BSA (αρνητικός ανοσοπροσροφητής) ακινητοποιημένα σε σφαιρίδια σεφαρόζης, ακολούθησε ραδιοανοσοπροσδιορισμός των MuSK αντισωμάτων (RIA, ), τα οποία παρέμειναν στο υπερκείμενο αφού δεν δεσμεύτηκαν στην ακινητοποιημένη πρωτεΐνη. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 3.11, η ακινητοποιημένη MuSK-ECD f πρωτεΐνη είναι σε θέση να αφαιρεί σχεδόν όλα τα MuSK αντισώματα (98%) από τους 24 ορούς MuSK-μυασθενών. Η MuSK-ECD ΔFz πρωτεΐνη αφαιρεί περίπου το 88% των MuSK αντισωμάτων από τους ίδιους ορούς, αποκαλύπτοντας την μεγαλύτερη αντιγονικότητα του MuSK-ECD f ανοσοπροσροφητή. Αξίζει να σημειωθεί, πως στο 50% των ορών που ελέγχθηκαν με τον ανοσοπροσροφητή MuSK-ECD ΔFz (12/24), το ποσοστό ανοσοπροσρόφησης των αντισωμάτων ξεπερνά το 80% ενώ μόνο στο 4% των ορών (1/24) το ποσοστό ανοσοπροσρόφησης των αντισωμάτων είναι μικρότερο του 60%, δείχνοντας την εξίσου υψηλή αντιγονικότητα του MuSK-ECD ΔFz ανοσοπροσροφητή στην πλειοψηφία των ορών των MuSK-μυασθενών MuSK-ECDf f MuSK-ECDΔFz ΔFz Οροί MuSK-μυασθενών Εικόνα 3.11 Ανοσοπροσρόφηση των MuSK αντισωμάτων από 24 ορούς MuSKμυασθενών χρησιμοποιώντας τους ανοσοπροσροφητές MuSK-ECD f και MuSK-ECD ΔFz. Σταθερή ποσότητα ακινητοποιημένης MuSK (1 μg) επωάστηκε με σταθερό όγκο ορού MuSK-μυασθενών με γνωστή ποσότητα MuSK αντισωμάτων (20 fmol). Μετά το τέλος της επώασης ακολούθησε RIA των MuSK αντισωμάτων τα οποία δεν δεσμεύτηκαν στην ακινητοποιημένη πρωτεΐνη και παρέμειναν στο υπερκείμενο και υπολογίστηκε το ποσοστό ανοσοπροσρόφησης. 112

113 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε ο καθορισμός της υπόταξης των αντισωμάτων τα οποία προσδένονται στις ακινητοποιημένες πρωτεΐνες. Μετά από αντίδραση ανοσοπροσρόφησης με τους δύο ανοσοπροσροφητές, τα δεσμευμένα MuSK αντισώματα απομονώθηκαν με την εφαρμογή χαμηλού ph στα σφαιρίδια σεφαρόζης ( ) και με RIA καθορίστηκε η υπόταξη στην οποία ανήκουν ( ). Επίσης, με RIA προσδιορίστηκε η υπόταξη των αντισωμάτων τα οποία δεν αναγνωρίζονται από τον MuSK-ECD ΔFz ανοσοπροσροφητή αλλά παραμένουν στο υπερκείμενο μετά την αντίδραση ανοσοπροσρόφησης ( ). Όπως φαίνεται στον Πίνακα 3.1, τα MuSK αντισώματα τα οποία υπάρχουν στον ορό των MuSKμυασθενών ανήκουν στην IgG4 υπόταξη. Επίσης, τα MuSK αντισώματα τα οποία αναγνωρίζονται και δεσμεύονται από τους δύο ανοσοπροσροφητές ανήκουν στην IgG4 υπόταξη. Τέλος, τα αντισώματα τα οποία δεν αφαιρούνται από τον ορό των MuSK-μυασθενών από τον MuSK-ECD ΔFz ανοσοπροσροφητή ανήκουν εξίσου στην IgG4 υπόταξη, δείχνοντας ότι η κυστεϊνική περιοχή που λείπει από τον MuSK- ECD ΔFz ανοσοπροσροφητή είναι επίσης ανοσογόνος για IgG4 αντισώματα. Πίνακας 3.1 Καθορισμός της υποτάξης των MuSK αντισωμάτων Είδος αντισωμάτων IgG1 (% συνολικών IgG) IgG2 (% συνολικών IgG) IgG3 (% συνολικών IgG) IgG4 (% συνολικών IgG) MuSK αντισώματα ορού MuSK-μυασθενούς Απομονωμένα αντισώματα με τον MuSK-ECD f ανοσοπροσροφητή Απομονωμένα αντισώματα με τον MuSK-ECD ΔFz ανοσοπροσροφητή Αντισώματα από το υπερκείμενο ανοσοπροσρόφησης με τον MuSK-ECD ΔFz ανοσοπροσροφητή

114 % μη προσροφημένα αντισώματα ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Χαρακτηρισμός των στηλών MuSK-ECD f και MuSK-ECD ΔFz Ειδικότητα των στηλών ανοσοπροσρόφησης Η ειδικότητα των στηλών ελέγχθηκε με βάση την ικανότητα τους να ανοσοπροσροφούν εκτός από MuSK αντισώματα και άλλους τύπους αντισωμάτων όπως nachr και LRP4 αντισώματα. Για αυτό το λόγο, ένας ορός MuSK-μυασθενούς και δύο οροί AChR-μυασθενών (20 fmoles αντισωμάτων) επωάστηκαν με τον κάθε έναν από τους δύο ανοσοπροσροφητές (1 μg) στους 4 ο C για 2h ( ). Μετά το τέλος της επώασης, τα υπερκείμενα των αντιδράσεων ανοσοπρορόφησης ελέγχθηκαν με RIA ( ) για MuSK και nachr αντισώματα, αντίστοιχα. Το υπερκείμενο των ανοσοπροσροφήσεων με MuSK ορό χρησιμοποιήθηκε για τον έλεγχο της λειτουργίας της αντίδρασης ανοσοπροσρόφησης. Αν οι MuSK-ECD ανοσοπροσροφητές προσδένουν μη ειδικά αντισώματα τότε θα εμφανιστεί μείωση των αντισωμάτων στους επωασμένους nachr ορούς σε σύγκριση με τους ίδιους ορούς που έχουν επωαστεί με ακινητοποιημένο BSA. Όπως φαίνεται στην εικόνα 3.12, δεν παρατηρείται ανοσοπροσρόφηση nachr αντισωμάτων από τους MuSK- ECD ανοσοπροσροφητές Πριν την ανοσοπροσρόφηση Μετά την ανοσοπροσρόφηση MuSK-MG AChR-MG 1 AChR-MG 2 Οροί MuSK-μυασθενών Εικόνα 3.12 Ειδικότητα των MuSK-ECD στηλών. Ένας γνωστός ορός MuSK-μυασθενούς (θετικό control) και δύο οροί nachr-μυασθενών επωάστηκαν με τον MuSK-ECD f ανοσοπροσροφητή και τα αντίστοιχα υπερκείμενα ελέγχθηκαν με RIA για MuSK και nachr αντισώματα, αντίστοιχα. Τα αποτελέσματα ήταν ίδια για τον MuSK-ECD ΔFz ανοσοπροσροφητή. 114

115 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Επιπλέον, ο έλεγχος συνεχίστηκε με επώαση δύο διπλά-θετικών ορών σε MuSK και LRP4 αντισώματα με τις στήλες ανοσοπροσρόφησης και στη συνέχεια τα υπερκείμενα των αντιδράσεων ελέγχθηκαν αφ ενός με RIA ( ) για την ανίχνευση των MuSK αντισωμάτων και αφ ετέρου με μία τεχνική βασισμένη σε κύτταρα (Zisimopoulou et al., 2013) για την ανίχνευση των LRP4 αντισωμάτων. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ενώ όλα τα MuSK αντισώματα αφαιρούνται απο τον ορό, τα LRP4 αντισώματα παραμένουν στον ορό μετά την επώαση με τους ανοσοπροσροφητές (τα αποτελέσματα δεν δείχνονται). Τα παραπάνω αποτελέσματα επιβεβαιώνουν ότι και οι δύο ανοσοπροσροφητές είναι ειδικοί για τα MuSK αντισώματα Χρόνος επώασης για την αφαίρεση των MuSK-αντισωμάτων Για τον υπολογισμό του χρόνου που απαιτείται από τους ανοσοπροσροφητές για την αφαίρεση των MuSK αντισωμάτων, πραγματοποιήθηκε αντίδραση ανοσοπροσρόφησης ( ), με ορούς MuSK-μυασθενών για διαφορετικές χρονικές περιόδους σε θερμοκρασία δωματίου. Για το συγκεκριμένο πείραμα, χρησιμοποιήθηκαν οροί MuSK-μυασθενών για τους οποίους σε προηγούμενα πειράματα παρατηρήθηκε ότι μπορούν να αφαιρεθούν από τους MuSK-ECD ανοσοπροσροφητές σχεδόν όλα τα MuSK αντισώματα. Από την Εικόνα 3.13 φαίνεται ότι ο η αφαίρεση των MuSK αντισωμάτων από τον MuSK-ECD f ανοσοπροσροφητή φτάνει στο 61% στα πρώτα έξι λεπτά της αντίδρασης και πρακτικά ολοκληρώνεται μετά από είκοσι λεπτά. Όσον αφορά τον MuSK-ECD ΔFz ανοσοπροσροφητή, η αφαίρεση των MuSK αντισωμάτων φτάνει στο 76% στα πρώτα έξι λεπτά της αντίδρασης και πρακτικά ολοκληρώνεται μετά από δέκα λεπτά. Τα παραπάνω πειράματα δείχνουν ότι η αφαίρεση των MuSK αντισωμάτων είναι αρκετά γρήγορη και επιπλέον, λιγότερος χρόνος απαιτείται όταν χρησιμοποιείται ο MuSK-ECD ΔFz ανοσοπροσροφητής. 115

116 % Ανοσοπροσρόφηση ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ MuSK-ECDf f MuSK-ECDΔFz Χρόνος επώασης (min) Εικόνα 3.13 Χρόνος επώασης κατά την αντίδραση ανοσοπροσρόφησης. Οι MuSK-ECD f και MuSK-ECD ΔFz ανοσοπροσροφητές επωάστηκαν με 20 fmol MuSK αντισωμάτων για διαφορετικές χρονικές περιόδους (2-120 λεπτά) σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά από κάθε χρονική στιγμή, η ανοσοπροσρόφηση υπολογίστηκε με RIA Τιτλοδότηση των στηλών ανοσοπροσρόφησης Για τον υπολογισμό της ποσότητας της πρωτεΐνης που απαιτείται για τον καθαρισμό του πλάσματος ενός ασθενούς σε μία συνεδρία ανοσοπροσρόφησης, μετρήθηκε η μέγιστη χωρητικότητα του κάθε ανοσοπροσροφητή. Έτσι, 1 μg από τον κάθε ανοσοπροσροφητή επωάστηκε για 2h στους 4 ο C χρησιμοποιώντας αυξανόμενες ποσότητες ορού κουνελιού θετικό σε MuSK αντισώματα ( ). Οι οροί κουνελιών χρησιμοποιήθηκαν σε αυτά τα πειράματα διότι έχουν πολύ μεγαλύτερο τίτλο από τους ανθρώπινους και επιπλέον, υπάρχουν σε μεγαλύτερες ποσότητες. 116

117 % Ανοσοπροσρόφηση Δεσμευμένα αντισώματα (pmol) % Ανοσοπροσρόφηση Δεσμευμένα αντισώματα (pmol) ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ A Τιτλοδότηση MuSK-ECD f ανοσοπροσροφητή % Ανοσοπροσρόφηση 4 10 Δεσμευμένα αντισώματα , MuSK αντισώματα (pmol) B Τιτλοδότηση MuSK-ECD ΔFz ανοσοπροσροφητή % Ανοσοπροσρόφηση Δεσμευμένα αντισώματα , MuSK αντισώματα (pmol) Εικόνα 3.14 Τιτλοδότηση του (A) MuSK-ECD f και (B) MuSK-ECD ΔFz ανοσοπροσροφητή. Τα ακινητοποιημένα ECD (1 μg) επωάστηκαν με αυξανόμενες ποσότητες ορού κουνελιού θετικού σε MuSK αντισώματα για 2h στους 4 ο C. Το ποσοστό της ανοσοπροσρόφησης δείχνεται με κόκκινη γραμμή ενώ με γκρι γραμμή δείχνεται η δέσμευση των MuSK αντισωμάτων του ορού σε pmol. Η Εικόνα 3.14 δείχνει ότι ο MuSK-ECD f ανοσοπροσροφητής δεσμεύει τουλάχιστον 17 pmol MuSK αντισωμάτων ενώ ο MuSK-ECD ΔFz ανοσοπροσροφητής 117

118 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ αφαιρεί τουλάχιστον 27 pmol MuSK αντισωμάτων. Αφού ο τίτλος αντισωμάτων των MuSK-μυασθενών είναι σχετικά χαμηλός, από τα παραπάνω πειράματα υπολογίζεται ότι 1.7 mg MuSK-ECD f ή 1.1 mg MuSK-ECD ΔFz θα επαρκούσαν για το καθαρισμό τριών λίτρων πλάσματος ενός MuSK-μυασθενούς με έναν μέσο τίτλο αντισωμάτων 10 nm Ανακύκλωση ανοσοπροσροφητών Σκοπός των παρακάτω πειραμάτων είναι να καθοριστεί αν οι ανοσοπροσροφητές μπορούν να επαναχρησιμοποιηθούν. Επωάστηκαν 17 και 27 pmol MuSK αντισωμάτων από ορό κουνελιού θετικό σε MuSK αντισώματα με 1 μg από τον κάθε ανοσοπροσροφητή για 2h στους 4 ο C. Οι ποσότητες αντισωμάτων που χρησιμοποιήθηκαν προσεγγίζουν τη μέγιστη χωρητικότητα των στηλών όπως αυτή υπολογίστηκε στην παράγραφο Στη συνέχεια, τα αντισώματα αποκολλήθηκαν από τις στήλες με 0,2 Μ διάλυμα γλυκίνης, ph 2,4 ( ) και οι ανοσοπροσροφητές χρησιμοποιήθηκαν ξανά. Η ίδια διαδικασία επαναλήφθηκε άλλες οχτώ και έξι φορές για τον MuSK-ECD f και τον MuSK-ECD ΔFz ανοσοπροσροφητή, αντίστοιχα. Μετά από κάθε επώαση, ένα κλάσμα από το υπερκείμενο ελέγχονταν με RIA ( ). Όπως φαίνεται στην Εικόνα 3.15, και οι δύο στήλες μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τουλάχιστον 3 φορές χωρίς απώλεια ανοσοπροσρόφησης αντισωμάτων. Επιπλέον, η MuSK-ECD στήλη μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τουλάχιστον 7 κύκλους ανοσοπροσρόφησης χωρίς σημαντική απώλεια της ιδιότητας της να ανοσοπροσροφά MuSK αντισώματα. 118

119 % Ανοσοπροσρόφηση ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ MuSK-ECDf f 10 MuSK-ECDΔFz ΔFz Συνεχείς αντιδράσεις ανοσοπροσρόφησης Εικόνα 3.15 Ανακύκλωση των στηλών ανοσοπροσρόφησης. 1 μg ακινητοποιημένων MuSK-ECD f και MuSK-ECD ΔFz επωάστηκαν στους 4 o C για 2h με 17 και 27 pmol MuSK αντισωμάτων, αντίστοιχα. Τα δεσμευμένα αντισώματα αφαιρέθηκαν από τις στήλες με 0,2 M διάλυμα γλυκίνης ph 2.4 και οι ανοσοπροσροφητές επαναχρησιμοποιήθηκαν κάτω από τις ίδιες συνθήκες. Τα MuSK αντισώματα τα οποία παρέμειναν στον ορό σε κάθε στάδιο ελέγχθηκαν με RIA και υπολογίστηκε το ποσοστό των αντισωμάτων που ανοσοπροσροφήθηκαν Σταθερότητα των ανοσοπροσροφητών κατά τη διάρκεια της αντίδρασης ανοσοπροσρόφησης Μία σημαντική παράμετρος, η οποία έπρεπε να μελετηθεί είναι η αντοχή των στηλών ανοσοπροσρόφησης κατά τη διάρκεια της διαδικασίας αφαίρεσης αντισωμάτων. Η απελευθέρωση οποιουδήποτε τμήματος MuSK πρωτεΐνης η οποία θα μπορούσε να ελευθερωθεί στο πλάσμα του ασθενούς και να εισαχθεί με αυτόν τον τρόπο στον οργανισμό, θα μπορούσε να δράσει ως πιθανό αντιγόνο. Αρχικά, τα ECDs σημάνθηκαν με 125 Ι με τη μέθοδο της χλωραμίνης Τ ( ) και ακινητοποιήθηκαν σε σφαιρίδια σεφαρόζης ( ). Ένας ορός MuSK-μυασθενούς επωάστηκε με τα ακινητοποιημένα 125 Ι-ECDs για 2h και 16h στους 4 ο C, 25 ο C και 37 ο C ( ). Όπως παρατηρείται στον Πίνακα 3.2, για κανέναν από τους δύο ανοσοπροσροφητές, δεν απελευθερώνεται σημαντικό ποσό ραδιοενεργότητας στο υπερκείμενο. Επίσης, η ραδιοενεργότητα των σφαιριδίων σεφαρόζης δεν μειώνεται ειδικά μετά τη δίωρη επώαση με τον ορό στους 37 ο C, η 119

120 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ οποία προσομοιάζει τις πραγματικές συνθήκες τις συγκεκριμένης θεραπευτικής προσέγγισης. Πίνακας 3.2 Σταθερότητα των ανοσοπροσροφητών κατά τη διάρκεια αντίδρασης ανοσοπροσρόφησης MuSK-ECD f % Ελεύθερη ραδιοενεργότητα MuSK-ECD ΔFz % Ελεύθερη ραδιοενεργότητα 2h 4 o C h 25 o C h 37 o C h 4 o C h 25 o C h 37 o C *Ακινητοποιημένα 125 I-MuSK-ECD f και 125 I-MuSK-ECD ΔFz επωάστηκαν με 120 μl MuSK- MG πλάσμα για διάφορες χρονικές περιόδους σε διαφορετικές θερμοκρασίες. Έπειτα, τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν και η ελεύθερη ραδιοενεργότητα μετρήθηκε σε γ-μετρητή Σταθερότητα του MuSK-ECD f ανοσοπροσροφητή κατά την αποθήκευσή του Στη συνέχεια, έπρεπε να ελεγχθεί η σταθερότητα των στηλών κατά τη διάρκεια της αποθήκευσής τους. Αν και οι στήλες δεν είναι παρασκευασμένες σε στείρες συνθήκες, θα μπορούσαμε σε αυτό το σημείο, να μετρήσουμε την αποκόλληση της MuSK-ECD f πρωτεΐνης από τα σφαιρίδια σεφαρόζης με ή χωρίς την προσθήκη συντηρητικών. Αρχικά, η MuSK-ECD f πρωτεΐνη σημάνθηκε με 125 Ι με τη μέθοδο της χλωραμίνης Τ ( ) και ακινητοποιήθηκε σε σφαιρίδια σεφαρόζης ( ). Τα σφαιρίδια χωρίστηκαν σε 7 διαφορετικές ομάδες. Στην πρώτη ομάδα τα beads αποθηκεύτηκαν χρησιμοποιώντας PBS και όχι το διάλυμα που συνήθως χρησιμοποιείται ( ). Στις υπόλοιπες 6 ομάδες χρησιμοποιήθηκε το σύνηθες διάλυμα αποθήκευσης αλλά σε όλες εκτός από μία προστέθηκε κάποιο συντηρητικό σε διαφορετική συγκέντρωση κάθε φορά. Τα Thiomersal και 2-Phenoxyethanol ήταν τα δύο συντηρητικά που προστέθηκαν για την προστασία των στηλών από διάφορους μικροοργανισμούς κατά τη διάρκεια της αποθήκευσης τους. Τα δύο αυτά 120

121 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ συντηρητικά επιλέχθηκαν εξαιτίας της ασφαλής χρήσης τους για τον ίδιο λόγο σε έναν μεγάλο αριθμό εμβολίων και άλλων προϊόντων. Τα σφαιρίδια με τον ανοσοπροσροφητή αποθηκεύτηκαν για περίπου 6 μήνες στους 4 o C. Ανά τακτά χρονικά διαστήματα μέρος των σφαιριδίων επιλέγονταν για τη μέτρηση και τον υπολογισμό της αποκόλλησης μετρώντας την 125 I-σημασμένη MuSK η οποία βρισκόταν στο υπερκείμενο των σφαιριδίων. Εικόνα 3.16 Σταθερότητα του MuSK-ECD f ανοσοπροσροφητή στα σφαιρίδια σεφαρόζης κατά την αποθήκευση του. Ακινητοποιημένα 125 I-MuSK-ECD f με ή χωρίς την προσθήκη συντηρητικού αποθηκεύτηκαν στους 4 o C για 25 εβδομάδες. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 3.16, η μικρότερη αποκόλληση (3,3%) μετά από την αποθήκευση των σφαιριδίων για περίπου 6 μήνες παρατηρείται με την προσθήκη του συντηρητικού Thiomersal σε συγκέντρωση 0,01% στο διάλυμα. Αυτό το αποτέλεσμα είναι εξαιρετικά σημαντικό αφού θα δώσει τη δυνατότητα της χρήσης της στήλης για αρκετές συνεδρίες μέσα σε ένα μεγάλο χρονικό διάστημα, μειώνοντας αρκετά το κόστος της θεραπείας για τον ασθενή. 121

122 % Ανοσοπροσρόφηση ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Πειράματα ανοσοπροσρόφησης σε μέτρια κλίμακα Για να ελέγξουμε την ικανότητα των δύο ανοσοπροσροφητών να αφαιρούν MuSK αντισώματα σε μεγαλύτερες ποσότητες πλάσματος, χρησιμοποιήθηκαν γυάλινες στήλες οι οποίες οι οποίες περιείχαν πακεταρισμένα σφαιρίδια σεφαρόζης με 0,5 mg ακινητοποιημένα ECDs (αντιστοιχούν σε ~150 μl σε όγκο). Πιο αναλυτικά, πλάσμα γνωστού τίτλου αντισωμάτων (12 nm) περνούσε μέσα από τη εκάστοτε στήλη και συλλέγονταν κλασματικά τα εκλούσματα του πλάσματος από τη στήλη. Χρησιμοποιώντας τη μέθοδο RIA υπολογίστηκε η αρχική ποσότητα αντισωμάτων στο πλάσμα, και στη συνέχεια το ποσοστό ανοσοπροσρόφησης των κλασμάτων της έκλουσης του πλάσματος από την κάθε στήλη. Συνολικά, περάστηκαν 24 και 36 ml πλάσματος από τις MuSK-ECD f και MuSK-ECD ΔFz στήλες, αντίστοιχα MuSK-ECDf f MuSK-ECDΔFz ΔFz Πλάσμα MuSK-μυασθενούς (ml) Εικόνα 3.17 Πειράματα ανοσοπροσρόφησης σε μέτρια κλίμακα. 24 και 36 ml πλάσμα MuSK-μυασθενούς περάστηκαν από MuSK-ECD f ή MuSK-ECD ΔFz στήλες, αντίστοιχα. Τα ποσοστά των ανοσοπροσροφήσεων προσδιορίστηκαν με RIA. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 3.17, ο MuSK-ECD f ανοσοπροσροφητής μπορεί να αφαιρέσει περισσότερα από 80% των MuSK αντισωμάτων για τα πρώτα 15 ml πλάσματος MuSK-μυασθενούς και περισσότερα από 70% για άλλα 10 ml πλάσματος MuSK-μυασθενούς. Ο MuSK-ECD ΔFz ανοσοπροσροφητής μπορεί να αφαιρέσει περισσότερα από 80% των MuSK αντισωμάτων για τα πρώτα 9 ml πλάσματος MuSK-μυασθενούς και περισσότερα από 70% για άλλα 21 ml πλάσματος MuSK- 122

123 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ μυασθενούς. Από το παραπάνω πείραμα προκύπτει ότι οι δύο ανοσοπροσροφητές είναι σε θέση να αφαιρούν MuSK αντισώματα από το πλάσμα MuSK-μυασθενών ακόμα και μετά την επαφή τους με αυτό για ελάχιστα δευτερόλεπτα. Το αποτέλεσμα αυτό κατέστησε δυνατή τη χρήση των στηλών ανοσοπροσρόφησης στα πειράματα που ακολουθούν τα οποία απαιτούσαν καθαρισμό σχετικά μεγάλων ποσοτήτων πλάσματος από MuSK αντισώματα Ex vivo πειράματα ανοσοπροσρόφησης Πειράματα ανοσοπροσρόφησης πραγματοποιήθηκαν σε θηλυκά κουνέλια New Zealand με σκοπό την έλεγχο της επίτευξης της θεραπευτικής προσέγγισης η οποία προτείνεται αλλά κυρίως, τον έλεγχο της τοξικότητας του MuSK-ECD f ανοσοπροσροφητή. Αρχικά, τα κουνέλια ανοσοποιήθηκαν είτε με ανθρώπινη MuSK- ECD f πρωτεΐνη είτε με PBS ( ). Μετά από μετρήσεις με RIA ( ) όλα τα ζώα εμφάνισαν MuSK αντισώματα μετά τη πρώτη αναμνηστική ένεση. Επιπλέον, παρατηρήθηκαν συμπτώματα μυασθένειας (μυϊκή και αναπνευστική αδυναμία) μετά την τέταρτη αναμνηστική ένεση (Εικόνα 3.18). Εικόνα 3.18 Συμπτωματικό-ανοσοποιημένο κουνέλι με MuSK-ECD f Για την διεξαγωγή του πειράματος ανοσοπροσρόφησης ( ), τα κουνέλια αναισθητοποιήθηκαν και 45 ml αίματος συλλέχθηκαν από την κεντρική αρτηρία του αυτιού. Στη συνέχεια, το αίμα διαχωρίστηκε σε πλάσμα και κύτταρα αίματος και το κλάσμα του πλάσματος, με τίτλο MuSK αντισωμάτων 40 nm, περάστηκε από MuSK- ECD f στήλη ανοσοπροσρόφησης. Μετά την αφαίρεση των MuSK αντισωμάτων από το πλάσμα μέσω της στήλης ανοσοπροσρόφησης, το καθαρισμένο πλάσμα, με τίτλο MuSK αντισωμάτων 3 nm, αναμείχθηκε με τα κύτταρα του αίματος και όλο το μείγμα επιστράφηκε στο ζώο μέσω της σύγχρονης χορήγησης φυσιολογικού ορού 123

124 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ από την φλέβα του αυτιού (Εικόνα 3.19). Η ίδια διαδικασία πραγματοποιήθηκε και σε μη ανοσοποιημένο κουνέλι το οποίο χρησιμοποιήθηκε ως control. ~ 100% αφαίρεση MuSK αααντιαντισ ωμάτων Εικόνα 3.19 Σχηματική αναπαράσταση του πειράματος ανοσοπροσρόφησης στα κουνέλια. Την ημέρα του πειράματος ανοσοπροσρόφησης, καθώς και 8 ημέρες αργότερα, πραγματοποιήθηκε λήψη αίματος από τα κουνέλια τα οποία είχαν υποβληθεί στη διαδικασία με σκοπό μετρήσεις οι οποίες αντιστοιχούν σε δείκτες φλεγμονής (λευκά αιμοσφαίρια, C-αντιδρώσα πρωτεΐνη), δείκτες ηπατικής λειτουργίας (γαμα-γλουταμυλοτρανσφεράση, οξαλική αμινοτρανσφεράση, πυροσταφυλική τρανσαμινάση) αλλά και μετρήσεις ενζύμων τα οποία σχετίζονται με μυϊκές λειτουργίες (γαλακτική αφυδρογονάση, κρετινική κινάση). Στο ανοσοποιημένο ζώο δεν παρατηρήθηκαν διαφορές πριν και μετά το πείραμα ανοσοπροσρόφησης, με το ίδιο αποτέλεσμα να επαναλαμβάνεται και στο control κουνέλι. Επιπλέον, εκτός από τον αιματολογικό έλεγχο, τις ίδιες ημέρες πραγματοποιήθηκαν μετρήσεις θερμοκρασίας και βάρους των κουνελιών τα οποία υποβλήθηκαν στη διαδικασία αφού θα μπορούσαν να υποδηλώσουν κάποια κακή επίδραση του ανοσοπροσροφητή στα ζώα αλλά όπως και παραπάνω, το πείραμα ανοσοπροσρόφησης δεν επηρέασε καθόλου τα κουνέλια. Όλα τα αποτελέσματα φαίνονται στους Πίνακες 3.3α και 3.3β επιβεβαιώνοντας ότι η διαδικασία δεν εμφανίζει καμία τοξική επίδραση στα κουνέλια. 124