3.5.4 Ο αυξητικός παράγοντας BMP Ο αυξητικός παράγοντας FGF Αυξητικός παράγοντας PDGF (Platelet Derived Growth Factor)...

Transcript

1 Ευχαριστίες Θα ήθελα να ευχαριστήσω τον επιβλέποντα καθηγητή Κο Χριστόφορο Προβατίδη για την αμέριστη υποστήριξη που μου προσέφερε και τις πολύτιμες γνώσεις που μου μετέδωσε κατά την εκπόνηση της Μεταπτυχιακής Διατριβής. Επίσης, θα ήθελα να ευχαριστήσω την οικογένεια μου που με στήριξαν με τον καλύτερο δυνατό τρόπο κατά την διάρκεια του μεταπτυχιακού. Τέλος, θα ήθελα να εκφράσω ένα μεγάλο ευχαριστώ, στους πολύ καλούς φίλους και συναδέλφους από την πρώτη μου δουλειά,,καθώς με στήριξαν επαγγελματικά κατά τον πρώτο χρόνο παρακολούθησης του μεταπτυχιακού. 1

2 Περίληψη Η διαδικασία πώρωσης καταγμάτων των οστών συμπεριλαμβάνει την ενεργοποίηση και αλληλεπίδραση διαφόρων κυττάρων, που ρυθμίζονται από βιοχημικά και μηχανικά σήματα. Στην παρούσα διπλωματική εργασία μελετάται το μαθηματικό μοντέλο πώρωσης καταγμάτων οστών, συμπεριλαμβανομένου μόνο των βιοχημικών ερεθισμάτων. Το μοντέλο αυτό, που αναπτύχθηκε αρχικά από τους Geris L. et al. (2008), περιλαμβάνει μία σειρά μερικών μη γραμμικών διαφορικών εξισώσεων που περιγράφουν την χωροχρονική εξέλιξη των συγκεντρώσεων και των πυκνοτήτων των κυτταρικών τύπων, των τύπων εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας και των αυξητικών παραγόντων που συμμετέχουν στη διαδικασία πώρωσης.[1] Η προσομοίωση του μαθηματικού μοντέλου πώρωσης οστών έγινε μέσω υπολογιστικού κώδικα πεπερασμένων όγκων στο Matlab. Ιδιαίτερη έμφαση δίνεται στην διαδικασία της αγγειογένεσης που λαμβάνει χώρα κατά την πώρωση των καταγμάτων και αποτελεί σημαντικό παράγοντα για την αποκατάσταση των οστών και την πλήρη επαναφορά τους στην αρχική κατάσταση. Για την καλύτερη κατανόηση των διαδικασιών αγγειογένεσης, εκτός από την μελέτη του μαθηματικού μοντέλου της πώρωσης των οστών, πραγματοποιήθηκε μελέτη των βιολογικών διαδικασιών επούλωσης δερματικής πληγής και προσομοίωση με υπολογιστικό κώδικα στο Matlab του απλοποιημένου μαθηματικού μοντέλου της αγγειογένεσης στην επούλωση δερματικών πληγών. [2] 2

3 Abstract The process of fracture healing involves the action and interaction of many cells, regulated by biochemical and mechanical signals. This postgraduate dissertation studies a mathematical bone fracture healing model for the case of normal fracture healing including only the biochemical factors (a bioregulatory model). The mathematical model, which was originally established by Geris L. et al. (2008), consists of a system of nonlinear partial differential equations describing the spatiotemporal evolution of concentrations and densities of the cell types, extracellular matrix types and growth factors indispensable to the healing process.[1] The simulation of mathematical model was held by a computational finite volume code in Matlab. Particular emphasis is given to the process of angiogenesis, which occurs during fracture healing and is a key factor for bone repair and restore of the original state. For a better understanding of angiogenesis processes, a study in biological processes for dermal wound healing was held and a simulation of a simplified mathematical model of angiogenesis in healing dermal wounds by a computational code in Matlab.[2] 3

4 Περιεχόμενα Ευχαριστίες... 1 Περίληψη... 2 Abstract... 3 Κατάλογος Συντμήσεων... 7 Κεφάλαιο 1: Εισαγωγή Σκοπός εργασίας Αναδρομή στα μοντέλα πώρωσης οστών Αναδρομή στα μοντέλα επούλωσης πληγών Δομή εργασίας Κεφάλαιο 2 : Ανατομία ανθρώπινου σκελετού και οστά Ανατομία και βασικές λειτουργίες του ανθρώπινου σκελετού Μικροσκοπική δομή οστίτη ιστού: Κυτταρικά και μη κυτταρικά συστατικά των οστών. 12 Εικόνα 2.1: Βασικά κύτταρα οστού και βασικές λειτουργίες αυτών Μακροσκοπική δομή του οστίτη οστού και βασικές ιδιότητες Εικόνα 2.2: Δομή συμπαγούς/φλοιώδους και δοκιδωτού/σπογγώδους οστού Κεφάλαιο 3: Εισαγωγή στις βιολογικές διαδικασίες πώρωσης οστών Ο ρόλος της αγγειογένεσης στην πώρωση καταγμάτων Εικόνα 3.1: Ρόλος του παράγοντα VEGF στην αγγειογένεση και οστεογένεση Βιολογία πώρωσης κατάγματος Πρωτογενής (άμεση) πώρωση κατάγματος και δευτερογενής (έμμεση) πώρωση κατάγματος Στάδια πώρωσης δευτερογενούς κατάγματος Εικόνα 3.2: Στάδια Δευτερογενούς πώρωσης κατάγματος Εικόνα 3.3: Χρονοδιάγραμμα με τις αλληλοεξαρτώμενες κύριες φυσιολογικές διαδικασίες που συμβαίνουν κατά την πώρωση των οστών, όπως προέκυψε από πειράματα σε μηριαία οστά αρουραίων που διεξήγαγαν οι Hadjiargyrou et al. (2002) Μοριακοί παράμετροι της πώρωσης οστών: Σηματοδοτικά μόρια και ο ρόλος των μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων Ο ρόλος των μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων στην πώρωση οστών Ο ρόλος των προ-φλεγμονωδών Κυτοκινών στην πώρωση καταγμάτων Ο αυξητικός παράγοντας TGF-β

5 3.5.4 Ο αυξητικός παράγοντας BMP Ο αυξητικός παράγοντας FGF Αυξητικός παράγοντας PDGF (Platelet Derived Growth Factor) Μεταλλοπρωτεινάσες και αγγειογενετικοί παράγοντες Εικόνα 3.4: Σύνοψη σε διάγραμμα των χρονικών διαστημάτων έκφρασης των μοριακών παραγόντων που συμμετέχουν στην πώρωση κατάγματος Κεφάλαιο 4: Βιολογικές διαδικασίες επούλωσης δερματικής πληγής Ανατομία Δέρματος Εικόνα 4.1: Σχηματική αναπαράσταση ενός τμήματος δερματικής πληγή ενήλικου θηλαστικού. Στην πραγματικότητα, το τυπικό πάχος μίας πληγής (σχισίματος) είναι μία τάξη μεγέθους μεγαλύτερο κατά πλάτος απ ότι σε βάθος Επούλωση πληγής Βιολογία της αγγειογένεσης στην επούλωση δερματικών πληγών Εικόνα 4.2: Αλληλεπικαλυπτόμενα φυσιολογικά στάδια επούλωσης πληγής : Βασικές διαδικασίες που λαμβάνουν χώρα και χημικοί κυτταρικοί παράγοντες που συμμετέχουν Φάση πολλαπλασιασμού Ινοβλαστική μετανάστευση Σύνθεση κολλαγόνου Αγγειογένεση και σχηματισμός κοκκιώδους ιστού Κεφάλαιο 5 : Μελέτη μαθηματικού μοντέλου αγγειογένεσης στην επούλωση δερματικών πληγών Εισαγωγή Μονοδιάστατο μαθηματικό μοντέλο για την αγγειογένεση στην επούλωση πληγής Αρχικές και οριακές συνθήκες 1-Δ μοντέλου Δισδιάστατο μαθηματικό μοντέλο για την αγγειογένεση στην επούλωση πληγής Αρχικές και οριακές συνθήκες 2-Δ μοντέλου Αριθμητικές μέθοδοι επίλυσης 1-Δ και 2-Δ μοντέλου αγγειογένεσης στην επούλωση πληγών Πίνακας 5.1 : Μέθοδοι χρονικής ολοκλήρωσης μονοδιάστατου μοντέλο Πίνακας 5.2: Μέθοδοι χρονικής ολοκλήρωσης δισδιάστατου μοντέλου Συζήτηση αποτελεσμάτων για μονοδιάστατο μοντέλο και δισδιάστατο μοντέλο επούλωσης πληγής Διάγραμμα 5.1: Κατανομές πυκνοτήτων ενδοθηλιακών κυττάρων (n) κατά μήκος της πληγής, όπως προέκυψαν από την προσομοίωση του 1-Δ μοντέλου για 8 χρονικές στιγμές (t=0,05,1,2,3,4,7,8,10)

6 Διάγραμμα 5.2: Κατανομές πυκνοτήτων ECM(m), κατά μήκος της πληγής, όπως προέκυψαν από την προσομοίωση του 1-Δ μοντέλου για 8 χρονικές στιγμές (t=0,05,1,2,3,4,7,8,10) Πίνακας 5.1: Κατανομή των πυκνοτήτων των ενδοθηλιακών κυττάρων εντός της πληγής για τις μέρες:1,2,4,6, Πίνακας 5.2: Κατανομή των πυκνοτήτων της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας (ECM) εντός της πληγής για τις μέρες: 1,2,4,6, Κεφάλαιο 6 : μελέτη μαθηματικού μοντέλου αγγειογένεσης στην πώρωση των οστών Μαθηματικό μοντέλο της πώρωσης οστών Αρχικές και συνοριακές συνθήκες μοντέλου προσομοίωσης Πίνακας 6.1: Συνθήκες Dirichlet των παραμέτρων Εικόνα 6.1 : Αριστερά: Γεωμετρία κάλου όπως προκύπτει μετά από απλοποίηση της γεωμετρίας του πραγματικού κάλου, Δεξιά: Οριακές συνθήκες Dirichlet (Geris L..et al.,2008), 1:ο κάλος γύρω από το περιόστεο, 2: ο κάλος στο ενδοφλοιώδες οστό, 3: ενδοστεϊκός κάλος, 4:φλοιώδες οστό Βιολογικοί παράμετροι μαθηματικού μοντέλου πώρωσης οστού Αριθμητική προσομοίωση μοντέλου Αξιολόγηση αποτελεσμάτων Πίνακας 6.2: Χωροχρονική εξέλιξη πυκνοτήτων μεσεγχυματικών κυττάρων, θεμέλιας ουσίας ινώδους ιστού/χόνδρου, οστού χονδρογενετικού και οστεγενετικού αυξητικού παράγοντα Geris L. et al.(2006) Πίνακας 6.3: Χωροχρονική εξέλιξη των πυκνοτήτων των μεσεγχυματικών κυττάρων [ 10^6cells/ml] Πίνακας 6.4: Χωροχρονική εξέλιξη πυκνοτήτων θεμέλιας ουσίας ινώδους ιστού, χόνδρου, οστού και αγγείων των Geris L. et al.(2008) Πίνακας 6.5 : Χωροχρονική εξέλιξη της πυκνότητας ινώδους ιστού [ 0.1g/ml] Πίνακας 6.6 : Χωροχρονική εξέλιξη της πυκνότητας χόνδρου[ 0.1g/ml] Πίνακας 6.7 : Χωροχρονική εξέλιξη πυκνότητας θεμέλιας ουσίας οστού [ 0.1g/ml] Πίνακας 6.8: Χωροχρονική εξέλιξη της πυκνότητας της αγγειακής ουσίας[ 0.1g/ml] Πίνακας 6.9: Χωροχρονική εξέλιξη της πυκνότητας αγγειογενετικού αυξητικού παράγοντα[ 100ng/ml] Πίνακας 6.10: Χωροχρονική εξέλιξη της πυκνότητας ενδοθηλιακών κυττάρων [ 10 6 cells/ml] Πίνακας 6.11: Χωροχρονική εξέλιξη πυκνότητας χονδρογενετικού αυξητικού παράγοντα[ 100ng/ml] Κεφάλαιο Προβλήματα που παρουσιάστηκαν κατά την προσομοίωση του μαθηματικού βιολογικού μοντέλου πώρωσης κατάγματος

7 7.2 Μελλοντικές προτάσεις Παράρτημα Παράρτημα Βιβλιογραφία Κατάλογος Συντμήσεων BMP= Bone Morphogenetic Protein FGF= Fibroblast Growth Factor VEGF= Vascular Endothelial Growth Factor TGF= Transforming Growth Factor GDF=Growth Differentiation Factor PDGF=Platelet Derived Growth Factor ECM=Extracellular Cell Matrix 7

8 Κεφάλαιο 1: Εισαγωγή 1.1 Σκοπός εργασίας Σκοπός της παρούσας διπλωματικής εργασίας είναι να διερευνήσει τις βιολογικές διαδικασίες που λαμβάνουν χώρα κατά την πώρωση καταγμάτων των οστών, καθώς και τα μαθηματικά μοντέλα που έχουν προταθεί και περιγράφουν τους διάφορους κυτταρικούς και μοριακούς τύπους που την προωθούν. Δίνεται ιδιαίτερη έμφαση στην διαδικασία αγγειογένεσης που αποτελεί βασική βιολογική διαδικασία κατά την πώρωση των οστών Πραγματοποιείται επίλυση με αριθμητικές μεθόδους ανάλυσης κι έτοιμες υπορουτίνες του Matlab,του μαθηματικού βιολογικού μοντέλου της αγγειογένεσης στην πώρωσης καταγμάτων των οστών που προτάθηκε από τους Geris L.et al.(2008).[1] Πριν την ανάπτυξη του μαθηματικού μοντέλου πώρωσης οστών μελετάται και επιλύεται, ένα απλό μοντέλο επούλωσης δερματικής πληγής, για την καλύτερη κατανόηση των διαδικασιών αγγειογένεσης. 1.2 Αναδρομή στα μοντέλα πώρωσης οστών Παρόμοια με την περίπτωση επούλωσης δερματικών πληγών, οι διαδικασίες αναδόμησης οστού ακολουθούν έναν αριθμό αλληλεπικαλυπτόμενων φάσεων που συνοψίζονται στα εξής στάδια : φλεγμονή, επιδιόρθωση και ανακατασκευή ή αναδόμηση του οστού. Τις τελευταίες δύο δεκαετίες, οι πολύπλοκες διαδικασίες αναδόμησης οστού μελετούνται μέσω μαθηματικών μοντέλων προσομοίωσης των διαδικασιών.[19] Η διαδικασία αναδόμησης οστού, δεν λαμβάνει χώρα μόνο για ένα μικρό χρονικό διάστημα μετά την δημιουργία του κατάγματος, αλλά πρόκειται για μία σταθερή μακροχρόνια διαδικασία κατά την οποία ανακατασκευάζονται μικρής κλίμακας καταστροφές των οστών και ανανεώνεται η οστική εξωκυττάρια ουσία. Τα μαθηματικά μοντέλα μακροχρόνιας αναδόμησης των οστών έχουν περιγραφεί από 8

9 τους Kroll et all(2000) και δεν αποτελούν αντικείμενο μελέτης της παρούσας εργασίας.[20] Τα πρώτα μοντέλα περιγραφής των διαδικασιών αναγέννησης οστού παρουσιάστηκαν στα τέλη τις δεκαετίας του 1990 και συσχετίζουν την δράση των κυττάρων με το μέγεθος του μηχανικού ερεθίσματος χρησιμοποιώντας απλά διαγράμματα (Prendergast et al. 1997; Carter et al. 1998; Claes and Heigele 1999).[24,26,27] Από, τότε έχουν αναπτυχθεί συνεχή μοντέλα μερικών διαφορικών εξισώσεων και fuzzy λογικής, επικεντρώνοντας στα βιολογικά ερεθίσματα, στα μηχανικά ερεθίσματα και στο συνδυασμό και των δύο. Οι περισσότερες μελέτες μοντέλων πώρωσης στρέφονται σε ειδικές περιπτώσεις αναδόμησης οστού, όπως ατροφικές μη ένωσης(non union) περιπτώσεις, διατατική οστεογένεση και υπερφόρτισης/υποφόρτισης διαταραγμένη πώρωση, καθώς αφορούν το μεγαλύτερο ποσοστό καταγμάτων. Η μελέτη των μαθηματικών μοντέλων γίνεται όλο και περισσότερο αναγκαία, λόγω των χρονοβόρων και επίπονων πειραματικών διαδικασιών σε ζώα.[19] Το μαθηματικό μοντέλο που ανέπτυξαν για τα στάδια πώρωσης οστού οι Bailόn-Plaza et al (2001) συμπεριλαμβάνει εφτά μεταβλητές (πυκνότητες κυττάρων, εξωκυττάριων ουσιών, αυξητικών παραγόντων) που συμμετέχουν στα διάφορα στάδια της πώρωσης χωρίς να λαμβάνει υπόψη το φαινόμενο της αγγειογένεσης και επιλύει το σύστημα των εξισώσεων με την αριθμητική μέθοδο πεπερασμένων διαφορών ADI(alternative direction implicit method).[20]οι πυκνότητες των κυττάρων μεταβάλλονται λόγω της ενδοχονρικής αντικατάστασης, της μετανάστευσης, του πολλαπλασιασμού,της διαφοροποίησης και της μετακίνησης των κυττάρων, ενώ οι μεταβολές της εξωκυττάριας ουσίας είναι αποτέλεσμα σύνθεσης και απορρόφησης οστού και χόνδρου. Οι συγκεντρώσεις των αυξητικών παραγόντων,που παράγονται από τα κύτταρα, μεταβάλλονται λόγω διάχυσης, σύνθεσης κι αποσύνθεσης. [20,13]Δύο χρόνια αργότερα, η ίδια επιστημονική ομάδα θα συνδυάσει το βιολογικό μοντέλο και το μηχανικό, μελετώντας τις επιδράσεις σε μέτρια και υπερβολική φόρτιση.[21] Προηγούμενα θεωρητικά μοντέλα έχουν εξερευνήσει τον συσχετισμό μεταξύ χόνδρου και σχηματισμού οστίτη ιστού και του μηχανικού περιβάλλοντος εντός του κάλου, καθορίζοντας το ποσοστό σταθερότητας ή κίνησης μεταξύ των θραυσμάτων του οστού(ament & Hofer,2000, Blenman et al.,1989;claes & Heigele,1999).[ 22,23,24,19] Η υποκείμενη υπόθεση των παραπάνω μελετών είναι ότι το επίπεδο των μηχανικών δυνάμεων ή τάσεων σε διαφορετική περιοχή του κάλου καθορίζει που θα σχηματιστεί ο χόνδρος και που το οστό, κατευθύνοντας την διαφοροποίηση των μεσεγχυματικών κυττάρων σε χονδροκύτταρα ή οστεοβλάστες και/ή επιδρώντας στην αγγειογένεση.[19] Οι Geris L. et all(2006), συνδύασαν το μοντέλο πώρωσης καταγμάτων που προτάθηκε από τους Bailόn-Plaza et al (2001) με πειραματικά δεδομένα,οδηγώντας σε μία βαθύτερη κατανόηση των μηχανισμών που διέπουν το φαινόμενο. Αργότερα, οι Geris L. et all(2008) προχώρησαν το βιολογικό μαθηματικό μοντέλο πώρωσης καταγμάτων προσθέτοντας διαφορικές εξισώσεις που υπολογίζουν πυκνότητες κυτταρικών τύπων, αυξητικών παραγόντων κι εξωκυττάριας ουσίας που συνδέονται 9

10 με το φαινόμενο της αγγειογένεσης στην πώρωση καταγμάτων. Το μοντέλο αυτό επιλύθηκε με μέθοδο πεπερασμένων όγκων και η ολοκλήρωση του ως προ το χρόνο έγινε με τον Rowmap κώδικα που ανέπτυξαν οι Weiner et al.(1997) [1,25,61] Τέλος, οι Peiffer V. et al.(2011) ανέπτυξαν το υβριδικό βιολογικό μοντέλο της αγγειογένεσης στην πώρωση κατάγματος, το οποίο αποτελεί την προέκταση του προαναφερθέντος μοντέλου (Geris L. et al. 2008)με εξισώσεις που προσδιορίζουν την ανάπτυξη των αιμοφόρων αγγείων ως αποτέλεσμα της κίνησης του προπορευόμενου φαινοτύπου ενδοθηλιακών κυττάρων, τα endothelial tip cells.αυτός ο φαινότυπος ενδοθηλιακών κυττάρων, καθοδηγούμενος από ερεθίσματα του μικροπεριβάλλοντος,δημιουργεί αναπτυσσόμενες διακλαδώσεις που συναντάνε τα αγγεία υποβάλλοντάς τα σε αναστόμωση.[1,62] 1.3 Αναδρομή στα μοντέλα επούλωσης πληγών Τα στάδια επούλωσης πληγών είναι τα εξής :αιμόσταση, φλεγμονή, πολλαπλασιασμός και αναδόμηση. Εξαιτίας της πολυπλοκότητας των διαδικασιών επούλωσης, τα περισσότερα μαθηματικά μοντέλα επικεντρώνονται σε ένα από τα στάδια. Κατά την διάρκεια των δεκαετιών , τα μοντέλα αυτά διαχωρίζονταν σε τέσσερις κατηγορίες: επιδερμική επούλωση, επιδιόρθωση της δερματικής εξωκυττάριας ουσίας, συρρίκνωση πληγής και αγγειογένεση της πληγής.[19] Οι πληγές που δεν επουλώνονται άμεσα και αδυνατούν να αποκατασταθούν με λειτουργική ακεραιότητα ονομάζονται χρόνιες πληγές (Lazarous et al.,1994) και, συνήθως, συνδέονται με νόσους, όπως είναι ο διαβήτης ή η φλεβική ανεπάρκεια(mathieu,2002).[29,30] Οι Olsen L.et al.(1997) μελέτησαν τον ρόλο των διαδικασιών της αγγειογένεσης στη επούλωση πληγών μέσω ενός μαθηματικού μοντέλου που υπολογίζει, τις πυκνότητες των ενδοθηλιακών κυττάρων και της εξωκυττάριας ουσίας. Το μοντέλο προβλέπει ότι η αγγειογένεση εξαρτάται σε σημαντικό βαθμό από την τυχαία(διάχυση) μετακίνηση των κυττάρων μέσω της εξωκυττάριας ουσίας και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, ενώ σε μικρότερο βαθμό από την κατευθυνόμενη μετακίνηση μέσω βαθμίδων συστατικών της εξωκυττάριας ουσίας( haptotaxis).[2] Οι Schugart Richard C. et al.(2008) μελέτησαν το μαθηματικό μοντέλο της αγγειογένεσης στην επούλωση πληγών μέσω της χρήσης υπερβαρικού οξυγόνου. Το μοντέλο έδειξε ότι η υπεροξία(περίσσεια οξυγόνου) προωθεί την αγγειογένεση και την επούλωση πληγών,αλλά υπάρχει μια βέλτιστη συγκέντρωση υπερβαρικού οξυγόνου πέρα από την οποία η επούλωση παρεμποδίζεται.[10] Τα αποτελέσματα τους συμφωνούν με τα πειραματικά αποτελέσματα για τραύματα με υποξία και υπεροξία (Hopf et al.,2005). Κάθε μοντέλο εστιάζει είτε στο στάδιο της φλεγμονής, ενσωματώνοντας στο μοντέλο τα φλεγμονώδη κύτταρα, είτε στην ισχαιμία της πληγής, που αποτελεί κοινή περίπτωση για μακροχρόνιες φλεγμονώδεις καταστάσεις. [19] 10

11 Οι Mi et al.(2007) ανέπτυξαν ένα μοντέλο βασισμένο σε μέσο (ΑΒΜ agent base model) για να αναλύσουν στρατηγικές με καθαρισμό της πληγής και τοπική χορήγηση αυξητικού παράγοντα. Το μοντέλο ABM είχε προηγούμενα χρησιμοποιηθεί στα πλαίσια φλεγμονής και επούλωσης πληγής (An et al. 2004; Vodovotz et al. 2004; Walker et al. 2004), κι έχει το πλεονέκτημα του υπολογισμού της στοχαστικής φύσης των βιολογικών φαινομένων.[19,35-38] Οι Velnar T. et al.(2009) πραγματοποίησαν μία επισκόπηση των κυτταρικών,μοριακών μηχανισμών που διέπουν την επούλωση των πληγών και αναφέρθηκαν αναλυτικά στα στάδια επούλωσης και στους κυτταρικούς,μοριακούς τύπους που συμμετέχουν. Τέλος, αναφέρθηκαν σε καινοτόμες μεθόδους αντιμετώπισης των πληγών και μείωσης του χρόνου επούλωσης, όπως η χρήση ηλεκτρικού πεδίου ως διεγέρτη και η τοπική έγχυση αυξητικών παραγόντων.[39] 1.4 Δομή εργασίας Στο κεφάλαιο 2 πραγματοποιείται θεωρητική διερεύνηση στην ανατομία του ανθρώπινου σκελετού,καθώς και στην μακροσκοπική και μικροσκοπική δομή των οστών. Στα κεφάλαια 3 και 4 πραγματοποιείται θεωρητική διερεύνηση στις βιολογικές διαδικασίες που λαμβάνουν χώρα κατά την πώρωση των οστών και την επούλωση δερματικών πληγών και στους κυτταρικούς και διάφορους βιοχημικούς παράγοντες που συμμετέχουν. Στα κεφάλαια 5,6 πραγματοποιείται προσομοίωση των μαθηματικών μοντέλων επούλωσης δερματικών πληγών και πώρωσης των οστών(δίνοντας έμφαση στην αγγειογένεση) και συζήτηση των αποτελεσμάτων. Στο κεφάλαιο 7 γίνεται σύντομη αναφορά στα προβλήματα που αντιμετωπίστηκαν κατά την μοντελοποίηση της πώρωσης οστών και παρατίθενται μελλοντικές προτάσεις για βελτίωση του μοντέλου. 11

12 Κεφάλαιο 2 : Ανατομία ανθρώπινου σκελετού και οστά 2.1 Ανατομία και βασικές λειτουργίες του ανθρώπινου σκελετού Ο σκελετός ενός ενήλικα ανθρώπου αποτελείται από 206 οστά και χωρίζεται σε δύο τμήματα: α) τον αξονικό σκελετό που συμπεριλαμβάνει τα 80 οστά του κρανίου, της σπονδυλικής στήλης και του θώρακα και β) τον προσαρτημένο σκελετό που συμπεριλαμβάνει τα 126 οστά των άκρων, της ωμικής και της πυελικής ζώνης. Το κάθε οστό υφίσταται σταθερά διαμόρφωση κατά την διάρκεια της ζωής του που το βοηθάει να προσαρμοστεί στις μεταβολές των εμβιομηχανικών δυνάμεων, καθώς και αναδιαμόρφωση για την αφαίρεση παλιού, κατεστραμμένου οστού και αντικατάσταση αυτού με νέο και μηχανικά δυνατότερο οστό,ώστε να διατηρηθεί η αντοχή του.[4] Οι τέσσερις γενικές κατηγορίες οστών είναι τα μακριά, τα πλατιά, τα βραχέα και τα ακανόνιστου σχήματος οστά. Τα μακριά οστά ( κλείδες, μετατάρσιο, μηριαίο οστό, κνήμες, φάλαγγες κ.α.) έχουν δύο άκρα, επιφύσεις, και μεταξύ των άκρων αυτών, το σώµα του οστού,την διάφυση. Μέσα στη διάφυση περικλείεται σωληνωτή κοιλότητα, ο αυλός ή µυελικός σωλήνας, που περιέχει τον µυελό των οστών. Τα πλατιά οστά( οστά κρανίου, ωμοπλάτης, γνάθου, στέρνου, πλευρών κ.α.) είναι τα οστά που παρουσιάζουν δύο επιφάνειες, χείλη και γωνίες. Τα βραχέα οστά(τα οστά του καρπού και το ταρσικό οστό) έχουν περίπου ίσες και τις τρεις διαστάσεις τους και δεν διαθέτουν διάφυση. Τα οστά ακανόνιστου σχήματος (υοειδές οστό, ιερό οστό, κόκκυγας) δεν έχουν συγκεκριμένο σχήμα και διαστάσεις, δεν είναι επιμήκη και δεν διαθέτουν διάφυση.[4,5] Ο σκελετός εξυπηρετεί διάφορες λειτουργίες όπως: δομική υποστήριξη του υπόλοιπου σώματος, προστασία εσωτερικών ζωτικών οργάνων, επιτρέπει την κίνηση και την μετακίνηση παρέχοντας μοχλούς για τους μύες, διατηρεί την ομοιόσταση των μεταλλικών στοιχείων και την ισορροπία οξέων βάσεων, λειτουργεί ως αποθήκη αυξητικών παραγόντων και κυτοκινών και παρέχει το περιβάλλον για την αιμοποίηση στον μυελό των οστών.[4] 2.2 Μικροσκοπική δομή οστίτη ιστού: Κυτταρικά και μη κυτταρικά συστατικά των οστών Τα οστά αποτελούνται από κυτταρικά και μη κυτταρικά συστατικά. Τα κύτταρα του οστίτη ιστού είναι οι οστεοβλάστες, τα οστεοκύτταρα, οι οστεοκλάστες και τα επενδυματικά κύτταρα (bone lining cells). Το οστό συντίθεται 12

13 από τους οστεοβλάστες, συντηρείται από τα οστεοκύτταρα και αποδομείται από τους οστεοκλάστες(εικόνα 1). [5] Οι οστεοβλάστες είναι μονοπύρηνα κύτταρα που προέρχονται από οστεο - προγεννητικά κύτταρα και παράγουν την θεμέλια εξωκυττάρια ουσία. Η θεμέλια εξωκυττάρια ουσία παράγεται περίπου με ρυθμό 1μm/μέρα και ασβεστοποιείται για να παράγει ανοργανοποιημένο οστό. Η θεμέλια ουσία μετά την οστεοποίησή της,περικλείει τους οστεοβλάστες που μετατρέπονται στη φάση αυτή σε οστεοκύτταρα. [4] Τα οστεοκύτταρα δημιουργούν αποφυάδες που φέρονται μέσα στα οστικά σωληνάρια και έτσι επικοινωνούν μεταξύ τους. Τα κύτταρα αυτά δεν αποτελούν ανενεργά στοιχεία του οστού, όπως πιστευόταν παλαιότερα, αλλά συμμετέχουν ενεργά στο μεταβολισμό και την ομοιόσταση του ασβεστίου.[4] Οι οστεοκλάστες είναι πολυπύρηνα κύτταρα προερχόμενα από μονοπύρηνα πρόδρομα μονοκύτταρα-μακροφάγα και ειδικεύονται στην απορρόφηση οστίτη ιστού. Πρώτα ανοργανοποιούν το γειτονικό οστό με οξέα και μετά διαλύουν το κολλαγόνο του με ένζυμα. Η απορρόφηση του οστού λαμβάνει χώρα με ρυθμό 10μm/ανά ημέρα.[4] Τα επενδυματικά κύτταρα προέρχονται από οστεοβλάστες που έχουν ολοκληρώσει την διαδικασία σύνθεσης οστού, είναι πεπλατυσμένα και βρίσκονται στην επιφάνεια του οστού, στις επιφάνειες των καναλιών Volkmann και στους σωληνίσκους τους οποίους διαπερνούν οι αποφυάδες των οστεοκυττάρων.[4,7] Το μη κυτταρικό συστατικό στοιχείο του οστού αποτελεί η οστική θεμέλια εξωκυττάρια ουσία(bone extracellular matrix), η οποία αποτελείται από α) οργανική εξωκυττάρια ουσία ή οστεοειδές (30%)και β)ανόργανη εξωκυττάρια ουσία(70%). Οι ίνες κολλαγόνου τύπου Ι που αποτελούν το 90% του οστεοειδούς,παράγονται από τους οστεοβλάστες και έχουν διαφορετική σύνθεση από τα ινίδια άλλων ιστών, γεγονός που κάνει δυνατή την εναπόθεση σε αυτά αλάτων ασβεστίου. Πρόκειται για μία πρωτεΐνη ικανή να οργανώνεται σε ισχυρές ίνες που παρέχουν την απαραίτητη ευελιξία και αντοχή σε εφελκυσμό στα οστά. Άλλες πρωτεΐνες του οστεοειδούς είναι διάφοροι τύποι κολλαγόνου και μη κολλαγόνες πρωτεΐνες,όπως οστεοκαλσίνη, πρωτεογλυκάνες, οστεοποντίνη, θρομβοσπονδίνη και φιμπρονεκτίνη.[4,5,6,7] Τα ανόργανα συστατικά των οστών είναι κυρίως το φωσφορικό ασβέστιο (80-90%) που βρίσκεται με τη μορφή υπερμικροσκοπικών κρυστάλλων του υδροξυαπατίτη, το ανθρακικό ασβέστιο (8-10%), το φθοριούχο και χλωριούχο ασβέστιο (0,5%), το φωσφορικό μαγνήσιο (1-2%) και τα αλκαλικά άλατα (2%). Τα συστατικά αυτά εναποτίθενται τη θεμέλια ουσία καθώς και στις ίνες κολλαγόνου παρέχοντας στο οστό ακαμψία και αντοχή σε θλίψη.[4,5,6,7] 13

14 Εικόνα 2.1: Βασικά κύτταρα οστού και βασικές λειτουργίες αυτών [64] 2.3 Μακροσκοπική δομή του οστίτη οστού και βασικές ιδιότητες Ο ιστός των οστών παρουσιάζει ιδιαίτερο ενδιαφέρον λόγω των δομικών του ιδιοτήτων. Αυτές οι ιδιότητες συνδέονται άμεσα με την δομική σύνθεση του οστού,τον υδροξυαπατίτη, το κολλαγόνο, τις μικρές ποσότητες πρωτεογλυκανών,τις μη κολλαγονούχες ενώσεις και το νερό. Τα ανόργανα συστατικά είναι,κυρίως, υπεύθυνα για την αντοχή του οστού σε συμπίεση και την δυσκαμψία, ενώ τα οργανικά συστατικά παρέχουν τις αντίστοιχες ιδιότητες σε τάση. Η σύνθεση των οστών ποικίλλει ανάλογα με το είδος, την ηλικία, το φύλο, τον τύπο οστού και από διάφορες ασθένειες που μπορεί να το προσβάλλουν.ένα άλλος σημαντικός παράγοντας που χαρακτηρίζει την ιδιόμορφη μηχανική συμπεριφορά του οστού είναι η ιεραρχική του οργάνωση. [55]Οι Weiner and Wagner(1998) περιέγραψαν αυτή την οργάνωση του οστού ξεκινώντας από νανομετρικά επίπεδα και καταλήγοντας σε μακροσκοπικά επίπεδα, σχετίζοντας την ιεραρχική τους οργάνωση με τις μηχανικές ιδιότητες.[56] Από μακροσκοπικής σκοπιάς, ο οστίτης ιστός είναι ανομοιογενής, πορώδης και ανισοτροπικός. Αν και το πορώδες του μπορεί να κυμαίνεται από 5-95%, οι περισσότεροι ιστοί έχουν είτε πολύ χαμηλό είτε πολύ υψηλό πορώδες. Με βάση το πορώδες τα οστά διαχωρίζονται σε δύο τύπους: τα συμπαγή ή φλοιώδη οστά (compact/cortical bone) με 5-10 % πορώδες και τα σπογγώδη ή δοκιδωτά οστά (trabecular/ cancellous bone) με 50-95% πορώδες.[55] Ο ενήλικας ανθρώπινος σκελετός αποτελείται κατά 80% από τα συμπαγή ή φλοιώδη οστά (compact/cortical bone) και 20% από σπογγώδη ή δοκιδωτά οστά 14

15 (trabecular / cancellous bone). Διαφορετικά οστά και περιοχές του σκελετού έχουν διαφορετικές αναλογίες φλοιώδους/δοκιδωτού οστού. Το φλοιώδες οστό είναι πυκνό,στερεό και περιβάλλει την περιοχή του μυελού,ενώ το δοκιδωτό οστό αποτελείται από ένα κυψελώδες δίκτυο δοκιδωτών πλακών και ράβδων (με κατά μέσο όρο πάχος mm) διάσπαρτο στα τμήματα του μυελού των οστών. Το φλοιώδες και δοκιδωτό οστό αποτελούνται από οστεώνες.[4,7] Οι φλοιώδεις οστεώνες (osteons) ονομάζονται συστήματα του Havers. Τα συστήματα του Havers είναι κυλινδρικά στο σχήμα, έχουν περίπου 400mm μήκος και 200mm πλάτος στην βάση τους και σχηματίζουν ένα διακλαδισμένο δίκτυο εντός του φλοιώδους οστού. Τα τοιχώματα των συστημάτων Havers σχηματίζονται από ομόκεντρα πετάλια οστίτη ιστού κατά τρόπο συμπαγή. Στον υγιή ανθρώπινο ενήλικα σκελετό υπολογίζονται 20*10^6 φλοιώδεις οστεώνες με μία συνολική επιφάνεια ανακατασκευής(harvesian remodeling area) περίπου 3.5 m^2. Το πορώδες του φλοιώδους οστού είναι συνήθως <5%,αλλά εξαρτάται κι από τον λόγο των ενεργών συστημάτων ανακατασκευής Havers προς τον λόγο των ανενεργών φλοιωδών οστεωνών. Η αυξημένη ανακατασκευή φλοιώδους οστού είναι ανάλογη του πορώδους και αντιστρόφως ανάλογη της φλοιώδους οστικής μάζας.[4] Οι δοκιδωτοί οστεώνες ονομάζονται packets, έχουν ημισωληνοειδές σχήμα πάχους 35mm και αποτελούνται από ομόκεντρα πετάλια. Στον υγιή ανθρώπινο ενήλικα σκελετό υπολογίζονται 14*10^6 δοκιδωτοί οστεώνες με μία συνολική επιφάνεια περίπου 7 m^2. Τα δοκιδωτά οστά αποτελούνται από πλάκες και ράβδους.[4] Η δομή και των δύο ειδών οστών είναι πεταλώδης, όπου οι ίνες κολλαγόνου τοποθετούνται σε εναλλασσόμενες κατευθύνσεις (δομή κόντρα πλακέ),ώστε να εξασφαλίζεται η μέγιστη δυνατή αντοχή σε κάμψη ή συστροφή, συμπίεση και προστασία από καταπονήσεις ή μικροφθορές.[4,7] Το περιόστεο είναι ένας ινώδης συνδετικός ιστός που περιβάλλει την επιφάνεια του φλοιώδους οστού (εκτός από τα τμήματα των αρθρώσεων που το οστό καλύπτεται από αρθρικό χόνδρο)και περιέχει αιμοφόρα αγγεία, νευρικές ίνες, οστεοβλάστες και οστεοκλάστες. Το περιόστεο συνδέεται σφικτά με την εξωτερική επιφάνεια του φλοιώδους οστού μέσω παχιών κολλαγόνων ινών, τις ίνες Sharpey, οι οποίες εκτείνονται στον υποκείμενο οστίτη ιστό. [4] Το ενδόστεο είναι η μεμβράνη που καλύπτει την εσωτερική επιφάνεια των φλοιωδών, δοκιδωτών οστών και τα κανάλια των αιμοφόρων αγγείων(κανάλια Volkmann)του οστού. Στο ενδόστεο, επίσης, περιέχονται αιμοφόρα αγγεία, οστεοβλάστες και οστεοκλάστες.[4,7] 15

16 Εικόνα 2.2: Δομή συμπαγούς/φλοιώδους και δοκιδωτού/σπογγώδους οστού[11] Κεφάλαιο 3: Εισαγωγή στις βιολογικές διαδικασίες πώρωσης οστών 3.1 Ο ρόλος της αγγειογένεσης στην πώρωση καταγμάτων Η αγγειογένεση είναι η διαδικασία κατά την οποία αναπτύσσονται νέα αιμοφόρα αγγεία μέσα σε έναν ιστό από το προϋπάρχον αγγειακό σύστημα και συμμετέχει σε σημαντικό βαθμό σε πολλές φυσιολογικές και παθολογικές διαδικασίες. Μερικές από αυτές είναι η εμβρυογένεση, η δημιουργία όγκων,η επούλωση πληγών, πώρωση καταγμάτων των οστών, αρθρίτιδα και άλλες παθολογικές καταστάσεις.[3] Η περίπτωση της πώρωσης των καταγμάτων είναι μία πολύπλοκη διαδικασία που απαιτεί την συντονισμένη απόκριση τεσσάρων τύπων ιστού: α) μυελό των οστών β)γλοιώδες οστό,γ) περιόστεο, δ) αδιαφοροποίητη περιτονία που περικλείει το 16

17 κάταγμα. Τα παρατιθέμενα θραύσματα του κατάγματος απαιτούν δυό σημαντικούς παράγοντες πώρωσης: παροχή αίματος και σταθερότητα.[8] Πολλοί ενεργοί τοπικοί και συστημικοί παράγοντες κατά την αποκατάσταση των καταγμάτων έχουν άμεσες ή έμμεσες χονδρογενετικές, οστεογενετικές ή αγγειογενετικές λειτουργίες. Αυτοί οι παράγοντες συμπεριλαμβάνουν μέλη των οικογενειών των αυξητικών παραγόντων FGF(fibroblast growth factor), TGF(transforming growth factor), BMP(bone morphogenetic protein) και του VEGF(vascular endothelial growth factor).[1] Ο αυξητικός παράγοντας VEGF είναι απαραίτητος στην ομαλή αγγειογένεση και αναδιαμόρφωση της αρχιτεκτονικής του οστού. Ο παράγοντας VEGF επιδρά στα ενδοθηλιακά κύτταρα σηματοδοτώντας την έναρξη των διαδικασιών αγγειογένεσης με μετανάστευση των μεσεγχυματικών κυττάρων στην περιοχή του χόνδρου μέσω των αιμοφόρων αγγείων.[65] Η επέμβαση των αιμοφόρων αγγείων παίζει σημαντικό ρόλο στην επιδιόρθωση του ιστού και η παραγωγή VEGF συνδέει τους μηχανισμού της αγγειογένεσης και της οστεογένεσης κατά την διαδικασία της πώρωσης. Η έκφραση του VEGF διεγείρεται από τους οστεοβλάστες μέσω ποικίλλων ερεθισμάτων, ο οποίος με την σειρά του ρυθμίζει την πρόσληψη, επιβίωση και ενεργοποίηση των οστεοκλαστών, ενδοθηλιακών κυττάρων και οστεοβλαστών(εικόνα 3.1). Επιπλέον, συμμετέχει στην έναρξη της ενδοχονδρικής οστεοποίησης με πρόσληψη και/ή διαφοροποίηση οστεοκλαστών που προσροφούν τον χόνδρο και προσελκύοντας οστεοβλάστες. Τέλος, στην μειωμένη αγγειογένεση παρεμποδίζεται η δράση του VEGF ή των ομολόγων του με αποτέλεσμα να διακόπτεται η διαδικασία επιδιόρθωσης και να καθυστερεί πώρωση του οστού ή να μην επιτυγχάνεται πλήρης ανακατασκευή.[1] Ο ρόλος της αγγειογένεσης στην πώρωσης καταγμάτων γίνεται ακόμα πιο σαφής παρακάτω με την περιγραφή των σταδίων πώρωσης. Εικόνα 3.1: Ρόλος του παράγοντα VEGF στην αγγειογένεση και οστεογένεση [65] 17

18 3.2 Βιολογία πώρωσης κατάγματος Η πώρωση κατάγματος είναι μια πολύπλοκη και εναρμονισμένη αναγεννητική διαδικασία που ξεκινάει ως απόκριση σε τραυματισμό κι έχει ως αποτέλεσμα την βέλτιστη επιδιόρθωση του σκελετού και ανάκτηση των σκελετικών λειτουργιών. Κατά την διαδικασία επιδιόρθωσης, η διαδρομή της φυσιολογικής εμβρυικής ανάπτυξης συνοψίζεται με την συντονισμένη συμμετοχή διαφόρων τύπων κυττάρων.[12] Οι τέσσερις περιοχές που περικλείει η τραυματισμένη περιοχή είναι: ο φλοιός του οστού, το περιόστεο, ο μυελός των οστών και εξωτερικοί μαλακοί ιστοί. Η κάθε περιοχή συμβάλλει σε διαφορετικό βαθμό στην διαδικασία αποκατάστασης του οστού και συνδέεται με διάφορες παραμέτρους,όπως αυξητικοί παράγοντες, ορμόνες, θρεπτικά συστατικά, ph, οξυγόνο, ηλεκτρικό περιβάλλον και μηχανική σταθερότητα.[12] Σύμφωνα με τους κλασικούς ιστολογικούς όρους, η πώρωση των καταγμάτων χωρίζεται σε πρωτογενή ή άμεση πώρωση και σε δευτερογενή ή έμμεση πώρωση. Πειραματικά μοντέλα που μελετάνε την πώρωση καταγμάτων σε ποντίκια έχουν δώσει σημαντικές πληροφορίες σχετικά με τα κυτταρικά γεγονότα που συντελούνται και τα χωροχρονικά τους χαρακτηριστικά.[12] Σε μικροσκοπικό επίπεδο, τα μόρια που προωθούν τις βιολογικές διαδικασίες πώρωσης χωρίζονται σε τρείς ομάδες : τις κυτοκίνες, του αυξητικούς παράγοντες και στους αγγειογενετικούς παράγοντες και μεταλλοπρωτεινάσες. [12] 3.3 Πρωτογενής (άμεση) πώρωση κατάγματος και δευτερογενής (έμμεση) πώρωση κατάγματος Η πώρωση των οστών, γενικότερα, λαμβάνει χώρα είτε με πρωτογενή ή άμεση πώρωση του οστού είτε με δευτερογενή ή έμμεση πώρωση του οστού. Τα κατάγματα που αξιολογούνται ως πρωτογενή ή άμεσα κατάγματα αφορούν μόνο τις περιπτώσεις μικρών παραμορφώσεων, είτε με μικρά κενά ή άμεση επαφή των άκρων του κατάγματος του συμπαγούς οστού και περιπτώσεις ιδανικών συνθηκών πώρωσης,όπως μηχανική σταθερότητα και απουσία κενού. Στην περίπτωση αυτή δεν εμφανίζεται φλεγμονή και δεν σχηματίζεται κάλος γύρω από το κάταγμα(μικρή ή μηδενική απόκριση του περιόστεου στην διαδικασία πώρωσης). Επίσης, υπάρχει άμεση απόκριση των διάφορων πολυκυτταρικών μονάδων στον φλοιό του οστού για αποκατάσταση των καναλιών Havers.[12,13,14] 18

19 H δευτέρου βαθμού ή έμμεση πώρωση κατάγματος, αφορά την πλειονότητα των καταγμάτων και περιλαμβάνει τον συνδυασμό ενδομεμβρανικής και ενδοχονδρικής οστεοποίησης και τον επακόλουθο σχηματισμό κάλου. Γενικότερα, ενισχύεται με την κίνηση και παρεμποδίζεται με άκαμπτη στερέωση. Στην δευτερογενή πώρωση η αποκατάσταση της αντοχής του οστού συμβαίνει σε μικρότερο χρονικό διάστημα από την πρωτογενή πώρωση. Στην παρούσα εργασία μελετάται το μαθηματικό μοντέλο των σταδίων δευτερογενούς πώρωσης οστού και παρακάτω περιγράφονται τα στάδια που συμπεριλαμβάνει η διαδικασία πώρωσης.[12,13,14] 3.4 Στάδια πώρωσης δευτερογενούς κατάγματος Το οστό είναι ένα ιστός μοναδικός για την αναγεννητική του ικανότητα χωρίς τον σχηματισμό ουλών. Στις περισσότερες των περιπτώσεων, το οστό μπορεί,πραγματικά, να αναγεννηθεί από μόνο του, σε αντίθεση με την περίπτωση επούλωσης πληγών μαλακών ιστών που οδηγούν στον σχηματισμό ουλής.[1] Η διαδικασία αναγέννησης των οστών συμπεριλαμβάνει τέσσερις αλληλεπικαλυπτόμενες φάσεις(εικόνα 3.2): 1)φλεγμονώδη φάση 2)φάση μαλακού κάλου 3)φάση σκληρού κάλου και 4) φάση αναδόμησης του οστού.[1] Φλεγμονώδης φάση Κατά τον τραυματισμό του οστού, το φλοιώδες οστό, το περιόστεο και οι μαλακοί ιστοί που το περιβάλλουν σχίζονται, προκαλώντας ρήξη σε πολυάριθμα αιμοφόρα αγγεία. Αυτή είναι η έναρξη του αρχικού σταδίου της πώρωσης των καταγμάτων, η φλεγμονώδης φάση. Τα οστεοκύτταρα στην περιοχή του κατάγματος στερούνται θρεπτικών συστατικών και υπόκεινται σε νέκρωση,όπως και ο κατεστραμμένος ιστός στην περιοχή.[1]ως επακόλουθο του τραυματισμού των αγγείων, η περιοχή του κατάγματος γίνεται υποξική και ενεργοποιείται ένας μεγάλος αριθμός προ-φλεγμονωδών κυτοκινών,όπως TNF-a και ιντερλευκίνη (IL-1b),μακροφάγων κυττάρων, λευκοκυττάρων και αυξητικών παραγόντων (TGF-β,BMP- 2,BMP-4,BMP-6). Ακόμη, οι υποξικές συνθήκες που δημιουργούνται από την ρήξη των αιμοφόρων αγγείων, ενεργοποιούν την έκφραση αγγειογενετικών παραγόντων (αγγειοποιητίνης και VEGF).[9,53] Αυτοί οι παράγοντες προσλαμβάνουν φλεγμονώδη κύτταρα και προωθούν την αγγειογένεση. Ακολουθεί η επέμβαση των ινοβλαστών, των μεσεγχυματικών βλαστικών και ενδοθηλιακών κυττάρων. Στην περιοχή της αναγέννησης απελευθερώνονται κύτταρα από τους γύρω ιστούς(κατεστραμμένα άκρα οστών, μύες, περιόστεο,μυελός των οστών), τα οποία παράγουν αυξητικούς παράγοντες και κυτοκίνες, που αναφέρθηκαν παραπάνω κι αποτελούν σημαντικούς ρυθμιστές της διαδικασίας πώρωσης. Οι οξείες φλεγμονώδεις αποκρίσεις κορυφώνονται μέσα στο πρώτο 24ωρο μετά τον τραυματισμό(απελευθέρωση IL-6 IL-1b) κι ολοκληρώνονται περίπου σε εφτά μέρες, σύμφωνα με πειράματα σε κατάγματα αρουραίων. Η φλεγμονώδης απόκριση 19

20 κρίνεται απαραίτητη για την βέλτιστη αποκατάσταση του κατάγματος, ενώ οι αντιφλεγμονώδεις θεραπείες τις πρώτες μέρες μετά τον τραυματισμό οδηγούν σε καθυστερημένη πώρωση του κατάγματος.[53] Στο τέλος της φλεγμονώδους φάσης, ο αρχικά τραυματισμένος ιστός αντικαθίσταται από ινώδη ιστό, σχηματίζοντας τον μαλακό κάλο(φάση 2).[1, 9] Αποκατάσταση κατάγματος: μαλακός κάλος και σκληρός κάλος Εντός του μαλακού κάλου, τα μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα αρχίζουν να διαφοροποιούνται, κατευθυνόμενα από ερεθίσματα που δέχονται από μικροπεριβάλλον τους, όπως η παρουσία βιολογικών παραγόντων και αντιληπτά μηχανικά ερεθίσματα. Κοντά στον φλοιό του οστού και μακριά από την περιοχή του κατάγματος παρατηρείται άμεση διαφοροποίηση προς οστεοβλάστες, οι οποίοι με την σειρά τους, παράγουν πρώιμη οστεώδη θεμέλια ουσία, τον σκληρό κάλο,μέσω μίας διαδικασίας που αποκαλείται ενδομεμβρανική οστεοποίηση. Τα μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα διαφοροποιούνται σε χονδροκύτταρα στην υποξική κεντρική περιοχή του κατάγματος, όπου ο μαλακός κάλος σταδιακά αντικαθίσταται με χόνδρο και σταθεροποιείται μηχανικά η περιοχή του κατάγματος. Τα χονδροκύτταρα ωριμάζουν προς υπερτροφικά χονδροκύτταρα, ξεκινώντας τις βιοχημικές προετοιμασίες για την ασβεστοποίηση της θεμέλιας οσίας του χόνδρου. Με την διαδικασία αυτή ολοκληρώνεται η φάση του μαλακού κάλου.[1] Στην επόμενη φάση, την φάση του σκληρού κάλου, οι οστεοκλάστες, προσελκύονται από αυξητικούς παράγοντες που εκκρίνονται από τα υπερτροφικά χονδροκύτταρα, υποβαθμίζουν την ανόργανη θεμέλια ουσία του χόνδρου επιτρέποντας στα αιμοφόρα αγγεία να εισβάλλουν στον ασβεστοποιημένο χόνδρο,τα οποία με την σειρά τους φέρνουν μαζί τους οστεοβλάστες. Οι οστεοβλάστες,λαμβάνοντας αρκετό οξυγόνο και κατάλληλα μηχανικά ερεθίσματα, παράγουν μέσω μίας διαδικασίας που αποκαλείται ενδοχονδρική οστεοποίηση, τον ιστό του σκληρού κάλου που αποτελείται από ανόργανη πρώιμη οστεώδη θεμέλια ουσία. Όταν τα άκρα του κατάγματος συνδεθούν με τον οστεώδη κάλο, η κλινική ένωση έχει επιτευχθεί. [1] Φάση αναδόμησης οστού Η φάση αναδόμησης του οστού, έχει ήδη ξεκινήσει από την φάση του σκληρού κάλου με απορρόφηση των άχρηστων μερών του κάλου από τους οστεοκλάστες και τον σχηματισμό του τελικού αναδομημένου οστού. [1]Το τελικό στάδιο της αναδόμησης του οστού είναι η αντικατάσταση του πρώιμου οστεώδους οστού που συνδέει τα άκρα του κενού που δημιουργείται με το κάταγμα(φάση σκληρού κάλου) με το τελικό οστό. Η αντικατάσταση του πρώιμου οστού πραγματοποιείται με σχηματισμό δευτερογενών οστεώνων. Αυτό το στάδιο είναι 20

21 βιοχημικά ελεγχόμενο από τους χημικού παράγοντες IL-1,TNF-a και BMP-2Η, οι οποίοι αυξάνουν εν αντιθέσει με τις περισσότερες φλεγμονώδεις κυτοκίνες που μειώνονται. [53] Η αναδόμηση του οστού διαρκεί για ένα μακρύ χρονικό διάστημα(5-8 εβδομάδες σε πειράματα με αρουραίους), όπου σταδιακά επανέρχεται η παροχή αίματος σε φυσιολογικά επίπεδα κι επαναφέρεται το οστό στο αρχικό του σχήμα και αντοχή. Υπάρχουν κι αρκετές περιπτώσεις ανθρώπινων οστών που η φάση αναδόμησης διαρκεί για χρόνια ή το οστό δεν ανακτά πλήρως τις αρχικές του ιδιότητες. [1,53] Οι Hadjiargyrou et al.(2002) σε πειράματα που πραγματοποίησαν σε κατάγματα του μηριαίου οστού αρουραίων, προσδιόρισαν τα χρονικά διαστήματα εξέλιξης των κύριων βιολογικών διαδικασιών της πώρωση του οστού (εικόνα 3.3).[54] Εικόνα 3.2: Στάδια Δευτερογενούς πώρωσης κατάγματος [14] Εικόνα 3.3: Χρονοδιάγραμμα με τις αλληλοεξαρτώμενες κύριες φυσιολογικές διαδικασίες που συμβαίνουν κατά την πώρωση των οστών, όπως προέκυψε από πειράματα σε μηριαία οστά αρουραίων που διεξήγαγαν οι Hadjiargyrou et al. (2002).[54] 21

22 3.5 Μοριακοί παράμετροι της πώρωσης οστών: Σηματοδοτικά μόρια και ο ρόλος των μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων Οι μοριακές δομές που συμμετέχουν στην πώρωση των οστών μπορούν να χωριστούν σε τρεις κατηγορίες: α) τις προ-φλεγμονώδεις κυτοκίνες β) τους αυξητικούς παράγοντες( της μεγάλης TGF-β ομάδας και άλλους) και γ) τους αγγειογενετικούς παράγοντες.[12] Στις παρακάτω ενότητες θα αναπτυχθεί ο ρόλος των μεσεγχυματικών κυττάρων,των κυτοκινών και των σημαντικότερων αυξητικών κι αγγειογενετικών παραγόντων και θα παρατεθεί διάγραμμα με την χρονική έκφραση αυτών των παραγόντων κατά την πώρωση του οστού(εικόνα 3.4).[12] Ο ρόλος των μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων στην πώρωση οστών Τα μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα είναι αδιαφοροποίητα κύτταρα ικανά για εκτενή αντιγραφή χωρίς διαφοροποίηση. Τα κύτταρα αυτά έχουν την δυνατότητα να δεσμεύονται και να διαφοροποιούνται σε σχεδόν οποιοδήποτε τύπο κυττάρου υποκινώντας, κυρίως, αυτά τα κύτταρα που σχηματίζουν μεσεγχυματικούς ιστούς, όπως οστά, χόνδρο, τένοντες, συνδέσμους, μυελό των οστών και λιπώδη ιστό. [32] Κατά την διάρκεια της πώρωσης των οστών, οι δυναμικές πηγές βλαστικών κυττάρων είναι ο μυελός των οστών, ο κοκκοποιημένος ιστός, το βαθύτερο στρώμα του περιόστεου, το ενδόστεο και οι περιβάλλοντες μαλακοί ιστοί. Επίσης, περιαγγειακά μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα που βρίσκονται στα τοιχώματα των αγγείων συμμετέχουν στην πώρωση των οστών.[32] Η πρωταρχική πηγή ιστών μεσεγχυματικών κυττάρων είναι το περιόστεο και μελέτες που πραγματοποίησαν οι Buckwalter et al. έδειξαν ότι η ικανότητα για την ανάπτυξη κάλου στην περιοχή του κατάγματος μειώνεται με μετακίνηση του περιόστεου [33] Η ποιοτική και ποσοτική μελέτη των μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων μέσω μαθηματικών μοντέλων προσομοίωσης των διαδικασιών αποκατάστασης και αναγέννησης ιστών, όπως στην περίπτωση των μοντέλων πώρωσης οστού, είναι ιδιαίτερα σημαντική σε μία εποχή που οι αλληλένδετες επιστήμες της Αναγεννητικής Ιατρικής και Μηχανικής Ιστών, εξελίσσονται ραγδαία. Οι πειραματικές μελέτες που διεξάγονται σε ιστούς ζώων για τον υπολογισμό παραμέτρων που συνδέονται με την αναγέννηση ιστών καθιστά αναγκαία την συνεχή εξέλιξη των μαθηματικών μοντέλων και των υπολογιστικών μεθόδων προσομοίωσης. 22

23 3.5.2 Ο ρόλος των προ-φλεγμονωδών Κυτοκινών στην πώρωση καταγμάτων Οι φλεγμονώδεις κυτοκίνες εμπλέκονται στην πώρωση καταγμάτων κατά την έναρξη των διαδικασιών αποκατάστασης του τραυματισμού, όπου παράγονται και λειτουργούν αμέσως μετά τον τραυματισμό και για ένα περιορισμένο χρονικό διάστημα. Στα ενδιάμεσα στάδια της πώρωσης, ρυθμίζονται κάποιες από τις κυτοκίνες, ώστε να ενεργοποιήσουν τους οστεοκλάστες για την αφαίρεση του ανοργανοποιημένου χόνδρου, ενώ άλλες συμμετέχουν στο μεταγενέστερο στάδιο της αναδόμησης του οστού. Οι ιντερλευκίνες-1,-6 έχει δειχθεί ότι παίζουν ρόλο στην έναρξη των αλληλουχιών αποκατάστασης και εκκρίνονται από μακροφάγα,φλεγμονώδη κύτταρα και κύτταρα μεσεγχυματικής προέλευσης που βρίσκονται στο περιόστεο. Αυτές οι κυτοκίνες διεξάγουν κεντρικές λειτουργίες μέσω κατάντη αποκρίσεων στο τραύμα κι έχουν χημειοτακτική επίδραση (chemotactic effect) σε άλλα φλεγμονώδη κύτταρα, ενισχύουν την σύνθεση εξωκυττάριας ουσίας, διεγείρουν την αγγειογένεση και προσλαμβάνουν ενδογενή ινωδογόνα κύτταρα στην περιοχή του τραύματος. Αυξάνουν το πρώτο 24ωρο μετά τον τραυματισμό, τα επίπεδά τους μειώνονται κατά τον σχηματισμό του χόνδρου και αυξάνονται για δεύτερη φορά κατά την φάση της αναδόμησης του οστού. Η κυτοκίνη TNF-a προωθεί την πρόσληψη μεσεγχυματικών κυττάρων, προκαλεί απόπτωση των υπερτροφικών χονδροκυττάρων κατά την ενδοχονδρική οστεοποίηση και ενεργοποιεί την λειτουργία των οστεοκλαστών.[31,32] Ο αυξητικός παράγοντας TGF-β Τα μόρια TGF-β είναι μέλη μίας μεγάλης οικογένειας εκκριτικών παραγόντων που αναφέρονται TGF-β υπεροικογένεια. Αυτή η υπεροικογένεια παραγόντων δεν περιλαμβάνει μόνο τα ισόμορφα του TGF-β,αλλά και τις ακτιβίνες, τους παράγοντες BMPs, GDFs και διάφορους άλλους εκκριτικούς παράγοντες. Ό λα τα μέλη της υπεροικογένειας TGF-β συντίθενται ως μεγάλες πρόδρομες ενώσεις,οι οποίες διασπώνται πρωτεολυτικώς για να δώσουν καρβοξυ-τερματικά ώριμων διμερών πρωτεΐνης. [34] Αρχικά, ο παράγοντας TGF-β απελευθερώνεται από τα αιμοπετάλια στο αιμάτωμα και από την εξωκυττάρια θεμέλια ουσία του οστού στην περιοχή του κατάγματος. Στα αρχικά στάδια, της πώρωσης μπορεί να εντοπισθεί στην περιοχή του σκληρού κάλου,όπου καθορίζει την περιοχή του περιοστεϊκού πολλαπλασιασμού και τον ενδομεμβρανικό σχηματισμό οστού. Τα στοιχεία δείχνουν ότι πιθανό ο TGF-β είναι πιθανό να εμπλέκεται αρχικά στην διέγερση του πολλαπλασιασμού από τους προ-οστεοβλάστες της περιοχής. Επιπρόσθετα, η έκφραση του TGF-β 23

24 αυξάνεται κατά την χονδρογένεση και τον ενδοχόνδριο σχηματισμό οστού με μία αρχική κορυφή σε επίπεδα m-rna που ανιχνεύτηκε περίπου την έκτη μέρα μετά τον τραυματισμό και φθάνει στο ναδίρ την δέκατη μέρα. Ο παράγοντας TGF-β αρχίζει να αυξάνεται ξανά από την 14 η ημέρα και παραμένει σε υψηλά επίπεδα μέχρι την τέταρτη εβδομάδα. Το ναδίρ της έκφρασης του TGF-β σχετίζεται με την μέγιστη τιμή της έκφρασης του κολλαγόνου τύπου ΙΙ και η επακόλουθη κορυφή συμπίπτει χρονικά με την υπερτροφία των χονδροκυττάρων. [34] Ο παράγοντας TGF-β, κυρίως, πιστεύεται ότι διεγείρει τα αδιαφοροποίητα μεσεγχυματικά κύτταρα, τον πολλαπλασιασμό των χονδροκυττάρων, την παραγωγή ECM κατά την χονδρογένεση και τον σχηματισμό του ενδοχόνδριου οστού.επίσης, μπορεί να εμπλέκεται στην φυσιολογική σύζευξη σχηματισμού οστού με επαναρρόφηση.[34] Ο αυξητικός παράγοντας BMP Οι παράγοντες BMPs παράγονται εντός της ECM από οστεοπρογόνους, οστεοβλάστες, μεσεγχυματικά κύτταρα και χονδροκύτταρα και είναι μέλη της μεγάλης οικογένειας παραγόντων TGF-β.Προκαλούν μία αλληλουχία γεγονότων χονδρογένεσης και οστεογένεσης, όπως χημειοταξία (chemotaxis), πολλαπλασιασμό μεσεγχυματικών κυττάρων και οστεοπρογόνων, αγγειογένεση κι ελεγχόμενη σύνθεση ECM. Η ρυθμιστική τους δράση εξαρτάται από το κύτταρο στόχο, το στάδιο διαφοροποίησης του, και την τοπική συγκέντρωση γύρω από τον υποκατάστατη, καθώς και την αλληλεπίδραση με άλλους παράγοντες. Τα μέλη της οικογένεια παραγόντων BMPs χωρίζονται τουλάχιστον σε τέσσερις κατηγορίες: 1) BMP-2, BMP-4, 2) BMP-5, BMP-6 και BMP-7, 3) GDF-5 (ή BMP-14), GDF-6 (ή BMP- 13), and GDF-7 (ήbmp-12) και 4) BMP-3(οστεογενίνη) και GDF-10 (BMP-3b). Ο παράγοντας BMP-1 δεν είναι μέλος της οικογένειας TGF-β,αλλά παίζει σημαντικό ρόλο στην ρύθμιση των ενεργειών των BMPs με την πρωτεόλυση των BMP ανταγωνιστών/πρωτεϊνών προσδετών. [12,32] Οι BMPs συνδέουν δύο διαφορετικούς τύπους σερίνης/θρεονίνης υποδοχής κινάσης,που ονομάζονται τύπου I και τύπου II υποδοχείς. Και οι δύο τύποι απαιτούνται για την μεταγωγή σήματος, με τους τύπου I υποδοχείς να ενεργοποιούνται από τους τύπου II υποδοχείς ακολουθώντας σύνδεση με τον παράγοντα BMP. Αυτή η αλληλεπίδραση ξεκινάει μία αλληλουχία ενδοκυτταρικών σημάτων μέσω των ενδοκυτταρικών πρωτεϊνών SMΑD. Οι παράγοντες BMPs είναι πολύτροπα μορφογονίδια και παίζουν κρίσιμο ρόλο στην ρύθμιση αυξητικών παραγόντων, διαφοροποίηση και απόπτωση οστεοβλαστών, χονδροβλαστών και επιθηλιακών κυττάρων. Από in vitro και in vivo μελέτες έχει δειχθεί ότι τα ΒΜΡs έτερο-διμερή, όπως BMP-4/-7 και BMP-2/-7 έχουν οστεοεπαγωγική ενισχυμένη δραστηριότητα που ρυθμίζει την διαφοροποίηση και τον πολλαπλασιασμό των μεσεγχυματικών κυττάρων σε οστεοβλάστες. Επίσης, χαμηλές συγκεντρώσεις BMP,όπως φαίνεται από in vitro μελέτες, ευνοούν την διαφοροποίηση των μεσεγχυματικών σε λιποκύτταρα. [12,32] 24

25 Τέλος, οι διάφοροι τύποι BMPs σχετίζονται μεταξύ τους λειτουργικά και δομικά, όμως ο καθένας ξεχωριστά έχει μοναδικό ρόλο στα διάφορα στάδια πώρωσης του οστού.[12,32] Ο αυξητικός παράγοντας FGF Οι παράγοντες FGFs είναι μια οικογένεια δομικά συγγενών πολυπεπτιδίων με υψηλή χημική συγγένεια με την ηπαρίνη. Η FGF οικογένεια γονιδίων περιλαμβάνει,σήμερα, εννέα μέλη που εκφράζονται σε θηλαστικά. Στους φυσιολογικούς ενήλικους ιστούς οι επικρατούσες μορφές είναι ο όξινος FGF και ο βασικός FGF(FGF-1,-2).Οι FGF-1 και FGF-2 εκφράζονται σε μια ευρεία ποικιλία ιστών και βρίσκονται σε αφθονία στην εξωκυττάρια θεμέλια ουσία των οστών. Η FGF οικογένεια μορίων μετατρέπει σήματα στο κυτταρόπλασμα μέσω μιας οικογένειας διαμεμβρανικών υποδοχέων μέσω της δράσης της κινάσης τυροσίνης. [34] Οι διάφοροι FGF υποδοχείς καθορίζουν ποικίλες συγγένειες για κάθε ένα από τα μέλη της οικογένειας FGF και εκφράζονται σε μία μεγάλη ποικιλία ιστών, συμπεριλαμβανομένων των οστών, παρόλο που δεν υπάρχουν αναφορές με λεπτομερές προφίλ του υποδοχέα FGF κατά την διάρκεια της διαδικασίας αποκατάστασης του κατάγματος. Όπως και με πολλούς από τους κινάσης τυροσίνης υποδοχείς, η ενεργοποίηση της ενδογενούς τυροσίνης κινάσης συμβαίνει μέσω διμερισμού υποδοχέα σε απόκριση προσδέτη -υποκατάστατη. [34] Κατά την διάρκεια της πώρωσης οστών, οι παράγοντες FGFs συντίθενται από μονοκύτταρα, μακροφάγα, μεσεγχυματικά κύτταρα, οστεοβλάστες και χονδροκύτταρα. Ο παράγοντας FGF προωθεί την ανάπτυξη και διαφοροποίηση μίας ποικιλίας κυττάρων,όπως ινοβλάστες, μυοκύτταρα, οστεοβλάστες και χονδροκύτταρα. Από τα πρώιμα στάδια της πώρωσης παράγεται ο FGF και παίζει κρίσιμο ρόλο στην αγγειογένεση και στην μιτογένεση των μεσεγχυματικών κυττάρων.[12] Ο παράγοντας a-fgf επιδρά στον πολλαπλασιασμό των χονδροκυττάρων και πιθανότατα είναι σημαντικός κατά την ωρίμανση τους, ενώ ο b-fgf εκφράζεται από τους οστεοβλάστες και, γενικότερα, έχει πιο ισχυρή δράση από τον a-fgf.σε οστεοτομή κνήμης σκύλου παρατηρήθηκε ότι η απλή έγχυση παράγοντα FGF-2 συνδεόταν με πρώιμη αύξηση του μεγέθους του κάλου.[12] 25

26 3.5.6 Αυξητικός παράγοντας PDGF (Platelet Derived Growth Factor) Ο παράγοντας PDGF είναι ένα διμερές μόριο που αποτελείται από δισουλφίδια συνδεδεμένα με Α- και Β- πολυπεπτιδικές αλυσίδες. Μπορεί να υπάρξει είτε σε ομοδιμερή μορφή (PDGF-AA, PDGF-BB), είτε σε ετεροδιμερή μορφή(pdgf-ab). Οι διαφορετικές ισομορφές του PDGF (AA, AB, BB) επιδρούν στα κύτταρα στόχους με διαφορετική εξειδίκευση στις δύο σχετικές δομικά πρωτείνες των υποδοχέων κινάσης τυροσίνης, γνωστούς ως α-υποδοχείς και β-υποδοχείς. Οι υποδοχείς PDGF ενεργοποιούνται με δέσμευση του υποκαταστάτη και επακόλουθο διμερισμό του υποδοχέα.[34] Ο παράγοντας PDGF,αρχικά, απελευθερώνεται από τα αιμοπετάλια στην περιοχή του αιματώματος και μπορεί να είναι σημαντικά για την προώθηση της χημειοταξίας. Στα πρώιμα στάδια της πώρωσης, ο PDGF-A βρίσκεται σε μεγαλύτερη αφθονία από τον PDGF-Β και τα περισσότερα κύτταρα εκφράζουν το ομοδιμερές PDGF-AA. Ο παράγοντας PDGF, επίσης, εκφράζεται από μακροφάγα κύτταρα που μεταναστεύουν εντός του κατάγματος ως απόκριση στον τραυματισμό και στην αρχική απελευθέρωση PDGF από αιμοπετάλια. Σε μεταγενέστερα στάδια, η πρωτεΐνη PDGF ανιχνεύεται σε πρόωρα κι ώριμα υπερτροφικά χονδροκύτταρα, κυρίως ως PDGF-A. Οι οστεοβλάστες εκφράζουν μόνο PDGF-B, υποδεικνύοντας την μορφή PDGF-BB ως αρχικό ισότυπο σε αυτά τα κύτταρα.[34] Οι μηχανισμοί επίδρασης του παράγοντα PDGF στα διάφορα στάδια πώρωσης είναι αμφιλεγόμενοι,καθώς από μελέτες που έχουν γίνει σε ποντίκια φαίνεται να έχει ανασταλτική δράση στην αναδόμηση του οστού.[58]ο ανασταλτικός αυτός μηχανισμός αποδόθηκε σε σημαντική διέγερση της αποκατάστασης των μαλακών ιστών με PDGF, η οποία μετριάζει την δράση του παράγονται BMP-3 στην οστεογένεση.[34] Μεταλλοπρωτεινάσες και αγγειογενετικοί παράγοντες Για την ιδανική αναδόμηση οστού απαιτείται επαρκής ποσότητα αίματος στην περιοχή του τραύματος. Κατά την διάρκεια του τελικών σταδίων της ενδοχονδρικής οστεοποίησης και της αναδόμησης του οστού, ειδικές ουσίες που ονομάζονται μεταλλοπρωτεινάσες υποβαθμίζουν τον χόνδρο και το οστό, επιτρέποντας την διείσδυση των αιμοφόρων αγγείων. [32] Η αγγειογένεση πιστεύεται ότι ρυθμίζεται μέσω δύο διαφορετικών βιολογικών μονοπατιών : το μονοπάτι που εξαρτάται από τον αυξητικό παράγοντα VEGF και το μονοπάτι που εξαρτάται από την αγγειοποιητίνη.πιθανολογείται ότι και οι δύο παραπάνω περιπτώσεις λαμβάνουν χώρα κατά την αποκατάσταση των καταγμάτων. Οι παράγοντες VEGFs είναι ουσιώδεις μεσολαβητές της νέο αγγειογένεσης και των 26

27 ενδοθηλιακών κυττάρων ειδικών μιτογόνων. Οι αγγειοποιητίνες Ι και ΙΙ είναι ρυθμιστικά αγγειακά μορφογενετικά μόρια που σχετίζονται με των σχηματισμών των μεγάλων αγγείων και την ανάπτυξη πλευρικών τμημάτων των προϋπαρχόντων αγγείων. Ωστόσο, η συμβολή τους στην αγγειογένεση δεν έχει κατανοηθεί πλήρως.[32] Μελέτες που διεξήγαγαν οι Street et al. έδειξαν ότι η αποκατάσταση του κατάγματος ενισχύθηκε με εξωγενή χορήγηση παράγοντα VEGF. Επίσης πιο πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι οι παράγοντες BMPs διεγείρουν την έκφραση του παράγοντα VEGF από οστεοβλάστες.[32] Εικόνα 3.4: Σύνοψη σε διάγραμμα των χρονικών διαστημάτων έκφρασης των μοριακών παραγόντων που συμμετέχουν στην πώρωση κατάγματος.[12] 27

28 Κεφάλαιο 4: Βιολογικές διαδικασίες επούλωσης δερματικής πληγής 4.1 Ανατομία Δέρματος Το δέρμα των ενήλικων θηλαστικών αποτελείται από μία πολύπλοκη διάταξη τοπικών και συστημικών στοιχείων, που το καθένα προσφέρει σημαντικά στις ρυθμιστικές και προστατευτικές λειτουργίες του δέρματος.[44] Ανατομικά το δέρμα απαρτίζεται από δύο στιβάδες: i) Την εξώτερη στιβάδα, την «επιδερμίδα», που αποτελείται από πυκνά στοιβαγμένα κύτταρα κερατίνης,τα οποία πολλαπλασιάζονται και διαφοροποιούνται συνεχώς(εικόνα 4.1).[44] ii) Την υποκείμενη στιβάδα (μεγαλύτερου πάχους), που είναι γνωστή ως δερμίδα και αποτελείται από ινοβλάστες, εξωκυττάρια θεμέλια ουσία (ECM),αιμοφόρα τριχοειδή αγγεία και άλλα κυκλοφορικά, εκκριτικά και δομικά συστατικά(εικόνα 4.1).[44] Οι ινοβλάστες πραγματοποιούν πολλούς ζωτικής σημασίας ρόλους στην διαδικασία επούλωσης δερματικής πληγής και, ιδιαίτερα, κατά την συρρίκνωση της πληγής. Τα διάφορα διαλυτά και ινώδη μόρια που συνιστούν την ECM περιλαμβάνουν πρωτεΐνες, όπως το κολλαγόνο, με την μεγαλύτερη αφθονία από τα συστατικά της στερεής φάσης του δέρματος, και τα ένζυμα,τα οποία επιτρέπουν στην ECM να υποβάλλεται σε συνεχείς κύκλους εργασιών. Τέλος, κάτω από το στρώμα της δερμίδας, αλλά χωρίς σαφή οριοθέτηση, βρίσκονται υποδόριοι λιπαροί /μυϊκοί ιστοί διάσπαρτοι με τα κυκλοφορικά αγγεία. [44] 28

29 Εικόνα 4.1: Σχηματική αναπαράσταση ενός τμήματος δερματικής πληγή ενήλικου θηλαστικού. Στην πραγματικότητα, το τυπικό πάχος μίας πληγής (σχισίματος) είναι μία τάξη μεγέθους μεγαλύτερο κατά πλάτος απ ότι σε βάθος.[44,59] 4.2 Επούλωση πληγής Ως πληγή ή τραύμα, ορίζεται η βλάβη ή διάσπαση της φυσιολογικής ανατομικής δομής και λειτουργίας. Μπορεί να κυμαίνεται από μία απλή διακοπή της ακεραιότητας του επιθηλίου του δέρματος έως βαθύτερους, εκτεταμένους υποδόριους ιστούς, όπως τένοντες, μύες, αγγεία και οστά. Οι πληγές μπορεί να προκύπτουν από παθολογικές διαδικασίες που ξεκινάνε εξωτερικά ή εσωτερικά του εμπλεκόμενου οργάνου. Η αιτιολογία τους μπορεί να είναι σκόπιμη ή τυχαία ή μπορεί να είναι αποτέλεσμα διαδικασιών που συνδέονται με ασθένεια. Ο τραυματισμός, ανεξάρτητα από την αιτία και την μορφή του, καταστρέφει τον ιστό και διασπά το τοπικό περιβάλλον μέσα σε αυτόν.[39] Η φυσιολογική επούλωση πληγής ως δυναμική και πολύπλοκη διαδικασία περιλαμβάνει μία σειρά συντονισμένων γεγονότων, όπως, αιμορραγία, συστολή αγγείων, δημιουργία θρόμβου, άμεση φλεγμονώδη αντίδραση,,ανάπλαση, μετανάστευση και πολλαπλασιασμό κυττάρων, σύνθεση πρωτεϊνών ECM,αναδόμηση 29

30 νέου παρεγχύματος και συνδετικού ιστού και εναπόθεση κολλαγόνου. Τελικώς, η αύξηση της αντοχής του τραύματος πραγματοποιείται με διατεταγμένο τρόπο και κορυφώνεται με την επιδιόρθωση διαφόρων ιστών. [39] Η επούλωση πληγής ξεκινάει αμέσως μετά τον τραυματισμό και περιλαμβάνει τα έξης βιολογικά συστατικά: μεταναστευτικά και εδραία(ινοβλάστες) είδη κυττάρων, ECM και διαλυτούς μεσολαβητές. Οι μηχανισμοί που υπόκεινται οι παραπάνω διαδικασίες είναι :i) φλεγμονώδεις μεσολαβητές κι αυξητικοί παράγοντες ii) αλληλεπιδράσεις κυττάρου-κυττάρου και κυττάρου-ecm iii)διαδικασίες ινοπλασίας, επιθηλιοποίησης κι αγγειογένεσης iv)συστολή πληγής και v)αναδόμηση. [39] Παρά το γεγονός ότι οι διαδικασίες επιδιόρθωσης αρχίζουν αμέσως μετά τον τραυματισμό και ότι οι φάσεις επούλωσης είναι παρόμοιες για όλους τους ιστούς, υπάρχουν ειδικοί ιστοί, όπως το συκώτι, ο σκελετικός ιστός και το μάτι, που ακολουθούν διαφορετικά μονοπάτια ανάπλασης και αποκατάστασης. Οι περισσότερες πληγές είναι αποτέλεσμα απλών τραυματισμών και επουλώνονται έγκαιρα και με διατεταγμένο τρόπο. Παρόλα αυτά, διάφοροι συστημικοί και τοπικοί παράγοντες μπορεί σε ορισμένες περιπτώσεις να καθυστερήσουν την επούλωση, διαταράσσοντας την αλληλουχία των διαδικασιών επούλωσης κι οδηγώντας σε χρόνιες πληγές. [39] 4.3 Βιολογία της αγγειογένεσης στην επούλωση δερματικών πληγών Τα θηλαστικά δερματικά κύτταρα λαμβάνουν ζωτικούς μεταβολίτες,όπως οξυγόνο,για ένα εκτενές τριχοειδές δίκτυο σε ολόκληρη την επιδερμίδα, το οποίο συνδέεται με μεγαλύτερες αρτηρίες και φλέβες στο υποδόριο στρώμα. Επομένως, η δερματική απόκριση σε τραυματισμό δεν απαιτεί μόνο την επαναφορά του τριχοειδούς δικτύου, αλλά και την παροχή επιπλέον θρεπτικών συστατικών για την αύξηση του αριθμού των μεταβολικά ενεργών κυττάρων που συμμετέχουν στην διαδικασία αποκατάστασης. Η αγγειογένεση αποτελεί σημαντικό παράγοντα στην επούλωση των δερματικών πληγών,καθώς συμμετέχει στην ινοπλασία και στην συρρίκνωση της πληγής [2]. Εν συντομία, τα στάδια επούλωσης της πληγής είναι (εικόνα 4.2): αιμόσταση και δημιουργία θρόμβου (hemostasis-coagulation), φλεγμονή (inflammation) και προσωρινές μεταβολικές ανάγκες, όπως είναι η μετανάστευση των κυττάρων(migration), ο πολλαπλασιασμός(proliferation), η αγγειογένεση (angiogenesis) και η αναδόμηση δερματικού ιστού (remodelling).[10,19] Η διαδικασία επούλωσης ξεκινά με αιμορραγία, όταν αγγειογενετικά προϊόντα αίματος διαρρέονται εντός της τραυματισμένης περιοχής. Αιμοπετάλια και πρωτείνες εισέρχονται στην πληγή για να σχηματίσουν ένα θρόμβο και φλεγμονώδη κύτταρα (ουδετερόφιλα, μακροφάγα) μετακινούνται εντός της πληγής για να υποβαθμίσουν τον νεκρωτικό ιστό και τα βακτήρια. Οι πρωτεΐνες πήξης, τα φλεγμονώδη κύτταρα 30

31 και τα μεταβολικά υποπροϊόντα παρέχουν μία πληθώρα αγγειογενετικών και αυξητικών παραγόντων εντός του περιβάλλοντος της πληγής, το οποίο διέπεται από μία μέτρια υποξία, συγκέντρωση γαλακτικού, ελαφριά μείωση ph και μία αύξηση του pco 2 (μερική πίεση διοξειδίου του άνθρακα). Αυτοί οι αγγειογενετικοί παράγοντες προσλαμβάνουν ινοβλάστες και ενδοθηλιακά κύτταρα, τα οποία συγκεντρώνονται στην περιοχή της πληγής. Η συγκέντρωση των κυττάρων αυξάνει την απαίτηση σε παροχή αίματος, πέρα από τα όρια των αγγείων που τροφοδοτούν την περιοχή. Οι ινοβλάστες αποκρίνονται στην μεταβολική ανάγκη νέων αγγείων καθορίζοντας την εξωκυττάρια ουσία μέσα στην οποία σχηματίζονται οι τριχοειδείς σωλήνες, ενώ τα ενδοθηλιακά κύτταρα επενδύουν του τριχοειδείς σωλήνες που επιτρέπουν την ροή του αίματος στην περιοχή της πληγής. Αφού, ικανοποιηθούν όλες οι μεταβολικές ανάγκες και κλείσει η πληγή, τα νέα αγγεία υποχωρούν, αφήνοντας μία αγγειωμένη ινώδη ουλή στην περιοχή του τραύματος. Η ουλή περιέχει κολλαγονούχο ουσία και παραμένει ανάλογα με το βαθμό της φλεγμονής και τον χρόνο που έχει απαιτηθεί για την επούλωσή της.[10] Το μαθηματικό μοντέλο επούλωσης δερματικής πληγής των Olsen et al. (1997) που μελετάται στην παρούσα εργασία αναφέρεται στις διαδικασίες επούλωσης που λαμβάνουν χώρα από τo στάδιο του πολλαπλασιασμού και μετά. Για αυτό το λόγο παρακάτω θα αναπτυχθούν σύντομα διαδικασίες που λαμβάνουν χώρα, κυρίως, από την φάση του πολλαπλασιασμού και μετά. 31

32 Εικόνα 4.2: Αλληλεπικαλυπτόμενα φυσιολογικά στάδια επούλωσης πληγής : Βασικές διαδικασίες που λαμβάνουν χώρα και χημικοί κυτταρικοί παράγοντες που συμμετέχουν [57] Φάση πολλαπλασιασμού Όταν σταματήσει η συνεχής εξέλιξη του τραυματισμού,η ομοιόσταση έχει επιτευχθεί και η ανοσοποιητική απόκριση, επιτυχώς, τεθεί σε εφαρμογή, στην περιοχή της πληγής, οι διαδικασίες μετατοπίζονται προς την αποκατάσταση του ιστού. Η φάση του πολλαπλασιασμού ξεκινάει την τρίτη μέρα μετά τον τραυματισμό και διαρκεί περίπου δύο εβδομάδες, χαρακτηρίζεται από τη μετανάστευση των ινοβλαστών και εναπόθεση νέο-συντιθέμενης ECM, ενεργώντας ως μία αντικατάσταση για τον προσωρινό δίκτυο που αποτελείται από φιμπρίνη (fibrin) και φιμπρονεκτίνη (fibronectin). Σε μακροσκοπικό επίπεδο, σε αυτή την φάση επούλωσης, παρατηρείται αφθονία σε κοκκιώδη ιστό(granulation tissue). [39] 32

33 4.3.2 Ινοβλαστική μετανάστευση Τις τρεις πρώτες μέρες μετά τον τραυματισμό, ενεργοποιείται ο πολλαπλασιασμός των ινοβλαστών και των μυοινοβλαστών του περιβάλλοντος ιστού. Μετά τον πολλαπλασιασμό τους, οι ινοβλάστες μεταναστεύουν εντός της πληγής, όπου προσελκύονται από παράγοντες, όπως ο TGF-β και PDGF, οι οποίοι απελευθερώνονται από φλεγμονώδη κύτταρα και αιμοπετάλια. Η συσσώρευση των ινοβλαστών εντός της πληγής απαιτεί την φαινοτυπική διαφοροποίηση τους. Εντός της πληγής, πολλαπλασιάζονται συνεχώς και παράγουν πρωτεΐνες της θεμέλιας ουσίας, όπως υαλουρονικό, φιμπρονεκτίνη, πρωτεογλυκάνες και προ-κολλαγόνο τύπου Ι και ΙΙ. Όλα τα παραπάνω προϊόντα εναποτίθενται στο τοπικό περιβάλλον. [39] Στο τέλος της πρώτης εβδομάδας, έχει συσσωρευτεί άφθονη ECM, η οποία παρέχει επιπρόσθετη υποστήριξη στην μετανάστευση των κυττάρων και είναι απαραίτητη στην διαδικασία αποκατάστασης της πληγής. Μετά το τέλος των παραπάνω διαδικασιών, οι ινοβλάστες διαφοροποιούνται φαινοτυπικά σε μυοινοβλάστες. Σε αυτή την φάση, περιέχουν παχιές δεσμίδες ακτίνης κάτω από την μεμβράνη του πλάσματος και επεκτείνονται με ψευδοπόδια, προσκολλώντας την φιμπρονεκτίνη και το κολλαγόνο στην ECM. [39] Η συστολή της πληγής, που αποτελεί σημαντικό γεγονός, της διαδικασίας επούλωσης πληγής, λαμβάνει χώρα, καθώς οι κυτταρικές προεκτάσεις υποχωρούν. Μόλις ολοκληρωθούν οι παραπάνω διαδικασίες, οι ινοβλάστες περιορίζονται με απόπτωση(κυτταρικός θάνατος). [39] Σύνθεση κολλαγόνου Το κολλαγόνο είναι βασικό συστατικό σε όλες τις φάσεις επούλωσης πληγής. Συντίθεται από ινοβλάστες, προσδίδει αντοχή και ακεραιότητα σε όλους τους ιστούς και παίζει σημαντικό ρόλο στις φάσεις πολλαπλασιασμού και αναδόμησης. Επίσης, το κολλαγόνο αποτελεί την θεμέλια ουσία για τον σχηματισμό της ενδοκυτταρικής θεμέλιας ουσίας εντός της πληγής. [39] Το υγιές δέρμα περιέχει 80% κολλαγόνο τύπου Ι και 20% τύπου ΙΙΙ, ενώ ο κοκκιώδης ιστός της πληγής εκφράζει 40% κολλαγόνο τύπου ΙΙΙ. [39] Αγγειογένεση και σχηματισμός κοκκιώδους ιστού Η διαμόρφωση και εγκατάσταση των νέων αιμοφόρων αγγείων είναι κρίσιμη στην επούλωση πληγών και λαμβάνει χώρα ταυτόχρονα κατά την διάρκεια όλων των φάσεων αποκατάστασης της πληγής. Επιπροσθέτως, προσελκύοντας ουδετερόφιλα και μακροφάγα, πολυάριθμοι αγγειογενετικοί παράγοντες εκκρίνονται κατά την διάρκεια της αιμοστατικής φάσης προωθώντας την αγγειογένεση. [39] 33

34 Τα εδραία ενδοθηλιακά κύτταρα είναι υπεύθυνα για έναν αριθμό αγγειογενετικών παραγόντων, συμπεριλαμβανομένων των FGF,VEGF,TGF-a,TGF-β και την αγγειογενίνη. Μία λεπτή ισορροπία διατηρείται με την δράση ανασταλτικών παραγόντων, όπως αγγειοστατίνη και στεροειδή. Ανασταλτικοί και διεγερτικοί παράγοντες ενεργούν για τον πολλαπλασιασμό των ενδοθηλιακών κυττάρων άμεσα όσο και έμμεσα, ενεργοποιώντας την μίτωση, προωθώντας την μετακίνηση και διεγείροντας τα κύτταρα ξενιστές να απελευθερώσουν ενδοθηλιακούς αυξητικούς παράγοντες. [39] Κάτω από υποξικές συνθήκες, ο περιβάλλων ιστός εκκρίνει μοριακές ενώσεις που προωθούν τον πολλαπλασιασμό και την ανάπτυξη των ενδοθηλιακών. Κατόπιν, μία διαδικασία τεσσάρων βημάτων ακολουθεί: i) παραγωγή πρωτεασών από ενδοθηλιακά κύτταρα για υποβάθμιση των βασικών στρώσεων των μητρικών αγγείων ii)χημειοταξία(chemotaxis) iii) πολλαπλασιασμός και iv) αναδόμηση και διαφοροποίηση. Οι παράγοντες FGF και VEGF παίζουν κεντρικό ρυθμιστικό ρόλο σε όλες τις διαδικασίες. Αρχικά, δεν υπάρχει αγγειακή παροχή στο κέντρο της πληγής, έτσι ο βιώσιμος ιστός, που είναι περιορισμένος στα όρια της πληγής, αιματώνεται από ατραυμάτιστα αγγεία και με διάχυση μέσω του ρευστού ιστού. Εντός της πληγής εισβάλλουν τριχοειδείς βλαστοί (capillary sprouts) και μέσα σε λίγες μέρες σχηματίζεται ένα μικροαγγειακό δίκτυο με πολλά νέα τριχοειδή αγγεία. [39] Η χημειοταξία(chemotaxis) είναι η ικανότητα των κυττάρων να μετακινούνται κατά μήκος χημικών βαθμίδων. Αυτός ο βιοχημικός μηχανισμός βοηθάει τα κύτταρα να απαντήσουν σωστά στα περιβαλλοντικά ερεθίσματα που καθορίζουν τον πολλαπλασιασμό, την διαφοροποίηση και την μετανάστευση τους. Χημειοτακτικοί παράγοντες ενεργούν πάνω σε κυτταρικούς επιφανειακούς υποδοχείς,ώστε να κατευθύνουν την μετανάστευση των κυττάρων, σημαντική διαδικασία που συμπεριλαμβάνεται στην αγγειογένεση κατά την διάρκεια επούλωσης της πληγής. [39] Η μετανάστευση των κυττάρων είναι μία πολύπλοκη διαδικασία που περιλαμβάνει συντονισμένες αλλαγές στον κυτταρικό σκελετό, μεταγωγή σημάτων και κυτταρική προσκόλληση. Εξαρτάται από το δίκτυο των ακτινών πρωτεϊνών κάτω από το πλάσμα της μεμβράνης και ρυθμίζεται από φυσικούς και χημικούς παράγοντες του αγγειακού συστήματος. Η ρύθμιση της μετανάστευσης των κυττάρων επιτυγχάνεται με τρείς μηχανισμούς: i) χημειοταξία ii ) μηχανοταξία (mechanotaxis: μετανάστευση κυττάρων που προκαλείται από μηχανικά ερεθίσματα)και με iii) Haptotaxis:μετανάστευση σε απόκριση βαθμίδων ακινητοποιημένων μορίων συνδετών(ligands). [39] 34

35 Κεφάλαιο 5 : Μελέτη μαθηματικού μοντέλου αγγειογένεσης στην επούλωση δερματικών πληγών 5.1 Εισαγωγή Πριν προχωρήσουμε στην επίλυση του μαθηματικού μοντέλου μερικών διαφορικών εξισώσεων για πώρωση κατάγματος, μελετήσαμε κι επιλύσαμε το μαθηματικό μοντέλο της αγγειογένεσης για επούλωση δερματικής πληγής.[2] Με βάση το μαθηματικό μοντέλο που προτάθηκε από τον Olsen L. et al(1997) επιλύθηκε το σύστημα των δύο μερικών διαφορικών εξισώσεων που περιγράφουν το φαινόμενο. Το μοντέλο αυτό συμπεριλαμβάνει τις μερικές διαφορικές εξισώσεις των πυκνοτήτων των ενδοθηλιακών κυττάρων και της εξωκυττάριας ουσίας(ecm).παρακάτω, θα περιγραφούν το μονοδιάστατο και δισδιάστατο μοντέλο επούλωση πληγής, θα αναφερθούν οι μέθοδοι αριθμητικής ανάλυσης που χρησιμοποιήσαμε για την επίλυση των μοντέλων, θα παρατεθούν διαγράμματα με τις χωροχρονικές μεταβολές των πυκνοτήτων όπως προέκυψαν από την προσομοίωση των μοντέλων και θα συζητηθούν τα αποτελέσματα. 5.2 Μονοδιάστατο μαθηματικό μοντέλο για την αγγειογένεση στην επούλωση πληγής Στο μαθηματικό μοντέλο επούλωσης πληγής μελετούνται οι βιολογικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ των κυττάρων (τριχοειδών ενδοθηλιακών) και της εξωκυττάριας ουσίας(κολλαγόνο), που κατά κύριο λόγο συμμετέχουν στην αγγειογένεση.[2] Τα σημαντικότερα βιολογικά φαινόμενα που λαμβάνουν χώρα είναι : Τυχαία μετανάστευση των κυττάρων που προκαλείται από την εξωκυττάρια ουσία(haptokinesis), κατευθυνόμενη μετανάστευση κυττάρων μέσω βαθμίδων πυκνοτήτων της εξωκυττάριας ουσίας (haptotaxis)και μιτωτική διαίρεση(πολλαπλασιασμός).[2] Παραγωγή(βιοσύνθεση) και υποβάθμιση (πρωτεόλυση ) της εξωκυττάριας ουσίας από κύτταρα.[2] Επιπλέον, η εξωκυττάρια ουσία, από πειραματικά δεδομένα, φαίνεται να επιδρά ως διεγέρτης σε χαμηλές πυκνότητες για την κίνηση και τον 35

36 πολλαπλασιασμό των κυττάρων και ως παρεμποδιστής σε σχετικά υψηλές πυκνότητες.[ 16,17] Τα βιολογικά φαινόμενα που περιγράφονται παραπάνω οδηγούν στο ακόλουθο μοντέλο εξισώσεων[2]: Διαστατικό 1-Δ μοντέλο : Αδιάστατο 1-Δ μοντέλο: Όπου, n=πυκνότητα ενδοθηλιακών κυττάρων, m=πυκνότητα εξωκυττάριας ουσίας, C=haptotactic coefficient, D=haptokinetic coefficient, α=συντελεστής πολλαπλασιασμού κυττάρων, P=σταθερά παραγωγής εξωκυττάριας ουσίας, Q=σταθερά υποβάθμισης εξωκυττάριας ουσίας.[2] Ανεξάρτητες μεταβλητές μοντέλου: 1. O χρόνος t, που αρχίζει να μετράει από την φάση του πολλαπλασιασμού,συνήθως 2 ή 3 μέρες μετά τον τραυματισμό.[2] 2. Η θέση στο χώρο: στην περίπτωση της 1-δ γεωμετρίας της πληγή στο επίπεδο της επιδερμίδας, δεν λαμβάνεται υπόψη το βάθος της πληγής. Το διάστημα της πληγής καθορίζεται ως -L x Lμε το κέντρο της πληγής στο x=0. Για, ξεκινάει το υγιές δέρμα.[2] Οι συντελεστές Haptotaxis, διάχυσης και πολλαπλασιασμού δίνονται από τις παρακάτω σχέσεις που ανέπτυξαν: C(m)= (1), (Sherratt, 1994),[42] D(m)= (2), (Dickinson & Tranquillo, 1993),[16] A(m)= (3), (Weinberg & Bell, 1985; Yoshizato et al., 1985)[41,63] 36

37 5.2.1 Αρχικές και οριακές συνθήκες 1-Δ μοντέλου Από την συμμετρία που παρουσιάζει το φαινόμενο, καθορίστηκαν οι λύσεις στον ημι-άπειρο χώρο x 0 με μηδενική ροή στο κέντρο της πληγής x=0(zero flux condition) και για τις δύο εξαρτημένες μεταβλητές n,m. Στο τέλος της πληγή x=l θεωρήσαμε ότι οι πυκνότητες n,m πλησιάζουν τις τιμές τους n 0, m 0 στην υγιή επιδερμίδα.[2,18] Αρχικά, για t=0 δεν υπάρχουν ενδοθηλιακά κύτταρα κατά μήκος της πληγής και η εξωκυττάρια θεμέλια ουσία βρίσκονται σε χαμηλά επίπεδα, n=0 και m=m init (0 m init m 0 ).Λεπτομέρειες για τις αδιάστατες αρχικές συνθήκες και τις σχέσεις που προκύπτουν δίνονται στο Παράρτημα 1,στο τέλος της εργασίας. [2] 5.3 Δισδιάστατο μαθηματικό μοντέλο για την αγγειογένεση στην επούλωση πληγής Αρχικά, μελετήσαμε την διαδικασία της αγγειογένεσης στην επούλωση πληγής σε μία χωρική διάσταση. Στην πράξη, οι διάφοροι παράγοντες που συμμετέχουν στις διαδικασίες επούλωσης δρουν από την βάση της πληγής προς τα ανώτερα στρώματα ιστών, τερματίζοντας στην επιφάνεια της πληγής. Το δισδιάστατο μοντέλο θεωρεί μία τετραγωνική διατομή της πληγής, όπου τα όρια της εκτείνονται από και. Στην παρούσα εργασία έγινε η προσομοίωση του μαθηματικού μοντέλου μόνο στον χώρο και.[2] Οι εξισώσεις του μοντέλου σε 2 διαστάσεις,όπως προκύπτουν από τις εξισώσεις του μονοδιάστατου:, όπου T 37

38 5.3.1 Αρχικές και οριακές συνθήκες 2-Δ μοντέλου Οι αρχικές συνθήκες είναι n=0 και m=m init στο διάστημα της πληγής 0 x 1, 0 y y b, ενώ στην ατραυμάτιστη περιοχή έχουμε n=1,m=1(x>1,0 y y b ).[2] Οι οριακές συνθήκες για το δισδιάστατο μοντέλο είναι n 1 και m 1 για χ και λόγω συμμετρίας για x=0 έχουμε zero-flux συνθήκη. Επίσης, υποθέτουμε ότι τα κύτταρα και η ECM δεν διαπερνούν την διεπιφάνεια δερμίδας-επιδερμίδας, οπότε για y=0 έχουμε zeroflux συνθήκη ( ).Τέλος, στην βάση της πληγής στο y=y b =1 έχουμε Dirichlet συνθήκες n=n b και m=m b. Τις ίδιες Dirichlet συνθήκες, ορίσαμε και στην περιοχή x=1, 0 y y b (διεπιφάνεια πληγής/υγιούς δερμίδας),θεωρώντας ότι στην περιοχή εκείνη οι πυκνότητες των n,m πλησιάζουν αυτές τις υγιούς δερμίδας.[2] 5.4 Αριθμητικές μέθοδοι επίλυσης 1-Δ και 2-Δ μοντέλου αγγειογένεσης στην επούλωση πληγών Για την επίλυση του συστήματος των δύο εξισώσεων που περιγράφουν το βιολογικό μοντέλο της αγγειογένεσης στην επούλωση πληγών ακολουθήσαμε την μέθοδο των γραμμών(method of lines, MOL), που επιτρέπει την ξεχωριστή διακριτοποίηση ως προς τον χώρο κι ως προς το χρόνο. Για την διακριτοποίηση των εξισώσεων ως προς τον χώρο χρησιμοποιήσαμε την δευτέρου βαθμού προσέγγιση κεντρικών διαφορών για τον haptokinetic (diffusion) όρο και τον haptotactic όρο, ενώ για τους όρους αντίδρασης(πολλαπλασιασμό, βιοσύνθεση, υποβάθμιση), ρητή διακριτοποίηση (κατά σημείο,point wise). Περισσότερες λεπτομέρειες για την χωρική διακριτοποίηση και το χωρικό πλέγμα αναφέρονται στο Παράρτημα 2 που επισυνάπτεται στο τέλος της εργασίας. Για το μονοδιάστατο μοντέλο έγινε διακριτοποίηση ως προς τον χρόνο με την μέθοδο Forward Euler και τις υπορουτίνες του matlab για επίλυση μερικών διαφορικών εξισώσεων ode 45,15s και 23tb. Η διακριτοποίηση ως προς τον χρόνο έγινε μέσω των υπορουτίνων του Matlab ode 45,15s,και με την ρητή μέθοδο Forward Euler για το δισδιάστατο μοντέλου. Παρακάτω παρουσιάζονται οι πίνακες 5.1,5.2 με τις μεθόδους χρονικής ολοκλήρωσης που χρησιμοποιήθηκαν για την προσομοίωση του μονοδιάστατου και δισδιάστατου μοντέλου και τα χωρικά βήματα που επιλέχθηκαν. Πραγματοποιήθηκε προσομοίωση του μοντέλου για 10 μέρες, όπου και παρατηρήθηκε επούλωση της πληγής και επιστροφή των πυκνοτήτων σε τιμές ατραυμάτιστης περιοχής. Δεν υπήρξε διαφορά στα αποτελέσματα με την χρονική ολοκλήρωση του μοντέλου με υπορουτίνες του Matlab(ode45,15s,23tb) και με την 38

39 μέθοδο Euler. Στην περίπτωση της ρητής μεθόδου Forward Euler έγινε διερεύνηση για την επιλογή βέλτιστου χρονικού και χωρικού βήματος. Στον παρακάτω πίνακα αναφέρεται η ακρίβεια της κάθε μεθόδου. Η ακρίβεια των υπορουτίνων ode του Matlab αξιολογήθηκε με βάση τις αναφορές των οδηγών Matlab. Γενικότερα, η επίλυση του συστήματος των δύο εξισώσεων επούλωσης δερματικής πληγής έδωσε ικανοποιητικά αποτελέσματα,που σχετίζονται άμεσα με την βιολογία του φαινομένου και θα μπορούσαν να χαρακτηριστούν όλες οι μέθοδοι χρονικής ολοκλήρωσης που χρησιμοποιήθηκαν κατάλληλες για την επίλυση του συστήματος. Πίνακας 5.1 : Μέθοδοι χρονικής ολοκλήρωσης μονοδιάστατου μοντέλο Μονοδιάστατο μοντέλο επούλωσης πληγής Μέθοδος χρονικής ολοκλήρωσης Χρονικά βήματα(tsteps) Χωρικό Βήμα/Υποδιαιρέσεις(nsteps) Forward Euler Matlab_Ode Matlab_Ode15s Matlab_Ode23tb Ακρίβεια Μεθόδου Ικανοποιητική για κατάλληλη επιλογή χωρικού και χρονικού βήματος Μέτρια Χαμηλή προς Μέτρια /Κατάλληλη για stiff συστήματα διαφορικών εξισώσεων Χαμηλή Ακρίβεια,αλλά πιο σταθερή από την Ode15s 39

40 Πίνακας 5.2: Μέθοδοι χρονικής ολοκλήρωσης δισδιάστατου μοντέλου Δισδιάστατο μοντέλο επούλωσης πληγής Μέθοδος χρονικής ολοκλήρωσης Χρονικά βήματα(tsteps) Χωρικό Βήμα/Υποδιαιρέσεις(nsteps) Χρόνος προσομοίωσης Forward Euler ημέρες Matlab_Ode ημέρες Matlab_Ode15s ημέρες Συζήτηση αποτελεσμάτων για μονοδιάστατο μοντέλο και δισδιάστατο μοντέλο επούλωσης πληγής Πραγματοποιήθηκε προσομοίωση του μοντέλου για 10 μέρες, όπου και παρατηρήθηκε επούλωση της πληγής και επιστροφή των πυκνοτήτων σε τιμές ατραυμάτιστης περιοχής. Καθώς εξελίσσεται η διαδικασία επούλωσης της πληγής,αυξάνονται οι συγκεντρώσεις των ενδοθηλιακών κυττάρων με κατεύθυνση από το άκρο της πληγής προς το κέντρο της ξεπερνώντας τις τιμές στην περιοχή μακριά από την πληγή(αδιάστατη φυσιολογική τιμή =1)(διάγραμμα 5.1). Τα κύτταρα πολλαπλασιάζονται και διαφοροποιούνται συνεχώς. Πλησιάζοντας προς το κέντρο της πληγής,οι πυκνότητες των ενδοθηλιακών κυττάρων στα σημεία μακριά από το κέντρο επιστρέφουν στις φυσιολογικές τους τιμές. Με το τέλος της διαδικασίας επούλωσης επιτυγχάνεται επούλωση και στο κέντρο της πληγής και οι τιμές σε όλη την έκταση της πληγής επιστρέφουν σε φυσιολογικά επίπεδα. Η αναδόμηση της ECM,όπως φαίνεται από τα διαγράμματα,συμβαίνει με πιο αργούς ρυθμούς από αυτούς του πολλαπλασιασμού των κυττάρων(διάγραμμα 5.2). Ξεκινάει από πολύ χαμηλές τιμές πυκνοτήτων και όσο μετατοπίζεται το φαινόμενο προς το κέντρο παρατηρείται συσσώρευση ECM με σταθερό ρυθμό,φθάνοντας στο τέλος της διαδικασίας σχεδόν την αδιάστατη τιμή 1 που είναι η συγκέντρωση της πυκνότητας ECM της ατραυμάτιστης περιοχής. Παρόμοιες, παρατηρήσεις έγιναν και κατά την προσομοίωση του δισδιάστατου μοντέλου επούλωσης πληγής. Προσομοίωση του μοντέλου εξισώσεων και στις δύο διαστάσεις για χρονικό διάστημα 10 ημερών έδωσε τα αποτελέσματα που απεικονίζονται παρακάτω(πίνακες 5.3,5.4). Κατά την διάρκεια του φαινομένου γίνεται μετατόπιση των πυκνοτήτων ενδοθηλιακών κυττάρων κατά τους άξονες x,y και από τα όρια της πληγής προς το κέντρο. Σε όλη την περιοχή της πληγής, μετά από μία μέγιστη τιμή πυκνότητας, τα ενδοθηλιακά κύτταρα επιστρέφουν στις αρχικές τους πυκνότητες (υγιούς δέρματος)(πίνακας 5.3). Η ECM αρχίσει να συσσωρεύεται παράλληλα με τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων μέχρι το τέλος της διαδικασίας,όπου σε όλη την επιφάνεια της πληγής η πυκνότητά της τείνει σε αυτή του υγιούς δέρματος(πίνακας 5.4). 40

41 Τα χωροχρονικά διαγράμματα που προκύπτουν από την προσομοίωση του μοντέλου βρίσκονται σε συμφωνία με τα αποτελέσματα των Olsen L. et al. (1997).[2] Διάγραμμα 5.1: Κατανομές πυκνοτήτων ενδοθηλιακών κυττάρων (n) κατά μήκος της πληγής, όπως προέκυψαν από την προσομοίωση του 1-Δ μοντέλου για 8 χρονικές στιγμές (t=0,05,1,2,3,4,7,8,10). Διάγραμμα 5.2: Κατανομές πυκνοτήτων ECM(m), κατά μήκος της πληγής, όπως προέκυψαν από την προσομοίωση του 1-Δ μοντέλου για 8 χρονικές στιγμές (t=0,05,1,2,3,4,7,8,10). 41

42 Πίνακας 5.3: Κατανομή των πυκνοτήτων των ενδοθηλιακών κυττάρων εντός της πληγής για τις μέρες:1,2,4,6,10 Ημέρα 1 Ημέρα2 Ημέρα 4 Ημέρα 6 Ημέρα 10 42

43 Πίνακας 5.4: Κατανομή των πυκνοτήτων της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας (ECM) εντός της πληγής για τις μέρες: 1,2,4,6,10 Ημέρα 1 Ημέρα 2 Ημέρα 4 Ημέρα 6 Ημέρα 10 43

44 Κεφάλαιο 6 : Μελέτη μαθηματικού μοντέλου αγγειογένεσης στην πώρωση των οστών 6.1 Μαθηματικό μοντέλο της πώρωσης οστών Αρχικά, το μαθηματικό μοντέλο βασίστηκε στο μοντέλο που προτάθηκε από τους Bailόn Plaza και Van der Meulen (2001) και περιγράφει την αποκατάσταση του κατάγματος ως χωροχρονική μεταβολή της πυκνότητας 7 μεταβλητών: μεσεγχυματικών κυττάρων(c m ), χονδροκυττάρων(c c ), οστεοβλαστών(c b ), ινώδους/χονδροειδούς εξωκυττάριας ουσίας(m c ), οστικής εξωκυττάριας ουσίας (m b ), οστεογενούς αυξητικού παράγοντα (g b )και χονδρογενετικού αυξητικού παράγοντα(g c ).[15] Στην παρούσα εργασία, θέλοντας να μελετήσουμε και τον ρόλο της αγγειογένεσης που αποτελεί σημαντικό παράγοντα στην πώρωση καταγμάτων,αναπτύξαμε το εκτενέστερο μοντέλο πώρωσης που ανέπτυξαν πρώτοι οι Geris L. et all(2008). Το μοντέλο που προτάθηκε από τους Geris L. et all(2008) επεκτείνεται με προσθήκη των παρακάτω μεταβλητών: Την πυκνότητα ενδοθηλιακών κυττάρων(c v ), τον αγγειογενετικό αυξητικό παράγοντα(g v ) και την αγγειακή εξωκυττάρια ουσία (m v ) που συνδέονται με την αγγειογένεση.[1] Τις συγκεντρώσεις των ινοβλαστών(c f ),του ινώδους ιστού (m f ) και την πυκνότητα της εξωκυττάριας ουσίας του χόνδρου(m c ),διαχωρίζοντας κατά αυτό τον τρόπο τους ινοβλάστες με τα χονδροκύτταρα και την εξωκυττάρια ουσία του χόνδρου με των ινοβλαστών.[1] Το συνεχές μαθηματικό μοντέλο της πώρωσης καταγμάτων περιγράφει την αλληλεπίδραση των συγκεντρώσεων των διαφόρων τύπων κυττάρων, εξωκυττάριων ουσιών και αυξητικών παραγόντων που συμμετέχουν στην διαδικασία μέσω ενός συστήματος μερικών διαφορικών εξισώσεων τύπου TDR(taxis-diffusion-reaction).[1] Οι μερικές διαφορικές εξισώσεις που περιγράφουν το μοντέλο είναι οι εξής[1]: (1) (2) 44

45 (3) (4) (5) (1- ) (6) (1- ) (7) (1- ) (8) (1- ) (9) (10) (11) (12) 6.2 Αρχικές και συνοριακές συνθήκες μοντέλου προσομοίωσης Οι αρχικές και συνοριακές συνθήκες ορίσθηκαν με βάση το μοντέλο που πρότειναν οι Geris et al.(2008) για φυσιολογική πώρωση κατάγματος και χάσμα κατάγματος (fracture gap) 0.5 mm. Το μοντέλο αυτό βασίζεται σε πειράματα που έγιναν σε σταθεροποιημένα κατάγματα τρωκτικών από τους Harrison et al. (2003),όπου και προέκυψε από ιστολογικές τομές του κάλου, η απλοποιημένη άξονοσυμμετρική γεωμετρία(εικόνα 6.1, αριστερό σχήμα).[60,1] Κατά την έναρξη της προσομοίωσης, ολόκληρος ο κάλος θεωρείται ότι καλύπτεται με ινώδη ιστό ( =0.1) και λόγω αιμορραγίας υπάρχει σε ολόκληρο τον κάλο κι έκφραση του αγγειογενετικού αυξητικού παράγοντα ( =10). Όλες οι υπόλοιπες μεταβλητές θεωρήθηκαν ίσες με 0 κατά την έναρξη της διαδικασίας.[1] Για όλες τις μεταβλητές στα σύνορα του κάλου εφαρμόσθηκαν no-flux οριακές συνθήκες, εκτός από ορισμένες περιπτώσεις Dirichlet συνθηκών σε ορισμένα μέρη του συνόρου και για ορισμένη χρονική περίοδο. Οι συνθήκες αυτές παρουσιάζονται στην εικόνα 6.1 (δεξιά γεωμετρία του κάλου), ενώ στον πίνακα 6.1 δίνονται οι αδιάστατες τιμές των συνθηκών Dirichlet και η χρονική περίοδος που εφαρμόζονται.[1] 45

46 Πίνακας 6.1: Συνθήκες Dirichlet των παραμέτρων Παράμετρος μοντέλου Dirichlet συνθήκη στο σύνορο Χρονική περίοδος πρώτες μέρες πρώτες μέρες 1 4 πρώτες μέρες Σε ολόκληρη την 10^-4 διαδικασία αποκατάστασης 20 5 πρώτες μέρες πρώτες μέρες Εικόνα 6.1 : Αριστερά: Γεωμετρία κάλου όπως προκύπτει μετά από απλοποίηση της γεωμετρίας του πραγματικού κάλου, Δεξιά: Οριακές συνθήκες Dirichlet (Geris L..et al.,2008), 1:ο κάλος γύρω από το περιόστεο, 2: ο κάλος στο ενδοφλοιώδες οστό, 3: ενδοστεϊκός κάλος, 4:φλοιώδες οστό[1] 6.3 Βιολογικοί παράμετροι μαθηματικού μοντέλου πώρωσης οστού Mετανάστευση κυττάρων (random and directly motion): Haptokinesis, Haptotaxis, Chemotaxis Η μετανάστευση των μεσεγχυματικών κυττάρων είναι συνδυασμός τυχαίας(haptokinesis) και κατευθυνόμενης κίνησης(haptotaxis,chemotaxis). Η τυχαία 46

47 μετακίνηση των διαφόρων τύπων κυττάρων κατά μήκος της εξωκυττάριας ουσίας (ECM) ονομάζεται haptokinesis κι εκφράζεται μέσω της σταθεράς διάχυσης D,η οποία παίρνει τιμές τάξεως cm 2 /s. Στην παρούσα εργασία, η τυχαία κίνηση των κυττάρων (haptokinesis) μοντελοποιήθηκε σύμφωνα με τους Geris L.et al.(2008), οι οποίοι βασίστηκαν σε προηγούμενα μοντέλα των Olsen et al. (1997) και Dickinson and Tranquillo (1993).[1,2,16] Η τυχαία κίνηση επηρεάζεται από την συνολική εξωκυττάρια ουσία m =m f +m c +m b +m v, έτσι ώστε στην απουσία ή παρουσία εξωκυττάριας ουσίας τα κύτταρα παύουν να κινούνται. [1] Ο συντελεστής διάχυσης για τα μεσεγχυματικά κύτταρα δίνεται από την παρακάτω σχέση: = (13) Ομοίως, μοντελοποιείται και για τα ενδοθηλιακά κύτταρα, τα οποία μεταναστεύουν τυχαία εντός και προς τον κάλο από το ανέπαφο αγγειακό που περιβάλλει την περιοχή: = (14) Για τα ινοβλαστικά κύτταρα, ο συντελεστής διάχυσης έλαβε σταθερή τιμή (Olsen et al., 1995).[44] Η κατευθυνόμενη μετακίνηση κυττάρων ως αποτέλεσμα χημικού ερεθίσματος ονομάζεται χημειοταξία (chemotaxis). Η χημειοταξία μοντελοποιήθηκε χρησιμοποιώντας υποδοχέα-κινητικής, δίνοντας μία μέγιστη χημειοτακτική απόκριση στην συγκέντρωση ενός ξεχωριστού αυξητικού παράγοντα, όπως παρατηρήθηκε από πειράματα των Lind et al. (1996), Fiedler et al. (2004, 2005) και Metheny-Barlow et al. (2004).[45-48] Η χημειοτακτική συμπεριφορά των μεσεγχυματικών κυττάρων εξαρτάται από τους οστεογενετικούς και αγγειογενετικούς παράγοντες [1]: = (15) Ομοίως, ισχύει και για τα ινοβλαστικά κύτταρα και τους οστεοβλάστες, μόνο που ο συντελεστής εξαρτάται μόνο από τον οστεογενετικό αυξητικό παράγοντα[1]: = (16) = 17) Στην περίπτωση των ενδοθηλιακών κυττάρων και πάλι ισχύει η παραπάνω σχέση, αλλά με εξάρτηση από τον αγγειογενετικό παράγοντα[1]: = (18) Η κατευθυνόμενη κίνηση κυττάρων που είναι αποτέλεσμα ερεθίσματος του κυττάρου από χημικές ουσίες επιφανειακά προσκολλημένες ονομάζεται «haptotaxis» και ο συντελεστής που την εκφράζει βασίζεται στην κινητική ανάλυση ενός μοντέλου κυττάρου-επιφάνειας-υποδοχέα-εξωκυττάριας ουσίας-υποκατάστατη (Sherrat 47

48 ,1994)[42]. Ο συντελεστής haptotaxis για τα μεσεγχυματικά κύτταρα δίνεται από την παρακάτω σχέση: = (19) Ενώ, στην περίπτωση της κατευθυνόμενης μετανάστευσης των ενδοθηλιακών κυττάρων πάνω σε μία βαθμίδα συγκέντρωσης αγγειακού ιστού, ο haptotactic συντελεστής θεωρήθηκε σταθερός, σύμφωνα με τους Anderson και Chaplain (1998).[43] Πολλαπλασιασμός κυττάρων (Cell proliferation) Ο πολλαπλασιασμός και των πέντε τύπων κυττάρων που περιλαμβάνει το μοντέλο, μοντελοποιείται μέσω μίας λογιστικής συνάρτησης ανάπτυξης, όπου ο ρυθμός πολλαπλασιασμού εξαρτάται από την περιβάλλουσα εξωκυττάρια ουσία( Olsen et al.,1997): =, όπου i=m,f,c,b,v (20) Διαφοροποίηση μεσεγχυματικών κυττάρων (Cell differentiation) Οι διαφοροποίηση των μεσεγχυματικών κυττάρων σε οστεοβλάστες ρυθμίζεται από την παρουσία των οστεογενετικών και αγγειογενετικών αυξητικών παραγόντων.[49-50] Για υψηλές συγκεντρώσεις χημικών έχει μοντελοποιηθεί η επίδραση κορεσμού που λαμβάνει χώρα (Bailόn Plaza και Van der Meulen,2001).[15] Παρακάτω,δίνεται ο συντελεστής διαφοροποίησης για τα μεσεγχυματικά κύτταρα: (21) Ομοίως, ισχύει και για τον συντελεστή διαφοροποίησης σε χονδροκύτταρα, ο οποίος εξαρτάται από την συγκέντρωση του χονδρογενετικού αυξητικού παράγοντα : (22) Ένας από τους κύριους ρυθμιστές της διαφοροποίησης των μεσεγχυματικών κυττάρων σε ινοβλάστες είναι η μηχανική φόρτιση και, μάλιστα, μία υψηλή μηχανική φόρτωση διεγείρει την τον σχηματισμό των ινοβλαστών. Όμως, το μαθηματικό μοντέλο πώρωσης που μελετάμε δεν περιλαμβάνει μηχανικούς παράγοντες, οπότε ο συντελεστής διαφοροποίησης των μεσεγχυματικών σε ινοβλάστες θεωρήθηκε ως σταθερά (F 4 ). Επιπλέον, επιλέχθηκε μικρή τιμή για την παράμετρος F 4, υποδηλώνοντας ότι η πλειοψηφία των ινοβλαστών που βρίσκονται στον κάλο, έχουν μεταναστεύσει από τους περιβάλλοντες ιστούς στην περιοχή του κάλου.[26,27] Ενδοχονδριακή αντικατάσταση(endochondral replacement) Η ενδοχονδριακή αντικατάσταση περιλαμβάνει την μετακίνηση του ανοργανοποιημένου χόνδρου και την αντικατάσταση με οστό. Τα χονδροκύτταρα, όταν ολοκληρώσουν τον πολλαπλασιαστικό τους κύκλο, θα ωριμάσουν προς 48

49 υπερτροφικά χονδροκύτταρα. Ουσιαστικά, από την σχέση(20) που μας δίνει τον συντελεστή πολλαπλασιασμού, μπορούμε να κατανοήσουμε ότι τα υπερτροφικά χονδροκύτταρα είναι χονδροκύτταρα που σταματούν να πολλαπλασιάζονται στην παρουσία πυκνής θεμέλιας ουσίας(m m max,a c 0). Σε αυτή την φάση τα χονδροκύτταρα κύτταρα αρχίζουν να παράγουν αγγειογενετικό παράγοντα (VEGF), προσελκύοντας οστεοκλάστες και ενδοθηλιακά κύτταρα εντός της ανοργανοποιημένης θεμέλιας ουσίας, αυξάνοντας την αγγείωση και ενεργοποιώντας τις μεταλλοπρωτεινάσες(μμρs) να υποβαθμίσουν την θεμέλια ουσία του χόνδρου. Αυτά τα κύτταρα ακολουθούνται στενά από του οστεοβλάστες που καθορίζουν την οστική θεμέλια ουσία.[1,51,52] Όλοι οι παραπάνω παράγοντες συνδυάζονται στην συνάρτηση για την ενδοχονδριακή αντικατάσταση(bailόn Plaza και Van der Meulen,2001),η οποία επεκτάθηκε για να συμπεριλάβει και την επίδραση της αγγειογενετικής διαδικασίας μέσω της παράμετρου B v [1,15] : (23) Ο πρώτος παράγοντας στην σχέση ( 23) αναφέρεται στην υπερτροφία των χονδροκυττάρων, ο δεύτερος στην εισβολή των αιμοφόρων αγγείων και ο τρίτος στην προσέλκυση των οστεοβλαστών. Η σχέση (23) χρησιμοποιείται, κυρίως, για να περιγράψει την εξάλειψη των χονδροκυττάρων από τον χόνδρο και την εισαγωγή νέων οστεοβλαστών εντός του κάλου.[1] Αποσύνθεση κυττάρων(cell Decay) Μία άλλη βιολογική διαδικασία που λαμβάνει χώρα κατά την πώρωση των καταγμάτων είναι η αποσύνθεση των κυττάρων (cell decay), η οποία μπορεί να συνδέεται με απομάκρυνση τους από την περιοχή του κάλου, με ωρίμανσή τους ή κυτταρικό θάνατο( απόπτωση).ο ρυθμός αποσύνθεσης των κυττάρων δεν είναι διαθέσιμος από την βιβλιογραφία κι έχει υπολογιστεί από τους Bailόn-Plaza και van der Meulen(2001) μέσω μίας γραμμικής ανάλυσης σταθερότητας για την περίπτωση των οστεοβλαστών και, παρομοίως, εφαρμόζεται και σε άλλους τύπους κυττάρων.[1,15] Τα ινοβλαστικά κύτταρα κατά την έναρξη της ενδοχονδριακής οστεοποίησης μετακινούνται από τον κάλο κι ο ρυθμός απομάκρυνσής τους(cell decay) μοντελοποιείται με χρήση της σχέσης (23) που εκφράζει την ενδοχονδριακή αντικατάσταση πολλαπλασιασμένη με έναν αναλογικό παράγοντα αποσύνθεσης d f.[1,15] Οι οστεοβλάστες κατά την συμμετοχή τους στην σύνθεση του οστού, σταδιακά παγιδεύονται στην θεμέλια ουσία του οστού που παράγουν. Όταν, ένας οστεοβλάστης φθάσει στο σημείο να περιβάλλεται ολοκληρωτικά από την θεμέλια ουσία του οστού, απομακρύνεται από την ενεργό περιοχή παραγωγής θεμέλιας ουσίας είτε με ωρίμανση είτε με θάνατο(απόπτωση).η παραπάνω διαδικασία μοντελοποιείται με μία σταθερά αποσύνθεσης d b. [1,15] 49

50 Τέλος, στην περίπτωση των ενδοθηλιακών κυττάρων, μετά τον σχηματισμό κολλαγονούχου αγγειώδους θεμέλιας ουσίας,παγιδεύονται και παύουν να μεταναστεύουν. Για αυτή την κατάσταση των ενδοθηλιακών κυττάρων μοντελοποιήθηκε μία σταθερά αποσύνθεσης d v. Η σταθερά αυτή πολλαπλασιάζεται με τη πυκνότητα των ενδοθηλιακών κυττάρων c v στην περίπτωση των ενεργών ενδοθηλιακών(με μεταναστευτική ικανότητα) και με την αγγειακή θεμέλια ουσία m v στην περίπτωση των ήρεμων ενδοθηλιακών(εσώκλειστων στην αγγειακή θεμέλια ουσία).[1,15] Σύνθεση και υποβάθμιση εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας : Matrix synthesis and degradation Η χωροχρονική εξέλιξη των πυκνοτήτων των εξωκυττάριων θεμέλιων ουσιών μοντελοποιήθηκε σύμφωνα με τα μοντέλα που πρότειναν οι Olsen et al.(1997) και Bailόn-Plaza και van der Meulen(2001).Οι βιολογικές διαδικασίες που επηρεάζουν τις πυκνότητες των εξωκυττάριων θεμέλιων ουσιών είναι η σύνθεση και υποβάθμιση της θεμέλιας ουσίας. Όταν η θεμέλια ουσία φθάσει την μέγιστη τιμή της, τότε η παραγωγή σταματάει. Τις αρχικές τιμές παραγωγής θεμέλιας ουσίας (P is, όπου i=f,c,v,bτις πήραμε από τους Geris L. et al.(2008), οποίοι βασίστηκαν στην μοντελοποίηση της διαδικασίας από Bailόn-Plaza et van der Meulen(2001) και Olsen et al.(1997).[1,15,2] Οι μαλακοί ιστοί (χόνδρος και ινώδης ιστός) υπόκεινται υποβάθμιση, αντανακλώντας στην απομάκρυνση του αντίστοιχου ιστού κατά την ενδοχονδριακή οστεοποίηση. Τις σταθερές υποβάθμισης των δύο ιστών τις πήραμε από τους Geris L. et al.(2008) και είναι Q f και Q c για ινώδη ιστό και χόνδρο, αντίστοιχα.[1] Βιολογικές διαδικασίες αυξητικών παραγόντων: Διάχυση (diffusion), Παραγωγή (production) και Aποσύνθεση /Κατανάλωση (decay/consumption) Στις βιολογικές διαδικασίες που αναφερθήκαμε παραπάνω,καθώς και στις αντίστοιχες παραμέτρους που τις εκφράζουν, η συγκέντρωση των αυξητικών παραγόντων παίζει σημαντικό ρόλο. Οι αυξητικοί παράγοντες είναι ικανοί να μεταναστεύουν εντός του κάλου μέσω διαδικασιών διάχυσης με σταθερό συντελεστή διάχυσης που δίνονται από τους Anderson και Chaplain M.A.J.(1998).[43] Ο χονδρογενετικός αυξητικός παράγοντας παράγεται από χονδροκύτταρα μέχρι μία συγκέντρωση κορεσμού, όπου τα ποσοστά παραγωγής σταθεροποιούνται. Για φυσιολογικές τιμές της θεμέλιας ουσίας (m), η παραγωγή του φθάνει σε κορεσμό και μειώνεται, καθώς αυξάνεται η θεμέλια ουσία. Όταν τα χονδροκύτταρα γίνονται υπερτροφικά, σταματάνε να παράγουν χονδρογενετικό παράγοντα και,καθώς, απομακρύνονται κατά την διαδικασία της ενδοχονδριακής οστεοποίησης, η παραγωγή του χονδρογενετικού παράγοντα πέφτει στο μηδέν. Η παραγωγή του χονδρογενετικού παράγοντα δίνεται από την παρακάτω σχέση:[1] 50

51 (24) Η παραγωγή του οστεογενετικού αυξητικού παράγοντα μοντελοποιήθηκε με παρόμοιο τρόπο, με την διαφορά ότι δεν περιορίζεται από την πυκνότητα της θεμέλιας ουσίας: (25) Οι αγγειογενετικοί αυξητικοί παράγοντες παράγονται από οστεοβλάστες και υπερτροφικά χονδροκύτταρα. Ο ρυθμός παραγωγής είναι ανάλογος της παρούσας συγκέντρωσης αυξητικού παράγοντα( μέχρι ενός σημείου κορεσμού) και φθάνει σε κορεσμό για υψηλές πυκνότητες αγγειακής θεμέλιας ουσίας, οδηγώντας στις παρακάτω σχέσεις για τους οστεοβλάστες και τα υπερτροφικά χονδροκύτταρα,αντίστοιχα[1]: (26) (27) Στην σχέση (27) ο τρίτος παράγοντας σχετίζεται με την υπερτροφία των χονδροκυττάρων.[1] Η αποσύνθεση των χονδρογενετικών (d gc ) και οστεογενετικών (d gb ) αυξητικών παραγόντων μοντελοποιήθηκε από τους Bailόn-Plaza και van der Meulen(2001) μέσω μίας σχέσης αποσύνθεσης που αντιπροσωπεύει την μετουσίωση και αμετάκλητη σύνδεση.[15] Στην περίπτωση των αγγειογενετικών αυξητικών παραγόντων, η απομάκρυνση τους από την περιοχή του κάλου, μέσω φυσικής αποσύνθεσης (d gv )και κατανάλωσης των ενδοθηλιακών κυττάρων (d gvc ),μοντελοποιήθηκε από τους Anderson και Chaplain(1998). [43] Οι αδιάστατες τιμές των σταθερών που περιλαμβάνει το μοντέλο αναφέρονται στο τέλος της εργασίας στο Παράρτημα Αριθμητική προσομοίωση μοντέλου Οι 12 μεταβλητές του μοντέλου είναι μη αρνητικές και για να εξασφαλιστεί αυτή η ποιοτική ιδιότητα της λύσης απαιτείται η επιλογή κατάλληλης αριθμητικής υπολογιστικής προσέγγισης, καθώς οι λάθος αρνητικές συγκεντρώσεις μπορούν να οδηγήσουν σε μη σταθερούς όρους αντίδρασης. Προκειμένου να εξασφαλιστεί η μη 51

52 αρνητικότητα, χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος των πεπερασμένων όγκων για την διακριτοποίηση των δώδεκα μερικών διαφορικών εξισώσεων στο χώρο. Η συγκεκριμένη μέθοδος ανήκει στις ολοκληρωτικές μεθόδους αριθμητικής επίλυσης και αντιμετωπίζει με επιτυχία προβλήματα μεταφοράς θερμότητας, μάζας κι ορμής. Στο παράτημα Α αναπτύσσεται εκτενώς η μέθοδος των πεπερασμένων όγκων. Η μέθοδος των γραμμών εφαρμόσθηκε και στην περίπτωση του μαθηματικού μοντέλου πώρωσης των οστών. Αρχικά, στον υπολογιστικό κώδικας που αναπτύχθηκε σε πρόγραμμα Matlab, έγινε η χωρική διακριτοποίηση των 12 εξισώσεων για τα εσωτερικά και συνοριακά σημεία (κόμβους)του κάλου και μετά ακολούθησε η χρονική διακριτοποίηση των εξισώσεων μέσω των υπορουτίνων του Matlab ode45,ode15s. Η αξονοσυμμετρική δομή του κάλου χρησιμοποιήθηκε για την προσομοίωση του μοντέλου, ώστε να προκύψει το ισοδύναμο πρόβλημα σε δισδιάστατο χώρο και να είναι πιο αποτελεσματική η χωρική διακριτοποίηση. Η περιοχή του κάλου καλύφθηκε με ομοιόμορφο τετραγωνικό πλέγμα διάστασης 0.05 mm. Η διακριτοποίηση που πραγματοποιήθηκε στο συγκεκριμένο πλέγμα για τους taxisdiffusion όρους είναι κεντρικές διαφορές δεύτερης τάξης και για τους όρους αντίδρασης έγινε άμεση διακριτοποίηση κατά κόμβο(pointwise discretization). Η χωρική διακριτοποίηση των συνοριακών κόμβων την περίπτωση των no-flux συνθηκών έγινε με ανάντη διαφορές δεύτερης τάξης. Στο παράρτημα 2 που παρατίθεται στο τέλος της εργασίας αναφέρονται οι σχέσεις που χρησιμοποιήθηκαν για την χωρική διακριτοποίηση των εξισώσεων. 6.5 Αξιολόγηση αποτελεσμάτων Τα διαγράμματα χωροχρονικής εξέλιξης των πυκνοτήτων που προέκυψαν από την προσομοίωση του μοντέλου για 9.78 μέρες συγκρίθηκαν μ ε τα υπολογιστικά δεδομένα που προέκυψαν από τους Geris L. et al (2006)(πίνακας 6.2), Geris L. et al (2008) (πίνακας 6.4). Η σύγκριση έγινε,κυρίως, με τους Geris L. et al (2008), καθώς η παρούσα εργασία λαμβάνει ένα έτοιμο μαθηματικό βιολογικό μοντέλο με τις οριακές, αρχικές συνθήκες που όρισε η συγκεκριμένη ομάδα και διαφοροποιείται μόνο ως προ της μέθοδο επίλυσης των εξισώσεων. Η σύγκριση των υπολογιστικών μοντέλων των Geris et al.,σύμφωνα με αναφορές και διαγράμματα που περιέχουν οι εργασίες τους, έγινε με πειραματικά δεδομένα των Harrison et al.(2003) και Bailόn- Plaza A.(2001).[1,15,25,60] Από τα χωροχρονικά διαγράμματα πυκνοτήτων των ιστών των Geris L. et al. (2008), παρατηρούμε παρόμοια κατανομή πυκνοτήτων για την 7 η μέρα μετά το κάταγμα. Στα διαγράμματα των πυκνοτήτων των διαφόρων ιστών παρατηρείται ραγδαία αύξηση του χόνδρου μέχρι και την 10 η μέρα στις περιοχές του κάλου στο ενδόστεο και στο περιόστεο. Η σύνθεση νέου οστού μέχρι την 10 η μέρα ακολουθεί πιο αργούς ρυθμούς με αρχική εμφάνιση πρώιμου οστίτη ιστού γύρω από το 52

53 φλοιώδες οστό και τα άκρα του οστού(πίνακας 6.7). Μέχρι και την 7 η μέρα ελάχιστος αγγειακός ιστός έχει σχηματιστεί γύρω από το φλοιώδες οστό και την μυελική κοιλότητα (της τάξεως 10^10) και κοντά στην 10 η μέρα αρχίζει να αυξάνεται η πυκνότητά του(πίνακας 6.8). Ο ινώδης ιστός παραμένει τις πρώτες μέρες σταθερός,περίπου κοντά στην αρχική του τιμή,και αρχίζει να μειώνεται από την 3 η μέρα παράλληλα με την αύξηση του χόνδρου(πίνακες 6.6,6.5). Αμέσως μετά την δημιουργία κατάγματος, οι πυκνότητες των μεσεγχυματικών κυττάρων αυξάνονται (λόγω πολλαπλασιασμού)φθάνοντας την μέγιστη τιμή τους στο τέλος της πρώτης μέρα και αρχίζουν να μειώνονται με γρήγορους ρυθμούς από την αρχή της δεύτερης μέρας(διαφοροποίηση)(πίνακας 6.3).Τα μεσεγχυματικά κύτταρα διαφοροποιούνται σε οστεοβλάστες κοντά στο φλοιώδες οστό υπό την καθοδήγηση του οστεογενετικού αυξητικού παράγοντα,οδηγώντας σε ενδομεμβρανική οστεοποίηση περίπου την 5 η μέρα μετά την δημιουργία κατάγματος. Στην υπόλοιπη περιοχή του κάλου διαφοροποιούνται σε χονδροκύτταρα μέσω του χονδρογενετικού αυξητικού παράγοντα. Παρόμοια, συμπεριφορά παρατηρείται στο μοντέλο που ανέπτυξαν οι Geris et al. (2006) (πίνακας 6.2)μόνο που στην περίπτωση που μελετάται στην παρούσα εργασία εμφανίστηκαν υψηλότερες τιμές πυκνοτήτων. Άμεση σύγκριση με το μοντέλο των Geris et al.(2008)(πίνακας 6.4) που προσομοιώνει η εργασία μας στην περίπτωση των μεσεγχυματικών κυττάρων δεν πραγματοποιήθηκε, καθώς δεν παραθέτουν χωροχρονικά διαγράμματα για τον συγκεκριμένο τύπο κυττάρων. Ο αγγειογενετικός αυξητικός παράγοντας(vegf) παρουσιάζει απότομη μείωση από την αρχική αδιάστατη τιμή 10 που είχε σε όλη τη επιφάνεια του κάλου κατά την διάρκεια των πρώτων εφτά ημερών μετά το κάταγμα. Από την 8 η μέρα και μετά παρατηρείται απότομη αύξηση κι επαναφορά στα αρχικά επίπεδα πυκνότητας(πίνακας 6.9). Αυτό μας οδήγησε στο συμπέρασμα ότι την πρώτη εβδομάδα μετά την δημιουργία κατάγματος, ο ρυθμός κατανάλωσης του VEGF από τα ενδοθηλιακά κύτταρα,είναι μεγαλύτερος από τον ρυθμό παραγωγής του από χονδροκύτταρα και οστεοβλάστες. Αυτό το συμπέρασμα θα μπορούσε να ερμηνευτεί ποιοτικά,καθώς ο παράγοντας VEGF που συνδέει την αγγειογένεση με την οστεογένεση, παράγεται σε μεγαλύτερους ρυθμούς κατά την διαδικασία της οστεογένεσης που λαμβάνει χώρα, δυναμικά, μετά το πέρας της πρώτης εβδομάδας, ενώ κατά την έναρξη της πώρωσης καταναλώνεται από τα ενδοθηλιακά κύτταρα.[1]δεν μπορούμε να καταλήξουμε σε ποσοτικά συμπεράσματα, καθώς παρατηρείται από τα διαγράμματα μέχρι και την 7 η μέρα τόσο ραγδαία μείωση που οι τιμές των πυκνοτήτων θα μπορούσαν να θεωρηθούν ίσες με το 0(της τάξεως 10^-40). Η μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων μέσω διάχυσης, βαθμίδας συγκέντρωσης αγγειογενετικού παράγοντα VEGF και βαθμίδας αγγειακού ιστού,αποτελεί βασική διαδικασία της αγγειογένεσης. Μέσω ερεθισμάτων που δέχονται τα ενδοθηλιακά κύτταρα από το μικροπεριβάλλον τους συνθέτουν το αγγειακό δίκτυο εσωτερικά του κάλου. Από τα χωροχρονικά διαγράμματα πυκνοτήτων που πήραμε από την προσομοίωση μοντέλου δεν ελήφθησαν σαφή ποιοτικά αποτελέσματα. Οι Geris et al. παραθέτουν χωροχρονικά διαγράμματα πυκνοτήτων ενδοθηλιακών κυττάρων από την 10 η μέρα και μετά και δεν ήταν εφικτή η σύγκριση. Αυτό που 53

54 παρατηρούμε από τα διαγράμματα που προέκυψαν, είναι ότι τα ενδοθηλιακά κύτταρα εισβάλλουν εντός του κάλου σε τυχαίες κατευθύνσεις, αρχικά από το περιόστεο κι ενδόστεο μετά την έναρξη της διαδικασίας πώρωσης και από την τρίτη μέρα και μετά εισβάλλουν και στην περιοχή των άκρων του οστού(πίνακας 6.10). Επίσης, το μαθηματικό μοντέλο που μελετάμε είναι συνεχές και η διακριτή φύση του αγγειακού συστήματος δεν μπορεί να ερμηνευτεί πλήρως μέσω συνεχών μεταβλητών, σύμφωνα με παρατηρήσεις των Peiffer V. et al. (2011).[62] Ο οστεογενετικός αυξητικός παράγοντας κατά την προσομοίωση του μοντέλου δεν παρουσίασε σημαντική μεταβολή στην περιοχή του κάλου μέχρι και την ένατη μέρα,ενώ ο χονδρογενετικός παράγοντας αυξάνεται στην περιοχή του ενδόστεου και του περιόστεου μέχρι την 2 η μέρα και αρχίζει να μειώνεται από την 3 η μέρα(πίνακας 6.11). Παρόμοια, ποιοτική συμπεριφορά για τους δύο παραπάνω αυξητικούς παράγοντες παρατηρείται και στο μοντέλο προσομοίωσης των Geris L. et al.(2006) (πίνακας 6.2)μέχρι και την 7 η μέρα, μόνο που στο συγκεκριμένο μοντέλο ο οστεογενετικός παράγοντας μεταβάλλεται στην περιοχή του κάλου στο περιόστεο κατά την ένατη μέρα. Πίνακας 6.2: Χωροχρονική εξέλιξη πυκνοτήτων μεσεγχυματικών κυττάρων, θεμέλιας ουσίας ινώδους ιστού/χόνδρου, οστού χονδρογενετικού και οστεγενετικού αυξητικού παράγοντα Geris L. et al.(2006) [25] 54

55 Πίνακας 6.3: Χωροχρονική εξέλιξη των πυκνοτήτων των μεσεγχυματικών κυττάρων [ 10^6cells/ml] Ημέρα 0.2 Ημέρα 0.5 Ημέρα 0.7 Ημέρα 1.5 Ημέρα 3.5 Πίνακας 6.4: Χωροχρονική εξέλιξη πυκνοτήτων θεμέλιας ουσίας ινώδους ιστού, χόνδρου, οστού και αγγείων των Geris L. et al.(2008) [1] 55

56 Πίνακας 6.5 : Χωροχρονική εξέλιξη της πυκνότητας ινώδους ιστού [ 0.1g/ml] Ημέρα 0 Ημέρα 1 Ημέρα Πίνακας 6.6 : Χωροχρονική εξέλιξη της πυκνότητας χόνδρου[ 0.1g/ml] Ημέρα 0 Ημέρα 3 Ημέρα

57 Πίνακας 6.7 : Χωροχρονική εξέλιξη πυκνότητας θεμέλιας ουσίας οστού [ 0.1g/ml] Ημέρα 0 Ημέρα 3 Ημέρα Πίνακας 6.8: Χωροχρονική εξέλιξη της πυκνότητας της αγγειακής ουσίας[ 0.1g/ml] Ημέρα 0 Ημέρα 3 Ημέρα x

58 Πίνακας 6.9: Χωροχρονική εξέλιξη της πυκνότητας αγγειογενετικού αυξητικού παράγοντα[ 100ng/ml] Ημέρα 0 Ημέρα 3 Ημέρα 9 58