Ιοί, ιοειδή, prions Γενικά χαρακτηριστικά, δομή, ταξινόμηση, απομόνωση, καλλιέργεια και ταυτοποίηση ιών

Transcript

1 Εθνικό & Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών Ιατρική Σχολή Εργαστήριο Μικροβιολογίας Ιοί, ιοειδή, prions Γενικά χαρακτηριστικά, δομή, ταξινόμηση, απομόνωση, καλλιέργεια και ταυτοποίηση ιών Μαρία Μαυρούλη Βιολόγος, MSc, PhD Ακαδημαϊκή Υπότροφος

2 Ιοί - Ιστορική αναδρομή Μόλις στον 20 ο αιώνα άρχισαν να μελετούνται 1883, Mayer A μυστηριώδεις παράγοντες που προκαλούν την ασθένεια «μωσαϊκή του καπνού» 1892, Iwanowski, D μολυσματικοί παράγοντες (ιοί) που διαπερνούν λεπτούς ηθμούς που συγκρατούν βακτήρια 1935, Stanley, W απομόνωση του tobacco mosaic virus 1935: ηλεκτρονικό μικροσκόπιο δεκαετίες 80 και 90: πρόοδος μοριακής βιολογίας αναγνώριση πολλών ιών

3 Ιοί Οι μικρότεροι λοιμογόνοι παράγοντες (20 nm nm, σε μήκος) Ιοειδή (5 nm) Prions (<5 nm)

4 Μέγεθος των ιών σε σύγκριση με άλλα κύτταρα

5 Ιδιότητες των ιών Υποχρεωτικώς ενδοκυττάρια παράσιτα πολλαπλασιασμός στο εσωτερικό ζωντανών κυττάρων χρήση μεταβολικών μηχανισμών του κυττάρου Δεν περιέχουν ριβοσώματα Έχουν ελάχιστα ή καθόλου ένζυμα: χρήση ενζύμων του κυττάρου-ξενιστή Μεταβολικά αδρανή (δεν μπορούν να συνθέσουν τις πρωτεΐνες τους) Σχηματίζουν εξειδικευμένες δομές για μεταφορά του ιικού νουκλεϊκού οξέος σε άλλα κύτταρα

6 Σύγκριση ιών με κύτταρα Χαρακτηριστικό Ιοί Κύτταρα Τύπος νουκλεϊκού οξέος DNA ή RNA DNA και RNA Πρωτεΐνες Λίγες Πολλές Λιποπρωτεϊνική μεμβράνη Έλυτρο σε ορισμένους ιούς Κυτταρική μεμβράνη σε όλα τα κύτταρα Ριβοσώματα Όχι Ναι Μιτοχόνδρια Όχι Ναι στα ευκαρυωτικά Ένζυμα Όχι ή πολύ λίγα Πολλά Πολλαπλασιασμός με διχοτόμηση ή μίτωση Όχι Ναι

7 Επίδραση φυσικών και χημικών παραγόντων στους ιούς Θερμότητα: αδρανοποίηση (56 ο C για 30, 100 ο C για λίγα sec) Ψύχος: διατήρηση στους -40 ο C, -70 o C Αφυδάτωση Υπεριώδης ακτινοβολία: αδρανοποίηση σε 30 Χλωροφόρμιο και αιθέρας: αδρανοποίηση ιών που έχουν έλυτρο Οξειδωτικοί παράγοντες (φορμαλδεϋδη, χλώριο, ιώδιο, Η 2 Ο 2 ) Φαινόλες (δεν έχουν καλή δράση στους ιούς) Απολυμαντικά (χλωρίνη, γλουταραλδεΰδη) Β-προπιολακτόνη (αποστείρωση εμβολίων)

8 Δομή ιών - Μεταλλάξεις Ανθεκτικότητα σε δύσκολες περιβαλλοντικές συνθήκες Πέρασμα από το δέρμα και άλλους φραγμούς Σύνδεση με το βιοχημικό μηχανισμό του κυττάρου ξενιστή Διαφυγή από την ανοσιακή απάντηση του ξενιστή Cago et al., 2009: Science, 323(5919), 1308

9 Δομή των ιών - Ιϊκό σωματίδιο (virion) 1 μοναδικό τύπο νουκλεϊκού οξέος (DNA ή RNA) Δεν έχουν κυτταρικό τοίχωμα ή κυτταρική μεμβράνη 1 πρωτεϊνικό κάλυμμα (καψίδιο) περιβάλλει το νουκλεϊκό οξύ πρωτεϊνικές υπομονάδες (καψομερίδια) Ορισμένες φορές το νουκλεοκαψίδιο (καψίδιο & γονιδίωμα) εσωκλείεται σε ένα μεμβρανώδη φάκελο (έλυτρο) ακίδες (σύμπλοκα υδατανθράκων-πρωτεϊνών) Μέσο προσκόλλησης του ιού στο κύτταρο-ξενιστή Μέσο ταυτοποίησης του ιού Ταξινόμηση των ιών ανάλογα με την αρχιτεκτονική του καψιδίου

10 Αρχιτεκτονική καψιδίου Ελικοειδείς ιοί (άκαμπτες ή ελαστικές μακριές ράβδοι) κοίλο, κυλινδρικό καψίδιο με ελικοειδή δομή ιός της λύσσας και ιός Ebola Πολυεδρικοί ιοί καψίδιο εικοσαεδρικής συμμετρίας αδενοϊός και polio ιός Ιοί με φάκελο (~ σφαιρικοί) πολυελικοειδείς ιοί (ιός της γρίπης) πολυεδρικοί ιοί (ιός του απλού έρπητα) Σύνθετοι ιοί (σύνθετες δομές) βακτηριοφάγοι (πολυεδρική κεφαλή + ελικοειδής ουρά) ιοί pox

11 Συμμετρία ιών 2011 Pearson Education, Inc. Ελικοειδής συμμετρία Κυβική (πολυεδρική) συμμετρία Πολυελικοειδής ιός Σύνθετη συμμετρία

12 Καψίδιο Προστασία από νουκλεάσες του αίματος Συμμετοχή στο μηχανισμό προσκόλλησης και διείσδυσης Φορέας μετάδοσης του ιού από το ένα κύτταρο στο άλλο πρωτεϊνικές υπομονάδες: καψομερίδια μονομερείς ή πολυμερείς πολυπεπτιδικές αλυσίδες ομοιότητα υπομονάδων: ανάγκης για πολλές γενετικές πληροφορίες 2016 Pearson Education, Inc.

13 Φάκελος (έλυτρο) λιπιδική στοιβάδα από κυτταρική μεμβράνη από πυρηνική μεμβράνη (herpesviruses) γλυκοπρωτεϊνική στοιβάδα από τον ίδιο τον ιό Συμμετοχή στο μηχανισμό προσκόλλησης στους κυτταρικούς υποδοχείς ακίδες 2016 Pearson Education, Inc. Δεν προσφέρει σταθερότητα στον ιό ευαισθησία σε: θερμότητα, ξηρασία, απορρυπαντικά, αλκοόλη, αιθέρα Ιοί - μετάδοση με την κοπρανο-στοματική οδό: δεν έχουν έλυτρο Ιοί - μετάδοση με άμεση επαφή (αίμα, σεξουαλική επαφή, τσίμπημα): έχουν έλυτρο

14 Ακίδες

15 Προέλευση ελύτρου

16 Εξωτερικές προστασία γενετικού υλικού σύνδεση με υποδοχείς κυττάρων λοιμογόνος δράση ιού αντιγόνα Πρωτεΐνες παραγωγή εξουδετερωτικών Abs ενεργοποίηση κυτταροτοξικών Τ κυττάρων Καθορισμός οροτύπου του ιού διάγνωση Spike protein Envelope protein Nucleocapsid protein Membrane protein RNA Εσωτερικές σχηματισμός καψιδίου ένζυμα κυτταρικές ή ιικές πολυμεράσες για την αντιγραφή πρωτεάσες για διάσπαση πολυπρωτεϊνών και απελευθέρωση DNA ή RNA από νουκλεοκαψίδιο ενδονουκλεάσες, λιγάσες για την αναπαραγωγή Peiris JSM et al., 2004: Nature Medicine Supplement, 10(12), s88-s97

17 Νουκλεϊκό οξύ ιών RNA ( 1 μόριο) ή DNA (1 μόριο) μονόκλωνο ή δίκλωνο γραμμικό, κυκλικό ή πολλά κομμάτια ένα αντίγραφο (μόνο οι retroviruses έχουν 2 αντίγραφα) λοιμογόνο ή μη λοιμογόνο λοιμογόνο RNA μεταγράφεται άμεσα μη λοιμογόνο DNA μεταγράφεται σε mrna ποσοστό ιικού νουκλεϊκού οξέος σε σε σχέση με ιικές πρωτεΐνες: 1-50% λίγες χιλιάδες έως nt ή bp (nucleotides ή base pairs)

18 Ιοί ζώων, φυτών και βακτηρίων Ιοί και εύρος ξενιστών Εύρος των ξενιστών: φάσμα κυττάρων που μπορεί να μολύνει ένας ιός Οι περισσότεροι ιοί μολύνουν συγκεκριμένους τύπους κυττάρων ή ιστών ενός ξενιστή (τροπισμός) McFadden et al. (2009): Nature Reviews Immunology, 9, Dermotropic measles virus mumps virus Herpes Simplex Virus rubella smallpox Neurotropic rabies virus West Nile virus polio virus Viscerotropic Yellow fever virus Dengue virus HIV Hepatitis A + B viruses Pneumotropic Influenza virus

19 Ιοί και εύρος ξενιστών Σπάνια διεύρυνση του εύρους των ξενιστών που μολύνουν οι ιοί Μόλυνση του κυττάρου - ξενιστή: η εξωτερική επιφάνεια του ιού (πρωτεΐνες) αλληλεπιδρά με ειδικούς υποδοχείς στην επιφάνεια του κυττάρου (κυτταρική μεμβράνη) - δεσμοί υδρογόνου

20 Ταξινόμηση Ονομασία ιών Σχετίζεται με: τη νόσο (ιός της ιλαράς) την τοποθεσία (coxsackie virus: Coxsackie, NY και norwalk virus: Norwalk, Ohio) το όνομα επιστημόνων (Epstein-Barr virus) τον ιστό που απομονώθηκαν 1 η φορά: (Αδενοειδείς: adenovirus, respiratory-enteric-orphan: reoviruses) σύνθεση DNA από RNA αντίγραφο: retroviruses κοινά επιδημιολογικά χαρακτηριστικά (arbo-viruses)

21 Ταξινόμηση ιών Βασίζεται στα εξής χαρακτηριστικά: Τύπος νουκλεϊκού οξέος (RNA ή DNA, μονόκλωνο ή δίκλωνο) Στρατηγική αντιγραφής (Baltimore classification system) Μορφολογικά χαρακτηριστικά σχήμα καψιδίου αριθμός καψομεριδίων μέγεθος καψιδίου παρουσία ή απουσία ελύτρου συμμετρία Ύπαρξη ενζύμων Τύπος ξενιστή, νόσου (ιοί ηπατίτιδας), ιστών που προσβάλουν (εντερικοί, αναπνευστικοί) Αντιγονικές ιδιότητες

22 Ταξινόμηση ιών International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV) - ales: τάξη (Picornavirales) - viridae: οικογένεια (Picornaviridae) - virus: γένος (Enterovirus) είδος: άθροισμα ιών με τις ίδιες γενετικές πληροφορίες και εύρος ξενιστών (Enterovirus B) ορότυπος (Coxsackievirus B1, Echovirus 1) 2000: >4000 ιοί ζώων, φυτών και βακτηρίων (71 οικογένειες, 9 υποοικογένειες και 164 γένη)

23 Ταξινόμηση ιών - Baltimore classification system

24 Ταξινόμηση DNA ιών Δίκλωνο DNA, ιικά σωμάτια με έλυτρο: Poxoviridae, Herpesviridae Δίκλωνο DNA, ιικά σωμάτια χωρίς έλυτρο: Adenoviridae, Papovaviridae DNA εν μέρει δίκλωνο εν μέρει μέρει μονόκλωνο, ιικά σωμάτια χωρίς έλυτρο: Hepadnaviridae Μονόκλωνο DNA, ιικά σωμάτια χωρίς έλυτρο: Parvoviridae

25 Ταξινόμηση RNA ιών Δίκλωνο RNA, ιικά σωμάτια χωρίς έλυτρο: Reovirdae Μονόκλωνο RNA, ιικά σωμάτια με έλυτρο, χωρίς στάδιο DNA: (+) φοράς: Togoviridae, Flaviviridae, Coronaviridae (-) φοράς, μη κατακερματισμένο: Paramyxoviridae, Rhabdoviridae, Filoviridae (-) φοράς, κατακερματισμένο: Orthomyxoviridae, Bunyaviridae, Arenaviridae Μονόκλωνο RNA, ιικά σωμάτια με έλυτρο και στάδιο DNA: Retroviridae Μονόκλωνο RNA (+) φοράς, ιικά σωμάτια χωρίς έλυτρο: Picornaviriase, Caliciviridae Ο χημικός προσανατολισμός του mrna λαμβάνεται ως (+) φοράς

26 Καλλιέργεια βακτηριοφάγων Οι ιοί καλλιεργούνται μόνο σε ζωντανά κύτταρα Βακτηριοφάγοι: οι ευκολότερα καλλιεργούμενοι ιοί Μέθοδος καλλιέργειας των πλακών Ανάμειξη βακτηριοφάγων με βακτήρια και θρεπτικό άγαρ (στρώμα βακτηρίων πάχους 1 κυττάρου) Κάθε ιός μολύνει 1 βακτήριο Μετά από αρκετούς κύκλους ιικού πολλαπλασιασμού, όλα τα βακτήρια στην περιοχή που βρέθηκε ο αρχικός ιός καταστρέφονται Διαυγείς ζώνες: πλάκες Η συγκέντρωση του ιού στο αρχικό εναιώρημα προσδιορίζεται από τον αριθμό των πλακών που σχηματίζονται στο στερεό θρεπτικό Μονάδες σχηματισμού πλακών (Plaque-Forming Units, PFU)

27 Καλλιέργεια ζωϊκών ιών Πειραματόζωα (κουνέλια, ινδικά χοιρίδια) ανοσολογική απόκριση σε ιογενείς λοιμώξεις κλινικά σημεία λοίμωξης θανάτωση εξέταση μολυσμένων ιστών Εμβρυοφόρα αυγά όρνιθας θάνατος εμβρύου βλάβες στα εμβρυϊκά κύτταρα σχηματισμός κακώσεων στις μεμβράνες Κυτταροκαλλιέργειες κυτταροπαθογόνος δράση αρχικές και εμβρυϊκές διπλοειδείς κυτταρικές σειρές (ανάπτυξη για μικρό χρονικό διάστημα) συνεχείς κυτταρικές σειρές (επ αόριστον)

28 Καλλιέργεια σε εμβρυοφόρα αυγά όρνιθας Άνοιγμα οπής στο κέλυφος των εμβρυοφόρων αυγών και έγχυση μιας ποσότητας εναιωρήματος ιού κοντά στην κατάλληλη μεμβράνη. Η ανάπτυξη του ιού ανιχνεύεται από το θάνατο του εμβρύου, τις βλάβες των εμβρυϊκών κυττάρων ή από την παρουσία αλλοιώσεων στις μεμβράνες των αυγών.

29 Κυτταροκαλλιέργειες Ευκαρυωτικά κύτταρα που αναπτύσσονται σε θρεπτικά υλικά προσκόλληση σε γυάλινες ή πλαστικές επιφάνειες πλαστικών ή γυάλινων δοχείων πολλαπλασιασμός σε μονόστιβες επιφάνειες Οι ιοί που μολύνουν τις μονόστιβες επιφάνειες αναγκάζουν τα κύτταρα να εκφυλίζονται ενώ πολλαπλασιάζονται Κυτταροκτόνος δράση: θάνατος Μη κυτταροκτόνος δράση: όχι πρόκληση κυτταρικού θανάτου Κυτταροπαθογόνος δράση ιών (cytopathic effects): ορατές αλλοιώσεις

30 Κυταροπαθογόνος δράση των ιών * * * * * * Inclusion bodies (έγκλειστα): κοκκία που εντοπίζονται στο κυτταρόπλασμα ή τον πυρήνα μολυσμένων κυττάρων (οξύφιλα ή βασεόφιλα) * Cell fusion (συγκύτιο): σύντηξη γειτονικών μολυσμένων κυττάρων σε ένα μεγάλο πολυπύρηνο κύτταρο

31 Άτυπες μορφές ιών Defective viruses για τον πολλαπλασιασμό τους χρειάζονται βοηθητικό ιό μετάλλαξη ή έλλειψη σε τμήμα του γονιδιώματος Pseudovirions περιέχουν DNA από το ευκαρυωτικό κύτταρο μολύνουν κύτταρα αλλά δεν πολλαπλασιάζονται

32 Ιοειδή (viroids) γυμνό μονής έλικας κυκλικό RNA ( νουκλεοτίδια) χωρίς καψίδιο ή έλυτρο δεν έχουν γονίδια δεν κωδικοποιούν καμία πρωτεΐνη πολλαπλασιάζονται καταστροφικές ασθένειες σε καλλιεργούμενα φυτά (αλλαγή χρώματος, παραμόρφωση, διακοπή αύξησης) είσοδος στο φυτικό κύτταρο μέσω τραυματισμών, μυκήτων ή εντόμων

33 Prions μικρά πρωτεϊνικά, λοιμώδη σωμάτια (< 5 nm) χωρίς νουκλεϊκό οξύ κωδικοποιούνται από κυτταρικά γονίδια 9 νευρολογικά νοσήματα σε ζώα γενετικό υπόβαθρο: σε οικογένειες Nόσος των τρελών αγελάδων: άνθρωποι, κατανάλωση μολυσμένου κρέατος εκφυλιστικές παθήσεις στο ΚΝΣ (Creutzfeldt-Jacob disease) με κινητικές διαταραχές και προϊούσα πνευματική έκπτωση πολύ μεγάλη αντοχή σε θερμότητα, UV, φορμαλδεϋδη, νουκλεάσες (A) Normal healthy brain tissue. (B) Brain tissue from the temporal lobe of a patient with Creutzfeldt-Jakob s disease. Note the large spaces in the tissue where the prion proteins have caused damage. Image credits: Nephron via Wikimedia Commons and Sherif Zaki; MD, PhD; Wun-Ju Shieh; MD, PhD, MPH

34 Πως μια πρωτεΐνη μπορεί να είναι λοιμογόνος? Παραγωγή PrP c από τα κύτταρα και έκκριση στην εξωτερική επιφάνεια Παραγωγή PrP Sc από ένα αλλοιωμένο PrP c γονίδιο Αντίδραση PrP Sc με PrP c στην επιφάνεια του κυττάρου Μετατροπή της PrP c σε PrP Sc μέσω της PrP Sc Μετατροπή περισσότερης Πρόσληψη της νέας PrP Sc Συσσώρευση PrP Sc σε PrP c από τη νέα PrP Sc με ενδοκυττάρωση ενδοσώματα 2016 Pearson Education, Inc. Συνεχόμενη συσσώρευση PrP Sc, μεταφορά των περιεχομένων του ενδοσώματος στα λυσοσώματα. Το αποτέλεσμα είναι ο κυτταρικός θάνατος.

35 Διαφορές prions και ιών Χαρακτηριστικό Prions Ιοί Νουκλεϊκό οξύ Όχι Ναι Πρωτεΐνες Αδρανοποίηση από UV, θερμότητα Εμφάνιση στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο Παραγωγή αντισωμάτων Δημιουργία φλεγμονής Κωδικοποιούνται από κυτταρικά γονίδια Όχι Επιμήκη Όχι Όχι Κωδικοποιούνται από ιϊκά γονίδια Ναι Εικοσάεδρη ή ελικοειδής συμμετρία Ναι Ναι

36 Ηλεκτρονικό Μικροσκόπιο Goldsmith CS & Miller SE, 2009: Clinical Microbiology Reviews, 22(4), a small naked icosahedral virus (poliovirus) 2. an enveloped virus with clear surface projections (influenza B virus) 3. a large naked icosahedral virus (adenovirus) 4. a poxvirus particle 5. a helical (like a Slinky) nucleocapsid of Nipah virus

37 Ορολογική μέθοδος ELISA

38 Ορολογική μέθοδος Western Blot

39 Μοριακή μέθοδος Πολυμορφισμοί μήκους περιοριστικών ενζύμων

40 Μοριακή μέθοδος Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR)

41 Μοριακή μέθοδος Reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR)