Εργαστηριακή άσκηση 2: Συγκολλητινοαντιδράσεις. Εργαστήριο Ανοσολογίας Εαρινό εξάμηνο 2019 Υπεύθυνες Διδάσκουσες: Βογιατζάκη Χρυσάνθη, Τσουμάνη Μαρία

Transcript

1 Εργαστηριακή άσκηση 2: Συγκολλητινοαντιδράσεις Εργαστήριο Ανοσολογίας Εαρινό εξάμηνο 2019 Υπεύθυνες Διδάσκουσες: Βογιατζάκη Χρυσάνθη, Τσουμάνη Μαρία

2 Αντιγόνο και Αντίσωμα Αντιγόνο: οποιαδήποτε ξένη προς τον οργανισμό ουσία. Ως αντιγόνο μπορεί να δράσει ένας ολόκληρος μικροοργανισμός (π.χ. ιός, βακτήριο κ.ά.), ένα τμήμα μικροοργανισμού, τοξικές ουσίες που παράγονται από μικροοργανισμούς, η γύρη (αλλεργικές αντιδράσεις), κύτταρα ή ορός από άλλα άτομα ή ζώα κ.ά. Αντίσωμα: είναι πρωτεΐνες μεγάλου μοριακού βάρους που παράγονται και εκκρίνονται από τα ενεργοποιημένα Β-Λεμφοκύτταρα (πλασματοκύτταρα) ως απόκριση στην εισβολή ενός αντιγόνου Αντιγονικός επίτοπος: είναι κάθε προέχουσα χημική διαμόρφωση πάνω στην εξωτερική επιφάνεια του αντιγόνου που μπορεί να συνδεθεί στερεοχημικά με το ομόλογό της αντίσωμα. Ένα αντιγόνο μπορεί να φέρει πολλούς επιτόπους.

3 Μηχανισμός ειδικής άμυνας Χαρακτηριστικά Α) Εξειδίκευση: τα προϊόντα της ανοσολογικής απόκρισης θα δράσουν μόνο εναντίον της ουσίας που προκάλεσε την παραγωγή τους Β) Μνήμη: ο οργανισμός «θυμάται» τα αντιγόνα με τα οποία έχει έλθει σε επαφή, έτσι ώστε μετά από μια πιθανή δεύτερη έκθεσή του σ αυτά να μπορεί να αποκρίνεται ταχύτερα

4 Διαγνωστικές ανοσολογικές μέθοδοι Ορολογικός έλεγχος-διάγνωση λοιμώξεων Συγκολλητινοαντιδράσεις Ιζηματινοαντιδράσεις Ορατή αντίδραση αντιγόνου-αντισώματος (συγκόλληση, σχηματισμός ιζήματος) Ανοσοφθορισμός Ανοσοενζυμικές Ραδιοανοσολογικές Σήμανση Ag ή Ab με διάφορους δείκτες (φθοριοχρώματα, ένζυμα, ραδιοϊσότοπα)

5 Ποιοτικοί Αρνητικό/Θετικό Εργαστηριακοί προσδιορισμοί στην Ανοσολογία Ημιποσοτικοί Τίτλος αραίωσης* Χρήση μαρτύρων Ποσοτικοί Συγκέντρωση *Ορίζεται ως η μεγαλύτερη αραίωση του υπο εξέταση ορού που δίνει θετική αντίδραση

6 Το φαινόμενο της προζώνης Το φαινόμενο προζώνης παρατηρείται όταν στο σύστημα της ανοσολογικής αντίδρασης το αντίσωμα είναι σε περίσσεια εμποδίζοντας τη δημιουργία ανοσοσυμπλέγματος. Το φαινόμενο προζώνης διορθώνεται με αραίωση του ορού. Με άλλα λόγια, τα ψευδώς αρνητικά αποτελέσματα στις χαμηλές αραιώσεις οφείλονται στην παρουσία ατελώς δεσμευτικών αντισωμάτων.

7 Συγκολλητινοαντιδράσεις (1) Η παλαιότερη ανοσολογική τεχνική (1896-Max Gruber &Herbert Durham) Αρχή μεθόδου: ΣΩΜΑΤΙΔΙΑΚΟ Ή ΔΙΑΛΥΤΟ ΑΝΤΙΓΟΝΟ +ΟΜΟΛΟΓΟ ΑΝΤΙΣΩΜΑ Αg:Ab Αg ΣΥΓΚΟΛΛΗΤΙΝΟΓΟΝΟ Ab ΣΥΓΚΟΛΛΗΤΙΝΕΣ IgG, IgM ΣΥΓΚΟΛΛΗΣΗσχηματισμός κροκίδων Ποιοτικός προσδιορισμός Ημιποσοτικός προσδιορισμός 1η φάση: Aναγνώριση του Ag από το Ab, ένωση του Ab με τις καθοριστικές αντιγονικές ομάδες (επίτοποι) πάνω στην επιφάνεια του κυττάρου (ή σωματιδίου) 2η φάση: Συγκόλληση κυττάρων (ή σωματιδίων) που έχουν ενωθεί με τα Abs Σχηματισμός κροκίδων (ορατή συγκόλληση)

8 Συγκολλητινοαντιδράσεις (2) Άμεσες: Ag στην επιφάνεια των κυττάρων πχ. Ομάδες αίματος ΑΒΟ και παράγοντας Rhesus Έμμεσες: Ag στην επιφάνεια σωματιδίων. Χρησιμοποιούνται για την ανίχνευση ενός αντισώματος σε ένα βιολογικό δείγμα. Τα αντιγόνα έναντι του προς εξέταση αντισώματος έχουν προσροφηθεί στα latex σωματίδια. Το αποτέλεσμα είναι να σχηματίζονται κροκίδες. + + Πλεονεκτήματα της μεθόδου: Απλή, Ταχεία, Δεν απαιτεί ειδικό εξοπλισμό

9 Σωματίδια latex Αδρανή σφαιρικά σωματίδια απο πολυστυρένιο διαμέτρου 0,05-2 μm Υδρόφοβα και άρα ιδανικά για την προσρόφηση πρωτεϊνών με παθητικό τρόπο

10 Δικτυωτό πλέγμα Κροκίδες ορατές με γυμνό μάτι, μεγεθυντικό φακό, μικροσκόπιο

11 Εφαρμογές συγκολλητινοαντιδράσεων C-αντιδρώσα πρωτεϊνη (C-reactive protein; CRP) Ρευματοειδής παράγοντας (RF) Αντιστρεπτολυσίνη O (ASTO) Άμεση βακτηριακή συγκολλητινοαντίδραση: ΣΑΛΜΟΝΕΛΛΕΣ Α Β ΣΥΓΚΟΛΛΗΤΙΝΟΑΝΤΙΔΡΑΣΗ WIDAL Salmonella typhie O,H, Salmonella paratyphi A,B- τυφοειδής πυρετός ΒΡΟΥΚΕΛΛΕΣ Α Β ΣΥΓΚΟΛΛΗΤΙΝΟΑΝΤΙΔΡΑΣΗ WRIGHT Brucella abortus.- μελιταίος πυρετός ΡΙΚΕΤΣΙΕΣ Α Β ΣΥΓΚΟΛΛΗΤΙΝΟΑΝΤΙΔΡΑΣΗ WEIL FELIX Ricketsia spp. Εξετάσεις που διενεργούνται μαζί

12 C-αντιδρώσα πρωτεϊνη (C-reactive protein;crp) Η CRP είναι πρωτεΐνη (β-σφαιρίνη) που αποτελείται από πέντε υπομονάδες (πολυπεπτίδια) των 206 αμινοξέων που διατάσσονται συμμετρικά γύρω από ένα κεντρικό άξονα. Τα ιόντα ασβεστίου (Ca ++ ) που συνδέουν κάθε υπομονάδα πολυπεπτιδίων βοηθούν στην ένωση του μορίου με τη φωσφατιδυλοχολίνη και τα φωσφολιπίδια της κυτταρικής μεμβράνης, με αποτέλεσμα την ενεργοποίηση της κλασικής οδού του συμπληρώματος και τη φαγοκυττάρωση των συνδεδεμένων με τη CRP υποστρωμάτων. Ενώνεται με το C- αντιγόνο του πνευμονιόκοκκου και σχηματίζει ίζημα. Ανήκει στις πρωτεϊνες οξείας φάσης: μεταβάλλεται η συγκέντρωση της κατά τη διάρκεια της φλεγμονής Η παραγωγή της γίνεται στα ηπατοκύτταρα. Τα ενεργοποιημένα λευκοκύτταρα επάγουν την παραγωγή κυτταροκινών οι οποίες ενεργοποιούν τα ηπατοκύτταρα να παράγουν CRP

13 Ρευματοειδής παράγοντας (Rheumatoid Factor; RF) H ανίχνευση του ρευματοειδή παράγοντα χρησιμοποιείται για τη διάγνωση της ρευματοειδούς αρθρίτιδας. Ανιχνεύεται περίπου στο 80% των ασθενών με ρευματοειδή αρθρίτιδα (3:1;γυναίκες:άνδρες). Είναι αυτοαντίσωμα έναντι του τμήματος Fc της ανοσοσφαιρίνης IgG ή των πρωτεϊνών του αρθρικού χόνδρου Αυξάνενται και σε άλλα αυτοάνοσα νοσήματα, σε χρόνιες λοιμώξεις, στην κίρρωση του ήπατος και σε ασθενείς με χρόνια αναπνευστικά προβλήματα

14 Αντιστρεπτολυσίνη O Ανιχνεύει την αιμολυσίνη Ο του στρεπτόκοκκου Α Βοηθά στη διάγνωση στρεπτοκοκκικής λοίμωξης από αιμολυτικό στρεπτόκοκκο ομάδας Α ο οποίος προκαλεί ενδοκαρδίτιδα, ρευματοειδή πυρετό στρεπτοκοκκική αμυγδαλίτιδα Φ.Τ. < 200 mg/dl στον ορό Κατά την συγκολλητινοαντίδραση χρησιμοποιούνται σωματίδια latex επικαλλυμένα με στρεπτολυσίνη-ο τα οποία συγκολλώνται όταν έρθουν σε επαφή με το αντίσωμα ASTO.

15 Υλικά Αντιδραστήριο latex Θετικός μάρτυρας Αρνητικός μάρτυρας Τest cards

16 Διεξαγωγή της εργαστηριακής άσκησης 1. Φέρνουμε όλα τα αντιδραστήρια σε θερμοκρασία δωματίου 2. Για το δείγμα: Πάνω σε ειδικά πλακίδια τοποθετούμε μία σταγόνα αντιδραστηρίου latex και μία σταγόνα απο τον υπο εξέταση ορό 3. Για τους μάρτυρες: Σε διαφορετικές θέσεις στα ειδικά πλακίδια τοποθετούμε μία σταγόνα αντιδραστηρίου latex και το θετικό ή αρνητικό μάρτυρα, αντίστοιχα 4. Αναμιγνύουμε τις σταγόνες αντιδραστηρίου-ορού/μαρτύρων και αφήνουμε τα πλακίδια να αναδευτούν για μερικά λεπτά σε ειδικό οριζόντιο αναδευτήρα 5. Παρατηρούμε τον σχηματισμό ή όχι κροκίδωσης στον υπο εξέταση ορό συγκρίνοντας με τον θετικό (έντονη κροκίδωση) και αρνητικό μάρτυρα (πλήρης απουσία κροκίδωσης) Αξιολόγηση αποτελέσματος Θετικό (+) ή αρνητικό (-). Σε περίπτωση θετικού αποτελέσματος μπορούμε να επισημάνουμε τον βαθμό κροκίδωσης με σταυρούς 1-4 (ασθενής-πολύ έντονη κροκίδωση) ή να αραιώσουμε τον ορό και να επισημάνουμε τη μέγιστη αραίωση κατά την οποία παρατηρήσαμε κροκίδωση.

17 Αρνητικός μάρτυρας Θετικός μάρτυρας Εργαστήριο Ανοσολογίας 2019

18 Εργαστήριο Ανοσολογίας 2019