ΠΡΟΣΥΝΕΔΡΙΑΚΗ ΗΜΕΡΙΔΑ 17 ΜΑΪΟΥ ΜΑΡΙΑ ΓΕΩΡΓΙΟΥ Χημικός, PhD ΣΠΥΡΟΣ ΣΠΥΡΙΔΑΚΗΣ Χημικός, MSc

Transcript

1 ΠΡΟΣΥΝΕΔΡΙΑΚΗ ΗΜΕΡΙΔΑ 17 ΜΑΪΟΥ 2012 ΜΑΡΙΑ ΓΕΩΡΓΙΟΥ Χημικός, PhD ΣΠΥΡΟΣ ΣΠΥΡΙΔΑΚΗΣ Χημικός, MSc

2

3 Τι περιλαμβάνει το οπτικό σύστημα; 1. Την πηγή (πηγές) φωτός 2. Διατάξεις για τη μετάδοση ακτινοβολίας 3. Κυψελίδα ροής 4. Διατάξεις συλλογής φωτός 5. Διατάξεις διαχείρισης ακτινοβολίας

4 E=hν h :σταθερά του Planck ν: συχνότητα κύματος

5 Ηλεκτρικό και Μαγνητικό πεδίο Μήκος κύματος (λ) Περίοδος (Τ) Συχνότητα (ν=1/τ) Ε=hν=hc/λ Συνιστώσα ηλεκτρικού πεδίου Συνιστώσα μαγνητικού πεδίου 3rd Ed. Shapiro p 78 4th Ed. Shapiro p 104

6

7 0 o 90 o 180 o 270 o 360 o Wavelength A A+B Amplitude Η συχνότητα του κύματος είναι η ίδια. Το πλάτος ταλάντωσης διπλασιαζεται B Constructive Interference C C+D Διαφορά φάσης 180 o (2 radians) τα δύο κύματα αλληλοαναιρούνται D Destructive Interference Figure modified from Shapiro 3 rd Ed Practical Flow Cytometry Wiley-Liss, p79 4 th Ed. Shapiro p 109

8

9

10 Θεωρία Rayleigh Σωματίδια < λ nm Θεωρία Mie Σωματίδια > λ nm

11 Reflected Beam r i n 1 n 2 Incident Beam Transmitted (refracted)beam t n 1 sin θ i = n 2 sin θ t Snell s Law: Η γωνία ανάκλασης (θ r ) είναι ίση με την γωνία πρόσπτωσης (θ i ) ανεξάρτητα από το υλικό της επιφάνειας Η γωνία διάθλασης (θ t ) εξαρτάται από το είδος του υλικού Η ταχύτητα του φωτός σε υλικό με συντελεστή διάθλασης n είναι c/n 3rd Ed. Shapiro p 81 4th Ed. Shapiro p 106

12 θ c = θ 1 = arcsin(n 2 /n 1 ) Θ=εφ -1 (n 2 /n 1 )

13 θλ Το φως «καμπυλώνεται» και τα χρώματα διαχωρίζονται. Οι ακτίνες με μικρότερο μήκος κύματος «καμπυλώνονται» περισσότερο.

14 Διακριτική Ικανότητα Φακού Θ=1,22λ / D D= διάμετρος οπής

15 ENERGY Jablonski Diagram S 2 Singlet States } { Triplet States Vibrational energy levels Rotational energy levels Electronic energy levels T2 S 1 IsC T 1 ABS ε 0 FL I.C PH IsC S 0 [Vibrational sublevels] 3 rd Ed. Shapiro p 87 4 th Ed. Shapiro p 112 ABS - Absorbance S Singlet Electronic Energy Levels FL - Fluorescence T 1,2 - Corresponding Triplet States I.C.- Nonradiative Internal Conversion IsC - Intersystem Crossing PH - Phosphorescence

16 Fluorescence Intensity Stokes Shift Η διαφορά μεταξύ του μέγιστου του φάσματος απορρόφησης και του μέγιστου του φάσματος εκπομπής Fluorescein molecule Stokes Shift is 20 + nm 495 nm 518 nm Wavelength

17 Απόδοση Φθορισμού (quantum efficiency / yield) Φ= Εκπεμπόμενα Φωτόνια Απορροφούμενα Φωτόνια ΚΡΙΤΗΡΙΑ ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗΣ ΧΡΩΣΤΙΚΩΝ ΣΥΝΤΕΛΕΣΤΗΣ ΑΠΟΡΡΟΦΗΣΗΣ STOKES SHIFT ΑΠΟΔΟΣΗ ΦΘΟΡΙΣΜΟΥ

18 Απόσβεση Φθορισμού (quenching)/environmental effects Διαμοριακές συγκρούσεις ph Βαρέα ιόντα Bleaching Φωσφορισμός ( sec) Σκεδασμός Raman

19 FLUORESENCE RESONANCE ENERGY TRANSFER Molecule 1 Molecule 2 Fluorescence DONOR ACCEPTOR Fluorescence Absorbance PE Absorbance CY5 Wavelength

20 BD Fluorescence Spectrum Viewer

21 Lamps Xenon-Mercury Mercury Lasers Argon Ion (Ar) Krypton (Kr) Helium Neon (He-Ne) Helium Cadmium (He-Cd) YAG (solid State), Diode LED (Light Emitting Diode) Variety of wavelengths, cheap

22 Irradiance at 0.5 m (mw m -2 nm -1 ) Xe Lamp Hg Lamp J.Paul Robinson You can t put any more light through a given area of the specimen than comes from the same area of an extended light Shapiro p125 4 th 3 rd Shapiro p 99 4 th Shapiro p 125

23 Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation TEM 00

24

25 Laser Ιοντών Αερίου Argon Ion (Ar) Ar + 488, 514 Ar ,363 Krypton (Kr) 568, 647 Helium Neon (He-Ne) 633, 543 Helium Cadmium (He-Cd) 325, 354, 441 Dye Lasers Rodahmine 6G Υλικό λ ακτινοβολίας Ισχύς Εξόδου Προφίλ ακτίνας Απόδοση Solid State Lasers Diode Lasers (GaAlAs) (600nm-1000nm) Nd:YAG 1064nm, 532nm, 355nm (frequency doubling /tripling)

26 Blue 488 out Diode 976nm Coherent Laser 1999 (20 mw version) frequency doubler Photo: J. Paul Robinson

27 Κλάση I IM II IIM IIIR IIIB IV Περιγραφή Η ακτίνα δεν βλάπτει τα μάτια ή το δέρμα. Η ακτίνα δεν βλάπτει τα μάτια ή το δέρμα, όταν δεν παρεμβάλλεται συγκεντρωτικός φακός ή άλλα οπτικά είδη. Η ακτίνα δεν βλάπτει τα μάτια ή το δέρμα, όταν η έκθεση δεν ξεπερνάει τα 0,25 sec. Η ακτίνα είναι ορατή στο γυμνό μάτι από τα 400 nm μέχρι τα 700 nm. Όπως η Σειρά 2, όταν δεν παρεμβάλλεται συγκεντρωτικός φακός ή άλλα οπτικά είδη. Η ακτίνα βλάπτει τα μάτια. Η ακτίνα βλάπτει τα μάτια και μπορεί να βλάψει και το δέρμα. Η ακτίνα είναι πολύ επικίνδυνη για τα μάτια και για το δέρμα, ακόμη και έπειτα από διάχυση σε επιφάνειες.

28 sample sheath

29 Vertical beam shaping lens Horizontal beam shaping lens

30

31

32 FS 2 O -19 O SS 90 O FLUORESCENCE

33

34 Field stop / pinhole Laser beam scatter detector Stream in air or a round capillary blocker

35

36

37

38 Π Ρ Ο Σ Θ Ι Ο Σ Σ Κ Ε Δ Α Σ Μ Ο Σ ΠΛΑΓΙΟΣ ΣΚΕΔΑΣΜΟΣ

39 Light cone θ NA=n ( sinθ ) (n=refractive index) Δχ=0,61λ/NA λ=μήκος κύματος Το αριθμητικό άνοιγμα εκφράζει την ικανότητα του φακού να συλέξει ακτινοβολία Η διακριτική ικανότητα του φακού συνδέεται άμεσα με το αριθμητικό άνοιγμα του φακού

40 principal axis Optical centre, C F: focus C F Focal length

41 u u v object 2F F F image object F F 2f u f object v 2F F F 2F object 2f u v image image object F u f v F F f F image

42

43 Συστοιχία φίλτρων ή οπτικές ίνες Flow Cell Gel coupling Pickup Lenses 500 pinhole

44 FL1 PMT 525BP 500 LP 675BP FL4 PMT 670BP FL3 PMT SS detector 575BP FL2 PMT 770BP FL5 PMT

45 Κατηγορίες φίλτρων Φίλτρα απορρόφησης Μεσώ απορρόφησης απορρίπτονται τα ανεπιθύμητα μήκη κύματος ενώ τα υπόλοιπα μεταδίδονται μέσα από το υλικό Φίλτρα παρεμβολής (Interference filters) Λειτουργούν με βάση το φαινόμενο της συμβολής των κυμάτων

46 Filter components Single Optical filter glue

47 Standard Band Pass Filters White Light Source 630 BP10 Transmitted Light nm Light FWHM: Full Width at Half Maximum

48 Light Source 520 LP Transmitted Light >520 nm Light Source 575 SP Transmitted Light <575 nm

49

50 Μειώνουν την ένταση της ακτινοβολίας στο συνολικά Η μείωση της έντασης γίνεται είτε με απορρόφηση είτε με παρεμβολή Είναι ND φίλτρα παρεμβολής που ανακλούν το 50% της προσπίπτουσας ακτινοβολίας ένω μεταδίδουν το υπόλοιπο.

51 95% 86% 77% 69% 86% 66% 90% 95% Ανάκλαση 90% Μετάδοση 95% 86% 77% 81% 90% 66% 77%

52

53 FITC FL1 PMT 525BP 500 LP 675BP FL4 PMT PE-CY5 670BP FL3 PMT ECD SS detector 575BP FL2 PMT PE 770BP FL5 PMT PE-CY7

54 FITC ECD PE-CY7 APC APC-A750 PAC BLUE 550DCSP 650DCSP 710DCSP 480DCSP 595DCSP 730DCSP 750DCSP PE PE-PC5 APC-A700 Krome ORANGE

55

56

57

58 ΜΟΡΦΟΛΟΓΙΑ ΣΥΜΠΑΓΕΙΣ ΟΓΚΟΙ ΕΝΔΟΚΥΤΤΑΡΙΟΣ ΕΝΤΟΠΙΣΜΟΣ ΦΘΟΡΙΣΜΟΥ ΚΑΤΑΣΤΡΟΦΗ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ ΚΙΝΗΤΙΚΗ

59 LASER SCANNING CYTOMETRY

60 Practical Flow Cytometry, Howard Maurice Shapiro - Wiley-Liss (2003) - ISBN PURDUE UNIVERSITY CURRENT PROTOCOLS IN CYTOMETRY, WILEY BECKMAN COULTER BECKMAN COULTER FC500 Flow Cytometer User and Service manual BECKMAN COULTER NAVIOS / GALLIOS Flow Cytometer User and Service manual BECKMAN COULTER MOFLO XDP Flow Cytometer User and Service manual BD BIOSCIENCES Canto II and LSRFortessa instrument brochures INTERNET INTERNET - INTERNET