ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ. Τίτλος:

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΣΤΑ ΠΑΛΙΣΙΑ ΤΟΥ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟΥ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑΤΟΣ ΣΠΟΥΔΩΝ: ΒΑΣΙΚΕΣ ΙΑΤΡΙΚΕΣ ΕΠΙΣΤΗΜΕΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗ: ΠΑΘΟΒΙΟΧΗΜΕΙΑ Τίτλος: Η ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΗΣ ΜΕΤΑΓΓΙΣΗΣ ΑΙΜΑΤΟΣ ΣΤΑ Τ ΡΥΘΜΙΣΤΙΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ ΑΣΘΕΝΩΝ ΠΟΥ ΥΠΟΒΑΛΛΟΝΤΑΙ ΣΕ ΜΕΡΙΚΗ Ή ΟΛΙΚΗ ΑΡΘΡΟΠΛΑΣΤΙΚΗ ΓΟΝΑΤΟΣ Ή ΙΣΧΙΟΥ. ΣΠΑΝΤΙΔΕΑ ΠΑΝΑΓΙΩΤΑ, ΒΙΟΛΟΓΟΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗΣ ΑΙΜΑΤΟΛΟΓΙΑΣ ΠΑΤΡΑ 2012

2 Η Επιβλέπουσα Καθηγήτρια Αθανασία Μουζάκη Καθηγήτρια Τα μέλη της Τριμελούς Εξεταστικής Επιτροπής Αθανασία Μουζάκη Καθηγήτρια Ηλίας Παναγιωτόπουλος Καθηγητής Μαρίνα Καρακάτζα Αναπλ. Καθηγήτρια

3 Πρόλογος Τα πρώτα μου βήματα στον χώρο της έρευνας τα έκανα το 2007, ως προπτυχιακή φοιτήτρια του τμήματος Βιολογίας του Πανεπιστημίου Πατρών. Από τότε μέχρι και σήμερα βρίσκομαι και εργάζομαι στο εργαστήριο της καθηγήτριας Κας Α. Μουζάκη, η οποία αποτελεί για μένα πηγή έμπνευσης. Σήμερα, 5 χρόνια μετά, τελειώνοντας και το μεταπτυχιακό μου στον ίδιο χώρο, θεωρώ τον εαυτό μου πολύ τυχερό γιατί με την επίβλεψη και τις συμβουλές της καθηγήτριάς μου αλλά και την συνεργασία με τους συναδέλφους, κατόρθωσα να γνωρίσω τον τον κόσμο της έρευνας. Το επάγγελμα του βιολόγου είναι συναρπαστικό. Το κύτταρο είναι ένας ζωντανός πολύπλοκος μικροοργανισμός που επικοινωνεί με τα γειτονικά του κύτταρα είτε μέσω αλληλεπιδράσεων είτε μέσω μορίων. Κατορθώνει και εναρμονίζεται με το περιβάλλον και αποκρίνεται στα ερεθίσματα με μοναδικά σωστό τρόπο. Απαιτείται από τον ερευνητή διαρκής κόπος και συνεχές διάβασμα, ώστε να συνδυαστούν οι πληροφορίες τόσο του πάγκου όσο και του διαδικτύου, ώστε να συμπληρωθούν τα κομμάτια που λείπουν στο τεράστιο πάζλ «του ανθρώπινου οργανισμού». Η παρούσα μελέτη ανατέθηκε σε μένα από την αρχή του μεταπτυχιακού και δεν θα μπορούσε να είχε ολοκληρωθεί χωρίς την συμβολή της Κ. Μουζάκη που με τις προτάσεις και τις συμβουλές της ήταν πάντα δίπλα μου να με προτρέπει για το καλύτερο και να μου δίνει ευκαιρίες. Ξεκινώντας αυτή την δουλειά δεν μπορούσα να καταλάβω πόσο σπουδαία ήταν, αλλά την αγάπησα και πιστεύω ότι είναι ένας τομέας που απαιτεί πολύ έρευνα ακόμα, αν και τα αποτελέσματα μπορεί να αποτελέσουν ένα λιθαράκι στον τεράστιο τομέα των μεταγγίσεων. Και φυσικά θα πρέπει να ευχαριστήσω και τον μεταδιδάκτορα και υπεύθυνο του εργαστηρίου μας, Γεωργακόπουλο Τάσο που με τον δικό του μοναδικό τρόπο είναι πάντα δίπλα μας. Μέσα από την εργαστηριακή ζωή ένιωσα και νιώθω καθημερινά πόσο ωραίο είναι το επάγγελμα του ερευνητή και η αλήθεια είναι πως μετά από τόσο καιρό τα παιδιά που δουλεύουμε μαζί δεν είναι απλώς συνάδελφοι αφού περνάμε το μεγαλύτερο μέρος της μέρας μαζί αλλά και φίλοι. Έτσι, θα ήθελα να εκφράσω ένα πολύ μεγάλο ευχαριστώ στον υποψήφιο διδάκτορα Γιάννη Παναγούλια ο οποίος με υπομονή και επιμονή με δίδαξε από την πρώτη στιγμή στο εργαστήριο αλλά και στάθηκε κοντά μου σε όλες τις στιγμές. Με δίδαξε με πολύ μεράκι όλες τις μεθόδους και δέχτηκε την περίοδο που μάθαινα με όλες τις απορίες και τα λάθη μου. Επίσης, θα ήθελα να ευχαριστήσω ιδιαίτερα την συνάδελφο και φίλη Σοφία Γιολδάση που ήταν και είναι δίπλα μου όποτε την χρειάζομαι. Ξεκινήσαμε μαζί και συνεχίζουμε μέχρι και σήμερα. Την εμπιστεύομαι και ελπίζω στο μέλλον να συνεχίσουμε την άψογη συνεργασία μας. Και τέλος, δεν θα πρέπει να παραλείψω να ευχαριστήσω την Ρόδη Μαρία με την οποία συνεργαστήκαμε σε κάποιο σημείο αυτής της μελέτης αλλά και σε όποιο σημείο έχει χρειαστεί η μια την άλλη. Και το νεότερο μέλλος της παρέας μας, την Ιωάννα. Το σημαντικότερο συστατικό της επιτυχίας τόσο της δουλειάς όσο και της μετατροπής των πειραμάτων στην πιο ευχάριστη διαδικασία είναι το πολύ ευχάριστο κλίμα εργασίας και συνεργασίας που επικρατεί στα εργαστήριο και αυτό το έχουμε σίγουρα επιτύχει!!!

4 Επίσης, να μην παραλείψω να ευχαριστήσω τον Ειδικευόμενο της ορθοπεδικής κλινικής, Αλέξη Χατζιαντωνίου για την πολύ καλή συνεργασία και την τεράστια υπομονή που επέδειξε κατά την διάρκεια της μελέτης. Τον ευχαριστώ ιδαίτερα γιατί δεν μου αρνήθηκε ποτέ την βήθειά του και ήταν πάντα εκεί όταν τον χρειάστηκα. Θα ήθελα επίσης να ευχαριστήσω, τον As.Professor Dr. Aristidis Asteinidis από το Drexel University της Philadelphia που μου προσέφερε την δυνατότητα να εργαστώ μαζί του για ένα μικρό χρονικό διάστημα, αλλά και την φίλη μου, PostDoc Erietta Stelekati, από το UPenn της Philadelphia, η οποία με βοήθησε, μου στάθηκε, με συμβουλεύει πάντα και δεν με ξεχνάει ποτέ. Το πιο βασικό πράγμα που μου έμαθε είναι να μην περιμένω πάντα ένα εγχείρημα να είναι μια καλή εμπειρία. Τα χρόνια του μεταπτυχιακού ήταν πολύ εποικοδομητικά για μένα γεμάτα εμπειρίες και αποφάσεις ζωής. Μέσα σε αυτά τα τρία χρόνια μεγάλωσα και ωρίμασα. Πήρα δύσκολες αποφάσεις για τις οποίες είμαι περήφανη και κατόρθωσα να βγω αλώβητη από αυτό. Φυσικά σε αυτό με βοήθησαν οι δικοί μου άνθρωποι οι οποίοι δεν έφυγαν στιγμή από κοντά μου, ακόμα και όταν εγώ ξεπέρασα τα όρια του Ατλαντικού και βρέθηκα στην άλλη άκρη του κόσμου γιατί ήθελα απλώς να ζήσω την εμπειρία. Φυσικά αναφέρομαι πρώτα από όλους στους γονείς μου, οι οποίοι μου αποδεικνύουν καθημερινά την ανιδιοτελή αγάπη τους, είναι πάντα δίπλα μου και με φροντίζουν ακόμα και όταν είναι πολύ δύσκολο για αυτούς χωρίς να περιμένουν από μένα τίποτα. Επίσης, να ευχαριστήσω θερμά τις πολύ καλές μου φίλες Χριστίνα και Αθανασία που είναι πάντα κοντά μου, με ακούνε και με ανέχονται και πάνω από όλα είναι δίπλα μου και με συμβουλεύουν με αγάπη. Αλλά και τις παραπάνω από φίλες μου, μετά από τόσα χρόνια είναι αδερφές μου, τις Δήμητρα και Βίλλυ γιατί απλά βρίσκονται στην ζωή μου πάντα, είναι εκεί ακόμα και όταν είμαστε μακριά, ακόμα και όταν η κάθε μια παίρνει τον δρόμο της στην ζωή. Και τέλος, ίσως το πιο μεγάλο μου ευχαριστώ στον Βασίλη μου, ο οποίος κάνει ότι μπορεί για να είμαι καλά, πιστεύει σε μένα και με βοηθά να γίνω καλύτερος άνθρωπος. Είναι πάντα κοντά μου και με καμάρι με παροτρύνει να κυνηγάμε τα όνειρά μας, τονίζοντάς μου ότι όλα θα πάνε καλά και ότι πάντα βρίσκεται η λύση στα προβλήματά μας. Σας ευχαριστώ πολύ όλους!!!

5 Περίληψη Από την δεκαετία του '70 είναι γνωστό ότι οι αλλογενείς μεταγγίσεις αίματος (ABT) προκαλούν ανοσοκαταστολή, ωστόσο, μετά το 1990 έγινε γνωστό ότι για το φαινόμενο αυτό ευθύνεται ο Τ λεμφοκυτταρικός πληθυσμός των ρυθμιστικών κυττάρων (Tregs). Στην παρούσα εργασία, μελετήθηκε η επίδραση της μετάγγισης σε ασθενείς που είχαν υποβληθεί σε ολική ή μερική αρθροπλαστική γόνατος ή ισχίου, στον πληθυσμό των φυσικών (ntreg) και επαγώγιμων (itreg) Τ ρυθμιστικών κυττάρων. Στους ίδιους ασθενείς μελετήθηκε και η αλλαγή προτύπου στην έκκριση των κυτταροκινών. Συλλέχθηκαν δείγματα ολικού αίματος από 46 ασθενείς, 7 άντρες και 39 γυναίκες. Από αυτούς, οι 36 ασθενείς έλαβαν μετάγγιση (Group1) ενώ οι 10, δεν έλαβαν. Η συλλογή των δειγμάτων έγινε πριν την εγχείρηση (BS), αμέσως μετά το χειρουργείο (Day0), μια εβδομάδα μετά (Day7), ένα μήνα μετά (1month) και κατά τον επανέλεγχο των ασθενών (>3months). Στα δείγματα έγινε απομόνωση των PBMC και καθορίστηκε το ποσοστό των CD4 + CD25 + Foxp3 + και CD4 + CD25 high/+ CD127 low/- Tregs με την μέθοδο FACS ενώ στο πλάσμα καθορίστηκαν τα επίπεδα των κυτταροκινών με τις μεθόδους Cytometric Bead Array (CBA) και ELISA. Επιπρόσθετα, μελετήθηκε η λειτουργικότητας των Treg από δείγμα αίματος ασθενών μέσα στην πρώτη εβδομάδα μετά το χειρουργείο. Καλλιεργήθηκαν διάφοροι λόγοι Tregs: Teff για 72 ώρες, παρουσία PHA και CFSE. Με την μέθοδο Cytometric Bead Array (CBA) καθορίστηκαν τα επίπεδα των κυτταροκινών IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL- 10, TNF-α, IFN-γ ενώ με την μέθοδο της ELISA καθορίστηκαν τα επίπεδα των TNFα και των υποδοχέων TNF-RI(p55/p60) και TNF-RII(p75/p80) καθώς επίσης και οι TGF-β1 και TGF-β2. Από τα πειράματα προέκυψε ότι οι πληθυσμοί τόσο των φυσικών CD4 + CD25 + Foxp3 + όσο και των επαγώγιμων CD4 + CD25 high/+ CD127 low/- Tregs, αυξάνονται μετά το χειρουργείο (day 0), μετά την μετάγγιση, ενώ μειώνονται την πρώτη εβδομάδα μετά το χειρουργείο. Αντίθετα αποτελέσματα παρατηρήθηκαν στους ασθενείς οι οποίοι υποβλήθηκαν σε χειρουργείο αλλά δεν μεταγγίστηκαν. Με τα πειράματα λειτουργικότητας, φάνηκε ότι τα Tregs ήταν λειτουργικά και ικανά να προκαλούν αναστολή του πολλαπλασιασμού των Teff. Σχεδόν όλες οι κυτταροκίνες

6 που αναλύθηκαν, οι IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, TNF-α, IFN-γ, ο υποδοχέας TNF- RI(p55/p60) και TNF-RII(p75/p80) και TGF-β2 εμφάνισαν αύξηση μετά το χειρουργείο, μετά την μετάγγιση. Ωστόσο, μόνο η αύξηση της IL-6, και των υποδοχέων TNF-RI(p55/p60) και TNF-RII(p75/p80) ήταν στατιστικώς σημαντική μετά το χειρουργείο, μετά την μετάγγιση. Τα επίπεδα του TGF-β1 μειώθηκαν μετά το χειρουργείο, μετά την μετάγγιση (Th3 απόκριση). Συμπερασματικά, τα ποσοστά των Tregs αυξήθηκαν στους ασθενείς που υποβλήθηκαν σε αρθροπλαστική και μεταγγίστηκαν. Οι πληθυσμοί των Tregs παρέμειναν αυξημένοι μέχρι και τον πρώτο μήνα μετά το χειρουργείο. Τα Tregs είναι λειτουργικά και ικανά να καταστέλλουν τον πολλαπλασιασμό των Teff, παρουσία PHA. Μετά το χειρουργείο, ύστερα από μετάγγιση, τα επίπεδα των IL-6, TNF-RI και TNF-RII αυξάνονται ως αντίδραση κατά του μοσχεύματος. Μετά την εγχείρηση (day 0) και μετά από μετάγγιση, οι ασθενείς αναπτύσσουν Th1 απόκριση και πολλαπλασιασμό των Tregs. Σταδιακά, τα Tregs καταστέλλουν τις προφλεγμονώδης αποκρίσεις μέχρι να επανέλθει η ισορροπία των ληπτών μετά την εγχείρηση.

7 Abstract Purpose/Objective: Clinical and experimental studies have established that allogeneic blood transfusion (ABT) can cause immunosuppression. In this work we determined whether and to which extend Tregs contribute to this effect. Material and methods: Heparinized peripheral blood samples were collected from 46 patients (7 male and 39 female, age years) that underwent joint replacement surgery. The samples were collected immediately before surgery (BS) and after surgery (AS) on days 0, 7, 1 month, and 3 months to 1 year. Thirty six patients received ABT and 10 did not. PBMC were isolated and the numbers and % of CD4 + CD25 + Foxp3 + Tregs and CD4 + CD25 high/+ CD127 low/- Tregs were determined by FACS. Tregs and T effectors (Teff) were isolated from patients on days 0-7 and Treg functional assays were performed by culturing Tregs with PHA-stimulated Teff at different ratios for 72h with CFSE, and analyzed by FACS. Cytokine serum level determined with Cytometric Bead Array (CBA) for IL-2, IL- 4, IL-5, IL-6, IL-10, TNF-α, IFN-γ and ELISA for TNF-α, the receptor TNF-RI(p55/p60) and II(p75/p80), TGF-β1 and β2. Results: Both, natural (CD4 + CD25 + Foxp3 + ) and inducible (CD4 + CD25 high/+ CD127 low/- ) Tregs increased in day 0 and decreased in day 7 until BS levels, after ABT. Opposite results (small reduction) observed in patients without ABT. With functional assays proved that Tregs are functional and suppress the T-cell proliferation. IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, TNF-α, IFN-γ, the receptor TNF-RI(p55/p60) and II(p75/p80), TGFβ1 and β2 increased after the surgery, after ABT. IL-6, TNF-RI(p55/p60) and II(p75/p80) levels increased with SSD after the surgery, after ABT. TGF-β1 levels decreased in day 0 until BS levels (Th3 response). Th3 cells growth from CD4 + CD25 - FoxP3 - Th0 peripheral cells. Th3 prevents maturation of DCs, Th2 T-cells. Induce the TGF-β secretion and inhibit IL-2 and antibodies secretion. Conclusion: In patients underwent scheduled joint replacement surgery, Tregs increased after ABT until 1 month and are functional and suppress Teff proliferation under PHA condition. IL-6, TNF-RI and TNF-RII are activation markers of immune system and suppressed after ABT. In day 0, IL-6, TNF-RI and II levels increased as a reaction graft against host s antigen. After surgery (day 0), patients develop Th1 response and Tregs proliferation, after ABT. Gradually, Tregs suppress the proinflammatory responses until the balance in the recipient, after the surgery.

8 Περιεχόμενα Πολύ γενικά... σελ Το Ανοσοποιητικό Σύστημα... σελ. 2-6 Αρθροπλαστική γόνατος... σελ. 7-8 Αρθροπλαστική Ισχίου... σελ Συντομογραφίες... σελ Κεφάλαιο 1 ο : Θεωρητικό Μέρος... σελ Εισαγωγή... σελ Ανοσοτροποποιητικές επιδράσεις αποθηκευμένου σελ.19 αίματος Χαρακτηριστικά των ρυθμιστικών κυττάρων - Treg... σελ Η λειτουργία του Foxp3... σελ Τα CD4+CD25+ Treg διακρίνονται κυρίως σε φυσικά ή σελ επαγώμενα Τρόποι δράσης των ρυθμιστικών κυττάρων... σελ Αναγνώριση των αντιγόνων από τα CD4 + CD25 + Treg... σελ Βασικοί μηχανισμοί της λειτουργίας των Treg... σελ Πόσους μηχανισμούς χρειάζονται τα TReg... σελ Πως επιλέγεται κάθε φορά ο κατάλληλος ρυθμιστικός σελ μηχανισμός Η καταστολή μέσω των Treg εμφανίζει ειδικότητα για τα σελ.37 αντιγόνα Τα Treg αναγνωρίζουν ίδια, ξένα ή και τα δυο... σελ Πως γνωρίζουν τα Treg ποια Th πρέπει να σελ.39 καταστείλουν Ανοσοτροποποιητικές επιδράσεις της μετάγγισης... σελ Σκοπός της εργασίας... σελ

9 Κεφάλαιο 2 ο : Υλικά και μέθοδοι... σελ Υλικά και μέθοδοι... σελ Δείγματα και ασθενείς... σελ Απομόνωση εμπύρηνων κυττάρων από αίμα με σελ. 45 βαθμίδωση φικόλης Υπολογισμός αριθμού κυττάρου με την χρήση του σελ 46 αιμοκυτταρομέτρου Ανάλυση με κυτταρομετρία ροής... σελ Χρώση επιφανειακών δεικτών... σελ Ανίχνευση του μεταγραφικού παράγοντα FoxP3 με σελ ενδοκυττάρια χρώση Μέτρηση των κυτταροκινών στο πλάσμα του αίματος... σελ Μέτρηση κυτταροκινών με την μέθοδο CBA... σελ Μέτρηση κυτταροκινών με την μέθοδο της ELISA... σελ Πειράματα λειτουργικότητας των Τregs... σελ Απομόνωση των ρυθμιστικών κυττάρων του αίματος... σελ Χρώση με CFSE... σελ Στατιστική ανάλυση... σελ.57 Κεφάλαιο 3ο - Αποτελέσματα... σελ Προσδιορισμός των CD4 + CD25 +/high FoxP3 + και σελ CD4 + CD25 + CD127 -/low πληθυσμών Ανάλυση των αποτελεσμάτων της κυτταρομετρίας σελ ροής με το πρόγραμμα FlowJo Αύξηση των CD4 + CD25 +/high FoxP3 + μετά την σελ.63 μετάγγιση Αύξηση των CD4 + CD25 + CD127 -/low μετά την σελ.64 μετάγγιση Λειτουργικότητα των Tregs μετά την μετάγγιση... σελ

10 11. Ανάλυση κυτταροκινών... σελ Μεταβολή της IL-6 μετά την μετάγγιση... σελ Μεταβολή των TNF-RI και TNF-RII μετά την σελ μετάγγιση Μεταβολή του TGF-β1μετά την μετάγγιση... σελ Μεταβολή των κυτταροκινών IL-2, IL-4, IL-5, IL-10 σελ IFN-γ και TFG-β2... Κεφάλαιο 4ο- Συμπεράσματα... σελ Βιβλιογραφία... σελ Παράρτημα Ι... σελ Παράρτημα ΙΙ... σελ

11 Πολύ γενικά... 1

12 Το Ανοσοποιητικό Σύστημα Το ανοσοποιητικό σύστημα είναι από τα πιο πολύπλοκα συστήματα του ανθρώπινου οργανισμού. Η κύρια λειτουργία του, είναι η άμυνα του οργανισμού ενάντια σε παθογόνους μικροοργανισμούς ή γενικά σε αντιγόνα. Αποτελείται από ένα σύνολο οργάνων και αρκετούς διαφορετικούς τύπους κυττάρων, τα οποία εξελίχθηκαν για να αναγνωρίζουν ορθά και ειδικά τα αντιγόνα που εισχωρούν στο σώμα. Ως αντιγόνα μπορεί να χαρακτηριστούν ολόκληροι μικροοργανισμοί ή τμήματα, μακρομόρια αυτών. Στον άνθρωπο (και άλλα σπονδυλωτά) οι γραμμές άμυνας είναι δύο, η φυσική και η επίκτητη ανοσία. Η φυσική ανοσία αποτελεί την πρώτη γραμμή άμυνας του οργανισμού και σε αυτήν ανήκουν οι μηχανισμοί δράσης έναντι των μικροβίων, που λειτουργούν με τον ίδιο τρόπο σε καταστάσεις επαναλαμβανόμενων μολύνσεων. Είναι ικανοί να προστατεύουν τον οργανισμό από τα εξωγενή παθογόνα μέχρι να αναπτυχθούν και να δράσουν οι μηχανισμοί της επίκτητης ανοσίας. Οι βασικοί μηχανισμοί είναι οι φυσικοί φραγμοί, διαλυτοί παράγοντες, κύτταρα, και μεταβιβαστές. Αν τα παράσιτα δεν καταπολεμηθούν επιτυχώς με τη φυσική ανοσία, τότε ενεργοποιούνται οι πιο εξελιγμένοι αμυντικοί μηχανισμοί, αυξάνοντας την έκταση και τη δυνατότητα της αμυντικής τους δράσης μετά από έκθεση σε ένα συγκεκριμένο αντιγόνο. Αυτή, η δεύτερη γραμμή άμυνας, ονομάζεται επίκτητη ανοσία και με αυτόν τον τρόπο επιτυγχάνεται η αντίδραση και η προσαρμογή στη μόλυνση. Τα χαρακτηριστικά της, είναι η ειδικότητα, ετερογένεια, μνήμη, αυτορρύθμιση, η ανοχή. Η επίκτητη ανοσία διακρίνεται σε χυμική και κυτταρική ανοσία. Η χυμική ανοσία αποτελεί τον κύριο προστατευτικό μηχανισμό έναντι εξωκυττάριων μικροβίων και των τοξινών τους και μεσολαβείται από τα αντισώματα, που παράγονται από τα Β κύτταρα ενώ η κυτταρική ανοσία, μεσολαβείται από Τ-κύτταρα, τα οποία συνεργάζονται με τα φαγοκύτταρα για την καταστροφή των μικροβίων, όπως βακτήρια, μύκητες και μολυσμένα από ιούς κύτταρα, προάγοντας την καταστροφή τους ή τη λύση των μολυσμένων κυττάρων. 2

13 Το Λεμφικό Σύστημα Τα πρωτογενή λεμφικά όργανα είναι ο θύμος αδένας και ο μυελός των οστών. Σε αυτά γίνεται η τελική διαφοροποίηση των λεμφοκυττάρων (από τα στελεχιαία λεμφοειδή κύτταρα), ο πολλαπλασιασμός και η ωρίμανσή τους σε λειτουργικά κύτταρα. Τα Τ κύτταρα ωριμάζουν στο θύμο αδένα ενώ τα Β κύτταρα στο ήπαρ του εμβρύου και στο μυελό των οστών. Στα δευτερογενή λεμφικά όργανα ανήκουν ο σπλήνας, οι λεμφαδένες, οι ιστοί που σχετίζονται με τους βλεννογόνους, οι αμυγδαλές και οι πλάκες του Peyer στο έντερο. Στάδια της ανοσολογικής απόκρισης. Η ενεργοποίηση του ανοσοποιητικού συστήματος γίνεται με την είσοδο των αντιγόνων στο σώμα και την προσπέλαση της πρώτης γραμμής άμυνας του σώματος, την φυσική ανοσία. Κατά την φυσική ανοσία ενεργοποιούνται τα φαγοκύτταρα τα οποία είναι υπεύθυνα για να εγκλωβίζουν και να καταστρέφουν το αντιγόνο αλλά και να εκθέτουν αντιγονικό τμήμα στην επιφάνειά του. Η έκθεση του αντιγονικού τμήματος πυροδοτεί την ενεργοποίηση της ειδικής ανοσίας, με αποτέλεσμα την κινητοποίηση μηχανισμών που μεσολαβούν στην εξουδετέρωση του αντιγόνου. Το πρώτο στάδιο της ενεργοποίησης που αποτελεί και τη φάση της αναγνώρισης, αφορά τη σύνδεση των αντιγόνων με τους ειδικούς επιφανειακούς λεμφοκυτταρικούς υποδοχείς. Στην συνέχεια, στη φάση της ενεργοποίησης τα λεμφοκύτταρα πολλαπλασιάζονται και διαφοροποιούνται. Ο πολλαπλασιασμός επιτυγχάνεται με διαδοχικές κυτταρικές διαιρέσεις των ειδικών για κάθε αντιγόνο λεμφοκυτταρικών κλώνων, με αποτέλεσμα τη δημιουργία αντίστοιχων λεμφοκυτταρικών πληθυσμών ενώ η διαφοροποίηση περιλαμβάνει τη μετατροπή των λεμφοκυττάρων από κύτταρα αναγνώρισης, σε κύτταρα ικανά να εξουδετερώνουν τα ξένα αντιγόνα. Τέλος, ακολουθεί η δραστική φάση της ανοσοποίησης όπου ειδικά ενεργοποιημένα από το αντιγόνο λεμφοκύτταρα, εκδηλώνουν τη δράση τους προς εξουδετέρωση του αντιγόνου και λέγονται ανοσοδραστικά (effector) κύτταρα. Σε αυτή την φάση συμμετέχουν και μη λεμφικά κύτταρα, μηχανισμοί της φυσικής ανοσίας, όπως η υποβοήθηση φαγοκυττάρωσης αντιγόνων συνδεδεμένων με αντισώματα, η ενεργοποίηση του συστήματος του συμπληρώματος από τα 3

14 αντισώματα, τα οποία επίσης ενισχύουν την αποκοκκίωση των ιστιοκυττάρων και την απελευθέρωση των μεσολαβητών της φλεγμονής. Πολύ σημαντικό σημείο στην διαδικασία της ανοσοποίησης είναι η έκκριση των κυτταροκινών που ενισχύουν τη δράση των φαγοκυττάρων και κινητοποιούν τη φλεγμονώδη αντίδραση και όχι μόνο. Κύτταρα του Ανοσοποιητικού Συστήματος Απαντώνται ως κυκλοφορούντα κύτταρα του αίματος ή της λέμφου και εντοπίζονται συναθροισμένα στα λεμφικά όργανα ή διάσπαρτα σε όλους τους ιστούς του οργανισμού, εκτός από το Κεντρικό Νευρικό Σύστημα και άλλες περιοχές (immunoprivileged) όπως είναι το μάτι και το σπέρμα. Τα κύτταρα διακρίνονται σε κύτταρα της λεμφικής και της μυελικής σειράς. Στα κύτταρα της λεμφικής σειράς ανήκουν τα μικρά (Β και Τ λεμφοκύτταρα) και μεγάλα λεμφοκύτταρα (ΝΚ κύτταρα) ενώ στα κύτταρα της μυελικής σειράς ανήκουν τα μονοπύρηνα φαγοκύτταρα, τα κοκκιοκύτταρα ή κύτταρα φλεγμονής, τα ιστιοκύτταρα και τα δενδριτικά. Λεμφική σειρά- Λεμφοκύτταρα Η διάκριση των υποπληθησμών επιτυγχάνεται μέσω της αναγνώρισης συγκεκριμένων συνδυασμών πρωτεϊνών, στην κυτταρική τους μεμβράνη και ονομάζονται CD, clusters of differentiation. Η διαφορετική έκφραση CD αλλάζει ανάλογα με το στάδιο διαφοροποίησης και τις διάφορες λειτουργίες που εξυπηρετούν οι συγκεκριμένες ομάδες λεμφοκυττάρων. Διακρίνονται σε Β και Τ κύτταρα. Τα Β κύτταρα παράγονται και ωριμάζουν στο μυελό των οστών και είναι υπεύθυνα για την παραγωγή αντισωμάτων. Οι αντιγονικοί υποδοχείς των Β λεμφοκυττάρων είναι μόρια ανοσοσφαιρινών συνδεδεμένα στη μεμβράνη τους. Η αλληλεπίδραση των αντιγόνων με τις μεμβρανικές ανοσοσφαιρίνες, οδηγεί στην ενεργοποίηση των πρώιμων Β κυττάρων όπου ωριμάζουν και διαφοροποιούνται σε πλασματοκύτταρα τα οποία παράγουν και εκκρίνουν τα ειδικά, για κάθε αντιγόνο, αντισώματα τα οποία θα συνδεθούν με τα αντίστοιχα διαλυτά αντιγόνα και θα κινητοποιήσουν τους μηχανισμούς εξουδετέρωσής τους. Τα Τ κύτταρα παράγονται στο μυελό των οστών και στη συνέχεια μεταναστεύουν και ωριμάζουν στο θύμο αδένα. Οι αντιγονικοί υποδοχείς των Τ λεμφοκυττάρων (TCRs, T Cell Receptors), είναι ετεροδιμερής γλυκοπρωτεῒνες που αποτελούνται από α και β αλυσίδες. Για την έκφραση του TCR στη μεμβράνη του Τ 4

15 κυττάρου, είναι απαραίτητη η προηγούμενη μη ομοιοπολική σύνδεσή του με το μόριο CD3. Τα Τ λεμφοκύτταρα αναγνωρίζουν αντιγονικά πεπτίδια που παρουσιάζονται στην επιφάνεια αντιγονοπαρουσιαστικών κυττάρων, συνδεδεμένα με πρωτεΐνες του Μείζωνος Συστήματος Ιστοσυμβατότητας (MHC). Οι σημαντικότεροι υποπληθυσμοί των Τ λεμφοκυττάρων είναι: Τα Βοηθητικά Τ λεμφοκύτταρα φέρουν στην επιφάνειά τους το μόριο CD4 και απαντούν στον αντιγονικό ερεθισμό με έκκριση κυτταροκινών που προάγουν τον πολλαπλασιασμό και την ενεργοποίηση των Τ λεμφοκυττάρων, των Β λεμφοκυττάρων και των μακροφάγων. Τα Κυτταροτοξικά Τ λεμφοκύτταρα - cytotoxic T cells χαρακτηρίζονται από την παρουσία του μορίου CD8 στην επιφάνειά τους, είναι ικανά να προκαλούν την άμεση λύση των κυττάρων που παράγουν ξένα αντιγόνα. Τα ρυθμιστικά Τ λεμφοκύτταρα - T regulatory cells/ Tregs δρουν ως κατασταλτικά κύτταρα αναστέλλοντας την ανοσιακή απάντηση. Και τέλος, τα κύτταρα μνήμης, τα οποία διαφοροποιούνται (σε κύτταρα μνήμης) μετά την επαφή τους με το αντιγόνο. Μπορεί να είναι Β ή Τ λεμφοκύτταρα και έχουν μεγάλο χρόνο ζωής χωρίς να απαιτείται η παρουσία αντιγονικού ερεθίσματος. Βρίσκονται σε κατάσταση ηρεμίας, μέχρι να ξαναέλθουν σε επαφή με το αντιγόνο. Μυελική σειρά: Στην μυελική σειρά ανήκουν τα Μονοπύρηνα Φαγοκύτταρα, Κοκκιοκύτταρα ή Κύτταρα Φλεγμονής, Ιστιοκύτταρα και Δενδριτικά κύτταρα. Επιλογή των Τ λεμφοκυττάρων στο θύμο Τα πρόδρομα Τ λεμφοκύτταρα μεταναστεύουν από το μυελό των οστών στο θύμο αδένα όπου ωριμάζουν και μπορούν να διακριθούν από τη διαφορική έκφραση του CD3 και των συνυποδοχέων CD4 ή CD8. Η ανάπτυξη των Τ λεμφοκυττάρων συνοδεύεται από εκτεταμένο κυτταρικό θάνατο, γεγονός που αντανακλά την έντονη επιλογή των Τ λεμφοκυττάρων και την εξάλειψη εκείνων που παρουσιάζουν ακατάλληλες ειδικότητες υποδοχέα. 5

16 Η επιλογή των Τ λεμφοκυττάρων μπορεί να είναι θετική ή αρνητική. Η θετική επιλογή ρυθμίζεται αποκλειστικά από τα επιθηλιακά κύτταρα του θύμου και εξασφαλίζει ότι όλα τα ώριμα Τ λεμφοκύτταρα θα είναι ικανά να ανταποκρίνονται σε ξένα αντιγόνα που παρουσιάζονται στα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα. Ενώ, η αρνητική επιλογή ρυθμίζεται κυρίως από τα δενδριτικά κύτταρα και τα μακροφάγα. Στην συνέχεια, τα Τ λεμφοκύτταρα μπαίνουν στην κυκλοφορία όπου η τύχη τους καθορίζεται ανάλογα με τον χρόνο επαφής και την χημική τους συγγένεια με τα αντιγόνα. Αν ένα Τ λεμφοκύτταρο δεν έρθει σε επαφή με κάποιο αντιγόνο σε σχετικά μικρό χρονικό διάστημα, που ακόμα δεν γνωρίζουμε ακριβώς, τότε το λεμφοκύτταρο οδηγείται σε απόπτωση από παραμέληση. Ωστόσο, η σύνδεση του λεμφοκυττάρου με το αντιγόνο είναι αναγκαία αλλά όχι ικανή από μόνη της να διασφαλίσει την επιβίωση στα λεμφοκύτταρα. Αυτό που είναι απαραίτητο είναι ο σωστός βαθμός χημικής συγγένειας με τον οποίο θα συνδεθεί το λεμφοκύτταρο με το αντιγόνο. Υψηλή χημική συγγένεια των κυττάρων λειτουργεί ως αποπτωτικό σήμα για τα κύτταρα τα οποία ως σύμπλοκο οδηγούνται σε απόπτωση ενώ χαμηλότερη χημική συγγένεια επάγει την ανοσολογική απόκριση και κινητοποιεί το ανοσοποιητικό σύστημα για την ενεργοποίηση όλων των απαραίτητων κυτταρικών τύπων προκειμένω να καταπολεμηθούν τα αντιγόνα. Τα κυκλοφορούντα Τ λεμφοκύτταρα διακρίνονται περαιτέρω ανάλογα με το αν έχουν έρθει σε επαφή (μνημονικά) ή όχι (παρθενικά) με αντιγόνο. Φύση και ο Ρόλος των Τ Ρυθμιστικών Κυττάρων (Τreg) Τα Τ ρυθμιστικά κύτταρα (Τreg), διακρίνονται από τα άλλα Τ κύτταρα βάσει των ρυθμιστικών λειτουργιών τους και των κυτταροκινών που παράγουν, όπως οι IL- 10 και TGF-β. Η δράση τους είναι κυρίως ανοσοκατασταλτική και υπάρχουν μελέτες που δείχνουν ότι η έλλειψή τους συνδέεται με την αυτοανοσία. Πρόκειται κυρίως για CD4 κύτταρα με φαινότυπου CD4 + CD25 +. Τα Τreg που παράγουν TGF-β χαρακτηρίζονται ως Th3 κύτταρα ενώ αυτά που παράγουν IL-10 ανήκουν στην κατηγορία Tr1. 6

17 Στην παρούσα εργασία επιλέχθηκε η χειρουργική επέμβαση της μερικής ή ολικής αρθροπλαστικής γόνατος ή ισχίου για να αποφευχθούν επιπλοκές στην ανοσοποίηση από άλλα νοσήματα. Παρακάτω θα παραθέσουμε επιγραμματικά αυτές τις διαδικασίες. Αρθροπλαστική γόνατος Η αρθροπλαστική γόνατος εφαρμόζεται σε ασθενείς με καταστάσεις προχωρημένης οστεοαρθρίτιδας ή οστικής νέκρωσης που σαν αποτέλεσμα έχουν τον έντονο πόνο στο γόνατο και άλλες θεραπείες δεν μπορούν να τον καταπολεμήσουν. Με αυτό το χειρουργείο επιτυγχάνεται ανακούφιση από τον πόνο και βελτίωση της κινητικότητας του ασθενούς. Εφαρμόζεται σε ασθενείς όπου ο πόνος είναι έντονος και περιορίζει τις καθημερινές δραστηριότητες, περιορίζει την κίνηση του γόνατος ή πρήξιμο του γόνατος που δεν επιτρέπει την κάμψη και έκταση του γόνατος, όταν όλα τα συντηρητικά μέσα για την ανακούφιση των συμπτωμάτων (ξεκούραση, απώλεια βάρους, φυσιοθεραπεία, βάδιση με μπαστούνι, φάρμακα) έχουν αποτύχει και τέλος, όταν υπάρχει παραμόρφωση (προς τα μέσα ή έξω). Η ηθοπλαστική του γόνατος γίνεται επίσης σε ασθενείς με τραυματισμό του γόνατος, με ρευματοειδή αρθρίτιδα, και άλλες καταστάσεις όπως άσηπτη νέκρωση μηριαίου κονδύλου. Η ηθοπλαστική γόνατος απευθύνεται κυρίως σε ασθενείς άνω των 55 ετών αν και αυτό δεν είναι απόλυτο. 7

18 Διαδικασία: Με την ηθοπλαστική γόνατος επιτυγχάνεται η αντικατάσταση της πάσχουσας άρθρωσης με μεταλλική πρόθεση (πολύ ανθεκτικά κράματα ατσαλιού και τιτανίου, τα οποία είναι απολύτως συμβατά με τον ανθρώπινο οργανισμό και δεν προκαλούν ενεργοποίηση του ανοσοποιητικού συστήματος) ύστερα από κατάλληλη διαμόρφωση των οστών της άρθρωσης (μηριαίο, κνήμη, επιγονατίδα). Έτσι, αποκαθίστανται οι τυχόν αξονικές παραμορφώσεις με τη βοήθεια ακρυλικού τσιμέντου ή ενσφηνώσεων των μεταλλικών μερών της τεχνητής άρθρωσης. Μεταξύ των μεταλλικών μερών προσαρμόζεται ειδικό ανθεκτικό πλαστικό (πολυαιθυλένιο), το οποίο εξυπηρετεί την κίνηση. Τα τμήματα της πρόθεσης μοιάζουν στη φυσιολογική ανατομία του γόνατος και λειτουργούν σαν μια φυσιολογική άρθρωση. Το ποσοστό σοβαρών επιπλοκών της ηθοπλαστικής του γόνατος στη διεθνή βιβλιογραφία είναι μικρότερο από 1% και μπορεί να είναι πνευμονική εμβολή, φλεγμονή, τραυματισμός νεύρου ή δυσκαμψία του γόνατος. Ιατρική Ορθοπεδική Ομάδα ΝΔ Ελλάδος 8

19 Ηθοπλαστική Ισχίου Η άρθρωση του ισχίου αποτελείται από δύο μέρη, μια σφαίρα (τη μηριαία κεφαλή) στη κορυφή του μηριαίου οστού και μια ημισφαιρική υποδοχή (τη κοτύλη) στο οστό της λεκάνης. Τα δυο μέρη του ισχίου αρθρώνονται ενώ μεταξύ των δυο παρεμβάλλεται συνδετικός ιστός, ο οποίος ενώνει, σταθεροποιεί και στεγανοποιεί τις αρθρικές επιφάνειες δημιουργώντας τον αρθρικό θύλακο. Οι επιφάνειες των οστών καλύπτονται από μία λεία ουσία που ονομάζεται αρθρικός χόνδρος, ο οποίος είναι υπεύθυνος για να απορροφά κραδασμούς και σε συνδυασμό με το αρθρικό υγρό επιτρέπει τη κίνηση μεταξύ των επιφανειών με ελάχιστη τριβή. Η ολική ηθοπλαστική ισχίου αντικαθιστά την κατεστραμμένη ισχιακή άρθρωση. Η πιο κοινή αιτία πόνου και δυσλειτουργίας του ισχίου είναι η αρθρίτιδα (οστεοαρθρίτιδα, ρευματοειδής αρθρίτιδα και μετατραυματική αρθρίτιδα είναι οι πιο κοινές μορφές της) και το κάταγμα. Τα κύρια συμπτώματα είναι ο πόνος σε καθημερινές δραστηριότητες όπως σκύψιμο ή βάδισμα, συνεχόμενος πόνος και κατά τη ξεκούραση, δυσκαμψία στο ισχίο (περιορισμός δυνατότητας κίνησης του κάτω άκρου), μικρή έως καθόλου αναλγησία από τα φάρμακα και άλλες θεραπευτικές παρεμβάσεις όπως η φυσιοθεραπεία ή η χρήση μπαστουνιού. Οι ασθενείς που υποβάλλονται σε ολική αρθροπλαστική ισχίου είναι συνήθως 60 με 80 ετών. 9

20 Διαδικασία: Η αρθρίτιδα προκαλεί τη φθορά του αρθρικού χόνδρου, αφήνοντας εκτεθειμένο το υποκείμενο οστό. Σε μία επέμβαση ολικής αρθροπλαστικής ισχίου αποκαθίστανται οι προσβεβλημένες ή κατεστραμμένες επιφάνειες στην ισχιακή άρθρωση, και πιο συγκεκριμένα, αντικαθίσταται η κεφαλή του μηριαίου οστού που έχει υποστεί φθορά, με μεταλλικό ή κεραμικό σφαιρικό εμφύτευμα στερεωμένο σε στυλεό, ενώ στην υποδοχή τοποθετείται πολυαιθυλένιο ή μεταλλικό κυπέλλιο με ένθετο πολυαιθυλενίου (πλαστικό). Η πρόθεση μπορεί να στερεωθεί με τσιμέντο παρόμοιο με το οδοντιατρικό τσιμέντο ή να εφαρμοστεί στην κατάλληλη θέση με την άσκηση πίεσης, χωρίς τη χρήση τσιμέντου. Το ποσοστό σοβαρών επιπλοκών της αρθροπλαστικής ισχίου στη διεθνή βιβλιογραφία είναι μικρότερο από 1% και μπορεί να είναι φλεγμονή, λοιμώξεις, θρόμβους και πιο σπάνια άλλες μείζονες ιατρικές επιπλοκές όπως έμφραγμα ή εγκεφαλικό. 10

21 Συντομογραφίες ABT - allogeneic blood transfusion = αλλογενείς μεταμοσχεύσεις αίματος APCs - antigen-presenting cells = αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα CD4 ή T helpers cells = βοηθητικά Τ κύτταρα CD8 T cytotoxic cells = κυτταροτοξικά Τ κύτταρα CTLA4 - cytotoxic T lymphocyte antigen 4 = κυτταροτοξικό Τ λεμφοκυτταρικό αντιγόνο 4 DC - dendritic-cell = δενδριτικά κύτταρα FITC = φλουορεσκεϊνη (fluorescein) IL 10 = ιντερλευκίνη 10 ITAM - immuno receptor tyrosine-based activation motif = υποδοχέας τυροσίνης itreg - induced Treg = επαγώγιμα ρυθμιστικά κύτταρα LR = αφαίρεση των λευκών αιμοσφαιρίων NK -natural killer cells = κύτταρα φυσικοί δολοφόνοι ntreg - natural Treg = φυσικά ρυθμιστικά κύτταρα PBMCs - peripheral blood mononuclear cells = μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος PE = φυκοερυθρίνη (Phycoerythrin) PE-Cy5 = R- φυκοερυθρίνη (R-phycoerythrin) και κυανίνη (cyanine) PHA - Phytohaemagglutinin = φυτο-αιματογλουτινίνη RBC -red blood cells = ερυθρά αιμοσφαίρια RCT- randomized clinical trials =τυχαιοποιημένες κλινικές μελέτες 11

22 TGF-β - Transforming Growth Factor-β = Τροποποιητικός Αυξητικός Παράγοντας-β TGF-βR - TGF-β receptor = υποδοχέας του TGF-β Th - T helper cells = βοηθητικά Τ κύτταρα βοηθητικά Τ κύτταρα Th0 - naive T helper cells = έχουν περάσει την πρώτη φάση της διέγερσης και είναι σε ηρεμία TRALI - transfusion-related acute lung injury = τραυματισμός των πνευμόνων που προκαλείται από την μετάγγιση. Tregs - T regulatory cells = Τ- ρυθμιστικά κύτταρα WBC - white blood cells = λευκά αιμοσφαίρια 12

23 Κεφάλαιο 1 ο : Θεωρητικό Μέρος 13

24 1. Εισαγωγή: Από την δεκαετία του 1970 είναι γνωστό ότι οι αλλογενείς μεταγγίσεις αίματος (allogeneic blood transfusion-αβτ) έχουν ανοσοτροποποιητικές επιδράσεις και προκαλούν ανοσοκαταστολή (Wood. & Sakaguchi., 2003, Baumgartner et al., 2009). Αυτό το συμπέρασμα, διατυπώθηκε για πρώτη φορά από τους Opelz και τους συνεργάτες του, το 1973, οι οποίοι παρατήρησαν ότι ασθενείς που υπόκειντο σε μεταμόσχευση νεφρών δέχονταν καλύτερα το μόσχευμα αν είχαν πρώτα δεχτεί μετάγγιση αίματος συγκριτικά με αυτούς που δεν είχαν μεταγγιστεί (Opelz, 1973). Το παραπάνω συμπέρασμα επιβεβαιώνεται και σε μελέτη παρατήρησης, από την ίδια ερευνητική ομάδα, 1360 ασθενών όπου αποδείχθηκε πολύ ισχυρή συσχέτιση μεταξύ των ληπτών (πτωματικών μοσχευμάτων) νεφρών και καλής πρόγνωσης ως προς την επιβίωση των ασθενών που είχαν προηγουμένως λάβει μετάγγιση αίματος, ακόμα και μετά από τέσσερα χρόνια μετά την μεταμόσχευση (Opelz, 1978). Το 1975, οι Kilshaw, Brent και Pinto, κατάφεραν να αναγνωρίσουν τον ρόλο των κυττάρων που προκαλούν ανοχή του ανοσοποιητικού μετά την μεταμόσχευση. Έτσι, για πάνω από τριάντα χρόνια έχει γίνει περιγραφή των λεμφοκυτταρικών πληθυσμών, οι οποίοι μπορούν να προκαλέσουν ανοσοκαταστολή. Ωστόσο, αρκετές ομάδες προσπάθησαν κατά την δεκαετία του '80 να βρουν τα μορφολογικά και μοριακά χαρακτηριστικά αυτών των κυττάρων που προκαλούν καταστολή, χωρίς επιτυχία αν και το φαινόμενο της καταστολής επαναλαμβανόταν in vivo, κυρίως σε μοντέλα μεταμόσχευσης. Ο καθορισμός του μοριακού μηχανισμού της ρύθμισης προς την αλλοαπόκριση η οποία μεσολαβείται από Τ κύτταρα ήταν πολύ σημαντική και οδήγησε στην ανακάλυψη των Τ ρυθμιστικών κυττάρων (TReg) τα οποία είναι υπεύθυνα για την ανοσολογική ανοχή που δημιουργείται από την μεταμόσχευση (Wood & Sakaguchi, 2003). Μέχρι και το 1982, οι μεταγγίσεις αίματος ήταν ένα πολύ συχνό και σύνηθες γεγονός στην ιατρική πράξη. Ωστόσο, η αύξηση των κρουσμάτων για αρκετές ασθένειες τις οποίες δεν γνώριζαν ότι μπορούσαν να μεταφερθούν μέσω του αίματος, όπως είναι ο ιός του HIV, η ηπατίτιδα Β και C, η νόσος Creutzfeldt-Jakob και άλλες, κατέστησαν τις μεταγγίσεις ένα πιο πολύπλοκο θέμα (Vidja, 2011, Dilsiz, 2012, El- Faramawy, 2012,), η επιδημία αυτών των ασθενειών ήταν η απαρχή για την 14

25 ανάπτυξη μεθόδων ελέγχου του αίματος, όπου η βελτιστοποίησή τους συνεχίζεται μέχρι και σήμερα. Το 1985, για πρώτη φορά εφαρμόστηκε διαγνωστικός έλεγχος για τον ιό HIV και λίγο αργότερα, το 1987, για τον ιό της ηπατίτιδας Β και C. Τα τελευταία χρόνια γίνεται μεγάλη προσπάθεια, πολύ ενωρίς ανίχνευσης των ιών που μεταδίδονται από το αίμα ώστε να μην ύπαρξη η πιθανότητα μόλυνσης (Contreras, 2011). Σήμερα, η μετάγγιση του αίματος αποτελεί μια διαδικασία ρουτίνας μιας και είναι το βασικό θεραπευτικό εργαλείο για την οξυγόνωση των ιστών για εγχειρισμένους ή μη ασθενείς. Οι ΑΒΤ αποτελούν μια διαδικασία αλλομεταμόσχευσης χωρίς να απαιτείται η ταυτοποίηση των HLA αφού δεν προκαλεί ανοσοποίηση έναντι των HLA αντιγόνων (Innerhofer et al., 1999). Ωστόσο, με τις ΑΒΤ εισέρχεται στον οργανισμό του λήπτη τεράστιος αριθμός αντιγόνων, μεγάλες ποσότητες πλάσματος και λευκών αιμοσφαιρίων τα οποία οδηγούν σε καταστολή (Innerhofer et al., 1999, Innerhofer et al 2000). Πολλοί παράγοντες προκαλούν την ανοσοκαταστολή και σε αυτούς ανήκουν τα λευκά αιμοσφαίρια του δότη (πιο συγκεκριμένα τα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα), διαλυτά μόρια που εκκρίνονται από τα λευκά αιμοσφαίρια, όπως είναι οι κυτταροκίνες, και διαλυτά HLA μόρια, παρόλο που ο ακριβής μηχανισμός δράσης δεν είναι ακόμα ξεκάθαρος (Innerhofer et al., 1999, Baumgartner et al., 2009,). Το μέγεθος της ανοσοκαταστολής είναι ανάλογο με την λειτουργικότητα των αντιγονοπαρουσιαστικών και των Τ κυττάρων του λήπτη αλλά και με την ποσότητα των λευκών αιμοσφαιρίων του δότη, την βιωσιμότητά τους και την ανοσοποίηση που προκαλούν. Μετά από ΑΒΤ έχει επιβεβαιωθεί ο χαμηλότερος ρυθμός πολλαπλασιασμού των CD3 κυττάρων, παρά με αυτόλογες (Innerhofer et al,, 2000). Ανοσοκαταστολή οφειλόμενη σε μεταγγίσεις και οι κλινικές συνέπειες αυτής, παρατηρούνται κυρίως λόγω μειωμένης δριμύτητας του ανοσοποιητικού και αυξημένου κινδύνου μολύνσεων, κυρίως σε ασθενείς με νεοπλασίες, πιο συγκεκριμένα σχετίζονται με επανεμφάνιση καρκίνου, πολυμεταγγιζόμενους ασθενείς ή άλλες ασθένειες (Innerhofer, et al., 1999, Innerhofer, et al 2000, Baumgartner et al., 2009). Με την αφαίρεση των λευκών αιμοσφαιρίων (LR) από τον ασκό ολικού αίματος, ελαττώνεται η ανοσοκαταστολή που προκαλείται από τα λευκά αιμοσφαίρια ή τις κυτταροκίνες του δότη. Έτσι, η λευκαφαίρεση φαίνεται να 15

26 μετριάζει τις ανοσοκατασταλτικές επιδράσεις της ΑΒΤ (Baumgartner et al., 2009). Σύμφωνα με την βιβλιογραφία, οι ΑΒΤ προκαλούν μείωση της έκκρισης της IL-2 και αύξηση των κυτταροκινών IL-4 και IL-10. Αυτό δηλώνει ότι ο συνδυασμός χειρουργικού τραύματος και αλλογενής μετάγγισης προάγει την Th2 απόκριση και τον σχηματισμό αντισωμάτων αλλά σταδιακά καταστέλλεται η Th1 απόκριση οποία μεσολαβείται μέσω υποδοχέων των Τ κυττάρων (Innerhofer et al, 2000). Ήδη από την δεκαετία του 70 ήταν γνωστό ότι η ανοσοκαταστολή οφείλεται σε Τ κυτταρικό πληθυσμό, ο οποίος ενισχύει την ανοσολογική ανοχή και την διάκριση των συστατικών του οργανισμού από τα αντιγόνα (διάκριση του "ιδίου" από το "ξένο"). Αυτό, διατυπώθηκε για πρώτη φορά από τον Gershon το 1969, δηλαδή, σχεδόν από την στιγμή που θεωρήθηκαν τα Τ κύτταρα ξεχωριστός κλάδος των λεμφοκυττάρων (Gershon & Kondo, 1970, Gershon & Kondo, 1971, Gershon et al., 1972, Corthay, 2009). Ωστόσο, μέχρι τα τέλη της δεκαετίας του 1980, η έρευνα για τα κατασταλτικά κύτταρα είχε σταματήσει αφού ο χαρακτηρισμός αυτών των κυττάρων ήταν πολύ δύσκολος λόγω της έλλειψης ειδικών επιφανειακών δεικτών. Στα μέσα της δεκαετίας του 1990, προτάθηκε η ονομασία του πληθυσμού ως Τ ρυθμιστικού πληθυσμού Treg με επιφανειακή έκφραση του δείκτη CD4 (Sakaguchi, 2007, Corthay, 2009). Σήμερα, είναι αποδεκτή η διάκριση των CD4 Τ κυττάρων σε δυο σαφώς διαχωρισμένους πληθυσμούς, τα Treg και τα βοηθητικά Τ κύτταρα (Th). Τα Th κύτταρα επάγουν την ανοσολογική απόκριση (βλέπε παράγραφο, πολύ γενικά) ενώ τα Treg έχουν κατασταλτική δράση. Πολλοί είναι οι μηχανισμοί δράσης έχουν αναφερθεί (Sojka et al.,2008). Ωστόσο, η κύρια λειτουργία των Treg είναι η αποτροπή των αυτοάνοσων νοσημάτων και η διατήρηση της ανοσολογικής ανοχής (Sakaguchi, 1995). Η ανοσοκαταστολή δημιουργείται από τον Τ λεμφοκυτταρικό πληθυσμό των ρυθμιστικών κυττάρων. Τα Tregs με φαινότυπο CD4 + CD25 + επάγουν την ανοσολογική ανοχή και αποτρέπουν την δημιουργία αυτοανόσων καταστάσεων. Χαρακτηρίζονται από μοναδική έκφραση του μεταγραφικού παράγοντα FoxP3, (Ng, 2001, Piccirillo, 2004) ο οποίος παίζει σπουδαίο ρόλο για την ανάπτυξη και την λειτουργικότητα των μορίων της οικογένειας forkhead/winged-helix. Τα Tregs καταστέλλουν τα effector T-κύτταρα και την λειτουργικότητα των δενδριτικών κυττάρων και σταδιακά αμβλύνουν την ανοσολογική απόκριση. Η ανοσοκαταστολή 16

27 που προκαλείται από τα Tregs φαίνεται να είναι υπεύθυνη για την ανοσοπαθολογία ασθενών με τραύμα και σήψη, καθώς οι τραυματισμένοι ασθενείς εμφανίζουν αυξημένα επίπεδα κυκλοφορούντων Tregs (Baumgartner et al., 2009). Η ανοσοκαταστολή επαγώμενη από τα Tregs μπορεί να δρα θετικά ή αρνητικά για τον ασθενή, κατά περίσταση. Αποτελεί κακό προγνωστικό δείκτη για ασθενείς με όγκους γιατί η επαφή των Tregs με τα καρκινικά κύτταρα οδηγεί σε ανοσοκαταστολή. Ωστόσο, σε ασθενείς, όπως μεταμοσχευμένοι, η ανοσοκαταστολή εξυπηρετεί την μηαπόρριψη του μοσχεύματος λόγω της επαγωγής της ανοχής (Baumgartner et al., 2009). Σε καταστάσεις μεταμοσχεύσεων ή αυτοανόσων νοσημάτων, χρησιμοποιούνται μονοκλωνικά αντισώματα CD25 με σκοπό την αποτροπή της οξείας απόρριψης του μοσχεύματος (Vincenti et al 1998, Kuypers et al., 2003, Wood & Sakaguchi, 2003, Bestard, 2005, Rech, & Vonderheide, 2009). Πειράματα σε επίμυες που είχαν υποβληθεί σε μεταμόσχευση καρδιάς και λάμβαναν θεραπεία με κυκλοσπορίνη Α (CsA), έδειξαν ότι είχαν μεγαλύτερα ποσοστά επιβίωσης και για μεγάλα χρονικά διαστήματα όταν λάμβαναν την θεραπεία με CsA. Επίσης, πειράματα λειτουργικότητας των Τ κυττάρων που απομόνωσαν από τους επιβιώσαντες επίμυες, έδειξαν ότι η ανοσολογική ανοχή δημιουργείται από τα CD4 + CD25 + κύτταρα και ότι τα CD4 + CD25 + Τ κύτταρα του δότη, έχουν δυνητικά ρυθμιστικές ιδιότητες τόσο στην επαγωγή του ανοσοποιητικού όσο και την διατήρηση του, σε in vivo καταστάσεις, και στις δυο φάσεις ανοχής των αλλοαντιγόνων σε μύες (Hall et al., 1990, Wood & Sakaguchi, 2003). Σε μεταμοσχεύσεις μυελού των οστών, τα Τregs κύτταρα του δότη ανιχνεύθηκαν στον μυελό των οστών και είχαν προστατευτική δράση έναντι της οξείας απόρριψης του μοσχεύματος (GVHD) (Hoffmann et al., 2002). Επίσης, έχει δειχθεί ότι τα Treg από περιφερικό αίμα είναι φαινοτυπικά και λειτουργικά ενεργά σε αίμα και θύμο αδένα και έτσι, μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως δείκτες ανοσολογικής ανοχής σε κάποιες κλινικές περιπτώσεις, όπως μεταμοσχεύσεις, αυτοανοσία, κυτταρική θεραπεία (Wood & Sakaguchi, 2003). 17

28 Εικόνα 1: Τα Tregs προάγουν την ανοσολογική ανοχή, σχεδιαγραμματική απεικόνιση (Hanidziar, 2010) Μερικές από τις κύριες λειτουργίες των Treg (κάποιες αναφέρθηκαν και πιο πάνω) είναι η ανάπτυξη και διατήρηση της ανοσολογικής ανοχής και με αυτόν τον τρόπο επιτυγχάνεται και η μη ανάπτυξη αυτανοσίας (Sakaguchi et al., 1995, Wang, et al., 2007), η καταστολή αλλεργιών και άσθματος, η επαγωγή της ανοχής σε κάποια αντιγόνα (Chen, et al., 1994, Weiner, 1997, Zhang, et al., 2001) και της μητέρας προς το έμβρυο (Aluvihar et al., 2004), η ρύθμιση της ανοσολογικής αποκρισης (Alpan et al., 2004, Matzinger, 2007), η καταστολή της ενεργοποίησης των Τ κυττάρων από αδύναμο ερέθισμα, ο έλεγχος της ανοσολογικής απόκρισης από τα effector Th κύτταρα (Oldenhove, 2003, Cohn, 2008), η προστασία έναντι των βακτηρίων για την ολοκληρωτική καταστροφή τους από το ανοσοποιητικό σύστημα και τέλος, η καταστροφή των Τ κυττάρων, τα οποία έχουν ενεργοποιηθεί με την πρόσδεση των αγωνιστών υψηλής συγγένειας με τους υποδοχείς τους (Corthay, 2009). Μια άλλη παράμετρος που πρέπει να ερευνηθεί περαιτέρω είναι αλλαγές στα συστατικά του αίματος κατά την αποθήκευση των ασκών. Οι μεταγγίσεις προκαλούν τροποποιήσεις λόγω της συσσώρευσης ανοσολογικών τροποποιητών μέχρι και την μέρα της μετάγγισης. Το αίμα μπορεί να αποθηκευτεί μέχρι και 42 μέρες (Baumgartner et al., 2009). 18

29 1.1. Ανοσοτροποποιητικές επιδράσεις αποθηκευμένου αίματος Κάθε χρόνο στις ΗΠΑ περίπου 5 εκατομμύρια ασθενείς δέχονται μετάγγιση. Ωστόσο, είναι πλέον γνωστό ότι η μεταγγίσεις αίματος προκαλούν ανοσοκαταστολή, ειδικά αν ο ασκός που χορηγείται είναι αποθηκευμένος για πολλές μέρες. Οι ασκοί του αίματος μπορεί να αποθηκευτούν μέχρι 42 μέρες. Αυτή η αποθήκευση προκαλεί αλλοιώσεις, τόσο σε βιοχημικό όσο και μορφολογικό επίπεδο. Για την περαιτέρω μελέτη αυτών των αλλοιώσεων, πολλές τυχαιοποιημένες κλινικές μελέτες (RCT) έχουν πραγματοποιηθεί (Yazdanbakhsh, 2011). Η μετάγγιση με αποθηκευμένο αίμα δημιουργεί ένα φλεγμονώδες μικροπεριβάλλον λόγω της μεταφοράς από τον δότη λευκών αιμοσφαιρίων, ιόντων σιδήρου, υψηλών συγκεντρώσεων λιπιδίων και κομματιών των μεμβρανών των ερυθρών κυττάρων και σχετίζεται με άμεση απόρριψη του μοσχεύματος, αύξηση μικροβιακών λοιμώξεων, αλλοανοσοποίηση από τα λευκά αιμοσφαίρια του δότη και μη αιμολυτική εμπύρετη αντίδραση στην μετάγγιση. Τα λευκά αιμοσφαίρια κατά την αποθήκευση ενεργοποιούνται και απελευθερώνουν κυτταροκίνες και λιπίδια στο πλάσμα του αίματος και ενεργοποιούν τα ουδετερόφιλα για την ανάπτυξη κυτταροτοξικότητας (TRALI). Ωστόσο, η λευκαφαίρεση με χρήση φίλτρων ή ακτινοβολίας μειώνει αλλά δεν εξαλείφει τις ανοσολογικές συνέπειες της μετάγγισης (Yazdanbakhsh, 2011). 2. Χαρακτηριστικά των ρυθμιστικών κυττάρων - Treg Οι επιφανειακοί και μοριακοί δείκτες αποτελούν χρήσιμο εργαλείο για τον καθορισμό και την ανάλυση των κυτταρικών πληθυσμών. Οι ευρέως αποδεκτοί δείκτες των Treg είναι οι CD25 (Sakaguchi et al., 1995 Ng, 2001), cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4 (CTLA-4) (Read, 2000 και Takahashi, 2000), glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor family-related gene (GITR), lymphocyte activation gene-3 (LAG-3), CD127 (Liu, 2006 και Seddiki,2006) και forkhead winged-helix transcription factor box P3 (Foxp3) (Hori, 2003 και Fontenot, 2003). Το μόριο CD25 είναι η α-αλυσίδα του υποδοχέα της IL-2 και εκφράζεται από όλα τα Τ κύτταρα ύστερα από ενεργοποίηση. Η IL-2 είναι αυξητικός παράγοντας των Τ κυττάρων, ο οποίος είναι σημαντικός για τον πολλαπλασιασμό των Τ κλώνων. Ενώ 19

30 το CTLA-4, το GITR και το LAG-3 είναι αρνητικοί ρυθμιστές της ενεργοποίησης των Τ κυττάρων, τα οποία υπερεκφράζονται σε όλα τα CD4 + και CD8 + Τ κύτταρα μετά από 2-3 μέρες ενεργοποίησης των Τ κυττάρων (Seddiki,2006 και Liu, 2006, Corthay, 2009). Ο CD4 + CD25 + Treg πληθυσμός, στους ανθρώπους, αποτελεί το 1-2% των CD4 Τ κυττάρων της περιφέρειας, σε αντίθεση με τα τρωκτικά όπου το ποσοστό αυτό φτάνει το 6-10% (Baecher-Allan, 2001, Jonuleit, 2001). Τα ρυθμιστικά κύτταρα εκφράζουν συνεχώς τα CD4 και CD25 (Ng, 2001, Piccirillo, 2004). Το μόριο CD127, είναι η α αλυσίδα του υποδοχέα της IL-7 και μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να γίνει η διάκριση μεταξύ των CD127 low Treg και CD127 high (Seddiki,2006 και Liu, 2006, Corthay, 2009). Ο Yu και οι συνεργάτες του, αξιολογώντας τους CD4 + CD25 high, CD4 + CD39 +, CD4 + CD73 + και CD4 + CD25 + CD127 low/- Treg κυτταρικούς πληθυσμούς απέδειξαν ότι ο CD4 + CD25 + CD127 low/- πληθυσμός μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ποσοτικοποίηση των Treg (Yu, 2012) Η λειτουργία του Foxp3 Ο μεταγραφικός παράγοντας forkhead box P3, Foxp3 εκφράζεται σχεδόν αποκλειστικά από τα Treg και είναι απαραίτητος για την ανάπτυξη, τη διατήρηση και την λειτουργία των κυττάρων (Hori, 2003, Fontenot, 2003). Εντοπίζεται κυρίως στους λεμφικούς ιστούς και εκφράζεται κυρίως από τα CD4 + και ορισμένα CD8 + Τ κύτταρα (σχεδόν μη ανιχνεύσιμα επίπεδα στα Β κύτταρα, στα γδ κύτταρα, στα ΝΚ κύτταρα, τα μακροφάγα και τα δενδριτικά). Οπότε, τα Treg χαρακτηρίζονται από την συνέκφραση των CD25 και Foxp3 (Corthay, 2009, Haiqi,2011). Η σπουδαιότητα του μεταγραφικού παράγοντα για την λειτουργία των Treg αποδείχθηκε πειραματικά, με αποσιώπηση ολόκληρου το γονιδίου (Fontenot, 2003, Hill, 2007) ή μεταλλάξεις στο γονίδιο (Corthay, 2009), τα αποτελέσματα και στις δυο περιπτώσεις ήταν η ανάπτυξη των αυτοανόσων νοσημάτων, XLAAD (X-linked autoimmunity-allergic dysregulation syndrome) και IPEX (immunodysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, X-linked syndrome). Έτσι, δικαιολογημένα ο Foxp3 θεωρείται ότι είναι ο master regulator ή lineage-specification factor για την ανάπτυξη των Treg. Η διαρκής έκφραση του Foxp3 είναι σημαντική για την διατήρηση της κατασταλτικής ικανότητας των ώριμων Treg στην περιφέρεια 20

31 (Fontenot, 2003, Corthay, 2009). Ωστόσο, δεν φαίνεται η έκφραση του Foxp3 από μόνη της να είναι αρκετή για την ρυθμιστική δράση των κυττάρων, καθώς ένα σημαντικό ποσοστό των ανθρώπινων ενεργοποιημένων Τ κυττάρων που εκφράζουν τον Foxp3 δεν έχουν ρυθμιστική ενεργότητα (Hill, 2007, Haiqi,2011). Ο Foxp3 είναι μεταγραφικός παράγοντας, ο οποίος επικάθεται στο NFAT Binding Site, στον υποκινητή της IL-2 και καταστέλλει την έκφρασή της. Οι NFAT πρωτεΐνες εντοπίζονται στον πυρήνα των Tregs, όπου επιλεκτικά προσδένεται στα γονίδια στόχων του FoxP3 (Wu, 2006). Φαίνεται ότι μπορεί να δράσει ως καταστολέας της μεταγραφής με την λειτουργία της ρύθμισης της απόκρισης των CD4 + T κυττάρων στην ενεργοποίηση. Επίσης, φάνηκε ότι τα CD4 + και CD8 + T κύτταρα μπορεί να υπερυθμίζουν τον FoxP3 και εμφανίζουν τις κατασταλτικές ιδιότητες μετά από ενεργοποίηση. Γενομική ανάλυση έδειξε ότι ο FoxP3 προσδένεται στον υποδοχέα γονιδίων, πολλά από τα οποία σχετίζονται με την σηματοδότηση μέσω του TCR. Μεγάλος αριθμός γονιδίων που επηρεάζονται από τον FoxP3 προκαλούν υπερ- ή υπό- ρύθμιση γονιδίων στα FoxP3 + T κύτταρα, οπότε ο FoxP3 μπορεί να δράσει είτε ως ενεργοποιητής είτε ως αναστολέας (Corthay, 2009, Haiqi,2011) Τα CD4 + CD25 + Treg διακρίνονται κυρίως σε φυσικά ή επαγώμενα. Εικόνα 2: Διάκριση των Tregs και χαρακτηριστικά των ntreg και itreg ( Li, 2010) 21

32 Φυσικά CD4 + CD25 + regulatory T κύτταρα Τα CD4 + CD25 + ntreg αναφέρονται ως φυσικός πληθυσμός ρυθμιστικών κυττάρων, επειδή υπάρχουν φυσιολογικά στον οργανισμό και εκτελούν την ρυθμιστική τους δράση κατά την διάρκεια φυσιολογικής επιτήρησης των αυτοαντιγόνων. Ωστόσο, η προέλευσή τους δεν είναι ακόμα ξεκάθαρη. Μπορεί να αναπτύσσονται στον θύμο αδένα από ένα μοναδικό προγονικό κύτταρο ή να προκύπτουν από ανώριμα CD4 + CD8 + ή CD4 + θυμοκύτταρα τα οποία μπορούν να διαφοροποιηθούν σε Treg υπό συγκεκριμένες καταστάσεις. Η κύρια λειτουργία τους, είναι η αναστολή της ενεργοποίησης των αυτοαντιδρώντων T κυττάρων και παίζουν ρόλο στην διαμόρφωση της ανοσολογικής απόκρισης έναντι αντιγόνων, την παρεμπόδιση και την μείωση της έκφρασης ισχυρής φλεγμονώδους απόκρισης (Baecher-Allan, 2001, Piccirillo, 2004). Φαινοτυπικά, τα ntreg χαρακτηρίζονται από την έκφραση αρκετών δεικτών (CD45RB low, CD38, CD62L hi, DX5, CD103, CTLA4) αλλά κυρίως των CD4 και CD25. Πρόσθετα, μοναδικό χαρακτηριστικό των Τreg αποτελεί η έκφραση του μεταγραφικού παράγοντα FoxP3 (όπως αναφέρθηκε και παραπάνω) (Baecher-Allan, 2001, Ng, 2001, Hori, 2003, Gambineri, 2003, Ochs,2007). Πράγματι, μεταλλάξεις στο γονίδιο του FoxP3, έχουν ως αποτέλεσμα την ανάπτυξη διαφόρων αυτοάνοσων νοσημάτων. Τα ntreg ωριμάζουν στον θύμο αδένα (Piccirillo, 2004). Για την ωρίμανσή τους απαιτείται η ισχυρή ενεργοποίηση του TCR και συνδιέγερση με το μόριο CD28 (Schimpl, 2002). Επαγώγιμα CD4 + CD25 + regulatory T κύτταρα Τα επαγώγιμα Treg ή itreg προκύπτουν είτε από ενεργοποίηση των ώριμων, περιφερικών CD4 + CD25 - T κυττάρων είτε από τον ίδιο ώριμο πρόγονο Τ κυττάρων, ανάλογα τις ποιοτικές και ποσοτικές διαφορές των αντιγόνων, σε μια διαδικασία που είναι εξαρτώμενη από κυτταροκίνες. Τα itreg δημιουργούνται από τα ώριμα CD4 + CD25 - T κύτταρα ύστερα από την επίδραση διαφορετικών διεγερτικών συνθηκών (παρουσία αντιγόνων και ανοσοκατασταλτικών κυτταροκινών, όπως η IL- 10 και TGF-β1, αλλά και η vitamin D3 και η dexamethasone όπου είναι αναστολείς των CD40-CD40L ή των ώριμων πληθυσμών DC) (Ng, 2001, Piccirillo, 2004). 22

33 Εικόνα 3: Διαφοροποίηση των ntreg και itreg Διαχωρισμός των itreg από τα ntreg κύτταρα. Η διάκριση των itreg ή ntreg γίνεται με μεγάλη επιλεκτικότητα και εξαρτάται από την παρουσίαση των αντιγόνων στα κύτταρα και την φύση της φλεγμονώδους απόκρισης (Piccirillo, 2004). Η έκκριση των κυτταροκινών από τα ntreg και η επαγωγή της ανοσολογικής ανοχής, εξαρτάται από τον αριθμό των αντιγόνων, την φύση του οργάνου στόχου, το μέγεθος του αντιγόνου και τα συνδιεγερτικά ερεθίσματα. Καθοριστικά μόρια στην δημιουργία της ανοσοκαταστολής είναι η IL-10 και ο TGF-β1. Ωστόσο, σε in vitro συστήματα ο μηχανισμός καταστολής των ntreg εξαρτάται από την κυτταρική επαφή και όχι από τις κυτταροκίνες (Thornton,1998, Takahashi, 2000, Shevach, 2001). Σε αντίθεση με in vivo καταστάσεις, όπου στην ανοσοκαταστολή οφειλόμενη στα ntreg, εμπλέκονται τόσο η κυτταρική επαφή όσο και η έκκριση των κυτταροκινών IL-10 και TGF-β1. Έτσι, μπορούμε να συμπεράνουμε ότι η καταστολή που προκαλείται από τις κυτταροκίνες είναι χαρακτηριστικό και των itreg αλλά και των ntregs (Piccirillo, 2004). 23

34 Εικόνα 4: Τρόπος δράσης των ntreg και itreg Οι βασικές διαφορές των itreg και ntreg πληθυσμών είναι δυο: 1. Τα ntreg είναι πλήρως λειτουργικά κατά την έξοδό τους από τον θύμο αδένα, ενώ η τελική ωρίμανση των itreg στην περιφέρεια γίνεται μέσω αντιγόνων που συνδέονται με χαμηλή συγγένεια ή της μεταγωγής σήματος μέσω του TCR. Έτσι, τα itreg απαιτούν περαιτέρω διαφοροποίηση με την έκθεσή του σε αντιγόνο (Piccirillo, 2004). 2. Τα itreg δεν χρειάζονται τον συνδιεγέρτη CD28 για την ανάπτυξη και την λειτουργία τους, ωστόσο, το συνδιεγερτικό μόριο CD28 B7 είναι σημαντικό για την αναγέννηση των effector Τ κυττάρων. Παράλληλα, πειραματικά δεδομένα στηρίζουν τη υπόθεση ότι τα ntreg διευκολύνουν την επαγωγή των itreg. Η υπόθεση αυτή προκύπτει από συνκαλλιέργειες ntreg με Th κύτταρα που σαν αποτέλεσμα είχαν την διαφοροποίηση των Th κυττάρων σε Treg πληθυσμό, ο οποίος μπορεί να καταστείλει τις Th1 ή Th2 κυτταρικές αποκρίσεις με τρόπο εξαρτώμενο από τις TGF-β1 και/ή IL-10, in vitro (Piccirillo, 2004). 24

35 Εικόνα 5: Διαφορές των ntreg και itreg 2.3. Τρόποι δράσης των ρυθμιστικών κυττάρων Η ειδική απόκριση των Τ κυττάρων προς κάθε αντιγόνο είναι ένας από τους κύριους μηχανισμούς συντήρησης της ειδικής ανοχής in vivo και του ελέγχου της ομοιόστασης των Τ κυττάρων (Wood & Sakaguchi, 2003). Στην παρακάτω εικόνα φαίνεται γενικά και σχεδιαγραμματικά ο μηχανισμός δράσης των Tregs. Τα Tregs μπορούν να δρουν ανασταλτικά είτε απευθείας στα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα ή απευθείας στα effector κύτταρα, προσδίδοντάς τους είτε οφέλη προς τον οργανισμό, είτε προκαλώντας επιβλαβείς επιδράσεις. Πίνακας 1:Οφέλη και επιβλαβείς επιδράσεις των Τregs οφέλη συντήρηση ομοιόστασης των Τ κυττάρων ανάπτυξη της ανοχής μετά από μεταμοσχεύσεις = αποδοχή του αλλογενούς μοσχεύματος Αποτροπή δημιουργίας αυτοάνοσων καταστάσεων Αποτροπή αλλεργικών ή καταστάσεων υπερευαισθησίας επιβλαβείς επιδράσεις μειωμένη ρύθμισης της ανοσίας έναντι μολύνσεων μειωμένη ρύθμισης της ανοσίας έναντι του όγκου 25

36 Εικόνα 6: Σχεδιαγραμματική απεικόνιση του τρόπου δράσης των Treg Ο παραπάνω μηχανισμός εξυπηρετεί στον έλεγχο της ανοσολογικής απόκρισης, την αναγνώριση των αυτοαντιγόνων, αποτρέπει την ανάπτυξη αυτοανόσων νοσημάτων και εξυπηρετεί στον έλεγχο αποκρίσεων σε μόρια του ξενιστή που δεν ανήκουν στον οργανισμό. Στην κατηγορία αντιγόνων που δεν ανήκουν στον οργανισμό, ανήκουν τα αντιγόνα για το μείζον και έλασσον σύμπλοκο ιστοσυμβατότητας των οργάνων ή κυττάρων των δοτών τα οποία δεν είναι κοινά με τον δέκτη της μεταμόσχευσης, ο οποίος είναι γνωστός και ως δότης αλλοαντιγόνων (Wood & Sakaguchi, 2003). Ο μηχανισμός της ανοχής είναι καλύτερα μελετημένος σε μεταμοσχευμένους ασθενείς. Ύστερα από μεταμόσχευση παρατηρείται, απαλοιφή (deletion), ανεργία, ignorance ή κλωνική απαλοιφή (clonal exhaustion) των Treg γιατί είναι πολύ σημαντική η διατήρηση της μη-απόκρισης της ανοσολογικής απόκρισης σε αλλοαντιγόνα του δότη, in vivo (παράρτημα Ι). Κλινικές και πειραματικές μελέτες αποδεικνύουν ότι για την ανοχή που δημιουργείται έναντι των αντιγόνων υπάρχει ισορροπία μεταξύ ρύθμισης και έλλειψη των Τ κυττάρων, κάτι που αποτελεί αποτελεσματική στρατηγική για τον έλεγχο της ανοσολογικής απόκρισης μετά από μεταμόσχευση κυττάρων (Wood & Sakaguchi, 2003). 26

37 2.4. Αναγνώριση των αντιγόνων από τα CD4 + CD25 + Treg Τα αλλοαντιγόνα μπορούν να αναγνωριστούν από τα Treg μέσω δυο οδών, της άμεσης και της έμμεσης οδού, οι οποίες συνεισφέρουν με διαφορετικό τρόπο στην ανοσορρύθμιση. Κατά την άμεση οδό αλλοαναγνώρισης παρατηρείται αλληλεπίδραση των κυττάρων του δότη με τα αντιγονοπαρουσιατικά κύτταρα του λήπτη μέσω των MHC μορίων. Ενώ κατά την έμμεση οδό, η αλλοαναγνώριση γίνεται ύστερα από επεξεργασία του MHC ή του ελάσσονος συμπλόκου ιστοσυμβατότητας από τα αλλοπεπτίδια των αντιγόνων τα οποία παρουσιάζονται είτε στα MHC μόρια του λήπτη είτε στα APC κύτταρα του λήπτη (Wood & Sakaguchi, 2003, Sánchez- Fueyo et al., 2007). Εικόνα 7: Σχεδιαγραμματική απεικόνιση της άμεσης και έμμεσης οδού αναγνώρισης από τα Treg Η άμεση οδός αλλοαναγνώρισης παρατηρείται στην πρώιμη φάση της απόκρισης μετά την μεταμόσχευση, όταν τα APC κύτταρα του δότη μεταναστεύουν από το μόσχευμα και διεγείρουν τα Τ κύτταρα στους λεμφοειδής ιστούς οδηγώντας σε απόρριψη του μοσχεύματος. Ωστόσο, ο μικρός χρόνος ζωής των APC κυττάρων κυττάρων του δότη οδηγεί στην έμμεση οδό της αλλοαναγνώρισης. Η έμμεση οδός παίζει σημαντικό ρόλο στην οξεία απόρριψη μοσχεύματος και την συνεχόμενη απόκριση έναντι του μοσχεύματος για μεγάλο χρονικό διάστημα (Wood & Sakaguchi, 27

38 2003). Ασθενείς που έλαβαν μετάγγιση αίματος πριν την μεταμόσχευση που ένα αντιγόνο MHC τάξης ΙΙ (HLA-DR) ήταν κοινό μεταξύ του αίματος και του μοσχεύματος είχαν καλύτερη πορεία και λιγότερη απόρριψη του μοσχεύματος μετά την μεταμόσχευση. Έτσι, η άμεση και έμμεση αλλοαναγνώριση (Sánchez-Fueyo et al., 2007). 3. Βασικοί μηχανισμοί της λειτουργίας των Treg Οι μηχανισμοί ρύθμισης του ανοσοποιητικού συστήματος είναι υπεύθυνοι για την διατήρηση της ομοιόστασης, την αποτροπή δημιουργίας αυτοάνοσων καταστάσεων και τον τερματισμό της φλεγμονής επαγώμενης από παθογόνους μικροοργανισμούς και περιβαλλοντικούς παράγοντες. Η περιφερική ανοχή αναπτύσσεται από τα Treg, όπως και η ανοσολογική απόκριση έναντι συγκεκριμένων παθογόνων και των όγκων (Vignali, 2008). Εικόνα 8: Συνέπειες της δράσης των Treg (Priyadharshini, 2011) Η μελέτη των μηχανισμών ρύθμισης των Treg έχει ξεκινήσει από το 1995, αλλά τα τελευταία χρόνια έχει σημειωθεί μεγάλη πρόοδος (Vignali, 2008). Με βάση την λειτουργικότητα των κυττάρων, η ποικιλία των πιθανών μηχανισμών καταστολής από τα Treg μπορούν να ομαδοποιηθούν σε τέσσερεις τρόπους δράσεις: 28

39 1. Καταστολή από ανασταλτικές κυτταροκίνες (suppression by inhibitory cytokines) 2. Καταστολή από λύση των κυττάρων (suppression by cytolysis) 3. Καταστολή μέσω μεταβολικών διαταραχών (suppression by metabolic disruption) 4. Και καταστολή από τροποποίηση της ωρίμασης ή λειτουργίας των δενδριτικών κυττάρων (suppression by modulation of dendritic-cell (DC) maturation or function). Eικόνα 9: Mηχανισμοί καταστολής των Treg (Vignali, 2008) 1. Καταστολή από ανασταλτικές κυτταροκίνες (Suppression by inhibitory cytokines). Η καταστολή των Treg γίνεται μέσω των κατασταλτικών μορίων, ιντερλευκίνη 10 (IL 10), TGF-β και IL 35, οι οποίες αναφέρονται και ως ανασταλτικές κυτταροκίνες. Ωστόσο, υπάρχουν αντικρουόμενα αποτελέσματα σε in vivo και in vitro μελέτες για την δράση αυτών των μορίων (Jonuleit, 2001). Επίσης, σε πειραματικά μοντέλα αλλεργιών ή άσθματος, φάνηκε ότι τόσο η IL 10 όσο και ο 29

40 TGF-β επηρέασαν τους πληθυσμούς των ntreg και itreg κυττάρων, σε συνδυασμό ή μόνες τους και ότι η καταστολή της Th2 απόκρισης in vivo από τα Treg εξαρτάται από την παραγωγή της IL-10, αλλά η παραγωγή της IL 10 από τα Treg δεν είναι απαραίτητη για να παρατηρηθεί καταστολή (Vignali, 2008). Εικόνα 10: Μηχανισμός καταστολής ανασταλτικών κυτταροκινών (Vignali, 2008) Η IL 10: Είναι σημαντική για τον έλεγχο βακτηριακών ή ιικών μολύνσεων, στις οποίες εμπλέκονται τα Treg όπως είναι ο ιός της ηπατίτιδας Β, τα Mycobacterium tuberculosis, Toxoplasma gondii, Leishmania major και Trichinella spiralis. Ωστόσο, η πηγή της IL 10 δεν φαίνεται να είναι τα Treg σε αυτά τα μοντέλα μολύνσεων. Επίσης, στο μικροπεριβάλλον του όγκου υπάρχουν Treg, εξαρτώμενα από την IL 10, ανεξάρτητα από την κυτταρική επαφή (Bergmann, 2007). Παρόμοια, σε πειραματικά μοντέλα τα οποία υπέστησαν καρκινογένεση οφειλόμενη σε ακτινοβόληση με UV ακτινοβολίες, φάνηκε ότι η παραγωγή της IL 10 από τα ρυθμιστικά να εμποδίζει σημαντικά την ανοσία έναντι των όγκων. Πρόσθετα, στην πρόσφατη βιβλιογραφία αναφέρονται οι καινούργιοι ρόλοι της IL 10 που προέρχεται από τα ρυθμιστικά Treg στην επαγωγή της ανοσολογικής ανοχής μεταξύ μητέρας και εμβρύου αλλά και η ανάρρωση από την επαγόμενη μέσω Β κυττάρων αυτοάνοση εγκεφαλομυελίτιδα (Vignali, 2008). Συμπερασματικά, η παραγωγή της IL 10 από τα Treg, μπορούν να δράσει ως μηχανισμός διαμεσολαβούμενος από κύτταρα προκαλώντας καταστολή με τρόπο ανάλογο της ασθένειας και του οργανισμού. Ο TGF-β: Σε in vitro μελέτες με χρήση αντισωμάτων έναντι του TGF-β ή Treg κυττάρων με ανεπάρκεια στον TGF-β, έδειξαν ότι ο TGF-β δεν είναι απαραίτητος για 30

41 την λειτουργία των Treg αλλά είναι απαραίτητη η πρόσδεσή του πάνω στην κυτταρική μεμβράνη των Treg. Επίσης, είναι γνωστό ότι ο TGF-β που παράγεται από τα Treg συμμετέχει καταστολή των effector Τ κυττάρων, δρα έναντι βακτηριακών μολύνσεων και αλλεργικών αποκρίσεων, και συμβάλλει στην ανοσίας έναντι ορισμένων καρκινωμάτων και λεμφωμάτων (Vignali, 2008, Tran, 2012). Επιπλέον, η φλεγμονή στους αεραγωγούς επαγώμενη από την οβαλβουμίνη μπορεί να εξασθενήσει από την οξυγονάση της αίμης 1 (haeme oxygenase 1) μέσω των TGF-β που βρίσκεται πάνω στις μεμβράνες και την έκκριση της IL 10 από τα Treg, αυτή η διαδικασία ενεργοποιεί τα Notch1 HES1 (hairy and enhancer of split 1) στα κύτταρα στόχους. Έτσι, φαίνεται τώρα ότι η διαλυτή μορφή και/ή σύνδεσή του πάνω στην μεμβράνη του TGF-β παίζει ρόλο την φυσική κατάσταση των Treg κυττάρων (Vignali, 2008, Tran, 2012). Η IL 35: Η IL 35 εκφράζεται επιλεκτικά από τα Treg και είναι απαραίτητη για την μεγιστοποίηση της κατασταλτικής τους ενεργότητας. Είναι μέλος της οικογένειας των ετεροδιμερών κυτταροκινών IL 12 και σχηματίζεται από την δημιουργία ζεύγους του γονιδίου 3 του ιού Epstein Barr (Epstein Barr virus-induced gene 3 Ebi3, η οποία σχηματίζει ζεύγος με το p28 από την IL 27) και p35 (ή αλλιώς Il12a, η οποία σχηματίζει ζεύγος με την p40 και σχηματίζει την IL 12). Οι Ebi3 και Il12a εκφράζεται από τα Treg που εκφράζουν τον FoxP3, αλλά όχι από τα κύτταρα σε ηρεμία ή τα ενεργοποιημένα effector Τ κύτταρα, και η έκφρασή τους είναι μεγαλύτερη στα Treg σε κύτταρα που είναι ενεργά κατασταλτικά (Vignali, 2008). Από τα παραπάνω γίνεται σαφές ότι οι ανασταλτικές κυτταροκίνες είναι τρεις, IL 10, IL 35 και TGFβ, και αποτελούν μόρια κλειδιά για την λειτουργία των Treg. Παρά το γεγονός ότι είναι και οι τρείς ανασταλτικές κυτταροκίνες, η έκταση της έκκρισης της κάθε μια και η διαφορετική έκφραση τους ανάλογα με καταστάσεις, την παθογένεια και τον τρόπο ρύθμισης της ομοιόστασης αποδεικνύουν ότι δεν υπάρχουν αλληλεπικαλυπτόμενες λειτουργίες (Vignali, 2008, Tran, 2012). 31

42 2. Καταστολή από λύση των κυττάρων (Suppression by cytolysis). Τα Treg μπορεί να οδηγήσουν στην λύση κυττάρων μέσω της έκκρισης granzymes, πιο συγκεκριμένα τα ntreg εκφράζουν granzyme A. Αυτά τα ένζυμα είναι ο κύριος λόγος της κυτταροτοξικότητας των NK κυττάρων και CD8 Τ κυττάρων (CTLs). Η κυτταροτοξικότητα των Treg μεσολαβείται από τα granzyme A και περφορίνη λόγω του CD18 (Vignali, 2008). Εικόνα 11: Μηχανισμός κυτταρόλυσης (Vignali, 2008) Η παρατήρηση ότι τα Treg μπορεί να έχουν κυτταροτοξική ενεργότητα, επιβεβαιώθηκε από μελέτες στις οποίες τα Treg οδηγούν τα Β κύτταρα σε απόπτωση με τρόπο εξαρτώμενο από το ένζυμο granzyme B και μερικώς εξαρτώμενο από την περφορίνη, με αποτέλεσμα την καταστολή της λειτουργία των Β κυττάρων (Vignali, 2008). Τα Treg αναστέλλουν την καταπολέμηση των όγκων οδηγώντας σε απόπτωση τα ΝΚ και CTLs εξαιτίας της παρουσίας granzyme B και περφορίνης. Ωστόσο, τα effector κύτταρα υπερεκφράζουν τον ειδικό αναστολέα inhibitor SPI6, για το granzyme B με αποτέλεσμα να εμφανίζουν αντίσταση στην καταστολή που μεσολαβείται από τα Treg. Παρόλα αυτά, η πλειονότητα των ερευνητικών δεδομένων δείχνει ότι η λύση των κυττάρων που μεσολαβείται από τα Treg επικεντρώνεται σε μηχανισμούς που μεσολαβούνται από το granzyme B (Vignali, 2008, Kim, 2010, Tran, 2012). 32

43 Εικόνα 12: Σχεδιαγραμματική απεικόνιση των δράσεων του TGF-β (Tran, 2012) 3. Καταστολή μέσω μεταβολικών διαταραχών (suppression by metabolic disruption) (i) Ένας πιθανός μηχανισμός καταστολής των κυττάρων από τα Treg, εμπλέκει την IL 2. Σύμφωνα με αυτόν, η υψηλή έκφραση των επιπέδων του CD25 από τα Treg οδηγεί σε αυξημένη πρόσδεση της IL 2 με τον υποδοχέα της, CD25, με αποτέλεσμα η IL 2 που βρίσκεται στο εξωκυττάριο περιβάλλον να καταναλώνεται από τα Treg και να οδηγεί τα effector κύτταρα σε απόπτωση λόγω της έλλειψης της IL 2 (Vignali, 2008, Kim, 2010). Εικόνα 13: Μηχανισμός μεταβολικών διαταραχών (Vignali, 2008) (ii) Συμπληρωματικά μπορεί να δράσει και η έκφραση και απελευθέρωση νουκλεοτιδίων αδενοσίνης (adenosine nucleosides) από τα CD39 και CD73, τα οποία έχει φανεί ότι μεσολαβούν στην απελευθέρωση αυτών. Μετά την απελευθέρωσή τους, στο εξωκυττάριο περιβάλλον θα προσδεθούν με τους αντίστοιχους υποδοχείς 2Α (adenosine receptor 2A -A 2A R) στα effector κύτταρα. Η πρόσδεση στον υποδοχέα 33

44 A 2A R, αναστέλλει τις λειτουργίες των κυττάρων και επάγει την αναγέννηση των itreg αναστέλλοντας την έκφραση της IL 6 και προάγοντας την έκκριση του TGFβ. Επίσης, η αδενοσίνη εξυπηρετεί την ωρίμανση των DC. Ο TGFβ επάγει την έκφραση του FoxP3, την διαφοροποίηση των Treg, αναστέλλει την αναγέννηση της IL 6 στα Treg και επάγει την έκκριση προ-φλεγμονωδών κυτταροκινών και ανάπτυξης των Th17 (Vignali, 2008, Kim, 2010). Εικόνα 14: Μηχανισμός μεταβολικών διαταραχών (Kim, 2010) (iii) Και τέλος, τα Treg μπορούν να καταστείλουν άμεσα την λειτουργία των effector μέσω του δευτερογενούς μηνύματος του κυκλικού AMP (camp) στα effector T κύτταρα μέσω των μεμβρανικών χασματοσυνδέσεων (Vignali, 2008). 4. Καταστολή από τροποποίηση της ωρίμασης ή λειτουργίας των δενδριτικών κυττάρων (suppression by modulation of dendritic-cell (DC) maturation or function). Τα Treg εξυπηρετούν την ωρίμανση των DCs κυττάρων τα οποία είναι απαραίτητα για την ενεργοποίηση των effector Τ κυττάρων. Πειράματα με την χρήση μικροσκοπίου απέδειξαν ότι υπάρχει άμεση αλληλεπίδραση μεταξύ των Treg και των DCs in vivo. Η ενεργοποίηση των Τ κυττάρων γίνεται μέσω της πρόσδεσης των CTLA4 και CD80 και/ή CD86 μορίων των DCs. Στο εσωτερικό των κυττάρων, αυτή η πρόσδεση, επάγει την παραγωγή του μορίου indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO), το οποίο, επάγει την παραγωγή προαποπτωτικών μεταβολιτών από τον καταβολισμό της τρυπτοφάνης. Το αποτέλεσμα, είναι η καταστολή των effector Τ κυττάρων μέσου ενός μηχανισμού εξαρτώμενου από το CTLA4 ή των αλληλεπιδράσεών του (Vignali, 2008, Kim, 2010). 34

45 Εικόνα 15: Μηχανισμός καταστολής δενδριτικών κυττάρων (Vignali, 2008) Αντίθετη δράση επιδεικνύει η πρόσδεση του μορίου LAG3 με το μόριο MHC τάξης II, με μεγάλη συγγένεια, και οδηγεί στην αναστολή της ωρίμανσης και της λειτουργίας των DC. Το LAG3 είναι ομόλογο του CD4 μορίου αλλά έχει αρνητική ρυθμιστική λειτουργία στα Τ κύτταρα. Με την πρόσδεση του LAG3 στο MHC τάξης II το οποίο εκφράζεται από τα ανώριμα DCs, επάγεται η έκφραση του υποδοχέα ITAM και μέσω ενός ανασταλτικού σηματοδοτικού μονοπατιού, στο οποίο εμπλέκονται εξωκυττάρια σήματα που ρυθμίζουν το μονοπάτι των ERK κινασών, αναστέλλεται η ωρίμανση των DC και μειώνεται η ανοσοδιεγερτική τους ικανότητα (Vignali,2008, Kim, 2010) Πόσους μηχανισμούς χρειάζονται τα TReg. Για την κατασταλτική δράση των Treg μπορεί να χρησιμοποιηθούν όλοι οι παραπάνω μηχανισμοί, μόνη τους ή σε συνδυασμό (Vignali, 2008). 1. Να χρησιμοποιηθεί ένας κατασταλτικός μηχανισμός. Ωστόσο αυτό δεν είναι και τόσο πιθανό αφού κανένα από τα μόρια ή τους μηχανισμούς που περιγράψαμε παραπάνω δεν σχετίζεται με ολοκληρωτική απώλεια της ρυθμιστικής ενεργότητας όταν μπλοκάρεται ή απαλείφεται. Ωστόσο, τα Treg τα οποία παρουσιάζουν έλλειψη σε ένα μόριο όπως η IL 10, IL 35 ή το granzyme B, παρουσιάζουν μειωμένη κατασταλτική λειτουργία. 35

46 2. Να χρησιμοποιηθούν πολλαπλοί, non-redundant, μηχανισμοί για την μέγιστη λειτουργία των Treg κυττάρων. Treg κύτταρα τα οποία παρουσιάζουν έλλειψη σε κατασταλτικά μόρια είναι μη λειτουργικά. Αυτό σημαίνει ότι θα μπορούσαμε, για παράδειγμα, να κάνουμε απαλοιφή μιας σειράς γονιδίων (ίσως δυο έως τέσσερα γονίδια) που θα οδηγήσει σε ολοκληρωτική απώλεια της ενεργότητας των Treg. 3. Να χρησιμοποιηθούν πολλαπλοί, redundant, μηχανισμοί για την μέγιστη λειτουργία των Treg. Αυτός ο συνδυασμός μηχανισμών αποτελεί εφεδρικό σύστημα και εξυπηρετεί στην μετανάστευση των effector Τ κυττάρων έναντι των Treg, ώστε να ξεφεύγουν από τον ρυθμιστικό έλεγχο. Φυσικά μπορεί να υπάρχει και ένα ημί-εφεδρικό (semiredundant) σενάριο Πως επιλέγεται κάθε φορά ο κατάλληλος ρυθμιστικός μηχανισμός. Όλα τα παραπάνω, θα μπορούσαν να ισχύουν υπό το πρίσμα και την προοπτική ενός ρυθμιστικού πληθυσμού με απόλυτη ομοιογένεια. Ωστόσο, κάτι τέτοιο δεν συμβαίνει καθώς ο πληθυσμός των Treg δεν είναι ομοιογενής αλλά αποτελείται από υποπληθυσμούς, κάθε ένας από τον οποίο βασίζεται σε έναν ή περισσότερους ρυθμιστικούς μηχανισμούς. Παραδείγματα αυτής της ετερογένειας αποτελούν ο CC υποδοχέας των χημοκινών 6 (CC chemokine receptor 6 / CCR6), ο οποίος εκφράζεται από έναν μικρό υποπληθυσμό Treg και σχετίζεται με Τ κύτταρα, με φαινότυπο μνημονικών κυττάρων (effector-memory) αλλά και η έκφραση του μορίου HLA-DR, η παρουσία του οποίου συνδέεται με ισχυρή κατασταλτικότητα συγκριτικά με αυτά που δεν το φέρουν στην επιφάνειά τους (Vignali, 2008). Με ποιο κριτήριο επιλέγεται ο ρυθμιστικός μηχανισμός που θα χρησιμοποιηθεί. Διαφορετικοί μηχανισμοί μπορεί να είναι πιο αποτελεσματικοί σε διαφορετικούς τύπους ιστών ή σε διαφορετικό πλαίσιο ασθενειών (Vignali, 2008). 36

47 1. Μπορεί να ακολουθείται μια "ιεραρχία". Από το σύνολο των μηχανισμών που έχουν τα Treg, να χρησιμοποιούν μόνο έναν ή δυο, οι οποίοι να είναι οι πιο κρίσιμοι και οι πιο σημαντικοί σε διάφορες καταστάσεις καταστολής. 2. Μπορεί να προκύπτει "εκ των συμφραζομένων" ποιος είναι ο κατάλληλος. Ανάλογα με το υπόβαθρο ή το πλαίσιο στο οποίο τα Treg βρίσκονται και τον τύπο του στόχου που θέλουν να καταστείλουν. Αυτό συμβαίνει κάθε φορά που ένας κυτταρικός πληθυσμός καταστέλλεται από κυτταροκίνες, ενώ άλλοι, από Treg που προκαλούν λύση των κυττάρων Η καταστολή μέσω των Treg εμφανίζει ειδικότητα για τα αντιγόνα. Τα Treg, όπως και όλα τα CD4 + T κύτταρα, έχουν τον TCR ο οποίος επιτρέπει την αναγνώριση των αντιγονικών πεπτιδίων από τα μόρια MHC τάξης ΙΙ. Η ενεργοποίηση των Th κυττάρων απαιτεί την ειδική αντιγονική αναγνώριση από τον TCR και αυτό αναμενόταν και για τα Treg. Η ενεργοποίηση των Treg είναι ειδική από αντιγόνα και η κατασταλτική ενεργότητα των Treg πυροδοτείται από αυτά. Το ίδιο φαίνεται να απαιτείται και για την λειτουργία των Treg in vivo, μιας και φάνηκε ότι ο πολλαπλασιασμός των Treg στους λεμφαδένες είναι εξαρτώμενος από τα αντιγόνα. Από τα παραπάνω εγείρεται το ερώτημα αν τα Treg και τα Th κύτταρα αναγνωρίζουν το ίδιο αντιγόνο, πειράματα με μεικτές καλλιέργειες έδειξαν ότι τα Treg κύτταρα μπορεί να ενεργοποιηθούν από τα αντιγόνα που καταστέλλουν τον πολλαπλασιασμό των Th κυττάρων με διαφορετικά αντιγονικές ιδιότητες. Αλλά και in vivo, φάνηκε ότι τα Treg καταστέλλουν τα Th κύτταρα με άλλες αντιγονικές ιδιαιτερότητες (Corthay, 2009). Συμπερασματικά, η καταστολή που μεσολαβείται από τα Treg είναι εξαρτώμενη από τα αντιγόνα. Η ενεργοποίηση των Treg και η κατασταλτική ενεργότητα των Treg πυροδοτούνται από ειδικά αντιγόνα. Για τα κύτταρα στόχους, δείχθηκε ότι τα Treg μπορεί να καταστέλλουν τα Th κύτταρα με διαφορετικές αντιγονικές ιδιότητες. Ωστόσο, είναι πιθανό αυτή η καταστολή να είναι πιο αποτελεσματική, οπότε και φυσιολογική, όταν τα Treg και τα κατασταλμένα Th κύτταρα έχουν την ίδια αντιγονική ειδικότητα (Corthay, 2009). 37

48 3.4. Τα Treg αναγνωρίζουν ίδια, ξένα ή και τα δυο. Η ικανότητα των κυττάρων να διαχωρίζουν τα συστατικά του οργανισμού, τα ίδια, από τα ξένα είναι μια κεντρική ιδιότητα των Th κυττάρων. Κατά την ανάπτυξη των Τ κυττάρων στον θύμο αδένα, οι TCR υποδοχείς δημιουργούνται στοχαστικά από αναδιάταξη γονιδίων. Για την αποφυγή της αυτοανοσίας, τα Τ κύτταρα με τους αντίστοιχους TCR υποδοχείς απαλείφονται από το αντιγονικό repertoire ή οδηγούνται σε ανεργία, δηλαδή, λειτουργική αδρανοποίηση (Corthay, 2009). Τα Treg είναι υπεύθυνα για την διατήρηση της αυτό-ανοχής και την αναγνώριση του κάθε αντιγόνου. Επίσης, έχει δειχθεί ότι τα Treg μπορεί να αναγεννώνται στον θύμο αδένα από προγονικά κύτταρα μέσω της πρόσδεσης πεπτιδίων του οργανισμού στον TCR με μεγάλη χημική συγγένεια. Τα CD4 + CD25 + Treg φαίνεται ότι έχουν μεγάλη συχνότητα εμφάνισης των TCR για ειδικά πεπτίδια του οργανισμού (Corthay, 2009). Εικόνα 16: Σχεδιαγραμματική μετατροπή των Tregs, παρουσία του FoxP3 (Li, 2010) 38

49 3.5. Πως γνωρίζουν τα Treg ποια Th πρέπει να καταστείλουν. Τα Treg είναι υπεύθυνα για την καταστολή των κυττάρων αλλά και την διάκριση αυτής της καταστολής μεταξύ των συστατικών του ίδιου του οργανισμού από τα ξένα. Αν δεν συμβεί η κατάλληλη διάκριση, δημιουργείται ανοσοκαταστολή και ο οργανισμός υποκύπτει σε μικροβιακές μολύνσεις ή καρκίνο. Σύμφωνα με το μοντέλο που προτάθηκε από τους Leon et al. (León, 2000) η καταστολή των Treg είναι ειδική για τα αντιγόνα (Corthay, 2009). Ο μηχανισμός καταστολής που έχει προταθεί βασίζεται σε αλληλεπίδραση μεταξύ των Treg, των Th που πρόκειται να κατασταλούν και των αντιγονοπαρουσιαστικών κυττάρων (APC). Ενώ το μοντέλο της σηματοδότησης μέσω TCR από τον Baecher-Allan και τους συνεργάτες του (Baecher-Allan et al., 2002) βασίζεται στην θεωρία ότι τα T κύτταρα στην περιφέρεια εμφανίζουν χαμηλής συγγένειας TCR γιατί τα Τ κύτταρα που εκφράζουν υψηλής συγγένειας TCR για τα αυτό-αντιγόνα απαλείφονται από τον θύμο αδένα μέσω της αρνητικής επιλογής. Κατά την διάρκεια μικροβιακών μολύνσεων, τα συντηρημένα μόρια που σχετίζονται με τα παθογόνα, προσδένονται στους Toll-like υποδοχείς (TLRs) των κυττάρων του ανοσοποιητικού (Corthay, 2009). Ένα τελευταίο μοντέλο για την λειτουργία των Treg είναι το associative recognition of antigen (ARA) των Melvin Cohn και των συνεργατών του (Cohn, 2008) σύμφωνα με το οποίο υπάρχουν Treg κύτταρα που δεν εμπλέκονται στην διάκριση του ιδίου από το ξένο, αλλά ουσιαστικά η λειτουργία τους είναι η ανατροφοδότηση της ανοσολογικής απόκρισης. Σύμφωνα με αυτό, τα Treg είναι ειδικά για τα ξένα αντιγόνα και να καταστέλλουν τα Th κύτταρα με μεγάλη ειδικότητα (Cohn, 2008). 39

50 3.6. Ανοσοτροποποιητικές επιδράσεις της μετάγγισης Σύμφωνα με την βιβλιογραφία και τα όσα αναφέρθηκαν παραπάνω, οι ΑΒΤ προκαλούν ανοσοτροποποιητικές επιδράσεις στον οργανισμό των ληπτών και επάγουν την εμφάνιση επιπλοκών, κυρίως μολύνσεων (Jensen, 1992, Agarwal, 1993). Αυξημένος κίνδυνος λοιμώξεων από βακτήρια έχουν αναφερθεί μετά από εγχειρήσεις σε σπλήνα (Duke, 1993) καρδιά, ορθοπεδικά χειρουργεία (Triulzi, 1992) ή εγχειρήσεις στο ορθό (Jensen, 1996). Σύμφωνα με την μελέτη των Jensen και των συνεργατών του το 1996, εγχειρισμένοι ασθενείς στο ορθό οι οποίοι έλαβαν μετάγγιση με ολικό αίμα εμφάνισαν περισσότερες μολύνσεις συγκριτικά με τις ομάδες των ασθενών που είχαν υποβληθεί στο ίδιο χειρουργείο και έλαβαν μετάγγιση με λευκαφαιρεμένο αίμα ή καθόλου μετάγγιση. Επίσης, στην ομάδα των ασθενών που μεταγγίστηκαν με ολικό αίμα, 30 μέρες μετά το χειρουργείο τα επίπεδα του υποδοχέα της IL-2 παρέμεναν αυξημένα ενώ η IL-6 στην ίδια ομάδα ασθενών παρουσιάστηκε αυξημένη τις πρώτες μέρες μετά το χειρουργείο, ενώ στα φυσιολογικά επίπεδα 30 μέρες μετά το χειρουργείο. Έτσι, μπορούμε να συμπεράνουμε ότι οι μεταγγίσεις παρουσιάζουν ανοσοκατασταλτικές ιδιότητες για τις οποίες σημαντικό ρόλο παίζουν τα APCs και T κύτταρα του δότη (Innerhofer, 2000). Αντικείμενο μελέτης και διαρκούς έρευνας αποτελούν οι διαφορές της μετάγγισης ολικού αίματος συγκριτικά με λευκαφαιρεμένο και η διερεύνηση των ανοσοκατασταλτικών ιδιοτήτων και μηχανισμών. 40

51 4. Σκοπός της εργασίας Ο σκοπός της παρούσας εργασίας είναι η μελέτη των επιδράσεων της μετάγγισης, σε ασθενείς που έχουν υποβληθεί σε μερική ή ολική αρθροπλαστική γόνατος ή ισχίου, στους ρυθμιστικούς πληθυσμούς των CD4 + CD25 + CD127 low και CD4 + CD25 + FoxP3 + και το κυτταρινικό προφίλ των ασθενών. Για την ορθότερη προσέγγιση του θέματος, επιλέχθηκαν ασθενείς οι οποίοι υποβλήθηκαν σε προγραμματισμένο χειρουργείο μερικής ή ολικής αρθροπλαστικής γόνατος ή ισχίου, χωρίς άλλα προβλήματα υγείας εκείνη την χρονική στιγμή και ο αριθμός των δειγμάτων για κάθε ασθενή ήταν πέντε, σε διαφορετικές χρονικές στιγμές. Τα υποκείμενα της μελέτης χωρίστηκαν σε δυο ομάδες, στην ομάδα 1 ανήκουν οι μεταγγισμένοι ασθενείς ενώ στην ομάδα 2, οι μη μεταγγισμένοι. Η δεύτερη ομάδα εξυπηρετεί και την ομάδα ελέγχου της μελέτης. Εικόνα 17: Έκφραση κυτταροκινών από τους κυριότερους κυτταρικούς τύπους (Panagoulias) 41

52 Τα ερωτήματα που τέθηκαν ήταν ο προσδιορισμός της μεταβολής των ρυθμιστικών κυτταρικών πληθυσμών, CD4 + CD25 + CD127 low και CD4 + CD25 + FoxP3 +, στα διάφορα χρονικά σημεία της μελέτης των ασθενών και ο προσδιορισμός της συγκέντρωσης κυτταροκινών χαρακτηριστικές για τους κυριότερους κυτταρικούς πληθυσμούς Th1, Th2, Th3 και Tr1. Στην παρακάτω εικόνα φαίνονται σχεδιαγραμματικά οι κυριότεροι κυτταρικοί πληθυσμοί και χαρακτηριστικές κυτταροκίνες που εκκρίνουν. Και τέλος, μελετήθηκε πειραματικά η λειτουργικότητα των Treg, με πειράματα λειτουργικότητας. 42

53 Κεφάλαιο 2 ο : Υλικά και μέθοδοι 43

54 5. Υλικά και μέθοδοι: 5.1. Δείγματα και ασθενείς: Στην παρούσα μελέτη χρησιμοποιήθηκε ολικό αίμα από ασθενείς που υποβλήθηκαν σε προγραμματισμένη μερική ή ολική αρθροπλαστική γόνατος ή ισχίου από την Ορθοπεδική Κλινική του Περιφερειακού Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Πατρών. Η συλλογή των δειγμάτων έγινε σε αποστειρωμένα, ηπαρινισμένα σωληνάκια και η επιλογή του τύπου της εγχείρησης, έγινε για να αποκλειστούν επιπλοκές και άλλα σοβαρότερα προβλήματα υγείας τα οποία θα επηρέαζαν με οποιοδήποτε τρόπο τα αποτελέσματα της μελέτης. Μελετήθηκαν 46 ασθενείς (7 άνδρες και 39 γυναίκες) με διάμεση ηλικία 71 έτη (εύρος έτη). Ο αριθμός των δειγμάτων για κάθε ασθενή ήταν πέντε και τα δείγματα συλλέχτηκαν σε συγκεκριμένες χρονικές στιγμές. Πριν το χειρουργείο (BS), αμέσως μετά το χειρουργείο (Day 0), μια εβδομάδα μετά το χειρουργείο (Day 7), ένα μήνα μετά το χειρουργείο (1 month) και στον επανέλεγχο (3 μήνες με 1 χρόνο). Η ομάδα ελέγχου της μελέτης, ήταν ασθενείς οι οποίοι υποβλήθηκαν σε αρθροπλαστική γόνατος ή ισχίου αλλά δεν μεταγγίστηκαν κατά το χειρουργείο και σε καμία αλλά χρονική στιγμή της μελέτης. Ο πρώτος διαχωρισμός των ασθενών έγινε με το αν χρειάστηκαν μετάγγιση κατά το χειρουργείο. Έτσι δημιουργήθηκαν οι ομάδα 1 (Group 1) η οποία αποτελείται από 36 άτομα (5 άνδρες και 31 γυναίκες) που μεταγγίστηκαν κατά την διάρκεια του χειρουργείου και η ομάδα 2 (Group 2) η οποία αποτελείται από 10 άτομα (2 άνδρες και 8 γυναίκες) που δεν χρειάστηκαν μετάγγιση. ασθενείς Group 1 Group 2 Ηλικία (σε έτη) Σύνολο Μέση τιμή +/- SD άνδρες 5 γυναίκες /- 15 άνδρες 2 γυναίκες / Πίνακας IΙ: Δημογραφικά στοιχεία ασθενών 44

55 Σε κάθε δείγμα αίματος ακολούθησε φυγοκέντρηση και συλλογή του πλάσματος, για τον προσδιορισμό των κυτταροκινών IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, TNF-α και IFN-γ με την μέθοδο Cytometric Bead Array (CBA) και TNF- RI(p55/p60),TNF-RII(p75/p80) και οι TGF-β1 και β2 με την μέθοδο της ELISA. Και παράλληλα, προσδιορίστηκε ο πληθυσμός των itreg και ntreg κυττάρων με φαινότυπους CD4 + CD25 + FoxP3 + και CD4+CD25+CD127 low με την μέθοδο της κυτταρομετρία ροής και η λειτουργικότητα των πληθυσμών αυτών με συνκαλλιέργειες Treg και Teff σε διάφορους λόγους, για 72 ώρες, παρουσία PHA και CFSE Απομόνωση εμπύρηνων κυττάρων από αίμα με βαθμίδωση φικόλης: Από κάθε ασθενή πήραμε 3 ml αίματος. Η απομόνωση των εμπύρηνων κυττάρων του αίματος γίνεται με φυγοκέντρηση σε βαθμίδωση Φικόλης (LSM- Lymphocyte separation medium), με αναλογία 1 όγκος φικόλης : 3 όγκους αίματος. Διαδικασία: Σε αποστειρωμένο Falcon προσθέτουμε φικόλη σε όγκο ίσο με το 1/3 του συνολικού όγκου. Προσθέτουμε το αίμα με προσοχή, ώστε να μην αναμιχθεί με την τοξική για τα κύτταρα φικόλη. Φυγοκέντρηση στις 2500 στροφές για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου (RT), χωρίς φρένο, ώστε να δημιουργηθεί βαθμίδωση. Από τον διαχωρισμό προκύπτουν: η πάνω στιβάδα, που είναι το πλάσμα του δείγματος, στην ενδιάμεση περιέχονται τα λεμφοκύτταρα, στην πιο κάτω η φικόλη και στην υποκείμενη τα ερυθροκύτταρα. Λαμβάνουμε προσεκτικά τα κύτταρα τις ενδιάμεσης στιβάδας (μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος - PBMCs) Προσθέτουμε ισοτονικό ρυθμιστικό διάλυμα (σκέτο RPMI ή PBS 1x) Φυγοκέντρηση στις 1800 στροφές, για 10 λεπτά στους 4 ο C (2 φορές) Υπολογισμός αριθμού κυττάρων με την χρήση αιμοκυτταρομέτρου Επαναδιάλυση των κυττάρων στον επιθυμητό όγκο, σε πλήρες θρεπτικό υλικό RPMI 1640 (τελική συγκέντρωση κυττάρων: 1-2x10 6 κύτταρα/ml). 45

56 5.3. Υπολογισμός αριθμού κυττάρου με την χρήση του αιμοκυτταρομέτρου: Για τη μέτρηση του συνολικού αριθμού των κυττάρων απαιτούνται 10μl δείγματος. Με τη χρήση μικροσκοπίου έγινε η μέτρηση των κυττάρων στα 25 κεντρικά τετράγωνα, όπου σχηματίζεται η εικόνα του σταυρού και ο αριθμός των κυττάρων, πολλαπλασιάστηκε με το 10 4 κύτταρα/ ml. 46

57 6. Ανάλυση με κυτταρομετρία ροής: 6.1. Χρώση επιφανειακών δεικτών: Ύστερα από την απομόνωση και τον υπολογισμό του αριθμού των PBMCs από το δείγμα των ασθενών. Για τον προσδιορισμό των Treg θα χρησιμοποιήσουμε αντισώματα συζευγμένα με φθοροχρώματα. Πιο συγκεκριμένα, θα χρησιμοποιήσουμε τα φθοροχρώματα FITC=φλουορεσκεϊνη (fluorescein), PE= φυκοερυθρίνη (Phycoerythrin) και PE-Cy5 = R- φυκοερυθρίνη (R-phycoerythrin) και κυανίνη (cyanine) (παράρτημα ΙΙ, παράγραφος 1.1). Διαδικασία: Φυγοκεντρούμε στις 2500rpm, για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, 10 6 κύτταρα. Απορρίπτουμε το υπερκείμενο Προσθέτουμε τις κατάλληλες ποσότητες των επιθυμητών αντισωμάτων CD4- FITC (beckman coulter), CD25- PE Cy5 (beckman coulter) και CD127 - PE (beckman coulter). Επωάζουμε τα δείγματα στο σκοτάδι, για 20 λεπτά, σε θερμοκρασία δωματίου Προσθέτουμε PBS 1x και φυγοκεντρούμε στις 2500 στροφές, για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου (για την απομάκρυνση περίσσειας μη προσδεδεμένων αντισωμάτων) Απόρριψη του υπερκειμένου και προσθήκη PBS 1x Ανάλυση στον κυτταρομετρητή 6.2. Ανίχνευση του μεταγραφικού παράγοντα FoxP3 με ενδοκυττάρια χρώση: Τα ρυθμιστικά κύτταρα είναι τα μοναδικά κύτταρα που εκφράζουν τον μεταγραφικό παράγοντα FoxP3. Έτσι, για τον χαρακτηρισμό των κυττάρων χρησιμοποιήθηκε πέρα από την χρώση για επιφανειακούς δείκτες και ενδοκυττάρια χρώση για τον μεταγραφικό παράγοντα με χρήση του αντισώματος FoxP3- PE Cy5 (ebioscience). 47

58 Ύστερα από την απομόνωση και τον υπολογισμό του αριθμού των PBMCs από το δείγμα των ασθενών. Ακολουθούμε την διαδικασία χρώσης επιφανειακών δεικτών για τα αντισώματα CD4- FITC (beckman coulter), και CD25- PE (BD pharmigen). Επώαση για 20 λεπτά στο σκοτάδι, σε θερμοκρασία δωματίου, προσθήκη ισοτονικού διαλύματος PBS 1x και φυγοκέντρηση στις 2500 στροφές, για 7 λεπτά, σε θερμοκρασία δωματίου. Διαδικασία: Ετοιμάζουμε το fix/perm διάλυμα (1 μέρος concentrate και 3 μέρη diluent) Απομακρύνουμε το υπερκείμενο από το δείγμα και προσθέτουμε PBS 1x (Vortex για λίγα δευτερόλεπτα) Επωάζεται το δείγμα για 30 λεπτά στους 4 0 C Ετοιμάζουμε το διάλυμα perm σε τελική συγκέντρωση 1x και το προσθέτουμε στο δείγμα. Φυγοκεντρούμε στις 2500 στροφές, για 10 λεπτά, απορρίπτουμε το υπερκείμενο και επαναδιαλύουμε σε διάλυμα perm (2 φορές) Προσθέτουμε το αντίσωμα για τον FoxP3 και επωάζουμε για 30 λεπτά, 4 0 C Επαναδιαλύουμε σε διάλυμα perm και μεταφέρουμε σε σωληνάκια RIA Φυγοκεντρούμε στις 2500 στροφές, για 10 λεπτά (2 φορές) Ετοιμάζουμε το διάλυμα λύσης σε τελική συγκέντρωση 1x Απομακρύνουμε το υπερκείμενο και προσθέτουμε το διάλυμα λύσης Επωάζουμε για 15 λεπτά στους 4 0 C και φυγοκεντρούμε στις 2500 στροφές, για 10 λεπτά Προσθήκη διαλύματος perm και φυγοκέντρηση στις 2500 στροφές, για 10 λεπτά, απόρριψη του υπερκειμένου και προσθήκη PBS 1x Ανάλυση στον κυτταρομετρητή 48

59 7. Μέτρηση των κυτταροκινών στο πλάσμα του αίματος: 7.1. Μέτρηση κυτταροκινών με την μέθοδο cytometric beads array (CBA): Για την ανίχνευση των κυτταροκινών στο πλάσμα του αίματος των δειγμάτων των ασθενών χρησιμοποιήθηκε το Human Th1/Th2 Cytokine Kit από την BD biosciense, με δυνατότητα ταυτόχρονης ανίχνευσης για τις κυτταροκίνες IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, TNF και IFN-γ και παράλληλα, με την ίδια μέθοδο μετρήθηκε η IL-6 με το Human IL-6 Flex Set της BD biosciense. Η αρχή της μεθόδου και ο τρόπος δράσης της, περιγράφεται στο παράρτημα ΙΙ, παράγραφος 2. Διαδικασία: Για την ανάλυση των κυτταροκινών στο πλάσμα ή ορό του αίματος απαραίτητη είναι η δημιουργία πρότυπης καμπύλης. Υπολογίζουμε την ποσότητα κάθε κυτταροκίνης που θα χρειαστούμε για το πείραμα πολλαπλασιάζοντας την ποσότητα της κάθε κυτταροκίνης επί τον αριθμό των προς ανάλυση δειγμάτων. Υπολογίζουμε τον συνολικό όγκο των κυτταροκινών που θα χρειαστούμε, πολλαπλασιάζοντας την ποσότητα της κάθε κυτταροκίνης επί τον αριθμό των κυτταροκινών που επιθυμούμε να αναλύσουμε. Φυγοκεντρούμε τα μαγνητικά σφαιρίδια (beads) στις 3000 στροφές, για 5 λεπτά, σε θερμοκρασία δωματίου. Απομακρύνουμε προσεκτικά το υπερκείμενο και προσθέτουμε το ειδικό διάλυμα serrum enhansement buffer. Επωάζουμε το διάλυμα στο σκοτάδι, σε θερμοκρασία, για 30 λεπτά. Στο κατάλληλο πιάτο προσθέτουμε: 25μl δείγματος, 25μl beads και 25μl PE. Επωάζουμε στο σκοτάδι, σε θερμοκρασία δωματίου, για 3 ώρες Με την χρήση μηχανήματος δημιουργίας κενού, αφαιρούμε τα υγρό. Προσθέτουμε το διάλυμα πλύσης (wash buffer), το οποίο αφαιρούμε υπό κενό (2 φορές) Προσθέτουμε το διάλυμα πλύσης και αναλύουμε στον ειδικό αναλυτή 49

60 Εικόνα: Σχεδιαγραμματική απεικόνιση της αρχή της μεθόδου CBA 7.2 Μέτρηση κυτταροκινών με την μέθοδο της Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA: ( Η μέθοδος ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay), είναι μια ποιοτική και ποσοτική μέθοδος ανοσοανίχνευσης, προσδιορισμού των συγκεντρώσεων πρωτεϊνών, όπως κυτταροκινών, στον ορό ή το πλάσμα του αίματος. Είναι μέθοδος με υψηλή ειδικότητα και ευαισθησία για την μέτρηση κυτταροκινών ή άλλων πρωτεϊνών στο διάλυμα. Στην παρούσα μελέτη ερευνήσαμε τους υποδοχείς του TNF, TNF -RI(p55/p60),TNF- RII(p75/p80) και τους TGF-β1 και TGF-β2 με την μέθοδο της ELISA. 50

61 Η συγκεντρώσεις των κυτταροκινών ανιχνεύονται συνήθως σε picogram/ml. Oι κύριοι τύποι της Elisa είναι η άμεση και η έμμεση (Παράρτημα ΙΙ,παράγραφος 4). τροποποιημένη εικόνα από: Διαδικασία της μεθόδου (ενδεικτικά αναφέρεται για τον TGF-β1): Για την ανίχνευση του TGF-β1, το πλάσμα των ασθενών αραιώνεται 10 φορές με διάλυμα Assay. Προσθήκη 1Ν HCL, επώαση του δείγματος για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Ουδετεροποίηση του δείγματος με προσθήκη 1Ν NaOH. Προσδιορισμός των κελιών που θα χρησιμοποιήσουμε. Προσθήκη διαλύματος πλυσίματος (wash buffer) Στη επιφάνεια των κελιών του πιάτου, βρίσκονται κολλημένα τα μονοκλωνικά αντισώματα (mab) για τον TGF-β1. Δημιουργία της πρότυπης καμπύλης με διαδοχικές αραιώσεις Προσθήκη του ειδικού διαλύματος Assay και του πλάσματος των δειγμάτων. 51

62 Επώαση σε διαρκή κίνηση, σε θερμοκρασία δωματίου, για 2 ώρες Απορρίπτουμε το υπερκείμενο από το πιάτο και με την χρήση του διαλύματος πλύσης απομακρύνεται η περίσσεια ή τα μη προσδεδεμένα αντιδραστήρια. Προσθήκη δεύτερου βιοτυνιλιωμένου αντισώματος, το οποίο χρησιμοποιείται για ανίχνευση. Η πρόσδεση του δεύτερου αντισώματος, είναι εφικτή γιατί γίνεται σε διαφορετικό επίτοπο της κυτταροκίνης. Επίσης, φέρει πάνω του ειδική θέση πρόσδεσης για το ένζυμο στρεπταβιδίνη. Επώαση σε θερμοκρασία δωματίου, για 1 ώρα, με διαρκή ανάδευση. Απορρίπτουμε το υπερκείμενο από το πιάτο και με την χρήση του διαλύματος πλύσης απομακρύνεται η περίσσεια ή τα μη προσδεδεμένα αντιδραστήρια. Προσθήκη του ενζύμου στρεπταβιδίνη. Επώαση σε θερμοκρασία δωματίου, για 1 ώρα, με διαρκή ανάδευση. Προσθήκη του διαλύματος, TMB Substrate Solution Επώαση σε θερμοκρασία δωματίου, για 1 ώρα, με διαρκή ανάδευση. Τέλος, ακολουθεί η προσθήκη του διαλύματος παύσης (stop solution- 1Μ Phosphoric acid ). Προσδιορισμός της οπτικής πυκνότητας των δειγμάτων (Ο.D.) με φωτόμετρο. Ο προσδιορισμός έγινε στα 450nm (εναλλακτικά στα 620nm, με αναφορά στα 610nm με 650nm) Το αποτέλεσμα είναι η δημιουργία χρώματος, το οποίο είναι ανάλογο με την συγκέντρωση της κυτταροκίνης στο δείγμα, και κυμαίνεται από καθόλου χρώμα (αρνητικό δείγμα) μέχρι σκούρο. Η συγκέντρωση της κυτταροκίνης καθορίζεται συγκριτικά με μια πρότυπη καμπύλη, με γνωστές συγκεντρώσεις κυτταροκινών. 52

63 8. Πειράματα λειτουργικότητας των Τregs. Για αυτά τα πειράματα χρησιμοποιήσαμε δείγματα από φυσιολογικούς, ασθενείς που είχαν υποβληθεί σε αρθροπλαστική γόνατος ή ισχίου και μεταγγίστηκαν με 1 ασκό αίματος μέσα στο χειρουργείο και ασθενείς που υποβλήθηκαν σε αρθροπλαστική γόνατος ή ισχίου αλλά δεν μεταγγίστηκαν μέσα στο χειρουργείο. Έτσι, από τους φυσιολογικούς και ασθενείς λάβαμε δείγμα (20ml) ολικού αίματος από το οποίο απομονώσαμε effectors κύτταρα (CD4+CD25-) και τα ρυθμιστικά (CD4+CD25+), τα οποία συνκαλλιεργήθηκαν σε καλλιέργειες για 72 ώρες παρουσία μιτογονικού ερεθίσματος (PHA) σε διαφορετικές αναλογίες κυττάρων (Τregs:effectors) Απομόνωση των ρυθμιστικών κυττάρων του αίματος: Η απομόνωση των ρυθμιστικών έγινε με το Dynabeads Regulatory CD4+CD25+ T Cell kit της invitrogen και συνθήκες του πειράματος ήταν: effectors μόνα τους, effectors + PHA και λόγοι των κυττάρων Τregs:effectors: 1:1, 1:2,1:4, 1:8, 1:16 και 1:32. Διαδικασία: Σύμφωνα με την βιβλιογραφία το 3-10% του CD4 T πληθυσμού εκφράζει το CD25 αντιγόνο. Για την απομόνωση των ρυθμιστικών κυττάρων αρχικά έγινε απομόνωση των μονοπύρηνων κυττάρων του περιφερικού αίματος με βαθμίδωση φικόλης και υπολογισμός του αριθμού τους με την χρήση αιματοκυτταρομέτρου (παράγραφος 2.4 και 2.5). Στην συνέχεια ακολούθησε: 53

64 Βήμα 1: Απομόνωση των CD4+ κυττάρων: Επαναδιάλυση των κυττάρων σε διάλυμα απομόνωσης (isolation buffer), 100% FBS και διάλυμα αντισωμάτων (Antibody Mix Human CD4). Επώαση των κυττάρων με τα αντισώματα για 20 λεπτά, στους 4-8 ο C Προσθήκη παγωμένου διάλυματος απομόνωσης, φυγοκέντρηση στις 1800 στροφές για 10 λεπτά, στους 4-8 ο C και απόρριψη του υπερκειμένου. Επαναδιάλυση του ιζήματος σε παγωμένο διάλυμα απομόνωσης και προσθήκη διαλύματος Depletion MyOne Dynabeads Επώαση για 15 λεπτά RT ενώ το eppendorf βρίσκεται σε διαρκή κίνηση. Επαναδιάλυση των συνδεδεμένων με τον μαγνήτη κυττάρων και προσθήκη διαλύματος απομόνωσης Τοποθέτηση των eppendorf σε μαγνητική βάση για 3 λεπτά και μεταφορά του υπερκειμένου, το οποίο περιέχει όλα τα μη-προσδεδεμένα στα μαγνητικά σφαιρίδια κύτταρα (CD4+ πληθυσμός). Προσθήκη στα eppendorf, διαλύματος απομόνωσης, ανάδευση και επανατοποθέτηση στον μαγνήτη για 3 λεπτά. (2 φορές) Φυγοκέντρηση στις 1800 στροφές, για 10 λεπτά, στους 4-8 ο C Επαναδιάλυση των CD4+ κυττάρων σε διάλυμα απομόνωσης και προσδιορισμός του αριθμού, με την χρήση αιματοκυτταρομέτρου. Βήμα 2: Απομόνωση των CD4+CD25-, υποπληθυσμό effector κυττάρων Προσθήκη αντισώματος Dynabeads CD25, ανάδευση και επώαση για 25 λεπτά στους 4-8 ο C, σε διαρκή κίνηση Τοποθέτηση του δείγματος στον μαγνήτη για 1 λεπτό και απομάκρυνση του υπερκειμένου, στο οποίο βρίσκονται τα effectors κύτταρα (CD4+CD25-) Επαναδιάλυση του δείγματος με διάλυμα απομόνωσης, επανατοποθέτηση στον μαγνήτη για 1 λεπτό και συλλογή του υπερκειμένου (2 φορές) Υπολογίζουμε τον αριθμό των CD4+CD25- (με χρήση αιματοκυτταρομέτρου) Σε αυτό το σημείο γίνεται χρώση των effectors κυττάρων με την ουσία CFSE (όπως περιγράφεται παρακάτω). 54

65 Βήμα 3: Απομόνωση των CD4+CD25+, υποπληθυσμό ρυθμιστικών κυττάρων Επαναδιάλυση των κυττάρων (με μαγνητικά σφαιρίδια) σε καλλιεργητικό RPMI με 1%FBS Προσθήκη διαλύματος DETACHaBEAD Επώαση για 45 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, σε διαρκή ανάδευση Τοποθέτηση του δείγματος στον μαγνήτη για 1 λεπτό Απομάκρυνση του υπερκειμένου με τα ρυθμιστικά κύτταρα CD4+CD25+ Επαναδιάλυση των σφαιριδίων σε καλλιεργητικό RPMI με 1%FBS και επανατοποθέτηση στον μαγνήτη για 1 λεπτό (2 φορές) φυγοκέντρηση στις 1800 στροφές για 10 λεπτά στους 4-8 ο C Υπολογισμός αριθμού των CD4+CD25+ κυττάρων (με αιματοκυτταρόμετρο) Επαναδιάλυση στον επιθυμητό όγκο σε πλήρες καλλιεργητικό υλικό (Culture Medium) διάλυμα απομόνωσης (isolation buffer) PBS (1x) 0.1% BSA 2mM EDTA Διαλύματα Antibody Mix Human CD4 αντισώματα mouse IgG CD14, CD16 (ειδικά για τα CD16a και CD16b), CD56, CDw123,CD36, CD8, CD19 και Glycophorin A. πλήρες καλλιεργητικό (Culture Medium) καλλιεργητικό υλικό RPMI 10%FBS αντιβιοτικά πενικιλίνηστρεπτομυκίνη 2-μερκαπταιθανόλη διάλυμα Depletion MyOne Dynabeads ομοιόμορφα, superπαραμαγνητικά σφαιρίδια από πολυστηρένιο με διάμετρο 1μm 55

66 8.2. Χρώση με CFSE Μετά την απομόνωση και τον υπολογισμό του αριθμού των effector κυττάρων (CD4+CD25-) στο δείγμα, στο εναιώρημα των κυττάρων προστίθεται η ουσία CFSE σε τελική συγκέντρωση, 5μM (αρχική συγκέντρωση, 5 mm). Η παρακάτω διαδικασία επιτελείται στο σκοτάδι (χωρίς φώτα, αλουμινόχαρτο γύρω από τα falcon κτλ). Σε 10 6 κύτταρα, προσθέτουμε διάλυμα απομόνωσης απουσία EDTA (isolation buffer χωρίς EDTA) Φυγοκέντρηση στις 1800 στροφές, για 10 λεπτά, στους 4 0 C Απομάκρυνση του υπερκειμένου Προσθήκη διαλύματος απομόνωσης απουσία EDTA Προσθήκη της ουσίας CFSE (1μl/10 6 cells) Επώαση στους 37 0 C, για 15 λεπτά Προσθήκη παγωμένου σκέτου καλλιεργητικού RPMI Επώαση για 5 λεπτά, στους 4 0 C Προσθήκη παγωμένου σκέτου καλλιεργητικού RPMI Φυγοκέντρηση στις 1800 στροφές, για 10 λεπτά, στους 4 0 C Αναδιάλυση σε πλήρες καλλιεργητικό υλικό Culture Medium (CM) ενώ μια μικρή ποσότητα δείγματος αναλύεται στον κυτταρομετρητή ροής για θετική επιβεβαίωση της χρώσης με CFSE. Ύστερα από την απομόνωση και χρώση των effectors κυττάρων με CFSE και την απομόνωση των ρυθμιστικών κυττάρων. Τα κύτταρα συνκαλλιεργούνται σε διαφορετικές συγκεντρώσεις, παρουσία μιτογονικών ερεθισμάτων (PHA) και κάλυψη από το φως (με αλουμινόχαρτο) για 3 μέρες (72 ώρες) στον επωαστικό θάλαμο. 56

67 Μετά από 3 μέρες (72 ώρες) επώαση στους 37 0 C, με 5% CO 2 και την απαραίτητη υγρασία. Τα κύτταρα συλλέγονται με φυγοκέντρηση στις 2500 στροφές, για 10 λεπτά, σε θερμοκρασία δωματίου Απομόνωση του υπερκειμένου και φύλαξη στους C για μέτρηση κυτταροκινών Αναδιάλυση του ιζήματος σε PBS 1x Ανάλυση σε κυτταρομετρητή ροής Περαιτέρω ανάλυση με το πρόγραμμα FlowJo Επίσης, περαιτέρω ανάλυση κυτταροκινών ακολούθησε στα υπερκείμενα των καλλιεργιών με την μέθοδο CBA. 9. Στατιστική ανάλυση Η στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων έγινε με το πρόγραμμα GraphPad Prism 5.0. Η σύγκριση των αποτελεσμάτων έγινε με two-paired, t-test και το επίπεδο σημαντικότητας ορίστηκε το p=

68 Κεφάλαιο 3ο Αποτελέσματα 58

69 Γενικά: Στην παρούσα μελέτη συλλέχθηκε ολικό αίμα από ασθενείς που υποβλήθηκαν σε προγραμματισμένη μερική ή ολική αρθροπλαστική γόνατος ή ισχίου από την Ορθοπεδική Κλινική του Περιφερειακού Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Πατρών. Τα υποκείμενα της μελέτης ήταν 46, και η διάκριση έγινε σε δύο ομάδες. Στην πρώτη ομάδα ανήκουν 36 μεταγγισμένοι ασθενείς (Group 1) από τους οποίους έχουμε 5 δείγματα για κάθε ασθενή, τις χρονικές στιγμές πριν το χειρουργείο (BS), αμέσως μετά (Day 0), μια εβδομάδα μετά (Day 7), ένα μήνα μετά (1 month) και κατά τον επανέλεγχο (3-12 μήνες). Ενώ στην δεύτερη ομάδα, την ομάδα ελέγχου, ανήκουν 10 μη μεταγγισμένοι ασθενείς (Group 2) από τους οποίους λάβαμε δείγματα, πριν και μετά το χειρουργείο (πίνακας δημογραφικών στοιχείων, κεφάλαιο 2, 5.υλικά και μέθοδοι, 5.2. δείγματα και ασθενείς). Ο λόγος του μικρότερου αριθμού δειγμάτων της ομάδας ελέγχου ήταν η καλύτερη μετεγχειρητική πορεία των ασθενών και η έξοδός τους από την κλινική σε λιγότερο από 7 ημέρες. 59

70 10. Προσδιορισμός των ρυθμιστικών κυτταρικών πληθυσμών, CD4 + CD25 +/high FoxP3 + και CD4 + CD25 + CD127 -/low Από τα δείγματα των ασθενών απομονώθηκαν τα PBMCs με βαθμίδωση φικόλης (κεφάλαιο 2, υλικά και μέθοδοι,παράγραφος 5.2., καθορίστηκε ο αριθμός των κυττάρων με την χρήση αιματοκυτταρομέτρου (παράγραφος5.3) και ακολούθησε επιφανειακή και ενδοκυττάρια χρώση για τους Tregs πληθυσμούς CD4 + CD25 + FoxP3 + και CD4 + CD25 + CD127 low και περαιτέρω ανάλυση με το πρόγραμμα FlowJo. Η στατιστική ανάλυση των δεδομένων έγινε με το πρόγραμμα GraphPad Prism 5. Τα αποτελέσματα των πειραμάτων φαίνονται στο παρακάτω διάγραμμα. Μετά το χειρουργείο στην ομάδα μελέτης συγκριτικά με την ομάδα ελέγχου, παρατηρείται αύξηση των κυτταρικών πληθυσμών. Τα επίπεδα των κυτταρικών πληθυσμών επανέρχονται μέσα στους πρώτους τρεις μήνες μετά το χειρουργείο Ανάλυση των αποτελεσμάτων της κυτταρομετρίας ροής με το πρόγραμμα FlowJo Μετά την χρώση των επιφανειακών ή τους ενδοκυττάριων δεικτών και την ανάλυση με κυτταρομετρητή τριών χρωμάτων (Beckmann Coulter), τα αποτελέσματα επεξεργάζονται περαιτέρω με το πρόγραμμα FlowJo (Tree star, Ashland, Oregon, USA). Tο πρόγραμμα FlowJo είναι το πιο διαδεδομένο λογισμικό ανάλυσης αποτελεσμάτων της κυτταρομετρίας ροής (flow cytometry analysis software programme). Η ανάλυση των δειγμάτων έγινε όπως ενδεικτικά φαίνεται στην εικόνα. Στο πρώτο διάγραμμα απεικονίζεται μια πρώτη διάκριση των κυττάρων ανάλογα με τον σκεδασμό της ακτίνας λέιζερ (παράρτημα ΙΙ, παράγραφος...), με βάση το μέγεθος και την κοκκίωση των κυττάρων. Έτσι, διαχωρίζονται οι πολύ μεγάλοι υποπληθυσμοί των λευκών αιμοσφαιρίων σε μονοκύτταρα, λεμφοκύτταρα και πολυμορφοπύρηνα. Τα λεμφοκύτταρα χαρακτηρίζονται από παρουσία κοκκίων και μέγεθος που κυμαίνεται από 6-15μm. Έτσι, είναι ο μεσαίος πληθυσμός. Αφού οριοθετήσουμε και επιλέξουμε αυτόν τον πληθυσμό, τον αναλύουμε περαιτέρω για τους δείκτες ενδιαφέροντος ανάλογα με τα φθοροχρώματα που έχουμε επιλέξει από τον μεγαλύτερο προς τον μικρότερο πληθυσμό. 60

71 Ενδεικτικά παρουσιάζεται στην εικόνα η ανάλυση για τον πληθυσμό CD4+CD25+FoxP3+. Από το (Α) επιλέγεται ο πληθυσμός των λεμφοκυττάρων, ενώ στην συνέχεια (Β) ο ntreg πληθυσμός χαρακτηρίζεται από την συνέκφραση των δυο επιφανειακών δεικτών CD4 και CD25. Θετική χρώση για τα κύτταρα θεωρείται ότι είναι πάνω από το 10 0, έτσι, η συνέκφραση των δυο δεικτών είναι το διπλά θετικό αποτέλεσμα που στο συγκεκριμένο παράδειγμα αποτελεί το 2.13% των κυττάρων. Τέλος, τα διπλά θετικά κύτταρα μπορούν να αναλυθούν ως προς τον ενδοκυττάριο δείκτη FoxP3, που όπως αναφέρθηκε πιο πάνω η έκφρασή του είναι μοναδική για τα ntreg. Εικόνα Παράδειγμα επεξεργασίας των αποτελεσμάτων με την μέθοδο της κυτταρομετρίας ροής και του προγράμματος FlowJο για τα ntregs. 61

72 Εικόνα Παράδειγμα επεξεργασίας των αποτελεσμάτων με την μέθοδο της κυτταρομετρίας ροής και του προγράμματος FlowJο για τα itregs. 62

73 Αύξηση των CD4 + CD25 +/high FoxP3 + μετά την μετάγγιση Για τον πληθυσμό CD4 + CD25 + FoxP3 + παρατηρείται στατιστικώς σημαντική αύξηση του πληθυσμού μετά το χειρουργείο, ύστερα από μετάγγιση (Group 1). Ο υπολογισμός των αποτελεσμάτων έγινε ως προς τον CD4 + Τ κυτταρικό πληθυσμό και το αποτέλεσμα είναι ο μέσος όρος των αποτελεσμάτων για κάθε χρονική στιγμή. Πριν από το χειρουργείο (BS), ο πληθυσμός των CD4 + CD25 + FoxP3 + αποτελούσε το 2.77% του CD4 + Τ κυτταρικού πληθυσμού, ποσοστό που έφτασε το 3.98% μετά το χειρουργείο (day 0). Η μεταβολή αυτή είναι στατιστικώς σημαντική, με p= Ωστόσο, το ποσοστό αυτό μειώθηκε μέσα στην πρώτη εβδομάδα, σε ποσοστά κάτω από τα BS επίπεδα πριν την μετάγγιση (1.37%, p=0.037), μείωση που ανιχνεύτηκε μέχρι και τον πρώτο μήνα (1 month), 1,05%. Αντίθετα, στον επανέλεγχο (>3 months) ο πληθυσμός των CD4 + CD25 + FoxP3 + έχει επανέλθει στα φυσιολογικά επίπεδα πριν το χειρουργείο, σε ποσοστό 2.84%. Η αύξηση που παρατηρείται από τα δείγματα του 1 μήνα μέχρι και τον επανέλεγχο είναι στατιστικώς σημαντική (p=0.019). Διαφορετική εικόνα, ωστόσο, παρατηρείται στους ασθενείς την ομάδας ελέγχου, αφού μετά το χειρουργείο παρατηρείται πολύ μικρή μείωση, 0.58%, η οποία δεν είναι στατιστικώς σημαντική, μετά το χειρουργείο (Day 0 NT). Πριν το χειρουργείο, τα ποσοστά του πληθυσμού ήταν 2.77% ενώ μετά το χειρουργείο το ποσοστό αυτό ήταν 2.19%. 63

74 10.3. Αύξηση των CD4 + CD25 + CD127 -/low μετά την μετάγγιση Παρόμοιο μοτίβο μεταβολής του κυτταρικού πληθυσμού παρατηρείται και για τον πληθυσμό των CD4 + CD25 + CD127 -/low. Όπως και στα Treg FoxP3 + η ομάδα μελέτης (Group 1) μετά το χειρουργείο εμφανίζει στατιστικώς σημαντική αύξηση του πληθυσμού των CD4 + CD25 + CD127 -/low itregs. Τα CD4 + CD25 + CD127 -/low πριν το χειρουργείο αποτελούσαν το 8.13% του CD4 + Τ κυτταρικού πληθυσμού, ποσοστό που έφτανε το 13.04% μετά το χειρουργείο. Αυτή η αύξηση είναι στατιστικώς σημαντική, με p= Αντίθετα, τα ποσοστά του CD4 + CD25 + CD127 -/low πληθυσμού, μέσα στην πρώτη εβδομάδα μέχρι και τον πρώτο μήνα μετά το χειρουργείο, μειώνονται κάτω από τα φυσιολογικά επίπεδα, με ποσοστά 6.03% (p=0.007) και 6.75%, αντίστοιχα. Τελικά, στον επανέλεγχο, μετά από τους τρεις μήνες της μετάγγισης, τα ποσοστά του κυτταρικού πληθυσμού είναι στατιστικώς σημαντικά μειωμένα συγκριτικά με τα επίπεδα του πληθυσμού πριν το χειρουργείο, σε ποσοστό 1.61% (p=0.003). Διαφορετική μεταβολή των itregs παρατηρείται στην ομάδα ελέγχου, Group 2. Ακολουθώντας την μεταβολή του CD4 + CD25 + FoxP3 + πληθυσμού, τα ποσοστά των CD4 + CD25 + CD127 -/low μειώνονται από το 8.13% που ήταν πριν το χειρουργείο σε 5.5%, διαφορά η οποία δεν είναι στατιστικώς σημαντική. 64

75 Λειτουργικότητα των Tregs μετά την μετάγγιση Με τα πειράματα των φαινοτυπίσεων αποδείχθηκε η αύξηση του αριθμού των ρυθμιστικών κυττάρων μετά τον χειρουργείο, μετά την μετάγγιση. Αριθμός ο οποίος προσέγγιζε τις φυσιολογικές τιμές μέσα στον πρώτο μήνα μετά την εγχείρηση. Ωστόσο, το ερώτημα που τέθηκε ήταν αν αυτά τα ρυθμιστικά κύτταρα είναι λειτουργικά, αν δηλαδή εξακολουθούν να έχουν την ικανότητα της καταστολής σε άλλα κύτταρα. Για να ερευνηθεί αυτό το ερώτημα, έγιναν "πειράματα λειτουργικότητας" (functional assays). Από 20ml ολικού αίματος ασθενών, μεταγγισμένων και μη, μέσα στην πρώτη εβδομάδα μετά το χειρουργείο, απομονώθηκαν τα PBMCs και από αυτά τα CD4+CD25- effector κύτταρα και τα CD4+CD25+ του ίδιου ασθενή, συνκαλλιεργήθηκαν παρουσία CSFE (κεφάλαιο 2, υλικά και μέθοδοι, 8. πειράματα λειτουργικότητας των Treg). Οι δυο κυτταρικοί πληθυσμοί συνκαλλιεργήθηκαν σε διαφορετικούς λόγους, για 3 μέρες (72 ώρες), παρουσία του μιτογονικού ερεθίσματος PHA. Οι αναλογίες Treg:Teff που χρησιμοποιήθηκαν ήταν όπως φαίνεται και στο διάγραμμα, 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16 και 1:32. Το μιτογονικό ερέθισμα ήταν απαραίτητο για την επαγωγή του πολλαπλασιασμού και την αποτροπή της απόπτωσης. Οι αναλογίες 1:8,1:16 και 1:32 δείχνουν ότι δεν συμβαίνει καταστολή. 65

76 Στα πειράματα επίσης, χρησιμοποιήθηκαν δυο σημεία που απουσίαζαν τα Treg, ήταν τα Teff μόνα τους αλλά και Teff+ PHA (0:1). Πράγματι, τα μεγαλύτερα ποσοστά ανοσοκαταστολής παρατηρήθηκαν σε αναλογία 1:1 όπου η ανοσοκαταστολή είναι στο 54%. Όσο μειώνεται η συγκέντρωση των Treg, τόσο μειώνεται και η καταστολή. Από την αναλογία 1:2, παρατηρείται καταστολή 35% ενώ με αναλογία 1:4 η ανοσοκαταστολή μειώνεται στο 20%, στο 1:8 είναι γύρω στο 3.26% ενώ στα υπόλοιπα σημεία δεν παρατηρείται ανοσοκαταστολή. Η καταστολή που παρατηρείται και είναι ανάλογη με την ποσότητα των Tregs που υπάρχουν στην καλλιέργεια αποδεικνύουν ότι τα Treg των ασθενών είναι λειτουργικά και έχουν την ικανότητα να επάγουν την ανοσοκαταστολή. Επίσης, τα υπερκείμενα των κυτταροκαλλιεργειών συλλέχθησαν και αναλύθηκαν με την μέθοδο CBA για τον προσδιορισμό των συγκεντρώσεων των κυτταροκινών. 66

77 11. Ανάλυση κυτταροκινών Στα δείγματα των ασθενών έγινε απομόνωση του πλάσματος (ύστερα από φυγοκέντρηση στις 2500rpm, για 3 λεπτά) και αποθήκευση στους C. Στην συνέχεια ακολούθησε καθορισμός των επιπέδων των κυτταροκινών στο πλάσμα του αίματος με τις μεθόδους, CBA και ELISA. Με την μέθοδο CBA καθορίστηκαν οι κυτταροκίνες IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, TNF-α και IFN-γ ενώ με την μέθοδο της ELISA καθορίστηκαν οι συγκεντρώσεις των κυτταροκινών TNF-α, TGF-β1 και TGFβ2 αλλά και των υποδοχέων TNF-RI(p55/p60) και TNF-RII(p75/p80). Τα επίπεδα των κυτταροκινών και των υποδοχέων μετρήθηκαν σε picogram/ml. Ωστόσο, από τα αποτελέσματα δεν φαίνεται να επηρεάζονται τα επίπεδα των άλλων κυτταροκινών που μετρήθηκαν. Επηρεάζονται τα επίπεδα της IL-6, του υποδοχέα TNF-RI(p55/p60) και TNF-RII(p75/p80) και του TGF-β1, μετά την μετάγγιση ενώ δεν υπάρχει στατιστικώς σημαντική μεταβολή για τις κυτταροκίνες IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, TNF-α και IFN-γ. Στα παρακάτω διαγράμματα παραθέτουμε αναλυτικά τις κυτταροκίνες στις οποίες παρατηρήθηκε μεταβολή στις διάφορες χρονικές στιγμές των δειγμάτων. Ενώ πιο συγκεντρωτικά, παρατίθενται οι υπόλοιπες κυτταροκίνες. Για την στατιστική ανάλυση των δειγμάτων χρησιμοποιήθηκε το πρόγραμμα GraphPad Prism 5.0 και η σύγκριση των δειγμάτων έγινε με το t-test. 67

78 11.1. Μεταβολή της IL-6 μετά την μετάγγιση Η συγκέντρωση της IL-6 πριν το χειρουργείο ήταν 15.1pg/ml, ενώ, αμέσως μετά το χειρουργείο αυξάνεται στα 106pg/ml (p=0.0003). Αυτή η αύξηση σηματοδοτεί την έναρξη φλεγμονωδών αντιδράσεων στον οργανισμό των ασθενών. Ωστόσο, μετά την πρώτη εβδομάδα και μέχρι το τέλος της μελέτης, τα επίπεδα της IL-6 ήταν μειωμένα στα 18.56pg/ml την Day7 (p<0.001), 13.4 pg/ml στον 1 μήνα μετά το χειρουργείο και 9.69pg/ml στον επανέλεγχο. Επίσης, μικρή αύξηση παρατηρήθηκε και στην συγκέντρωση της IL-6 στην ομάδα ελέγχου, όπου από 15.1pg/ml που ήταν πριν το χειρουργείο, μετά το χειρουργείο χωρίς μετάγγιση ήταν 25.47pg/ml, αλλά δεν είναι στατιστικώς σημαντική διαφορά μεταξύ των τιμών πριν και μετά το χειρουργείο. Σε αυτό το σημείο θα πρέπει να τονίσουμε ότι η αύξηση της IL-6 μετά το χειρουργείο είναι στατιστικώς σημαντική μεταξύ των μη μεταγγισμένων και των μεταγγισμένων ασθενών, αυτό σημαίνει ότι η μετάγγιση per se προκαλεί αύξηση της IL-6. 68

79 11.2. Μεταβολή των TNF-RI και TNF-RII μετά την μετάγγιση Ο TNF-α ανήκει στην κατηγορία των προφλεγμονωδών κυτταροκινών άρα αυξάνεται κατά την διάρκεια φλεγμονωδών αντιδράσεων. Κατά την μέτρησή του, στο πλάσμα των ασθενών δεν παρατηρήθηκαν στατιστικώς σημαντικές μεταβολές. Παρατηρήθηκε μικρή αύξηση του TNF-α μετά το χειρουργείο, από 1.25pg/ml πριν το χειρουργείο σε 3.23pg/ml μετά και παρέμειναν αυξημένα την πρώτη εβδομάδα (3.27pg/ml) μέχρι και τον πρώτο μήνα (3.74pg/ml). Ενώ στον επανέλεγχο των ασθενών (>3 μήνες) τα επίπεδα του TNF-α ήταν στα φυσιολογικά, όπως πριν από το χειρουργείο (1.44pg/ml). Ωστόσο, γνωρίζουμε ότι TNF-α για να ενεργοποιήσει την έκφραση πολλών γονιδίων για τα οποία είναι υπεύθυνος, συμπεριλαμβανομένης και της IL-6, απαιτείται η πρόσδεσή στον υποδοχέα TNF-RI, με τον οποίο συνδέεται μοναδικά αλλά και του TNFR-II, στον οποίο μπορεί να συνδεθεί ο TNF-α ή TNF-β. Έπειτα οι TNF-α-TNF-R, ως σύμπλοκο πλέον, κυκλοφορεί σε διαλυτή μορφή στο πλάσμα όπου και ανιχνεύεται με ELISA Έτσι, ακολούθησε μέτρηση των υποδοχέων και τα αποτελέσματα φαίνονται στα παρακάτω διαγράμματα. 69

80 Διάγραμμα 8.2.1: TNF-RI(p55/p60) Στην ομάδα 1, μετά την μετάγγιση, παρατηρείται αύξηση του υποδοχέα TNF- RI(p55/p60) μετά το χειρουργείο. Πριν το χειρουργείο, τα επίπεδα του υποδοχέα ήταν 762.5pg/ml ενώ μετά το χειρουργείο παρατηρήθηκε αύξηση στα pg/ml (p=0.002). Την αύξηση αυτή, ακολούθησε μείωση στα 1509pg/ml μετά την πρώτη εβδομάδα του χειρουργείου η οποία εξακολούθησε και στον μήνα (1376.2pg/ml) αλλά και στον επανέλεγχο, μετά από 3 μήνες από το χειρουργείο (1021pg/ml). Ωστόσο, στην ομάδα ελέγχου δεν παρατηρήθηκε το ίδιο πρότυπο έκφρασης για τον υποδοχέα, αφού οι ασθενείς οι οποίοι δεν μεταγγίστηκαν μετά το χειρουργείο δεν εμφάνισαν αυξημένες συγκεντρώσεις του υποδοχέα. Από τα 762.5pg/ml που ήταν πριν το χειρουργείο, μετά την εγχείρηση ο TNF-RI(p55/p60) ανιχνεύτηκε σε συγκεντρώσεις 734.2pg/ml. Σημαντικό στοιχείο στο παραπάνω διάγραμμα είναι η στατιστικώς σημαντική διαφορά που υπολογίζεται μετά το χειρουργείο με ή χωρίς μετάγγιση (p=0.01). 70

81 Διάγραμμα 8.2.2: TNF-RII(p75/p80) Τα επίπεδα του TNF-RII(p75/p80) πριν το χειρουργείο ήταν pg/ml. Όπως παρατηρήθηκε και για άλλες κυτταροκίνες, μετά το χειρουργείο τα επίπεδα αυτά αυξήθηκαν στα pg/ml (p= 0.003). Όμως, το μοτίβο έκφρασης διαφοροποιείται και δεν παρατηρείται μείωση μέσα στην πρώτη εβδομάδα και τον μήνα, και να επανέλθουν τα φυσιολογικά επίπεδα μέχρι τον επανέλεγχο. Αντίθετα, την πρώτη εβδομάδα μετά το χειρουργείο συνεχίζει να παρατηρείται αύξηση η οποία φτάνει τα pg/ml την πρώτη εβδομάδα και τα 2939pg/ml στον πρώτο μήνα. Επίσης, στον επανέλεγχο των ασθενών δεν φάνηκαν τα επίπεδα του TNF- RII(p75/p80) να έχουν επανέλθει στα φυσιολογικά αφού ήταν στα 2481pg/ml. Τα επίπεδα του TNF-RII(p75/p80) στην ομάδα ελέγχου δεν παρουσιάζουν μεταβολές πριν και μετά το χειρουργείο αφού πριν το χειρουργείο ήταν pg/ml ενώ μετά ήταν 1762pg/ml. Ωστόσο, υπάρχει στατιστικώς σημαντική διαφορά μετά την εγχείρηση, μεταξύ των μεταγγισμένων και μη. 71

82 11.3. Μεταβολή του TGF-β1μετά την μετάγγιση Ο TGF-β1 είναι ανασταλτική κυτταροκίνη, εκφράζεται από τα Tregs και θα περίμενε κανείς να ακολουθεί το ίδιο πρότυπο αύξησης με αυτά, δηλαδή, αύξηση του TGF-β1 μετά το χειρουργείο και μείωση μέσα στην πρώτη εβδομάδα και τον πρώτο μήνα μετά το χειρουργείο. Μετά από τους τρεις μήνες (επανέλεγχος) τα επίπεδα του TGF-β1 να είναι στα επίπεδα πριν το χειρουργείο. Παρόλα αυτά, τα αποτελέσματα είναι διαφορετικά και χαρακτηρίζονται από διαδοχική αυξομείωση του TGF-β1. Στην πρώτη ομάδα, των μεταγγισμένων ασθενών, τα φυσιολογικά επίπεδα του TGF-β1 των ασθενών είναι στα 91627pg/ml ενώ μείωση παρατηρείται μετά το χειρουργείο, σε 69100pg/ml (p=0.002). Την πρώτη εβδομάδα μετά το χειρουργείο, τα επίπεδα του TGF-β1 αυξάνονται (85426pg/ml) και στην συνέχεια, στον πρώτο μήνα μειώνονται πάλι, στα 60475pg/ml). Τελικά, μετά από 3 μήνες τα επίπεδα του TGF-β1 είναι στα 77028pg/ml. Στην ομάδα ελέγχου, παρατηρείται μείωση των επιπέδων του TGF-β1 πριν και μετά το χειρουργείο, από τα 91627pg/ml που είναι πριν την εγχείρηση, σε 80075pg/ml μετά το χειρουργείο. Ωστόσο σε αυτή την περίπτωση, δεν παρατηρείται στατιστικώς σημαντική διαφορά μεταξύ των μεταγγισμένων και μη, μετά το χειρουργείο. 72