ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ

Transcript

1 ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΣΤΑ ΠΛΑΙΣΙΑ ΤΟΥ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟΥ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑΤΟΣ ΣΠΟΥΔΩΝ: ΒΑΣΙΚΕΣ ΙΑΤΡΙΚΕΣ ΕΠΙΣΤΗΜΕΣ «ΓΟΝΙΔΙΑΚΗ ΕΚΦΡΑΣΗ ΚΑΙ ΜΕΛΕΤΗ ΠΑΡΑΓΟΝΤΩΝ ΠΟΥ ΕΠΗΡΕΑΖΟΥΝ ΤΗΝ ΠΛΑΣΤΙΚΟΤΗΤΑ ΤΩΝ ΑΝΘΡΩΠΙΝΩΝ Τ ΒΟΗΘΗΤΙΚΩΝ ΛΕΜΦΟΚΥΤΤΑΡΩΝ ΣΕ ΜΕΤΑΓΓΙΖΟΜΕΝΟΥΣ ΑΣΘΕΝΕΙΣ.» ΣΠΑΝΤΙΔΕΑ ΠΑΝΑΓΙΩΤΑ, MSc ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΑΝΟΣΟΛΟΓΙΑΣ ΑΙΜΑΤΟΛΟΓΙΑΣ ΠΑΤΡΑ 2015

2 ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ: Καθηγήτρια Ανοσολογίας, κ. Αθανασία Μουζάκη, Ιατρική Σχολή, Πανεπιστημίου Πατρών. Ερευνήτρια Β, κ. Βίλη Πανουτσακοπούλου, Ίδρυμα Ιατροβιολογικών Ερευνών, Ακαδημία Αθηνών Επίκουρος Καθηγητής, κ. Χαράλαμπος Σπηλιανάκης, Τμήμα Βιολογίας, Πανεπιστημίου Κρήτης ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ: Καθηγητής Ορθοπεδικής, κ. Ηλίας Παναγιωτόπουλος, Ιατρική Σχολή, Πανεπιστημίου Πατρών. Καθηγητής Ορθοπεδικής, κ. Παναγιώτης Μέγας, Ιατρική Σχολή, Πανεπιστημίου Πατρών. Αναπληρωτής Καθηγητής Αιματολογίας, κ. Αλέξανδρος Σπυριδωνίδης, Ιατρική Σχολή, Πανεπιστημίου Πατρών. Λέκτορας Ανοσολογίας, κ. Ελευθερία Ροζμαράκη, Τμήμα Βιολογίας, Πανεπιστημίου Πατρών. 1

3 Σας ευχαριστώ πολύ όλους!!! Ήταν ένα πραγματικά όμορφο ταξίδι. «τη βοήθεια που θες και τη ζητάς με πόνο μέσα σου μόνο θα τη βρεις στην πίστη σου και μόνο. Έτσι ναι Γέρο η Λευτεριά. Σ αυτόν μονάχα ανήκει που θα κερδίσει μονάχος με το αίμα του τη νίκη. Αν λαχταράς τη Λευτεριά, σε άλλον μην ελπίζεις μόνος σου παρ την αν μπορείς, αλλιώς δεν την αξίζεις.» Απόσπασμα από Το Όραμα Του Κολοκοτρώνη 2

4 Πίνακας περιεχομένων Περίληψη... 6 Abstract Ανοσοποιητικό σύστημα Και τελικά τι είναι το ανοσοποιητικό σύστημα; Στάδια της ανοσολογικής απόκρισης: Κύτταρα του Ανοσοποιητικού Συστήματος: Κύτταρα λεμφικής σειράς ή λεμφοκύτταρα: Αρθροπλαστική γόνατος ή ισχίου Αρθροπλαστική γόνατος Αρθροπλαστική Ισχίου Επιλογή των Τ λεμφοκυττάρων στο θύμο Πλαστικότητα των CD4 + κυττάρων Ρυθμιστικά κύτταρα Χαρακτηριστικά των ρυθμιστικών κυττάρων - Treg Λειτουργίες των ρυθμιστικών κυττάρων - Treg Επαγώγιμα και Φυσικά ρυθμιστικά κύτταρα Επαγώγιμα CD4 + CD25 + ρυθμιστικά T κύτταρα Φυσικά CD4 + CD25 + ρυθμιστικά T κύτταρα Διαφορές μεταξύ των φυσικών και των επαγώγιμων Tregs O μεταγραφικός παράγοντας forkhead box-p3 (Foxp3) Τρόποι δράσης των ρυθμιστικών κυττάρων Τρόποι αναγνώριση των αλλοαντιγόνων από τα Tregs Μηχανισμοί ρύθμισης των Treg Καταστολή από ανασταλτικές κυτταροκίνες Καταστολή μέσω της λύσης των κυττάρων Καταστολή μέσω διαταραχών του μεταβολισμού Καταστολή της ωρίμανσης ή λειτουργίας των δενδριτικών κυττάρων Πόσους μηχανισμούς χρειάζονται τα Tregs Πως επιλέγεται κάθε φορά ο κατάλληλος ρυθμιστικός μηχανισμός Αναγνώριση των αντιγόνων από τα Tregs Πως γνωρίζουν τα Treg ποια Th πρέπει να καταστείλουν Άλλοι CD3 + κυτταρικοί πληθυσμοί Οι δείκτες CD45RA και CD45RO Οι δείκτες ενεργοποίησης HLA-DR

5 6. Κυτταροκίνες Ιντερλευκίνη-2 (IL-2) Ιντερλευκίνη-4 (IL-4) Ιντερλευκίνη-6 (IL-6) Ιντερλευκίνη-10 (IL-10) Ιντερφερόνη-γ (IFN-γ) Παράγοντας Νέκρωσης Όγκου-α (TNF-a) Τροποποιητικός Αυξητικός Παράγοντας-β (Transforming Growth Factor-β, TGF-β)41 7. Ανοσοτροποποιητικές επιδράσεις της μετάγγισης Ιστορία της μετάγγισης: Επίδραση της μετάγγισης: Ανοσοτροποποιητικές επιδράσεις αποθηκευμένου αίματος Σκοπός της εργασίας Ασθενείς: Κλινική αξιολόγηση και προετοιμασία των ασθενών Επεξεργασία δειγμάτων: Πλήρες καλλιεργητικό υλικό: Απομόνωση μονοπύρηνων κυττάρων περιφερικού αίματος (PBMC s) με βαθμίδωση φικόλης: Ανάλυση με κυτταρομετρία ροής: Γενικά: Ενδοκυττάρια και εξωκυττάρια χρώση των PBMC s: Χρώση επιφανειακών δεικτών: Ενδοκυττάρια χρώση για ανίχνευση μεταγραφικού παράγοντα FoxP3: Μέτρηση κυτταροκινών και άλλων μορίων στο πλάσμα: Με την μέθοδο της Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA: Μέτρηση κυτταροκινών με την μέθοδο Cytometric Beads Array: Πειράματα λειτουργικότητας των Τregs Απομόνωση των effector και ρυθμιστικών κυττάρων του αίματος: Χρώση με CFSE Στατιστική ανάλυση...70 Αποτελέσματα, γενικά: Προσδιορισμός των CD4 + CD25 + CD127 -/low και CD4 + CD25 +/high FoxP3 + ρυθμιστικών κυτταρικών πληθυσμών, και άλλων CD3 + κυτταρικών πληθυσμών στα δείγματα των ασθενών

6 14.1. Ανάλυση των αποτελεσμάτων της κυτταρομετρίας ροής με το πρόγραμμα FlowJo Αύξηση των CD4 + CD25 + CD127 -/low μετά την μετάγγιση Αύξηση των CD4 + CD25 +/high FoxP3 + μετά την μετάγγιση Μεταβολή άλλων CD3 + κυτταρικών πληθυσμών πριν και μετά το χειρουργείο Λειτουργικότητα των Tregs μετά την μετάγγιση Ανάλυση κυτταροκινών Η μεταβολή της IL Η μεταβολή των υποδοχέων TNF-RI και TNF-RII Η μεταβολή στις συγκεντρώσεις των μορίων της οικογένειας των αυξητικών παραγόντων Transforming Growth Factor /TGF Η μεταβολή των συγκεντρώσεων του TGF-β Η μεταβολή των συγκεντρώσεων του TGF-β Η μεταβολή των συγκεντρώσεων των υπολοίπων κυτταροκινών Η μεταβολή των συγκεντρώσεων της κυτταροκίνης IL-2 (Th0) Η μεταβολή των συγκεντρώσεων της κυτταροκίνης IFN-γ (Th1) Η μεταβολή των συγκεντρώσεων της κυτταροκίνης IL-4 (Th2) Η μεταβολή των συγκεντρώσεων της κυτταροκίνης IL-10 (Tr1) Προσδιορισμός των συγκεντρώσεων των κυτταροκινών στους ασκούς των ασθενών Διάρκεια νοσηλείας, καταγραφή θερμοκρασίας σώματος και μετεγχειρητικές επιπλοκές Διάρκεια νοσηλείας Καταγραφή θερμοκρασίας σώματος Μετεγχειρητικές επιπλοκές Μετεγχειρητικές επιπλοκές στους μη-μεταγγισμένους ασθενείς Μετεγχειρητικές επιπλοκές στους μεταγγισμένους ασθενείς Σύγκριση μετεγχειρητικών επιπλοκών μεταγγισμένων και μη-μεταγγισμένων ασθενών Συμπεράσματα Μεταβολή των κυτταρικών πληθυσμών Λειτουργικότητα των ρυθμιστικών κυττάρων Μεταβολή στο κυτταροκινικό δίκτυο Μετεγχειρητικές επιπλοκές Συζήτηση Βιβλιογραφία (

7 Περίληψη Εισαγωγή: Ο πληθυσμός των CD4 + Τ κυττάρων είναι υπεύθυνος για την οργάνωση και ισορροπία του ανοσοποιητικού συστήματος και την αντιμετώπιση ειδικά έναντι σε κάθε αντιγόνο. Αυτό επιτυγχάνεται λόγω της πλαστικότητας των CD4 + κυττάρων μέσα (διαφοροποιούνται τα ρυθμιστικά Τ κύτταρα-tregs) και κατά την έξοδό τους (παρθενικά CD4 + Τ κύτταρα) από τον θύμο καθώς και τα ερεθίσματα που δέχονται στο μικροπεριβάλλον τους κυρίως από αντιγόνα και κυτταροκίνες. Με τις αλλογενείς μεταγγίσεις αίματος (ABT) τεράστιος αριθμός αντιγόνων εισέρχεται στο σώμα του λήπτη και τον τροποποιεί με μηχανισμό ο οποίος δεν είναι πλήρως κατανοητός μέχρι σήμερα. Σκοπός της εργασίας: Στην παρούσα εργασία, μελετήθηκαν ο τρόπος και οι παράγοντες που επηρεάζουν την πλαστικότητα των CD4 + Τ κυττάρων υπό την επίδραση της μετάγγισης σε ασθενείς που είχαν υποβληθεί σε προγραμματισμένο χειρουργείο αρθροπλαστικής γόνατος ή ισχίου χωρίς άλλες ανοσοτροποποιητικές νόσους. Η διάκριση των ασθενών έγινε με βάση αν έλαβαν μετάγγιση (54 ασθενείςgroup1) ή όχι (35 ασθενείς- group2). Ασθενείς, υλικά και μέθοδοι: Ηπαρινισμένα δείγματα ολικού αίματος από 89 ασθενείς συλλέχτηκαν πριν το χειρουργείο (BS) και αμέσως μετά το χειρουργείο μέχρι την πρώτη εβδομάδα (days 0-7) ή μέχρι το εξιτήριο, ένα μήνα μετά το χειρουργείο (1month) και κατά τον επανέλεγχο των ασθενών (>3months). Σε απομονωμένα PBMC s ασθενών προσδιορίστηκε η μεταβολή των CD4 + CD25 high/+ Foxp3 + (ntreg), CD4 + CD25 + CD127 low/- (itreg) και άλλων CD3 + πληθυσμών με την μέθοδο FACS και στο πλάσμα των ασθενών προσδιορίστηκαν οι συγκεντρώσεις των κυτταροκινών IL-2, IL- 4, IL-5, IL-6, IL-10, TNF-α, IFN-γ με την μέθοδο Cytometric Bead Array (CBA) και των υποδοχέων TNF-RI(p55/p60), TNF-RII(p75/p80), TGF-β1 και TGF-β2 την μέθοδο της ELISA. Επίσης πραγματοποιήθηκαν πειράματα λειτουργικότητας των Tregs σε δείγματα μεταγγισμένων και μη μεταγγισμένων ασθενών, μέσα στην πρώτη μετεγχειρητική εβδομάδα. Σε αυτά καλλιεργήθηκαν απομονωμένα Tregs και Teff από τον ίδιο ασθενή για 72 ώρες σε διάφορους λόγους παρουσία PHA και CFSE. Και τέλος, έγινε συσχέτιση της μετάγγισης με την σοβαρότητα των μετεγχειρητικών επιπλοκών και την παραμονή των ασθενών στο νοσοκομείο. 6

8 Αποτελέσματα: Από τα παραπάνω πειράματα παρατηρήθηκε σημαντική αύξηση των CD4 + CD25 high/+ Foxp3 + και CD4 + CD25 + CD127 low/- μέχρι την πρώτη μετεγχειρητική εβδομάδα στους μεταγγισμένους αλλά όχι στους μη-μεταγγισμένους ασθενείς. Τα πειράματα λειτουργικότητας απέδειξαν ότι τα Tregs μεταγγισμένων και μη μεταγγισμένων ασθενών είναι λειτουργικά και ικανά να προκαλούν αναστολή του πολλαπλασιασμού των Teff, ωστόσο, τα Tregs των μεταγγισμένων ασθενών μπορούσαν να καταστέλλουν ισχυρότερα και παρουσία μεγαλύτερου αριθμού Teff στην καλλιέργεια. Από τις κυτταροκίνες που ανιχνεύτηκαν στο πλάσμα των ασθενών η IL-6, και οι υποδοχείς TNF-RI(p55/p60) και TNF-RII(p75/p80) εμφάνισαν σημαντική αύξηση ενώ σημαντική μείωση εμφάνισε ο TGF-β1 και ιδιαίτερο ρόλο φαίνεται να παίζουν οι IL-2 και TGF-β2. Παρατεταμένη νοσηλεία καθώς και αυξημένες και πιο σοβαρές μετεγχειρητικές επιπλοκές φαίνεται να εμφανίζουν οι μεταγγισμένοι ασθενείς συγκριτικά με τους μη-μεταγγισμένους. Συμπεράσματα: Οι ασθενείς που δέχονται μετάγγιση κατά την διάρκεια του χειρουργείου είναι ανοσοκατεσταλμένοι για τις πρώτες μέρες μετά την μετάγγιση και αυτό οφείλεται στον αυξημένο αριθμό των ρυθμιστικών τους κυττάρων και την επαγωγή των προφλεγμονωδών αποκρίσεων, έτσι οι ασθενείς αναπτύσσουν Th1 απόκριση και πολλαπλασιασμό των Tregs τα οποία καταστέλλουν τον πολλαπλασιασμό των Teff ισχυρότερα. Έτσι σταδιακά, τα Tregs καταστέλλουν τις προφλεγμονώδης αποκρίσεις μέχρι να επανέλθει η ισορροπία των ληπτών μετά την εγχείρηση. Ωστόσο, η ανοσοκαταστολή οφειλόμενη στην μετάγγιση που παρατηρείται τις πρώτες μέρες, οδηγεί τους ασθενείς σε παρατεταμένη νοσηλεία και αυξημένες μετεγχειρητικές επιπλοκές. 7

9 Abstract Introduction: ABT during and following surgery has been widely associated with immunosuppression and nosocomial infections. To investigate whether ABT exerts specific immunomodulatory effects, we studied a cohort of patients that underwent scheduled joint replacement surgery and had no underlying pathologies. Materials and methods: Peripheral blood samples (PBS) were drawn from 89 patients, of which 54 received ABT (TP) and 35 did not (NT), before surgery (BS), and after surgery (AS) on days 0-7, 1 and >3 months. PB cells were phenotyped. The activities of Tregs and T effector (Teff) cells were tested. PB cytokine and TNF-RI/II concentrations were measured. Post-operative complications were recorded for all patients. Results: In TP, CD3 + CD4 + HLA-DR + cells increased significantly on d0 and CD4 + CD25 high/+ CD127 low/- and CD4 + CD25 + Foxp3 + cells between d1-d7, to achieve BS levels >3 months. Tregs and Teffs from all patients were functional, but TP Tregs were significantly more efficient, i.e fewer were required to inhibit Teff proliferation. IL-6 and TNF-RI/II levels increased significantly on d0 and decreased by d7; inversely, TGF-β1 levels fell on d0 and increased by d7. In NT, no differences in cells or cytokine/tnf- RI/II levels were observed BS and AS. Significantly higher rates of post-operative complications were observed in TP (57.4%, 25.53% infections) vs NT (21.88%, 0% infections). Conclusion: ABT causes immunomodulation. ABT results in immediate Teff cell activation and elevated levels of IL-6 and TNF-RI/II, followed by Treg activation and TGF-β1 secretion that peak on d7. Homeostasis is reached 3 months post-abt. ABT results in higher incidence of post-operative complications including infections. 8

10 Θεωρητικό Μέρος 9

11 1. Ανοσοποιητικό σύστημα. 1.1 Και τελικά τι είναι το ανοσοποιητικό σύστημα; Το ανοσοποιητικό είναι ένα ιδιαίτερο σύστημα κυττάρων, ιστών και οργάνων με κύρια λειτουργία την αναγνώριση και άμυνα του οργανισμού έναντι αντιγόνων (μπορεί να είναι ολόκληροι μικροοργανισμοί, τμήματα ή μόρια αυτών) τα οποία εισχωρούν στο σώμα καθώς και την αναγνώριση των συστατικών του ίδιου του οργανισμού. Χαρακτηρίζεται από έντονη πολυπλοκότητα και μεγάλη πλαστικότητα και στον άνθρωπο (και άλλα σπονδυλωτά) ως γραμμές άμυνας υπάρχουν οι φραγμοί, η φυσική ανοσία και η επίκτητη ανοσία. Στην πρώτη κατηγορία ανήκουν οι φραγμοί που διακρίνονται σε φυσικούςμηχανικούς (δέρμα, βλέννα και αναπνευστική οδός), χημικούς (το ph και η μικροβιοκτόνος δράση εκκρινόμενων μορίων) και βιολογικούς (συμβιωτικά μικρόβια) που ως σκοπό έχουν την παρεμπόδιση της εισόδου παθογόνων (ή εν δυνάμει παθογόνων) μικροοργανισμών στο σώμα. Αν κάποιοι μικροοργανισμοί κατορθώσουν να υπερνικήσουν την πρώτη γραμμή άμυνας τότε έρχονται σε επαφή με την δεύτερη αμυντική γραμμή όπου είναι η φυσική ανοσία. Τα στοιχεία της φυσικής ανοσίας βρίσκονται πάντα σε ενεργοποιημένη ή ημι-ενεργοποιημένη κατάσταση με αποτέλεσμα να αποκρίνονται ταχύτατα αλλά όχι ειδικά έναντι των μικροοργανισμών. Σε αυτόν τον τύπο ανοσίας ανήκουν μόρια ή διαλυτοί παράγοντες (όπως ιντερφερόνες τύπου Ι, μικροβιοκτόνα μόρια, συμπλήρωμα, κυτταροκίνες και χημειοκίνες), κύτταρα (όπως φαγοκύτταρα και ΝΚ κύτταρα) και η φλεγμονή (άλγος, πυρετός, οίδημα, ερυθρότητα) τα οποία λειτουργούν μη-ειδικά έναντι μικροοργανισμών που έχουν εισέλθει σε αυτόν. Είναι γρήγορη απόκριση χωρίς ωστόσο να δημιουργεί ανοσολογική μνήμη. Έτσι, οι μηχανισμοί της φυσικής ανοσίας είναι ικανοί να προστατεύουν τον οργανισμό από τα εξωγενή παθογόνα μέχρι να αναπτυχθούν και να δράσουν οι μηχανισμοί της επίκτητης ανοσίας. Στην περίπτωση που οι παθογόνοι μικροοργανισμοί ξεπεράσουν και τους μηχανισμούς της φυσικής ανοσίας, τότε έρχονται αντιμέτωποι με τους μηχανισμούς της επίκτητης ανοσίας. Πρόκειται για πιο εξελιγμένο σύστημα αμυντικών μηχανισμών, το οποίο αυξάνει την έκταση και την δυνατότητα της αμυντικής δράσης μετά από έκθεση σε ένα συγκεκριμένο αντιγόνο. Χαρακτηρίζεται από ειδικότητα, 10

12 ετερογένεια, αυτορρύθμιση, ανοχή και παρέχει στον οργανισμό ανοσολογική μνήμη. Περαιτέρω διακρίνεται και αυτή, σε χυμική και κυτταρική ανοσία. Η χυμική ανοσία αποτελεί τον κύριο προστατευτικό μηχανισμό έναντι εξωκυττάριων μικροβίων και των τοξινών τους και μεσολαβείται από τα Β-κύτταρα τα οποία παρουσία των κατάλληλων ερεθισμάτων διαφοροποιούνται σε πλασματοκύταρρα και εκκρίνουν αντισώματα ενώ η κυτταρική ανοσία, μεσολαβείται από Τ-κύτταρα, τα οποία συνεργάζονται με τα φαγοκύτταρα (στοιχεία της φυσικής ανοσίας) για την καταστροφή των μικροβίων, όπως βακτήρια, μύκητες και μολυσμένα από ιούς κύτταρα, προάγοντας την καταστροφή τους ή τη λύση των μολυσμένων κυττάρων. Τα κύτταρα της επίκτητης ανοσίας (τόσο τα Β όσο και τα Τ κύτταρα) ωριμάζουν και διαφοροποιούνται στα πρωτογενή λεμφικά όργανα δηλαδή τον μυελό των οστών και τον θύμο αδένα. Η ωρίμανση των Τ και Β κυττάρων ξεκινά στον μυελό των οστών, ωστόσο η τελική τους διαφοροποίηση γίνεται στον θύμο αδένα και τον μυελό των οστών αντίστοιχα. Στα δευτερογενή λεμφικά όργανα ανήκουν ο σπλήνας, οι λεμφαδένες, οι ιστοί που σχετίζονται με τους βλεννογόνους, οι αμυγδαλές και οι πλάκες του Peyer στο έντερο. Στην παρακάτω εικόνα φαίνονται σχεδιαγραμματικά τα κύτταρα και μόρια που απαρτίζουν το κάθε σύστημα της ανοσολογικής απόκρισης (Gregersen and Behrens, 2006). Εικόνα 1.1. Απεικόνιση των συστημάτων της φυσικής και της επίκτητης ανοσίας 11

13 1.2 Στάδια της ανοσολογικής απόκρισης: Η ενεργοποίηση του ανοσοποιητικού συστήματος ξεκινά με την είσοδο των αντιγόνων στο σώμα, αφού τα τελευταία έχουν ξεπεράσει τους φραγμούς. Σε αυτή την περίπτωση, πρώτα έρχονται σε επαφή με όλους τους μηχανισμούς της φυσικής ανοσίας και αν δεν καταπολεμηθούν από αυτούς, τότε ενεργοποιούν τους μηχανισμούς της επίκτητης ανοσολογικής απόκρισης. Αυτό συμβαίνει κυρίως μέσω της φαγοκυττάρωσης, όπου γενικά τα φαγοκύτταρα και πιο ειδικά τα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα εγκλωβίζουν, καταστρέφουν και εκθέτουν τμήμα του αντιγόνου στην επιφάνειά τους, και τότε συνδέονται με ειδικούς TCR υποδοχείς (φάση αναγνώρισης) των βοηθητικών λεμφοκυττάρων (ανοσολογική σύναψη) και τα ενεργοποιούν (φάση ενεργοποίησης). Τα ενεργοποιημένα Τ-βοηθητικά λεμφοκύτταρα αποκρίνονται στο ερέθισμα που λαμβάνουν μέσω πολλαπλασιασμού κλώνων για κάθε αντιγόνο και διαφοροποίησης τους σε κύτταρα ικανά να εξουδετερώνουν τα αντιγόνα (κυτταροτοξικά Τ κύτταρα ή Β κύτταρα), διαδικασίες οι οποίες πραγματοποιούνται μέσω της έκκρισης των κατάλληλων κυτταροκινών, οι οποίες μπορούν πρόσθετα να ενισχύουν τη δράση των φαγοκυττάρων και κινητοποιούν τη φλεγμονώδη αντίδραση. Κατά την εξουδετέρωση του αντιγόνου (δραστική φάση) Τ και Β κύτταρα μνήμης παράγονται, ώστε σε επόμενη επαφή με το ίδιο αντιγόνο να παραχθούν γρήγορα και πολλά αντισώματα και τα κατάλληλα κύτταρα της κυτταρικής ανοσίας. Ενώ μετά την εξουδετέρωση του αντιγόνου αυξάνεται ο κατασταλτικός πληθυσμός, ο οποίος είναι υπεύθυνος για την επαναφοράς της ισορροπίας του ανοσοποιητικού συστήματος Κύτταρα του Ανοσοποιητικού Συστήματος: Απαντώνται ως κυκλοφορούντα κύτταρα του αίματος ή της λέμφου και εντοπίζονται συναθροισμένα στα λεμφικά όργανα ή διάσπαρτα σε όλους τους ιστούς του οργανισμού, εκτός από το Κεντρικό Νευρικό Σύστημα. Κατά την διαφοροποίηση των κυττάρων της λεμφικής σειράς από τον κοινό πρόγονο των λεμφοκυττάρων (common lymphoid progenitor/ CLP) μπορούν τα προκύψουν αρχικά οι πρόδρομες μορφές των Τ και Β κυττάρων, τα οποία τελικά θα διαφοροποιηθούν σε ώριμα Τ και Β κύτταρα αντίστοιχα. Ενώ τα υπόλοιπα λευκά αιμοσφαίρια (WBC) προκύπτουν από τον κοινό πρόγονο της μυελοειδούς σειράς (common myeloid progenitor/cmp) ο οποίος διαφοροποιείται στο πρόδρομο κύτταρο των κοκκιοκυττάρων (granulocytemacrophage progenitor/ GMP) και τελικά διαφοροποιούνται σε ουδετερόφιλα, 12

14 μονοκύτταρα, μακροφάγα, βασεόφιλα, ηωσινόφιλα, δενδριτικά και άλλα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα. Επίσης, στην κυτταρική επιφάνεια όλων των κυττάρων υπάρχουν συγκεκριμένοι συνδυασμοί πρωτεϊνών, μορίων ή υποδοχέων, τα οποία ονομάζονται CD, clusters of differentiation και αποτελούν δείκτη διάκρισης των κυτταρικών πληθυσμών. Η έκφραση των CD s διαφέρει ανάλογα με το στάδιο της διαφοροποίησης των κυττάρων, τις λειτουργίες τις οποίες επιτελούν αλλά και την φύση τους. Μπορεί να αφορούν σε κυτταρικούς υποδοχείς ή σε μόρια τα οποία να απαντώνται σε πάνω από μια ομάδες κυττάρων οπότε και δεν αποτελούν πάντα μοναδικούς δείκτες για τα κύτταρα Κύτταρα λεμφικής σειράς ή λεμφοκύτταρα: Στα κύτταρα της λεμφικής σειράς ανήκουν τα ώριμα Τ και Β κύτταρα. Τα Β κύτταρα παράγονται και ωριμάζουν στο μυελό των οστών και είναι υπεύθυνα για την παραγωγή αντισωμάτων. Οι αντιγονικοί υποδοχείς των Β λεμφοκυττάρων είναι μόρια ανοσοσφαιρινών συνδεδεμένα στη μεμβράνη τους. Η αλληλεπίδραση των αντιγόνων με τις μεμβρανικές ανοσοσφαιρίνες, οδηγεί στην ενεργοποίηση των πρώιμων Β κυττάρων όπου ωριμάζουν και διαφοροποιούνται σε πλασματοκύτταρα τα οποία παράγουν και εκκρίνουν τα ειδικά, για κάθε αντιγόνο, αντισώματα τα οποία θα συνδεθούν με τα αντίστοιχα διαλυτά αντιγόνα και θα κινητοποιήσουν τους μηχανισμούς εξουδετέρωσής τους. Τα Τ κύτταρα παράγονται στο μυελό των οστών και στη συνέχεια μεταναστεύουν και ωριμάζουν στο θύμο αδένα. Οι αντιγονικοί υποδοχείς των Τ λεμφοκυττάρων (Tcell receptors/tcrs), είναι ετεροδιμερής γλυκοπρωτεῒνες που αποτελούνται από α και β αλυσίδες. Για την έκφραση του TCR στη μεμβράνη του Τ κυττάρου, είναι απαραίτητη η προηγούμενη μη ομοιοπολική σύνδεσή του με το μόριο CD3. Τα Τ λεμφοκύτταρα αναγνωρίζουν αντιγονικά πεπτίδια που παρουσιάζονται στην επιφάνεια αντιγονοπαρουσιαστικών κυττάρων, συνδεδεμένα με πρωτεῒνες του Μείζωνος Συστήματος Ιστοσυμβατότητας (MHC). Τα Τ λεμφοκύτταρα ανάλογα με το ερέθισμα που δέχονται διαφοροποιούνται σε: Τα Βοηθητικά Τ-λεμφοκύτταρα φέρουν στην επιφάνειά τους το μόριο CD4, όταν έρθουν σε επαφή με αντιγονικό ερέθισμα ενεργοποιούνται και εκκρίνουν κυτταροκίνες που προάγουν τον πολλαπλασιασμό άλλων CD4 κυττάρων και 13

15 κυτταροκίνες που προάγουν την ενεργοποίηση και τον πολλαπλασιασμό άλλων Τ λεμφοκυττάρων, Β λεμφοκυττάρων και μακροφάγων. Τα CD4 κύτταρα ενεργοποιούν τα κυτταροτοξικά Τ-λεμφοκύτταρα τα οποία φέρουν στην επιφάνειά τους το μόριο CD8 και είναι ικανά να προκαλούν την άμεση λύση μικροοργανισμών ή μολυσμένων από ιούς κυττάρων. Επίσης, υπάρχουν κύτταρα τα οποία μετά την επαφή τους με το αντιγόνο διαφοροποιούνται σε κύτταρα μνήμης και βρίσκονται σε κατάσταση ηρεμίας για επόμενη επαφή με το ίδιο αντιγόνο. Μπορεί να είναι Β ή Τ κύτταρα και έχουν μεγάλο χρόνο ζωής χωρίς να απαιτείται η παρουσία αντιγονικού ερεθίσματος. Τέλος, τα ρυθμιστικά Τ-λεμφοκύτταρα δρουν ως κατασταλτικά τερματίζοντας την ανοσολογική απάντηση όταν το αντιγόνο έχει εξαλειφθεί. Εικόνα 1.4. Η ανοσοαπόκριση ανάλογα με το ερέθισμα (Walsh and Mills,2013) 14

16 2. Αρθροπλαστική γόνατος ή ισχίου Αρθροπλαστική γόνατος Η αρθροπλαστική γόνατος εφαρμόζεται σε ασθενείς με καταστάσεις προχωρημένης οστεοαρθρίτιδας ή οστικής νέκρωσης που σαν αποτέλεσμα έχει τον έντονο πόνο στο γόνατο περιορίζοντας τις καθημερινές δραστηριότητες, όπως την κίνηση (την κάμψη και έκταση), όταν όλα τα συντηρητικά μέσα για την ανακούφιση των συμπτωμάτων (ξεκούραση, απώλεια βάρους, φυσιοθεραπεία, βάδιση με μπαστούνι, φάρμακα) έχουν αποτύχει και τέλος, όταν υπάρχει παραμόρφωση (προς τα μέσα ή έξω). Η αρθοπλαστική γίνεται επίσης σε ασθενείς με τραυματισμό του γόνατος, με ρευματοειδή αρθρίτιδα, και άλλες καταστάσεις όπως άσηπτη νέκρωση μηριαίου κονδύλου. Απευθύνεται κυρίως σε ασθενείς άνω των 55 ετών αν και αυτό δεν είναι απόλυτο. Με αυτό το χειρουργείο επιτυγχάνεται ανακούφιση από τον πόνο και βελτίωση της κινητικότητας του ασθενούς. Οστεοαρθρίτιδα γόνατος τελικού σταδίου και ραιβογονία Με αυτή την επέμβαση επιτυγχάνεται η αντικατάσταση της πάσχουσας άρθρωσης με μεταλλική πρόθεση (πολύ ανθεκτικά κράματα ατσαλιού και τιτανίου, τα οποία είναι απολύτως συμβατά με τον ανθρώπινο οργανισμό) ύστερα από κατάλληλη διαμόρφωση των οστών της άρθρωσης (μηριαίο, κνήμη, επιγονατίδα). Έτσι, αποκαθίστανται οι τυχόν αξονικές παραμορφώσεις με τη βοήθεια ακρυλικού τσιμέντου ή ενσφηνώσεων των μεταλλικών μερών της τεχνητής άρθρωσης. Μεταξύ των μεταλλικών μερών προσαρμόζεται ειδικό ανθεκτικό πλαστικό (πολυαιθυλένιο), 15

17 το οποίο εξυπηρετεί την κίνηση. Τα τμήματα της πρόθεσης μοιάζουν στη φυσιολογική ανατομία του γόνατος και λειτουργούν σαν μια φυσιολογική άρθρωση. Ολική αρθροπλαστική γόνατος - Ιατρική Ορθοπαιδική Ομάδα ΝΔ Ελλάδος 2.2. Αρθροπλαστική Ισχίου Η άρθρωση του ισχίου αποτελείται από δύο μέρη, μια σφαίρα (τη μηριαία κεφαλή) στη κορυφή του μηριαίου οστού και μια ημισφαιρική υποδοχή (τη κοτύλη) στο οστό της λεκάνης. Τα δυο μέρη του ισχίου αρθρώνονται ενώ μεταξύ των δυο παρεμβάλλεται συνδετικός ιστός, ο οποίος ενώνει, σταθεροποιεί και στεγανοποιεί τις αρθρικές επιφάνειες δημιουργώντας τον αρθρικό θύλακο. Οι επιφάνειες των οστών καλύπτονται από μία λεία ουσία που ονομάζεται αρθρικός χόνδρος, ο οποίος είναι υπεύθυνος για να απορροφά κραδασμούς και σε συνδυασμό με το αρθρικό υγρό επιτρέπει τη κίνηση μεταξύ των επιφανειών με ελάχιστη τριβή. Η ολική αρθροπλαστική ισχίου αντικαθιστά την κατεστραμμένη ισχιακή άρθρωση. Η πιο κοινή αιτία πόνου και δυσλειτουργίας του ισχίου είναι η αρθρίτιδα (οστεοαρθρίτιδα, ρευματοειδής αρθρίτιδα και μετατραυματική αρθρίτιδα είναι οι πιο κοινές μορφές της) και το κάταγμα. Τα κύρια συμπτώματα είναι ο πόνος σε καθημερινές δραστηριότητες όπως σκύψιμο ή βάδισμα, συνεχόμενος πόνος και κατά τη ξεκούραση, δυσκαμψία στο ισχίο (περιορισμός δυνατότητας κίνησης του κάτω άκρου), μικρή έως καθόλου αναλγησία από τα φάρμακα και άλλες θεραπευτικές παρεμβάσεις όπως η φυσιοθεραπεία ή η χρήση μπαστουνιού. Οι ασθενείς που υποβάλλονται σε ολική αρθροπλαστική ισχίου είναι συνήθως 60 με 80 ετών. 16

18 Η αρθρίτιδα προκαλεί τη φθορά του αρθρικού χόνδρου, αφήνοντας εκτεθειμένο το υποκείμενο οστό. Σε μία επέμβαση ολικής αρθροπλαστικής ισχίου αποκαθίστανται οι προσβεβλημένες ή κατεστραμμένες επιφάνειες στην ισχιακή άρθρωση, και πιο συγκεκριμένα, αντικαθίσταται η κεφαλή του μηριαίου οστού που έχει υποστεί φθορά, με μεταλλικό ή κεραμικό σφαιρικό εμφύτευμα στερεωμένο σε στυλεό, ενώ στην υποδοχή τοποθετείται πολυαιθυλένιο ή μεταλλικό κυπέλλιο με ένθετο πολυαιθυλενίου (πλαστικό). Η πρόθεση μπορεί να στερεωθεί με τσιμέντο παρόμοιο με το οδοντιατρικό τσιμέντο ή να εφαρμοστεί στην κατάλληλη θέση με την άσκηση πίεσης, χωρίς τη χρήση τσιμέντου. Το ποσοστό σοβαρών επιπλοκών της αρθροπλαστικής ισχίου στη διεθνή βιβλιογραφία είναι μικρότερο από 1% και μπορεί να είναι φλεγμονή, λοιμώξεις, θρόμβους και πιο σπάνια άλλες μείζονες ιατρικές επιπλοκές όπως έμφραγμα ή εγκεφαλικό. 17

19 3. Επιλογή των Τ λεμφοκυττάρων στο θύμο. Τα πρόδρομα Τ λεμφοκύτταρα μεταναστεύουν από το μυελό των οστών στο θύμο αδένα όπου ωριμάζουν και τελικώς διαφοροποιούνται και μπορούν να διακριθούν από τη διαφορική έκφραση του μορίου CD3 και των συνυποδοχέων CD4 ή CD8. Η ανάπτυξη των Τ λεμφοκυττάρων συνοδεύεται από εκτεταμένο κυτταρικό θάνατο, γεγονός που αντανακλά την έντονη επιλογή των Τ λεμφοκυττάρων και την εξάλειψη εκείνων που παρουσιάζουν ακατάλληλες ειδικότητες υποδοχέα. Η επιλογή των Τ λεμφοκυττάρων στον θύμο μπορεί να είναι θετική ή αρνητική (Germain, 2002.) Εικόνα 3.1. Σχεδιαγραμματική απεικόνιση θετικής και αρνητικής επιλογής των κυττάρων στον μέσα θύμο (Klein et al, 2009) Η θετική επιλογή ρυθμίζεται αποκλειστικά από τα επιθηλιακά κύτταρα του θύμου και εξασφαλίζει ότι όλα τα ώριμα Τ λεμφοκύτταρα θα είναι ικανά να ανταποκρίνονται σε ξένα αντιγόνα που παρουσιάζονται στα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα. Ενώ, η αρνητική επιλογή ρυθμίζεται κυρίως από τα δενδριτικά κύτταρα και τα μακροφάγα (Klein et al,2009). Η τύχη ενός Τ-λεμφοκυττάρου εξαρτάται από τον χρόνο επαφής με το αντιγόνο και την χημική συγγένεια που θα δημιουργηθεί στο σύμπλοκο κύτταρο-αντιγόνο. Όπως φαίνεται και στο παρακάτω γράφημα, τα περισσότερα θυμοκύτταρα θα οδηγηθούν σε απόπτωση μην έχοντας δει αντιγόνο, λιγότερα θα περάσουν από την θετική επιλογή ώστε να φτάσουν στην περιφέρεια, ενώ ακόμα λιγότερα θα υποστούν αρνητική επιλογή μέσα στον θύμο και θα μετατραπούν σε κύτταρα τα οποία θα ρυθμίζουν τις ανοσολογικές αποκρίσεις (Hogquist et al., 2005;Minton, 2011). 18

20 Εικόνα 3.2. Διαγραμματική απεικόνιση των κυττάρων που υπόκεινται σε απόπτωση, θετική ή αρνητική επιλογή μέσα στον θύμο και πριν εξέλθουν στην περιφέρεια( Hogquist et al., 2005) Όπως αναφέρθηκε και πιο πάνω, τα λεμφοκύτταρα θα πρέπει να έρθουν σε επαφή με κάποιο αντιγόνο σε σχετικά μικρό χρονικό διάστημα, διαφορετικά θα οδηγηθούν σε απόπτωση από «εγκατάλειψη». Ωστόσο άλλη μια σημαντική παράμετρος για την επιβίωση των λεμφοκυττάρων είναι ο σωστός βαθμός χημικής συγγένειας που θα πρέπει να αναπτυχθεί ώστε να δημιουργηθεί το σύμπλοκο, λεμφοκύτταρο-αντιγόνο, και να οδηγήσει σε σωστή ενεργοποίηση του ανοσοποιητικού παρά σε απόπτωση. Σύνδεση με υψηλή χημική συγγένεια κυττάρου-αντιγόνου οδηγεί σε απόπτωση και το ίδιο αποτέλεσμα παρατηρείται όταν η χημική συγγένεια του συμπλόκου είναι ασθενής. Σωστή χημική συγγένεια επάγει την ανοσολογική απόκριση και κινητοποιεί το ανοσοποιητικό σύστημα για την ενεργοποίηση των απαραίτητων κυτταρικών τύπων προκειμένου να καταπολεμηθούν τα αντιγόνα. Τα κυκλοφορούντα Τ λεμφοκύτταρα διακρίνονται περαιτέρω ανάλογα με το αν έχουν έρθει σε επαφή (μνημονικά) ή όχι (παρθενικά) με αντιγόνο (Kohler and Thiel,2009;Love and Bhandoola,2011). Εικόνα 3.3.Επιλογή των κυτταρικών κλώνων στην περιφέρεια (Kohler and Thiel,2009) Ωστόσο υπάρχει μια κατηγορία βοηθητικών κυττάρων τα οποία ωριμάζουν μέσα στον θύμο και υπόκεινται σε τελική επιλογή μέσα σε αυτόν. Αυτά τα κύτταρα είναι τα φυσικά ρυθμιστικά κύτταρα τα οποία αναγνωρίζουν τα αυτοαντιγόνα μέσω των αντιγονοπαρουσιατικών και κατά την έξοδό τους στην κυκλοφορία είναι διαφοροποιημένα και έτοιμα να επιτελέσουν την κατασταλτική τους δράση (Xing&Hogquist,2011). Όπως φαίνεται και στην παρακάτω εικόνα η τύχη ενός CD4 + κυττάρου μέσα στον θύμο εξαρτάται από δυο 19

21 παραμέτρους, τον αριθμό των αντιγόνων με τα οποία έρχεται σε επαφή και τον ρυθμό δημιουργία των κυτταρικών κλώνων και έτσι τελικά διαφοροποιούνται τα κύτταρα σε φυσικά ρυθμιστικά ή σε παρθενικά τα οποία θα βγουν στην περιφέρεια για να έρθουν σε επαφή με άλλα αντιγόνα (Hsieh et al.,2012). Εικόνα 3.4. Διαφοροποίηση των CD4 κυττάρων στον θύμο(hsieh et al., 2012) 3.1. Πλαστικότητα των CD4 + κυττάρων. Εικόνα Διαφοροποίηση των Τ-κυττάρων (O'Shea&Paul, 2010) 20

22 Ο πληθυσμός των βοηθητικών CD4 + Τ κυττάρων χαρακτηρίζεται από πολύ μεγάλη ετερογένεια καθώς τα παρθενικά CD4 + κύτταρα μπορεί να διαφοροποιηθούν ανάλογα με το ερέθισμα (αντιγόνο) από το οποίο ενεργοποιούνται, σε διαφορετικούς Τ κυτταρικούς πληθυσμούς με συγκεκριμένες λειτουργίες. Τα παρθενικά CD4 + κύτταρα θα μπορούσαμε να πούμε ότι έχουν ιδιότητες παρόμοιες με αυτές των βλαστικών κυττάρων καθώς μπορούν να διαφοροποιηθούν σε δραστικά, μνημονικά ή ρυθμιστικά κύτταρα. Η διάκριση αυτών των πληθυσμών γίνεται με βάση τις κυτταροκίνες που εκφράζουν και/ή παράγουν όπως φαίνεται στον παρακάτω πίνακα. Τα παρθενικά CD4 + Τ κύτταρα μπορούν να διαφοροποιηθούν ανάλογα με το αν είναι ειδικά για παθογόνα σε κύτταρα τύπου Th1, Th2 ή Th17, με το αν επιτελούν επιτήρηση για αυτό-αντιγόνα στον οργανισμό, σε Tregs και σε αποκρίσεις που χρειάζεται η επαγωγή των αντισωμάτων από τα Β κύτταρα σε θυλακοειδή Τ βοηθητικά κύτταρα (T fh ). Ορισμένα από τα κύτταρα στην περιφέρεια εξακολουθούν να συντηρούν έναν βαθμό πλαστικότητας, αν και μικρότερο, καθώς για την τελική τους διαφοροποίηση χρειάζονται την παρουσία και άλλων κυτταροκινών αλλά και την περαιτέρω ενεργοποίηση με το ίδιο αντιγόνο ενώ άλλα είναι τελικώς διαφοροποιημένα. Σε άλλες περιπτώσεις έχει παρατηρηθεί η μετατροπή δραστικών κυττάρων σε ρυθμιστικά, παρουσία των κατάλληλων ερεθισμάτων (Geginat et al.,2014;hirahara et al., 2013;Walsh and Mills,2013;O'Shea and Paul, 2010). Πιο συγκεκριμένα, όταν στον οργανισμό εισέλθουν βακτήρια ή ιοί, εντοπίζονται από τα δενδριτικά τα οποία τα καταστρέφουν και εκκρίνουν IL-12. Παρουσία της IL-12 τα παρθενικά CD4 + Τ-κύτταρα ενεργοποιούνται, αρχικά εκκρίνουν IL-2 και στην συνέχεια διαφοροποιούνται προς Th1 Τ-κύτταρα εκκρίνοντας την προφλεγμονώδη κυτταροκίνη IFN-γ. Η διαφοροποίηση των Th1 κυττάρων παρουσία των παραπάνω κυτταροκινών, οδηγεί στην προσέλκυση των μακροφάγων στην περιοχή ώστε να φαγοκυτταρώσουν και τελικά να καταστρέψουν τους παθογόνους μικροοργανισμούς που έχουν εισέλθει σε αυτόν. Αντίθετα, παρουσία παρασίτων στον οργανισμό, τα παρθενικά CD4 + Τ-κύτταρα ενεργοποιούνται από την IL-4, αρχικά εκκρίνουν IL-2 και στην συνέχεια διαφοροποιούνται προς Th2 Τ-κύτταρα εκκρίνοντας την αντιφλεγμονώδη κυτταροκίνη IL-4 και στην συνέχεια ανάλογα με την ανοσολογική απόκριση μπορεί να παράγουν IL-4, IL-5 και IL-13, έτσι επάγεται και η έκκριση IgE αντισωμάτων από τα Β κύτταρα, τα οποία εμπλέκονται και σε αλλεργίες. Όταν τα παρθενικά CD4 + 21

23 Τ-κύτταρα βρεθούν σε περιβάλλον IL-10 επάγεται ο πολλαπλασιασμός των ρυθμιστικών κυττάρων. Η έκκριση των διαφορετικών κυτταροκινών που παρατηρείται από τους διαφοροποιημένους κυτταρικούς πληθυσμούς είναι αποτέλεσμα διαφορετικής μοριακής σηματοδότησης και άρα και μεταγραφικών παραγόντων που εμπλέκονται στην διαδικασία, όπως φαίνεται λεπτομερώς και στον πίνακα 3.1.3(Geginat et al.,2014;bailey et al.,2013;magombedze et al., 2013;Walsh and Mills,2013;O'Shea and Paul, 2010). Εικόνα Διαφορές μεταξύ πλαστικότητας και διαφοροποίησης των CD4 + Τ-κυττάρων (Geginat et al.,2014) Υποπληθυσμοί Τ-κυττάρων Φαινότυπος Κυτταροκίνες Παρθενικά κύτταρα CD45RA + CCR7 + IL-2 T CM (central μνημονικά) T EM (δρασικά μνημονικά) T RM CD45RA - CCR7 + CCR7 - IL-2, IL-21 IFN-γ, IL-4, IL-5, IL-17 Μεταγραφικοί παράγοντες Λειτουργία Προγονικά κύτταρα, προστασία έναντι νέων παθογόνων Δευτερογενής κλωνική επέκταση και απόκριση Προστασία στους ιστούς και απόκριση (ιστοειδικά μνημονικά) CD103 + CD69 + IFN-γ Προστασία στους ιστούς T FH (follicular βοηθητικά) CXCR5 + ICOS + IL-21 BCL6 Απόκριση μέσω Β κυττάρων Th1 CXCR3 + IFN-γ T-bet Προστασία έναντι ενδοκυττάριων παθογόνων Th2 CRTH2 + IL-4, IL-5, Προστασία έναντι εξωκυττάριων GATA-3 IL-13 παρασίτων Th9? IL-9 PU.1 Προστασία έναντι εξωκυττάριων παρασίτων Th17 CCR6 + CD161 + IL-17, IL-22, Προστασία έναντι εξωκυττάριων RORC2 IL-26 βακτηρίων και μυκήτων Treg CD25 + CD127 - TGF-β FOXP3 Διατήρηση της αυτό-ανοχής Tr1 CD25 - CD127 - ή (ρυθμιστικά τύπου-1) CD49b + LAG3 + IL-10? Αναστολή της ανοσοπαθολογίας Πίνακας Δείκτες διαφοροποίησης των Τ-κυττάρων (τροποποιημένος από Geginat et al.,2014) 22

24 4. Ρυθμιστικά κύτταρα Χαρακτηριστικά των ρυθμιστικών κυττάρων - Treg Οι επιφανειακοί (τα CD s όπως αναφέρθηκαν πιο πάνω) και μοριακοί δείκτες αποτελούν χρήσιμο εργαλείο για τον καθορισμό και την ανάλυση των κυτταρικών πληθυσμών. Τα ρυθμιστικά κύτταρα είναι υποπληθυσμός των Τ-βοηθητικών λεμφοκυττάρων και αποτελούν το 1-2% των βοηθητικών Τ-λεμφοκυττάρων στην περιφέρεια (Baecher-Allan et al.,2001;jonuleit et al.,2001), οπότε είναι κύτταρα τα οποία θα έχουν φαινότυπο CD3 + CD4 +. Επίσης πρόκειται για ενεργοποιημένα κύτταρα οπότε θα φέρουν στην επιφάνειά τους τον υποδοχέα της IL-2, όπου μέχρι σήμερα ανιχνεύεται μέσω της α-αλυσίδας του, δηλαδή του μορίου CD25. Η IL-2 είναι αυξητικός παράγοντας των Τ κυττάρων, ο οποίος είναι σημαντικός για τον πολλαπλασιασμό των Τ κλώνων και ικανοποιητικός δείκτης προσδιορισμού των ενεργοποιημένων κυττάρων. Οπότε ο πληθυσμός των ρυθμιστικών κυττάρων φαινοτυπικά χαρακτηρίζεται από την συνεχή έκφραση των μορίων CD3 + CD4 + CD25 + (Piccirillo et al.,2004;ng et al.,2001). Εικόνα 4.1. Ωρίμαση και διαφοροποίηση των κυττάρων μέσα και έξω από τον θύμο. Έτσι, οι ευρέως αποδεκτοί δείκτες για τον προσδιορισμό των Treg είναι όπως αναφέρθηκε το μόριο CD25 (Ng et al.,2001;sakaguchi et al.,1995), και άλλα μόρια όπως το cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4 (CTLA-4) (Read et al.,2000; Takahashi et al.,2000), το μόριο glucocorticoid-induced tumour necrosis factor receptor family-related gene (GITR), το μόριο lymphocyte activation gene-3 (LAG-3), η έκφραση του μεταγραφικού παράγοντα forkhead winged-helix transcription factor box P3 (Foxp3) (Fontenot et al.,2003;hori et al.,2003) και έχει βρεθεί ότι τα ρυθμιστικά κύτταρα έχουν έλλειψη στον υποδοχέα της IL-7, κάτι που μπορεί να εντοπιστεί μέσω της έλλειψης της α-αλυσίδας του υποδοχέα της, το μόριο CD127 (Corthay et al.,2009;liu et al.,2006;seddiki et al.,2006) όπως αποδείχθηκε και από τα πειράματα τα 23

25 Yu και των συνεργατών του, όπου απέδειξε ότι ο ρυθμιστικός πληθυσμός με φαινότυπο CD4 + CD25 + CD127 low/- είναι αντιπροσωπευτικός για σωστή ποσοτικοποίηση των ρυθμιστικών κυττάρων (Yu et al.,2012) Λειτουργίες των ρυθμιστικών κυττάρων - Treg Τα ρυθμιστικά κύτταρα (Treg) είναι επιφορτισμένα να επιτελούν πολύ σημαντικές λειτουργίες για τον οργανισμό, πριν αναλυθούν λεπτομερώς τα κύτταρα παρακάτω ας εξεταστούν οι λειτουργίες που επιτελούν. Η σημαντικότερη λειτουργία είναι η ανάπτυξη και διατήρηση της ανοσολογικής ανοχής ώστε να αποφεύγεται η ανάπτυξη αυτοάνοσων νοσημάτων (Wang et al., 2007;Sakaguchi et al.,1995) ενώ άλλες λειτουργίες που επιτελούν είναι η καταστολή αλλεργιών και άσθματος, η επαγωγή της ανοχής σε κάποια αντιγόνα (Zhang et al.,2001;weiner et al.,1997;chen et al.,1994) και της μητέρας προς το έμβρυο (Aluvihar et al.,2004), η ρύθμιση της ανοσολογικής απόκρισης (Matzinger et al.,2007;alpan et al.,2004), η καταστολή της ενεργοποίησης των Τ κυττάρων από αδύναμο ερέθισμα, ο έλεγχος της ανοσολογικής απόκρισης από τα effector Th κύτταρα (Cohn et al. 2008; Oldenhove et al.,2003), η προστασία έναντι των βακτηρίων για την ολοκληρωτική καταστροφή τους από το ανοσοποιητικό σύστημα και τέλος, η καταστροφή των Τ κυττάρων, τα οποία έχουν ενεργοποιηθεί με την πρόσδεση των αγωνιστών υψηλής συγγένειας με τους υποδοχείς τους (Corthay et al., 2009). (Hanidziar et al.,2010) Εικόνα Σχεδιαγραμματική απεικόνιση της ανοσολογικής ανοχής που επάγεται από τα Tregs 24

26 4.2. Επαγώγιμα και Φυσικά ρυθμιστικά κύτταρα. Οι κυτταρικοί πληθυσμοί των ρυθμιστικών κυττάρων επάγουν την ανοσολογική ανοχή και καταστέλλουν τις ανοσολογικές αποκρίσεις. Οι μηχανισμοί δράσης των κυττάρων (περιγράφονται παρακάτω) εξαρτώνται από τις κυτταροκίνες και την κυτταρική επαφή. Η έκκριση των κυτταροκινών από τα Treg και η επαγωγή της ανοσολογικής ανοχής, εξαρτάται από τον αριθμό των αντιγόνων, την φύση του οργάνου στόχου, το μέγεθος του αντιγόνου και τα συδιεγερτικά ερεθίσματα. Καθοριστικά μόρια στην δημιουργία της ανοσοκαταστολής είναι οι κυτταροκίνες IL- 10 και TGF-β1, οι οποίες εκκρίνονται τόσο από τα itreg αλλά και των ntregs (Shevach et al.,2001;takahashi et al.,2000;thornton et al.,1998) Επαγώγιμα CD4 + CD25 + ρυθμιστικά T κύτταρα Τα επαγώγιμα ρυθμιστικά κύτταρα ή inducible T regulatory cells ή itreg προκύπτουν είτε από ενεργοποίηση των ώριμων, περιφερικών CD4 + CD25 - T- κυττάρων είτε από τον ίδιο ώριμο πρόγονο Τ κυττάρων, ανάλογα τις ποιοτικές και ποσοτικές διαφορές των αντιγόνων, σε μια διαδικασία που είναι εξαρτώμενη από κυτταροκίνες. Τα itreg δημιουργούνται από τα ώριμα CD4 + CD25 - T κύτταρα ύστερα από την επίδραση διαφορετικών διεγερτικών συνθηκών (παρουσία αντιγόνων και ανοσοκατασταλτικών κυτταροκινών, όπως η IL-10 και TGF-β1, αλλά και η vitamin D3 και η dexamethasone όπου είναι αναστολείς των CD40-CD40L ή των ώριμων πληθυσμών DC) (Yu et al., 2012;Peralta et al.,2011;piccirillo et al.,2004;ng et al.,2001) Φυσικά CD4 + CD25 + ρυθμιστικά T κύτταρα Η βασική λειτουργία των φυσικών ρυθμιστικών κυττάρων ή natural regulatory cells ή ntregs είναι να αναγνωρίζουν τα αυτοαντιγόνα και να καταστέλλουν ανοσολογικές αποκρίσεις που μπορεί λανθασμένα να ξεκινούν έναντι αυτών, αποτρέποντας έτσι την αυτοανοσία. Ωριμάζουν και διαφοροποιούνται στον θύμο αδένα μέσω της θετικής ή αρνητικής επιλογής από ένα μοναδικό προγονικό κύτταρο ή προκύπτουν από ανώριμα CD4 + CD8 + ή CD4 + θυμοκύτταρα τα οποία μπορούν να διαφοροποιηθούν σε Treg υπό συγκεκριμένες καταστάσεις (Piccirillo, 2004, Baecher- Allan et al., 2001). Φαινοτυπικά χαρακτηρίζονται από την συνεχή έκφραση των μορίων CD4 + CD25 + και άλλων δεικτών όπως οι CD45RB low, CD38, CD62L hi, DX5, CD103, CTLA4 καθώς και την έκφραση του μεταγραφικού παράγοντα FoxP3 (Ochs 25

27 et al.,2007;fontenot et al., 2003;Hori et al.,2003;gambineri et al.,2003;baecher-allan et al.,2001;ng et al., 2001) Διαφορές μεταξύ των φυσικών και των επαγώγιμων Tregs. Βασικό χαρακτηριστικό των ρυθμιστικών πληθυσμών είναι η επαγωγή της ανοσοκαταστολής ή της ανοσολογικής ανοχής όπου και όταν αυτή χρειάζεται, ωστόσο πρόκειται για δυο διαφορετικούς κυτταρικούς πληθυσμούς. Έτσι, οι διαφορές μεταξύ των δυο εντοπίζονται στην τελική ωρίμανση των κυττάρων και τον τρόπο ενεργοποίησής τους. Τα ntreg είναι πλήρως διαφοροποιημένα κατά την έξοδό τους από τον θύμο αδένα έχοντας αναγνωρίσει αυτοαντιγόνα μέσα σε αυτόν, σε αντίθεση με τα itreg τα οποία διαφοροποιούνται στην περιφέρεια μέσω αντιγόνων που συνδέονται με χαμηλή συγγένεια ή της μεταγωγής σήματος μέσω του TCR. Επίσης, η ωρίμανση των ntreg γίνεται μέσω των APCs και της ανοσολογίκης σύναψης ενώ τα itreg δεν χρειάζονται τον συνδιεγέρτη CD28 για την ανάπτυξη και την λειτουργία τους, ωστόσο, το συνδιεγερτικό μόριο CD28 B7 είναι σημαντικό για την αναγέννηση των δραστικών (effector) Τ-κυττάρων. Παράλληλα, οι Piccirillo και συνεργάτες το 2004, απέδειξαν ότι τα ntreg διευκολύνουν την επαγωγή των itreg μέσω καλλιεργειών των ntreg παρουσία άλλων Teff κυττάρων, in vitro, τα Teff διαφοροποιούνταν σε Treg πληθυσμό, ικανό να καταστείλει τις Th1/Th2 αποκρίσεις με τρόπο εξαρτώμενο από τις TGF-β1 και/ή IL-10 ( Li et al.,2010;piccirillo et al.,2004). Εικόνα Χαρακτηριστικά των φυσικών (ntreg) και επαγώμενων (itreg) ρυθμιστικών κυττάρων ( Li et al.,2010) 26

28 O μεταγραφικός παράγοντας forkhead box-p3 (Foxp3). Το γονίδιο Foxp3 εντοπίζεται στο χρωμόσωμα Χ και πιο συγκεκριμένα στον γενετικό τόπο Xp Κωδικοποιεί τον μεταγραφικό παράγοντα Foxp3, ο οποίος είναι μια πρωτεΐνη μεγέθους 50kDa και εντοπίζεται στον πυρήνα του κυττάρου. Γενομική ανάλυση έδειξε ότι είναι υπεύθυνος για τον έλεγχο και την έκφραση γονιδίων καθώς μπορεί να προσδένεται στον υποδοχέα γονιδίων τα οποία σχετίζονται με την σηματοδότηση μέσω του TCR, γονίδια κυτταροκινών και γονίδια επιφανειακών μορίων και μπορεί να δρα είτε ως ενεργοποιητής είτε ως αναστολέας (Caudy et al., 2007; Zheng et al., 2007; Schimpl et al., 2002; Bennett et al., 2001; Jordan et al., 2001; Wildin et al., 2001). Αποτελεί μοναδικό δείκτη των CD4 + CD25 + Tregs κυττάρων καθώς είναι απαραίτητος για την ανάπτυξη, τη διατήρηση και την λειτουργία τους, ενώ αποσιώπηση ή μεταλλάξεις του γονιδίου Foxp3 έχουν σαν αποτέλεσμα την ανάπτυξη των σοβαρών αυτοανόσων καταστάσεων XLAAD (X-linked autoimmunity-allergic dysregulation syndrome) και IPEX (immunodysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, X-linked syndrome) σε ανθρώπους και ποντίκια. Εντοπίζεται κυρίως στους λεμφικούς ιστούς και εκφράζεται κυρίως από τα CD4 + και ορισμένα CD8 + Τ κύτταρα (σχεδόν μη ανιχνεύσιμα επίπεδα στα Β κύτταρα, στα γδ κύτταρα, στα ΝΚ κύτταρα, τα μακροφάγα και τα δενδριτικά). Οπότε, φαινοτυπικά τα Treg χαρακτηρίζονται από την συνέκφραση των CD25 και Foxp3 μορίων (Sun et al., 2012; Haiqi et al.,2011; Corthay et al.,2009; Huehna et al., 2009; Sakaguchi et al.,2008; Hori et al., 2003; Khattri et al., 2003). Η διαρκής έκφραση του Foxp3 είναι σημαντική για την διατήρηση της κατασταλτικής ικανότητας των ώριμων Treg στην περιφέρεια. Ωστόσο, δεν φαίνεται η έκφραση του Foxp3 από μόνη της να είναι αρκετή για την ρυθμιστική δράση των κυττάρων, καθώς ένα σημαντικό ποσοστό των ανθρώπινων ενεργοποιημένων Τ κυττάρων που εκφράζουν τον Foxp3 δεν έχουν ρυθμιστική ενεργότητα (Huehna &Beyer., 2015;Corthay et al.,2009;hill et al.,2007;haiqi et al.,2011;fontenot et al.,2003) 27

29 4.3. Τρόποι δράσης των ρυθμιστικών κυττάρων Η σωστή αναλογία των ρυθμιστικών κυττάρων στο ανοσοποιητικό σύστημα είναι ιδιαίτερα σημαντική και κρίσιμη γιατί τα ρυθμιστικά κύτταρα μπορούν να λειτουργήσουν θετικά για τον οργανισμό, ωστόσο ανισορροπία τους μπορεί να έχει επιβλαβή αποτελέσματα. Ο βασικός ρόλος που είναι επιφορτισμένα να εξυπηρετούν είναι η συντήρηση της ομοιόστασης, η αναγνώριση των αυτοαντιγόνων ώστε να αποτρέπονται καταστάσεις αυτοανοσίας, καταστάσεις υπερευαισθησίας ή αλλεργιών και να προκαλούν τον τερματισμό ανοσολογικών αποκρίσεων έναντι αντιγόνων που έχουν εισέλθει και καταπολεμηθεί. Επίσης αυξημένος αριθμός τους είναι σημαντικός για την ανάπτυξη ανοσολογικής ανοχής μετά από καταστάσεις μεταμοσχεύσεων ώστε να γίνει η αποδοχή του μοσχεύματος. Ο μηχανισμός της ανοσολογικής ανοχής σε μεταμοσχευμένους ασθενείς είναι καλύτερα μελετημένος προσδίδοντας πληροφορίες για τον τρόπο ανάπτυξης της ανοσολογικής ανοχής μέσω απαλοιφής (deletion), ανεργίας, ignorance ή κλονική απαλοιφής (clonal exhaustion) των Treg ώστε να μην εγείρεται η ανοσολογική απόκριση έναντι αλλοαντιγόνων του δότη. Από την άλλη, ο αυξημένος πληθυσμός των ρυθμιστικών κυττάρων λειτουργεί αρνητικά σε καταστάσεις καρκίνου και ορισμένων μολύνσεων. Παρ όλα αυτά, πρόκειται για πληθυσμό Τ-κυττάρων ο οποίος δημιουργεί ειδική απόκριση προς κάθε αντιγόνο και η δράση του μπορεί να επιτελείται είτε απευθείας στα APCs, είτε απευθείας στα δραστικά (effector) κύτταρα, όπως φαίνεται παρακάτω (Schmidt et al., 2012; Wood&Sakaguchi,2003). Εικόνα Σχεδιαγραμματική απεικόνιση των τρόπων δράσης των Treg. 28

30 4.4. Τρόποι αναγνώριση των αλλοαντιγόνων από τα Tregs. Η αναγνώριση των αντιγόνων από τα Tregs ώστε να ενεργοποιηθούν και να καταστείλουν τον πολλαπλασιασμό των κατάλληλων κυττάρων μπορεί να γίνει είτε άμεσα είτε έμμεσα. Άμεσα παρατηρείται όταν τα Tregs του δότη αλληλεπιδρούν άμεσα με τα APCs του λήπτη μέσω των MHC μορίων σε μια διαδικασία αμέσως μετά την μεταμόσχευση, όπου τα APCs του δότη μεταναστεύουν από το μόσχευμα και διεγείρουν τα Τ κύτταρα στους λεμφοειδής ιστούς οδηγώντας σε απόρριψη του μοσχεύματος, ωστόσο ο χρόνος ζωής των APCs του δότη είναι μικρός. Ενώ έμμεσα παρατηρείται όταν τα Tregs αναστέλλουν τον πολλαπλασιασμό των CD4 + και CD8 + κυττάρων που έχουν ενεργοποιηθεί από αντιγόνα στα κυκλοφορούντα APCs. Η έμμεση οδός παίζει σημαντικό ρόλο στην οξεία απόρριψη μοσχεύματος και την συνεχόμενη απόκριση έναντι του μοσχεύματος για μεγάλο χρονικό διάστημα. Ωστόσο, έχει αποδειχθεί ότι οι ασθενείς που έλαβαν μετάγγιση αίματος, με το αίμα του δότη πριν την μεταμόσχευση, όπου ένα αντιγόνο MHC τάξης ΙΙ (HLA-DR) ήταν κοινό μεταξύ του αίματος και του μοσχεύματος, είχαν καλύτερη πορεία και μικρότερη πιθανότητα απόρριψης μετά την μεταμόσχευση (Wood & Sakaguchi, 2003; Sánchez-Fueyo et al.,2007). Εικόνα Σχεδιαγραμματική απεικόνιση της άμεσης και έμμεσης οδού αναγνώρισης από τα Treg. 29

31 4.5. Μηχανισμοί ρύθμισης των Treg Με βάση την λειτουργικότητα των κυττάρων, η ποικιλία των πιθανών μηχανισμών καταστολής από τα Treg μπορούν να ομαδοποιηθούν σε τέσσερεις τρόπους δράσεις (Caridade et al., 2013;Schmidt et al., 2012; Priyadharshini et al.,2011;vignali et la.,2008): 1. Καταστολή από ανασταλτικές κυτταροκίνες (suppression by inhibitory cytokines) 2. Καταστολή από λύση των κυττάρων (suppression by cytolysis) 3. Καταστολή μέσω μεταβολικών διαταραχών (suppression by metabolic disruption) 4. Και καταστολή από τροποποίηση της ωρίμασης ή λειτουργίας των δενδριτικών κυττάρων (suppression by modulation of dendritic-cell (DC) maturation or function). Eικόνα Τρόποι καταστολής των Treg Καταστολή από ανασταλτικές κυτταροκίνες. Τα Tregs μπορούν να ασκούν την κατασταλτική τους δράση μέσω των ανασταλτικών κυτταροκινών IL 10, TGF-β και IL 35. Σε πειραματικά μοντέλα αλλεργιών ή άσθματος φάνηκε ότι η IL 10 και ο TGF-β, σε συνδυασμό ή μόνες τους, επηρέασαν τους πληθυσμούς των ntreg και itreg κυττάρων καθώς η καταστολή της Th2 απόκρισης από τα Treg εξαρτάται από την IL-10, αλλά όχι το αντίστροφο (Vignali, 2008;Jonuleit, 2001). 30

32 4.5.2.Καταστολή μέσω της λύσης των κυττάρων. Τα Tregs μπορούν προκαλέσουν λύση των κυττάρων μέσω της έκκρισης granzymes Α ή Β. Η κυτταροτοξική ενεργότητα των Tregs έχει επιβεβαιωθεί καθώς μπορούν να οδηγήσουν τα Β κύτταρα σε απόπτωση με τρόπο εξαρτώμενο από το granzyme B και μερικώς εξαρτώμενο από την περφορίνη. Ωστόσο αυτή τους η ιδιότητα μπορεί να προκαλέσει αναστολή της καταστροφής των όγκων μέσω της επαγωγής της απόπτωσης των ΝΚ και CTLs εξαιτίας της παρουσίας granzyme B και περφορίνης (Tran et al.,2012;kim et al.,2010;vignali et al.,2008) Καταστολή μέσω διαταραχών του μεταβολισμού. IL 2: Υψηλή συγκέντρωση της IL 2 στο μικροπεριβάλλον των κυττάρων επάγει την έκφραση του υποδοχέα της (ο οποίος ανιχνεύεται μέσω του μορίου CD25) και την αυξημένη πρόσδεση σε αυτόν με αποτέλεσμα να καταναλώνεται από τα Treg και να οδηγεί τα effector κύτταρα σε απόπτωση λόγω της έλλειψής της (Vignali et al.,2008;kim et al.,2010). Νουκλεοτίδια αδενοσίνης: Η έκφραση και απελευθέρωση των νουκλεοτιδίων από τους υποδοχείς CD39 και CD73 στο εξωκυττάριο περιβάλλον έχει σαν αποτέλεσμα την πρόσδεση με τους αντίστοιχους υποδοχείς 2Α (adenosine receptor 2A -A 2A R) που βρίσκονται στα effector κύτταρα. Αυτή η πρόσδεση αναστέλλει τις λειτουργίες των κυττάρων (μέσω αναστολής της IL 6 και επαγωγής του TGFβ), επάγει την αναγέννηση των itreg και εξυπηρετεί την ωρίμανση των DC. Ο TGF-β επάγει την έκφραση του Foxp3 οπότε και την διαφοροποίηση των Treg καθώς και την έκκριση προ-φλεγμονωδών κυτταροκινών και Th17 (Kim et al.,2010;vignali et al.,2008). Κυκλικό AMP: Η άμεση καταστολή των effector κυττάρων από τα Tregs μπορεί να γίνει μέσω του κυκλικού AMP (camp) μέσω μεμβρανικών χασματοσυνδέσεων (Vignali et al.,2008) Καταστολή της ωρίμανσης ή λειτουργίας των δενδριτικών κυττάρων. Ένας άλλος μηχανισμός καταστολής των κυττάρων από τα Treg αφορά στην ωρίμανση των DCs. Η ενεργοποίηση των effector Τ κυττάρων γίνεται μέσω της πρόσδεσης των CTLA4 και CD80 και/ή CD86 μορίων των DCs. Στο εσωτερικό των DCs επάγεται η παραγωγή του μορίου indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO), το οποίο, 31

33 επάγει την παραγωγή προ-αποπτωτικών μεταβολιτών από τον καταβολισμό της τρυπτοφάνης και έτσι καταστέλλεται ο πολλαπλασιασμός των effector Τ κυττάρων. Πρόσθετα, πρόσδεση του μορίου LAG3 (ομόλογο του μορίου CD4 αλλά με αρνητική ρυθμιστική λειτουργία) με το μόριο MHC τάξης II (μόριο που εκφράζεται από τα ανώριμα DCs) με μεγάλη συγγένεια, οδηγεί στην αναστολή της ωρίμανσης και της λειτουργίας των DC. Παράλληλα, επάγεται η έκφραση του υποδοχέα ITAM και μέσω ανασταλτικού σηματοδοτικού μονοπατιού, στο οποίο εμπλέκονται εξωκυττάρια σήματα που ρυθμίζουν το μοναπάτι των ERK κινασών, αναστέλλεται η ωρίμανση των DC και μειώνεται η ανοσοδιεγερτική ικανότητα τους (Kim et al.,2010; Vignali et al.,2008). Εικόνα Μηχανισμοί δράσης των ρυθμιστικών κυττάρων (Caridade et al., 2013) 4.6. Πόσους μηχανισμούς χρειάζονται τα Tregs. Τα Tregs μπορούν να χρησιμοποιήσουν όλους τους παραπάνω μηχανισμούς καταστολής, μόνους τους ή σε συνδυασμό. Ωστόσο, η χρήση ενός και μόνο μηχανισμού καταστολής δεν είναι και τόσο πιθανή αφού κανένα από τα μόρια ή τους μηχανισμούς που περιγράφηκαν δεν σχετίζεται με ολοκληρωτική απώλεια της ρυθμιστικής ενεργότητας όταν μπλοκάρεται ή απαλείφεται. Έλλειψη ενός μορίου όπως η IL 10, IL 35 ή το granzyme B οδηγεί σε μειωμένη κατασταλτική ικανότητα. Έτσι, ανάλογα με την ανάγκη της απόκρισης, μπορούν να χρησιμοποιηθούν συνδυαστικά πολλαπλοί μηχανισμοί για την μέγιστη λειτουργία των ρυθμιστικών κυττάρων. Η αποφυγή του ρυθμιστικού ελέγχου των Tregs στα effector Τ κύτταρα γίνεται μέσω της μετανάστευση των Teffs. 32

34 4.6.1.Πως επιλέγεται κάθε φορά ο κατάλληλος ρυθμιστικός μηχανισμός. Ένα κριτήριο επιλογής του κατάλληλου ρυθμιστικού πληθυσμού θα μπορούσε να αποτελέσει το είδος των ιστών στο οποίο θα πρέπει να επιτελέσουν την κατασταλτική τους δράση. Ένα άλλο κριτήριο θα μπορούσε να είναι η ιεραρχική χρήση των μηχανισμών, όπου σε αυτή την περίπτωση από το σύνολο των μηχανισμών θα χρησιμοποιούνταν μόνο οι πιο κρίσιμοι και οι πιο σημαντικοί ανάλογα τις καταστάσεις (ένας ή δυο μηχανισμοί). Ενώ ένα τρίτο κριτήριο θα μπορούσε να είναι η χρήση της έμμεσης καταστολής όπου ο κυτταρικός πληθυσμός ενδιαφέροντος καταστέλλεται από κυτταροκίνες, ενώ σε άλλους προκαλείται λύση των κυττάρων από τα Treg. Σε όλα τα παραπάνω θα πρέπει να προστεθεί η παράμετρος της ετερογένειας των ρυθμιστικών πληθυσμών. Ο πληθυσμός των ρυθμιστικών κυττάρων χαρακτηρίζεται από μεγάλη ετερογένεια καθώς έχουν βρεθεί και άλλοι πληθυσμοί με διαφορετικούς φαινότυπους οι οποίοι έχουν ρυθμιστικές ιδιότητες χωρίς ακόμα να έχουν αποσαφηνιστεί πλήρως, έτσι δεν είναι ακόμα γνωστό ποιος μηχανισμός επιλέγεται κάθε φορά Αναγνώριση των αντιγόνων από τα Tregs. Κατά την ανάπτυξη των Τ-κυττάρων στον θύμο αδένα, οι TCR υποδοχείς δημιουργούνται στοχαστικά από αναδιάταξη γονιδίων. Για να αποφευχθούν αυτοάνοσες καταστάσεις (όπως θα περιγραφούν παρακάτω), τα Τ-κύτταρα με τους αντίστοιχους TCR υποδοχείς απαλείφονται από το αντογονικό repertoire ή οδηγούνται σε ανεργία, δηλαδή, υπόκεινται σε λειτουργική αδρανοποίηση. Έτσι θα μπορούσαμε να πούμε ότι η ικανότητα των κυττάρων να διαχωρίζουν τα συστατικά του οργανισμού, τα ίδια, από τα ξένα είναι μια κεντρική ιδιότητα των Th κυττάρων. Τα Treg είναι υπεύθυνα για την διατήρηση της αυτό-ανοχής και την αναγνώριση του κάθε αντιγόνου, αναγεννώνται στον θύμο αδένα από προγονικά κύτταρα μέσω της πρόσδεσης πεπτιδίων του οργανισμού στον TCR με μεγάλη χημική συγγένεια και έχουν μεγάλη συχνότητα εμφάνισης των TCR για ειδικά πεπτίδια του οργανισμού (Li et al.,2010;corthay et al.,2009). 33

35 Εικόνα Σχεδιαγραμματική μετατροπή των Tregs, παρουσία του FoxP3 (Li et al.,2010) Πως γνωρίζουν τα Treg ποια Th πρέπει να καταστείλουν. Το βασικό γνώρισμα των Tregs είναι η διάκριση των συστατικών του ίδιου του οργανισμού από αντιγόνα που εισβάλλουν σε αυτόν, και κύρια δράση τους είναι να καταστέλλουν τα δραστικά κύτταρα. Ωστόσο υπέρμετρη αύξηση των Tregs οδηγεί σε ανοσοκαταστολή και ο οργανισμός είναι επιρρεπής σε μικροβιακές μολύνσεις ή καρκίνο. Το επόμενο ερώτημα που τίθεται είναι η ειδικότητα των Tregs έναντι των αντιγόνων και σε αυτό απαντά το μοντέλο που προτάθηκε από τον Leon και τους συνεργάτες του που απέδειξαν ότι η καταστολή που οφείλεται στα Treg είναι ειδική έναντι των αντιγόνων και ο μηχανισμός αυτής βασίζεται στην αλληλεπίδραση των Treg και effectors και των APC κυττάρων. Ένα άλλο μοντέλο που απαντά στο ίδιο ερώτημα προτάθηκε από τους Baecher- Allan και τους συνεργάτες του και βασίζεται στον βαθμό συγγένειας των TCR υποδοχέων. Σύμφωνα με αυτό, τα Τ-κύτταρα τα οποία έρχονται σε επαφή με αυτοαντιγόνα στον θύμο υπόκεινται σε αρνητική επιλογή και απαλείφονται πριν βγουν στην περιφέρεια οπότε τα κυκλοφορούντα T-κύτταρα στην περιφέρεια θα εμφανίζουν χαμηλής συγγένειας TCR υποδοχείς. Ενώ σε περιπτώσεις μικροβιακών μολύνσεων, τα συντηρημένα μόρια που σχετίζονται με τα παθογόνα, προσδένονται στους Toll-like υποδοχείς (TLRs) των κυττάρων του ανοσοποιητικού. Και ένα ακόμα προτεινόμενο μοντέλο που απαντά στο ίδιο ερώτημα είναι των Cohn και των συνεργατών του όπου αφορά στο associative recognition of antigen (ARA). Σύμφωνα 34

36 με αυτό, υπάρχουν Tregs κύτταρα που δεν είναι επιφορτισμένα για την διάκριση των συστατικών αλλά για την ανατροφοδότηση της ανοσολογικής απόκρισης. Όλα τα παραπάνω, αν και προσεγγίζουν διαφορετικά την διαδικασία, το συμπέρασμα είναι το ίδιο, τα Tregs είναι ειδικά έναντι των αντιγόνων (Corthay et al.,2009; Cohn et al., 2008Baecher-Allan et al., 2002;León et al.,2000). 5. Άλλοι CD3 + κυτταρικοί πληθυσμοί Κατά την διαδικασία της ωρίμανσης των Τ-κυττάρων μέσα στον θύμο, δημιουργούνται στην κυτταρική επιφάνεια μόρια και υποδοχείς ειδικά για κάθε κυτταρικό πληθυσμό. Έτσι τα Τ-κύτταρα φέρουν στην επιφάνειά τους πέρα από τον υποδοχέα των Τ-κυττάρων (TCR) και το μόριο CD3, το οποίο αποτελεί ειδικό χαρακτηριστικό των Τ-κυττάρων. Παράλληλα, στον θύμο μέσω της θετικής και αρνητικής επιλογής (όπως περιγράφηκε και πιο πάνω) τα ανώριμα θυμοκύτταρα ωριμάζουν και διαφοροποιούνται είτε σε βοηθητικά Τ-κύτταρα τα οποία φέρουν στην επιφάνειά τους τον υποδοχέα, CD4 είτε σε κυτταροτοξικά Τ-κύτταρα τα οποία φέρουν στην επιφάνειά τους το μόριο, CD8. (Kioussis&Ellmeier,2002) (Reuter et al., 2015) 35

37 5.1. Οι δείκτες CD45RA και CD45RO Κατά την έξοδο των διαφοροποιημένων Τ-κυττάρων από τον θύμο στην περιφέρεια είτε είναι CD4 + είτε είναι CD8 + κύτταρα μπορούν να διακριθούν περαιτέρω ανάλογα με το αν έχουν έρθει σε επαφή με κάποιο αντιγόνο. Κύτταρα τα οποία δεν έχουν έρθει ακόμα σε επαφή με κάποιο αντιγόνο στην περιφέρεια, είναι παρθενικά (naïve) Τ-κύτταρα και φέρουν στην επιφάνειά τους το μόριο CD45RA ενώ μετά την επαφή τους με το αντιγονικό ερέθισμα, τα κύτταρα μεταβάλλονται σε μνημονικά (memory) και το μόριο στην κυτταρική επιφάνεια μεταβάλλεται σε CD45RΟ. Έτσι, αν θέλουμε να κατανοήσουμε τους υποπληθυσμούς των Τ-κυττάρων σε δείγμα μονοπύρηνων κυττάρων περιφερικού αίματος, τότε θα έπρεπε να ελέγξουμε για τα κύτταρα CD3 + CD4 + CD45RA +, CD3 + CD4 + CD45RΟ + αλλά και για τους κυτταρικούς πληθυσμούς CD3 + CD8 + CD45RA + και CD3 + CD8 + CD45RΟ +. (Andersen et al.,2006) 5.2. Οι δείκτες ενεργοποίησης HLA-DR. Τα HLA γονίδια εδράζονται στο χρωμόσωμα 6 και αφορούν στα ανθρώπινα λευκοκυτταρικά αντιγόνα (human leukocyte antigen/hla) που σχετίζονται με το κύριο σύμπλοκο ιστοσυμβατότητας στον άνθρωπο. Κάθε ένα από αυτά επιτελεί ξεχωριστό ρόλο. Ένα από αυτά είναι και το HLA-DR εντοπίζεται στον γενετικό τόπο 6p21.31, ανήκει στα μόρια τάξης ΙΙ και είναι μεμβρανικός υποδοχέας. Το μόριο HLA-DR αποτελεί δείκτη ενεργοποίησης των κυττάρων καθώς παρουσιάζεται αυξημένος σε απόκριση στην μοριακή σηματοδότηση. 36

38 6. Κυτταροκίνες. (Michalak-Stoma et al., 2011) Εικόνα 6.1. Σχεδιαγραμματική απεικόνιση κυτταροκινών και κυτταρικών τύπων Οι κυτταροκίνες είναι πρωτεΐνες μικρού μοριακού βάρους (5-20kDa) που απελευθερώνονται από έναν κυτταρικό τύπο και επηρεάζουν τόσο τον ίδιο όσο και τους παρακείμενους ώστε να αποκριθούν στο ερέθισμα. Είναι είδος κυτταρικής επικοινωνίας και η δράση τους μπορεί να είναι αυτοκρινής (στον ίδιο κυτταρικό πληθυσμό) ή παρακρινής (δράση σε κοντινά κύτταρα) ή ενδοκρινής (δράση σε κύτταρα που βρίσκονται πιο μακριά). Ανάλογα με την δράση τους μπορούν να διακριθούν σε προ- και αντιφλεγμονώδη τύπου ανάλογα με την απόκριση που προκαλούν (Zhang et al., 2007). Όπως φαίνεται και στην παραπάνω εικόνα (εικόνα 6.1) η ανοσολογική απόκριση ξεκινά από την IL-2, η οποία είναι η πρώτη κυτταροκίνη που εκκρίνεται. Στην συνέχεια, ανάλογα με το ερέθισμα το οποίο έχουν δεχτεί τα κύτταρα και το μικροπεριβάλλον στο οποίο βρίσκονται διαφοροποιούνται προς μια κατεύθυνση και εκκρίνουν τις κατάλληλες κυτταροκίνες. Το κυτταροκινικό δίκτυο μπορεί να γίνει πολύ πολύπλοκο αφού η κυτταρική επικοινωνία δεν είναι μονόδρομος όπως φαίνεται στην εικόνα παρακάτω (εικόνα 6.2). 37

39 Εικόνα 6.2. Απεικόνιση κυτταροκινικού δικτύου επικοινωνίας Ας δούμε λίγο καλύτερα τις κυτταροκίνες που θα μας απασχολήσουν στην παρούσα μελέτη Ιντερλευκίνη-2 (IL-2) Είναι η μοναδική κυτταροκίνη που εκκρίνεται από τα παρθενικά Τ λεμφοκύτταρα όταν αυτά ενεργοποιηθούν, παρουσία αντιγόνου, και στην συνέχεια εκκρίνεται και από τα μνημονικά. Παράλληλα με την έκφραση της IL-2, παρατηρείται και έκφραση του μεμβρανικού της υποδοχέα (IL-2 receptor, IL-2R), ο οποίος εκφράζεται από τα CD4 και CD8 Τ-λεμφοκύτταρα, τα Β-λεμφοκύτταρα και τα κύτταρα φυσικούς δολοφόνους (Natural Killer cells-νκ cells). Ο υποκινητής του γονιδίου της IL-2 φέρει πολλές θέσεις πρόσδεσης για διάφορους μεταγραφικούς παράγοντες οι οποίοι δένουν σε cis στοιχεία του υποκινητή (ΑΡ-1, NF-kβ, Oct-1, NFAT καθώς και cyclosporin A-CsA). Η παρουσία της IL-2 επάγει την διαφοροποίηση και τον πολλαπλασιασμό των T λεμφοκυττάρων που την εκφράζουν (αυτοκρινής τρόπος δράσης) καθώς και των κυττάρων που φέρουν τον IL-2R (παρακρινής και ενδοκρινείς τρόπος δράσης) Ιντερλευκίνη-4 (IL-4) Εκκρίνεται κυρίως από τα CD4 Th2 τύπου κύτταρα καθώς και από τα ενεργοποιημένα μαστοκύτταρα και βασεόφιλα. Δρα πορστατευτικά έναντι παρασίτων και αλλεργικών αντιδράσεων λόγω της μεταστροφής της βαρειάς 38

40 αλυσίδας των ανοσοσφαιρινών των IgE που προκαλεί. Επάγει την ενεργοποίηση, τον πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίηση των Β λεμφοκυττάρων, στα οποία αυξάνεται η έκφραση των μορίων HLA τάξης ΙΙ και αναστέλλει την ενεργοποίηση των μακροφάγων. Επιπλέον, ρυθμίζει την ανάπτυξη και τον πολλαπλασιασμό των Th2 κυττάρων από τα παρθένικα CD4 και δρα ως αυτοκρινής αυξητικός παράγοντας για αυτά. Τέλος, αναστέλλει την ενεργοποίηση των μακροφάγων, ανταγωνιζόμενη τη δράση της IFN-γ Ιντερλευκίνη-6 (IL-6) Παράγεται από τα μακροφάγα, τα ενδοθηλιακά κύτταρα, τους ινοβλάστες και άλλα ενεργοποιημένα Τ κύτταρα, υπό την επίδραση της IL-1 και λιγότερο του TNF. Μπορεί να χαρακτηριστεί ως διττής φύσεως κυτταροκίνη, γιατί οι δράσεις της αφορούν φυσική και επίκτητη ανοσία. Κατά τη φυσική ανοσοαπόκριση διεγείρει τη σύνθεση των πρωτεϊνών οξείας φάσης από τα ηπατοκύτταρα και την κινητοποίηση ουδετεροφίλων από τον μυελό των οστών, συμβάλλοντας στις συστηματικές δράσεις της φλεγμονής. Στην επίκτητη ανοσοαπόκριση επάγει τη διαφοροποίηση των Β λεμφοκυττάρων σε πλασματοκύτταρα τα οποία παράγουν κυρίως IgG και IgA, επάγει τη διαφοροποίηση και ενεργοποίηση των Τ και ΝΚ κυττάρων και δρα ως αυξητικός παράγοντας σε υβριδώματα, κακοήθη κύτταρα (σάρκωμα Kaposi) και νεοπλασματικά κύτταρα των μυελωμάτων (αυτοκρινής δράση). Η ανοσοκατασταλτική και αντιφλεγμονώδης δράση της πιθανόν να σχετίζεται με τη ρυθμιστική της επίδραση στη λειτουργία του υποθαλαμοϋποφυσιακού άξονα Ιντερλευκίνη-10 (IL-10) Παράγεται από τα CD4 Τ λεμφοκύτταρα και από ενεργοποιημένα μακροφάγα. Έχει ανασταλτικές δράσεις και εξαιτίας αυτού μπορεί να επαναφέρει το σύστημα σε κατάσταση ηρεμίας μετά από μικροβιακή λοίμωξη. Εμπλέκεται σε καταστάσεις της φυσικής ανοσίας και της διαμεσολαβούμενης από κύτταρα ανοσοαπόκρισης. Δρα ανασταλτικά στα ενεργοποιημένα μακροφάγα (αρνητικό feed-back) και των κυτταροκινών που αυτά παράγουν (TNF, IL-1, IL-12, χημειοκίνες), των δενδριτικών και επικουρικών λειτουργιών των μακροφάγων κατά τη διάρκεια της ενεργοποίησης των Τ λεμφοκυττάρων. Και αναστέλλει την παραγωγή της IL-12 και την έκφραση 39

41 συνδιεγερτικών μορίων και MHC τάξης ΙΙ μορίων από τα μακροφάγα και τα δενδριτικά κύτταρα Ιντερφερόνη-γ (IFN-γ) Παράγεται από τα CD4 Τ-λεμφοκύτταρα που εκκρίνουν την IL-2, τα CD8 Τ- λεμφοκύτταρα και λιγότερο από τα ΝΚ κύτταρα. Τα ΝΚ κύτταρα αποτελούν ανεξάρτητη από Τ λεμφοκύτταρα οδό ενεργοποίησης των μακροφάγων και έτσι, η έκκριση της IFN-γ από τα ενεργοποιημένα ΝΚ κύτταρα αποτελεί το πρωταρχικό γεγονός κινητοποίησης του πλέγματος των κυτταροκινών μετά την έκθεση του οργανισμού σε βακτηριακά προϊόντα. In vivo, η βασική παραγωγή της IFN-γ είναι εξαιρετικά χαμηλή. Γενικά οι δράσεις της IFN-γ είναι αρκετές. Κυριότερος ενεργοποιητής των μακροφάγων, η έκκρισή της επάγεται κυρίως από τις IL-12 και IL-18 (παράγονται από μακροφάγα) κι είναι ιδιαίτερα αποτελεσματική στην αντιμετώπιση ενδοκυτταρίων μικροβίων γιατί παρουσία IFN-γ εξασφαλίζονται οι συνθήκες που απαιτούνται για την επαγωγή της ενεργοποίησης των μακροφάγων από τα Τ λεμφοκύτταρα. Χαρακτηρίζεται ως ενεργοποιητής ενδοθηλιακών κυττάρων αφού αυξάνει την προσκολλητική ικανότητα των CD4 λεμφοκυττάρων στο ενδοθήλιο και επιφέρει μορφολογικές αλλοιώσεις που επιτρέπουν την εξαγγείωση των λεμφοκυττάρων. Επάγει τη σύνθεση παραγόντων της εναλλακτικής οδού του συμπληρώματος. Επιδρά στα APCs, επάγοντας την έκφραση MHC και συνδιεγερτικών μορίων. Προάγει τη διαφοροποίηση των παρθενικών CD4 + Τ-κυττάρων προς Th1, αναστέλλοντας ταυτόχρονα τη διαφοροποίηση σε Th2. Και τέλος, δρα στα Β κύτταρα, επάγοντας τη μεταστροφή ισοτύπων σε υποτάξεις ανοσοσφαιρινών που συνδέουν το συμπλήρωμα και δρουν ως οψωνίνες, διευκολύνοντας τη φαγοκυττάρωση των μικροβίων Παράγοντας Νέκρωσης Όγκου-α (TNF-a) Παράγεται από τα ενεργοποιημένα μακροφάγα από πολυσακχαρίτες βακτηρίων, τα Τ και τα ΝΚ κύτταρα. Ο γενετικός τόπος των ΤNF-α και TNF-β βρίσκεται εντός του MHC και παράγονται ως εκκριτικές πρωτεΐνες, οι μεμβρανικές 40

42 μορφές των οποίων έχουν απομονωθεί και χαρακτηρισθεί να παίζουν σημαντικό ρόλο στις διακυτταρικές κυτταροτοξικές αλληλεπιδράσεις. Σε μικρές συγκεντρώσεις, λειτουργεί ως παρακρινής ή αυτοκρινής ρυθμιστής των WBC και των ενδοθηλιακών κυττάρων και επάγει την φλεγμονή. Αυξάνει την έκφραση μορίων προσκόλλησης στο ενδοθήλιο, ενεργοποιεί τα πολυμορφοπύρηνα προς καταστροφή των μικροβίων και διεγείρει την παραγωγή κυτταροκινών όπως της IL-1, IL-6, χημειοκινών, αλλά και του ίδιου του TNF, από τα μονοπύρηνα. Σε υψηλές συγκεντρώσεις, παρατηρείται αύξηση της διόδου του στο αίμα, με αποτέλεσμα την επαγωγή συστηματικών εκδηλώσεων της φλεγμονής. Πιο ειδικά, δρα στον υποθάλαμο (όπως και η IL-1) και προκαλεί πυρετό που οφείλεται στην αυξημένη σύνθεση προσταγλανδινών από τα κύτταρα του υποθαλάμου. Δρα στα ηπατοκύτταρα (όπως επίσης η IL-1 και IL-6) και αυξάνει τη σύνθεση ορισμένων πρωτεϊνών του ορού. Και τέλος, δρα στον μυελό των οστών και προκαλεί κινητοποίηση ουδετεροφίλων στο σημείο της φλεγμονής. Η παρατεταμένη δράση του οδηγεί σε ατροφία των μυϊκών και λιπωδών κυττάρων. Πολύ μεγάλες ποσότητες του ΤNF-α έχουν ως αποτέλεσμα τοξικά φαινόμενα, όπως μείωση της συσταλτικότητας του μυοκαρδίου κ.α Επομένως η μέτρηση των επιπέδων του ΤΝF-α στον ορό μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως προγνωστικός δείκτης για την έκβαση μιας βαρειάς λοίμωξης από Gram αρνητικά μικρόβια. Γίνεται επομένως φανερό ότι ενώ η τοπική παραγωγή ΤΝF-α από τα μακροφάγα είναι ευεργετική διότι επάγει τη φαγοκυττάρωση και την επακόλουθη επίκτητη ανοσοαπάντηση, η συστηματική μπορεί να αποβεί θανατηφόρα λόγω της σηπτικής καταπληξίας Τροποποιητικός Αυξητικός Παράγοντας-β (Transforming Growth Factor-β, TGF-β) Παράγεται από ενεργοποιημένα μακροφάγα, Τ κύτταρα και πολλούς άλλους κυτταρικούς πληθυσμούς και ιδιαίτερα από τα ρυθμιστικά Τ κύτταρα (Treg), όπου μαζί με την IL-10 προκαλούν ανοσοκαταστολή. Έχει κυρίως ανασταλτικές δράσεις, στον πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίηση των Τ κυττάρων και την ενεργοποίηση των μακροφάγων κατά διάφορους τρόπους, λειτουργώντας ως αρνητικός ρυθμιστής. Ωστόσο, διεγείρει την παραγωγή IgA αντισωμάτων, επάγοντας τη μεταστροφή στον 41

43 ισότυπο αυτό. Άλλες δράσεις του TGF-β είναι η επαγωγή της σύνθεσης πρωτεϊνών της εξωκυττάριας ουσίας (π.χ. κολλαγόνο), ενζύμων που τροποποιούν τη θεμέλια ουσία (π.χ. μεταλλοπρωτεϊνάσες) και κυτταρικών υποδοχέων για πρωτεΐνες της θεμέλιας ουσίας (π.χ. ιντεγκρίνες) και επαγωγή της επαναδόμησης των ιστών ύστερα από επιτυχημένη φλεγμονώδη απόκριση. Εικόνα 6.7. Διαφοροποίηση των CD4 + κυττάρων ανάλογα με το μικροπεριβάλλον τους. 7. Ανοσοτροποποιητικές επιδράσεις της μετάγγισης Υπάρχουν βιβλιογραφικά δεδομένα που να συνηγορούν στο γεγονός ότι οι αλλογενείς μεταγγίσεις αίματος (ΑΒΤ) προκαλούν ανοσοτροποποιητικές επιδράσεις στον οργανισμό των ληπτών και επάγουν την εμφάνιση επιπλοκών, κυρίως μολύνσεων (Jensen et al.,1992;agarwal et al.,1993). Αυξημένος κίνδυνος λοιμώξεων από βακτήρια έχουν αναφερθεί μετά από εγχειρήσεις σε σπλήνα (Duke et al.,1993) καρδιά, ορθοπεδικά χειρουργεία (Triulzi et al.,1992) ή εγχειρήσεις στο ορθό (Jensen et al., 1996). Σύμφωνα με την μελέτη των Jensen και των συνεργατών του το 1996, εγχειρισμένοι ασθενείς στο ορθό οι οποίοι έλαβαν μετάγγιση με ολικό αίμα εμφάνισαν περισσότερες μολύνσεις συγκριτικά με τις ομάδες των ασθενών που είχαν υποβληθεί στο ίδιο χειρουργείο και έλαβαν μετάγγιση με λευκαφαιρεμένο αίμα ή καθόλου μετάγγιση. Επίσης, στην ομάδα των ασθενών που μεταγγίστηκαν με ολικό αίμα, 30 μέρες μετά το χειρουργείο τα επίπεδα του υποδοχέα της IL-2 παρέμεναν αυξημένα ενώ η IL-6 στην ίδια ομάδα ασθενών παρουσιάστηκε αυξημένη τις πρώτες 42

44 μέρες μετά το χειρουργείο, ενώ στα φυσιολογικά επίπεδα 30 μέρες μετά το χειρουργείο. Έτσι, φάνηκαν οι ανοσοτροποποιητικές δράσεις της μετάγγισης και οι κυτταρικοί πληθυσμοί που ενοχοποιήθηκαν για αυτό ήταν τα APCs και T κύτταρα του δότη (Innerhofer et al.,2000) Ιστορία της μετάγγισης: Οι επιδράσεις της αλλογενούς μετάγγισης αίματος αποτέλεσαν αντικείμενο έρευνας από την δεκαετία του 1970 καθώς παρατηρήθηκε ότι οι ασθενείς που υποβάλλοντο σε αυτήν παρουσίαζαν αλλαγές στο ανοσοποιητικό μέχρι και ανοσοκαταστολή (Wood&Sakaguchi.2003;Baumgartner et al.,2009). Tο γεγονός ότι η ανοσοκαταστολή οφείλεται σε Τ κυτταρικό πληθυσμό, ο οποίος ενισχύει την ανοσολογική ανοχή και την διάκριση των συστατικών του οργανισμού από τα αντιγόνα (διάκριση του "ιδίου" από το "ξένο") διατυπώθηκε για πρώτη φορά από τον Gershon το 1969, δηλαδή, σχεδόν από την στιγμή που θεωρήθηκαν τα Τ κύτταρα ξεχωριστός κλάδος των λεμφοκυττάρων χωρίς ωστόσο να υπάρχουν αρκετά ερευνητικά δεδομένα που να ενισχύουν αυτή την άποψη (Gershon & Kondo,1970&1971;Gershon et al.,1972). Έτσι, αυτό επιβεβαιώθηκε για πρώτη φορά με την έρευνα του Opelz και των συνεργάτων του, το 1973, οι οποίοι παρατήρησαν ότι ασθενείς που υπόκειντο σε μεταμόσχευση νεφρών δέχονταν καλύτερα το μόσχευμα αν είχαν πρώτα δεχτεί μετάγγιση αίματος συγκριτικά με αυτούς που δεν είχαν μεταγγιστεί (Opelz et al.,1973). Στο ίδιο συμπέρασμα κατέληξε και η μελέτη παρατήρησης, από την ίδια ερευνητική ομάδα, σε 1360 ασθενείς όπου αποδείχθηκε πολύ ισχυρή συσχέτιση μεταξύ των ληπτών (πτωματικών μοσχευμάτων) νεφρών και καλής πρόγνωσης ως προς την επιβίωση των ασθενών που είχαν προηγουμένως λάβει μετάγγιση αίματος, ακόμα και μετά από τέσσερα χρόνια μετά την μεταμόσχευση (Opelz et al.,1978). Μέσα στην ίδια δεκαετία, το 1975, οι Kilshaw, Brent και Pinto, κατάφεραν να αναγνωρίσουν τον ρόλο των κυττάρων που προκαλούν ανοχή μετά την μεταμόσχευση. Ωστόσο, αυτό που δεν κατάφερναν να αναγνωρίσουν πολλές ερευνητικές ομάδες που προσπάθησαν, ήταν την μορφολογία και τα μοριακά χαρακτηριστικά αυτών των κυττάρων κυρίως λόγω της έλλειψης ειδικών επιφανειακών δεικτών, αν και το φαινόμενο της καταστολής επαναλαμβανόταν in 43

45 vivo, κυρίως σε μοντέλα μεταμόσχευσης. Ο καθορισμός του μηχανισμού της ρύθμισης προς την διαμεσολαβούμενη από Τ-κύτταρα απόκριση, ήταν σημαντική και οδήγησε στην ανακάλυψη των Τ ρυθμιστικών κυττάρων (Treg) τα οποία είναι υπεύθυνα για την ανοσολογική ανοχή που δημιουργείται από την μεταμόσχευση (Wood & Sakaguchi, 2003). Ωστόσο δεν ήταν παρά στα μέσα της δεκαετίας του 1990 που προτάθηκε η ονομασία του πληθυσμού ως Τ ρυθμιστικού πληθυσμού Treg με επιφανειακή έκφραση του δείκτη CD4 (Sakaguchi et al.,2007;corthay et al., 2009). Παράλληλα και μέχρι και το 1982, οι μεταγγίσεις αίματος ήταν ένα πολύ συχνές και σύνηθες στην ιατρική πράξη. Ωστόσο, η αύξηση των κρουσμάτων για αρκετές ασθένειες τις οποίες δεν γνώριζαν ότι μπορούσαν να μεταφερθούν μέσω του αίματος, όπως είναι ο ιός του HIV, η ηπατίτιδα Β και C, νόσο Creutzfeldt-Jakob και άλλες, κατέστησαν τις μεταγγίσεις ένα πιο πολύπλοκο θέμα (Dilsiz et al.,2012, El- Faramawy et al.,2012, Vidja et al.,2011), η επιδημία αυτών των ασθενειών ήταν η απαρχή για την ανάπτυξη μεθόδων ελέγχου του αίματος, όπου η βελτιστοποίησή τους συνεχίζεται μέχρι και σήμερα. Το 1985, για πρώτη φορά εφαρμόστηκε διαγνωστικός έλεγχος για τον ιό HIV και λίγο αργότερα, το 1987, για τον ιό της ηπατίτιδας Β και C. Τα τελευταία χρόνια γίνεται μεγάλη προσπάθεια, για πολύ έγκαιρη ανίχνευσης των ιών που μεταδίδονται από το αίμα ώστε να εξαλειφθεί η πιθανότητα μόλυνσης (Contreras et al.,2011) Επίδραση της μετάγγισης: Σήμερα, η μετάγγιση του αίματος αποτελεί διαδικασία ρουτίνας μιας και είναι το βασικό θεραπευτικό εργαλείο για την οξυγόνωση των ιστών για εγχειρισμένους ή μη ασθενείς. Οι ΑΒΤ αποτελούν μια διαδικασία αλλομεταμόσχευσης χωρίς να απαιτείται η ταυτοποίση των HLA αντιγόνων αφού δεν προκαλεί ανοσοποίηση έναντι αυτών. Ωστόσο, μέσω της μετάγγισης εισέρχεται από τον δότη στον οργανισμό του λήπτη τεράστιος αριθμός αντιγόνων, μεγάλες ποσότητες πλάσματος στις οποίες περιέχονται διαλυτά μόρια που εκκρίνονται από τα λευκά αιμοσφαίρια, όπως είναι οι κυτταροκίνες αλλά και λευκά αιμοσφαίρια (κυρίως APCs) τα οποία οδηγούν σε καταστολή. Το μέγεθος της ανοσοκαταστολής είναι ανάλογο με την λειτουργικότητα των APCs και των Τ κυττάρων του λήπτη αλλά και με την 44

46 ποσότητα των λευκών αιμοσφαιρίων του δότη, την βιωσιμότητά τους και την ανοσοποίηση που προκαλούν (Baumgartner et al., 2009;Innerhofer et al.,1999&2000). Στις κλινικές συνέπειες της ανοσοκαταστολής οφειλόμενης στις μεταγγίσεις συγκαταλέγεται ο αυξημένος κίνδυνος μολύνσεων των ασθενών, και αυτό είναι ιδιαίτερα σημαντικό σε ασθενείς όπως με νεοπλασίες (οι μεταγγίσεις σχετίζονται με επανεμφάνιση καρκίνου) πολυμεταγγιζόμενοι ασθενείς ή άλλοι. Έτσι, η πρώτη παράμετρος που μελετήθηκε ήταν η φύση του αίματος που μεταγγίζονταν, αν δηλαδή ήταν ολικό ή λευκαφαιρεμένο και αυτό που παρατηρήθηκε ήταν ότι οι ασθενείς που μεταγγίζονταν με λευκαφαιρεμένο αίμα παρουσίασαν μειωμένη καταστολή συγκριτικά με αυτούς που μεταγγίζονταν με ολικό. Οπότε συμπεραίνεται ότι η καταστολή που προκαλείται οφείλεται στα λευκά αιμοσφαίρια ή τις κυτταροκίνες του δότη. Ως προς τις κυτταροκίνες, σύμφωνα με την βιβλιογραφία, οι ΑΒΤ προκαλούν μείωση της έκκρισης της IL-2 και αύξηση των κυτταροκινών IL-4 και IL-10. Αυτό δηλώνει ότι ο συνδυασμός χειρουργικού τραύματος και αλλογενής μετάγγισης προάγει την Th2 απόκριση και τον σχηματισμό αντισωμάτων αλλά σταδιακά καταστέλλεται και επάγεται η Th1 απόκριση η οποία μεσολαβείται μέσω υποδοχέων των Τ-κυττάρων (Baumgartner et al.,2009;innerhofer et al.,1999&2000). Σήμερα γνωρίζουμε ότι τα CD4 Τ-κύτταρα διακρίνονται σε ρυθμιστικά κύτταρα (Treg) και δραστικά Τ-κύτταρα (Teff). Τα Teff κύτταρα επάγουν την ανοσολογική απόκριση ενώ τα Treg την καταστέλλουν. Ο φαινότυπος των Treg (όπως αναφέρθηκε παραπάνω) είναι CD4 + CD25 + και εκφράζουν τον μεταγραφικό παράγοντα Foxp3, και η βασική τους λειτουργία είναι η αποτροπή των αυτοάνοσων νοσημάτων και η διατήρηση της ανοσολογικής ανοχής (Sojka et al.,2008; Piccirillo et al.,2004;ng et al.,2001;sakaguchi et al., 1995). Έτσι, μπορούμε να αξιολογήσουμε την ανοσοκαταστολή ανάλογα με την περίσταση, τον ασθενή και την νόσο και πολλές φορές εκμεταλλευόμαστε αυτό το γνώρισμα των κυττάρων προς όφελος του οργανισμού. Τέτοιες περιπτώσεις είναι οι μεταμοσχεύσεις (οργάνου ή μυελού των οστών) ή αυτοάνοσα νοσήματα όπου επάγεται ο πληθυσμός των Tregs με την χρήση ανοσοκατασταλτικών φαρμάκων και μονοκλονικών αντισωμάτων έναντι του υποδοχέα της IL-2 και πιο συγκεκριμένα του μορίου CD25 με σκοπό την αποτροπή της οξείας απόρριψης του μοσχεύματος. Σε μεταμοσχεύσεις μυελού των οστών, τα Τregs κύτταρα του δότη φάνηκε να είχαν προστατευτική δράση έναντι της οξείας 45

47 απόρριψης του μοσχεύματος (GVHD) (Rech,&Vonderheide,2009; Bestard et al.,2005; Wood&Sakaguchi,2003;Kuypers et al.,2003;hoffmann et al.,2002;vincenti et al.,1998). Άλλη μια παράμετρος που αφορά στην μετάγγιση αίματος και έχει αποτελέσει έναυσμα για έρευνα τα τελευταία χρόνια είναι η αποθήκευση των ασκών και αν προκαλεί αλλαγές στα συστατικά του αίματος. Το αίμα μπορεί να αποθηκευτεί μέχρι και 42 μέρες από την μέρα της αιμοληψίας ωστόσο αλλαγές παρατηρούνται σε μόρια που μπορούν να δράσουν ως ανοσολογικοί τροποποιητές όταν συσσωρεύονται (Baumgartner et al., 2009) Ανοσοτροποποιητικές επιδράσεις αποθηκευμένου αίματος Κάθε χρόνο στις ΗΠΑ περίπου 5 εκατομμύρια ασθενείς δέχονται μετάγγιση. Είναι πολύ σύνηθες στην καθημερινή πράξη παρά το γεγονός ότι έχει ανοσοτροποιητικές επιδράσεις. Αυτές οι επιδράσεις επάγονται αν ο ασκός που χορηγείται είναι αποθηκευμένος για πολλές μέρες. Το μέγιστο χρονικό διάστημα που μπορεί να παραμείνουν οι ασκοί σε φύλαξη είναι 42 μέρες, ωστόσο η παραμονή του ασκού στους 4 0 C προκαλεί αλλοιώσεις, τόσο σε βιοχημικό όσο και μορφολογικό επίπεδο. Για την περαιτέρω μελέτη αυτών των αλλοιώσεων, έχουν πραγματοποιηθεί τυχαιοποιημένες κλινικές μελέτες (RCT) στις οποίες έχει δειχθεί ότι μετάγγιση με αποθηκευμένο αίμα επάγει φλεγμονώδες μικροπεριβάλλον λόγω της μεταφοράς από τον δότη λευκών αιμοσφαιρίων, ιόντων σιδήρου, υψηλών συγκεντρώσεων λιπιδίων και κομματιών των μεμβρανών των ερυθρών κυττάρων και σχετίζεται με άμεση απόρριψη του μοσχεύματος, αύξηση μικροβιακών λοιμώξεων, αλλοανοσοποίηση από τα λευκά αιμοσφαίρια του δότη και μη αιμολυτική εμπύρετη αντίδραση στην μετάγγιση. Τα λευκά αιμοσφαίρια κατά την αποθήκευση ενεργοποιούνται και απελευθερώνουν κυτταροκίνες και λιπίδια στο πλάσμα του αίματος και ενεργοποιούν τα ουδετερόφιλα για την ανάπτυξη κυτταροτοξικότητας (TRALI). Ωστόσο, η λευκαφαίρεση με χρήση φίλτρων ή ακτινοβολίας μειώνει αλλά δεν εξαλείφει τις ανοσολογικές συνέπειες της μετάγγισης (Yazdanbakhsh et al, 2011). 46

48 8. Σκοπός της εργασίας Ο σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η μελέτης της τροποποίησης του ανοσοποιητικού συστήματος και πιο ειδικά των CD4 + Τ-κυττάρων και η κατανόηση των μηχανισμών δράσης τους, παρουσία υψηλού αριθμού ξένων αντιγόνων. Τα πολυάριθμα αντιγόνα παρέχονταν στον οργανισμό μέσω της διαδικασίας της μετάγγισης, σε ασθενείς που υποβάλλονταν σε προγραμματισμένο χειρουργείο αρθροπλαστικής χωρίς άλλες υποβόσκουσες νόσους ώστε να προσδιοριστεί η δράση αυτών και των παραγόντων που εκκρίνονται από αυτά στην πλαστικότητα των CD4 + κυττάρων. Η πλαστικότητα, δηλαδή η διαφοροποίηση των κυττάρων προσδιορίστηκε μέσω φαινοτυπίσεων κυτταρικών πληθυσμών καθώς και μέσω του προσδιορισμού των συγκεντρώσεων κυτταροκινών και άλλων διαλυτών μορίων. Την ομάδα μελέτης αποτέλεσαν ασθενείς που υποβλήθηκαν στο παραπάνω χειρουργείο και μεταγγίστηκαν κατά την διάρκειά του, ενώ στην ομάδα ελέγχου συμπεριλήφθησαν ασθενείς οι οποίοι υποβλήθησαν στο ίδιο χειρουργείο χωρίς να μεταγγιστούν σε κανένα σημείο της μελέτης. Το υλικό που χρησιμοποιήθηκαν ήταν ηπαρινισμένα δείγματα ολικού αίματος και οι χρονικές στιγμές της μελέτης ήταν πριν το χειρουργείο αλλά και αμέσως μετά το χειρουργείο (κάθε μέρα) μέχρι την πρώτη εβδομάδα, στον πρώτο μήνα και στην τελευταία επίσκεψη των ασθενών. Φαινοτυπικά προσδιορίστηκαν οι πληθυσμοί των ρυθμιστικών κυττάρων καθώς και άλλοι, ενώ σε κυτταροκινικό επίπεδο προσδιορίστηκαν οι IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL- 10, TNF-α, IFN-γ, TGF-β1 και TGF-β2 και οι υποδοχείς TNF-RI(p55/p60),TNF- RII(p75/p80). 47

49 Ασθενείς, υλικά και μέθοδοι 48

50 9. Ασθενείς: Στην παρούσα μελέτη χρησιμοποιήθηκε ολικό αίμα από ασθενείς που υποβλήθηκαν σε προγραμματισμένη αρθροπλαστική γόνατος ή ισχίου από την Ορθοπεδική Κλινική του Περιφερειακού Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Πατρών. Η μελέτη έλαβε έγκριση από την επιτροπή βιοηθικής του νοσοκομείου και οι ασθενείς είχαν πλήρη ενημέρωση και συναίνεσαν γραπτώς. Τα κριτήρια εισαγωγής των ασθενών στην μελέτη ήταν το προγραμματισμένο χειρουργείο με ελεύθερο ιατρικό ιστορικό ενώ στα κριτήρια αποκλεισμού των ασθενών συγκαταλέγονται σοβαρές παθήσεις και άλλες ανοσοτροποποιητικές νόσοι. Στην μελέτη συμμετείχαν 89 ασθενείς (73 γυναίκες και 16 άντρες) οι οποίοι διακρίθηκαν ανάλογα με το αν έλαβαν μετάγγιση αίματος κατά την διάρκεια του χειρουργείου. Τα δείγματα συλλέχθησαν πριν το χειρουργείο (before surgery/bs) και μετά το χειρουργείο καθημερινά μέχρι το εξιτήριο από το νοσοκομείο (after surgery/as). Ως μέρα 0 (day0) ορίζεται η μέρα του χειρουργείου και η λήψη του δείγματος έγινε αμέσως μετά το χειρουργείο, και τα υπόλοιπα δείγματα συλλέχθησαν καθημερινά (on days 0-7) μέχρι την πρώτη εβδομάδα. Καθώς επίσης δείγματα είχαμε και 1 μήνα μετά το χειρουργείο (1month) ενώ το τελευταίο ήταν στην τελευταία επίσκεψη όποτε αυτή πραγματοποιήθηκε μετά από τουλάχιστον τρεις μήνες (followup visit / >3months). Έτσι, προέκυψαν δύο ομάδες ασθενών, η ομάδα ελέγχου στην οποία οι ασθενείς δεν μεταγγίστηκαν σε καμία χρονική στιγμή της μελέτης (group 2) και η ομάδα ενδιαφέροντος (group 1) όπου οι ασθενείς μεταγγίστηκαν κατά την διάρκεια του χειρουργείου. Ο αριθμός των ασκών που έλαβαν κατά την μετάγγιση αποτέλεσε άλλο ένα κριτήριο αποκλεισμού ασθενών από την μελέτη καθώς ασθενείς οι οποίοι έλαβαν πάνω από τρεις ασκούς αποκλείστηκαν από την ανάλυση. Επίσης, ασθενείς οι οποίοι μεταγγίστηκαν πολλές μέρες μετά το χειρουργείο δεν συμπεριλήφθησαν στην μελέτη. Στον παρακάτω πίνακα (πίνακας 9.1.) παρουσιάζονται τα δημογραφικά χαρακτηριστικά των ασθενών ανά ομάδα και ο τύπος της εγχείρησης που υποβλήθηκαν οι ασθενείς. 49

51 Αριθμός ασθενών: 89 Εύρος (έτη) Διάμεσος (έτη) Μ.Ο. (έτη) Ολική αρθ/ική ισχίου Αναθεώρ. ισχίου Ολική αρθ/ική γόνατος Αναθεώρ. γόνατος Άνδρες 8 (14,82%) ,5 64,5 6 (11,11%) 2 (3,7%) 0 0 Group 1 Γυναίκες 46 (85,18%) ,28 Σύνολο ,3 26 (48,15%) 32 (59,26%) 5 (9,26%) 7 (12,96%) 14 (25,92%) 14 (25,92%) 1 (1,85%) 1 (1,85%) Άνδρες 8 (22,86%) ,17 4 (11,43%) 0 4 (11,43%) 0 Group 2 Γυναίκες 27 (77,14%) ,5 Σύνολο ,17 13 (37,14%) 17 (48,75%) 1 (2,86%) 1 (2,86%) 13 (37,14%) 17 (48,75%) 0 0 Πίνακας 9.1: Δημογραφικά στοιχεία και τύπος χειρουργείου των ασθενών 9.1. Κλινική αξιολόγηση και προετοιμασία των ασθενών. Μετά την απόφαση του θεράποντος ιατρού για την αναγκαιότητα της χειρουργικής επέμβασης και τον προγραμματισμό του χειρουργείου, οι ασθενείς εισήχθησαν στην κλινική από την προηγούμενη μέρα όπου τους παρεσχέθη προεγχειρητική αξιολόγηση. Στα πλαίσια της προεγχειρητικής αξιολόγησης κάθε ασθενούς αναισθησιολογική, πνευμονολογική, καρδιολογική και οδοντιατρική εκτίμηση πραγματοποιήθηκε. Επίσης, πραγματοποιήθηκαν εργαστηριακές αναλύσεις αίματος (γενική αίματος, βιοχημικές αναλύσεις και έλεγχος πηκτικότητας) και καλλιέργεια ούρων. Ασθενείς οι οποίοι είχαν επιβαρυμένο ιστορικό όπως συνοδά νοσήματα, ηλικία και γενική κατάσταση υγείας υποβλήθησαν σε ειδικές εξετάσεις και φυσική εξέταση. Η ανίχνευση συμπτωμάτων ή σημείων λοίμωξης κατά την προεγχειρητική αξιολόγηση είχε ως αποτέλεσμα την αναβολή της επέμβασης μέχρι την πλήρη αποκατάστασή τους. Τα συνυπάρχοντα προβλήματα υγείας των ασθενών ομαδοποιήθηκαν σε γενικές κατηγορίες και ασθενείς με υψηλό κίνδυνο λοίμωξης αποκλείστηκαν από τη μελέτη. Συνυπάρχοντα προβλήματα υγείας μπορεί να 50

52 αφορούν σε διάφορα συστήματα του ανθρώπινου σώματος όπως το καρδιαγγειακό, το γαστρεντερικό, το αναπνευστικό, το μυοσκελετικό σύστημα ή σε άλλες διαταραχές όπως αιματολογικές, ενδοκρινικές, ψυχιατρικές, νευρολογικές παθήσεις, ηπατικές, γυναικολογικές διαταραχές και δυσλιπιδαιμίες. Κριτήρια αποκλεισμού των ασθενών από την μελέτη μπορούσαν να αποτελέσουν αυτοάνοσες διαταραχές, ασθενείς που υποβάλλονταν σε θεραπεία με κορτιζόνη, κακή θρέψη ή άλλη υποκείμενη ανοσοτροποποιητική νόσο. Διεγχειρητικά, ίσχαιμος περίδεση εφαρμόστηκε σε όλες τις περιπτώσεις ολικής αρθροπλαστικής γόνατος και αναθεώρησης ολικής αρθροπλαστικής γόνατος. Επίσης, σε όλους τους ασθενείς τοποθετήθηκε συσκευή παροχέτευσης αίματος κατά τη σύγκλειση του τραύματος ολικών αρθροπλαστικών ισχίου και γόνατος και αναθεωρήσεων και χορηγήθηκε αντιβιοτική προφυλακτική αγωγή 750mg κεφουροξίμη ενδοφλεβίως (μια δόση προεγχειρητικά και 3 δόσεις μετεγχειρητικά), εκτός περιπτώσεων αλλεργιών όπου επιλέχθηκε άλλης κατηγορίας αντιβιοτική αγωγή. Την 2 η μετεγχειρητική ημέρα αφαιρέθηκαν από τους ασθενείς οι συσκευές παροχέτευσης αίματος και χορηγήθηκε αντιθρομβωτική προφυλακτική αγωγή (από του στόματος αντιπηκτικά ή χαμηλού μοριακού βάρους ηπαρίνη) κατά τη διάρκεια της νοσηλείας τους και για ένα μήνα μετεγχειρητικά. Καθημερινά μετρούνταν οι τιμές της θερμοκρασίας και του αιματοκρίτη (HCT) των ασθενών κατά τη διάρκεια νοσηλείας, ωστόσο, δεν είχε οριστεί όριο τιμής αιματοκρίτη κάτω από το οποίο η μετάγγιση θεωρείτο επιβεβλημένη αλλά ούτε τιμή πάνω από την οποία η μετάγγιση δεν ήταν απαραίτητη. Η απόφαση για μετάγγιση κατά τη διάρκεια της παραμονής των ασθενών στο νοσοκομείο βασίστηκε σε μια συνολική αξιολόγηση, η οποία περιελάμβανε τα συμπτώματα του ασθενούς, την εκτιμώμενη απώλεια αίματος διεγχειρητικά, την τιμή του αιματοκρίτη, τα ζωτικά σημεία και το ισοζύγιο προσλαμβανόμενων αποβαλλόμενων υγρών. 51

53 9.2. Επεξεργασία δειγμάτων: Από το πλάσμα κάθε δείγματος ακολούθησε προσδιορισμός των κυτταροκινών IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, TNF-α και IFN-γ με την μέθοδο Cytometric Bead Array (CBA) και των διαλυτών μορίων TNF-RI(p55/p60),TNF- RII(p75/p80) και κυτταροκινών TGF-β1 και TGF-β2 με την μέθοδο της ELISA. Παράλληλα, προσδιορίστηκαν με την μέθοδο της κυτταρομετρίας ροής ο πληθυσμός των επαγώγιμων ρυθμιστικών κυττάρων/itreg (CD4 + CD25 + CD127 -/low ), των φυσικών ρυθμιστικών/ntreg κυττάρων (CD4 + CD25 high / + FoxP3 + ) για όλες τις χρονικές στιγμές καθώς και άλλων CD3 + πληθυσμών, πριν και μετά το χειρουργείο Πλήρες καλλιεργητικό υλικό: Το πλήρες καλλιεργητικό υλικό (culture medium/cm) αποτελείται από RPMI medium 1640 (1x) (Gibco, Life Technologies, Carlsbad, California, USA) στο οποίο προστίθενται 10% Fetal Bovine Serum (FBS) (Heat inactivated FBS, Gibco, Life Technologies, Carlsbad, California, USA), 10 IU/ml πενικιλίνη και στρεπτομυκίνη και 50mM 2-μερκαπταιθανόλη (Gibco, Life Technologies, Carlsbad, California, USA) Απομόνωση μονοπύρηνων κυττάρων περιφερικού αίματος (PBMC s) με βαθμίδωση φικόλης: Η απομόνωση των PBMC s πραγματοποιήθηκε με την χρήση του ουδέτερου, υδρόφιλου πολυσακχαρίτη Φικόλη ύστερα από την δημιουργία βαθμίδωσης με το αίμα (Biocoll separating solution Biochrom AG, Berlin, Germany) υπό την επίδραση φυγοκέντρου δύναμης. Διαδικασία: Σε Falcon προστίθεται φικόλη στο 1/3 του συνολικού όγκου του δείγματος. Το δείγμα επιστοιβάζεται προσεκτικά ώστε να αποφεύγεται η ανάμιξη της τοξικής για τα κύτταρα φικόλης με το αίμα. Φυγοκέντρηση στις 2500rpm, 30 min, σε θερμοκρασία δωματίου (RT), χωρίς φρένο, ώστε να δημιουργηθεί βαθμίδωση. 52

54 Από τον διαχωρισμό προκύπτουν τέσσερις στιβάδες. Από πάνω προς τα κάτω μπορούμε να διαχωρίσουμε τα εξής: το πλάσμα του δείγματος, τα PBMC s, τη φικόλη και στην υποκείμενη στιβάδα ερυθροκύτταρα και κοκκιοκύτταρα. Προσεκτική λήψη των κυττάρων της ενδιάμεσης στιβάδας PBMC s Προσθήκη ισοτονικού ρυθμιστικού διαλύματος (σκέτο RPMI ή PBS(1x)) και φυγοκέντρηση (1800rpm, 10min, RT - 2 φορές) Υπολογισμός απόλυτου αριθμού κυττάρων με την χρήση αιμοκυτταρομέτρου (πλάκα Neubauer) Επαναδιάλυση των κυττάρων στον επιθυμητό όγκο, σε ισοτονικό διάλυμα (PBS(1x)) ή σκέτο RPMI ή πλήρες θρεπτικό μέσο με τελική συγκέντρωση των κυττάρων να είναι 10 6 κύτταρα/ml. Εικόνα 9.4. Απομόνωση PBMC s με βαθμίδωση φικόλης 10. Ανάλυση με κυτταρομετρία ροής: Γενικά: Αρχή της μεθόδου: Η κυτταρομετρία ροής είναι μέθοδος μέτρησης φυσικών και χημικών (ή φθοριζουσών) ιδιοτήτων των κυττάρων που βρίσκονται σε εναιώρημα συνεχόμενης ροής. Στα πλεονεκτήματά της μεθόδου ανήκουν η ταχύτητα και η ευαισθησία, η ποικιλία υλικών στα οποία εφαρμόζεται, η δυνατότητα ταυτόχρονης ανάλυσης πολλών παραμέτρων και ποσοτικοποίησης πολλών αντιγόνων, η ταυτοποίηση σπάνιων πληθυσμών και η ανίχνευση ασθενών αντιγόνων. Η λειτουργία των κυτταρομετρητών βασίζεται στην υδροδυναμική εστίαση του εναιωρήματος των προς μέτρηση κυττάρων. Όταν το εναιώρημα κυττάρων αναρροφάται από το λεπτό ρύγχος, σχηματίζει ένα ρεύμα πυρήνα (coaxial flow) μέσα 53

55 στο υγρό που το περιβάλλει (sheath fluid). Όμως, το υγρό που περιβάλλει τα κύτταρα κινείται με διαφορετική ταχύτητα από το ρεύμα του πυρήνα σχηματίζοντας το ρεύμα περιβλήματος (sheath flow). Λόγω της διαφοράς της ταχύτητας των δυο υγρών, αναπτύσσεται διαφορά πιέσεων και σταδιακή σμίκρυνση της διαμέτρου του ρεύματος του πυρήνα, μέχρι η ροή να γίνει νηματοειδής και τα κύτταρα να ρέουν ένα- ένα. Η ακτινοβολία που προσπίπτει στα κύτταρα, παράγεται από πηγές Laser και πρέπει να είναι μονοχρωματική (ενός μήκους κύματος). Η μονοχρωματική ακτινοβολία της Laser προσπίπτει κάθετα προς την ροή των υπό μέτρηση κυττάρων, στο σημείο που η ροή του ρεύματος του πυρήνα έχει γίνει νηματοειδής και όπου τα κύτταρα ρέουν μοναδιαία σε απόσταση που να διαχωρίζονται απόλυτα μεταξύ τους. Το σημείο αυτό καλείται θάλαμος μέτρησης. Ένα μέρος της ακτινοβολίας που προσπίπτει στο κύτταρο απορροφάται από αυτό ενώ η υπόλοιπη διαχέεται (σκεδάζεται) προς όλες τις κατευθύνσεις. Η σκεδαζόμενη ακτινοβολία διακρίνεται σε ακτινοβολία που σκεδάζεται σε 10 0 και καλείται κατευθείαν σκεδαζόμενο φως (forward light scatter) και σε 90 0 που καλείται ορθογώνια ή πλάγια ή υπό ευρεία γωνία σκεδαζόμενο φως (side light scatter). Το κατευθείαν σκεδαζόμενο φως είναι ανάλογο του όγκου του κυττάρου ενώ το ορθογώνια σκεδαζόμενο φως είναι ανάλογο με την κοκκίωση και πολυπλοκότητα του κυττάρου. Η σκέδαση του φωτός επιτρέπει τον διαχωρισμό των κυτταρικών πληθυσμών βάσει του μεγέθους και της κοκκίωσής τους. 54

56 Εικόνα Σχηματική απεικόνιση της απομόνωσης των πληθυσμών με τον κυτταρομετρητή ροής (αριστερά) και σχηματική απεικόνιση οπτικής διάταξης ενός κυτταρομετρητή ροής (δεξιά). (Ελληνικό Ινστιτούτο Παστέρ, μονάδα κυτταρομετρίας ροής ( Φθοροχρώματα: Φθορισμός ορίζεται η ιδιότητα ορισμένων χημικών ενώσεων να εκπέμπουν δευτερογενή ακτινοβολία όταν διεγείρονται με πρωτογενή ακτινοβολία. Η πρωτογενής (διεγείρουσα) και δευτερογενής (εκπέμπουσα) ακτινοβολία είναι χαρακτηριστικές για την δεδομένη φθορίζουσα ουσία ή φθορόχρωμα. Όταν στα κύτταρα υπάρχουν φθορίζοντα συστατικά ή φθορίζουσες ουσίες η μονοχρωματική ακτινοβολία που προσπίπτει σε αυτά διεγείρει την εκπομπή δευτερογενούς ακτινοβολίας η οποία ανιχνεύεται με κατάλληλα φίλτρα και ενισχύεται με την χρήση φωτοπολλαπλασιαστών που συνήθως διατάσσονται στον άξονα του ορθογώνια σκεδαζόμενου φωτός. Τα ιδανικά φθοροχρώματα για χρήση στην κυτταρομετρία ροής πρέπει αν είναι βιολογικά αδρανή, να έχουν υψηλή κυτταρική δέσμευση φθορισμού, να έχουν περιορισμένο μήκος κύματος δευτερογενούς ακτινοβολίας, να μπορούν να συνδεθούν με μονοκλωνικά αντισώματα. Το πρόβλημα που προκύπτει στην κυτταρομετρία τριών και άνω φθορισμών είναι η αλληλοεπικάλυψη των φασμάτων εκπομπής δευτερογενούς ακτινοβολίας των φθοροχρωμάτων. Τα φθοροχρώματα που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα μελέτη είναι τα FITC = φλουορεσκεϊνη (fluorescein), PE = φυκοερυθρίνη (Phycoerythrin) και PE- Cy5 = R- φυκοερυθρίνη (R-phycoerythrin) και κυανίνη (cyanine). Λίγα λόγια: 55

57 Η ουσία φλουορεσκεϊνη (fluorescein) είναι μια οργανική ουσία με μέγιστο απορρόφησης στα 494 nm και μέγιστο εκπομπής στα 521 nm. Ο κύριος μεταβολίτης της ουσίας είναι το συνθετικό ολιγονουκλεοτίδιο fluorescein isothiocyanate ή FITC. H φυκοερυθρίνη - Phycoerythrin (PE) είναι πρωτεϊνη με μεγάλο μοριακό βάρος (περίπου 240 kd) παρουσιάζει μέγιστο απορρόφησης στα 496 nm και μέγιστο εκπομπής στα 578 nm. Το φθορόχρωμα PE-Cy5 ανήκει στην κατηγορία των tandem dyes γιατί αποτελεί συνδυασμό δυο πρωτεϊνών όπου η μια είναι ο δότης των ηλεκτρονίων και εκπέμπει στο μέγιστο απορρόφησης της δεύτερης ουσίας ενώ η δεύτερη είναι ο δέκτης και έτσι επιτυγχάνεται η εκπομπή της ακτινοβολίας στο επιθυμητό μήκος κύματος. Στην συγκεκριμένη περίπτωση αυτές οι δυο πρωτεΐνες είναι η κυανίνη (cyanine) όπου συμπεριφέρεται ως δότης) και η R- φυκοερυθρίνη (R-phycoerythrin) όπου συμπεριφέρεται ως δέκτης. Παρουσιάζει μέγιστο απορρόφησης στα 488 nm και μέγιστο εκπομπής στα 667 nm Ενδοκυττάρια και εξωκυττάρια χρώση των PBMC s: Στα απομονωμένα PBMC s ασθενών και μετά τον προσδιορισμό του απόλυτου αριθμού τους, ακολουθεί χρώση και επώαση με τα αντισώματα ενδιαφέροντος τα οποία είναι προηγουμένως συζευγμένα με τα κατάλληλα φθοροχρώματα για την ανίχνευση των κυτταρικών πληθυσμών ενδιαφέροντος. Η ανάλυση των δειγμάτων πραγματοποιήθηκε στον κυτταρομετρητή Coulter EPICS-XL-MCL Flow cytometer (Beckman Coulter, Miami, Florida) και περαιτέρω ανάλυση πραγματοποιήθηκε με το πρόγραμμα FlowJo V7.5 software (Tree Star Inc., Ashland, OR, USA). Τα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν είναι τα CD3-PE-Cy5 (Beckman Coulter [BC], Paris, France), CD4-FITC (Beckman Coulter [BC], Paris, France), CD8-FITC (Beckman Coulter [BC], Paris, France), CD25-PE-Cy5 (BC), CD25- PE (Becton Dickinson, [BD Pharmigen], San Diego, CA, USA), CD127-PE (BC), CD45RO-PE (Becton Dickinson, [BD Pharmigen], San Diego, CA, USA), CD45RA-PE (Becton Dickinson, [BD Pharmigen], San Diego, CA, USA), HLA-DR-PE (Beckman Coulter [BC], Paris, France), FoxP3-PE-Cy5 (ebioscience, San Diego, CA, USA) και όλες οι διαδικασίες που ακολουθήθηκαν ήταν οι ενδεδειγμένες για την ενδο- και εξωκυττάρια χρώση, σύμφωνα με τις οδηγίες. Καθώς και ισοτυπικά δείγματα και negative controls χρησιμοποιήθηκαν για ορθότητα των αποτελεσμάτων. Κατά την ανάλυση των δειγμάτων 20,000 κύτταρα /δείγμα χρειάστηκαν για την ανίχνευση των 56

58 επιφανειακών δεικτών, ενώ 100,000 κύτταρα χρειάστηκαν για δείγματα στα οποία είχε προηγηθεί ενδοκυττάρια χρώση Χρώση επιφανειακών δεικτών: Α) Για τον προσδιορισμό των itregs με φαινότυπο CD4 + CD25 + CD127 -/low χρησιμοποιήθηκαν απομονωμένα PBMC s ασθενών όπως περιγράφηκε παραπάνω. Ακολούθως, πραγματοποιήθηκε χρώση των επιφανειακών δεικτών (10 6 κύτταρα/δείγμα) σύμφωνα με το παρακάτω πρωτόκολλο. Διαδικασία: 10 6 κύτταρα/δείγμα και φυγοκέντρηση 2500rpm, 10min, RT Προσθήκη κατάλληλων ποσοτήτων και αντισωμάτων. Επώαση 20min, RT, στο σκοτάδι. Προσθήκη PBS(1x) και φυγοκέντρηση 2500rpm, 10min, RT Απόρριψη υπερκειμένου, προσθήκη PBS (1x) και ανάλυση στον κυτταρομετρητή Β) Για τον προσδιορισμό των CD3 + CD4 + CD45RO +, CD3 + CD8 + CD45RO +, CD3 + CD4 + CD45RΑ +, CD3 + CD8 + CD45RΑ +, CD3 + CD4 + HLA-DR + και CD3 + CD8 + HLA-DR +, χρησιμοποιήθηκε ποσότητα ολικού αίματος και πραγματοποιήθηκε χρώση των επιφανειακών δεικτών (100μL αίματος/δείγμα) σύμφωνα με το παρακάτω πρωτόκολλο. Διαδικασία: Σε ποσότητα αίματος προστίθενται κατάλληλες ποσότητες αντισωμάτων. Επώαση 20min, RT, στο σκοτάδι. Προσθήκη PBS(1x) και φυγοκέντρηση 2500rpm, 10min, RT Προετοιμασία διαλύματος λύσης των κυττάρων (1x) Απόρριψη υπερκειμένου και προσθήκη διαλύματος λύσης. Επώαση 10min, RT Προσθήκη PBS(1x) και φυγοκέντρηση 1800rpm, 10min, RT Προσθήκη PBS(1x) και ανάλυση στον κυτταρομετρητή 57

59 Ενδοκυττάρια χρώση για ανίχνευση μεταγραφικού παράγοντα FoxP3: Για τον προσδιορισμό των ntregs με φαινότυπο CD4 + CD25 high/+ FoxP3 + ακολουθήθηκε το πρωτόκολλο για την ενδοκυττάρια χρώση του μεταγραφικού παράγοντα, καθώς εντοπίζεται μέσα στον πυρήνα. Η διαδικασία ακολουθείται όπως φαίνεται παρακάτω για 10 6 κύτταρα /δείγμα. Διαδικασία: 10 6 κύτταρα/δείγμα και φυγοκέντρηση 2500rpm, 10min, RT Προσθήκη κατάλληλων ποσοτήτων CD4-FITC και CD25-PE αντισωμάτων. Επώαση 20min, RT, στο σκοτάδι. Προσθήκη PBS(1x) και φυγοκέντρηση 2500rpm, 7min, RT Προετοιμασία διαλύματος fix/perm (1 μέρος concentrate και 3 μέρη diluent) Απομάκρυνση υπερκειμένου και προσθήκη διαλύματος fix/perm (Vortex για 5 ) Επώαση 30min, 4 0 C, στο σκοτάδι. Προετοιμασία διαλύματος permeabilization (1x) και το προσθήκη στο δείγμα. Φυγοκέντρηση 2500rpm, 10min, RT Μεταφορά σε Eppendorf και φυγοκέντρηση 2500rpm, 10min, RT. Προσεκτική απομάκρυνση του υπερκειμένου και επαναδιάλυση σε μικρή ποσότητα διαλύματος permeabilization (1x). Προσθήκη FoxP3 αντισώματος και επώαση 30min, 4 0 C, στο σκοτάδι. Επαναδιάλυση σε διάλυμα permeabilization (1x) και μεταφορά σωληνάκια RIA Φυγοκέντρηση 2500rpm, 7min, RT (x2) και ανάλυση στον κυτταρομετρητή. 58

60 11. Μέτρηση κυτταροκινών και άλλων μορίων στο πλάσμα: Με την μέθοδο της Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA: Αρχή της μεθόδου: Η μέθοδος ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay), είναι μια ποιοτική και ποσοτική μέθοδος ανοσοανίχνευσης, προσδιορισμού των συγκεντρώσεων πρωτεϊνών, όπως κυτταροκινών, στον ορό ή το πλάσμα του αίματος. Είναι μέθοδος με υψηλή ειδικότητα και ευαισθησία για την μέτρηση κυτταροκινών ή άλλων πρωτεϊνών στο διάλυμα. Μπορεί να διακριθεί ανάλογα με το αν υπάρχει πρόσδεση των μορίων στο πιάτο σε ετερογενείς και ομοιογενείς. Πιο συγκεκριμένα, στους ετερογενείς τύπους ELISA (πιο κοινός τύπος) ανήκουν οι μετρήσεις κατά τις οποίες τα πρώτα αντιγόνα/αντισώματα είναι προσδεδεμένα στην επιφάνεια του πιάτου, ενώ τα επόμενα αντιγόνα ή αντισώματα προστίθενται σε υγρή μορφή. Ενώ στους ομοιογενείς τύπους ανήκουν οι μετρήσεις όπου όλα τα αντιγόνα και αντισώματα τα οποία χρησιμοποιούνται είναι σε μορφή διαλύματος (liquid phase). Ενώ και οι δύο τύποι περαιτέρω διακρίνονται σε άμεση, έμμεση ή τύπου σάντουιτς ELISA. Άμεση ELISA: Τα μονιμοποιημένα αντιγόνα του ασθενούς αντιδρούν με άμεση σύνδεση με το κατάλληλο αντίσωμα, στο οποίο υπάρχει συνδεδεμένο ένζυμο ώστε από την αντίδραση του ενζύμου με το υπόστρωμα να παραχθεί χρώμα. 59

61 Έμμεση ELISA: Αρχικά οι δυο διαδικασίες είναι ίδιες αφού τα αντιγόνα του ασθενή μονιμοποιούνται σε ειδικό πιάτο ELISA. Αντίσωμα έναντι του αντιγόνου προστίθεται, ενώ ακολουθεί και η προσθήκη ενός δεύτερου αντισώματος συνδεδεμένου με ένζυμο, το οποίο θα αντιδράσει με το κατάλληλο υπόστρωμα και θα οδηγήσει στην παραγωγή χρώματος. Εικόνα Σχεδιαγραμματική απεικόνιση του έμμεσου τύπου ELISA ( ELISA τύπου σάντουιτς: Χαρακτηρίζεται ως έμμεση ELISA, στην οποία το αντιγόνο "εγκλωβίζεται" μεταξύ δυο αντισωμάτων. Το πρώτο αντίσωμα, προσδεδεμένο στην επιφάνεια του πιάτου, αντιδρά με τον ορό ή το πλάσμα του ασθενή και στην συνέχεια, στο σύμπλοκο προστίθεται και ένα δεύτερο αντίσωμα ενωμένο με ένζυμο. Παρουσία του υποστρώματος, το ένζυμο αντιδρά και παράγεται χρώμα. Τέλος, υπάρχει η ανταγωνιστική ELISA. Αποτελεί ουσιαστικά τροποποιημένη μορφή των παραπάνω τύπων. Σε αυτόν τον τύπο, χρησιμοποιούνται μια ή περισσότερες βιοτινιλιωμένες ουσίες, οι οποίες ανταγωνίζονται τα Ab ή Ag κατά την αντίδραση. Η λογική της προσθήκης μιας ανταγωνιστικής ουσίας είναι η παρεμπόδιση της μη ειδικής πρόσδεσης στα Ab ή Ag, ώστε η πρόσδεση να οφείλεται σε μεγαλύτερη συγγένεια μεταξύ Ag ή Ab, και όχι στην απλή προσθήκη της ουσίας. 60

62 Εικόαν Απεικόνιση άμεσου και έμμεσου τύπου ELISA (τροποποιημένη εικόνα: Στην παρακάτω εικόνα, φαίνονται συνοπτικά τα βήματα που ακολουθούνται στην μέθοδο. Εικόνα Συνοπτική παρουσίαση των βημάτων της διαδιακασίας Στην παρούσα μελέτη προσδιορίστηκαν οι συγκεντρώσεις των υποδοχέων του TNFα, οι TNF -RI(p55/p60) και TNF-RII(p75/p80) καθώς και οι κυτταροκίνες TGF-β1 και TGF-β2 με την μέθοδο της ELISA. Η συγκεντρώσεις των κυτταροκινών ανιχνεύονται συνήθως σε picogram/ml. 61

63 Ενδεικτικά περιγράφεται η διαδικασία ανίχνευσης του μορίου TGF-β1: Αρχικά γίνεται αραίωση του δείγματος 10x με ειδικό διάλυμα. Στο αραιωμένο δείγμα, προστίθεται 1Ν HCL, το δείγμα επωάζεται 1hour, σε RT, και ουδετεροποιείται με την προσθήκη 1Ν NaOH. Ακολουθεί η δημιουργία της πρότυπης καμπύλης με τις κατάλληλες αραιώσεις και η δημιουργία των απαραίτητων διαλυμάτων ανάλογα με το πρωτόκολλο. Γνωρίζοντας ότι στην επιφάνεια των κελιών βρίσκονται προσδεδεμένα τα μονοκλωνικά αντισώματα (mab) έναντι του TGF-β1, υπολογίζεται ο συνολικός αριθμός των δειγμάτων που θα χρησιμοποιηθούν. Στον αριθμό των δειγμάτων του πειράματος υπολογίζονται: ο αριθμός των δειγμάτων των ασθενών, των σημείων της πρότυπης καμπύλης, των δειγμάτων control (αν είναι απαραίτητα) και blank σημεία που θα χρησιμοποιηθούν. Ακολουθεί προσθήκη ειδικού διαλύματος σε όλα τα δείγματα. Προσθήκη όλων των δειγμάτων. Επώαση 2hour, RT, διαρκή ανάδευση. Απόρριψη υπερκειμένου και πλύση με διάλυμα πλύσης. Προσθήκη βιοτυνιλιωμένου-ab, το οποίο γίνεται σε διαφορετικό επίτοπο της κυτταροκίνης και φέρει θέση πρόσδεσης για το ένζυμο στρεπταβιδίνη. Επώαση 1hour, RT, διαρκή ανάδευση. Απόρριψη υπερκειμένου και πλύση με διάλυμα πλύσης. Προσθήκη του ενζύμου στρεπταβιδίνη. Επώαση 1hour, RT, διαρκή ανάδευση. Προσθήκη του διαλύματος, TMB Substrate Solution (μπλε χρώμα) Επώαση 1hour, RT, διαρκή ανάδευση. Προσθήκη του διαλύματος παύσης (1Μ Phosphoric acid) (κίτρινο χρώμα). Η δημιουργία χρώματος είναι ανάλογη με την συγκέντρωση της κυτταροκίνης στο δείγμα, και κυμαίνεται από καθόλου χρώμα (αρνητικό δείγμα) μέχρι σκούρο. Προσδιορισμός της οπτικής πυκνότητας των δειγμάτων (Ο.D.) με φωτόμετρο, στα 450nm (εναλλακτικά στα 620nm, με αναφορά στα 610nm με 650nm). Η συγκέντρωση της κυτταροκίνης καθορίζεται από την πρότυπη καμπύλη, με το πρόγραμμα Curve Expert. 62

64 11.2. Μέτρηση κυτταροκινών με την μέθοδο Cytometric Beads Array: Αρχή της μεθόδου: Η μέθοδος CBΑ συνδυάζει τις αρχές των μεθόδων της κυτταρομετρίας ροής και της ELISA επιτρέποντας τον ταυτόχρονο προσδιορισμό πολλών κυτταροκινών, προφλεγμονωδών, αυξητικών και άλλων παραγόντων την ίδια χρονική στιγμή, σε πολύ μικρή ποσότητα υπερκείμενου δειγμάτων αίματος ή καλλιέργειας κυττάρων. Πρωτεΐνες από ορό ή πλάσμα δείγματος, ενώνονται με ομοιόμορφου τύπου μαγνητικά σφαιρίδια (beads), τα οποία φέρουν στην επιφάνειά τους ομοιοπολικά προσκολλημένα αντισώματα που αναγνωρίζουν και δεσμεύουν μια συγκεκριμένη πρωτεΐνη-αντιγόνο, π.χ. κυτταροκίνες. Στην συνέχεια, στο δείγμα προστίθενται ειδικά αντισώματα με διακριτή ένταση φθορισμού μιας εκπεμπόμενης κόκκινης χρωστικής (ΡΕ) που χρησιμοποιούνται ως ανιχνευτές. Τα bead εκπέμπουν φθορισμό σε ένα συγκεκριμένο μήκος κύματος και με αυτό τον τρόπο επιτρέπεται η ταυτόχρονη διάκριση πολλών κυτταροκινών. Αναλύοντας το δείγμα από τον ειδικό αναλυτή λαμβάνονται μετρήσεις διαφορετικής έντασης φθορισμού μεγέθους των συμπλόκων, οι οποίες είναι ανάλογες με τη συγκέντρωση της εκάστοτε κυτταροκίνης στο δείγμα. Εικόνα Αρχή της μεθόδου CBA ( Οι μέθοδοι CBA και ELISA, είναι δυο μέθοδοι ανίχνευσης πρωτεϊνών στον ορό ή στο πλάσμα του αίματος. Χρησιμοποιούνται ευρέως και η επιλογή της μιας έναντι της άλλης, αφορά στον σχεδιασμό των πειραμάτων. Ωστόσο, η μέθοδος CBA εμφανίζει κάποια συγκριτικά πλεονεκτήματα έναντι της ΕLISA. CBA Απαιτούνται 25μl δείγματος. Ταυτόχρονη ανάλυση πολλών κυτταροκινών. ΕLISA Απαιτούνται περίπου 100μl δείγματος. Δυνατότητα ανάλυσης μιας κυτταροκίνης. 63

65 Μεγαλύτερη ευαισθησία και ακρίβεια Είναι απαραίτητος ειδικός αναλυτής και υπολογιστικό πρόγραμμα για την ανάλυση των δειγμάτων Ανάλυση 2 φορές για το ίδιο δείγμα (duplicate) Η ανάλυση των δειγμάτων γίνεται με απλό φωτόμετρο Εικόνα Σχηματική απεικόνιση της σύνδεσης της κυτταροκίνης με την πρωτεΐνη στην μέθοδο CBA ( (multiplex bead array)) Για την ανίχνευση των κυτταροκινών στο πλάσμα του αίματος των ασθενών αλλά και στα υπερκείμενα του αίματος των ασκών χρησιμοποιήθηκε το Human Th1/Th2 Cytokine Kit από την BD biosciense, με δυνατότητα ταυτόχρονης ανίχνευσης για τις κυτταροκίνες IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, TNF-α και IFN-γ και παράλληλα, με την ίδια μέθοδο μετρήθηκε η IL-6 με το Human IL-6 Flex Set της BD biosciense. Διαδικασία: Προετοιμάζουμε την πρότυπη καμπύλη. Υπολογισμός αριθμού δειγμάτων (πρότυπης, δείγματα ασθενών και ελέγχου). Υπολογισμός ποσότητας κάθε κυτταροκίνης (ποσότητα κυτταροκίνης x αριθμό δειγμάτων). Υπολογισμός συνολικού όγκου διαλύματος κυτταροκινών (ποσότητα κυτταροκίνης x αριθμό κυτταροκινών). Φυγοκέντρηση μαγνητικών σφαιριδίων (beads) 3000rpm, 5min, RT. Προσεκτική απομάκρυνση υπερκειμένου διαλύματος beads και προσθήκη ίσης ποσότητας ειδικού διαλύματος (serum enhansement buffer). Επώαση 30min, RT, στο σκοτάδι. Προσθήκη ισόποσου διαλύματος πλύσης σε όλα τα wells. Ορίζουμε τις περιοχές ενδιαφέροντος Προσθήκη: 25μl δείγματος, 25μl beads και 25μl PE. 64

66 Επώαση 3hours, RT, στο σκοτάδι. Αφαίρεση περίσσειας υλικών με την χρήση μηχανήματος δημιουργίας κενού. Προσθήκη διαλύματος πλύσης (wash buffer) και αφαίρεση με την χρήση κενού Προσθήκη διαλύματος πλύσης Ανάλυση στον ειδικό αναλυτή της BD με την χρήση του προγράμματος BD array και περαιτέρω ανάλυση με το πρόγραμμα FlowJo και CurveExpert. 12. Πειράματα λειτουργικότητας των Τregs. Γνωρίζουμε από τα πειραματικά δεδομένα της μελέτης ότι ο αριθμός των Tregs αυξάνεται μετά τον χειρουργείο, μετά την μετάγγιση και προσεγγίζει τις τιμές πριν το χειρουργείο μετά την 1 η εβδομάδα και τελικά μετά την τελευταία επίσκεψη των ασθενών. Η αύξηση του απόλυτου αριθμού των ρυθμιστικών κυττάρων, που αποδείχθηκε με την ανίχνευση των κυτταρικών πληθυσμών με την μέθοδο της κυτταρομετρίας ροής, εγείρει το ερώτημα της λειτουργικότητας τους, αν δηλαδή τα Tregs εξακολουθούν να αναστέλλουν τον πολλαπλασιασμό των Teffs μετά την μετάγγιση. Για την διερεύνηση αυτού του ερωτήματος πραγματοποιήθηκαν πειράματα λειτουργικότητας (functional assays), τα οποία πραγματοποιήθηκαν σε δείγματα αίματος από τρεις υγιείς δότες, τρεις μη- μεταγγισμένους ασθενείς και τρεις μεταγγισμένους ασθενείς που είχαν υποβληθεί σε αρθροπλαστική γόνατος ή ισχίου. Από τα ηπαρινισμένα δείγματα ολικού αίματος απομονώθηκαν τα effectors (CD4+CD25-) και τα ρυθμιστικά (CD4+CD25+) κύτταρα, τα οποία συνκαλλιεργήθηκαν για 72 ώρες παρουσία ή απουσία μιτογονικού ερεθίσματος (PHA) σε διαφορετικές αναλογίες κυττάρων (Τregs:effectors) Απομόνωση των effector και ρυθμιστικών κυττάρων του αίματος: Η απομόνωση των κυττάρων έγινε με το Dynabeads Regulatory CD4+CD25+ T Cell kit της εταιρείας Invitrogen και ακολουθήθηκε το πρωτόκολλο εργασίας όπως δίνεται. Οι συνθήκες που εφαρμόστηκαν ορίστηκαν για την διερεύνηση της αναστολής του πολλαπλασιασμού των effectors ως εξής: (Τregs:effectors) σε αναλογίες 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16 και 1:32 καθώς και τα σημεία ελέγχου του πειράματος όπου καλλιεργήθηκαν τα effectors κύτταρα μόνα τους ±PHA. 65

67 Εικόνα Σχεδιαγραμματική απεικόνιση των βημάτων της διαδικασίας: Διαδικασία: Αρχικά πραγματοποιήθηκε απομόνωση των PBMCs με βαθμίδωση φικόλης και υπολογισμός του απόλυτου αριθμού τους. Δημιουργήθηκαν τα κατάλληλα διαλύματα και πραγματοποιήθηκαν τα παρακάτω βήματα. Βήμα 1: Απομόνωση των CD4 + κυττάρων: Φυγοκέντρηση 1800rpm, 10min, RT. Επαναδιάλυση των κυττάρων σε διάλυμα απομόνωσης (Isolation Buffer/ΙΒ), 100% FBS και διάλυμα αντισωμάτων (Antibody Mix Human CD4). Επώαση των κυττάρων με τα αντισώματα, 20min, 4-8 ο C. Προσθήκη παγωμένου ΙΒ και φυγοκέντρηση 1800rpm, 10min, 4-8 ο C. Απόρριψη υπερκειμένου, επαναδιάλυση σε παγωμένο ΙΒ και προσθήκη διαλύματος Depletion MyOne Dynabeads Επώαση 10min, RT (διαρκή κίνηση). Επίδραση μαγνητικού πεδίου και συλλογή των μη-προσδεδεμένων κυττάρων (CD4 + πληθυσμός). Στα προσδεδεμένα κύτταρα με μαγνητικά σφαιρίδια ακολουθεί προσθήκη ΙΒ διαλύματος, ανάδευση, 3min επίδραση μαγνητικού πεδίου και συλλογή υπερκειμένου (CD4 + πληθυσμός). Στο υπερκείμενο ακολουθεί φυγοκέντρηση 1800rpm, 10min, 4-8 ο C. Επαναδιάλυση των CD4 + κυττάρων σε ΙΒ διάλυμα και προσδιορισμός του απόλυτου αριθμού τους με την χρήση αιματοκυτταρομέτρου. 66

68 Βήμα 2: Απομόνωση των CD4+CD25- κυττάρων: Προσθήκη αντισώματος Dynabeads-CD25, ανάδευση και επώαση 25min, 4-8 ο C, σε διαρκή κίνηση. Επίδραση μαγνητικού πεδίου στο δείγμα για 1min και απομάκρυνση του υπερκειμένου. Στο υπερκείμενο βρίσκονται τα CD4 + CD25 - effector κύτταρα. Επαναδιάλυση των CD4 + CD25 + κυττάρων σε ΙΒ διάλυμα, Επίδραση μαγνητικού πεδίου στο δείγμα 1min και απομάκρυνση του υπερκειμένου. Φυγοκέντρηση 1800rpm, 10min, 4-8 ο C του υπερκειμένου Υπολογισμός του απόλυτου αριθμού των CD4 + CD25 - Σε αυτό το σημείο γίνεται χρώση των CD4 + CD25 - κυττάρων με την ουσία CFSE. Βήμα 3: Απομόνωση των CD4 + CD25 + ρυθμιστικών κυττάρων: Επαναδιάλυση των CD4 + CD25 + κυττάρων σε καλλιεργητικό RPMI με 1%FBS Προσθήκη διαλύματος DETACHaBEAD Επώαση για 45min, RT, διαρκή ανάδευση Επίδραση μαγνητικού πεδίου στο δείγμα 1min Απομάκρυνση υπερκειμένου στο οποίο βρίσκονται ελεύθερα τα CD4 + CD25 + Προσθήκη διαλύματος RPMI+1%FBS στα μαγνητικά σφαιρίδια, ανάδευση και επίδραση μαγνητικού πεδίου στο δείγμα για 1min. Συλλογή υπερκειμένου και φυγοκέντρηση 1800rpm, 10min, 4-8 ο C. Υπολογισμός του απόλυτου αριθμού των CD4 + CD25 + Επαναδιάλυση στον επιθυμητό όγκο σε πλήρες καλλιεργητικό υλικό. Διαλύματα Διάλυμα Απομόνωσης (Isolation Buffer/ΙΒ) Antibody Mix Human CD4 Πλήρες Καλλιεργητικό (Culture Medium/CM) διάλυμα Depletion MyOne Dynabeads Σύσταση PBS (1x)+0.1% BSA+2mM EDTA αντισώματα mouse IgG CD14, CD16a, CD16b, CD56, CDw123, CD36, CD8, CD19 και Glycophorin A. RPMI +10%FBS +πεν./στρεπ.+ 2-μερκαπταιθανόλη ομοιόμορφα, υπερ-μαγνητικά σφαιρίδια πολυστηρενίου διαμέτρου 1μm 67

69 12.2. Χρώση με CFSE Η ονομασία CFSE είναι συντομογραφία της πλήρους ονομασίας 5- (και 6)- Carboxy fluorescein diacetate succinimidyl ester, CFDA SE και στα ελληνική ονομασία καρβοξική φλουορεσκεΐνης διακετιλικού ηλεκτριμιδεστέρα εστέρα. Η ουσία CFSE έχει μοριακό βάρος και μοριακό τύπο C 29 H 19 NO 11. Χρησιμοποιείται για την ανίχνευση κυττάρων και μελέτες πολλαπλασιασμού. Η πρόδρομος ουσία ονομάζεται CFDA SE και όταν προστεθεί στην καλλιέργεια εισέρχεται στα κύτταρα μέσω διάχυσης. Οι ενδοκυττάριες εστεράσες που βρίσκονται στο εσωτερικό της κυτταρικής μεμβράνης, διασπούν τις κετονομάδες ώστε να προκύψουν τα φθορίζοντα μόρια καρβόξυ- φλουορεσκεΐνης με αποτέλεσμα τη μετατροπή της CFDA SE σε CFSE. Οι εστερικές ομάδες του μορίου succinimidyl αλληλεπιδρά με τις πρωτογενής αμίνες και με crosslinking ενώνεται με τις ενδοκυττάριες πρωτεϊνες. Με τον πολλαλασιαμό των κυττάρων, η ένταση του φθορισμού που προκύπτει από την ουσία CFSE μειώνεται στο μισό, σε κάθε κυτταρικό κύκλο. Μετά την απομάκρυνση των κετονομάδων, η ουσία μετατρέπεται σε φθορίζουσα, και απορροφά σε μήκος κύματος 494 nm ενώ εκπέμπει στα 521 nm. Εικόνα Χημικός Τύπος της ουσίας 5- (και 6)-Carboxy fluorescein diacetate succinimidyl ester ( Για τον έλεγχο του πολλαπλασιασμού των κυττάρων CD4 + CD25 - και την επίδραση των CD4 + CD25 + σε αυτά, ακολούθησε προσθήκη της ουσίας CFSE σε συγκέντρωση 5μM, στα πρώτα. Συγκεντρώσεις της ουσία πάνω από 10 mm είναι τοξικές για τα κύτταρα. 68

70 Η παρακάτω διαδικασία επιτελείται στο σκοτάδι. Προσθήκη ΙΒ διαλύματος απουσία EDTA, σε 10 6 κύτταρα. Φυγοκέντρηση 1800rpm, 10min, 4 0 C. Απομάκρυνση υπερκειμένου και προσθήκη ΙΒ διαλύματος απουσία EDTA Προσθήκη της ουσίας CFSE (5μM τελική συγκέντρωση) Επώαση στους 37 0 C, για 15 λεπτά Προσθήκη παγωμένου σκέτου καλλιεργητικού RPMI Επώαση 5min, 4 0 C και προσθήκη παγωμένου σκέτου RPMI Φυγοκέντρηση 1800rpm, 10min, 4 0 C. Αναδιάλυση σε επιθυμητό όγκου CM ενώ μια μικρή ποσότητα δείγματος αναλύεται με κυτταρομετρία ροήςμγια θετική επιβεβαίωση της χρώσης με CFSE. Ύστερα από απομόνωση και χρώση με CFSE των CD4 + CD25 - και την απομόνωση των CD4 + CD25 +, τα κύτταρα συνκαλλιεργούνται παρουσία PHA για 3 μέρες (72 ώρες) στον επωαστικό θάλαμο. Μετά από 3 μέρες (72 ώρες) επώαση στους 37 0 C, με 5% CO 2 και υγρασία. Συλλογή των κυττάρων και φυγοκέντρηση 2500rpm, 10min, RT. Συλλογή υπερκειμένου και αποθήκευση στους C για προσδιορισμό συγκεντρώσεων κυτταροκινών. Αναδιάλυση ιζήματος σε PBS 1x και ανάλυση με κυτταρομετρία ροής Περαιτέρω ανάλυση με το πρόγραμμα FlowJo Ο προσδιορισμός των συγκεντρώσεων των κυτταροκινών στα υπερκείμενα των καλλιεργειών πραγματοποιήθηκε με την μέθοδο CBA. 69

71 13. Στατιστική ανάλυση Η στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων έγινε με το πρόγραμμα GraphPad Prism5. Και πιο συγκεκριμένα: Δημιουργία κατάλληλου φύλου εργασίας και ορθή επιλογή τύπου διαγράμματος. Εισαγωγή των δεδομένων Εφαρμογή Column Statistics στα δεδομένα ώστε να διαπιστώσουμε αν περνούν τα τεστ κανονικότητας (kolmogorov smirnov/ks normality test) Αν οι τιμές περνούν το τεστ κανονικότητας (παραμετρικές τιμές) τότε εφαρμόζεται είτε paired ή unpaired t-test Το paired t test συγκρίνει την μέση τιμή δύο matched ομάδων όταν οι τιμές ακολουθούν κανονική κατανομή. Τα unpaired t test συγκρίνει την μέση τιμή δύο unmatched ομάδων όταν οι τιμές ακολουθούν κανονική κατανομή. Αν οι τιμές δεν περνούν το τεστ κανονικότητας (μη-παραμετρικές τιμές) τότε εφαρμόζεται one or two-way anova και πιο συγκεκριμένα: Με το One-way ANOVA συγκρίνονται η μέση τιμή τριών ή παραπάνω unmatched ομάδων και με το two-way ANOVA καθορίζεται πως η ανάλυση καθορίζεται από δυο παράγοντες. Για παράδειγμα, αν θελήσουμε να μετρήσουμε την επίδραση ενός φαρμάκου (ένας παράγοντας) σε άντρες και γυναίκες (το φύλο αποτελεί άλλο παράγοντα). Εφαρμόζοντας τα Kurskal-Wallis τεστ ή Mann-Whitney. Το Kurskal-Wallis τεστ είναι μη-παραμετρικό τεστ στο οποίο συγκρίνονται τρία ή παραπάνω unmatched ομάδες. Το Mann-Whitney τεστ είναι ένα μη-παραμετρικό τεστ κατά το οποίο συγκρίνονται δυο unmatched ομάδες. Αυτό το τεστ επίσης ονομάζεται και Wilcoxon rank sum test. Το επίπεδο σημαντικότητας ορίζεται ως p value>0,05ώστε να υπάρχει στατιστικώς σημαντική διαφορά. Στα παρακάτω διαγράμματα φαίνονται με error bars το SD των τιμών. 70

72 Αποτελέσματα 71

73 Αποτελέσματα, γενικά: Ηπαρινισμένο περιφερικό αίμα ασθενών που υπεβλήθησαν σε αρθροπλαστική γόνατος ή ισχίου ή αναθεωρήσεων αυτών και ιδιαίτερα χωρίς άλλες υποβόσκουσες ανοσοτροποποιητικές νόσους, χρησιμοποιήθηκαν για την διερεύνηση της πλαστικότητας των Τ-βοηθητικών κυττάρων μετά την επίδραση της μετάγγισης αίματος. Η συλλογή των δειγμάτων έγινε από την Ορθοπεδική Κλινική του Περιφερειακού Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Πατρών. Συνολικά συλλέχθησαν δείγματα από 89 ασθενείς οι οποίοι υπεβλήθησαν σε προγραμματισμένο χειρουργείο ολικής αρθροπλαστικής γόνατος ή ισχίου ή αναθεωρήσεων αυτών (περιπτώσεις άσηπτης χαλάρωσης των υλικών) ωστόσο, το ερέθισμα που διαφοροποιεί τις δυο ομάδες είναι η μετάγγιση. Με την διαδικασία της μετάγγισης εισέρχεται στο σώμα του λήπτη τεράστιος αριθμός αντιγόνων, τα οποία δρουν ως παράγοντες που επηρεάζουν τα κύτταρα του ανοσοποιητικού. Έτσι, οι ασθενείςνδιακρίνονται σε αυτούς που έλαβαν μετάγγιση και σε αυτούς που δεν μεταγγίστηκαν σε κανένα σημείο της μελέτης. Στην πρώτη ομάδα (Group 1) ανήκουν 54 μεταγγισμένοι ασθενείς (46 γυναίκες και 8 άντρες) ενώ στην δεύτερη ομάδα (Group 2) ανήκουν 35 μη-μεταγγισμένοι ασθενείς (27 γυναίκες και 8 άντρες). Η συλλογή των δειγμάτων έγινε στις διάφορες χρονικές στιγμές πριν το χειρουργείο (BS), αμέσως μετά το χειρουργείο και κάθε μέρα μέχρι την πρώτη μετεγχειρητική εβδομάδα (Days 0-7), ένα μήνα μετά (1 month) και κατά τον επανέλεγχο των ασθενών (>3 μήνες). 14. Προσδιορισμός των CD4 + CD25 + CD127 -/low και CD4 + CD25 +/high FoxP3 + ρυθμιστικών κυτταρικών πληθυσμών, και άλλων CD3 + κυτταρικών πληθυσμών στα δείγματα των ασθενών. Μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος (PBMC s) ασθενών απομονώθηκαν με διαχωρισμό με βαθμίδωση φικόλης και καθορίστηκε ο απόλυτος αριθμός τους με την χρήση αιματοκυτταρομέτρου (με τις διαδικασίες όπως περιγράφονται παραπάνω). Στα κύτταρα προσδιορίστηκαν πιο συγκεκριμένα, με επιφανειακή χρώση ο πληθυσμός των CD4 + CD25 + CD127 -/low κυττάρων και με ενδοκυττάρια χρώση ο πληθυσμός των CD4 + CD25 +/high FoxP3 +. Πρόσθετα, σε 72

74 κύτταρα ολικού αίματος ακολούθησε επιφανειακή χρώση για άλλους CD3 + κυτταρικούς πληθυσμούς. Η ανάλυση των δειγμάτων έγινε με χρήση κυτταρομετρίας ροής και περαιτέρω ανάλυση ακολούθησε με το πρόγραμμα FlowJo. Η στατιστική ανάλυση των δεδομένων έγινε με το στατιστικό πρόγραμμα GraphPad Prism5 και τα αποτελέσματα των πειραμάτων παρατίθενται παρακάτω υπό την μορφή διαγραμμάτων Ανάλυση των αποτελεσμάτων της κυτταρομετρίας ροής με το πρόγραμμα FlowJo. Η ανάλυση των δειγμάτων τόσο για τους επιφανειακούς όσο και για τους ενδοκυττάριους δείκτες πραγματοποιήθηκε στον κυτταρομετρητή της εταιρείας Beckamn Coulter με δυνατότητα ανάλυσης τριών χρωμάτων. Τα αποτελέσματα υφίστανται περαιτέρω επεξεργασία με το λογισμικό ανάλυσης FlowJo (Tree star, Ashland, Oregon, USA), το οποίο αποτελεί ένα από τα πιο διαδεδομένα λογισμικά ανάλυσης αποτελεσμάτων κυτταρομετρίας ροής. Ενδεικτικά παρατίθενται παρακάτω εικόνες επεξεργασίας των αποτελεσμάτων με το πρόγραμμα FlowJo μεταγγισμένων ασθενών, πριν (BS) και μετά το χειρουργείο (day0). Η πρώτη διάκριση των κυττάρων (πρώτο διάγραμμα) η οποία γίνεται ανάλογα με τον σκεδασμό της ακτίνας λέιζερ, γίνεται με βάση το μέγεθος (οριζόντιος άξονας) και την κοκκίωση των κυττάρων (κάθετος άξονας). Έτσι, είναι εφικτό να διαχωριστούν οι πληθυσμοί των λευκών αιμοσφαιρίων σε μονοκύτταρα, λεμφοκύτταρα και πολυμορφοπύρηνα. Ο κυτταρικός πληθυσμός των λεμφοκυττάρων είναι μεσαίου μεγέθους (6-15μm) με χαρακτηριστικά μεγάλο πυρήνα, πολύ μικρό κυτταρόπλασμα και απουσία κοκκίων. Με βάση τα παραπάνω οριοθετείται και επιλέγεται ο σωστός κυτταρικός πληθυσμός και στην συνέχεια με ιεραρχική ανάλυση (από τον μεγαλύτερο προς τον μικρότερο πληθυσμό) ακολουθεί η διάκριση των δεικτών ενδιαφέροντος, ανάλογα με τα φθοροχρώματα που έχουν προσεκτικά επιλεγεί. Ενδεικτικά αναλύονται παρακάτω οι ρυθμιστικοί πληθυσμοί των επαγώγιμων CD4 + CD25 + CD127 -/low (εικόνα14.1.1) και φυσικών CD4 + CD25 +/high FoxP3 + (εικόνα ) ρυθμιστικών κυττάρων καθώς 73

75 και των ενεργοποιημένων βοηθητικών CD4 + κυττάρων (εικόνα ) με φαινότυπο CD3 + CD4 + HLA-DR +. α. CD4 + CD25 + CD127 -/low Εικόνα Παράδειγμα επεξεργασίας των αποτελεσμάτων με την μέθοδο της κυτταρομετρίας ροής και του προγράμματος FlowJο για τα itregs. CD4 + CD25 + CD127 low/- Λεμφοκύτταρα CD4 + CD25 + CD127 low/- CD127 + Πριν το χειρουργείο (BS) Μετά το χειρουργείο (day0) Πίνακας Παρουσίαση απόλυτων αριθμών των κυτταρικών πληθυσμών Τα παραπάνω αποτελέσματα αφορούν σε απόλυτο αριθμό λεμφοκύτταρα και το δείγμα είναι του ίδιου ασθενή πριν και μετά το χειρουργείο, μετά από μετάγγιση. Από το πρώτο διάγραμμα (διάγραμμα Α) επιλέγεται ο πληθυσμός των λεμφοκυττάρων, ενώ στην συνέχεια για τα itregs, θετικά επιλέγεται ο μεγαλύτερος πληθυσμός CD4 (διάγραμμα Β), μετά επιλέγονται τα ενεργοποιημένα CD4 κύτταρα τα οποία φέρουν στην επιφάνειά τους τον δείκτη CD25 (διάγραμμα Γ), και τέλος, από τα ενεργοποιημένα βοηθητικά Τ-κύτταρα (CD4 + CD25 + ) επιλέγονται 74

76 αυτά τα οποία φέρουν ή όχι τον υποδοχέα της IL-7 στην επιφάνειά τους (διαγράμματα Δ). β. CD4 + CD25 +/high FoxP3 + Εικόνα Παράδειγμα επεξεργασίας των αποτελεσμάτων με την μέθοδο της κυτταρομετρίας ροής και του προγράμματος FlowJο για τα ntregs. CD4 + CD25 +/high FoxP3 + Σύνολο Λεμφοκύτταρα CD4 + CD4 + CD25 high/+ FoxP3 + Πριν το χειρουργείο (BS) Μετά το χειρουργείο (day0) Πίνακας Παρουσίαση απόλυτων αριθμών των κυτταρικών πληθυσμών Τα παραπάνω αποτελέσματα αφορούν σε απόλυτο αριθμό κύτταρα και το δείγμα είναι του ίδιου ασθενή πριν και μετά το χειρουργείο, μετά από μετάγγιση. Και στις δυο περιπτώσεις η λογική της ανάλυσης είναι η ίδια. Για τον πληθυσμό των ntreg κυττάρων μετά την επιλογή των λεμφοκυττάρων όπως φαίνεται στο πρώτο διάγραμμα (διάγραμμα Α) επιλέγεται η ανάλυση με την αξιοποίηση της συνέκφρασης των δυο επιφανειακών δεικτών CD4 και CD25. Έτσι, στο διάγραμμα Γ μπορεί να διακριθεί στον οριζόντιο άξονα το μόριο CD25 ενώ στον κάθετο άξονα το 75

77 μόριο CD4. Για το μόριο CD25, ως θετικός πληθυσμός ορίζεται ο δεξιά του τεταρτημορίου ενώ για το μόριο CD4, ως θετικός πληθυσμός ορίζεται ο πληθυσμός που φαίνεται στην πάνω μεριά του τεταρτημορίου. Η σωστή επιλογή του πληθυσμού ενδιαφέροντος αφορά στο τεταρτημόριο πάνω δεξιά όπου ο πληθυσμός χαρακτηρίζεται από ταυτόχρονη έκφραση των δυο δεικτών, όπως φαίνεται και στην εικόνα. Τέλος, τα διπλά θετικά κύτταρα αναλύονται ως προς τον ενδοκυττάριο μεταγραφικό παράγοντα FoxP3 (διάγραμμα Δ), όπου επιλέγεται ο θετικός πληθυσμός. γ. CD3 + CD4 + HLA-DR + Εικόνα Παράδειγμα επεξεργασίας των αποτελεσμάτων με την μέθοδο της κυτταρομετρίας ροής και του προγράμματος FlowJο για τα HLA-DR +. Η παραπάνω εικόνα έχει προκύψει από επεξεργασία των δειγμάτων του ίδιου ασθενή πριν και μετά το χειρουργείο, ύστερα από μετάγγιση κατά την διάρκεια του χειρουργείου. Η επεξεργασία του δείγματος έγινε σε ολικό αίμα και η μέτρηση σταμάτησε όταν ο πληθυσμός των λεμφοκυττάρων έφτασε τα Η ανάλυση που ακολουθήθηκε ήταν ιεραρχική, επιλέγοντας αρχικά τον CD3 + πληθυσμό, στην συνέχεια τον πληθυσμό CD4 + και τέλος, τα ενεργοποιημένα κύτταρα μέσα σε αυτόν. Με την ίδια λογική έγινε και η ανάλυση για τα ενεργοποιημένα CD8 + κύτταρα καθώς και τα μνημονικά και παρθενικά CD4 + και CD

78 14.2. Αύξηση των CD4 + CD25 + CD127 -/low μετά την μετάγγιση Για τον προσδιορισμό του ρυθμιστικού πληθυσμού των επαγώγιμων κυττάρων, τα οποία τελικώς διαφοροποιούνται στην περιφέρεια, πραγματοποιήθηκαν πειράματα κυτταρομετρίας ροής για την ταυτόχρονη ανίχνευση των επιφανειακών δεικτών CD4 και CD25 με ταυτόχρονη έλλειψη του μορίου CD127. Τα επίπεδα του πληθυσμού πριν το χειρουργείου (BS) αποτελούσαν το 8,73% των CD4 + κυττάρων ενώ μετά το χειρουργείο οι ασθενείς με ή χωρίς μετάγγιση ακολουθούν το ίδιο πρότυπο έκφρασης Διαγραμματική απεικόνιση των αποτελεσμάτων του itreg πληθυσμού για τις πρώτες τέσσερεις μετεγχειρητικές μέρες για τους μεταγγισμένους (Α) και μη-μεταγγισμένους ασθενείς (Β). Τα αποτελέσματα των μη-μεταγγισμένων ασθενών παρουσιάζονται στο διάγραμμα Β. Στους μη-μεταγγισμένους ασθενείς, παρατηρείται πολύ μικρή αύξηση μετά το χειρουργείο (day0) σε ποσοστό 9,46% των CD4 + κυττάρων η οποία συνεχίζεται και την επόμενη μέρα και φτάνει σε επίπεδα 12,27% των CD4 + κυττάρων (day1). Από την δεύτερη μετεγχειρητική μέρα (day2) τα επίπεδα των itregs έχουν περίπου επανέλθει σε αυτά που ήταν πριν το χειρουργείο (9,04%) ενώ μειώνονταν τις επόμενες μέρες. Πιο συγκεκριμένα την τρίτη μέρα (day3) τα itregs ανιχνεύτηκαν σε ποσοστό 7,2% ενώ περαιτέρω μείωση του πληθυσμού παρατηρήθηκε στην 4 η μετεγχειρητική μέρα. Τα αποτελέσματα των μεταγγισμένων ασθενών παρουσιάζονται στο διάγραμμα Α. Στους μεταγγισμένους ασθενείς, παρόλο που το μοτίβο έκφρασης είναι το 77

79 ίδιο, σημαντικές αλλαγές σημειώθηκαν μεταξύ των δύο ομάδων. Σημαντική αύξηση των itregs σημειώθηκε τόσο αμέσως μετά το χειρουργείο (day0) σε ποσοστά που έφτασαν το 14,9% των CD4 + κυττάρων όσο και την επόμενη μέρα (day1) όπου ο πληθυσμός έφτασε το 21,05% των CD4 + κυττάρων. Την δεύτερη μετεγχειρητική μέρα (day2) τα ποσοστά των ρυθμιστικών κυττάρων επανήλθαν στα επίπεδα πριν το χειρουργείο (8,15%), ενώ από την τρίτη μέρα (day3) και έπειτα ο πληθυσμός παρατηρήθηκε να μειώνεται. Πιο συγκεκριμένα, την day3 τα itregs πλησίασαν το 5,98% και την day4 το ποσοστό αυτό έφτασε το 1,64%. Την 7 η μετεγχειρητική μέρα τα επίπεδα του πληθυσμού ήταν στο 6,03%, παρόμοια με αυτά που ανιχνεύθηκαν ένα μήνα μετά την μετάγγιση (6,75%) ενώ τα επίπεδα του κυτταρικού πληθυσμού δεν φαίνεται να έχουν επανέλθει σε ισορροπία στην τελευταία επίσκεψη των ασθενών Στην εικόνα παρουσιάζονται στο ίδιο διάγραμμα οι δύο ομάδες των ασθενών μέχρι την πρώτη εβδομάδα μετά το χειρουργείο Στην εικόνα παρουσιάζεται ο πληθυσμός των itregs για περισσότερες χρονικές στιγμές μετά το χειρουργείο, μετά την μετάγγιση. 78

80 Αύξηση των CD4 + CD25 +/high FoxP3 + μετά την μετάγγιση Με την ίδια λογική ακολούθησε ανίχνευση των φυσικών ρυθμιστικών κυττάρων, τα οποία ωριμάζουν και τελικώς διαφοροποιούνται στον θύμο. Για τον προσδιορισμό των φυσικών ρυθμιστικών κυττάρων, πραγματοποιήθηκαν πειράματα κυτταρομετρίας ροής για την ταυτόχρονη ανίχνευση των επιφανειακών δεικτών CD4 και CD25 καθώς και του ενδοκυττάριου μεταγραφικού παράγοντα FoxP3, στις ίδιες χρονικές στιγμές. Τα επίπεδα του πληθυσμού πριν το χειρουργείου (BS) αποτελούσαν το 2,27% των CD4 + κυττάρων, ενώ μετά το χειρουργείο οι ασθενείς με ή χωρίς μετάγγιση ακολουθούν το ίδιο πρότυπο έκφρασης και για αυτόν τον κυτταρικό πληθυσμό με στατιστικώς σημαντική αύξηση την δεύτερη μετεγχειρητική μέρα Διαγραμματική απεικόνιση των αποτελεσμάτων των ntregs τις πρώτες μετεγχειρητικές μέρες για τους μεταγγισμένους (Α) και μη-μεταγγισμένους ασθενείς (Β). Τα αποτελέσματα των φαινοτυπήσεων για τον πληθυσμό των CD4 + CD25 +/high FoxP3 + κυττάρων για τους μη-μεταγγισμένους ασθενείς παρουσιάζονται στην εικόνα Β. Αμέσως μετά το χειρουργείο, τα ntregs αυξάνονται σε ποσοστό 2,6% (day0) και συνεχίζουν να αυξάνονται σε ποσοστό 3,73% την πρώτη μετεγχειρητική μέρα (day1) και 5,58% την δεύτερη μετεγχειρητική μέρα (day2). Ενώ στην συνέχεια, ο πληθυσμός των ntregs μειώνεται και πλησιάζει τα πριν το χειρουργείο επίπεδα. Στατιστικώς σημαντική αύξηση παρατηρείται τη δεύτερη μετεγχειρητική μέρα (day2) συγκριτικά με τα BS και day0 επίπεδα και στατιστικώς σημαντική μείωση παρατηρείται από την επόμενη κιόλας μέρα day3. 79

81 Στην εικόνα Α. παρουσιάζονται σε διάγραμμα τα αποτελέσματα των φαινοτυπήσεων για τις χρονικές στιγμές από πριν το χειρουργείο και κάθε μέρα μέχρι την πρώτη μετεγχειρητική εβδομάδα των ασθενών που έχουν υποβληθεί σε αρθροπλαστική και έλαβαν μετάγγιση κατά την διάρκεια του χειρουργείου. Όπως και στους μη-μεταγγισμένους ασθενείς παρατηρήθηκε αύξηση των φυσικών ρυθμιστικών κυττάρων αμέσως μετά το χειρουργείο και μέχρι την δεύτερη μετεγχειρητική μέρα και στην συνέχεια πτώση μέχρι την πρώτη μετεγχειρητική εβδομάδα. Ωστόσο, η αύξηση των ntresg ήταν πολύ μεγαλύτερη στους μεταγγισμένους ασθενείς συγκριτικά με τους μη μεταγγισμένους. Πιο συγκεκριμένα, αμέσως μετά το χειρουργείο (day0) οι ασθενείς είχαν 3,13% ntresg επί των CD4 + κυττάρων. Τα οποία αυξήθηκαν σε ποσοστό 11,84% την δεύτερη μετεγχειρητική μέρα (day2). Και μειώνονται την επόμενη μέρα (day3) σε ποσοστό 4,42%, ποσοστό που εξακολουθεί να είναι στατιστικώς σημαντικά αυξημένο συγκριτικά με τα BS επίπεδα. Περαιτέρω μείωση παρατηρείται την τέταρτη μετεγχειρητική μέρα η οποία συνεχίζεται μέχρι την ολοκλήρωση της πρώτης μετεγχειρητικής εβδομάδας(day7) όπου τα ποσοστά είναι σημαντικά μειωμένα Στο παραπάνω διάγραμμα παρουσιάζεται η μεταβολή των ntregs μεταγγισμένων και μη-μεταγγισμένων ασθενών μέχρι την έβδομη μετεγχειρητική μέρα. Η φαινοτυπική ανίχνευση των ntregs συνεχίστηκε και μετά την πρώτη μετεγχειρητική εβδομάδα, στον ένα μήνα μετά το χειρουργείο και στην τελευταία επίσκεψη των ασθενών μετά το χειρουργείο (follow-up visit). Την πρώτη μετεγχειρητική εβδομάδα παρατηρήθηκαν χαμηλά ποσοστά των ntregs (1,57%) τα 80

82 οποία μειώθηκαν περαιτέρω σε 1,05% τον πρώτο μήνα μετά το χειρουργείο και επανήλθαν στα πριν το χειρουργείο επίπεδα (2,84%) στην τελευταία επίσκεψη των ασθενών. Έτσι φαίνεται ότι στην τελευταία επίσκεψη των ασθενών έχει επέλθει η ισορροπία αυτού του κυτταρικού πληθυσμού κάτι που δεν παρατηρήθηκε στον πληθυσμό των επαγώγιμων κυττάρων itregs (εικόνα ) Στο παραπάνω διάγραμμα απεικονίζεται ο πληθυσμός των ntregs για περισσότερες χρονικές στιγμές μετά το χειρουργείο, μετά την μετάγγιση. 81

83 Μεταβολή άλλων CD3 + κυτταρικών πληθυσμών πριν και μετά το χειρουργείο. Μετά τον προσδιορισμό των ρυθμιστικών πληθυσμών των ασθενών, δημιουργήθηκε το ερώτημα αν μεταβάλλονται και άλλοι κυτταρικοί πληθυσμοί. Έτσι, για την ανίχνευση των άλλων κυτταρικών πληθυσμών πριν και μετά το χειρουργείο, ακολούθησε κυτταρομετρία ροής. Για αυτό χρησιμοποιήθηκε ολικό αίμα από εννέα ασθενείς, πέντε μεταγγισμένους και τέσσερις μη-μεταγγισμένους ασθενείς και προσδιορίστηκαν οι παρακάτω πληθυσμοί όπως φαίνονται στους παρακάτω πίνακες. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέση τιμή των θετικών αποτελεσμάτων ±SEM και στην τελευταία στήλη των πινάκων παρουσιάζονται οι στατιστικώς σημαντικές διαφορές με την χρήση συμβόλων (+) όπου υπήρχε διαφορά, ενώ (-) για όπου δεν έχουν παρατηρηθεί διαφορές. Πίνακας Παρουσίαση αποτελεσμάτων κυτταρικών πληθυσμών σε μεταγγισμένους ασθενείς, πριν και μετά το χειρουργείο. Αριθμός Ασθενών n=9 Mean ± SEM n=5 Mean ± SEM Κυτταρικός Τύπος Πριν (BS) Μετά (AS) Σ.Σ.Δ. Lymphocytes + 31,47±1,08 19,8±3,025 ΝΑΙ (+++) CD3 + 48,23±3 40,28±2,7 ΝΑΙ (+) CD3 + CD4 + 62,04±3,25 54,35±3,84 ΟΧΙ (-) CD3 + CD8 + 28,44±3,46 37,48±3,49 ΟΧΙ (-) CD3 + CD4 + CD45RA + 50,22±3,82 38,61±4,4 ΟΧΙ (-) CD3 + CD4 + CD45RO + 33,09±3,16 38,56±2,5 ΟΧΙ (-) CD3 + CD8 + CD45RA + 55,10±4,5 50,77±4,7 ΟΧΙ (-) CD3 + CD8 + CD45RO + 13,30±1,99 13,46±2,26 ΟΧΙ (-) CD3 + CD4 + HLA-DR + 3,667±0,35 7,308±0,77 ΝΑΙ (+++) CD3 + CD8 + HLA-DR + 4,310±0,66 9,476±1,89 ΝΑΙ (++) Στους μεταγγισμένους ασθενείς (πίνακας ) μετά το χειρουργείο παρατηρείται στατιστικώς σημαντική μείωση τόσο του λεμφοκυτταρικού πληθυσμού όσο και των CD3 + κυττάρων χωρίς ωστόσο να διαταράσσεται η ισορροπία των άλλων υποπληθυσμών, παρά το γεγονός ότι αυξάνονται τα ρυθμιστικά κύτταρα. Σημαντικό εύρημα αποτελεί ο δείκτης ενεργοποίηση HLA-DR όπου βρίσκεται σημαντικά αυξημένος μετά 82

84 το χειρουργείο μόνο σε αυτή την ομάδα των ασθενών και υποδηλώνει ενεργοποίηση του ανοσοποιητικού συστήματος των ασθενών. Στην συνέχεια (πίνακας ) παρουσιάζονται τα αποτελέσματα των φαινοτυπίσεων των μη-μεταγγισμένων ασθενών πριν και μετά το χειρουργείο. Οι μημεταγγισμένοι ασθενείς παρουσιάζουν σημαντική μείωση των λεμφοκυττάρων αλλά και των CD3 + χωρίς ωστόσο να διαταράσσεται κανένας άλλος κυτταρικός πληθυσμός. Πίνακας Παρουσίαση αποτελεσμάτων κυτταρικών πληθυσμών σε μημεταγγισμένους ασθενείς, πριν και μετά το χειρουργείο. Αριθμός Ασθενών n=9 Mean ± SEM n=4 Mean ± SEM Κυτταρικός Τύπος Πριν (BS) Μετά (AS) Σ.Σ.Δ. Lymphocytes + 31,47±1,08 14,08±2,76 ΝΑΙ (+++) CD3 + 48,23±3 21,22±4,7 ΝΑΙ (+++) CD3 + CD4 + 62,04±3,25 69,31±2,99 ΟΧΙ (-) CD3 + CD8 + 28,44±3,46 20,06±3,67 ΟΧΙ (-) CD3 + CD4 + CD45RA + 50,22±3,82 59,02±8,89 ΟΧΙ (-) CD3 + CD4 + CD45RO + 33,09±3,16 31,81±1,05 ΟΧΙ (-) CD3 + CD8 + CD45RA + 55,10±4,5 68,43±7,98 ΟΧΙ (-) CD3 + CD8 + CD45RO + 13,30±1,99 17,22±3,06 ΟΧΙ (-) CD3 + CD4 + HLA-DR + 3,667±0,35 4,697±0,34 ΟΧΙ (-) CD3 + CD8 + HLA-DR + 4,310±0,66 4,084±0,33 ΟΧΙ (-) Τέλος, στον παρακάτω πίνακα (πίνακας ) ακολούθησε η σύγκριση των αποτελεσμάτων των μεταγγισμένων και μη-μεταγγισμένων ασθενών την χρονική στιγμή μετά το χειρουργείο, χωρίς να υπάρξουν σημαντικές διαφορές μεταξύ των δυο ομάδων. 83

85 Πίνακας Παρουσίαση αποτελεσμάτων κυτταρικών πληθυσμών σε μεταγγισμένους και μη-μεταγγισμένους ασθενείς μετά το χειρουργείο. Αριθμός Ασθενών n=5 Mean ± SEM n=4 Mean ± SEM Κυτταρικός Τύπος Μεταγγισμένοι Μη-μεταγγισμένοι Σ.Σ.Δ. Lymphocytes + 19,8±3,025 14,08±2,76 ΟΧΙ (-) CD3 + 40,28±2,7 21,22±4,7 ΟΧΙ (-) CD3 + CD4 + 54,35±3,84 69,31±2,99 ΝΑΙ (+) CD3 + CD8 + 37,48±3,49 20,06±3,67 ΝΑΙ (+) CD3 + CD4 + CD45RA + 38,61±4,4 59,02±8,89 ΟΧΙ (-) CD3 + CD4 + CD45RO + 38,56±2,5 31,81±1,05 ΟΧΙ (-) CD3 + CD8 + CD45RA + 50,77±4,7 68,43±7,98 ΟΧΙ (-) CD3 + CD8 + CD45RO + 13,46±2,26 17,22±3,06 ΟΧΙ (-) CD3 + CD4 + HLA-DR + 7,308±0,77 4,697±0,34 ΟΧΙ (-) CD3 + CD8 + HLA-DR + 9,476±1,89 4,084±0,33 ΟΧΙ (-) 84

86 Λειτουργικότητα των Tregs μετά την μετάγγιση Η ιδιαίτερη αύξηση των ρυθμιστικών πληθυσμών στους μεταγγισμένους και όχι στους μη μεταγγισμένους ασθενείς, εγείρει το ερώτημα της λειτουργικότητας αλλά και της δραστικότητας αυτών των πληθυσμών. Οπότε, ο έλεγχος της λειτουργικότητας των κυττάρων προσδιορίστηκε έμμεσα μέσω της αναστολής του πολλαπλασιασμού των δραστικών κυττάρων σε δείγματα ολικού αίματος. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν αρχικά σε υγιείς δότες και στην συνέχεια σε μημεταγγισμένους αλλά και μεταγγισμένους ασθενείς. Τα δείγματα των ασθενών λήφθησαν κατά την πρώτη μετεγχειρητική εβδομάδα (ιδιαίτερα την δεύτερη μετεγχειρητική μέρα), τα PBMC s απομονώθηκαν όπως περιγράφονται παραπάνω και από αυτά τα CD4 + CD25 - effector κύτταρα με τα CD4 + CD25 + του ίδιου ασθενή, καλλιεργήθηκαν παρουσία CSFE ±ΡΗΑ για 72 ώρες. Η λειτουργικότητα των ρυθμιστικών κυττάρων ελέχθηκε χρησιμοποιώντας διαφορετικούς λόγους ρυθμιστικών κυττάρων: δραστικών και ως σημεία ελέγχου του πειράματος χρησιμοποιήθηκαν δραστικά κύτταρα μόνα τους παρουσία και απουσία μιτογονικών ερεθισμάτων. Οι λόγοι Treg:Teff που χρησιμοποιήθηκαν ήταν οι 1:1, 1:2, 1:4, 1:8 όπως φαίνονται και στο παρακάτω διάγραμμα (εικόνα ). Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως στήλες όπου η κάθε μια αφορά σε τρία ανεξάρτητα πειράματα. Η χρήση της ουσίας CSFE ήταν αυτή που επέτρεψε την ανίχνευση του πολλαπλασιασμού των δραστικών κυττάρων ± ρυθμιστικών και ως σημείο μηδενικής καταστολής του πολλαπλασιασμού χρησιμοποιήθηκε το σημείο όπου είχαν τοποθετηθεί τα δραστικά κύτταρα μόνα τους ±ΡΗΑ (Teff+ PHA (0:1)). Στην παρακάτω εικόνα φαίνεται η αναστολή του πολλαπλασιασμού που προκαλείται από τα ρυθμιστικά κύτταρα. Ο τρόπος αναστολής του πολλαπλασιασμού είναι ανάλογος και στις δυο κατηγορίες των ασθενών και ανάλογος με τον αριθμό των ρυθμιστικών κυττάρων. Έτσι, ισχυρότερη αναστολή του πολλαπλασιασμού των δραστικών κυττάρων παρατηρείται όταν ο αριθμός των Tregs είναι ίδιος με τον αριθμό των Teffs, ενώ αυξάνεται ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων όσο αυξάνονται και τα δραστικά κύτταρα στην καλλιέργεια. Σημαντικό εύρημα αυτού του πειράματος αποτελεί ότι παρ όλο που οι καλλιέργειες των μεταγγισμένων και μη-μεταγγισμένων ασθενών παρουσιάζουν ίδιο πρότυπο, τα ρυθμιστικά κύτταρα των μεταγγισμένων ασθενών φαίνεται να 85

87 καταστέλλουν ισχυρότερα τον πολλαπλασιασμό των δραστικών κυττάρων στις ίδιες συνθήκες, ακόμα και παρουσία μικρότερου αριθμού ρυθμιστικών κυττάρων. Έτσι, για τους μη-μεταγγισμένους ασθενείς παρατηρείται ότι η αναστολή του πολλαπλασιασμού των Teffs στον λόγο 1:1 είναι σε ποσοστό 65,5%, και μειώνεται όσο αυξάνονται τα Teffs στην καλλιέργεια σε 55,4% στο σημείο 1:2, σε ποσοστό 36,77% στο σημείο 1:4 και φτάνει το ποσοστό 31,67% στο τελευταίο σημείο 1:8. Ενώ για τους μεταγγισμένους ασθενείς παρατηρείται ότι η αναστολή του πολλαπλασιασμού των Teffs στον λόγο 1:1 είναι σε ποσοστό 86,4% και μειώνεται όσο αυξάνονται τα Teffs στην καλλιέργεια σε 74,8% στο σημείο 1:2, σε ποσοστό 67% στο σημείο 1:4 και φτάνει το ποσοστό 58,4% στο τελευταίο σημείο 1: Παρουσίαση αποτελεσμάτων των πειραμάτων λειτουργικότητας των ρυθμιστικών κυττάρων σε διαφορετικούς λόγους για τους μεταγγισμένους και μη-μεταγγισμένους ασθενείς. 86

88 15. Ανάλυση κυτταροκινών Στα δείγματα ασθενών ακολουθεί φυγοκέντρηση 2500rpm, 5min, απομάκρυνση του πλάσματος και αποθήκευση στους C. Αργότερα, ακολουθεί προσδιορισμός συγκεντρώσεων των κυτταροκινών στο πλάσμα του αίματος με τις μεθόδους, CBA και ELISA. Οι κυτταροκίνες IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, TNF-α και IFN-γ προσδιορίστηκαν με την μέθοδο CBA ενώ οι TGF-β1, TGF-β2 και οι υποδοχείς του TNF-α, TNF-RI(p55/p60) και TNF-RII(p75/p80) προσδιορίστηκαν με την μέθοδο ELISA. Τα επίπεδα των μορίων δίνονται συνήθως σε pg/ml. Παράλληλα, μετά το χειρουργείο ακολουθεί συλλογή του ασκού αίματος και προσεκτική τοποθέτηση του αίματος σε falcon. Ακολουθεί φυγοκέντρηση 2500rpm, 5min, απομάκρυνση του πλάσματος και αποθήκευση στους C για προσδιορισμό των συγκεντρώσεων των κυτταροκινών στον ορό του αίματος και αποθήκευση του ασκού. Τα αποτελέσματα δίνονται παρακάτω σε μορφή διαγραμμάτων για τις χρονικές στιγμές της μελέτης για τις δυο ομάδες ασθενών. Σημαντικές μεταβολές παρατηρήθηκαν στις κυτταροκίνες IL-6 και TGF-β1 καθώς και στους υποδοχείς του TNF-α, TNF-RI(p55/p60) και TNF-RII(p75/p80). Για τις υπόλοιπες κυτταροκίνες παρατηρήθηκαν χαμηλές συγκεντρώσεις σε όλη την διάρκεια της μελέτης. Στα παρακάτω διαγράμματα παρατίθενται αναλυτικά τα αποτελέσματα των συγκεντρώσεων των κυτταροκινών, και η μεταβολή τους στις διάφορες χρονικές στιγμές της μελέτης. Για την στατιστική ανάλυση των δειγμάτων χρησιμοποιήθηκε το πρόγραμμα GraphPad Prism 5.0 και η σύγκριση των αποτελεσμάτων πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφεται παραπάνω Η μεταβολή της IL-6. Ο προσδιορισμός της IL-6 έγινε με την μέθοδο CBA με το πρόγραμμα BD Facs Array Sortware, περαιτέρω ανάλυση πραγματοποιήθηκε με το πρόγραμμα FlowJo και η συγκέντρωση της κυτταροκίνης υπολογίστηκε σε pg/ml μέσω του προγράμματος CurveExpert. 87

89 Η IL-6 παρατηρήθηκε ιδιαίτερα αυξημένη και στις δυο ομάδες ασθενών, αμέσως μετά το χειρουργείο και τις πρώτες δυο μετεγχειρητικές ημέρες (days0-2) ενώ από την τρίτη μετεγχειρητική μέρα και μέχρι το τέλος της μελέτης μειώθηκε σημαντικά χωρίς ωστόσο να έχει πλησιάσει τα πριν το χειρουργείο (BS) επίπεδα που ήταν 2,6pg/ml. Παρόλο που η μέγιστη συγκέντρωση της κυτταροκίνης παρατηρήθηκε και για τις δύο ομάδες την πρώτη μετεγχειρητική μέρα (day1), τα επίπεδα της IL-6 παρέμειναν ιδιαίτερα αυξημένα σε όλες τις χρονικές στιγμές της μελέτης. Εικόνα Αποτελέσματα των συγκεντρώσεων της IL-6 σε μεταγγισμένους (διάγραμμα αριστερά) και μη-μεταγγισμένους (διάγραμμα δεξιά) ασθενείς, τις πρώτες μετεγχειρητικές μέρες. Για τους μη-μεταγγισμένους ασθενείς (διάγραμμα δεξιά), αμέσως μετά το χειρουργείο (day0) τα επίπεδα της IL-6 ήταν 45,8pg/ml και περαιτέρω αύξηση παρατηρήθηκε την επόμενη μέρα σε 103pg/ml (day1). Την δεύτερη μετεγχειρητική μέρα μειώθηκαν σε 66,5pg/ml (day2) ενώ την επόμενη μέρα (day3) τα επίπεδα της IL-6 ήταν 26,8pg/ml και την day4 τα επίπεδα μειώθηκαν περαιτέρω στα 6,55pg/ml. Για τους μεταγγισμένους ασθενείς (διάγραμμα αριστερά), αμέσως μετά το χειρουργείο (day0) τα επίπεδα της IL-6 ήταν 63,32pg/ml και περαιτέρω αύξηση παρατηρήθηκε την επόμενη μέρα σε 80,45pg/ml (day1). Την δεύτερη μετεγχειρητική μέρα (day2) η συγκέντρωση της κυτταροκίνης ήταν 54,75pg/ml και την τρίτη μέρα ήταν 22,7pg/ml. Την τέταρτη μέρα ήταν 16,75pg/ml ενώ την πρώτη μετεγχειρητική εβδομάδα τα επίπεδα της IL-6 ήταν 6,35pg/ml. 88

90 Εικόνα Αποτελέσματα των συγκεντρώσεων της IL-6 σε μεταγγισμένους και μημεταγγισμένους ασθενείς. Στο παραπάνω διάγραμμα παρουσιάζεται η συγκέντρωση της IL-6 σε όλη την διάρκεια της μελέτης. Με πράσινο χρώμα φαίνονται τα αποτελέσματα των μεταγγισμένων και με πορτοκαλί παρουσιάζονται τα αποτελέσματα των μημεταγγισμένων ασθενών. Ένα μήνα μετά το χειρουργείο στους ασθενείς που μεταγγίστηκαν κατά την διάρκειά του, ανιχνεύθηκαν τα επίπεδα της IL-6 σε 5,07pg/ml και στην τελευταία επίσκεψη των ασθενών ήταν στα 10,15pg/ml. 89

91 15.2. Η μεταβολή των υποδοχέων TNF-RI και TNF-RII. Ο παράγοντας νέκρωσης όγκου-α (Tumor Necrosis Factor-α/TNF-α) ανήκει στην κατηγορία των προφλεγμονωδών κυτταροκινών, αύξηση των οποίων οδηγεί σε κυτταρο-διαμεσολαβούμενη ανοσολογική απόκριση. Η ενεργοποίηση μοριακού μονοπατιού του παράγοντα TNF-α (όπως περιγράφεται στην εικόνα 8.2.1) απαιτεί την σύνδεση με τους υποδοχείς του, TNFRI(p55/p60) ή TNFRII(p75/80). Η σύνδεση με τον υποδοχέα TNFRI(p55/p60) οδηγεί κυρίως σε απόπτωση ενώ η σύνδεση με τον υποδοχέα TNFRII(p75/80), ο οποίος εκφράζεται σε διάφορους κυτταρικούς τύπους όπως τα ρυθμιστικά κύτταρα και άλλους, σχετίζεται με την επιβίωση των κυττάρων μέσω του μοριακού μονοπατιού του NF-κΒ (Faustman and Davis, 2013). Εικόνα Τα ενδοκυττάρια μονοπάτια σηματοδότησης των υποδοχέων του TNF-α. Ο προσδιορισμός της συγκέντρωσης του παράγοντα TNF-α στο πλάσμα των ασθενών έγινε με την μέθοδο CBA και τα αποτελέσματα φαίνονται στο γράφημα παρακάτω. Η συγκέντρωση του TNF-α δεν ξεπέρασε σε καμία χρονική στιγμή της μελέτης τα 5,5pg/ml, τιμές πολύ χαμηλές και για τις δυο ομάδες των ασθενών, με την συγκέντρωση του παράγοντα πριν το χειρουργείο (BS) να ανιχνεύεται στα 2,6pg/ml. Πιο συγκεκριμένα, η συγκέντρωση του TNF-α στους μη μεταγγισμένους ασθενείς ανιχνεύτηκε αμέσως μετά το χειρουργείο (day0) στα 2,4pg/ml και αυξήθηκε στα 4,6pg/ml την επόμενη μέρα (day1) ενώ για κάθε άλλη χρονική στιγμή η συγκέντρωση του TNF-α ήταν στα BS επίπεδα ή και πιο κάτω. Για τους μεταγγισμένους ασθενείς, η συγκέντρωση του TNF-α ανιχνεύτηκε στα 5,4pg/ml αμέσως μετά το χειρουργείο (day0) και στα 4pg/ml την επόμενη μέρα (day1), ενώ για 90

92 κάθε άλλη χρονική στιγμή η συγκέντρωση του TNF-α ήταν στα BS επίπεδα ή και πιο κάτω. Εικόνα Στο γράφημα παρουσιάζονται τα αποτελέσματα του παράγοντα TNF-α στους μεταγγισμένους και μη-μεταγγισμένους ασθενείς. Με βάση τα παραπάνω οι χαμηλές συγκεντρώσεις του TNF-α μπορεί να οφείλονται είτε στην απουσία της κυτταροκίνης από το πλάσμα των ασθενών, είτε στην πρόσδεση του μορίου στους υποδοχείς του ώστε να ενεργοποιηθεί το μοριακό μονοπάτι και να επαχθεί η μεταγραφή γονιδίων μεταξύ των οποίων και της IL-6. Έτσι, προσδιορίστηκαν οι υποδοχείς TNFRI(p55/p60) και TNFRII(p75/80) με την μέθοδο της ELISA για τις χρονικές στιγμές της μελέτης. Εικόνα : Παρουσίαση αποτελεσμάτων του υποδοχέα TNF-RI(p55/p60). 91

93 Τα επίπεδα του υποδοχέα TNF-RI(p55/p60) την χρονική στιγμή πριν το χειρουργείο (BS) ήταν 828,6pg/ml. Αμέσως μετά το χειρουργείο (day0) τα επίπεδα του υποδοχέα στους μη-μεταγγισμένους ασθενείς εντοπίστηκαν στα 734,2pg/ml ενώ στους μεταγγισμένους ασθενείς παρατηρήθηκε σημαντική αύξηση στα 2123pg/ml. Στο τέλος της πρώτης μετεγχειρητικής εβδομάδας τα επίπεδα του υποδοχέα στους μεταγγισμένους ασθενείς ήταν στα 1510pg/ml και μειώνονταν σταδιακά τον πρώτο μήνα στα 1376,25pg/ml και στην τελευταία επίσκεψη των ασθενών στα 1020,25pg/ml. Εικόνα : Παρουσίαση συγκεντρώσεων του υποδοχέα TNF-RII(p75/p80). Η συγκέντρωση του υποδοχέα TNF-RII(p75/p80) βρέθηκε αυξημένη (σχεδόν σε διπλάσια συγκέντρωση) σε όλες τις χρονικές στιγμές της μελέτης συγκριτικά με τον υποδοχέα TNF-RI(p55/p60), ωστόσο το πρότυπο έκφρασης των πρωτεϊνών παρουσιάζει κάποιες ομοιότητες. Πριν το χειρουργείο τα επίπεδα του υποδοχέα TNF- RII(p75/p80) ανιχνεύτηκαν στα 1897,34pg/ml. Αμέσως μετά το χειρουργείο (day0) στους μη-μεταγγισμένους ασθενείς η συγκέντρωση του υποδοχέα ανιχνεύτηκε στα 1762,02pg/ml, χωρίς ιδιαίτερες μεταβολές συγκριτικά με την χρονική στιγμή BS (ομοίως με τον υποδοχέα TNF-RI(p55/p60)) ενώ στους μεταγγισμένους ασθενείς παρατηρήθηκε σημαντική αύξηση στα 2806pg/ml και στα 3477,17pg/ml την πρώτη μετεγχειρητική εβδομάδα (day7). Στην συνέχεια, μικρή μείωση παρατηρήθηκε στις υπόλοιπες χρονικές στιγμές της μελέτης καθώς στον πρώτο μήνα μετά την μετάγγιση ο TNF-RII(p75/p80) ανιχνεύτηκε στα 2939pg/ml και στην τελευταία επίσκεψη των ασθενών ανιχνεύτηκε στα 2480,74pg/ml. Από την πρώτη μετεγχειρητική εβδομάδα 92

94 και έπειτα το μοτίβο έκφρασης των δυο υποδοχέων του TNF-α διαφοροποιείται με την συγκέντρωση του υποδοχέα TNF-RI(p55/p60) να μειώνεται και να πλησιάζει τα πριν το χειρουργείο επίπεδα μέχρι την τελευταία επίσκεψη των ασθενών. Αντίθετα, η συγκέντρωση του υποδοχέα TNF-RII(p75/p80) αυξάνεται περαιτέρω την day7 και μειώνεται μετά χωρίς να πλησιάζει τα BS επίπεδα ακόμα και μετά την τελευταία επίσκεψη των ασθενών. Τα παραπάνω ευρήματα μπορεί να οφείλονται στον διαφορετικό τρόπο ενεργοποίησης των υποδοχέων καθώς ο TNF-RI(p55/p60) ενεργοποιείται αποκλειστικά από τον TNF-α ενώ ο υποδοχέας TNF-RII(p75/p80) ενεργοποιείται τόσο από τον TNF-α όσο και από τον TNF-β (του οποίου τα επίπεδα δεν έχουν προσδιοριστεί στην παρούσα μελέτη) Η μεταβολή στις συγκεντρώσεις των μορίων της οικογένειας των αυξητικών παραγόντων Transforming Growth Factor /TGF. Στα μέλη της οικογενείας των transforming growth factors ανήκουν τα μέλη TGF-β1, TGF-β2 και TGF-β3. Χαρακτηρίζονται ως πολύ-λειτουργικά πεπτίδια τα οποία ρυθμίζουν τον πολλαπλασιασμό, την διαφοροποίηση, προσκόλληση, μετανάστευση και άλλες λειτουργίες σε πολλούς κυτταρικούς τύπους. Πολλά κύτταρα φέρουν τους υποδοχείς του TGF-β οι οποίοι ρυθμίζουν θετικά ή αρνητικά πολλούς άλλους παράγοντες Η μεταβολή των συγκεντρώσεων του TGF-β1. Ο Transforming Growth Factor-β1/TGF-β1 ανήκει στις κυτταροκίνες με ανοσοκατασταλτικές ιδιότητες. Εκκρίνεται από τα ρυθμιστικά κύτταρα, ενισχύει την ρυθμιστική τους δράση, συντηρεί την έκφραση του μεταγραφικού παράγοντα Foxp3 χωρίς να απαιτείται για την τελική τους διαφοροποίηση στον θύμο (Marie et al., 2005). Η πρόδρομη μορφή του παράγοντα TGF-β1 ωριμάζει σε latency-associated peptide (LAP) και τον ώριμο TGF-β1, τα οποία μπορούν να σχηματίσουν ετερο- και ομοδιμερή μόνα τους ή μεταξύ τους ή με άλλα μέλη της οικογένειας ( 93

95 Ο προσδιορισμός της συγκέντρωσης του TGF-β1 έγινε με την μέθοδο της ELISA για τις χρονικές στιγμές της μελέτης, και για τις δυο ομάδες των ασθενών. Πριν το χειρουργείο (BS) η συγκέντρωση του TGF-β1 ήταν ,6pg/ml και αμέσως μετά το χειρουργείο (day0) παρατηρήθηκε μείωση και στις δυο ομάδες των ασθενών. Πιο συγκεκριμένα, στους μη-μεταγγισμένους ασθενείς η συγκέντρωση του TGF-β1 ήταν ,6pg/ml ενώ στους μεταγγισμένους ασθενείς παρατηρήθηκε σημαντική μείωση σε ,6pg/ml μείωση. Την πρώτη μετεγχειρητική εβδομάδα τα επίπεδα της κυτταροκίνης, έφτασαν περίπου τα BS επίπεδα, στα ,7pg/ml στους μεταγγισμένους ασθενείς ενώ τον πρώτο μετεγχειρητικό μήνα παρατηρήθηκε μείωση στα ,2pg/ml και στην τελευταία επίσκεψη των ασθενών ήταν ,2pg/ml. Εικόνα Η μεταβολή στην συγκέντρωση του TGF-β1 κατά την διάρκεια της μελέτης Η μεταβολή των συγκεντρώσεων του TGF-β2. Επιπλέον προσδιορίστηκε ένα ακόμα μέλος της οικογένειας των TGF και πιο συγκεκριμένα προσδιορίστηκε η συγκέντρωση του TGF-β2 με την μέθοδο της ELISA για τις χρονικές στιγμές της μελέτης και τις δυο ομάδες των ασθενών. Ο παράγοντας TGF-β2 ανιχνεύτηκε σε όλες τις χρονικές στιγμές της μελέτης σε χαμηλότερες συγκεντρώσεις συγκριτικά με τον παράγοντα TGF-β1, ωστόσο εμφάνισε μεγαλύτερη διακύμανση στις τιμές οπότε δεν φάνηκε σημαντική διαφορά μεταξύ των χρονικών στιγμών. Πριν το χειρουργείο (BS) τα επίπεδα του TGF-β2 94

96 ανιχνεύτηκαν στα 2.140,99pg/ml ενώ στην συνέχεια το πρότυπο έκφρασης είναι όμοιο με το πρότυπο έκφρασης των ρυθμιστικών κυτταρικών πληθυσμών. Έτσι, στα δείγματα των μη-μεταγγισμένων ασθενών αμέσως μετά το χειρουργείο (day0) η συγκέντρωση του TGF-β2 ήταν μειωμένη στα 847,15pg/ml ενώ αντίθετα, στα δείγματα των μεταγγισμένων ασθενών την χρονική στιγμή day0 η συγκέντρωση του TGF-β2 παρατηρήθηκε αυξημένη στα 3382,54pg/ml. Στο τέλος της πρώτης μετεγχειρητικής εβδομάδας (day7) η συγκέντρωση του TGF-β2 στους μεταγγισμένους ασθενείς μειώθηκε περίπου στα BS επίπεδα (2.528,57pg/ml) για να ανιχνευθεί ξανά αυξημένη ένα μήνα μετά την μετάγγιση στα 3.659,52pg/ml, ενώ ιδιαίτερα μειωμένη ήταν η συγκέντρωση της κυτταροκίνης στην τελευταία επίσκεψη των μεταγγισμένων ασθενών. Στην εικόνα φαίνονται διαγραμματικά τα αποτελέσματα των ασθενών για όλες τις χρονικές στιγμές της μελέτης. Εικόνα Η μεταβολή στην συγκέντρωση του TGF-β2 κατά την διάρκεια της μελέτης Η μεταβολή των συγκεντρώσεων των υπολοίπων κυτταροκινών. Στην συνέχεια προσδιορίστηκαν οι συγκεντρώσεις και άλλων κυτταροκινών, πιο συγκεκριμένα των IL-2, IL-4, IL-10 και IFN-γ, για τις χρονικές στιγμές της μελέτης και τις δυο ομάδες των ασθενών. Στις παραπάνω κυτταροκίνες ανιχνεύτηκαν (εκτός από την IL-2) ιδιαίτερα χαμηλές συγκεντρώσεις κάτω από 3pg/ml σε όλες τις χρονικές στιγμές και δεν παρατηρήθηκαν στατιστικώς σημαντικές μεταβολές μεταξύ των χρονικών στιγμών ή των δυο ομάδων των ασθενών. Τα αποτελέσματα φαίνονται στα παρακάτω διαγράμματα. 95

97 Η μεταβολή των συγκεντρώσεων της κυτταροκίνης IL-2 (Th0). Το έναυσμα της ανοσολογικής απόκρισης έναντι αντιγόνου κατά την κυτταρική ανοσία δίνεται όταν ένα παρθενικό CD4 + κύτταρο ενεργοποιείται, εκκρίνει την κυτταροκίνη IL-2 και τον υποδοχέα της και μετατρέπεται σε ενεργοποιημένο CD4 + κύτταρο. Η κυτταροκίνη IL-2 επάγει τον πολλαπλασιασμό συγκεκριμένων κλώνων μέσω του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και αντιαποπτωτικών μηχανισμών. Επάγει την έκκριση άλλων κυτταροκινών και διαφοροποιεί τα κύτταρα προς Th1 ή Th2 κυτταρικό τύπο. Επίσης, επάγει την απόπτωση των κυττάρων μέσω της Fas/FasL σηματοδότησης καθώς και την ανάπτυξη των ρυθμιστικών κυττάρων (Gaffen and Liu, 2004). Εικόνα Απεικόνιση των αποτελεσμάτων των συγκεντρώσεων της IL-2 στις χρονικές στιγμές της μελέτης, στους μεταγγισμένους και μη- ασθενείς. Πριν το χειρουργείο η συγκέντρωση της κυτταροκίνης IL-2 ήταν στα 10,5pg/ml και δεν φάνηκε ιδιαίτερα αυξημένη (πάνω από 19pg/ml) σε καμία χρονική στιγμή της μελέτης. Στους μη μεταγγισμένους ασθενείς, η συγκέντρωση της IL-2 αυξήθηκε αμέσως μετά το χειρουργείο (day0) στα 18,38pg/ml ενώ μειώθηκε σταδιακά την πρώτη μετεγχειρητική μέρα (day1) στα 12pg/ml και την δεύτερη και την τρίτη μετεγχειρητική μέρα ανιχνεύτηκε στα πριν το χειρουργείο επίπεδα, 10,6pg/ml και 10,8pg/ml, αντίστοιχα. Στους μεταγγισμένους ασθενείς, η συγκέντρωση της IL-2 δεν αυξήθηκε αμέσως μετά το χειρουργείο καθώς ανιχνεύτηκε στα 11,18pg/ml την day0 και τα επίπεδά της παρέμειναν πολύ χαμηλά (<5pg/ml) μέχρι και τον πρώτο μήνα μετά το χειρουργείο, μετά την μετάγγιση, όπου τα επίπεδα 96

98 της IL-2 ήταν 14,91pg/ml. Στην τελευταία επίσκεψη των μεταγγισμένων ασθενών, η συγκέντρωση της IL-2 ανιχνεύτηκε στα 18,85pg/ml Η μεταβολή των συγκεντρώσεων της κυτταροκίνης IFN-γ (Th1). Η ιντρεφερόνη-γ (IFN-γ) ανήκει στην οικογένεια των ιντερφερονών ενώ είναι το μοναδικό μέλος που ταξινομείται στον τύπο ΙΙ. Δομικά διαφέρει από τα υπόλοιπα μέλη της οικογένειας και εκκρίνεται από πολλούς κυτταρικούς τύπους αλλά κυρίως από τα CD4+ Τ κύτταρα τύπου 1 (Th1). Είναι υπεύθυνη για την ενεργοποίηση των μακροφάγων, την προσέλκυση των λευκοκυττάρων στο σημείο, στην κυτταρική ανάπτυξη, ωρίμανση και την διαφοροποίηση πολλών κυτταρικών τύπων και άλλα (Schroder et al., 2004). Ανιχνεύτηκε στα δείγματα των ασθενών με την μέθοδο CBA ενώ η συγκέντρωσή της ήταν πολύ χαμηλή και στις δυο ομάδες των ασθενών χωρίς να ξεπεράσει τα 3pg/ml. Εικόνα Παρουσίαση των συγκεντρώσεων της IFN-γ κατά την διάρκεια της μελέτης. 97

99 Η μεταβολή των συγκεντρώσεων της κυτταροκίνης IL-4 (Th2). Η IL-4 εκκρίνεται κυρίως από τα διαφοροποιημένα Th2 κύτταρα και επάγει κυρίως την αντιφλεγμονώδη δράση. Οι συγκεντρώσεις της παρούσας κυτταροκίνης ανιχνεύτηκαν ιδιαίτερα χαμηλές, τιμές κάτω από 3pg/ml, σε όλες τις χρονικές στιγμές της μελέτης και στις δυο ομάδες των ασθενών. Εικόνα Παρουσίαση αποτελεσμάτων των συγκεντρώσεων της IL-4 σε μεταγγισμένους και μη-μεταγγισμένους ασθενείς Η μεταβολή των συγκεντρώσεων της κυτταροκίνης IL-10 (Tr1). Η ιντερλευκίνη-10 (IL-10) είναι μια πολύ καλά χαρακτηρισμένη κυτταροκίνη, η οποία συνδυάζει τα στοιχεία των αντιφλεγμονωδών κυτταροκινών με κατασταλτικές ιδιότητες. Έχει διττό τρόπο δράσης στα ρυθμιστικά κύτταρα καθώς μπορεί να δρα είτε αυτοκρινώς είτε παρακρινώς (Pierson and Liston, 2010). Ωστόσο, στην παρούσα εργασία οι συγκεντρώσεις της IL-10 είναι (όπως και στις παραπάνω κυτταροκίνες) ιδιαίτερα χαμηλές σε όλες τις χρονικές στιγμές της μελέτης. Σε καμία χρονική στιγμή δεν ξεπέρασαν τα 3pg/ml. 98

100 Εικόνα Παρουσίαση αποτελεσμάτων των συγκεντρώσεων της IL-10 σε μεταγγισμένους και μη-μεταγγισμένους ασθενείς Προσδιορισμός των συγκεντρώσεων των κυτταροκινών στους ασκούς των ασθενών. Με την ίδια τεχνική (με την μέθοδο CBA) προσδιορίστηκαν οι συγκεντρώσεις των κυτταροκινών IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNF-α και IFN-γ στα υπερκείμενα του αίματος που συλλέχθησαν από τους ασκούς. Οι συγκεντρώσεις των κυτταροκινών που ανιχνεύτηκαν ήταν πολύ χαμηλές, τιμές κάτω από 3pg/ml, για όλες τις κυτταροκίνες. Αυτό μας οδηγεί στο συμπέρασμα ότι οι μεταβολή που παρατηρείται στις κυτταροκίνες αμέσως μετά το χειρουργείο, μετά την μετάγγιση είναι απόκριση του ανοσοποιητικού συστήματος των ασθενών και όχι μορίων που εισήλθαν στο σώμα μέσω της μετάγγισης. 99

101 16. Διάρκεια νοσηλείας, καταγραφή θερμοκρασίας σώματος και μετεγχειρητικές επιπλοκές. Τέλος, καταγράφηκαν και αξιολογήθηκαν η διάρκεια νοσηλείας πριν το εξιτήριο και η θερμοκρασίας σώματος κάθε ασθενούς. Οι ιατρικοί φάκελοι των ασθενών εκτιμήθηκαν λεπτομερώς και καταγράφηκαν αναλυτικά όλες οι διεγχειρητικές και μετεγχειρητικές επιπλοκές, οι οποίες κατηγοριοποιήθηκαν για τον σκοπό της μελέτης σε εμπύρετο χωρίς ανάδειξη εστίας λοίμωξης κατά τη διερεύνηση, σε μη λοιμώδεις επιπλοκές και σε λοιμώδεις επιπλοκές Διάρκεια νοσηλείας. Όπως φαίνεται και στην εικόνα οι μεταγγισμένοι ασθενείς παρέμειναν στο νοσοκομείο περισσότερες μέρες συγκριτικά με τους μη-μεταγγισμένους. Πιο συγκεκριμένα, οι μη-μεταγγισμένοι ασθενείς παρέμειναν για 7,85±1,7μέρες ενώ οι μεταγγισμένοι ασθενείς παρέμειναν για 11,7±3,5μέρες. Η ανάλυση των αποτελεσμάτων έγινε με το στατιστικό πρόγραμμα GraphPad Prism και για την σύγκριση των δυο χρησιμοποιήθηκε t-test. Οι ασθενείς έλαβαν εξιτήριο για το σπίτι ή κάποιο κέντρο αποθεραπείας με βάση την αξιολόγηση από το θεράποντα χειρουργό σε συνδυασμό με την ομάδα φυσιοθεραπείας και στη συνέχεια ακολούθησαν τακτικό έλεγχο παρακολούθησης στα εξωτερικά ιατρεία για τουλάχιστον 1 έτος μετεγχειρητικά. Εικόνα Διάρκεια νοσηλεία των μη-μεταγγισμένων και μεταγγισμένων ασθενών. 100

102 16.2. Καταγραφή θερμοκρασίας σώματος. Η καταγραφή της θερμοκρασίας σώματος κάθε ασθενούς σε θερμομετρικό διάγραμμα πραγματοποιήθηκε ως έλεγχος ρουτίνας, τρεις φορές την ημέρα και για κάθε ημερολογιακή ημέρα μέχρι το εξιτήριο. Έτσι, δημιουργήθηκε το παρακάτω διάγραμμα θερμοκρασίας σε σχέση με την διάρκεια της νοσηλείας των ασθενών (εικόνα 16.2). Εικόνα Θερμομετρικό διάγραμμα ασθενών κατά την διάρκεια της νοσηλείας. Για την δημιουργία του παραπάνω διαγράμματος χρησιμοποιήθηκαν οι μέγιστες τιμές της θερμοκρασίας των ασθενών καθημερινά, ορίζοντας ως χρονική στιγμή πριν το χειρουργείο (BS), τις θερμομετρικές πληροφορίες που κατεγράφησαν το προηγούμενο απόγευμα πριν την επέμβαση. Στο διάγραμμα φαίνονται με πράσινο χρώμα οι καταγεγραμμένες θερμοκρασίες των μη-μεταγγισμένων ασθενών ενώ με κόκκινο φαίνονται αυτές των μεταγγισμένων σε σχέση με τις μέρες παραμονής στο νοσοκομείο. Η μεταβολές της θερμοκρασίας σώματος όλων των ασθενών κυμαινόταν από 36 ο C μέχρι 39 ο C και η μέγιστη θερμοκρασία και για τις δυο ομάδες των ασθενών σημειώθηκε αμέσως μετά το χειρουργείο (day0) και μέχρι την τρίτη μετεγχειρητική μέρα ενώ στην συνέχεια μειώθηκε κοντά στα BS επίπεδα. Οι μεταβολές που παρατηρήθηκαν ήταν στατιστικώς σημαντικές μόνο στους μη-μεταγγισμένους ασθενείς όταν συγκρίθηκαν οι τιμές της πρώτης μετεγχειρητικής μέρας και της τέταρτης και μέχρι το εξιτήριο. Αυτό σημαίνει ότι στους μη-μεταγγισμένους ασθενείς επανήλθε η σωματική θερμοκρασία στα επίπεδα πριν το χειρουργείο μόλις 101

103 την τέταρτη μετεγχειρητική μέρα, έφτασε τα BS επίπεδα και δεν παρατηρήθηκε πάλι αύξηση ενώ οι μεταγγισμένοι ασθενείς είχαν υψηλότερες τιμές θερμοκρασίας σώματος, οι οποίες παρέμειναν υψηλότερες σε όλη την διάρκεια της νοσηλείας τους Μετεγχειρητικές επιπλοκές. Οι μετεγχειρητικές επιπλοκές αξιολογήθηκαν από τους θεράποντες ιατρούς, με την διενέργεια των κατάλληλων εξετάσεων και την εφαρμογή της αντίστοιχης αγωγής εξατομικευμένα για τον κάθε ασθενή και διακρίθηκαν σε εμπύρετο χωρίς ανάδειξη εστίας λοίμωξης κατά τη διερεύνηση, σε μη-λοιμώδεις και σε λοιμώδεις επιπλοκές. Τα αποτελέσματα που αφορούν τους μη-μεταγγισμένους ασθενείς παρουσιάζονται στον πίνακα , τους μεταγγισμένους ασθενείς στον πίνακα και στον πίνακα φαίνεται η σύγκριση των δυο ομάδων των ασθενών Μετεγχειρητικές επιπλοκές στους μη-μεταγγισμένους ασθενείς. Για το σκοπό της μελέτης, ως εμπύρετος ορίστηκε η θερμοκρασίας σώματος 38 C, στις μη-λοιμώδεις επιπλοκές συμπεριλήφθησαν οι διαταραχές πηκτκότητας, εκρροή τραύματος, εν τω βάθει φλεβοθρόμβωση, κνιδωτικό εξάνθημα με φυσαλίδες και βραδυαριθμία ενώ στις λοιμώδεις επιπλοκές εντάχθηκαν οι τύποι των μετεγχειρητικών λοιμώξεων που αντιμετωπίστηκαν με χορήγηση αντιβιοτικής αγωγής. Τέτοιες λοιμώξεις μπορεί να είναι λοιμώξεις ανώτερου ή κατώτερου αναπνευστικού, φλεγμονές ή λοιμώξεις τραύματος, λοιμώξεις του ουροποιητικού συστήματος ή άλλες. Ως λοιμώξεις του ουροποιητικού συστήματος ορίστηκαν οι θετικές για μικροοργανισμούς καλλιέργειες ούρων και ως λοιμώξεις του αναπνευστικού συστήματος ορίστηκαν οι ως επί θετικών ευρημάτων σε ακτινογραφία θώρακος και/ή θετική καλλιέργειες πτυέλων, και στις δυο περιπτώσεις οι επιπλοκές αντιμετωπίστηκαν με χορήγηση αντιβιοτικής αγωγής. Η διάγνωση των λοιμώξεων χειρουργικού τραύματος, επιπολής ή εν τω βάθει, έγινε με βάση τα κριτήρια που προτείνει το Εθνικό Κέντρο Λοιμωδών νοσημάτων Ηνωμένων Πολιτειών Αμερικής (National Center for Infectious Diseases, Centers for Disease Control and Prevention, USA). 102

104 Μη-μεταγγισμένοι Μη Χωρίς Επιπλοκές Εμπύρετος Λοιμώδεις ασθενείς λοιμώδεις επιπλοκές Άνδρες 22,86% 0% 0% 0% 0% 20% Γυναίκες 77,14% 20% 11,43% 8,57% 0% 60% Σύνολο 100% 20% 11,43% 8,57% 0% 80% Πίνακας Παρουσίαση αποτελεσμάτων επιπλοκών των μη-μεταγγισμένων ασθενών. Από το σύνολο των 35 μη-μεταγγισμένων ασθενών που έλαβαν μέρος στην μελέτη, το 22,86% (8/35) ήταν άνδρες ενώ η πλειοψηφία των ασθενών, το 77,14% (27/35) ήταν γυναίκες. Στην πλειοψηφία των ασθενών δεν εμφανίστηκαν επιπλοκές σε ποσοστό 80% (28/35) ενώ οι επιπλοκές αποτέλεσαν μόλις το 20% (7/35) και όλες εμφανίστηκαν σε γυναίκες. Οι άνδρες που πήραν μέρος στην μελέτη, υποβλήθηκαν σε αρθροπλαστική και δεν μεταγγίστηκαν δεν παρουσίασαν καμία επιπλοκή κατά την διάρκεια της παραμονής τους στο νοσοκομείο. Οι επιπλοκές χαρακτηρίστηκαν ως ήπιες και αφορούσαν κυρίως σε εμφάνιση εμπυρέτου χωρίς εστία λοίμωξης μετά το χειρουργείο σε ποσοστό 11,43% (4/35), και άλλες μη λοιμώδεις επιπλοκές σε ποσοστό 8,57% (3/35) ενώ κανένα περιστατικό δεν εμφάνισε επιπλοκή που να αφορούσε σε μόλυνση από μικροοργανισμούς Μετεγχειρητικές επιπλοκές στους μεταγγισμένους ασθενείς. Μεταγγισμένοι Μη Χωρίς Επιπλοκές Εμπύρετος Λοιμώδεις ασθενείς λοιμώδεις επιπλοκές Άντρες 14,82% 11,11% 5,56% 1,85% 3,7% 3,7% Γυναίκες 85,18% 48,15% 20,37% 5,56% 22,22% 37,04% Σύνολο 100% 59,26% 25,92% 7,41% 25,92% 40,74% Πίνακας Παρουσίαση αποτελεσμάτων επιπλοκών των μεταγγισμένων ασθενών. Από το σύνολο των 54 μεταγγισμένων ασθενών, οι 46 ασθενείς (85,18%) ήταν γυναίκες, και οι 8 (14,82%) ήταν άνδρες. Το 40,74%, δηλαδή οι 22 από τους 54 ασθενείς δεν εμφάνισαν επιπλοκές και οι υπόλοιποι 32 (59,26%) εμφάνισαν και τις τρεις κατηγορίες των επιπλοκών. Από το 59,26%, το 48,15% (26/54) ήταν γυναίκες και το 11,11% (6/54) ήταν άνδρες. Εμπύρετο χωρίς εστία λοίμωξης εμφάνισαν οι 14 από τους 54 ασθενείς (25,92%) εκ των οποίων οι 11 ήταν γυναίκες (20,37%) και οι τρεις (5,56%) ήταν άνδρες. Μη λοιμώδεις επιπλοκές εμφάνισαν το 7,41% (4/54), τρεις γυναίκες (5,56%) και ένας άνδρας (1,85%). Ενώ λοιμώδεις επιπλοκές 103

105 εμφανίστηκαν στους 14/54 ασθενείς (25,92%), σε δώδεκα γυναίκες (22,22%) και δυο άνδρες (3,7%) Σύγκριση μετεγχειρητικών επιπλοκών μεταγγισμένων και μημεταγγισμένων ασθενών. Μη Χωρίς Ασθενείς Επιπλοκές Εμπύρετος Λοιμώδεις λοιμώδεις επιπλοκές Μη-μεταγγισμένοι 20% 11,43% 8,57% 0% 80% Μεταγγισμένοι 59,26% 25,92% 7,41% 25,92% 40,74% Πίνακας Σύγκριση μετεγχειρητικών επιπλοκών μη-μεταγγισμένων και μεταγγισμένων ασθενών. Από τον παραπάνω πίνακα (16.2.3) προκύπτει ότι οι μεταγγισμένοι ασθενείς είναι πιο επιρρεπείς σε μετεγχειρητικές επιπλοκές συγκριτικά με τους μη μεταγγισμένους. Πιο συγκεκριμένα, παρατηρήθηκε ότι κανένας από τους μημεταγγισμένους ασθενείς δεν εμφάνισε λοιμώδεις επιπλοκές σε αντίθεση με τους μεταγγισμένους ασθενείς όπου οι 14 από τους 54 εμφάνισαν λοιμώξεις που αντιμετωπίστηκαν με αντιβιοτική αγωγή. 104

106 Συμπεράσματα - Συζήτηση 105

107 17. Συμπεράσματα Το ανοσοποιητικό είναι πολύ δυναμικό σύστημα και επιφορτισμένο να προστατεύει το ανθρώπινο σώμα από «εισβολείς» σε αυτό ώστε να διατηρείται η ισορροπία και η σωστή του λειτουργία. Ο τρόπος με τον οποίο αυτό επιτυγχάνεται είναι πολύπλοκος καθώς εμπλέκει μόρια, κύτταρα, ιστούς και όργανα όπως έχει περιγραφεί παραπάνω. Αν ωστόσο ένας μικροοργανισμός ξεπεράσει τις πρώτες γραμμές άμυνας (φραγμούς και μη ειδική ανοσία) τότε έρχεται σε επαφή με την τελευταία και ειδική γραμμή άμυνας έναντι του κάθε αντιγόνου. Η ενεργοποίηση του ανοσοποιητικού συστήματος ξεκινά από την στιγμή που ένα παρθενικό Τ λεμφοκύτταρο έρχεται σε επαφή με το αντιγόνο μέσω των APCs κυττάρων και εκκρίνει IL-2, τότε τα κύτταρα ενεργοποιούνται και πολλαπλασιάζονται και ενεργοποιούν τους κατάλληλους κυτταρικούς τύπους ένα παράδειγμα αυτού αποτελούν τα Treg τα οποία διαφοροποιούνται παρουσία της IL-2 και TGF-β. Αυτό είναι ένα μοναδικό χαρακτηριστικό για τα κύτταρα και ονομάζεται πλαστικότητα των CD4 + κυττάρων. Με την διαδικασία της μετάγγισης εισέρχονται στο ανθρώπινο σώμα τεράστιος αριθμός αντιγόνων του δότη, κύτταρα και μόρια όπως κυτταροκίνες. Η απόκριση του οργανισμού σε αυτό το ερέθισμα είναι η επαγωγή των ρυθμιστικών κυττάρων και τελικά ανοσοκαταστολής χωρίς ωστόσο να έχει αποσαφηνιστεί ο μηχανισμός μέσω του οποίου γίνεται όλο αυτό. Έτσι, στην παρούσα εργασία έγινε προσπάθεια να γίνει κατανοητός ο μηχανισμός επαγωγής της ανοσοκαταστολής μέσω της πλαστικότητας των CD4 + βοηθητικών κυττάρων. Έτσι, επιλέγησαν ασθενείς οι οποίοι υποβλήθησαν σε προγραμματισμένο χειρουργείο αρθροπλαστικής γόνατος ή ισχίου ή αναθεωρήσεων αυτών χωρίς άλλες ανοσοτροποποιητικές νόσους ώστε να αποσαφηνιστεί ο τρόπος που αντιδρούν τα CD4 + παρουσία φυσικών αντιγόνων. Για να μπορέσουμε να κατανοήσουμε τις μεταβολές στα κύτταρα του ανοσοποιητικού κρίθηκε αναγκαία η δημιουργία μιας ομάδας ελέγχου της μελέτης. Έτσι, ως ομάδα μελέτης χρησιμοποιήθηκαν ασθενείς οι οποίοι υποβλήθηκαν σε προγραμματισμένο χειρουργείο αρθροπλαστικής και μεταγγίστηκαν κατά την διάρκεια του χειρουργείου, ενώ ως ομάδα ελέγχου ήταν οι ασθενείς που υποβλήθηκαν σε αντίστοιχες χειρουργικές επεμβάσεις χωρίς να μεταγγιστούν σε οποιοδήποτε σημείο της μελέτης. 106

108 17.1. Μεταβολή των κυτταρικών πληθυσμών. Για τον έλεγχο της πλαστικότητα των CD4 + κυττάρων έγινε φαινοτύπηση σε μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος για κυτταρικούς πληθυσμούς των CD3 + κυττάρων παρθενικών, μνημονικών και ενεργοποιημένων καθώς και για τους ρυθμιστικούς πληθυσμούς των φυσικών και των επαγώγιμων. Η επιλογή των κυττάρων στον θύμο αδένα είναι μια διαδικασία κατά την οποία τα φυσικά ρυθμιστικά κύτταρα έρχονται σε επαφή με τα αυτοαντιγόνα, τα αναγνωρίζουν και κατά την έξοδο τους στην περιφέρεια είναι πλήρως διαφοροποιημένα ώστε να επιτελούν τον βασικό τους ρόλο που είναι η επιτήρηση και η ορθή λειτουργία του ανοσοποιητικού. Ενώ τα υπόλοιπα κύτταρα κατά τη έξοδό τους από τον θύμο είναι σε παρθενική μορφή μέχρι να έρθουν σε επαφή με το αντιγόνο ή να οδηγηθούν σε απόπτωση (Geginat et al.,2014;bailey et al.,2013;magombedze et al., 2013;Walsh and Mills,2013;O'Shea and Paul, 2010). Εικόνα Διαφοροποίηση των παρθενικών CD4 + κυττάρων (Bailey et al.,2013) Για τον έλεγχο των κυτταρικών πληθυσμών χρησιμοποιήθηκε ολικό αίμα ασθενών πριν και μετά το χειρουργείο και αυτό που φάνηκε από τα παραπάνω πειράματα είναι ότι η εισροή των αντιγόνων στο σώμα τροποποιούν το ανοσοποιητικό σύστημα και το οδηγούν σε ανοσολογική ανοχή. Έτσι, μετά την μετάγγιση σε κυτταρικό επίπεδο αυτό που παρατηρείται είναι μείωση των λεμφοκυττάρων και των CD3 + κυττάρων σε απόκριση στο χειρουργείο καθώς παρατηρείται και στις δυο ομάδες των ασθενών, με ταυτόχρονη μείωση των παρθενικών κυττάρων και αύξηση των μνημονικών χωρίς ωστόσο να παρουσιάζουν σημαντική διαφορά με τα επίπεδα πριν το χειρουργείο. Αυτό που ήταν σημαντικό 107

109 ήταν η αύξηση των δεικτών ενεργοποίηση HLA-DR τόσο για τον πληθυσμό των CD4 + όσο και για τον πληθυσμό των CD8 + μόνο στους μεταγγισμένους ασθενείς, που υποδηλώνει ότι το ανοσοποιητικό σύστημα των μεταγγισμένων ασθενών ενεργοποιήθηκε από την μετάγγιση και όχι από το χειρουργείο. Επίσης, σε μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος ασθενών πραγματοποιήθηκαν φαινοτυπίσεις πριν το χειρουργείο, αμέσως μετά και κάθε μέρα μέχρι το εξιτήριο των ασθενών από το νοσοκομείο, την πρώτη εβδομάδα, τον πρώτο μήνα και στην τελευταία επίσκεψη των ασθενών μετά τους τρεις μήνες. Σε αυτά τα δείγματα προσδιορίστηκαν τα Treg. Ο πληθυσμός των Treg είναι ετερογενής και διακρίνεται στα ntreg τα οποία ωριμάζουν στον θύμο αδένα και τα itreg τα οποία ωριμάζουν στην περιφέρεια, ωστόσο και οι δυο πληθυσμοί μοιράζονται κοινά φαινοτυπικά χαρακτηριστικά όπως η συνεχή έκφραση των μορίων CD4 και CD25. Ωστόσο διακρίνονται από την έκφραση του παράγοντα Foxp3 και την έλλειψη του υποδοχέα CD127 low/-, αντίστοιχα. Αυτό που παρατηρήθηκε από αυτά τα πειράματα ήταν αρχικά ότι τα επίπεδα των itregs ήταν υψηλότερα πριν το χειρουργείο από τα ntregs. Τα itregs αποτελούσαν το 8,18% των CD4+ κυττάρων ενώ τα ntregs αποτελούσαν το 2,27% των CD4+κυττάρων, αυτή η παρατήρηση ήταν αναμενόμενη μιας και τα itregs που βρίσκονται στην περιφέρεια χρειάζονται να είναι σε υψηλότερα ποσοστά ώστε να επιτηρούν στην περιφέρεια τα δραστικά κύτταρα χωρίς ωστόσο να έχει δειχθεί. Αμέσως μετά το χειρουργείο (day0) στους μεταγγισμένους ασθενείς, τα itregs αυξήθηκαν σε ποσοστό 14,9% και συνέχισαν να αυξάνονται και την επόμενη μέρα όπου ανιχνεύτηκαν στο 21,05% των CD4+ κυττάρων ενώ μειώθηκαν τις επόμενες μέρες και έφτασαν τα πριν το χειρουργείο επίπεδα την πρώτη εβδομάδα. Παρόμοιο μοτίβο παρατηρείται και για τους μη-μεταγγισμένους ασθενείς που ωστόσο τα ρυθμιστικά τους κύτταρα είναι σε πολύ πιο χαμηλά επίπεδα συγκριτικά με τους μεταγγισμένους. Έτσι, μετά το χειρουργείο οι μη-μεταγγισμένοι ασθενείς είχαν 9,46% CD4+ κύτταρα ενώ την επόμενη μέρα έφτασαν το 12,27% των ίδιων κυττάρων. Από την δεύτερη κιόλας μέρα τα επίπεδα των itregs ήταν στα επίπεδα πριν το χειρουργείο. Έτσι παρατηρείται ότι την πρώτη μετεγχειρητική μέρα όπου και παρατηρήθηκε η μεγαλύτερη αύξηση του κυτταρικού πληθυσμού, οι μεταγγισμένοι ασθενείς αύξησαν τα itregs 2,57 φορές συγκριτικά με τα επίπεδα πριν το χειρουργείο ενώ στους μη-μεταγγισμένους ασθενείς παρατηρήθηκε αύξηση 1,5 φορές. Επίσης, 108

110 για τους μεταγγισμένους ασθενείς στις χρονικές στιγμές μετά την πρώτη εβδομάδα παρατηρείται μείωση του πληθυσμού κάτω από τα πριν το χειρουργείο επίπεδα τα οποία δεν φαίνεται να έχουν επανέλθει ούτε και στην τελευταία επίσκεψη των ασθενών. Για τον πληθυσμό των ntregs και για τις δυο ομάδες των ασθενών παρατηρήθηκε αύξηση του ρυθμιστικού πληθυσμού μετά το χειρουργείο και μέχρι την δεύτερη μετεγχειρητική μέρα. Πιο συγκεκριμένα, για τους μεταγγισμένους ασθενείς αμέσως μετά το χειρουργείο και για την πρώτη μετεγχειρητική μέρα τα επίπεδα του πληθυσμού δεν ήταν πολύ αυξημένα ωστόσο την δεύτερη μετεγχειρητική μέρα έφτασαν το 11,84% των CD4 + κυττάρων και για τους μημεταγγισμένους ασθενείς παρατηρήθηκε η ίδια τάση φτάνοντας το 5,58%. Αυτό σημαίνει ότι στους μεταγγισμένους ασθενείς παρατηρήθηκε αύξηση 5,22 φορές συγκριτικά με τα επίπεδα πριν το χειρουργείο, ενώ για τους μη-μεταγγισμένους ασθενείς παρατηρήθηκε αύξηση 2,46 φορές. Και τα ntregs παρέμειναν μειωμένα στην πρώτη εβδομάδα και τον μήνα μετά την μετάγγιση ωστόσο στην τελευταία επίσκεψη των ασθενών τα επίπεδα των ntregs ήταν όπως αυτά πριν το χειρουργείο. Το πρώτο συμπέρασμα που μπορεί να διεξαχθεί είναι ότι ο τεράστιος αριθμός αντιγόνων που εισέρχεται στο σώμα μέσω της μετάγγισης οδηγεί σε ενεργοποίηση του ανοσοποιητικού μέσω του δείκτη ενεργοποίησης HLA-DR καθώς και η αύξηση των ρυθμιστικών πληθυσμών οδηγεί στο συμπέρασμα ότι μετά την μετάγγιση ακολουθεί γρήγορη ανοσολογική απόκριση αυξάνοντας τα ρυθμιστικά κύτταρα για τις πρώτες μέρες μετά το χειρουργείο Λειτουργικότητα των ρυθμιστικών κυττάρων. Μετά την παρατήρηση για την αύξηση των ρυθμιστικών πληθυσμών ακολούθησαν πειράματα λειτουργικότητας ώστε να ελεγθεί η ικανότητα των κυττάρων να καταστέλλουν τον πολλαπλασιασμό των δραστικών κυττάρων. Γι αυτά τα πειράματα απομονώθηκαν Treg και Teff κύτταρα από το ίδιο δείγμα ασθενούς, από υγιείς, μεταγγισμένους και μη-μεταγγισμένους ασθενείς και συνκαλλιεργήθηκαν για 72 ώρες, σε διαφορετικές αναλογίες Treg:Teff± του μιτογονικού ερεθίσματος PHA. Οι αναλογίες των Treg:Teff που χρησιμοποιήθηκαν ήταν οι 1:1, 1:2, 1:4, 1:8. Επίσης, τα Teff κύτταρα μετά την απομόνωσή τους επωάστηκαν παρουσία CFSE για την ανίχνευση πολλαπλασιασμού τους και σημεία ελέγχου του πειράματος ήταν σημεία με Teff μόνα τους και Teff+PHA. Σε όλα τα σημεία του πειράματος φαίνεται 109

111 ότι τα Treg είναι ικανά να καταστέλλουν τον πολλαπλασιασμό των Teff με τρόπο εξαρτώμενο από τον αριθμό των ρυθμιστικών που βρίσκονται στην καλλιέργεια, έτσι, ισχυρότερη αναστολή του πολλαπλασιασμού των δραστικών κυττάρων παρατηρείται στην αναλογία 1:1 και λιγότερη στην 1:8 καις τις δυο ομάδες των ασθενών. Ωστόσο, στα κύτταρα που απομονώθηκαν από τους μεταγγισμένους ασθενείς παρατηρήθηκε ισχυρότερη καταστολή συγκριτικά με τους μημεταγγισμένους. Συμπερασματικά μπορούμε να πούμε ότι η αναστολή του πολλαπλασιασμού των Teff των μεταγγισμένων ασθενών ήταν ισχυρότερη και πιο αποτελεσματική συγκριτικά με τους μη-μεταγγισμένους. Οπότε οι ασθενείς βρίσκονται ανοσοκατασταλμένοι για τις πρώτες μέρες μετά το χειρουργέιο και αυτό οφείλεται στην αύξηση των Treg Μεταβολή στο κυτταροκινικό δίκτυο. Η επικοινωνία των κυττάρων μπορεί να γίνεται είτε μέσω της κυτταρικής επαφής είτε μέσω των κυτταροκινών που εκκρίνουν. Η κάθε κυτταροκίνη δρα σε συγκεκριμένους κυτταρικούς πληθυσμούς και προκαλεί συγκεκριμένη απόκριση. Η αρχή της ανοσολογικής απόκρισης γίνεται όταν ένα παρθενικό CD4 + κύτταρο έρχεται σε επαφή με αντιγόνο και ενεργοποιείται εκκρίνοντας IL-2. Από εκεί και πέρα ανάλογα με τις κυτταροκίνες που θα εκκριθούν τα κύτταρα διαφοροποιούνται στους κατάλληλους κυτταρικούς πληθυσμούς, οι οποίοι μπορούν και αυτοί να επικοινωνούν μεταξύ τους είτε θετικά είτε αρνητικά. Εικόνα Απεικόνιση της κυτταρικής επικοινωνίας μέσω των κυτταροκινών. 110

112 Στην προσπάθεια κατανόησης του τρόπου της επικοινωνίας μεταξύ των κυττάρων και της επίδρασης του μεγάλου αριθμού των αντιγόνων που δέχονται οι ασθενείς με την μετάγγιση, προσδιορίστηκαν τα επίπεδα των συγκεντρώσεων των κυτταροκινών και διαλυτών μορίων χαρακτηριστικά από τους περισσότερους κυτταρικούς τύπους. Πιο συγκεκριμένα, προσδιορίστηκαν οι IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, INF-γ, TNF-α, TGF-β1, TGF-β2, TNF-RI(p55/p60), TNF-RII(p75/p80) και αυτό που παρατηρήθηκε ήταν ότι στατιστικώς σημαντικές διαφορές εντοπίστηκαν μόνο στους υποδοχείς του TNF-α, TNF-RI(p55/p60), TNF-RII(p75/p80), στην κυτταροκίνη IL-6 καθώς και στην ανασταλτική κυτταροκίνη TGF-β1. Τα επίπεδα της IL-2 ανιχνεύτηκαν στα ίδια επίπεδα πριν και αμέσως μετά το χειρουργείο στους μεταγγισμένους ασθενείς ενώ ήταν αυξημένη στους μη-μεταγγισμένους, στην συνέχεια πολύ μικρές ποσότητες IL-2 ανιχνεύτηκαν μέχρι και τον πρώτο μήνα μετά το χειρουργείο. Τα επίπεδα των κυτταροκινών IL-4, IL-10, INF-γ και TNF-α ήταν και παρέμειναν πολύ χαμηλά σε όλη την διάρκεια της μελέτης και στις δυο ομάδες των ασθενών, παρόλο που θα περιμέναμε τα επίπεδα της IL-10 να είναι υψηλότερα μιας και είναι κυτταροκίνη που εκκρίνεται από τα ρυθμιστικά κύτταρα. Ενώ οι υποδοχείς TNF-RI(p55/p60), TNF-RII(p75/p80) και IL-6 αυξήθηκαν μετά το χειρουργείο στους μεταγγισμένους ασθενείς και όχι στους μημεταγγισμένους. Τα μόρια της οικογένειας των TGF ακολούθησαν διαφορετικά πρότυπα με το TGF-β1 να μειώνεται μετά το χειρουργείο και στις δυο ομάδες των ασθενών αλλά περισσότερο στους μεταγγισμένους, ενώ ο TGF-β2 αν και δεν εμφανίζει στατιστικώς σημαντικές διαφορές μεταξύ των χρονικών στιγμών και των ομάδων των ασθενών φαίνεται να ακολουθεί το μοτίβο έκφρασης των ρυθμιστικών κυττάρων καθώς αυξάνεται μετά το χειρουργείο μόνο στους μεταγγισμένους ασθενείς και όχι στους μη-μεταγγισμένους. Όλα τα παραπάνω οδηγούν στο συμπέρασμα ότι στους ασθενείς που υποβάλλονται σε μετάγγιση επάγεται η έκκριση προφλεγμονωδών κυτταροκινών μετά το χειρουργείο τα οποία είτε επανέρχονται στα πριν το χειρουργείο επίπεδα πολύ αργότερα στην διάρκεια της μελέτης, είτε απαιτείται μεγαλύτερο χρονικό διάστημα. Σε αντίθεση με τους μη-μεταγγισμένους ασθενείς όπου μόνο στην IL-6 ακολουθεί το πρότυπο των μεταγγισμένων ασθενών ενώ σε καμία άλλη κυτταροκίνη ή μόριο δεν εντοπίζεται σημαντική διαφορά. Από όλα τα παραπάνω θα μπορούσαμε να συμπεράνουμε ότι ο μεγάλος αριθμός των αντιγόνων που εισέρχεται στο σώμα 111

113 των ασθενών επάγει ανοσολογική ανοχή τόσο μέσω κυττάρων όσο και μέσω των κυτταροκινών που εκκρίνονται. Αυτή η ανοσολογική ανοχή κρατάει τουλάχιστον μια εβδομάδα μετά την μετάγγιση ωστόσο η ανισορροπία του ανοσοποιητικού σε πολλές περιπτώσεις υπερβαίνει και τους 3 μήνες Μετεγχειρητικές επιπλοκές. Τα θερμομετρικά διαγράμματα των ασθενών, η διάρκεια νοσηλείας και η εμφάνιση ή μη μετεγχειρητικών επιπλοκών αξιολογήθηκαν και κατηγοριοποιήθηκαν. Η αύξηση των ρυθμιστικών κυττάρων και η μεταβολή στο προφίλ των κυτταροκινών μας οδηγεί στο συμπέρασμα ότι το ανοσοποιητικό σύστημα των μεταγγισμένων ασθενών βρίσκεται σε καταστολή για την πρώτη μετεγχειρητική εβδομάδα και ιδιαίτερα τις πρώτες τέσσερις μετεγχειρητικές μέρες. Αυτό που παρατηρήθηκε συγκρίνοντας τις δυο ομάδες των ασθενών, τους μεταγγισμένους συγκριτικά με τους μη-μεταγγισμένους, είναι ότι οι ασθενείς που δέχτηκαν μετάγγιση κατά την διάρκεια του χειρουργείου εμφάνισαν υψηλότερα ποσοστά μετεγχειρητικών επιπλοκών, παρέμειναν στο νοσοκομείο για περισσότερες μέρες και εμφάνισαν αυξημένη θερμοκρασία σώματος. Η παρατεταμένη νοσηλεία των μεταγγισμένων ασθενών επιβεβαιώνεται από τα στοιχεία καθώς οι μεταγγισμένοι ασθενείς παρέμειναν στο νοσοκομείο για περίπου 12 μέρες, συγκριτικά με τους μη-μεταγγισμένους όπου η παραμονή τους δεν ξεπερνούσε ιδιαίτερα τις 9 μέρες. Οι θερμομετρικές μετρήσεις των ασθενών όπως φαίνονται στο διάγραμμα σημειώνονται υψηλότερες στην ομάδα μελέτης. Και, υψηλότερα ποσοστά μετεγχειρητικών επιπλοκών εμφάνισαν οι μεταγγισμένοι ασθενείς σε ποσοστά 59,26% συγκριτικά με το 20% των μημεταγγισμένων ασθενών. Οι μετεγχειρητικές επιπλοκές διακρίθηκαν σε εμπύρετο, επιπλοκές που δεν οφείλονταν σε μικροοργανισμούς και σε επιπλοκές οφειλόμενες σε μικροοργανισμούς. Αυτό που αξίζει να σημειωθεί εδώ είναι ότι οι μημεταγγισμένοι ασθενείς δεν εμφάνισαν καμία επιπλοκή που να αφορούσε λοίμωξη από μικροβιακό παράγοντα σε αντίθεση με τους μεταγγισμένους ασθενείς όπου αυτό το ποσοστό πλησίαζε το 26%. Από όλα τα παραπάνω, κρίνεται απαραίτητο και στην κλινική πράξη η ανάπτυξη καινοτόμων στρατηγικών πρόληψης της εμφάνισης μετεγχειρητικών επιπλοκών με ιδιαίτερη στην προεγχειρητική διόρθωση της αναιμίας που είναι η 112

114 κύρια αιτία λήψης μετάγγισης αίματος. Ασθενείς που εμφανίζουν υψηλά ποσοστά μετεγχειρητικών επιπλοκών είναι πιο επιρρεπείς και μακροπρόθεσμα είναι πιθανότερο να υποστούν χαλάρωση του υλικού και τελικά να οδηγηθούν σε επέμβαση αναθεώρησης χρειαστεί αναθεώρηση. Υπάρχουν μελέτες που συνηγορούν στην επικινδυνότητα της ασυμπτωματικής αναιμίας καθώς μπορεί να οδηγήσει σε σοβαρές μετεγχειρητικές επιπλοκές μέχρι και θάνατο, αν δεν γίνει αντιληπτή από την αρχή και δεν αντιμετωπιστεί κατάλληλα και έγκαιρα. Τρόποι προσέγγισης αυτού του προβλήματος θα μπορούσαν να αποτελέσουν η θεραπεία με σίδηρο ή χορήγηση ερυθροποιητίνης πριν το χειρουργείο ώστε τα επίπεδα του αιματοκρίτη να είναι εντός των φυσιολογικών ορίων. 113

115 18. Συζήτηση Μετά την είσοδο αριθμού αντιγόνων στο σώμα, το ανοσοποιητικό σύστημα αποκρίνεται επάγοντας την ανοσολογική ανοχή σε μια διαδικασία τουλάχιστον δυο τμημάτων. Αρχικά, επάγεται μια γρήγορη απόκριση του ανοσοποιητικού μέσω της αύξηση των itreg τα οποία βρίσκονται στην περιφέρεια και έρχονται σε επαφή με τα αντιγόνα και αποκρινόμενα εκκρίνουν κυτταροκίνες τύπου Th1 και Th3. Αυτή η διαδικασία επιτελείται αμέσως μετά την επαφή με τα αντιγόνα και διατηρείται για περίπου 24 ώρες. Τα αντιγόνα αφού εισέλθουν στην κυκλοφορία μεταφέρονται σε όλο στο σώμα μέσα στις επόμενες μέρες. Τότε ακολουθεί το επόμενο τμήμα της επαγωγής της ανοσολογικής ανοχής όπου έχει να κάνει με τον πληθυσμό των φυσικών ρυθμιστικών κυττάρων (ntreg) ο οποίος αυξάνεται ιδιαίτερα στις πρώτες 48 ώρες μετά την μετάγγιση. Αυτό θα μπορούσε να σημαίνει ότι είτε τα αντιγόνα περνάνε από τον θύμο επάγουν τον πολλαπλασιασμό των ntreg τα οποία εξέρχονται στην περιφέρεια όπου και εντοπίστηκαν, είτε ότι επάγεται επιλεκτικά ο πολλαπλασιασμός των CD3 + CD4 + Foxp3 + στην περιφέρεια, από κύτταρα του θύμου τα οποία δεν είναι CD3 + CD4 + CD127 -/low, ώστε να επιτευχθεί η ανοσολογική ανοχή. Γενικά, οι ασθενείς είναι κατασταλμένοι για την πρώτη εβδομάδα μετά το χειρουργείο και ιδιαίτερα τις πρώτες τέσσερις μέρες μετά και αυτό τους κάνει πιο επιρρεπείς σε μετεγχειρητικές επιπλοκές όπως εμπύρετος, μικροβιακές λοιμώξεις και άλλες επιπλοκές που δεν οφείλονται σε μικροοργανισμούς με αποτέλεσμα να παρατείνεται σημαντικά η διάρκεια νοσηλείας για την αντιμετώπιση αυτών των επιπλοκών. Εικόνα Προτεινόμενο μοντέλο δράσης της μετάγγισης Το προτεινόμενο μοντέλο της δράσης της μετάγγισης στο ανοσοποιητικό όπως φαίνεται και στην εικόνα παρακάτω (εικόνα 18.1) αφορά στην ισορροπία των 114