ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ. Παραγωγή οργανικών οξέων από κυτταρινούχο βιομάζα με τη χρήση κίσσηρης ως προωθητή

Transcript

1 ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Παραγωγή οργανικών οξέων από κυτταρινούχο βιομάζα με τη χρήση κίσσηρης ως προωθητή ΑΓΑΠΗ ΔΗΜΑ ΧΗΜΙΚΟΣ, MSc Επιβλέπoυσα: Αργυρώ Μπεκατώρου ΠΑΤΡΑ, 2018

2 ii

3 SCHOOL OF NATURAL SCIENCES DEPARTMENT OF CHEMISTRY DOCTORAL THESIS Organic acids production from cellulosic biomass using kissiris as promoter AGAPI DIMA CHEMIST, MSc Supervisor: Argyro Bekatorou PATRAS, 2018 iii

4 iv

5 ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΑΡΓΥΡΩ ΜΠΕΚΑΤΩΡΟΥ (Επιβλέπουσα) Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Χημείας & Τεχνολογίας Τροφίμων Τμήμα Χημείας, Πανεπιστήμιο Πατρών ΜΑΡΙΑ ΚΑΝΕΛΛΑΚΗ Καθηγήτρια Χημείας & Βιοτεχνολογίας Τροφίμων Τμήμα Χημείας, Πανεπιστήμιο Πατρών ΧΡΥΣΗ ΚΑΡΑΠΑΝΑΓΙΩΤΗ Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Χημείας Περιβάλλοντος με έμφαση στην Υγρή Ρύπανση Τμήμα Χημείας, Πανεπιστήμιο Πατρών ΜΑΓΔΑΛΗΝΗ ΣΟΥΠΙΩΝΗ Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Ραδιοχημείας & Εφαρμογών Πυρηνικής Χημείας Τμήμα Χημείας, Πανεπιστήμιο Πατρών ΙΩΑΝΝΗΣ ΚΟΥΚΟΣ Αναπληρωτής Καθηγητής Σχεδιασμός, Βελτιστοποίηση & Οικονομική Ανάλυση Διεργασιών Τμήμα Χημικών Μηχανικών, Πανεπιστήμιο Πατρών ΑΠΟΣΤΟΛΟΣ ΚΟΥΤΙΝΑΣ Επίκουρος Καθηγητής Σχεδιασμού Βιομηχανιών Τροφίμων & Βιοδιεργασιών Τμήμα Επιστήμης Τροφίμων και Διατροφής του Ανθρώπου, Γεωπονικό Πανεπιστήμιο Αθηνών ΣΤΑΥΡΟΣ ΠΛΕΣΣΑΣ Επίκουρος Καθηγητής Ποιοτικού Ελέγχου Τροφίμων Τμήμα Αγροτικής Ανάπτυξης, Δημοκρίτειο Πανεπιστήμιο Θράκης v

6 vi

7 SEVEN MEMBER EXAMINATION COMMITTEE ARGYRO BEKATOROU (Supervisor) Associate Professor of Food Chemistry & Technology Department of Chemistry, University of Patras MARIA KANELLAKI Professor of Food Chemistry & Biotechnology Department of Chemistry, University of Patras MAGDALINI SOUPIONI Associate Professor of Radiochemistry & Applications of Nuclear Chemistry Department of Chemistry, University of Patras HRISSI KARAPANAGIOTI Associate Professor of Environmental Chemistry with emphasis to Liquid Pollution Department of Chemistry, University of Patras IOANNIS KOOKOS Associate Professor of Process Design, Optimisation & Economic Analysis Department of Chemical Engineering, University of Patras APOSTOLIS KOUTINAS Assistant Professor of Design of Food Industries & Bioprocesses Department of Food Science and Human Nutrition, Agricultural University of Athens STAVROS PLESSAS Assistant Professor of Food Quality Control Department of Agricultural Development, Democritus University of Thrace vii

8 viii

9 Μέρος της παρούσας διατριβής πραγματοποιήθηκε στο πλαίσιο ερευνητικού προγράμματος της Δράσης «ΣΥΝΕΡΓΑΣΙΑ 2011» που συγχρηματοδοτείται από το Ευρωπαϊκό Ταμείο Περιφερειακής Ανάπτυξης (85%) και Εθνικούς Πόρους (15%). ΕΥΡΩΠΑΪΚΗ ΕΝΩΣΗ ΕΥΡΩΠΑΪΚΟ ΤΑΜΕΙΟ ΠΕΡΙΦΕΡΕΙΑΚΗΣ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ Υπουργείο Παιδείας, Δια Βίου Μάθησης και Θρησκευμάτων ΓΓΕΤ ΕΥΔΕ-ΕΤΑΚ ix

10 x

11 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η παρούσα διατριβή εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Χημείας και Τεχνολογίας Τροφίμων του Τμήματος Χημείας του Πανεπιστημίου Πατρών και αφορά την παραγωγή οργανικών οξέων από λιγνινοκυτταρινούχo βιομάζα με τη χρήση κίσσηρης ως προωθητή για παραγωγή βιοκαυσίμων Ένα θερμό ευχαριστώ οφείλω στην επιβλέπουσα της παρούσας διατριβής, την Επίκουρο Καθηγήτρια κ. Αργυρώ Μπεκατώρου, για την αμέριστη βοήθεια της καθ όλη τη διάρκεια εκπόνησης της εργασίας, τόσο στο πειραματικό μέρος όσο και στην επιμέλεια της συγγραφής. Πάνω απ όλα θέλω να την ευχαριστήσω για την υπομονή της, τη διαρκή υποστήριξη της και τη φιλία της. Θα ήθελα να ευχαριστήσω από καρδιάς τον Ομότιμο Καθηγητή του Τμήματος Χημείας του Πανεπιστημίου Πατρών, κ. Αθανάσιο Α. Κουτίνα για την εμπιστοσύνη που μου, τις ευκαιρίες που μου έδωσε να εξελιχθώ σε επιστημονικό και προσωπικό επίπεδο καθώς και για τις γνώσεις και εμπειρίες που με τόση γενναιοδωρία μοιράστηκε και συνέβαλε στην ολοκλήρωση της διατριβής. Ιδιαίτερα ευχαριστώ την Καθηγήτρια, κ. Μαρία Κανελλάκη για τη βοήθεια της, τις συμβουλές της και τη διαρκή στήριξη που μου παρείχε. Ευχαριστώ πολύ τα μέλη της Επταμελούς Εξεταστικής Επιτροπής, για την τιμή που μου έκαναν να διορθώσουν και να κρίνουν τη διδακτορική μου διατριβή. Ευχαριστώ πολύ τους μεταδιδάκτορες ερευνητές κκ. Παναγιώτη Κανδύλη, Θεανώ Πέτση, Μιχάλη Καλλή και Κατερίνα Πισσαρίδη για τη βοήθεια τους και τη στενή παρακολούθηση των πειραμάτων ώστε να είναι επιτυχής η έκβαση του προγράμματος. Ευχαριστώ θερμά τους φίλους και συνεργάτες, Κωνσταντίνα Μπούρα, Τζένη Παπαφωτοπούλου-Πατρινού, Διονυσία Διαμαντοπούλου, Ίρις Πλειώνη, Βασίλειο Παναγόπουλο, Αικατερίνη Λάππα, Τάνια Τέρπου, Ελευθερία Μπαρούνη, Αλίνα Γιαλλελή, Παναγιώτα Τσαφρακίδου, Ιωάννη Σερβετά και Βασίλειο Γκανάτσιο, η ενεργός βοήθεια και οι χρήσιμες υποδείξεις τους, υπήρξαν πολύτιμες τόσο για την επιτυχή διεξαγωγή όλων των πειραμάτων, όσο και για την ολοκληρωμένη συγγραφή της παρούσας εργασίας. Τέλος θέλω να ευχαριστήσω αυτούς τους γονείς μου και τον αδερφό μου που με έχουν αντέξει όλα αυτά τα χρόνια. xi

12 xii

13 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Στην παρούσα διδακτορική διατριβή ο στόχος ήταν η εύρεση των βέλτιστων συνθηκών για την παραγωγή πτητικών λιπαρών οξέων (ΟΑ) και αιθανόλης μέσω της διεργασίας της αναερόβιας χώνευσης, υπό παρουσία ενός προωθητή της βιοδιεργασίας όπως είναι η κίσσηρης.αυτά τα οξέα θα μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την παραγωγή νέας γενιάς βιοκαυσίμου ή για άλλες εφαρμογές. Τα πειράματα για τη μελέτη της οξεογένεσης έγιναν αρχικά σε συνθετικό μέσο γλυκόζης. Μελετήθηκε η επίδραση της αρχική τιμής ph του υποστρώματος ζύμωσης (3, 4, 5, 6, 7, 8 και 9), η συγκέντρωση του σακχάρου (30, 50, και 70 g/l) και η θερμοκρασία της ζύμωσης (30, 37 και 52 o C). Τα πειράματα αυτά έγιναν τόσο με τη χρήση ελεύθερων κυττάρων της μικτής αναερόβιας καλλιέργειας UASB όσο και με τη χρήση ακινητοποιημένων κυττάρων σε κίσσηρη για να μελετηθεί η επίδραση του προωθητή. Η συνολική παραγωγή οξέων ήταν υψηλότερη στο αρχικό ph 9, θερμοκρασία 37 o C ενώ η καλύτερη συγκέντρωση ήταν τα 30 g/l. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε ξεκίνησε η μελέτη της οξεογένεσης του λιγνινοκυτταρινούχου αποβλήτου. Αρχικά μελετήθηκε η επίδραση της παρουσίας της κίσσηρης σε ζυμώσεις διαλείποντος έργου (batch) σε χημικώς απολιγνινοποιημένο άχυρο. Οι ζυμώσεις αυτές έγιναν στους 37 ο C σε συγκέντρωση 30 g/l απολιγνινοποιημένου άχυρου και δοκιμάστηκαν οι αρχικές τιμές ph 7, 8, και 9 για λόγους σύγκρισης και διήρκησαν 48 h. Η παραγωγή αιθανόλης ήταν στα 0,2 ml/l ενώ από τα οξέα παράχθηκε κυρίως γαλακτικό (4,5 5,3 g/l), ηλεκτρικό και οξικό σε μικρότερες ποσότητες (1 και 1,5 g/l, αντίστοιχα). Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκαν επαναλαμβανόμενες ζυμώσεις διαλείποντος έργου σε αρχικές τιμές ph 7, 8, και 9 σε αρχική συγκέντρωση άχυρου 30 g/l σε θερμοκρασία 37 o C παρουσία και απουσία κίσσηρης. Tα ζυμωμένα υγρά αναπληρωνόντουσαν κάθε 9 ώρες με θρεπτικό διάλυμα ίδιο με αυτό που χρησιμοποιήθηκε για τη ζύμωση αλλά χωρίς την προσθήκη άχυρου. Παρατηρήθηκε παραγωγή οξέων για 4 επαναλαμβανόμενα batch. Στη συνέχεια μελετήθηκε η συνεχής ζύμωση της γλυκόζης. Η συνεχής λειτουργία του αντιδραστήρα διήρκησε 97 μέρες και δοκιμάστηκαν 3 διαφορετικές συγκεντρώσεις γλυκόζης με αρχικό ph 9 και θερμοκρασία 37 o C. Αρχικά στο σύστημα παροχετεύθηκε με θρεπτικό υγρό που περιείχε 70 g/l γλυκόζη του οποίου η συγκέντρωση σταδιακά μειώθηκε στα 30 g/l. Η συνεχής ζύμωση έδωσε συγκεντρώσεις οργανικών οξέων που έφτασαν μέχρι τα 15,2 g/l. Για τη συνεχή αναερόβια ζύμωση άχυρου παρουσία κίσσηρης χρησιμοποιήθηκε η ίδια πειραματική διάταξη, ο αντιδραστήρας ανοίχθηκε ώστε να πληρωθεί με διάλυμα άχυρου 30 g/l, ενώ έγινε τροφοδοσία με συνθετικό υγρό χωρίς άχυρο. Η ζύμωση αυτή έδωσε οξέα για 10 μέρες, κυρίως οξικό και βουτυρικό. Στη συνέχεια έγιναν πειράματα σε μεγάλη κλίμακα (scale-up) χρησιμοποιώντας βιοαντιδραστήρα όγκου 82 L με χρήση κίσσηρης ως προωθητή. Μελετήθηκαν 2 όγκοι 17 L και 40 L. Η παραγωγή οργανικών οξέων έφτασε τα 17,2 g/l και xiii

14 αποτελούνταν κυρίως από βουτυρικό και οξικό οξύ. Τέλος μελετήθηκε η ανάκτηση των οργανικών οξέων από τα υγρά ζύμωσης με τη χρήση οργανικών διαλυτών με τη μέθοδο της υγρής-υγρής εκχύλισης. Τα πειράματα έγιναν σε πρότυπα υδατικά διαλύματα αλλά και σε υγρά ζύμωσης απολιγνινοποιημένου άχυρου. Από τους διαλύτες που δοκιμάστηκαν η βουτανόλη-1 επιλέχθηκε ως ο καλύτερος διαλυτής για τη συγκεκριμένη εφαρμογή από άποψη απόδοσης εκχύλισης και κόστους. Όσον αφορά στην εκχύλιση των οξέων από τα υγρά της ζύμωσης τα αποτελέσματα ήταν ανάλογα με αυτά των πρότυπων διαλυμάτων. Πιο συγκεκριμένα τα καλύτερα αποτελέσματα ελήφθησαν για αρχικό ph 1 με διαλύτη τη βουτανόλη-1 (σχεδόν 80% συνολική παραλαβή). Λέξεις κλειδιά: Κίσσηρη, Αναερόβια Χώνευση, Απόβλητα Βιομηχανίας Τροφίμων, Λιγνινοκυτταρινούχος Βιομάζα, Scale-Up, Οξεογένεση, Βιοκαύσιμο xiv

15 ABSTRACT In this doctoral thesis the aim was to find the optimum conditions for the production of volatile fatty acids and ethanol through the process of anaerobic digestion in the presence of the mineral kissiris as promoter. The experiments for the study of acidogenesis were initially carried out using a synthetic glucose medium as substrate. The effect of initial ph of the fermentation substrate (3, 4, 5, 6, 7, 8 and 9), the sugar concentration (30, 50, and 70 g/l) and the fermentation temperature (30, 37 and 52 C) were studied. These experiments were preformed with the use of both free cells of the mixed UASB anaerobic culture and cells immobilized on kissiris in order to study the effect of the promoter. The total acid production was higher at ph 9, 37 o C, and 30 g/l substrate concentration. The lignocellulosic material was studied next. Initially, the effect of the presence of kissiris on batch fermentations of chemically delignified straw, were studied. These fermentations were carried out for 48 h, at 37 C, 30 g/l straw concentration, and initial ph 7, 8 and 9, for comparison reasons. Ethanol production was at 0.2 ml/l while the acids produced were mainly lactic ( g/l), as well as succinic and acetic in smaller quantities (1 and 1.5 g/l, respectively). Repeated batch fermentations were then performed at initial ph 7, 8 and 9, 37 o C, and straw concentration 30 g/l, in the presence and absence of kissiris. The fermented liquids were replenished every 9 h with a nutrient solution identical to that used for the fermentation but without the addition of straw. Acid production was observed for 4 repeated batches. Subsequently, the continuous fermentation of glucose was studied. The continuous operation of the reactor lasted 97 days and three different concentrations of glucose at initial ph 9 and 37 C were tested. Initially, the system was pumped with nutrient medium containing 70 g/l glucose, the concentration of which gradually decreased to 30 g/l. The continuous fermentation gave high concentrations of organic acids reaching up to 15.2 g/l. For the continuous anaerobic straw fermentation in the presence of kissiris, the same experimental arrangement was used but the reactor was opened to fill with a 30 g/l straw solution, and then feeding was done with synthetic medium that did not contain any straw. This fermentation produced acids for 10 days, mainly acetate and butyrate. Subsequently, scale-up experiments were performed using a 82 L volume bioreactor using kissiris as promoter. Two volumes of 17 L and 40 L were studied. The production of organic acids reached 17.2 g/l and consisted mainly of butyric and acetic acid. Finally, the recovery of organic acids from the fermentation broths was studied by liquid-liquid extraction using various organic solvents. The experiments were carried out in standard aqueous solutions but also in fermentation broths of delignified straw. xv

16 Of all the solvents tested, butanol-1 was chosen as the best solvent for this particular application in terms of extraction yields and process cost. Regarding the acid extraction from the fermentation broths, the results were similar to those of the standard organic acid solutions. In particular, the best results were obtained at ph 1 with butanol-1 (almost 80% total recovery). Keywords: Kissiris, Anaerobic Digestion, Food Industry Wastes, Lignocellulosic Biomass, Scale-Up Acidogenesis, Biofuel xvi

17 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Πρόλογος... xi ΠΕΡΙΛΗΨΗ... xiii Abstract... xv ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ... xvii ΣΧΗΜΑΤΑ... xxiii ΠΙΝΑΚΕΣ... xxv ΕΙΚΟΝΕΣ... xxvii Συντομογραφίες/Ξένοι όροι... xxix ΜΕΡΟΣ 1 o - ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΑΓΡΟΤΟΒΙΟΜΗΧΑΝΙΚΑ ΑΠΟΒΛΗΤΑ Αξιοποίηση αγροτοβιομηχανικών αποβλήτων Ανάκτηση χημικών προϊόντων Ανάκτηση οργανικών οξέων Ανάκτηση σακχάρων Ανάκτηση φυτικών ινών Ανάκτηση φαινολικών συστατικών Βιοτεχνολογικά προϊόντα Γαλακτικό οξύ Οξικό οξύ Ιτακονικό οξύ Ηλεκτρικό οξύ Βουτυρικό οξύ Βιοκαύσιμα Αλκοόλες ως χημικά πλατφόρμας ή βιοκαύσιμα Μονοκυτταρική πρωτεΐνη & ζωοτροφές εμπλουτισμένες σε πρωτεΐνη ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΑΠΟΒΛΗΤΑ ΤΗΣ ΒΙΟΜΗΧΑΝΙΑΣ ΤΡΟΦΙΜΩΝ Βιομηχανία γαλακτοκομικών προϊόντων Βιομηχανία ζάχαρης Βιομηχανία ζύθου Απόβλητα φυτικής παραγωγής και μαζικής εστίασης Απόβλητα ζωικής παραγωγής Βιομηχανία αλκοολούχων ποτών xvii

18 ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΛΙΓΝΙΝΟΚΥΤΤΑΡΙΝΟΥΧΟΣ ΒΙΟΜΑΖΑ Χρήσεις Αξιοποίηση της βιομάζας Βιοτεχνολογική αξιοποίηση Σύγχρονες τάσεις και προοπτικές ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΑΝΑΕΡΟΒΙΑ ΧΩΝΕΥΣΗ Μικροβιολογία Βιοχημεία Οξεογένεση Παράγοντες που επηρεάζουν την αναερόβια χώνευση ph Θερμοκρασία Θρεπτικά στοιχεία Παρουσία τοξικών ουσιών Νέες τάσεις στην αναερόβια χώνευση αποβλήτων ΠΡΟΩΘΗΣΗ ΖΥΜΩΤΙΚΩΝ ΔΙΕΡΓΑΣΙΩΝ Ακινητοποιημένα κύτταρα Φορείς ακινητοποίησης Κίσσηρη ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΝΕΕΣ ΤΑΣΕΙΣ ΣΤΗΝ ΠΑΡΑΓΩΓΑ ΒΙΟΚΑΥΣΙΜΩΝ Βιοκαύσιμα νέας γενιάς Βιοκαύσιμα πρώτης γενιάς Βιοκαύσιμα δεύτερης γενιάς Βιοκαύσιμα τρίτης γενιάς Βιοκαύσιμα τέταρτης γενιάς Βιοαιθανόλη Βιοντίζελ Βιοϋδρογόνο Βιαέριο Ανησυχίες για την παραγωγή βιοκαυσίμων Εστέρες πτητικών λιπαρών οξέων ως καύσιμα ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΣΤΟΧΟΙ ΤΗΣ ΔΙΑΤΡΙΒΗΣ xviii

19 2. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Χημικές ενώσεις Υλικά Όργανα και συσκευές Πρώτες ύλες Λιγνινοκυτταρινούχο υλικό Απολιγνινοποίηση λιγνινοκυτταρινούχου υλικού Φορέας ακινητοποίησης (κίσσηρη) Καλλιέργεια και μέσα ανάπτυξης Αναερόβια μικτή καλλιέργεια ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΑΝΑΛΥΣΕΙΣ Προσδιορισμός οργανικών οξέων Προσδιορισμός αιθανόλης Προσδιορισμός σακχάρων ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 Κύριο Πειραματικό Μέρος της Διατριβής ΑΝΑΕΡΟΒΙΕΣ ΟΞΕΟΓΕΝΕΙΣ ΖΥΜΩΣΕΙΣ ΓΛΥΚΟΖΗΣ ΚΑΙ ΑΧΥΡΟΥ ΓΙΑ ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΟΡΓΑΝΙΚΩΝ ΟΞΕΩΝ ΠΑΡΟΥΣΙΑ ΚΑΙ ΑΠΟΥΣΙΑ ΠΡΟΩΘΗΤΗ Αναερόβια οξεογενής ζύμωση γλυκόζης παρουσία κίσσηρης Επαναλαμβανόμενες οξεογενείς ζυμώσεις γλυκόζης, διαλείποντος έργου (batch), παρουσία κίσσηρης σε διαφορετικές αρχικές τιμές ph Επαναλαμβανόμενες, batch, οξεογενείς ζυμώσεις γλυκόζης παρουσία κίσσηρης σε διαφορετικές θερμοκρασίες Επαναλαμβανόμενες, batch, οξεογενείς ζυμώσεις γλυκόζης παρουσία κίσσηρης σε διαφορετικές αρχικές συγκεντρώσεις σακχάρου Αναερόβια οξεογενής ζύμωση γλυκόζης με ελεύθερα κύτταρα Επαναλαμβανόμενες, batch, οξεογενείς ζυμώσεις γλυκόζης με ελεύθερα κύτταρα σε διαφορετικές αρχικές τιμές ph Επαναλαμβανόμενες, batch, οξεογενείς ζυμώσεις γλυκόζης με ελεύθερα κύτταρα σε διαφορετικές θερμοκρασίες Επαναλαμβανόμενες, batch, οξεογενείς ζυμώσεις γλυκόζης με ελεύθερα κύτταρα σε διαφορετικές αρχικές συγκεντρώσεις σακχάρου Αναερόβια οξεωγενής ζύμωση άχυρου παρουσία κίσσηρης Επαναλαμβανόμενες, batch, οξεογενείς ζυμώσεις άχυρου παρουσία κίσσηρης σε διαφορετικές τιμές αρχικού ph Επαναλαμβανόμενες, batch, οξεογενείς ζυμώσεις άχυρου παρουσία κίσσηρης σε διαφορετικές αρχικές τιμές ph με αποβολή και αναπλήρωση του υγρού ζύμωσης Αναερόβια οξυγενής ζύμωση άχυρου με ελεύθερα κύτταρα Επαναλαμβανόμενες, batch, οξεογενείς ζυμώσεις άχυρου με ελεύθερα κύτταρα σε τιμές xix

20 αρχικού ph Συνεχείς οξεογενείς ζυμώσεις γλυκόζης και άχυρου παρουσία προωθητών Συνεχείς οξεογενείς ζυμώσεις γλυκόζης παρουσία κίσσηρης Συνεχείς οξεογενείς ζυμώσεις άχυρου παρουσία κίσσηρης Scale-up (17 L) αναερόβιων ζυμώσεων άχυρου παρουσία κίσσηρης Επαναλαμβανόμενες, batch, οξεογενείς ζυμώσεις άχυρου παρουσία κίσσηρης Scale-up (40 L) αναερόβιων ζυμώσεων άχυρου παρουσία κίσσηρης Επαναλαμβανόμενες, batch, scale-up οξεογενείς ζυμώσεις άχυρου παρουσία κίσσηρης Παραλαβή προϊόντων της αναερόβιας οξεογένεσης με εκχύλιση Εκχύλιση οργανικών οξέων από πρότυπα υδατικά διαλύματα με ζυμέλαια σε διάφορες αναλογίες Εκχύλιση οργανικών οξέων από πρότυπα υδατικά διαλύματα σε διάφορες τιμές ph Εκχύλιση οργανικών οξέων από τα υγρά της ζύμωσης άχυρου ΜΕΡΟΣ 3 ο - ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ και ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΚΕΦΑΛΑΙΟ Η ΦΙΛΟΣΟΦΙΑ ΤΗΣ ΔΙΑΤΡΙΒΗΣ Γενικά επί των στόχων της διατριβής Σχεδιασμός και οργάνωση των κεφαλαίων Περιγραφή της πειραματικής εργασίας Τα υλικά που χρησιμοποιήθηκαν στη διατριβή Γιατί χρησιμοποιήθηκε η λιγνινοκυτταρινούχος βιομάζα για την παραγωγή οργανικών οξέων Τα προβλήματα στη βιοκατεργασία της κυτταρίνης σε σχέση και με άλλες μορφές οργανικού φορτίου και άλλες πρώτες ύλες Τα οργανικά οξέα ως εμπορικά προϊόντα Παραγωγή οργανικών οξέων κατά την αναερόβια οξεογένεση κυτταρίνης και γλυκόζης Ο ρόλος της κίσσηρης στην οξεογένεση της κυτταρινούχου βιομάζας Η κίσσηρη έναντι της γ-αλουμίνας στην οξεογένεση της κυτταρίνης Πειράματα μεγάλης κλίμακας (scale-up) Απομόνωση των οργανικών οξέων από το υγρό ζύμωσης Οι εφαρμογές της γλυκόλυσης στη Λευκή Βιοτεχνολογία και η διδακτορική διατριβή Η πρωτοτυπία της διατριβής ΚΕΦΑΛΑΙΟ xx

21 3.2.1 Οξεογενείς ζυμώσεις γλυκόζης και αχύρου για παραγωγή οργανικών οξέων με προωθητή και χωρίς Επίδραση του ph στην οξεογένεση της γλυκόζης παρουσία κίσσηρης Επίδραση της θερμοκρασίας στην οξεογένεση της γλυκόζης παρουσία και απουσία κίσσηρης Επίδραση της συγκέντρωσης στην οξεογένεση της γλυκόζης παρουσία και απουσία κίσσηρης Τεχνολογική αξιολόγηση των αποτελεσμάτων Οξεογένεση αχύρου παρουσία κίσσηρης Επίδραση του ph στις επαναλαμβανόμενες batch αναερόβιες ζυμώσεις αχύρου παρουσία και απουσία κίσσηρης Επαναλαμβανόμενες batch αναερόβιες ζυμώσεις αχύρου παρουσία και απουσία κίσσηρης με αποβολή και αναπλήρωση του υγρού ζύμωσης: Επίδραση του ph Επιστημονική και τεχνολογική αξιολόγηση των αποτελεσμάτων της οξεογένεσης της απολιγνινοποιημένης κυτταρίνης παρουσία κίσσηρης Συνεχής οξεογένεση γλυκόζης και αχύρου παρουσία προωθητών Συνεχής οξεογένεση γλυκόζης παρουσία κίσσηρης Συνεχείς αναερόβιες ζυμώσεις αχύρου παρουσία κίσσηρης ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΠΕΙΡΑΜΑΤΑ ΜΕΓΑΛΗΣ ΚΛΙΜΑΚΑΣ ΟΞΕΟΓΕΝΕΣΗΣ ΑΧΥΡΟΥ, ΔΙΑΛΕΙΠΟΝΤΟΣ ΕΡΓΟΥ (BATCH), ΣΕ ΒΙΟΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΑ 82 L ΠΑΡΟΥΣΙΑ ΚΙΣΣΗΡΗΣ Eκκινητήρια (1 η ) batch ζύμωση μίγματος κυτταρίνης και γλυκόζης με φόρτωση του 1 ου ορόφου με κίσσηρη Επαναλαμβανόμενες batch οξεογενείς ζυμώσεις αχύρου, μεγάλης κλίμακας, παρουσία κίσσηρης με φόρτωση του 1 ου ορόφου Λειτουργία 1 ου και 2 ου ορόφου του βιοαντιδραστήρα μεγάλης κλίμακας: Επαναλαμβανόμενες batch ζυμώσεις αχύρου παρουσία κίσσηρης Επιστημονική και τεχνολογική αξιολόγηση των αποτελεσμάτων της οξεογένεσης του αχύρου στο βιοαντιδραστήρα των 82 L Σύγκριση αποτελεσμάτων με άλλες έρευνες ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΑΝΑΚΤΗΣΗ ΟΡΓΑΝΙΚΩΝ ΟΞΕΩΝ Ανάκτηση οργανικών οξέων με εκχύλιση με οργανικούς διαλύτες Εκχύλιση υδατικού διαλύματος πρότυπων οργανικών οξέων με ζυμέλαια Εκχύλιση οργανικών οξέων από πρότυπα υδατικά διαλύματα με ζυμέλαια σε διάφορες αναλογίες όγκων διαλύτη / διαλύματος οργανικών οξέων Επίδραση του ph στην εκχύλιση οργανικών οξέων από πρότυπα υδατικά διαλύματα οργανικών οξέων με ζυμέλαια Εκχύλιση οργανικών οξέων από τα υγρά της ζύμωσης αχύρου με διάφορες αλκοόλες ΚΕΦΑΛΑΙΟ xxi

22 3.5 ΚΟΣΤΟΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ ΝΕΑΣ ΓΕΝΙΑΣ ΒΙΟΚΑΥΣΙΜΟΥ ΜΕ ΒΑΣΗ ΤΟΥΣ ΕΣΤΕΡΕΣ Οικονομική ανάλυση Ερευνητικά αποτελέσματα για την οικονομική ανάλυση Προκαταρτική οικονομική ανάλυση παραγωγής βιοκαυσίμου χημικής σύστασης εστέρων από κυτταρινούχο βιομάζα Εστεροποίηση Κόστος, επένδυση και προστιθέμενη αξία ΚΕΦΑΛΑΙΟ Συμπεράσματα Επίδραση των παραγόντων κατά την οξεογένεση της γλυκόζης στη συγκέντρωση των οξέων παρουσία κίσσηρης Επίδραση της κίσσηρης στη συγκέντρωση των οργανικών οξέων και στην ταχύτητα της ζύμωσης κατά την οξεογένεση της γλυκόζης Επίδραση της κίσσηρης στη συγκέντρωση των οργανικών οξέων και στην ταχύτητα της ζύμωσης κατά την οξεογένεση της κυτταρίνης Επίδραση της διεργασίας στην τελική συγκέντρωση οργανικών οξέων Πειράματα αυξημένης κλίμακας (scale-up) Εκχύλιση οργανικών οξέων Οικονομικά συμπεράσματα Γενικά συμπεράσματα Προοπτικές της έρευνας στο πεδίο της παραγωγής νέας γενιάς βιοκαυσίμου Ερευνητικά θέματα που προκύπτουν από τα αποτελέσματα της διατριβής Βιβλιογραφία ΞΕΝΗ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΕΣ ΔΙΑΤΡΙΒΕΣ ΔΙΑΔΙΚΤΥΟΓΡΑΦΙΑ ΔΗΜΟΣΙΕΥΣΕΙΣ ΒΙΟΓΡΑΦΙΚΟ ΣΗΜΕΙΩΜΑ xxii

23 ΣΧΗΜΑΤΑ Σχήμα 1: Οι δομές της κυτταρίνης, της λιγνίνης και της ημικυτταρίνης (Alonso et al., 2012) Σχήμα 2: Βασικές μέθοδοι κυτταρικής ακινητοποίησης (Kourkoutas et al., 2004; Μπεκατώρου, 2017) Σχήμα 3: Σχηματική διάταξη των πειραματικών ενοτήτων της διατριβής Σχήμα 4: Σχέδιο του βιοαντιδραστήρα που χρησιμοποιήθηκε για τα πειράματα μεγάλης κλίμακας με την κίσσηρη ως προωθητή της οξεογένεσης του αχύρου (απολιγνινοποιημενης κυτταρίνης) Σχήμα 5: Επίδραση του ph στο ποσοστό του γαλακτικού οξέος σε συνθετικά θρεπτικά μέσα γλυκόζης με συγκέντρωση 70 g/l Σχήμα 6: Επίδραση της κίσσηρης στην οξεογένεση γλυκόζης αρχικής συγκέντρωσης 70 g/l παρουσία και απουσία κίσσηρης στους 37 o C σε διαφορετικές αρχικές τιμές ph. 107 Σχήμα 7: Κινητική παραγωγής οργανικών οξέων κατά την οξεογένεση γλυκόζης αρχικής συγκέντρωσης 70 g/l παρουσία και απουσία κίσσηρης στους 37 o C και αρχική τιμή ph Σχήμα 8: Επίδραση της θερμοκρασίας στην παραγωγή οργανικών οξέων σε διαλύματα γλυκόζης 70 g/l, και αρχική τιμή ph 9, παρουσία και απουσία κίσσηρης Σχήμα 9: Κινητική παραγωγής οργανικών οξέων κατά τη οξεογένεση γλυκόζης αρχικής συγκέντρωσης 30, 50 και 70 g/l παρουσία κίσσηρης στους 37 o C και αρχική τιμή ph Σφάλμα! Δεν έχει οριστεί σελιδοδείκτης. Σχήμα 10: Επίδραση της κίσσηρης στην οξεογένεση του αχύρου αρχικής συγκέντρωσης 30 g/l, στους 37 o C, παρουσία και απουσία κίσσηρης, σε διαφορετικές αρχικές τιμές ph Σχήμα 11: Κινητική παραγωγής οργανικών οξέων κατά τη οξεογένεση αχύρου αρχικής συγκέντρωσης 30 g/l, παρουσία και απουσία κίσσηρης, στους 37 o C και αρχική τιμή ph Σχήμα 12: Η επίδραση του αρχικού ph στην παραγωγή οργανικών οξέων σε επαναλαμβανόμενες οξεογενείς ζυμώσεις διάρκειας 9 h, ποσότητας αχύρου 30 g/l, στους 37 ο C, παρουσία και απουσία κίσσηρης Σχήμα 13: Παραγωγή οργανικών οξέων παρουσία κίσσηρης στη ζύμωση μιας παρτίδας 48 h και 4 διαδοχικών ζυμώσεων διάρκειας 9 h η κάθε μία, ποσότητας 30 g/l αχύρου, σε ph Σχήμα 14: Παραγωγή επιμέρους οργανικών οξέων σε αρχικό ph 9 για κάθε επαναλαμβανόμενη παρτίδα αναερόβιας ζύμωσης, διάρκειας 9 h, ποσότητας 30 g/l αχύρου παρουσία κίσσηρης Σχήμα 15: Επίδραση της συγκέντρωσης γλυκόζης στη συνεχή οξεογένεση παρουσία κίσσηρης Σχήμα 16: Χρήση του 1 ου ορόφου: Κινητικές στην 1 η batch οξεογένεση προσαρμογής της καλλιέργειας σε εναιώρημα 30 g/l αχύρου με γλυκόζη στους 37 o C, παρουσία κίσσηρης Σχήμα 17: Συνολικά οργανικά οξέα που παράχθηκαν κατά τη λειτουργία του 1 ου ορόφου του βιοαντιδραστήρα κατά το 2 ο, 5 ο, και 7 ο batch οξεογένεσης xxiii

24 Σχήμα 18: Κινητική της μέσης συγκέντρωσης των παραγόμενων οξέων όλων των ζυμώσεων ανά ημέρα Σχήμα 19: Κινητικές μεταβολής του ph στα batch 2, 5, 7 και 9 μεγάλης κλίμακας, παρουσία κίσσηρης Σχήμα 20: Κινητική παραγωγής βουτυρικού οξέος και ολικών οργανικών οξέων κατά την οξεογένεση απολιγνινοποιημένου άχυρου για τις επαναλαμβανόμενες παρτίδες 2, 7 και 9 στο βιοαντιδραστήρα των 82 L Σχήμα 21: Κινητική της παραγωγής οξικού οξέος και της ολικής παραγωγής οργανικών οξέων κατά την οξεογένεση απολιγνινοποιημένου άχυρου για τις επαναλαμβανόμενες παρτίδες 2, 7 και 9 στο βιοαντιδραστήρα 82 L Σχήμα 22: Κινητική της παραγωγής προπιονικού και ισοβουτυρικού οξέος κατά την οξεογένεση απολιγνινοποιημένου άχυρου για τις επαναλαμβανόμενες παρτίδες 2, 7 και 9 στο βιοαντιδραστήρα των 82 L Σχήμα 23: Απόδοση παραγωγής οξικού, βουτυρικού και συνολικών οξέων για όλες τις ζυμώσεις απολιγνινοποιημένου άχυρου που διεξάχθηκαν στο βιοαντιδραστήρα των 82 L Σχήμα 24: Σύγκριση οξεογένεσης μικρής και μεγάλης κλίμακας Σχήμα 25: Προκαταρκτικό διάγραμμα ροής των διεργασιών για την παραγωγή της νέας γενιάς βιοκαυσίμου με βάση τους εστέρες από λιγνινοκυτταρινούχο βιομάζα Σχήμα 26: Κινητική οξεογένεσης παρουσία κίσσηρης σε μικρή και μεγάλη κλίμακα με πρώτη ύλη την κυτταρίνη για το σύνολο των οξέων Σχήμα 27: Κινητική παραγωγής βουτυρικού οξέος παρουσία κίσσηρης σε μικρή και μεγάλη κλίμακα με πρώτη ύλη την κυτταρίνη Σχήμα 28: Πιθανό μεταβολικό μονοπάτι οξεογένεσης της λιγνινοκυττα-ρινούχου βιομάζας παρουσία κίσσηρης (βασισμένο στο Ren et al. 1997) xxiv

25 ΠΙΝΑΚΕΣ Πίνακας 1: Παραγωγή λιγνινοκυτταρινούχου βιομάζας ανά έτος σε kt (Kim & Dale 2004) Πίνακας 2: Περιεκτικότητες κυτταρίνης, ημικυτταρίνης, λιγνίνης (% επί ξηρού) διαφόρων γεωργικών υποπροϊόντων (Gaurav et al. 2017) Πίνακας 3: Επίδραση μικροοργανισμών σε διάφορους τύπους λιγνινοκυτ-ταρινούχου βιομάζας (Sindhu et al. 2016) Πίνακας 4: Προϊόντα βιοτεχνολογικής αξιοποίησης της λιγνινοκυτταρινούχου βιομάζας (Yang et al. 2015) Πίνακας 5: Τυπικά είδη υδρολυτικών μικροοργανισμών, υποστρώματα, και παραγόμενα προϊόντα Πίνακας 6: Τα τυπικά είδη οξεογόνων μικροοργανισμών, υποστρώματα και τα παραγόμενα προϊόντα Πίνακας 7: Τα τυπικά είδη ακετογόνων μικροοργανισμών, το χρησιμοποιούμενο υπόστρωμα και τα παραγόμενα προϊόντα Πίνακας 8: Τα τυπικά είδη μεθανογενών μικροοργανισμών, το χρησιμοποιούμενο υπόστρωμα και τα παραγόμενα προϊόντα Πίνακας 9: Βιομηχανική παραγωγή οργανικών οξέων από βιομάζα διαφορετικής προέλευσης (Becker et al., 2015) Πίνακας 10: Επίδραση του αρχικού ph παρουσία κίσσηρης στην παραγωγή αιθανόλης και οργανικών οξέων σε συνθετικά θρεπτικά μέσα γλυκόζης με συγκέντρωση 70 g/l Πίνακας 11: Επίδραση της συγκέντρωσης της γλυκόζης στην παραγωγή αιθανόλης και οργανικών οξέων παρουσία κίσσηρης σε θερμοκρασία 37 ο C παρουσία κίσσηρης Πίνακας 12: Επίδραση του ph στην οξεογένεση χημικώς απολιγνινοποιημένου άχυρου συγκέντρωσης 30 g/l παρουσία κίσσηρης Πίνακας 13: Αποτελέσματα οξεογένεσης γλυκόζης 50 και 70 g/l σε αντιδραστήρα συνεχούς λειτουργίας, στους 37 ο C και σε αρχικό ph 9, παρουσία κίσσηρης Πίνακας 14: Αποτελέσματα οξεογένεσης γλυκόζης 30 g/l σε αντιδραστήρα συνεχούς λειτουργίας, στους 37 ο C και σε αρχικό ph 9, παρουσία κίσσηρης Πίνακας 15: Συγκριτικά στοιχεία στις αποδόσεις της batch και συνεχούς οξεογένεσης γλυκόζης παρουσία κίσσηρης σε διάφορες συγκεντρώσεις Πίνακας 16: Αποτελέσματα οξεογένεσης απολιγνινοποιημένου αχύρου 30 g/l σε αντιδραστήρα συνεχούς λειτουργίας, στους 37 ο C, και σε αρχικό ph 9, με ακινητοποιημένα κύτταρα σε κίσσηρη Πίνακας 17: Επαναλαμβανόμενες batch οξεογενείς ζυμώσεις αχύρου, μεγάλης κλίμακας, παρουσία κίσσηρης με φόρτωση του 1 ου ορόφου: Αποτελέσματα του 2 ου batch (30 g/l αχύρου, 37 o C) Πίνακας 18: Επαναλαμβανόμενες batch οξεογενείς ζυμώσεις αχύρου, μεγάλης κλίμακας, παρουσία κίσσηρης με φόρτωση του 1 ου ορόφου: Αποτελέσματα του 5 ου batch (30 g/l αχύρου, 37 o C) Πίνακας 19: Επαναλαμβανόμενες batch οξεογενείς ζυμώσεις αχύρου, μεγάλης xxv

26 κλίμακας, παρουσία κίσσηρης με φόρτωση του 1 ου ορόφου: Αποτελέσματα του 7 ου batch (30 g/l αχύρου, 37 o C) Πίνακας 20: Σύγκριση της οξεογένεσης μικρής και μεγάλης κλίμακας, παρουσία κίσσηρης Πίνακας 21: Επαναλαμβανόμενες batch οξεογενείς ζυμώσεις αχύρου, μεγάλης κλίμακας, παρουσία κίσσηρης με φόρτωση του 1 ου και 2 ου ορόφου: Αποτελέσματα του 8 ου batch (30 g/l αχύρου, 37 o C) Πίνακας 22: Επαναλαμβανόμενες batch οξεογενείς ζυμώσεις αχύρου, μεγάλης κλίμακας, παρουσία κίσσηρης με φόρτωση του 1 ου και 2 ου ορόφου: Αποτελέσματα του 9 ου batch (30 g/l αχύρου, 37 o C) Πίνακας 23: Παραγωγή αιθανόλης και οργανικών οξέων κατά τη διάρκεια των batch οξεογενών ζυμώσεων αχύρου, μεγάλης κλίμακας, παρουσία κίσσηρης με φόρτωση του 1 ου ή και του 2 ου ορόφου του βιοαντιδραστήρα Πίνακας 24: Σύγκριση των αποτελεσμάτων της οξεογένεσης του αχύρου με την οξεογένεση της βινάσσας, του τυρογάλακτος και απλών σακχάρων Πίνακας 25: Ποσοστά εκχύλισης (%) οργανικών οξέων πρότυπων υδατικών διαλυμάτων με ζυμέλαια σε 3 αναλογίες όγκων διαλύτη / διαλύματος οργανικών οξέων και σε ph Πίνακας 26: Ποσοστά εκχύλισης (%) οργανικών οξέων πρότυπων υδατικών διαλυμάτων με ζυμέλαια σε 3 αναλογίες όγκων διαλύτη / διαλύματος οργανικών οξέων και σε ph 1, Πίνακας 27: Ποσοστά εκχύλισης (%) οργανικών οξέων πρότυπων υδατικών διαλυμάτων με ζυμέλαια σε διαφορετικές τιμές αρχικού ph σε αναλογία διαλύτη / διαλύματος οργανικών οξέων 1: Πίνακας 28: Επίδραση του ph στα ποσοστά εκχύλισης (%) οργανικών οξέων από υγρά ζύμωσης απολιγνινοποιημένου αχύρου με διάφορους διαλύτες σε αναλογία διαλύτη / διαλύματος 1: Πίνακας 29: Κόστος επένδυσης για την παραγωγή εστέρων ως βιοκαύσιμο από λιγνινοκυτταρινούχα υλικά με ημερήσια παραγωγή L Πίνακας 30: Ανάλυση κόστους παραγωγής βιοκαυσίμου από λιγνινοκυτταρινούχο βιομάζα Πίνακας 31: Σύγκριση της οξεογένεσης μικρής και μεγάλης κλίμακας με κίσσηρη xxvi

27 ΕΙΚΟΝΕΣ Εικόνα 1: Ηφαιστειογενής κίσσηρη Εικόνα 2: Σύστημα συνεχούς λειτουργίας οξεογένεσης με κίσσηρη Εικόνα 3: Πειραματική διάταξη του συστήματος συνεχούς λειτουργίας για τη ζύμωση του απολιγνινοποιημένου αχύρου παρουσία κίσσηρης Εικόνα 4: (α) Βιοντιδραστήρας 82 L που χρησιμοποιήθηκε στα πειράματα μεγάλης κλίμακας. (β) Κίσσηρη. (γ) Διάτρητο καλάθι που περιείχε την κίσσηρη μέσα στον αντιδραστήρα xxvii

28 xxviii

29 ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΕΣ/ΞΕΝΟΙ ΟΡΟΙ ΣΥΝΤΟΜΟ- ΓΡΑΦΙΑ Άχυρο ΕΕ Batch ΠΛΗΡΗΣ ΟΝΟΜΑΣΙΑ ΕΛΛΗΝΙΚΗ ΟΝΟΜΑΣΙΑ (στο Μέρος 3-Αποτελέσματα της Διατριβής) Απολιγνινοποιημένο άχυρο, ή απολιγνινοποιημένη κυτταρίνη, ή κυτταρίνη Ευρωπαϊκή ένωση Ζυμώσεις διαλείποντος έργου SCP Single Cell protein Μονοκυτταρική πρωτεΐνη SEM Scanning Electron Microscopy Ηλεκτρονική μικροσκοπία σάρωσης MFBT Multi-stage Fixed-Bed Tower Βιοαντιδραστήρας πολλαπλών κλινών UASB Spent grains Spent yeast Spent hops Βιο-Η 2 CO 2 CH 4 Up-Flow Anaerobic Sludge Blanket Αναερόβιος αντιδραστήρας στρώματος ιλύος ανοδικής ροής Στερεά απορρίμματα βύνης μετά το στάδιο της χυλοποίησης Απορριπτόμενη μαγιά ζυθοποιίας Απορριπτόμενος λυκίσκος Βιοϋδρογόνο Διοξείδιο του άνθρακα Μεθάνιο BOD Biological oxygen demand Βιολογική απαίτηση οξυγόνου COD Chemical oxygen demand Χημική απαίτηση οξυγόνου xxix

30 xxx

31 Μέρος 1 Ο Εισαγωγή ΜΕΡΟΣ 1 O - ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΑΓΡΟΤΟΒΙΟΜΗΧΑΝΙΚΑ ΑΠΟΒΛΗΤΑ Όλες σχεδόν οι ανθρώπινες δραστηριότητες στις σύγχρονες κοινωνίες οδηγούν στην παραγωγή υγρών και στερεών αποβλήτων. Σε όλες τις δραστηριότητες στις οποίες γίνεται χρήση πρώτων υλών για παραγωγή προϊόντων και ενέργειας έχει ως αποτέλεσμα την παραγωγή αποβλήτων. Ως απόβλητα ορίζονται τα διάφορα παραπροϊόντα ανθρωπίνων δραστηριοτήτων τα οποία δεν έχουν πλέον κάποια χρησιμότητα για τον άνθρωπο, αλλά πρέπει με κάποιον τρόπο να επαναπροωθηθούν στο περιβάλλον με ασφαλή τρόπο χωρίς να υπάρξει θέμα ρύπανσης. Γενικά τα απόβλητα χωρίζονται σε 2 μεγάλες κατηγορίες, σε υγρά και στερεά, ανάλογα με το ποσοστό υγρασίας που περιέχουν. Στην Ευρώπη, κάθε χρόνο καταναλώνονται 16 t υλικών/άτομο, από τους οποίους οι 6 t γίνονται απόβλητα. Μολονότι η διαχείριση των αποβλήτων εξακολουθεί να βελτιώνεται στην ΕΕ, η Ευρωπαϊκή οικονομία εξακολουθεί να χάνει σημαντικές ποσότητες δυνητικών «δευτερογενών πρώτων υλών», όπως μέταλλα, ξύλο, γυαλί, χαρτί, και πλαστικό. Το 2010, η συνολική παραγωγή αποβλήτων στην ΕΕ ανήλθε σε 2,5 δις t, από τους οποίους ανακυκλώθηκε μόνο ένα περιορισμένο (αν και αυξανόμενο) ποσοστό (36%). Τα υπόλοιπα απορρίφθηκαν σε χωματερές ή κάηκαν, ενώ περίπου 600 Mt θα μπορούσαν να ανακυκλωθούν ή να ξαναχρησιμοποιηθούν. Επίσης, κάθε άτομο στην Ευρώπη παράγει κατά μέσο όρο 0,5 t οικιακών αποβλήτων. Μόνο το 40% αυτών επαναχρησιμοποιείται ή ανακυκλώνεται και σε ορισμένες χώρες πάνω από το 80% εξακολουθεί να εισέρχεται σε χώρους υγειονομικής ταφής (Διαδίκτυο 1). Για να μειωθεί το ποσοστό των αναξιοποίητων αποβλήτων είναι επιτακτική η ανάγκη εύρεσης νέων λύσεων. Η παραγωγή προϊόντων προστιθέμενης αξίας από αναξιοποίητα απόβλητα είναι μια ελκυστική λύση για το ολοένα και αυξανόμενο αυτό πρόβλημα καθώς εκτός από τα περιβαλλοντολογικά οφέλη έχουμε ταυτόχρονα και την παραγωγή ωφέλιμων προϊόντων, και πρόληψη δημιουργίας νέων απόβλητων και κατανάλωσης πόρων Αξιοποίηση αγροτοβιομηχανικών αποβλήτων Παραδοσιακά οι τεχνολογίες βιομετατροπής για την αξιοποίηση των αγροτοβιομηχανικών αποβλήτων είναι ουσιαστικά εκείνες που αναπτύχθηκαν για την επεξεργασία λυμάτων και χρησιμοποιούνται ευρέως. Αυτές περιλαμβάνουν αερόβιες διεργασίες και χρήση φίλτρων. Σε αυτές τις περιπτώσεις, μικροοργανισμοί ενεργούν ως προσροφητές και ισχυροί καταλύτες οξείδωσης που μετατρέπουν τα οργανικά υλικά σε CO2 και κυτταρική βιομάζα. Σε αναερόβιες διεργασίες, όπως αυτές της αναερόβιας 31

32 Μέρος 1 Ο Εισαγωγή χώνευσης το οργανικό υλικό μετατρέπεται σε CH4 & CO2 («βιοαέριο») και βιομάζα λάσπης (Kosseva, 2011). Μία άλλη διαδικασία που ακολουθείται, είναι η φωτεινή ζύμωση, δηλαδή η μετατροπή οργανικού υποστρώματος σε βιο-η2 με τη δράση φωτοσυνθετικών βακτηρίων, και κατά την οποία λαμβάνουν χώρα βιοχημικές αντιδράσεις παρόμοιες με εκείνες της αναερόβιας χώνευσης. Η φωτεινή ζύμωση διαφέρει από τη σκοτεινή ζύμωση, επειδή προχωρεί παρουσία φωτός (Rai & Singh, 2016). Στα Κεφάλαια που ακολουθούν παρουσιάζονται τα είδη των προϊόντων προστιθέμενης αξίας που προκύπτουν είτε με ανάκτηση (recovery) είτε με βιομετατροπή (bioconversion) των αποβλήτων Ανάκτηση χημικών προϊόντων Η εξαγωγή, ο κλασματικός διαχωρισμός και η απομόνωση ενώσεων υψηλής προστιθέμενης αξίας από απόβλητα συνήθως ακολουθούν τις αρχές της αναλυτικής χημείας. Στη συνέχεια εισάγονται τροποποιήσεις στη μεθοδολογία, με στόχο να μεγιστοποιηθεί η απόδοση της παραλαβής των επιθυμητών ενώσεων, που πρέπει να είναι κατάλληλες ως προς τις απαιτήσεις της βιομηχανικής μεταποίησης. Επιπλέον πρέπει τα συστατικά υψηλής προστιθέμενης αξίας να είναι απαλλαγμένα από ακαθαρσίες και τοξικές ενώσεις ενώ θα πρέπει να αποφεύγεται η αλλοίωσή τους ή η απώλεια της λειτουργικότητάς τους κατά τη διάρκεια της επεξεργασίας, ειδικά όταν πρόκειται για εφαρμογές σε βιομηχανίες τροφίμων (Galanakis, 2012) Ανάκτηση οργανικών οξέων Για την ανάκτηση των οργανικών οξέων μία βασική μέθοδος που χρησιμοποιείται είναι η εκχύλιση Soxhlet σε εργαστηριακό επίπεδο. Αν και η Soxhlet είναι μια χρονοβόρος και εντατική διεργασία κατά την οποία απαιτείται χρήση μεγάλου όγκου διαλυτών, έχει ως τώρα χρησιμοποιηθεί ευρέως για την εκχύλιση οργανικών ενώσεων από στερεά υποστρώματα λόγω της υψηλής αποτελεσματικότητάς της. Η εκχύλιση αυτή πραγματοποιείται σε τρία στάδια: βρασμός, εξαντλητική έκπλυση με το διαλύτη, και ανάκτηση διαλύτη. Η μέθοδος Soxtec επιτρέπει ταχύτερη, οικονομικότερη (καλύτερη ανάκτηση διαλύτη) και ασφαλέστερη εκχύλιση. Ως εναλλακτική λύση της εκχύλισης Soxhlet, έχουν επίσης χρησιμοποιηθεί ευρέως υπέρηχοι κατά την έκπλυση. Η διαδικασία «σπηλαίωσης» που παράγεται από το λουτρό υπερήχων μειώνει σημαντικά το χρόνο εκχύλισης που απαιτεί η Soxhlet, αν και δίνει λιγότερο αναπαραγώγιμα αποτελέσματα. Ωστόσο, οι συμβατικές διαδικασίες εκχύλισης (Soxhlet, Soxtec) συνεχίζουν να εφαρμόζονται για την ανάκτηση οργανικών ενώσεων από λυματολάσπη. Οι παραδοσιακές τεχνικές χαρακτηρίζονται από χειροκίνητο χειρισμό, μεγάλη κατανάλωση δείγματος και αντιδραστηρίων και παραγωγή μεγάλων ποσοτήτων αποβλήτων. Ωστόσο, κατά τη διάρκεια των τελευταίων δέκα ετών νέες τεχνικές έχουν εφαρμοστεί για εκχύλιση στερεών ή ημι-στερεών δειγμάτων, όπως η λυματολάσπη. Ένα επιπλέον θέμα με αυτές τις τεχνικές είναι πως στις περισσότερες περιπτώσεις το στάδιο εκχύλισης δεν είναι μοναδικό και απαιτείται ένα επιπλέον βήμα 32

33 καθαρισμού (Zuloaga et al., 2012). Μέρος 1 Ο Εισαγωγή Υπάρχουν και άλλες τεχνικές, που εφαρμόζονται για την ανάκτηση οργανικών οξέων από υγρά ζύμωσης, όπως η ηλεκτροδιαπίδυση, η ιονανταλλαγή, η προσρόφηση και η εκχύλιση υγρού-υγρού. Μεταξύ αυτών, η εκχύλιση υγρούυγρού είναι αποδεκτή ως αποτελεσματική, οικονομική και φιλική προς το περιβάλλον μέθοδος για το διαχωρισμό καρβοξυλικών οξέων. Η εκχύλιση υγρού-υγρού είναι μία από τις παλαιότερες και καθιερωμένες χημικές διεργασίες. Η απόδοση της εκχύλισης εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από τη φύση του οξέος, τη συγκέντρωση του διαλύτη εκχύλισης, τον τύπο του διαλύτη, και το ph στο οποίο γίνεται η εκχύλιση. Αλκοόλες, κετόνες, αιθέρες και αλειφατικοί υδρογονάνθρακες μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως διαλύτες για την εκχύλιση των οργανικών οξέων από υγρά ζύμωσης. Ωστόσο, ουσίες όπως το οξείδιο της τριοκτυλφωσφίνης (ΤΟΡΟ), το φωσφορικό τρι-n-βουτύλιο και αλειφατικές αμίνες βρέθηκαν να είναι πιο αποτελεσματικά μέσα για τo σκοπό αυτό (Alkaya et al., 2009) Ανάκτηση σακχάρων Η διαδικασία ανάκτησης σακχάρων από λιγνινοκυτταρινούχο βιομάζα δεν είναι εύκολη, κυρίως λόγω της δυσκολίας λήψης ζυμώσιμων σακχάρων με σπάσιμο των δεσμών λιγνίνης-ημικυτταρίνης για να επιτραπεί η πρόσβαση στα ένζυμα για υδρόλυση της κυτταρίνης προς απλούστερα σάκχαρα. Αυτό επιτυγχάνεται συνήθως με διεργασίες μετατροπής υψηλής ενεργειακής κατανάλωσης, όπως η χημική υδρόλυση με όξινους ή αλκαλικούς καταλύτες, ή βιολογικές οδοί με ενζυμικούς καταλύτες. Παρόλο που η χημική υδρόλυση είναι σχετικά γρήγορη μέθοδος που παράγει υψηλές συγκεντρώσεις σακχάρων, το μέσο αντίδρασης θα πρέπει να εξουδετερώνεται μετά τη διαδικασία, δημιουργώντας εκ νέου στερεά απόβλητα. Άλλα μειονεκτήματα περιλαμβάνουν τη διάβρωση του χρησιμοποιούμενου εξοπλισμού, τη δυσκολία επαναχρησιμοποίησης των καταλυτών, και της αποδόμησης των σακχάρων. Λόγω των περιβαλλοντικών προβλημάτων που δημιουργούνται από αυτές τις τεχνικές, προτιμάται η ενζυμική διαδικασία, που εκτός του ότι δεν παράγει στερεά υπολείμματα, δε αποικοδομεί τα σάκχαρα κι έτσι δεν υπάρχουν απώλειες πρώτης ύλης ή δημιουργία αναστολέων για τους μικροοργανισμούς ζύμωσης που θα χρησιμοποιηθούν στη συνέχεια. Σε αντίθεση όμως με τις χημικές οδούς, η διαδικασία είναι αργή και ενεργοβόρα, ενώ τα ένζυμα είναι δύσκολο να ανακτηθούν και να επαναχρησιμοποιηθούν. Επιπλέον, τα ένζυμα δεν μπορούν να διασπάσουν τους δεσμούς λιγνίνης-ημικυτταρίνης, με αποτέλεσμα αυτή η διαδικασία να απαιτεί στάδιο προκατεργασίας για να επιτραπεί στα ένζυμα η πρόσβαση στην κυτταρίνη και ημικυτταρίνη. Λόγω της αυξανόμενης κατανόησης των διεργασιών που λαμβάνουν χώρα κατά τη διάρκεια της υδρόλυσης, η βιομάζα γίνεται όλο και περισσότερο αντικείμενο εκμετάλλευσης με νέες τεχνικές. Μια φυσικοχημική προσέγγιση χρησιμοποιεί το υπο/υπερκρίσιμο νερό ως μέσο αντίδρασης. Αυτή η διαδικασία αποικοδομεί τα σάκχαρα σε λιγότερο βαθμό σε σχέση με τη χημική υδρόλυση, δεν παράγει στερεά υπολείμματα και είναι εξαιρετικά γρήγορη, σε σύγκριση τόσο με τις χημικές όσο και με τις ενζυμικές οδούς. Επίσης, μπορεί να 33

34 Μέρος 1 Ο Εισαγωγή οδηγήσει σε αποφυγή του σταδίου προεπεξεργασίας που απαιτείται στις ενζυμικές διεργασίες (Prado et al., 2016) Ανάκτηση φυτικών ινών Παραδοσιακά, οι φυτικές ίνες έχουν οριστεί ως μίγμα πολυμερών πολυσακχαριτών (εκτός αμύλου), όπως κυτταρίνη, ημικυτταρίνη και πηκτίνη, που είναι ανθεκτικό στην πέψη στο γαστρεντερικό σύστημα. Ο σκοπός του διαχωρισμού των ινών αυτών στα επιμέρους συστατικά τους είναι η απομόνωση των κλασμάτων ενδιαφέροντος και η απομάκρυνση ανεπιθύμητων ενώσεων. Έχουν διερευνηθεί διάφορες μέθοδοι εκχύλισης και διαχωρισμού φυτικών ινών από διάφορες πηγές. Η μέθοδος διαχωρισμού, ο διαλύτης, η ξήρανση, η ένταση της διεργασίας, και η προέλευση των ινών, επηρεάζουν σε μεγάλο βαθμό τις ιδιότητες και τη σύνθεση των προϊόντων που προκύπτουν. Η μέθοδος διαχωρισμού επηρεάζει ακόμα και τη συμπεριφορά των ινών κατά την εφαρμογή σε τρόφιμα ή την κατανάλωση από τον ανθρώπινο οργανισμό. Οι ίνες μπορούν να εξαχθούν ως σύνολο (ολικές ίνες), ως διαλυτές ή αδιάλυτες ίνες ή και ως μεμονωμένο συστατικό. Κάποιες μέθοδοι για την εξαγωγή ινών από φυτικές πηγές περιλαμβάνουν ξηρή, υγρή, χημική, ενζυμική, φυσική, ή μικροβιακή επεξεργασία, ή συνδυασμό τους. Εφόσον δεν υπάρχει τυποποιημένη μέθοδος παραλαβής ινών, η διαδικασία τροποποιείται ανάλογα με τις υφιστάμενες ανάγκες. Ορισμένες μέθοδοι ανάκτησης ινών χρησιμοποιούνται από τη βιομηχανία, ενώ άλλες χρησιμοποιούνται για πειραματικούς και ερευνητικούς σκοπούς. Οι διαλυτές φυτικές ίνες μπορούν να απομονωθούν χρησιμοποιώντας ζεστό νερό σε συνδυασμό με EDTA για διαλυτοποίηση της πηκτίνης. Άλλες μέθοδος εκχύλισης αδιάλυτων ινών χρησιμοποιούν οξέα ή άλλες χημικές κατεργασίες σε συνδυασμό με ενζυμική πέψη για μετατροπή του υποστρώματος σε ημικυτταρίνη, κυτταρίνη και λιγνίνη (Maphosa & Jideani, 2016) Ανάκτηση φαινολικών συστατικών Οι κύριες κατηγορίες των φαινολικών συστατικών που βρίσκονται στα φυτά, είναι ανθοκυανίνες, φλαβονόλες, φλαβαν-3-όλες (μονομερή κατεχίνης), προανθοκυανιδίνες, και παράγωγα φαινολικών οξέων ενώ οι φλαβονόνες και μη φλαβονοειδείς πολυφαινόλες βρίσκονται σε χαμηλότερο ποσό. Η κουρκουμίνη είναι επίσης παρούσα στο φυτό Curcuma longa, που είναι μια άλλη πολυφαινόλη που χρησιμοποιείται συνήθως στη βιομηχανία τροφίμων. Οι φαινολικές αυτές ενώσεις αν και έχουν αντιοξειδωτικές ιδιότητες και πολλά οφέλη για την υγεία, είναι επιρρεπείς στην αποικοδόμηση. Έτσι, για εφαρμογές στην παραγωγή τροφίμων χρησιμοποιούνται ενθυλακωμένες, π.χ. σε μήτρες πρωτεΐνης ή πολυσακχαριτών. Οι μέθοδοι για την ενθυλάκωση φαινολικών ενώσεων περιλαμβάνουν διεργασίες όπως γαλακτωματοποίηση, ζελατινοποίηση, ξήρανση με ψεκασμό, συσσωμάτωση, κ.α., που είναι κατάλληλες για ευρύ φάσμα ενώσεων. Ωστόσο, η υψηλή κατανάλωση ενέργειας αυτών των μεθόδων ή η θερμότητα που απαιτείται και μπορεί να οδηγήσει σε αποικοδόμηση των θερμοευαίσθητων ενώσεων, περιορίζουν τις εφαρμογές τους (Jia et al., 2016). 34

35 Μέρος 1 Ο Εισαγωγή Άλλος τρόπος ανάκτησης λειτουργικών ενώσεων από απόβλητα είναι η χρήση μεμβρανών. Με χρήση υπερδιήθησης και νανοδιήθησης μπορούν να ανακτηθούν ξεχωριστά συγκεκριμένες φαινολικές ενώσεις που ανάλογα με τη βιολογική τους δραστηριότητα, έχουν διάφορες εφαρμογές στις βιομηχανίες τροφίμων και φαρμάκων. Επιπλέον, σε σύγκριση με τις παραδοσιακές μεθόδους, αυτές οι διεργασίες διαχωρισμού είναι οικονομικά βιώσιμες και φιλικές προς το περιβάλλον, λόγω της υψηλής ανάκτησης που επιτυγχάνεται, αλλά και επειδή δεν απαιτείται η χρήση άλλων ουσιών, βλαβερών ή μη (Castro- Munoz et al., 2016) Βιοτεχνολογικά προϊόντα Από τα παραπάνω υποστρώματα με βιοτεχνολογική μετατροπή (ζύμωση φωτεινή, ζύμωση σκοτεινή, αναερόβια χώνευση μπορούν να παραχθούν και να παραληφθούν διάφορα προϊόντα όπως οργανικά οξέα (γαλακτικό κυρίως, κιτρικό, ιτακονικό, κλπ). Τα οργανικά οξέα αναφέρονται σαν η τρίτη μεγαλύτερη κατηγορία μεταξύ των βιολογικών προϊόντων, θεωρούνται βασικά χημικά δομικά στοιχεία και μπορούν να παραχθούν με μικροβιακή επεξεργασία. Το κιτρικό οξύ το γαλακτικό οξύ και το οξικό οξύ είναι από τα πιο συνηθισμένα μεταξύ των οργανικών οξέων και χρησιμοποιούνται από ένα ευρύ φάσμα βιομηχανιών και μονάδων επεξεργασίας, όπως η επεξεργασία τροφίμων, η βιομηχανία ζωοτροφών, οι φαρμακοβιομηχανίες. Διάφορα βακτήρια όπως τα Arthrobacter paraffinensis, Bacillus sp., Lactobacillus sp., Streptococcus thermophillus, και μύκητες όπως Aspergillus sp., Penicillium sp., Yarrowia sp., χρησιμοποιούνται εμπορικά για την παραγωγή οργανικών οξέων (Panda et al., 2016) Γαλακτικό οξύ Lactobacillus Leuconostoc Pediococcus Lactococcus Streptococcus Aerococcus Carnobacterium Enterococcus Oenococcus, Sporolactobacillus Tetragenococcus Vagococcus Weissella Το γαλακτικό οξύ είναι ένα ευρέως διαδεδομένο οργανικό οξύ που μπορεί να παραχθεί τόσο με ζύμωση όσο και με χημική σύνθεση. Περίπου 90% της παγκόσμιας παραγωγής οφείλεται σε βακτηριακή ζύμωση. Τα ομοζυμωτικά βακτήρια του γαλακτικού οξέος παράγουν σχεδόν καθαρό γαλακτικό οξύ (90% καθαρότητα). Το γαλακτικό οξύ χρησιμοποιείται σε τρόφιμα, φαρμακευτικά, χημικά, και καλλυντικά, ενώ χαρακτηρίζεται ως γενικά ασφαλές για ανθρώπινη κατανάλωση (GRAS). Το γαλακτικό οξύ χρησιμοποιείται επίσης για την παραγωγή βιοδιασπώμενων και βιοσυμβατών πολυμερών, όπως το πολυγαλακτικό οξύ. Υπάρχουν αρκετές μελέτες που περιγράφουν την παραγωγή γαλακτικού οξέος από αγροτοβιομηχανικά υπολείμματα, όπως π.χ., η παραγωγή από απόβλητα επεξεργασίας μάνγκο (63,33 g/l), καλαμποκιού (37,62 g/l), και πατάτας (38.88 g/l) χρησιμοποιώντας το βακτήριο Lactobacillus casei (Panda et al., 2016). 35

36 Οξικό οξύ Acetobacter Acidiphilium Acidomonas Belnapia Gluconacetobacter Gluconobacter Kozakia Muricoccus Neoasaia Oleomonas Paracraurococcus Roseococcus Saccharibacter Teichococcus Μέρος 1 Ο Εισαγωγή Το οξικό οξύ είναι ένα άλλο δημοφιλές οργανικό οξύ και ως προϊόν ζύμωσης χρησιμοποιείται παγκοσμίως υπό μορφή ξυδιού. Το οξικό οξύ είναι ένα προϊόν αναερόβιας ζύμωσης και αερόβιας οξείδωσης (οξοποίηση). Είδη Clostridium και Acetobacterium μπορούν να μετατρέψουν τη γλυκόζη σε οξικό οξύ μέσα σε ένα μόνο βήμα, αν και η χρήση βακτηρίων του οξικού οξέος (Acetobacter) είναι αυτή που συνιστάται ως επί το πλείστων για την παραγωγή οξικού οξέος κατάλληλου για τρόφιμα. Πολλές μελέτες έχουν διεξαχθεί για την παραγωγή οξικό οξέως από αγροτοβιομηχανικά απόβλητα, όπως για παράδειγμα η παραγωγή από απόβλητα επεξεργασίας ανανά. Οι φλούδες του ανανά στην περίπτωση αυτή, πρώτα υπέστησαν ζύμωση για 48 h με Saccharomyces cerevisiae για παραγωγή αιθανόλης, και στη συνέχεια η αιθανόλη υπέστη αερόβια ζύμωση με Acetobacter aceti για 9 ημέρες ώστε να μετατραπεί σε οξικό οξύ. Παρόμοια πειράματά έχουν γίνει και με άλλα απόβλητα όπως φλούδες παπάγιας (Panda et al., 2016) Ιτακονικό οξύ Aspergillus terreus Rt A. terreus Rt A. niger Rt Escherichia coli Rt Yarrowia lipolytica Ustilago maydis Candida sp. Pseudozyma antartica Η μικροβιακή παραγωγή ιτακονικού οξέως έχει επίσης επιχειρηθεί με τη χρήση αγροτοβιομηχανικών απόβλητων. Το ιτακονικό οξύ είναι μία από τις πιο ελπιδοφόρες ουσίες μεταξύ των οργανικών οξέων καθώς χρησιμοποιείται στην κατασκευή τεχνητού γυαλιού, στη φαρμακευτική, στην ιατρική, στη γεωργία, στην παραγωγή καουτσούκ και χρωμάτων κ.α. Ήδη έχει αναπτυχθεί μια πολλά υποσχόμενη μέθοδος για την παραγωγή του ιτακονικού οξέως με το μικροοργανισμό Ustilago maydis από διαφορετικά αγροτοβιομηχανικά απόβλητα, όπως κελύφη φιστικιού και απόβλητα πορτοκαλιών (Panda et al., 2016) Ηλεκτρικό οξύ Actinobacillus succinogenes Escherichia coli Saccharomyces cerevisiae Anaerobiospirillum succiniciproducens Corynebacterium glutamicum Mannheimia succiniciproducens Basfia succiniciproducens Ομοίως, το ηλεκτρικό οξύ έχει και αυτό μεγάλη σημασία, δεδομένου ότι χρησιμοποιείται σήμερα σε τρόφιμα, ποτά, καθώς και από τις φαρμακευτικές βιομηχανίες. Το ηλεκτρικό οξύ θεωρείται ως γενικά ασφαλής ουσία από τον FDA. Το ηλεκτρικό οξύ έχει απεδείχθη ότι μπορεί να παραχθεί από φρούτα με αρκετά καλά αποτελέσματα, όπως ροδάκινα που κρίθηκαν ακατάλληλα για ανθρώπινη κατανάλωση (Panda et al., 2016). 36

37 Βουτυρικό οξύ Μέρος 1 Ο Εισαγωγή Clostridium butyricum Clostridium kluyveri Clostridium pasteurianum Faecalibacterium prausnitzii Το βουτυρικό οξύ είναι επίσης μία σημαντική χημική ουσία με εφαρμογές σε χημικές και φαρμακευτικές βιομηχανίες, καθώς και βιομηχανίες τροφίμων. Χρησιμοποιείται επίσης στην παραγωγή πλαστικών, γαλακτω-ματοποιητών, απολυμαντικών και εστέρων. Σε καθαρή μορφή χρησιμοποιείται ως Fusobacterium nucleatum αρωματικό πρόσθετο σε διάφορα τρόφιμα, και ως Butyrivibrio fibrisolvens αρωματική ουσία σε αρώματα. Επιπλέον, το Eubacterium limosum βουτυρικό οξύ με καταλυτική μετατροπή μπορεί να δώσει βουτανόλη-1 που είναι ένα πολλά υποσχόμενο καύσιμο. Συντίθεται εμπορικά με πετροχημικές διεργασίες, με οξείδωση της βουτυραλδεΰδης καθώς επίσης και με μια νέα μέθοδο σύνθεσης από μηλεϊνικό ανυδρίτη. Λόγω της μεγάλης ζήτησης του και ταυτόχρονα της μείωσης του αργού πετρελαίου, υπάρχει πρόβλημα στην παραγωγή του βουτυρικού οξέος το οποίο χρήζει άμεσης αντιμετώπισης (Maiti et al., 2016) Βιοκαύσιμα Βιοκαύσιμα θεωρούνται τα καύσιμα προέρχονται από βιολογικό υλικό (φυτά, μικροοργανισμούς, ζώα και απόβλητα). Όλα τα βιοκαύσιμα έχουν την ίδια βασική και ανανεώσιμη προέλευση. Βασίζονται στην «σημερινή» φωτοσυνθετική μετατροπή της ηλιακής ενέργειας σε χημική ενέργεια, η οποία τα ξεχωρίζει από τα ορυκτά καύσιμα που βασίζονται σε αρχαία φωτοσύνθεση (Aro, 2016). Το κατά πόσο είναι ανανεώσιμη πηγή ενέργειας το κάθε βιοκαύσιμο εξαρτάται από την κατανάλωση μη ανανεώσιμης ενέργειας στη διαδικασία του κύκλου ζωής, η οποία εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από συνθήκες όπως οι διάφοροι πόροι, οι γεωγραφικές και φυσικές συνθήκες, η οικονομική κατάσταση και το επίπεδο της τεχνολογίας. Πολυάριθμες μελέτες έχουν δείξει ότι όσο ευρύτερα είναι τα όρια της αξιολόγησης του κύκλου ζωής, τόσο μικρότερη ανανεώσιμη πηγή ενέργειας είναι το παραγόμενο βιοκαύσιμο. Σε ορισμένες αναπτυσσόμενες χώρες, το βιοκαύσιμο είναι μη ανανεώσιμη ενέργεια. Μερικοί μελετητές πιστεύουν ότι το βιοκαύσιμο είναι καθαρή ενέργεια αν και υπάρχουν επίσης στοιχεία που δείχνουν ότι το βιοκαύσιμο δεν είναι τόσο καθαρό όσο αναμενόταν. Τα αέρια θερμοκηπίου που παράγονται από την ανάπτυξη βιοκαυσίμων σε τεχνολογικά ευνοημένες χώρες είναι πολύ υψηλότερο από αυτό που παράγεται από τεχνολογικά μη ευνοημένες χώρες. Επιπλέον, ορισμένα βιοκαύσιμα (όπως το βιοντίζελ) θα οδηγήσουν σε αυξημένες εκπομπές οξειδίων του αζώτου. Τέλος, ο ανταγωνισμός μεταξύ ορυκτών καυσίμων και βιοκαυσίμων θα μειώσει την τιμή των ορυκτών καυσίμων, ενισχύοντας έτσι την αύξηση της οικονομικής δραστηριότητας, η οποία θα οδηγήσει σε μεγαλύτερη ρύπανση (Ji & Long, 2016) Αλκοόλες ως χημικά πλατφόρμας ή βιοκαύσιμα Οι βιοαλκοόλες παράγονται συνήθως με ζύμωση αμύλων και σακχάρων από 37

38 Μέρος 1 Ο Εισαγωγή φυτικές πηγές όπως καλαμπόκι, σιτάρι, σακχαροκάλαμο, σακχαρότευτλα, μελάσα, απόβλητα φυτικής παραγωγής και από μικροφύκη. Η αιθανόλη, η μεθανόλη, η βουτανόλη και η προπανόλη είναι οι κυρίως παραγόμενες βιοαλκοόλες. Η πιο κοινή από αυτές είναι η βιοαιθανόλη η οποία παράγεται με ζύμωση πρώτης ύλης πλούσιας σε σάκχαρα από διάφορους μικροοργανισμούς. Οι εφαρμογές της αιθανόλης, έχουν διευρυνθεί σημαντικά λόγω της ανάπτυξης των μεθόδων καθαρισμού. Η βιοαιθανόλη μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως υποκατάστατο της βενζίνης για τη μείωση των εκπομπών CO2. Επιπλέον, κατά την καύση της, είναι δυνατόν να μειωθεί η εκπομπή ορισμένων τοξικών αερίων (CO, NO) λόγω του περιεχόμενου οξυγόνου. Για την παραγωγή βιοαιθανόλης, υπάρχουν διαθέσιμες πολλές πρώτες ύλες: σακχαρόζη και μπαγκάσσα από σακχαχαροκάλαμο, άμυλο από καλαμπόκι, και λιγνινοκυτταρινούχος βιομάζα. Επιπλέον, έχουν χρησιμοποιηθεί μικροφύκη όπως Chlorella, Chlamydomonas, Dunaliella, Scenedesmus και η Spirulina, ως πρώτη ύλη και για την παραγωγή βιοαιθανόλης. Επιπλέον, κάποια από αυτά μπορούν να εκτελέσουν αυτοζυμωτικές διεργασίες για την παραγωγή αιθανόλης. Η διαδικασία της ζύμωσης απαιτεί λιγότερη κατανάλωση ενέργειας σε σχέση με άλλες μεθόδους. Επιπλέον, το CO2 που παράγεται ως παραπροϊόν, μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως πηγή άνθρακα για την καλλιέργεια μικροφυκών και ως εκ τούτου να μειωθεί η εκπομπή αερίων του θερμοκηπίου. Η μεθανόλη είναι μία από τις πιο σημαντικές βιομηχανικά παραγόμενες αλκοόλες και μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως καθαρό καύσιμο ή ως πρόσθετο βενζίνης. Επί του παρόντος η παραγωγή μεθανόλης βασίζεται σε χημική διαδικασία, η οποία μετατρέπει το φυσικό αέριο σε μεθανόλη. Η διαδικασία αυτή αποτελείται από τρία στάδια: αναμόρφωση με ατμό, σύνθεση και απόσταξη. Επιπλέον, η μεθανόλη μπορεί να ανακτηθεί πιο εύκολα από την αιθανόλη, η οποία σχηματίζει αζεοτροπικό μίγμα με το νερό. Ένας άλλος τρόπος παραγωγής είναι με αεριοποίηση και μερική οξείδωση των υδατανθράκων με Ο2 και Η2Ο και με αντιδράσεις οξείδωσης βιομάζας. Η μεθανόλη μπορεί να παραχθεί και με ζύμωση φυτικών πρώτων υλών, από άλγη, αλλά και από απόβλητη βιομάζα. Η μετατροπή της βιομάζας σε μεθανόλη λαμβάνει χώρα με την προσθήκη επαρκούς ποσότητας υδρογόνου στο αέριο που συντίθενται. Επίσης, η διαδικασία της αεριοποίησης λαμβάνει χώρα σε ορισμένες ποικιλίες μικροφυκών, για παράδειγμα, Spiroulina sp. Επιπλέον, υπάρχει μια πληθώρα από πρωτεΐνες και υδατάνθρακες στη βιομάζα μικροφυκών, τα οποία μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την παραγωγή μεθανόλης. Παρ όλα αυτά, η βιομεθανόλη έχει λάβει λιγότερη προσοχή από ότι η βιοαιθανόλη λόγω των διαβρωτικών και τοξικών ιδιοτήτων της (Voloshin et al., 2016) Μονοκυτταρική πρωτεΐνη & ζωοτροφές εμπλουτισμένες σε πρωτεΐνη Ο όρος μονοκυτταρική πρωτεΐνη (SCP) χρησιμοποιείται για να περιγράψει πρωτεΐνες που προέρχονται από κύτταρα ή πρωτεΐνες που εξάγονται από διάφορους μικροοργανισμούς, όπως ζύμες, μύκητες, μικροφύκη, και βακτήρια. Συνήθως παράγεται με καλλιέργειες που χρησιμοποιούν διάφορες φθηνές πηγές άνθρακα, όπως τα γεωργικά απόβλητα, και προορίζονται για ανθρώπινα συμπληρώματα διατροφής και ζωοτροφές. Η παραγωγή SCP έχει μεγάλες 38

39 Μέρος 1 Ο Εισαγωγή δυνατότητες για την τροφοδοσία του συνεχώς αυξανόμενου παγκόσμιου πληθυσμού καθώς μαζικές ποσότητές της μπορούν να παραχθούν σε πολύ μικρό χρόνο. Η SCP είναι επίσης πλούσια σε λίπη, υδατάνθρακες, και βιταμίνες. Ωστόσο, το μειονέκτημα της ως προϊόν ανθρώπινης διατροφής είναι η υψηλή περιεκτικότητα σε νουκλεϊνικά οξέα, που μπορεί να προκαλέσει σοβαρό πρόβλημα δυσπεψίας, και γι αυτό η SCP είναι πιο ελκυστική για χρήση σε ζωοτροφές. Κατά τις τελευταίες δεκαετίες έχει δοκιμαστεί μια ποικιλία πρώτων υλών για την παραγωγή SCP, όπως CO2, CΗ4, μεθανόλη, αιθανόλη, διάφορα σάκχαρα, πετρελαϊκοί υδρογονάνθρακες, και αγροτοβιομηχανικά απόβλητα. Σε ορισμένες περιπτώσεις, η πρώτη ύλη απαιτεί προεπεξεργασία ή και υδρόλυση πριν τη χρήση. Οι πηγές άνθρακα που χρησιμοποιούνται για την παραγωγή της SCP είναι συνήθως άφθονες και φθηνές. Η παραγωγή SCP είναι επομένως μία κατάλληλη μέθοδος για τη μετατροπή αποβλήτων σε χρήσιμη βιομάζα που περιέχει πρωτεΐνη (Jahanshahi and Najafpour, 2007). 39

40 Μέρος 1 Ο Εισαγωγή ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΑΠΌΒΛΗΤΑ ΤΗΣ ΒΙΟΜΗΧΑΝΊΑΣ ΤΡΟΦΙΜΩΝ Οι βιομηχανίες τροφίμων παράγουν μεγάλες ποσότητες αποβλήτων και απορριμμάτων, κάποια από τα οποία μπορούν να χρησιμοποιηθούν σε άλλες εφαρμογές. Σε αυτό το κεφάλαιο παρουσιάζονται συνοπτικά ορισμένα από τα απόβλητα και απορρίμματα καθώς και κάποιοι τρόποι επεξεργασίας και εκμετάλλευσης τους Βιομηχανία γαλακτοκομικών προϊόντων Η σημερινή συνολική παραγωγή του τυρογάλακτος σε παγκόσμια κλίμακα εκτιμάται σε Mt/έτος. Το μεγαλύτερο ποσοστό προέρχεται από την ΕΕ και τις ΗΠΑ (~70%). Το ποσοστό παραγωγής τυρογάλακτος αυξάνεται αναλόγως με την αύξηση παραγωγής γάλακτος, και είναι περίπου 2% ετησίως (Yadav et al., 2015). Το τυρόγαλο είναι πράσινο-κιτρινωπό υγρό που προκύπτει από την καθίζηση και την απομάκρυνση της καζεΐνης του γάλακτος στις διαδικασίες παραγωγής τυριού. Το κιτρινωπό χρώμα του προκαλείται από την παρουσία της ριβοφλαβίνης (βιταμίνη Β2). Το σύνολο της λακτόζης του γάλακτος παραμένει στο τυρόγαλο και αποτελεί το κύριο μέρος (90%) του οργανικού του φορτίου, μαζί με λίπος και πρωτεΐνη που είναι υπεύθυνα για το υπόλοιπο. Το τυρόγαλο παρουσιάζει βιολογική απαίτηση οξυγόνου (BOD) στην περιοχή g/l και χημική απαίτηση οξυγόνου (COD) στην περιοχή g/l. Ο λόγος BOD/COD είναι συνήθως πάνω από 0,5 με αποτέλεσμα το απόβλητο να αποτελεί υπόστρωμα εύκολα βιοδιασπώμενο κατά την αναερόβια ή αερόβια πέψη. Τα ολικά αιωρούμενα στερεά έχουν τιμές ~1,3-22,0 g/l. Επιπλέον, άλλα συστατικά όπως το κιτρικό και το γαλακτικό οξέα (0,02-0,05%), οι μη πρωτεϊνικές ενώσεις αζώτου (ουρία και ουρικό οξύ) και οι βιταμίνες (ομάδα Β), μπορούν επίσης να βρεθούν στο τυρόγαλο (Carvalho et al., 2013). Το ανόργανο φορτίο του τυρογάλακτος οφείλεται στην παρουσία μεταλλικών αλάτων, κυρίως NaCl και KCl (>50%) και στα άλατα Ca (κυρίως φωσφορικά). Το ανόργανο φορτίο είναι συνέπεια της προσθήκης NaCl κατά την παραγωγή τυριού. Η υψηλή περιεκτικότητα σε Na μπορεί να προκαλέσει προβλήματα κατά τη λειτουργία βιολογικών χωνευτήρων. Το όξινο ph επηρεάζει επίσης την αποτελεσματικότητα της βιολογικής επεξεργασίας. Το τυρόγαλο μπορεί να προκαλέσει ευτροφισμό κατά την απόρριψη στο περιβάλλον που οφείλεται στη μεγάλη περιεκτικότητα Ν και P. Έτσι, είναι προφανές ότι το τυρόγαλο τυροκόμησης δεν μπορεί να απορριφθεί απευθείας στο περιβάλλον χωρίς κατάλληλη επεξεργασία ή/και αξιοποίηση. Το τυρόγαλο είναι πλούσιο σε θρεπτικά συστατικά και μπορεί να αξιοποιηθεί για την παραγωγή διάφορων προϊόντων. Συγκεκριμένα το τυρόγαλο περιέχει 93-94% νερό, λακτόζη 2-8% επί ξηρού, διαλυτές πρωτεΐνες, μέταλλα, γαλακτικό οξύ και λίπος καθώς και 40

41 Μέρος 1 Ο Εισαγωγή μικρότερες ποσότητες άλλων συστατικών, όπως κιτρικό οξύ, μη πρωτεϊνικές αζωτούχες ενώσεις (ουρικό οξύ), βιταμίνες (συμπλέγματος Β), κ.α. (Prazeres et al., 2012). Η επεξεργασία του τυρογάλακτος πραγματοποιείται κυρίως με 2 διαδικασίες μετατροπής σε προϊόντα προστιθέμενης αξίας. Ο πρώτος είναι η φυσική ή θερμική επεξεργασία για να ληφθεί σκόνη από τυρόγαλο, συμπυκνωμένη πρωτεΐνη τυρογάλακτος, λακτόζη και άλλα κλάσματα. Η δεύτερη αφορά τη βιοτεχνολογική επεξεργασία, όπου το τυρόγαλο χρησιμοποιείται ως υπόστρωμα για διάφορες μικροβιακές/ενζυμικές διεργασίες για να ληφθούν πολύτιμα τελικά προϊόντα. Τέτοια προϊόντα είναι εμπλουτισμένες ζωοτροφές, SCP, προβιοτικά τρόφιμα και καλλιέργειες, οργανικά οξέα, ένζυμα, καροτενοειδή, κ.α. (Yadav et al., 2015) Βιομηχανία ζάχαρης Η βιομηχανία ζάχαρης παράγει διάφορα παραπροϊόντα όπως η μπαγκάσσα και η μελάσα που μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως πρώτες ύλες για άλλες διεργασίες. H μπαγκάσσα περιέχει περίπου 50% κυτταρίνη, 25% ημικυτταρίνη, 25% λιγνίνη και ενώ βρέθηκε πως περιέχει μόνο 2,4% τέφρα. Λόγω της χαμηλής περιεκτικότητάς της σε τέφρα, η μπαγκάσσα προσφέρει πολλά πλεονεκτήματα για χρήση σε διαδικασίες βιομετατροπής σε σύγκριση με άλλα υπολείμματα καλλιεργειών. 41

42 42 Μέρος 1 Ο Εισαγωγή

43 Μέρος 1 Ο Εισαγωγή Επίσης, σε σύγκριση με άλλα γεωργικά υπολείμματα, η μπαγκάσσα μπορεί να θεωρηθεί πλούσια δεξαμενή δεσμευμένης ηλιακής ενέργειας λόγω των υψηλών αποδόσεών της (περίπου 80 t/ha, σε σύγκριση με περίπου 1, 2, και 20 t/ha για το σιτάρι, άλλα χόρτα, και τα δέντρα, αντίστοιχα, και την ετήσια ικανότητα αναγέννησης της (Pandey et al., 2000). Χρησιμοποιείται για την παραγωγή ηλεκτρισμού, καυσίμων, χαρτιού και οργανικών χημικών ουσιών. Η μελάσσα χρησιμοποιείται ως πρώτη ύλη σε αποστακτήρια για την παραγωγή αιθανόλης. Άλλα απόβλητα της βιομηχανίας είναι οι κορφές, τα φύλλα και τα υπόλοιπα απορρίμματα που προέρχονται από το σακχαροκάλαμο. Συνήθως χρησιμοποιούνται για την παραγωγή ζωοτροφών και αποτελούν σημαντική πηγή θρεπτικών συστατικών (Chauhan et al., 2011) Βιομηχανία ζύθου Η βιομηχανία ζυθοποιίας παράγει σχετικά μεγάλα ποσά υποπροϊόντων και αποβλήτων. Τα στερεά απορρίμματα του βυνοποιημένου κριθαριού (spent grains) μαγιά (spent yeast), και απορρίμματα λυκίσκου (spent hops) είναι τα κύρια απόβλητα που παράγονται. Ωστόσο, τα περισσότερα από αυτά μπορούν εύκολα να αξιοποιηθούν με αποτέλεσμα, σε σύγκριση με άλλες βιομηχανίες, η βιομηχανία ζυθοποιίας να είναι περισσότερο φιλική προς το περιβάλλον. Τα spent grains είναι το πιο άφθονο παραπροϊόν ζυθοποιίας και αντιστοιχεί σε περίπου 85% των συνολικών υποπροϊόντων που παράγονται. Κατά μέσο όρο παράγονται 20 kg spent grains (31% του αρχικού βάρους της βύνης) ανά 100 λίτρα μπύρας. Τα spent grains διατίθενται με χαμηλό ή χωρίς κόστος καθ 'όλη τη διάρκεια του έτους και παράγονται σε μεγάλες ποσότητες όχι μόνο από μεγάλα αλλά και από μικρά ζυθοποιεία. Μέχρι τώρα, η κύρια εφαρμογή των spent grains ήταν ως ζωοτροφές (κυρίως για βοοειδή), λόγω της υψηλής περιεκτικότητάς τους σε πρωτεΐνες και φυτικές ίνες. Ως ζωοτροφή χρησιμοποιούνται είτε ως υγρό υπόλειμμα, λίγο μετά την απομάκρυνση από το χυλό, είτε ως ξηρό υλικό. Λόγω του χαμηλού κόστους και της υψηλής θρεπτικής αξίας τους τα spent grains έχουν χρησιμοποιηθεί για την παρασκευή τροφίμων όπως νιφάδες, ψωμί ολικής άλεσης, μπισκότα και σνακ. Ωστόσο, τα spent grains έχουν έντονα κοκκώδη υφή για άμεση προσθήκη στα τρόφιμα και πρέπει πρώτα να μετατραπούν σε αλεύρι. Η προτεινόμενη χρήση για τα spent grains είναι στην παραγωγή ενέργειας, είτε με απευθείας καύση είτε με ζύμωση για την παραγωγή βιοαερίου. Η χαμηλή περιεκτικότητα σε τέφρα και η υψηλή ποσότητα σε ινώδη υλικά (κυτταρίνη, μη κυτταρινικοί πολυσακχαρίτες και λιγνίνη) τα καθιστά κατάλληλα για χρήση σε δομικά υλικά, παρασκευή χαρτιού, παραγωγή ενεργού άνθρακα και ως συστατικό σε τούβλα. Όσον αφορά βιοτεχνολογικές διεργασίες τα spent grains έχουν χρησιμοποιηθεί ως υπόστρωμα καλλιέργειας μικροοργανισμών για μεγάλο εύρος προϊόντων (Mussatto et al., 2006). Όσον αφορά τη μαγιά, η πλεονάζουσα ανακτάται κατά τη ζυθοποιία με φυσική καθίζηση στο τέλος της δεύτερης ζύμωσης. Μόνο ένα μέρος της μαγιάς μπορεί να επαναχρησιμοποιηθεί ως νέα μαγιά παραγωγής. 43

44 Μέρος 1 Ο Εισαγωγή Η πλεονάζουσα ζύμη έχει πολύ υψηλή περιεκτικότητα σε πρωτεΐνες και βιταμίνες του συμπλέγματος Β και χρησιμοποιείται ως συμπλήρωμα διατροφής ανθρώπων και ζώων. H μαγιά αυτή έχει ξηρά συστατικά περίπου 10% w/w και παράγεται σε ποσότητα 1,5-3% του συνολικού όγκου της παραγόμενης μπύρας (Olajire, 2012). 44

45 Μέρος 1 Ο Εισαγωγή Ο απορριπτόμενος λυκίσκος παραδοσιακά χρησιμοποιείται ως λίπασμα. Ωστόσο, οι βιομηχανίες επεξεργασίας λυκίσκου αναζητούν εναλλακτικούς τρόπους αξιοποίησης. Αρκετές μελέτες σε αυτόν τον τομέα περιλάμβαναν τη χρήση του για ανάκτηση πολύτιμων βιοδραστικών συστατικών. Ο απορριπτόμενος λυκίσκος είναι επίσης πλούσιος σε πρωτεΐνες (μέχρι 29% ακατέργαστης πρωτεΐνης). Από την άποψη αυτή, η χρησιμοποίησή του ως συμπλήρωμα ζωοτροφών είναι λογική, ωστόσο, απαιτείται μείωση των πικρών οξέων του λυκίσκου καθώς τα ζώα αποφεύγουν να καταναλώσουν πικρή τροφή (Huszcza & Bartmańska, 2008). Τα υγρά λύματα από μια μονάδα ζυθοποιίας μπορούν να απορριφθούν με διάφορους τρόπους, όπως κατευθείαν απόρριψη στο περιβάλλον (ωκεανοί, ποτάμια, ρέματα ή λίμνες), στο σύστημα αποχέτευσης, με ή χωρίς προκατεργασία, και στη μονάδα επεξεργασίας λυμάτων του ζυθοποιείου. Η απόρριψη ακατέργαστων (ή μερικώς επεξεργασμένων) αποβλήτων ζυθοποιίας σε υδάτινα σώματα μπορεί προκαλέσει σοβαρά προβλήματα ρύπανσης αφού τα απόβλητα περιέχουν οργανικές ενώσεις που απαιτούν οξυγόνο για αποικοδόμηση (Simate et al., 2011) Απόβλητα φυτικής παραγωγής και μαζικής εστίασης Οι βιομηχανίες τροφίμων παράγουν μεγάλες ποσότητες αποβλήτων κατά την επεξεργασία φρούτων και λαχανικών γεγονός που επιβαρύνει τους χώρους υγειονομικής ταφής λόγω της υψηλής βιοδιασπασιμότητας τους και των εκπομπών μεθανίου κατά τη διάρκεια τις αποικοδόμησης τους. Αυτά τα απόβλητα, γενικά περιέχουν μεγάλες ποσότητες στερεών και παρουσιάζουν υψηλό BOD (π.χ. από 3,2 g/l για προϊόντα αρτοποιίας και 0,53 g/l προϊόντα με βάση το κρέας) και COD (0,9-7 g/l) γεγονός που επηρεάζει τις πιθανές λύσεις και το κόστος διαχείρισης. Η σύνθεση των οργανικών απόβλητων περιλαμβάνει σάκχαρα, ημικυτταρίνη, κυτταρίνη, λιγνίνη, και σχετικά μικρές ποσότητες πρωτεϊνών και λίπους. Επίσης περιέχουν και διάφορες τοξικές ενώσεις όπως φυτοφάρμακα, ζιζανιοκτόνα καθώς και χημικά καθαρισμού (Mirabella et al., 2014). Όσον αφορά τα δημητριακά, το σιτάρι είναι η κυρίαρχη καλλιέργεια σε χώρες μεσαίου και υψηλού εισοδήματος, ενώ στη Νότια και Ν/Α Ασία το ρύζι είναι πιο διαδεδομένο. Η άλεση των δημητριακών και η αποφλοίωση του ρυζιού παράγουν υποπροϊόντα όπως πίτουρο ή άχυρο, τα οποία είναι πλούσια σε υψηλής θρεπτικής αξίας πρωτεΐνες και διαιτητικές ίνες. Οι πατάτες είναι επίσης ένα από τα πλέον διαδεδομένα λαχανικά σε όλον τον κόσμο. Οι πατάτες περιέχουν κυρίως υδατάνθρακες (άμυλο), βιταμίνες, μέταλλα και άλλες ουσίες, όπως τα καροτενοειδή και οι φαινόλες. Τα αντίστοιχα στερεά απόβλητα της επεξεργασίας τους αποτελούνται κυρίως από φλούδες ή πατάτες που δεν επιλέχθηκαν για επεξεργασία. Οι φλούδες πατάτας και τα υπολείμματα επεξεργασίας έχουν ερευνηθεί εκτενώς για βιομετατροπή ή ανάκτηση πολύτιμων συστατικών (Galanakis, 2012). 45

46 Μέρος 1 Ο Εισαγωγή Σε αντίθεση με άλλους τύπους φρούτων, τα εσπεριδοειδή είναι βρώσιμα σε ένα μικρό ποσοστό του βάρους τους με αποτέλεσμα μεγάλες ποσότητες αποβλήτων υλικών, όπως φλούδες, πολτός και σπόροι να απορρίπτονται κατά τη διάρκεια της παραγωγής χυμών καθώς και από άλλες επεξεργασίες (μαρμελάδες, κ.α.). 46

47 Μέρος 1 Ο Εισαγωγή Αυτά τα υπολείμματα αποτελούν πηγή πολλών ενώσεων όπως διαλυτά σάκχαρα, ίνες, οργανικά οξέα, αμινοξέα, πρωτεΐνες, μέταλλα, έλαια, λιπίδια, καθώς και φλαβονοειδή και βιταμίνες. Μια μορφή αξιοποίησης αυτών των υποπροϊόντων είναι η ανάκτηση διαφόρων χρήσιμων συστατικών τους, όπως κυτταρίνη, φλαβονοειδή (π.χ. εσπεριδίνη), αιθέριο έλαιο και λιμονένιο, καροτενοειδή κ.α. Άλλη ενδιαφέρουσα μορφή αξιοποίησης τους είναι η παραγωγή ζωοτροφών για βοοειδή (Mirabella et al., 2014) Απόβλητα ζωικής παραγωγής Η κατανάλωση κρέατος παγκοσμίως έχει αυξηθεί σημαντικά για δύο κυρίως λόγους, την αύξηση του παγκόσμιου πληθυσμού και την αύξηση της κατανάλωσης ανά άτομο. Επίσης αύξηση της κατανάλωσης κρέατος έχουν προκαλέσει οικονομικοί λόγοι όπως η απελευθέρωση του εμπορίου, δημογραφικοί όπως η αστικοποίηση, και διατροφικοί όπως η αλλαγή των διατροφικών προτύπων προς την κατεύθυνση της κατανάλωσης τροφίμων με υψηλή περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη. Το κρέας θεωρείται το προϊόν διατροφής με τις μεγαλύτερες περιβαλλοντικές επιπτώσεις. Τα μεγαλύτερα προβλήματα προκύπτουν από τις κτηνοτροφικές μονάδες καθώς καταναλώνουν πολύς φυσικούς πόρους (γη, νερό και ενέργεια) και προκαλούν σοβαρή μόλυνση στον αέρα, στο νερό και στο έδαφος. Επιπλέον κατανάλωση πόρων και επιπλέον μόλυνση προκαλούν οι διαδικασίες παραγωγής όπως η σφαγή και η επεξεργασία (Djekic & Tomasevic, 2016). Ενώ η συχνότητα κατανάλωσης κρέατος έχει αυξηθεί, η προτίμηση των καταναλωτών στις ανεπτυγμένες αγορές για άπαχο κρέας και η μείωση της ζήτησης λιγότερο πολύτιμων προϊόντων όπως αίμα, σπλάχνα κ.α., που καταναλώνονταν στο παρελθόν λόγω φτώχειας, έχει ως αποτέλεσμα η βιομηχανία κρέατος να απορρίπτει μεγάλες ποσότητες υποπροϊόντων (δέρμα, οστά, εντόσθια, λιπώδεις ιστούς, πόδια, κ.α.). Συνολικά τα διάφορα παραπροϊόντα του κρέατος αποτελούν σχεδόν το 60-70% του σφαγμένου ζώου, εκ των οποίων σχεδόν το 40% είναι βρώσιμο και το 20% μη βρώσιμο. Ως εκ τούτου, η βιομηχανία κρέατος προσπαθεί να βρει νέες λύσεις για τη διαχείριση των συγκεκριμένων απόβλητων τα οποία μπορούν να αποτελέσουν σοβαρό κίνδυνο τόσο για το περιβάλλον όσο και για την ανθρώπινη υγεία. Δυστυχώς, σε αντίθεση με τα φυτικά απόβλητα, η αξιοποίηση των υποπροϊόντων της βιομηχανίας κρέατος δεσμεύεται από σοβαρούς περιορισμούς. Για παράδειγμα η σπογγώδης εγκεφαλοπάθεια των βοοειδών οδήγησε την ΕΕ στη δημοσίευση νομοθετικών μέτρων, προκειμένου να αποφευχθεί η κατάληξη μολυσμένων προϊόντων στον καταναλωτή. Παρά τις δυσκολίες αυτές γίνονται προσπάθειες ώστε να διερευνηθούν πιο αποδοτικοί τρόπο αξιοποίησης αυτών των αποβλήτων. Τα απόβλητα με βάση το κρέας, έχουν κυρίως τρεις τρόπους αξιοποίησης: τρόφιμα για ανθρώπινη χρήση, τροφές για ζώα και εφαρμογές στον τομέα της βιοτεχνολογίας και της χημικής βιομηχανίας. Η διερεύνηση των μεθόδων για απομόνωση και καθαρισμό πρωτεϊνών κρέατος, έχει οδηγήσει στη μεγιστοποίηση της ποιότητας και ποσότητας της ανακτημένης ζωικής πρωτεΐνης 47

48 Μέρος 1 Ο Εισαγωγή ώστε να μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως συστατικό τροφίμων. Επιπλέον διάφορα απόβλητα και υποπροϊόντα της επεξεργασίας κρέατος μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την ανάκτηση πολύτιμων προϊόντων με τη βοήθεια ενζυμικής υδρόλυσης (Mirabella et al., 2014) Βιομηχανία αλκοολούχων ποτών Η βινάσσα είναι παραπροϊόν της βιομηχανίας παραγωγής αιθανόλης. Είναι ένας όξινος (pη 3,5-5) σκούρος καφέ πολτός, με υψηλό οργανικό περιεχόμενο (COD g/l), και δυσάρεστη οσμή. H παραγωγή αιθανόλης από καλλιέργειες ζάχαρης, καλλιέργειες άμυλου, ή και από κυτταρινούχο υλικό, παράγουν σημαντικό όγκο βινάσσας. Κατά μέσο όρο, L βινάσσας δημιουργούνται για κάθε L αιθανόλης, ανάλογα με το αποστακτήριο. Η απόθεση βινάσσας στα εδάφη και στα υδάτινα σώματα οδηγεί σε σοβαρή περιβαλλοντική ρύπανση λόγω του υψηλού οργανικού της φορτίου. Η ακριβής χημική σύνθεση της βινάσσας ποικίλει ανάλογα με το φυτό που χρησιμοποιείται για την παραγωγή της αιθανόλης καθώς και τη διαδικασία απόσταξης. Η βινάσσα από μελάσα έχει υψηλότερες συγκεντρώσεις οργανικής ύλης, κάλιο, ασβέστιο και μαγνήσιο. Η βινάσσα από σακχαροκάλαμο, από την άλλη πλευρά, έχει σημαντικά χαμηλότερες συγκεντρώσεις αυτών των στοιχείων. Σε γενικές γραμμές η βινάσσα αποτελείται από νερό (93%), οργανικά στερεά και μέταλλα (7%). Έχει υψηλά επίπεδα οργανικής ύλης, αλλά χαμηλή περιεκτικότητα σε Ν και Ρ. Τα κύρια οργανικά συστατικά της βινάσσας από σακχαροκάλαμο είναι γλυκερόλη, γαλακτικό οξύ, αιθανόλη και οξικό οξύ), ενώ 48

49 Μέρος 1 Ο Εισαγωγή η βινάσσα από ζαχαρότευτλο περιέχει επίσης γλυκερίνη και βεταΐνη. Εκτός από αυτές τις χαμηλού μοριακού βάρους ενώσεις, η βινάσσα μπορεί να περιέχει μελανοϊδίνες, φαινολικές ενώσεις καθώς και κυτταρίνη και ημικυτταρίνη (Christofoletti et al., 2013). Για την αξιοποίηση της βινάσσας έχουν προταθεί κάποιες εναλλακτικές λύσεις όπως η χρήση της ως λίπασμα, για την παραγωγή SCP, την παραγωγή ενέργειας και ως πρώτη ύλη για την παραγωγή ζωοτρόφων (Christofoletti et al., 2013). Επιπλέον γίνονται προσπάθειες για αξιοποίηση της βινάσσας με αναερόβια χώνευση για την παραγωγή βιοαερίου (Cruz-Salomón et al., 2017) και την παραγωγή οργανικών οξέων (Lappa et al., 2015b). 49

50 Μέρος 1 Ο Εισαγωγή ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΛΙΓΝΙΝΟΚΥΤΤΑΡΙΝΟΥΧΟΣ ΒΙΟΜΑΖΑ Η λιγνινοκυτταρινούχος βιομάζα είναι ένας γενικός όρος που χρησιμοποιείται για να περιγράψει τη βιομάζα φυτικής προέλευσης. Είναι η πιο άφθονη ανανεώσιμη πηγή άνθρακα στον κόσμο. Ως απόβλητο, περιλαμβάνει τα δασικά απορρίμματα, το μη βρώσιμο τμήμα των καλλιεργειών τροφίμων, και κάθε είδους βλάστησης, και τα απόβλητα επεξεργασίας ξύλου (πριονίδι). Αυτοί οι τύποι πρώτης ύλης είναι πάντα διαθέσιμοι για την παραγωγή βιοκαυσίμων. Πίνακας 1: Παραγωγή λιγνινοκυτταρινούχου βιομάζας/έτος σε kt (Kim & Dale 2004). Υπολείμματα καλαμποκιού Άχυρο από κριθάρι Άχυρο βρώμης Άχυρο ρυζιού Αφρική Ασία Ευρώπη Β. Αμερική Κ. Αμερική Ωκεανία Ν. Αμερική Σύνολο 0,00 33,90 28,61 133,66 0,00 0,24 7,20 203,62 0,00 1,97 44,24 9,85 0,16 1,93 0,29 58,45 0,00 0,27 6,83 2,80 0,03 0,47 0,21 10,62 20,93 667,59 3,92 10,95 2,77 1,68 23,51 731,34 Άχυρο σίτου 5,34 145,20 132,59 50,05 2,79 8,57 9,80 354,35 Άχυρο σόργου 0,00 0,00 0,35 6,97 1,16 0,32 1,52 10,32 Μπαγκάσσα 11,73 74,88 0,01 4,62 19,23 6,49 63,77 180,73 Σύνολο 38,00 923,82 216,56 218,90 26,14 19,70 106, ,42 Η κυτταρίνη, η ημικυτταρίνη και η λιγνίνη είναι οι τρεις σημαντικότερες οργανικές ενώσεις που περιέχονται στη λιγνινοκυτταρινούχο βιομάζα και περιέχονται σε ποσοστά (κ.β.) περίπου 30-50%, 20-40% και 10-20%, αντίστοιχα, ανάλογα με την προέλευση του φυτού (Patel & Kumar, 2016). Η περιεκτικότητα σε υγρασία των γεωργικών υπολειμμάτων είναι 10-20%, που αποτελεί πλεονέκτημα για την παραγωγή βιοκαυσίμων με τη διαδικασία της πυρόλυσης. Η κυτταρίνη είναι ένας πολυσακχαρίτης που αποτελείται από μονάδες D- γλυκόζης συνδεδεμένες με β(1 4) δεσμούς, σχηματίζοντας γραμμικές αλυσίδες. Η κυτταρίνη βρίσκεται κυρίως στο κυτταρικό τοίχωμα της βιομάζας των φυτών. Το φυτικό κυτταρικό τοίχωμα αποτελείται από μικροϊνιδία που σχηματίζονται από αλυσίδες κυτταρίνης και συνδέονται μεταξύ τους με δεσμούς υδρογόνου. Κάθε αλυσίδα περιέχει περίπου μόρια γλυκόζης. Η ημικυτταρίνη είναι ένα ετερογενές πολυμερές που αποτελείται από μικρές αλυσίδες των μορίων πολυσακχαριτών. Περιέχει κυρίως πέντε διαφορετικά μονομερή: D- 50

51 Μέρος 1 Ο Εισαγωγή ξυλόζη, L-αραβινόζη (πεντόζες), D-γαλακτόζη, D-μαννόζη και D-γλυκόζη (εξόζες) καθώς και σε μερικές περιπτώσεις άλλα σάκχαρα όπως α-l-ραμνόζη και α-l-φουκόζη σε μικρές ποσότητες. Η ημικυτταρίνη συνδέεται με την κυτταρίνη με δεσμούς υδρογόνου και με τη λιγνίνη με ομοιοπολικούς δεσμούς. Η λιγνίνη από την άλλη είναι ένα πολυμερές που η δομή του ποικίλλει ανάλογα με το είδος του φυτού από το οποίο προέρχεται. Αντιπροσωπεύει περίπου το 30% του οργανικού άνθρακα στη βιόσφαιρα και είναι το δεύτερο πιο άφθονο βιοπολυμερές της λιγνινοκυτταρινούχου βιομάζας μετά την κυτταρίνη. Η λιγνίνη είναι ένα εξαιρετικά διακλαδισμένο και άμορφο βιομακρομόριο που τυπικά αποδίδει μοριακές μάζες μεταξύ 1000 και g/mol, ανάλογα με τη χρησιμοποιούμενη μέθοδο απομόνωσης. Αποτελείται από τρία βασικά φαινυλοπροπανολικά μονομερή γνωστά ως μονολιγνόνες: π- κουμαρόλη, κονιφερόλη, και σιναπόλη. Όταν ενσωματώνονται στο πολυμερές λιγνίνης, οι μονάδες που προέρχονται από τις μονολιγνόλες ονομάζονται μονάδες π-υδροξυφαινυλ-, γουαϊακυλ- και συριγγκύλ-μονάδες, αντιστοίχως (Figueiredo et al., 2018). Σχήμα 1: Δομές κυτταρίνης, λιγνίνης και ημικυτταρίνης (Alonso et al., 2012). Η λιγνίνη είναι ένας από τους πιο σημαντικούς περιοριστικούς παράγοντες στη μικροβιακή προσβολή της κυτταρίνης. Η έρευνα έχει δείξει ότι η απομάκρυνση της λιγνίνης διευκολύνει την υδρόλυση της κυτταρίνης. Ο μηχανισμός με τον οποίο λιγνίνη παρεμποδίζει την υδρόλυση αυτή δεν είναι ακόμα πλήρως κατανοητή. Ωστόσο, έχουν προταθεί δύο λόγοι που μπορεί να εξηγήσουν αυτό το φαινόμενο. Ο πρώτος είναι ότι η λιγνίνη προσδίδει αντοχή στο τοίχωμα του φυτικού κυττάρου με ομοιοπολική σύνδεση προς την ημικυτταρίνη με 51

52 Μέρος 1 Ο Εισαγωγή αποτέλεσμα να αποτρέπει την έκθεση του υδατάνθρακα για ενζυμική υδρόλυση. Δεύτερον, η βιομάζα που προέρχεται από ξυλώδη υποστρώματα είναι πιο δύσκολο να υδρολυθεί σε σύγκριση με τη βιομάζας προερχόμενη από χλοώδη υποστρώματα, γιατί η δομή της λιγνίνης από ξύλο είναι πολύ πιο σύνθετη σε σχέση με εκείνη των χλοωδών υποστρωμάτων. Άλλα συστατικά της βιομάζας είναι πηκτίνη, τέφρα (5-10% σε γεωργικά απορρίμματα και περίπου 1% σε ξύλο) καθώς και άλατα και μέταλλα σε μικρές ποσότητες (Ravindran & Jaiswal, 2016). Βέβαια ανάλογα με την προέλευση της λιγνινοκυτταρινούχου βιομάζας υπάρχουν διαφορές στην αναλογία κυτταρίνης-ημικυτταρίνης-λιγνίνης. Ενδεικτικά στον Πίνακα 2 φαίνονται αυτές οι αναλογίες σε βιομάζες διαφόρων προελεύσεων. Πίνακας 2: Περιεκτικότητες κυτταρίνης, ημικυτταρίνης, λιγνίνης (% επί ξηρού) διαφόρων γεωργικών υποπροϊόντων (Gaurav et al. 2017). Λιγνινοκυτταρινούχος βιομάζα Κυτταρίνη Ημικυτταρίνη Λιγνίνη Κέλυφος καρύδας 20,8 22,7 50,7 Υπολείμματα ανανά 19,4 22,4 4,7 Δασικά υπολείμματα 46,3 28,3 26,5 Πυρήνας κοκοφοίνικα Ζαχαροκάλαμο Υπολείμματα σόγιας Υπολείμματα καλαμποκιού Άχυρο σίτου Ίνες κοκοφοίνικα 20,8 38,8 28,5 Κορμός κοκοφοίνικα 41,2 34,4 17,1 Φλοιός ρυζιού 35,1 20,9 17,6 Απόβλητα μπανάνας 31, ,4 Καλάμι 39,5 29, Χρήσεις Η λιγνινοκυτταρινούχος βιομάζα είναι ένας από τους πιο άφθονους αλλά και από τους πιο υποεκμεταλλευομένους πόρους στον κόσμο. Θεωρείται μια από τις καλύτερες πηγές φθηνών υδατανθράκων και χρησιμοποιείται ως πιθανό υπόστρωμα για την παραγωγή μιας σειράς προϊόντων υψηλής αξίας, συμπεριλαμβανομένων των βιοκαυσίμων, όπως η βιοαιθανόλη και το βιοαέριο. Εκτός από την αφθονία της και τη διαθεσιμότητα της, το γεγονός ότι το 75% της σύνθεσης της είναι πολυσακχαρίτες την κάνει μία πολύ επιθυμητή πρώτη ύλη για την παραγωγή βιοκαυσίμων. Εκτός από τα βιοκαύσιμα η λιγνινοκυτταρινούχος βιομάζα μπορεί να χρησιμοποιηθεί και ως πρώτη ύλη 52

53 Μέρος 1 Ο Εισαγωγή για την παραγωγή άλλων προϊόντων προστιθέμενης αξίας, όπως τα ένζυμα και άλλα βιοτεχνολογικά προϊόντα. Τα περισσότερα από τα απόβλητα που παράγονται από τη βιομηχανία τροφίμων είναι λιγνινοκυτταρινούχα στη φύση. Τα πολύτιμα προϊόντα που μπορούν να παραχθούν από αυτά τα απόβλητα περιλαμβάνουν βιοκαύσιμα όπως αιθανόλη, βουτανόλη, βιοαέριο, συμπληρώματα διατροφής όπως τα πριβιοτικά, διάφορες βιοδραστικές ενώσεις με εμπορική σημασία όπως ένζυμα, και πολλά άλλα (Ravindran & Jaiswal, 2016; Yang et al., 2015) Αξιοποίηση της βιομάζας Για τη μετατροπή της βιομάζας σε χρήσιμα προϊόντα είναι αναγκαία η προεπεξεργασία της ώστε να διασπαστεί ή να απομακρυνθεί η λιγνίνη, να διαρραγεί η κρυσταλλική δομή της κυτταρίνης και να αυξηθεί η διαθέσιμη επιφάνεια του υλικού για ενζυμική κατεργασία. Διάφορες φυσικές, χημικές και βιολογικές μέθοδοι (επόμενο Σχήμα), όπως επίσης και συνδυασμοί τους, έχουν χρησιμοποιηθεί για την προεπεξεργασία των λιγνινοκυτταρινούχων υλικών. Μία άλλη σημαντική προεπεξεργασία που γίνεται στα λιγνινοκυτταρινούχα υλικά είναι η απολιγνινοποίηση της, με σκοπό την απομάκρυνση της λιγνίνης. Μια απλή διαδικασία απολιγνινοποίησης περιλαμβάνει θέρμανση του λιγνινοκυτταρινούχου υλικού με διάλυμα 10 kg m -3 ΝαΟΗ, η οποία παράγει πορώδη υλικά κυτταρίνης (νανο- και μικρο-σωληνοειδή κυτταρίνη) που μπορεί να χρησιμοποιηθεί πολύ ευκολότερα. Το επόμενο βήμα μετά την προεπεξεργασία του λιγνινοκυτταρινούχου υλικού είναι η υδρόλυση της κυτταρίνης σε απλά σάκχαρα. Η ενζυμική υδρόλυση της κυτταρίνης έχει πολυάριθμα πλεονεκτήματα έναντι άλλων μεθόδων υδρόλυσης (π.χ. όξινη υδρόλυση), όπως ηπιότερες συνθήκες (θερμοκρασίες C και ph 4,5-5,0), απλούστερος εξοπλισμός, αποφυγή διάβρωσης του εξοπλισμού, μη υποβάθμιση των παραγόμενων σακχάρων ή παραγωγή τοξικών παραπροϊόντων, και γενικά θεωρείται φιλική προς το περιβάλλον διαδικασία. Tα ένζυμα που αποδομούν τη λιγνινοκυτταρινούχο βιομάζα παράγονται από ποικιλία μικροοργανισμών, όπως των σαπροφυτικών που αναπτύσσονται σε σάπια οργανική ύλη, καθώς και παθογόνων των φυτών.τα είδη Aspergillus niger, Trichoderma reesei & Trichoderma viride, είναι οι πιο μελετημένοι μύκητες για την παραγωγή κυτταρινάσης και επίσης προτιμώνται για τη βιομηχανική παραγωγή ενζύμων. Ο T. reesei μεταφέρει περίπου 200 γονίδια υδρολάσης γλυκοζιτών και παράγει ένα εξωκυτταρικό, σταθερό και αποτελεσματικό σύστημα κυτταρινάσης, το οποίο όμως δεν είναι ικανό για την πλήρη υδρόλυση της κελλοβιόζης. Επιπλέον οι β-γλυκοσιδάσες από Τ. reesei είναι λιγότερο ανεκτικές στη γλυκόζη σε σύγκριση με αυτές των ειδών Aspergillus. Άρα τα μεταλλαγμένα γενετικά Τ. reesei για να εκφράζουν το ένζυμο του Aspergillus είναι τα πλέον κατάλληλα για να έχουμε τον καλύτερο συνδυασμό για την αποτελεσματική υδρόλυση της κυτταρίνης (Kandylis et al., 2016). 53

54 Μέρος 1 Ο Εισαγωγή Βιοτεχνολογική αξιοποίηση Στον Πίνακα 3 παρατηρείται πως μπορεί να επιτευχθεί μεγάλο ποσοστό απομάκρυνσης της λιγνίνης που μπορεί να οδηγήσει σε πιο εκτεταμένη αύξηση στην υδρόλυση της βιομάζας με τη χρήση μικροοργανισμών. Αυτό θα οδηγήσει και σε καλύτερες αποδόσεις στην παραλαβή σακχάρων, γεγονός που στη συνέχεια θα δώσει καλύτερα αποτελέσματα και στην παραγωγή των διαφόρων προϊόντων. 54

55 Μέρος 1 Ο Εισαγωγή Πίνακας 3: Επίδραση μικροοργανισμών σε διάφορους τύπους λιγνινοκυτταρινούχου βιομάζας (Sindhu et al. 2016). Μικροοργανισμός Υπόστρωμα Αποτέλεσμα Punctualaria sp. TUFC20056 Καλάμια μπαμπού 50% απομάκρυνση λιγνίνης Irpex lacteus Κοτσάνια καλαμποκιού 82% απόδοση υδρόλυσης Fungal consortium Άχυρο Επταπλάσια αύξηση στην υδρόλυση Pleourotus ostreatus/p. pulmonarius Πριονίδι από Eucalyptus grandis Phanerochaete chrysosporium Φλοιός ρυζιού Fungal consortium Υπολείμματα καλαμποκιού 20 φορές αύξηση στην υδρόλυση 43,8% απομάκρυνση λιγνίνης/7πλάσια αύξηση υδρόλυσης Ceriporiopsis subvermispora Άχυρο σίτου Ελάχιστη απώλεια κυτταρίνης C. subvermispora Υπολείμματα καλαμποκιού 2-3 φορές αύξηση στην απόδοση των αναγόμενων ζάχαρων Fungal consortium Βιομάζα από φυτά Πλήρης εξάλειψη της χρήσης επικίνδυνων χημικών ουσιών Πίνακας 4: Προϊόντα βιοτεχνολογικής αξιοποίησης της λιγνινοκυτταρινούχου βιομάζας (Yang et al. 2015). Ένζυμο/μικροοργανισμός Υπόστρωμά Προϊόν Pichia stipitis Υπολείμματα καλαμποκιού Cellulase/S. cerevisiae CHY 1011 Μίσχανθος S. cerevisiae Φλοιός ελάτου Βιο-αιθανόλη Εμπορικά ένζυμα/μαγιά Caldicellulosiruptor saccharolyticus Novozyme NS22086, NS22083, NS22118 Cellulase και beta-glucosidase, C. acetobutylicum NRRL B-591 Mannheimia succiniciproducens MBEL55E Aspergillus terreus Panus tigrinus Κυτταρινολυτικοί μύκητες Aspergillus carneus M34 Fusarium sp. Grifola frondosa Κίτρινη λεύκα και υπολείμματα ξύλου Ζαχαρόχορτο Άχυρο σίτου Άχυρο ρυζιού Υδρολυμένο ξύλο Άχυρο ρυζιού ελαφρά επεξεργασμένο με βάση Άχυρο ρυζιού, φλοιός ρυζιού, φλοιός από κασσάβα Υπολείμματα από κυτταρίνη (φλοιός ρυζιού, πίτουρο σίτου, κότσαλος καλαμποκιού) Γεωργικά υπολείμματα Άχυρο σίτου, πίτουρο σίτου, Πριονίδι βελανιδιάς με πίτουρο καλαμποκιού Βιο-υδρογόνο Ακετόνη Ηλεκτρικό οξυ Κυτταρινάσες Λακάσες και Υπεροξειδάσες λιγνίνης Φυτάση Ξυλανάσες Ξυλανάσες και Κυτταρινάσες 55

56 Μέρος 1 Ο Εισαγωγή Στον Πίνακα 4 αναφέρονται διάφορα προϊόντα που παράγονται από βιοτεχνολογική αξιοποίηση λιγνινοκυτταρινούχου βιομάζας. Παρατηρείται επιπλέον πως από τη λιγνοκυτταρινούχο βιομάζας μπορούν να ληφθούν ποικιλία προϊόντων ανάλογα με την προέλευση του υποστρώματός και το χρησιμοποιούμενο μικροοργανισμό, τα οποία, μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως έχουν, ή μπορούν να χρησιμοποιηθούν σαν πρώτες ύλες σε άλλες διεργασίες για παραγωγή νέων προϊόντων Σύγχρονες τάσεις και προοπτικές Η λιγνινοκυτταρινούχος βιομάζα έχει μεγάλες δυνατότητες για χρήση στην παραγωγή βιοκαυσίμων. Ειδικότερα, η δεύτερης γενιάς βιοαιθανόλη μπορεί να συμβάλλει σε ένα καθαρότερο περιβάλλον. Ωστόσο, το υψηλό κόστος των ένζυμων που προσβάλουν τη λιγνινοκυτταρινούχο βιομάζα είναι περιοριστικό για τον κλάδο των βιοκαυσίμων. Η σακχαροποίηση της βιομάζας σε υψηλότερες θερμοκρασίες έχει πολλά πλεονεκτήματα, καθώς ένζυμα (κυτταρινάσες και ημικυτταρινάσες) από θερμόφιλους ή θερμοανθεκτικούς μικροοργανισμούς είναι ιδιαίτερα ενεργά και σταθερά ακόμα και παρουσία υψηλών συγκεντρώσεων παρεμποδιστικών ενώσεων. Οι θερμόφιλοι ζυμομύκητες έχουν μεγαλύτερη ευελιξία σε σχέση με τις συνθήκες διεργασίας και υψηλή δραστικότητα, άρα και μικρότερη απαιτούμενη ποσότητα ενζύμου. Επιπλέον η μείωση του ιξώδους σε υψηλές θερμοκρασίες αυξάνει τη διάχυση των υποστρωμάτων κάνοντας πιο αποτελεσματική την ενζυμική υδρόλυση. Όλοι αυτοί οι παράγοντες είναι ικανοί να βελτιώσουν την αποτελεσματικότητα της βιοδιεργασίας και να κάνουν τους θερμόφιλους/θερμοανθεκτικούς μικροοργανισμούς να προτιμώνται για την παραγωγή βιοαιθανόλης (Arora et al., 2015). Επιπλέον θερμοανθεκτικά στελέχη ζυμομυκήτων μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την παραγωγή βιοαιθανόλης με ζύμωση στερεάς κατάστασης σε υψηλές θερμοκρασίες. Οι θερμοανθεκτικές ζύμες μπορούν να δημιουργηθούν με μετάλλαξη, γενετική μηχανική, μηχανική μεταβολισμού ή και απομόνωση από θερμά περιβάλλοντα. Η ταυτόχρονη σακχαροποίηση και ζύμωση σε υψηλές θερμοκρασίες έχει πολλά πλεονεκτήματα, όπως η μείωση του κόστους για ψύξη, η μειωμένη ανάγκη για νερού και ενέργεια, οι υψηλότερες αποδόσεις και η μη αναστολή στη δράση των ενζύμων. Αντίθετα, οι κρύο-ενεργές κυτταρινάσες και ημικυταρινάσες μπορούν και υδρολύουν τη βιομάζα σε χαμηλές θερμοκρασίες, αλλά με μικρότερη απόδοση. Έτσι, οι σύγχρονες μέθοδοι της γενετικής μηχανικής μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την ανάπτυξη βελτιωμένων στελεχών κυτταρινολυτικών και λιγνινολυτικών μικροοργανισμών. Ωστόσο, η παραγωγή ανασυνδυασμένων στελεχών ζυμομυκήτων έχει περιοριστεί σε μερικά είδη, όπως π.χ. Κluyveromyces marxianus και Pichia kudriavzevii, επειδή λείπουν τα αποτελεσματικά γενετικά εργαλεία (Choudhary et al., 2016). Ένα πολύ αποδοτικό βακτήριο παραγωγής γαλακτικού οξέος, ο Lactobacillus paracasei 7Β, είναι σε θέση να ζυμώσει λιγνινοκυτταρινούχα προϊόντα υδρόλυσης με καλές αποδόσεις και δυνητικά κατάλληλο για την παραγωγή L- 56

57 Μέρος 1 Ο Εισαγωγή γαλακτικού οξέος από βιομάζα σε βιομηχανικές εφαρμογές μεγάλης κλίμακας (Kuo et al., 2015). Τέλος μια άλλη δυνατότητα αξιοποίησης της βιομάζας που μελετάται είναι η αναερόβια ζύμωση αγροτοβιομηχανικών αποβλήτων για ταυτόχρονη παραγωγή οργανικών οξέων και αιθανόλης τα οποία μπορούν να αξιοποιηθούν μετά από εστεροποίηση για την παραγωγή βιοκαυσίμων (Syngiridis et al., 2013, 2014; Lappa et al., 2015b; Boura et al., 2017). 57

58 Μέρος 1 Ο Εισαγωγή ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΑΝΑΕΡΟΒΙΑ ΧΩΝΕΥΣΗ Ως αναερόβια χώνευση ορίζεται η βιολογική διεργασία κατά την οποία, οργανική ύλη μετατρέπεται κυρίως σε CH4 & CΟ2 με συνδυασμένη δράση μεικτού μικροβιακού πληθυσμού, υπό συνθήκες απουσίας οξυγόνου (Ο2) (Toerien & Ηatting, 1969). Τα τελικά προϊόντα της αναερόβιας χώνευσης παράγονται σε αναλογίες περίπου 50 75% CΗ4, (25-50%), 5-10% CΟ2 και Ν2 (1-2%). Η ανάπτυξη μεθόδων για τον έλεγχο και την παρακολούθηση της διεργασίας της αναερόβιας χώνευσης, καθώς και η οργάνωση των λειτουργικών συνθηκών, έχει προκαλέσει μεγάλο ενδιαφέρον σε πρόσφατες μελέτες. Αυτό οφείλεται κυρίως στα πλεονεκτήματα της αναερόβιας χώνευσης έναντι της συμβατικής βιολογικής επεξεργασίας, όπως είναι η σημαντική μείωση των παραγόμενων αποβλήτων καθώς και η παραγωγή καυσίμου βιοαερίου. Παρά τα πλεονεκτήματα αυτά, βελτιώσεις στη σταθερότητα της μεθόδου, στις αποδόσεις καθώς και σε διάφορα προβλήματα αναστολής εξακολουθούν να είναι απαραίτητες για να ενισχυθεί η απόδοση της αναερόβιας χώνευσης, ειδικά όταν αφορά ανθεκτικούς ρύπους (Kamali et al., 2016) Μικροβιολογία Πίνακας 5: Τυπικά είδη υδρολυτικών μικροοργανισμών, υποστρώματα, και παραγόμενα προϊόντα. Υπόστρωμα Τυπικά είδη μικροοργανισμών Προϊόντα Clostridium sp. Πρωτεΐνες Proteus vulgaris Peptococcus sp. Bacillus sp. Vibrio sp. Αμινοξέα, Σάκχαρα Clostridium sp. Υδατάνθρακες Acetivibrio cellulolyticus Staphylococcus sp. Σάκχαρα Bacteroides sp. Λιπίδια Clostridium sp. Ανώτερα λιπαρά οξέα, αλκοόλες, Micrococcus sp. αμινοξέα Staphylococcus sp. Σάκχαρα RNA, DNA Bacillus sp. Πουρίνες, πυριμιδίνες Ο πληθυσμός των βακτηρίων εντός ενός τυπικού αναερόβιου χωνευτή συχνά είναι μεγαλύτερος από κύτταρα/ml. Αυτός ο πληθυσμός αποτελείται από σακχαρολυτικά βακτήρια (~10 8 κύτταρα/ml), πρωτεολυτικά βακτήρια (~

59 Μέρος 1 Ο Εισαγωγή κύτταρα/ml), λιπολυτικά βακτήρια (~10 5 κύτταρα/ml) και μεθανογενή (~10 8 κύτταρα/ml). Διάφοροι μικροοργανισμοί με συγκεκριμένες ιδιότητες λαμβάνουν μέρος στη διαδικασία της αναερόβιας χώνευσης και επιπλέον έχει παρατηρηθεί πως υπάρχουν αλληλεπιδράσεις μεταξύ των μικροοργανισμών αυτών. Στους Πίνακες 5-8 παρουσιάζονται τα είδη που βρίσκονται συνήθως σε διαδικασίες αναερόβιας χώνευσης, το υπόστρωμα που χρησιμοποιείται από το κάθε είδος και τα παραγόμενα προϊόντα. Πίνακας 6: Τα τυπικά είδη οξεογόνων μικροοργανισμών, υποστρώματα και τα παραγόμενα προϊόντα. Υπόστρωμα Αμινοξέα Αμινοξέα Σάκχαρα Αλκοόλες Τυπικά είδη μικροοργανισμών Lactobacillus sp. Eschericia coli Staphylococcus sp. Bacillus sp. Pseudomonas sp. Micrococcus sp. Eubacterium limosum Clostridium sp. Zymomonas mobiliz Eubacterium sp. Eschericia coli Bifidobacterium sp. Acetobacterium sp. Syntrophomonas wolfei Προϊόντα Βαλερικό, ισοβαλερικό, προπιονικό, βουτυρικό Οξικό άλας, υδρογόνο, ανώτερα λιπαρά οξέα CO 2, H 2, μυρμηκικό, βουτυρικό CO 2, H 2, μυρμηκικό, αιθανόλη, γαλακτικό Μυρμηκικό, οξικό άλας, αιθανόλη, γαλακτικό Οξικό άλας Πίνακας 7: Τυπικά είδη ακετογόνων μικροοργανισμών, χρησιμοποιούμενο υπόστρωμα και παραγόμενα προϊόντα. Υπόστρωμα Βουτυρικό Προπιονικό Τυπικά είδη μικροοργανισμών Syntrophobacter wolinii Προϊόντα Οξικό άλας S. fumaroxidans H 2/CO 2, μυρμηκικό Syntrophomonas wolfei Pelotomaculum thermopropionicum P. schinkii Smithella propionica H 2/CO 2, μυρμηκικό Βουτυρικό, Οξικό άλας H 2, CO 2 Clostridium aceticum Οξικό άλας 59

60 Μέρος 1 Ο Εισαγωγή Πίνακας 8: Τυπικά είδη μεθανογενών μικροοργανισμών, χρησιμοποιούμενο υπόστρωμα και παραγόμενα προϊόντα. Υπόστρωμα Τυπικά είδη μικροοργανισμών Προϊόντα Βουτυρικό H 2, CO 2 Μυρμηκικό, H 2, CO 2 Methanothrix soehngenii Methanosaeta concilii Methanosarcina acetivorans Methanobacterium bryantii M. thermoautotrophicum M. alcaliphilum Methanobrevibacter arboriphilus Methanococcus jannaschii Methanolacinia paynteri Methanospirillum hungatei Methanoplanus endosymbiosis M. olentangyi Methanothermus fervidus Methanobacterium formicicum Methanobrevibacter smithii M. ruminantium Methanococcus voltae M. deltae M. maripaludis M. thermolithoautotrophicus Methanoplanus limicola Methanogenium cariaci M. marisnigri M. olentangyi M. tatii M. thermophilicum M. bourgense Methanocorpusculum aggregans CH 4, CO 2 CH 4 CH 4, CO Βιοχημεία Η διαδικασία της αναερόβιας χώνευσης αποτελείται από τέσσερα στάδια. Το πρώτο στάδιο είναι η υδρόλυση. Η υδρόλυση είναι ένα εξωκυτταρικό στάδιο που προκαλείται από ένζυμα που υδρολύουν και διαλυτοποιούν τα διάφορα υποστρώματα που δεν μπορούν να χρησιμοποιηθούν άμεσα από τους αναερόβιους οργανισμούς. Το δεύτερο στάδιο είναι η οξεογένεση ή ζύμωση. Η διαδικασία αυτή είναι η μετατροπή των διαλυτών υποστρωμάτων όπως τα αμινοξέα και τα σάκχαρα σε πιο απλά προϊόντα. Τα προϊόντα που παράγονται κατά τη διάρκεια της οξεογένεσης είναι σε μεγάλο βαθμό οργανικά οξέα και αλκοόλες. Το τρίτο στάδιο είναι η ακετογένεση όπου τα λιπαρά πτητικά οξέα (προπιονικό, βουτυρικό, βαλερικό, κ.λπ.) καθώς και τα άλλα οργανικά μόρια που παράγονται στο στάδιο της οξεογένεσης μετατρέπονται σε οξικό οξύ, CO2 60

61 και Η2 από τα ακετογόνα βακτήρια Μέρος 1 Ο Εισαγωγή Τελευταίο στάδιο είναι η μεθανογένεση κατά την οποία παράγεται CΗ4 & CO2, από δύο διαφορετικές ομάδες μικροοργανισμών: (1) τα ακετολαστικά μεθανογόνα βακτήρια που καταναλώνουν οξικό οξύ και παράγουν περίπου το 70% του CΗ4 στο βιοαέριο, και (2) τα μεθανογόνα βακτήρια που καταναλώνουν Η2 & CO2 (Stamatelatou et al., 2011) Οξεογένεση Η οξεογένεση περιλαμβάνει πολλαπλές αντιδράσεις για τη μετατροπή των προϊόντων υδρόλυσης σε οξέα χαμηλού μοριακού βάρους και αλκοόλης. Η τελική σύνθεση των οξέων και αλκοόλης σε αυτό το βήμα εξαρτάται από τις ποσότητες σακχάρων, αμινοξέων και λιπαρών οξέων που παράγονται κατά τη διάρκεια της υδρόλυσης. Τα μικρόβια έχουν την ικανότητα να μετατοπίζουν το μεταβολισμό τους σε πιο ανηγμένους οργανικούς μεταβολίτες, ανάλογα με τις συνθήκες που περιλαμβάνουν το pη, το διαθέσιμο υδρογόνο και τη μερική πίεση. Είναι γενικά αποδεκτό ότι υπό συνθήκες χαμηλού ph και υψηλών επιπέδων υδρογόνου και μυρμηκικού, παράγονται περισσότεροι ανηγμένοι μεταβολίτες, όπως βουτυρικό, γαλακτικό και αιθανόλη. Η οξεογένεση των σακχάρων υπό αναερόβιες συνθήκες μπορεί να αποδώσει υψηλά επίπεδα υδρογόνου. Η αποικοδόμηση των εξοζών με μικτές αναερόβιες μικροβιακές καλλιέργειες έχει μελετηθεί εκτενώς και έχει βρεθεί ότι κατά τη διάρκειά της παράγονται υδρογόνο και διάφορα μεταβολικά προϊόντα, κυρίως πτητικά λιπαρά οξέα (όπως οξικό, προπιονικό, βουτυρικό και γαλακτικό οξύ) και αλκοόλες (βουτανόλη και αιθανόλη), ανάλογα με τα παρόντα μικροβιακά είδη και τις επικρατούσες συνθήκες. Η απόδοση σε υδρογόνο μπορεί να συσχετιστεί στοιχειομετρικά με τα τελικά μεταβολικά προϊόντα με τις κύριες αντιδράσεις (1,2,3) που περιγράφουν τις μεμονωμένες διαδικασίες της οξεογένεσης: (1) C6H12O6 +2H2O 2CH3COOH + 2CO2 + 4H2 (2) C6H12O6 CH3CH2CH2COOH +2CO2 + 2H2 (3) C6H12O6 + 2H2 2CH3CH2COOH + 2H2O Οι παραπάνω αντιδράσεις δείχνουν ότι η παραγωγή οξικού και βουτυρικού οξέος οδηγεί στην ταυτόχρονη παραγωγή υδρογόνου. Το στάδιο οξεογένεσης μπορεί να ρυθμιστεί για να δώσει υδρογόνο μαζί με πτητικά λιπαρά οξέα και άλλους μεταβολίτες. Σε αυτή τη διαδικασία, η εξάλειψη των μικροοργανισμών που καταναλώνουν υδρογόνο, ο έλεγχος του ph και η ρύθμιση του υποστρώματος και της συγκέντρωσης του προϊόντος (υδρογόνου) είναι οι βασικοί παράγοντες λειτουργίας που κατευθύνουν την απόδοση του υδρογόνου (Stamatelatou et al., 2014). 61

62 Μέρος 1 Ο Εισαγωγή Παράγοντες που επηρεάζουν την αναερόβια χώνευση Οι μικροοργανισμοί που μετέχουν στην αναερόβια χώνευση ανήκουν σε διάφορες ομάδες μικροοργανισμών με διαφορετική φυσιολογία και συνυπάρχουν συνθετικά ή ανταγωνιστικά, με αποτέλεσμα διαφορετική απόκριση στις περιβαλλοντικές αλλαγές. Κατά συνέπεια, όταν η δραστικότητα μίας από τις ομάδες μικροοργανισμών αναστέλλεται, οι ρυθμοί ανάπτυξης των άλλων μικροοργανισμών επηρεάζονται, μεταβάλλοντας την ισορροπία του πληθυσμού, προκαλώντας συχνά μείωση της αποτελεσματικότητας της διαδικασίας ή ακόμη και αποτυχία. Έχει αναγνωριστεί ότι οι σημαντικότεροι παράγοντες που επηρεάζουν τη διεργασία αναερόβιας χώνευσης είναι το ph, η θερμοκρασία, η πρώτη ύλη (σύνθεση, θρεπτικά συστατικά), η παρουσία τοξικών ή ανασταλτικών ουσιών και ο ρυθμός φόρτωσης (Stamatelatou et al., 2011) ph Το pη επηρεάζει τη διάσταση των ασθενών οξέων και βάσεων και επομένως και το σχηματισμό αδιάστατων οξέων και βάσεων που μπορούν εύκολα να διεισδύσουν στην κυτταρική μεμβράνη αλλάζοντας το εσωτερικό pη των κυττάρων. Το pη επηρεάζει επίσης τη λειτουργία των εξωκυτταρικών ενζύμων και έχει αντίκτυπο στο ρυθμό υδρόλυσης. Στις περισσότερες περιπτώσεις, ο αναερόβιος μετασχηματισμός της οργανικής ύλης επιτυγχάνεται πιο αποτελεσματικά σε ουδέτερο ph. Πολλά είδη όμως μπορούν να αναπτυχθούν σε χαμηλότερες ή υψηλότερες τιμές pη. Οι χαμηλές τιμές pη και η επακόλουθη ενδιάμεση συσσώρευση οξέων είναι ανασταλτικός παράγοντας περισσότερο για τα μεθανογόνα από ότι για τα οξεογόνα βακτήρια. Τα οξεογόνα μπορούν να αναπτυχθούν και να συνεχίσουν να παράγουν οξέα σε χαμηλές τιμές pη (5-6), εντείνοντας τις ανασταλτικές συνθήκες για τα μεθανογόνα. Ωστόσο, η μεθανογένεση μπορεί να συμβεί και σε ακραία περιβάλλοντα όπου επικρατούν πολύ χαμηλές ή υψηλές τιμές pη, όπως βάλτοι, θερμές πηγές, κ.α. Είναι κοινό για τα οξεογόνα που παράγουν ένα μείγμα μεταβολικών προϊόντων να αλλάζουν το μεταβολισμό τους προς το σχηματισμού αλκοολών για να αποτρέψουν οποιαδήποτε περαιτέρω μείωση του ph (Stamatelatou et al., 2011). Η παραγωγή βιοαερίου λαμβάνει χώρα σε ουδέτερο ph, αν και είναι δυνατή η παραγωγή μεθανίου σε χαμηλότερες ή υψηλότερες τιμές ph. Το pη επηρεάζει επίσης τις δραστικότητες των μικροοργανισμών που παράγουν υδρογόνο, καθώς επηρεάζει άμεσα τη δραστηριότητα υδρογονάσης καθώς και την ακολουθούμενη μεταβολική οδό. Εντούτοις, έχει προταθεί ένα ευρύ φάσμα τιμών pη ως βέλτιστο για την παραγωγή υδρογόνου από διαφορετικές πρώτες ύλες. Η περιοχή pη 5-7,5 αναφέρεται συνήθως ως βέλτιστη, αν και χαμηλότερες ή υψηλότερες τιμές pη όπως 4,5 και 9,0 έχουν επίσης προταθεί ως βέλτιστες (Stamatelatou et al., 2014) Θερμοκρασία Καθώς αυξάνεται η θερμοκρασία, οι βιοχημικές αντιδράσεις λαμβάνουν χώρα σε όλο και υψηλότερο ρυθμό, μέχρι ένα σημείο όπου η δομή των κυτταρικών 62

63 Μέρος 1 Ο Εισαγωγή συστατικών (πρωτεΐνες, νουκλεϊνικά οξέα, κ.λπ.) αλλάζει, καθιστώντας το κύτταρο ανενεργό. Γενικά, οι μικροοργανισμοί διακρίνονται σε τρεις ομάδες ανάλογα με το εύρος θερμοκρασίας στο οποίο αναπτύσσονται: θερμόφιλοι (βέλτιστη θερμοκρασία >50 C), μεσόφιλοι (βέλτιστη θερμοκρασία C) και ψυχρόφιλοι (βέλτιστη θερμοκρασία <20 C). Τα ένζυμα που αναπτύσσονται σε έναν μικροοργανισμό, μετά από σωστή ρύθμιση, μπορούν να είναι ανθεκτικά στις μεταβολές της θερμοκρασίας. Ως αποτέλεσμα, υπάρχουν βακτηρίδια που μπορούν να αναπτυχθούν σε ένα φάσμα θερμοκρασιών. Στην πλειονότητα των αναερόβιων συστημάτων οι μικροοργανισμοί επηρεάζονται δραματικά από μικρές μεταβολές της θερμοκρασίας (ιδίως οι ακετοκλαστικοί μεθανογόνοι). Η θερμοκρασία σε συνδυασμό με άλλους παράγοντες επηρεάζει τον αριθμό των βακτηρίων που συνυπάρχουν σε ετερογενείς πληθυσμούς και ως εκ τούτου έχει σημαντικό ρόλο στην επιλογή της ομάδας των μικροοργανισμών που θα επικρατήσει σε ένα σύστημα αναερόβιας χώνευσης. Η μεσόφιλη και θερμόφιλη αναερόβια χώνευση προτιμώνται έναντι της ψυχρόφιλης λόγω του υψηλότερου ρυθμού της διαδικασίας σε αυτές τις θερμοκρασίες. Ωστόσο, οι ψυχροφιλικές θερμοκρασίες συχνά επιβάλλονται από τοπικές κλιματολογικές συνθήκες και είναι σημαντικό να βελτιωθεί η διαδικασία και σε αυτές τις συνθήκες. Οι περισσότερες έρευνες έχουν επικεντρωθεί σε μεσόφιλα βακτηρίδια εγκλιματισμένα σε χαμηλές θερμοκρασίες και όχι σε πραγματικά ψυχροφιλικά βακτήρια που απομονώνονται από φυσικά κρύα περιβάλλοντα (Stamatelatou et al., 2011) Θρεπτικά στοιχεία Αν και η απαίτηση για ιχνοστοιχεία είναι εξαιρετικά χαμηλή, η ανεπάρκεια των βασικών ιχνοστοιχείων μπορεί να προκαλέσει τη μη σωστή σύνθεση των ενζύμων και συνενζύμων που απαιτούνται για το μεταβολισμό. Αυτό περιορίζει σοβαρά την ανάπτυξη μικροοργανισμών και οδηγεί σε αστάθεια τη διαδικασία και κατά συνέπεια στην αποτυχία της. Τα μεταλλικά θρεπτικά συστατικά μπορούν να ταξινομηθούν με βάση τη συγκέντρωσή τους στα κύτταρα σε μείζονα κατιόντα (K, Mg, Ca) και μικροθρεπτικά συστατικά, γνωστά ως ιχνοστοιχεία (Mn, Fe, Co, Cu, Mo, Ni, Se, W). Η συγκέντρωση μετάλλων στα κύτταρα κυμαίνεται από 10-7 έως 10-3 Μ για τα μείζονα κατιόντα και από 10-6 έως Μ για τα ιχνοστοιχεία. Τα βασικά ιχνοστοιχεία είναι συμπαράγοντες στα ενζυμικά συστήματα που συμμετέχουν στις αναερόβιες αντιδράσεις. Τα ιχνοστοιχεία που θεωρούνται τα πιο σημαντικά στην αναερόβια χώνευση είναι τα Fe, Ni, και Co (Thanh et al., 2016). Μεταξύ των διαφόρων αυτών ιχνοστοιχείων, ο Fe είναι το πιο συχνά μελετημένο στοιχείο για την επίδραση που έχουν τα διάφορα συμπληρώματα στην αναερόβια χώνευση. Η προσθήκη 1,25% κ.β. Fe(III) σε ένα σύστημα αναερόβιας χώνευσης λυμάτων απομάκρυνε δύσοσμα υποπροϊόντα, αφού το τοξικό και δύσοσμο υδρόθειο (H2S) είχε μειωθεί κατά περισσότερο από 65%. Ο ζωτικός ρόλος του Ni στην αναερόβια χώνευση έχει επίσης αναφερθεί καθώς απαιτείται για την ανάπτυξη όλων των μεθανογόνων, ενώ σχετίζεται με την αύξηση της κατανάλωσης του οξικού οξέος και την κυριαρχία του γένους Methanosarcina (Choong et al., 2016). 63

64 Παρουσία τοξικών ουσιών Μέρος 1 Ο Εισαγωγή Η παρουσία διαφόρων ουσιών στο σύστημα της αναερόβιας χώνευσης μπορεί να δημιουργήσει προβλήματα στην όλη διαδικασία. Η αναερόβια χώνευση πρώτων υλών όπως η κοπριά έχει ως αποτέλεσμα την παραγωγή μεγάλων ποσοτήτων αμμωνίας. Η μη ιονισμένη αμμωνία είναι αρκετά ανασταλτική για τα μεθανογόνα. Υπάρχουν αντιφατικές αναφορές σχετικά με τα επίπεδα ανοχής στην αμμωνία, λόγω των διαφορών στα υποστρώματα, τη μικροχωρίδα, τις περιβαλλοντικές συνθήκες και τις περιόδους εγκλιματισμού. Η συγκέντρωση αμμωνίας που προκαλεί μείωση κατά 50% στην παραγωγή CH4 κυμαίνεται από 1,7 έως 14 g/l. Έχει όμως παρατηρηθεί πως o εγκλιματισμός διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην ανεκτικότητα της αναερόβιας κοινοπραξίας σε υψηλά επίπεδα αμμωνίας. Τα λιπαρά οξέα μακράς αλύσου δημιουργούν και αυτά προβλήματα καθώς τείνουν να προσροφούνται σε επιφάνειες και να παρεμποδίζουν τους μηχανισμούς μεταφοράς μορίων ή τις λειτουργίες προστασίας της κυτταρικής μεμβράνης. Επιπλέον, η επίπλευση βιομάζας μπορεί να συμβεί ως αποτέλεσμα της προσρόφησης των λιπαρών οξέων μακράς αλυσίδας. Η αναστολή σε θερμοφιλικά αναερόβια βακτήρια είναι πιο σοβαρή λόγω της διαφορετικής σύνθεσης των κυτταρικών μεμβρανών τους. Η βιοαποικοδόμηση αυτών λιπαρών οξέων, αν και δύσκολη, έχει παρατηρηθεί σε μεσοφιλικές και θερμόφιλες συνθήκες. Άλλες οργανικές ενώσεις που έχουν βρεθεί ότι είναι τοξικές για την αναερόβια χώνευση είναι: αλκυλοβενζόλια, αλογονωμένα βενζόλια, νιτροβενζόλια, φαινόλες και αλκυλοφαινόλες, αλογονωμένες φαινόλες, νιτροφαινόλες, αλκάνια, αλκοόλες, αλογονωμένες αλκοόλες, αλδεΰδες, αιθέρες, κετόνες, ακρυλικά άλατα, καρβοξυλικά οξέα, αμίνες, νιτρίλια, αμίδια, πυριδίνη και παράγωγά της. Η έκταση της τοξικότητας εξαρτάται από διάφορους παράγοντες όπως η συγκέντρωση της τοξικής ουσία, η συγκέντρωση των μικροοργανισμών, ο χρόνος έκθεσης, η κυτταρική ηλικία, το σχήμα διατροφής, ο εγκλιματισμός και η θερμοκρασία. Τα βαρέα μέταλλα (π.χ. Cr, Fe, Co, Cu, Zn, Cd, Ni) μπορούν να βρεθούν σε σημαντικές συγκεντρώσεις σε αστικές λυματολάσπες καθώς και σε βιομηχανικά λύματα. Αρκετά μέταλλα όπως Fe, Co, Cu, Zn, Ni, Mo είναι χρήσιμα θρεπτικά συστατικά για την παραγωγή ενζύμων. Λόγω της μη βιοδιασπασιμότητας των βαρέων μετάλλων, αυτά τείνουν να συσσωρεύονται σε τοξικές συγκεντρώσεις. Εκτός από το να προσροφηθούν, τα βαρέα μέταλλα μπορούν και να καθιζάνουν (αντιδρώντας με θειούχα, ανθρακικά ή υδροξύλια) ή να σχηματίσουν σύμπλοκα σε διάλυμα με ενώσεις που παράγονται κατά την πέψη. Ωστόσο, μόνο τα μέταλλα σε διαλυτή ελεύθερη ιονική μορφή εμφανίζουν τοξικότητα. Η σχετική ευαισθησία της οξεογένεσης και της μεθανογένεσης στα βαρέα μέταλλα είναι Cu>Zn>Cr>Cd>Ni>Pb και Cd>Cu>Cr>Zn>Pb>Ni, αντίστοιχα (Stamatelatou et al., 2011). 64

65 Μέρος 1 Ο Εισαγωγή Νέες τάσεις στην αναερόβια χώνευση αποβλήτων Υπάρχει μεγάλο ενδιαφέρον για την αναερόβια χώνευση αποβλήτων τα τελευταία χρόνια καθώς είναι μία μέθοδος που δίνει τη δυνατότητα διαχείρισης διαφόρων αποβλήτων με ταυτόχρονη παραγωγή χρήσιμων προϊόντων. Για να γίνει ακόμα πιο αποδοτική η αναερόβια χώνευση έχουν προταθεί διάφοροι τρόποι βελτίωσης. Πιο συγκεκριμένα υπάρχει τεράστιο δυναμικό χρήσης καινοτόμων προκατεργασιών για την κυτταρίνη που προέρχεται από τη βιομηχανία τροφίμων. Η επιλογή της προκατεργασίας πρέπει να γίνεται με βάση τη φυσικoχημική φύση της βιομάζας με στόχο τη μέγιστη απελευθέρωση αναγόντων σακχάρων μέσω ενζυμικής υδρόλυσης. Δυστυχώς όμως μερικές προκατεργασίες δημιουργούν ανασταλτικά στοιχεία τα οποία θα πρέπει ή να αποτρέπονται ή να απομακρύνονται κατά το σχηματισμό τους. Έτσι, οι υπάρχουσες στρατηγικές προκατεξεργασίας πρέπει να επανασχεδιαστούν για να ικανοποιηθούν οι απαιτήσεις για μεγάλης κλίμακας εφαρμογή (Ravindran & Jaiswal, 2016). Σε μία νέα μελέτη παρατηρήθηκε ότι η προκατεργασία ηλεκτροϋδρόλυσης έχει σημαντική επίδραση στη λιγνινοκυτταρινούχο βιομάζα καθώς οδήγησε στην επιτάχυνση του σταδίου υδρόλυσης στη διεργασία αναερόβιας χώνευσης. Οι οργανικές και ανόργανες ενώσεις διαλυτοποιήθηκαν αποτελεσματικά στα 15V για 45 min. Η ανάλυση έδειξε ότι η προκατεργασία ηλεκτροϋδρόλυσης επηρέασε έντονα τις δομές της κυτταρίνης (Veluchamy et al., 2017). Η προσθήκη υλικών που απορροφούν ανασταλτικές ουσίες στην αναερόβια χώνευση είναι ένας άλλος τομέας που μπορεί να διερευνηθεί περαιτέρω. Για παράδειγμα προστέθηκε ενεργός άνθρακας σε χώνευση αποβλήτων εσπεριδοειδών. Η φλούδα εσπεριδοειδών έχει ανασταλτικό αποτέλεσμα στην αναερόβια χώνευση. Η παρουσία του ενεργού άνθρακα είχε δύο επιδράσεις: μείωση της διάρκειας της φάσης υστέρησης και μεγαλύτερη παραγωγή CH4 (Fagbohungbe et al., 2016). Μία άλλη χρήση που μπορεί να επεκταθεί περαιτέρω είναι αυτή της παραγωγή ενέργειας. Ένα εργοστάσιο παραγωγής βιολογικών αποβλήτων σχεδιάστηκε χρησιμοποιώντας αναερόβια πέψη και τις τεχνολογίες κυψελών καυσίμου (Rayner et al., 2017). Διαπιστώθηκε ότι η ενσωμάτωση αυτών των τεχνολογιών σε μεγάλη κλίμακα θα μπορούσε να είναι επωφελής για το περιβάλλον. Οι κυψέλες είναι σε θέση να μετατρέψουν αποτελεσματικά τη χημική ενέργεια που αποθηκεύεται στα αστικά απόβλητα σε χρήσιμη ηλεκτρική και θερμική ενέργεια. Συνολικά, το σύστημα μπορεί να παράγει ηλεκτρική ενέργεια με ουδέτερες εκπομπές άνθρακα μεταξύ 480 kw και 1410 kw. Η χρήση της τεχνολογίας κυψελών αποφεύγει επίσης την απελευθέρωση ρύπων στην ατμόσφαιρα καθώς δεν συμβαίνει καύση του βιοαερίου. Η ενσωμάτωση αυτών των δύο τεχνολογιών είναι μια περιβαλλοντικά βιώσιμη και οικονομικά αποδοτική λύση για τη διαχείριση των αποβλήτων και την παραγωγή ενέργειας αστικών περιοχών (Rayner et al., 2017). 65

66 Μέρος 1 Ο Εισαγωγή ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΠΡΟΩΘΗΣΗ ΖΥΜΩΤΙΚΩΝ ΔΙΕΡΓΑΣΙΩΝ Η βελτίωση των διαφόρων διεργασιών έχει μεγάλη σημασία στη σύγχρονη βιοτεχνολογία καθώς με τις κατάλληλες προσαρμογές συνθηκών μπορεί να μειωθεί ο χρόνος διεργασίας, να αυξηθούν οι αποδόσεις ή και να παραχθούν διαφορετικά προϊόντα. Η προώθηση των ζυμωτικών διεργασιών με τη χρήση ακινητοποιημένων κυττάρων έχει δώσει πολύ θετικά αποτελέσματα σε αυτή την κατεύθυνση, με τη χρήση διαφόρων υλικών ως φορέων ακινητοποίησης, όπως η γ-αλουμίνα (Boura et al., 2017), η κίσσηρη (Koutinas et al., 1994) καθώς και η πορώδης απολιγνινοποιημένη κυτταρίνη (Kumar et al., 2014) Ακινητοποιημένα κύτταρα Η ακινητοποίηση ολόκληρων κυττάρων ορίζεται ως "ο φυσικός περιορισμός ή η τοποθέτηση ακέραιων κυττάρων σε μια ορισμένη περιοχή με διατήρηση κάποιας επιθυμητής καταλυτικής δραστικότητας". Η ακινητοποίηση προσομοιάζει τις συνθήκες στις οποίες βρίσκονται τα μικροβιακά κύτταρα στη φύση, λαμβάνοντας υπόψη το γεγονός ότι τα κύτταρα συναντώνται και αναπτύσσονται σε διαφορετικά είδη επιφανειών. Η σημαντική έρευνα και το βιομηχανικό ενδιαφέρον για τη χρήση ακινητοποιημένων κυττάρων σε διάφορες διεργασίες ζυμώσεων που σχετίζονται με την παραγωγή τροφίμων η βιοκαυσίμων οφείλεται στα πολυάριθμα πλεονεκτήματα που προσφέρουν αυτές οι τεχνολογίες σε σύγκριση με τα συμβατικά συστήματα ελεύθερων κυττάρων (Bekatorou et al., 2015). Η ακινητοποίηση των κυττάρων μπορεί να γίνει με διάφορους τρόπους, ανάλογα με την τεχνική που ακολουθείται και οι οποίοι συνήθως χωρίζονται διάφορες κατηγορίες όπως ακινητοποίηση σε συμπαγή φορέα, ακινητοποίηση με παγίδευση σε πορώδες πλέγμα, ακινητοποίηση χωρίς τη χρήση φορέα και περιορισμός πίσω από φράγμα (Kourkoutas et al., 2004; Bekatorou et al., 2015). Η ακινητοποίηση σε συμπαγή φορέα μπορεί να γίνει είτε με φυσικό εγκλωβισμό στους πόρους του φορέα, ή με ομοιοπολική σύνδεση της κυτταρικής μεμβράνης στο φορέα ή με συγκράτηση στο φορέα με άλλου είδους ασθενέστερες δυνάμεις (δεσμοί-η, ηλεκτροστατικές δυνάμεις, δυνάμεις Van der Waals, κ.λπ.). Η δύναμη με την οποία τα κύτταρα δεσμεύονται πάνω στο φορέα εξαρτάται από το είδος του φορέα και του κυττάρου. Σε αυτού του είδους την ακινητοποίηση είναι δυνατόν τα ακινητοποιημένα κύτταρα να πολλαπλασιαστούν και να δραπετεύσουν ανάλογα με τις υπάρχουσες συνθήκες και είναι σε ισορροπία με τα αιωρούμενα ελευθέρα κύτταρα. Η συγκεκριμένη τεχνική ακινητοποίησης έχει χρησιμοποιηθεί ευρέως κυρίως λόγω της ευκολίας της καθώς μπορεί να επιτευχθεί με απλή επαφή του φορέα με ένα κυτταρικό εναιώρημα για μια ένα σύντομο χρονικό διάστημα (Bekatorou et al., 2015). 66

67 Μέρος 1 Ο Εισαγωγή Στην ακινητοποίηση σε πορώδες πλέγμα τα κύτταρα είτε αφήνονται να διαπεράσουν το πορώδες πλέγμα μέχρι να εμποδιστεί η κινητικότητά τους από την παρουσία άλλων κυττάρων, είτε το πορώδες υλικό (π.χ. πηκτή υδροκολλοειδούς) σχηματίζεται γύρω από τα κύτταρα παγιδεύοντας τα. Αυτού του είδους η ακινητοποίηση βασίζεται στην έγκλειση των κυττάρων σε ένα σταθερό σύστημα το οποίο όμως αφήνει την κυκλοφορία των θρεπτικών συστατικών και των μεταβολιτών ενώ δεν εξαρτάται από τον τύπο του κυττάρου (Bekatorou et al., 2015). Σχήμα 2: Βασικές μέθοδοι κυτταρικής ακινητοποίησης (Kourkoutas et al., 2004; Μπεκατώρου, 2017). Η ακινητοποίηση χωρίς τη χρήση φορέα μπορεί να γίνει με κροκίδωση (φυσική) ή τεχνητά με τη χρήση παραγόντων που δημιουργούν διασταυρωμένες συνδέσεις. Η κροκίδωση κυττάρων έχει οριστεί ως η συσσωμάτωση κυττάρων για τη δημιουργία μιας μεγαλύτερης μονάδας ή ως η 67

68 Μέρος 1 Ο Εισαγωγή ιδιότητα των κυττάρων σε εναιωρήματα να προσκολληθούν μεταξύ τους και να καθιζάνουν με γρήγορο ρυθμό. Η κροκίδωση μπορεί να θεωρηθεί ως τεχνική ακινητοποίησης καθώς τα συσσωματώματα διευκολύνουν την ενδεχόμενη χρήση τους σε βιοαντιδραστήρες. Είναι η πιο απλή και ανέξοδη μέθοδος ακινητοποίησης, αν και είναι πολύ δύσκολο να ελεγχθεί και να προβλεφθεί, πράγμα που είναι απαραίτητο για τη μεγιστοποίηση της αποδοτικότητας του βιοαντιδραστήρα (Bekatorou et al., 2015). Ο περιορισμός των κυττάρων πίσω από φράγμα μπορεί να επιτευχθεί με τη χρήση ημιδιαπερατών μεμβρανών, για την απομόνωση των κυττάρων από το υγρό που περιέχει τα κύτταρα, με παγίδευση κυττάρων σε μικροκάψουλα ή με ακινητοποίηση κυττάρων στην επιφάνεια αλληλεπίδρασης δύο μη αναμίξιμων υγρών. Τα κύτταρα μπορούν να ακινητοποιηθούν στη μεμβράνη ή μπορούν να αφεθούν να αναπτυχθούν σε ένα κενό που περικλείεται από τη μεμβράνη. Αυτός ο τύπος ακινητοποίησης είναι ιδανικός όταν απαιτείται προϊόν ελεύθερο από κύτταρα και χρειάζεται ελάχιστη μεταφορά ενώσεων. Χρησιμοποιείται ευρέως στην ανακύκλωση των κυττάρων και στις συνεχείς διαδικασίες (Bekatorou et al., 2015). Η ακινητοποίηση έχει διάφορα πλεονεκτήματα καθώς λόγω της επίτευξης υψηλότερων κυτταρικών πυκνοτήτων στους βιοαντιδραστήρες, παρουσιάζεται αυξημένη πρόσληψη υποστρώματος, υψηλότερες παραγωγικότητες και μικρότεροι χρόνοι επεξεργασίας, ενώ τα κύτταρα είναι προστατευμένα έναντι διατμητικών δυνάμεων οδηγώντας σε εκτεταμένη λειτουργική σταθερότητα του βιοκαταλύτη. Επιπλέον υπάρχει δυνατότητα για συνεχή επεξεργασία ενώ είναι εύκολη η ανάκτηση των προϊόντων και η επαναχρησιμοποίηση του βιοκαταλύτη. Υπάρχει επίσης δυνατότητα οι ζυμώσεις να γίνουν σε χαμηλές θερμοκρασίες γεγονός που μπορεί να οδηγήσει σε βελτιωμένη ποιότητα προϊόντος, ενώ ταυτόχρονα σε όλες αυτές τις διαδικασίες υπάρχει μειωμένος κίνδυνος μόλυνσης λόγω των υψηλότερων κυτταρικών πυκνοτήτων και αυξημένης δραστηριότητας ζύμωσης. Όσον αφορά το κόστος, τόσο το επενδυτικό όσο και το ενεργειακό μειώνονται εξαιτίας της κατασκευής μικρότερων βιοαντιδραστήρων, των λιγότερων απαιτήσεων για διαχωρισμούς, και των υψηλότερων παραγωγικοτήτων (Kourkoutas et al., 2004; Bekatorou et al., 2015). Στα μειονεκτήματα συγκαταλέγονται διάφορα προβλήματα μετανάστευσης ουσιών από το φορέα στα προϊόντα γεγονός που περιορίζει την εφαρμογή της ακινητοποίησης ιδίως σε εργασίες σχετικές με τρόφιμα (Bekatorou et al., 2015) Φορείς ακινητοποίησης Για την ακινητοποίηση χρησιμοποιούνται διάφοροι τύποι στερεών φορέων όπως είναι η κυτταρίνη από ξύλο, απολιγνινοποιημένα πριονίδια, πίτυρα δημητριακών, κ.α., καθώς και ανόργανα υλικά όπως η πορώδης πορσελάνη και το πορώδες γυαλί, κ.α. Τα στερεά υλικά όπως το γυαλί ή η κυτταρίνη μπορούν επίσης να υποβληθούν σε επεξεργασία με διάφορες χημικές ουσίες (πολυκατιόντα, χιτοζάνη, κ.λπ.) για να βελτιώσουν τα χαρακτηριστικά τους ως φορείς δέσμευσης κυττάρων. Τα ανόργανα υλικά είναι σε κάποιο βαθμό 68

69 Μέρος 1 Ο Εισαγωγή πλεονεκτικά για χρήση ως φορείς ακινητοποίησης, επειδή συνήθως είναι άφθονα και φθηνά υλικά που μπορούν να βελτιώσουν την παραγωγικότητα, μπορούν να αντέξουν τις διατμητικές δυνάμεις, να ανακτηθούν και να επαναχρησιμοποιηθούν και επομένως μπορούν να διευκολύνουν την ανάπτυξη συνεχών λειτουργιών μεγάλης κλίμακας. Ωστόσο, κάποια δεν είναι κατάλληλα (π.χ. γ-αλουμίνα, κίσσηρη, κ.α.) για χρήση στην παραγωγή τροφίμων λόγω μετανάστευσης ανεπιθύμητων ουσιών στο τελικό προϊόν. Είναι κατάλληλα όμως για παραγωγή αλκοόλης αφού οι ανεπιθύμητες ουσίες δεν είναι πτητικές και δεν μεταφέρονται στο απόσταγμα Κίσσηρη Εικόνα 1: Ηφαιστειογενής κίσσηρη. μικρότερες συγκεντρώσεις. Η Κίσσηρη (πιο γνωστή και ως ελαφρόπετρα ή Θηραϊκή γη) είναι ένας ηφαιστειακός βράχος που συνήθως σχηματίζεται από την ηφαιστειακή λάβα και χαρακτηρίζεται ως φυσικός αφρός γυαλιού. Εξαιτίας του μεγάλου όγκου των αερίων που απελευθερώνονται κατά τη διάρκεια του σχηματισμού της έχει μεγάλο πορώδες και μεγάλη ειδική επιφάνεια. Περιέχει >70% SiO2, 13% Al2O3 καθώς και άλλα ανόργανα οξείδια σε Είναι ένα αρκετά οικονομικό υλικό και βρίσκεται σε αφθονία. Έχει χρησιμοποιηθεί σε διάφορες μελέτες ως φορέας ακινητοποίησης ή προωθητής για παραγωγή αιθανόλης με S. cerevisiae (Kana et al., 1989; Tsoutsas et al., 1990), στην προώθηση της αναερόβιας παραγωγής βιοαέριου από σακχαρόζη (Koutinas et al., 1994) καθώς και στην προώθηση της συνεχούς αναερόβιας οξεογένεσης σακχαρόζης, ραφινόζης και βινάσσας (Lappa et al., 2015b) Ακινητοποίηση κυττάρων στην αναερόβια χώνευση Η ακινητοποίηση κυττάρων πάνω σε διάφορους φορείς έχει χρησιμοποιηθεί και στην αναερόβια χώνευση δίνοντας ενθαρρυντικά αποτελέσματα. Η γ-αλουμίνα έχει εξεταστεί για την προώθηση της παραγωγής CH4. Χρησιμοποιώντας αντιδραστήρα συνεχούς λειτουργίας πακτωμένο με γ-αλουμίνα που είχε εμβολιαστεί με αναερόβια καλλιέργεια και τροφοδοτώντας διαλύματα γλυκόζης και βινάσσας οι ερευνητές παρατήρησαν πως η αναερόβια χώνευση προχωρούσε με γρήγορους ρυθμούς δίνοντας μεγάλη αύξηση στο ρυθμό παραγωγής του CH4 (Koutinas et al., 1991). Σε μία άλλη σειρά πειραμάτων όταν χρησιμοποιήθηκε η κίσσηρη για την προώθηση της αναερόβιας βιομετατροπής της σακχαρόζης σε βιοαέριο 69

70 Μέρος 1 Ο Εισαγωγή παρατηρήθηκε πως η παρουσία της κίσσηρης είχε ευεργετικά αποτελέσματα καθώς υπήρξε αύξηση της παραγωγής του CH4 ακόμα και σε τιμές ph και συγκεντρώσεις παραγόμενων οργανικών οξέων στις οποίες συνήθως η μεθανογένεση αναστέλλεται. Επιπλέον παρατηρήθηκε πως δεν πραγματοποιήθηκε καθόλου παραγωγή CH4 απουσία κίσσηρης (Koutinas et al., 1994). Σε άλλη έρευνα όταν πραγματοποιήθηκε ακινητοποίηση αναερόβιων μικροοργανισμών σε διαφορετικούς τύπους αδρανών υλικών (άργιλος, ενεργός άνθρακας, ζεόλιθος, πολυβινυλική αλκοόλη) παρατηρήθηκε πως μειώνεται η αναστολή στην αναερόβια χώνευση για παραγωγή βιοαερίου (Yuan & Zhu, 2016). Για την παραγωγή βιο-η2 από αναερόβια καλλιέργεια έχουν χρησιμοποιηθεί κόκκοι ενεργοποιημένου άνθρακα ως φορέας ακινητοποίησης με πολύ καλά αποτελέσματα σε αντιδραστήρα συνεχούς λειτουργίας (Lutpi et al., 2016). Η γ-αλουμίνα ως φορέας ακινητοποίησης και προωθητής της αναερόβιας ζύμωσης της γλυκόζης οδήγησε σε ενισχυμένη και ταυτόχρονη παραγωγή αιθανόλης και οργανικών οξέων, ιδιαίτερα οξικού οξέος. Παρατηρήθηκαν επίσης χαμηλές αποδόσεις άλλων οξέων όπως προπιονικό, βουτυρικό, βαλερικό, ισοβαλερικό και ισοβουτυρικό (Syngiridis et al., 2013). Σε αντίστοιχες συνεχείς διεργασίες βελτιώθηκε και η παραγωγή του βουτυρικού οξέως (Syngiridis et al., 2014). Η προωθητική δράση της γ-αλουμίνας φάνηκε και σε πειράματα συνεχούς ζύμωσης σακχαρόζης, ραφινόζης και βινάσσας, όπου εκτός από τα βελτιωμένα αποτελέσματα παρουσιάστηκε υψηλή λειτουργική σταθερότητα στο βιοαντιδραστήρα (Lappa et al., 2015a). 70

71 Μέρος 1 Ο Εισαγωγή ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΝΕΕΣ ΤΑΣΕΙΣ ΣΤΗΝ ΠΑΡΑΓΩΓΑ ΒΙΟΚΑΥΣΙΜΩΝ Βιοκαύσιμα νέας γενιάς Στην παρούσα κατάσταση, τα ορυκτά καύσιμα αποτελούν μια από τις πιο βασικές πηγές ενέργειας. Οι πηγές αυτών των ορυκτών καυσίμων και των αποθεμάτων πετρελαίου εξαντλούνται πολύ γρήγορα. Επιπλέον διαπιστώνεται ότι συνεισφέρουν σημαντικά στην εκπομπή επιβλαβών αερίων που έχουν αρνητικές επιπτώσεις, όπως η υποχώρηση των παγετώνων, η απώλεια βιοποικιλότητας, η αλλαγή του κλίματος, η αύξηση της στάθμης της θάλασσας, κ.λπ. Μπεκατώρου, 2017 Η υψηλή ζήτηση για τα ορυκτά καύσιμα επηρεάζει επίσης τις παγκόσμιες 71

72 Μέρος 1 Ο Εισαγωγή οικονομικές δραστηριότητες καθώς υπάρχει αύξηση των τιμών του αργού πετρελαίου. Πολλές εναλλακτικές πηγές ενέργειας είναι ήδη διαθέσιμες και σε αυτές περιλαμβάνονται τα βιοκαύσιμα. Τα βιοκαύσιμα παράγονται από διάφορα είδη βιομάζας και αποτελούν μια αποτελεσματική εναλλακτική λύση για την αντικατάσταση των μη ανανεώσιμων καυσίμων. Τα πλεονεκτήματα των βιοκαυσίμων έναντι των ορυκτών καυσίμων είναι ότι μπορούν εύκολα να εξαχθούν από τη βιομάζα, είναι βιώσιμα επειδή είναι ανανεώσιμα και βιοδιασπόμενα, η καύση τους βασίζεται στον κύκλο του CO2, και είναι περισσότερο φιλικά προς το περιβάλλον. Το μερίδιο των βιοκαυσίμων στην αγορά αυτοκινήτων θα αυξηθεί ραγδαία κατά την επόμενη δεκαετία λόγω των περιβαλλοντικών τους πλεονεκτημάτων, γεγονός που θα οδηγήσει σίγουρα σε ισχυρή ανάπτυξη στον τομέα της γεωργίας για περισσότερη παραγωγή και συναφή υποπροϊόντα (Gaurav et al., 2017). Τα βιοκαύσιμα χωρίζονται σε 4 κατηγορίες ή αλλιώς «γενιές» βιοκαυσίμων οι οποίες αναλύονται παρακάτω Βιοκαύσιμα πρώτης γενιάς Τα βιοκαύσιμα πρώτης γενιάς παράγονται από φυτά τα οποία μπορούν επίσης να χρησιμοποιηθούν για την παραγωγή τροφίμων, όπως το καλαμπόκι και τα σακχαρότευτλα. Τα σάκχαρα που περιέχονται σε αυτές τις πρώτες ύλες ζυμώνονται για να παραχθεί κυρίως αιθανόλη ως καύσιμο καθώς και άλλα καύσιμα, όπως η βουτανόλη. Οι πρώτες ύλες που δεν βασίζονται στη ζάχαρη περιλαμβάνουν ζωικά λίπη και φυτικά λίπη, όπως σογιέλαιο, φοινικέλαιο και κραμβέλαιο, τα οποία μπορούν να μετατραπούν σε καύσιμο βιοντίζελ μετά από μετεστεροποίηση. Στη διεργασία της μετεστεροποίησης τα τριγλυκερίδια των διάφορων ελαίων αντιδρούν με αλκοόλες και παράγονται μονοαλκυλεστέρες, οι οποίοι αποτελούν το καύσιμο, και γλυκερόλη ως υποπροϊόν. Τα λεγόμενα βιοκαύσιμα πρώτης γενιάς έχουν σαν βασικό μειονέκτημα τον ανταγωνισμό με τα τρόφιμα για γη, νερό και άλλους πόρους. Η αιθανόλη και το βιοντίζελ είναι τα κύρια βιοκαύσιμα που έχουν αυτό το μειονέκτημα, αν και στις δύο περιπτώσεις καταβάλλονται προσπάθειες για την ανάπτυξη νέων μεθόδων για την απόκτηση αυτών των καυσίμων από πηγές που δεν θα επηρεάσουν τα τρόφιμα (Hayes et al., 2015) Βιοκαύσιμα δεύτερης γενιάς Τα βιοκαύσιμα δεύτερης γενιάς παράγονται από μη βρώσιμα μέρη φυτικής βιομάζας. Στο πλαίσιο της παραγωγής βιοκαυσίμων, ο όρος «φυτική βιομάζα» αναφέρεται σε μεγάλο βαθμό στο λιγνινοκυτταρινούχο υλικό, και γι αυτό τα βιοκαύσιμα δεύτερης γενιάς αναφέρονται επίσης ως λιγνινοκυτταρινούχα βιοκαύσιμα. Η φυτική βιομάζα αντιπροσωπεύει έναν από τους πλέον άφθονους και ανεπαρκώς χρησιμοποιημένους βιολογικούς πόρους στον πλανήτη. Προς το παρόν, η παραγωγή τέτοιων καυσίμων δεν είναι αποδοτική ως προς το κόστος, διότι υπάρχουν πολλά τεχνικά εμπόδια που πρέπει να ξεπεραστούν πριν υλοποιηθεί το δυναμικό τους (Naik et al., 2010; Hayes et al., 2015). 72

73 Βιοκαύσιμα τρίτης γενιάς Μέρος 1 Ο Εισαγωγή Στην τρίτη γενιά βιοκαυσίμων περιλαμβάνεται η συγκεκριμένη παραγωγή βιοντίζελ και άλλων βιοκαυσίμων, όπως η αιθανόλη και το βιοαέριο, από άλγη. Η φωτοσυνθετική δέσμευση CO2 από τα άλγη και η επακόλουθη χρήση της βιομάζας τους για παραγωγή βιοκαυσίμων, έχει προκαλέσει αρκετό ερευνητικό ενδιαφέρον αν και ακόμα η τεχνολογία αυτή εξακολουθεί να μην είναι οικονομική και βιώσιμη. Τα άλγη βρίσκονται υπό εκτεταμένη διερεύνηση προκειμένου να βελτιωθεί τόσο η μεταβολική παραγωγή ελαίου, όσο και οι μετέπειτα διεργασίες παραγωγής βιοκαυσίμων (Aro, 2016) Βιοκαύσιμα τέταρτης γενιάς Τα βιοκαύσιμα της τέταρτης γενιάς θα παράγονται με τη χρήση προχωρημένων βιοχημικών και άλλων επαναστατικών τεχνικών (π.χ. γεννητικά τροποποιημένα άλγη), και θα βασίζονται σε πρώτες ύλες που είναι ουσιαστικά ανεξάντλητες, φθηνές και ευρέως διαθέσιμες. Με τη χρήση της γενετικής τροποποίησης είναι δυνατόν να σχεδιαστούν και να κατασκευαστούν νέα βιολογικά μέρη, μηχανισμοί και συστήματα ή να επανασχεδιαστούν υπάρχοντα φυσικά βιολογικά συστήματα για χρήσιμους σκοπούς. Έτσι με αυτόν τον τρόπο μπορεί να δημιουργηθεί ένα πλαίσιο φυσικό ή τεχνητό που να παράγει βιοκαύσιμα υψηλής ποιότητας με μεγάλη απόδοση (Aro, 2016). Μπεκατώρου,

74 Μέρος 1 Ο Εισαγωγή Βιοαιθανόλη Η πιο κοινή βιοαλκοόλη είναι η βιοαιθανόλη η οποία παράγεται με ζύμωση πρώτης ύλης πλούσιας σε σάκχαρα από διάφορους μικροοργανισμούς. Οι εφαρμογές της αιθανόλης, έχουν διευρυνθεί σημαντικά λόγω της ανάπτυξης των μεθόδων καθαρισμού. Η βιοαιθανόλη μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως υποκατάστατο της βενζίνης για τη μείωση των εκπομπών CO2. Επιπλέον, κατά την καύση της, είναι δυνατόν να μειωθεί η εκπομπή ορισμένων τοξικών αερίων (CO, NO) λόγω της παρουσίας οξυγόνου (Voloshin et al., 2016). Για την παραγωγή της βιοαιθανόλης έχει χρησιμοποιηθεί μια μεγάλη ποικιλία φυτικών πρώτων υλών που περιέχουν υδατάνθρακες, όπως σάκχαρα (σακχαροκάλαμο, τεύτλα, φρούτα, κ.α), άμυλο (σιτάρι, ρύζι, καλαμπόκι, πατάτα, μανιόκα), και κυτταρίνη (διάφορα απόβλητα και γεωργικά κατάλοιπα) (Naik et al., 2010). Επιπλέον, έχουν χρησιμοποιηθεί άλγη (π.χ. Chlorella, Chlamydomonas, Dunaliella, Scenedesmus και η Spirulina), τα οποία συσσωρεύουν άμυλο, ως υπόστρωμα για διαδικασίες ζύμωσης για την παραγωγή βιοαιθανόλης. Επιπλέον έχει αναφερθεί ότι τα μικροφύκη μπορούν να διεξάγουν διαδικασίες αυτο-ζύμωσης για την παραγωγή βιοαιθανόλης, όπως για παράδειγμα τα θαλάσσια πράσινα φύκια Chlorococcum littorale που παρήγαγαν 450 mmol (ethanol)/g στους 30 C μέσω σκούρας ζύμωσης (Voloshin et al., 2016) Βιοντίζελ Το βιοντίζελ είναι ένα εναλλακτικό καύσιμο που αποτελείται από μονοαλκυλεστέρες λιπαρών οξέων μακράς αλυσίδας (R) και αλκοολών μικρού μοριακού βάρους (R ). Παράγεται από ανανεώσιμες πηγές, όπως τα φυτικά έλαια (βρώσιμα και μη) και τα ζωικά λίπη. Το σοβαρότερο πρόβλημα στη χρήση φυτικών ελαίων απευθείας σε μηχανές είναι η δημιουργία σοβαρών βλαβών στους κινητήρες λόγω του υψηλού ιξώδους. Η μείωση του ιξώδους μπορεί να επιτευχθεί με μετεστεροποίηση του ελαίου για την παραγωγή βιοντίζελ που έχει ιδιότητες παρόμοιες με καύσιμα ντίζελ χρησιμοποιώντας τον κατάλληλο καταλύτη. Η μετεστεροποίηση είναι η κυρίαρχη διαδικασία παραγωγής βιοντίζελ, και τυπικά περιλαμβάνει την αντίδραση μίας αλκοόλης με ένα γλυκερίδιο παρουσία καταλύτη για να δώσει μονοαλκυλεστέρες (βιοντίζελ) και γλυκερίνη. Εξαιτίας της αύξησης της κατανάλωσης των βρώσιμων ελαίων η έμφαση έχει μετατοπιστεί προς τα μη εδώδιμα έλαια ως πιθανές πρώτες ύλες (Verma & Sharma, 2016). Ένας άλλος τρόπος παραγωγής βιοντίζελ είναι η χρήση των μικροφυκών, που προσφέρει πολλά πλεονεκτήματα όσον αφορά το περιβάλλον και τη χρήση γης. Το έλαιο που εξάγεται από τη βιομάζα των μικροφυκών έχει ιδιαίτερα χαρακτηριστικά, όπως υψηλά επίπεδα ακορεστότητας, γεγονός που κάνει το παραγόμενο καύσιμο να έχει χαμηλή απόδοση σε σύγκριση με άλλα βιοκαύσιμα και έχει βρεθεί πως και η επιλογή του στελέχους, η μέθοδος 74

75 Μέρος 1 Ο Εισαγωγή καλλιέργειας, οι συνθήκες καλλιέργειας και η χημική σύνθεση των φυκιών επηρεάζουν σημαντικά το κόστος παραγωγής αλλά και την απόδοση του κινητήρα και τις εκπομπές καυσαερίων (Piloto-Rodríguez et al. 2017). Επιπλέον έχει βρεθεί πως η χρήση διάφορων προσθέτων έχει ευεργετική επίδραση καθώς αυξάνεται η απόδοση του βιοντίζελ, βελτιώνεται η καύση και μειώνονται οι εκπομπές αερίων (Da Costa Gomez, 2013) Βιοϋδρογόνο Το υδρογόνο έχει το υψηλότερο ενεργειακό περιεχόμενο ανά μονάδα βάρους οποιουδήποτε γνωστού καυσίμου (142 kj/g) καθώς και μεγαλύτερη ενεργειακή πυκνότητα από άλλα υπάρχοντα βιοκαύσιμα όπως μεθάνιο, μεθανόλη και αιθανόλη. Για την παραγωγή του βιο-η2 χρησιμοποιούνται μικροοργανισμοί που καταναλώνουν ανανεώσιμες πηγές, όπως η βιομάζα. Το βιο-η2 παράγεται από τρεις διαφορετικούς μηχανισμούς την άμεση ή έμμεση βιοφωτόλυση και τη φωτοζύμωση που εξαρτώνται από το φως και τη σκοτεινή ζύμωση που είναι μηχανισμός ανεξάρτητος από το φως (Hayes et al., 2015) Η παραγωγή βιο-η2 έχει κάποια πλεονεκτήματα έναντι άλλων μεθόδων καθώς έχει τη δυνατότητα να χρησιμοποιεί άφθονα οργανικά υλικά όπως οργανικά πλούσια λύματα χωρίς να αυξάνει την ποσότητα αερίων θερμοκηπίου στην ατμόσφαιρα ενώ μπορεί να χρησιμοποιηθεί ένα απλό σύστημα αντιδραστήρα για αυτή την παραγωγή γεγονός που ελαχιστοποιεί το κόστος κεφαλαίου και 75

76 Μέρος 1 Ο Εισαγωγή λειτουργίας. Παρά τα πλεονεκτήματα αυτά, η βιολογική παραγωγή υδρογόνου στην αγορά δεν είναι προς το παρόν οικονομικά αποδοτική (Arimi et al., 2015). Η παραγωγή υδρογόνου σε βιολογικές μεθόδους δυστυχώς έχει χαμηλή απόδοση και ασταθή ρυθμό παραγωγής. Οι κύριοι λόγοι για αυτό είναι η κατανάλωση υδρογόνου από βακτήρια και το γεγονός πως η υψηλού ρυθμού και συνεχής παραγωγή υδρογόνου έχει ανάγκη αντίστοιχα υψηλό ρυθμό τροφοδοσίας, πράγμα που έχει ως αποτέλεσμα την έκπλυση των κυττάρων. Αυτοί οι περιορισμοί και οι χαμηλοί ρυθμοί παραγωγής υδρογόνου περιορίζουν σε μεγάλο βαθμό τις βιολογικές μεθόδους παραγωγής υδρογόνου σε βιομηχανικά επίπεδα. Η αύξηση των αποδόσεων υδρογόνου και η αποδοτικότητα μετατροπής υδρογόνου σε βιολογικές διεργασίες θα ήταν πολύτιμες για την πρακτική εφαρμογή της τεχνολογίας (Singh & Wahid, 2015) Βιαέριο Το βιοαέριο είναι το αέριο που παράγεται από τις μονάδες αναερόβιας χώνευσης και αποτελεί ένα πολλά υποσχόμενο καύσιμο για την αντιμετώπιση των παγκόσμιων ενεργειακών αναγκών και των περιβαλλοντικών επιπτώσεων. Οι εκτιμήσεις της ΕΕ είναι ότι τουλάχιστον το 25% όλης της βιοενέργειας θα μπορούσε να προέρχεται αποκλειστικά από το βιοαέριο. Επιπλέον, από κοινωνικο-οικονομικής άποψης, η παραγωγή βιοαερίου όχι μόνο μειώνει σημαντικά το κόστος επεξεργασίας αποβλήτων, αλλά έχει και σχετικά χαμηλό κόστος πρώτης ύλης και χαμηλότερη τιμή πώλησης σε σύγκριση με το ντίζελ και 76

77 τη βενζίνη (Mao et al., 2015). Μέρος 1 Ο Εισαγωγή Το βιοαέριο παράγεται με βακτηριακή αποικοδόμηση βιομάζας υπό αναερόβιες συνθήκες. Μπορούν να χρησιμοποιηθούν διάφορα είδη βιομάζας, όπως κοπριά, απόβλητα ζωοτροφών, απορρίμματα συγκομιδής, ενεργειακές καλλιέργειες, οικιακά απορρίμματα και διάφορα βιομηχανικά υποπροϊόντα, όπως γλυκερίνη, υποπροϊόντα επεξεργασίας τροφίμων, κ.α. Όπως συμβαίνει και με το φυσικό αέριο, το κύριο συστατικό του βιοαερίου που καθορίζει το ενεργειακό περιεχόμενο του αερίου είναι το εύφλεκτο CH4. Ανάλογα με το υπόστρωμα που αφομοιώνεται στη μονάδα παραγωγής βιοαερίου, η περιεκτικότητα σε CH4 του βιοαερίου κυμαίνεται μεταξύ 50% και 75%. Η δεύτερη βασική συνιστώσα του βιοαερίου είναι το CO2 (25-50). Άλλα συστατικά του βιοαερίου είναι H2O, O2, και ίχνη S2 και H2S. Μετά από αποθείωση και ξήρανση, το βιοαέριο μπορεί να χρησιμοποιηθεί για παραγωγή ηλεκτρισμού ή θερμότητας. Εκτός αυτού, το βιοαέριο μπορεί επίσης να αντικαταστήσει τις ορυκτές ενώσεις άνθρακα σε πλαστικά προϊόντα. Είναι ένα ευέλικτο καύσιμο και είναι το μόνο ανανεώσιμο καύσιμο που αποτελεί σήμερα μια βιώσιμη εναλλακτική λύση για όλους τους σκοπούς για τους οποίους χρησιμοποιείται φυσικό αέριο (Da Costa Gomez, 2013) Ανησυχίες για την παραγωγή βιοκαυσίμων Τα βιοκαύσιμα πρώτης και δεύτερης γενιάς έχουν διάφορα μειονεκτήματα. Στα βιοκαύσιμα πρώτης γενιάς υπάρχει ανταγωνισμός των πρώτων υλών που χρησιμοποιούνται ως τρόφιμα. Απαιτούν επίσης σημαντικές ποσότητες νερού και λιπασμάτων καθώς και υψηλής ποιότητας καλλιεργήσιμη γη. Τα βιοκαύσιμα δεύτερης γενιάς, ενώ δεν ανταγωνίζονται την παραγωγή τροφίμων, χρειάζονται περισσότερα στάδια επεξεργασίας άρα και περισσότερη ενέργεια για να παραχθούν (εκχύλιση, καθαρισμός, κ.λπ.). Ανεξάρτητα από την πηγή, η χημική φύση των καυσίμων μπορεί επίσης να δημιουργήσει διάφορα προβλήματα. Ένα ιδιαίτερο μειονέκτημα της αιθανόλης είναι το γεγονός ότι μπορεί να προκαλέσει βλάβη στους κινητήρες εσωτερικής καύσης. Ως εκ τούτου, δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε μεγάλες αναλογίες σε μη τροποποιημένους κινητήρες. Παρομοίως, τα μη τροποποιημένα βιοντίζελ δεν είναι κατάλληλα ως καύσιμα για αεροπλάνα, κυρίως εξαιτίας φυσικών ιδιοτήτων όπως το ιξώδες και το υψηλό σημείο πήξεως (Hayes et al., 2015). Όσον αφορά το βιο-η2, τα προβλήματα που σχετίζονται με την παραγωγή του είναι τόσο οικονομικά όσο και τεχνολογικά. Τα οικονομικά αφορούν το κόστος παραγωγής και διανομής του, το κόστος των πρώτων υλών, τις απαιτούμενες υποδομές και τον ανταγωνισμό με τη σημερινή αγορά ορυκτών καυσίμων. Τα τεχνολογικά εμπόδια περιλαμβάνουν ζητήματα όπως οι χαμηλές αποδόσεις των σκοτεινών ζυμώσεων, το υψηλό ενεργειακό κόστος των φωτεινών ζυμώσεων, η αναστολή σχεδόν όλων των ενζύμων που εμπλέκονται από το νερό παρουσία οξυγόνου, και η δύσκολη αποθήκευση του βιο-η2. Το υψηλό κόστος της επεξεργασίας που χρειάζεται η βιομάζα είναι ένας άλλος περιοριστικός παράγοντας, και υπάρχει ανάγκη ανάπτυξης νέων τεχνικών καλλιέργειας, συγκομιδής, μεταφοράς και προκαταρκτικής επεξεργασίας 77

78 Μέρος 1 Ο Εισαγωγή ενεργειακών καλλιεργειών ή/και αποβλήτων βιομάζας (Kumar & Chowdhary, 2016) Εστέρες πτητικών λιπαρών οξέων ως καύσιμα Τα πτητικά λιπαρά οξέα, είναι λιπαρά οξέα βραχείας αλυσίδας (C2-C6) (οξικό, προπιονικό, βουτυρικό, κ.λπ.) τα οποία παράγονται είτε με σύνθεση είτε στο στάδιο της οξεογένεσης κατά τη διεργασία της αναερόβιας χώνευσης. Τα πτητικά λιπαρά οξέα είναι πολύτιμες χημικές ενώσεις και έχουν ποικίλες χρήσεις (Calull et al., 1992). Τα πτητικά οργανικά οξέα γενικά δεν χρησιμοποιούνται σε κινητήρες εσωτερικής καύσης. Συνεπώς, συνδυάζονται με αιθανόλη (παράγεται επίσης σε μικρές αναλογίες κατά τα πρώτα στάδια της οξεογένεσης) για να παραχθεί οξικός αιθυλεστέρας, προπιονικός αιθυλεστέρας και βουτυρικός αιθυλεστέρας. Η διαδικασία παράγει ένα μίγμα διαφόρων εστέρων σε αναλογίες που ποικίλλουν ανάλογα με τις συνθήκες ζύμωσης και τις πηγές της χρησιμοποιούμενης βιομάζας. Η απομάκρυνση των ανεπιθύμητων συστατικών ή και η διατήρηση μιας ακριβούς σύνθεσης του βιοκαυσίμου απαιτούν περισσότερες διαδικασίες διαχωρισμού που καταναλώνουν ενέργεια, επομένως, για να χρησιμοποιηθούν τα μίγματα καυσίμων απευθείας σε έναν κινητήρα, πρέπει να εξεταστεί η απόδοση τους. Η χρήση των εστέρων σε μορφή μιγμάτων προσδιορίζει και τις ιδιότητες της ανάφλεξης στον κινητήρα. Πιο συγκεκριμένα βρέθηκε πειραματικά ότι ο προπιονικός αιθυλεστέρας δεν επηρέαζε το χρόνο ανάφλεξης, ενώ η αυξημένη παρουσία του βουτυρικού αιθυλεστέρα οδηγεί σε μείωση του χρόνου ανάφλεξης (Contino et al., 2011) Για να παραχθούν οργανικά οξέα τα οποία στη συνέχεια θα μετατραπούν σε εστέρες για την παραγωγή βιοκαυσίμων έχουν γίνει αρκετές έρευνες που χρησιμοποιούν απόβλητα ως υποστρώματα μειώνοντας έτσι το κόστος παραγωγής αλλά και τη μόλυνση του περιβάλλοντος (Syngiridis et al., 2013, 2014; Lappa et al., 2015b; Boura et al., 2017). 78

79 Μέρος 1 Ο Εισαγωγή ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΣΤΟΧΟΙ ΤΗΣ ΔΙΑΤΡΙΒΗΣ Ο στόχος της παρούσας διατριβής είναι η εύρεση των βέλτιστων συνθηκών για την παραγωγή πτητικών λιπαρών οξέων και αιθανόλης μέσω αναερόβιας χώνευσης, παρουσία της κίσσηρης ως φορέα ακινητοποίησης της καλλιέργειας και προωθητή της βιοδιεργασίας. Η γλυκόζη επιλέχθηκε ως ένωση μοντέλο, εφ όσον είναι συστατικό των αγροτοβιομηχανικών αποβλήτων, σε ελεύθερη η δεσμευμένη μορφή, αλλά και επειδή πολλοί άλλοι ερευνητές ασχολήθηκαν με την οξεογένεση της γλυκόζης και έτσι δίνεται η δυνατότητα σύγκρισης με τις εργασίες αυτές. Από τα απόβλητα της βιομηχανίας τροφίμων έχει επιλεγεί η λιγνινοκυτταρινούχος βιομάζα, η οποία είναι απόβλητο που υπάρχει σε αφθονία και αναζητούνται εντατικά τρόποι αξιοποίησης του. Στην παρούσα διατριβή η διεργασία της αναερόβιας χώνευσης έφτανε στο στάδιο της οξεογένεσης ώστε να μεγιστοποιηθεί η παραγωγή των πτητικών λιπαρών οξέων. Η χρήση της αιθανόλης που παράγεται καθώς και η εστεροποίηση των πτητικών λιπαρών οξέων δίνει τη δυνατότητα παραγωγής καύσιμης ύλης σε συντομότερο χρονικό διάστημα σε σχέση με την ανάκτηση ενέργειας από το στάδιο της μεθανογένεσης (Contino et al., 2011). Η κίσσηρη, που είναι ένα πορώδες ανόργανο υλικό, έχει αποδειχθεί ότι λειτουργεί και ως φορέας ακινητοποίησης (Kana et al., 1989), αλλά και ως προωθητής της αλκοολικής ζύμωσης (Tsoutsas et al., 1990) όταν μελετήθηκε με τη ζύμη S. cerevisiae σε παλαιότερες έρευνες. Επίσης η κίσσηρη έχει αποδειχθεί ότι είναι προωθητής της παραγωγής βιοαερίου από σακχαρόζη με αναερόβια ζύμωση (Koutinas et al., 1991), αλλά και προωθητής της συνεχούς οξεογένεσης της σακχαρόζης, της ραφινόζης και της βινάσσας (Lappa et al., 2015b). Συνεπώς η χρήση ακινητοποιημένης αναερόβιας καλλιέργειας μαζί με την κίσσηρη προσφέρει τα πλεονέκτημα της ακινητοποίησης σε ένα πορώδες υλικό, αλλά και ενός πιθανού προωθητή της διεργασίας. Η επίδραση των διαφορετικών συνθηκών, όπως είναι το ph, η θερμοκρασία και η συγκέντρωση του υποστρώματος, μελετήθηκε για τη βελτιστοποίηση της παραγωγής των πτητικών λιπαρών οξέων. Η χρήση ενός αποβλήτου όπως είναι η λιγνινοκυτταρινούχος βιομάζα και η παραγωγή των πτητικών λιπαρών οξέων δίνει νέες προοπτικές στην ανάκτηση ενέργειας μέσω της οξεογένεσης και στην αύξηση παραγωγής του βιοκαυσίμου που μπορούμε να παράγουμε σε μια μονάδα. Επιπλέον μελετήθηκαν διάφοροι οργανικοί διαλύτες ως προς την ικανότητα ανάκτησης των παραγόμενων οργανικών οξέων. Από τους διαθέσιμους οργανικούς διαλύτες επιλέχθηκαν τελικά για περαιτέρω μελέτη να εξεταστούν οι αλκοόλες, προκειμένου να διευκολυνθεί η άμεση εστεροποίηση (ενζυμική ή χημική) των προϊόντων εκχύλισης για την παραγωγή νέας γενιάς βιοκαυσίμων (αλκυλεστέρες). Η επίδραση του ph και οι συγκεντρώσεις των οργανικών οξέων 79

80 Μέρος 1 Ο Εισαγωγή που ανακτήθηκαν από καθαρά υδατικά διαλύματα των οξέων, αλλά και από τα υγρά ζύμωσης, αξιολογήθηκαν έτσι ώστε να βρεθούν ο βέλτιστος διαλύτης και οι καταλληλότερες συνθήκες για την πραγματοποίηση της εκχύλισης. Έτσι, η παρούσα διατριβή σχεδιάστηκε για να βελτιωθεί η διεργασία της οξεογένεσης για αποδοτικότερη παραγωγή των οργανικών οξέων και της εκχύλισης αυτών σε οργανικούς διαλύτες έτσι ώστε χρησιμοποιηθούν στη συνέχεια για μια αποδοτικότερη παραγωγή εστέρων για μια νέα γενιά βιοκαυσίμου. 80

81 Μέρος 2 Ο Πειραματικό 2. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Χημικές ενώσεις 50% Η3PO4 (MERCK) 0,4% NaHCO3 (MERCK) Αλκοολικό διάλυμα 70 % ν/ν για αποστείρωση Glucose (SERVA) Yeast Powder Extract (FLUCA) NaOH (Lach-Ner) NH3 (CHEM-LAB) HCL (MERCK) H2SO4 (CARLO ERBA REAGENTS) C2H4O2 (Acetic acid Fluka) C3H6O2 (Propionic acid Fluka) C3H6O3 (Lactic acid Fluka) C4H6O4 (Succinic acid Fluka) C4H8O2 (Butyric acid Fluka) C4H8O2 (Isobutyric acid Fluka) C5H10O2 (Valeric acid Fluka) C5H10O2 (Isovaleric acid Fluka) C4H10O (Diethyl Ether Panreac) C4H8O2 (Ethyl acetate Panreac) Υλικά Όργανα και συσκευές Τα όργανα που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα διατριβή είναι: Αναλυτικός ζυγός (EL B600, Shimadzu, ± 0,05) Περισταλτική αντλία (Miniplus 3, Gilson) Φυγόκεντρος (Sigma 3K12, Βioblock Scientific) Αναδευτήρας (WiseStir MSH 20D, Daihan) 81

82 Αυτόκλειστο Επωαστικός θάλαμος (Raypa Incuterm Digit, ± 0,1 C) Ηλεκτρονική συσκευή μέτρησης ph (ΗΙ 99161, Hanna, ± 0,1) Συσκευή καθαρισμού νερού (Μilli-Q Direct 8, Millipore) Ψυχόμενος θάλαμος (FOC 2151, Velp Scientifica) Μέρος 2 Ο Πειραματικό Γυάλινοι βιοαντιδραστήρες συνεχούς λειτουργίας, λειτουργικού όγκου 500 ml και 1500 ml Κωνικές φιάλες 250 και 500 ml Ογκομετρικές φιάλες και κύλινδροι Αυτόματες πιπέτες μm (Transferpette-BRAND) Ρύγχη πιπετών Αποστειρωμένα δοχεία τύπου urobox και falcon Αποστειρωμένα τρυβλία petri Φυγοκεντρικοί σωλήνες Δοκιμαστικοί σωλήνες Eppendorf 1,5 ml Syringe filters 0,22 μm Λύχνοι Bunsen Θερμόμετρα Κόσκινα Τουλπάνι για φιλτράρισμα Προσδιορισμός οργανικών οξέων: Χρωματογράφος Jasco LC-2000 Series με αυτόματο δειγματολήπτη AS 2050 PLUS, στήλη Bio-rad Aminex HPX- 87H column (300 7,8 mm i.d., 9 μm μέγεθος σωματιδίων) σε φούρνο CO-2060 PLUS και ανιχνευτή συστοιχίας διόδων MD-2018 Προσδιορισμός σακχάρων: Χρωματογράφος με αντλία υψηλής πίεσης τύπου Shimadzu LC-9A, στήλη NUCLEOGEL ION 300 OA, φούρνο Shimadzu CTO-10A, ανιχνευτή δείκτη διάθλασης RID-6A συνδεδεμένο με ολοκληρωτή τύπου Shimadzu C-R6A Θερμοστατημένος βιοαντιδραστήρας διαλείποντος έργου με ανακύκλωση όγκου 60 L Θερμοστατημένος βιοαντιδραστήρας συνεχούς λειτουργίας όγκου 1,2 L Βιοαντιδραστήρες διαλείποντος έργου. 82

83 Μέρος 2 Ο Πειραματικό Πρώτες ύλες Λιγνινοκυτταρινούχο υλικό Άχυρο σίτου (Triticum spp): Το άχυρο που χρησιμοποιήθηκε σε όλα τα πειράματα οξεογένεσης ήταν κοινό άχυρο εμπορίου και προήλθε από την ίδια πηγή Απολιγνινοποίηση λιγνινοκυτταρινούχου υλικού Για την απολιγνινοποίηση του λιγνινοκυτταρινούχου υλικού, 300 g άχυρου και 3 L διαλύματος NaOH 1% w/v τοποθετήθηκαν σε ποτήρι ζέσης και το μίγμα υποβλήθηκε σε ήπιο βρασμό για 3 ώρες (70-80 C), προσθέτοντας περιοδικά νερό, ώστε ο όγκος του να διατηρείται σταθερός (Bardi & Koutinas, 1994; Koutinas et al., 2012). Στη συνέχεια, το υλικό πλύθηκε εξαντλητικά με ζεστό νερό μέχρι πλήρους απομάκρυνσης των υπολειμμάτων του μετά νατρίου άλατος της λιγνίνης και αφέθηκε να στεγνώσει σε φούρνο στους 110 ο C για 24 ώρες. Μετά το πέρας της ξήρανσης το απολιγνινοποιημένο άχυρο τεμαχίστηκε σε κομμάτια μήκους 1 cm. Πριν από την κάθε χρήση του το απολιγνινοποιημένο άχυρο αποστειρωνόταν σε αυτόκαυστο για 15 min στους 120 C και πίεση 1,5-2 atm. Το κυτταρινούχο υλικό που προκύπτει ύστερα από την απολιγνινοποίηση αποτελείται κυρίως από κυτταρίνη, ημικυτταρίνη και ίχνη λιγνίνης (<2%) (Kumar et al., 2016) Φορέας ακινητοποίησης (κίσσηρη) Σε όλα τα πειράματα της παρούσας διατριβής χρησιμοποιήθηκε κίσσηρη ως φορέας ακινητοποίησης των κυττάρων της μικτής αναερόβιας καλλιέργειας και προωθητης της αναερόβιας ζύμωσης. Η κίσσηρη ειναι γνωστή ως ελαφρόπετρα ή Θηραϊκή γη και είναι ένα ηφαιστειακό πέτρωμα με μεγάλη ειδική επιφάνεια που περιέχει >70% SiO2, 13% Al2O3 και άλλα ανόργανα οξείδια Καλλιέργεια και μέσα ανάπτυξης Αναερόβια μικτή καλλιέργεια Η αναερόβια μικτή καλλιέργεια που χρησιμοποιήθηκε για τη διεργασία της οξεογένεσης απομονώθηκε από αντιδραστήρα UASB και αναπτύχθηκε σε συνθετικό μέσο γλυκόζης 50 g/l στους 37 o C. Το συνθετικό μέσο γλυκόζης που χρησιμοποιήθηκε περιείχε: 50% Η3PO4 4 g/l yeast extract 4 g/l NaHCO3 Υδατικό διάλυμα NH3 Γλυκόζη 83

84 Μέρος 2 Ο Πειραματικό H αναλογία COD:N:P ήταν 100:5:1 (Koutinas et al., 1991) (COD γλυκόζης ~1,07 mg/l). Τα θρεπτικά μέσα αποστειρώθηκαν σε αυτόκλειστο πίεσης 1,5-2 atm στους 120 C για 15 min, πριν τη χρήση τους ενώ η καλλιέργεια παρελήφθη με φυγοκέντριση (5000 rpm/10 min). Η βιομάζα των ελεύθερων κυττάρων λαμβανόταν όταν τα κύτταρα της μικτής αναερόβιας καλλιέργειας ήταν στην εκθετική τους φάση. 84

85 Μέρος 2 Ο Πειραματικό ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΑΝΑΛΥΣΕΙΣ Προσδιορισμός οργανικών οξέων Ο προσδιορισμός των παραγόμενων οργανικών οξέων έγινε με υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC) σε σύστημα Jasco LC-2000 Series HPLC (Jasco Inc., Ιαπωνία) με αυτόματο δειγματολήπτη AS 2050 PLUS. Οι αναλυτικές συνθήκες ήταν: (i) στήλη Bio-rad Aminex HPX-87H column (300 7,8 mm διάμετρος, μεγέθος σωματιδίων 9 μm) σε φούρνο CO-2060 PLUS, (ii) κινητή φάση 0,008N H2SO4 (ισοκρατικός διαχωρισμός), (iii) ταχύτητα ροής 0,6 ml/min (iv) θερμοκρασία στήλης 50 C, (v) ανιχνευτής συστοιχίας διόδων (PDA) MD-2018 στα 210 nm. Το σήμα του ανιχνευτή καταγράφηκε και αναλύθηκε από το λογισμικό ChromNav. Η ποσότητα του δείγματος που εγχύθηκε ήταν 20 μl, μετά από φιλτράρισμα με μικροφίλτρο nylon μεγέθους πόρων 0,22 μm. Η ποσοτικοποίηση έγινε με τη βοήθεια πρότυπων καμπυλών των οργανικών οξέων: οξικό, γαλακτικό, προπιονικό, ηλεκτρικό, βουτυρικό, ισοβουτυρικό, βαλερικό, και ισοβαλερικό (Sigma-Aldrich Ltd) Προσδιορισμός αιθανόλης Ο προσδιορισμός της αιθανόλης έγινε με αέρια χρωματογραφία σε σύστημα Shimadzu GC-8A συνδεδεμένο με ολοκληρωτή Shimadzu C-R6A. Οι αναλυτικές συνθήκες ήταν: i) στήλη Solvents HayeSep Q, (2 m x 1 mm εσ. διάμετρος), ii) ανιχνευτής ιονισμού φλόγας (FID), iii) φέρον αέριο ήλιο υψηλής καθαρότητας με ροή 20 ml/min (40 C). Ο προσδιορισμός έγινε με προγραμματισμό ώστε η θερμοκρασία να αυξάνει από τους 80 C έως τους 180 C με 16 C/min. Η θερμοκρασία στην είσοδο της στήλης και η θερμοκρασία του ανιχνευτή ήταν 200 C. Η έγχυση των δειγμάτων (2 μl) γινόταν κατευθείαν στη στήλη με τη βοήθεια μικροσύριγγας Προσδιορισμός σακχάρων Ο προσδιορισμός των εναπομεινάντων σακχάρων των ζυμώσεων έγινε με HPLC σε χρωματογράφο Shimadzu με αντλία υψηλής πίεσης τύπου LC-9A. Οι αναλυτικές συνθήκες ήταν: (i) στήλη NUCLEOGEL ION 300 OA, (ii) κινητή φάση 0,008 N Η2SO4, (iii) ταχύτητα ροής 0,5 ml/min (iv) θερμοκρασία στήλης 60 C, (v) ανιχνευτής δείκτη διάθλασης RID-6A συνδεδεμένος με ολοκληρωτή τύπου Shimadzu C-R6A. Τα δείγματα εισήχθησαν στη στήλη (60 μl) αφού αραιώθηκαν με υπερκάθαρο νερό κλάσης Milli-Q (Millipore, Merck) σε 85

86 Μέρος 2 Ο Πειραματικό αναλογία 1 προς 100 και διηθήθηκαν στη συνέχεια με μικροφίλτρο 0,22 μm. Ως εσωτερικό πρότυπο χρησιμοποιήθηκε 1-προπανόλη σε συγκέντρωση 1% v/v και οι συγκεντρώσεις των σακχάρων προσδιορίστηκαν με χρήση πρότυπων καμπυλών. 86

87 Μέρος 2 Ο Πειραματικό ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 Κύριο Πειραματικό Μέρος της Διατριβής 2.3. ΑΝΑΕΡΟΒΙΕΣ ΟΞΕΟΓΕΝΕΙΣ ΖΥΜΩΣΕΙΣ ΓΛΥΚΟΖΗΣ ΚΑΙ ΑΧΥΡΟΥ ΓΙΑ ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΟΡΓΑΝΙΚΩΝ ΟΞΕΩΝ ΠΑΡΟΥΣΙΑ ΚΑΙ ΑΠΟΥΣΙΑ ΠΡΟΩΘΗΤΗ Αναερόβια οξεογενής ζύμωση γλυκόζης παρουσία κίσσηρης Επαναλαμβανόμενες οξεογενείς ζυμώσεις γλυκόζης, διαλείποντος έργου (batch), παρουσία κίσσηρης σε διαφορετικές αρχικές τιμές ph Πριν πραγματοποιηθούν οι ζυμώσεις προηγήθηκε ακινητοποίηση της αναερόβιας καλλιέργειας στην κίσσηρη. Για το σκοπό αυτό, οι βιοαντιδραστήρες πληρώθηκαν με 100 g κίσσηρη και 200 ml συνθετικού μέσου γλυκόζης συγκέντρωσης 50 g/l, υδατικό διάλυμα NH3 και 50% H3PO4 σε αναλογία COD:N:P 100:5:1 (COD γλυκόζης ~1,07 mg/l), NaHCO3 4 g/l, yeast extract 4 g/l, και 4 g αναερόβιας καλλιέργειας. Οι βιοαντιδραστήρες τοποθετήθηκαν σε θερμοθάλαμο στους 37 ο C για 48 h. Πριν την αναερόβια ζύμωση έγινε φυγοκέντριση όλου του όγκου των υγρών της ζύμωσης της ακινητοποίησης, με σκοπό την παραλαβή του συνόλου των ελευθέρων κυττάρων που υπήρχαν μέσα στο βιοαντιδραστήρα. Στη συνέχεια τα φυγοκεντρημένα κύτταρα τοποθετήθηκαν μαζί με την κίσσηρη με τα ακινητοποιημένα κύτταρα πίσω στο βιοαντιδραστήρα. Για τις αναερόβιες ζυμώσεις γλυκόζης παρουσία κίσσηρης χρησιμοποιήθηκαν διαλύματα με την παραπάνω σύσταση, αλλά με 70 g/l γλυκόζη. Οι επαναλαμβανόμενες batch ζυμώσεις πραγματοποιήθηκαν σε αρχικές τιμές ph 3, 4, 5, 6, 7, 8, και 9 στους 37 o C. Τα προϊόντα των ζυμώσεων αναλύθηκαν με HPLC για οργανικά οξέα και αζύμωτο σάκχαρο καθώς και με GC για αιθανόλη Επαναλαμβανόμενες, batch, οξεογενείς ζυμώσεις γλυκόζης παρουσία κίσσηρης σε διαφορετικές θερμοκρασίες Αφού προηγήθηκε η ακινητοποίηση και η φυγοκέντριση όπως προηγουμένως αναφέρθηκε ( ), πραγματοποιήθηκαν επαναλαμβανόμενες batch ζυμώσεις γλυκόζης 30 g/l στους 30, 37 και 52 ο C, σε αρχική τιμή ph 9 του υποστρώματος. Τα προϊόντα των ζυμώσεων αναλύθηκαν με HPLC για οργανικά οξέα και αζύμωτο σάκχαρο και με GC για αιθανόλη Επαναλαμβανόμενες, batch, οξεογενείς ζυμώσεις γλυκόζης παρουσία κίσσηρης σε διαφορετικές αρχικές συγκεντρώσεις σακχάρου Με τον ίδιο τρόπο ( ), πραγματοποιήθηκαν επαναλαμβανόμενες batch ζυμώσεις διαλυμάτων γλυκόζης συγκέντρωσης 30, 50 και 70 g/l σε θερμοκρασία 37 o C και αρχική τιμή ph 9. Τα προϊόντα των ζυμώσεων 87

88 Μέρος 2 Ο Πειραματικό αναλύθηκαν με HPLC για οργανικά οξέα και αζύμωτο σάκχαρο και με GC για αιθανόλη Αναερόβια οξεογενής ζύμωση γλυκόζης με ελεύθερα κύτταρα Επαναλαμβανόμενες, batch, οξεογενείς ζυμώσεις γλυκόζης με ελεύθερα κύτταρα σε διαφορετικές αρχικές τιμές ph Για την πραγματοποίηση των ζυμώσεων οι αντιδραστήρες πληρώθηκαν με 200 ml συνθετικού μέσου γλυκόζης συγκέντρωσης 50 g/l και της σύστασης που περιγράφεται στην , καθώς και 4 g αναερόβιας καλλιέργειας. Ακολουθήθηκε η ίδια διδικασία όπως στην Οι ζυμώσεις πραγματοποιήθηκαν στους 37 o C με ελεύθερα κύτταρα σε αρχικές τιμές ph 3, 4, 5, 6, 7, 8 και 9 σε αρχική συγκέντρωση γλυκόζης 70 g/l. Μετά το πέρας της ζύμωσης ο ολικός όγκος των υγρών της ζύμωσης φυγοκεντρήθηκε με σκοπό την παραλαβή του συνόλου της βιομάζας η οποία και επαναχρησιμοποιήθηκε στο επόμενο batch. Τα προϊόντα των ζυμώσεων αναλύθηκαν με HPLC για οργανικά οξέα και αζύμωτο σάκχαρο και με GC για αιθανόλη Επαναλαμβανόμενες, batch, οξεογενείς ζυμώσεις γλυκόζης με ελεύθερα κύτταρα σε διαφορετικές θερμοκρασίες Αφού επήλθε η σταθερή κατάσταση και έγινε η φυγοκέντριση όπως αναφέρθηκε προηγουμένως ( ), πραγματοποιήθηκαν επαναλαμβανόμενες batch ζυμώσεις με ελεύθερα κύτταρα σε αρχική τιμή ph 9 σε αρχική συγκέντρωση γλυκόζης 70 g/l σε θερμοκρασία 30, 37, 52 o C. Τα προϊόντα των ζυμώσεων αναλύθηκαν με HPLC για οργανικά οξέα και αζύμωτο σάκχαρο και με GC για αιθανόλη Επαναλαμβανόμενες, batch, οξεογενείς ζυμώσεις γλυκόζης με ελεύθερα κύτταρα σε διαφορετικές αρχικές συγκεντρώσεις σακχάρου Αφού επήλθε η σταθερή κατάσταση και έγινε η φυγοκέντριση όπως αναφέρθηκε προηγουμένως ( ), πραγματοποιήθηκαν επαναλαμβανόμενες batch ζυμώσεις σε αρχική συγκέντρωση γλυκόζης 30, 50, και 70 g/l σε θερμοκρασία 37 o C σε αρχικό ph 9. Τα προϊόντα των ζυμώσεων αναλύθηκαν με HPLC για οργανικά οξέα και αζύμωτο σάκχαρο και με GC για αιθανόλη Αναερόβια οξεωγενής ζύμωση άχυρου παρουσία κίσσηρης Επαναλαμβανόμενες, batch, οξεογενείς ζυμώσεις άχυρου παρουσία κίσσηρης σε διαφορετικές τιμές αρχικού ph Πριν πραγματοποιηθούν οι ζυμώσεις προηγήθηκε ακινητοποίηση της αναερόβιας καλλιέργειας σε κίσσηρη και φυγοκέντριση όπως περιγράφεται παραπάνω ( ). Για τις οξεογενείς ζυμώσεις χρησιμοποιήθηκαν διαλύματα 88

89 Μέρος 2 Ο Πειραματικό που περιείχαν 30 g/l άχυρου και τη σύσταση που περιγράφεται στην Οι ζυμώσεις πραγματοποιήθηκαν σε θερμοκρασία 37 o C. Οι ζυμώσεις έγιναν σε αρχικό ph 7, 8, και 9. Τα προϊόντα των ζυμώσεων αναλύθηκαν με HPLC για οργανικά οξέα και αζύμωτο σάκχαρο και με GC για αιθανόλη Επαναλαμβανόμενες, batch, οξεογενείς ζυμώσεις άχυρου παρουσία κίσσηρης σε διαφορετικές αρχικές τιμές ph με αποβολή και αναπλήρωση του υγρού ζύμωσης Αφού προηγήθηκε η ακινητοποίηση και η φυγοκέντριση όπως προηγουμένως αναφέρθηκε ( ) πραγματοποιήθηκαν επαναλαμβανόμενες batch ζυμώσεις σε αρχικές τιμές ph 7, 8, και 9 σε αρχική συγκέντρωση άχυρου 30 g/l σε θερμοκρασία 37 o C. Tα ζυμωμένα υγρά αναπληρωνόντουσαν κάθε 9 ώρες, για 3 επαναλλήψεις, με θρεπτικό διάλυμα ίδιο με αυτό που χρησιμοποιήθηκε για τη ζύμωση αλλά χωρίς την προσθήκη άχυρου, ενώ κατά τη διάρκεια της ζύμωσης λαμβάνονταν δείγματα ανά 3 ώρες. Τα προϊόντα των ζυμώσεων αναλύθηκαν με HPLC για οργανικά οξέα και αζύμωτο σάκχαρο και με GC για αιθανόλη Αναερόβια οξυγενής ζύμωση άχυρου με ελεύθερα κύτταρα Επαναλαμβανόμενες, batch, οξεογενείς ζυμώσεις άχυρου με ελεύθερα κύτταρα σε τιμές αρχικού ph Με τον ίδιο τρόπο όπως στην περίπτωση της γλυκόζης ( ) πραγματοποιήθηκαν, οξεογενείς ζυμώσεις αχύρου (30 g/l) με ελεύθερα κύτταρα σε θερμοκρασία 37 o C. Οι ζυμώσεις έγιναν σε αρχικό ph 7, 8, και 9. Μετά το πέρας της ζύμωσης ο ολικός όγκος των υγρών της ζύμωσης φυγοκεντρήθηκαν με σκοπό την παραλαβή του συνόλου της βιομάζας η οποία και επαναχρησιμοποιήθηκε στο επόμενο batch. Τα προϊόντα των ζυμώσεων αναλύθηκαν με HPLC για οργανικά οξέα και αζύμωτο σάκχαρο και με GC για αιθανόλη Συνεχείς οξεογενείς ζυμώσεις γλυκόζης και άχυρου παρουσία προωθητών Συνεχείς οξεογενείς ζυμώσεις γλυκόζης παρουσία κίσσηρης. Για την ανάπτυξη του βιοκαταλύτη του συνεχούς συστήματος, 700 g κίσσηρης αναμείχθηκαν με 700 ml θρεπτικού μέσου γλυκόζης 50 g/l και με αναερόβια καλλιέργεια για ακινητοποιηση. Ο βιοαντιδραστήρας ήταν όγκου 1,2 L και τοποθετήθηκε σε θερμοθάλαμο με σταθερή θερμοκρασία στους 37 C με μια περισταλτική αντλία και μια φιάλη προκειμένου να τροφοδοτείται με συνθετικό μέσο χωρίς άχυρο και μια φιάλη για τη συλλογή της εκροής. Στην αρχή έγινε κυκλοφορία του υγρού και μετά το σύστημα λειτούργησε χωρίς κυκλοφορία για δύο μέρες. Στη συνέχεια τροφοδοτήθηκε με θρεπτικό μέσο γλυκόζης για 10 ημέρες περίπου. 89

90 Μέρος 2 Ο Πειραματικό Tο συνεχές σύστημα μελετήθηκε σε αρχική συγκέντρωση γλυκόζης 70 g/l σε ph 9 και στους 37 ο C και περιείχε υδατικό διάλυμα NH3, και 50% H3PO4 σε αναλογία COD:N:P 100:5:1, NaHCO3 4 g/l και yeast extract 4 g/l για 18 ημέρες. Στη συνέχεια μελετήθηκε η συγκέντρωση γλυκόζης 50 g/l για 18 ημέρες ενώ τελικά μελετήθηκε και η συγκέντρωση γλυκόζης 30 g/l για 58 ημέρες στις ίδιες συνθήκες. Καθ όλη τη διάρκεια των πειραμάτων λαμβάνονταν δείγματα προς ανάλυση τα οποία αναλύθηκαν με HPLC για οργανικά οξέα και αζύμωτο σάκχαρο και με GC για αιθανόλη Συνεχείς οξεογενείς ζυμώσεις άχυρου παρουσία κίσσηρης. Ακολουθήθηκε η ιδία πορεία όπως στην παραπάνω παράγραφο ( ) για την ακινητοποίηση της καλλιέργειας και τη σταθεροποίηση του συστήματος με υπόστρωμα τη γλυκόζη. Μετά το πέρας των 10 ημερών τροφοδοσίας με γλυκόζη, ο αντιδραστήρας ανοίχθηκε, απομακρύνθηκαν τα υγρά ζύμωσης και πληρώθηκε με 700 ml αιώρημα άχυρου 30 g/l. Το υγρό που αφέθηκε να κυκλοφορήσει μέσα στον αντιδραστήρα περιείχε 1,6 ml/l υδατικό διάλυμα NH3, και 0,32 ml/l 50% H3PO4, NaHCO3 4 g/l και yeast extract 4 g/l. Καθ όλη τη διάρκεια των πειραμάτων λαμβάνονταν δείγματα προς ανάλυση τα οποία αναλύθηκαν με HPLC για οργανικά οξέα και αζύμωτο σάκχαρο και με GC για αιθανόλη Scale-up (17 L) αναερόβιων ζυμώσεων άχυρου παρουσία κίσσηρης Επαναλαμβανόμενες, batch, οξεογενείς ζυμώσεις άχυρου παρουσία κίσσηρης. Ένας βιοαντιδραστήρας που αποτελείται από μεταλλικό κυλινδρικό αντιδραστήρα συνολικού όγκου εργασίας 82 L που συνδέεται με περισταλτική αντλία, ώστε να επιτευχθεί αναρροή. Αυτό το σύστημα τοποθετείται σε επωαστήρα στους 37 C. Μια ποσότητα 4,4 kg κίσσηρης διαμέτρου περίπου 5 cm τοποθετήθηκε μέσα στο βιοαντιδραστήρα καθώς και 2,75 kg κίσσηρης μικρότερης διαμέτρου (περίπου 1 cm) τοποθετήθηκε μέσα σε μεταλλικό καλάθι το οποίο εισήχθη επίσης στο βιοαντιδραστήρα (Σχήμα 4). Σε όλα τα πειράματα χρησιμοποιήθηκε ως υπόστρωμα απολιγνινοποιημένο άχυρο. Για την έναρξη του πειράματος 50 g υγρής καλλιέργειας προστέθηκαν στο βιοαντιδραστήρα καθώς και 15 L υγρού μέσου που περιείχαν 27,2 ml υδατικό διάλυμα NH3, και 5,44 ml 50% H3PO4, NaHCO3 4 g/l και yeast extract 4 g/l και 30 g/l άχυρου. Επιπλέον, προκειμένου να διευκολυνθεί η προσαρμογή της καλλιέργειας καθώς και η ακινητοποίηση στην κίσσηρη, προστέθηκαν επίσης 200 g γλυκόζης για να γίνει το εκκινητήριο πείραμα. Το αρχικό pη του υγρού ήταν 9. Το σύστημα αφέθηκε για 24 h. Μετά από αυτό η αντλία ρυθμίστηκε για να επιτευχθεί η ανακυκλοφορία του υγρού του βιοαντιδραστήρα με ρυθμό 536 ml/min. Στο τέλος του κάθε πειράματος το ζυμωμένο υγρό απομακρύνθηκε με απόχυση, 90

91 Μέρος 2 Ο Πειραματικό ενώ η κίσσηρη και τα υπολείμματα του άχυρου διατηρήθηκαν στο βιοαντιδραστήρα. Για τα ακόλουθα πειράματα προστέθηκε νέο άχυρο καθώς και θρεπτικά συστατικά, στις ίδιες ποσότητες καθώς και 2 L του υγρού ζύμωσης του προηγουμένου πειράματος (το οποίο αφέθηκε σε ηρεμία για καταβύθιση της καλλιέργειας, και απομακρύνθηκε το υπερκείμενο πριν τη συλλογή των 2 L). Καθ όλη τη διάρκεια των πειραμάτων λαμβάνονταν δείγματα προς ανάλυση τα οποία αναλύθηκαν με HPLC για οργανικά οξέα και αζύμωτο σάκχαρο και με GC για αιθανόλη Scale-up (40 L) αναερόβιων ζυμώσεων άχυρου παρουσία κίσσηρης Επαναλαμβανόμενες, batch, scale-up οξεογενείς ζυμώσεις άχυρου παρουσία κίσσηρης. Μετά το πέρας των παραπάνω πειραμάτων ο αντιδραστήρας λειτούργησε και σε τελικό όγκο 40 L. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφονται παραπάνω ( 2.3.6) με τη διαφορά ότι τοποθετήθηκε και δεύτερο καλάθι γεμισμένο με 2,75 kg κίσσηρη (Σχήμα 4). Καθ όλη τη διάρκεια των πειραμάτων λαμβάνονταν δείγματα προς ανάλυση τα οποία αναλύθηκαν με HPLC για οργανικά οξέα και αζύμωτο σάκχαρο και με GC για αιθανόλη Παραλαβή προϊόντων της αναερόβιας οξεογένεσης με εκχύλιση Μετά το πέρας των ζυμώσεων έπρεπε να παραληφθούν τα οργανικά οξέα, και ενδεχομένως η αιθανόλη, που παράχθηκαν. Ο τρόπος παραλαβής που επιλέχθηκε ήταν η εκχύλιση υγρού με υγρό. Ως εκχύλιση υγρού με υγρό είναι γνωστός ο διαχωρισμός των συστατικών ενός υγρού μίγματος όταν επεξεργάζεται µε ένα διαλύτη, στον οποίο το ένα (ή περισσότερα) από τα επιθυμητά συστατικά είναι εκλεκτικά διαλυτό Εκχύλιση οργανικών οξέων από πρότυπα υδατικά διαλύματα με ζυμέλαια σε διάφορες αναλογίες. Ο διαλύτης που χρησιμοποιήθηκε για την παραλαβή των οργανικών οξέων ήταν ζυμέλαιο, το οποίο ελήφθη από ένα τοπικό αποστακτήριο (ΒΓ Σπηλιόπουλος ΑΒΕΕ, Πάτρα). Το ζυμέλαιο (fusel oil) αποτελείται κυρίως από αλκοόλες (κυρίως αμυλικές) και προσμείξεις οξέων, αλδεϋδών και άλλων ενώσεων. Έχει όψη ελαιώδη, σχηματίζεται κατά τη διάρκεια της αλκοολικής ζύμωσης και λαμβάνεται κατά το τέλος της απόσταξης αλκοολούχων υγρών, ως παραπροϊόν. Ενδεικτικά, στη Βραζιλία παράγεται σε αναλογία 2.5 L ανά 1000 L αιθανολης (Awad et al., 2018). Προκειμένου να αξιολογηθεί η επίδραση του διαλύτη για την ανάκτηση των οργανικών οξέων παρασκευάστηκε ένα πρότυπο υδατικό διάλυμα που περιέχει 5 g/l από το κάθε από τα παρακάτω οργανικά οξέα: προπιονικό, βουτυρικό, ισοβουτυρικό, ηλεκτρικό και γαλακτικό. Η συνολική συγκέντρωση των οξέων του διαλύματος ήταν 30 g/l. Το pη του πρότυπου διαλύματος ήταν 2,5. Η 91

92 Μέρος 2 Ο Πειραματικό παραλαβή πραγματοποιήθηκε σε θερμοκρασία δωματίου (20 C) υπό μαγνητική ανάδευση και σε αναλογία διαλύτη/πρότυπου διαλύματος 1:1, 1:2 και 1:3. Κατά τη διάρκεια των 2 h της εκχύλισης ελήφθησαν δείγματα από την υδατική φάση και αναλύθηκαν με HPLC για να προσδιοριστεί η συγκέντρωση των οξέων που εκχυλίστηκαν στην υδατική φάση. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν και για αρχικό ph 1, Εκχύλιση οργανικών οξέων από πρότυπα υδατικά διαλύματα σε διάφορες τιμές ph. Η ίδια διαδικασία ακολουθήθηκε για να αξιολογηθεί το αποτέλεσμα του ph επί της ανάκτησης των οργανικών οξέων χρησιμοποιώντας πρότυπα υδατικά διαλύματα με ph ρυθμισμένο σε τιμές 2,5, 1,5 και 1,0 με την προσθήκη πυκνού H2SO4 σε αναλογία διαλύτη/διαλύματος 1:1. Κατά τη διάρκεια των 2 h της εκχύλισης ελήφθησαν δείγματα από την υδατική φάση και αναλύθηκαν με HPLC για να προσδιοριστεί η συγκέντρωση των οξέων που εκχυλίστηκαν στην υδατική φάση Εκχύλιση οργανικών οξέων από τα υγρά της ζύμωσης άχυρου. Η ίδια διαδικασία ακολουθήθηκε για να αξιολογηθεί η ανάκτηση των οργανικών οξέων από διάφορους διαλύτες (2-μεθυλοπροπανόλη-1, η 1- βουτανόλη, 3-μεθυλοβουτανόλη-1, 2-πεντανόλη, η 1-πεντανόλη και ζυμέλαιο) από τα υγρά της ζύμωσης άχυρου το οποίο περιείχε οξικό (6 g/l), προπιονικό (1,1 g/l), ισοβουτυρικό (1,1 g/l) και βουτυρικό οξύ 8 g/l. Η παραλαβή πραγματοποιήθηκε σε θερμοκρασία δωματίου (20 C) υπό μαγνητική ανάδευση και σε αναλογία διαλύτη /υγρού ζύμωσης 1:1 για 30 min σε αρχικό ph 1. Στο τέλος της εκχύλισης ελήφθησαν δείγματα από την υδατική φάση και αναλύθηκαν με HPLC για να προσδιοριστεί η συγκέντρωση των οξέων που εκχυλίστηκαν στην υδατική φάση. 92

93 ΜΕΡΟΣ 3 Ο - ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 Μέρος 3 Ο Αποελέσματα 3.1 Η ΦΙΛΟΣΟΦΊΑ ΤΗΣ ΔΙΑΤΡΙΒΉΣ Γενικά επί των στόχων της διατριβής Ο κύριος στόχος της διατριβής είναι η παραγωγή πτητικών λιπαρών οξέων από την κυτταρινούχο βιομάζα με αναερόβια χώνευση σε συνθήκες οξεογένεσης, παρουσία της κίσσηρης ως προωθητή της βιοδιεργασίας. Οι τεχνολογίες που παρουσιάζονται στη διατριβή αυτή είναι η προώθηση της αναερόβιας χώνευσης της κυτταρίνης και η εκχύλιση των παραγόμενων οξέων με οργανικούς διαλύτες. Η προώθηση της αναερόβιας χώνευσης από το ορυκτό κίσσηρη βασίστηκε στη δομή της κίσσηρης η οποία, όπως έχει αποδειχθεί με ηλεκτρονική μικροσκοπία σάρωσης (SEM), είναι ένα πορώδες υλικό που διευκολύνει τον εγκλωβισμό των μικροβιακών κυττάρων. Η έρευνα για την απόδειξη της προώθησης της βιοδιεργασίας με τα εγκλωβισμένα στην κίσσηρη κύτταρα, έγινε για υποστρώματα όπως η γλυκόζη και το άχυρο. Η εκχύλιση των παραγόμενων οξέων με οργανικούς διαλύτες από τα υδατικά διαλύματα στηρίχθηκε στη χρήση αλκοολών με σχετικά μεγάλο μοριακό βάρος που δεν αναμειγνύονται με το νερό και μπορούν στη συνέχεια να χρησιμοποιηθούν ως πρώτη ύλη για την απευθείας εστεροποίηση των οργανικών οξέων (είτε ενζυμική, είτε χημική) προς εστέρες-συστατικά ενός νέου βιοκαυσίμου (Contino et al., 2011). Επίσης για την εστεροποίηση μπορεί να χρησιμοποιηθεί και η βιοαιθανόλη που παράγεται ταυτόχρονα με τα οργανικά οξέα κατά την οξεογένεση (Ren et al., 1997). Έχει επίσης γίνει γνωστό ότι η γ- αλουμίνα είναι προωθητής της οξεογένεσης (Syngiridis et al., 2013) της γλυκόζης και η κίσσηρη προωθεί την οξεογένεση της σακχαρόζης, της ραφινόζης και της βινάσσας (Lappa et al., 2015b). Η προωθητική δράση της γ- αλουμίνας και της κίσσηρης στην αλκοολική ζύμωση είχε επίσης μελετηθεί και αναδειχθεί στο παρελθόν (Kanellaki et al., 1989; Tsoutsas et al., 1990). Με βάση τα παραπάνω και το γεγονός ότι στην οξεογένεση επικρατούν διαφορετικά οργανικά οξέα ανάλογα με την πρώτη ύλη, τον προωθητή και τις συνθήκες, είναι ενδιαφέρον να ερευνηθεί η οξεογένεση της κυτταρίνης της οποίας η βιοαποικοδόμηση είναι ιδιαίτερα δύσκολη. Η αφθονία της λιγνινοκυτταρινούχου βιομάζας στη φύση εγγυάται τη βιομηχανική εφαρμογή της οξεογένεσης υπό την προϋπόθεση ότι αυτή θα δώσει καλή παραγωγικότητα και ενδιαφέρουσα σύσταση οξέων. Τα παραπάνω επιχειρήματα στηρίζουν την επιλογή της έρευνας με στόχο την αύξηση της βελτίωσης των κινητικών παραμέτρων της οξεογένεσης της κυτταρίνης και στη συνέχεια την ανάπτυξη μεθόδου οξεογένεσης. Επίσης στο πλαίσιο της έρευνας αυτής διερευνάται με ενδιαφέρον η επικράτηση συγκεκριμένων οξέων κατά την οξεογένεση καθώς και η ανάπτυξη μεθόδου ανάκτησής τους από το υγρό της ζύμωσης που αποτελεί βασικό πρόβλημα στο πεδίο αυτό. 93

94 Μέρος 3 Ο Αποελέσματα Σχεδιασμός και οργάνωση των κεφαλαίων Σχήμα 3: Σχηματική διάταξη των πειραματικών ενοτήτων της διατριβής. 94

95 Μέρος 3 Ο Αποελέσματα Περιγραφή της πειραματικής εργασίας Η παραγωγή πτητικών οργανικών οξέων μέσω ακινητοποιημένης αναερόβιας καλλιέργειας σε κίσσηρη αποτελεί μια εναλλακτική προσέγγιση για την παραγωγή βιοκαυσίμου. Τα πλεονεκτήματα της χρήσης της κίσσηρης ως προωθητή της ζύμωσης έχουν αναφερθεί σε εργασίες στην αλκοολική ζύμωση (Tsoutsas et al., 1990) και στην παραγωγή οξέων μέσω της αναερόβιας χώνευσης με υπόστρωμα τη βινάσσα (Lappa et al., 2015b). Η παραγωγή των πτητικών οργανικών οξέων και η μετέπειτα εστεροποίηση μπορούν να οδηγήσουν σε εστέρες όπως ο οξικός αιθυλεστέρας και ο βουτυρικός αιθυλεστέρας που μπορούν να χρησιμοποιηθούν σε κινητήρες εσωτερικής καύσης (Contino et al., 2011). Στο πειραματικό μέρος της διατριβής μελετήθηκαν οι συνθήκες που επηρεάζουν την παραγωγή των πτητικών οργανικών οξέων από τα διάφορα υποστρώματα. Συγκεκριμένα χρησιμοποιήθηκε ένας θερμοστατούμενος εργαστηριακός βιοαντιδραστήρας με ανακύκλωση, όγκου 82 L, ένας θερμοστατούμενος εργαστηριακός βιοαντιδραστήρας συνεχούς λειτουργίας όγκου 1,2 L, και βιοαντιδραστήρες διαλείποντος έργου. Στο πρώτο μέρος χρησιμοποιήθηκαν συνθετικά θρεπτικά μέσα γλυκόζης, ως μοντέλο υπόστρωμα, με ρύθμιση του ph σε μεσοφιλικές και θερμοφιλικές συνθήκες. Η κελλοβιόζη που είναι δισακχαρίτης δύο μορίων γλυκόζης ενωμένων με β(1,4) γλυκοζιτικό δεσμό (4-O-β-D-γλυκοπυρανόζυλ-D-γλυκόζη) χρησιμοποιήθηκε ως μοντέλο υπόστρωμα για την οξεογένεση της κυτταρίνης από άλλον ερευνητή (Τσαφρακίδου, 2016). Ανάλογα με τις συνθήκες εξετάστηκε η διαφοροποίηση στην παραγωγή των πτητικών οργανικών οξέων, πράγμα που διαπιστώθηκε για την οξεογένεση και σε άλλα υποστρώματα όπως η βινάσσα (Lappa et al., 2015b) και το τυρόγαλα (Boura et al., 2017). Με βάση τα παραπάνω μελετήθηκε ως υπόστρωμα το λιγνινοκυτταρινούχo απόρριμμα άχυρο. Τα πτητικά οργανικά οξέα που παράχθηκαν εκχυλίστηκαν με βουτανόλη-1 έτσι ώστε να είναι δυνατή χρήση τους ως χημικές πρώτες ύλες ή απευθείας για την παραγωγή εστέρων οι οποίοι μπορούν να χρησιμοποιηθούν σε μηχανές εσωτερικής καύσης ως βιοκαύσιμο τρίτης γενιάς. Όμως, προηγουμένως εξετάστηκε η εκχύλιση των οργανικών οξέων από συνθετικά υδατικά διαλύματα Τα υλικά που χρησιμοποιήθηκαν στη διατριβή Τα κυριότερα απόβλητα της βιομηχανίας τροφίμων, όπως είναι το τυρόγαλο, τα απόβλητα από φρούτα και λαχανικά, τα απόβλητα ζυθοποιίας, αλλά και της βιομηχανίας παραγωγής πόσιμου οινοπνεύματος, περιέχουν ζυμώσιμα σάκχαρα τα οποία μπορούν να αξιοποιηθούν για την παραγωγή προϊόντων όπως οι ζωοτροφές αν τα απόβλητά αυτά δεν οδηγηθούν στη χωματερή ή δεν αξιοποιηθούν για την παραγωγή ενέργειας μέσω καύσης (Kosseva, 2011). Όμως η χρήση τους για παραγωγή ενέργειας μπορεί να επιτευχθεί και μέσω της αναερόβιας ζύμωσης σε συνθήκες οξεογένεσης, γεγονός που μπορεί να οδηγήσει στην εκμετάλλευση του συνόλου των αποβλήτων αυτών για 95

96 Μέρος 3 Ο Αποελέσματα παραγωγή προϊόντων και κατά συνέπεια στη μείωση της ρύπανσης του περιβάλλοντος ταυτόχρονα με την παραγωγή προστιθέμενης αξίας. Εκτός από απόβλητα της βιομηχανίας τροφίμων μπορούν να χρησιμοποιηθούν και τα λιγνινοκυτταρινούχα υλικά τα οποία μέσω της διάσπασης τους σε μονομερή μας δίνουν υδατάνθρακες και κυρίως γλυκόζη. Στην παρούσα διατριβή χρησιμοποιήθηκε συγκεκριμένα το άχυρο σίτου απόβλητο της λιγνινοκυτταρινούχου βιομάζας. Το άχυρο σίτου χρησιμοποιείται συνήθως ως ζωοτροφή ως έχει, αλλά οι διαθέσιμες ποσότητες είναι πολύ μεγάλες. Το υλικό αυτό αποτελεί τη λιγνινοκυτταρινούχο πρώτη ύλη/μοντέλο για την κατεργασία κυτταρινούχων πρώτων υλών με διαφορετική προέλευση. Άλλο υλικό που χρησιμοποιήθηκε στη διατριβή ήταν το ορυκτό κίσσηρη που μελετήθηκε ως προωθητής της οξεογένεσης της γλυκόζης και της κυτταρίνης που παρασκευάστηκε με απολιγνινοποίηση το αχύρου. Η καλλιέργεια που χρησιμοποιήθηκε για τη διεργασία της οξεογένεσης ήταν αναερόβια μικτή καλλιέργεια από αντιδραστήρα UASB, που αναπτύχθηκε σε συνθετικό μέσο γλυκόζης. Χρησιμοποιήθηκαν επίσης ζυμέλαια (fusel oil) από την εταιρία ΒΓ Σπηλιόπουλος ΑΒΕΕ για την εκχύλιση των οργανικών οξέων ως διαλύτες χαμηλού κόστους Γιατί χρησιμοποιήθηκε η λιγνινοκυτταρινούχος βιομάζα για την παραγωγή οργανικών οξέων Η λιγνινοκυτταρινούχος βιομάζα είναι ένας γενικός όρος που χρησιμοποιείται για να περιγράψει τη βιομάζα των φυτών. Είναι η πιο άφθονη ανανεώσιμη πηγή άνθρακα στον κόσμο. Περιλαμβάνει μεταξύ άλλων, το μη βρώσιμο τμήμα των μεγάλων καλλιεργειών τροφίμων όπως το άχυρο, κάθε είδους φυτικά απόβλητα όπως τα απόβλητα της κατεργασίας του ζαχαροκάλαμου, και τα υπολείμματα από την παραγωγή σιτηρών. Η κυτταρίνη, η ημικυτταρίνη και η λιγνίνη είναι οι τρεις σημαντικότερες οργανικές ενώσεις που περιέχονται στη λιγνινοκυτταρινούχο βιομάζα και περιέχονται κατά βάρος τους σε ποσοστά περίπου 30-50%, 20-40% και 10-20%, αντίστοιχα, αναλόγως της προέλευσης του φυτού (Patel and Kumar, 2016). Η λιγνινοκυτταρινούχος βιομάζα είναι ένας από τους πιο άφθονους, αλλά και πιο υποεκμεταλλευομένους πόρους στον κόσμο. Θεωρείται μια από τις καλύτερες πηγές φθηνών υδατανθράκων και χρησιμοποιείται ως πιθανό υπόστρωμα για την παραγωγή μιας σειράς προϊόντων υψηλής αξίας, συμπεριλαμβανομένων των βιοκαυσίμων, όπως η βιοαιθανόλη και το βιοαέριο. Εκτός από την αφθονία της και τη διαθεσιμότητα της, το γεγονός ότι το 75% της σύστασης της αποτελείται από πολυσακχαρίτες την κάνει μία πολύ επιθυμητή πρώτη ύλη για την παραγωγή βιοκαυσίμων. Εκτός από τα βιοκαύσιμα η λιγνινοκυτταρινούχος βιομάζα μπορεί να χρησιμοποιηθεί και ως πρώτη ύλη για την παραγωγή άλλων προϊόντων προστιθέμενης αξίας, όπως τα ένζυμα (Ravindran and Jaiswal, 2016). Η λιγνινοκυτταρινούχος βιομάζα έχει ερευνηθεί ως πρώτη ύλη σε μεγάλο βαθμό μετά την πετρελαϊκή κρίση του 1973 και έχουν χρηματοδοτηθεί προγράμματα έρευνας με μεγάλα ποσά και σε παγκόσμια κλίμακα έχοντας ως 96

97 Μέρος 3 Ο Αποελέσματα στόχο την παραγωγή της βιοαιθανόλης ως βιοκαυσίμου για αντικατάσταση της βενζίνης και του πετρελαίου ντίζελ. Στο πλαίσιο του γενικότερου αυτού στόχου έχουν ερευνηθεί σε μεγάλο βαθμό η παραγωγή βιοαιθανόλης από την κυτταρίνη και την ημικυτταρίνη (Limayem and Ricke, 2012) καθώς και η παραγωγή προϊόντων από τη λιγνίνη (Asina et al., 2017; Chen and Wan, 2017) έτσι ώστε να μην υπάρχει απόβλητη ύλη στο περιβάλλον και να δημιουργηθεί έτσι η οικονομία της βιοαιθανόλης. Αυτό το φιλόδοξο σχέδιο ενισχύεται ακόμη περισσότερο και από το γεγονός ότι από τη βιοαιθανόλη μπορούμε να οδηγηθούμε στην παραγωγή του αιθυλενίου που είναι ίσως το σπουδαιότερο δομικό υλικό (building-block) της πετροχημικής βιομηχανίας. Επίσης η υδρόλυση της κυτταρίνης σε γλυκόζη ανοίγει το δρόμο στην παραγωγή χημικών προϊόντων με τη χρήση διαφορετικών μικροοργανισμών για κάθε προϊόν (White Biotechnology-Λευκή Βιοτεχνολογία). Έτσι γίνεται σαφές ότι η λιγνινοκυτταρινούχος βιομάζα θα αντικαταστήσει το πετρέλαιο ως πρώτη ύλη στην παραγωγή καυσίμων αλλά και στην παραγωγή πετροχημικών προϊόντων. Έτσι από την οικονομία του πετρελαίου θα μεταφερθούμε στην αειφόρο οικονομία της κυτταρίνης. Η οδός για να επιτευχθεί αυτό είναι η υδρόλυση της κυτταρίνης και των ημικυτταρινών σε απλά, ζυμώσιμα σάκχαρα. Η μεν κυτταρίνη δίνει γλυκόζη 100% με την υδρόλυση, ενώ οι ημικυτταρίνες δίνουν 60% περίπου ξυλόζη (Liu et al., 2008; Kumar et al., 2009). Τη γλυκόζη βιομετατρέπουν πολύ εύκολα όλοι οι μικροοργανισμοί σε χρήσιμα προϊόντα, ενώ την ξυλόζη αξιοποιούν προς τούτο λίγοι μικροοργανισμοί, δημιουργώντας την ανάγκη για αναζήτηση και έρευνα για τη βιομετατροπή της (Chu and Lee, 2007; Kuhad et al., 2011; Kim et al., 2013). Όμως, ενώ η σχεδίαση της έρευνας φαντάζει καταπληκτική και θεωρητικά δίνει λύση για αειφόρο ανάπτυξη της παγκόσμιας οικονομίας, υπήρξαν δύο σημαντικά εμπόδια στην πορεία για ανάπτυξη των νέων τεχνολογιών: η μικρή ταχύτητας υδρόλυσης της κυτταρίνης και η χαμηλή παραγωγικότητα σε γλυκόζη που επιτυγχάνεται (Sun and Cheng, 2002; Bansal et al., 2009). Παρόλο τον πακτωλό χρημάτων που έχουν διατεθεί παγκοσμίως δεν υπήρξε ουσιαστική πρόοδος για να δοθεί λύση στα προβλήματα αυτά. Επίσης νέα πεδία έρευνας και γνώσης όπως η τεχνολογία του ανασυνδυασμένου DNA και η μεταβολική μηχανική δεν κατάφεραν να προσεγγίσουν το θέμα με επιτυχία. Έτσι η σκέψη στην παρούσα διατριβή ήταν να γίνει προσέγγιση του θέματος από άλλη οδό, που παρακάμπτει την υδρόλυση της κυτταρίνης και των ημικυτταρινών. Η λύση αυτή στοχεύει στην ταυτόχρονη βιομετατροπή της κυτταρίνης και των ημικυτταρινών με μια καλλιέργεια αναερόβιων βακτηρίων και σε ένα βιοαντιδραστήρα. Τα οργανικά οξέα στη συνέχεια θα εστεροποιηθούν και οι εστέρες θα χρησιμοποιηθούν ως νέα βιοκαύσιμα δεύτερης γενιάς (Contino et al., 2011). Επίσης τα οργανικά οξέα θα μπορούν να χρησιμοποιηθούν και ως χημικά προϊόντα. 97

98 Μέρος 3 Ο Αποελέσματα Τα προβλήματα στη βιοκατεργασία της κυτταρίνης σε σχέση και με άλλες μορφές οργανικού φορτίου και άλλες πρώτες ύλες Η κυτταρίνη είναι στερεό υλικό και αυτό δημιουργεί προβλήματα που τα υγρά απόβλητα δεν έχουν, καθώς είναι δύσκολο να τροφοδοτηθεί ως έχει με αντλίες στους διάφορους αντιδραστήρες. Επιπλέον απαιτείται σχεδιασμός ειδικών αντιδραστήρων που να παρέχουν τη δυνατότητα προκατεργασίας της κυτταρίνης πριν την αναερόβια ζύμωση. Η προκατεργασία της λιγνινοκυτταρινούχου βιομάζας είναι απαραίτητη για να διασπαστεί ή να απομακρυνθεί η λιγνίνη, να διαρραγεί η κρυσταλλική δομή της κυτταρίνης και να αυξηθεί η διαθέσιμη επιφάνεια του υλικού για ενζυμική δράση. Εάν απαιτείται υδρόλυση της κυτταρίνης σε σάκχαρα σε χωριστό βήμα είτε με χρήση ενζύμων ή άλλων μέσων, το αποτέλεσμα είναι η δημιουργία επιπλέον κόστους. Πριν τη χρήση της αναερόβιας καλλιέργειας κρίθηκε σκόπιμο να γίνει κοπή στην απολιγνινοποιημένη κυτταρίνη για να αυξηθεί η επιφάνεια επαφής γεγονός που πρόσθεσε άλλο ένα βήμα στην όλη διαδικασία με ότι αυτό συνεπάγεται. Το αντίστοιχο βήμα στα υγρά απόβλητα ήταν μια αραίωση με νερό αν χρειαζόταν Τα οργανικά οξέα ως εμπορικά προϊόντα Tα οργανικά οξέα όπως το οξικό, το γαλακτικό και το κιτρικό οξύ, καθώς και άλλα έχουν παγιωθεί ως επιθυμητά προϊόντα τα οποία επιπλέον αποτελούν πρώτες ύλες για την παραγωγή άλλων πολύτιμων χημικών παρέχοντας έτσι μια πληθώρα παράγωγων προϊόντων. Μεταξύ αυτών, τα οργανικά οξέα με πάνω από μία λειτουργικές ομάδες έχουν μεγάλο ενδιαφέρον, καθώς μπορούν να εξυπηρετήσουν τη σταθερά αναπτυσσόμενη αγορά πολυμερών. Πέραν των οξέων που αναφέρθηκαν έχουν προσελκύσει την προσοχή και άλλα οργανικά οξέα μεγαλύτερης αλυσίδας που έχουν μεγάλη αξία λόγω των διαφορετικών δυνατοτήτων παραγωγής πολυμερικών υλικών. Γενικά τα σύγχρονα επιτεύγματα της βιοτεχνολογίας αποδείχθηκαν εντυπωσιακά όσον αφορά την παραγωγή αμινοξέων και συναφών ενώσεων, βιταμινών, τερπενοειδών, βιοκαυσίμων, πολυμερών και των δομικών συστατικών τους, δείχνουν το δρόμο για νέες εξελίξεις (Becker et al., 2015). Από τα οργανικά οξέα το γαλακτικό οξύ είναι το πιο ευρέως διαθέσιμο οργανικό οξύ στον πλανήτη και μπορεί να παραχθεί τόσο με ζύμωση όσο και με χημική σύνθεση. Το 90% της παγκόσμιας παραγωγής γαλακτικού οξέος οφείλεται σε βακτηριακή ζύμωση. Το γαλακτικό οξύ χρησιμοποιείται στις βιομηχανίες τροφίμων, φαρμακευτικών, καλλυντικών, και χημικών, μεταξύ των οποίων στην παραγωγή βιοδιασπόμενων και βιοσυμβατών πολυμερών όπως το πολυγαλακτικό οξύ, ενώ επιπλέον έχει χαρακτηριστεί ως γενικά ασφαλές για ανθρώπινη κατανάλωση (GRAS) (Panda et al., 2016). Το οξικό οξύ είναι ένα άλλο δημοφιλές οργανικό οξύ και χρησιμοποιείται παγκοσμίως ως τρόφιμο υπό τη μορφή όξους. Το οξικό οξύ είναι προϊόν αναερόβιας ζύμωσης και αερόβιας οξείδωσης. Είδη Clostridium και Acetobacterium μπορούν να μετατρέψουν τη γλυκόζη σε οξικό οξύ σε ένα μόνο 98

99 Μέρος 3 Ο Αποελέσματα βήμα μέσω αναερόβιας ζύμωσης, αλλά η χρήση βακτηρίων του οξικού οξέος (Acetobacter) είναι αυτή που εφαρμόζεται για την παραγωγή οξικού οξέος κατάλληλου για τρόφιμα (Panda et al., 2016). Ομοίως, το ηλεκτρικό οξύ έχει και αυτό μεγάλη σημασία, δεδομένου ότι χρησιμοποιείται σήμερα σε τρόφιμα, ποτά, καθώς και από τις φαρμακευτικές βιομηχανίες. Το ηλεκτρικό οξύ επίσης χαρακτηρίζεται ως GRAS από τον FDA (Panda et al., 2016). Επιπλέον το ηλεκτρικό οξύ μπορεί να αποτελέσει την πρώτη ύλη για την παραγωγή του μηλεϊνικού οξέος που είναι σημαντικό δομικό υλικό της πετροχημικής βιομηχανίας (Satinder et al., 2017). Το βουτυρικό οξύ έχει εφαρμογές σε χημικές, φαρμακευτικές βιομηχανίες και βιομηχανίες τροφίμων. Χρησιμοποιείται επίσης στην παραγωγή πλαστικών, γαλακτωματοποιητών, απολυμαντικών και εστέρων. Στην καθαρή του μορφή χρησιμοποιείται ως πρόσθετο σε διάφορα τρόφιμα, για την αύξηση του αρώματος σε φρούτα και ως αρωματική ουσία σε αρώματα (Maiti et al., 2016). Πίνακας 9: Βιομηχανική παραγωγή οργανικών οξέων από διάφορα είδη βιομάζας (Becker et al., 2015). Προϊόν Γαλακτικό οξύ Ετήσια παραγωγή (tn/χρόνο) (παγκόσμια) Οργανισμός Πρώτη ύλη Ζαχαρότευτλα Ζυμομύκητας Σάκχαρα από καλαμπόκι, σιτάρι, ζαχαροκάλαμο Γαλακτικά βακτήρια Υδατάνθρακες Ηλεκτρικό οξύ (Ισπανία) Basfia succiniciproducens Γλυκερόλη, σάκχαρα 13,600 (ΗΠΑ) E. coli Ζαχαρόχορτο 3000 (Γαλλία) E. coli, Ζυμομύκητας (πιθανόν Candida krusei) Καλαμπόκι (Ιταλία) S. cerevisiae Άμυλο Ιτακονικό οξύ Aspergillus terreus Μελάσα, άμυλο, γλυκόζη, γλυκερόλη, ξυλόζη Αδιπικό οξύ 800 kg (ΗΠΑ, pilot plant) Ζυμομύκητας Λιπαρά οξέα Παραγωγή οργανικών οξέων κατά την αναερόβια οξεογένεση κυτταρίνης και γλυκόζης Για την οξεογένεση της κυτταρίνης χρειάζονται να γίνουν ορισμένα βήματα προκειμένου η βιομετατροπή αυτή να είναι επιτυχημένη. Στην αρχή πρέπει να 99

100 Μέρος 3 Ο Αποελέσματα απομακρυνθεί η λιγνίνη καθώς (i) προσφέρει στεγανοποίηση και προστασία από τη μικροβιακή και χημική αποικοδόμηση, (ii) είναι δύσκολη τόσο η χημική όσο και η βιολογική αποικοδόμηση της, (iii) μπλοκάρει την πρόσβαση στην κυτταρίνη και (iv) προκαλεί τη μη αναστρέψιμη προσρόφηση κυτταρινολυτικών ενζύμων (Kandylis et al., 2016). Επειδή η βιοαποικοδόμηση της κυτταρίνης και με τη μεικτή καλλιέργεια είναι πολύ δύσκολη, ιδιαίτερα για να πετύχουμε αυξημένες συγκεντρώσεις, το επόμενο βήμα είναι η υδρόλυση της κυτταρίνης σε σάκχαρα έτσι ώστε να παραχθούν κατάλληλα σάκχαρα που να μπορούν να χρησιμοποιηθούν ευκολότερα από την αναερόβια καλλιέργεια, πράγμα που προτάθηκε πολύ νωρίς από άλλους ερευνητές (Sun and Cheng, 2002). Όμως τα επιπλέον βήματα για την οξεογένεση προσθέτουν κόστος στη διεργασία και γι αυτό πρέπει να αποφευχθούν. Η υδρόλυση της κυτταρίνης σε σάκχαρα και η μετατροπή αυτών σε οργανικά οξέα έγινε σε ένα μόνο βήμα στην παρούσα διατριβή, με τη χρήση προωθητή (κίσσηρη), προκειμένου να αυξηθεί η ταχύτητα της βιοδιεργασίας και η τελική συγκέντρωση των οργανικών οξέων (Dima et al., 2017). Είναι κατανοητό ότι η υδρόλυση της κυτταρίνης που επιχειρήθηκε πριν την αναερόβια κατεργασία στη συνέχεια δίνει υδατοδιαλυτά σάκχαρα που χρησιμοποιούνται από τα οξεογόνα βακτήρια για να παράγουν κυρίως οργανικά οξέα βραχείας αλυσίδας, όπως οξικό, προπιονικό, βουτυρικό, βαλερικό, γαλακτικό, ηλεκτρικό, κ.α. Άλλα προϊόντα ζύμωσης κατά την οξεογένεση είναι η αιθανόλη, το CO2 και το H2. Πολλά είδη βακτηρίων εμπλέκονται στην οξεογένεση και κατά συνέπεια παράγονται διάφορα είδη οργανικών οξέων. Ο ρυθμός, η απόδοση, τα τελικά προϊόντα και η αναστολή του σταδίου της οξεογενέσης εξαρτώνται από τα επικρατούντα μικροβιακά είδη, τη σύνθεση του υποστρώματος και τις συνθήκες διεργασίας. Τέλος, η ΝΗ3 και το Η2S είναι επίσης πιθανά προϊόντα της οξεογένεσης, τα οποία μπορεί να είναι τοξικά και να αναστέλλουν τη δράση ιδιαίτερα των μεθανογόνων βακτηρίων (Kandylis et al., 2016). Η οξεογένεση της γλυκόζης μελετήθηκε χωρίς προωθητή σε ότι αφορά την ταυτόχρονη παραγωγή οργανικών οξέων και βιοαιθανόλης (Ren et al., 1997). Τα οργανικά οξέα που παρήχθησαν μαζί με τη βιοαιθανόλη ήταν το οξικό, προπιονικό, βουτυρικό, βαλερικό και γαλακτικό. Κάθε φορά όμως και ανάλογα με τις συνθήκες επικρατεί κάποιος τύπος ζύμωσης (Syngiridis et al., 2014; (Lappa et al., 2015a, 2015b; Ren et al., 2016; Boura et al., 2017). Από το μηχανισμό είναι δυνατή η παραγωγή αιθανόλης, οξικού, προπιονικού, βουτυρικού, και γαλακτικού οξέος, καθώς και Η2 και CO2. Όμως για να έχει πιθανότητα βιομηχανικής εφαρμογής η ταυτόχρονη παραγωγή οργανικών οξέων και αιθανόλης που απαιτούνται για την παραγωγή εστέρων, θα πρέπει να αυξηθεί η παραγωγικότητα και των δύο αυτών προϊόντων. Αυτό έδωσε το έναυσμα για τη χρήση της κίσσηρης ως προωθητή εφ όσον είχε αποδειχθεί σε προηγούμενες μελέτες ότι αυτή είναι προωθητής της αλκοολικής (Tsoutsas et al., 1990) και μεθανικής ζύμωσης (Koutinas et al., 1994) αλλά και της οξεογένεσης της βινάσσας (Lappa et al., 2015a, 2015b;). 100

101 Μέρος 3 Ο Αποελέσματα Ο ρόλος της κίσσηρης στην οξεογένεση της κυτταρινούχου βιομάζας Στις ζυμώσεις που πραγματοποιήθηκαν παρουσία κίσσηρης φάνηκε σε όλες τις περιπτώσεις βελτίωση του αποτελέσματος της οξεογένεσης καθώς παρατηρήθηκε αύξηση της συγκέντρωσης των παραγόμενων οξέων και αύξηση του ρυθμού της ζύμωσης σε όλες τις συνθήκες που δοκιμάστηκαν. Η κίσσηρη προτάθηκε επίσης ως ένας πολύ καλός φορέας ακινητοποίησης κυττάρων ζυμομυκήτων (Kana et al., 1989). Το ιστορικό αυτό ήταν και η αιτία που η κίσσηρη προτάθηκε να ερευνηθεί αρχικά ως προωθητής της οξεογένεσης της γλυκόζης ως ένωσης/μοντέλο για την οξεογένεση της κυτταρίνης. Μετά την έρευνα στην οξεογένεση της γλυκόζης και εφόσον τα αποτελέσματα ήταν αποδεκτά έγινε η έρευνα στην οξεογένεση της κυτταρίνης Η κίσσηρη έναντι της γ-αλουμίνας στην οξεογένεση της κυτταρίνης Η κίσσηρη είναι μια άφθονη ηφαιστειακή πρώτη ύλη και χαμηλού κόστους ενώ η γ-αλουμίνα είναι ένα ακριβότερο βιομηχανικό προϊόν. Και στα δύο υλικά η τεχνική για την ακινητοποίηση της μικτής καλλιέργειας είναι η ίδια, μια φθηνή και απλή διεργασία. Στην περίπτωση επιμόλυνσης η γ-αλουμίνα αλλά και η κίσσηρη μπορούν να αναγεννηθούν με πλύση με ζεστό νερό ή με κάποια χημική επεξεργασία και να επαναχρησιμοποιηθούν. Από τη βιβλιογραφία έχει γίνει γνωστό ότι η γ-αλουμίνα είναι επίσης προωθητής της αλκοολικής (Kanellaki et al., 1989) και μεθανικής ζύμωσης (Koutinas et al., 1991), αλλά και της οξεογένεσης της σακχαρόζης και της βινάσσας (Lappa et al., 2015a), καθώς και καλός φορέας ακινητοποίησης ζυμομυκήτων. Επομένως, τόσο η κίσσηρη όσο και η γ-αλουμίνα μπορούν να είναι προωθητές της οξεογένεσης της κυτταρίνης. Στην παρούσα διατριβή χρησιμοποιήθηκε ως προωθητής η κίσσηρη στην προσπάθεια παραγωγής μιας νέας γενιάς βιοκαυσίμου Πειράματα μεγάλης κλίμακας (scale-up) O βιοαντιδραστήρας (Σχήμα 4) που χρησιμοποιήθηκε για τα πειράματα μεγάλης κλίμακας αναερόβιας ζύμωσης απολιγνινοποιημένου αχύρου με χρήση αναερόβιας καλλιέργειας ακινητοποιημένης σε κίσσηρη είχε συνολικό όγκο εργασίας 82 L. Ο βιοαντιδραστήρας ήταν κυλινδρικού σχήματος, αποτελείτο από ανοξείδωτο χάλυβα και ήταν συνδεδεμένος με μια περισταλτική αντλία για την επίτευξη της ανακύκλωσης του υγρού της ζύμωσης που έχει σε διασπορά την απολιγνινοποιημένη κυτταρίνη (Σχήμα 4). Η κατασκευή του σχεδιάστηκε με στόχο (i) την ευκολότερη φόρτωση του βιοαντιδραστήρα, (ii) την ομοιογενή κατανομή της κίσσηρης στον όγκο του βιοαντιδραστήρα, (iii) τη μείωση της πίεσης που θα ασκείται στη βάση του βιοαντιδραστήρα, (iv) την ευκολία στην πλύση του βιοαντιδραστήρα, και (v) τη μείωση της πτώσης πίεσης στο βιοαντιδραστήρα κατά τη μεταφορά μάζας με την αντλία. Επίσης, (vi) για να διευκολύνεται η μεταφορά μάζας, αλλά (vii) και η πρόσβαση στη λειτουργία του βιοαντιδραστήρα των χειριστών του μηχανήματος. Η μέθοδος ζύμωσης αναπτύχθηκε με στόχο (1) την προσαρμογή (adaptation) της καλλιέργειας στη 101

102 Μέρος 3 Ο Αποελέσματα βιοποικοδόμηση της κυτταρίνης, (2) την ακινητοποίηση της καλλιέργειας, (3) την αύξηση της ταχύτητας της οξεογένεσης, (4) την αύξηση της συγκέντρωσης των οργανικών οξέων και (5) τη λειτουργική σταθερότητα του βιοαντιδραστήρα. Σχήμα 4: Σχέδιο του βιοαντιδραστήρα που χρησιμοποιήθηκε για τα πειράματα μεγάλης κλίμακας με την κίσσηρη ως προωθητή της οξεογένεσης του αχύρου (απολιγνινοποιημενης κυτταρίνης) Απομόνωση των οργανικών οξέων από το υγρό ζύμωσης Για να επιτευχθεί η παραγωγή του προτεινόμενου καυσίμου που αποτελείται από εστέρες μικρού μοριακού βάρους πρέπει τα οργανικά οξέα που θα παραχθούν με την οξεογένεση να παραλειφθούν με κάποια οικονομική μέθοδο. Oι διάφορες τεχνικές που έχουν χρησιμοποιηθεί για την παραλαβή οξέων από προϊόντα ζύμωσης περιλαμβάνουν προσρόφηση, καθίζηση, ηλεκτροδιάλυση, καθώς και εκχύλιση υγρού-υγρού, οι οποίες έχουν μεγάλο κόστος που μπορεί να φτάσει και το 30 40% του κόστους της όλης παραγωγής (Alkaya et al., 2009; Straathof, 2011). Η εκχύλιση ως μέθοδος φαίνεται να είναι η επικρατέστερη, κι αυτό επειδή είναι λιγότερο ενεργοβόρος, χρειάζεται απλή μηχανολογική εγκατάσταση, και υπό την προϋπόθεση ότι ο διαλύτης είναι φθηνός και άφθονος, δεν περιλαμβάνει ακριβά υλικά τα οποία μπορούν και να ανακυκλώνονται εύκολα. Επειδή τα παραληφθέντα οξέα θα χρησιμοποιηθούν για εστεροποίηση, για τις συγκεκριμένες εκχυλίσεις χρησιμοποιήθηκαν αλκοόλες σχετικά μεγάλου μοριακού βάρους που δεν αναμειγνύονται με το νερό. Έτσι τα προϊόντα θα μπορούν να οδηγηθούν σε απευθείας εστεροποίηση (θερμική η ενζυμική) ως έχουν. Φυσικά η βιοαιθανόλη που παράγεται κατά την 102

103 Μέρος 3 Ο Αποελέσματα οξεογένεση θα εκχυλίζεται ταυτόχρονα και θα συμμετέχει στην εστεροποίηση. Ανάλογα με την πρώτη ύλη που χρησιμοποιείται στην οξεογένεση δημιουργείται και διαφορετικό περιβάλλον από τη διαφορετική σύσταση των οξέων (Syngiridis et al., 2014; Lappa et al., 2015a, 2015b; Ren et al., 2016) το διαφορετικό ph, τα διαφορετικά σάκχαρα ποιοτικά και ποσοτικά και τα διαφορετικά λοιπά συμπαρομαρτούντα συστατικά. Η διαφοροποίηση της σύστασης οδηγεί σε διαφορετικά αποτελέσματα για τον κάθε διαλύτη και κατά συνέπεια αυτό δικαιολογεί την έρευνα κάθε φορά ανάλογα με την πρώτη ύλη Οι εφαρμογές της γλυκόλυσης στη Λευκή Βιοτεχνολογία και η διδακτορική διατριβή Στην παρούσα διδακτορική διατριβή στόχος ήταν η παραγωγή οργανικών οξέων με πρώτη ύλη την κυτταρίνη που υπάρχει στη λιγνινοκυτταρινούχο βιομάζα, στο πλαίσιο μιας αειφόρου ανάπτυξης (sustainable development) και όχι το πετρέλαιο, για χρήση στην παραγωγή εστέρων ως νέων βιοκαυσίμων, ή ως χημικά προϊόντα για διάφορες χρήσεις. Τέτοιου είδους αειφόρες τεχνολογίες (sustainable technologies) περιλαμβάνονται στο γενικότερο επιστημονικά όρο γνωστό διεθνώς ως Λευκή Βιοτεχνολογία. Η βασική βιοχημική διεργασία στην οποία στηρίζεται η Λευκή Βιοτεχνολογία είναι η γλυκόλυση, δηλαδή η βιοχημική μετατροπή των εξοζών σε πυροσταφυλικό οξύ. Αυτή είναι ίσως η σπουδαιότερη μεταβολική βιοχημική οδός, διότι είναι βασική για τη ζωή του ανθρώπου, αλλά και για την αειφορία (sustainability). Οι μικροοργανισμοί μετατρέπουν τη γλυκόζη σε πυροσταφυλικό οξύ, αλλά δεν παράγουν τα ίδια τελικά προϊόντα γιατί το ένζυμο ή τα ένζυμα που βιομετατρέπουν στη συνέχεια το πυροσταφυλικό οξύ είναι διαφορετικά για κάθε μικροοργανισμό. Για παράδειγμα οι ζυμομύκητες βιομετατρέπουν το πυροσταφυλικό σε αιθανόλη σε αναερόβια διεργασία και σε πρωτεΐνες σε αερόβια, τα γαλακτικά βακτήρια σε γαλακτικό οξύ, ο Aspergilus niger σε κιτρικό οξύ, τα Acetobacter σε οξικό οξύ, τα Actinobacillus succinogenes και C. glutamicum σε ηλεκτρικό οξύ (Becker et al., 2015) και οι ελαιογενείς ζύμες σε εστέρες οξέων μεγάλου μοριακού βάρους (Sitepu et al., 2014). Από τη βιοαιθανόλη μπορεί εύκολα να παραχθεί αιθυλένιο που μαζί με το ηλεκτρικό οξύ αποτελούν δύο σημαντικά δομικά υλικά της πετροχημικής βιομηχανίας. Τα παραπάνω παραδείγματα είναι ένα μέρος των προϊόντων που μπορούν να παραχθούν από τη Λευκή Βιοτεχνολογία. Αυτό όμως δείχνει τις τεράστιες δυνατότητες που μας παρέχει η γλυκόλυση όχι μόνο για τη ζωή, αλλά και για την επιβίωση του σύγχρονου τεχνικού πολιτισμού που δυστυχώς στηρίχτηκε στο πετρέλαιο και όχι σε ανανεώσιμες πρώτες ύλες. Στο πλαίσιο της διατριβής έγινε προσπάθεια παραγωγής οργανικών οξέων μικρού μοριακού βάρους από κυτταρίνη με μίγμα μεγάλου αριθμού αναερόβιων βακτηρίων. Η μεικτή αυτή καλλιέργεια καταλήγει στη δημιουργία μόνον πυροσταφυλικού σαν να είναι ένας μικροοργανισμός. Στη συνέχεια το πυροσταφυλικό μέσα από πέντε διαφορετικούς μηχανισμούς και ανάλογα με τις συνθήκες (Ren et al., 1997; Syngiridis et al., 2014; Lappa et al., 2015a, 2015b), μπορεί να μετατραπεί σε διάφορα προϊόντα όπως αιθανόλη, οξικό, βουτυρικό, προπιονικό και γαλακτικό οξύ. Για να γίνει όμως αυτό πρακτικά εφαρμόσιμο, χρειάζεται η προώθηση της οξεογένεσης που είναι και το αντικείμενο της 103

104 Μέρος 3 Ο Αποελέσματα παρούσας διατριβής Η πρωτοτυπία της διατριβής Ένα σημαντικό πρόβλημα στο πεδίο της βιοτεχνολογικής αξιοποίησης της λιγνινοκυτταρινούχου βιομάζας είναι η ανάγκη προκατεργασίας για απομάκρυνση της λιγνίνης και υδρόλυση της κυτταρίνης πριν την οξεογενή ζύμωσή της. Για το λόγο αυτό στην παρούσα διατριβή ερευνήθηκε η οξεογένεση της κυτταρίνης χωρίς να μεσολαβήσει η υδρόλυση προκειμένου να έχουμε μείωση στον αριθμό των χρησιμοποιούμενων βιοαντιδραστήρων, στη μεταφορά μάζας και στο μέγεθος της εγκατάστασης. Επίσης διερευνήθηκε η χάραξη μιας οδού για την εκμετάλλευση της κυτταρίνης που μέχρι σήμερα δεν έχει καταλήξει σε αποτελέσματα που να προσεγγίζουν σε λύση σχετική με την παραγωγή καυσίμων (βιοαιθανόλη) και χημικών προϊόντων. Έτσι η παραγωγή καυσίμων με πρώτη ύλη την κυτταρίνη προτείνεται να γίνει μέσω της παραγωγής οργανικών οξέων και στη συνέχεια εστεροποίηση αυτών προς εστέρες που θα αποτελούν βιοκαύσιμο (Contino et al., 2011). Συγκεκριμένα μελετήθηκαν πρωτότυπα κεφάλαια που περιλαμβάνουν: (i) την έρευνα οξεογένεσης της γλυκόζης παρουσία προωθητή (κίσσηρη) για αύξηση της ταχύτητας ζύμωσης και της συγκέντρωσης σε οργανικά οξέα. Η γλυκόζη μελετήθηκε και ως ένωση μοντέλο για τη βελτιστοποίηση της οξεογένεσης της λιγνινοκυτταρινούχου βιομάζας παρουσία της κίσσηρης. (ii) Επιπλέον μελετήθηκε η οξεογένεση κυτταρίνης μετά από χημική απολιγνινοποίηση της βιομάζας παρουσία προωθητή κίσσηρης σε ένα στάδιο που είναι επίσης πρωτότυπη έρευνα. (iii) Η χρήση του βιοαντιδραστήρα τύπου Multi-Stage Fixed-Bed Tower (MFBT) στην κατεργασία της κυτταρίνης. (iv) Η πρωτότυπη μέθοδος οξεογένεσης της κυτταρίνης στο βιοαντιδραστήρα των 82 L που περιλαμβάνει την προσαρμογή της καλλιέργειας (adaptation) και την παλίρροια του εναιωρήματος που αυξάνει την επαφή των αντιδρώντων. (v) Η ανάκτηση των οργανικών οξέων από το υγρό της ζύμωσης. Τα παραπάνω παρέχουν μια νέα μέθοδο επεξεργασίας της κυτταρίνης για βελτίωση της οξεογένεσης με προωθητή την κίσσηρη και ανοίγουν το δρόμο της παραγωγής οργανικών οξέων και χημικών προϊόντων χωρίς την ανάγκη επιπλέον βημάτων όπως είναι η υδρόλυση. Επιπλέον υπάρχει πρωτοτυπία και στην εργασία ανάκτησης των οργανικών οξέων με διαλύτες όπως οι αλκοόλες που λειτουργούν σαν υπόστρωμα για παραγωγή εστέρων. 104

105 Μέρος 3 Ο Αποελέσματα ΚΕΦΑΛΑΙΟ Οξεογενείς ζυμώσεις γλυκόζης και αχύρου για παραγωγή οργανικών οξέων με προωθητή και χωρίς Mελετήθηκε η χρήση και η προωθητική ικανότητα της κίσσηρης σε βιοαντιδραστήρες διαλείποντος έργου και συνεχούς λειτουργίας για το σχηματισμό αιθανόλης και οργανικών οξέων κατά την οξεογένεση γλυκόζης και αχύρου. Η κίσσηρη χρησιμοποιήθηκε επιπλέον και ως φορέας ακινητοποίησης κυττάρων. Μελετήθηκαν διάφορες παράμετροι που επηρεάζουν την αναερόβια οξεογένεση έτσι ώστε να εντοπιστούν οι βέλτιστες συνθήκες παραγωγής οξέων με χρήση κίσσηρης και με ελεύθερα κύτταρα Επίδραση του ph στην οξεογένεση της γλυκόζης παρουσία κίσσηρης Πίνακας 10: Επίδραση του αρχικού ph παρουσία κίσσηρης στην παραγωγή αιθανόλης και οργανικών οξέων σε συνθετικά θρεπτικά μέσα γλυκόζης με συγκέντρωση 70 g/l. Παρτίδες Αρχικό ph Τελικό ph Αιθανόλη (ml/l) Οργανικά οξέα (g/l) Ηλεκτρικό Γαλακτικό Οξικό Κιτρικό Σύνολο 1 9 3,45 3,89 1,46 17,17 4,23 0,00 22, ,16 5,38 1,01 14,83 3,94 0,00 19, ,23 4,58 1,23 13,83 3,34 0,00 18, ,30 3,60 1,54 12,10 5,65 0,00 19, ,33 4,41 1,30 13,98 2,10 0,00 17, ,23 4,03 1,36 13,08 2,43 0,00 16, ,47 3,47 1,15 12,26 3,30 0,66 17, ,31 4,83 1,03 12,13 4,68 0,00 17, ,42 4,23 1,43 12,95 2,23 0,00 16, ,78 1,93 1,10 11,80 2,43 0,00 15, ,75 4,06 1,01 12,00 3,02 0,00 16, ,40 3,56 1,66 13,41 2,69 0,00 17, ,38 3,39 1,08 12,54 2,48 0,00 16, ,79 4,56 1,42 10,24 2,16 0,00 13, ,77 2,45 1,44 11,01 2,44 0,00 14, ,23 3,29 1,12 12,52 2,16 0,00 15, ,85 2,58 2,12 11,90 2,07 0,00 16, ,85 5,46 2,28 11,74 2,68 0,00 16, ,12 3,59 1,00 11,99 2,60 0,48 16, ,16 2,69 1,47 10,20 1,66 0,00 13, ,73 3,33 2,22 11,60 2,04 0,00 15,86 Η πρώτη παράμετρος που μελετήθηκε ήταν η αρχική τιμή ph (3 έως 9) του 105

106 Μέρος 3 Ο Αποελέσματα διαλύματος γλυκόζης 70 g/l, στους 37 ο C. Άλλοι ερευνητές χρησιμοποίησαν την ίδια καλλιέργεια στη ζύμωση γλυκόζης με γ-αλουμίνα ως προωθητή (Syngiridis et al., 2013, 2014) και είχε διαπιστωθεί ότι οι μεσοφιλικές συνθήκες ήταν ιδανικότερες για τη μέγιστη παραγωγή οργανικών οξέων σε σύγκριση με τις θερμοφιλικές συνθήκες. Όλες οι ζυμώσεις γλυκόζης που έγιναν παρουσία κίσσηρης διήρκησαν 48 h. Από τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται στον Πίνακα 10 γίνεται φανερό πως η στατική αναερόβια ζύμωση παρουσία κίσσηρης έχει ως προϊόντα αιθανόλη, ηλεκτρικό, γαλακτικό και οξικό οξύ. Η αιθανόλη που παράχθηκε παρουσία κίσσηρης ήταν σε συγκεντρώσεις 4,0-5,9 ml/l και παράχθηκε ταυτόχρονα με τα οργανικά οξέα. Η μέγιστη συγκέντρωση της αιθανόλης μπορεί να εστεροποιήσει το 40% περίπου των οργανικών οξέων που συνυπάρχουν στο διάλυμα στη μεγαλύτερή τους συγκέντρωση. Το γαλακτικό οξύ είναι το οξύ που παράγεται στη μεγαλύτερη συγκέντρωση ενώ έχουμε και παραγωγή οξικού οξέος ιδίως στα πιο υψηλά ph. Η συνολική παραγωγή οξέων ήταν υψηλότερη σε αρχικό ph 9 ενώ φάνηκε πως υπάρχει αυξητική τάση στη συγκέντρωση των οξέων από την τιμή 7 μέχρι την τιμή 9. Αυτά τα αποτελέσματα είναι σε αντιστοιχία με προηγούμενες εργασίες στις οποίες χρησιμοποιήθηκε υπόστρωμα γλυκόζης και γ-αλουμίνα ως προωθητής (Syngiridis et al., 2013, 2014). Το γαλακτικό οξύ παράγεται σε ποσοστά που κυμαίνονται επί των συνολικών κοντά στο 65-75% και συνεπώς μπορούμε να πούμε ότι στην οξεογένεση της γλυκόζης παρουσία κίσσηρης επικρατεί ο τύπος της γαλακτικής ζύμωσης, ο μηχανισμός της οποίας δίδεται στις μεταβολικές οδούς της οξεογένεσης της γλυκόζης χωρίς προωθητή κατά Ren (Ren et al., 1997). Σχήμα 5: Επίδραση του ph στο ποσοστό του γαλακτικού οξέος σε συνθετικά θρεπτικά μέσα γλυκόζης με συγκέντρωση 70 g/l. Η παραγωγή του γαλακτικού οξέος ως ποσοστού των συνολικών οξέων 106

107 Μέρος 3 Ο Αποελέσματα φαίνεται να μην επηρεάζεται από το ph (Σχήμα 5). Το οξικό οξύ σχηματίστηκε σε ποσοστά μέχρι 27% ενώ παρήχθη και μια μικρή περιεκτικότητα ηλεκτρικού οξέος. Για λόγους σύγκρισης παράλληλα πραγματοποιήθηκαν τα ίδια πειράματα με τη χρήση ελεύθερων κυττάρων (χωρίς κίσσηρη) έτσι ώστε να φανεί η επίδραση της κίσσηρης στη διεργασία. Τα αποτελέσματα φαίνονται στο παρακάτω Σχήμα 6. Σχήμα 6: Επίδραση της κίσσηρης στην οξεογένεση γλυκόζης αρχικής συγκέντρωσης 70 g/l παρουσία και απουσία κίσσηρης στους 37 o C σε διαφορετικές αρχικές τιμές ph. Σχήμα 7: Κινητική παραγωγής οργανικών οξέων κατά την οξεογένεση γλυκόζης αρχικής συγκέντρωσης 70 g/l παρουσία και απουσία κίσσηρης στους 37 o C και αρχική τιμή ph

108 Μέρος 3 Ο Αποελέσματα Στο Σχήμα 6 παρατηρείται πως η κίσσηρη έχει ευεργετική επίδραση στην οξεογένεση της γλυκόζης σε όλες τις διαφορετικές τιμές αρχικού ph αποδεικνύοντας έτσι την προωθητική της δράση. Η κίσσηρη φαίνεται να αυξάνει τη συγκέντρωση των οργανικών οξέων μέχρι και 150%. Επίσης η κίσσηρη αυξάνει σημαντικά και την ταχύτητα της οξεογένεσης όπως φαίνεται από το Σχήμα 7. Η μεγαλύτερη αύξηση παραγωγής οργανικών οξέων παρατηρήθηκε στην αρχική τιμή ph 9 όπως και οι μεγαλύτερες συγκεντρώσεις. Συνεπώς όλα τα υπόλοιπα πειράματα έγιναν σε αυτήν την αρχική τιμή ph. Με την κίσσηρη φαίνεται ότι μπορεί να επιτευχθει συγκέντρωση 22 g/l οργανικών οξέων σε 48 h, ενώ χωρίς κίσσηρη η συγκέντρωση δεν υπερβαίνει τα 8,5 g/l για το ίδιο χρονικό διάστημα Επίδραση της θερμοκρασίας στην οξεογένεση της γλυκόζης παρουσία και απουσία κίσσηρης Για να μελετηθεί η επίδραση της θερμοκρασίας πραγματοποιήθηκαν batch ζυμώσεις για 48 h στην ίδια συγκέντρωση γλυκόζης (70 g/l), παρουσία και απουσία κίσσηρης, σε τρεις διαφορετικές θερμοκρασίες (30, 37 και 52 ο C) σε αρχική τιμή ph 9. Τα αποτελέσματα φαίνονται στο Σχήμα 6. Σχήμα 8: Επίδραση της θερμοκρασίας στην παραγωγή οργανικών οξέων σε διαλύματα γλυκόζης 70 g/l, και αρχική τιμή ph 9, παρουσία και απουσία κίσσηρης. Στο Σχήμα 8 παρατηρείται πως η κίσσηρη έχει διαφορετική θετική επίδραση στην οξεογένεση της γλυκόζης σε όλες τις θερμοκρασίες που δοκιμαστήκαν αποδεικνύοντας έτσι ξανά την προωθητική της δράση.επιπλέον παρατηρείται πως στους 37 ο C παράχθηκαν οι μεγαλύτερες συγκεντρώσεις οργανικών οξέων παρουσία και απουσία κίσσηρης καθώς και η μεγαλύτερη αύξηση που επιτυγχάνεται με την κίσσηρη στη συγκέντρωση των ολικών οξέων σε σχέση με 108

109 Μέρος 3 Ο Αποελέσματα τα ελευθέρα κύτταρα που ήταν 150%. Το Σχήμα 8 δείχνει ότι ο ρυθμός οξεογένεσης της γλυκόζης είναι σαφώς μεγαλύτερος για την κίσσηρη σε σύγκριση με την οξεογένεση χωρίς τον προωθητή. Αν και στους 30 ο C και 52 ο C η επίδραση ήταν μικρή είναι σαφές από τα Σχήματα 6, 7, και 8 ότι στην οξεογένεση της γλυκόζης παρουσία κίσσηρης επιτυγχάνεται σημαντική αύξηση τόσο του ρυθμού της ζύμωσης αυτής όσο και της συγκέντρωσης των ολικών οξέων. Συνεπώς όλα τα υπόλοιπα πειράματα έγιναν στη θερμοκρασία των 37 ο C. Έτσι επιβεβαιώνεται η προωθητική δράση της κίσσηρης στην οξεογένεση της γλυκόζης πράγμα που συμβαδίζει με την προωθητική δράση της κίσσηρης στην αλκοολική ζύμωση (Tsoutsas et al., 1990) Επίδραση της συγκέντρωσης στην οξεογένεση της γλυκόζης παρουσία και απουσία κίσσηρης Για να μελετηθεί η επίδραση της συγκέντρωσης πραγματοποιήθηκαν batch ζυμώσεις σε θερμοκρασία 37 ο C, αρχική τιμή ph 9 και σε συγκεντρώσεις γλυκόζης 30, 50 και 70 g/l. Όλες οι ζυμώσεις πραγματοποιήθκαν για 48 h. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται στον παρακάτω Πίνακα 11. Σχήμα 9: Κινητική παραγωγής οργανικών οξέων κατά τη οξεογένεση γλυκόζης αρχικής συγκέντρωσης 30, 50 και 70 g/l παρουσία κίσσηρης στους 37 o C και αρχική τιμή ph 9. Παρατηρώντας τον παραπάνω Πίνακα 11, είναι φανερό πως η συγκέντρωση 30 g/l έδωσε τα καλύτερα αποτελέσματα σε σχέση με την απόδοση όσον αφορά τη συνολική παραγωγή των προϊόντων. Στη συγκέντρωση των 30 g/l γλυκόζης παρατηρήθηκαν παρόμοιες συγκεντρώσεις αιθανόλης με αυτές που παρήχθησαν από τα διαλύματα των μεγαλύτερων συγκεντρώσεων. Το οξύ που παράχθηκε σε μεγαλύτερη συγκέντρωση σε όλα τα πειράματα είναι το γαλακτικό. 109

110 Μέρος 3 Ο Αποελέσματα Πίνακας 11: Επίδραση της συγκέντρωσης της γλυκόζης στην παραγωγή αιθανόλης και οργανικών οξέων παρουσία κίσσηρης σε θερμοκρασία 37 ο C παρουσία κίσσηρης Batch Αρχικό ph Τελικό ph Γλυκόζη (g/l) Αιθανόλη (ml/l) Οργανικά οξέα (g/l) Ηλεκτρικό Γαλακτικό Οξικό Σύνολο Απόδοση (g/g γλυκόζης) 1 9 3, ,57 1,08 7,01 1,05 9,14 0, , ,98 0,82 6,04 1,02 7,88 0, , ,18 1,07 6,44 0,92 8,43 0, , ,62 1,01 6,99 0,70 8,70 0, , ,23 0,92 7,02 0,97 8,91 0, , ,42 1,32 9,64 0,00 10,96 0, , ,15 1,24 9,10 0,00 10,34 0, , ,17 1,05 8,98 0,00 10,03 0, , ,89 1,46 17,17 4,23 22,86 0, , ,38 1,01 14,83 3,94 19,78 0, , ,58 1,23 13,83 3,34 18,40 0,31 110

111 Μέρος 3 Ο Αποελέσματα Στη συγκέντρωση 50 g/l δεν παράχθηκε καθόλου οξικό οξύ ενώ υπήρξε στις υπόλοιπες συγκεντρώσεις. Σε όλα τα πειράματα είχαμε και μια ποσότητα ηλεκτρικού οξέος γύρω στο 1 g/l. Παρόλο που οι συγκεντρώσεις των ολικών οργανικών οξέων είναι μεγαλύτερες όταν η συγκέντρωση της γλυκόζης αυξάνει, επειδή η απόδοση στη μικρότερη συγκέντρωση των 30g/L είναι βελτιωμένη, προκρίνεται η συγκέντρωση αυτή για περαιτέρω έρευνα της οξεογένεσης της κυτταρίνης (αχύρου). Αυτό αποδίδεται στην πληρέστερη εκμετάλλευση της πρώτης ύλης και βέβαια πάντοτε με την ελπίδα ότι θα υπάρξει και αυξημένη συγκέντρωση των οξέων. Στο Σχήμα 9 φαίνεται ότι ότι ο ρυθμός της οξεογένεσης είναι μεγαλύτερος στην κινητική των 70 g/l από ότι στις άλλες συγκεντρώσεις που δοκιμάστηκαν. Παρόλο που η συγκέντρωση των οργανικών οξέων είναι μεγαλύτερη στα 70 g/l προτείνεται η συγκέντρωση των 30 g/l καθώς η απόδοση είναι σημαντικά μεγαλύτερη Τεχνολογική αξιολόγηση των αποτελεσμάτων Η οξεογένεση της γλυκόζης παρουσία κίσσηρης έδωσε σημαντικά αυξημένες συγκεντρώσεις οργανικών οξέων, σε όλες τις ζυμώσεις που έγιναν σε διαφορετικές συγκεντρώσεις, αρχικές τιμές ph και θερμοκρασίες. Έτσι επικυρώνεται η κίσσηρη ως προωθητής της οξεογένεσης της γλυκόζης και επιβεβαιώνεται η αρχική θεώρηση, ότι, πιθανόν η κίσσηρη να βελτίωνε την οξεογένεση, επειδή είχε παρατηρηθεί παρόμοια δράση της κίσσηρης στην αλκοολική ζύμωση (Tsoutsas et al., 1990). Από τα αποτελέσματα που παρουσιάστηκαν παραπάνω φαίνεται επίσης ότι η κίσσηρη αυξάνει ταυτόχρονα το ρυθμό της ζύμωσης και την τελική συνολική συγκέντρωση των οργανικών οξέων. Έτσι έχουμε αύξηση της παραγωγικότητας και της ποσότητας των οργανικών οξέων που μπορούμε να παράγουμε σε ορισμένο όγκο αντιδραστήρα. Αυτά τα δύο μειώνουν όχι μόνον το κόστος παραγωγής, το μέγεθος των βιοαντιδραστήρων και του εργοστασίου γενικότερα, αλλά και το ύψος της επένδυσης. Έτσι αποδεικνύεται ότι η ανάπτυξη μεθόδου για τη βιομηχανική παραγωγή οργανικών οξέων από κυτταρίνη δεν μπορεί να επιχειρηθεί χωρίς την κίσσηρη. Μετά από όλα τα παραπάνω επιλέγεται η κίσσηρη για πιθανή προωθητική δράση στην οξεογένεση της κυτταρίνης (απολιγνινοποιημένου αχύρου) σε ph 9, θερμοκρασία 37 o C και συγκέντρωση κυτταρίνης 30 g/l Οξεογένεση αχύρου παρουσία κίσσηρης Επίδραση του ph στις επαναλαμβανόμενες batch αναερόβιες ζυμώσεις αχύρου παρουσία και απουσία κίσσηρης Μετά τον προσδιορισμό των μεταβλητών της ζύμωσης με το πρότυπο διάλυμα γλυκόζης, τα επόμενα πειράματα προχώρησαν με μελέτη του λιγνινοκυτταρινούχου αποβλήτου. Αρχικά μελετήθηκε το χημικώς απολιγνινοποιημένο άχυρο και η επίδραση της παρουσίας της κίσσηρης σε 111

112 Μέρος 3 Ο Αποελέσματα ζυμώσεις διαλείποντος έργου. Το άχυρο εκτός από απολιγνινοποίηση είχε κοπεί σε κομμάτια περίπου 1 cm. Οι ζυμώσεις αυτές έγιναν στους 37 ο C σε συγκέντρωση 30 g/l απολιγνινοποιημένου αχύρου και δοκιμάστηκαν οι αρχικές τιμές ph 7, 8, και 9 για λόγους σύγκρισης. Όλες οι ζυμώσεις ήταν διάρκειας 48 h. Στον Πίνακα 12 παρατηρείται πως η παραγωγή αιθανόλης έχει μειωθεί σε πολύ χαμηλές συγκεντρώσεις (κάτω από 0,2 ml/l στις περισσότερες περιπτώσεις) και είναι σε πολύ μικρότερα επίπεδα από τα 4-5 ml/l που είχαμε στις αντίστοιχες συγκεντρώσεις γλυκόζης. Όσον αφορά τα οξέα, παράχθηκε κυρίως γαλακτικό (4,5 5,3 g/l) και ηλεκτρικό και οξικό σε μικρότερες ποσότητες (1 και 1,5 g/l αντίστοιχα). Τα συνολικά οξέα που παράχθηκαν ήταν 7,8 g/l, συγκέντρωση περίπου 10% μικρότερη από την αντίστοιχη κατά την οξεογένεση της γλυκόζης στη συγκέντρωση 30 g/l. Η μείωση αυτή οφείλεται στο γεγονός ότι η βιοαποικοδόμηση της κυτταρίνης είναι δυσκολότερη. Όμως το γεγονός ότι η συγκέντρωση που επετεύχθη γειτνιάζει της συγκέντρωσης οργανικών οξέων που επετεύχθη με τη γλυκόζη ενθαρρύνει την περαιτέρω έρευνα. Όπως και στην περίπτωση της γλυκόζης, το οξύ που κυριαρχεί είναι το γαλακτικό που παράχθηκε σε ποσοστά μέχρι 70% των συνολικών οξέων. Έτσι και στην οξεογένεση της κυτταρίνης έχουμε τον τύπο της γαλακτικής ζύμωσης να κυριαρχεί. Συμπερασματικά παρατηρείται πως το προφίλ των οξέων που παράχθηκε από την οξεογένεση του αχύρου είναι αντίστοιχο με αυτό της αναερόβιας ζύμωσης της γλυκόζης. Σχήμα 10: Επίδραση της κίσσηρης στην οξεογένεση του αχύρου αρχικής συγκέντρωσης 30 g/l, στους 37 o C, παρουσία και απουσία κίσσηρης, σε διαφορετικές αρχικές τιμές ph. 112

113 Μέρος 3 Ο Αποελέσματα Πίνακας 12: Επίδραση του ph στην οξεογένεση χημικώς απολιγνινοποιημένου άχυρου συγκέντρωσης 30 g/l παρουσία κίσσηρης. Ζύμωση Αρχικό ph Τελικό ph Αιθανόλη (ml/l) Οργανικά οξέα (g/l) Ηλεκτρικό Γαλακτικό Οξικό Σύνολο Αζύμωτο σάκχαρο (g/l) 1 9 5,31 0,13 1,01 5,37 1,43 7,81 0, ,23 0,16 0,97 5,10 1,53 7,60 0, ,23 0,14 1,10 4,93 1,44 7,47 0, ,16 0,19 1,15 4,95 1,55 7,65 0, ,15 0,12 0,86 4,55 1,36 6,89 0, ,32 0,24 0,94 4,44 1,32 6,70 0, ,52 0,33 0,87 5,23 1,43 7,53 0, ,52 0,29 0,97 4,34 1,44 6,75 0, ,25 0,14 0,96 4,44 1,38 6,78 0, ,15 0,16 0,84 5,21 1,23 7,28 0, ,23 0,16 0,92 5,48 1,43 7,83 0, ,16 0,18 0,95 4,58 1,23 6,76 0,33 113

114 Μέρος 3 Ο Αποελέσματα Στο Σχήμα 10 παρατηρείται πως η κίσσηρη έχει θετική επίδραση στην οξεογένεση του αχύρου σε όλες τις διαφορετικές αρχικές τιμές ph αποδεικνύοντας έτσι την προωθητική της ιδιότητα και σε αυτή τη διαδικασία οξεογένεσης. Η μεγαλύτερη συγκέντρωση οξέων καθώς και η αύξηση παραγωγής αυτών παρατηρήθηκε σε αρχικό ph 9, όπου η συγκέντρωση των οξέων ήταν μέχρι και 300% μεγαλύτερη από εκείνη χωρίς την κίσσηρη. Επίσης, το Σχήμα 11 μας δείχνει ότι η κίσσηρη αύξησε σημαντικά την ταχύτητα της οξεογένεσης σε σύγκριση με την οξεογένεση χωρίς την κίσσηρη, και μάλιστα περισσότερο από εκείνη που επετεύχθη στη γλυκόζη. Σχήμα 11: Κινητική παραγωγής οργανικών οξέων κατά τη οξεογένεση αχύρου αρχικής συγκέντρωσης 30 g/l, παρουσία και απουσία κίσσηρης, στους 37 o C και αρχική τιμή ph Επαναλαμβανόμενες batch αναερόβιες ζυμώσεις αχύρου παρουσία και απουσία κίσσηρης με αποβολή και αναπλήρωση του υγρού ζύμωσης: Επίδραση του ph Οι κινητικές που παρουσιάζονται στην δείχνουν ότι η παραγωγή μεγάλου ποσοστού των οργανικών οξέων σχηματίζεται στις πρώτες 9 ώρες της οξεογένεσης. Έτσι έγινε η σκέψη η οξεογένεση της ίδιας ποσότητας απολιγνινοποιημένου αχύρου να γίνεται κατά επαναλαμβανόμενες παρτίδες διάρκειας 9 ωρών. Αυτό έγινε σε 4 παρτίδες συνολικής διάρκειας 36 ωρών με στόχο να συντομευθεί ο χρόνος της οξεογένεσης αλλά και να αυξηθεί η απόδοση της κατεργασίας του αχύρου έτσι ώστε το υπόλειμμα του μη ζυμωθέντος αχύρου στο βιοαντιδραστήρα να είναι μηδαμινό. Μ αυτό τον τρόπο θα μειωθεί σημαντικά η παρεμπόδιση που ασκούν τα οργανικά οξέα. Έτσι πραγματοποιήθηκαν επαναλαμβανόμενες batch ζυμώσεις σε αρχικές τιμές ph 7, 8 και 9 σε αρχική συγκέντρωση αχύρου 30 g/l σε θερμοκρασία 37 o C παρουσία και απουσία κίσσηρης. Tα ζυμωμένα υγρά αναπληρωνόντουσαν 114

115 Μέρος 3 Ο Αποελέσματα κάθε 9 ώρες με θρεπτικό διάλυμα ίδιο με αυτό που χρησιμοποιήθηκε για τη ζύμωση αλλά χωρίς την προσθήκη νέου αχύρου. Τα αποτελέσματα φαίνονται στα παρακάτω Σχήματα. Σχήμα 12: Η επίδραση του αρχικού ph στην παραγωγή οργανικών οξέων σε επαναλαμβανόμενες οξεογενείς ζυμώσεις διάρκειας 9 h, ποσότητας αχύρου 30 g/l, στους 37 ο C, παρουσία και απουσία κίσσηρης. Στο Σχήμα 12 παρατηρείται πως η κίσσηρη έχει θετική επίδραση στην οξεογένεση της απολιγνινοποιημένης κυτταρίνης (αχύρου) σε όλες τις αρχικές τιμές ph που δοκιμαστήκαν επιβεβαιώνοντας έτσι ξανά την προωθητική της ιδιότητα. Ιδίως σε αρχική τιμή ph 9 παρατηρήθηκε η μεγαλύτερη αύξηση παραγωγής (περίπου 300%). Σε ph 7 οι συγκεντρώσεις των παραγόμενων οξέων ήταν περίπου ίδιες με αυτές σε ph 9 (0,1 g/l διαφορά). Παρατηρείται επίσης ότι η παραγωγή πέφτει σε κάθε επαναλαμβανομένη ζύμωση της ίδιας ποσότητας αχύρου. Η μείωση αυτή δικαιολογείται από το ότι η συγκέντρωση της κυτταρίνης μειώνεται από παρτίδα σε παρτίδα. Στο Σχήμα 13 φαίνεται η συνολική παραγωγή οξέων από 30 g/l κυτταρίνη σε μια παρτίδα ζύμωσης διάρκειας 48 h καθώς και σε διαδοχικές επαναλαμβανόμενες παρτίδες διάρκειας η κάθε μια 9 h. Από τη σύγκριση αυτή φαίνεται ότι η ποσότητα των οργανικών οξέων που παράγεται στις διαδοχικές ζυμώσεις είναι κατά 150% μεγαλύτερη εκείνης της μιας παρτίδας των 48 h. Επίσης ο χρόνος ζύμωσης της μιας παρτίδας είναι μεγαλύτερος εκείνου των διαδοχικών παρτίδων συνολικά, με σημαντική αύξηση της παραγωγικότητας σε οργανικά οξέα. 115

116 Μέρος 3 Ο Αποελέσματα Σχήμα 13: Παραγωγή οργανικών οξέων παρουσία κίσσηρης στη ζύμωση μιας παρτίδας 48 h και 4 διαδοχικών ζυμώσεων διάρκειας 9 h η κάθε μία, ποσότητας 30 g/l αχύρου, σε ph 9. Σχήμα 14: Παραγωγή επιμέρους οργανικών οξέων σε αρχικό ph 9 για κάθε επαναλαμβανόμενη παρτίδα αναερόβιας ζύμωσης, διάρκειας 9 h, ποσότητας 30 g/l αχύρου παρουσία κίσσηρης. Στο Σχήμα 14 εμφανίζεται το προφίλ των οξέων που παράχθηκαν κατά τη διάρκεια της ζύμωσης της ίδιας ποσότητας αχύρου σε διαδοχικές παρτίδες. Στο πρώτο batch παρουσιάστηκαν ηλεκτρικό οξύ και μία μεγάλη ποσότητα γαλακτικού οξέος που δεν ξαναεμφανίστηκε μετά. Σε όλα τα batch υπήρξε μία μικρή ποσότητα οξικού οξέος ενώ από το 2 ο και μετά παράχθηκε και μια ποσότητα βαλερικού οξέος. Άλλα οξέα που παράχθηκαν είναι μια 116

117 Μέρος 3 Ο Αποελέσματα μικροποσότητα ισοβουτυρικού στο 2 ο batch καθώς και βουτυρικό οξύ (1,73 g/l) στο 2 ο batch και περίπου 0,5 g/l στο 1 ο και 4 ο. Σε όλες τις ζυμώσεις υπήρξε παραγωγή και μίας μικρής ποσότητας αιθανόλης η οποία δεν ξεπέρασε τα 0,5 g/l. Έτσι εδώ φαίνεται ότι υπάρχει διαφοροποίηση στην παραγωγή των επιμέρους οργανικών οξέων κατά την πορεία της ζύμωσης που είναι και ένα νέο αποτέλεσμα στην οξεογένεση της κυτταρίνης Επιστημονική και τεχνολογική αξιολόγηση των αποτελεσμάτων της οξεογένεσης της απολιγνινοποιημένης κυτταρίνης παρουσία κίσσηρης Η οξεογένεση του αχύρου παρουσία κίσσηρης έδωσε σημαντικά αυξημένες συγκεντρώσεις οργανικών οξέων σε σύγκριση με την οξεογένεση απουσία κίσσηρης. Από τα αποτελέσματα που παρουσιάστηκαν παραπάνω φαίνεται επίσης ότι η κίσσηρη αυξάνει ταυτόχρονα το ρυθμό της ζύμωσης και την τελική συνολική συγκέντρωση των οργανικών οξέων. Έτσι παρατηρείται αύξηση της παραγωγικότητας αλλά και της ποσότητας των οργανικών οξέων που μπορούν να παραχθούν σε ορισμένο όγκο αντιδραστήρα. Αυτά τα δύο μειώνουν όχι μόνον το κόστος παραγωγής, το μέγεθος των βιοαντιδραστήρων και του εργοστασίου γενικότερα αλλά και το ύψος της επένδυσης. Έτσι αποδεικνύεται ότι η ανάπτυξη μεθόδου για τη βιομηχανική παραγωγή των οργανικών οξέων από την κυτταρίνη δεν μπορεί να επιχειρηθεί χωρίς την κίσσηρη Συνεχής οξεογένεση γλυκόζης και αχύρου παρουσία προωθητών Συνεχής οξεογένεση γλυκόζης παρουσία κίσσηρης. Εικόνα 2: Σύστημα συνεχούς λειτουργίας οξεογένεσης με κίσσηρη. Η συνεχής λειτουργία του αντιδραστήρα διήρκησε 97 μέρες και δοκιμάστηκαν 117

118 Μέρος 3 Ο Αποελέσματα 3 διαφορετικές συγκεντρώσεις γλυκόζης με αρχικό ph 9 και θερμοκρασία 37 o C. Η τιμή ph και η θερμοκρασία επιλέχτηκαν ως βέλτιστες συνθήκες, έχοντας βασιστεί στα αποτελέσματα της οξεογένεσης της γλυκόζης παρουσία κίσσηρης (Κεφ ) που είναι παρόμοια με τα αποτελέσματα της οξεογένεσης της γλυκόζης παρουσία γ-αλουμίνας (Syngiridis et al., 2013, 2014). Αρχικά το σύστημα της Εικόνας 2 τροφοδοτήθηκε με θρεπτικό υγρό που περιείχε 70 g/l γλυκόζη του οποίου η συγκέντρωση σταδιακά μειώθηκε στα 30 g/l. Τα αποτελέσματα της συνεχούς οξεογένεσης της γλυκόζης με ακινητοποιημένα κύτταρα σε κίσσηρη δίνονται στους Πίνακες 13 και 14. Το ph μειώθηκε σε σημαντικό βαθμό κατά τη διάρκεια της ζύμωσης, από 8,9 σε 3,5. Το γεγονός αυτό δείχνει την πραγματοποίηση της οξεογένεσης. Η βιομετατροπή των σακχάρων είναι ικανοποιητική, ειδικά στις χαμηλότερες συγκεντρώσεις της γλυκόζης ενώ δεν παρατηρήθηκε παραγωγή βιοαερίου σε κανένα στάδιο της ζύμωσης. Η συνεχής ζύμωση έδωσε υψηλές συγκεντρώσεις οργανικών οξέων που έφτασαν μέχρι τα 15,2 g/l μετά το πέρας της περιόδου προσαρμογής. Όμως η πιο σταθεροποιημένη κατάσταση όσον αφορά τη συγκέντρωση των ολικών όξέων επετεύχθη στη συγκέντρωση γλυκόζης 30 g/l. Συγκεκριμένα τα ολικά οξέα μετά από μια περίοδο προσαρμογής του βιοαντιδραστήρα ήταν g/l. Έτσι η συγκέντρωση στη συνεχή οξεογένεση στα 30 g/l γλυκόζης είναι 25-50% μεγαλύτερη στη συνεχή διεργασία σε σύγκριση με την οξεογένεση διαλείποντος έργου (batch). Η αύξηση αυτή δεν είναι συνηθισμένη όταν συγκρίνουμε σε άλλες αντιδράσεις τη συνεχή και τη batch διεργασία. Έτσι η αύξηση αυτή μπορεί να αποδοθεί (i) στο γεγονός ότι στον batch αντιδραστήρα έχουμε το ίδιο ph σε όλη τη μάζα του αντιδραστήρα ενώ κατά τη συνεχή διεργασία το ph μειώνεται από κάτω προς τα πάνω. Κατά συνέπεια η παρεμπόδιση που ασκείται από τα αδιάστατα μόρια των οργανικών οξέων (Jankowska et al., 2015) να είναι μικρότερη. (ii) Επίσης η συγκέντρωση της γλυκόζης μειώνεται από κάτω προς τα πάνω του βιοαντιδραστήρα, πράγμα που μειώνει την ωσμωτική πίεση και προκαλείται έτσι μικρότερο ωσμωτικό stress στα κύτταρα. Η συγκέντρωση αυτή δεν διαφέρει σημαντικά από τη συγκέντρωση που έδωσαν τα 50 και 70 g/l και κατά συνέπεια η απόδοση σε ολικά οργανικά οξέα είναι πολύ μεγαλύτερη στα 30 g/l γλυκόζης. Τα οξέα που παρήχθησαν κατά τη διάρκεια του ζύμωσης ήταν το οξικό, το γαλακτικό, και το ηλεκτρικό οξύ ενώ μετά από κάποιες ημέρες ζύμωσης εμφανιζόταν ισοβουτυρικό και μηλικό οξύ σε μικρές συγκεντρώσεις. Παρατηρήθηκε ότι το γαλακτικό οξύ είναι το κύριο προϊόν και επομένως ευνοείται και στη συνεχή διεργασία ο τύπος της γαλακτικής ζύμωσης. Η συγκέντρωση του γαλακτικού είναι αρκετά υψηλότερη σε σχέση με τα πειράματα στατικών ζυμώσεων και ακολουθεί περίπου την αύξηση των ολικών οργανικών οξέων. Η συγκέντρωση του γαλακτικού είναι περίπου και μέχρι το 75% των συνολικών οργανικών οξέων. Αντίστοιχα η συγκέντρωση του οξικού οξέος κυμάνθηκε σε πολύ χαμηλότερα επίπεδα σε σχέση με τις batch ζυμώσεις. Όσον αφορά τα αζύμωτα σάκχαρα παρατηρήθηκε πώς όσο προχωρούσε η ζύμωση μειωνόταν η ποσότητα τους και στις χαμηλότερες συγκεντρώσεις 30 και 50 g/l γλυκόζης η ποσότητά τους εκμηδενίστηκε. 118

119 Μέρος 3 Ο Αποελέσματα Επιπλέον παρατηρήθηκε παραγωγή αιθανόλης καθ όλη τη διάρκεια της συνεχούς οξεογένεσης όπως και σε άλλες έρευνες σε παρόμοια συστήματα στα οποία είχαν χρησιμοποιηθεί σάκχαρα όπως η γλυκόζη, η σακχαρόζη και η ραφινόζη και γ-αλουμίνα ως προωθητής (Syngiridis et al., 2013, 2014; Lappa et al., 2015a). Συγκεκριμένα όταν η συγκέντρωση της γλυκόζης ήταν στα 70 g/l παρατηρήθηκαν οι μεγαλύτερες συγκεντρώσεις αιθανόλης που έφτασαν και τα 6,5 ml/l ενώ όσο έπεφτε η συγκέντρωση της γλυκόζης μειωνόταν ανάλογα και η αιθανόλη, δίνοντας περίπου 5,23 ml/l μέγιστο στα 50 g/l γλυκόζης και 4,1 ml/l μέγιστο στα 30 g/l. Παρόλα αυτά όμως η αλκοόλη που παράγεται ταυτόχρονα με τα οργανικά οξέα είναι περίπου το 50-60% της ποσότητας που χρειάζεται για την εστεροποίηση της συνολικής ποσότητας των οργανικών οξέων. Σχήμα 15: Επίδραση της συγκέντρωσης γλυκόζης στη συνεχή οξεογένεση παρουσία κίσσηρης. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 15 παρατηρήθηκε παραγωγή οξικού οξέος όλες τις μέρες καθώς και μεγάλης ποσότητας γαλακτικού πού ήταν και το οξύ που παράχθηκε σε μεγαλύτερη συγκέντρωση. Παρατηρείται επίσης πως στη μικρότερη παροχή γλυκόζης τα αποτελέσματα ήταν παρόμοια με τις μεγαλύτερες παροχές όσον αφορά στην παραγωγή οξέων μετά όμως από μία μακρά περίοδο προσαρμογής. 119

120 Μέρος 3 Ο Αποελέσματα Πίνακας 13: Αποτελέσματα οξεογένεσης γλυκόζης 50 και 70 g/l σε αντιδραστήρα συνεχούς λειτουργίας, στους 37 ο C και σε αρχικό ph 9, παρουσία κίσσηρης. Γλυκόζη (g/l) Flow rate (L/d) Χρόνος ζύμωσης (d) Τελικό ph Αιθανόλη (ml/l) Οργανικά οξέα (g/l) Ηλεκτρικό Οξικό Γαλακτικό Μηλικό Ισοβουτυρικό Σύνολο Αζύμωτο σάκχαρο (g/l) 70 0,2 1 3,59 3,89 10,00 0 3,15 0 0,99 14,14 10, ,2 2 3,43 4,81 3,29 1,24 5, ,26 9, ,2 3 3,55 6,48 1,97 1,07 4, ,07 11, ,2 5 3,49 5,43 0,40 1,22 7, ,85 10, ,2 8 3,33 4,13 4,60 1,80 7,69 0 0,80 14,89 9, ,2 9 3,12 4,65 3,88 1,81 8,62 0 0,82 15,13 8, ,2 11 3,56 5,19 3,40 1,83 7,92 0 0,78 13,93 9, ,2 12 3,48 6,17 2,85 1,49 8, ,68 8, ,2 15 3,64 6,49 2,16 1,30 7, ,46 7, ,2 18 3,55 6,25 1,85 1,95 7, ,26 6, ,2 19 3,68 4,39 0,96 1,15 7, ,62 4, ,2 23 3,72 4,23 0,99 1,34 6, ,71 2, ,2 26 3,56 5,37 1,04 1,12 6, ,05 0, ,2 28 3,45 4,59 1,04 1,30 6, ,87 0, ,2 29 3,53 4,98 1,06 1,65 6, ,95 0, ,2 33 3,49 5,23 2,25 1,51 11, , ,2 34 3,42 5,03 1,49 1,21 8, , ,2 37 3,46 4,51 1,56 1,11 10, ,

121 121 Μέρος 3 Ο Αποελέσματα Πίνακας 14: Αποτελέσματα οξεογένεσης γλυκόζης 30 g/l σε αντιδραστήρα συνεχούς λειτουργίας, στους 37 ο C και σε αρχικό ph 9, παρουσία κίσσηρης. Γλυκόζη (g/l) Flow rate (L/d) Χρόνος ζύμωσης (d) Τελικ ό ph Αιθανόλη (ml/l) Οργανικά οξέα (g/l) Ηλεκτρικό Οξικό Γαλακτικό Μηλικό Ισοβουτυρικό Σύνολο Αζύμωτο σάκχαρο (g/l) 30 0,2 39 3,29 0,49 0 2, ,97 5, ,2 40 3,32 0,48 0 0,53 3, ,14 4, , ,35 0,51 0 0,69 4, ,28 2, , ,65 0, , ,25 2, , ,45 0,55 0 1,18 2, ,93 1, ,2 58 4,39 0, , ,25 1, ,2 61 4,56 1, , ,87 0, ,2 63 3,82 2, , ,05 0, ,2 68 4,72 2,36 0 0,65 4, , ,2 72 3,49 2, , ,04 0, ,2 74 3,5 3,46 0 0,53 4, , ,2 76 3,52 3,24 0 3,80 6, ,34 0, ,2 77 3,6 3,59 1,01 1,00 8,92 1, , ,2 79 3,33 3,61 1,07 1,01 8,91 1, ,07 0, ,2 82 3,35 3,98 0,93 1,00 8,30 1, , ,2 84 3,86 3,16 0,92 0,93 7,64 1, ,58 0, ,2 85 3,69 3,23 0,92 0,97 8,62 1, ,53 0, ,2 87 3,6 3,48 0,91 0,99 9,20 1, ,32 0, ,2 88 3,59 4,16 0,88 1,01 7,50 1, ,53 0, ,2 90 3,45 3,56 0,96 1,02 8,60 1, ,84 0, ,2 92 3,52 3,75 0,89 0,96 8,10 1, , ,2 93 3,49 3,89 0,87 0,94 8,63 1, , ,2 94 3,46 3,49 0,93 1,06 8,12 1, , ,2 97 3,55 3,49 0,86 1,00 8,98 1, ,08 0,21

122 Μέρος 3 Ο Αποελέσματα Πίνακας 15: Συγκριτικά στοιχεία στις αποδόσεις της batch και συνεχούς οξεογένεσης γλυκόζης παρουσία κίσσηρης σε διάφορες συγκεντρώσεις. Τύπος ζύμωσης Γλυκόζη (g/l) Βιοαιθανόλη (ml/l) Οργανικά οξέα (g/l) Απόδοση βιοαιθανόλης (g /g γλυκόζης) Παραγωγικότητα βιοαιθανόλης (g/ld) Απόδοση οξέων (g /g γλυκόζης) Παραγωγικότητα οξέων (g/ld) Συνολική απόδοση (g /g γλυκόζης) Συνολική παραγωγικότητα (g/ld) Συνεχής 30 3,48 12,32 0,09 0,78 0,41 3,52 0,50 4,30 Batch 30 4,57 9,14 0,12 1,80 0,30 4,57 0,42 6,37 Συνεχής 50 5,23 15,2 0,08 1,18 0,30 4,34 0,39 5,52 Batch 50 5,17 10,03 0,08 2,04 0,20 5,02 0,28 7,05 Συνεχής 70 4,65 15,13 0,05 1,05 0,22 4,32 0,27 5,37 Batch 70 3,89 22,86 0,04 1,53 0,33 11,43 0,37 12,96 122

123 Μέρος 3 Ο Αποελέσματα Στον Πίνακα 15 παρατηρείται πως κατά τη συνεχή οξεογένεση γλυκόζης συγκέντρωσης 30 και 50 g/l επιτεύχθηκαν μεγαλύτερες συγκεντρώσεις οξέων από ότι στις batch ζυμώσεις. Σε όλες τις συνθήκες η συγκέντρωση, η απόδοση και η παραγωγικότητα της βιοαιθανόλης κυμάνθηκε σε χαμηλά επίπεδα. Όσον αφορά τα οξέα, η παραγωγικότητα ήταν υψηλότερη στις batch ζυμώσεις αν και στις μικρές συγκεντρώσεις η διαφορά ήταν αρκετά πιο μικρή σε σχέση με τη συγκέντρωση γλυκόζης των 70 g/l που ήταν 3 φορές μεγαλύτερη. Οι μεγαλύτερες συνολικές αποδόσεις επιτεύχθηκαν στη συγκέντρωση 30 g/l ενώ οι μεγαλύτερες συνολικές παραγωγικότητες στην batch ζύμωση συγκέντρωσης γλυκόζης 70 g/l. H μεγαλύτερη συγκέντρωση οργανικών οξέων οφείλεται στη μεγαλύτερη απόδοση κατά τη συνεχή διεργασία. Όταν όμως η συγκέντρωση γλυκόζης αυξάνει το αποτέλεσμα είναι ακριβώς το αντίθετο Συνεχείς αναερόβιες ζυμώσεις αχύρου παρουσία κίσσηρης. Για τη συνεχή αναερόβια ζύμωση αχύρου παρουσία κίσσηρης χρησιμοποιήθηκε η ίδια πειραματική διάταξη και ακολουθήθηκε η ίδια μέθοδος για την ακινητοποίηση της βιομάζας όπως στα πειράματα με τη συνεχή αναερόβια ζύμωση γλυκόζης (Εικόνα 3). Εικόνα 3: Πειραματική διάταξη του συστήματος συνεχούς λειτουργίας για τη ζύμωση του απολιγνινοποιημένου αχύρου παρουσία κίσσηρης. 123

124 Μέρος 3 Ο Αποελέσματα Αφού επήλθε η σταθερή κατάσταση ο αντιδραστήρας ανοίχθηκε ώστε να πληρωθεί με εναιώρημα απολιγνινοποιημένου αχύρου 30 g/l με μήκος σωματιδίων του αχύρου μικρότερο του 1 cm. Το υγρό που αφέθηκε να κυκλοφορήσει μέσα στον αντιδραστήρα με τη βοήθεια αντλίας περιείχε 1,6 ml/l υδατικό διάλυμα NH3, και 0,32 ml/l 50% H3PO4, NaHCO3 4 g/l και yeast extract 4 g/l και δεν περιείχε άχυρο. Η τροφοδοσία κράτησε 10 μέρες καθώς την 11 η δεν παράχθηκαν οργανικά οξέα. Τα αποτελέσματα φαίνονται στον παρακάτω Πίνακα 16. Η συνεχής οξεογένεση της ίδιας ποσότητας απολιγνινοποιημένου αχύρου έγινε κυρίως με στόχο να διαπιστωθεί ο χρόνος που χρειάζεται για την πλήρη βιομετατροπή όλης της ποσότητας του. Από τα αποτελέσματα βλέπουμε πως η ποσότητα των συνολικών οξέων και αιθανόλης μειώθηκε σε σύγκριση με τη ζύμωση της γλυκόζης αλλά το σύστημα φάνηκε να ανταπεξέρχεται τόσο στην απευθείας υδρόλυση του απολιγνινοποιημένου άχυρου όσο και στην οξεογένεση του σε ένα βήμα. Επιπλέον δεν μετρήθηκαν αζύμωτα σάκχαρα, δηλαδή τα υδρολυμένα σάκχαρα καταναλώνονταν όλα από την καλλιέργεια. Επιπλέον παρατηρείται πως έχει αλλάξει το προφίλ των οργανικών οξέων που παράγεται καθώς μετά την πρώτη μέρα δεν έχουμε καθόλου γαλακτικό οξύ που παραγόταν σε πολύ μεγάλες ποσότητες όταν το υπόστρωμα ήταν η γλυκόζη, και επιπλέον έχουμε παραγωγή βουτυρικού οξέος. Έτσι από έναν τύπο γαλακτικής ζύμωσης στην batch οξεογένεση, πηγαίνουμε σε βουτυρικού τύπου οξεογένεση στη συνεχή αναερόβια κατεργασία της κυτταρίνης με ακινητοποιημένα κύτταρα σε κίσσηρη. Επίσης εδώ θα πρέπει να τονίσουμε ότι όλες οι παράμετροι στην οξεογένεση είναι ακριβώς ίδιες. Η μόνη διαφορά που καταγράφεται είναι ότι στη μία περίπτωση χρησιμοποιήθηκε batch και στην άλλη περίπτωση συνεχής διεργασία. Είναι δε λογικό να ειπωθεί πως η διαφοροποίηση στη ζύμωση αυτή οφείλεται στο είδος της διεργασίας. Μια εξήγηση που θα μπορούσε να δοθεί στην προκειμένη περίπτωση είναι (i) οι διαφορετικές συνθήκες που θα μπορούσαν να δημιουργηθούν στην επιφάνεια της κίσσηρης και της κυτταρίνης (ii) καθώς και από το διαφορετικό χρόνο επαφής του βιοκαταλύτη με την κυτταρίνη που είναι λογικό να υπάρξει διότι κατά τη συνεχή διεργασία εφάπτεται λιγότερο στην επιφάνεια της κίσσηρης. Η αυξημένη συγκέντρωση του βουτυρικού οξέος είναι επιθυμητή για την παραγωγή βουτυρικού εστέρα, ο οποίος έχει αυξημένο ιξώδες, σημείο ανάφλεξης και σημείο ζέσεως σε σύγκριση με τους εστέρες οξέων με λιγότερα άτομα άνθρακα (Contino et al., 2011) που τον κάνει ιδανικό για την παραγωγή βιοκαυσίμου. 124

125 Μέρος 3 Ο Αποελέσματα Πίνακας 16: Αποτελέσματα οξεογένεσης απολιγνινοποιημένου αχύρου 30 g/l σε αντιδραστήρα συνεχούς λειτουργίας, στους 37 ο C, και σε αρχικό ph 9, με ακινητοποιημένα κύτταρα σε κίσσηρη. Χρόνος ζύμωσης (d) Παροχή (L/day) Αιθανόλη (ml/l) Οργανικά οξέα (g/l) Οξικό Γαλακτικό Βουτυρικό Βαλερικό Σύνολο Αζύμωτο σάκχαρο (g/l) 1 0,2 0,43 1,29 1,06 2,44 0 4, ,2 0,46 1,25 0 2,28 0 3, ,2 0, ,72 0 1, ,2 0,32 1, , ,2 0,30 1,09 0 1,15 0 2, ,2 0,29 1,05 0 1,32 0 2, ,2 0,24 1,03 0 1,22 1,21 3, ,2 0,13 0,50 0 0,85 0 1, ,

126 Μέρος 3 Ο Αποελέσματα ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΠΕΙΡΑΜΑΤΑ ΜΕΓΑΛΗΣ ΚΛΙΜΑΚΑΣ ΟΞΕΟΓΕΝΕΣΗΣ ΑΧΥΡΟΥ, ΔΙΑΛΕΙΠΟΝΤΟΣ ΕΡΓΟΥ (BATCH), ΣΕ ΒΙΟΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΑ 82 L ΠΑΡΟΥΣΙΑ ΚΙΣΣΗΡΗΣ Τα αποτελέσματα της έρευνας σε μικρής κλίμακας βιοαντιδραστήρες στη γλυκόζη και στην απολιγνινοποιημένη κυτταρίνη αχύρου παρουσία κίσσηρης έδωσαν το συμπέρασμα ότι η κίσσηρη αυξάνει τόσο τη συγκέντρωση των οργανικών οξέων, όσο και το ρυθμό της ζύμωσης σε σύγκριση με την οξεογένεση χωρίς την κίσσηρη. Επίσης κατά την batch οξεογένεση της κυτταρίνης (αχύρου) παρουσία της κίσσηρης επιτυγχάνονται καλύτερα αποτελέσματα συγκέντρωσης οργανικών οξέων και ταχύτητας οξεογένεσης. Όμως η σύσταση των επιμέρους οργανικών οξέων φαίνεται να είναι ευαίσθητη και ο τύπος της ζύμωσης που επικρατεί είναι γαλακτικού τύπου στη γλυκόζη, αλλά για την κυτταρίνη υπό προϋποθέσεις επικρατεί ζύμωση βουτυρικού τύπου. Έτσι η έρευνα σε βιοαντιδραστήρα μεγάλης σχετικά κλίμακας αναμενόταν με ενδιαφέρον. Για τους παραπάνω λόγους αποφασίστηκε η έρευνα να γίνει σε βιοαντιδραστήρα 82 L με batch οξεογένεση. Ο αντιδραστήρας αποφασίστηκε να είναι δύο ορόφων και τύπου Multi-Stage Fixed-Bed Tower (MFBT). Οι δύο όροφοι εξυπηρετούν (1) την ομογενή κατανομή της κίσσηρης στο βιοαντιδραστήρα, (2) τη μείωση της πίεσης που ασκείται στον πυθμένα του αντιδραστήρα, (3) την καλύτερη κυκλοφορία του υγρού, (4) την αυξημένη επαφή της κυτταρίνης και των διαλυτών σακχάρων με το βιοκαταλύτη, (5) τη διευκόλυνση της πλύσης της κίσσηρης και την αναγέννηση της, και (6) τη διευκόλυνση του γεμίσματος και αδειάσματος του βιοαντιδραστήρα. Αποφασίστηκε επίσης στην πρώτη ζύμωση να γίνει προσαρμογή (adaptation) της καλλιέργειας στη βιοαποικοδόμηση της κυτταρίνης χρησιμοποιώντας μίγμα κυτταρίνης γλυκόζης με θρεπτικά συστατικά έτσι ώστε να βελτιωθεί η οξεογένεση της κυτταρίνης. Προς τούτο αποφασίστηκε και η χρήση στο σύστημα μιας φυγοκεντρικής αντλίας για τη συνεχή μεταφορά του υγρού της ζύμωσης από τον πυθμένα του βιοαντιδραστήρα στην επάνω επιφάνεια του υγρού της ζύμωσης (παλίρροια), ενώ η άκρη του σωλήνα ήταν βυθισμένη μέσα στο υγρό για αποφυγή της μεταφοράς οξυγόνου. Αυτό έγινε προκειμένου να αυξηθεί η επαφή της κυτταρίνης με το βιοκαταλύτη αλλά και για να διευκολυνθεί η ακινητοποίηση των κυττάρων της αναερόβιας καλλιέργειας στην κίσσηρη. Για να πετύχουμε τη βέλτιστη θερμοκρασία των 37 ο C ο βιοαντιδραστήρας τοποθετήθηκε σε κατάλληλο θερμοθάλαμο όπου προσαρμόστηκε και η φυγοκεντρική αντλία μεταφοράς του ζυμούμενου υγρού μέσα σε αυτόν. 126

127 Μέρος 3 Ο Αποελέσματα Eκκινητήρια (1 η ) batch ζύμωση μίγματος κυτταρίνης και γλυκόζης με φόρτωση του 1 ου ορόφου με κίσσηρη Ο βιοαντιδραστήρας των δύο ορόφων εργάστηκε σε δύο στάδια. Στο πρώτο στάδιο φορτώθηκε ο 1 ος όροφος με κίσσηρη στο διάτρητο καλάθι που αποτελούσε τον 1 ο όροφο του βιοαντιδρατήρα. Με τον 1 ο όροφο φορτωμένο με βιοκαταλύτη έγιναν 7 ζυμώσεις και με τους δύο ορόφους έγιναν 2 ζυμώσεις. Κάθε φορά η ζύμωση γινόταν με τα ίδια ακινητοποιημένα κύτταρα. Όταν φορτώθηκε ο 2 ος όροφος δεν προστέθηκε νέα ποσότητα καλλιέργειας αλλά χρησιμοποιήθηκε μόνο η καλλιέργεια που ήδη υπήρχε στο βιοαντιδραστήρα για να εξεταστεί η λειτουργική σταθερότητα του βιοκαταλύτη. Στο Σχήμα 16 φαίνονται τα αποτελέσματα της batch ζύμωσης εκκίνησης που πραγματοποιήθηκε στο βιοαντιδραστήρα (Eικόνα 4). Οι ζυμώσεις αυτές έγιναν στους 37 ο C σε συγκέντρωση αχύρου 30 g/l και με αρχικό ph 9 που είναι και οι βέλτιστες συνθήκες όπως φάνηκε από τα προηγούμενα πειράματα, ενώ έγινε και προσθήκη 200 g γλυκόζης για να επιτευχθεί η ακινητοποίηση του μικροοργανισμού στην κίσσηρη καθώς και για να γίνει η προσαρμογή της καλλιέργειας στις συνθήκες ζύμωσης. Εικόνα 4: (α) Βιοντιδραστήρας 82 L που χρησιμοποιήθηκε στα πειράματα μεγάλης κλίμακας. (β) Κίσσηρη. (γ) Διάτρητο καλάθι που περιείχε την κίσσηρη μέσα στον αντιδραστήρα. 127

128 Μέρος 3 Ο Αποελέσματα Είναι φανερό πως η οξεογένεση του μίγματος κυτταρίνης-γλυκόζης παρουσία της κίσσηρης στο βιοαντιδραστήρα των 82 L είχε ως αποτέλεσμα τη δημιουργία γαλακτικού και βουτυρικού οξέος καθώς και την παραγωγή αιθανόλης. Με την πάροδο του χρόνου παρατηρήθηκε πως η συγκέντρωση του γαλακτικού οξέος άρχιζε να μειώνεται στις 47 ώρες, όταν καταναλώθηκε η προστιθέμενη γλυκόζη, και από 10,51 g/l μηδενίστηκε στις 123 ώρες από την έναρξη του πειράματος. Όταν η γλυκόζη καταναλώθηκε, μετά τις 75 ώρες, η συγκέντρωση του βουτυρικού και του οξικού οξέος άρχισε να αυξάνεται γεγονός που δείχνει ότι η κυτταρίνη αρχίζει να βιομετατρέπεται σε οργανικά οξέα. Η παραγωγή βιοαιθανόλης κυμάνθηκε σε χαμηλά επίπεδα του 0,5-1 g/l σε όλη τη διάρκεια της ζύμωσης. Από την κινητική σχηματισμού των οργανικών οξέων φαίνεται ότι το μέγιστο του συνόλου των οργανικών οξέων 12,5 g/l παράγεται στις πρώτες 27 h και τα 10,5 g/l απ αυτά παράγονται στις πρώτες 4-5 ώρες. Άλλα οξέα που σχηματίστηκαν σε μικρές όμως συγκεντρώσεις είναι το οξικό και το ηλεκτρικό οξύ. Χαρακτηριστικό αποτέλεσμα της οξεογένεσης της κυτταρίνης παρουσία γλυκόζης είναι η αλλαγή της ζύμωσης από τον τύπο της γαλακτικής ζύμωσης σε βουτυρικού τύπου ζύμωση, όταν αρχίζει να εξαφανίζεται η γλυκόζη και αρχίζει να βιομετατρέπεται η κυτταρίνη (Σχήμα 16). Σχήμα 16: Χρήση του 1 ου ορόφου: Κινητικές στην 1 η batch οξεογένεση προσαρμογής της καλλιέργειας σε εναιώρημα 30 g/l αχύρου με γλυκόζη στους 37 o C, παρουσία κίσσηρης. Ένα άλλο αξιοπρόσεκτο αποτέλεσμα είναι ότι όσο αυξάνεται το βουτυρικό αρχίζει να εξαφανίζεται το γαλακτικό του οποίου η συγκέντρωση μηδενίστηκε. Η παραγωγή του γαλακτικού οξέος ως το επικρατών οξύ, είναι χαρακτηριστικό της οξεογένεσης της γλυκόζης παρουσία κίσσηρης σύμφωνα με τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται στην Η εξαφάνιση του γαλακτικού μπορεί να αποδοθεί στη χρήση του ως πηγή άνθρακα από κάποιο 128

129 Μέρος 3 Ο Αποελέσματα μικροοργανισμό της μεικτής καλλιέργειας (Ohnishi et al., 2012) ή στην αλλαγή της δομής του επίσης από τον/τους μικροοργανισμό(ους) (Antonopoulou et al., 2008). Ο μηδενισμός της συγκέντρωσης του γαλακτικού συμπίπτει χρονικά με το μέγιστο της συγκέντρωσης του βουτυρικού. Η δε συγκέντρωση των συνολικών οργανικών οξέων στο χρονικό διάστημα από 140 h μέχρι τις 170 h συμπίπτει με τη βιομετατροπή της κυτταρίνης σε μικρή κλίμακα που παρουσιάζονται στην Η παραγωγή βουτυρικού και οξικού που συμβαίνει μετά την κατανάλωση της γλυκόζης ταυτίζεται με τα αποτελέσματα της συνεχούς οξεογένεσης τη κυτταρίνης (Πίνακας 16). Η ταύτιση αυτή οφείλεται στο γεγονός ότι στο πείραμα αυτό είχαμε μεταφορά του υγρού με αντλία από τον πυθμένα του βιοαντιδραστήρα των 82 L στην επιφάνεια πράγμα που προσομοιάζει με τη συνεχή τροφοδοσία του συνεχούς βιοαντιδραστήρα Επαναλαμβανόμενες batch οξεογενείς ζυμώσεις αχύρου, μεγάλης κλίμακας, παρουσία κίσσηρης με φόρτωση του 1 ου ορόφου. Μετά το πέρας της εναρκτήριας ζύμωσης έγιναν άλλες 6 ζυμώσεις στις ίδιες συνθήκες (37 ο C, αρχικό ph 9) αλλά χωρίς την προσθήκη γλυκόζης. Σε κάθε νέα ζύμωση γινόταν προσθήκη άχυρου σε συγκέντρωση 30 g/l. Επιπλέον ότι υπόλειμμα αχύρου υπήρχε από τις προηγούμενες ζυμώσεις παρέμενε στον αντιδραστήρα κατά τη διάρκεια των νέων ζυμώσεων. Συνολικά έγιναν άλλες 6 ζυμώσεις με αυτή τη μέθοδο και με τον ίδιο βιοκαταλύτη από παρτίδα σε παρτίδα. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται στους Πίνακες 17, 18, 19. Σε όλα σχεδόν τα πειράματα στην αρχή της ζύμωσης παρουσιάστηκε μια μικρή ποσότητα ηλεκτρικού και γαλακτικού οξέος κοντά στο 1 g/l η οποία μέχρι τις 24 h είχε εξαφανιστεί. Σε όλες τις επαναλαμβανόμενες παρτίδες ζύμωσης παράχθηκαν βουτυρικό, ισοβουτυρικό και οξικό οξύ. Επίσης παράγονταν και μικρές συγκεντρώσεις προπιονικού. Το οξύ που παράχθηκε σε μεγαλύτερη συγκέντρωση ήταν το οξικό και ακολούθησε το βουτυρικό και τρίτο το ισοβουτυρικό. Το άθροισμα της συγκέντρωσης του βουτυρικού και ισοβουτυρικού ήταν μεγαλύτερο της συγκέντρωση του οξικού οξέος. Επειδή οι διαφορές μεταξύ βουτυρικού και οξικού δεν ήταν μεγάλες μπορεί να ισχύει ότι η ζύμωση ήταν τύπου οξικού αλλά ευνοήθηκε και η οδός που οδηγεί στο βουτυρικό οξύ (Ren et al., 1997). Το ποσοστό του οξικού οξέος στο σύνολο των οργανικών οξέων ήταν 40-50% ενώ η αιθυλική αλκοόλη που παράχθηκε ήταν της τάξης του 0,3 ml/l, ενώ το αζύμωτο σάκχαρο ήταν πολύ χαμηλό που σημαίνει ότι τα σάκχαρα που δημιουργούνται από την υδρόλυση της κυτταρίνης βιομετατρέπονται. Αν και η οξεογένεση της κυτταρίνης μελετήθηκε σε όλες τις παρτίδες σε βάθος χρόνου 240 h, τα αποτελέσματα δείχνουν ότι στις 48 h παράγεται το 60-90% των οργανικών οξέων (Σχήμα 17). Έτσι δίνεται η δυνατότητα η παραγωγικότητα να είναι μεγάλη και έτσι να υπάρχει δυνατότητα η αποδοτική διακοπή της ζύμωσης να γίνεται πολύ νωρίς και σε σχετικά μικρό χρόνο ζύμωσης. 129

130 130 Μέρος 3 Ο Αποελέσματα Πίνακας 17: Επαναλαμβανόμενες batch οξεογενείς ζυμώσεις αχύρου, μεγάλης κλίμακας, παρουσία κίσσηρης με φόρτωση του 1 ου ορόφου: Αποτελέσματα του 2 ου batch (30 g/l αχύρου, 37 o C). Χρόνος (h) Αιθανόλη ml/l ph Οργανικά οξέα (g/l) Ηλεκτρικό Γαλακτικό Οξικό Προπιονικό Ισοβουτυρικό Βουτυρικό Σύνολο 2 0,00 5,39 1,00 0,00 1,49 0,00 0,00 1,15 3,64 0,37 4 0,00 5,34 1,00 0,00 1,59 0,00 0,00 1,24 3,83 0,00 22,5 0,34 5,26 0,00 0,00 3,76 0,98 0,74 1,98 7,46 0, ,33 4,75 0,00 0,00 4,08 0,90 0,74 2,06 7,78 0,00 46,5 0,31 4,87 0,00 0,00 5,33 0,95 0,77 2,37 9,42 0, ,37 4,82 0,00 0,00 5,17 0,95 0,76 2,30 9,18 0, ,32 4,85 0,00 0,00 5,70 0,62 0,85 2,66 9,83 0, ,35 4,83 0,00 0,00 5,56 0,90 0,98 2,66 10,10 0, ,31 4,75 0,00 0,00 6,23 0,89 1,27 3,18 11,56 0, ,33 4,69 0,00 0,00 6,51 0,00 1,45 3,49 11,45 0, ,29 4,55 0,00 0,00 6,27 0,00 1,50 3,47 11,24 0, ,31 4,59 0,00 0,00 6,51 0,00 1,61 3,71 11,83 0, ,27 4,32 0,00 0,00 6,23 0,00 1,55 3,66 11,44 0, ,34 4,38 0,00 0,00 6,11 0,00 1,47 3,51 11,09 0,00 Αζύμωτο σάκχαρο (g/l) 240 0,30 4,33 0,00 0,00 6,01 0,00 1,48 3,42 10,91 0,00

131 Μέρος 3 Ο Αποελέσματα Πίνακας 18: Επαναλαμβανόμενες batch οξεογενείς ζυμώσεις αχύρου, μεγάλης κλίμακας, παρουσία κίσσηρης με φόρτωση του 1 ου ορόφου: Αποτελέσματα του 5 ου batch (30 g/l αχύρου, 37 o C). Χρόνος (h) Αιθανόλη ml/l ph Οργανικά οξέα (g/l) Ηλεκτρικό Γαλακτικό Οξικό Προπιονικό Ισοβουτυρικό Βουτυρικό Σύνολο Αζύμωτο σάκχαρο (g/l) 8 0,00 5,88 0,93 1,32 2,93 0,00 0,00 1,98 5,87 0, ,25 5,6 0,00 0,00 5,37 1,05 1,40 2,90 10,72 0, ,37 5,23 0,00 0,00 3,95 0,98 1,09 2,73 8,75 1, ,35 5,10 0,00 0,00 4,34 0,98 1,24 2,21 8,78 0, ,37 5,02 0,00 0,00 4,71 1,05 1,21 2,40 9,36 0, ,35 4,97 0,00 0,00 5,83 1,04 1,48 2,85 11,20 0, ,42 4,51 0,00 0,00 6,13 1,00 1,65 3,08 11,86 0, ,44 4,55 0,00 0,00 7,36 1,10 1,86 3,68 13,99 0, ,36 4,33 0,00 0,00 8,18 1,06 2,17 4,16 15,57 0, ,41 4,31 0,00 0,00 8,00 1,07 2,08 4,02 15,16 0,32 131

132 Μέρος 3 Ο Αποελέσματα Πίνακας 19: Επαναλαμβανόμενες batch οξεογενείς ζυμώσεις αχύρου, μεγάλης κλίμακας, παρουσία κίσσηρης με φόρτωση του 1 ου ορόφου: Αποτελέσματα του 7 ου batch (30 g/l αχύρου, 37 o C). Χρόνος (h) Αιθανόλη ml/l ph Οργανικά οξέα (g/l) Ηλεκτρικό Γαλακτικό Οξικό Προπιονικό Ισοβουτυρικό Βουτυρικό Σύνολο Αζύμωτο σάκχαρο (g/l) 4 0,00 5,85 1,22 0,91 1,93 0,00 0,00 1,23 5,29 0,33 9 0,00 5,77 0,91 0,61 2,06 0,00 0,00 1,64 5,22 0, ,31 5,61 0,00 0,00 5,53 0,00 2,58 3,90 12,01 0, ,35 5,44 0,00 0,00 6,28 0,00 3,17 4,59 14,03 0, ,34 5,41 0,00 0,00 6,43 0,83 3,56 4,68 15,50 0, ,33 5,33 0,00 0,00 6,88 1,02 4,19 5,63 17,72 0, ,36 4,95 0,00 0,00 6,99 1,01 4,12 5,00 17,12 0, ,25 4,88 0,00 0,00 7,34 0,98 4,23 4,98 17,53 0, ,29 4,87 0,00 0,00 7,38 1,01 4,13 4,85 17,37 0, ,32 4,89 0,00 0,00 6,45 1,01 3,95 4,76 16,17 0, ,31 5,10 0,00 0,00 6,36 1,06 3,64 4,71 15,77 0, ,29 5,04 0,00 0,00 6,04 1,01 3,45 4,51 15,01 0,30 132

133 Μέρος 3 Ο Αποελέσματα Σχήμα 17: Συνολικά οργανικά οξέα που παράχθηκαν κατά τη λειτουργία του 1 ου ορόφου του βιοαντιδραστήρα κατά το 2 ο, 5 ο, και 7 ο batch οξεογένεσης. Το Σχήμα 17 μας δίνει τα συνολικά οργανικά οξέα που παράχθηκαν κατά τη λειτουργία του 1 ου ορόφου του βιοαντιδραστήρα κατά το 2 ο, 5 ο, και 7 ο batch οξεογένεσης. Το μέγιστο των οργανικών οξέων φαίνεται να επιτυγχάνεται στο 7 ο batch (17,53 g/l). Αυτό δικαιολογείται από το γεγονός της προσαρμογής της καλλιέργειας μετά από έναν αριθμό παρτίδων στη βιοαποικοδόμηση της κυτταρίνης. Σχήμα 18: Κινητική της μέσης συγκέντρωσης των παραγόμενων οξέων όλων των ζυμώσεων ανά ημέρα. 133

134 Μέρος 3 Ο Αποελέσματα Το Σχήμα 18 μας δίνει το μέσο όρο των οργανικών οξέων που παράχθηκαν ανά batch. Το μέγιστο των οργανικών οξέων φαίνεται να επιτυγχάνεται κατά την 6 η ημέρα (14 g/l). Η μέση αυτή συγκέντρωση είναι ικανοποιητική και ανταγωνίζεται τη συγκέντρωση των οργανικών οξέων που παράγονται με τη γλυκόζη. Αυτό δείχνει ότι το scale-up έδωσε βελτιωμένα αποτελέσματα στην οξεογένεση της κυτταρίνης. Από το παραπάνω Σχήμα 18 παρατηρείται πως το ισοβουτυρικό και προπιονικό οξύ είχαν τον πιο χαμηλό μέσο όρο συγκεντρώσεων από τα παραγόμενα οξέα (~1 και 2 g/l, αντίστοιχα) χωρίς πολλές διακυμάνσεις. Το οξικό και το βουτυρικό εμφάνισαν αρκετά μεγαλύτερους μέσους όρους συγκεντρώσεων γύρω στο 6,5 και 4,5 g/l, αντίστοιχα. Επίσης παρατηρείται πως ενώ τα συνολικά οξέα παρέμειναν σταθερά από την 6 η μέρα και μετά, όπου εμφανίστηκε ένα μέγιστο, η συγκέντρωση του βουτυρικού άρχισε να πέφτει ενώ του οξικού άρχισε να μειώνεται αντίστοιχα. Αυτό δείχνει ότι το προφίλ τον παραγόμενων οξέων αλλάζει ανάλογα με το χρόνο. Από τον Πίνακα 20 γίνεται εμφανές πως στα πειράματα μεγάλης κλίμακας όπου εμφανίστηκε και η μεγαλύτερη συγκέντρωση οξέων παρατηρείται και η μεγαλύτερη παραγωγικότητα καθώς και η μεγαλύτερη απόδοση στην παραγωγή οξέων. Επιπλέον παρατηρείται πως στα πειράματα μεγάλης κλίμακας άλλαξε το κύριο παραγόμενο οξύ από γαλακτικό που ήταν στα πειράματα μικρής κλίμακας σε οξικό υποδηλώνοντας πως στα πειράματα μεγάλης κλίμακας άλλαξε το βιοχημικό μονοπάτι. Αυτό σημαίνει πως στα μεγάλης κλίμακας πειράματα ευνοείται ο σχηματισμός του ακετυλοσυνένζυμου Α από το πυροσταφιλικό οξύ που είναι και το τελικό προϊόν της γλυκόλυσης (Ren et al., 1997). Έτσι δεν ευνοείται η αναγωγή του σε γαλακτικό η προπιονικό. Η αλλαγή αυτή προς ακετυλοσυνέζυμο Α δικαιολογείται στον ταυτόχρονο σχηματισμό του βουτυρικού και του οξικού σε σχετικά μεγαλύτερες συγκεντρώσεις. Η διαφορά που έχουνε στη διεργασία μεταξύ των μεγάλης κλίμακας πειραμάτων είναι ότι στο scale-up υπάρχει μεταφορά μάζας και μάλιστα μεγάλης με αντλία από τον πυθμένα του βιοαντιδραστήρα προς στην επιφάνεια του υγρού. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα την αυξημένη συγκέντρωση των οξέων και την αλλαγή του ph. Επίσης αυτό αλλάζει το μικρόκοσμο όλου του κυττάρου και αφορά επιπλέον τη συγκέντρωση του σακχάρου, άλλων θρεπτικών συστατικών και ιχνοστοιχείων που πιθανόν να έχουν άμεση σχέση με την οδό που ο μηχανισμός ακολούθησε. 134

135 Μέρος 3 Ο Αποελέσματα Πίνακας 20: Σύγκριση της οξεογένεσης μικρής και μεγάλης κλίμακας, παρουσία κίσσηρης. Οργανικά οξέα (g/l) Απόδοση οξέων (g /g) Παραγωγικότητα οξέων (g/ld) Κύριο οργανικό οξύ Batch ζύμωση γλυκόζης μικρής κλίμακας Batch ζύμωση αχύρου μικρής κλίμακας Batch ζύμωση αχύρου μεγάλης κλίμακας (1 ος όροφος) 9,14 0,3 4,57 Γαλακτικό 7,81 0,26 3,91 Γαλακτικό 17,72 0,59 5,32 Οξικό Batch ζύμωση αχύρου μεγάλης κλίμακας (1 ος και 2 ος όροφος) 17,20 0,57 13,94 Βουτυρικό 135

136 Μέρος 3 Ο Αποελέσματα Λειτουργία 1 ου και 2 ου ορόφου του βιοαντιδραστήρα μεγάλης κλίμακας: Επαναλαμβανόμενες batch ζυμώσεις αχύρου παρουσία κίσσηρης Μετά το πέρας των παραπάνω πειραμάτων στον 1 ο όροφο, ο αντιδραστήρας λειτούργησε και σε τελικό όγκο με τη χρήση και των δύο ορόφων. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφονται παραπάνω με συγκέντρωση απολιγνινοποιημένου αχύρου 30 g/l και αρχικό ph 9. Η βιομάζα που χρησιμοποιήθηκε και στον 2 ο όροφο ήταν η βιομάζα που υπήρχε ήδη στα πειράματα του 1 ου ορόφου χωρίς να προστεθεί άλλη. Αυτή μεταφέρονταν κατά τη λειτουργία του 2 ου ορόφου με την αντλία και φυσικά εδώ μεταφέρονταν μόνο η βιομάζα των ελεύθερων κυττάρων, όπου με την πάροδο του χρόνου ακινητοποιούνταν στην κίσσηρη του 2 ου ορόφου. Καθ όλη τη διάρκεια των πειραμάτων λαμβάνονταν δείγματα προς ανάλυση τα οποία αναλύθηκαν με HPLC για την περιεκτικότητα τους σε οργανικά οξέα και σε υπολειμματικά σάκχαρα καθώς και με GC για την εύρεση της περιεκτικότητας σε αιθανόλη. Τα αποτελέσματα δίνονται στους πίνακες 21,22 και 23 καθώς και στα διαγράμματα 17, 18, και 19. Σε αυτά τα πειράματα είδαμε όπως και πριν πως η συγκέντρωση της αιθανόλης έμεινε σε χαμηλά επίπεδα (περίπου 0,3 g/l). Σε αυτά τα πειράματα δεν εμφανίστηκαν καθόλου γαλακτικό και ηλεκτρικό οξύ που ήταν τα κύρια οξέα των πειραμάτων με υπόστρωμα τη γλυκόζη. Με την πάροδο του χρόνου οι συγκεντρώσεις του οξικού και του βουτυρικού οξέος αυξάνονταν και έφτασε τα 6,5 και 8,4 g/l αντίστοιχα. Η συγκέντρωση του βουτυρικού στα πειραματα του 1 ου και 2 ου ορόφου παρατηρήθηκε πως ήταν σχετικά αυξημένη (Πίνακες 21, 22) σε σχέση με τα πειραματα του 1 ου ορόφου (Πίνακες 17, 18, 19), ενώ του οξικού ηταν αντίστοιχα σχετικα μειωμένη. Έτσι μπορεί να ειπωθεί ότι στον 1 ο όροφο του βιοαντιδραστήρα πραγματοποιήθηκε κυρίως οξικού τύπου ζύμωση, ενώ όταν ο βιοαντιδραστήρας εργάστηκε και με τον 1 ο και τον 2 ο όροφο πραγματοποιήθηκε βουτυρικού τύπου ζύμωση. Οι συγκεντρώσεις όμως του βουτυρικού και του οξικού ήταν σχετικά μεγάλες ανεξάρτητα από το οξύ που παράγεται σε μεγαλύτερη συγκέντρωση για κάθε περίπτωση. Όμως οι συνθήκες και η πρώτη ύλη σε κάθε περίπτωση είναι ίδιες και το μόνο που διαφέρει είναι ο διπλασιασμός της κλίμακας. Αυτό δημιουργεί διαφορές στο ph κατά τη διάρκεια της ζύμωσης (Σχήμα 19) και πιθανόν εκεί και να οφείλονται και οι διαφορές στον τύπο της ζύμωσης. Το προπιονικό και το ισοβουτυρικό κυμάνθηκαν σε χαμηλά επίπεδα κοντά στο 1 και 1,8 g/l, αντίστοιχα. Ο Πίνακας 23 μας δίνει τα μέγιστα των παραγόμενων συνολικών οργανικών οξέων καθώς και τα επιμέρους οξέα και το σχηματισμό της αιθανόλης που παράχθηκαν στις επαναλαμβανόμενες ζυμώσεις στο βιοαντιδραστήρα των 82 L. Τα αποτελέσματα αφορούν τόσο τις οξεογενέσεις που έγιναν στον 1 ο όροφο όσο και στους δύο ορόφους του βιοαντιδραστήρα. Είναι καθαρό ότι η βιοαιθανόλη που παράγεται μαζί με τα οργανικά οξέα σε όλες τις παρτίδες είναι μικρή και αρκεί για να εστεροποιήσει λιγότερο από το 10% του βουτυρικού οξέος που παράγεται ταυτόχρονα. 136

137 Μέρος 3 Ο Αποελέσματα Πίνακας 21: Επαναλαμβανόμενες batch οξεογενείς ζυμώσεις αχύρου, μεγάλης κλίμακας, παρουσία κίσσηρης με φόρτωση του 1 ου και 2 ου ορόφου: Αποτελέσματα του 8 ου batch (30 g/l αχύρου, 37 o C). Χρόνος (h) Αιθανόλη ml/l ph Οργανικά οξέα (g/l) Οξικό Προπιονικό Ισοβουτυρικό Βουτυρικό Σύνολο Αζύμωτο σάκχαρο (g/l) 2 0,00 6,12 1,95 0,00 1,88 1,25 5,07 0,35 6 0,00 5,93 2,01 0,00 1,79 2,23 6,03 0, ,31 5,67 4,90 0,00 1,43 7,61 13,94 0, ,30 5,23 5,28 0,00 1,54 8,29 15,11 0, ,30 5,46 5,04 0,00 1,49 8,43 14,97 0, ,31 5,66 5,16 0,00 1,52 8,49 15,17 0, ,34 4,93 5,42 0,94 1,55 8,52 16,43 0, ,32 4,84 5,73 0,99 1,58 8,64 16,94 0, ,33 4,99 5,92 0,99 1,67 8,41 16,99 0, ,31 4,63 5,86 0,99 1,69 7,89 16,43 0, ,35 4,68 6,46 0,95 1,61 7,89 16,91 0, ,37 4,63 6,49 0,96 1,78 7,97 17,20 0,32 137

138 Μέρος 3 Ο Αποελέσματα Πίνακας 22: Επαναλαμβανόμενες batch οξεογενείς ζυμώσεις αχύρου, μεγάλης κλίμακας, παρουσία κίσσηρης με φόρτωση του 1 ου και 2 ου ορόφου: Αποτελέσματα του 9 ου batch (30 g/l αχύρου, 37 o C). Χρόνος (h) Αιθανόλη ml/l ph Οργανικά οξέα (g/l) Οξικό Προπιονικό Ισοβουτυρικό Βουτυρικό Σύνολο Αζύμωτο σάκχαρο (g/l) 2 0,00 6,23 1,85 0,00 1,32 1,01 4,18 0,35 6 0,00 5,93 1,93 0,00 1,35 1,06 4,34 0, ,31 5,34 4,55 0,99 1,53 4,45 11,52 0, ,36 5,27 4,69 0,99 1,59 4,56 11,83 0, ,35 5,01 5,72 1,10 1,67 6,81 15,30 0, ,34 5,06 6,06 1,14 1,75 6,78 15,73 0, ,29 4,73 5,76 1,12 1,74 7,70 16,32 0, ,35 4,49 6,56 0,93 1,12 7,23 15,84 0, ,35 4,41 5,93 1,08 1,10 7,84 15,95 0, ,39 4,44 6,01 1,10 1,28 7,90 16,29 0, ,35 4,48 6,43 1,28 1,94 7,53 17,18 0,25 138

139 Μέρος 3 Ο Αποελέσματα Σχήμα 19: Κινητικές μεταβολής του ph στα batch 2, 5, 7 και 9 μεγάλης κλίμακας, παρουσία κίσσηρης. Επίσης, τα συνολικά οξέα που παράχθηκαν σταθεροποιούνται μετά το 6 ο batch στα 17 g/l. Αυτή η συγκέντρωση μπορεί να δώσει μια ελάχιστη συγκέντρωση εστέρων 25 g/l. Η συγκέντρωση αυτή μπορεί να θεωρηθεί ότι μπορεί να στηρίξει μια συμφέρουσα παραγωγή βιοκαυσίμου με βάση τους εστέρες. Επίσης φαίνεται επίσης ότι η αύξηση της κλίμακας αυξάνει και την τελική συγκέντρωση των οργανικών οξέων. Το Σχήμα 19 μας δειχνει τη μεταβολή του ph κατά τη διάρκεια της ζύμωσης της κυτταρίνης και παρατηρείται πως το ph μειώθηκε δραματικά τις πρώτες ώρες των ζύμωσεωνκαι σταθεροποιήθηκε γύρο στο 4,5 με 5. Επίσης στον Πίνακα 23 φαίνονται τα καλύτερα αποτελέσματα από τα πειράματα μεγάλης κλίμακας. Παρατηρείται πως όταν χρησιμοποιήθηκε μόνο ο ένας όροφος η παραγωγή βουτυρικού και οξικού οξέος αυξάνεται καθώς προχωρά η ζύμωση, ενώ το οξικό οξύ έφτασε το μέγιστο (8,18 g/l) στην 5 η ζύμωση και το βουτυρικό οξύ (5,69 g/l) στην 6 η. Η συγκέντρωση τον ολικών οργανικών οξέων έφθασε την υψηλότερη συγκέντρωση (17,53 g/l) κατά τη διάρκεια της 7 ης ζύμωσης. Όταν ο 2 ος όροφος προστέθηκε για τις επόμενες δυο ζυμώσεις, η συγκέντρωση του οξικού οξέος έφτασε περίπου 6,5 g/l και το βουτυρικό οξύ αυξήθηκε στα 7,5-8 g/l ενώ η συνολική συγκέντρωση των οργανικών οξέων σταθεροποιήθηκε σε περίπου 17,2 g/l. Τέλος, λαμβάνοντας υπόψη ότι χρησιμοποιήθηκαν 40 L ζυμωμένου υγρού και 1,2 kg απολιγνινοποιημένου αχύρου στους δύο ορόφους, η απόδοση της μεθόδου ήταν 0,57 g οργανικά οξέα/g κυτταρίνης. 139

140 Μέρος 3 Ο Αποελέσματα Πίνακας 23: Παραγωγή αιθανόλης και οργανικών οξέων κατά τη διάρκεια των batch οξεογενών ζυμώσεων αχύρου, μεγάλης κλίμακας, παρουσία κίσσηρης με φόρτωση του 1 ου ή και του 2 ου ορόφου του βιοαντιδραστήρα. Ζύμωση Εκκινητήρια ζύμωση Αιθανόλη ml/l Οργανικά οξέα (g/l) Ηλεκτρικό Γαλακτικό Οξικό Προπιονικό Ισοβουτυρικό Βουτυρικό Σύνολο Με χρήση 1 ου ορόφου 1,14 1,02 6,82 1,60 0,00 0,00 3,14 12,58 2 ο batch 0,31 0,00 0,00 6,51 0,00 1,61 3,71 11,83 3 ο batch 0,39 0,00 0,00 6,55 0,86 1,68 4,57 13,66 4 ο batch 0,52 0,00 0,00 8,09 1,15 1,95 4,28 15,47 5 ο batch 0,36 0,00 0,00 8,18 1,06 2,17 4,16 15,57 6 ο batch 0,27 0,00 0,00 8,01 1,06 1,86 5,69 16,62 7 ο batch 0,25 0,00 0,00 7,34 0,98 4,23 4,98 17,53 Με χρήση και των 2 ορόφων 8 ο batch 0, ,49 0,96 1,78 7,97 17,2 9 ο batch 0, ,43 1,28 1,94 7,53 17,18 140

141 Μέρος 3 Ο Αποελέσματα Σχήμα 20: Κινητική παραγωγής βουτυρικού οξέος και ολικών οργανικών οξέων κατά την οξεογένεση απολιγνινοποιημένου άχυρου για τις επαναλαμβανόμενες παρτίδες 2, 7 και 9 στο βιοαντιδραστήρα των 82 L. Στο Σχήμα 20 παρουσιάζεται η κινητική της ολικής παραγωγής οργανικών οξέων και η παραγωγή βουτυρικού οξέος για τις παρτίδες 2, 7 και 9. Εδώ φαίνεται ότι μια συγκέντρωση 14 g/l επιτυγχάνεται στην 7 η παρτίδα σε 48 h και στην 9 η σε 70 h. Αυτό σημαίνει ότι σε χρόνο δύο ημερών ζύμωσης μπορούν να παραχθούν το 67-82% των οργανικών οξέων. Αυτό είναι χρήσιμο αποτέλεσμα και ιδιαίτερα όταν επιτευχθεί περαιτέρω αύξηση της ταχύτητας και της συγκέντρωσης των οξέων όταν θα αυξηθεί η κλίμακα και θα οδηγήσει σε περαιτέρω αύξηση της συγκέντρωσης πράγμα που συνέβη όταν από τον εργαστηριακό βιοαντιδραστήρα πήγαμε στο βιοαντιδραστήρα των 82 L. Η υψηλότερη συνολική παραγωγή οργανικών οξέων πραγματοποιήθηκε μετά από 75 h στην 7 η παρτίδα, στις 95 h στη 2 η και σε 190 h στην 9 η. Ωστόσο, στην 9 η παρτίδα, η συγκέντρωση των 15 g/l οξέων επιτυγχάνεται σε χρόνο οξεογένεσης μόλις 95 h. Επιπλέον το βουτυρικό οξύ σχηματίστηκε σε πολύ μεγαλύτερη συγκέντρωση στην 9 η παρτίδα με τη μέγιστη συγκέντρωση να αποκτάται μετά από 140 h οξεογένεσης ενώ στην 7 η παρτίδα στις 75 h και για τη 2 η μετά από 170 h. Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι η αντίδραση μπορεί να σταματήσει σε κάθε παρτίδα σε 3-4 ημέρες. Κι αυτό επειδή η διαφορά στην παραγωγή των οργανικών οξέων μέχρι το τέλος της παρτίδας είναι μικρή και όχι σημαντική λαμβάνοντας υπόψη το κέρδος που θα υπάρξει από την αυξημένη συγκέντρωση και την αύξηση του κόστους από τη μειωμένη παραγωγικότητα. 141

142 Μέρος 3 Ο Αποελέσματα Σχήμα 21: Κινητική της παραγωγής οξικού οξέος και της ολικής παραγωγής οργανικών οξέων κατά την οξεογένεση απολιγνινοποιημένου άχυρου για τις επαναλαμβανόμενες παρτίδες 2, 7 και 9 στο βιοαντιδραστήρα 82 L. Στο Σχήμα 21 παρατηρείται πως η παραγωγή του οξικού οξέος δεν έχει μεγάλες διαφορές από ζύμωση σε ζύμωση. Σε όλες τις ζυμώσεις υψηλή συγκέντρωση λαμβάνεται αμέσως μετά από 24 h και στις 48 h η συγκέντρωση έφθασε κοντά στο μέγιστο. Έτσι φαίνεται ότι το οξικό έχει μεγαλύτερο ρυθμό παραγωγής από το βουτυρικό. Όμως στην 9 η παρτίδα που πραγματοποιήθηκε και με τους 2 ορόφους βλέπουμε ότι το βουτυρικό επικρατεί του οξικού. Στη συνέχεια ο σχηματισμός οξικού οξέος παραμένει σχεδόν σταθερός. Σχήμα 22: Κινητική της παραγωγής προπιονικού και ισοβουτυρικού οξέος κατά την οξεογένεση απολιγνινοποιημένου άχυρου για τις επαναλαμβανόμενες παρτίδες 2, 7 και 9 στο βιοαντιδραστήρα των 82 L. 142

143 Μέρος 3 Ο Αποελέσματα Στο Σχήμα 22 παρατηρείται πως το προπιονικό οξύ σχηματίζεται στην αρχή της οξεογένεσης και οι μέγιστες συγκεντρώσεις παρουσιάστηκαν στην 7 η και 9 η ζύμωση μετά από 24 h. Το ισοβουτυρικό οξύ σχηματίστηκε με σημαντικές διαφορές από παρτίδα σε παρτίδα. Σε υψηλότερη συγκέντρωση στην 7 η παρτίδα ενώ στην 9 η παρτίδα σχηματίστηκε η μέγιστη συγκέντρωση μόλις μετά από λίγες ώρες. Επιπλέον προπιονικό οξύ πάλι μειώθηκε κατά 75% από την 2 η στην 7 η. Σχήμα 23: Απόδοση παραγωγής οξικού, βουτυρικού και συνολικών οξέων για όλες τις ζυμώσεις απολιγνινοποιημένου άχυρου που διεξάχθηκαν στο βιοαντιδραστήρα των 82 L. Ο μέγιστος συντελεστής απόδοσης της συνολικής παραγωγής ΟΑ είναι 0,58 g/g κυτταρίνης (Σχήμα 23). Η απόδοση αυξήθηκε από ζύμωση σε ζύμωση μέχρι την 7 η όπου μετά σταθεροποιήθηκε. Η απόδοση του οξικού οξέος ήταν υψηλότερη από αυτήν του βουτυρικού οξέος μέχρι την 7 η ζύμωση κατά τις οποίες λειτουργούσε ο βιοαντιδραστήρας με κίσσηρη μόνο ο 1 ος όροφος. Με τη χρήση και του 2 ου ορόφου η απόδοση του βουτυρικού οξέος ξεπέρασε αυτήν του οξικού οξέος. Τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι το προτεινόμενο σύστημα ευνοεί τη ζύμωση βουτυρικού τύπου (Ren et al., 1997), η οποία εμφανίζεται υπό ανεπαρκή NADH σε ph υψηλότερο από 6 και μικρότερο από 5, που πράγματι συμβαίνει στην περίπτωση της οξεογένεσης του βιοαντιδραστήρα με δύο ορόφους (Σχήμα 23), λόγω της κατανάλωσης για ανάπτυξη κυττάρων ή για μετατροπή σε NAD + και παραγωγή H2. Επιπλέον, παρατηρήθηκε ελάχιστος ή και καθόλου σχηματισμός αέριων προϊόντων καθώς το αυξημένο ελεύθερο άζωτο αμμωνίας σε υψηλό ph αλλά και η απόκλιση του ph από εκείνο της μεθανογέννεσης που είναι αναστέλλει τα μεθανογόνα βακτηρίδια και οδηγεί σε συσσώρευση οργανικών οξέων (Rajagopal et al., 2013). Τα αποτελέσματα που ελήφθησαν από το προτεινόμενο σύστημα μεγάλης κλίμακας ήταν πολύ πιο ελπιδοφόρα. Η αποτελεσματικότητα του συστήματος βελτιώθηκε καθώς οι παρτίδες ζύμωσης διαδέχονται η μια την άλλη, καθώς και 143

144 Μέρος 3 Ο Αποελέσματα όταν αυξήθηκε ο όγκος του βιοαντιδραστήρα. Η άμεση βιομετατροπή της κυτταρίνης σε ΟΑ χρησιμοποιώντας αναερόβια καλλιέργεια UASB ακινητοποιημένη σε κίσσηρης είναι ως εκ τούτου μια υποσχόμενη εναλλακτική μέθοδος για την παραγωγή οργανικών οξέων ως πρώτης ύλης βιοκαυσίμων ή χημικών ουσιών που βασίζονται σε οργανικά οξέα. Σχήμα 24: Σύγκριση οξεογένεσης μικρής και μεγάλης κλίμακας. Στο Σχήμα 24 παρουσιάζεται η κινητική της ολικής παραγωγής οργανικών οξέων και η παραγωγή βουτυρικού οξέος για τη μικρή και μεγάλη κλίμακα. Η συγκέντρωση του βουτυρικου και των ολικών οξέων είναι κατά πολύ μεγαλύτερη στα πειράματα μεγάλης κλίμακας από ότι σε αυτό της μικρής Επιστημονική και τεχνολογική αξιολόγηση των αποτελεσμάτων της οξεογένεσης του αχύρου στο βιοαντιδραστήρα των 82 L Στο βιοαντιδραστήρα μεγάλης κλίμακας έχουμε ανατροπή της ζύμωσης από γαλακτικού σε οξικού τύπου στα πειράματα που έγιναν στον 1 ο όροφο και μετά σε βουτυρικού τύπου στις οξυγενέσεις που έγιναν στον 1 ο και 2 ο όροφο. Η δεύτερη αλλαγή σε βουτυρικό οξύ έγινε λόγω διαφοροποίησης στο ph από τον 1 ο όροφο στο σύνολο του 1 ου και 2 ου ορόφου. Είναι επίσης σαφές ότι αυξάνοντας την κλίμακα αυξάνεται η συγκέντρωση των οργανικών οξέων αλλά και η ταχύτητα της οξεογένεσης πράγμα που αναμένεται να συμβεί και όταν η κλίμακα αυξηθεί σε έναν ημιβιομηχανικό και βιομηχανικό βιοαντιδραστήρα. Επίσης σημαντικό αποτέλεσμα είναι το ότι σχηματίζεται μεγάλο ποσοστό των οργανικών οξέων 67-82% κατά τη 1 η ή και 2 η ημέρα ζύμωσης. Τα αποτελέσματα αυτά οδηγούν επίσης σε μια συγκέντρωση εστέρων που μπορεί να είναι μεγαλύτερη από τα 25 g/l. Ένα άλλο αποτέλεσμα που θα μπορούσε να σημειωθεί εδώ είναι ότι ο MFBT βιοαντιδραστήρας βελτιώνει τα αποτελέσματα 144

145 Μέρος 3 Ο Αποελέσματα πράγμα που φάνηκε με την αύξηση των ορόφων από 1 σε 2. Έτσι αυτό μπορεί να δώσει ελπίδες για την αύξηση των ορόφων στο βιομηχανικό βιοαντιδραστήρα που έτσι και αλλιώς θα γίνει Σύγκριση αποτελεσμάτων με άλλες έρευνες Ο Πίνακας 24 παρέχει τα αποτελέσματα στην παραγωγή οργανικών οξέων που λαμβάνονται χρησιμοποιώντας άχυρο στο πλαίσιο της παρούσας έρευνας, σε σύγκριση με τη βινάσσα και τη μελάσα καθώς και άλλα υποστρώματα όπως η γλυκόζη, η ραφινόζη, η λακτόζη και η κελοβιόζη. Το άχυρο με την παρουσία κίσσηρης της έδωσε 17,5 g/l ολική συγκέντρωση οργανικών οξέων σε αντίθεση με 15,3 g/l που έδωσε η βινάσσα. Στην περίπτωση της βινάσσας η οξεογένεση έγινε σε εργαστηριακό συνεχή βιοαντιδραστήρα 1,25 L, ενώ η οξεογένεση του άχυρου έγινε σε σύστημα batch ζύμωσης όγκου 82 L. Τα αποτελέσματα της οξεογένεσης του άχυρου θεωρούνται ικανοποιητικά, καθώς τα σωματιδία κυτταρίνης διασπείρονται στο υγρό της ζύμωσης χωρίς να διαλυθούν, ενώ το οργανικό φορτίο της βινάσσας είναι διαλυτό άρα είχε καλύτερη επαφή με τον προωθητή κίσσηρη. Αν και η γ- αλουμίνα δίνει συγκέντρωση οργανικών οξέων 19,2 g/l στην οξεογένεση της βινάσσας προτιμήθηκε η χρήση της κίσσηρης σε πειράματα μεγάλης κλίμακας επειδή η κίσσηρη είναι ένα ακατέργαστο φυσικό ορυκτό εξαιρετικά χαμηλού κόστους. Από τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται είναι σαφές και το προωθητικό αποτέλεσμα της κίσσηρης, αλλά και της γ-αλουμίνας στην οξεογένεση. Η σακχαρόζη που περιέχεται στη μελάσα και είναι ένα εύκολα βιοαποικοδομήσιμο σάκχαρο, χωρίς τη χρήση κίσσηρης έδωσε οξέα σε μικρότερη συγκέντρωση από το άχυρο και τη βινάσσα. Επιπλέον, ο Πίνακας δείχνει ότι το οργανικό οξύ που κυριαρχεί στην κάθε οξεογένεση, εξαρτάται από την πρώτη ύλη την ύπαρξη προωθητή καθώς και το είδος του. Επίσης είναι χαρακτηριστικό ότι η συνεχής οξεογένεση έδωσε μεγαλύτερες συγκεντρώσεις οργανικών οξέων. Έτσι η εξήγηση που δόθηκε για την κυτταρίνη ισχύει και για τις άλλες πρώτες ύλες. Τα οξέα που συνήθως επικρατούν είναι το βουτυρικό, το γαλακτικό και το οξικό. Σε ότι αφορά τις πρώτες ύλες, το άχυρο και η βινάσσα δίνουν κυρίως βουτυρικό ενώ το τυρόγαλα γαλακτικό. Σε ότι αφορά τα σάκχαρα η γλυκόζη δίνει οξικό και η σακχαρόζη και η λακτόζη δίνουν γαλακτικό και η ραφινόζη βουτυρικό. 145

146 Μέρος 3 Ο Αποελέσματα Πίνακας 24: Σύγκριση των αποτελεσμάτων της οξεογένεσης του αχύρου με την οξεογένεση της βινάσσας, του τυρογάλακτος και απλών σακχάρων. Υπόστρωμα Πρώτες ύλες Προωθητής Όγκος βιοαντιδραστήρα (L) Συνολικά οργανικά οξέα (g/l) Τύπος οξεογενούς ζύμωσης Κύρια οργανικά οξέα Αναφορά Γλυκόζη γ-αλουμίνα 1L 6,13 Batch Οξικό Syngiridis et al., 2014 Σακχαρόζη Κίσσηρη 1L 11,94 Συνεχής Γαλακτικό Lappa et al., 2015b Λακτόζη Κίσσηρη 1L 16 Batch Γαλακτικό Μπούρα 2017 Ραφινόζη γ-αλουμίνα 1,25 L 8,49 Συνεχής Βουτυρικό Lappa et al., 2015a Άχυρο Κίσσηρη 80 L 17,5 Batch Οξικό, Βουτυρικό Dima et al., 2017 Βινάσσα Κίσσηρη 1,25 L 15,3 Συνεχής Βουτυρικό, Οξικό Lappa et al., 2015b Βινάσσα γ-αλουμίνα 1,25 L 19,2 Συνεχής Βουτυρικό, Ηλεκτρικό Lappa et al., 2015a Τυρόγαλα Κίσσηρη 70 L 22,7 Batch Γαλακτικό Μπούρα,

147 Μέρος 3 Ο Αποελέσματα ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΑΝΑΚΤΗΣΗ ΟΡΓΑΝΙΚΩΝ ΟΞΕΩΝ Ανάκτηση οργανικών οξέων με εκχύλιση με οργανικούς διαλύτες Για να επιτευχθεί η παραγωγή οργανικών οξέων ως χημικών, καθώς και η παραγωγή του προτεινόμενου καυσίμου που αποτελείται από εστέρες μικρού μοριακού βάρους, πρέπει να παραλειφθούν με κάποιο οικονομικό τρόπο τα οργανικά οξέα που παράγονται κατά την αναερόβια διεργασία. Σύμφωνα με άλλους ερευνητές οι διεργασίες που απαιτούνται για τον αποτελεσματικό διαχωρισμό και καθαρισμό των οξέων αυτών έχει μεγάλο κόστος που μπορεί να φτάσει και το 30 40% του κόστους της όλης παραγωγής των εστέρων(alkaya et al., 2009; Straathof, 2011). Μέχρι τώρα οι τεχνικές που έχουν χρησιμοποιηθεί για την παραλαβή των οξέων από τα προιοντα ζύμωσης περιλαμβάνουν την προσρόφηση, την καθίζηση, την ηλεκτροδιάλυση, καθώς και την εκχύλιση υγρού-υγρού (Alkaya et al., 2009; Umpuch et al., 2015) Η εκχύλιση υγρού με υγρό (liquid liquid extraction) είναι από τις παλαιότερες μεθόδους ανάκτησης, ωστόσο αρκετοί παράγοντες την επηρεάζουν όπως η φύση των οργανικών οξέων, η συγκέντρωση του εκχυλιστικού υγρού, το είδος του διαλύτη, το ph κ.α. (Calull et al., 1992; Alkaya et al., 2009). Ως διαλύτες σε υγρά ζύμωσης έχουν χρησιμοποιηθεί αλκοόλες, κετόνες, αιθέρες (εύφλεκτοι), αλειφατικοί υδρογονάνθρακες με μικρό ποσοστό παραλαβής, καθώς και οργανοφωσφορικές ενώσεις που είναι τοξικές και υψηλού κόστους (Calull et al., 1992). Στην παρούσα διατριβή επειδή τα εκχυλισθέντα οξέα θα χρησιμοποιηθούν για εστεροποίηση για τις συγκεκριμένες εκχυλίσεις χρησιμοποιήθηκαν αλκοόλες έτσι ώστε τα προιόντα να μπορούν να οδηγηθούν σε απευθείας εστεροποίηση (θερμική η ενζυμική). Αρχικά έγινε εκτίμηση ορισμένων διαλυτών για την εκχυλιστική τους ικανότητα σε υδατικά διαλύματα πρότυπων οξέων. Μελετήθηκαν διάφορες αναλογίες υδατικού διαλύματος και οργανικού διαλύτη. Στη συνέχεια ο διαλύτης που έδωσε την καλύτερη απόδοση, χρησιμοποιήθηκε για πειράματα εκχύλισης υγρού ζύμωσης σε διάφορες αναλογίες και μελετήθηκε η επίδραση της τιμής του ph. Σαν διαλύτης χρησιμοποιήθηκαν τα ζυμέλαια που είναι υποπροϊόντα από τα αποστακτήρια παραγωγής ποσίμου οινοπνεύματος και περιέχουν κυρίως ανώτερες αλκοόλες. Στη συνέχεια με τον καλύτερο διαλύτη έγινε εκχύλιση οργανικών οξέων που παρήχθησαν κατάτην οξεογένεση του αχύρου Εκχύλιση υδατικού διαλύματος πρότυπων οργανικών οξέων με ζυμέλαια Στην παρούσα διατριβή θα παρουσιαστούν αρχικά αναλυτικά τα 147

148 Μέρος 3 Ο Αποελέσματα αποτελέσματα των εκχυλίσεων που έγιναν με τα ζυμέλαιο σε συνθετικά διαλύματα οργανικών οξέων. Στα πλαίσια αυτά μελετήθηκε η εκχυλιστική ικανότητα των ζυμελαίων καθώς και η επίδραση του ph και της αναλογίας εκχυλιστικού μέσου/διαλύματος οργανικών οξέων. Στη συνέχεια ακολούθησαν πειράματα εκχύλισης σε προϊόντα οξεογένεσης του απολιγνινοποιημένου αχύρου και εξετάστηκε η επίδραση διαφόρων αλκοολών στην απόδοση της εκχύλισης. Τo ζυμέλαιο ελήφθη από ένα τοπικό αποστακτήριο παραγωγής πόσιμου οινοπνεύματος (ΒΓ Σπηλιόπουλος ΑΒΕΕ, Πάτρα, Ελλάδα). Στους παρακάτω Πίνακες 25, 26, 27, φαίνονται τα αποτελέσματα της μελέτης επίδρασης του ζυμελαίου στην εκχύλιση οργανικών οξέων από υδατικό διάλυμα. Τα οργανικά οξέα που εκχυλίστηκαν ήταν το οξικό, το ηλεκτρικό, το γαλακτικό, το προπιονικό, το βουτυρικό και το ισοβουτυρικό οξύ. Στον Πίνακα 28 δίνονται αποτελέσματα εκχύλισης προϊόντος ζύμωσης αχύρου με διάφορες αλκοόλες Εκχύλιση οργανικών οξέων από πρότυπα υδατικά διαλύματα με ζυμέλαια σε διάφορες αναλογίες όγκων διαλύτη / διαλύματος οργανικών οξέων. Στον παρακάτω Πίνακα 25 φαίνονται τα αποτελέσματα των εκχυλίσεων με ζυμέλαια σε 3 διαφορετικές αναλογίες διαλύτη / διαλύματος οργανικών οξέων (1:1, 1:2, 1:3) και σε αρχικό ph 2.5. Το ηλεκτρικό οξύ μαζί με το οξικό έδωσαν τα χαμηλότερα ποσοστά παραλαβής από 5% έως 16% μέγιστο. Το γαλακτικό έδωσε μέγιστο ποσοστό παραλαβής 29% στις 2 h στην αναλογία 1:3 και το προπιονικό 43% στα 30 λεπτά στη αναλογία 1:1. Το βουτυρικό και το ισοβουτυρικό οξύ έδωσαν τα καλύτερα αποτελέσματα με ποσοστά που κυμάνθηκαν από 45% εώς 67%. Τα καλύτερα αποτελέσματα στη συνολική παραλαβή λήφθηκαν στις αναλογίες 1:1 στην 1 h εκχύλισης που ήταν 37% και στην αναλογία 1:1 στα 30 min (36%). Τα αποτελέσματα αυτά παρουσιάζουν μικρή απόδοση στην εκχύλιση οργανικών οξέων και εκ πρώτης όψεως δεν ικανοποιούν τη χρήση των ζυμέλαιων στην εκχύλιση των οργανικών οξέων, υπό τις συνθήκες που έγιναν οι εκχυλίσεις. Για να αυξήσουμε την απόδοση στην εκχύλιση προχωρήσαμε σε χαμηλότερο ph. Στον παρακάτω Πίνακα 26 φαίνονται τα αποτελέσματα των εκχυλίσεων με ζυμέλαια στις ίδιες 3 διαφορετικές αναλογίες (1:1, 1:2, 1:3) σε αρχικό ph 1.5. Το γαλακτικό οξύ μαζί με το οξικό έδωσαν τα χαμηλότερα ποσοστά παραλαβής από 5 έως 16% μέγιστο. Το γαλακτικό έδωσε μέγιστό ποσοστό παραλαβής 46% στις 2 ώρες στην αναλογία 1:3 και το προπιονικό 60% στην 1 ώρα στη αναλογία 1:1. Το βουτυρικό και το ισοβουτυρικό οξύ έδωσαν τα καλύτερα αποτελέσματα με ποσοστά που κυμάνθηκαν από 55% εώς 73%. Τα καλύτερα αποτελέσματα στη συνολική παραλαβή ελήφθησαν στις αναλογίες 1:1 στις 2 ώρες εκχύλισης (53%) και στην αναλογία 1:2 στις 2 ώρες εκχύλισης (40,2%). Έτσι μειώνοντας το ph από το 2,5 στο 1,5 έχουμε αύξηση στο ποσοστό εκχύλισης των συνολικών οξέων. Όσο η αναλογία διαλύτη διαλύματος ανέβαινε το συνολικό ποσοστό της εκχύλισης μειώθηκε. Από τα παραπάνω αποτελέσματα συμπεραίνεται πως η μείωση του ph οδήγησε σε αύξηση του ποσοστού εκχύλισης των συνολικών οξέων, αλλά για βιομηχανική εφαρμογή το ποσοστό αυτό κρίνεται ανεπαρκές. 148

149 Μέρος 3 Ο Αποελέσματα Πίνακας 25: Ποσοστά εκχύλισης (%) οργανικών οξέων πρότυπων υδατικών διαλυμάτων με ζυμέλαια σε 3 αναλογίες όγκων διαλύτη / διαλύματος οργανικών οξέων και σε ph 2.5. Ποσοστό μείωσης οξέων % Αναλογία Χρόνος Οξικό Προπιονικό Ισοβουτυρικό Βουτυρικό Γαλακτικό Ηλεκτρικό Σύνολο 1:1 1:2 1:3 30 min 17,3±8,6 43,2±4,4 66,4±2,0 62,9±4,0 18,2±6,5 5,0±2,5 35,5±6,6 1 h 7,8±2,2 38,6±0,7 67,8±0,4 63,4±2,0 19,3±6,5 5,7±2,9 33,8±7,5 2 h 12,0±9,3 35,6±13,3 62,2±12,1 60,1±11,7 23,8±6,5 11,8±8,3 34,3±5,1 30 min 12,4±0,7 24,1±4,0 56,2±2,7 53,0±2,9 11,0±2,5 14,2±3,0 28,5±3,7 1 h 18,6±0,5 37,0±1,5 60,6±2,0 61,9±2,2 26,6±2,3 18,7±1,3 36,7±0,2 2 h 16,4±4,1 40,1±10,9 61,1±2,2 62,3±6,1 24,1±2,8 15,9±2,3 36,7±4,5 30 min 5,0±1,2 15,8±1,5 45,1±0,5 44,8±3,1 10,1±2,4 4,3±1,0 20,9±2,3 1 h 12,4±0,7 34,3±1,3 54,2±0,9 53,8±2,1 27,0±2,1 5,8±1,6 31,3±4,1 2 h 11,3±4,8 35,8±2,5 56,2±1,5 59,1±2,4 29,4±1,6 10,4±1,5 33,7±4,4 149

150 Μέρος 3 Ο Αποελέσματα Πίνακας 26: Ποσοστά εκχύλισης (%) οργανικών οξέων πρότυπων υδατικών διαλυμάτων με ζυμέλαια σε 3 αναλογίες όγκων διαλύτη / διαλύματος οργανικών οξέων και σε ph 1,5. ph 1,5 1:1 1:2 1: 3 Ποσοστό μείωσης οξέων % Σύνολο Χρόνος Οξικό Προπιονικό Ισοβουτυρικό Βουτυρικό Γαλακτικό Ηλεκτρικό 30 min 17,1±8,4 39,0±2,9 64,0±1,1 59,7±1,9 4,1±2,7 4,7±1,6 31,4±4,4 1 h 50,3±2,9 44,9±2,8 71,4±0,8 66,8±1,5 36,8±3,4 25,7±5,2 33,5±3,1 2 h 39,0±7,3 60,1±4,3 70,9±10,8 73,9±1,6 32,3±6,3 34,3±7,0 51,8±3,5 30 min 11,9±7,4 35,4±6,4 62,1±1,8 59,8±5,4 5,9±4,60 8,4±4,5 30,5±6,6 1 h 17,8±11,5 39,1±6,3 64,2±2,7 60,2±3,3 6,9±7,3 9,1±6,8 32,8±6,5 2 h 23,7±13,36 44,8±10,4 67,3±5,6 64,0±5,9 14,5±7,65 18,5±12,9 38,8±5,4 30 min 22,1±8,7 39,5±11,4 61,6±8,0 58,1±8,1 9,8±8,6 11,2±8,3 33,7±5,2 1 h 19,2±12,3 36,1±17,7 58,1±10,9 55,0±11,4 10,8±6,9 34,1±18,9 36,9±17,0 2 h 16,0±15,5 31,6±13,8 56,4±6,8 52,6±8,11 11,9±5,8 45,9±17,8 35,7±3,5 150

151 Μέρος 3 Ο Αποελέσματα Επίδραση του ph στην εκχύλιση οργανικών οξέων από πρότυπα υδατικά διαλύματα οργανικών οξέων με ζυμέλαια Έτσι για να επιτευχθεί πιθανόν περαιτέρω βελτίωση των αποτελεσμάτων έγινε προσπάθεια να μελετηθεί η επίδραση του ph. Για να μελετηθεί η επίδραση του ph στην εκχύλιση, δοκιμάστηκαν 3 τιμές ph (2,5-1,5 1,0) στις οποίες η αναλογία διαλύτη διαλύματος παρέμεινε σταθερή στο 1:1. Τα αποτελέσματα φαίνονται στον παρακάτω Πίνακα 27. Το ηλεκτρικό, γαλακτικό και οξικό έδωσαν τα χαμηλότερα ποσοστά στην εκχύλιση με ζυμέλαια. Το γαλακτικό έδωσε μέγιστό ποσοστό παραλαβής 32% στις 2 ώρες για αρχικό ph 1,5 και το προπιονικό 60% στην 1 ώρα στη αναλογία 1:1. Το βουτυρικό και το ισοβουτυρικό οξύ έδωσαν τα καλύτερα αποτελέσματα με ποσοστά που έφτασαν το 78% και 75% αντίστοιχα στο ph 1. Το αποτέλεσμα αυτό μπορεί να θεωρηθεί εδώ ικανοποιητικό επειδή τα οξέα αυτά μαζί σχηματίζονται στην οξεογένεση του αχύρου στο scale-up σε σχετικά μεγάλα ποσοστά που φθάνουν και το 60%. Τα καλύτερα αποτελέσματα στη συνολική παραλαβή ελήφθησαν στις 2 ώρες εκχύλισης (53%) για αρχικό ph 1 αν και ακόμα και στα 30 λεπτά επιτεύχθηκε 50% απόδοση στην εκχύλιση. Στα αποτελέσματα του Πίνακα 27 βλέπουμε επίσης ότι η μείωση του ph αυξάνει την απόδοση στην εκχύλιση των ολικών οργανικών οξέων. Επίσης η μείωση του ph αυξάνει και την απόδοση στην εκχύλιση του οξικού, γαλακτικού, βουτυρικού, ισοβουτυρικού και ηλεκτρικού. Έτσι το μέγιστο ποσοστό εκχύλισης 53% από τη συγκριτική μελέτη δεν οδήγησε σε μια αύξηση που θα μπορούσε να γίνει αποδεκτή για μία βιομηχανική εφαρμογή. Όμως το γεγονός ότι στα πειράματα scale-up τα βουτυρικό και ισοβουτυρικό οξύ είναι τουλάχιστον το 60% αυτό πιθανόν να οδηγήσει σε περαιτέρω αύξηση του ποσοστού εκχύλισης Εκχύλιση οργανικών οξέων από τα υγρά της ζύμωσης αχύρου με διάφορες αλκοόλες. Επειδή η έρευνα με τα ζυμέλαια για την εκχύλιση των οξέων δεν έδωσε σχετικά μεγάλα ποσοστά εκχύλισης, η έρευνα για τη λήψη των οργανικών οξέων από τα υγρά ζύμωσης του αχύρου οδηγήθηκε στην εξέταση διαφόρων διαλυτών. Οι διαλύτες που χρησιμοποιήθηκαν ήταν διάφορες ανώτερες αλκοόλες που δεν αναμιγνύονταν με το νερό. Η δομή των αλκοολών είχε επιλεγεί επειδή ο ίδιος ο διαλύτης θα χρησιμοποιηθεί και στην εστεροποίηση. Επίσης, επειδή είδαμε ότι το ph επηρεάζει σημαντικά την εκχύλιση των οργανικών οξέων τα πειράματα οργανώθηκαν σε διάφορα ph. Για να προσδιοριστεί η επίδραση του ph στη διαδικασία της εκχύλισης από υγρά ζύμωσης αχύρου δοκιμάστηκαν διάφοροι διαλύτες όπως οι 2- μεθυλοπροπανόλη-1, η 1-βουτανόλη, 3-μέθυλοβουτανόλη-1, 2-πεντανόλη, και τo ζυμέλαιο σε 3 τιμές ph (2,5, 1,5, 1,0) σε εκχυλίσεις στις οποίες η αναλογία διαλύτη διαλύματος παρέμεινε σταθερή στο 1:1 όπου και ελήφθησαν τα καλύτερα αποτελέσματα στα συνθετικά διαλύματα οργανικών οξέων. Σημειωτέον ότι η αναλογία 1:1 έδωσε τα καλύτερα αποτελέσματα με διαλύτη εκχύλισης τα ζυμέλαια. 151

152 Μέρος 3 Ο Αποελέσματα Πίνακας 27: Ποσοστά εκχύλισης (%) οργανικών οξέων πρότυπων υδατικών διαλυμάτων με ζυμέλαια σε διαφορετικές τιμές αρχικού ph σε αναλογία διαλύτη / διαλύματος οργανικών οξέων 1:1. ph 2,5 1,5 1 Χρόνος Ποσοστό μείωσης οξέων % Οξικό Προπιονικό Ισοβουτυρικό Βουτυρικό Γαλακτικό Ηλεκτρικό Σύνολο 30 min 17,3±8,6 43,2±4,4 66,4±2,0 62,9±4,0 18,2±6,5 5,0±2,5 35,5±6,6 1 h 7,8±2,2 38,6±0,7 67,8±0,4 63,4±2,0 19,3±6,5 5,7±2,9 33,8±7,4 2 h 12,1±9,3 35,6±13,3 62,2±12,1 60,0±11,7 23,8±6,5 11,8±8,3 34,3±5,1 30 min 17,1±8,4 39,0±2,9 64,0±1,1 59,7±1,9 4,1±2,7 4,7±1,6 31,4±4,4 1 h 10,3±2,9 44,9±2,8 71,4±0,8 66,8±1,5 23,8±3,4 22,7±5,1 40,0±6,3 2 h 39,0±7,3 60,2±4,3 70,9±10,8 73,9±1,6 32,3±6,5 34,3±7,0 51,8±3,5 30 min 30,9±2,7 59,9±1,4 78,2±0,4 75,0±0,4 16,6±2,8 30,6±1,5 50,2±1,4 1 h 32,2±5,9 62,1±0,6 78,5±0,1 75,4±0,10 27,2±2,1 33,8±4,1 51,6±5,3 2 h 36,9±8,1 62,1±3,2 78,7±0,6 75,5±0,9 27,7±11,0 40,1±8,1 53,5±4,6 152

153 Μέρος 3 Ο Αποελέσματα Τα αποτελέσματα φαίνονται στον Πίνακα 28. Τα καλύτερα αποτελέσματα πάρθηκαν για αρχικό ph 1 με διαλύτη τη βουτανόλη (σχεδόν 80% συνολική παραλαβή). Το ισοβουτυρικό οξύ ήταν αυτό που εκχυλίστηκε πιο εύκολα με το βουτυρικό και το προπιονικό να ακολουθούν. Το οξικό έδωσε τα χειρότερα αποτελέσματα σε όλους τους διαλύτες. Επαληθεύεται και στο διάλυμα της οξεογένεσης του αχύρου ότι η μείωση του ph στην τιμή 1 δίνει την καλύτερη απόδοση στην εκχύλιση των ολικών οργανικών οξέων. Έτσι το αποτέλεσμα της απόδοσης του 80% για το προϊόν ζύμωσης του αχύρου είναι ικανοποιητικό. Επίσης, η μείωση του ph αυξάνει την απόδοση στην εκχύλιση όλων των οξέων που περιέχονται στο προϊόν οξεογένεσης του αχύρου. Το αποτέλεσμα αυτό λαμβάνεται με τη βουτανόλη-1 που είναι μια αλκοόλη που παράγεται βιοτεχνολογικά (Zheng et al., 2015) και επομένως μπορεί να παραχθεί από τη λιγνινοκυτταρινούχο βιομάζα. Από την έκθεση των αποτελεσμάτων για την ανάκτηση των οργανικών οξέων είναι σαφές ότι τα ζυμέλαια δεν είναι ένας κατάλληλος διαλύτης για την ανάκτηση των οργανικών οξέων από τα υγρό της οξεογένεσης του απολιγνινοποιημένου αχύρου. Κι αυτό παρόλο που τα ζυμέλαια έχουν ένα μικρό κόστος ως υποπροϊόν των αποστακτηρίων παραγωγής ποσίμου οινοπνεύματος και στην περίπτωση της εκχύλισης του υγρού της οξεογένεσης του αχύρου έδωσαν καλύτερες αποδόσεις στην εκχύλιση απ ότι στα συνθετικά διαλύματα των οργανικών οξέων. Όμως στην εκχύλιση του υγρού της οξεογένεσης του αχύρου επετεύχθη μια σημαντική βελτίωση στην απόδοση σε σχέση με τα συνθετικά διαλύματα των οξέων. Έχουμε κι εδώ βελτίωση της απόδοσης εκχύλισης των οργανικών οξέων με τη μείωση του ph. Μάλιστα η απόδοση στην εκχύλιση υγρών οξεογένεσης του αχύρου έφθασε μέχρι και 80% στο ph 1, όταν χρησιμοποιήθηκε η βουτανόλη-1. Το ποσοστό αυτό είναι μάλλον αποδεκτό για βιομηχανική εφαρμογή στην παραγωγή των οργανικών οξέων είτε ως χημικά προϊόντα, είτε αυτά χρησιμοποιηθούν ως πρώτη ύλη στην παραγωγή εστέρων που μπορούν να αποτελέσουν μια νέα γενιά βιοκαυσίμου. Έτσι το χρήσιμο αποτέλεσμα του κεφαλαίου αυτού είναι ότι για να παραλάβουμε τα οργανικά οξέα από το υγρό της οξεογένεσης του αχύρου θα χρησιμοποιήσουμε τη βουτανόλη-1 ως διαλύτη εκχύλισης και η εκχύλιση θα πρέπει να γίνει στο ph

154 Μέρος 3 Ο Αποελέσματα Πίνακας 28: Επίδραση του ph στα ποσοστά εκχύλισης (%) οργανικών οξέων από υγρά ζύμωσης απολιγνινοποιημένου αχύρου με διάφορους διαλύτες σε αναλογία διαλύτη / διαλύματος 1:1 ph 2,5 1,5 1 Διαλύτης Ποσοστό μείωσης οξέων Οξικό Προπιονικό Ισοβουτυρικό Βουτυρικό Σύνολο 2-Μέθυλοπροπανόλη-1 40,2±0,9 61,2±0,6 73,8±0,3 69,2±0,8 61,1±0,7 Βουτανόλη-1 48,9±0,9 66,1±0,3 76,1±0,4 76,4±1,1 66,9±0,7 3-Μέθυλο-βουτανόλη-1 31,5±0,6 59,1±0,8 71,3±1,1 67,6±1,1 57,4±0,9 2-Πεντανόλη 34,2±0,8 52,0±1,2 69,2±1,3 71,2±0,7 56,7±1,0 Ζυμέλαιο 22,1±2,3 34,9±1,8 57,9±0,7 73,7±1,3 47,2±1,5 2-Μέθυλοπροπανόλη-1 49,1±0,3 69,5±0,3 78,3±0,4 74,8±0,5 67,9±0,4 Βουτανόλη-1 59,1±0,7 73,4±0,7 81,1±0,8 76,1±0,5 72,4±0,7 3-Μέθυλο-βουτανόλη-1 37,4±0,4 59,5±0,9 74,3±1,3 78,2±0,5 62,4±0,8 2-Πεντανόλη 38,2±0,1 64,5±0,2 71,0±0,4 84,0±0,1 64,4±0,2 Ζυμέλαιο 25,9±2,2 38,9±1,1 72,2±0,4 75,0±0,4 53±1,0 2-Μέθυλοπροπανόλη-1 55,6±0,9 75,1±0,6 78,9±0,7 82,1±0,7 72,9±0,7 Βουτανόλη-1 65,4±0,6 80,4±0,4 86,5±0,3 87,1±0,4 79,9±0,4 3-Μέθυλο-βουτανόλη-1 42,6±0,9 71,5±0,8 78,6±0,8 85,4±0,6 69,5±0,8 2-Πεντανόλη 44,6±0,7 68,4±0,4 79,6±0,7 91,6±0,4 71,1±0,6 Ζυμέλαιο 34,9±2,7 45,9±1,1 69,4±0,8 78,1±0,9 57,1±1,4 154

155 Μέρος 3 Ο Αποελέσματα ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΚΟΣΤΟΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ ΝΕΑΣ ΓΕΝΙΑΣ ΒΙΟΚΑΥΣΙΜΟΥ ΜΕ ΒΑΣΗ ΤΟΥΣ ΕΣΤΕΡΕΣ Οικονομική ανάλυση Προκειμένου να διαπιστωθεί αν η προτεινόμενη τεχνολογία έχει πιθανότητες να εφαρμοστεί έγιναν τα πειράματα μεγάλης κλίμακας όπως είδαμε παραπάνω. Με βάση αυτά, τα αποτελέσματα της εκχύλισης των οργανικών οξέων αλλά και τα αποτελέσματα της εστεροποίησης με λιπάσσες πού έγιναν στο Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων (Foukis et al., 2017) έγινε η οικονομική ανάλυση αυτών για καλύτερη αξιολόγηση της τεχνολογίας παραγωγής εστέρων με πρώτη ύλη το άχυρο. Παρακάτω παρουσιάζεται μία οικονομική αξιολόγηση της προτεινόμενης τεχνολογίας για την παραγωγή μιας νέας γενιάς βιοκαυσίμων με τη χρήση αγροτοβιομηχανικών στερεών αποβλήτων (λιγνινοκυτταρινούχος βιομάζα) ως πρώτη ύλη σε βιομηχανική κλίμακα με βάση τα αναφερόμενα αποτελέσματα πειραμάτων εργαστηριακής και μεγάλης κλίμακας για μια ημερήσια παραγωγή L (Koutinas et al., 2016) Ερευνητικά αποτελέσματα για την οικονομική ανάλυση Η οικονομική ανάλυση βασίζεται κυρίως σε αποτελέσματα πειραμάτων μεγάλης κλίμακας που έγιναν στο βιοαντιδραστήρα των 82 L για την οξεογενή ζύμωση της λιγνινοκυτταρινικής βιομάζας. Επιπλέον, υποστηρίχθηκε από τα εργαστηριακά αποτελέσματα που ελήφθησαν για την παραγωγή, την ανάκτηση και την αντίδραση εστεροποίησης των οργανικών οξέων. Η τεχνολογία για την παραγωγή μιας νέας γενιάς βιοκαυσίμων βασίζεται σε τρεις μονάδες που είναι: (i) η αναερόβια επεξεργασία σε συνθήκες οξεογένεσης της λιγνινοκυτταρινικής βιομάζας παρουσία κίσσηρης ως προωθητή για την παραγωγή οργανικών οξέων, (ii) η ανάκτηση οργανικών οξέων από τα υδατικά διαλύματα και (iii) η εστεροποίηση οργανικών οξέων σε εστέρες με τη χρήση λιπασσών. Διεξήχθη εκτεταμένη έρευνα για την παραγωγή οργανικών οξέων που δείχνει ότι η κίσσηρη είναι ένα κατάλληλο υλικό για την προώθηση των οξεογενών ζυμώσεων της λιγνινοκυτταρινικής βιομάζας. Επιπλέον διαπιστώθηκε ότι η επεξεργασία της απολιγνινοποιημένης κυτταρινικής βιομάζας παρουσία κίσσηρης οδηγεί σε άμεση παραγωγή οργανικών οξέων χωρίς προεπεξεργασία για υδρόλυση κυτταρίνης και ως εκ τούτου επιδέχεται μία διεργασία στην οξεογένεση της κυτταρίνης ενός σταδίου. Τα παραγόμενα οργανικά οξέα ανακτήθηκαν από το υδατικό διάλυμα με εκχύλιση με βουτανόλη-1 με απόδοση 80% και χρησιμοποιήθηκαν στη συνέχεια σε ενζυμο-καταλυόμενη αντίδραση εστεροποίησης. Κατά την οξεογένεση της 155

156 Μέρος 3 Ο Αποελέσματα λιγνινοκυτταρινικής βιομάζας σχηματίστηκαν επίσης μικρές ποσότητες αιθανόλης (Koutinas et al., 2016) Προκαταρτική οικονομική ανάλυση παραγωγής βιοκαυσίμου χημικής σύστασης εστέρων από κυτταρινούχο βιομάζα Το διάγραμμα ροής των διεργασιών παρουσιάζεται στο Σχήμα 25. Το διάγραμμα σχεδιάστηκε και το ισοζύγιο μάζας υπολογίστηκε, λαμβάνοντας υπόψη τα αποτελέσματα πειραμάτων που πραγματοποιήθηκαν σε εργαστηριακή κλίμακα, όσον αφορά την κινητική της οξεογένεσης, την αντίδραση εστεροποίησης και την ανάκτηση των οργανικών οξέων. Επιπλέον, ελήφθησαν υπόψη ο τύπος των χρησιμοποιούμενων μηχανημάτων και ο τρόπος παραγωγής κατά παρτίδες. Πίνακας 29: Κόστος επένδυσης για την παραγωγή εστέρων ως βιοκαύσιμο από λιγνινοκυτταρινούχα υλικά με ημερήσια παραγωγή L. Μηχανικός εξοπλισμός Χωρητικότητα Κόστος ( ) Δεξαμενή υγρών αποβλήτων t Περισταλτική αντλία 2 20 tn/h Αντιδραστήρας απολιγνινοποίησης m Συνεχής βιοαντιδραστήρας t Βιοαντιδραστήρας εστεροποίησης t Αντλία 3 16 t/h Παραγωγή καλλιέργειας για παραγωγή λιπάσης 20 t Στήλη ανάκτησης διαλύτη 6 t/h Δεξαμενή παραλαβής βιοκαυσίμων 20 t Λέβητας 2 t oil/day Δεξαμενή εκχύλισης 50 t Σωληνώσεις Πνευματικά Δικαιώματα Μελέτη εγκατάστασης Συνολική επένδυση Επιπλέον το κόστος των μηχανημάτων υπολογίστηκε με την προϋπόθεση ότι θα σχεδιαστεί από τους δημιουργούς της τεχνολογίας και θα κατασκευαστεί σε εταιρείες κατασκευής στην Ελλάδα. Το ισοζύγιο μάζας υπολογίστηκε με βάση την ημερήσια παραγωγική ικανότητα των L εστέρων από τη 156

157 Μέρος 3 Ο Αποελέσματα λιγνινοκυτταρινική βιομάζα. Η εκτίμηση του επενδυτικού και παραγωγικού κόστους έγινε με βάση την προηγούμενη εμπειρία από έρευνα σε βιοτεχνολογικό εργοστάσιο και σε κάθε περίπτωση τα στοιχεία που παρουσιάζονται στην παρούσα έρευνα είναι προκαταρκτικά. Το κόστος επένδυσης για την κυτταρίνη παρουσιάζεται στον Πίνακα 29. Οι διεργασίες θα πρέπει να περιλαμβάνουν μία διάταξη για την ανάπτυξη της αναερόβιας καλλιέργειας (1) και μεταφορά της καλλιέργειας με χρήση μίας περισταλτικής αντλίας (2) σε ένα σύστημα βιοαντιδραστήρα (3) κλίνης με πληρωτικό υλικό την κίσσηρη κατανεμημένη σε ορόφους για οξεογένεση. Σε αυτόν τον αντιδραστήρα καταλήγει η λιγνινοκυτταρινική βιομάζα που έχει περάσει από τον αντιδραστήρα απολιγνινοποίησης (3α). Το υδατικό διάλυμα που περιέχει τα παραγόμενα οργανικά οξέα αντλείται στη δεξαμενή (4) για εκχύλιση με βουτανόλη-1 (Ren et al., 1997; Bekatorou et al., 2016). Το εκχύλισμα που περιέχει 80% των οργανικών οξέων αντλείται στον αντιδραστήρα (5) για εστεροποίηση, χρησιμοποιώντας λιπάση που παράγεται σε βιοαντιδραστήρα (7). Το διάλυμα εστέρων σε βουτανόλη-1 αποστάζεται στη στήλη ανάκτησης διαλύτη (8) χρησιμοποιώντας ατμό από το λέβητα (10) και οι εστέρες ρέουν στο δοχείο συλλογής (9). Το βιοκαύσιμο που θα παράγεται από λιγνινοκυτταρινούχο βιομάζα θα περιέχει κυρίως ένα μίγμα οξικού βουτυλεστέρα και βουτυρικού βουτυλεστέρα Εστεροποίηση Στην παρούσα προτεινόμενη τεχνολογία η οξεογένεση των αποβλήτων ακολουθείται από εκχύλιση των παραγόμενων οξέων με βουτανόλη-1 και από την εστεροποίηση. Η κύρια μέθοδος εστεροποίησης περιλαμβάνει τη χρήση ενζύμων (λιπάση), χρησιμοποιώντας ταυτόχρονα το μέσο εκχύλισης, βουτανόλη-1, ως αλκοόλη που είναι η πλέον συμφέρουσα από τεχνολογική και οικονομική άποψη. Μπορεί επίσης να μελετηθεί και η χημική εστεροποίηση με θέρμανση του μέσου εκχύλισης (βουτανόλη-1 και οργανικά οξέα) σε ξεχωριστό αντιδραστήρα, αλλά η μέθοδος αυτή είναι περισσότερο ενεργοβόρα λόγω των απαιτήσεων για θέρμανση. Για την ενζυμική εστεροποίηση έγιναν μελέτες του ρυθμού σχηματισμού προϊόντος, της επιδράσης των μεταβολών στις συνθήκες του συστήματος και για τη χρήση κατάλληλων αντιδραστήρων προκειμένου να βελτιωθεί τόσο η απόδοση όσο και η ποιότητα της συνθέσεως εστέρων που καταλύεται από λιπάση (Foukis et al., 2017 ; Stergiou et al., 2013). Για τη βελτίωση της διεργασίας από οικονομική άποψη θα πρέπει να οριστεί η βέλτιστη αναλογία αλκοόλης/οξύ, η ελάχιστη ποσότητα χρησιμοποιούμενου ενζύμου κ.λπ. Αυτό το βιοκαύσιμο νέας γενιάς που παράγεται είναι ένα μείγμα εστέρων χαμηλού μοριακού βάρους σε σύγκριση με τους εστέρες του βιοντίζελ που είναι ετέρες οργανικών οξέων μεγάλου μοριακού βάρους. Έτσι το βιοκαύσιμο νέας γενιάς προσομοιάζει περισσότερο με τη βενζίνη. 157

158 Μέρος 3 Ο Αποελέσματα Σχήμα 25: Προκαταρκτικό διάγραμμα ροής των διεργασιών για την παραγωγή της νέας γενιάς βιοκαυσίμου με βάση τους εστέρες από λιγνινοκυτταρινούχο βιομάζα. 158

159 Μέρος 3 Ο Αποελέσματα Κόστος, επένδυση και προστιθέμενη αξία Χρησιμοποιώντας αιθανόλη για την αντίδραση εστεροποίησης, το κόστος είναι κατά περίπου 10% χαμηλότερο στην κυτταρίνη σε σχέση με τη χρήση βουτανόλης. Ωστόσο, χρησιμοποιώντας βιοαιθανόλη δεν έχουμε το πλεονέκτημα του χαμηλού ενεργειακού κόστους και η βιωσιμότητα της διεργασίας επιτυγχάνεται χρησιμοποιώντας βουτανόλη-1 που είναι βιοτεχνολογικό προϊόν. Το κόστος της επένδυσης είναι αρκετά υψηλό για την κυτταρίνη (Πίνακας 30). Χρησιμοποιώντας λιγνινοκυτταρινούχο βιομάζα από ξύλο, άχυρο, αστικά λύματα και γεωργικά υπολείμματα μπορεί να παραχθεί ετησίως ένας μεγάλος όγκος εστέρων που μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως νέα γενιά βιοκαυσίμων. Η ετήσια προστιθέμενη αξία για την Ελλάδα, την ΕΕ και τις ανεπτυγμένες χώρες, σε δις $ είναι 5.5, 275 και 690 αντίστοιχα. Πίνακας 30: Ανάλυση κόστους παραγωγής βιοκαυσίμου από λιγνινοκυτταρινούχο βιομάζα Απόσβεση της επένδυσης L x 1,6 /L = /ημέρα Κεφάλαιο παραγωγής/μήνα ( /μήνα) / = 495 ημέρες Εργατικό κόστος 80 εργάτες x = Ενεργειακό κόστος 6 tn x 800 /tn x 30 ημέρες = Απαιτήσεις Ηλεκτρισμού και νερό Κόστος πρώτης ύλης Κόστος συντήρησης Σύνολο Προστιθέμενη αξία/μήνα και κόστος παραγωγής βιοκαυσίμου L βιοκαυσίμου x 1.6 = Κόστος παραγωγής 1.10 /L Το κόστος παραγωγής είναι 1.10 /L που είναι μικρότερη τιμή από εκείνη της πώλησης της βενζίνης. Όμως το κόστος αυτό ενδέχεται να μειωθεί αν αυξηθεί η συγκέντρωση των οργανικών οξέων. Αυτό αναμένεται να συμβεί όταν αυξηθεί η κλίμακα στη βιομηχανική ανάπτυξη της τεχνολογίας η με περαιτέρω έρευνα. Η αύξηση της συγκέντρωσης των οξέων θα οδηγήσει στη μείωση του αριθμού των βιοαντιδραστήρων πράγμα που θα οδηγήσει σε σημαντική μείωση του κόστους της επένδυσης. 159

160 Μέρος 3 Ο Αποελέσματα ΚΕΦΑΛΑΙΟ Συμπεράσματα Στόχος της διατριβής ήταν η έρευνα για τη χρήση των λιγνινοκυτταρινούχων υλικών ως πρώτη ύλη για την παραγωγή οργανικών οξέων με αναερόβια διεργασία παρουσία προωθητή. Όμως η δυσκολία της βιοαποικοδόμησης της κυτταρίνης (Kumar et al., 2009) οδήγησε στη σκέψη να χρησιμοποιηθεί η κίσσηρη ως προωθητής της βιοδιεργασίας. Το υλικό αυτό βρέθηκε κατά το παρελθόν ότι προωθεί την αλκοολική ζύμωση (Tsoutsas et al., 1990) και τη μεθανογένεση (Koutinas et al., 1994). Η παραγωγή των οργανικών οξέων θα γινόταν μέσω της αναερόβιας διεργασίας σε συνθήκες οξεογένεσης, ερευνώντας την κίσσηρη ως προωθητή έτσι ώστε αυτά να χρησιμοποιηθειν για παραγωγή εστέρων για τη δημιουργία μιας νέας γενιάς βιοκαυσίμου. Επίσης τα οργανικά οξέα να μπορούν να χρησιμοποιηθούν και ως χημικά προϊόντα που παράγονται με ανανεώσιμη πρώτη ύλη. Στη διατριβή χρησιμοποιήθηκε ως αγροτοβιομηχανικό απόβλητο το άχυρο ως πηγή άνθρακα για τη μικτή αναερόβια καλλιέργεια που χρησιμοποιήθηκε στη διεργασία της οξεογένεσης. Η αναερόβια μικτή καλλιέργεια χρησιμοποιήθηκε σε ελεύθερη μορφή και με τη χρήση κίσσηρης. Επίσης η κίσσηρη μπορεί ταυτόχρονα να αποτελέσει υπόστρωμα για ακινητοποίηση των κυττάρων της αναερόβιας διεργασίας σε συνθήκες οξεογένεσης, όπως αυτό απεδείχθη για τις ζύμες σε προγενέστερες εργασίες (Kana et al., 1989; Tsoutsas et al., 1990). Για να προσδιοριστούν οι βέλτιστες συνθήκες για την αναερόβια χώνεψη έγιναν πειράματα χρησιμοποιώντας γλυκόζη με προωθητή την κίσσηρη σαν πρότυπο σάκχαρο που είναι και το μονομερές της κυτταρίνης. Σε προηγούμενες εργασίες μελετήθηκε η οξεογένεση της γλυκόζης και έγινε γνωστό η ταυτόχρονη παραγωγή οργανικών οξέων και βιοαιθανόλης (Ren et al., 1997). Με την ίδια εργασία ανακοινώθηκε ο μηχανισμός σχηματισμού του οξικού, προπιονικού, γαλακτικού, βουτυρικού οξέος και της βιοαιθανόλης. Στη συνέχεια δημοσιεύτηκε η επίδραση της γ-αλουμίνας στην προώθηση της οξεογένεσης της γλυκόζης (Syngiridis et al., 2013). Παράλληλα ερευνήθηκε πρόσφατα και η επίδραση της γ-αλουμίνας στην οξεογένεση της κελοβιόζης (Τσαφρακίδου, 2016) που είναι δισακχαρίτης από δύο μόρια γλυκόζης, που είναι ταυτόχρονα και προϊόν υδρόλυσης της κυτταρίνης μαζί με τη γλυκόζη, και η επίδραση της γ-αλουμίνας. Έτσι στα πλαίσια της διατριβής εξετάζεται διεξοδικά η επίδραση της κίσσηρης στην οξεογένεση της κυτταρίνης που λαμβάνεται με την απολιγνινοποίηση του αχύρου. Η διατριβή απαντά στο ερώτημα αυτό με μια σειρά πειραμάτων που φθάνουν μέχρι αντιδραστήρα όγκου 82 L. Τα συμπεράσματα της έρευνας που έγινε και που δίδονται στη συνέχεια, αφορούν την οξεογένεση της γλυκόζης και της κυτταρίνης αχύρου με κίσσηρη, σε batch και συνεχείς ζυμώσεις, σε μικρού και μεγάλου όγκου βιοαντιδραστήρες. 160

161 Μέρος 3 Ο Αποελέσματα Επίδραση των παραγόντων κατά την οξεογένεση της γλυκόζης στη συγκέντρωση των οξέων παρουσία κίσσηρης. Για τη μελέτη της επίδρασης των παραγόντων της αναερόβιας χώνεψης διερευνήθηκαν η επίδραση της αρχικής τιμής ph της ζύμωσης, η συγκέντρωση του σακχάρου και η θερμοκρασία ζύμωσης ως οι παράγοντες που επηρεάζουν την ταυτότητα και την τελική συγκέντρωση των παραγόμενων προϊόντων. Πιο συγκεκριμένα μελετήθηκε η επίδραση της θερμοκρασίας (30, 37, και 52 ο C), η αρχική τιμή ph (3-9) του υποστρώματος καθώς και η συγκέντρωση γλυκόζης (30, 50, και 70 g/l). Αρχικά διατηρήθηκε σταθερή θερμοκρασία στους 37 ο C και η συγκέντρωση 70 g/l και δοκιμάστηκε το ph του υποστρώματος. Η συνολική παραγωγή οξέων ήταν υψηλότερη σε αρχικό ph 9 ενώ φάνηκε πως υπάρχει αυξητική τάση στη συγκέντρωση των οξέων από την τιμή 7 μέχρι την τιμή 9. Για να μελετηθεί η επίδραση της θερμοκρασίας διατηρήθηκε σταθερή η τιμή του ph στο 9, η οποία είναι και αυτή που έχει το υπόστρωμα μετά την αποστείρωση του χωρίς ρύθμιση, και η συγκέντρωση της γλυκόζης στα 30 g/l. Οι μεσόφιλες συνθήκες στους 37 ο C έδωσαν καλύτερα αποτελέσματα τόσο για τα ακινητοποιημένα κύτταρα σε κίσσηρη όσο και για τα ελεύθερα ενώ σε αυτή τη θερμοκρασία παρατηρήθηκε και η μεγαλύτερη αύξηση συγκέντρωσης στα οργανικά οξέα σε σχέση με τα ελευθέρα κύτταρα. Επιπλέον παρατηρείται πως στους 37 ο C παράχθηκαν οι μεγαλύτερες συγκεντρώσεις οργανικών οξέων παρουσία και απουσία κίσσηρης καθώς και η μεγαλύτερη αύξηση που επιτυγχάνεται με την κίσσηρη στη συγκέντρωση των ολικών οξέων σε σχέση με τα ελευθέρα κύτταρα που ήταν 150%. Επίσης παρατηρήθηκε και σημαντικά αυξημένη ταχύτητα στην οξεογένεση τόσο της γλυκόζης όσο και της κυτταρίνης παρουσία κίσσηρης. Στη συνέχεια μελετήθηκε η επίδραση της αρχικής συγκέντρωσης της γλυκόζης διατηρήθηκε σταθερή η τιμή του ph στο 9, η οποία είναι και αυτή που έχει το υπόστρωμα μετά την αποστείρωση του χωρίς ρύθμιση και δοκιμάστηκαν οι συγκεντρώσεις γλυκόζης στα 30, 50 και 70 g/l. Οι καλύτερες αποδόσεις σε οργανικά οξέα επετεύχθησαν στη συγκέντρωση των 30 g/l και καθιερώθηκε ως η συγκέντρωση όπου έγιναν όλα τα πειράματα οξεογένεσης της κυτταρίνης. Η γαλακτικού τύπου ζύμωση φάνηκε να είναι η επικρατέστερη ζύμωση στην οξεογένεση της γλυκόζης και το οξύ που κυριάρχησε ήταν το γαλακτικό οξύ. Τα άλλα οξέα της οξεογένεσης παρήχθησαν σε μικρότερες συγκεντρώσεις και ήταν το ηλεκτρικό και το οξικό οξύ, το οποίο ήταν και το επικρατέστερο. Η αιθανόλη παράχθηκε σε μικρές συγκεντρώσεις (1,93 ml/l εώς 5,98 ml/l) σε αντίθεση με άλλες εργασίες που αφορούσαν αναερόβια οξεογένεση της γλυκόζης (Ren et al., 1997) και την αναερόβια οξεογένεση της γλυκόζης με προωθητή γ-αλουμίνα (Syngiridis et al., 2013). Επιπλέον η παραγωγή της αιθανόλης ήταν σχεδόν η ίδια σε όλες τις συγκεντρώσεις γλυκόζης που δοκιμάστηκαν ενώ αντίθετα η συγκέντρωση των οξέων αυξήθηκε στις μεγαλύτερες συγκεντρώσεις γλυκόζης. 161

162 Μέρος 3 Ο Αποελέσματα Επίδραση της κίσσηρης στη συγκέντρωση των οργανικών οξέων και στην ταχύτητα της ζύμωσης κατά την οξεογένεση της γλυκόζης Στις batch ζυμώσεις της γλυκόζης που πραγματοποιήθηκαν παρουσία κίσσηρης έγιναν και τα αντίστοιχα πειράματα σε ελεύθερα κύτταρα για λόγους σύγκρισης. Η παρουσία της κίσσηρης έδειξε σε όλες τις περιπτώσεις βελτίωση του αποτελέσματος της οξεογένεσης καθώς παρατηρήθηκε αύξηση της συγκέντρωσης των παραγόμενων οξέων σε όλες τις συνθήκες που δοκιμάστηκαν. Γενικά η παρουσία της κίσσηρης είχε ευεργετική επίδραση στη αναερόβια ζύμωση της γλυκόζης. Στις batch ζυμώσεις παρατηρήθηκε πως παρουσία της κίσσηρης στους ιδίους χρόνους είχαμε καλύτερη παραγωγη οξέων. Στις συνέχεις ζυμώσεις ο βιοαντιδραστήρας λειτούργησε για μεγάλο χρονικό διάστημα χωρίς προβλήματα αποδεικνύοντας τη σταθερότητα του βιοκαταλύτη. Τέλος η χρήση της κίσσηρης δίνει τη δυνατότητα ο βιοκαταλύτης να επαναχρησιμοποιηθεί, μειώνοντας το κόστος, κάτι το οποίο είναι αδύνατον όταν χρησιμοποιούνται ελεύθερα κύτταρα. Η κίσσηρη δίνει μεγαλύτερο ρυθμό οξεογένεσης σε σύγκριση με την οξεογένεση χωρίς την κίσσηρη καθώς αυξάνει ταυτόχρονα το ρυθμό της ζύμωσης και την τελική συνολική συγκέντρωση των οργανικών οξέων. Έτσι έχουμε αύξηση της παραγωγικότητας αλλά και της ποσότητας των οργανικών οξέων που, μπορούμε να παράγουμε σε ορισμένο όγκο αντιδραστήρα. Η γαλακτικού τύπου ζύμωση φάνηκε να είναι η επικρατέστερη ζύμωση στην οξεογένεση της γλυκόζης παρουσία κίσσηρης και το οξύ που κυριάρχησε ήταν το γαλακτικό (7 g/l σε συγκέντρωση γλυκόζης 30g/L) ενώ τα συνολικά οξέα που παράχθηκαν ήταν 9,14 g/l. Έτσι αποδεικνύεται ότι η κίσσηρη οδηγεί την οξεογένεση της γλυκόζης σε γαλακτικού τύπου ζύμωση ενώ με γ-αλουμίνα έχουμε οξικού τύπου ζύμωση (Syngiridis et al., 2014). Τα άλλα οξέα της οξεογένεσης παρήχθησαν σε μικρότερες συγκεντρώσεις ήταν το ηλεκτρικό και το οξικό οξύ, με το οξικό οξύ να είναι το επικρατέστερο. Συγκεκριμένα σε αντίστοιχα πειράματα με χρήση γ-αλουμίνας ως προωθητή σε batch ζυμώσεις μικρής κλίμακας, παρουσιάστηκε παραγωγή 6,13 g/l ολικά οξέα σε ζύμωση στη συγκέντρωση των 30 g/l γλυκόζης με το οξικό να είναι το κυριότερο παραγόμενο οξύ σε συγκέντρωση 3,85 g/l (Syngiridis et al., 2014) δείχνοντας έτσι πως η κίσσηρη είναι πιο αποτελεσματικός προωθητής από τη γ- αλουμίνα Επίδραση της κίσσηρης στη συγκέντρωση των οργανικών οξέων και στην ταχύτητα της ζύμωσης κατά την οξεογένεση της κυτταρίνης Στις batch ζυμώσεις της κυτταρίνης που πραγματοποιήθηκαν παρουσία κίσσηρης έγιναν και τα αντίστοιχα πειράματα σε ελεύθερα κύτταρα για λόγους σύγκρισης. Η παρουσία της κίσσηρης έδειξε σε όλες τις περιπτώσεις βελτίωση του αποτελέσματος της οξεογένεσης καθώς παρατηρήθηκε αύξηση της 162

163 Μέρος 3 Ο Αποελέσματα συγκέντρωσης των παραγόμενων οξέων σε σύγκριση με τη ζύμωση χωρίς κίσσηρη και μάλιστα περισσότερο από εκείνη που επετεύχθη στη γλυκόζη. Γενικά η παρουσία της κίσσηρης είχε ευεργετική επίδραση στη αναερόβια ζύμωση της κυτταρίνης. Στις batch ζυμώσεις παρατηρήθηκε πως παρουσία της κίσσηρης στους ιδίους χρόνους είχαμε καλύτερη παραγωγή οξέων. Έτσι παρατηρήθηκε αύξηση της παραγωγικότητας, αλλά και της ποσότητας των οργανικών οξέων που παράγονται σε ορισμένο όγκο αντιδραστήρα. Η γαλακτικού τύπου ζύμωση φάνηκε να είναι η επικρατέστερη ζύμωση στην οξεογένεση της κυτταρίνης και το οξύ που κυριάρχησε ήταν το γαλακτικό οξύ (4,5 με 5,3 g/l στη συγκέντρωση 30 g/l κυτταρίνης) ενώ τα συνολικά οξέα που παράχθηκαν ήταν 7,8 g/l που είναι μικρότερη συγκέντρωση κατά περίπου 10% από τη συγκέντρωση των συνολικών οργανικών οξέων που παρήχθησαν κατά την οξεογένεση της γλυκόζης στη συγκέντρωση 30 g/l. Τα άλλα οξέα της οξεογένεσης παρήχθησαν σε μικρότερες συγκεντρώσεις ήταν το ηλεκτρικό και το οξικό οξύ, με το οξικό οξύ να είναι το επικρατέστερο Επίδραση της διεργασίας στην τελική συγκέντρωση οργανικών οξέων Η διεργασία που χρησιμοποιήθηκε για τις αναερόβιες ζυμώσεις είχε και αυτή επίδραση στην τελική συγκέντρωση των παραγόμενων οργανικών οξέων (batch ζυμώσεις ή συνεχείς). Οι βέλτιστες συνθήκες των batch ζυμώσεων χρησιμοποιήθηκαν για τη λειτουργία του συνεχούς συστήματος ζύμωσης. Το συνεχές σύστημα μελετήθηκε με χρήση συνθετικού μέσου γλυκόζης καθώς και με διάλυμα χημικώς απολιγνινοποιημένου άχυρου. Οι τελικές συγκεντρώσεις του συνόλου των οργανικών οξέων ήταν αυξημένες σε σχέση με τις batch ζυμώσεις στις χαμηλές συγκεντρώσεις γλυκόζης (30 g/l) ενώ στα 70 g/l είχαμε πιο χαμηλές συγκεντρώσεις οξέων αλλά η συγκέντρωση της αιθανόλης ήταν αυξημένη. Στις batch ζυμώσεις όταν χρησιμοποιήθηκε άχυρο ως υπόστρωμα δεν παρατηρήθηκε διαφορά στα παραγόμενα οξέα αλλά η συγκέντρωση της αιθανόλης μειώθηκε αρκετά σε σχέση με τις ζυμώσεις της γλυκόζης. Όμως στις επαναλαμβανόμενες batch αναερόβιες ζυμώσεις αχύρου παρουσία και απουσία κίσσηρης με αποβολή και αναπλήρωση του υγρού ζύμωσης παρατηρήθηκε πως το ηλεκτρικό και το γαλακτικό οξύ που παρουσιαστήκαν αρχικά έδωσαν τη θέση τους στο βουτυρικό οξύ ενώ υπήρξε παραγωγή οξικού οξέος καθ όλη τη διάρκεια της ζύμωσης. Η αλλαγή του υποστρώματος από γλυκόζη σε απολιγνινοποιημένο άχυρο είχε μεγάλη επίδραση στα παραγόμενα οξέα στη συνεχή ζύμωση. Το ηλεκτρικό και το γαλακτικό οξύ που είχε τη μεγαλύτερη παραγωγή εξαφανίστηκαν ενώ παρατηρήθηκε παραγωγή βουτυρικού και οξικού οξέος Πειράματα αυξημένης κλίμακας (scale-up) Τα θετικά αποτελέσματα των εργαστηριακών πειραμάτων ζύμωσης συνεχούς 163

164 Μέρος 3 Ο Αποελέσματα και batch λειτουργίας ώθησαν στη μελέτη σε αυξημένη κλίμακα σε όγκο 82 L. Τα πειράματα έγιναν σε batch ζυμώσεις στον 1 ο όροφο αλλά και στον 1 ο και 2 ο όροφο. Στα πειράματα μεγάλης κλίμακας παρατηρήθηκε πως η παραγωγή οργανικών οξέων κυμάνθηκε σε υψηλά επίπεδα και επαληθεύτηκε ξανά η σταθερότητα του βιοκαταλύτη καθώς το σύστημα αυτό λειτούργησε για μεγάλο χρονικό διάστημα χωρίς να μειωθεί η δραστικότητα του. Επιπλέον παρατηρήθηκε αύξηση της παραγωγής του βουτυρικού και του οξικού οξέος καθώς και ελάχιστη παραγωγή αιθανόλης και προπιονικού και ισοβουτυρικού. Σχήμα 26: Κινητική οξεογένεσης παρουσία κίσσηρης σε μικρή και μεγάλη κλίμακα με πρώτη ύλη την κυτταρίνη για το σύνολο των οξέων. Σχήμα 27: Κινητική παραγωγής βουτυρικού οξέος παρουσία κίσσηρης σε μικρή και μεγάλη κλίμακα με πρώτη ύλη την κυτταρίνη. 164

165 Μέρος 3 Ο Αποελέσματα Στο Σχήμα 26 παρουσιάζεται η παραγωγή των συνολικών οξέων σε πειράματα μικρής και μεγάλης κλίμακας με κυτταρίνη. Η μεγαλύτερη ποσότητα των οξέων παράχθηκε τις πρώτες 24 h και στις δύο περιπτώσεις, ενώ παρατηρείται πως στα πειράματα μεγάλης κλίμακας παράχθηκαν πολύ μεγαλύτερες ποσότητες οξέων. Στο Σχήμα 27 παρουσιάζεται η παραγωγή βουτυρικού οξέος σε πειράματα μικρής και μεγάλης κλίμακας με κυτταρίνη. Η μεγαλύτερη ποσότητα των οξέων παράχθηκε τις πρώτες 24 h και στις δύο περιπτώσεις, ενώ παρατηρείται πως στα πειράματα μεγάλης κλίμακας παράχθηκαν πολύ μεγαλύτερες ποσότητες οξέων. Πίνακας 31: Σύγκριση της οξεογένεσης μικρής και μεγάλης κλίμακας με κίσσηρη. Συγκέντρωση οργανικών οξέων (g/l) Απόδοση οξέων (g /g υποστρ.) Παραγωγικότητα οξέων (g/l d) Κύρια οργανικά οξέα Batch ζύμωση γλυκόζης μικρής κλίμακας Batch ζύμωση αχύρου μικρής κλίμακας 9,14 0,3 4,57 Γαλακτικό 7,81 0,26 3,91 Γαλακτικό Batch ζύμωση αχύρου μεγάλης κλίμακας 17,72 0,59 5,32 Οξικό, Βουτυρικό Όπως φαίνεται στον Πίνακα 31 κατά την οξεογένεση στο βιοαντιδραστήρα μεγαλύτερης κλίμακας παρατηρήθηκε σημαντική αύξηση στην παραγωγή οργανικών οξέων η οποία έφτασε τα 17,72 g/l, ενώ η απόδοση παραγωγής των οργανικών οξέων διπλασιάστηκε συγκριτικά με τις batch ζυμώσεις εργαστηριακής κλίμακας, ενώ μεγάλο ενδιαφέρον έχει το γεγονός ότι τα κύρια παραγόμενα οξέα στo πείραμα μεγάλης κλίμακας είναι το βουτυρικό και το οξικό σε αντίθεσή με τα πειράματα μικρής κλίμακας που έχουν το γαλακτικό οξύ ως κύριο προϊόν. Συνεπώς αφού το σύστημα αυτό επέδειξε ικανοποιητική λειτουργική σταθερότητα, δίνοντας επιθυμητά προϊόντα, η μεταφορά της τεχνολογίας αυτής σε αυξημένη κλίμακα παρουσίασε ενθαρρυντικά αποτελέσματα για μελλοντική βιομηχανική εφαρμογή Εκχύλιση οργανικών οξέων Τέλος μελετήθηκε η εκχύλιση των οργανικών οξέων με διάφορους διαλύτες, σε διαφορετικές συγκεντρώσεις και τιμές ph. Τα πειράματα έγιναν σε πρότυπα υδατικά διαλύματα αλλά και σε υγρά ζύμωσης απολιγνινοποιημένου άχυρου. 165

166 Μέρος 3 Ο Αποελέσματα Από τους διαλύτες που δοκιμάστηκαν η βουτανόλη επιλέχθηκε ως ο καλύτερος διαλυτής για τη συγκεκριμένη εφαρμογή από άποψη απόδοσης εκχύλισης και κόστους. Από την έκθεση των αποτελεσμάτων για την ανάκτηση των οργανικών οξέων είναι σαφές ότι τα ζυμέλαια δεν είναι κατάλληλος διαλύτης για την ανάκτηση των οργανικών οξέων από τα υγρό της οξεογένεσης του απολιγνινοποιημένου αχύρου. Κι αυτό παρόλο που τα ζυμέλαια έχουν ένα μικρό κόστος ως υποπροϊόν των αποστακτήριων παραγωγής ποσίμου οινοπνεύματος και στην περίπτωση της εκχύλισης του υγρού της οξεογένεσης του αχύρου έδωσαν καλύτερες αποδόσεις απ ότι στα συνθετικά διαλύματα οργανικών οξέων. Όσον αφορά στην εκχύλιση των οξέων από τα υγρά της ζύμωσης τα αποτελέσματα ήταν ανάλογα με αυτά των πρότυπων διαλυμάτων. Πιο συγκεκριμένα τα καλύτερα αποτελέσματα παρουσιάστηκαν για αρχικό ph 1 με διαλύτη τη βουτανόλη (σχεδόν 80% συνολική παραλαβή). Το ισοβουτυρικό οξύ ήταν αυτό που εκχυλίστηκε πιο εύκολα με το βουτυρικό και το προπιονικό να ακολουθούν. Το οξικό έδωσε τα χειρότερα αποτελέσματα σε όλους τους διαλύτες. Έτσι το συμπέρασμα είναι ότι για να παραληφθούν τα οργανικά οξέα από το υγρό της οξεογένεσης του αχύρου θα χρησιμοποιηθεί η βουτανόλη-1 ως διαλύτη εκχύλισης και η εκχύλιση θα πρέπει να γίνει σε ph Οικονομικά συμπεράσματα Το κόστος παραγωγής του νέου αυτού τύπου βιοκαυσίμων με βάση τους εστέρες μικρού μοριακού βάρους οργανικών οξέων από αγροτοβιομηχανικά απόβλητα και συγκεκριμένα από τα άχυρα, φαίνεται ότι μπορεί να είναι διαχειρίσιμο γεγονός που κάνει αρκετά ελπιδοφόρες τις προοπτικές μιας τέτοιας επένδυσης. Επιπλέον, η πρώτη ύλη, το άχυρο, είναι αμελητέου κόστους που μειώνει το λειτουργικό κόστος της μονάδας παραγωγής ενώ μπορεί να εξεταστεί στο μέλλον και η χρήση άλλων μορφών λιγνινοκυτταρινούχου βιομάζας. Χρησιμοποιώντας τη βιοαιθανόλη για την αντίδραση εστεροποίησης, το κόστος είναι ακόμα χαμηλότερο. Επειδή όμως, χρησιμοποιώντας βιοαιθανόλη το πλεονέκτημα του χαμηλού ενεργειακού κόστους χάνεται, η βιωσιμότητα της διαδικασίας επιτυγχάνεται χρησιμοποιώντας βουτανόλη-1, μια αλκοόλη που παράγεται βιοτεχνολογικά με χαμηλό κόστος. Το κόστος παραγωγής του νέου βιοκαυσίμου είναι χαμηλότερο από την τιμή πώλησης της βενζίνης. Όμως το κόστος αυτό μπορεί να μειωθεί σημαντικά αν αυξηθεί η συγκέντρωση των οξέων που αναμένεται να συμβεί όταν αυξηθεί η κλίμακα με τη βιομηχανοποίηση της μεθόδου. Αν όμως αυτό δεν συμβεί, τότε είναι δυνατόν να επιτευχθεί με περαιτέρω έρευνα. Το κόστος παραγωγής, αλλά και το κόστος της επένδυσης είναι μικρότερο όταν η πρώτη ύλη είναι το τυρόγαλο (Boura et al., 2017) ή η βινάσσα (Lappa et al., 2015b). Αυτό οφείλεται στο ότι η οξεογένεση του τυρογάλακτος αλλά και τις βινάσσας γίνεται με μεγαλύτερη ταχύτητα σε σύγκριση με την κυτταρίνη. Αυτό αυξάνει για την κυτταρίνη σημαντικά τον αριθμό των βιοαντιδραστήρων στην 166

167 Μέρος 3 Ο Αποελέσματα κατεργασία του αχύρου για την ίδια παραγωγή, με άμεσο αποτέλεσμα την αύξηση της επένδυσης αλλά και του κόστους εργασίας. Όμως το γεγονός ότι το κόστος παραγωγής είναι ήδη ανταγωνιστικό στην τιμή της βενζίνης δημιουργεί σημαντικές ελπίδες για την ανάπτυξη της τεχνολογίας παραγωγής του νέου βιοκαυσίμου από κυτταρινούχο βιομάζα Γενικά συμπεράσματα Η παραγωγή ενέργειας από το στάδιο της οξεογένεσης έχει ως αποτέλεσμα να αποφευχθεί η ανάκτηση της ενέργειας από τη χρονοβόρο και ενεργοβόρο μεθανογένεση. Η χρήση του σταδίου της οξεογένεσης για την παραγωγή ενέργειας έχει μεγάλο ενδιαφέρον λόγω των μικρότερων χρόνων ζύμωσης που παρατηρούνται σε σχέση με τη μεθανογένεση, αλλά και γιατί η παραγωγή καυσίμων σε υγρή μορφή προτιμάται έναντι του βιοαερίου. Η επιτυχής παραγωγή ενέργειας εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από τη σταθερότητα του συστήματος καθώς και από τις συνθήκες λειτουργίας του βιοαντιδραστήρα. Για τη μείωση του κόστους αλλά και για την εκμετάλλευση των πλεονεκτημάτων της χρήσης ακινητοποιημένων κυττάρων επιλέχθηκε η κίσσηρη ως φορέας ακινητοποίησης βελτιώνοντας την απόδοση της οξεογένεσης, μειώνοντας το χρόνο της ζύμωσης. Η χρήση των συνθετικών μέσων γλυκόζης σε διαφορετικές συγκεντρώσεις, ph, θερμοκρασίας αλλά και η ανάπτυξη μεθόδου ζυμώσεως, εξέτασε τις συνθήκες κάτω από τις οποίες ευνοείται η παραγωγή προϊόντων, όπως τα οργανικά οξέα. Η δυνατότητα της οξεογένεσης ενός οργανικού αποβλήτου όπως είναι το άχυρο βοηθάει την οικονομική εκμετάλλευση με εφαρμογή σε βιομηχανική κλίμακα, λόγω του μεγάλου όγκου παραγωγής του αποβλήτου αλλά και επειδή αποτελεί φθηνή πρώτη ύλη. Παράλληλα, δημιουργείται προοπτική για την αξιοποίηση και άλλων λιγνινοκυτταρινούχων υλικών, που είναι η πιο άφθονη και ανανεώσιμη πηγή άνθρακα στον πλανήτη και η οποία μέχρι σήμερα μελετάται για την παραγωγή κυρίως βιοαερίου και βιοαιθανόλης. Η προωθητική δράση της κίσσηρης βελτίωσε την ταχύτητα της οξεογένεσης και την απόδοση της διεργασίας αυξάνοντας τις συγκεντρώσεις των οξέων, γεγονός που θα οδηγούσε στη μείωση του κόστους και θα προσέφερε όλα τα πλεονεκτήματα της ακινητοποίησης των κυττάρων σε βιομηχανική κλίμακα εκμετάλλευσης των λιγνινοκυτταρινούχων υλικών. Με αυτή τη διδακτορική διατριβή φάνηκε να επιλύεται το πρόβλημα της ανάκτησης των οργανικών οξέων από το προϊόν της οξεογένεσης του αχύρου. Αυτό επιτυγχάνεται με την αλκοόλη βουτανόλη-1 που είναι βιοτεχνολογικό προϊόν (Zheng et al., 2015) και μπορεί να παραχθεί από την ίδια πρώτη ύλη. Έτσι η διατριβή κατάφερε να δώσει απαντήσεις και να προωθήσει: i. Την ταχύτητα οξεογένεσης της κυτταρίνης. ii. iii. Την αύξηση της συγκεντρώσεις των οργανικών οξέων στην οξεογένεση της κυτταρίνης που είναι εξαιρετικά δύσκολη. Την ανάκτηση των οργανικών οξέων από το υγρό ζύμωσης του αχύρου. 167

168 iv. Μέρος 3 Ο Αποελέσματα Επίσης εντόπισε την έρευνα που απαιτείται να γίνει προκειμένου να μειωθεί περαιτέρω το κόστος παραγωγής των οργανικών οξέων, των εστέρων αλλά και της επένδυσης για τη βιομηχανική παραγωγή. v. Έχει κάνει γνωστό ότι τα οξέα που μπορούν να παραχθούν από την κυτταρίνη ως βιομηχανικά χημικά προϊόντα, είναι το οξικό και βουτυρικό οξύ, καθώς και ότι η σύσταση των εστέρων θα είναι ένα μίγμα όπου θα κυριαρχούν ο οξικός και ο βουτυρικός βουτυλεστέρας. vi. Οδήγησε στην αποφυγή της ποσοτικής υδρόλυσης της κυτταρίνης σε γλυκόζη που χρειάζεται για την παραγωγή της βιοαιθανόλης και τη μεγάλη συγκέντρωση γλυκόζης που απαιτείται. Έτσι ο μηχανισμός της λύσης που προτείνεται δίδεται στη συνέχεια. Λαμβάνοντας υπόψη τα αποτελέσματα της διατριβής καθώς και το μηχανισμό οξεογένεσης της γλυκόζης των Ren et al. (1997), ο μηχανισμός οξεογένεσης της κυτταρίνης προτείνεται να είναι το παρακάτω Σχήμα. Σχήμα 28: Πιθανό μεταβολικό μονοπάτι οξεογένεσης της λιγνινοκυτταρινούχου βιομάζας παρουσία κίσσηρης (βασισμένο στο Ren et al. 1997). 168

169 Μέρος 3 Ο Αποελέσματα Ο προτεινόμενος μηχανισμός της οξεογένεσης της λιγνινοκυτταρινούχου βιομάζας με μικτή αναερόβια καλλιέργεια περιλαμβάνει την υδρόλυσή της σε γλυκόζη και παρουσία ενζύμων που παράγονται από τα βακτήρια της αγνώστου μικροβιακής σύστασης αναερόβιας καλλιέργειας. Στο Σχήμα 28 παρουσιάζεται ένα πιθανό μονοπάτι οξεογένεσης της γλυκόζης βασισμένο στην ερευνητική εργασία της ομάδας του Ren et al. (1997). Σύμφωνα με το μηχανισμό η κυτταρίνη υδρολύεται σε γλυκόζη. Ταυτόχρονα όμως καταναλώνεται από άλλα βακτήρια προς πυροσταφυλικό και αυτό βιομετατρέπεται σε βουτυρικό και οξικό. Στην παραγωγή της αιθανόλης χρειάζεται πολύ ενέργεια στην απόσταξη της ενώ χρειάζεται και αυξημένη συγκέντρωση γλυκόζης για να υπάρξει αυξημένη συγκέντρωση βιοαιθανόλης που θα μειώσει την κατανάλωση ατμού. Αν η κυτταρίνη βιομετατραπεί σε οργανικά οξέα και αυτά εκχυλιστούν με μία αλκοόλη όπως η βουτανόλη, η συγκέντρωση των οξέων στη βουτανόλη μπορεί να αυξηθεί με επαναχρησιμοποίηση του εκχυλιστικού μέσου. Επίσης η ενέργεια που χρειάζεται για την ανάκτηση των εστέρων με απόσταξη είναι σημαντικά μικρότερη λόγω του ότι χρησιμοποιείται οργανικός διαλύτης. Η συμβατική εκχύλιση των οξέων με οργανικούς διαλύτες μπορεί να δώσει πολύ καλά αποτελέσματα όσον αφορά την απόδοση της διεργασίας για την παραλαβή του συνόλου των οξέων, πρέπει όμως να ληφθεί υπόψη η επίδραση των διαλυτών στην επιβάρυνση του περιβάλλοντος. Η χρήση αλκοολών για την εκχύλιση, οι οποίες μετά θα χρησιμεύσουν ως αντιδραστήρια για την εστεροποίηση των οξέων για τον τελικό σχηματισμό του βιοκαυσίμου μειώνει τον όγκο των παραγόμενων αποβλήτων Προοπτικές της έρευνας στο πεδίο της παραγωγής νέας γενιάς βιοκαυσίμου Οι προοπτικές που ανοίγονται στην εκμετάλλευση των λιγνινοκυτταρινούχων υλικών αφορούν στη χρήση καθαρών μικροοργανισμών σε επίπεδο είδους ή στελέχους και βελτιστοποίηση των παραγόντων που επηρεάζουν την παραγωγή επιμέρους προϊόντων (π.χ. συγκεκριμένα οργανικά οξέα όπως το ηλεκτρικό, το βουτυρικό, κ.α.). Στη συγκεκριμένη διατριβή ως υπόστρωμα χρησιμοποιήθηκε μόνο άχυρο σίτου και θα μπορούσαν να μελετηθούν και άλλα υλικά ή απόβλητα από λιγνινοκυτταρινούχο υλικό όπως πριονίδι, υπολείμματα από καλαμπόκι ή ρύζι. Επιπλέον κατά τη διάρκεια της χημικής απολιγνινοποίησης δημιουργείται μεγάλος όγκος αποβλήτων ο οποίος είναι δυνατόν να αξιοποιηθεί παράγοντας προϊόντα προστιθέμενης αξίας μειώνοντας έτσι το κόστος και τη μόλυνση του περιβάλλοντος. Επίσης, δεδομένου ότι μετά την απομάκρυνση των οργανικών οξέων από το υγρό ζύμωσης προκύπτει ένα ακόμα υγρό ρεύμα αποβλήτων που πρέπει και αυτό να αξιοποιηθεί με κάποιο τόπο ώστε να μειωθεί ακόμα περισσότερο ο όγκος των αποβλήτων και η επίδραση που έχουν στο περιβάλλον. Η χρήση λιπασών στην εστεροποίηση θα έχει μεγάλο ενδιαφέρον για την εκμετάλλευση της οξεογένεσης με τη μεγιστοποίηση των παραγόμενων εστέρων 169

170 Μέρος 3 Ο Αποελέσματα σε σύντομο χρονικό διάστημα και τη μείωση της ενέργειας που χρειάζεται για την παραγωγή του βιοκαυσίμου. Τέλος θα είχε ενδιαφέρον να μελετηθεί αν κάποιος συνδυασμός αποβλήτων που έχουν μελετηθεί για την παραγωγή οργανικών οξέων (τυρόγαλο, βινάσσα, μελάσα, άχυρο) μπορεί να δώσει ακόμα καλύτερα αποτελέσματα στην παραγωγή οξέων κατά τη διάρκεια της ζύμωσης σε σχέση με την παραγωγή που παρατηρήθηκε σε κάθε απόβλητο χωριστά. Επιπλέον θα υπάρξει μείωση του κόστους αφού θα υπάρξει μόνο μια διάταξη για όλα τα απόβλητα Ερευνητικά θέματα που προκύπτουν από τα αποτελέσματα της διατριβής Ένα ερευνητικό αντικείμενο θα πρέπει να έχει ως στόχο (1) τη μείωση του αριθμού των βιοαντιδραστήρων που αυξάνουν έτσι την επένδυση. Για να συμβεί αυτό θα πρέπει να αυξηθεί περαιτέρω (α) η ταχύτητα της οξεογένεσης καθώς και (β) η συγκέντρωση των οργανικών οξέων. Αυτό θα μπορούσε να επιτευχθεί (i) με τη χρήση μίας άφθονης λιγνινοκυτταρινούχου πρώτης ύλης με μεγάλη επιφάνεια. Ως τέτοια προτείνεται ο κορμός του καλαμποκιού μαζί με το λιγνινοκυτταρινούχο μέρος του καρπού του. (ii) Επίσης θα μπορούσε να επιτευχθεί με έρευνα σε πρώτη ύλη λιγνινοκυτταρινούχου βιομάζας (άχυρο, ρύζι καλαμπόκι, κ.λπ.) όπου η βιοαποικοδόμιση για την παραγωγή των οργανικών οξέων θα γίνει σε κόκκους της πρώτης ύλης εξαιρετικά μικρού μεγέθους. Ένας άλλος στόχος (2) που απορρέει από τα αποτελέσματα της διατριβής θα είναι η μηχανολογική διευκόλυνση του βιοαντιδραστήρα. Το τελευταίο είναι σημαντικό εμπόδιο για τη βιομηχανική ανάπτυξη της βιοδιεργασίας. Συγκεκριμένα, ο MFBT αντιδραστήρας που χρησιμοποιήθηκε στην παρούσα διατριβή έχει ως μειονέκτημα την κατασκευαστική πολυπλοκότητα που δημιουργείται από τους 4-6 ορόφους που απαιτούνται σε έναν βιομηχανικό βιοαντιδραστήρα που αυξάνει το κόστος κατασκευής. Αυτό όμως δεν σημαίνει ότι αποκλείεται να εφαρμοστεί ο βιοαντιδραστήρας στη βιομηχανία. Τα πλεονεκτήματα του βιοαντιδραστήρα έχουν ήδη συζητηθεί στο Κεφάλαιο 3.3. Για να αποφευχθεί το μειονέκτημα αυτό προτείνεται να γίνει έρευνα της οξεογένεσης της κίσσηρης σε μορφή σκόνης, διάφορων διαστάσεων μικρού μεγέθους κόκκων που να διευκολύνει έτσι ένα fluidized-bed σύστημα βιοαντιδραστήρα. Αυτό αναμένεται να αυξήσει την ταχύτητα και τη συγκέντρωση των οξέων και να μειώσει έτσι και τη μάζα του προωθητή. 170

171 Βιβλιογραφία ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 4.1. ΞΈΝΗ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΊΑ Alkaya, E., Kaptan, S., Ozkan, L., Uludag-Demirer, S. and Demirer, G.N. (2009). Recovery of acids from anaerobic acidification broth by liquid-liquid extraction. Chemosphere, 77(8), doi: /j.chemosphere Alonso, D.M., Wettstein, S.G., Dumesic, J.A. (2012) Bimetallic catalysts for upgrading of biomass to fuels and chemicals, Chemical Society Reviews, 41(24), doi: /c2cs35188a. Antonopoulou, G., Gavala, H.N., Skiadas, I.V., Angelopoulos, K and Lyberatos, G. (2008). Biofuels generation from sweet sorghum: Fermentative hydrogen production and anaerobic digestion of the remaining biomass. Bioresource Technology, 99(1), doi: /j.biortech Arimi, M.M., Knodel, J., Kiprop, A., Namango, S.S., Zhang, Y and Geißen, S.U. (2015). Strategies for improvement of biohydrogen production from organic-rich wastewater: A review. Biomass and Bioenergy, doi: /j.biombioe Aro, E.M. (2016). From first generation biofuels to advanced solar biofuels. Ambio, 45(1), doi: /s Arora, R., Behera, S and Kumar, S. (2015). Bioprospecting thermophilic/thermotolerant microbes for production of lignocellulosic ethanol: A future perspective. Renewable and Sustainable Energy Reviews, 51, doi: /j.rser Asina, F.N.U., Brzonova, I., Kozliak, E., Kubátová, A and Ji, Y. (2017). Microbial treatment of industrial lignin: Successes, problems and challenges. Renewable and Sustainable Energy Reviews, 77, doi: /j.rser Awad, O.I., Mamat, R., Ali, O.M., Sidik, N.A.C., Yusaf, T., Kadirgama, K., Kettner, M. (2018). Alcohol and ether as alternative fuels in spark ignition engine: A review. Renewable & Sustainable Energy Reviews, 82, Bansal, P., Hall, M., Realff, M.J., Lee, J.H. and Bommarius, A.S. (2009). Modeling cellulase kinetics on lignocellulosic substrates. Biotechnology Advances, 27(6), doi: /j.biotechadv Bardi, E.P and Koutinas, A.A. (1994). Immobilization of yeast on delignified cellulosic material for room temperature and low-temperature wine making. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 42(1), doi: /jf00037a040. Becker, J., Lange, A., Fabarius, J and Wittmann, C. (2015). Top value platform chemicals: Bio-based production of organic acids. Current Opinion in Biotechnology, doi: /j.copbio Bekatorou, A., Dima, A., Tsafrakidou, P., Boura, K., Lappa, K., Kandylis, P., Pissaridi, K., Kanellaki, M and Koutinas, A.A. (2016). Downstream extraction process development for recovery of organic acids from a fermentation broth. Bioresource Technology, 220, doi: /j.biortech Bekatorou, A., Plessas, S and Mallouchos, A. (2015). Cell Immobilization Technologies for Applications in Alcoholic Beverages. in Handbook of Encapsulation and Controlled Release. CRC Press, doi: /b

172 172 Βιβλιογραφία Boura, K., Kandylis, P., Bekatorou, A., Kolliopoulos, D., Vasileiou, D., Panas, P., Kanellaki, M and Koutinas, A.A. (2017). New generation biofuel from whey: Successive acidogenesis and alcoholic fermentation using immobilized cultures on γ-alumina. Energy Conversion and Management, 135, doi: /j.enconman Calull, M., Marcé, R.M and Borrull, F. (1992). Determination of carboxylic acids, sugars, glycerol and ethanol in wine and grape must by ion-exchange high-performance liquid chromatography with refractive index detection. Journal of Chromatography A, 590(2), doi: / (92) Carvalho, F., Prazeres, A.R and Rivas, J. (2013). Science of the total environment cheese whey wastewater: Characterization and treatment. Science of the Total Environment, , doi: /j.scitotenv Castro-Muñoz, R., Yáñez-Fernández, J and Fíla, V. (2016). Phenolic compounds recovered from agro-food by-products using membrane technologies: An overview. Food Chemistry, 213, doi: /j.foodchem Chauhan, M.K., Varun, Chaudhary, S., Kumar, S and Samar (2011). Life cycle assessment of sugar industry: A review. Renewable and Sustainable Energy Reviews, doi: /j.rser Chen, Z and Wan, C. (2017). Biological valorization strategies for converting lignin into fuels and chemicals. Renewable and Sustainable Energy Reviews, 73, doi: /j.rser Choong, Y.Y., Norli, I., Abdullah, A.Z and Yhaya, M.F. (2016). Impacts of trace element supplementation on the performance of anaerobic digestion process: A critical review. Bioresource Technology, doi: /j.biortech Choudhary, J., Singh, S and Nain, L. (2016). Thermotolerant fermenting yeasts for simultaneous saccharification fermentation of lignocellulosic biomass. Electronic Journal of Biotechnology, doi: /j.ejbt Christofoletti, C.A., Escher, J.P., Correia, J.E., Marinho, J.F.U and Fontanetti, C.S. (2013). Sugarcane vinasse: Environmental implications of its use. Waste Management, 33(12), doi: /j.wasman Chu, B.C.H and Lee, H. (2007). Genetic improvement of Saccharomyces cerevisiae for xylose fermentation. Biotechnology Advances, 25(5), doi: /j.biotechadv Contino, F., Foucher, F., Mounaïm-Rousselle, C and Jeanmart, H. (2011). Combustion characteristics of tricomponent fuel blends of ethyl acetate, ethyl propionate, and ethyl butyrate in homogeneous charge compression ignition (HCCI). Energy and Fuels, 25(4), doi: /ef200193q. Da Costa Gomez, C. (2013). Biogas as an energy option: an overview, The biogas handbook Science, production and applications. Woodhead Publishing Limited. doi: / frontmatter. Cruz-Salomón, A., Meza-Gordillo, R., Rosales-Quintero, A., Ventura-Canseco, C., Lagunas-Rivera, S and Carrasco-Cervantes, J. (2017). Biogas production from a native beverage vinasse using a modified UASB bioreactor. Fuel, 198, doi: /j.fuel Dima, A., Boura, K., Bekatorou, A., Stergiou, P.Y., Foukis, A., Gkini, O.A., Kandylis, P., Pissaridi, K., Kanellaki, M., Papamichael, E.M and Koutinas, A.A. (2017). Scale-up for esters production from straw whiskers for biofuel applications. Bioresource

173 Technology, 242, doi: /j.biortech Βιβλιογραφία Djekic, I and Tomasevic, I. (2016). Environmental impacts of the meat chain Current status and future perspectives. Trends in Food Science & Technology, 54, doi: /j.tifs Fagbohungbe, M.O., Herbert, B.M.J., Hurst, L., Li, H., Usmani, S.Q and Semple, K.T. (2016). Impact of biochar on the anaerobic digestion of citrus peel waste. Bioresource Technology, 216, doi: /j.biortech Figueiredo, P., Lintinen, K., Hirvonen, J.T., Kostiainen, M.A., Santos, H.A. (2018). Properties and chemical modifications of lignin: Towards lignin-based nanomaterials for biomedical applications. Progress in Materials Science, 93, Foukis, A., Gkini, O.A., Stergiou, P.Y., Sakkas, V.A., Dima, A., Boura, K., Koutinas, A and Papamichael, E.M. (2017). Sustainable production of a new generation biofuel by lipase-catalyzed esterification of fatty acids from liquid industrial waste biomass. Bioresource Technology, 238, doi: /j.biortech Galanakis, C.M. (2012). Recovery of high added-value components from food wastes: Conventional, emerging technologies and commercialized applications. Trends in Food Science and Technology, 26(2), doi: /j.tifs Gaurav, N., Sivasankari, S., Kiran, G.S., Ninawe, A and Selvin, J. (2017). Utilization of bioresources for sustainable biofuels: A Review. Renewable and Sustainable Energy Reviews, doi: /j.rser Hayes, C.J., Burgess, D.R and Manion, J.A. (2015). Combustion pathways of biofuel model compounds: A review of recent research and current challenges pertaining to first-, second-, and third-generation biofuels. Advances in Physical Organic Chemistry, doi: /bs.apoc Huszcza, E and Bartmańska, A. (2008). The implication of yeast in debittering of spent hops. Enzyme and Microbial Technology, 42(5), doi: /j.enzmictec Jankowska, E., Chwialkowska, J., Stodolny, M and Oleskowicz-Popiel, P. (2015). Effect of ph and retention time on volatile fatty acids production during mixed culture fermentation. Bioresource Technology, 190, doi: /j.biortech Ji, X and Long, X. (2016). A review of the ecological and socioeconomic effects of biofuel and energy policy recommendations. Renewable and Sustainable Energy Reviews, doi: /j.rser Jia, Z., Dumont, M.-J and Orsat, V. (2016). Encapsulation of phenolic compounds present in plants using protein matrices. Food Bioscience, 15, doi: doi.org/ /j.fbio Kamali, M., Gameiro, T., Costa, M.E.V and Capela, I. (2016). Anaerobic digestion of pulp and paper mill wastes - An overview of the developments and improvement opportunities. Chemical Engineering Journal, doi: /j.cej Kana, K., Kanellaki, M., Psarianos, C and Koutinas, A. (1989). Ethanol production by Saccharomyces cerevisiae immobilized on mineral Kissiris. Journal of Fermentation and Bioengineering, 68(2), doi: / X(89) Kandylis, P., Bekatorou, A., Pissaridi, K., Lappa, K., Dima, A., Kanellaki, M and Koutinas, A.A. (2016). Acidogenesis of cellulosic hydrolysates for new generation biofuels. Biomass and Bioenergy, 91, doi: /j.biombioe

174 174 Βιβλιογραφία Kanellaki, M., Koutinas, a a, Kana, K., Nicolopoulou, M., Papadimitriou, a and Lycourghiotis, a (1989). Ethanol production by Saccharomyces cerevisiae promoted by gamma-alumina. Biotechnology and bioengineering, 34(1), doi: /bit Kim, S and Dale, B.E. (2004). Global potential bioethanol production from wasted crops and crop residues. Biomass and Bioenergy, 26(4), doi: /j.biombioe Kim, S.R., Park, Y.C., Jin, Y.S and Seo, J.H. (2013). Strain engineering of Saccharomyces cerevisiae for enhanced xylose metabolism. Biotechnology Advances, 31(6), doi: /j.biotechadv Kosseva, M. R. (2011) Management and Processing of Food Wastes, in Comprehensive Biotechnology. Second Edi. Elsevier B.V., pp doi: /B Kourkoutas, Y., Bekatorou, A., Banat, I.M., Marchant, R and Koutinas, A.A. (2004). Immobilization technologies and support materials suitable in alcohol beverages production: A review. Food Microbiology, 21(4), doi: /j.fm Koutinas, A.A., Sypsas, V., Kandylis, P., Michelis, A., Bekatorou, A., Kourkoutas, Y., Kordulis, C., Lycourghiotis, A., Banat, I.M., Nigam, P., Marchant, R., Giannouli, M and Yianoulis, P. (2012). Nano-tubular cellulose for bioprocess technology development. PLoS ONE, 7(4), e doi: /journal.pone Koutinas, A.A., Toutoutzidakis, G., Kana, K and Kouinis, I. (1991). Methane fermentation promoted by γ-alumina pellets. Journal of Fermentation and Bioengineering, 72(1), doi: / X(91)90149-B. Koutinas, A.A., Tsoutsas, T and Kaliafas, A. (1994). Anaerobic bioconversion of sucrose to biogas promoted by the mineral Kissiris. Process Biochemistry, 29(4), doi: / (94) Koutinas, A., Kanellaki, M., Bekatorou, A., Kandylis, P., Pissaridi, K., Dima, A., Boura, K., Lappa, K., Tsafrakidou, P., Stergiou, P.-Y.Y., Foukis, A., Gkini, O.A and Papamichael, E.M. (2016). Economic evaluation of technology for a new generation biofuel production using wastes. Bioresource Technology, 200, doi: /j.biortech Kuhad, R.C., Gupta, R., Khasa, Y.P., Singh, A and Zhang, Y.H.P. (2011). Bioethanol production from pentose sugars: Current status and future prospects. Renewable and Sustainable Energy Reviews, 15(9), doi: /j.rser Kumar, G.R and Chowdhary, N. (2016). Biotechnological and bioinformatics approaches for augmentation of biohydrogen production: A review. Renewable and Sustainable Energy Reviews, doi: /j.rser Kumar, M.N., Gialleli, A.-I., Bekatorou, A., Koutinas, A.A and Kanellaki, M. (2016). Application of nano/micro-tubular cellulose of Indian origin for alcoholic fermentation and cold pasteurization of contaminated water. LWT - Food Science and Technology, 69, doi: /j.lwt Kumar, M.N., Gialleli, A.-I., Masson, J.B., Kandylis, P., Bekatorou, A., Koutinas, A.A and Kanellaki, M. (2014). Lactic acid fermentation by cells immobilised on various porous cellulosic materials and their alginate/poly-lactic acid composites. Bioresource technology, 165, doi: /j.biortech Kumar, P., Barrett, D.M., Delwiche, M.J and Stroeve, P. (2009). Methods for

175 175 Βιβλιογραφία pretreatment of lignocellulosic biomass for eficient hydrolysis and biofuel production. Industrial and Engineering Chemistry, 48(8), doi: /ie801542g. Kuo, Y.C., Yuan, S.F., Wang, C.A., Huang, Y.J., Guo, G.L and Hwang, W.S. (2015). Production of optically pure l-lactic acid from lignocellulosic hydrolysate by using a newly isolated and d-lactate dehydrogenase gene-deficient Lactobacillus paracasei strain. Bioresource Technology, 198, doi: /j.biortech Lappa, K., Kandylis, P., Bastas, N., Klaoudatos, S., Athanasopoulos, N., Bekatorou, A., Kanellaki, M and Koutinas, A.A. (2015a). New generation biofuel: continuous acidogenesis of sucrose-raffinose mixture simulating vinasse is promoted by γ- alumina pellets. Biotechnology for Biofuels, 8(1), doi: /s Lappa, K., Kandylis, P., Bekatorou, A., Bastas, N., Klaoudatos, S., Athanasopoulos, N., Kanellaki, M and Koutinas, A.A. (2015b). Continuous acidogenesis of sucrose, raffinose and vinasse using mineral kissiris as promoter. Bioresource Technology, 188(11), doi: /j.biortech Limayem, A and Ricke, S.C. (2012). Lignocellulosic biomass for bioethanol production: Current perspectives, potential issues and future prospects. Progress in Energy and Combustion Science, doi: /j.pecs Liu, H., Jiang, G.M., Zhuang, H.Y and Wang, K.J. (2008). Distribution, utilization structure and potential of biomass resources in rural China: With special references of crop residues. Renewable and Sustainable Energy Reviews, 12(5), doi: /j.rser Lutpi, N.A., Md Jahim, J., Mumtaz, T., Harun, S and Abdul, P.M. (2016). Batch and continuous thermophilic hydrogen fermentation of sucrose using anaerobic sludge from palm oil mill effluent via immobilisation technique. Process Biochemistry, 51(2), doi: /j.procbio Maiti, S., Brar, S. K., Verma, M., Soccol, C. R. and Maiti, D. C. (2016) Chapter 7 - Butyric Acid: A Platform Chemical for Biofuel and High-Value Biochemicals BT - Platform Chemical Biorefinery, in. Amsterdam: Elsevier, pp doi: Mao, C., Feng, Y., Wang, X and Ren, G. (2015). Review on research achievements of biogas from anaerobic digestion. Renewable and Sustainable Energy Reviews, doi: /j.rser Maphosa, Y and Jideani, V.A. (2016). Dietary fiber extraction for human nutrition A review. Food Reviews International, 32(1), doi: / Mirabella, N., Castellani, V and Sala, S. (2014). Current options for the valorization of food manufacturing waste: A review. Journal of Cleaner Production, 65, doi: /j.jclepro Mussatto, S.I., Dragone, G and Roberto, I.C. (2006). Brewers spent grain: Generation, characteristics and potential applications. Journal of Cereal Science, 43(1), doi: /j.jcs Naik, S.N., Goud, V.V., Rout, P.K and Dalai, A.K. (2010). Production of first and second generation biofuels: A comprehensive review. Renewable and Sustainable Energy Reviews, 14(2), doi: /j.rser Jahanshahi, M., Najafpour, G., CHAPTER 17 - Advanced Downstream Processing in Biotechnology BT - Biochemical Engineering and Biotechnology. Elsevier,

176 176 Βιβλιογραφία Amsterdam, pp doi: Ohnishi, A., Hasegawa, Y., Abe, S., Bando, Y., Fujimoto, N and Suzuki, M. (2012). Hydrogen fermentation using lactate as the sole carbon source: Solution for blind spots in biofuel production. Rsc Advances, 2(22), doi: /c2ra20590d. Olajire, A.A. (2012). The brewing industry and environmental challenges. Journal of Cleaner Production., doi: /j.jclepro Panda, S.K., Mishra, S.S., Kayitesi, E and Ray, R.C. (2016). Microbial-processing of fruit and vegetable wastes for production of vital enzymes and organic acids: Biotechnology and scopes. Environmental Research, 146, doi: /j.envres Pandey, A., Soccol, C.R., Nigam, P and Soccol, V.T. (2000). Biotechnological potential of agro-industrial residues.i: Sugarcane bagasse. Bioresource Technology, doi: /S (99)00142-X. Patel, M and Kumar, A. (2016). Production of renewable diesel through the hydroprocessing of lignocellulosic biomass-derived bio-oil: A review. Renewable and Sustainable Energy Reviews, 58, doi: /j.rser Piloto-Rodríguez, R., Sánchez-Borroto, Y., Melo-Espinosa, E.A and Verhelst, S. (2017). Assessment of diesel engine performance when fueled with biodiesel from algae and microalgae: An overview. Renewable and Sustainable Energy Reviews, 69, doi: /j.rser Prado, J.M., Lachos-Perez, D., Forster-Carneiro, T and Rostagno, M.A. (2016). Sub- A nd supercritical water hydrolysis of agricultural and food industry residues for the production of fermentable sugars: A review. Food and Bioproducts Processing, 98, doi: /j.fbp Prazeres, A.R., Carvalho, F and Rivas, J. (2012). Cheese whey management: A review. Journal of Environmental Management, 110, doi: /j.jenvman Rai, P.K and Singh, S.P. (2016). Integrated dark- and photo-fermentation: Recent advances and provisions for improvement. International Journal of Hydrogen Energy, 41(44), doi: /j.ijhydene Rajagopal, R., Massé, D.I and Singh, G. (2013). A critical review on inhibition of anaerobic digestion process by excess ammonia. Bioresource Technology, doi: /j.biortech Ravindran, R and Jaiswal, A.K. (2016). A comprehensive review on pre-treatment strategy for lignocellulosic food industry waste: Challenges and opportunities. Bioresource Technology, doi: /j.biortech Rayner, A.J., Briggs, J., Tremback, R and Clemmer, R.M.C. (2017). Design of an organic waste power plant coupling anaerobic digestion and solid oxide fuel cell technologies. Renewable and Sustainable Energy Reviews, 71, doi: /j.rser Ren, N.Q., Zhao, L., Chen, C., Guo, W.Q and Cao, G.L. (2016). A review on bioconversion of lignocellulosic biomass to H2: Key challenges and new insights. Bioresource Technology, doi: /j.biortech Ren, N., Wang, B and Huang, J.C. (1997). Ethanol-type fermentation from carbohydrate in high rate acidogenic reactor. Biotechnology and Bioengineering, 54(5), doi: /(SICI) ( )54:5<428::AID-BIT3>3.0.CO;2-G.

177 177 Βιβλιογραφία Simate, G.S., Cluett, J., Iyuke, S.E., Musapatika, E.T., Ndlovu, S., Walubita, L.F and Alvarez, A.E. (2011). The treatment of brewery wastewater for reuse: State of the art. Desalination, doi: /j.desal Sindhu, R., Binod, P and Pandey, A. (2016). Biological pretreatment of lignocellulosic biomass - An overview. Bioresource Technology, 199, doi: /j.biortech Singh, L and Wahid, Z.A. (2015). Methods for enhancing bio-hydrogen production from biological process: A review. Journal of Industrial and Engineering Chemistry, 21, doi: /j.jiec Sitepu, I.R., Garay, L.A., Sestric, R., Levin, D., Block, D.E., German, J.B and Boundy- Mills, K.L. (2014). Oleaginous yeasts for biodiesel: Current and future trends in biology and production. Biotechnology Advances, 32(7), doi: /j.biotechadv Stamatelatou, K., Antonopoulou, G and Lyberatos, G. (2011) Production of biogas via anaerobic digestion BT - Handbook of Biofuels Production. in Woodhead Publishing Series in Energy, doi: Stamatelatou, K., Antonopoulou, G and Michailides, P. (2014). Biomethane and biohydrogen production via anaerobic digestion/fermentation. A2 - Waldron, Keith BT - Advances in Biorefineries. In Woodhead Publishing, pp Stergiou, P.Y., Foukis, A., Filippou, M., Koukouritaki, M., Parapouli, M., Theodorou, L.G., Hatziloukas, E., Afendra, A., Pandey, A and Papamichael, E.M. (2013). Advances in lipase-catalyzed esterification reactions. Biotechnology Advances, 31(8), doi: /j.biotechadv Straathof, A.J. (2011) The Proportion of Downstream Costs in Fermentative Production Processes. Second Edi, Comprehensive Biotechnology. Elsevier B.V. doi: /B X. Sun, Y and Cheng, J. (2002). Hydrolysis of lignocellulosic materials for ethanol production: a review. Bioresource technology, 83(1), doi: /S (01) Syngiridis, K., Bekatorou, A., Kallis, M., Kandylis, P., Kanellaki, M and Koutinas, A.A. (2013). γ-alumina as a process advancing tool for a new generation biofuel. Bioresource Technology, 132, doi: /j.biortech Syngiridis, K., Bekatorou, A., Kandylis, P., Larroche, C., Kanellaki, M and Koutinas, A.A. (2014). Favouring butyrate production for a new generation biofuel by acidogenic glucose fermentation using cells immobilised on γ-alumina. Bioresource Technology, 161, doi: /j.biortech Thanh, P.M., Ketheesan, B., Yan, Z and Stuckey, D. (2016). Trace metal speciation and bioavailability in anaerobic digestion: A review. Biotechnology Advances, 34(2), doi: /j.biotechadv Tsoutsas, T., Kanellaki, M., Psarianos, C., Kalliafas, A and Koutinas, A.A. (1990). Kissiris: A mineral support for the promotion of ethanol fermentation by Saccharomyces cerevisiae. Journal of Fermentation and Bioengineering, 69(2), doi: / X(90) Umpuch, C. et al., Removal of contaminated organic acids from simulated succinic acid fermentation broth by reactive extraction process: Single- and mixedsolute solution. Separation Science and Technology, 51(4), pp

178 Βιβλιογραφία Veluchamy, C., Raju, V.W and Kalamdhad, A.S. (2017). Prerequisite An electrohydrolysis pretreatment for anaerobic digestion of lignocellulose waste material. Bioresource Technology, 235, doi: /j.biortech Verma, P and Sharma, M.P. (2016). Review of process parameters for biodiesel production from different feedstocks. Renewable and Sustainable Energy Reviews, 62, doi: /j.rser Voloshin, R.A., Rodionova, M.V., Zharmukhamedov, S.K., Nejat Veziroglu, T and Allakhverdiev, S.I. (2016). Review: Biofuel production from plant and algal biomass. International Journal of Hydrogen Energy, doi: /j.ijhydene Yadav, J.S.S., Yan, S., Pilli, S., Kumar, L., Tyagi, R.D and Surampalli, R.Y. (2015). Cheese whey: A potential resource to transform into bioprotein, functional/nutritional proteins and bioactive peptides. Biotechnology Advances, doi: /j.biotechadv Yang, X., Choi, H.S., Park, C and Kim, S.W. (2015). Current states and prospects of organic waste utilization for biorefineries. Renewable and Sustainable Energy Reviews, 49, doi: /j.rser Yuan, H and Zhu, N. (2016). Progress in inhibition mechanisms and process control of intermediates and by-products in sewage sludge anaerobic digestion. Renewable and Sustainable Energy Reviews, doi: /j.rser Zheng, J., Tashiro, Y., Wang, Q and Sonomoto, K. (2015). Recent advances to improve fermentative butanol production: Genetic engineering and fermentation technology. Journal of Bioscience and Bioengineering, 119(1), 1 9. doi: /j.jbiosc Zuloaga, O., Navarro, P., Bizkarguenaga, E., Iparraguirre, A., Vallejo, A., Olivares, M and Prieto, A. (2012). Overview of extraction, clean-up and detection techniques for the determination of organic pollutants in sewage sludge: A review. Analytica Chimica Acta, 736, doi: /j.aca ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΕΣ ΔΙΑΤΡΙΒΕΣ Μπούρα Κ Παραγωγή οργανικών οξέων από τυρόγαλο παρουσία κίσσηρης και γ-αλουμίνας ως προωθητές. Διδακτορική διατριβή υποβληθείσα στο Πανεπιστήμιο Πατρών στο Τμήμα Χημείας. Τσαφρακίδου Π Παραγωγή οργανικών οξέων από λιγνινοκυτταρινούχα συστατικά με τη χρήση γ-αλουμίνας ως προωθητή. Διδακτορική διατριβή υποβληθείσα στο Πανεπιστήμιο Πατρών στο Τμήμα Χημείας. 4.3 ΔΙΑΔΙΚΤΥΟΓΡΑΦΙΑ 1) 178

179 Δημοσιεύσεις ΔΗΜΟΣΙΕΥΣΕΙΣ 179

180 180 Δημοσιεύσεις

181 181 Δημοσιεύσεις

182 182 Δημοσιεύσεις

183 183 Δημοσιεύσεις

184 184 Δημοσιεύσεις

185 Βιογραφικό ΒΙΟΓΡΑΦΙΚΟ ΣΗΜΕΙΩΜΑ ΠΡΟΣΩΠΙΚΕΣ ΠΛΗΡΟΦΟΡΙΕΣ ΕΠΑΓΓΕΛΜΑΤΙΚΗ ΕΜΠΕΙΡΙΑ Αγάπη Δήμα Χημικος, MSc, PhD 9, Θεοδότου, Πάτρα, (Ελλάδα) Ημερομηνία γέννησης 10/01/ /09/ /7/2018 Βοηθός εργαστηρίου (επικουρικό έργο ως υποψήφια διδάκτορας), Πανεπιστήμιο Πατρών, Τμήμα Χημείας, Πάτρα Διδασκαλία εργαστηριακών ασκήσεων Χημείας Τροφίμων και Οινολογίας-Τεχνολογίας Τροφίμων Επιτήρηση φοιτητών κατά τη διεξαγωγή εξετάσεων Επίβλεψη φοιτητών κατά την εκπόνηση των διπλωματικών τους εργασιών στη Βιοτεχνολογία Τροφίμων Οργάνωση αναλώσιμων υλικών και επικοινωνία με προμηθευτές Δημιουργία παρουσιάσεων σε συνέδρια 27/02/ /06/2015 Επιστημονική Συνεργάτης, Πανεπιστήμιο Πατρών, Τμήμα Χημείας, Εργαστήριο Βιοτεχνολογίας Τροφίμων, Πάτρα - Συμμετοχή ως χημικός ερευνητής σε έργο ΕΣΠΑ με τίτλο «Αγροτοβιομηχανικά υγρά και στερεά απόβλητα ως πρώτες ύλες για την παραγωγή μιας νέας γενιάς βιοκαυσίμου» Πειραματική μελέτη για την εύρεση των βέλτιστων συνθηκών για ζυμώσεις αγροτοβιομηχανικών αποβλήτων Μελέτη διαχωρισμού και απομόνωσης των παραγόμενων οξέων από τις ζυμώσεις οξεογένεσης (εκχύλιση, εστεροποίηση) Οργάνωση αποτελεσμάτων 1/09/ /05/2007 Τηλεφωνήτρια, Οργανισμός Τηλεπικοινωνιών Ελλάδος (Τηλεφωνήτρια στο κέντρο αναγγελίας βλαβών) 25/10/ /2/2006 Πρακτική εξάσκηση στην οινοποιία «ΟΙΝΙΚΗ- Γεώργιος Καρέλας ΑΒΕΕ» (Ποιοτικός και ποσοτικός έλεγχος των προϊόντων καθ όλη τη διάρκεια της παραγωγής - Δειγματοληψία και χημικές αναλύσεις) ΕΚΠΑΙΔΕΥΣΗ ΚΑΙ ΚΑΤΑΡΤΙΣΗ 25/04/2013 σήμερα Υποψήφια Διδάκτωρ στη Βιοτεχνολογία Τροφίμων (ΟΛΟΚΛΗΡΩΜΕΝΕΣ ΥΠΟΧΡΕΩΣΕΙΣ/ ΣΤΑΔΙΟ ΔΙΟΡΘΩΣΗΣ ΤΗΣ ΔΙΑΤΡΙΒΗΣ), Πανεπιστήμιο Πατρών, Τμήμα Χημείας, Πάτρα (Ελλάδα). Τίτλος Διατριβής: «Παραγωγή οργανικών οξέων από κυτταρινούχο βιομάζα με τη χρήση κίσσηρης ως 185