H επίδραση του οικογενειακού περιβάλλοντος στην σύσταση της εντερικής μικροβιακής χλωρίδας

Transcript

1 Πανεπιστήμιο Πατρών, Σχολή Επιστημών Υγείας, Τμήμα Ιατρικής ΠΜΣ Βασικές Ιατρικές Επιστήμες Εργαστήριο Υγιεινής Διπλωματική Εργασία H επίδραση του οικογενειακού περιβάλλοντος στην σύσταση της εντερικής μικροβιακής χλωρίδας Μαριάννα Ζαππή Κλινική Διαιτολόγος-Διατροφολόγος Πάτρα, Μάϊος 2013

2 Η παρούσα διπλωματική εργασία εκπονήθηκε στα πλαίσια των σπουδών για την απόκτηση του μεταπτυχιακού διπλώματος ειδίκευσης που απονέμει το Μεταπτυχιακό Πρόγραμμα Σπουδων Εφαρμογές Βασικών Ιατρικών Επιστημών Εξεταστική Επιτροπή Βανταράκης Απόστολος (επιβλέπων καθηγητής) Ζαρκάδης Ιωάννης Παπαχατζοπούλου Αδαμαντία 2

3 Ευχαριστίες Θα ήθελα να ευχαριστήσω ιδιαίτερα τον επιβλέποντα καθηγητή μου, κ. Βανταράκη Απόστολο, για την αποδοχή στο εργαστήριο του προκειμένου να εκπονήσω την μεταπτυχιακή διπλωματική μου εργασία. Η συνεργασία, η βοήθεια και η καθοδήγησή του δημιούργησαν τις κατάλληλες συνθήκες για να ολοκληρωθεί η παρούσα προσπάθεια. Επίσης, θερμά θα ήθελα να ευχαριστήσω όλους τους συντελεστές του Εργαστηρίου Υγιεινής, και πιο συγκεκριμένα τον κ.ζήρο Πάνο για την συμβολή του στο πειραματικό μέρος και τις πάντα κατατοπιστικές κατευθυντήριες οδηγίες, τον κ.κόκκινο Πέτρο, την δίδα Μπίρμπα Αγγελική και την δίδα Κούγια Έφη. Η βοήθεια τους, η υπομονή τους σε κάθε απορία, το ενδιαφέρον και ο ζήλος τους υπήρξαν υποστήριξη ανεκτίμητης αξίας. Ακόμα, θα ήθελα να ευχαριστήσω το Επιστημονικό Συμβούλιο του Γενικού Νοσοκομείου Πατρών «ο Άγιος Ανδρέας» που ενέκρινε την πραγματοποίηση αυτής της μελέτης. Τέλος, οφείλω ένα μεγάλο ευχαριστώ σε όλους όσους εθελοντικά συμμετείχαν στην έρευνα αυτή, για την βοήθεια και την εμπιστοσύνη που μου έδειξαν. 3

4 Περίληψη Η εντερική χλωρίδα θα μπορούσε να περιγραφεί ως ένα μικροβιακό όργανο, μείζονος σημασίας για την ομοιόσταση του οργανισμού, εξαιτίας της συμμετοχής του σε πολλαπλές και διαφορετικές λειτουργιές όπως η πέψη, η απορρόφηση των θρεπτικών συστατικών, η αποβολή των άχρηστων ουσιών και η φυσική ανοσία. Η σύστασή της έχει παρατηρηθεί ότι διαφέρει από άνθρωπο σε άνθρωπο. Ενώ οι κυριότεροι παράγοντες που διαμορφώνουν το τελικό μικροβιακό περιεχόμενο περιλαμβάνουν την ηλικία, το περιβάλλον, τις διαιτητικές συνήθειες, το γενετικό υπόβαθρο, την καταγωγή, την χρήση αντιβιοτικών, πρεβιοτικών ή προβιοτικών, την έκθεση σε ποικιλλία μικροβίων και τις χειρουργικές επεμβάσεις. Η ανθρώπινη εντερική χλωρίδα αποτελείται κατά κύριο λόγο από μόλις τέσσερα φύλα βακτηρίων, τα Bacteroidetes (23%), τα Firmicutes (64%), τα Actinobacteria (3%), και τα Proteobacteria (8%). Τα τελευταία χρόνια αρκετό είναι το ερευνητικό ενδιαφέρον στην μελέτη της σχέσης μεταξύ της σύνθεσης της εντερικής χλωρίδας και της παχυσαρκίας. Η έρευνα των πιθανών μηχανισμών αλληλεπίδρασης του μικροβιακού περιεχομένου και του ξενιστή εκτελείσεται τόσο με την χρήση πειραματοζώων όσο και σε ανθρώπινο επίπεδο. Έχει αποδειχθεί ότι σε παχύσαρκα άτομα υπάρχει χαμηλότερο ποσοστό Bacteroidetes και μεγαλύτερο Firmicutes, σε σύγκριση με άτομα κανονικού βάρους. Αν και έχουν επίσης διατυπωθεί αντίθετα αποτελέσματα. Οι διαιτητικές συνήθεις είναι ένας από τους κύριους παράγοντες που επηρεάζουν την σύσταση της εντερικής χλωρίδας. Παράλληλα, είναι γνωστό ότι το μοντέλο της οικογένειας και το γονεϊκό πρότυπο είναι καθοριστικής σημασίας στην διαμόρφωση διαιτητικών και διατροφικών επιλογών. Στην παρούσα μελέτη στόχος ήταν να ερευνήσουμε την επιρροή του οικογενειακού περιβάλλοντος, της μεσογειακής διατροφής και της παχυσαρκίας στην σύσταση της εντερικής χλωρίδας. 4

5 Στην έρευνα συμμετείχαν 35 άτομα, από 12 οικογένειες, ηλικίας από 18 ετών έως και 77 ετών. Όλοι είναι μέλη οικογενειών που κατοικούν στην περιοχή της Πάτρας, και αφού πληροφορήθηκαν εκτενώς για τον σκοπό και την μεθεδολογιά της, συνένεσαν εθελοντικά. Μετρήθηκαν τα ανθρωπομετρικά χαρακτηριστικά κάθε εθελοντή, και υπολογίστηκε ο δείκτης μάζας σώματος (ΔΜΣ), καταγράφηκαν, μέσω ερωτηματολογίων, δημογραφικά, κοινωνικοοικονομικά στοιχεία και οι διαιτητικές-διατροφικές τους συνήθειες. Ακόμα έγινε συλλογή κοπράνων, από όπου απομονώθηκε DNA και αναλύθηκε με την χρήση Real Time PCR. Μετά την στατιστική επεξεργασία, δεν επιβεβαιώθηκε η αρχική εκτίμηση για παρόμοια βακτηριακή κατανομή μεταξύ των μελών της κάθε οικογένειας και τελικά δεν σχετίστηκε στατιστικά σημαντικά η υιοθέτηση της Μεσογειακής διατροφής (MedDiet score) με την σύσταση της εντερικής χλωρίδας. 5

6 Summary The intestinal flora is a microbial organ of major importance for the homeostasis of human organism, because of its participation in multiple and diverse functions such as digestion, absorption of nutrients, elimination of waste products and immunity. Gut flora is affected by various factors, such as the age, environment, dietary habits, host s genotype, origin, using of antibiotics, prebiotics or probiotics, exposure to a variety of microbes and surgeries. Human intestinal flora consists primarily of four bacterial genders: the Bacteroidetes (23%), the Firmicutes (64%), the Actinobacteria (3%), and the Proteobacteria (8%). In the last years, many scientists study the correlation between the gut microbiota and obesity. Although, there are conflicting results, there is evidence that obese people have lower percentage of Bacteroides and higher percentage of Firmicutes, when compared with normal weight. It is known that dietary habits affect the composition of gut flora. Furthermore, it has also been proved that type of family and/or parenting model are crucial factors in shaping dietary and nutritional choices. The objective of this study was to investigate the correlation between the Mediterranean diet, obesity and family s environment with gut microbiota. The survey involved 35 people, from 12 different families, aged from 18 years to 77 years. We measured anthropometric characteristics of each volunteer, calculated body mass index (BMI) and then demographic, socioeconomic data and dietary-nutritional habits were recorded through questionnaires. We collected stool sample from every partitipant, DNA was isolated and analyzed using Real-Time PCR. Statistical analysis did not confirm the initial estimate for similar bacterial distribution among the members of each family, and eventually the adherence to Mediterranean Diet (MedDiet score) was not significally related with changes of the intestinal flora. 6

7 Πίνακας περιεχομένων Ι. Θεωρητικό μέρος Κεφάλαιο πρώτο: Εντερική μικροβιακή χλωρίδα 1.1 Γενικά 1.2 Σύσταση της εντερικής χλωρίδας 1.3 Παράγοντες διαμόρφωσης της εντερικής χλωρίδας Ηλικία Καταγωγή Διατροφικές συνήθειες Γενετικό υπόβαθρο 1.4 Κύριες λειτουργίες Μεταβολική δράση Δράση στα εντερικά επιθηλιακά κύτταρα Προστατευτική δράση 1.5 Αλληλεπίδραση με το ανοσοποιητικό σύστημα Προγεννητική μικροβιακή έκθεση Μεταγεννητική εντερική μικροβιακή σύσταση Ασθένειες και διαταραχές Κεφάλαιο δεύτερο: Παχυσαρκία 2.1 Ορισμός 2.2 Επιδημιολογικά στοιχεία 2.3 Αιτιολογικοί παράγοντες Διατροφή και άσκηση Γενετικοί παράγοντες Άλλοι παράγοντες 2.4 Επιπτώσεις 7

8 Κεφάλαιο τρίτο: Παχυσαρκία και Εντερική χλωρίδα 3.1 Έρευνες σε πειραματόζωα 3.2 Έρευνες σε ανθρώπους 3.3 Μηχανισμοί αλληλεπίδρασης Κεφάλαιο τέταρτο: Διατροφή και Εντερική χλωρίδα 4.1 Μεσογειακή διατροφή 4.2 Μεσογειακή διατροφή και εντερική χλωρίδα 4.3 Αλληλεπίδραση της παχυσαρκίας και της δίαιτας στη σύσταση της εντερικής χλωρίδας 4.4 Σύσταση δίαιτας και εντερική χλωρίδα 4.5 Οικογενειακό περιβάλλον και εντερική χλωρίδα ΙΙ. Υλικά και Μέθοδοι Κεφάλαιο πέμπτο: Χαρακτηριστικά της έρενας 5.1 Σκοπός 5.2 Επιδημιολογικά στοιχεία Πληθυσμός Μετρήσεις, Δειγματοληψία και Ερωτηματολόγια Υπό μελέτη οργανισμοί 5.3 Πειραματική διαδικασία Απομόνωση DNA Φθοριομέτρηση Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης πραγματικού χρόνου (Real-time PCR) 8

9 ΙΙΙ. Αποτελέσματα Κεφάλαιο έκτο: Αποτελέσματα της έρευνας 6.1 Επιδημιολογικά στοιχεία 6.2 Διατροφικά στοιχεία 6.3 Σύγκριση μικροοργανισμών 6.4 Στατιστική ανάλυση των δεδομένων των αποτελεσμάτων Συζήτηση Βιβλιογραφία Παράρτημα 9

10 Ι. Θεωρητικό Μέρος 10

11 Κεφάλαιο πρώτο: Εντερική Μικροβιακή Χλωρίδα Εντερική Μικροβιακή Χλωρίδα 1.1 Γενικά Στον γαστρεντερικό σωλήνα αποικούν διάφοροι μικροοργανισμοί, οι οποίοι τελικά διαμορφώνουν την εντερική μικροβιακή χλωρίδα. Η εντερική χλωρίδα θα μπορούσε να περιγραφεί ως ένα μικροβιακό όργανο, μείζονος σημασίας για την ομοιόσταση του οργανισμού, εξαιτίας της συμμετοχής του σε πολλαπλές και διαφορετικές λειτουργιές όπως η πέψη, η απορρόφηση των θρεπτικών συστατικών, η αποβολή των άχρηστων ουσιών και η φυσική ανοσία (Tsukumo et al., 2009). Στον ανθρώπινο οργανισμό, έχει εκτιμηθεί ότι συναντώνται διαφορετικοί μικροοργανισμοί σε διάφορα μέρη του σώματος όπως η επιφάνεια του δέρματος, το ουρογεννητικό σύστημα, η αναπνευστική οδός και ο γαστρεντερικός σωλήνας, όπου εντοπίζεται και ο μεγαλύτερος αριθμός μικροοργανισμών (Harris et al., 2012). Εικόνα 1.1: Η μικροβιακή χλωρίδα στον ανθρώπινο οργανισμό,σε κάθε μέρος του σώματος που υπάρχει άμεση επαφή με το περιβάλλον (Harris et al., 2012) 11

12 Κεφάλαιο πρώτο: Εντερική Μικροβιακή Χλωρίδα Ο εντερικός αυλός είναι αποστειρωμένος κατά τη γέννηση και στη συνέχεια αποικίζεται με βακτήρια από τη μητέρα και για το περιβάλλον. Η μικροβιακή εντερική χλωρίδα αποτελείται από είδη μικροοργανισμών, κυρίως αναερόβια βακτήρια (Cani et al., 2007). Η πολυπλοκότητα της χλωρίδας του εντέρου αυξάνεται κατά την παιδική ηλικία, και σε ενήλικες τα βακτηριακά γονίδια μπορεί να είναι και 150 φορές περισσότερα από όσα περιέχονται στο ανθρώπινο γονιδίωμα (Bäckhed F., 2011). Ο γαστρεντερικός σωλήνας, αποτελείται από διαφορετικά τμήματα όπως το στόμα, ο οισοφάγος, το στομάχι, το λεπτό και παχύ έντερο. Κάθε ένα από τα τμήματα αυτά έχει μοναδικές φυσιολογικές λειτουργίες και ανατομική δομή, με αποτέλεσμα το μικροβιακό τους περιεχόμενο να διαφέρει σε πολύ μεγάλο βαθμό. Οι χολικές και παγκρεατικές εκκρίσεις εμποδίζουν τον εποικισμό του στομάχου και του λεπτού εντέρου στα περισσότερα βακτήρια. Για τον λόγο αυτό, παρατηρούνται μικρές σχετικά συγκεντρώσεις βακτηρίων, κάποια από τα οποία βρίσκονται προσκολλημένα στα επιθηλιακά κύτταρα και κάποια είναι σε κίνηση. Αντίθετα, στο παχύ έντερο συναντώνται πολύ υψηλές συγκεντρώσεις βακτηρίων, οι οποίες φτάνουν τα κύτταρα/ γραμμάριο ολικού εντερικού περιεχομένου (Guarner et al., 2003, Shanahan F., 2002). εικόνα 1.2: Σχετικές βακτηριακές συγκεντρώσεις, σε διαφορετικές περιοχές του γαστρεντερικού σωλήνα (Tsukumo et al., 2009) 12

13 Κεφάλαιο πρώτο: Εντερική Μικροβιακή Χλωρίδα 1.2 Σύσταση της εντερικής χλωρίδας Η μικροβιακή σύνθεση της εντερικής χλωρίδας αποτελείται κατά κύριο λόγο από μόλις τέσσερα φύλα βακτηρίων, τα Bacteroidetes (23%), τα Firmicutes (64%), τα Actinobacteria (3%), και τα Proteobacteria (8%) (Frank D.N. et al., 2007), καθώς και από μερικά Αρχαία, Ευκαρυώτες, και ιούς (Lee et al., 2010). Τα κυρίαρχα, από τα 70 φύλα που συναντώνται σε κάθε οργανισμό, είναι εκείνα των Bacteroidetes και Firmicutes αντιπροσωπεύοντας περισσότερο από το 90% του συνολικού βακτηριακού πληθυσμού. Επίσης, έχει ταυτοποιηθεί ότι το Methanobrevibacter smithii είναι το επικρατέστερο από τα είδη των Αρχαίων (Angelakis et al., 2012). Εικόνα 1.3: Σχηματική ποσοτική απεικόνιση των κυρίαρχων φύλων της εντερική χλωρίδας (Sun et al., 2010) Το 95% όσων βακτηρίων κατηγοριοποιούνται στο φύλο Firmicutes ανήκει στην οικόγενεια Clodridia, ενώ τα Bacteroidetes αποτελούνται από 4 κύρια είδη: B. thetaiomicron, B. vulgaris, B. distasonis και B. fragilis (Gill et al.,2006). Τα άλλα φύλα βακτηρίων υπάρχουν σε μικρούς πληθυσμούς. 13

14 Κεφάλαιο πρώτο: Εντερική Μικροβιακή Χλωρίδα Εξαιτίας των αναερόβιων συνθηκών που επικρατούν στο παχύ έντερο, βρίσκονται σε ιδιαίτερα μεγάλο βαθμό αποκλειστικά αναερόβια γένη όπως, Bacteroides, Eubacterium, Bifidobacterium, Fusobacterium, Peptostreptococcus, Clostridium και Ruminococcus, ενώ αντίθετα αερόβια γένη όπως, Escherichia, Enterobacter, Enterococcus, Lactobacillus, Klebsiella και Proteus σχηματίζουν μικρούς πληθυσμούς ( Tsumuko et al., 2009; Eckburg et al., 2005). εικόνα 1.4: Φυλογενετική ταξινόμηση της ανθρώπινης εντερικής χλωρίδας ( 14

15 Κεφάλαιο πρώτο: Εντερική Μικροβιακή Χλωρίδα Παρακάτω αναφέρονται περισσότερο αναλυτικά ενδεικτικά γένη βακτηριών, που ανήκουν σε καθένα από τα τέσσερα κύρια φύλα. Για το φύλο των Firmicutes, ως αντιπροσωπευτικά θεωρούνται τα γένη Clostridium και Lactobacillus. Το γένος Clostridium ανήκει στην οικογένεια των Clostridiaceae, στην τάξη των Clostridia του φύλου των Firmicutes. Τα βακτήρια αυτού του γένους είναι Gram-θετικά, αναερόβια (με εξαίρεση ορισμένα είδη που είναι μικροαερόφιλα), ενώ μπορούν να σχηματίσουν ενδοσπόρια. Λαμβάνουν σχήμα ράβδου, και παράγουν μια ποικιλία από τοξίνες, ορισμένες θανατηφόρες (Bruggemann et al., 2009). Τα πιο γνωστά παθογόνα είδη για τον άνθρωπο είναι, το C.botulinum που είναι υπεύθυνο για την αλλαντίαση σε βρέφη εξαιτίας της τοξίνης που παράγει, το C.difficile το οποίο μπορεί προκαλέσει κολίτιδα και διάρροια μετά από αντιβιωτική θεραπεία, το C.perfringenes που προκαλεί ποικιλία συμπτωμάτων τροφικής δηλητηρίασης, το C.tetani η αιτία του τετάνου και το C.sordelii το οποίο εξαιρετικά σπάνια μπορεί να προκαλέσει θανατηφόρο λοίμωξη μετά από επέμβαση άμβλωσης (Wells et al., 2006; Meites et al., 2010). Το γένος Lactobacillus ανήκει στην οικογένεια των Lactobacillaceae, στην τάξη των Bacilli του φύλου των Firmicutes. Τα βακτήρια αυτού του γένους είναι επίσης Gram-θετικά, αναερόβια ή μικροαερόφιλα και έχουν σχήμα ράβδου. Έχουν την δυνατότητα μεταβολισμού της λακτόζης και άλλων σακχάρων σε γαλακτικό οξύ, μετατρέποντας το περιβάλλον τους σε όξινο, και με τον τρόπο αυτό αναστέλλουν την ανάπτυξη επιβλαβών βακτηρίων. Ορισμένα είδη Lactobacillus χρησιμοποιούνται για την παραγωγή γιαουρτιού, τυριών, μπύρας, κρασιού, και άλλων τροφίμων όπου απαιτείται ζύμωση. Τα είδη L.casei και L.brevis είναι εκείνα που χρησιμοποιούνται συχνότερα στην παραγωγή μπύρας (Makarova et al.,2006). Τα Lactobacillus έχουν την ιδιότητα να είναι ανθεκτικά σε χαμηλό ph και να διατηρούν την ισορροπία του ph σε φυσιολογικά επίπεδα, όπως για παράδειγμα στην περιοχή της κολπικής κοιλότητας. Παράλληλα, ορισμένα είδη Lactobacillus βρέθηκε να έχουν πιθανές θεραπευτικές ιδιότητες συμπεριλαμβανομένων αντιφλεγμονωδών και 15

16 Κεφάλαιο πρώτο: Εντερική Μικροβιακή Χλωρίδα αντικαρκινικών δράσεων και θεωρούνται προβιοτικά στοιχεία (Chen et al.,2009). Το γένος Bacteroides ανήκει στην οικογένεια των Bacteroidaceae, στην τάξη των Bacteroidetes του φύλου των Bacteroidetes, για το οποίο θα θεωρηθεί αντιπροσωπευτικό. Πρόκειται για Gram-αρνητικά βακτήρια, ανερόβια, που δεν σχηματίζουν ενδοσπόρια, κινητά ή μη κινητά ανάλογα με το είδος, ενώ στις μεμβράνες τους εντοπίζονται σφιγγολιπίδια παρότι είναι σπάνιο σε βακτηριακούς οργανισμούς (Madigan et al.,2005). Έχουν την ικανότητα να διασπούν και να μεταβολίζουν άπεπτους πολυσακχαρίτες κυρίως φυτικές γλυκάνες, παράγωντας ενέργεια (Martens et al.,2008). Ορισμένα είδη, όπως το B.fragillis, μπορούν να είναι ευκαιριακά παθογόνα για τον ανθρώπινο οργανισμό προκαλώντας λοιμώξεις στην περιτοναϊκή κοιλότητα έπειτα από χειρουργική επέμβαση ή με τον σχηματισμό αποστήματος στην σκωληκοειδή απόφυση, ενώ παράλληλα είναι ανθεκτικά σε ποικιλία αντιβιωτικών (Ryan et al., 2004). Για την εκτίμηση του φύλου των Actinobacteria μπορεί να χρησιμοποιηθεί το γένος των Bifidobacterium, το οποίο ανήκει στην οικογένεια των Bifidobacteriaceae της τάξης των Actinobacteria. Περιλαμβάνει Gram-θετικά βακτηρία, αναερόβια, μη κινητά, τα οποία απαντώνται σε διαφορετικές κοιλότητες του ανθρώπινου οργανισμού, όπως ο γαστρεντερικός σωλήνας και το στόμα (Lee et al., 2010). Ορισμένα είδη Bifidobacterium θεωρούνται σημαντικά προβιοτικά και χρησιμοποιούνται στην βιομηχανία τροφίμων, εξαιτίας των ευεργετικών ιδιοτήτων τους στην υγεία. Οι δράσεις τους περιλαμβάνουν την ρύθμιση της εντερικής μικροβιακής ομοιόστασης, την αναστολή εποικισμού από πιθανά παθογόνα βακτήρια, την διαμόρφωση τοπικών και συστηματικών ανοσοποκρίσεων, την παραγωγή βιταμινών και την καταστολή πιθανών προκαρκινικών κυττάρων. Παράλληλα, μπορούν να μεταβολίζουν τους άπεπτους ολιγοσακχαρίτες της διατροφής. Πιο συγκεκριμένα, στα βρέφη τα είδη των Bifidobcterium έχουν συσχετιστεί με την ζύμωση ολογοσακχαριτών του γάλακτος, ενώ στους ενήλικες με την ζύμωση ολιγοσακχαριτών φυτικής προέλευσης (Lee et al., 2010). 16

17 Κεφάλαιο πρώτο: Εντερική Μικροβιακή Χλωρίδα Τέλος, από το φύλο των Proteobacteria, ως αντιπροσωπευτικές συγκντρώσιες λαμβάνονται εκείνες του γένους Enterobacter, της οικογένειας των Enterobacteriaceae που ανήκει στην τάξη των Gammaproteobacteria. Τα Enterobacter είναι ένα γένος Gram-αρνητικών, αναερόβιων, ραβδόμορφων βακτηρίων. Αρκετά είδη τους είναι παθογόνα και προκαλούν ευκαιριακές λοιμώξεις, συνήθως σε ανοσοκατεσταλμένους ασθενείς ή σε εκείνους που χρειάζονται αναπνευστική μηχανική υποστήριξη, με πιο κοινές θέσεις μόλυνσης στο ουροποιητικό και το αναπνευστικό σύστημα. Κλινικής σημασίας θεωρούνται τα είδη E.aerogenes και E.cloacae (Sanders et al., 1997). Επιπρόσθετα, στην πρόσφατη μελέτη των Fei N. and Zhao L., σχετίστηκε η παρουσία του Enterobacter cloacae B29 στην εντρική χλωρίδα ενός νοσηρά παχύσαρκου ατόμου με την ύπαρξη της παχυσαρκίας (Fei et al.,2013). Στην συγκεκριμένη έρευνα, η μείωση των επιπέδων του E.cloacae B29 από 35% σε μη ανιχνεύσιμα επίπεδα, συσχετίστηκε με αντίστοιχη μείωση της ενδοτοξίνης που παράγει, προκαλώντας χρόνια ήπια φλεγμονή, και σημαντική απώλεια στο βάρους του. Ενώ, παρόμοια ήταν τα αποτελέσματα και σε έρευνα με germfree ποντικούς, οι οποίοι σιτίζονταν με διατροφή υψηλή σε λιπαρά (Fei et al., 2013). 17

18 Κεφάλαιο πρώτο: Εντερική Μικροβιακή Χλωρίδα 1.3 Παράγοντες διαμόρφωσης της εντερικής χλωρίδας Αρκετοί είναι οι παράγοντες που θεωρούνται ότι αλληλεπιδρούν με την εντερική χλωρίδα και τελικά την διαφοροποιούν από άνθρωπο σε άνθρωπο (εικόνα 1.5). Οι κυριότεροι περιλαμβάνουν την ηλικία, το περιβάλλον, τις διαιτητικές συνήθειες, το γενετικό υπόβαθρο, την καταγωγή, την χρήση αντιβιοτικών, πρεβιοτικών ή προβιοτικών, την έκθεση σε ποικιλλία μικροβίων και τις χειρουργικές επεμβάσεις (Angelakis et al., 2012; Zhang et al., 2009). Εικόνα 1.5: Παράγοντες που επηρεάζουν την σύνθεση και λειτουργία της ανθρώπινης εντρικής μικροβιακής χλωρίδας (Angelakis et al., 2012) Ηλικία Όπως έχει αναφερθεί και νωρίτερα, κατά τη γέννηση ο εντερικός σωλήνας είναι στείρος από βακτήρια. Με την πάροδο του χρόνου, μέσα από την διαδικασία του εποικισμού που αρχίζει από τις πρώτες ώρες ζωής και 18

19 Κεφάλαιο πρώτο: Εντερική Μικροβιακή Χλωρίδα συνεχίζεται μέχρι την ενηλικίωση, το σώμα τελικά φιλοξενεί πολλά μικροβιακά είδη. Η αρχική εντερική βρεφική χλωρίδα συνήθως κυριαρχείται απο Bifidocteria, ενώ πιστεύεται ότι μετά την ηλικία των δύο ετών μοιάζει πολύ με εκείνη του ενήλικα (Palmer et al., 2007). Παρόλ αυτά, σε παιδιά ηλικίας ενός εως επτά ετών παρουσιάστηκε μεγαλύτερη συγκέντρωση εντεροβακτηρίων σε σχέση με ενήλικες (Hopkins et al., 2001). Επιπλέον, σε μιας μεγάλης κλίμακας μελέτη, παρατηρήθηκαν σημαντικές αλλαγές σε πολλά από τα γένη κατά τη διάρκεια των δύο πρώτων ετών ζωής των παιδιών, αλλά όχι αξιοσημείωτες αλλαγές μεταξύ δύο και δεκαοκτώ ετών, όπου συμπεριλαμβάνονται και σταθερά επίπεδα Bifidobacterium και Lactobacillus (Enck et al., 2009). Επίσης, σε μια άλλη πρόσφατη μελέτη, η σύγκριση της εντερικής χλωρίδας εφήβων με ενήλικες αποκάλυψε στατιστικά σημαντικά μεγαλύτερη συγκέντρωση Bifidobacterium και Clostridium στους έφηβους (Agans et al., 2011). Η σύνθεση της εντερικής χλωρίδας των ενηλίκων μοιάζει να είναι αρκετά σταθερή διαχρονικά, παρά τις μεταβολές που έχει κατά μήκος του εντέρου, και μπορεί να είναι παρόμοια μεταξύ διαφορετικών ανθρώπων (Mackie et al., 1999; Zoetendal et al., 1998). Εικόνα 1.6: αλλαγές στη σύσταση της ανθρώπινης εντερικής χλωρίδας με την πάροδο του χρόνου (Les Laboratoires Nicar, Inc.) 19

20 Κεφάλαιο πρώτο: Εντερική Μικροβιακή Χλωρίδα Με την πάροδο της ηλικίας όμως, διαφαίνεται μειωμένη σταθερότητα στην εντερική μικροβιακή χλωρίδα και αυξημένη ποικιλομορφία (Tiihonen et al., 2010). Σε ηλικιωμένα άτομα, έχει παρατηρηθεί μείωση στον αριθμό των Bacteroides όσο και διαφοροποίηση των ειδών (Woodmansey et al., 2007; 2004). Παράλληλα, η μελέτη τεσσάρων ομάδων Νότιων και Βόρειων ευρωπαίων ανέδειξε μεγαλύτερες ποσότητες enterobacteria σε ηλικιωμένους εθελοντές (Mueller et al., 2006). Τέλος, σε μια άλλη έρευνα, στην οποία χρησιμοποιήθηκαν δεκαεπτά ηλικιωμένοι που διέμεναν σε κλινική, διαπιστώθηκε ότι ο αριθμός των Bacteroidetes ήταν σημαντικά αυξημένος σε σχέση με νεότερους ενήλικες, ενώ είχαν μειωμένες συγκεντρώσεις Bifidobacterium και Clostridium (Zwielehner et al.,2009) Καταγωγή Δεν είναι πλήρως κατανοητό πώς το διαφορετικό περιβάλλον και το μεγάλος εύρος διατροφικών συνηθειών που ακολουθούνται παγκοσμίως έχουν επηρεάσει την ανθρώπινη εντερική χλωρίδα. Ορισμένες επιλογές στην καθημερινότητα ενός ανθρώπου θεωρείται ότι θα μπορούσαν να επηρεάζουν την μικροβιακή σύσταση του εντέρου, αλλά δεν είναι έχει ακόμα γίνει κατανοητός ο μηχανισμός (εικόνα 1.5). Σε μια πολύ μεγάλη μελέτη, όπου συμμετείχαν 124 άτομα από ευρωπαϊκές χώρες (Σκανδιναβικές και Μεσογειακές), βρέθηκε ότι μόνο το ένα τρίτο από τα βακτηριακά γονίδια που βρέθηκαν να διατηρούνται, θα μπορούσε να συνδεθεί με κάποια λειτουργική περιοχή. Σχεδόν το 40% των γονιδίων κάθε ατόμου ήταν κοινό με τουλάχιστον τους μισούς από τους συμμετέχοντες. Από αυτούς, το 99,1% των γονιδίων τους ήταν βακτηριακής προεύλευσης και το υπόλοιπο ήταν κυρίως αρχαία, με μόνο 0,1% να είναι ευκαρυωτικής ή ιικής προέλευσης. Τα αποτελέσματα αυτά οδήγησαν τους συγγραφείς στο συμπέρασμα ότι δεν υπάρχουν σημαντικές διαφοροποιήσεις στην εντερική χλωρίδα ατόμων από κοντινές χώρες (Qin et al.,2010). 20

21 Κεφάλαιο πρώτο: Εντερική Μικροβιακή Χλωρίδα Άλλες έρευνες όμως έχουν δείξει διαφορές στην εντερική χλωρίδα μεταξύ ανθρώπων που ζουν σε βόρειες και νότιες ευρωπαϊκές χώρες. Πιο συγκεκριμένα, έχει παρατηρηθεί ότι βρέφη από χώρες της βόρειας Ευρώπης είχαν υψηλότερες συγκεντρώσεις σε Bifidobacteria, ενώ βρέφη από χώρες της νότιας Ευρώπης είχαν υψηλότερες συγκεντρώσεις σε Bacteroides και Lactobacilli (Fallani et al., 2011). Σε άλλη έρευνα, βρέθηκε ότι η αναλογία των Bifidobacteria ήταν δύο με τρεις φορές υψηλότερη στους Ιταλούς, σε σύγκριση με Γάλλους, Γερμανούς ή Σουηδούς (Mueller et al., 2006). Τέλος, οι μεγαλύτερες διαφορές διαπιστώθηκαν μεταξύ αφρικανών παιδιών (μιας αγροτικής περιοχής) που είχαν περισσότερα Actinobacteria και Bacteroidetes αλλά λιγότερα Firmicutes και Proteobacteria, συγκριτικά με παιδιά από την Ευρώπη. Επιπρόσθετα, τα παιδιά από την Αφρική παρουσίασαν περισσότερα λιπαρά οξέα μικρής αλύσου στην εντερική τους χλωρίδα και κατ επέκταση μεγαλύτερη απελευθέρωση ενέργειας από το εντερικό περιεχόμενο (De Filippo et al., 2010) Διατροφικές συνήθειες Η διαιτητική συμπεριφορά και γενικότερα οι διατροφικές επιλογές θεωρούνται από τους κυριότερους παράγοντες για την ύπαρξη ποικιλομορφίας στην ανθρώπινη εντερική μικροβιακή χλωρίδα (Backhed et al., 2005). Παράλληλα, φαίνεται ότι οι αμυλούχες τροφές είναι εξαιρετικά σημαντικές στην εξελικτική πορεία του ανθρώπου. Αυτό αποδεικνύεται μέσα από το μοντέλο διακύμανσης του αριθμού των αντιγράφων για το γονίδιο της αμυλάσης στο σάλιο, το οποίο συνάδει με αλλαγές στη διατροφή ιστορικά και με τους παράγοντες εξελικτικής πίεσης και επιλογής (Perry et al., 2007). Επίσης αρκετές είναι οι έρευνες που διερευνούν την σχέση μεταξύ συγκεκριμένων συστατικών της διατροφής και την σύσταση της εντερικής χλωρίδας. Ενδεικτικά, τέτοια συστατικά είναι οι υδατάνθρακες, τα λιπίδια, η αναλογία μεταξύ υδατανθράκων και λιπαρών οξέων, οι φυτικές ίνες, και οι 21

22 Κεφάλαιο πρώτο: Εντερική Μικροβιακή Χλωρίδα χορτοφαγικές δίαιτες (De Filippo et al., 2010; Sokol et al., 2008; Duncan et al., 2007; Liszt et al., 2009). Επιπλέον, άλλες έρευνες έχουν διεξαχθεί με σκόπο να μελετήσουν την επίδραση της απώλειας βάρους, μέσα από υποθερμιδική δίαιτα, στην μικροβιακή εντερική σύσταση. Στις περισσότερες, φαίνεται ότι μετά την απώλεια βάρους, στα παχύσαρκα άτομα η εντερικής τους χλωρίδα αλλάζει προσομοιάζοντας εκείνη ατόμων φυσιολογικού βάρους (Santacruz et al., 2009; Ley et al., 2006). Όμως, υπάρχουν και βιβλιογραφικές ανάφορες με αντίθετα αποτελέσματα (Duncan et al., 2008). Τέλος, τόσο τα πρεβιοτικά όσο και τα προβιοτικά έχουν τα τελευταία χρόνια μελετηθεί αρκετά, εξαιτίας της ευεργετικής τους δράση στην υγεία όσων τα καταναλώνουν. Τα πρεβιοτικά είναι άπεπτα συστατικά των τροφίμων, ενώ τα προβιοτικά είναι ζωντανοί μη παθογόνοι μικροοργανισμοί ( 2001). Φαίνεται, λοιπόν, ότι συμβάλλουν στην βελτίωση της υγείας του ξενιστή, μέσα από αλλαγές που προκαλούν στην σύσταση της εντερικής του χλωρίδας (εικονα 1.7 και εικόνα 1.8). Εικόνα 1.7: Σχηματική αναπαράσταση των πιθανών μηχανισμών δράσης των πρεβιοτικών (Ouwehand et al., 2005) 22

23 Κεφάλαιο πρώτο: Εντερική Μικροβιακή Χλωρίδα Σε μελέτες όπου χορηγήθηκαν είτε προβιοτικά είτε πρεβιοτικά παρατηρήθηκαν αλλαγές στην εντερική χλωρίδα, με αύξηση του πληθυσμού συγκεκριμένων βακτηριακών ειδών ή/ και μείωση του πληθυσμού άλλων (Gourbeyre et al., 2011; Bermudez-Brito et al., 2012). Εικόνα 1.8: Οι κυριότερες δράσεις των προβιοτικών (Ferreira et al., 2011) Γενετικό υπόβαθρο Η μικροβιακή χλωρίδα του εντέρου ενός ατόμου μπορεί να διαφέρει σημαντικά από ενός άλλου, και μελέτες που συνέκριναν ενήλικες που είχαν διαφορετικούς βαθμούς συγγένειας έδειξαν ότι ο γονότυπος του ξενιστή είναι περισσότερο σημαντικός από την διατροφή και την ηλικία στην σύσταση της μικροβιακής χλωρίδας του εντέρου (Hopkins et al., 2001; Zoetendal et al., 2001). 23

24 Κεφάλαιο πρώτο: Εντερική Μικροβιακή Χλωρίδα Επίσης, είναι γνωστό ότι οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ των μικροοργανισμών του εντερικού σωλήνα είναι ουσιαστικής σημασίας για τον οργανισμό, διότι μπορούν να ενεργοποιήσουν το ανοσοποιητικό σύστημα μέσα από αλλαγές στην μικροβιακή χλωρίδα. Τα γονίδια του ξενιστή που σχετίζονται με την ανοσία του συνήθως φέρουν μια ποικιλία πολυμορφισμών, παράγοντες που επιδρούν και επηρεάζουν την σύσταση της εντρικής χλωρίδας (Macpherson et al., 2005). Σε μελέτες που χρησιμοποιήθηκαν ποντίκια, αποδείχθηκε ότι η εντερική μικροβιακή χλωρίδα είναι κρίσιμης σημασίας τόσο για την διατήρησης της ομαλής γαστρεντερικής και ανοσοποιητικής λειτουργίας όσο και για την πέψη των θρεπτικών συστατικών. Επιπρόσθετα, ζώα που δεν έχουν μικροβιακή χλωρίδα είναι περισσότερο επιρρεπή σε μολύνσεις και έχουν μειωμένη αγγείωση, μειωμένη ενζυμική δραστηριότητα στην πέψη, μειωμένη παραγωγή κυτοκίνης και μειωμένα επίπεδα ανοσοσφαιρίνης ορού (Shanahan F., 2002). Ακόμα, ο γονότυπος του ξενιστή δύναται να αλλοιώσει την εντερική χλωρίδα μέσα από την διαθεσιμότητα των σημείων προσκόλλησης και των συστατικών που διαθέτει ο ξενιστής. Ενδεικτικά, το βακτήριο Bacteroides thetaiotaomicron ρυθμίζει την παραγωγή γλυκοζυλιωμένων γλυκανών στο εντερικό επιθήλιο τρωκτικών, προκειμένου να καλυφθούν οι ανάγκες των βακτηρίων και να μπορούν να πολλαπλασιαστούν. Με την προϋπόθεση ότι συμβαίνει το ίδιο και στο ανθρώπινο εντερικό επιθήλιο, αυτή η δραστηριότητα μπορεί να επηρρεαστεί από πολυμορφισμούς στα γονίδια των ενζύμων που ευθύνονται για την γλυκοζυλίωση (Becker et al., 2003). Επιπρόσθετα, σε άλλη μελέτη με τρωκτικά, φάνηκε ότι ο γονότυπος του κύριου συμπλόκου ιστοσυμβατότητας (Major Histocompatibility Complex-MHC) επιδρά στα μικρόβια των κοπράνων τους (Toivannen et al., 2001). 24

25 Κεφάλαιο πρώτο: Εντερική Μικροβιακή Χλωρίδα 1.4 Κύριες Λειτουρίες Η μικροβιακή χλωρίδα του εντέρου είναι υπεύθυνη για μια σειρά από λειτουργίες, που εμπλέκονται με την θρέψη, την ανάπτυξη και την υγεία, είναι δηλαδή απαραίτητες για τον ανθρώπινο οργανισμό (εικόνα 1.9). Στις λειτουργίες αυτές περιλαμβάνονται η ζύμωση των άπεπτων υδατανθράκων, η παραγωγή ορισμένων βιταμινών, η ανάπτυξη και ο πολλαπλασιασμός των επιθηλιακών κυττάρων του εντέρου, η αλληλεπίδραση με το ανοσοποιητικό σύστημα για την αναγνώριση και την καταστολή παθογόνων μικροοργανισμών και τέλος, προστατευτικοί μηχανισμοί ενάντια σε ορισμένες ασθένειες (Sears CL. 2005; Guarner et al., 2003). Εικόνα 1.9: Οι λειτουργίες της εντερικής μικροβιακής χλωρίδας (O Hara et al, 2006) Μεταβολική δράση Η πιο βασική μεταβολική λειτουργία της εντερικής χλωρίδας είναι η εκμετάλλευση των άπεπτων υδατανθράκων της διατροφής. Τα βακτήρια που βρίσκονται στο παχύ έντερο παράγωντας και χρησιμοποιώντας διαφορετικά ένζυμα από εκείνα των ανθρώπινων κυττάρων, 25

26 Κεφάλαιο πρώτο: Εντερική Μικροβιακή Χλωρίδα συνεπώς και διαφορετικές μεταβολικές οδούς, μπορούν να διασπάσουν τα υπολείμματα των υδατανθράκων που δεν μπόρεσαν να απορροφηθούν στο λεπτό έντερο. Οι άπεπτοι αυτοί υδατάνθρακές είναι πολυσακχαρίτες και ολιγοσακχαρίτες, όπως κυτταρίνη, ημικυτταρίνη, πηκτίνη, ινουλίνη και άμυλο. Μέσα από την διαδιακασία της σακχαρολυτικής ζύμωσης προκύπτουν μικρής αλύσου λιπαρά οξέα (Short-chain fatty acids, SCFAs), και πιο συγκεκριμένα το βουτυρικό, το προπιονικό και το οξικό οξύ. Αποτέλεσμα αυτών των προϊόντων είναι η παροχή ενέργειας και θρεπτικών συστατικών όπως μαγνήσιο, σίδηρο και ασβέστιο, στον οργανισμό του ξενιστή ( Sanz et al., 2008; Guarner et al., 2003). Σε έρευνα που χρησιμοποιήθηκαν ποντίκια χωρίς εντερική χλωρίδα, οι ερευνητές υπολόγισαν ότι έπρεπε να καταναλώνουν περίπου 30% επιπλέον ενέργεια για να διατηρήσοουν το βάρος τους σταθερό, σε σύγκριση με τα ποντίκια που είχαν κανονική εντερική χλωρίδα (Sears CL, 2005). Τα παραγώμενα SCFAs απορροφώνται σχεδόν εντελώς κατά μήκος του γαστρεντερικού σωλήνα. Έχει παρατηρηθεί όμως πως την ικανότητα διάσπασης των αδιάλυτων πολυσακχαριτών, όπως η κυτταρίνη, έχουν κυρίως γένη του φύλου των Firmicutes και ένα μικρότερο ποσοστό από γένη που ανήκουν στο φύλο των Bacteroides. Ενώ, περισσότερο διαλυτούς ολιγοσακχαρίτες, όπως το άμυλο, μπορούν να διασπάσουν βακτήρια τόσο του φύλου των Bacteroides όπως και του φύλου των Bifidobacterium. Πιο συγκεκριμένα, το βουτυρικό οξύ χρησιμοποιείται από τα εντεροκύτταρα για παροχή ενέργειας και καλύπτει περίπου το 70% των αναγκών, συμβάλλοντας στην ρύθμιση της επιθυλιακής ανάπτυξης και τη διαφοροποίησή τους (Hamer et al., 2008). Τα άλλα δύο λιπαρά οξέα, το οξικό και το προπιονικό οξύ μπορούν να μεταφερθούν στο ήπαρ με την κυκλοφορία του αίματος μέσω της πυλαίας φλέβας. Εκεί, το οξικό οξύ συμμετέχει στην σύνθεση λιπιδίων και χοληστερόλης, ενεργοποιώντας την κυτταροπλασματική συνθετάση του ακέτυλο-συνενζύμου Α S2. Αντίθετα, το προπιονικό οξύ μάλλον αναστέλλει τη λιπογένεση που προκαλεί το οξικό οξύ, τουλάχιστον όπως έχει μελετηθεί σε ηπατοκύτταρα ποντικών (Wolever et al., 1995) (εικόνα 1.10). 26

27 Κεφάλαιο πρώτο: Εντερική Μικροβιακή Χλωρίδα Εικόνα 1.10: Σχηματική απεικόνιση των κύριων μεταβολικών οδών των διατροφικών πολύ-/ολιγο-σακχαριτών και η επίδραση τους στην εντερική χλωρίδα (Sanz et al., 2008) Μια ακόμα μεταβολική δράση είναι ο αναερόβιος μεταβολισμός πρωτεϊνών και πεπτιδίων, όπως ελαστίνη, κολλαγόνο και παγκρεατικά ένζυμα. Σε αυτή την οδό παράγονται επίσης SCFAs, αλλά και τοξικές ουσίες όπως αμμωνία, αμίνες και θειόλες (Guarner et al., 2003). Παράλληλα, είναι γνωστό ότι κατά την επεξεργασία σε υψηλές θερμοκρασίες κρέατος και ψαριού παράγονται ετροκυκλικές αμίνες (Heterocyclic amines, HCAs). Οι ενώσεις αυτές έχουν συσχετιστεί, ως επιβαρυντικοί παράγοντες, με την εμφάνιση μορφών καρκίνου όπως μαστού, παχέος εντέρου και προστάτη. Ο μεταβολισμός τους είναι έργο της εντερικής χλωρίδας και θεωρείται ιδιαίτερης σημασίας, διότι καταστέλλονται πιθανοί καρκινογόνοι παράγοντες. Η πλήρης 27

28 Κεφάλαιο πρώτο: Εντερική Μικροβιακή Χλωρίδα αποφυγή του σχηματισμού τους δεν είναι εφικτή, όμως μειωμένη διαιτητική πρόσληψη πρωτεϊνών μπορεί να περιορίσει την παραγωγή τοξινών (Suqimura T, 2000). Επίσης, η εντερική χλωρίδα συμβάλλει στην σύνθεση βιταμινών, όπως Β1, Β2, Β6, Κ, βιοτίνη και φυλλικό οξύ. Και τέλος, αυξάνει την εντερική απορρόφηση του νερού (Guarner et al., 2003) Δράση στα εντερικά επιθηλιακά κύτταρα Μέσα από την παραγωγή μικρής αλύσου λιπαρών οξέων (SCFAs), τα βακτήρια του εντερικού αυλού φαίνεται να ενισχύουν τον πολλαπλασιασμό των εντερικών επιθηλιακών κυττάρων και να επηρεάζουν την διαφοροποίησή τους (Shanahan, 2002). Όπως αναφέρθηκε και προηγουμένως, από αυτή την μεταβολική δραστηριότητα ο ξενιστής ανακτά ενέργεια και απορροφήσιμα υποστρώματα, ενώ ταυτόχρονα παρέχεται ενέργεια και θρεπτικά συστατικά στα βακτήρια για ανάπτυξη και διαφοροποίηση. Έχει αποδειχθεί ότι τα βακτηριακά κύτταρα μπορούν να μεταβάλλουν την εντερική επιθηλιακή ανάπτυξη αλλάζοντας την έκφραση πρωτεϊνών της κυτταρικής μεμβράνης, όπως για παράδειγμα του μεταφορέα νατρίου/γλυκόζης (Guaner et al., 2003). Έτσι ο εποικισμός του εντέρου αυξάνει την απορρόφηση γλυκόζης. Σε μελέτη με πoντικούς χωρίς εντερική μικροβιακή χλωρίδα, παρατηρήθηκε ότι απαιτείται μεγαλύτερη θερμιδική πρόσληψη για να διατηρήσουν το βάρος τους σταθερό, σε σύγκριση με ομόλογους ποντικούς που είχαν κανονικό μικροβιακό αποικισμό (Backhed et al., 2004). Ακόμα, υπολογίστηκε ότι τα διαθέσιμα υποστρώματα είναι κατά προσέγγιση 20-60γρ υδατανθράκων και 5-20γρ πρωτεϊνών ημερησίως. Η ζύμωση είναι πιο έντονη στο τυφλό και το παχύ έντερο, όπου υπάρχει υψηλή παραγωγή SCFAs, και κατά συνέπεια χαμηλό ph αλλά και ταχεία βακτηριακή ανάπτυξη. Αντίθετα, εξαιτίας της μειωμένης διαθεσιμότητας υδατανθράκων στο σιγμοειδές, συμβαίνει κυρίως διάσπαση πρωτεϊνών και το ph διατηρείται 28

29 Κεφάλαιο πρώτο: Εντερική Μικροβιακή Χλωρίδα σχεδόν ουδέτερο ενώ ο βακτηριακός πληθυσμός παραμένει στάσιμος (Guarner et al., 2003) (εικόνα 1.11). Εικόνα 1.11: Περιοχές ζύμωσης στο παχύ έντερο (Guarner et al., 2003) Τέλος, υπάρχουν ενδείξεις ότι η διαφοροποίηση των επιθηλιακών εντερικών κυττάρων εξαιτίας των SCFAs, δρα προστατευτικά έναντι παθολογικών καταστάσεων όπως η χρόνια ελκώδης κολίτιδα και η καρικινογένεση στο παχύ έντερο, αν και χρειάζεται περισσότερη έρευνα να γίνει προς αυτή την κατεύθυνση (Siavoshian et al., 2000) Προστατευτική δράση Η εντερική βακτηριακή χλωρίδα αποτελεί ένα φυσικό αμυντικό φραγμό του ανθρώπινου οργανισμού, και παράλληλα βρίσκεται σε συνεχή και δυναμική αλληλεπίδραση με το ανοσοποιητικό σύστημα του ξενιστή (Steinhoff, 2005). Η δράση των εντερικών βακτηρίων έχει αποδειχθεί μέσα από συγκριτικές μελέτες ζώων, που είχαν κανονική εντερική μικροβιακή χλωρίδα 29

30 Κεφάλαιο πρώτο: Εντερική Μικροβιακή Χλωρίδα και άλλων χωρίς μικροοργανισμούς. Έτσι, τα germ-free ζώα είναι περισσότερο επιρρεπή σε μολύνσεις, έχουν μικρότερη συγκέντρωση λεμφοκυττάρων στον εντερικό βλεννογόνο και χαμηλότερα επίπεδα ανοσοσφαρινών στο αίμα (Shanahan, 2002). Ωστόσο, εποικισμός της γαστρεντερικής οδού με μικρόβια επαρκεί για να αυξηθεί η σύνθεση του λεμφικού ιστού και να αποκατασταθεί το ανοσοποιητικό σύστημα του βλεννογόνου (Butler et al., 2000; Umesaki et al., 1995). Ακόμα και ο εποικισμός από ένα μόνο είδος, το Bacteroides thetaiotaomicron, σε germ-free ποντίκια φάνηκε να επηρεάζει την έκφραση διαφόρων γονιδίων του ξενιστή που διαμορφώνουν την πρόσληψη θρεπτικών συστατικών, το μεταβολισμό, την αγγειογένεση, τη λειτουργία του φυσικού φραγμού του εντερικού βλεννογόνου και την ανάπτυξη του εντερικού νευρικού συστήματος (Xu et al., 2003). Επίσης, η αλληλεπίδραση μεταξύ των μικροβίων, των εντερικών επιθηλιακών κυττάρων και του λεμφικού ιστού μπορεί να συνεισφέρει στους μηχανισμούς μνήμης του ανοσοποιητικού συστήματος. Παρατηρήθηκε ότι σε germ-free ποντίκια η μνήμη για την καταστολή ενός παθογόνου μικροβίου με συστηματική ανοσολογική απόκριση διατηρείται μόνο μερικές μέρες, ενώ σε ποντίκια με κανονική εντερική χλωρίδας το διάστημα αυτό ήταν μερικοί μήνες (Moreau et al., 1996). Παράλληλα, η εντερική μικροβιακή χλωρίδα εμποδίζει την εγκατάσταση εξωγενών μικροβίων στο εντερικό επιθήλιο και αποτρέπει τον πολλαπλασιασμό ευκαιριακών βακτηρίων, που βρίσκονται μεν στο έντερο αλλά σε περιορισμένο αριθμό. Οι παραπάνω δράσεις φαίνεται ότι επιτυγχάνονται κατ αρχάς μέσα από τον ανταγωνισμό των βακτηρίων για τις θέσεις πρόσδεσης στα εντερικά επιθηλιακά κύτταρα, εμποδίζοντας άλλα παθογόνα βακτήρια. Ένας άλλος τρόπος προστασίας είναι με τον έλεγχο στην διαθεσιμότητα θρεπτικών συστατικών. Τα βακτήρια και ο ξενιστής διατηρώντας συμβιωτική σχέση, αποφεύγουν τον πλεονασμό σε θρεπτικά συστατικά, τα οποία δυνητικά θα μπορούσαν να χρησιμοποιήσουν παθογόνοι μικροοργανισμοί. Ένας τελευταίος μηχανισμός είναι η παραγωγή αντιμικροβιακών ουσιών από τα βακτήρια, τις βακτηριοκίνες, που μπορούν να περιορίσουν δυνητικά παθογόνους μικροοργανισμούς χωρίς να βλάπτουν τον ξενιστή (O Hara et al., 2006). 30

31 Κεφάλαιο πρώτο: Εντερική Μικροβιακή Χλωρίδα 1.5 Αλληλεπίδραση με το ανοσοποιητικό σύστημα Η εντερική μικροβιακή χλωρίδα επηρεάζει καθοριστικά την δομική και λειτουργική ανάπτυξη του ανοσοποιητικού συστήματος του ξενιστή, όπως αναφέρθηκε και νωρίτερα. Παράλληλα, για την ανοσολογική απόκριση έναντι σε μικροοργανισμούς που βρίσκονται στο βλεννογόνο είναι απαραίτητο να υπάρχει ακριβής έλεγχος και ικανότητα διάκρισης μεταξύ των παθογόνων και των συμβιωτικών βακτηρίων (O Hara et al., 2006). Ενώ, παρεκκλίσεις στην σύσταση της εντερικής μκροβιακής χλωρίδας έχουν συσχετιστεί με έναν αριθμό ασθενειών και διαταραχών, όπως αλλεργικές αντιδράσεις, καρκίνο του παχέος εντέρου, παχυσαρκία και νόσο του Crohn (Fujimura et al.,2010) Προγεννητική μικροβιακή έκθεση Σύμφωνα με πρόσφατες μελέτες έχει διατυπωθεί η άποψη ότι η προδιάθεση για ασθένεια μπορεί κατά ένα ποσοστό να καθορίζεται από την εμβυϊκή περίοδο. Η μητρική έκθεση σε περιβαλλοντικά ερεθίσματα και ιδιαίτερα μικρόβια στη διάρκεια της εγκυμοσύνης, φαίνεται να έχει σημαντικό ρόλο στη μεταγεννητική λειτουργία του ανοσοποιητικού και ειδικότερα στην ανάπτυξη αλλεργιών και άσθματος (Ege et al., 2006; Wegienka et al., 2009). Στην έρευνα των Schaub et al. αποδείχθηκε ότι για τα παιδία, που οι μητέρες τους είχαν εκτεθεί σε αγρόκτημα και σε εκτρεφόμενα ζώα στην περίοδο της εγκυμοσύνης, η πιθανότητα να αναπτύξουν αλλεργία ή άσθμα είναι μικρότερη (Schaub et al., 2009) (εικόνα 1.12). Αυτή η προγεννητική έκθεση φάνηκε ότι επηρέασε την ανοσολογική απόκριση και συσχετίστηκε με αυξημένο αριθμό και λειτουργία των Τ-ρυθμιστικών κυττάρων (Treg), τα οποία συνδέονται με μειωμένη έκκριση της κυτοκίνης Th2 (αντίθετα, αυξημένη έκκριση κυτοκίνης Th2 είναι χαρακτηριστικό της αλλεργικής απόκρισης). Για το λόγο αυτό, οι ερευνητές υπέθεσαν ότι μια τέτοια έκθεση θα μπορούσε να προσφέρει μια μορφή φυσικής ανοσοθεραπείας. 31

32 Κεφάλαιο πρώτο: Εντερική Μικροβιακή Χλωρίδα Σε άλλη έρευνα δείχθηκε ότι η μητρική προγεννητική έκθεση σε κατοικίδια ζώα (γάτες και σκύλους), προστατεύει επίσης από την ανάπτυξη αλλεργίας (Wengieka et al., 2009; Aichbhaumik et al., 2008) (εικόνα 1.12). Η προστατευτική δράση και στις δύο περιπτώσεις πιστεύεται ότι επιτυγχάνεται με την διαμεσολάβηση μικροβίων. Εικόνα 1.12: Παράγοντες που επηρεάζουν την σύνθεση της εντερικής χλωρίδας και την ανοσολογική απόκριση (Fujimura et al., 2011) Πιο συγκεκριμένα, τα βακτηριακά είδη Actinobacter lwofii και Lactococcus lactis έχουν απομονωθεί από υπόστεγα αγελάδων, και αποδεδειγμένα περιορίζουν τις αλλεργικές αντιδράσεις σε ποντίκια. Τόσο το Α.lwfii όσο και το L.lactis παρουσίασαν την ικανότητα να πολώνουν την ωρίμανση των Τ-κυττάρων προς Th1 απόκριση, διεγείροντας την παραγωγή δενδριτικών IL-12 κυττάρων, με αποτέλεσμα την καταστολή της αλλεργικής φλεγμονής και βελιτιωμένη λειτουργία των αεραγωγών (Debarry et al., 2007). Από την άλλη πλευρά, η έκθεση σε κατοικίδια ζώα συνδέεται με χαμηλότερα επίπεδα ομφαλοπλακουντικής IgE (Aichbhaumik et al., 2008). Η ανοσοσφαιρίνη IgE κατέχει σημαντικό ρόλο για την λειτουργία του εμβρυϊκού ανοσοποιητικού συστήματος και τα αυξημένα επίπεδά της έχουν συσχετιστεί με ανάπτυξη αλλεργικών διαταραχών (Bergmann et al,1997; Tariq et al,1999). 32

33 Κεφάλαιο πρώτο: Εντερική Μικροβιακή Χλωρίδα Συνεπώς, τα μειωμένα επίπεδα IgE μπορούν να θεωρηθούν προστατευτικός παράγοντας (Aichbhaumik et al., 2008) Μεταγεννητική εντερική μικροβιακή σύσταση Η εντερική μικροβιακή χλωρίδα μέσα από την ποικιλομορφία των ειδών που περιλαμβάνει και την έκφραση των γονιδίων τους, επιτελεί βασικές λειτουργίες για την ομοιόσταση του ξενιστή. Για το λόγο αυτό, είναι αναγκαίο το ανοσοποιητικό σύστημα του ξενιστή να διατηρεί ισορροπία μεταξύ της διαμόρφωσης ευνοϊκού περιβάλλοντος για την ανάπτυξη της εντερικής χλωρίδας και ταυτόχρονα, να προστατεύει από την είσοδο ή την ανάπτυξη παθογόνων μικροοργανισμών (O Hara et al., 2006). Η ικανότητα του ανοσοποιητικού συστήματος να διακρίνει επιβλαβή και ωφέλιμα είδη μικροβίων φαίνεται να καθορίζεται κατά κύριο λόγο από (1) την προγεννητική έκθεση της μητέρας σε μικροοργανισμούς και (2) τον μεταγεννητικό μικροβιακό εποικισμό στον εντερικό αυλό του βρέφους (Rakoff-Nahoum et al.,2008; Michelsen et al.,2007). Ιδιαίτερο ρόλο στην διαμόρφωση της μικροβιακής σύνθεσης του εντέρου παίζουν παράγοντες όπως, ο τοκετός (φυσικός ή καισαρική τομή), ο μητρικός θηλασμός ή η χρήση γάλατος εμπορίου, η διάρκεια της κύησης και η χρήση αντιβιοτικών (Penders et al.,2006; Thavagnanam et al.,2008). Ενώ, η άμυνα του εντερικού βλεννογόνου και η λειτουργικότητά του επιτυγχάνονται μέσω δύο διακριτών μηχανισμών: τον ανοσολογικό αποκλεισμό, με την έκκριση αντισωμάτων από την επιφάνεια του βλεννογόνου και την ανοσοκαταστολή, όπου αντιγόνα από παθογόνα και από συμβιούντα βακτήρια αναγνωρίζονται μέσω TLRs (Toll-Like Receptors) (Kawai et al.,2005; Rakoff-Nahoum et al., 2004). 33

34 Κεφάλαιο πρώτο: Εντερική Μικροβιακή Χλωρίδα Έρευνες με germ-free ποντίκια απέδειξαν πως η απουσία μικροβιακού εποικισμού στο έντερο, οδηγεί σε ανεπαρκή ανάπτυξη του ανοσοποιητικού συστήματος (Fujimura et al.,2011). Ειδικότερα, η σημαντικότητα της πρώιμης έκθεσης σε μικροοργανισμούς παρουσιάζεται σε μια μελέτη με νεογέννητα ποντίκια που εκτέθηκαν είτε σε λιποπολυσακχαρίτες (LPS) είτε σε αλβουμίνη. Όσα ποντίκια είχαν εκτεθεί σε LPS ανέπτυξαν Τ-κύτταρα, στα οποία εκφράζονταν CD25 + και Il-10 παρουσία αντιγόνου, και εμφάνισαν μειωμένη υπερευαισθησία αεραγωγών σε σύγκριση με όσα εκτέθηκαν αποκλειστικά σε αλβουμίνη (όπου παρουσιάστηκε ισχυρή Th-1 απόκριση) (Wang et al.,2006). Αρκετές ακόμα μελέτες σε ζωικά μοντέλα και συγκρίσεις με την ανθρώπινη εντερική μικροβιακή χλωρίδα ενισχύουν την άποψη πως ο κατάλληλος εποικισμός του εντέρου έχει καθοριστικό ρόλο στην ανάπτυξη του λεμφικού ιστού που σχετίζεται με τον εντερικό βλεννογόνο, σε πτυχές του ανοσοποιητικού συστήματος, και στην αρτιότητα του βλεννογονικού φραγμού (Fujimura et al.,2011; Penders et al.,2007) Ασθένειες και διαταραχές Αλλοιώσεις στην σύσταση της μικροβιακής εντερικής χλωρίδας που συνήθως συνοδεύονται από υπερανάπτυξη παθογόνων μικροοργανισμών, σε συνδυασμό με σημαντική απώλεια στην ποικιλομορφία των ειδών ή των λειτουργιών που επιτελούν, και παράλληλα φλεγμονώδη απόκριση του ξενιστή, τελικά συμβάλλουν στην εμφάνιση ασθενειών (Fujimura et al., 2010). Η διαταραχή αυτή στους μικροοργανισμούς που συνθέτουν την εντερική χλωρίδα περιγράφεται με τον όρο dysbiosis (Collins et al.,2009). Η κατάσταση dysbiosis έχει συσχετιστεί με ανισορροπία μεταξύ των Τ- βοηθητικών κυττάρων (Th1, Th2 και Th17), που μεσολαβούν σε περίπτωση φλεγμονής, και των αντιφλεγμονωδών Treg κυττάρων. Ενδεικτικά, παρατεταμένη υπερπαραγωγή κυτοκινών από Th1 και Th17 κύτταρα έχει συνδεθεί με φλεγμονώδεις νόσους του εντέρου, την νόσο του 34

35 Κεφάλαιο πρώτο: Εντερική Μικροβιακή Χλωρίδα Crohn και την ελκώδη κολίτιδα (Kobayashi et al.,2008), και αυτοάνοσες διαταραχές, όπως ο λύκος και η σκλήρυνση κατά πλάκας, ενώ αντίστοιχα ανισορροπία των Th2 κυττάρων συνδέεται με το άσθμα, αλλεργικές παθήσεις και την ελκώδη κολίτιδα (Chow et al.,2009; Heller et al.,2005) (εικόνα 1.13). Εικόνα 1.13: Επιπτώσεις στο ανοσοποιητικό σύστημα (Fujimura et al.,2010) Αν και αλλαγές στην εντερική χλωρίδα έχουν συσχετιστεί με φλεγμονώδεις νόσους του εντέρου (IBD), δεν είναι ξεκάθαρο αν η dysbiosis κατάσταση είναι η αιτία ή το αποτέλεσμα. Σε ασθενείς όμως, τα ευρήματα τυπικά είναι: μειωμένη εντερική μικροβιακή ποικιλότητα σε σύγκριση με υγιή άτομα, αυξημένα επίπεδα E.coli, και μειωμένοι πληθυσμοί σε συγκεκριμένα είδη Firmicutes και Bacteroides. Συγκεκριμένα, το είδος Clostridium leptum που ανήκει στο φύλο των Firmicutes, και παράγει βουτυρικό οξύ, είναι περιορισμένο σε ασθενείς με IBD. Ένα ακόμα βακτήριο που παράγει βουτυρικό οξύ και επίσης έχει αντιφλεγμονώδεις ιδιότητες, το Faecalibacterium prausnitzii, μειώνεται στον ειλεό ασθενών με νόσο του 35

36 Κεφάλαιο πρώτο: Εντερική Μικροβιακή Χλωρίδα Crohn ενώ παράλληλα αυξάνονται τα επίπεδα E.coli (Fujimura et al.,2010; Willing et al.,2009). Επιπλέον, ορισμένα είδη βακτηρίων έχουν συσχετιστεί θετικά ή αρνητικά με την εμφάνιση καρκίνου του παχέος εντέρου. Η σύσταση της διατροφής, όπως η κατανάλωση κόκκινου κρέατος και λιπαρών και η μειωμένη πρόσληψη φρούτων, λαχανικών, ολικής άλεσης προϊόντων, ψαριών, επηρεάζει την σύσταση της εντερικής χλωρίδας και πιθανά συμβάλλει στη δημιουργία και την προώθηση του καρκίνου στο παχύ έντερο μέσα από την έκκριση καρκινογόνων και προκαρκινογόνων παραγόντων. Τα είδη Bacteroides vulgates και Bacteroides stercoris φαίνεται να αυξάνουν τον κίνδυνο εμφάνισης καρκίνου του παχέος εντέρου, ενώ τα Lactobaccilus acidophlus, Lactobaccilus S06, Bifidobacterium longum και Eubacterium aerofaciens θεωρείται ότι παρεμποδίζουν την καρκινογένεση και συνεπώς έχουν προστατευτική δράση (Davis et al.,2009). Ακόμα, η ύπαρξη παχυσαρκίας έχει συσχετιστεί με αλλαγές στην σύσταση της εντερικής χλωρίδας. Παρότι δεν αποτελεί νόσημα, σχετίζεται με την εμφάνιση μεταβολικού συνδρόμου, σακχαρώδη διαβήτη τύπου ΙΙ, καρδιαγγειακών νοσημάτων και καρκίνου, άρα έχει ιδιαίτερη σημασία. Σε παχύσαρκα άτομα και πειραματόζωα, παρατηρήθηκε αύξηση στον αριθμό των Firmicutes και μείωση στον αριθμό των Bacteroidetes, σε σύγκριση με υγιή. Ενώ, οι μηχανισμοί που εμπλέκονται με αυτές τις αλλαγές υποδεικνύουν την συμμετοχή φλεγμονωδών παραγόντων (Tsukumo et al.,2009). Χαμηλού βαθμού φλεγμονή χαρακτηρίζει τόσο την παχυσαρκία όσο και τον ΣΔ τύπου ΙΙ και δεν έχει σαφή προέλευση. Σε έρευνα, in vitro και με ζώα, αυξημένες προφλεγμονώδης κυτοκίνες, όπως TNF-α, θεωρήθηκε ότι οδηγούν σε ινσουλινοαντίσταση (Hotamisligli GS, 2006). Τέλος, σε άλλη έρευνα φανερώθηκε ότι οι βακτηριακοί λιποπολυσακχαρίτες (LPS) επηρεάζουν την εντερική μικροβιακή χλωρίδα, και αποτελούν παράγοντες έκκρισης προφλεγμονωδών κυτοκινών (Cani et al.,2007). 36

37 Κεφάλαιο δεύτερο: Παχυσαρκία Παχυσαρκία 2.1 Ορισμός Η παχυσαρκία αναφέρεται στην παθολογική κατάσταση κατά την οποία υπερβολική ποσότητα λίπους, αναλογικά με την ηλικία, το φύλο και το ύψος του ατόμου, συσσωρεύεται κυρίως κάτω από το δέρμα αλλά και σε διάφορα όργανα του σώματος και δυνητικά μπορεί να βλάψει την υγεία ( WHO,2013; Kafatos et al., 2002). Ο Δείκτης Μάζας Σώματος (Body Mass Index) είναι ένας αδρός δείκτης εκτίμησης του λιπώδους ιστού, μέσα από την συσχέτιση βάρους και ύψους. Κάθε άνθρωπος έχει διαφορετικό σωματότυπο και περιοχές εναπόθεσης λιποκυττάρρων, όμως μέσα από τις τιμές του ΔΜΣ μπορεί να προσδιοριστεί μερικώς η σχέση του βάρους του με την πιθανότητα να αναπτύξει προβλήματα υγείας (CDC, 2011). Εικόνα 2.1: Σχηματική αναπαράσταση της σωματικής διάπλασης όσο αυξάνεται ο Δείκτης Μάζας Σώματος ( 37

38 Κεφάλαιο δεύτερο: Παχυσαρκία Είναι ο περισσότερο ευρεύως χρησιμοποιούμενος δείκτης για την διάκριση κανονικού ή υπερβάλλοντος βάρους, αφού τα όρια των τιμών διάκρισης είναι ίδια στους ενήλικες, ανεξάρτητα από φύλο και ηλικία (πίνακας 2.1). Υπολογίζεται ως το πηλίκο του βάρους (σε κιλά) προς το τετράγωνο του ύψους (σε μέτρα) (WHO, 2006). Πίνακας 2.1: Ταξινόμηση του βάρους σύμφωνα με τον Δείκτη Μάζας Σώματος (WHO, 1995, WHO, 2000 and WHO 2004). 2.2 Επιδημιολογικά στοιχεία Το υπερβάλον βάρος και η παχυσαρκία είναι ο πέμπτος κατά σειρά κίνδυνος θνησιμότητας παγκοσμίως και τουλάχιστον 2,8 εκατομμύρια ενήλικες πεθαίνουν κάθε χρόνο ως αποτέλεσμα του αυξημένου βάρους. Στοιχεία του Παγκόσμιου Οργανισμού Υγείας (World Health Organisation) από το 2008 κατέγραψαν πως περισσότεροι από 1,4 δισεκατομμύρια ενήλικες, 20 ετών και άνω, είχαν αυξημένο βάρος. Από αυτούς, περισσότεροι από 200 εκατομμύρια άνδρες και σχεδόν 300 εκατομμύρια γυναίκες ήταν παχύσαρκοι. Δηλαδή, τα παχύσαρκα άτομα 38

39 Κεφάλαιο δεύτερο: Παχυσαρκία αντιστοιχούν σε ποσοστό μεγαλύτερο από 10% του ενήλικου πληθυσμού, παγκοσμίως. Παράλληλα, το 2011, περισσότερα από 40 εκατομμύρια παιδιά ηλικίας μικρότερης από πέντε ετών ήταν υπέρβαρα. Αρχικά, η παιδική παχυσαρκία είχε θεωρηθεί πρόβλημα των χωρών με υψηλά εισοδήματα, όμως πλέον ο επιπολασμός της αυξάνεται τόσο σε χώρες με χαμηλά αλλά και μεσαία εισοδήματα, ιδιαίτερα στις αστικές περιοχές. Περισσότερα από 30 εκατομμύρια υπέρβαρα παιδιά ζουν σε αναπτυσσόμενες χώρες και άλλα 10 εκατομμύρια σε ανεπτυγμένες χώρες (WHO 2013). Αναφορικά με την Ελλάδα, τα ποσοστά παχυσαρκίας των ενήλικων, την κατατάσσουν μεταξύ των Ευρωπαϊκών χωρών με τα υψηλότερα ποσοστά παχυσαρκίας. Ο επιπολασμός του υπέρβαρου και της παχυσαρκίας βρέθηκε 53% και 20% αντίστοιχα στους άνδρες, και 31% και 15% αντίστοιχα στις γυναίκες (Panagiotakos et al., 2004). Εικόνα 2.2: Απεικόνιση του επιπολασμού της παχυσαρκίας (ΔΜΣ>30) παγκοσμίως. 39

40 Κεφάλαιο δεύτερο: Παχυσαρκία 2.3 Αιτιολογικοί παράγοντες Η μεταβολή του βάρους και η αντίστοιχη αλλαγή του λιπώδους ιστού αντικατοπτρίζει ανισορροπία στο ενεργειακό ισοζύγιο του ατόμου. Ως ενεργειακό ισοζύγιο ορίζεται η διαφορά μεταξύ της ενεργειακής πρόσληψης και της ενεργειακής κατανάλωσης, όπου η ενεργειακή πρόσληψη αφορά στο σύνολο της θερμιδικής τροφοδότησης μέσω τροφής και η ενεργειακή κατανάλωση το σύνολο της ενέργειας που δαπανάται για τις βασικές ανάγκες ενός οργανισού (Βασικός Μεταβολικός Ρυθμός) και την φυσική του δραστηριότητα (ΝΙΗ 2013) Διατροφή και άσκηση Σύμφωνα με το ισοζύγιο ενέργειας, όταν η ενεργειακή πρόσληψη είναι μεγαλύτερη από την ενεργειακή κατανάλωση, δηλαδή έχουμε θετικό ισοζύγιο ενέργειας, η περίσσεια της ενέργειας μετατρέπεται σε λίπος για να αποθηκευθεί στο σώμα και οδηγούμαστε σε αύξηση του βάρους. Αντίθετα, το βάρος μειώνεται όταν η ενεργειακή κατανάλωση είναι μεγαλύτερη από την ενεργειακή πρόσληψη, δηλαδή έχουμε αρνητικό ισοζύγιο ενέργειας, και απαιτείται να χρησιμοποιηθεί αποθηκευμένη ενέργεια από τα λιποκύτταρα για να καλυφθούν οι ανάγκες του οργανισμού (εικόνα 2.3). Εικόνα 2.3: Ενεργειακό ισοζύγιο ( 40

41 Κεφάλαιο δεύτερο: Παχυσαρκία Σε παγκόσμιο επίπεδο έχει παρατηρηθεί: α. Αυξημένη πρόσληψη σε τρόφιμα ενεργειακά πυκνά και πλούσια σε λίπος και β. Μείωση της φυσικής δραστηριότητας, εξαιτίας της ολοένα και πιο έντονα καθιστικής φύσης πολλών μορφών εργασίας, της αλλαγής στους τρόπους μεταφοράς και της αυξανόμενης αστικοποίησης. Αλλαγές στις διατροφικές συνήθειες και στα επίπεδα σωματικής δραστηριότητας είναι συχνά το αποτέλεσμα περιβαλλοντικών και κοινωνικών μεταβολών που σχετίζονται με την ανάπτυξη και την αντίστοιχη έλλειψη υποστηρικτικών πολιτικών σε τομείς όπως η υγεία, η γεωργία, η επεξεργασία τροφίμων, εμπορίας και εκπαίδευσης (WHO 2013). Αξίζει να σημειωθεί ότι ακόμα και μια μικρή απόκλιση του ισοζυγίου ενέργειας, της τάξης του 2% ημερισίως (40kcal για έναν μέσο άνθρωπο με ημερήσια ενεργειακή κατανάλωση 2000kcal) μπορεί να οδηγήσει σε αύξηση του βάρους κατά 2kg σε ένα έτος ή 20kg σε 10 χρόνια. Συνεπώς, μια συστηματική παρόμοια απόκλιση θα μπορούσε σε βάθος χρόνου να οδηγήσει κάποιο άτομο να γίνει παχύσαρκο Γενετικοί παράγοντες Κάθε επεξήγηση του φαινομένου της παχυσαρκίας περιλαμβάνει πέρα από το ρόλο του περιβάλλοντος και πιθανούς γενετικούς παράγοντες (εικόνα 2.4). Πιστεύεται ότι η επιρροή του γενετικού υπόβαθρου στην εμφάνιση της παχυσαρκίας κυμαίνεται από 6-85% (Yang et al., 2007). Μια διαδεδομένη γενετική εξήγηση για την ραγδαία αύξηση της παχυσαρκίας αποτελεί η υπόθεση του φειδωλού γονότυπου ( thrifty genotype ), όπου γονιδιακά ενισχύεται η εναποθήκευση ενέργειας μέσω του λιπώδους ιστού προκειμένου να προστατευτεί ο οργανισμός από την πιθανή απρόβλεπτη απουσία πηγών τροφής. Η θεώρηση αυτή επίσης υποστηρίζεται από την ταχεία ανάπτυξη των περιβαλλοντικών συνθηκών και την εξασφάλιση 41

42 Κεφάλαιο δεύτερο: Παχυσαρκία κάθε είδους τροφίμων σε όλη τη διάρκεια του χρόνου, ενώ τονίζει τον αναντιστοίχο κατά κάποιο τρόπο ρυθμό αλλαγής του γενετικού κώδικα σε σχέση με την επάρκεια τροφής (Bouchard et al., 2010; 2007). Όμως, η παραπάνω υπόθεση είναι μόνο ένα μέρος της πιθανής δράσης των γονιδίων στην συσσώρευση λίπους και την αύξηση του βάρους. Υπάρχουν έμμεσες επιστημονικές αποδείξεις για την γενετική βάση της παχυσαρκίας, μέσα από έρευνες όπου μελετήθηκαν μέλη της ίδιας οικογένειας, δίδυμα και υιοθετημένα άτομα (Farooqi et al., 2007). Επιπλέον, πολυμορφισμοί γονιδίων ή/και διαφορετικός αριθμός αλλλομόρφων έχουν συσχετιστεί με αλλαγές στην όρεξη και τον μεταβολισμό σε παχύσαρκα άτομα (Heber et al., 2010). Περισσότεροι από 41 γενετικοί τόποι έχουν ταυτοποιηθεί να σχετίζονται με την παθοφυσιολογία της παχυσαρκίας, ακόμα και όταν οι περιβαλλοντικοί παράγοντες είναι ευνοϊκοί (Poirier et al., 2006). Ακόμα, έχει βρεθεί ότι άτομα που φέρουν δύο αντίγραφα του γονιδίου FTO (fat mass and obesity associated gene) έχουν αυξημένο βάρος κατά 3-4kg και παρουσιάζουν 1,67 φορές μεγαλύτερο κίνδυνο να εμφανίσουν παχυσαρκία, σε σύγκριση με όσους δεν είχαν κανένα αλληλόμορφο (Dina et al., 2007). Εικόνα 2.4: Παράγοντες που επηρεάζουν την εμφάνιση παχυσαρκίας ( 42

43 Κεφάλαιο δεύτερο: Παχυσαρκία Άλλοι παράγοντες Παράγοντες όπως ορμονικές διαταραχές, ψυχολογικά προβλήματα ή λήψη φαρμακευτικής αγωγής έχουν επίσης συσχετιστεί με την εμφάνιση της παχυσαρκίας (εικόνα 2.4). Φαίνεται ότι σε ασθενείς με σοβαρές ψυχικές διαταραχές η παχυσαρκία είναι πιο συχνή από ότι στο γενικό πληθυσμό. Επίσης, η κατάθλιψη και οι διαταραχές πρόσληψης τροφής όπως η Διαταραχή Επεισοδιακής Πολυφαγίας (Binge Eating Disorder), είτε μέσα από την φαρμακευτική αγωγή αλλά και εξαιτίας υιοθέτησης συγκεκριμένης συμπεριφοράς συμβάλλουν στην εμφάνιση παχυσαρκίας. Με αντίστοιχο τρόπο, ορμονικές διαταραχές όπως ο υποθυρεοειδισμός ή το σύνδρομο πολυκυστικών ωοθηκών συνδέονται επίσης με την εμφάνιση παχυσαρκίας. Τέλος, αρκετά είναι τα φάρμακα που συσχετίζονται με αύξηση στο βάρος, αν και δεν αναγνωρίζεται πάντα. Ενδεικτικά, έχουν αναφερθεί κορτικοστεροειδή σε υψηλές δόσεις, η ινσουλίνη και από του στόματος υπογλυκαιμικά φάρμακα, μερικά αντικαταθληπτικά, μερικά αντιψυχωσικά και το λίθιο για υποτροπιάζουσα κατάθλιψη, μανία ή διπολική διαταραχή ( Wilding et al., 2006). 2.4 Επιπτώσεις Η παχυσαρκία μπορεί να επηρεάσει πολλά όργανα και συστήματα του οργανισμού, γι αυτό και οι επιπτώσεις της ποικίλλουν. Ο αυξημένος ΔΜΣ είναι ένας σημαντικός παράγοντας κινδύνου για χρόνιες ασθένειες όπως: καρδιαγγειακές παθήσεις, και κυρίως στεφανιαία νόσο και εγκεφαλικά επεισόδια (η πρώτη αιτία θανάτου το 2008) διαβήτη υπέρταση αναπνευστικά προβλήματα και υπνική άπνοια 43

44 Κεφάλαιο δεύτερο: Παχυσαρκία μυοσκελετικές παθήσεις, κυρίως οστεοαρθρίτιδα ορισμένες μορφές καρκίνου, όπως μαστού, ενδομητρίου και παχέος εντέρου γαστρο-οισοφαγική παλινδρόμηση και παθήσεις της χοληδόχου κύστης Έχει παρατηρηθεί ότι όσο αυξάνεται ο ΔΜΣ, τόσο αυξάνεται και ο κίνδυνος εμφάνισης των παθήσεων αυτών (εικόνα 2.5). Εικόνα 2.5: Οι πιο συχνές επιπτώσεις της παχυσαρκίας σε ενήλικες Επιπρόσθετα, η παιδική παχυσαρκία έχει συσχετιστεί με αυξημένη πιθανότητα παχυσαρκίας στην ενήλικη ζωή, πρόωρο θάνατο και αναπηρία. Πέρα από τον αυξημένο μελλοντικό κίνδυνο, τα παχύσαρκα παιδιά αντιμετωπίζουν δυσκολίες στην αναπνοή, αυξημένο κίνδυνο καταγμάτων, υπέρταση, αντίσταση στην ινσουλίνη και ψυχολογικές επιπτώσεις, όπως 44

45 Κεφάλαιο δεύτερο: Παχυσαρκία χαμηλή αυτοεκτίμηση και εσφαλμένη εικόνα σώματος (WHO 2013). Σύμφωνα με τον πολύ μεγάλο αριθμό μελετών σχετικά με την παχυσαρκία και τις επιπτώσεις που έχει στην υγεία έχει παρατηρηθεί ότι, είτε άμεσα είτε έμμεσα, επηρεάζεται κάθε σύστημα του οργανισμού (εικόνα 2.7). Ενώ, ο Δείκτης Μάζας Σώματος έχει συνδεθεί με τη θνησιμότητα σε διάφορες μελέτες (Manson et al., 1995; Willett et al.,1995). Έχει αποδειχθεί ότι η παχυσαρκία μπορεί να μειώσει το προσδόκιμο ζωής εξαιτίας πολλαπλής νοσηρότητας, και συγκεκριμένα για άτομα ηλικάς 40 ετών, κατά περίπου 7 χρόνια (Blüher M., 2009; Peeters et al., 2003). Παράλληλα, για άτομα μικρότερης ηλικάς από 45 έτη, φαίνεται ότι ο κίνδυνος εμφάνισης χρόνιων παθήσεων, που αναφέρθηκαν παραπάνω, είναι πολύ μεγαλύτερος σε σχέση άτομα φυσιολογικού βάρους (Blüher M., 2009; Calza et al., 2008). Η συσσώρευση λιποκυττάρων και η δυσλειτουργία του λιπώδους ιστού είναι χαρακτηριστικά της παχυσαρκίας. Ειδικότερα, η συσσώρευση σπλαχνικού λίπους στην κοιλιακή χώρα, δηλαδή η κεντρικού τύπου παχυσαρκία (εικόνα 2.6), σχετίζεται με την ανάπτυξη χρόνιας φλεγμονής (Jensen M. 2008). Εικόνα 2.6: Διάκριση παχυσαρκίας, σε κεντρική (μήλο) και περιφερική (αχλάδι). Σε αυτή την περίπτωση, ο λιπώδης ιστός, δρώντας σαν εκκριτικό όργανο, παράγει προφλεγμονώδεις κυττοκίνες (Ιντερλευκίνη 1 & 6, και TNF-a) 45

46 Κεφάλαιο δεύτερο: Παχυσαρκία και αυξάνει την προδιάθεση για καρκίνο πυροδοτώντας μονοπάτια σχετικά με την παθοφυσιολογία του. Ακόμα, προκαλώντας παρακρινικώς καταστολή στην έκκριση της αδιπονεκτίκνης, μπορεί να επιβαρύνει την αντίσταση στην ινσουλίνη και να συμβάλλει στην εμφάνιση σακχαρώδους διαβήτη τύπου ΙΙ (Goossens GH., 2008; Jensen MD., 2008). Επίσης, η μη αλκοολική διήθηση και κίρρωση του ήπατος, που είναι η πιο κοινή ηπατική νόσος σήμερα, συσχετίζεται με τις επιδημικές διαστάσεις της παχυσαρκίας και του σακχαρώδους διαβήτη τύπου ΙΙ (Puppala et al., 2013). Τέλος, η παχυσαρκία έχει και ψυχολογικές επιπτώσεις, όπως την κατάθλιψη και την χαμηλή αυτοεκτίμηση. Υπολογίστηκε ότι το ποσοστό εμφάνισης τους είναι μεγαλύτερο κατά 37% σε παχύσαρκες Αμερικανίδες σε σχέση με αντίστοιχες γυναίκες κανονικού βάρους (Atlantis et al., 2008). Εικόνα 2.7: Επιπτώσεις της παχυσαρκίας σε κάθε σύστημα του ανθρώπινου οργανισμού ( 46

47 Κεφάλαιο τρίτο: Παχυσαρκία και Εντερική χλωρίδα Παχυσαρκία και Εντερική χλωρίδα Με δεδομένη την επιδημική διάσταση που έχει πλέον το φαινόμενο της παχυσαρκίας, έχει αυξηθεί το ερευνητικό ενδιαφέρον αναφορικά με την σχέση και την πιθανή αλληλεπίδραση της εντρικής χλωρίδας στην ανάπτυξη της παχυσαρκίας. Έτσι, γίνονται προσπάθειες να αποσαφηνιστούν οι πιθανοί μηχανισμοί με τους οποίους οι μκροοργανισμοί του εντέρου επηρεάζουν την εμφάνιση παχυσαρκίας ή και άλλων χρόνιων παθήσεων που συνδέονται με την παχυσαρκία, όπως ο σακχαρώδης διαβήτης τύπου ΙΙ και το μεταβολικό σύνδρομο (Harris et al., 2012; Angelakis et al., 2012). 3.1 Έρευνες σε πειραματόζωα Σε έρευνες που έγιναν από την ομάδα του Gordon JI και των συνεργατών του, φάνηκε ότι η μικροβιακή χλωρίδα του εντέρου, ως περιβαλλοντικός παράγοντας, επηρεάζει την αποθήκευση λίπους και την παχυσαρκία. Αρχικά, βρήκαν ότι ποντίκια που εκτρέφονται κανονικά είχαν 42% περισσότερο ολικό λίπος σώματος σε σύγκριση με germ-free ποντικούς, παρότι η ενεργειακή τους πρόσληψη ήταν χαμηλότερη. Το δεδομένο αυτό υποδήλωνε ότι η παρουσία της εντερικής χλωρίδας μπορούσε να αυξήσει την ενεργειακή απόδοση της τροφής (Bäckhed et al.,2004). Στη συνέχεια, η ίδια ομάδα απέδειξε ότι ο εποικισμός των germ-free ποντικών με μικρόβια από συμβατικά εκτρεφόμενα ποντίκια, προκαλούσε αύξηση του λιπώδους ιστού κατά 60%, που συσχετίζεται με αυξημένη ινσουλινοαντίσταση, παρά την χαμηλή ενεργειακή πρόσληψη. Παρατήρησαν ακόμα, ότι όταν χρησιμοποιούσαν για τον εποικισμό μικρόβια από παχύσαρακα ποντίκια η αύξηση του λιπώδους ιστού ήταν μεγαλύτερη, σε σύγκριση με την αύξηση από τον αντίστοιχο εποικισμό από αδύνατα ποντίκια (Turnbaugh et al., 2006). 47

48 Κεφάλαιο τρίτο: Παχυσαρκία και Εντερική χλωρίδα Μια άλλη ομάδα, αυτή του Ley και των συνεργατών, έδειξε ότι η παχυσαρκία μπορεί να συνδέεται με αλλοιωμένη μικροβιακή σύσταση (Ley et al.,2005). Η σύγκριση της εντερικής μικροβιακής χλωρίδας μεταξύ ob/ob ποντικών και ποντικών κανονικού βάρους έδειξε ότι στα ob/ob ποντίκια τα Bacteroidetes ήταν κατά 50% λιγότερα, ενώ τα Firmicutes κατά 50% περισσότερα (εικόνα 3.1). εικόνα 3.1: Σχετική αναλογία στη σύσταση της εντερικής χλωρίδας σε παχύσαρκα και κανονικού βάρους ποντίκια(ley et al., 2005) Άλλες μελέτες, επίσης σε germ-free ποντίκια, αποκάλυψαν ότι η εντερική μικροβιακή χλωρίδα οδηγεί τον ξενιστή σε αυξημένη ηπατική παραγωγή τριακυλογλυκερόλης και γλυκόζης, με αποτέλεσμα την συνολική μεγαλύτερη ενεργειακή πρόσληψη (Vrieze et al., 2010). 48

49 Κεφάλαιο τρίτο: Παχυσαρκία και Εντερική χλωρίδα 3.2 Έρευνες σε ανθρώπους Σε έρευνες με εθελοντές βρέθηκαν επίσης διαφορές στην σύσταση της εντερικής χλωρίδας μεταξύ παχύσαρκων και κανονικού βάρους ατόμων. Μελετήθηκαν ως επί το πλείστον τα δύο κυρίαρχα φύλα, Bacteroidetes και Firmicutes, αλλά τα αποτελέσματα δεν ήταν ταυτίζονται πάντα. Αρκετές ερευνητικές ομάδες παρατήρησαν μειωμένο αριθμό των Bacteroidetes στα παχύσαρκα άτομα, σε σύγκριση με τα άτομα κανονικού βάρους σε παιδιά και ενήλικες (Xu et al., 2012; Ley et al., 2006; Furet et al., 2010). Επίσης βρέθηκε αρνητική συσχέτιση μεταξύ του ΔΜΣ και του λόγου Bacteroidetes/Firmicutes (Xu et al., 2012), αλλά και αυξημένος αριθμός των Firmicutes σε παχύσαρκα άτομα, που συσχετίστηκε με αυξημένη ενεργειακή πρόσληψη (Ley et al., 2006). Έχουν διατυπωθεί όμως και αντίθετες παρατηρήσεις. Πιο συγκεκριμένα, η ομάδα του Duncan και των συνεργατών, σχετικά με τον αριθμό των Bacteroidetes σε παxύσαρκα και κανονικού βάρους άτομα δεν βρήκε καμία στατιστικά σημαντική διαφορά, ούτε και αλλαγή της αναλογίας τους μετά από δίαιτα στα παχύσαρκα άτομα (Duncan et al., 2008). Ενώ, η ομάδα του Schwiertz και των συνεργατών, παρουσίασαν πως σε παχύσαρκα και υπέρβαρα άτομα ο αριθμός των Bacteroidetes ήταν μεγαλύτερος σε σχέση με εκείνον των κανονικού βάρους ατόμων. Παράλληλα, όμως ανέφεραν ότι ο αριθμός του Ruminococcus flavefaciens σε υπέρβαρα ή παχύσαρκα άτομα ήταν χαμηλότερος από ότι σε κανονικού βάρους άτομα, και επιπρόσθετα για τα παχύσαρκα άτομα βρέθηκε σημαντικά μειωμένοι οι αριθμοί των Clostridium leptum και Bifidobacterium (Schwiertz et al., 2010). Τέλος, συσχέτιση έχει επίσης παρατηρηθεί μεταξύ της σύστασης της εντερικής χλωρίδας και της απώλειας βάρους. Φαίνεται ότι παχύσαρκα άτομα που μείωσαν το βάρος τους, μετά από δίαιτα διάρκειας ενός χρόνου, απέκτησαν εντερική μικροβιακή σύσταση παρόμοια με εκείνη ατόμων κανονικού βάρους, όπου αυξήθηκαν τα Bacteroidetes (3%-15%) και μειώθηκαν τα Firmicutes (Ley et al., 2006). 49

50 Κεφάλαιο τρίτο: Παχυσαρκία και Εντερική χλωρίδα 3.3 Μηχανισμοί αλληλεπίδρασης Οι παρατηρήσεις σχετικά με την πιθανή διαφορετική σύσταση της εντερικής μικροβιακής χλωρίδας σε παχύσαρκους και άτομα κανονικού βάρους διαμόρφωσαν την υπόθεση της συνεισφοράς των μικροοργανισμών του εντέρου στην παθοφυσιολογία της παχυσαρκίας (Tsukumo et al.,2009). Διαφορετικοί μηχανισμοί έχουν προταθεί για την επεξήγηση αυτής της αλληλεπίδρασης (Harris et al.,2012) (εικόνα 3.2). Οι τρεις κύριοι ρόλοι δράσης που αποδίδονται στην μικροβιακή χλωρίδα είναι: 1. η αύξηση της ενεργειακής πρόσληψης, (α) μέσα από την ζύμωση των άπεπτων διαιτητικών πολυσακχαριτών και (β) από την απορρόφηση των παραγώμενων SCFAs και την de novo ηπατική λιπογένεση 2. η συμβολή στη χρόνια χαμηλού βαθμού φλεγμονή, μέσα από την διαμόρφωση των επιπέδων βακτηριακών πολυσακχαριτών στο πλάσμα 3. η ρύθμιση γονιδίων του ξενιστή, τα οποία επηρεάζουν την εναπόθεση λίπους Εικόνα 3.2: Σχηματική απεικόνιση των πιθανών μηχανισμών αλληλεπίδρασης της μικροβιακής χλωρίδας με την εμφάνιση παχυσαρκία (Tsukumo et al., 2009) 50

51 Κεφάλαιο τρίτο: Παχυσαρκία και Εντερική χλωρίδα Περισσότερο αναλυτικά: Η διάσπαση των άπεπτων διαιτητικών υδατανθράκων και η παραγωγή SCFAs, όπως έχει αναφερθεί ήδη, προσφέρει επιπλέον ποσά ενέργειας στον ξενιστή. Υπολογίζεται ότι το πλεόνασμα ενέργειας κυμαίνεται από 80 εως 200kcal/ημέρα ή περίπου 4-10% της ημερήσιας συνιστώμενης ενεργειακής πρόσληψης για ενήλικες (Xu et al., 2003). Επίσης, το ποσό προσφερόμενης ενέργειας από την εντερική χλωρίδα έχει συσχετιστεί θετικά με αυξημένο πληθυσμό του φύλου των Bacteroidetes και αρνητικά με αυξημένο πληθυσμό του φύλου των Firmicutes (Jumpertz et al., 2011). Το οξικό οξύ και το προπιονικό οξύ, δύο από τα τρια κύρια SCFAs, απορροφώνται από την πυλαία κυκλοφορία, και επηρεάζουν την σύνθεση χοληστερόλης στο ήπαρ έχοντας ανταγωνιστική δράση (Harris et al., 2012). Παράλληλα, σε in vitro έρευνα φαίνεται ότι το προπιονικό οξύ περιορίζει και την ηπατική λιπογένεση (Hosseini et al., 2011). Ενώ, το τρίτο κύριο SCFA, το βουτυρικό οξύ παρέχει ενέργεια στα εντεροκύτταρα. Ακόμα, τα SCFAs μπορούν να λειτουργήσουν σαν σηματοδοτικά μόρια. Συγκεκριμένα, έχουν την ικανότητα να συνδέονται στους υποδοχείς GPCRs (G-protein-coupled receptors), GPR41 και GPR43, των εντεροενδοκρινών L-κυττάρων. Με τον τρόπο αυτό, επηρεάζουν την έκφραση ορμονών όπως του παγκρεατικού πεπτιδίου PYY (Peptide tyrosine-tyrosine) και του πεπτιδίου GLP-1 (Glugagon-like Peptide 1). Κατά συνέπεια, επιδρούν στην έκκριση ινσουλίνης και γκλυκαγόνης, είτε μέσω του αυτόνομου νευρικού συστήματος είτε απευθείας στα παγκρεατικά νησίδια. Η βιολογική λειτουργία των GPR41 και GPR43, λοιπόν, σχετίζεται με τον μεταβολισμό των λιπιδίων, και ιδιαίτερα με την ρύθμιση της λιπόλυσης και την συγκέντρωσης των ελεύθερων λιπαρών οξέων ( Harris et al., 2012). Ενώ, έλλειψη του GPR43 σχετίστηκε με μειωμένη έκφραση του PYY, μειωμένη ενεργειακή απόδοση της δίαιτας και περιορισμένη ηπατική λιπογένεση (Samuel et al., 2008). Οι λιποπολυσακχαρίτες (LPS) που προέρχονται από Gram αρνητικά βακτήρια του παχέος εντέρου έχουν συνδεθεί με χρόνια συστηματική φλεγμονή, και διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην εμφάνιση αντίστασης 51

52 Κεφάλαιο τρίτο: Παχυσαρκία και Εντερική χλωρίδα στην ινσουλίνη και την παχυσαρκία. Η παρουσία των LPS ελέγχεται από τον ξενιστή μέσω του TLR4 (toll-like receptor), ο οποίος αναγνωρίζει επίσης μη μικροβιακής προέλευσης ενώσεις όπως τα κορεσμένα λιπαρά οξέα. Έρευνα σε ποντίκια με ανεπάρκεια του TLR4, έδειξε ότι προστατεύοναι από παχυσαρκία και ινσουλινοαντίσταση έπειτα από υιοθέτηση δίαιτας υψηλή σε λιπαρά (Davis et al.,2008). Σε άλλη έρευνα παρατηρήθηκε ότι ποντίκια που ακολουθούσαν δίαιτα υψηλή σε λίπος αύξησαν την αναλογία Gram + /Gram - βακτήρια, σε συνδυασμό με αυξημένα επίπεδα LPS στο πλάσμα, αυξημένο βάρος, λιπώδη ιστό, εμφάνιση διαβήτη και προφλεγμονώδεις δείκτες (Cani et al., 2007c). Επιπρόσθετα, τα SCFAs, και συγκεκριμένα το προπιονικό και το βουτυρικό οξύ μπορούν να αυξήσουν την έκφραση του γονιδίου της λεπτίνης (Xiong et al.,2004). Η λεπτίνη είναι μια adipokine που παράγεται από τον λιπώδη ιστό, και μια από τις λειτουργίες της είναι ο έλεγχος της όρεξης και η πρόσληψη τροφής. Τέλος, τα βακτήρια μπορούν να μειώσουν την εντερική έκφραση του παράγοντα FIAF (Fasting Induced Adipose Factor), που είναι αναστολέας της λιποπρωτεϊνικής λιπάσης (Lipoprotein Lipase-LPL). Αυτό οδηγεί στην απελευθέρωση λιπαρών οξέων από τα χυλομικρά και την VLDL, και την αποθήκευση τους στον λιπώδη ιστό ως τριγλυκερίδια. Έρευνες με ποντίκια που είχαν αυξημένα επίπεδα FIAF, φανέρωσαν επακόλουθη αυξημένη παραγωγή του μεταγραφικού παράγοντα PPARγ (Peroxisome Proliferatoractivated receptor gamma), που οδηγεί σε έκφραση ρυθμιστικών γονιδίων της μιτοχονδριακής οξείδωσης των λιπαρών οξέων (Backhed et al., 2004). 52

53 Κεφάλαιο τέταρτο: Διατροφή και Εντερική Χλωρίδα Διατροφή και Εντερική χλωρίδα 4.1 Μεσογειακή Διατροφή Ο όρος Μεσογειακή Διατροφή αναφέρεται στο είδος διατροφής που χαρακτηρίζεται από χαμηλή κατανάλωση λίπους, και ιδιαίτερα κορεσμένων λιπαρών οξέων, και από υψηλή κατανάλωση υδατανθράκων, που βρίσκονται στα σιτηρά και τα προϊόντα τους (δημητριακά, ψωμί, ρύζι, μακαρόνια), στα φρούτα, στα λαχανικά, στο γάλα και τα υπόλοιπα γαλακτοκομικά προϊόντα. Ιδιαίτερης σημασίας είναι η χρήση του ελαιολάδου ως κύριο έλαιο και η τακτική αλλά μέτρια κατανάλωση αιθανόλης, με την μορφή κρασιού ως επι το πλείστον, συνήθως κατά την διάρκεια των γευμάτων (Ζαμπέλας Α, 2007) (εικόνα 4.1). Εικόνα 4.1: Η πυραμίδα της μεσογειακής διατροφής 53

54 Κεφάλαιο τέταρτο: Διατροφή και Εντερική Χλωρίδα Τα χαρακτηριστικά της και η συσχέτιση της με χρόνια νοσήματα έχουν αποτελέσει αντικείμενο έρευνας για πολλά χρόνια. Φαίνεται ότι η υιοθέτηση της έχει ευεργετικές επιδράσεις στο λιπιδαιμικό προφίλ και την στεφανιαία νόσο, και γι αυτό το λόγο αναφέρεται με τον τίτλο καρδιοπροστατευτική δίαιτα (Ζαμπέλας Α, 2007; Antonogeorgos et al., 2012; Kontogianni et al., 2012). Έχει ακόμα συχετιστεί θετικά με μειωμένο κίνδυνο εμφάνισης μεταβολικού συνδρόμου, σακχαρώδη διαβήτη τύπου ΙΙ, υπέρτασης και καρκίνου του παχέος εντέρου (Psaltopoulou et al., 2011; Tzima et al., 2009; Pitsavos et al., 2008). Η αξιολόγηση της υιοθέτησης των προτύπων της Μεσογειακής Διατροφής γίνεται με την χρήση του ερωτηματολογίου και του αντίστοιχου σκορ που ανέπτυξε η ερευνητική ομάδα του Panagiotakos DB και των συνεργατών του, MedDiet Score (Panagiotakos et al., 2007). 4.2 Μεσογειακή διατροφή και εντερική χλωρίδα Λίγες είναι οι έρευνες που έχουν γίνει σχετικά με την διερεύνηση της επίδρασης της Μεσογεικής διατροφής στη σύσταση της εντερικής χλωρίδας, με αποτέλεσμα να μην υπάρχουν ξεκάθαρα συμπεράσματα. Αρχικά, οι Michalsen et al. μελέτησαν την επίδραση της Μεσογειακής διατροφής και της δίαιτας χαμηλών σε θερμίδων στη σύσταση της μικροβιακής εντερικής χλωρίδας σε ασθενείς με ρευματοειδή αρθρίτιδα και ινομυαλγία. Έτσι, δημιούργησαν δύο ομάδες συμμετεχόντων, όπου η πρώτη ομάδα ακολούθησε δίαιτα σύμφωνα με τα πρότυπα της Μεσογειακής διατροφής για 2 μήνες και η δεύτερη ομάδα ακολούθησε έντονα υποθερμιδική δίαιτα (της τάξης των 300kcal ημερησίως) για 8 ημέρες. Έγινε συλλογή από δείγματα κοπράνων στην αρχή και το τέλος κάθε παρέμβασης, και στη συνέχεια ποσοτικοποιήθηκαν οι περιεχόμενοι μικροοργανισμοί. Καμιά στατιστικά σημαντική αλλαγή όμως δεν βρέθηκε, ούτε μεταξύ των 54

55 Κεφάλαιο τέταρτο: Διατροφή και Εντερική Χλωρίδα διατροφικών παρεμβάσεων, ούτε ανάμεσα στις δύο ομάδες ασθενών (Michalsen et al., 2005). Αργότερα, η ίδια σχεδόν ερευνητική ομάδα, χρησιμοποιώντας το ίδιο πρωτόκολλο, προσπάθησε να μελετήσει εάν οι δύο τύποι δίαιτας επηρεάζουν την ενζυμική δραστηριότητα και το μεταβολισμό των βακτηρίων. Οι πιθανές μεταβολές μπορούν να ανιχνευθούν από μετρήσεις των αλλαγών στην ποσότητα και την αναλογία των SCFAs στα δείγματα κοπράνων. Μετά την ανάλυση, καμία στατιστικά σημαντική διαφορά δεν βρέθηκε για το βουτυρικό και το προπιονικό οξύ μεταξύ των δύο τύπων δίαιτας. Αντίθετα, παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική αύξηση του οξικού οξέος στην ομάδα που ακολούθησε την υποθερμιδική δίαιτα. Το εύρημα αυτό όμως δεν υποδεικνύει ισχυρή σχέση μεταξύ Μεσογειακής διατροφής και εντερικής χλωρίδας (Abendroth et al., 2010). Τέλος, σε in vitro έρευνα μελετήθηκε η ζύμωση των φυτικών ινών και οι διαφορές που παρουσιάζουν ανάλογα με την προέλευσή τους. Χρησιμοποιήθηκαν δείγματα φυτικών ινών από δίαιτα Μεσογειακού τύπου (Ισπανία), και από δίαιτα Σκανδιναβικού τύπου (Δανία). Από τα δείγματα των δύο τύπων διατροφής, απομονώθηκαν οι ολικές φυτικές ίνες, οι φυτικές ίνες που προέρχονταν από δημητριακά, εκείνες που προέρχονταν από φρούτα και οι φυτικές ίνες από λαχανικά. Η Μεσογειακού τύπου διατροφή, και πιο συγκεκριμένα οι ολικές φυτικές ίνες συσχετίστηκαν με υψηλότερες συγκεντρώσεις βουτυρικού οξέος, ενώ η Σκανδιναβικού τύπου διατροφή σχετίστηκε με υψηλότερες συγκεντρώσεις προπιονικού οξέος (Tabernero et al., 2011). Εξαιτίας της μικρής ερευνητικής δραστηριότητας σχετικά με την επίδραση της Μεσογειακής διατροφής στην εντερική χλωρίδα, δεν μπορούν να διατυπωθούν ασφαλή συμπεράσματα. Παρότι, οι πρώτες ενδείξεις δεν είναι ιδιαίτερα ενθαρρυντικές, περισσότερη μελέτη πάνω στο αντικείμενο χρειάζεται να γίνει για να διαπιστωθεί το είδος της πιθανής συσχέτισης. 55

56 Κεφάλαιο τέταρτο: Διατροφή και Εντερική Χλωρίδα 4.3 Αλληλεπίδραση της παχυσαρκίας και της δίαιτας στη σύσταση της εντερικής χλωρίδας Αρκετές είναι οι ερευνητικές εργασίες που μελετούν την επίδραση της απώλειας βάρους, μέσα από μια υποθερμιδική δίαιτα, στην σύσταση της εντερικής χλωρίδας. Σε γενικές γραμμές, φαίνεται ότι μετά από απώλεια βάρους η εντερική μικροβιακή χλωρίδα προηγουμένως παχύσαρκων ατόμων προσεγγίζει εκείνη ατόμων κανονικού βάρους (Ley et al.,2006). Αν και αντίθετα αποτελέσματα έχουν επίσης παρατηρηθεί (Duncan et al.,2008). Παράλληλα, έρευνα σε άτομα που έπασχαν από νοσογόνο παχυσαρκία και προχώρησαν σε γαστρικό by-pass, έδειξε ότι η εντερική μικροβιακή χλωρίδα μετά την χειρουργική παράκαμψη έχει περισσότερες ομοιότητες με αυτή παχύσαρκων ατόμων, παρά με ατόμων κανονικού βάρους (Zhang et al., 2009). Στον πίνακα 4.1 παρουσιάζονται έρευνες που μελέτησαν τη σχέση παχυσαρκίας ή/και δίαιτας με την σύσταση της εντερικής χλωρίδας, σε διάφορους πληθυσμούς. Πίνακας 4.1: Μεταβολές πληθυσμών της ανθρώπινης εντερικής μικροβιακής χλωρίδας, που σχετίζονται με αύξηση βάρους (Angelakis et al.,2012) Ερευνητική ομάδα Συμμετέχοντες Μέθοδος Υπο μελέτη μικροοργανισμοί Κύρια Ευρήματα Ley et al.,2006 Παχύσαρκοι Φυσιολογικού βάρους 16S clonal sequencing (κλωνική αλληλουχία) Firmicutes Bacteroidetes Σημαντικά μειωμένα επίπεδα Bacteroidetes σε παχύσαρκους Συσχέτιση μεταξύ αύξησης Bacteroidetes και μείωσης σωματικού βάρους σε παχύσαρκα άτομα Zuo et al.,2011 Παχύσαρκοι Φυσιολογικού βάρους Culture (καλλιέργεια) Firmicutes Bacteroidetes Σημαντικά μειωμένα επίπεδα Clostridium perfringens και Bacteroides στους παχύσαρκους του δείγματος 56

57 Κεφάλαιο τέταρτο: Διατροφή και Εντερική Χλωρίδα Schwiertz et al.,2010 Παχύσαρκοι Υπέρβαροι Φυσιολογικού βάρους qpcr Firmicutes Bacteroidetes Bifidobacteria Σημαντική αύξηση Bacteroidetes στους παχύσαρκους Μείωση των Firmicutes Σημαντική μείωση σε Bifidobacteria και σε Methanobrevibacter sp. σε παχύσαρκα άτομα Kalliomaki et al.,2008 Παχύσαρκα & Υπέρβαρα παιδιά Φυσιολογικού βάρους παιδιά FISH Bifidobacteria Lactobacilli Clostridia Staphylococcus aureus Χαμηλότερος αριθμός bifidobacteria και υψηλότερος αριθμός Staphylococcus aureus προβλέπουν παχύσαρκο/υπέρβαρο φαινότυπο Mai et al.,2009 Παχύσαρκοι Φυσιολογικού βάρους FISH qpcr Bacteroidetes Καμία σημαντική διαφορά στα επίπεδα Bacteroidetes μεταξύ παχύσαρκων ατόμων και ατόμων φυσιολογικού βάρους Duncan et al.,2008 Παχύσαρκοι Φυσιολογικού βάρους FISH Firmicutes Bacteroidetes Eubacterium rectale/ Clostridium coccoides Καμία διαφορά στα επίπεδα Bacteroidetes, μεταξύ παχύσαρκων και ατόμων κανικού βάρους, ανεξάρτητα διατροφής. Σημαντική μείωση, σχετιζόμενη με τη διατροφή, στα επίπεδα Eubacterium rectale/roseburia σε παχύσαρκα άτομα Collado et al.,2008 Παχύσαρκες εγκυμονούσες Φυσιολογικού βάρους εγκυμονούσες FCM-FISH και qpcr Bacteroidetes Bifidobacteria Staphylococcus aureus Υψηλότερος αριθμός Bacteroides και Staphylococcus aureus σε παχύσαρκες εγκυμονούσες Συσχέτιση μεταξύ αύξησης βάρους και υψηλών επιπέδων Bacteroides Nadal et al.,2009 Παχύσαρκοι έφηβοι σε δίαιτα και φυσική δραστηριότητα FISH Bacteroidetes/ Prevotella Bifidobacterium Clostridium hystol yticum Η μεγαλύτερη απώλεια βάρους, συσχετίστηκε με: Σημαντική μείωση των Eubacterium rectale, Clostridium coccoides και Clostridium histolyticum 57

58 Κεφάλαιο τέταρτο: Διατροφή και Εντερική Χλωρίδα Eubacterium rectale/ Clostridium coccoides Και, σημαντική αύξηση Bacteroides/Prevotella Lactobacillus/ Enteroccocus Enteric group Zhang et al.,2009 Παχύσαρκοι Φυσιολογικού βάρους 16S Pyrosequenci ng Firmicutes Bacteroidetes Proteobacteria Actinobacteria Fusobacteria Verrucomicrobia Μεγαλύτερη αφθονία Bacteroidetes στους παχύσαρκους και εποικισμός από Prevotellaceae. Σημαντική αύξηση των Methanobacteriales σε παχύσαρκους Συνολικά, η εντερική χλωρίδα των ατόμων με γαστρικό bypass έχει περισσότερες ομοιότητες με εκείνη παχύσαρκων ατόμων Turnbaugh et al.,2009 Δίδυμα μονοζυγωτικά και διζυγωτικά, και η μητέρες τους, παχύσαρκοι ή κανονικού βάρους 16S με την ακολουθία Sanger, και pyrosequenci ng Firmicutes Bacteroidetes Actinobacteria Proteobacteria Σημαντικά μειωμένα επίπεδα Bacteroidetes και σημαντική αύξηση Actinobacteria στους παχύσαρκους Καμία στατιστικά σημαντική διαφορά σε Firmicutes Η χλωρίδα των παχύσαρκων είναι εμπλουτισμένη σε γονίδια που ανήκουν στα Actinobacteria και Firmicutes Balamurugan et al.,2010 Παχύσαρκοι qpcr Bacteroidetes Bifidobacterium Lactobacillus acidophilus Σημαντική αύξηση στα επίπεδα Faecalibacterium prausntzi (ανήκουν στα Firmicutes) σε παχύσαρκα άτομα Φυσιολογικού βάρους Eubacterium rectale Faecalibacterium prausnitzii Καμία σημαντική διαφορά στα επίπεδα των Bacteroidetes και Bifidobacterium μεταξύ σε παχύσαρκα και υπέρβαρα άτομα 58

59 Κεφάλαιο τέταρτο: Διατροφή και Εντερική Χλωρίδα Armougom et al.,2009 Παχύσαρκοι Φυσιολογικού βάρους Ανορεξικοί qpcr Firmicutes Bacteroidetes Lactobacillus Methanobrevibact er smithii Σημαντικά μειωμένα επίπεδα σε Bacteroidetes σε παχύσαρκα άτομα συγκριτικά με τα φυσιολογικού βάρους Σημαντικά υψηλότερα επίπεδα σε Lactobacillus Καμία διαφορά στη διατροφική πρόσληψη Bacteroides fragilis Santacruz et al.,2009 Υπέρβαροι έφηβοι qpcr Lactobacillus Clostridium coccoi des Clostridium leptum Έπειτα από υποβολή παχύσαρκων σε πρόγραμμα απώλειας βάρους >4 κιλά εντοπίσθηκαν: Σημαντική μείωση στο C. coccoides Bifidobacterium Αύξηση του Bacteroides fragilis και του φύλου Lactobacillus Escherichia coli Total bacteria Santacruz et al.,2010 Παχύσαρκες Εγκυμονούσες Υπέρβαρες εγκυμονούσες qpcr Bifidobacterium Lactobacillus Bacteroides Escherichia coli Staphylococcus Σημαντικά μειωμένα επίπεδα Bifidobacterium και Bacteroides και αυξημένα επίπεδα Staphylococcus και Escherichia coli στις παχύσαρκες έγκυες γυναίκες Total bacteria υποδηλώνει στατιστικά σημαντική διαφορά Συνοπτικά, σύμφωνα με τις παραπάνω έρευνες, καταλήγουμε σε συμπεράσματα αναφορικά με τους βακτηριακούς πληθυσμούς που μελετάμε και στην παρούσα εργασία. 59

60 Κεφάλαιο τέταρτο: Διατροφή και Εντερική Χλωρίδα Bacteroidetes Στην ομάδα των Armougom et al. διαπίστωσαν σημαντική μείωση των Bacteroidetes σε παχύσαρκους, συγκριτικά με άτομα κανονικού βάρους και ανορεξικούς χρησιμοποιώντας ποσοτική PCR (Armougon et al., 2009). Παράλληλα, η ανάλυση της αλληλουχίας των 16S rdna από 154 άτομα τα οποία αποτελούσαν μονοζυγωτικοί, διζυγωτικοί δίδυμοι και οι μητέρες τους, που πραγματοποίησε η ομάδα των Turnbaugh et al., έδειξε ότι συσχετίζεται η μικροβιακή εντερική χλωρίδα των παχύσαρκων ατόμων με μειωμένο επίπεδο ποικιλομορφίας και σημαντικά μικρότερο αριθμό Bacteroidetes (Turnbaugh et al., 2009). Από την άλλη πλευρά, η ομάδα των Schwiertz et al. μετρώντας ποσοτικά τους βακτηριακούς πληθυσμούς σε δείγματα κοπράνων από υπέρβαρους, παχύσαρκους και άτομα κανονικού βάρους διαπίστωσε σημαντικά αυξημένο τον αριθμό των Bacteroidetes σε παχύσαρκα και υπέρβαρα άτομα (Schwiertz et al., 2010). Σε έρευνα που συμμετείχαν έγκυες γυναίκες, παρατηρήθηκε ο αριθμός των Bacteroidetes να είναι υψηλότερος σε εκείνες που ήταν υπέρβαρες πριν την έναρξη της εγκυμοσύνης, ενώ επίσης, ο απόλυτος αριθμός του πληθυσμού σχετίστηκε θετικά με την αύξηση του βάρους τους κατά την εγκυμοσύνη (Collado et al., 2008). Ακόμα, η μέλετη της εντερικής χλωρίδας σε άτομα με νοσογόνο παχυσαρκία, άτομα φυσιολογικού βάρους και άτομα μετά από επέμβαση γαστρικού bypass, που πραγματοποιήθηκε από την ομάδα των Zhang et al. χρησιμοποιώντας 16S rdna pyrosequencing, φανέρωσε μεγαλύτερο εποικισμό στους παχύσαρκους με Prevotellaceae, ένα είδος που ανήκει στο φύλο των Bacteroidetes (Zhang et al., 2009). Υπάρχουν όμως και έρευνες όπου δεν βρέθηκε καμία συσχέτιση μεταξύ των Bacteroidetes και της δίαιτας ή της απώλειας βάρους, τόσο σε ενήλικες όσο και σε παιδιά (Ducan et al., 2008; Kalliomäki et al., 2008). Τέλος, πιο ειδικά, τα Bacteroides είναι Gram-αρνητικοί βάκιλοι οι οποίοι ανήκουν στην ευρύτερη οικογένεια των Bacteroidaceae και στο φύλο των Bacteroidetes. Η ομάδα των Santacruz et al. συσχέτισε την ποσότητα 60

61 Κεφάλαιο τέταρτο: Διατροφή και Εντερική Χλωρίδα των Bacteroides με την απώλεια βάρους και το βακτήριο Bacteroides fragilis με την κατανάλωση υδατανθράκων (Santacruz et al., 2009). Επίσης, η ομάδα των Nadal et al., μετά την υπαγωγή 39 εφήβων σε δίαιτα και άσκηση για δέκα εβδομάδες, βρήκε αυξημένη ποσότητα Bacteroides στην ομάδα εκείνων που πέτυχαν την μεγαλύτερη απώλεια βάρους (Nadal et al., 2009). Firmicutes Η ομάδα των Ley et al. παρατήρησε ότι σε παχύσαρκους τα μειωμένα επίπεδα των Bacteroidetes τείνουν να αντισταθμίζονται από αυξημένα επίπεδα Firmicutes, ενώ η αύξηση αυτή μπορoύσε να ελλατωθεί μετά από απώλεια βάρους (Ley et al., 2006). Παρόμοια ήταν τα αποτελέσματα κι άλλων ερευνών, όπου διαπιστώθηκε ότι σημαντικά μειωμένα επίπεδα σε Clostridium hystoliticum, Eubacterium rectale και Clostridium, τα οποία ανήκουν στο φύλο των Firmicutes, σχετίζονται με την απώλεια βάρους σε παχύσαρκους έφηβους (Nadal et al., 2009; Santacruz et al., 2009). Πιο συγκεκριμένα, τα Clostridium είναι Gram-θετικά, υποχρεωτικά αναερόβια βακτήρια, ανήκουν στην οικογένεια των Clostridiacaea και στο φύλο των Firmicutes. Η έρευνα των Santacruz et al. όπου μελετήθηκε η επιρροή της δίαιτας και της άσκησης σε εφήβους, έδειξε πως η μείωση του βάρους σχετίζεται με μειωμένη ποσότητα Clostridium coccoides (Santacruz et al., 2009). Ενώ παράλληλα, η αναλογία των Clostridium σχετίστηκε και με μειωμένη πρόσληψη υδατανθράκων (Ducan et al., 2008). Επιπλέον, τα Lactobacillus είναι Gram-θετικά βακτήρια, ανήκουν στην οικογένεια Lactobacillaceae και επίσης στο φύλο Firmicutes. Η ομάδα των Armougom et al. θεώρησε ότι το είδος Lactobacillus επηρεάζει αλλαγές στο βάρος, και στην έρευνα τους μεταξύ ανορεξικών, κανονικού βάρους και παχύσαρκων ατομών διαπίστωσαν σημαντικά υψηλότερες συγκεντρώσεις Lactobacillus σχεδόν για το 50% των παχύσαρκων συμμετεχόντων (Armougom et al., 2009). Ακόμα, σε άλλη έρευνα όπου συμμετείχαν 36 έφηβοι, οι οποίοι ακολούθησαν δίαιτα και άσκηση για δέκα εβδομάδες, παρατηρήθηκε αύξηση των Lactobacillus και συσχετίστηκε στατιστικώς 61

62 Κεφάλαιο τέταρτο: Διατροφή και Εντερική Χλωρίδα σημαντικά με τη μείωση βάρους (Santacruz et al., 2009). Τέλος, σε παχύσαρκους ασθενείς με διαβήτη τύπου ΙΙ, τα επίπεδα των Lactobacillus έχει δειχθεί να είναι επίσης στατιστικά σημαντικά αυξημένα (Larsen et al., 2010). Actinobacteria Πέρα από τα Bacteroidetes και Firmicutes, τα δύο κύρια φύλα της εντερικής χλωρίδας, και τα Actinobacteria φαίνεται να σχετίζονται επίσης με την αύξηση του σωματικού βάρους. Βασικός αντιπρόσωπος της επίδρασης των Actinobacteria είναι το γένος Bifidobacterium. Στην έρευνα των Turnbaugh et al., όπου μελετήθηκαν 18 δίδυμοι κανονικού βάρους ή παχύσαρκοι και οι μητέρες τους, παρατηρήθηκαν υψηλότερα επίπεδα Actinobacteria στα παχύσαρκα άτομα. Επιπρόσθετα, βρέθηκε ότι τα περισσότερα γονίδια (75%) που σχετίστηκαν με την παχυσαρκία προέρχονταν από Actinobacteria, και αρκετά από αυτά φάνηκε να εμπλέκονται στον μεταβολισμό υδατανθράκων, λιπαρών οξέων και αμινοξέων (Turnbaugh et al., 2009). Επιπλέον, οι Zhang et al. απέδειξαν ότι η εντερική χλωρίδα παχύσαρκων εποικίστηκε από βακτήρια της οικογένειας Coriobacteriaceae, που ανήκουν στο φύλο των Actinobacteria (Zhang et al., 2009). Αντίθετα, η συγκέντρωση του γένους Bifidobacterium μετρήθηκε στατιστικά σημαντικά χαμηλότερη, από τους Santacruz et al., σε παχύσαρκα άτομα σε σχέση με άτομα κανονικού βάρους (Santacruz et al., 2009). Το εύρημα αυτό είναι σύμφωνο με τα αποτελέσματα κι άλλων ερευνητικών ομάδων (Kalliomäki et al., 2008; Schwiertz et al., 2010). Ενώ, η ομάδα των Zuo et al. βρήκε μη στατιστικά σημαντική μείωση των Bifidobacteria μεταξύ παχύσαρκων και κανονικού βάρους ατόμων (Zuo et al., 2011). 62

63 Κεφάλαιο τέταρτο: Διατροφή και Εντερική Χλωρίδα Proteobacteria Τα βακτήρια Enterobacter είναι Gram-αρνητικά και περιλαμβάνουν αρκετά παθογόνα, όπως Escherichia coli. Η ερυνητική ομάδα των Sotos et al. μελέτησε 8 υπέρβαρα και παχύσαρκα άτομα, τα οποία υποβλήθηκαν σε υποθερμιδική δίαιτα για να επιτύχουν απώλεια βάρους. Παρατηρήθηκε μείωση της συγκέντρωσης της οικογένειας Enterobacteriaceae στην ομάδα των εθελοντών με την μεγαλύτερη απώλεια βάρους, ενώ βρέθηκε επίσης ελλατωμένη συγκέντρωση Eubacterium στα άτομα με μικρότερη απώλεια βάρους (Sotos et al.,2008). 4.4 Σύσταση της δίαιτας και εντερική χλωρίδα Οι διατροφικές συνήθειες θεωρούνται ένας από τους κύριους παράγοντες που επηρεάζουν και συμβάλλουν στην σύνθεση της ανθρώπινης εντερικής μικροβιακής χλωρίδας. Σε έρευνες με ανθρώπους ή πειραματόζωα, έχει μελετηθεί η σχέση μεταξύ συγκεκριμένων μακροθρεπτικών και μικροθρεπτικών συστατικών με της σύσταση της εντερικής χλωρίδας. Στην έρευνα των De Filippo et al., όπου συγκρίθηκε η σύνθεση της εντερικής χλωρίδας παιδιών από ένα αγροτικό χωριό στην Αφρική και από περιοχές Ευρωπαϊκές, η παρουσία των ειδών Prevotella, Xylanibacter και Treponema συνδέθηκε με την υψηλή πρόσληψη φυτικών ινών, για να επιτευχθεί μέγιστη απόδοση ενέργειας από τους πολυσακχαρίτες της διατροφής ( De Filippo et al., 2010). Παράλληλα, η ομάδα των Wu et al. χρησιμοποιώντας δείγματα κοπράνων και ερωτηματολόγια διαιτητικών συνηθειών από 98 άτομα, παρατήρησε ότι οι μακροχρόνιες διατροφικές συνήθειες μπορούν να επηρεάσουν την σύσταση της εντερικής χλωρίδας, ενώ η μικρής χρονικής διάρκειας αλλαγές δεν έχουν κανένα αποτέλεσμα. Ακόμα, βρέθηκε συσχέτιση του γένους Bacteroides με δίαιτα πλούσια σε πρωτεΐνες και ζωϊκής 63

64 Κεφάλαιο τέταρτο: Διατροφή και Εντερική Χλωρίδα προέλευσης λίπος, και συσχέτιση του γένους Prevotella με δίαιτα πλούσια σε υδατάνθρακες (Wu et al., 2011). Σε άλλη μελέτη, βρέθηκε ότι η χορτοφαγική δίαιτα μπορεί να επηρεάσει την εντερική χλωρίδα, κυρίως με μειωμένη ποσότητα και αλλαγή στην ποικιλομορφία των Clostridium (Liszt et al., 2009). Η ερευνητική ομάδα των Walker et al. χώρισε υπέρβαρους άνδρες σε τρεις ομάδες και τους υπέβαλε σε (α) δίαιτα ελέγχου, (β) δίαιτα με υψηλή περιέκτικοτητα σε σύνθετους υδατάνθρακες ή μη αμυλούχους πολυσακχαρίτες και (γ) σε υποθερμιδική δίαιτα απώλειας βάρους με μειωμένη περιέκτικοτητα υδατανθράκων, για περισσότερες από δέκα εβδομάδες. Στα αποτελέσματα αυτής της έρευνας δεν παρατηρήθηκε καμία σημαντική επίδραση της διατροφής στις συγκεντρώσεις των Bacteroidetes, Firmicutes, Actinobacteria ή Proteobacteria της εντερικής χλωρίδας των συμμετεχόντων από όλες τις ομάδες. Ωστόσο, τα Eubacterium rectal και Ruminococcus bromii φάνηκε να αυξάνονται με την δίαιτα που περιείχε υψηλούς σύνθετους υδατάνθρακες, ενώ το Collinsella aerofaciens φάνηκε να μειώνεται με την υποθερμιδική δίαιτα (Walker et al., 2011). Επίσης στην ερευνητική εργασία των Mai et al. βρέθηκε ότι τα άτομα που προσλαμβάνουν το μεγαλύτερο μέρος των ημερήσιων θερμίδων τους από λίπος, έχουν μειωμένα Clostridia. Όταν όμως μεγαλώνει η πρόσληψη ετεροκυκλικών αμινών, ενώσεων που παράγονται κατά την επεξεργάσια του κρέατος σε υψηλές θερμοκρασίες, αυξάνεται και η συγκέντρωση των Clostiria. Ενώ, η κατανάλωση διαιτητικών ινών, και πιο συγκεκριμένα από δημητριακά, φρούτα, λαχανικά, και όχι από όσπρια, συσχετίστηκε θετικά με την παρουσία και την ποσότητα Lactic Acic Bacteria, τα οποία έχουν ευεργετικές ιδιότητες (Mai et al.,2009). Σε έρευνες με νεογνά, έχει δειχθεί ότι όσα τελειόμηνα βρέφη γεννήθηκαν με φυσιολογικό τοκετό και θήλασαν αποκλειστικά παρουσίασαν την πιο ευεργετική μικροβιακή εντερική χλωρίδα, που χαρακτηρίζεται από υψηλό αριθμό Bifidobacteria και μειωμένες συγκεντρώσεις σε E.coli και C.difficile (Penders et al., 2006). Από την άλλη πλευρά, παρατηρήθηκαν διαφορές στην εντερική χλωρίδα ανάλογα με το γάλα που κατανάλωναν, δλδ 64

65 Κεφάλαιο τέταρτο: Διατροφή και Εντερική Χλωρίδα γάλα αγελάδας ή παιδική φόρμουλα, με ή χωρίς συμπλήρωμα ιχθυελαίων, οι οποίες εικάζεται ότι σχετίζονται με την πρόσληψη σιδήρου και ω-3 πολυακόρεστων λιπαρών οξέων (Nielsen et al., 2007). Τέλος, η ομάδα των Turnbaugh et al. χρησιμοποίησε δύο ομάδες ποντικιών που ακολούθησαν διαφορετικές δίαιτες. Η πρώτη ομάδα υποβλήθηκε σε δίαιτα πλούσια σε υδατάνθρακες και η δεύτερη ομάδα σε μια δυτικού τύπου δίαιτα, υψηλή σε λίπος και σάκχαρα. Η ομάδα που ακολούθησε την δυτικού τύπου δίαιτα αύξησε περισσότερο το σωματικό βάρος και το υποδόριο λίπος, ενώ παράλληλα είχε στατιστικά σημαντικά μεγαλύτερη ποσότητα Firmicutes και μικρότερη αναλογία Bacteroidetes. Μετα-ανάλυση των αποτελεσμάτων έδειξε ότι όσα ποντίκια ακολούθησαν την δυτικού τύπου δίαιτα παρήγαγαν υψηλότερες συγκεντρώσεις τελικών προϊόντων βακτηριακής ζύμωσης, όπως οξικό και βουτυρικό οξύ (Turnbaugh et al., 2008). 4.5 Οικογενειακό περιβάλλον και εντερική χλωρίδα Οι ατομικές προτιμήσεις έναντι σε τρόφιμα αναπτύσσονται από την γενετικά καθορισμένη προδιάθεση να είναι αρεστές η γλυκιά και η αλμυρή γεύση και να είναι απωθητικές η πικρή και η ξινή γεύση. Ωστόσο, η γενετική αυτή προδιάθεση τροποποιείται μέσα από την εμπειρία κάθε ανθρώπου, και καταλήγουμε σε διαφορετικές προτιμήσεις. Μηχανισμοί που επηρεάζουν την ανάπτυξη της γεύσης περιλαμβάνουν: την έκθεση σε ποικιλία τροφίμων, την μάθηση γεύσεων, την πληροφόρηση σχετικά με τα θρεπτικά συστατικά των τροφίμων και τις ιδιότητές τους (Scaglioni et al., 2008). Ένα μεγάλο μέρος της εκπαίδευσης για τα τρόφιμα και την διατροφή λαμβάνει χώρα κατά την μετάβαση από την αποκλειστή διατροφή με γάλα της βρεφικής ηλικίας, έως την προσαρμογή σε ένα πλήρες διαιτολόγιο στην αρχή της παιδικής ηλικίας. Παράγοντες, όπως η γενετική προδιάθεση στην γλυκιά και την αλμυρή γεύση, και η τάση των παιδιών να απορρίπτουν νέα 65

66 Κεφάλαιο τέταρτο: Διατροφή και Εντερική Χλωρίδα τρόφιμα (νεοφοβία), εμποδίζουν την πρώιμη εκμάθηση. Για το λόγο αυτό, ο ρόλος των γονέων θεωρείται πολύ σημαντικός (Birch et al., 1998). Οι γονείς διαδραματίζουν καίριο ρόλο στην ανάπτυξη των διατροφικών προτιμήσεων του παιδιού τους και την πρόσληψη σε ενέργεια, αν και υπάρχουν ενδείξεις για έναν έμφυτο μηχανισμό που ρυθμίζει την όρεξη και κατά συνέπεια την ενεργειακή πρόσληψη. Τα στοιχεία δείχνουν ότι τα παιδία είναι σε θέση να ανταποκριθούν στην ενεργειακή πυκνότητα των τροφίμων και πως, μολονότι η ενεργειακή πρόσληψη στα επιμέρους γέυματα είναι ακανόνιστη, η συνολική ενεργειακή πρόσληψη του εικοσιτεραώρου είναι αρκετά καλά οργανωμένη. Έχει δειχθεί ότι ορισμένες πρακτικές σίτισης των παιδιών, όπως η άσκηση υπερβολικού έλεγχου στην ποσότητα και την ποιότητα του φαγητού, μπορεί να συμβάλει στην αύξηση του βάρους. Πιο συγκεκριμένα, η επιβολή αυστηρού γονεϊκού ελέγχου φαίνεται να ενισχύει τις προτιμήσεις των παιδιών σε τρόφιμα ενεργειακά πυκνά και πλούσια σε λιπαρά, και ταυτόχρονα να περιορίζει την αποδοχή τροφίμων που θεωρούνται υγειινά, συνήθως φρούτων και λαχανικών. Παράλληλα, λειτουργεί σαν παράγοντας απορύθμισης των αισθημάτων πείνας και κορεσμού (Birch et al., 1998; Scaglioni et al, 2008). Επιπρόσθετα, το οικογενειακό περιβάλλον πιθανά να συμβάλλει επίσης στην διαμόρφωση των διατροφικών συνηθειών. Ο παράγοντας του οικογενειακού περιβάλλοντος περιλαμβάνει τις μεθόδους σίτισης του παιδιού και τις διατροφικές συμπεριφορές των γονέων. Έχει παρατηρηθεί ότι υπέρβαροι γονείς τείνουν να έχουν υπέρβαρα παιδιά. Πιο αναλυτικά, οι υπέρβαροι γονείς συνήθως είτε αντιμετωπίζουν προβλήματα με τον δικό τους έλεγχο στη πρόσληψη τροφής είτε ανησυχώντας για την πιθανότητα το παιδί τους να γίνει υπέρβαρο, υιοθετούν αυστηρές πρακτικές σχετικά με την σίστιση του. Η προσπάθεια αυτή όμως μοιάζει να αλληλεπιδρά με παράγοντες γενετικής προδιάθεσης, και καταλήγει να προωθεί την ανάπτυξη προβληματικών προτύπων διατροφής και παιδικής παχυσαρκίας. Έτσι, αν και το γενετικό υπόβαθρο έχει ρόλο στην διαμόρφωση διατροφικών συνηθειών, οι οικογενειακοί περιβαλλοντικοί παράγοντες, όπως η υπερφαγία και η απουσία ανοστολών των γονέων ή οι πρακτικές ανατροφής των παιδιών, 66

67 Κεφάλαιο τέταρτο: Διατροφή και Εντερική Χλωρίδα είναι μάλλον πιο ισχυροί (Birch et al., 2001). Ακόμα, τα παιδιά είναι πιο πιθανό να αναπτύξουν διαφορετικές συνήθειες διατροφής σε συναισθηματικά θετικές ατμόσφαιρες. Τόσο οι γονείς, όσο και αδέρφια ή συμμαθητές μπορούνα να λειτουργήσουν σαν θετικά πρότυπα για την δοκιμή νέων τροφίμων και την αλλαγή συμπεριφοράς απέναντι στο φαγητό (Benton, 2004). Σύμφωνα με τα προηγούμενα, μπορεί εύκολα κανείς να κατανοήσει την σημασία και την επίδραση που έχει το οικογενειακό περιβάλλον στην διαμόρφωση διαιτητικών συνηθειών, αρχικά στα παιδιά και κατ επέκταση και στους ενήλικες. Εξαιτίας της επιρροής της δίαιτας στην σύνθεση της εντερικής χλωρίδας, είναι λογικό να υποτεθεί ότι το οικογενειακό περιβάλλον θα μπορούσε να λειτουργεί σαν ένας ακόμα παράγοντας που επηρεάζει την εντερική μικροβιακή χλωρίδα. Όμως, προς το παρόν δεν υπάρχουν ερευνητικά δεδομένα προς αυτή την κατεύθυνση. Επομένως, είναι απαραίτητο να πραγματοποιηθούν μελέτες που να διερευνούν αυτή την πιθανή συσχέτιση για να υπάρξουν σαφή συμπεράσματα. 67

68 ΙΙ. Υλικά και Μέθοδοι 68

69 Κεφάλαιο πέμπτο: Χαρακτηριστικά της έρευνας Χαρακτηριστικά της έρευνας 5.1 Σκοπός Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν να διερευνήσει την επίδραση του οικογενειακού περιβάλλοντος, μέσα από την καταγραφή των διατροφικών συνηθειών, επιλογών και συμπεριφορών εθελοντών, λαμβάνοντας σαν δεδομένο τη γενετική συνάφεια, στην σύσταση της εντερικής μικροβιακής χλωρίδας, μελετώντας με μοριακή μέθοδο τις διαφορές ποιοτικές και ποσοτικές του εντερικού βακτηριακού φορτίου κάθε συμμετέχοντα. Σε όλες τις διαδικασίες και πρακτικές, δόθηκε βάρος στην διατήρηση πολύ αυστηρού πειραματικού πρωτοκόλλου, ενώ παράλληλα συλλέχθηκαν πληροφορίες που είναι πιθανό να σχετίζονται με αλλαγές της εντερικής σύστασης, όπως η παρουσία ή όχι υπερβάλλοντος βάρους, η κατάσταση υγείας των συμμετεχόντων και η ηλικία τους. 5.2 Επιδημιολογικά στοιχεία Πληθυσμός Τα άτομα που συμμετείχαν στην έρευνα, είναι μέλη οικογενειών που κατοικούν στην περιοχή της Πάτρας, ενήλικες, και αφού πληροφορήθηκαν εκτενώς για τον σκοπό και την μεθεδολογιά της, συνένεσαν εθελοντικά. 69

70 Κεφάλαιο πέμπτο: Χαρακτηριστικά της έρευνας Την διεξαγωγή της έρευνας ενέκρινε ομόφωνα το Επιστημονικό Συμβούλιο του νοσοκομείου Πατρών «ο Άγιος Ανδρέας», μετά από συνεδρίαση, με αριθμό πρωτοκόλλου 195/ Το δείγμα στην παρούσα μελέτη αποτέλεσαν 35 άτομα, από 12 οικογένειες, 13 άνδρες και 22 γυναίκες, ηλικίας από 18 ετών έως και 77 ετών. Οι συμμετέχοντες διαχωρίστηκαν σε τρεις ομάδες, με βάση το ΔΜΣ, και πιο συγκεκριμένα, χαρακτηρίστηκαν φυσιολογικού βάρους (νορμοβαρείς) άτομα με ΔΜΣ=18,5-24,9kg/m 2, υπέρβαροι άτομα με ΔΜΣ=25-29,9kg/m 2 και παχύσαρκοι άτομα με ΔΜΣ>30kg/m 2 (WHO). Κατηγορία Φυσιολογικού βάρους (NW-Normal Weight) Υπέρβαροι (OV-Overweight) Παχύσαρκοι (OB-Obese) Χαρακτηριστικά Άτομα με ΔΜΣ=18,5-24,9kg/m 2 Άτομα με ΔΜΣ=25-29,9kg/m 2 Άτομα με ΔΜΣ>30kg/m 2 Πίνακας 5.1: Διαχωρισμός των εθελοντών σύμφωνα με το ΔΜΣ τους. Κατά την διεξαγωγή της έρευνας χρησιμοποιήθηκαν επίσης κριτήρια αποκλεισμού, τα οποία ήταν: (1) οι εθελοντές να είναι ενήλικες, (2) να μην έχει γίνει χρήση αντιβιοτικών για τουλάχιστον ένα μήνα πριν, (3) να μην λαμβάνουν πρεβιοτικά ή προβιοτικά για τουλάχιστον δύο μήνες πριν, και (4) να μην αντιμετωπίζουν γαστρεντερικά συμπτώματα-προβλήματα, διότι θα μπορούσαν να αλλοιώσουν την εντερική μικροβιακή χλωρίδα. 70

71 Κεφάλαιο πέμπτο: Χαρακτηριστικά της έρευνας Μετρήσεις, Δειγματοληψία και Ερωτηματολόγια Μετρήθηκαν το βάρος και το ύψος κάθε εθελοντή, και υπολογίστηκε ο δείκτης μάζας σώματος (ΔΜΣ). Δόθηκαν αποστειρωμένα δοχεία συλλογής κοπράνων σε κάθε συμμετέχοντα, και σαφείς οδηγίες για την συλλογή τους. Κάθε δείγμα διατηρήθηκε σε συνθήκες ψύξης, μέχρι να μεταφερθεί το συντομότερο δυνατό (λιγότερο από 24 ώρες) στο εργαστήριο, όπου έγινε απομόνωση ολικού DNA και διατήρησή του στους -20 ο C. Η διαδικασία αυτή ακολουθήθηκε προκειμένου να διατηρηθεί κατά το δυνατόν αρτιότερα ο βακτηριακός πληθυσμός, με ελάχιστες απώλειες, και επομένως χωρίς αλλοιώσεις των αποτελεσμάτων. Τέλος, από κάθε άτομο ζητήθηκε να συμπληρώσει τρία ερωτηματολόγια. Το πρώτο αφορούσε σε δημογραφικά, κοινωνικο-οικονομικά χαρακτηριστικά, και ένα μικρό ιατροφαρμακευτικό ιστορικό. Τα άλλα δύο ερωτηματολόγια περιελάμβαναν ερωτήσεις αναφορικά με τις διαιτητικές και διατροφικές τους συνήθειες, κυρίως τους τελευταίους δύο μήνες. Το πρώτο ήταν το ερωτηματολόγιο εκτίμησης υιοθέτησης της Μεσογειακής διατροφής MedDiet Score (Panagiotakos et al., 2007) και το δεύτερο ήταν ένα Ερωτηματολόγιο Συχνότητας Κατανάλωσης Τροφίμων (ΕΣΚΤ) με 36 ερωτήσεις πολλαπλής επιλογής (Bountziouka et al., 2011). Αντίγραφα των ερωτηματολογίων βρίσκονται στο Παράρτημα. Το ερωτηματολόγιο MedDiet Score έχει σχεδιαστεί για να αξιολογήσει την συμμόρφωση του ερωτηθέντα στο πρότυπο της Μεσογειακής Διατροφής. Σύμφωνα με τις διαιτητικές συνήθειες που διαμορφώνουν το πρότυπο, το ερωτηματολόγιο περιλαμβάνει την εβδομαδιαία κατανάλωση 9 κύριων ομάδων τροφίμων: τα μη επεξεργασμένα δημητριακά (ολικής άλεσης δημητριακά και ψωμί, καστανό ρύζι, κα), τα φρούτα, τα λαχανικά, τα όσπρια, τις πατάτες, τα ψάρια, το κρέας και τα προϊόντα κρέατος, τα πουλερικά, τα 71

72 Κεφάλαιο πέμπτο: Χαρακτηριστικά της έρευνας πλήρη γαλακτοκομικά προϊόντα (τυρί, γιαούρτι, γάλα), το ελαιόλαδο και το αλκοόλ. Με βάση την προτεινόμενη πρόσληψη κάθε ομάδας τροφίιμων και χρησιμοποιώντας μονοτονικές συναρτήσεις, με εξαίρεση το αλκοόλ, οι ερευνητές κατέληξαν στην αξιολόγηση των αντίστοιχων συχνοτήτων. Από τους ερευνητές, για κάθε ομάδα τροφίμων δίνεται ένας βαθμός, από 0 έως 5 ή αντίστροφα, σύμφωνα με τη θέση τους στην Μεσογειακή διατροφική πυραμίδα. Για την κατανάλωση τροφίμων που θεωρούνται κοντά στο μεσογειακό πρότυπο, δηλαδή για όσα συστήνεται η κατανάλωση τους καθημερινά ή σε ποσότητες >3μερίδες/εβδομάδα, δίνεται σκορ από 1 εως 5 για σπάνια εως καθημερινή κατανάλωση και 0 για απουσία κατανάλωσης. Οι πατάτες συμπεριλαμβάνονται επίσης στο ερωτηματολόγιο, διότι αποτελούν καλή πηγή βιταμινών C, B1, B2, νιασίνης, υδατανθράκων, καλίου και μαγνησίου, παρότι η κατανάλωση τους έχει συσχετιστεί με σακχαρώδη διαβήτη εξαιτίας του υψηλού τους γλυκαιμικού δείκτη. Για την κατανάλωση τροφίμων που θεωρούνται μακριά από το μεσογειακό πρότυπο, δηλαδή για όσα συστήνεται σπάνια ή μηνιαία κατανάλωση, η βαθμολόγηση του σκορ γίνεται με αντίστροφη φορά από 5 για μηδενική κατανάλωση εως 0 για καθημερινή κατανάλωση. Ενώ για το αλκοόλ, αποδίδεται σκορ 5 για κατανάλωση < 300ml/ημέρα, σκορ 0 για κατανάλωση >700ml/ημέρα και σκορ από 4-1 για κατανάλωση ml/ημέρα, ml/ημέρα, ml/ημέρα, ml/ημέρα αντίστοιχα. Τελικά, το ερωτηματολόγιο λαμβάνει τιμές σκορ 0-55, όπου υψηλότερες τιμές υποδεικνύουν μεγαλύτερη συμμόρφωση στα πρότυπα της μεσογειακής διατροφής (Panagiotakos et al., 2007). Το ΕΣΚΤ αποτελείται από 30 ερωτήσεις αναφορικά με την κατανάλωση συγκεκριμένων τροφίμων από τις κύριες ομάδες τροφίμων (φρούτα, λαχανικά, γαλακτοκομικά, αμυλούχα, κρέας και ψάρι) και ακόμα 6 ερωτήσεις που αφορούν στην διατροφική συμπεριφορά (Bountziouka et al., 2011). 72

73 Κεφάλαιο πέμπτο: Χαρακτηριστικά της έρευνας Για το πρώτο μέρος του ερωτηματολογίου, κάθε εθελοντής ανέφερε την συχνότητα κατανάλωσης των επιλεγμένων τροφίμων κατά μέσο όρο για τους τελευταίους 2 μήνες. Οι επιλογές των απαντήσεων ήταν ποτέ/σπάνια, 1-3φορές/μήνα, 1-2φορές/εβδομάδα, 3-6φορές/εβδομάδα, 1φορά/ημέρα, και >2φορές/ημέρα. Στις απαντήσεις αυτές δίνονται αριθμοί από 1 εως 6 αντίστοιχα, προσδιορίζοντας την συχνότητα διαιτητικής πρόσληψης για κάθε τρόφιμο. Συνεπώς, μεγαλύτερες τιμές αντικατοπτρίζουν μεγαλύτερη διατροφική κατανάλωση. Το δεύτερο μέρος του ερωτηματολογίου αποτελούν οι εξής ερωτήσεις: Πόσες φορές χρησιμοποιείς ελαιόλαδο (οπουδήποτε); Πόσες φορές χρησιμοποιείς άλλου είδους λίπος ή έλαιο (οπουδήποτε); Πόσο συχνά καταναλώνεις προϊόντα ολικής άλεσης; Πόσο συχνά παραγγέλνεις απ έξω ή τρως εκτός σπιτιού; Πόσο συχνά καταναλώνεις πρωϊνό; Όπου οι επιλογές των πιθανών απαντήσεων ήταν επίσης ποτέ/σπάνια, 1-3φορές/μήνα, 1-2φορές/εβδομάδα, 3-6φορές/εβδομάδα, 1φορά/ημέρα, και >2φορές/ημέρα. Και η τελευταία ερώτηση: Πόσα γεύματα έχεις συνολικά την μέρα, μαζί με τα σνάκ; Μπορούσε να απαντηθεί με 1-3, 4-5 ή >6 γεύματα και σνάκ/ ημέρα. 73

74 Κεφάλαιο πέμπτο: Χαρακτηριστικά της έρευνας Υπο μελέτη μικροοργανισμοί Σύμφωνα με την βιβλιογραφία, η εντερική χλωρίδα αποτελείται κυρίως από δύο φύλα, αυτά των Bacteroidetes και των Firmicutes. Επίσης, σε μικρότερη αλλά σημαντική ποσότητα βρίσκονται και άλλα δύο φύλα, εκείνα των Proteobacteria και των Actinobacteria. Τα γένη των βακτηρίων που επιλέχθηκαν προς μελέτη ανήκουν σε αυτά τα φύλα, και πιο συγκεκριμένα είναι τα εξής: 1. Enterobacter, το οποίο ανήκει στο φύλο των Proteobacteria. 2. Clostridium, το οποίο ανήκει στο φύλο των Firmicutes. 3. Lactobacillus, το οποίο ανήκει στο φύλο των Firmicutes. 4. Bacteroides, το οποίο ανήκει στο φύλο των Bacteroidetes. 5. Bifidobacterium, το οποίο ανήκει στο φύλο των Actinobacteria. 74

75 Κεφάλαιο πέμπτο: Χαρακτηριστικά της έρευνας 5.3 Πειραματική διαδικασία Απομόνωση DNA Για την απομόνωση του DNA χρησιμοποιήθηκε το QIAamp DNA stool Minikit της εταιρίας GIAGEN και το αντίστοιχο πρωτόκολλο, Using stool tubes for isolation of DNA from stool for pathogen Detection, λίγο τροποποιημένο. Αναλυτικά: 1. Ζυγίζουμε περίπου 2g κόπρανα από κάθε δείγμα προς επεξεργασία, και τα τοποθετούμε σε αποστειρωμένο falcon χωρητικότητας 15mL. 2. Σε καθένα από τα falcons προσθέτουμε διάλυμα PBS όγκου ίσο με 5mL/g κοπράνων που ζυγίσαμε νωρίτερα, και κάνουμε συνεχόμενα vortex μέχρι να ομογενοποιηθεί. 3. Απο κάθε ομογενοποιημένο διάλυμα λαμβάνουμε 200μL, σε eppendorfs όγκου 2mL. Αν χρειάζεται κόβουμε την μύτη των tips. 4. Προσθέτουμε 1,6mL από το Buffer ASL σε κάθε eppendorf. Προηγουμένως, έχουμε θερμάνει σε υδατόλουτρο 70 o C το Buffer ASL προκειμένου τα ένζυμα λύσης να λειτουργήσουν καλύτερα. 5. Έπειτα τοποθετούμε τα eppendorfs σε υδατόλουτρο 95 o C, για δέκα λεπτά, κάνοντας συχνά vortex για βέλτιστη λύση. Παράλληλα, η θέρμανση στο υδατόλουτρο αυξάνει την συνολική απόδοση του DNA, και μπορεί να την τριπλασιάσει εως και να την πενταπλασιάσει ενώ καταστρέφει παράσιτα. 6. Κάνουμε φυγοκέντρηση των δειγμάτων στις 14000στροφές/λεπτό για δέκα λεπτά. 7. Σε νέα αποστειρωμένα eppendorfs όγκου 2mL, λαμβάνουμε 1,2mL από το υπερκείμενο της φυγοκέντρησης. 75

76 Κεφάλαιο πέμπτο: Χαρακτηριστικά της έρευνας 8. Σε κάθε δείγμα προσθέτουμε ένα χάπι αποδέσμευσης αναστολέων (Inhibitex tablet), και κάνουμε συνεχόμενα vortex έως ότου η ταμπλέτα διαλυθεί τελείως. Αφήνουμε σε θερμοκρασία δωματίου για ένα λεπτό περίπου, ώστε οι αναστολείς να απορροφηθούν πλήρως. 9. Φυγοκεντρούμε για πέντε λεπτά στις 14000στροφές/λεπτό. 10. Σε νέα αποστειρωμένα eppendorfs όγκου 2mL λαμβάνουμε το υπερκείμενο της φυγοκέντρησης, περίπου 800μL. 11. Φυγοκεντρούμε για τρία λεπτά στις 14000στροφές/λεπτό. 12. Σε νέα αποστειρωμένα eppendorfs όγκου 1,5mL, όπου έχουμε ήδη τοποθετήσει από 30μL πρωτεϊνάσης Κ (prok), προσθέτουμε 400μL από το υπερκείμενο της φυγοκέντρησης. 13. Προσθέτουμε ακόμα 400μL Buffer AL σε κάθε δείγμα και κάνουμε vortex για ένα λεπτό περίπου. 14. Τοποθετούμε τα δείγματα σε υδατόλουτρο 70 o C για δέκα λεπτά. 15. Προσθέτουμε 400μL αιθανόλης (100%) σε κάθε δείγμα, κάνουμε vortex και στη συνέχεια φυγοκέντρηση για ένα λεπτό στις 14000στροφές/λεπτό. 16. Σε δύο στάδια, τοποθετούμε το σύνολο του περιεχομένου των eppendorfs σε ειδική στήλη QIAmp και φυγοκεντρούμε για ένα λεπτό στις 14000στροφές/λεπτό, σε κάθε στάδιο. 17. Προσεκτικά αντικαθιστούμε τις στήλες, τις ανοίγουμε και προσθέτουμε 500μL Buffer AW Φυγοκεντρούμε για ένα λεπτό στις 14000στροφές/λεπτό. 19. Προσεκτικά αντικαθιστούμε ξανά τις στήλες, τις ανοίγουμε και προσθέτουμε 500μL Buffer AW Κάνουμε φυγοκέντρηση για τρία λεπτά στις 14000στροφές/λεπτό. 76

77 Κεφάλαιο πέμπτο: Χαρακτηριστικά της έρευνας 21. Προσεκτικά αντικαθιστούμε ξανά τις στήλες και κάνουμε εκ νέου φυγοκέντρηση για ένα λεπτό στις 14000στροφές/λεπτό. 22. Τοποθετούμε τις στήλες σε νέα αποστειρωμένα eppendorfs όγκου 1,5mL. 23. Σε κάθε δείγμα προσθέτουμε 200μL Buffer AE, και τα αφήνουμε σε θερμοκρασία δωματίου για ένα-δύο λεπτά για να επιτύχουμε την βέλτιστη έκλουση. 24. Κάνουμε φυγοκέντρηση για πέντε λεπτά στις 8000στροφές/λεπτό. 25. Αποσύρουμε το μέρος της στήλης που περιλαμβάνει την QIAmp μεμβράνη και αποθηκεύουμε τα eppendorfs με το απομονωμένο DNA στους -20 o C Φθοριομέτηση Για την φθοριομέτρηση χρησιμοποιήθηκε το Qubit TM dsdna HS Assay Kit, και το φθοριόμετρο Qubit 2.0 Fluorometer, της εταιρείας Invitrogen. Με την μέθοδο της φθοριομετρίας έγινε ποιοτικός έλεγχος των δειγμάτων και υπολογίστηκε η συγκέντωση απομονωμένου DNA(μg/mL) σε κάθε δείγμα. Εξαιτίας της φωτοευαίσθητης φύσης της φθορίζουσας χρωστικής, Qubit TM dsdna HS Reagent, όλη η διαδικασίας γίνεται χωρίς να υπάρχει απευθείας έκθεση σε φως. Πρωτόκολλο: 1. Παρασκευάζουμε το standard διάλυμα με συγκέντρωση 1:200, δηλαδή σε κάθε tube που περιέχει 1990μL Qubit TM dsdna HS Buffer προσθέτονται 10μL Qubit TM dsdna HS Reagent. Για καλύτερη ανάμειξη κάνουμε vortex για 2-3sec, στη συνέχεια καλύπτουμε με αλουμινόχαρτο για περισσότερη προστασία από το φως και περιμένουμε είκοσι λεπτά. 77

78 Κεφάλαιο πέμπτο: Χαρακτηριστικά της έρευνας 2. Βγάζουμε τα δείγματα από τους -20 o C, που έχουν φυλαχθεί, και τα τοποθετούμε σε δοχείο με πάγο, ώστε να αποφύγουμε πιθανές αλλοιώσεις. 3. Κατασκευάζουμε τα πρότυπα δείγματα. Σε δυο ξεχωριστά tubes προσθέτουμε από 190μL standard διαλύματος και 10μL από το κάθε πρότυπο διάλυμα (st1 και st2). Κάνουμε vortex για 2-3sec και περιμένουμε δύο λεπτά. 4. Η ίδια διαδικασία επαναλαμβάνεται για όλα τα δείγματα μας, χρησιμοποιώντας όγκο δείγματος 3μL-20μL, και αντίστοιχα όγκο standard διαλύματος 197μL-180μL. 5. Κάνουμε vortex και έπειτα αφήνουμε σε θερμοκρασία δωματίου για δυο λεπτά, προκειμένου να έχουμε καλό σήμα φθορισμού. Χρησιμοποιώντας τις παραπάνω ποσότητες για κάθε δείγμα, καταλήγουμε να έχουμε τουλάχιστον τρεις διαφορετικές αραιώσεις σε κάθε περίπτωση ώστε να διασφαλίσουμε την ακρίβεια της μέτρησης. 6. Επιλέγουμε φθοριομέτρηση δίκλωνου DNA υψηλής ευαισθησίας (Quant-iT dsdna, HS). 7. Βαθμονομούμε, τοποθετώντας πρώτα το δείγμα St1 και στη συνέχεια το St2. 8. Φθοριομετρούμε τα δείγματα μας, σε παραπάνω από μια αραιώσεις, και υπολογίζουμε τον μέσο όρο των μετρήσεων. Αξίζει να σημειωθεί ότι το Qubit TM dsdna HS Assay Kit έχει κατασκευαστεί να λειτουργεί βέλτιστα σε θερμοκρασία δωματίου. Έτσι, όλες οι ενέργεις πρέπει να γίνονται σε θερμοκρασία o C, χωρίς να υπάρχουν διακυμάνσεις όσο το δυνατόν. Για το λόγο αυτό, αποφεύγουμε να κρατάμε για ώρα στο χέρι τα tubes με τα διαλύματα για φθοριομέτρηση. Τέλος, προσπαθούμε η παραμονή τους στο φθοριόμετρο να είναι η ελάχιστη δυνατή (Qubit TM dsdna HS Assay Manual, 2010). 78

79 Κεφάλαιο πέμπτο: Χαρακτηριστικά της έρευνας Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) Αρχή της μεθόδου Η τεχνική της PCR δίνει την δυνατότητα της αντιγραφής νουκλεοτιδικών αλληλουχιών, εκλεκτικά και σε μεγάλες ποσότητες, από οποιδήποτε δείγμα DNA. Η εφαρμογή της βασίζεται στην χρήση της DNA πολυμεράσης για τον πολλαπλασιασμό της επιθυμητής νουκλεοτιδικής αλληλουχίας, σε επαναλαμβανόμενους κύκλους αντιγραφής. Το ένζυμο καθοδηγείται στην αλληλουχία που επιδιώκουμε να αντιγραφεί από ολιγονουκλεοτίδια, συμπληρωματικά της αλληλουχίας, τους εκκινητές (primers). Οι εκκινητές δεν υποβοηθούν μόνο την έναρξη της αντιγραφής της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας αλλά και ορίζουν το προς αντιγραφή τμήμα. Η παρασκευή τους γίνεται με χημική σύνθεση. Για το λόγο αυτό, απαραίτητη προϋπόθεση της μεθόδου είναι να είναι γνωστά τα άκρα της προς αντιγραφή αλληλουχίας. Η μέθοδος της PCR είναι εξαιρετικά ευαίσθητη. Επιτρέπει την γρήγορη ενίσχυση περιοχών DNA, με την χρήση ελάχιστου δείγματος. Πιο συγκεκριμένα, είναι δυνατή η ανίχνευση ακόμα και ενός μόνο αντιγράφου μιας αλληλουχίας από ένα δείγμα DNA, διότι ενισχύεται τόσο ώστε με κατάλληλη χρώση να είναι ορατό μετά από ηλεκτροφόρηση σε πηκτή. Η τεχνική της PCR έχει πολλαπλές χρήσεις, σαν διαγνωστικό εργαλείο στην ανίχνευση ασθενειών, μεταλλάξεων και λοιμώξεων, αλλά και σε πρώιμο στάδιο στην εγκληματολογία. Στην βασική έρευνα, χρησιμοποιείται για την απομόνωση και κλωνοποίηση γονιδίων, την ανάλυση πολυμορφισμών και αλλού. 79

80 Κεφάλαιο πέμπτο: Χαρακτηριστικά της έρευνας Περιγραφή της μεθόδου Για μια τυπική PCR είναι απαραίτητα, το δείγμα DNA, ζεύγος κατάλληλων εκκινητών (primers), η DNA πολυμεράση, το ρυθμιστικό διάλυμα της πολυμεράσης, MgCl 2, νουκλεοτίδια και H 2 O για την αραίωση σε τελικό όγκο. Η PCR ξεκινάει με ένα δίκλωνο μόριο DNA. Κάθε κύκλος της αντίδρασης αρχίζει με θέρμαναση περίπου στους o C για λίγα λεπτά, για να αποδιαταχθούν οι κλώνοι του DNA (βήμα 1). Αφού γίνει η αποδιάταξη τους, η θερμοκρασία ελλατώνεται στους o C προκειμένου να υβριδοποιηθούν οι εκκινητές με τις συμπληρωματικές τους αλληλουχίες στους δύο κλώνους του DNA (βήμα 2). Έπειτα, η θερμοκρασία αυξάνεται λίγο ακόμα, περίπου στους 72 o C, και με την βοήθεια της DNA πολυμεράσης συνθέτονται οι νέες νουκλεοτιδικές αλυσίδες συμπληρωματικές προς κάθε αρχικό κλώνο (βήμα 3). Με την ολοκλήρωση του πρώτου κύκλου, ξεκινάει ο δεύτερος επαναλαμβάνοντας τα τρια προηγούμενα βήματα (εικόνα 5.1). Έτσι, οι νεοσυντιθέντες κλώνοι αποδιατάσονται και λειτουργούν σαν εκμαγεία για την δημιουργία νέων μορίων DNA. Εικόνα 5.1:Απεικόνιση των τριών βημάτων της PCR 80

81 Κεφάλαιο πέμπτο: Χαρακτηριστικά της έρευνας Για επιτυχημένη ποσοτική αύξηση του DNA απαιτούνται περίπου κύκλοι, διάρκειας μερικών λεπτών ο καθένας. Ενώ, η αντοχή της DNA πολυμεράσης σε υψηλές θερμοκρασίες επιτρέπει να προστίθεται από την αρχή της διαδικασίας, χωρίς να χρειάζεται επαναλαμβανόμενα η προσθήκη της. Η παραγωγή των αντιγράφων στην PCR και η αντίστοιχη διαγραμματική απεικόνιση αποτελείται από τρεις φάσεις: την εκθετική φάση (Exponential phase), την γραμμική φάση (Linear phase) και την φάση του κορεσμού (Plateau phase) (εικόνα 5.2). Στην πρώτη φάση παρατηρείται ραγδαίος πολλαπλασιασμός του προϊόντος, εξαιτίας του διπλασιασού σε κάθε κύκλο. Στη συνέχεια, στην γραμμική φάση, τα διαθέσιμα αντιδραστήρια μειώνονται και παράλληλα συσσωρεύονται αναστολείς στο μείγμα, με αποτέλεσμα ο ρυθμός του πολλαπλασιασμού να είναι μικρότερος. Τέλος, στη φάση του κορεσμού η απόδοση της αντίδρασης συνεχίζει να μειώνεται μέχρι που σταματάει εντελώς. Εικόνα 5.2: Σχηματική απεικόνιση της παραγωγής προϊόντων στην PCR 81

82 Κεφάλαιο πέμπτο: Χαρακτηριστικά της έρευνας Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης πραγματικού χρόνου (Real-time PCR) Περιγραφή της μεθόδου Η ποσοτική PCR (Quantitative PCR, Q-PCR) είναι μια γρήγορη, αξιόπιστη και ευαίσθητη μέθοδος, η οποία επιτρέπει την ποσοτικοποίηση συγκεκριμένων αλληλουχιών-στόχων DNA. Υπάρχουν δύο είδη: (α) η τελικού σημείου ή απλή (End-point PCR) και (β) η πραγματικού χρόνου (Real-time PCR). Στην τελευταία, η μέτρηση της ποσότητας του προϊόντος πραγματοποιείται σε όλη τη διάρκεια της αντίδρασης στο τέλος κάθε κύκλου, μέσα από την ένταση του φθορισμού κάποιας φθορίζουσας ουσίας. Αντίθετα, στην απλή Q-PCR ο υπολογισμός του προϊόντος γίνεται αφού έχει ολοκληρωθεί η αντίδραση. Αυτή η ποσοτικοποίηση όμως ενέχει δυσκολίες εξαιτίας των αναστολέων που έχουν συσσωρευτεί. Για την Real-time PCR υπάρχουν δύο είδη συστημάτων ανίχνευσης της προς ενίσχυσης αλληλουχίας του DNA, τα μη ειδικά και τα ειδικά συστήματα. Στην πρώτη περίπτωση ανιχνεύονται όλα τα δίκλωνα μόρια DNA, τα οποία ενισχύονται κατά την αντίδραση, ενώ στην δεύτερη περίπτωση επιτυγχάνεται διαχωρισμός της αλληλουχίας-στόχου από άλλα προϊόντα που τυχόν ενισχύονται παράλληλα, και από διμερή εκκινητών που ίσως σχηματιστούν. Στην παρούσα έρευνα χρησιμοποιήθηκε μη ειδικό σύστημα ανίχνευσης, με φθορίζουσα ουσία πρόσδεσης στο δίκλωνο DNA, την SYBR Green I. Πρόκειται για μια φθορίζουσα χρωστική, ευρέως χρησιμοποιούμενη στην Realtime PCR, η οποία συνδέεται στο δίκλωνο DNA και φθορίζει ανάλογα με την ποσότητα του DNA. Η διέγερση και η μέγιστη εκπομπή της είναι στα 494nm και 521nm αντίστοιχα, χαρακτηριστικά που δίνουν συμβατότητα με κάθε 82

83 Κεφάλαιο πέμπτο: Χαρακτηριστικά της έρευνας συσκευή. Είναι μια ασύμμετρη κυανίνη, η οποία εμφανίζει 100 φορές μεγαλύτερη συγγένεια με το δίκλωνο DNA συγκριτικά με το βρωμιούχο αιθίδιο, γεγονός που την καθιστά πολύ ευαίσθητο δείκτη για την ποσότητα του DNA. Στην διάρκεια της διαδικασίας της αλυσιδωτής αντίδρασης, η χρωστική SYBR Green I δεσμεύεται συνεχώς στο πολλαπλασιαζόμενο DNA, και μετά την σύνδεσή της φθορίζει, δίνοντας ολοένα αυξανόμενο σήμα (εικόνα 5.3). Η χρωστική SYBR Green I εξαιτίας της μεγάλης της συγγένειας με το DNA, πλεονεκτεί έναντι άλλων χρωστικών. Το μη ειδικό σύστημα όμως, απαιτεί να γίνει διαχωρισμός του σήματος φθορισμού που εκπέμπει η αλληλουχία-στόχος, από άλλα δίκλωνα τμήματα DNA που πιθανά υπάρχουν στο διάλυμα και εκπέμπουν επίσης σήμα φθορισμού. Για το λόγο αυτό, μετά την ολοκλήρωση της ενίσχυσης της αλληλουχίας-στόχου είναι απαραίτητη η ανάλυση της καμπύλης τήξεως. Εικόνα 5.3: Η λειτουργία της χρωστικής SYBR Green I στην Real-time Q-PCR 83

84 Κεφάλαιο πέμπτο: Χαρακτηριστικά της έρευνας Μετά την ολοκλήρωση της Real-time Q-PCR, ακολουθεί η ανάλυση της καμπύλης αποδιάταξης (Melting Curve Analysis) με στόχο να ανιχνευθεί η πιθανή ύπαρξη διμερών των εκκινητών (primers-dimers) ή άλλων προϊόντων πέρα από το DNA-στόχο. Η θερμοκρασία τήξεως (Melting Temperature) των προϊόντων εξαρτάται από το μήκος της αλυσίδας του δίκλωνου DNA και από το ποσοστό γουανίνης/κυτοσίνης που περιέχει. Κατά συνέπεια, τα διμερή των εκκινητών τήκονται σε χαμηλότερες θερμοκρασίες από το προϊόν της αντίδρασης, και βάσει αυτού μπορεί να γίνει ο διαχωρισμός τους. Πιο συγκεκριμένα, στην γραφική παράσταση της παραγώγου της καμπύλης τήξης εμφανίζονται κορυφές, καθεμία από τις οποίες αντιστοιχεί στην θερμοκρασία τήξης κάποιου δίκλωνου μορίου DNA. Το επιθυμητό είναι η θερμοκρασία αποδιάταξης να λαμβάνει μία τιμή για τα προϊόντα, οπότε να αντιστοιχεί σε μία κορυφή. Η εμφάνιση περισσότερων κορυφών σημαίνει σχηματισμό περισσότερων προϊόντων. Για την κατασκευή της καμπύλης, η θερμοκρασία αποδιάταξης ξεκινά από τους 60 ο C και αυξάνεται σταδιακά ανά 0,5 ο C. Ποσοτικοποίηση των αποτελεσμάτων της Real-time PCR Η ποσοτικοποίηση των αποτελεσμάτων της Real-time PCR μπορεί να γίνει μέσω δύο μεθόδων, την σχετική και την απόλυτη. Στην παρούσα μελέτη χρησιμοποιήθηκε η απόλυτη μέθοδος. Στην περίπτωση της απόλυτης ποσοτικοποίησης, κατασκευάζεται μια πρότυπη καμπύλη με διαδοχικές αραιώσεις δειγμάτων DNA ή RNA γνωστής συγκέντρωσης. Για την κατασκευή πρότυπων καμπυλών μπορεί να χρησιμοποιηθεί είτε πλασμιδιακό δίλωνο DNA, είτε in vitro συντιθέμενο μονόκλωνο DNA ή cdna για το γονίδιο-στόχο. Σε καθεμία από τις παραπάνω περιπτώσεις, η συγκέντωση (ng/μl) των δειγμάτων DNA υπολογίζεται με φωτομέτρηση στα 260nm και στη συνέχεια υπολογίζεται η συγκέντωση σε 84

85 Κεφάλαιο πέμπτο: Χαρακτηριστικά της έρευνας copies/μl, με την χρήση τύπων που περιλαμβάνουν την σταθερά Avogadro και το μέγεθος του γονιδίου-στόχου. Έπειτα, πραγματοποιούνται διαδοχικές αραιώσεις, γίνεται Real-time PCR για τα νέα δείγματα και κατασκευάζεται η πρότυπη καμπύλη (εικόνα 5.4). Εικόνα 5.4: Πρότυπη καμπύλη για την απόλυτη ποσοτικοποίηση στην Real-time PCR Βελτιστοποίηση των συνθηκών της Real-time PCR Για την δημιουργία ιδανικών συνθηκών στην Real-time PCR, είναι αναγκαίο να δοθεί μεγάλη σημασία στις συγκεντώσεις της SYBR Green I, των εκκινητών, του χλωριούχου μαγνησίου (MgCl 2 ) και του δείγματος DNA, όπως και στην θερμοκρασία κάθε βήματος. Πολύ υψηλή συγκέντρωση SYBR Green I μπορεί να προκαλέσει αναστολή της αλυσιδωτής αντίδρασης, ενώ πολύ χαμηλή συγκέντρωση μπορεί να μην επαρκεί για την σήμανση όλων των 85

86 Κεφάλαιο πέμπτο: Χαρακτηριστικά της έρευνας προϊόντων. Επίσης, μεγάλη ποσότητα DNA είναι πιθανό να μειώσει το μέγιστο σήμα φθορισμού και την γραμμικότητα των καμπυλών αναφοράς. Στην συγκεκριμένη έρευνα χρησιμοποιήθηκε το KAPA SYBR FAST qpcr Kit, όπου περιέχεται αυξημένης συγκέντρωσης SYBR Green I και DNA πολυμεράση ανθεκτική στις υψηλές συγκεντρώσεις χρωστικής, προκειμένου να μην δημιουργείται πρόβλημα στην αποδοτικότητα της αντίδρασης. Το απομονωμένο DNA χρησιμοποιήθηκε σε αραίωση και οι αποδεκτές συγκεντρώσεις των εκκινητών έχουν εύρος nM. Το χλωριούχο μαγνήσιο παρέχει ιόντα μαγνησίου, τα οποία επιδρούν στην ενεργότητα της DNA πολυμεράσης, δρώντας ως συνένζυμο και την καθιστούν περισσότερο ειδική για την προς ενίσχυση αλληλουχία. Χαμηλή συγκέντρωση MgCl 2 μειώνει την απόδοση της αλυσιδωτής αντίδρασης, ενώ αντίθετα υψηλή συγκέντρωση MgCl 2 οδηγεί στον σχηματισμό κι άλλων προϊόντων. Το αποδεκτό εύρος συγκέντρωσης για το MgCl 2 είναι 1,5-5mM. Εκτός από την χρωστική SYBR Green I, χρησιμοποιήθηκε και η ROX, η οποία είναι μια χρωστική αναφοράς (Reference Dye), δηλαδή το σήμα φθορισμού της παραμένει σταθερό σε όλη την διάρκεια της αντίδρασης. Το φάσμα εκπομπής της είναι διαφορετικό από εκείνο της SYBR Green I, και ο σκοπός της χρήσης της είναι να διαχωρίζει τον φθορισμό ουσιών που δεν σχετίζονται με την Real-time PCR, να ελαχιστοποιεί επιρροές από μικρές διαφορές όγκου διαλυμάτων ή την διαφάνεια του πλαστικού της πλάκας. Η αποδιάταξη γίνεται στους 95 ο C, διότι η DNA πολυμεράση είναι hot start. Σε αυτή την θερμοκρασία μετουσιώνεται το σύμπλοκο της DNA πολυμεράσης και ενεργοποιείται, ενώ παράλληλα παρεμποδίζεται ο σχηματισμός λανθασμένων προϊόντων, όπως διμερών των εκκινητών, με αποτέλεσμα να αυξάνεται η ακρίβεια και η ειδικότητα της μεθόδου. Στη συνέχεια, η υβριδοποίηση και η επιμήκυνση γίνονται σε θερμοκρασία 65 ο C. 86

87 Κεφάλαιο πέμπτο: Χαρακτηριστικά της έρευνας Εφαρμογή της Real-time PCR Η RT-qPCR γίνεται με σκοπό τον προσδιορισμό του γονιδίου που κωδικοποιεί το 16S ριβοσωμικό RNA (16S rrna). Το 16S rrna είναι συστατικό της 30S μικρής υπομονάδας των προκαρυωτικών ριβοσωμάτων και έχει μήκος περίπου 1,5kb. Είναι λειτουργικά σταθερό, ενώ αποτελεί μωσαϊκό από συντηρημένες και μεταβλητές περιοχές. Για το λόγο αυτό, χρησιμοποιείται για την ανίχνευση γενών βακτηρίων φυλογενετικά (Coenye et al., 2003). Πιο ειδικά, για τον προσδιορισμό των ολικών βακτηρίων χρησιμοποιήθηκαν universal primers, οι οποίοι αντιστοιχούν στις συντηρημένες περιοχές του γονιδίου του 16S rrna. Αντίθετα, για τον προσδιορισμό των διαφορετικών γενών βακτηρίων χρησιμοποιήθηκαν εκκινητές για τις μεταβλητές περιοχές του γονιδίου. Ο ποσοτικός προσδιορισμός των βακτηρίων στα κόπορανα έγινε σε επίπεδο Τάξης. Όλοι οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν παρουσιάζονται στον παρακάτω πίνακα (Hartman et al., 2009) (πίνακας 5.2). Τέλος, στην RT-qPCR χρησιμοποιήθηκε η χρωστική SYBR Green I και ακολουθήθηκε το πρωτόκολλο KAPA SYBR FAST qpcr. Πίνακας 5.2: Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν στην Real-time qpcr 87

88 Κεφάλαιο πέμπτο: Χαρακτηριστικά της έρευνας Βήμα 1: Ετοιμασία αντιδραστηρίων Υπολογίζονται οι συγκεντρώσεις των απαιτούμενων αντιδραστηρίων: KAPA SYBR qpcr Master Mix (2X), ROX Reference Dye Low, DNA (σε αραίωση), primers. Πίνακας 5.3: Οι ποσότητες και οι συγκεντρώσεις των αντιδραστηρίων που χρησιμοποιήθηκαν στην Real-time qpcr Βήμα 2: Ανάμειξη αντιδραστηρίων και προετοιμασία πλάκας Τα αντιδραστήρια μεταφέρονται στην πλάκα PCR, προστίθεται το κάλυμμα και αναδεύονται σύντομα. Βήμα 3: Τρέξιμο της qpcr Για την αντίδραση χρησιμποιήθηκε το KAPA SYBR FAST qpcr Kti Master Mix (2X) Universal, της εταιρείας KapaBiosystems και το μηχάνημα MX3005P της εταιρείας Stratagene, με το αντίστοιχο λογισμικό. Η DNA πολυμεράση σε αυτή την περίπτωση ήταν hot start, δηλαδή η ενεργοποίησή της επιτυγχάνεται στους 95 ο C. Στην ίδια θερμοκρασία αποδιατάσσεται το δίκλωνο DNA, και στην συνέχεια σε μικρότερη 88

89 Κεφάλαιο πέμπτο: Χαρακτηριστικά της έρευνας θερμοκρασία ο C ολοκληρώνεται το στάδιο της υβριδοποίησηςεπιμήκυνσης. Στον παρακάτω πίνακα παρουσιάζονται αναλυτικά τα στάδια της Real-time qpcr (πίνακας 5.4). Πίκανας 5.4: Τα στάδια της Real-time qpcr Βήμα 4: Απόλυτη ποσοτικοποίηση Για την ποσοτικοποίηση, από κάθε τάξη βακτηρίων, χρησιμοποιήθηκαν πρότυπα στελέχη, ο αριθμός των οποίων υπολογίστηκε βακτηριολογικά με διαδοχικές αραιώσεις και στη συνέχεια έγινε απομόνωση DNA από γνωστή ποσότητα βακτηρίων. Η πρότυπη καμπύλη αναφοράς κατασκευάστηκε αυτόματα από το λογισμικό του μηχανήματος MX3005P της εταιρείας Stratagene σε διαδοχικές αραιώσεις του δείγματος DNA ( cfu), και εκφράζει τον αριθμό βακτηρίων της κάθε αραίωσης και τις τιμές Ct. Στη συνέχεια παρουσιάζονται όλες οι πρότυπες καμπύλες. 89

90 Κεφάλαιο πέμπτο: Χαρακτηριστικά της έρευνας Εικόνα 5.5: Πρότυπη καμπύλη ποσοτικοποίησης για τα ολικά βακτήρια Εικόνα 5.6: Πρότυπη καμπύλη ποσοτικοποίησης για το γένος Bacteroides 90

91 Κεφάλαιο πέμπτο: Χαρακτηριστικά της έρευνας Εικόνα 5.7: Πρότυπη καμπύλη ποσοτικοποίησης για το γένος Lactobacillus Εικόνα 5.8: Πρότυπη καμπύλη ποσοτικοποίησης για το γένος Bifidobacterium 91

92 Κεφάλαιο πέμπτο: Χαρακτηριστικά της έρευνας Εικόνα 5.9: Πρότυπη καμπύλη ποσοτικοποίησης για το γένος Enterobacter Εικόνα 5.10: Πρότυπη καμπύλη ποσοτικοποίησης για το γένος Clostridium 92

93 III. Αποτελέσματα 93

94 Κεφάλαιο έκτο: Αποτελέσματα της έρευνας Αποτελέσματα της έρευνας 6.1 Επιδημιολογικά Στοιχεία Στοιχεία του πληθυσμού της έρευνας Τους εθελοντές της έρευνας αποτέλεσαν 13 άνδρες και 22 γυναίκες, όπως φαίνεται με ποσοστιαία κατανομή στο γράφημα 6.1. Η αριθμητική διαφορά μεταξύ των ανδρών και των γυναικών που συμμετείχαν, έχει να κάνει με μικρότερο βαθμό συγκατάθεσης από την πλευρά των ανδρών να δηλώσουν συμμετοχή και να ολοκληρώσουν τις απαιτήσεις της έρευνας. Αρκετές όμως είναι οι έρευνες, όπου ομοίως δεν υπήρχε ίση αναλογία μεταξύ των δύο φύλων (Schwiertz et al., 2010; Sabate et al., 2008). Γράφημα 6.1: Κατανομή των εθελοντών ανάλογα με το φύλο 94

95 Κεφάλαιο έκτο: Αποτελέσματα της έρευνας Οι συμμετέχοντες όμως, όπως έχει ήδη αναφερθεί, χωρίστηκαν ανάλογα με το ΔΜΣ σε άτομα κανονικού βάρους (NW), σε υπέρβαρα άτομα (OV) και παχύσαρκα άτομα (OB). Η κατανομή αυτή παρουσιάζεται στο γράφημα 6.2. Γράφημα 6.2: Αναλογία των συμμετεχόντων ανάλογα με το ΔΜΣ (NW: άτομα κανονικού βάρους, OV: υπέρβαρα άτομα, OB: παχύσαρκα άτομα) Η ηλικία των εθελοντών κυμάνθηκε από 18 έως 77 έτη. Είναι γνωστό, από όσα αναφέρθηκαν προηγουμένως, ότι η σύσταση της εντερικής χλωρίδας διαμορφώνεται μέχρι την ηλικία περίπου των 2 ετών και παραμένει σταθερή κατά την ενήλικη ζωή, ενώ διαφοροποιείται σε ηλικιωμένους, ηλικίας 80 ετών (Angelakis et al.,2012; Fujimura et al.,2010). Έτσι, έγινε προσπάθεια να καλυφθεί ένα μεγάλο ηλικιακό εύρος, χωρίς όμως να επηρεάζει την αξιοπιστία των αποτελεσμάτων. Στο γράφημα 6.3 εμφανίζεται ο μέσος όρος ηλικίας των συμμετεχόντων, για κάθε κατηγορία βάρους. Πιο συγκεκριμένα, ο μέσος όρος ηλικίας των ατόμων κανονικού βάρους είναι 38,5 έτη, των υπέρβαρων ατόμων 55,9 έτη και των παχύσαρκων ατόμων 51,8 έτη. 95

96 Κεφάλαιο έκτο: Αποτελέσματα της έρευνας Γράφημα 6.3: Μέσος όρος ηλικίας συμμετεχόντων ανάλογα με την κατηγορία βάρους (NW: άτομα κανονικού βάρους, OV: υπέρβαρα άτομα, OB: παχύσαρκα άτομα) Κοινωνικά χαρακτηριστικά του πληθυσμού της έρευνας Οι εθελοντές της έρευνας ερωτήθηκαν σχετικά με το μορφωτικό τους επίπεδο, την επαγγελαματική και την οικογενειακή τους κατάσταση. Οι πληροφορίες αυτές παρουσιάζονται στα παρακάτω γραφήματα. Γράφημα 6.4: Το μορφωτικό επίπεδο του δείγματος, εκφρασμένο σε ποσοστά 96

97 Κεφάλαιο έκτο: Αποτελέσματα της έρευνας Γράφημα 6.5: Η επαγγελματική σχέση του δείγματος, εκφρασμένη σε ποσοστά Γράφημα 6.6: Η οικογενειακή κατάσταση του δείγματος, εκφρασμένη σε ποσοστά 97

98 Κεφάλαιο έκτο: Αποτελέσματα της έρευνας Ιατρικό ιστορικό του πληθυσμού της έρευνας Από τους συμμετέχοντες της έρευνας συλλέχθηκαν επίσης μερικές πληροφορίες σχετικά με το ιατρικό τους ιστορικό. Απάντησαν αν πάσχουν από κάποια ασθένεια και ποιά είναι αυτή, αν λαμβάνουν φαρμακευτική αγωγή, και αν καπνίζουν. Στη συνέχεια, παρατίθενται τα στοιχεία που συλλέχθηκαν. Γράφημα 6.7: Ποσοστά καπνίσματος των συμμετεχόντων ανά κατηγορία βάρους (NW: άτομα κανονικού βάρους, OV: υπέρβαρα άτομα, OB: παχύσαρκα άτομα) Γράφημα 6.8: Παρουσία νοσημάτων των συμμετεχόντων ανά κατηγορία βάρους (NW: άτομα κανονικού βάρους, OV: υπέρβαρα άτομα, OB: παχύσαρκα άτομα) 98

99 Κεφάλαιο έκτο: Αποτελέσματα της έρευνας 6.2 Διατροφικά Στοιχεία Διαιτητική κατανάλωση Με την χρήση γραφημάτων στην συνέχεια παρουσιάζεται η διαιτητική κατανάλωση των ομάδων τροφίμων, όπως καταγράφηκε μέσα από το Ερωτηματολόγιο Συχνότητας Κατανάλωσης Τροφίμων. Το ΕΣΚΤ αποτελείται από 36 ερωτήσεις και καθεμία έχει 6 πιθανές απαντήσεις. Οι επιλογές των απαντήσεων ήταν ποτέ/σπάνια, 1-3φορές/μήνα, 1-2φορές/εβδομάδα, 3-6φορές/εβδομάδα, 1φορά/ημέρα, και >2φορές/ημέρα, όπου δόθηκαν αριθμοί από 1 εως 6 αντίστοιχα, προσδιορίζοντας την συχνότητα διαιτητικής πρόσληψης για κάθε τρόφιμο. Έτσι, δημιουργήθηκε ένας Δείκτης Συχνότητας της διατροφικής κατανάλωσης και συνεπώς, μεγαλύτερες τιμές αντικατοπτρίζουν συχνότερη/μεγαλύτερη κατανάλωση. Γράφημα 6.9: Κατανάλωση γαλακτοκομικών προϊόντων ανά κατηγορία βάρους (NW: άτομα κανονικού βάρους, OV: υπέρβαρα άτομα, OB: παχύσαρκα άτομα) 99

100 Κεφάλαιο έκτο: Αποτελέσματα της έρευνας Γράφημα 6.10: Κατανάλωση αμυλούχων τροφίμων ανά κατηγορία βάρους (NW: άτομα κανονικού βάρους, OV: υπέρβαρα άτομα, OB: παχύσαρκα άτομα) Γράφημα 6.11: Κατανάλωση φρούτων, λαχανικών, οσπρίων και προϊόντων ολικής άλεσης ανά κατηγορία βάρους (NW: άτομα κανονικού βάρους, OV: υπέρβαρα άτομα, OB: παχύσαρκα άτομα) 100

101 Κεφάλαιο έκτο: Αποτελέσματα της έρευνας Γράφημα 6.12: Κατανάλωση τροφίμων της ομάδας κρέατος ανά κατηγορία βάρους (NW: άτομα κανονικού βάρους, OV: υπέρβαρα άτομα, OB: παχύσαρκα άτομα) Γράφημα 6.13: Κατανάλωση ψαριών και θαλασσινών ανά κατηγορία βάρους (NW: άτομα κανονικού βάρους, OV: υπέρβαρα άτομα, OB: παχύσαρκα άτομα) 101

102 Κεφάλαιο έκτο: Αποτελέσματα της έρευνας Γράφημα 6.14: Κατανάλωση τροφίμων της ομάδας λίπους ανά κατηγορία βάρους (NW: άτομα κανονικού βάρους, OV: υπέρβαρα άτομα, OB: παχύσαρκα άτομα) Γράφημα 6.15: Κατανάλωση τροφίμων της ομάδας γλυκών ανά κατηγορία βάρους (NW: άτομα κανονικού βάρους, OV: υπέρβαρα άτομα, OB: παχύσαρκα άτομα) 102

103 Κεφάλαιο έκτο: Αποτελέσματα της έρευνας Γράφημα 6.16: Κατανάλωση ροφημάτων και αλκοόλ ανά κατηγορία βάρους (NW: άτομα κανονικού βάρους, OV: υπέρβαρα άτομα, OB: παχύσαρκα άτομα) Υιοθέτηση της Μεσογειακής Διατροφής (MedDiet Score) Η εκτίμηση της συμμόρφωσης των συμμετεχόντων στο πρότυπο της Μεσογειακής Διατροφής έγινε με την χρήση του ερωτηματολογίου MedDiet Score. Στο επόμενο γράφημα φαίνεται το σκορ για κάθε κατηγορίας ΔΜΣ. Γράφημα 6.17: Το MedDiet Score ανά κατηγορία βάρους (NW: άτομα κανονικού βάρους, OV: υπέρβαρα άτομα, OB: παχύσαρκα άτομα) 103

104 Κεφάλαιο έκτο: Αποτελέσματα της έρευνας 6.3 Σύγκριση μικροοργανισμών Στο παρακάτω γράφημα παρουσιάζεται η κατανομή των γενών των βακτηρίων, όπως μετρήθηκαν μετά την φωτομέτρηση της Real-time qpcr. Κατά συνέπεια, ο αριθμός των κύκλων της αντίδρασης (cycle threshold, CT) είναι αντιστρόφως ανάλογος του βακτηριακού πληθυσμού. Γράφημα 6.18: Κατανομή των μικροοργανισμών στο σύνολο του δείγματος Στη συνέχεια, γίνεται παρουσίαση με γραφήματα της κατανομής των βακτηριακών πληθυσμών ανάλογα με την κατηγορία βάρους των συμμετεχόντων. 104

105 Κεφάλαιο έκτο: Αποτελέσματα της έρευνας Γράφημα 6.19: Κατανομή των βακτηριακών πληθυσμών ανά κατηγορία βάρους (NW: άτομα κανονικού βάρους, OV: υπέρβαρα άτομα, OB: παχύσαρκα άτομα) Περισσότερο αναλυτικά, για κάθε γένος βακτηρίων φαίνεται η κατανομή τους ανάλογα με την κατηγορία βάρους των εθελοντών. Γράφημα 6.20: Κατανομή των ολικών βακτηρίων ανά κατηγορία βάρους (NW: άτομα κανονικού βάρους, OV: υπέρβαρα άτομα, OB: παχύσαρκα άτομα) 105

106 Κεφάλαιο έκτο: Αποτελέσματα της έρευνας Γράφημα 6.21: Κατανομή των βακτηριακών πληθυσμών του γένους Bifidobacterium ανά κατηγορία βάρους (NW: άτομα κανονικού βάρους, OV: υπέρβαρα άτομα, OB: παχύσαρκα άτομα) Γράφημα 6.22: Κατανομή των βακτηριακών πληθυσμών του γένους Bacteroides ανά κατηγορία βάρους (NW: άτομα κανονικού βάρους, OV: υπέρβαρα άτομα, OB: παχύσαρκα άτομα) 106

107 Κεφάλαιο έκτο: Αποτελέσματα της έρευνας Γράφημα 6.23: Κατανομή των βακτηριακών πληθυσμών του γένους Lactobacillus ανά κατηγορία βάρους (NW: άτομα κανονικού βάρους, OV: υπέρβαρα άτομα, OB: παχύσαρκα άτομα) Γράφημα 6.24: Κατανομή των βακτηριακών πληθυσμών του γένους Clostridium ανά κατηγορία βάρους (NW: άτομα κανονικού βάρους, OV: υπέρβαρα άτομα, OB: παχύσαρκα άτομα) 107

108 Κεφάλαιο έκτο: Αποτελέσματα της έρευνας Γράφημα 6.25: Κατανομή των βακτηριακών πληθυσμών του γένους Enterobacter ανά κατηγορία βάρους (NW: άτομα κανονικού βάρους, OV: υπέρβαρα άτομα, OB: παχύσαρκα άτομα) 108

109 Κεφάλαιο έκτο: Αποτελέσματα της έρευνας 6.4 Στατιστική ανάλυση των δεδομένων των αποτελεσμάτων Για την στατιστική ανάλυση των δεδομένων του δείγματος στην παρούσα μελέτη χρησιμοποιήθηκε το πρόγραμμα SPSS Αρχικά, όλες οι μεταβλητές που προέκυψαν από την συλλογή και την καταγραφή των δεδομένων περάστηκαν σε SPSS αρχείο για περαιτέρω επεξεργασία. Στη συνέχεια, σε ένα πρώτο επίπεδο στατιστικής ανάλυσης, υπολογίστηκαν οι κατανομές συχνοτήτων, οι οποίες ανήκουν στα περιγραφικά στατιστικά που επιτρέπουν τη σύνοψη, την οργάνωση και την παρουσίαση των πιο σχετικών και σπουδαίων πληροφοριών αναφορικά με τα δεδομένα του δείγματος. Έπειτα, πραγματοποιήθηκε ανάλυση συσχέτισης κατά Spearman (correlation, r) και ανάλυση διακύμανσης Kruskal-Wallis. Α) Independent-Samples Kruskal-Wallis test Η μονόδρομη (one-way) ανάλυση διακύμανσης Kruskal-Wallis είναι μια μη-παραμετρική μέθοδος, η οποία χρησιμοποιείται για να διαπιστωθεί εάν τα δείγματα προέρχονται από την ίδια κατανομή και γίνεται σύγκριση δύο ή περισσότερων δειγμάτων που είναι ανεξάρτητα ή δεν σχετίζονται. Όταν το Kruskal-Wallis test οδηγεί σε στατιστικά σημαντικά αποτελέσματα, τότε τουλάχιστον ένα από τα δείγματα είναι διαφορετικό από τα υπόλοιπα. Παρακάτω παρουσιάζονται οι συγκρίσεις μεταξύ των διαφορετικών μεταβλητών. 109

110 Κεφάλαιο έκτο: Αποτελέσματα της έρευνας 110

111 Κεφάλαιο έκτο: Αποτελέσματα της έρευνας 111

112 Κεφάλαιο έκτο: Αποτελέσματα της έρευνας 112

113 Κεφάλαιο έκτο: Αποτελέσματα της έρευνας 113

114 Κεφάλαιο έκτο: Αποτελέσματα της έρευνας Δεν βρέθηκε στατιστικά σημαντική διαφορετική κατανομή ολικών βακτηρίων και των εξεταζόμενων γένων των βακτηρίων μεταξύ των οικογενειών Δεν βρέθηκε στατιστικά σημαντική διαφορετική κατανομή ολικών βακτηρίων και των εξεταζόμενων γένων των βακτηρίων μεταξύ των διαφορετικών βαθμών συγγένειας, με εξαίρεση το γένος Lactobacillus (p=0.039) Ο παράγοντας οικογενειακή κατάσταση σχετίστηκε στατιστικώς σημαντικά με το ΔΜΣ (p=0.024) και την ηλικία (p=0.000) 114