Άσκηση 7: Κύκλος ζωής μικροοργανισμών και επίδραση διαφόρων παραγόντων

Transcript

1 Άσκηση 7: Κύκλος ζωής μικροοργανισμών και επίδραση διαφόρων παραγόντων Σύνοψη Σκοπός της άσκησης είναι να γνωρίσουν οι φοιτητές θεωρητικά και πειραματικά την έννοια του κύκλου ζωής των κυττάρων καθώς και την επίδραση που έχουν σ αυτόν ορισμένοι κρίσιμοι φυσικοί και χημικοί παράγοντες. Για τον σκοπό αυτό θα χρησιμοποιηθούν στο εργαστηριακό μέρος μη παθογόνοι μικροοργανισμοί με σύντομο κυτταρικό κύκλο που μπορούν να αναπαραχθούν με σχετική ευκολία και επιτρέπουν να μελετηθεί ποσοτικά: α) η επίδραση της θερμοκρασίας, β) η ανεπάρκεια ή η έλλειψη ορισμένων απαραίτητων αυξητικών παραγόντων και γ) η επίδραση ανασταλτικών παραγόντων (π.χ. αντιβιοτικά). Η άσκηση αυτή επιτρέπει στους φοιτητές να έλθουν σε επαφή με κλασσικές και σύγχρονες ερευνητικές μεθόδους της βιολογίας των μικροοργανισμών (όπως η νεφελομετρική μέθοδος) οι οποίες χρησιμοποιούνται ευρύτατα σε πολλές εφαρμογές, τόσο της καθημερινής ζωής (π.χ. έλεγχος μικροβιακού φορτίου υδάτων ή τροφίμων), όσο και της βασικής έρευνας. Προαπαιτούμενη γνώση Από το βιβλίο των Campbell, N. A., & Reece, J. B. (2010), Βιολογία (τόμος Ι), Πανεπιστημιακές Εκδόσεις Κρήτης, ISBN: , ο φοιτητής θα πρέπει να ανατρέξει στο Κεφάλαιο 12: Ο κυτταρικός κύκλος. Από το βιβλίο των Madigan, M. T., Martinko, J. M., & Parker, J. (2005), Brock, Βιολογία των Μικροοργανισμών (τόμος I), Πανεπιστημιακές Εκδόσεις Κρήτης, ISBN: , ο φοιτητής θα πρέπει να ανατρέξει στο Κεφάλαιο 6: Μικροβιακή αύξηση. 1. Εισαγωγικό μέρος 1.1. Κυτταρικός κύκλος Κυτταρικός κύκλος ονομάζεται το χρονικό διάστημα της ζωής ενός κυττάρου που μεσολαβεί ανάμεσα στη στιγμή της δημιουργίας του (από τη διαίρεση κάποιου γονικού κυττάρου), μέχρι τη στιγμή της δημιουργίας των απογόνων του, δηλαδή μέχρι τη στιγμή που και το ίδιο θα διαιρεθεί σε δύο νέο κύτταρα. Σκοπός αυτών των διαιρέσεων δεν είναι τίποτε άλλο παρά η «διαιώνιση» του κυττάρου. Στην περίπτωση των μονοκύτταρων οργανισμών (όπως π.χ. η αμοιβάδα ή της Escherichia coli), η διαιώνιση του κυττάρου είναι ταυτόσημη με την επιβίωσή και τον πολλαπλασιασμό του οργανισμού. Οι περισσότεροι πολυκύτταροι οργανισμοί διαιωνίζονται με πιο εξειδικευμένο τρόπο (μέσω φυλετικής αναπαραγωγής) αλλά ακόμη και σ αυτούς, η κυτταρική διαίρεση αποτελεί απαραίτητο συστατικό της ζωής τους. Για παράδειγμα, όταν ένας ιστός τραυματίζεται, τα κατεστραμμένα κύτταρα αντικαθίστανται από τις κυτταρικές διαιρέσεις άλλων (βλέπε και Άσκηση 8). Επιπλέον, υπάρχουν και κύτταρα, όπως π.χ. τα ερυθρά αιμοσφαίρια και τα λευκοκύτταρα του αίματος, που έχουν περιορισμένο χρόνο ζωής και η διαρκής παρουσία ενός ικανού αριθμού από αυτά στο σώμα βασίζεται στις διαδοχικές κυτταρικές διαιρέσεις συγκεκριμένων κυττάρων του μυελού των οστών. Σε κάθε περίπτωση, για να φτάσει ένα κύτταρο στο σημείο να μπορεί να διαιρεθεί, θα πρέπει πρώτα να έχουν εκπληρωθεί ορισμένες προϋποθέσεις. Η εκπλήρωση αυτών των προϋποθέσεων λαμβάνει χώρα καθ όλη τη διάρκεια του κυτταρικού βίου, μέχρι τη στιγμή της διαιρέσεως. Είναι γνωστό ότι η κυτταρική διαίρεση αποσκοπεί στο να δημιουργήσει δύο νέα κύτταρα, καθένα από τα οποία θα περιέχει την ίδια γενετική πληροφορία με το γονικό κύτταρο. Επομένως, μια πρώτη απαραίτητη προϋπόθεση που πρέπει να εκπληρωθεί για να προχωρήσει ένα κύτταρο στη διαίρεσή του είναι να έχει διπλασιαστεί το γενετικό του υλικό. Εκτός όμως από αυτό είναι απαραίτητο να υπάρχουν σε επάρκεια και τα διάφορα κυτταρικά συστατικά (μιτοχόνδρια, ριβοσώματα κ.λπ.), προκειμένου να κατανεμηθούν στα δύο νέα κύτταρα, έτσι ώστε αυτά να μπορούν τις πρώτες ώρες μετά τη διαίρεση να επιτελέσουν τις στοιχειώδεις λειτουργίες τους. Με τη σειρά της, η κατασκευή όλων αυτών των συστατικών σημαίνει ότι το κύτταρο θα πρέπει να έχει σε επάρκεια όλες τις απαραίτητες πρώτες ύλες (αμινοξέα, λιπαρά οξέα, ιχνοστοιχεία κ.λπ.) και επίσης αρκετή ενέργεια (που κατά κανόνα αντλείται από υδατάνθρακες) για να μπορεί να εκτελέσει όλο αυτό το αναβολικό έργο (δηλαδή τη σύνθεση πρωτεϊνών,

2 ριβοσωμάτων, κυτταρικών μεμβρανών κ.λπ.). Και πάλι γίνεται κατανοητό ότι ένα κύτταρο δεν μπορεί να επιβιώσει (και κατ επέκταση να προχωρήσει στον κυτταρικό κύκλο), χωρίς να έχει σε επάρκεια όλα τα απαραίτητα σ αυτό συστατικά. Αν δεν έχει αμινοξέα δεν θα μπορεί να συνθέσει πρωτεΐνες, αν δεν έχει λιπαρά οξέα δεν θα μπορεί να συνθέσει μεμβράνες, αν δεν έχει ιχνοστοιχεία δεν θα μπορεί να έχει λειτουργικά ένζυμα κ.λπ. Στους πολυκύτταρους οργανισμούς, υπάρχουν ορισμένα κύτταρα που εφόσον δημιουργηθούν, πλέον δεν διαιρούνται. Όμως, εκτός από αυτά τα κύτταρα, όλα τα υπόλοιπα προετοιμάζουν διαρκώς τη διαίρεσή τους, ήδη από την πρώτη στιγμή που θα δημιουργηθούν. Αυτό ισχύει τόσο για τα ευκαρυωτικά κύτταρα όσο και για τα προκαρυωτικά. Η διάρκεια του κυτταρικού κύκλου στα κύτταρα του ανθρώπου ποικίλλει από περίπου μια ημέρα (στα κύτταρα του επιθηλίου του δέρματος), μέχρι πολλές ημέρες σε άλλες περιπτώσεις κυττάρων, π.χ., τα ερυθρά αιμοσφαίρια ζουν περίπου 120 ημέρες. Είναι ευνόητο ότι η ζωή ενός κυττάρου είναι ενιαία, αλλά μας διευκολύνει να την μοιράζουμε σε στάδια, για να μπορούμε να τη μελετήσουμε με μεγαλύτερη συστηματικότητα. Έτσι, ο κυτταρικός κύκλος των κυττάρων των θηλαστικών χωρίζεται σε τέσσερα στάδια ή φάσεις: G 1, S, G 2 και M (Εικ. 7.1). Τα γράμματα G, S και M προέρχονται από τις λέξεις Growth (αύξηση), Synthesis και Mitosis, αντιστοίχως. Οι τρεις πρώτες φάσεις (G 1, S, G 2 ) είναι φάσεις ανάπτυξης και προετοιμασίας του κυττάρου για την κυτταρική διαίρεση και συνιστούν, όλες μαζί, τη μεσόφαση, ενώ η τέταρτη φάση (M) είναι η φάση αυτής καθαυτής της κυτταρικής διαίρεσης (μίτωση). Εικόνα 7.1 Οι τέσσερεις φάσεις του κυτταρικού κύκλου Ο κυτταρικός κύκλος στα ευκαρυωτικά κύτταρα Τι ακριβώς συμβαίνει στις τέσσερις αυτές φάσεις του κυτταρικού κύκλου; Όπως υπονοεί και το όνομά της, η φάση G 1 (Growth 1) είναι ένα στάδιο κατά το οποίο το κύτταρο αυξάνεται σε μέγεθος συσσωρεύοντας πρώτες ύλες (υδατάνθρακες, πρωτεΐνες κ.λπ.). Η φάση S (Synthesis) είναι η φάση που αντιγράφεται το γενετικό υλικό (δηλαδή συντίθεται DNA). Αυτό δεν σημαίνει ότι κατά τη διάρκεια αυτής της φάσης το κύτταρο σταματά να αυξάνεται ή να συσσωρεύει υλικά. Αντιθέτως, συνεχίζει να αυξάνεται και να συσσωρεύει υλικά που θα του χρειαστούν κατά την κυτταρική διαίρεση, αλλά επειδή το πιο χαρακτηριστικό συμβάν αυτής της φάσης είναι η σύνθεση του DNA (αντιγραφή των χρωμοσωμάτων), γι αυτό και ονομάζεται φάση σύνθεσης. Στη φάση G 2 το κύτταρο συνεχίζει να αυξάνεται ακόμη πιο πολύ και ολοκληρώνει την προετοιμασία του για τη διαίρεση. Τέλος, στη φάση Μ (μίτωση), που είναι συγκριτικώς πολύ σύντομη, το κύτταρο διαιρείται. Για να αποκτήσουμε μια αίσθηση του πόσο διαρκεί κάθε φάση, θα αναφερθούμε στο παράδειγμα των κυττάρων του δερματικού επιθηλίου του ανθρώπου. Σ αυτά τα κύτταρα λοιπόν, η φάση G 1 διαρκεί 4-6 ώρες, η φάση S ώρες, η φάση G ώρες και η φάση Μ (δηλαδή αυτή καθαυτή η διαίρεση) μόλις μία ώρα. Υπάρχουν όμως και περιπτώσεις που η διάρκεια των φάσεων G 1 και G 2 μειώνεται δραστικά ή εξαφανίζεται τελείως και η φάση Μ είναι πολύ γρήγορη, όπως συμβαίνει κατά τις πρώτες κυτταρικές διαιρέσεις του ωαρίου αμέσως μετά τη γονιμοποίησή του. Πώς όμως προχωρά ένα ευκαρυωτικό κύτταρο από τη μια φάση στην άλλη; Αυτή η μετάβαση γίνεται αυτομάτως, ως εάν να έχει το κύτταρο ένα εσωτερικό ρολόι που καθορίζει τη διαδοχή των φάσεων λειτουργίας

3 (όπως π.χ. στις φάσεις λειτουργίας ενός πλυντηρίου); Ή μήπως υπάρχουν κάποια σημεία κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου όπου ο κύκλος επιδέχεται ρυθμίσεων από το εσωτερικό ή το εξωτερικό περιβάλλον του κυττάρου; Από τα μέχρι τώρα ερευνητικά δεδομένα γνωρίζουμε ότι το κύτταρο λειτουργεί σε μεγάλο βαθμό αυτομάτως, αλλά ότι επίσης υπάρχουν και ορισμένα «σημεία ελέγχου» κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου στα οποία όντως καθορίζεται αν το κύτταρο θα προχωρήσει στην εκάστοτε επόμενη φάση ή όχι (Εικ. 7.2). Εικόνα 7.2 Σημεία ελέγχου του κυτταρικού κύκλου Σημεία ελέγχου του κυτταρικού κύκλου Στον κυτταρικό κύκλο των περισσότερων ζωικών κυττάρων υπάρχουν χρονικά σημεία όπου το κύτταρο υπόκειται στον έλεγχο ουσιών (ενδοκυττάριων ή εξωκυττάριων) που λειτουργούν ως «σήματα διακοπής» και τα οποία μπορούν να προκαλέσουν διακοπή του κυτταρικού κύκλου. Αυτό διαρκεί μέχρι το κύτταρο να δεχθεί την επίδραση άλλων ουσιών που θα μπορούσαμε να πούμε ότι λειτουργούν ως «σήματα ελεύθερης πορείας» και αίρουν την επίδραση των «σημάτων διακοπής», επιτρέποντας έτσι στο κύτταρο να συνεχίσει ελεύθερα τη μετάβαση στα επόμενα στάδια του κύκλου. Μέχρι στιγμής τα κυριότερα σημεία ελέγχου που έχουν βρεθεί είναι τρία. Το πρώτο βρίσκεται προς το τέλος της φάσης G 1. Όταν ένα κύτταρο φτάσει στο σημείο αυτό, υπάρχουν δύο δυνατότητες. Αν λάβει σήμα «ελεύθερης πορείας», τότε το κύτταρο συνεχίζει στα επόμενα στάδια. Αν όχι, τότε βγαίνει από τον κυτταρικό κύκλο μεταπίπτοντας σε μια φάση που ονομάζεται G 0 και ισοδυναμεί με μια κατάσταση αδιαιρεσίας (Εικ. 7.3). Αυτό, για παράδειγμα, συμβαίνει στα νευρικά και τα μυϊκά κύτταρα, τα οποία δεν διαιρούνται διότι ποτέ δεν προχωρούν πέραν της φάσης G 0. Εικόνα 7.3 Σχηματική παράσταση του τρόπου που λειτουργεί το σημείο ελέγχου του κυτταρικού κύκλου κοντά στο τέλος της φάσης G 1. Τα άλλα δύο σημεία ελέγχου του κυτταρικού κύκλου βρίσκονται στο τέλος της φάσης G 2 και στο τέλος της φάσης Μ (Εικ. 7.2). Οι περισσότερες ουσίες που ελέγχουν το αν το κύτταρο θα «περάσει» από τα σημεία ελέγχου είναι ενδοκυτταρικής προέλευσης. Συνήθως πρόκειται για ουσίες που εξασφαλίζουν ότι το κύτταρο δεν θα προχωρήσει στην επόμενη φάση, αν δεν έχει ολοκληρωθεί με ασφάλεια κάποια κρίσιμη διαδικασία (π.χ. ότι δεν θα ξεκινήσει η κυτταρική διαίρεση πριν ολοκληρωθεί ο διαχωρισμός των αδελφών χρωματίδων). Εκτός όμως από τις ουσίες ενδοκυττάριας προέλευσης, υπάρχουν και ουσίες με παρόμοια δράση που προέρχονται από

4 το εξωκυττάριο περιβάλλον. Για παράδειγμα, οι ινοβλάστες (κύτταρα του συνδετικού ιστού που συμμετέχουν στην επούλωση των τραυμάτων) για να προχωρήσουν στον κυτταρικό τους κύκλο και να διαιρεθούν πρέπει απαραιτήτως να δεχθούν την επίδραση ενός αυξητικού παράγοντα που προέρχεται από τα αιμοπετάλια. Βλέπουμε λοιπόν, ότι ο κυτταρικός κύκλος λειτουργεί σε μεγάλο βαθμό αυτόνομα (όπως το πρόγραμμα ενός πλυντηρίου), αλλά διαθέτει και σημεία όπου η λειτουργία του ελέγχεται από εσωτερικά ή εξωτερικά σήματα. Το ερευνητικό ενδιαφέρον για την κατανόηση αυτών των μηχανισμών είναι τεράστιο, διότι μια τέτοια γνώση θα μας επιτρέψει να παρασκευάσουμε φάρμακα κατά των ανεξέλεγκτων κυτταρικών διαιρέσεων που λαμβάνουν χώρα στον καρκίνο, καθώς επίσης και να διασαφηνίσουμε την επίδραση άλλων παραγόντων, όπως η διατροφή, σ αυτά τα φαινόμενα Ο κυτταρικός κύκλος στα προκαρυωτικά κύτταρα Στους προκαρυωτικούς μονοκύτταρους οργανισμούς, η κυτταρική διαίρεση ονομάζεται διχοτόμηση (βλέπε Εικ. 7.4). Εφόσον αυτοί οι οργανισμοί συναντήσουν ευνοϊκές συνθήκες, αναπτύσσονται ταχύτατα και ο κυτταρικός τους κύκλος διαρκεί μόλις λεπτά. Γι αυτόν τον λόγο, δεν διακρίνουμε στα προκαρυωτικά κύτταρα κάποιες σαφώς καθορισμένες φάσεις του κυτταρικού κύκλου, όπως κάνουμε στα ευκαρυωτικά. Πάντως και σ αυτούς τους οργανισμούς, οι απαιτήσεις είναι παρόμοιες με εκείνες των ευκαρυωτικών κυττάρων. Το κύτταρο θα πρέπει να συλλέξει όλα τα απαραίτητα συστατικά, να αντιγράψει το γενετικό υλικό και τα οργανίδιά του και μόνον μετά θα προχωρήσει στην κυτταρική διαίρεση. Αξίζει να παρατηρήσετε στην Εικόνα 7.4 ότι το βακτήριο επιμηκύνεται (δηλ. αυξάνει τον όγκο του) καθώς οδεύει προς τη διχοτόμηση. Αυτό είναι απαραίτητο καθώς το DNA στα βακτήρια αποτελείται από ένα μόνο χρωμόσωμα, το οποίο είναι κυκλικό. Αν κόβαμε το DNA και το απλώναμε δίπλα στο βακτήριο, θα διαπιστώναμε ότι είναι 500 φορές πιο μακρύ από το βακτηριακό κύτταρο. Επομένως, καθώς αντιγράφεται, το κύτταρο θα πρέπει μόνο και μόνο για να «χωρέσει» το αντιγραφόμενο DNA να μεγεθύνεται. Αυτό με τη σειρά του σημαίνει ότι πρέπει να αυξάνει αντιστοίχως το κυτταρικό τοίχωμα, την κυτταροπλασματική μεμβράνη κ.λπ. Εικόνα 7.4 Σχηματική παράσταση της πορείας της κυτταρικής διαίρεσης στα βακτήρια. Παρατηρήστε ότι το βακτήριο μεγεθύνεται (επιμηκύνεται) κατά τη διάρκεια της προετοιμασίας του για διχοτόμηση. Παρότι δεν διακρίνουμε φάσεις στον κύκλο ζωής των βακτηρίων, εν τούτοις θα μπορούσαμε να πούμε ότι ένα σημαντικό σημείο καμπής στον κυτταρικό κύκλο των βακτηρίων είναι το αν υπάρχουν ή όχι οι κατάλληλες εξωτερικές συνθήκες για κυτταρική διαίρεση. Πολλά βακτήρια, αν δεν υπάρχουν αυτές οι συνθήκες, μεταπίπτουν σε σπόρια, δηλαδή σε μια μορφή εξαιρετικής ανθεκτικότητας, από την οποία ξαναβγαίνουν μόλις ξαναβρεθούν σε κατάλληλο περιβάλλον

5 Θρεπτικά μέσα καλλιέργειας μικροοργανισμών Για να αναπτυχθούν οι μικροοργανισμοί, θα πρέπει να λάβουν από το περιβάλλον τους όλες τις ουσίες που είναι απαραίτητες για την παραγωγή ενέργειας και τη σύνθεση των κυτταρικών υλικών και οργανιδίων, κάτι που όπως είδαμε είναι απαραίτητο για την επιτυχή ολοκλήρωση του κυτταρικού τους κύκλου. Επομένως, ένα θρεπτικό μέσο θα πρέπει να περιέχει σε επαρκείς ποσότητες όλες τις απαραίτητες για έναν συγκεκριμένο μικροοργανισμό θρεπτικές ουσίες. Σε αδρές γραμμές, οι κύριες απαιτήσεις για την ανάπτυξη ενός μικροοργανισμού φαίνονται από τη χημική του σύνθεση. Έτσι, σε ένα θρεπτικό μέσο πρέπει να υπάρχουν επαρκείς ποσότητες σε άνθρακα, άζωτο, άλατα, νερό και ενέργεια. Επιπλέον, θα πρέπει να υπάρχουν σε μικροποσότητες ορισμένοι πρόσθετοι παράγοντες (βιταμίνες, αυξητικοί παράγοντες), οι οποίοι ποικίλουν ανάλογα με τον καλλιεργούμενο μικροοργανισμό. Υπάρχουν δύο κατηγορίες θρεπτικών μέσων, σε ό,τι αφορά τη φυσική τους μορφή, τα υγρά και τα στερεά, ενώ αναλόγως με την προέλευσή τους τα διακρίνουμε σε συνθετικά και εμπειρικά. Στα συνθετικά θρεπτικά μέσα, τα απαραίτητα συστατικά επιλέγονται και προστίθενται ένα-ένα από τον ερευνητή ενώ τα εμπειρικά θρεπτικά μέσα περιέχουν το εκχύλισμα κάποιου οργανισμού που εκ πείρας έχουμε διαπιστώσει ότι επαρκεί για την ανάπτυξη μικροοργανισμών (π.χ. εκχύλισμα ζύμης ή κρέατος). Στην άσκηση αυτή θα χρησιμοποιήσουμε ένα εμπειρικό μέσο, το TSB (Trypticase Soy Broth), το οποίο έχει ένα συγκριτικό πλεονέκτημα στον συγκεκριμένο τύπο πειράματος που θα κάνουμε (βλέπε αναφορά παρακάτω) Μέτρηση της κυτταρικής αύξησης Στη μικροβιολογία, με τον όρο αύξηση (ή ανάπτυξη) εννοούμε τον πολλαπλασιασμό των μικροβιακών κυττάρων. Η αύξηση είναι μια σημαντική συνιστώσα της μικροβιακής λειτουργίας δεδομένου ότι η διάρκεια ζωής κάθε μικροβιακού κυττάρου στη φύση είναι πεπερασμένη και επομένως, τα είδη διατηρούνται μόνο μέσω της διαρκούς αύξησης του πληθυσμού τους. Για να συμβεί βεβαίως αυτό, θα πρέπει τα βακτήρια να ολοκληρώσουν με επιτυχία τον κυτταρικό τους κύκλο. Αν για κάποιο λόγο δεν συναντήσουν ευνοϊκές συνθήκες, τότε δεν θα προχωρήσουν σε διχοτόμηση και επομένως ο αριθμός τους όχι μόνο δεν θα αυξηθεί, αλλά πιθανότατα θα μειωθεί. Κάτι τέτοιο μπορεί να συμβεί, π.χ., αν δεν υπάρχουν σε επάρκεια όλα τα συστατικά που απαιτεί το βακτήριο για τις λειτουργίες του ή για την αναπαραγωγή του. Εφόσον καλλιεργήσουμε σε κατάλληλα θρεπτικά μέσα και κατάλληλες συνθήκες μικροοργανισμούς, τότε διαπιστώνουμε ότι πολύ γρήγορα φτάνουν στο μέγιστο της αύξησής τους (Εικ. 7.5). Η καμπύλη αύξησης, όπως αυτή που παρουσιάζεται στην Εικόνα 7.5, είναι τυπική για τους βακτηριακούς πληθυσμούς. Γνωρίζοντας ποια είναι η καμπύλη αύξησης ενός βακτηρίου, μπορούμε στη συνέχεια να υπολογίσουμε την θετική ή αρνητική επίδραση διαφόρων παραγόντων στον κύκλο ζωής του. Εικόνα 7.5 Τυπική καμπύλη αύξησης ενός βακτηριακού πληθυσμού

6 Η μελέτη της κυτταρικής αύξησης γίνεται με μετρήσεις είτε της κυτταρικής μάζας είτε του αριθμού των κυττάρων (σε καθορισμένο όγκο) (Εικ. 7.6). Κατά κανόνα, τα δύο αυτά μεγέθη (η μάζα και ο αριθμός των κυττάρων) σχετίζονται γραμμικώς μεταξύ τους σε μια συνήθη καλλιέργεια. Εικόνα 7.6 Αύξηση του αριθμού των κυττάρων σε μία υγρή καλλιέργεια. Στην εικόνα δεξιά παρατηρήστε ότι η θολερότητα του διαλύματος αυξάνεται καθώς αυξάνεται ο αριθμός των κυττάρων. Στη σημερινή άσκηση, θα μετρήσετε τον αριθμό των κυττάρων χρησιμοποιώντας τη νεφελομετρική μέθοδο (turbidimetric technique), η οποία γίνεται με τη χρήση ενός φασματοφωτομέτρου. Υπάρχουν και άλλες μέθοδοι για να μετρηθεί ο αριθμός των κυττάρων (μικροσκοπική μέτρηση, μέτρηση αριθμού ζωντανών κυττάρων, μέτρηση της ολικής πρωτεΐνης κ.λπ.), αλλά είναι χρονοβόρες και σχετικά πολύπλοκες ενώ καθεμιά τους ενέχει και έναν βαθμό ανακρίβειας. Η νεφελομετρική μέθοδος είναι μια έμμεση μέθοδος και χαρακτηρίζεται, και αυτή, από ένα μικρό ποσοστό ανακρίβειας, αλλά είναι εύκολη και ταχύτατη και γι αυτόν τον λόγο χρησιμοποιείται ευρύτατα από τα μικροβιολογικά εργαστήρια σε όλον τον κόσμο. Εικόνα 7.7 Αρχή λειτουργίας της νεφελομετρικής μεθόδου, με τη χρήση φασματοφωτομέτρου. Η αρχή της μεθόδου είναι η εξής. Αν πάρουμε έναν δοκιμαστικό σωλήνα που περιέχει ένα αιώρημα κυττάρων, τότε θα δούμε ότι το αιώρημα φαίνεται λίγο θολό. Αυτό συμβαίνει επειδή τα κύτταρα σκεδάζουν ένα ποσοστό του φωτός που διέρχεται μέσα από τον δοκιμαστικό σωλήνα (Εικ. 7.7). Όσο μεγαλύτερος είναι ο αριθμός των κυττάρων σε ένα τέτοιο διάλυμα, τόσο μεγαλύτερη θα είναι και η θολερότητα (νεφέλωση) του διαλύματος, λόγω της μεγαλύτερης σκεδάσεως. Όσο μεγαλύτερη είναι η θολερότητα ενός διαλύματος, τόσο μεγαλύτερη θα είναι η διάθλαση του προσπίπτοντος φωτός και επομένως τόσο μικρότερη η ποσότητα του φωτός που τελικά θα διέρχεται μέσα από το διάλυμα αυτό. Αν γνωρίζουμε: α) την ποσότητα του φωτός Ι 0 που πέφτει σε ένα διάλυμα κυττάρων και β) την ποσότητα του φωτός Ι που τελικά διέρχεται μέσα από αυτό (μη σκεδασμένο φως), τότε γνωρίζουμε με αρκετά μεγάλη ακρίβεια τη συγκέντρωση των αιωρούμενων σωματιδίων, που στην περίπτωσή μας είναι τα καλλιεργούμενα κύτταρα. Ο λογάριθμος του κλάσματος Ι 0 /Ι (log Ι 0 /Ι) ονομάζεται

7 οπτική πυκνότητα (Optical Density, OD). Όταν μετράται η απορρόφηση μόνο του θρεπτικού μέσου, τότε το κλάσμα Ι 0 /Ι ισούται με 1 και η OD ισούται με 0. Η σχέση ανάμεσα στην οπτική πυκνότητα και τη συγκέντρωση του καλλιεργούμενου μικροοργανισμού ακολουθεί τον τύπο: OD = K x C όπου K είναι η χαρακτηριστική σταθερά των μετρούμενων σωματιδίων και C (concentration) η συγκέντρωση των σωματιδίων. Η σταθερά Κ εξαρτάται από διάφορους παράγοντες, μεταξύ των οποίων το μέγεθος και το σχήμα των κυττάρων που προκαλούν τη διάθλαση του φωτός και το μήκος κύματος της χρησιμοποιούμενης ακτινοβολίας. Η τιμή της Κ υπολογίζεται εμπειρικώς μέσω της κατασκευής πρότυπης καμπύλης, δηλαδή μιας καμπύλης απορρόφησης από γνωστές συγκεντρώσεις κυττάρων (βλέπε παρακάτω). Η παραπάνω αναλογία ανάμεσα στην οπτική πυκνότητα και τη συγκέντρωση ισχύει μόνο μέσα σε ορισμένα όρια συγκεντρώσεων. Αυτό πρακτικώς σημαίνει ότι αν το διάλυμα είναι πάρα πολύ πυκνό, τότε η OD δεν αντιστοιχεί με ακρίβεια στη συγκέντρωση των κυττάρων του διαλύματος. Γι αυτόν τον λόγο φροντίζουμε πάντοτε να κάνουμε τις ανάλογες αραιώσεις, ώστε να μειώνουμε αυτό το σφάλμα (βλέπε Εικ. 7.8). Επίσης, προκειμένου να υπάρχει η μικρότερη δυνατή παρεμβολή του καλλιεργητικού υγρού στην απορρόφηση του φωτός, στη συγκεκριμένη άσκηση επιλέχθηκε η χρήση του θρεπτικού διαλύματος TSB, το οποίο απορροφά πολύ λίγο φως, σε σχέση με άλλα θρεπτικά μέσα. Για να είναι ακριβής η αντιστοίχιση της οπτικής απορρόφησης και της συγκέντρωσης των κυττάρων του εξεταζόμενου διαλύματος, θα πρέπει προηγουμένως να έχει κατασκευαστεί μια πρότυπη καμπύλη, δηλαδή μια καμπύλη όπου θα έχουμε εκ των προτέρων μετρήσει την OD (σε συγκεκριμένο μήκος κύματος του φωτός) για κυτταρικά αιωρήματα δεδομένων συγκεντρώσεων στο καλλιεργητικό μέσο της επιλογής μας και στη βέλτιστη θερμοκρασία. Θα παρασκευάσετε μόνοι σας την πρότυπη καμπύλη, για τους 37 ο C, και θα τη χρησιμοποιήσετε για να μετρήσετε τη συγκέντρωση των βακτηρίων στα υπόλοιπα πειράματα της άσκησης. Κάθε φορά που θα μετράτε την OD ενός αιωρήματος κυττάρων, θα μπορείτε, ανατρέχοντας στην πρότυπη καμπύλη, να βρίσκετε πόση είναι η συγκέντρωση του αιωρήματος. 2. Πρακτικό μέρος 2.1. Κατάλογος εφοδίων Συσκευές λύχνος bunsen, φασματοφωτόμετρο, επωαστικοί κλίβανοι σε θερμοκρασία 37 ο C και 27 ο C, αυτόματες ρυθμιζόμενες μικροπιπέτες (Ρ200) Υλικά κυψελίδες (κυβέτες) με πώμα, δηλαδή ειδικοί φωτομετρικοί σωλήνες που χρησιμοποιούνται στο φασματοφωτόμετρο, κωνικές φιάλες καλλιέργειας των 250 ml, αποστειρωμένοι δοκιμαστικοί σωλήνες των 10 ml και των 5 ml, αποστειρωμένα σιφώνια (πιπέτες) μεταφοράς του 1 ml, των 5 ml και των 10 ml, πλαστικά ρύγχη (tips) των μl, υδρόφοβο βαμβάκι, καλλιέργεια stock Escherichia coli (E.coli) μετά από 24ωρη επώαση στους 37 ο C. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Καλλιέργεια stock ονομάζεται μια πυκνή καλλιέργεια E.coli, την οποία χρησιμοποιούμε (για ένα περιορισμένο χρονικό διάστημα) ως πηγή κάθε φορά που θέλουμε να λάβουμε μια ποσότητα του μικροοργανισμού

8 Διαλύματα διάλυμα θρεπτικού μέσου Trypticase Soy Broth - TSB (~3 λίτρα), διάλυμα 10 mm καφεϊκού οξέος (10 ml), διάλυμα πενικιλίνης (5.000 Units/ml), αιθυλική αλκοόλη 70%. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Το διάλυμα του καφεϊκού οξέος (ΜΒ: 180,16 g/mol) πρέπει να είναι φρέσκο και παρασκευάζεται διαλύοντας 0,018 g σκόνης καφεϊκού οξέος σε 10 ml αποσταγμένου βραστού νερού Πειραματική διαδικασία Γενικές οδηγίες Η άσκηση περιλαμβάνει πειράματα καλλιέργειας ενός μη παθογόνου στελέχους του βακτηρίου E.coli. Παρότι το βακτηριακό στέλεχος που θα χρησιμοποιήσετε είναι μη παθογόνο, εν τούτοις θα συμπεριφερθείτε στο εργαστήριο ως εάν να ήταν παθογόνο. Έτσι, θα ακολουθήσετε σχολαστικώς όλες τις οδηγίες ασφαλείας που θα σας δοθούν στο εργαστήριο. Όσα υλικά (π.χ. σωλήνες) αδειάζουν ή δεν πρόκειται να ξαναχρησιμοποιηθούν, είτε καταστρέφονται είτε αποστειρώνονται σε ειδικούς χώρους ή δοχεία που θα σας υποδειχθούν. Η άσκηση περιλαμβάνει τρία πειράματα καλλιέργειας του βακτηριακού στελέχους της E.coli: ένα πείραμα όπου θα συγκριθεί η επίδραση της θερμοκρασίας στην καλλιέργεια του βακτηρίου (πείραμα Α), ένα πείραμα όπου στο θρεπτικό μέσο θα προστεθεί ένα διάλυμα σιδηροδεσμευτικής ένωσης (πείραμα Β), ένα πείραμα όπου στο θρεπτικό μέσο θα προστεθεί αντιβιοτικό (πείραμα Γ). Επειδή και τα τρία πειράματα ξεκινούν ταυτοχρόνως θα πρέπει να εκτελεστούν από τρεις διαφορετικές ομάδες (ομάδες Α, Β και Γ). Η αλληλοενημέρωση για τα αποτελέσματα κάθε πειράματος θα γίνει στο τέλος της άσκησης. Χρησιμοποιήστε άσηπτες τεχνικές μετάγγισης ή μεταφοράς σε όλα τα βήματα της άσκησης. Το άνοιγμα και το κλείσιμο δοχείων που περιέχουν το θρεπτικό υλικό ή την καλλιέργεια πρέπει να γίνεται δίπλα σε φλόγα λύχνου. Το θρεπτικό μέσο και όλα τα υλικά πρέπει να είναι αποστειρωμένα Δημιουργία πρότυπης καμπύλης Στην άσκηση θα κάνετε μία σειρά από αραιώσεις της αρχικής (πυκνής) καλλιέργειας της E.coli που θα σας δώσουν οι υπεύθυνοι της άσκησης. Αυτό είναι απαραίτητο στο πλαίσιο των πειραμάτων Α, Β και Γ, καθώς και για να κατασκευάσετε την πρότυπη καμπύλη που θα χρησιμοποιήσετε για να υπολογίσετε τη συγκέντρωση των κυττάρων στις καλλιέργειες που θα φτιάξετε. Θα σας δοθεί έτοιμο το υγρό θρεπτικό μέσο TSB στο οποίο θα καλλιεργηθεί ο πληθυσμός E.coli, σε κωνική φιάλη των 250 ml. Τα ακόλουθα βήματα (βήματα 1-7) είναι κοινά και για τις τρεις ομάδες, επομένως θα γίνουν από όλες τις ομάδες από κοινού. 1. Από τη φιάλη που περιέχει το θρεπτικό μέσο μεταφέρετε 5 ml σε αποστειρωμένη κυψελίδα (φωτομετρικό σωλήνα) και χρησιμοποιήστε την για να μηδενίσετε το φωτόμετρο, μετρώντας στα 580 nm. 2. Πάρτε οκτώ (8) δοκιμαστικούς σωλήνες και τοποθετήστε σε καθέναν από αυτούς 9 ml θρεπτικού μέσου. Θα χρησιμοποιηθούν για να φτιάξετε τις αραιώσεις της αρχικής καλλιέργειας (βλέπε Εικ. 7.8)

9 3. Χρησιμοποιώντας αποστειρωμένη πιπέτα, μεταφέρετε 1 ml από το πυκνό αιώρημα E.coli (καλλιέργεια stock) στην κωνική φιάλη με το υπόλοιπο υγρό θρεπτικό μέσο. Αναμίξτε καλά. Υποθέστε ότι η πυκνότητα των κυττάρων E.coli (συγκέντρωση) στην κωνική φιάλη είναι τώρα 1 δισεκατομμύριο κύτταρα ανά ml (10 9 /ml). 4. Μεταφέρετε ασηπτικά 1 ml από την κωνική φιάλη με την υγρή καλλιέργεια σε έναν δοκιμαστικό σωλήνα που περιέχει 9 ml θρεπτικού μέσου και σημάνετέ τον ως σωλήνα No1 (Εικ. 7.8). Αναμίξτε καλά. Υπολογίστε την αραίωσή του, δηλαδή τη συγκέντρωση των κυττάρων E.coli/ml. 5. Μεταφέρετε 1 ml από τον δοκιμαστικό σωλήνα No1 σε έναν δεύτερο δοκιμαστικό σωλήνα, τον οποίο θα σημάνετε ως σωλήνα No2. Αναμίξτε καλά. Υπολογίστε την αραίωσή του. 6. Επαναλάβετε το ίδιο μέχρι και τον σωλήνα Νο8 (Εικ. 7.8). ΕΡΩΤΗΣΗ: Αν θεωρήσουμε ότι η αρχική καλλιέργεια E.coli έχει συγκέντρωση 1, ποιά είναι η συγκέντρωση της καλλιέργειας στους σωλήνες No1 έως No8; Συμβουλευτείτε την Εικόνα 7.8. Εικόνα 7.8 Πρωτόκολλο αραίωσης της υγρής καλλιέργειας. 7. Από τον σωλήνα No1 μεταφέρετε ασηπτικά 2,5 ml στην κυψελίδα φωτομέτρησης και φωτομετρήστε την οπτική πυκνότητα στα 580 nm (OD 580 ). Επαναλάβετε το ίδιο για τους σωλήνες No2 έως No8 και καταγράψτε τις τιμές της OD 580 στον Πίνακα 1 και το αντίστοιχο διάγραμμα (Εικ. 7.9). Αριθμός δοκιμαστικού σωλήνα No1 No2 No3 No4 No5 No6 No7 No8 Συγκέντρωση κυττάρων E.coli/ml ΟD580 Πίνακας 7.1 Πειραματικές μετρήσεις OD 580 για διαφορετικές αραιώσεις καλλιεργούμενων κυττάρων E.coli

10 Εικόνα 7.9 Πρότυπη καμπύλη οπτικής απορρόφησης (OD 580 ) για γνωστές συγκεντρώσεις κυττάρων E.coli Πείραμα Α: Μέτρηση του ρυθμού αύξησης σε θερμοκρασίες 37 ο C και 27 ο C (Το πείραμα Α θα διενεργηθεί από την ομάδα Α). 8. Ανακινήστε ελαφρώς τον δοκιμαστικό σωλήνα No6 και πάρτε 5 ml για να γεμίσετε δύο αποστειρωμένες κυψελίδες. Η μία προορίζεται για την επώαση στους 37 ο C και η άλλη για τους 27 ο C. 9. Καλύψτε τις κυψελίδες με το πώμα. Οι κυψελίδες θα παραμείνουν καλυμμένες μέχρι το τέλος του πειράματος. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Χρειάζεται προσοχή ώστε η εξωτερική επιφάνεια των κυψελίδων να είναι καθαρή πριν εισαχθούν στην υποδοχή του φασματοφωτομέτρου. Για τον σκοπό αυτό θα πρέπει να προσέχετε ώστε να πιάνετε τις κυψελίδες πάντοτε από το πάνω μέρος. 10. Μετρήστε την OD 580 των δύο κυψελίδων και σημειώστε τις τιμές στα αντίστοιχα πεδία του Πίνακα 7.2 που υπάρχει στο τέλος της άσκησης. Ως χρόνος μηδέν (0) για τις μετρήσεις όλων των πειραμάτων θα ληφθεί ο χρόνος της 1 ης φωτομέτρησης. Αφού ολοκληρώσετε αυτή τη μέτρηση, τοποθετήστε τη μία κυψελίδα στον επωαστικό κλίβανο που έχει ρυθμιστεί στους 37 ο C και την άλλη στον επωαστικό κλίβανο που έχει ρυθμιστεί στους 27 ο C. 11. Επαναλάβετε κάθε 15 λεπτά τη μέτρηση της OD 580 των δύο κυψελίδων και συμπληρώστε τα αντίστοιχα πεδία του Πίνακα 7.2. Μετά από κάθε μέτρηση, οι κυψελίδες τοποθετούνται και πάλι στον επωαστικό κλίβανο. 12. Αναπαραστήστε γραφικά τις μετρήσεις που πήρατε στο διάγραμμα καμπύλης αύξησης που βρίσκεται στο τέλος της άσκησης (Εικ. 7.10). Στον άξονα των X θα αναγράφεται ο χρόνος και στον άξονα των Ψ οι μετρήσεις από το φασματοφωτόμετρο. Χρησιμοποιήστε διαφορετικό χρώμα για τις δύο θερμοκρασίες επώασης. ΕΡΩΤΗΣΗ: Πόση είναι η συγκέντρωση των κυττάρων στη χαμηλότερη οπτική απορρόφηση που μετρήσατε και πόση στην υψηλότερη; Συμβουλευτείτε την πρότυπη καμπύλη

11 Πείραμα Β: Μέτρηση του ρυθμού αύξησης παρουσία ουσιών που δεσμεύουν τον σίδηρο (Το πείραμα Β θα διενεργηθεί από την ομάδα Β). 13. Στο βήμα 8, αντί για δύο κυψελίδες θα χρησιμοποιήστε μία. Η κυψελίδα του φωτομέτρου περιέχει 2,5 ml αιωρήματος κυττάρων E.coli. Πριν σκεπάσετε την κυψελίδα με το αιώρημα των βακτηρίων (δηλαδή πριν το βήμα 9), προσθέσετε, χρησιμοποιώντας αυτόματη μικροπιπέτα, 25 μl διαλύματος 10 mm καφεϊκού οξέος. Καλύψτε την κυψελίδα με το πώμα και αναμίξτε καλά. Το καφεϊκό οξύ έχει την ικανότητα να δεσμεύει τον ελεύθερο σίδηρο, όπως αυτόν που περιέχει το καλλιεργητικό μέσο. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Επειδή ο όγκος του διαλύματος καφεϊκού οξέος που θα προσθέσετε είναι πολύ μικρός, θεωρήσετε ότι δεν επηρεάζει τον όγκο του διαλύματος των βακτηρίων. 14. Στη συνέχεια, διενεργούμε τα υπόλοιπα βήματα του πειράματος Α (βήματα 10-12) προσαρμοσμένα για μία κυψελίδα, η οποία θα επωάζεται στον κλίβανο επώασης των 37 ο C Πείραμα Γ: Μέτρηση του ρυθμού αύξησης παρουσία πενικιλίνης (Το πείραμα Γ θα διενεργηθεί από την ομάδα Γ). 15. Ανακινήστε ελαφρώς τον σωλήνα Νο5 και μεταφέρετε άσηπτα 1 ml σε έναν δοκιμαστικό σωλήνα που περιέχει 9 ml υγρού θρεπτικού μέσου. Σημειώστε αυτόν τον σωλήνα με την ένδειξη Γ 1 και υπολογίστε την αραίωσή του. 16. Μεταφέρετε 2,5 ml από το αιώρημα του σωλήνα Γ 1, αφού πρώτα αναμίξτε καλά, σε μια κυψελίδα φωτομέτρησης. Πριν σκεπάσετε την κυψελίδα, προσθέσετε, χρησιμοποιώντας αυτόματη μικροπιπέτα, 100 μl έτοιμου διαλύματος πενικιλίνης (5.000 U/ml). ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Επειδή ο όγκος του διαλύματος πενικιλίνης που θα προσθέσετε είναι πολύ μικρός, θεωρήσετε ότι δεν επηρεάζει τον όγκο του διαλύματος με τα βακτήρια. 17. Στη συνέχεια, διενεργούμε τα υπόλοιπα βήματα του πειράματος Α (βήματα 10-12) προσαρμοσμένα για μία κυψελίδα που θα επωάζεται στον κλίβανο επώασης των 37 ο C. 18. Την επόμενη ημέρα της διεξαγωγής του πειράματος αυτού (μετά από ~24 ώρες) θα πρέπει να επαναλάβετε τη φωτομέτρηση της κυψελίδας με το αιώρημα των κυττάρων E.coli παρουσία του αντιβιοτικού πενικιλίνη. Χρόνος μέτρησης Θερμοκρασία 37 ο C Θερμοκρασία 27 ο C Με καφεϊκό οξύ (στους 37 ο C) Με πενικιλίνη (στους 37 ο C) 0 min 15 min 30 min 45 min 60 min 75 min 90 min 105 min 24 ώρες Πίνακας 7.2 Πειραματικές μετρήσεις οπτικής απορρόφησης στους 37 ο C και 27 ο C, καθώς και στους 37 ο C παρουσία διαλύματος καφεϊκού οξέος ή πενικιλίνης

12 Εικόνα 7.10 Καμπύλες αύξησης σε θερμοκρασία 37 ο C και 27 ο C, καθώς και στους 37 ο C παρουσία διαλύματος καφεϊκού οξέος ή πενικιλίνης (χρησιμοποιήστε διαφορετικά χρώματα για να σχεδιάσετε κάθε καμπύλη) Ερωτήσεις Παρατηρήσεις 1. Υπάρχουν διαφορές στις καμπύλες αύξησης σε θερμοκρασία 37 ο C και 27 ο C που σχεδιάσατε; Κατά τη γνώμη σας πώς εξηγούνται; 2. Ερευνήστε στο διαδίκτυο να βρείτε ποια είναι η βέλτιστη θερμοκρασία ανάπτυξης για τον μικροοργανισμό που χρησιμοποιήσατε. Συμφωνεί αυτή η καμπύλη με τα δικά σας αποτελέσματα; Εξηγήστε. 3. Επηρεάζει η παρουσία του καφεϊκού οξέος την ανάπτυξη του βακτηριακού πληθυσμού; Με ποιόν τρόπο; 4. Πόση είναι η τελική συγκέντρωση του καφεϊκού οξέος στο διάλυμα της κυψελίδας; Υποθέστε ότι η προσθήκη των 25 μl δεν επηρεάζει τον όγκο των 2,5 ml. 5. Πόση είναι η τελική συγκέντρωση της πενικιλίνης (U/ml) στο διάλυμα της κυψελίδας; 6. Υπάρχουν διαφορές στη δράση της πενικιλίνης μετά από 24 ώρες και αν ναι, πώς θα μπορούσαν να εξηγηθούν; 7. Ποιός είναι ο τρόπος δράσης της πενικιλίνης; Αν χρησιμοποιούσαμε άλλον τύπο αντιβιοτικού (π.χ. στρεπτομυκίνη), τι διαφορές πιστεύετε ότι μπορεί να παρουσιάζονταν;

13 Συνιστώμενη βιβλιογραφία 1. Campbell, N. A., & Reece, J. B. (2010). Βιολογία (τόμος Ι). Πανεπιστημιακές Εκδόσεις Κρήτης. ISBN: Madigan, M. T., Martinko, J. M., & Parker, J. (2005). Brock, Βιολογία των Μικροοργανισμών (τόμος I). Πανεπιστημιακές Εκδόσεις Κρήτης. ISBN: