ΕΘΝΙΚΟ ΜΕΤΣΟΒΙΟ ΠΟΛΥΤΕΧΝΕΙΟ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΙΚΩΝ ΜΗΧΑΝΙΚΩΝ. Στεριώτη Αικατερίνη Αίθρα

Transcript

1 ΕΘΝΙΚΟ ΜΕΤΣΟΒΙΟ ΠΟΛΥΤΕΧΝΕΙΟ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΙΚΩΝ ΜΗΧΑΝΙΚΩΝ Τομέας IV: Σύνθεσης και Ανάπτυξης Βιομηχανικών Διαδικασιών Στεριώτη Αικατερίνη Αίθρα Υπεύθυνος Καθηγητής:Κος Ε. Τόπακας Θέμα Διπλωματικής Εργασίας: ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΖΥΜΗΣ LIPOMYCES STARKEYI ΩΣ ΠΡΟΣ ΤΗΝ ΙΚΑΝΟΤΗΤΑ ΒΙΟΣΥΝΘΕΣΗΣ ΕΝΔΟΚΥΤΤΑΡΙΚΟΥ ΛΙΠΟΥΣ ΣΕ ΣΥΝΘΕΤΙΚΑ ΥΠΟΣΤΡΩΜΑΤΑ ΚΑΙ ΡΕΥΣΤΟΠΟΙΗΜΕΝΑ ΣΤΕΛΕΧΗ ΓΛΥΚΟΥ ΣΟΡΓΟΥ Μάρτιος 2013

2 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Σελίδα Περίληψη 1 Ι. Εισαγωγή 5 Ι.1 Βιο - Ανανεώσιμες πηγές ενέργειας 7 Ι.2 Βιομάζα 8 Ι.3 Βιοκαύσιμα 10 Ι.4 Βιοντίζελ 14 Ι.4.1 Από το ντίζελ στο βιοντίζελ 14 Ι.4.2 Ιστορική αναδρομή 16 Ι.4.3 Ιδιότητες βιοντίζελ σύγκριση με ορυκτό ντίζελ 16 Ι.4.4 Πρώτες ύλες 19 Ι.4.5 Διαδικασίες παραγωγής βιοντίζελ 21 Ι.4.6 Μικροοργανισμοί ικανοί για την παραγωγή βιοντίζελ 24 Ι.4.7 Μικροβιακό λίπος για τη παραγωγή βιοντίζελ 27 Ι.4.8 Βιοχημεία συσσώρευσης ενδοκυτταρικού λίπους 27 Ι.4.9 Συνθήκες καλλιέργειας 31 Ι.4.10 Γλυκό σόργο 31 Ι.4.11 Ζύμες για τη συσσώρευση ενδοκυτταρικού λίπους 33 Lipomyces starkeyi ΙΙ. Υλικά και μέθοδοι 34 ΙΙ.1 Υλικό 34 ΙΙ.2 Θρεπτικά Υποστρώματα 34 Υγρό υπόστρωμα προ καλλιέργειας Θρεπτικό μέσο καλλιέργειας της ζύμης Υπόστρωμα για τριβλία Διάλυμα Ringer ΙΙ.3 Αναλύσεις 38 Δειγματοληψία Προσδιορισμός και διόρθωση ph Προσδιορισμός βιομάζας Προσδιορισμός βιομάζας στο σόργο Προσδιορισμός ολικών σακχάρων Εκχύλιση λιπαρών Προσδιορισμός αζώτου των ελεύθερων αμινομάδων Ενζυμική υδρόλυση ξηρού σόργου Σχεδιασμός πειραμάτων 45 ΙΙΙ. Αποτελέσματα 46 ΙΙΙ.Α Πηγή Άνθρακα 46 Συζήτηση αποτελεσμάτων πρώτης σειράς πειραμάτων 54 ΙΙΙ.Β Πηγή Αζώτου 56 Συζήτηση αποτελεσμάτων δεύτερης σειράς πειραμάτων 68 ΙΙΙ.Γ Λόγο άνθρακα/αζώτου (C/N) 71 Συζήτηση αποτελεσμάτων δεύτερης σειράς πειραμάτων 82 ΙΙΙ.Δ Γλυκό Σόργο 84 Γενικά συμπεράσματα 89 Βιβλιογραφία 90

3 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Η μεγάλη ζήτηση σε ενέργεια, η παγκόσμια αύξηση της θερμοκρασίας η οποία οφείλεται στις εκπομπές των αερίων του θερμοκηπίου, η μόλυνση του περιβάλλοντος, η αύξηση της τιμής του αργού πετρελαίου και η γρήγορη μείωση της προσφοράς ορυκτών καυσίμων είναι οι βασικοί παράγοντες που οδήγησαν στην αναζήτηση εναλλακτικών πηγών ενέργειας. Μία μορφή εναλλακτικής πηγής ενέργειας αποτελεί το βιοντίζελ, το οποίο προέρχεται από διάφορα φυτικά ελαία, ζωικά λίπη, καθώς και απόβλητα ελαίων. Ως εναλλακτική λύση των γεωργικών και ζωικών πηγών για την παραγωγή ελαίων και λιπών, έχουν θεωρηθεί οι μικροοργανισμοί. Υπάρχουν πολλές ζύμες και μύκητες, καλούμενοι ελαιογόνοι μικροοργανισμοί, οι οποίοι μπορούν να συσσωρεύουν ενδοκυτταρικά υψηλές ποσότητες μικροβιακού λίπους (SCO), το οποίο έχει την ίδια σύνθεση λιπαρών οξέων με τα φυτικά έλαια. Συνεπώς, η παραγωγή βιοντίζελ από ελαιογόνους μικροοργανισμούς αποτελεί μια πολλά υποσχόμενη εναλλακτική λύση. Η παρούσα ερευνητική μελέτη, είχε στόχο τη διερεύνηση της βιοφυσιολογικής συμπεριφοράς της ζύμης Lipomyces starkeyi και της ικανότητάς της να συσσωρεύει ενδοκυτταρικό λίπος. Για το σκοπό αυτό, πραγματοποιήθηκαν τέσσερις σειρές πειραμάτων μεταβάλλοντας κάθε φορά από μία παράμετρο. Πιο συγκεκριμένα η πρώτη σειρά πειραμάτων αφορούσε την ικανότητα ανάπτυξης και παραγωγής λίπους της εν λόγω ζύμης καταναλώνοντας τα σάκχαρα που υπάρχουν στο γλυκό σόργο (δηλαδή σακχαρόζη, γλυκόζη και φρουκτόζη) σε αρχική συγκέντρωση 40g/L, ενώ ο λόγος C/N ήταν ίσος με 100. Όλες οι ζυμώσεις που πραγματοποιήθηκαν ήταν ασυνεχούς τύπου σε ανακινούμενο επωαστήρα. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το γλυκό σόργο θα μπορούσε να αποτελέσει κατάλληλο υπόστρωμα για την ανάπτυξη της ζύμης L. starkeyi και την παραγωγή λίπους. Στη συνέχεια έγινε έλεγχος της πηγής αζώτου. Χρησιμοποιήθηκαν οργανικές πηγές αζώτου: ουρία, πεπτόνη και yeast extract και ανόργανες: χλωριούχο αμμώνιο (NH4Cl), θειικό αμμώνιο ((NH4)2SO4) και όξινο φωσφορικό αμμώνιο (NH4)2HPO4. Ως πηγή άνθρακα χρησιμοποιήθηκε μίγμα σακχαρόζης, γλυκόζης και φρουκτόζης με αρχική συγκέντρωση 40g/L και ο λόγος C/Ν ήταν 100. Τις καλύτερες αποδόσεις σε παραγωγή ενδοκυτταρικού λίπους έδωσε η πεπτόνη με 44,02% w/w και το yeast extract με 43,70% w/w, ενώ οι συγκεντρώσεις λίπους έφθασαν την τελευταία ημέρα της ζύμωσης τα 4,86 g/l και 5,23 g/l αντίστοιχα. Στην τρίτη σειρά πειραμάτων έγινε έλεγχος για την εύρεση της επίδρασης του λόγου άνθρακα/αζώτου στην ανάπτυξη και ικανότητα βιοσύνθεσης ενδοκυτταρικού λίπους από τη ζύμη L. Starkeyi. Τα πειράματα που διεξήχθηκαν είχαν λόγο άνθρακα/αζώτου 130, 160, 190, 220 και τέλος 250. Ως πηγή αζώτου χρησιμοποιήθηκε το yeast extract, το οποίο έδωσε τα καλύτερα αποτελέσματα, με βάση τη δεύτερη σειρά πειραμάτων, ενώ πηγή σακχάρων αποτέλεσε το μίγμα σακχαρόζης, γλυκόζης και φρουκτόζης με αρχική συγκέντρωση 40g/L. Ο βέλτιστος λόγος C/N για την παραγωγή ενδοκυτταρικού λίπους ήταν ο 190 με μέγιστη παραγωγή λίπους στα 5,81g/L και έναν συντελεστή παραγωγής λίπους ίσο με 47,33% w/w. ~ 1 ~

4 Παρατηρήθηκε ότι με την αύξηση του λόγου C/N, υπήρχε μια σταδιακή αύξηση της % συγκέντρωσης του ενδοκυτταρικού λίπους σε σχέση με την συνολική ξηρή βιομάζα, έως της τιμής C/N 190, ενώ από εκεί και έπειτα με την αύξηση της αναλογίας του άνθρακα, παρατηρείται μια μικρή μείωση της % συγκέντρωσης λίπους. Ωστόσο οι διαφορές δεν είναι πολύ μεγάλες και έτσι φαίνεται ότι η ζύμη έχει την ικανότητα να συσσωρεύει σημαντικές ποσότητες λίπους σε ένα σημαντικό εύρος τιμών του λόγου C/N (από 100 έως και 220). Τέλος, μετά την διερεύνηση των συνθηκών που επηρεάζουν την ανάπτυξη της ζύμης L. starkeyi και την ικανότητα συσσώρευσης ενδοκυτταρικού λίπους, πραγματοποιήθηκε ανάπτυξη της ζύμης σε ρευστοποιημένο γλυκό σόργο, όπου έγινε έλεγχος της ικανότητας της ζύμης να καταναλώνει ταυτόχρονα και το άζωτο που περιέχετε στο σόργο με την μορφή πρωτεϊνών ~ 2 ~

5 ABSTRACT The great demand for energy, the global warming which is caused from the emission of greenhouse gases, the environmental pollution, the rising price of the crude oil and the rapid decrease of the supply of fossil fuels are the prime factors that have increased the interest for the production of fuels from renewable resources. Biodiesel comprise one form of renewable energy, which can be produced by utilizing as raw material various vegetable oils, animal fats, as well as oil wastes. Apart from the agricultural and animal sources, microorganisms are considered an alternative solution for the production of oil lipids which could be utilized as raw material for the production of biodiesel. There are plentiful yeasts and fungi, called oleaginous microorganisms, which are capable of accumulating high quantities of microbial lipid (SCO single cell oil), which has the same composition of fatty acids with vegetable oils. As a result, the utilization of yeast for the production of biodiesel seems to be promising. The aim of this study is to investigate the biophysical behavior of the yeast Lipomyces starkeyi and its ability to accumulate intracellular lipid. For this purpose, four series of experiments were performed, changing each time one of the parameters. More specifically, during the first series of experiments the ability of the yeast to grown and accumulate intracellular lipids, when cultivating on the sugars present in sweet sorghum (namely sucrose, glucose, fructose and a mixture of them) was evaluated. Initial sugar concentration was adjust of 40g/L, while the C/N ratio was equal to 100. Batch cultivations were carried out at a rotary shaker. The results have shown that the sweet sorghum is a proper substrate for the cultivation of the yeast in order to accumulate SCO. Subsequently, the effect of the nitrogen source was evaluated. Both organic and inorganic sources were tested. More specifically organic sources of nitrogen were: urea, peptone and yeast extract, and the inorganic were: ammonium chloride (NH4Cl), ammonium sulphate ((NH4)2SO4) and diammonium phosphate (NH4)2HPO4. The carbon source that was used was a mixture of sucrose, glucose and fructose at an initial concentration of 40g/L, while the C/N ratio was equal to 100. The best results for the production of intracellular lipid were obtained when peptone and yeast extract were used, giving a yield of 44,02% w/w and 43,70% w/w respectively. Concentration of SCO reached 4,86 g/l and 5,23 g/l respectively. At the third series of experiments, the effect of the carbon to nitrogen ratio (C/N) on yeast growth and SCO accumulation ability was examined. During these experiments, the C/N ratios examined, were 130, 160, 190, 220 and 250. Yeast extract was utilized as nitrogen source (based on previous results) while the mixture of sucrose, glucose and fructose at an initial concentration of 40g/L was used as carbon source. The optimum C/N ratio for the production of intracellular lipid was found to be 190, where a production of 5,81g/L SCO and a lipid production coefficient that is equal to 47,33% w/w were obtained. ~ 3 ~

6 It was observed that with increasing C/N ratio up to 190, a gradual increase of % w/w lipid concentration was obtained while from this point on with the increase of the proportion of the carbon, a small reduction of the % lipid concentration was observed. Nevertheless, due to the fact that at these range of C/N ratios, differences concerning SCO accumulation were not very important, indicating that the yeast is capable of producing significant amounts of SCO at a wide range of C:N ratios (from 100 up to 220). Eventually, after the investigation of the conditions that affect the growth and SCO accumulation of L. starkeyi when cultivated on synthetic media, the ability of the yeast to grow on liquefied sweet sorghum stalks was examined. During this experiment, no external nitrogen source was added, in order to evaluate the ability of the yeast to utilize the proteins contained in sweet sorghum. ~ 4 ~

7 Ι. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η ενέργεια παίζει ζωτικό ρόλο στη ζωή των ανθρώπων, καθώς αποτελεί σημαντικό παράγοντα της κοινωνικό-οικονομικής εξέλιξης κάθε χώρας. Είναι απολύτως απαραίτητη για την ίδια τη ζωή, αλλά και για όλες τις ανθρώπινες δραστηριότητες και την επίτευξη των αναπτυξιακών σχημάτων που η ανθρωπότητα επεξεργάζεται, για να καλυτερεύσει τις συνθήκες διαβίωσης, να κατακτήσει την πρόοδο και την ευημερία και να βελτιώσει την ποιότητα ζωής. Η ανθρώπινη ιστορία λοιπόν σημαδεύεται από μια ολοένα αυξανόμενη ανακάλυψη και χρήση ενεργειακών πόρων και εφεύρεση τεχνολογιών για την εκμετάλλευση της ενέργειας. Συνέπεια αυτού η παραγωγή ενέργειας ήταν και θα είναι πάντα ένας τομέας που παρουσιάζει σημαντικό ενδιαφέρον για έρευνα. Υπάρχουν διάφοροι τρόποι με τους οποίους η αφθονία της ενέργειας μπορεί να αποθηκευτεί, να μετατραπεί και να ενισχυθεί, προκειμένου να χρησιμοποιηθεί από τον άνθρωπο. Οι πηγές ενέργειας μπορούν να ταξινομηθούν σε 3 κατηγορίες: 1. ενέργεια προερχόμενη από ορυκτά καύσιμα, 2. ανανεώσιμες πηγές και 3. πυρηνική ενέργεια. Τα ορυκτά καύσιμα ή αλλιώς τα καύσιμα που προέρχονται από απολιθώματα, σχηματίστηκαν σε μία ύστερη χρονική γεωλογική περίοδο, δεν είναι ανανεώσιμα και περιλαμβάνουν: τα στερεά καύσιμα των γαιανθράκων, όπως λιγνίτη, ανθρακίτη, τύρφη, τα υγρά καύσιμα, που προκύπτουν ύστερα από κατεργασία, όπως πετρέλαιο, βενζίνη, κηροζίνη, μαζούτ και τα αέρια καύσιμα, όπως το φυσικό αέριο και το υγραέριο. Σήμερα τα καύσιμα και τα χημικά, που κατά κύριο λόγο προέρχονται από μη ανανεώσιμες ορυκτές πηγές πετρελαίου και γαιάνθρακα, οδηγούν σε περιβαλλοντική μόλυνση, εκπομπή των αερίων του θερμοκηπίου και προβλήματα σχετικά με την ασφάλεια της ενέργειας. Οι ανανεώσιμες πηγές ενέργειας, είναι «καθαρές» μορφές ενέργειας, φιλικές προς το περιβάλλον και ανεξάντλητες. Συμπεριλαμβάνουν την αιολική ενέργεια, την ηλιακή, τη γεωθερμική, την υδροηλεκτρική, τη θαλάσσια ενέργεια, την ενέργεια από το υδρογόνο, καθώς και τη βιομάζα. [1] Τα κύρια πλεονεκτήματα των Ανανεώσιμων Πηγών Ενέργειας (ΑΠΕ), είναι τα εξής: Είναι πρακτικά ανεξάντλητες πηγές ενέργειας και συμβάλλουν στη μείωση της εξάρτησης από τα ορυκτά καύσιμα. Είναι εγχώριες πηγές ενέργειας και συνεισφέρουν στην ενίσχυση της ενεργειακής ανεξαρτητοποίησης και της ασφάλειας του ενεργειακού εφοδιασμού σε εθνικό επίπεδο. Είναι διάσπαρτες γεωγραφικά και οδηγούν στην αποκέντρωση του ενεργειακού συστήματος, δίνοντας τη δυνατότητα κάλυψης των ενεργειακών αναγκών σε τοπικό και περιφερειακό επίπεδο, ανακουφίζοντας έτσι τα συστήματα υποδομής και μειώνοντας τις απώλειες από τη μεταφορά ενέργειας. ~ 5 ~

8 Προσφέρουν τη δυνατότητα ορθολογικής αξιοποίησης των ενεργειακών πόρων, καλύπτοντας ένα ευρύ φάσμα των ενεργειακών αναγκών των χρηστών (π.χ. ηλιακή ενέργεια για θερμότητα χαμηλών θερμοκρασιών, αιολική ενέργεια για ηλεκτροπαραγωγή). Έχουν συνήθως χαμηλό λειτουργικό κόστος, που δεν επηρεάζεται από τις διακυμάνσεις της διεθνούς οικονομίας και ειδικότερα των τιμών των συμβατικών καυσίμων. Οι εγκαταστάσεις εκμετάλλευσης των ΑΠΕ έχουν σχεδιαστεί για να καλύπτουν τις ανάγκες των χρηστών και σε μικρή κλίμακα εφαρμογών ή σε μεγάλη κλίμακα, αντίστοιχα, έχουν μικρή διάρκεια κατασκευής, επιτρέποντας έτσι τη γρήγορη ανταπόκριση της προσφοράς προς τη ζήτηση ενέργειας. Οι επενδύσεις σε ΑΠΕ μπορούν να οδηγήσουν στη δημιουργία νέων θέσεων εργασίας, μειώνοντας έτσι τα υψηλά επίπεδα ανεργίας. Μπορούν να αποτελέσουν σε πολλές περιπτώσεις πυρήνα για την αναζωογόνηση οικονομικά και κοινωνικά υποβαθμισμένων περιοχών και πόλο για την τοπική ανάπτυξη, με την προώθηση ανάλογων επενδύσεων (π.χ. θερμοκηπιακές καλλιέργειες με τη χρήση γεωθερμικής ενέργειας). Είναι φιλικές προς το περιβάλλον και τον άνθρωπο και η αξιοποίησή τους είναι γενικά αποδεκτή από το κοινό. [2] Πυρηνική ή ατομική ενέργεια ονομάζεται η ενέργεια που απελευθερώνεται, όταν μετασχηματίζονται ατομικοί πυρήνες. Είναι δηλαδή η δυναμική ενέργεια, που είναι εγκλεισμένη στους πυρήνες των ατόμων λόγω της αλληλεπίδρασης των σωματιδίων που τα συνιστούν. Η πυρηνική ενέργεια απελευθερώνεται κατά τη σχάση ή σύντηξη των πυρήνων και, εφόσον οι πυρηνικές αντιδράσεις είναι ελεγχόμενες, η εκλυόμενη ενέργεια με τη μορφή θερμότητας μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την κάλυψη ενεργειακών αναγκών. Η σχάση πυρήνων δεν αποτελεί ανεξάντλητη πηγή ενέργειας, ούτε και καθαρή και ελλοχεύει αρκετούς κινδύνους, καθώς αποτελεί μια πολύ επικίνδυνη μορφή ενέργειας. [3] Εικόνα 1: Σχηματική παράσταση ανανεώσιμων και μη ανανεώσιμων πηγών ενέργειας ~ 6 ~

9 I.1 ΒΙΟ-ΑΝΑΝΕΩΣΙΜΕΣ ΠΗΓΕΣ ΕΝΕΡΓΕΙΑΣ Η μεγάλη ζήτηση σε ενέργεια, η αύξηση της τιμής του αργού πετρελαίου, η παγκόσμια αύξηση της θερμοκρασίας η οποία οφείλεται στις εκπομπές των αερίων του θερμοκηπίου, η μόλυνση του περιβάλλοντος και η γρήγορη μείωση της προσφοράς ορυκτών καυσίμων είναι οι βασικοί παράγοντες που οδήγησαν στην αναζήτηση εναλλακτικών πηγών ενέργειας. [4] Διάγραμμα 1: Αναπαράσταση της ανάπτυξης των ανανεώσιμων πηγών (GWh/a*). * Γιγαβατώρες ανά έτος Πηγή: Μοντέλο Green-X του Ιδρύματος Fraunhofer και του EEG. ~ 7 ~

10 I.2 ΒΙΟΜΑΖΑ Μία μορφή ανανεώσιμης πηγής ενέργειας αποτελεί η βιομάζα. Με τον όρο βιομάζα ονομάζουμε οποιοδήποτε υλικό παράγεται από ζωντανούς οργανισμούς (όπως υπολείμματα καλλιεργειών, κτηνοτροφικά απόβλητα, δασικά κατάλοιπα και απόβλητα βιομηχανιών τροφίμων) και μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως καύσιμο για παραγωγή ενέργειας. Η ενέργεια, η οποία είναι αποθηκευμένη στις φυτικές ουσίες, προέρχεται από τον ήλιο όπου μέσω της φωτοσυνθετικής διαδικασίας τα φυτά μετασχηματίζουν το διοξείδιο του άνθρακα (CO2) σε βιομάζα. Στη συνέχεια οι ζωικοί οργανισμοί προσλαμβάνουν την ενέργεια αυτή με την τροφή τους και αποθηκεύουν ένα μέρος της. Τελικά αυτή την ενέργεια αποδίδει η βιομάζα μετά την επεξεργασία και τη χρήση της. Στην ουσία η βιομάζα είναι λοιπόν αποθηκευμένη ηλιακή ενέργεια, η οποία δεσμεύτηκε από τα φυτά κατά τη διαδικασία της φωτοσύνθεσης, γι αυτό και αποτελεί ανανεώσιμη πηγή. Η βιομάζα είναι η παλαιότερη και περισσότερη διαδεδομένη ανανεώσιμη πηγή ενέργειας, αφού ο πρωτόγονος άνθρωπος, για να ζεσταθεί και να μαγειρέψει, χρησιμοποιούσε την ενέργεια που προερχόταν από την καύση των ξύλων, τα οποία αποτελούν ένα είδος βιομάζας. Υπάρχουν δύο είδη βιομάζας : i) οι υπολειμματικές μορφές (τα κάθε είδους φυτικά υπολείμματα, ζωικά απόβλητα και απορρίμματα) και ii) η βιομάζα που παράγεται από ενεργειακές καλλιέργειες. Οι ενεργειακές καλλιέργειες, είτε αφορούν παραδοσιακές καλλιέργειες που μπορούν να χρησιμοποιηθούν και για την παραγωγή βιοκαυσίμων (π.χ. ζαχαροκάλαμο και καλαμπόκι για βιοαιθανόλη, ηλίανθος για βιοντίζελ, κλπ.), είτε νέες καλλιέργειες που δεν καλλιεργούνται προς το παρόν εμπορικά όπως ο μίσχανθος, η αγριαγκινάρα και το καλάμι, των οποίων το τελικό προϊόν προορίζεται για την παραγωγή ενέργειας. [5], [6], [7] Οι πηγές βιομάζας περιλαμβάνουν ποικίλα φυσικά και παραγόμενα υλικά, όπως ξύλο και ποώδη είδη, δασικά κατάλοιπα, βαγγάση, αγροτικά και βιομηχανικά υπολείμματα, απορρίμματα χαρτιού, στερεά αστικά απόβλητα, πριονίδια, βιοστερεά, γρασίδι, υπολείμματα από επεξεργασία τροφίμων, απορρίμματα ζώων, υδρόβια φυτά και άλγη. Τα κύρια συστατικά που απαρτίζουν τη βιομάζα είναι η κυτταρίνη, η ημικυτταρίνη και η λιγνίνη. [1] Η κυτταρίνη αποτελεί το σημαντικότερο συστατικό των πολυσακχαριτών των κυτταρικών τοιχωμάτων. Αποτελείται από ένα γραμμικό πολυμερές μονάδων D-γλυκόζης, συνδεδεμένων μεταξύ τους με β-1,4 γλυκοζιτικό δεσμό. Τα πολυμερή κυτταρίνης παρουσιάζονται ως διατεταγμένες δομές (μικροϊνίδια) και η λειτουργία τους είναι να εξασφαλίσουν την ακαμψία του κυτταρικού τοιχώματος των φυτών. Η κυτταρίνη είναι ένας αδιάλυτος πολυσακχαρίτης που σχηματίζει κρυσταλλικές περιοχές, οι άμορφες περιοχές της είναι πολύ υγροσκοπικές, διογκώνεται απεριόριστα και διαλύεται πλήρως από θειικό οξύ, υδροχλωρικό οξύ και φωσφορικό οξύ. ~ 8 ~

11 Η ημικυτταρίνη στην πραγματικότητα δεν είναι μία, αλλά υπάρχουν πολλά είδη ημικυτταρινών. Θα μπορούσε να οριστεί σαν το μίγμα συμπολυμερών ουσιών που μαζί με την κυτταρίνη και τη λιγνίνη συγκρατούν τα κυτταρικά τοιχώματα των ξύλινων ιστών. Οι ημικυτταρίνες είναι άμορφες (όχι κρυσταλλικές), έχουν χαμηλό βαθμό πολυμερισμού, είναι έντονα υγροσκοπικές και παρουσιάζουν υψηλή χημική δραστικότητα. Το κυριότερο συστατικό της ημικυτταρίνης αποτελεί η ξυλάνη. Η λιγνίνη αποτελεί ένα από τα σπουδαιότερα και πιο άφθονα συστατικά της φυτικής βιομάζας, ωστόσο δε βρίσκεται σε όλα τα φυτικά είδη. Είναι άμορφη, έχει πολύ υψηλό βαθμό πολυμερισμού, έντονα υδρόφοβη ουσία αδιάλυτη στο νερό και με χαμηλή διόγκωση. Η λιγνίνη ενώνεται με χημικούς δεσμούς με τις ημικυτταρίνες και με την κυτταρίνη και προσδίδει υψηλή αντοχή σε κάμψη, θλίψη και κρούση. [8] Εικόνα 2: Δομή λιγνοκυτταρινούχου υλικού Ο μέσος όρος της πλειοψηφίας της ενέργειας από βιομάζα παράγεται από ξύλο και υπολείμματα ξύλου (64%), ακολουθεί η παραγωγή από στερεά αστικά απόβλητα (24%), αγροτικά απορρίμματα (5%) και αέρια υγειονομικής ταφής (5%). Η παγκόσμια παραγωγή βιομάζας εκτιμάται στα 146 δισεκατομμύρια μετρικούς τόνους το χρόνο. Μερικές γεωργικές καλλιέργειες και δέντρα μπορούν να παράγουν πάνω από 20 μετρικούς τόνους ανά στρέμμα βιομάζας το χρόνο. [1] Η παραγωγή ενέργειας από βιομάζα μπορεί να γίνει με διάφορους τρόπους: με καύση, με πυρόλυση, με αεριοποίηση, με αλκοολική ζύμωση, με αναερόβια ζύμωση, με μετεστεροποίηση λιπαρών οξέων. Η μετεστεροποίηση των ελαίων αποτελεί και τον κύριο τρόπο παραγωγής βιοντίζελ. ~ 9 ~

12 Ι.3 ΒΙΟΚΑΥΣΙΜΑ Από τη βιομάζα άμεσα ή έμμεσα προέρχονται τα βιοκαύσιμα, τα οποία είναι καύσιμα στερεής, υγρής και αέριας μορφής. Τα βασικότερα βιοκαύσιμα που κυκλοφορούν σήμερα στο εμπόριο είναι το βιοντίζελ, η βιοαιθανόλη και το βιοαέριο. Ενώ στα βιοκαύσιμα ακόμα συμπεριλαμβάνονται η βιομεθανόλη, το βιο MTBE και βιο ETBE. Ως βιολογικό ντίζελ (biodiesel) ορίζεται το οξυγονωμένο καύσιμο με βάση τον μονο-αλκυλικό εστέρα, που προκύπτει από την επεξεργασία φυτικών ελαίων ή ζωικών λιπών. Αποτελεί καύσιμο συγκρίσιμης ποιότητας με το ορυκτό ντίζελ και χρησιμοποιείται ως υποκατάστατο του. Η βιοαιθανόλη είναι ουσιαστικά αιθυλική αλκοόλη, που παράγεται με ζύμωση βιομάζας ή από βιοαποικοδομήσιμο κλάσμα αποβλήτων. Όλα τα ζυμώσιμα σάκχαρα, όπως η γλυκόζη, η σακχαρόζη, μπορούν να μετατραπούν σε αιθανόλη με ζύμωση. Τέτοια σάκχαρα βρίσκονται σε πολλά είδη φυτών σε όλο τον κόσμο, όπως στα ζαχαρότευτλα, στο ζαχαροκάλαμο, στο σιτάρι, στο καλαμπόκι, στις πατάτες, αλλά επίσης και σε υπολείμματα δασικών και αγροτικών διεργασιών πχ. αγροτικά παραπροϊόντα. Ανάλογα με τον βαθμό πολυμερισμού τα σάκχαρα υποβάλλονται σε ένα ή περισσότερα στάδια επεξεργασίες με στόχο να μετατραπούν οι πολυμερείς αλυσίδες σε απλά ζυμώσιμα σάκχαρα. Η ζύμωση γίνεται με τη βοήθεια μικροοργανισμών και η βιοαιθανόλη ανακτάται με απόσταξη (ένυδρη αιθανόλη 92-96% κατ όγκο) και ακολουθείται αφυδάτωση (άνυδρη αιθανόλη 99,7% κατ όγκο). Το βιοαέριο ή βιομεθάνιο είναι καύσιμο αέριο, το οποίο παράγεται από βιομάζα ή βιοαποικοδομήσιμο κλάσμα αστικών και βιομηχανικών αποβλήτων, το οποίο μπορεί να καθαριστεί και να αναβαθμιστεί σε ποιότητα φυσικού αερίου για χρήση του ως βιοκαύσιμο. Σχηματίζεται με αναερόβια χώνευση οργανικής ύλης απουσία οξυγόνου με τη βοήθεια μικροοργανισμών. Το αέριο, που παράγεται, είναι μίγμα μεθανίου και διοξειδίου του άνθρακα και χρησιμοποιείται κυρίως για θέρμανση ή και για παραγωγή ηλεκτρικής ενέργειας. Η Βιομεθανόλη είναι η μεθανόλη που παράγεται από βιομάζα, για χρήση ως βιοκαύσιμο. Το Βιο-ΕΤΒΕ είναι ο αιθυλο-τριτοταγής-βουτιλαιθέρας (ΕΤΒΕ) που παράγεται από βιοαιθανόλη, για χρήση ως βιοκαύσιμο. Το κατ όγκο ποσοστό Βιο-ΕΤΒΕ, που υπολογίζεται, ως βιοκαύσιμο είναι 47% επί του συνόλου του. Το Βιο-ΜΤΒΕ είναι ο μεθυλο-τριτοταγής-βουτιλαιθέρας (ΜΤΒΕ) που παράγεται από μεθανόλη, για χρήση ως βιοκαύσιμο. Το κατ όγκο ποσοστό Βιο-ΜΤΒΕ, που υπολογίζεται ως βιοκαύσιμο, είναι 36% επί του συνόλου του. [9], [10] ~ 10 ~

13 Τα βιοκαύσιμα είναι γνωστά σαν μη συμβατικά ή εναλλακτικά καύσιμα. Σαν εναλλακτικά καύσιμα μπορούν να θεωρηθούν οποιαδήποτε καύσιμα που προέρχονται από μη συμβατικές πηγές, όπως το πετρέλαιο, ο άνθρακας και το φυσικό αέριο. Εκτός από τα βιοκαύσιμα, κάποια άλλα παραδείγματα εναλλακτικών καυσίμων είναι η ηλιακή, η αιολική, η θαλάσσια ενέργεια, η ενέργεια από το υδρογόνο και η ενέργεια που προέρχεται από τα μη συμβατικά λάδια. Από την εποχή που η ανθρωπότητα ανακάλυψε τη φωτιά, το ξύλο έγινε το πρώτο βιοκαύσιμο που χρησιμοποιήθηκε για θέρμανση και μαγείρεμα. Έχει επίσης χρησιμοποιηθεί και για την παραγωγή ηλεκτρισμού. Σε αντίθεση με τα ορυκτά καύσιμα, τα οποία κατ ανάγκη προέρχονται από βιολογικούς μικροοργανισμούς, που είναι καιρό νεκροί και έχουν αλλάξει μορφή, τα βιοκαύσιμα (γνωστά και ως αγροκαύσιμα) λαμβάνονται από πρόσφατα αποθνήσκοντες οργανισμούς ή από οργανισμούς που ζουν βιολογικά, με άλλα λόγια βιομάζα ή βιολογικά απόβλητα. Επίσης αντίθετα με τα ορυκτά καύσιμα, τα βιοκαύσιμα δε συνεισφέρουν στο απόθεμα του συνολικού διοξειδίου του άνθρακα στην ατμόσφαιρα, αφού οι πηγές των περισσότερων βιοκαυσίμων είναι φυτά, που φυσιολογικά αφαιρούν το διοξείδιο του άνθρακα από την ατμόσφαιρα (με την αναπνοή τους) και δίνουν την ίδια ποσότητα, όταν καίγονται. Θεωρούνται ως εκ τούτου «CO2 ουδέτερα». Τα βιοκαύσιμα μπορούν τα ταξινομηθούν σε πρώτης γενιάς, δεύτερης και τρίτης γενιάς. Τα βιοκαύσιμα 2 ης και 3 ης γενιάς ονομάζονται και προηγμένα (advanced biofuels) και η σύνθεση τους ποικίλει ανάλογα με τις τεχνικές που χρησιμοποιούνται για την μετατροπή της πρώτης ύλης. Τα βιοκαύσιμα πρώτης γενιάς Τα πρώτης γενιάς βιοκαύσιμα είναι εκείνα τα καύσιμα που παρασκευάζονται απευθείας από βιομάζα, η οποία θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί και σαν τροφή. Τα κύρια βιοκαύσιμα 1ης γενιάς που βρίσκονται στο εμπόριο είναι το βιοντίζελ (βίο-εστέρες), η βιοαιθανόλη και το βιοαέριο και έχουν ως χαρακτηριστικό τη δυνατότητα να αναμειγνύονται με ορυκτά καύσιμα και να χρησιμοποιούνται στις ήδη υπάρχουσες μηχανές και υποδομές ή και σε εναλλακτικής τεχνολογίας οχήματα. Κατά την παραγωγή βιοκαυσίμων πρώτης γενιάς χρησιμοποιούνταν ως πρώτη ύλη καλλιέργειες, που μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν και ως τροφή (π.χ. σπόροι καλαμποκιού, ζαχαρότευτλα κτλ για την παραγωγή αιθανόλης και φυτικά έλαια για την παραγωγή βιοντίζελ). Το γεγονός αυτό οδήγησε, τόσο στην εξάντληση των φυσικών πόρων, καθώς επίσης και στον ανταγωνισμό μεταξύ παραγωγής βιοκαυσίμων και παραγωγής τροφίμων, κάτι το οποίο είχε ως αποτέλεσμα την αύξηση της τιμής βασικών καταναλωτικών αγαθών (όπως του καλαμποκιού). Ακόμη, θέματα όπως η αποψίλωση των δασών, η διάβρωση του εδάφους, η χρήση νερού, οι εκπομπές τους διοξειδίου του άνθρακα και οι τιμές των βιοκαυσίμων περιπλέκουν την αναμέτρηση «τροφής έναντι καυσίμων» όσον αφορά το ενεργειακό ισοζύγιο και την αποδοτικότητα. ~ 11 ~

14 Τα βιοκαύσιμα δεύτερης γενιάς Τα δεύτερης γενιάς βιοκαύσιμα παράγονται από φυτά, τα οποία δεν μπορούν να αποτελέσουν μέρος της τροφικής αλυσίδας. Ως εκ τούτου, η παραγωγή τους στηρίζεται σε πρώτες ύλες, όπως αστικά απόβλητα, δασικές και αγροτικές πηγές, καθώς και μη επαναχρησιμοποιήσιμα τμήματα στερεών αστικών αποβλήτων. Συνεπώς το κόστος της πρώτης ύλης είναι μειωμένο, καθώς επίσης και η παροχή τροφίμων και η βιοποικιλότητα δεν απειλούνται από την παραγωγή τέτοιων καυσίμων. Δεδομένου ότι το κύριο συστατικό αυτών των υλικών βιομάζας είναι η κυτταρίνη, τα δεύτερης γενιάς βιοκαύσιμα ονομάζονται και «κυτταρινούχα καύσιμα». Επίσης τα καύσιμα 2ης γενιάς συνεισφέρουν σημαντικά στη μείωση του διοξειδίου του άνθρακα με σχεδόν ουδέτερο φορτίο άνθρακα. Εκτός από την κυτταρινούχο αιθανόλη, που είναι το κύριο δεύτερης γενιάς βιοκαύσιμο, η βιομεθανόλη, ο διμέθυλο-αιθέρας, το βίο-υδρογόνο, το συνθετικό ντίζελ και η συνθετική βενζίνη (green gasolines) αποτελούν επίσης βιοκαύσιμα δεύτερης γενιάς. Η φυτική βιομάζα είναι μια από τις αφθονότερες πηγές στο πλανήτη και πολλά υποσχόμενη όσον αφορά την παραγωγή των υγρών βιοκαυσίμων από βιομάζα. Ωστόσο, η παραγωγή βιοκαυσίμων από αγροτικά και δασικά κατάλοιπα δεν μπορεί παρά να καλύψει ένα μέρος μόνο των απαιτήσεων για υγρά βιοκαύσιμα. Αυτό έχει γεννήσει το ενδιαφέρον στην καλλιέργεια σοδιών που προορίζονται αποκλειστικά και μόνο στην παραγωγή βιοκαυσίμων (ενεργειακές σοδιές). Στόχος των ενεργειακών σοδιών είναι οι μεγάλες αποδόσεις με χαμηλές απαιτήσεις. Η πορεία προς τα δεύτερης γενιάς βιοκαύσιμα οφείλεται σε μελέτες που δείχνουν ότι η παραγωγή των βιοκαυσίμων πρώτης γενιάς μπορεί στην πραγματικότητα να έχει μεγαλύτερες εκπομπές διοξειδίου του άνθρακα απ ό, τι «απομακρύνει», αφού σε πολλές περιπτώσεις, τα φυσικά ενδιαιτήματα μετατρέπονται σε καλλιεργούμενες εκτάσεις, απελευθερώνοντας έτσι το διοξείδιο του άνθρακα που περιέχεται στα δένδρα, στα χόρτα και στο έδαφος, όπου αυτά μεγαλώνουν. Κατά την παραγωγή της δεύτερης γενιάς βιοκαυσίμων έχουν υιοθετηθεί δύο προσεγγίσεις. Στην πρώτη γίνεται χρήση ενζυμικών συστημάτων για την υδρόλυση της βιομάζας και στη δεύτερη γίνεται χρήση οξέων για την υδρόλυσή της. Η μείωση των χώρων υγειονομικής ταφής, όπου τελικά τα απορρίμματα μετατρέπονται σε μεθάνιο (σημαντικό αέριο θερμοκηπίου), και η μείωση της εξάρτησης από το πετρέλαιο είναι μεταξύ των πλεονεκτημάτων της δεύτερης γενιάς βιοκαυσίμων. Έρευνα, που βρίσκεται σε εξέλιξη, επικεντρώνεται στην αύξηση των διαθέσιμων καλλιεργήσιμων εκτάσεων και στην αλλαγή της σύνθεσης των πρώτων υλών με σκοπό τη μείωση του κόστους επεξεργασίας και την αύξηση της αξίας των συμπροϊόντων. ~ 12 ~

15 Εικόνα 3 : Σχηματική παράσταση παραγωγής 2 ης γενιάς βιοκαυσίμων από βιομάζα Τα βιοκαύσιμα τρίτης γενιάς Τα τρίτης γενιάς βιοκαύσιμα προέρχονται από άλγη, τα οποία είναι είτε μονοκύτταροι είτε πολυκύτταροι αυτότροφοι οργανισμοί. Είναι ικανά να φωτοσυνθέτουν, αλλά δεν έχουν τα τυπικά όργανα των φυτικών οργανισμών. Κατά τη διάρκεια της φωτοσύνθεσης, τα άλγη μπορούν να μετατρέπουν το διοξείδιο του άνθρακα και την ηλιακή ενέργεια σε βιομάζα και οξυγόνο. Τα συσσωρευμένα έλαια στα άλγη μπορούν να συλλεχθούν και να μετατραπούν σε βιοντίζελ, ενώ οι υδατάνθρακες, που περιέχονται στη βιομάζα τους, μπορούν να υποστούν ζύμωση για την παραγωγή βιο αλκοολών. Τα βιοκαύσιμα 3 ης γενιάς αποτελούν μία πολλά υποσχόμενη εναλλακτική λύση. [11], [12], [13], [14] Ένα εναλλακτικό καύσιμο, για να είναι βιώσιμο υποκατάστατο ενός ορυκτού καυσίμου, δε θα πρέπει να έχει μόνο ανώτερα οφέλη για το περιβάλλον σε σχέση με τα ορυκτά καύσιμα που εκτοπίζει, αλλά θα πρέπει να είναι και οικονομικά ανταγωνιστικό με αυτό. Επιπρόσθετα, πρέπει να μπορεί να παράγεται σε επαρκείς ποσότητες, ώστε να έχει σημαντική επίδραση στις ενεργειακές απαιτήσεις, αλλά επίσης πρέπει και να παρέχει ένα καθαρό ενεργειακό κέρδος πάνω από τις πηγές ενέργειας, που χρησιμοποιήθηκαν για την παραγωγή του. ~ 13 ~

16 Ι.4 ΒΙΟΝΤΙΖΕΛ Ι.4.1 ΑΠΟ ΤΟ ΝΤΙΖΕΛ ΣΤΟ ΒΙΟΝΤΙΖΕΛ Από την έναρξη της βιομηχανικής επανάστασης στα τέλη του 18 ου αιώνα και αρχές 19 ου, η ενέργεια είχε γίνει αναπόσπαστος παράγοντας για την διατήρηση της οικονομικής ανάπτυξης και του βιοτικού επιπέδου όλης της ανθρωπότητας. Το μεγαλύτερο μέρος της παγκόσμιας παραγωγής πρωτογενούς ενέργειας προέρχεται από ορυκτά καύσιμα. Σύμφωνα με στοιχεία του 2009 τα ορυκτά καύσιμα αντιπροσωπεύουν το 88% της κατανάλωσης πρωτογενούς ενέργειας, με το πετρέλαιο (35%), τον άνθρακα (29%) και το φυσικό αέριο (24%) ως κύρια καύσιμα, ενώ η πυρηνική και η υδροηλεκτρική ενέργεια αποτελούν το 5% και 6% αντίστοιχα της συνολικής κατανάλωσης πρωτογενούς ενέργειας. Ωστόσο λόγω του περιορισμού των παραδοσιακών πηγών ενέργειας και της αύξησης των περιβαλλοντικών ανησυχιών έχει καταβληθεί προσπάθεια τα τελευταία χρόνια για την εξεύρεση και χρήση εναλλακτικών πηγών ενέργειας. Διάγραμμα 2 : Παγκόσμια παραγωγή πρωτογενούς ενέργειας (από πηγή του 2009) Η ανάπτυξη εναλλακτικών καυσίμων είναι μία αναπόφευκτη επιλογή για τη βιώσιμη οικονομική ανάπτυξη στην ανθρώπινη κοινωνία. Επιπλέον, είναι σημαντική για την αρμονική συνύπαρξη του ανθρώπου και του περιβάλλοντος. [15] ~ 14 ~

17 Μεγάλη προσοχή δόθηκε στην ανάπτυξη βιοκαυσίμων, με ιδιαίτερη αναφορά στο βιοντίζελ. Η παραγωγή ενός εναλλακτικού καυσίμου θα πρέπει να είναι τεχνικά εφικτή, με ανταγωνιστικό κόστος παραγωγής (σε σχέση με την παραγωγή συμβατικών καυσίμων), ενώ θα πρέπει να έχει θετικό περιβαλλοντικό αντίκτυπο και να είναι εύκολη η ευρεία διανομή του στους καταναλωτές. Το βιοντίζελ μπορεί να προσφέρει και άλλα οφέλη συμπεριλαμβανομένης της μείωσης των εκπομπών των αερίων του θερμοκηπίου, την περιφερειακή ανάπτυξη, η οποία έχει και κοινωνικό αντίκτυπο, καθώς βοηθάει στην αποκέντρωση και στη βιώσιμη ανάπτυξη φτωχών και υποβαθμισμένων περιοχών. Θα μπορούσε ακόμη να συνεισφέρει στην αγροτική παραγωγή, καθώς μπορεί να αποτελέσει ένα επιπλέον εισόδημα στους αγροτικούς πληθυσμούς Επιπρόσθετα, οι ομοιότητες μεταξύ των ιδιοτήτων καύσης του βιοντίζελ και του ορυκτού ντίζελ έχουν κάνει το βιοντίζελ μία από τις πιο πολλά υποσχόμενες εναλλακτικές λύσεις όσον αφορά τα ανανεώσιμα και βιώσιμα καύσιμα στην αυτοκινητοβιομηχανία. Ωστόσο για την ποσοτικοποίηση της επίδρασης του βιοντίζελ είναι σημαντικό να ληφθούν υπόψη και άλλοι παράγοντες, όπως είναι η πρώτη ύλη για την παραγωγή του, οι κύκλοι οδήγησης, καθώς και η τεχνολογία των οχημάτων. Η χρήση του βιοντίζελ θα επιτρέψει μια ισορροπία που πρέπει να επιδιώκεται μεταξύ της γεωργίας, της οικονομικής ανάπτυξης και του περιβάλλοντος. [14], [15] Η παραγωγή βιοντίζελ εμφανίζει μεγάλη αύξηση τα τελευταία χρόνια παγκοσμίως. Τα κίνητρα για τις κυβερνήσεις να συνεχίσουν δυναμικά την ανάπτυξη του είναι πολύπλοκα και πολυδιάστατα. Η βασική κινητήρια δύναμη πίσω από τις κυβερνητικές πολιτικές για την ανάπτυξη του βιοντίζελ μπορεί να χωριστεί σε τρία σημεία ως εξής: Πρώτον, με την παγκόσμια ενεργειακή κρίση το βιοντίζελ διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην ενίσχυση της ενεργειακής ασφάλειας του έθνους. Δεύτερον, ως ανανεώσιμη πηγή ενέργειας το βιοντίζελ προέρχεται από φυτικά υλικά που μπορούν να συμβάλουν στη μείωση των εκπομπών των αερίων του θερμοκηπίου. Τρίτον, η αυξημένη ζήτηση για ελαιούχες καλλιέργειες για την παραγωγή βιοντίζελ έχει σαφώς θετική επίδραση στο καθαρό γεωργικό εισόδημα και μειώνει επίσης τις δαπάνες της κυβέρνησης για τους αγρότες αυξάνοντας την τιμή αγοράς των ελαιούχων καλλιεργειών. ~ 15 ~

18 Ι.4.2 ΙΣΤΟΡΙΚΗ ΑΝΑΔΡΟΜΗ Στην πραγματικότητα η χρήση φυτικών ελαίων σε κινητήρα diesel χρονολογείται στις 10 Αυγούστου του 1893, όταν ο εφευρέτης του κινητήρα, που πήρε και το όνομά του Rudolf Diesel, χρησιμοποίησε φυστικέλαιο, για να τροφοδοτήσει τον κινητήρα, γι αυτό και η μέρα αυτή έμεινε γνωστή ως «Παγκόσμια Ημέρα Βιοντίζελ». Η χρήση των φυτικών ελαίων ως καύσιμα, που συνεχίστηκε μέχρι το 1920, εξαλείφθηκε εντελώς, καθώς τα ορυκτά καύσιμα με βάση το πετρέλαιο ήταν φθηνότερα και η διαθεσιμότητα τους στην αγορά ήταν μεγαλύτερη. Ο κινητήρας ντίζελ τροποποιήθηκε για να μπορέσει να λειτουργήσει με χαμηλότερο ιξώδες καυσίμου πετρελαίου, γνωστό σήμερα ως ντίζελ. Ωστόσο στη δεκαετία του 1970 υπήρξε νέο ενδιαφέρον για τη χρήση φυτικών ελαίων ως εναλλακτική πηγή ενέργειας, λόγω της έλλειψης ασφάλειας των ορυκτών καυσίμων. Αναφέρθηκαν κάποια λειτουργικά προβλήματα, όπως το υψηλό ιξώδες των φυτικών ελαίων το οποίο οδηγούσε σε κακή εξαέρωση, η χαμηλή πτητικότητα, η δραστικότητα των ακόρεστων αλυσίδων των υδρογονανθράκων, καθώς επίσης σημειώθηκαν προβλήματα με περιβαλλοντική μόλυνση. Για τους λόγους αυτούς η απευθείας χρήση των ελαίων δεν ήταν κατάλληλη. Η χημική δομή τους χρειάστηκε να τροποποιηθεί, ώστε να μειωθεί το ιξώδες, το μοριακό βάρος, το ειδικό βάρος και γενικότερα οι ιδιότητες τους να πλησιάσουν αυτές του ντίζελ, για να μην απαιτηθούν μετατροπές στις μηχανές. Το τροποποιημένο αυτό προϊόν ονομάστηκε βιοντίζελ. Ωστόσο, η αύξηση της επιδότησης στην αγορά του πετρελαίου εμπόδισε οποιαδήποτε σημαντική εξέλιξη για την παραγωγή βιοντίζελ έως τα τέλη της δεκαετίας του 1990, όπου οι αυξανόμενες ανησυχίες σχετικά με το περιβάλλον και τη βιωσιμότητα οδήγησαν τελικά στην ανάπτυξη της εμπορικής παραγωγής βιοντίζελ. Με την ταχεία ανάπτυξη του στη βιομηχανία, ο ρόλος του πλέον έχει καταστεί πολύ σημαντικός στην πρωτογενή ενέργεια παγκοσμίως. [15], [16], [17] Ι.4.3 ΙΔΙΟΤΗΤΕΣ ΒΙΟΝΤΙΖΕΛ ΣΥΓΚΡΙΣΗ ΜΕ ΟΡΥΚΤΟ ΝΤΙΖΕΛ Το βιοντίζελ, ως εναλλακτικό καύσιμο για μηχανές εσωτερικής καύσης, ορίζεται σαν ένα μίγμα μονο-αλκυλυομένων εστέρων των λιπαρών οξέων μακράς αλύσου (FAME) που προέρχεται από ανανεώσιμες πρώτες ύλες, όπως φυτικά έλαια ή ζωικά λίπη. Έχει πολλά οφέλη, όπως: είναι βιοαποικοδομήσιμο, μη τοξικό, έχει χαμηλές εκπομπές ρύπων και είναι ανανεώσιμος πόρος. Επιπλέον δε συμβάλλει στην αύξηση των επιπέδων του άνθρακα στην ατμόσφαιρα και έτσι ελαχιστοποιείται η ένταση του φαινομένου του θερμοκηπίου. Οι φυσικές και οι χημικές ιδιότητες του βιοντίζελ καθορίζονται από τη σύνθεση του και μπορούν να ποικίλουν σημαντικά ανάλογα με τις πρώτες ύλες που χρησιμοποιήθηκαν για την παραγωγή του. ~ 16 ~

19 Είναι ένα διαυγές πορτοκαλοκίτρινο υγρό, το οποίο είναι αρκετά παρόμοιο με το ορυκτό ντίζελ στα κύρια χαρακτηριστικά του, όπως στον αριθμό κετανίου, στο ενεργειακό περιεχόμενο, στο ιξώδες και στις αλλαγές φάσης. Αποτελούμενα κυρίως από ευθείες αλυσίδες εστέρων, τα περισσότερα καύσιμα βιοντίζελ έχουν εξαιρετικό αριθμό κετανίου. Το βιοντίζελ είναι μη εύφλεκτο σε αντίθεση με το ντίζελ, καθώς και μη εκρηκτικό αφού παρουσιάζει σημείο ανάφλεξης στους 423K σε σύγκριση με τους 337K για το ντίζελ. Το σημείο ανάφλεξης είναι η χαμηλότερη θερμοκρασία στην οποία αναφλέγονται οι ατμοί του καυσίμου με προσαγωγή, όταν αυτό θερμαίνεται κάτω από πρότυπες συνθήκες, αποτελεί μία προδιαγραφή ασφάλειας για τις συνθήκες αποθήκευσης και μεταφοράς, καθώς και την πρώτη ένδειξη μόλυνσης με ελαφρύτερα συστατικά. Το ιξώδες του είναι παρόμοιο με αυτό του ορυκτού ντίζελ Σε αντίθεση με το ορυκτό ντίζελ είναι βιοδιασπώμενο, μη τοξικό και μειώνει σημαντικά τις τοξικές και άλλες εκπομπές όταν καίγεται σαν καύσιμο. Η ανώτερη θερμογόνος δύναμη (higher heating value) του βιοντίζελ (39-41MJ/Kg) είναι ελαφρώς χαμηλότερη από εκείνη της βενζίνης (46MJ/Kg) ή του πετρελαίου (42MJ/Kg), αλλά υψηλότερη από εκείνη του άνθρακα (32-37 MJ/Kg). Οι μεθυλεστέρες του βιοντίζελ βελτιώνουν τις ιδιότητες λίπανσης του καύσιμου μίγματος ντίζελ. Το βιοντίζελ είναι ένα καλό λιπαντικό (περίπου 66% καλύτερα από το ντίζελ). Λόγω της σημαντικής περιεκτικότητάς του σε οξυγόνο (τυπικά 11%) το βιοντίζελ έχει χαμηλότερο περιεχόμενο σε άνθρακα και υδρογόνο σε σύγκριση με το ντίζελ, με αποτέλεσμα περίπου 10% χαμηλότερη ενεργειακή περιεκτικότητα ανά μονάδα μάζας. Ωστόσο λόγω της υψηλότερης πυκνότητας του βιοντίζελ, το ογκομετρικό του ενεργειακό περιεχόμενο είναι μόνο 5-6% περίπου χαμηλότερο από το πετρέλαιο ντίζελ. Τυπικά το βιοντίζελ έχει κάπως υψηλότερο μοριακό βάρος το οποίο αντικατοπτρίζεται στις ελαφρώς υψηλότερες θερμοκρασίες απόσταξης. Ακόμη, αν και δεν περιέχει προϊόντα ορυκτών πόρων, είναι συμβατό με τα συμβατικά ντίζελ και μπορεί να αναμειχθεί σε οποιαδήποτε αναλογία με τα ορυκτά ντίζελ και να δημιουργήσουν ένα σταθερό μίγμα βιοντίζελ. Ως εκ τούτου το βιοντίζελ έχει γίνει ένα από τα πιο κοινά βιοκαύσιμα στον κόσμο. [17], [18], [19], [20], [21] ~ 17 ~

20 Ιδιότητες Καυσίμου Ντίζελ Βιοντίζελ Στάνταρ ASTM D975 ASTM PS 121 Σύνθεση Καυσίμου C10 C21 MC C12 C22 FAME Ελάχιστη Θερμαντική Αξία 131, ,093 (Btu/gal) Κινηματικό Ιξώδες σε 40 o C 1,3-4,1 1,9-6,0 Ειδικό Βάρος σε 60 o F (Kg/l) 0,85 0,88 Πυκνότητα σε 15 o C (lb/gal) 7,079 7,328 Νερό (ppm κ.β.) 161 0,5% max Άνθρακας % κ.β Υδρογόνο % κ.β Οξυγόνο % κ.β Θείο % κ.β. 0,05 max 0,0-0,00024 Σημείο ζέσης ( o C) Σημείο ανάφλεξης ( o C) Σημείο θόλωσης ( o C) -15 έως 5-3 έως 12 Αριθμός Κετανίου Στοιχειομετρική αναλογία αέρα/καυσίμου κ.β ,8 Πίνακας 1 : Επιλεγμένες ιδιότητες για το ντίζελ και το βιοντίζελ Πηγή: Biodiesel Handling and Use Guidelines, K. Shaine Tyson, National Renewable Energy Laboratory, September 2001 Ενώ το βιοντίζελ θεωρείται γενικά ότι μπορεί να υποκαταστήσει το ορυκτό ντίζελ, υπάρχουν κάποια βασικά σημεία, που πρέπει να ληφθούν υπόψη, όταν εξετάζεται η ικανότητα χρήσης του βιοντίζελ ως υποκατάστατο του ορυκτού ντίζελ ή ως μίγμα με αυτό. Τα εν λόγω σημεία ακολουθούν παρακάτω: 1. Αντιαφριστικό: το καθαρό βιοντίζελ έχει εξαιρετικές αντι-αφριστικές ιδιότητες, καλύτερες από το πετρέλαιο ντίζελ. Αυτό δίνει τη δυνατότητα και εξασφαλίζει γρήγορη πλήρωση των οχημάτων χωρίς πιθανές διαρροές ή υπερχειλίσεις αφρού. 2. Αριθμός κετανίου: ο αριθμός κετανίου του βιοντίζελ (κυμαίνεται μεταξύ 45-70) είναι γενικά υψηλότερος σε σύγκριση με το πετρέλαιο ντίζελ ( 40-55) και εξαρτάται από τη σύσταση σε λιπαρά οξέα των αρχικών λιπών ή ελαίων. Τα μεγάλης αλυσίδας λιπαρά οξέα και περισσότερο κορεσμένα οδηγούν σε υψηλότερους αριθμούς κετανίου. 3. Χημική δομή: το βιοντίζελ είναι ένας συνδυασμός μικρού φάσματος μορίων, τυπικά εστέρες λιπαρών οξέων από C 12, C 14, C 16, C 18 και C 22, ενώ το ντίζελ είναι ένα σύμπλοκο από ένα ευρύ φάσμα υδρογονανθράκων από C 10 έως C 21, αποτελούμενο από παραφίνες, ναφθένια, αρωματικά, καθώς και άζωτο και θείο που περιέχονται στις οργανικές ενώσεις. Το βιοντίζελ είναι κυρίως ευθείας αλύσου υδρογονάνθρακες εστέρων, ενώ το ντίζελ περιέχει δομές δακτυλίου, όπως αρωματικά μόρια. ~ 18 ~

21 4. Ιδιότητες ψυχρής ροής: για τα ορυκτό ντίζελ κάθε συστατικό του μίγματος έχει τη δική του θερμοκρασία κρυστάλλωσης, έτσι η στερεοποίηση του είναι μια σταδιακή διαδικασία. Αντίθετα, το βιοντίζελ τείνει να είναι ένα πολύ απλούστερο μίγμα που περιέχει σχετικά λίγα συστατικά, ώστε ένα ή δύο συστατικά έχουν την τάση να κυριαρχούν με αποτέλεσμα η στερεοποίηση να είναι πολύ πιο ταχεία και δύσκολο να ελεγθεί. 5. Διάβρωση: η απορρόφηση νερού σε συνδυασμό με την παρουσία οξυγόνου τείνει να συμβάλλει στην αυξημένη διάβρωση, αλλά αυτό αντιμετωπίζεται με την υγρή-ικανότητα, η οποία μειώνει την ικανότητα μεταφοράς οξυγόνου στις μεταλλικές επιφάνειες. [4] I.4.4 ΠΡΩΤΕΣ ΥΛΕΣ Το βιοντίζελ κατά κύριο λόγο παράγεται από σόγια, ελαιοκράμβη και φοινικέλαια. Η πρώτη ύλη του βιοντίζελ εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από το κλίμα, τις τοπικές συνθήκες του εδάφους και τη διαθεσιμότητα, συνέπεια αυτών είναι ότι σε διαφορετικές περιοχές εστιάζονται οι προσπάθειες για διαφορετικούς τύπους πετρελαίου. Εικόνα 4: Πρώτες ύλες για την παραγωγή βιοντίζελ ανά τον κόσμο ~ 19 ~

22 Λίπη και έλαια από ζωικές πηγές και μαγειρικά απόβλητα αποτελούν επίσης πηγές πρώτων υλών. Υπάρχουν διάφορες άλλες πηγές βιοντίζελ όπως: jatropha, αμύγδαλο, κριθάρι, καρύδα, camelina, ιχθυέλαιο, δάφνη, βρώμη, σπόροι παπαρούνας, σπόροι μπάμιας, σουσάμι, σόργο, σίτος και άλλα. Οι φυσικές και οι χημικές ιδιότητες του καυσίμου βιοντίζελ εξαρτώνται ουσιαστικά από την κατανομή των λιπαρών οξέων των τριγλυκεριδίων που χρησιμοποιούνται στην παραγωγή. Το βιοντίζελ «πρώτης γενιάς» παράγεται κυρίως από εδώδιμα έλαια και σύμφωνα με έρευνες η απόκτηση των πρώτων υλών αποτελεί πάνω από το 75% των εξόδων της παραγωγής βιοντίζελ και αυτό αποτελεί σοβαρή απειλή για την οικονομική βιωσιμότητα της βιομηχανίας. Συνεπώς το τελικό κόστος του βιοντίζελ εξαρτάται κυρίως από την πρώτη ύλη. Με τις τιμές των φυτικών ελαίων στα ύψη τα τελευταία χρόνια, το κόστος παραγωγής του βιοντίζελ θα συνεχίσει να αυξάνεται και θα χάσει το ανταγωνιστικό πλεονέκτημα λόγω της υψηλής τιμής του. Επιπρόσθετα, έχουν προκύψει προβλήματα που σχετίζονται με τις επιπτώσεις στην διαθεσιμότητα των τροφίμων και την αλλαγή της γης. Εξ αιτίας των παραπάνω οι επιστήμονες αναπτύσσουν μια νέα γενιά βιοντίζελ, η οποία θα βοηθήσει στην αποφυγή τέτοιων προβλημάτων. ~ 20 ~

23 Date Soybean Sunflower Groundnut Palm Rapeseed Coconut Πίνακας 2: Τιμές κύριων καλλιεργειών για την παραγωγή πρώτης γενιάς βιοκαυσίμων (US $/τόνο). Μια εναλλακτική λύση είναι η χρησιμοποίηση εναλλακτικών πρώτων υλών διαφορετικών στο είδος, στην ποιότητα και στο κόστος. Αυτές οι πρώτες ύλες μπορούν να περιλαμβάνουν όξινα έλαια, χρησιμοποιημένα μαγειρικά έλαια, λίπη από απόβλητα εστιατορίων, μη εδώδιμα φυτικά έλαια, διάφορα ζωικά λίπη και έλαια που λαμβάνονται από δένδρα και μικροοργανισμούς, όπως οι ζύμες και τα φύκη. [15], [17] Ι.4.5 ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΕΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ ΒΙΟΝΤΙΖΕΛ Υπάρχουν αρκετές γενικά αποδεκτές τεχνολογίες που έχουν καθιερωθεί για την παραγωγή βιοντίζελ. Φυτικά έλαια και ζωικά λίπη είναι κατάλληλα να τροποποιηθούν για να μειωθεί το ιξώδες τους, ώστε το λαμβανόμενο προϊόν να έχει τις κατάλληλες ιδιότητες και να χρησιμοποιηθεί ως καύσιμο σε ντίζελ κινητήρες. Υπάρχουν διάφοροι μέθοδοι για τη χρήση ελαίων ως καύσιμο, όπως η άμεση χρήση και ανάμειξη ελαίων, τα μικρογαλακτώματα, η πυρόλυση φυτικών ελαίων και η μετεστεροποίηση. Άμεση χρήση και ανάμιξη των ελαίων: Η άμεση χρήση φυτικών ελαίων σε κινητήρες ντίζελ είναι προβληματική και έχει πολλές εγγενείς αδυναμίες. Ακατέργαστα φυτικά έλαια μπορούν να αναμειχθούν απ ευθείας ή να αραιωθούν με καύσιμο ντίζελ, για να βελτιωθεί το ιξώδες τους, έτσι ώστε να λυθούν τα προβλήματα που σχετίζονται με τη χρήση καθαρών φυτικών ελαίων με υψηλό ιξώδες σε κινητήρες ανάφλεξης με συμπίεση. ~ 21 ~

24 Η ενεργειακή κατανάλωση με τη χρήση καθαρών φυτικών ελαίων βρέθηκε να είναι παρόμοια με εκείνη του καυσίμου ντίζελ, όμως η άμεση χρήση τους, καθώς και των μιγμάτων τους, έχει γενικά θεωρηθεί μη ικανοποιητική. Το υψηλό ιξώδες, η παρουσία όξινων ομάδων, το περιεχόμενο σε ελεύθερα λιπαρά οξέα, καθώς επίσης και η δημιουργία κόμμεων εξ αιτίας της οξείδωσης και των αντιδράσεων πολυμερισμού, η εναπόθεση άνθρακα και οι κακές λιπαντικές ιδιότητες είναι προφανή προβλήματα. Η θέρμανση και η ανάμειξη των φυτικών ελαίων μπορούν να μειώσουν το ιξώδες και να βελτιώσουν την πτητικότητα των ελαίων, αλλά η μοριακή δομή παραμένει αμετάβλητη, επομένως παραμένει και ο πολυακόρεστος χαρακτήρας τους. Η απ ευθείας χρήση των φυτικών ελαίων σε ντίζελ κινητήρες απαιτεί επίσης σημαντικές μετατροπές στους κινητήρες. Μικρο-γαλακτώματα των ελαίων: Μικρογαλακτωματοποίηση είναι ο σχηματισμός μικρογαλακτωμάτων (cosolvency) και αποτελεί μια πιθανή λύση για την επίλυση του προβλήματος του υψηλού ιξώδους των φυτικών ελαίων. Μικρογαλάκτωμα είναι μια διαυγής, ισότροπη και θερμοδυναμικά σταθερή διασπορά ελαίου, νερού, επιφανειενεργού (surfactant) και συχνά ενός αμφίφυλου μορίου που ονομάζεται συνεπιφανειενεργό. Η διάμετρος των μικρογαλακτωμάτων κυμαίνεται από Α. Μικρογαλάκτωμα μπορεί να σχηματιστεί με την ανάμιξη φυτικού ελαίου, εστέρα σε μέσο διασποράς (συνδιαλύτης) ή φυτικού ελαίου αλκοόλης και επιφανειενεργού. Με αυτό τον τρόπο μειώνεται το ιξώδες και βελτιώνεται ο ψεκασμός του καυσίμου. Πυρόλυση πετρελαίων: Η πυρόλυση είναι μια μέθοδος που μετατρέπει μια οργανική ουσία σε μια άλλη μέσω της θερμότητας ή με θερμότητα και τη βοήθεια ενός καταλύτη. Το πυρολυόμενο υλικό μπορεί να είναι φυτικό έλαιο, ζωικό λίπος, φυσικά λιπαρά οξέα ή μεθυλεστέρες λιπαρών οξέων. Η μετατροπή των φυτικών ελαίων και των ζωικών λιπών, που αποτελούνται κυρίως από τριγλυκερίδια, με χρήση θερμικών αντιδράσεων πυρόλυσης αποτελεί μια πολλά υποσχόμενη μέθοδο για παραγωγή βιοντίζελ. Η έρευνα για την πυρόλυση των τριγλυκεριδίων διαιρείται σε καταλυτική και μη καταλυτική και πολλοί ερευνητές αναφέρουν ότι από την πυρόλυση των τριγλυκεριδίων μπορούν να ληφθούν προϊόντα κατάλληλα για ντιζελοκινητήρες. Οι μηχανισμοί για τη θερμική αποσύνθεση των τριγλυκεριδίων είναι πιθανό να είναι πολύπλοκοι, λόγω των πολλών δομών και της πολλαπλότητας των πιθανών αντιδράσεων των μικτών τριγλυκεριδίων. Ο εξοπλισμός για τη θερμική πυρόλυση (thermal cracking) είναι δαπανηρός για μονάδες μικρής παραγωγικότητας. Επιπλέον, ενώ τα προϊόντα είναι χημικώς παρόμοια με τα παράγωγα ορυκτής βενζίνης και ντίζελ, η απομάκρυνση του οξυγόνου κατά τη διάρκεια της θερμικής επεξεργασίας απομακρύνει επίσης κάθε περιβαλλοντικό όφελος από τη χρήση ενός οξυγονωμένου καυσίμου. Παράγονται επίσης κάποια χαμηλής αξίας υλικά και μερικές φορές περισσότερη βενζίνη απ ό,τι καύσιμο ντίζελ. ~ 22 ~

25 Μετεστεροποίηση: Η πιο κοινή μέθοδος παραγωγής βιοντίζελ είναι η μετεστεροποίηση ελαίων (τριγλυκεριδίων) με αλκοόλη, η οποία δίνει βιοντίζελ (εστέρες λιπαρών οξέων (FAME)) ως κύριο προϊόν και γλυκερίνη ως παραπροϊόν. Βασική αντίδραση μετεστεροποίησης Κατά την μετεστεροποίηση των λιπών και ελαίων, ένα τριγλυκερίδιο αντιδρά με μία αλκοόλη παρουσία ενός ισχυρού οξέος ή μιας βάσης, παράγοντας ένα μίγμα αλκυλεστέρων λιπαρών οξέων και της γλυκερίνης. Η γενική διαδικασία είναι μια ακολουθία τριών διαδοχικών και αντιστρέψιμων αντιδράσεων, στις οποίες τα διγλυκερίδια και μονογλυκερίδια σχηματίζονται σαν ενδιάμεσα προϊόντα. Η στοιχειομετρία της αντίδρασης απαιτεί 1 mol τριγλυκεριδίου και 3 mol αλκοόλης. Εντούτοις χρησιμοποιείται περίσσεια αλκοόλης, για να αυξήσει την απόδοση και να επιτρέψει το διαχωρισμό από την γλυκερίνη που σχηματίζεται. Εικόνα 5: Σχηματική παράσταση μετεστεροποίηση λιπιδίων Διάφοροι παράγοντες, συμπεριλαμβανομένων της συγκέντρωσης και του τύπου καταλύτη (αλκαλικού ή όξινου), της μοριακής αναλογίας φυτικού ελαίου - αλκοόλης, της θερμοκρασίας της αντίδρασης, της πίεσης, της έντασης της ανάμειξης, της καθαρότητας των αντιδραστηρίων, κυρίως της περιεκτικότητας σε νερό και της περιεκτικότητας σε ελεύθερα λιπαρά οξέα, έχουν επίδραση στην πορεία της μετεστεροποίησης. [4], [16], [17], [18], [22] ~ 23 ~

26 Ι.4.6 ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΟΙ ΙΚΑΝΟΙ ΓΙΑ ΤΗΝ ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΒΙΟΝΤΙΖΕΛ Μία από τις πιο εξέχουσες πηγές ανανεώσιμης ενέργειας αποτελεί το βιοντίζελ. Στην παγκόσμια παραγωγή βιοντίζελ, διάφορα ανανεώσιμα λιπίδια έχουν επιλεγεί, συμπεριλαμβανομένων των φυτικών ελαίων, ζωικών λιπών και απόβλητων ελαίων. Ως εναλλακτική λύση των γεωργικών και ζωικών πηγών για την παραγωγή ελαίων και λιπών, έχουν θεωρηθεί οι μικροοργανισμοί. Μικροοργανισμοί μπορούν να συσσωρεύουν υψηλό επίπεδο λιπιδίων και δεν απαιτούν καλλιεργήσιμη γη. Επιπλέον, η παραγωγή αυτών των μικροοργανισμών δεν ανταγωνίζεται την παραγωγή τροφών, εφόσον μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως πρώτη ύλη απόβλητα ή βιομάζα. Συνεπώς, οι ελαιογόνοι μικροοργανισμοί για την παραγωγή βιοντίζελ αποτελούν μια πολλά υποσχόμενη εναλλακτική λύση. Ελαιογόνοι νοούνται οι μικροοργανισμοί εκείνοι, οι οποίοι αναπτυσσόμενοι σε συγκεκριμένες συνθήκες περιβάλλοντος, δύναται να συσσωρεύσουν λίπος εντός των κυττάρων τους, σε ποσοστό μεγαλύτερο από 20% κατά βάρος επί ξηράς ουσίας. Μάλιστα, ορισμένοι μικροοργανισμοί είναι ικανοί να συσσωρεύσουν ενδοκυτταρικό λίπος έως και 70% w/w επί της ξηράς βιομάζας τους. Το ενδιαφέρον για την παραγωγή των λιπιδίων αυτών, καλούμενων και μικροβιακών ή μονοκυτταρικών λιπιδίων (microbial oils ή single cell oils) είναι μεγάλο, καθώς αποτελούν πηγή σημαντικών λιπαρών οξέων που δεν απαντώνται συχνά στη φύση. Το εν λόγω λίπος μπορεί να περιέχει υψηλές ποσότητες πολυακόρεστων λιπαρών οξέων (PUFAs) σπουδαίας διατροφικής και κλινικής σημασίας. Το κυρίαρχο κλάσμα των μικροβιακών αποθησαυριστικών λιπιδίων συνίσταται από τριγλυκερίδια, τα οποία αντιπροσωπεύουν το 55-80% w/w του συνολικού κυτταρικού λίπους. Σε πολλές περιπτώσεις το μικροβιακό λίπος έχει παρόμοια περιεκτικότητα σε λιπαρά οξέα όπως στην περίπτωση των φυτικών ελαίων που χρησιμοποιούνται για την παραγωγή βιοντίζελ. Το μικροβιακό λίπος αποτελείται κυρίως από τριγλυκερίδια τα οποία περιέχουν λιπαρά οξέα όπως το παλμιτικό (16:0), το παλμιτολεϊκό (16:1), το ελαϊκό (18:1) και το λινολεϊκό (18:2). [23], [24], [25] ~ 24 ~

27 Microorganisms Lipid composition (w/total lipid) C16:0 C16:1 C18:0 C18:1 C18:2 Microalgae Yeast Fungi Bacterium Πίνακας 3: Σύνθεση λιπιδίων κάποιων μικροοργανισμών Οι μικροοργανισμοί που έχουν την ικανότητα να σχηματίζουν λίπος μπορεί να είναι βακτήρια, ζύμες, μύκητες καθώς και άλγη. Τα βακτήρια ως πηγή παραγωγής λίπους έχουν απορριφθεί από τους περισσότερους ερευνητές, επειδή η ποσότητα λιπιδίων, που παράγουν, είναι μικρή, τυπικά λιγότερο από 10% επί της ξηράς βιομάζας τους. Μερικά βακτήρια του γένους Arthrobacter sp. μπορούν να συσσωρεύσουν μέχρι και 80% και κάποια άλλα είδη όπως τα Mycobacterium, Corynebacterium και Rhodococcus κοντά στο 30 με 40 %, ωστόσο είτε αυτά αναπτύσσονται με πολύ βραδείς ρυθμούς, είτε τα λιπίδια, που παράγουν, είναι δύσκολο να εξαχθούν ή σχετίζονται με αλλεργικούς και τοξικούς παράγοντες. Τα βακτήρια χρησιμοποιούνται κυρίως για ορισμένη παραγωγή ειδικών λιπιδίων, όπως τα πολυακόρεστα λιπαρά οξέα και μερικά λιπαρά οξέα διακλαδισμένης αλυσίδας. Microorganisms Oil content (% dry wt) Microorganisms Πίνακας 4: Συσσώρευση λιπιδίων (% ξηρού βάρους) σε διάφορους μικροοργανισμούς Oil content (% dry wt) Bacterium Fungi Arthrobacter sp. >40 Aspergillus oryzae 57 Acinetobacter Mortierella isabellina 86 capcoaceticus Rhodococcus opacus Humicola lanuginose 75 Bacillus alcalophilus Mortierella vinacea 66 Yeast Microalgae Candida curvata 58 Botryococcus braunii Cryptococcus albidus 65 Cylindrotheca sp Lipomyces starkeyi 64 Nitzschia sp Rhodotorula glutinis 72 Schizochytrium sp ~ 25 ~

28 Οι ζύμες και οι μύκητες θεωρούνται ως ιδανικοί ελαιογόνοι μικροοργανισμοί. Σύμφωνα με εκτιμήσεις περίπου 125 είδη μυκήτων και ζυμών είναι ελαιογόνοι. Μερικά στελέχη ζύμης και μυκήτων μπορούν να συσσωρεύσουν ενδοκυτταρικά λιπίδια μέχρι και σε ποσοστό 70% της ξηρής βιομάζας τους. Η πιο αποτελεσματική ελαιογόνος ζύμη, Crptococcus curvatus, μπορεί να συσσωρεύσει λιπίδια σε ποσοστό μεγαλύτερο του 60% επί του ξηρού βάρους, ενώ αναπτύσσεται κάτω από συνθήκες έλλειψης αζώτου. Αν και κάποιοι τύποι μυκήτων έχουν την ικανότητα να παράγουν έλαια, οι περισσότεροι μύκητες έχουν διερευνηθεί κυρίως για την παραγωγή ορισμένων ειδικών διατροφικών/φαρμακευτικών πολυακόρεστων λιπιδίων (όπως DHA, GLA, EPA και ARA). Το μικροβιακό λίπος που παράγεται από μικροφύκη τυπικά κυμαίνεται από %, αλλά μπορεί να φτάσει και το 85% της ξηράς βιομάζας τους. Τα αυτότροφα άλγη έχουν τα πλεονεκτήματά τους, δεδομένου ότι μπορούν να χρησιμοποιούν το ηλιακό φως και το διοξείδιο του άνθρακα για τη συσσώρευση ελαίων, και γι αυτό θεωρείται ότι είναι η πιο φιλική προς το περιβάλλον παραγωγή λιπιδίων, όμως η χρήση μικροφυκών δεν είναι πάντοτε οικονομικά εφικτή, δεδομένου ότι απαιτούν ειδικές συνθήκες ανάπτυξης και δύσκολες τεχνικές συγκομιδής και ανάκτησης του ελαίου. Επιπλέον τα περισσότερα είδη μικροφυκών δεν αναπτύσσουν επαρκή ποσότητα βιομάζας και πολλές φορές η ανάπτυξή τους είναι εξαιρετικά αργή. Species Fermentation reactor Biomass (g/l) Lipid content % (w/w) Lipid yield (g/l) Lipid volumetric productivity (Kg m -3 day -1 ) R. toruloides Flask 18,2 76,1 13,9 2,78 R. toruloides Stirred 106,5 67,5 71,89 12,96 fermenters L. starkeyi Flask 19,0 52,6 9,99 2,0 M. Stirred 67,7 55,2 37,4 17,95 ramanniana fermenters C. Stirred 27,1 46,13 12,50 1,63 potothecoides fermenters Autotrophism Photobioreactor 4,0 2,8 1,535 microalgae Autotrophism Raceway ponds 0,14 0,098 0,117 microalgae Πίνακας 5: Σύγκριση για την παραγωγή λιπιδίων από διαφόρους μικροοργανισμούς Στους μικροοργανισμούς η έκταση της συσσώρευσης λιπιδίων καθορίζεται από τη γενετική τους σύσταση και η μέγιστη εφικτή περιεκτικότητα σε λιπίδια μπορεί να διαφέρει σημαντικά μεταξύ των ειδών των μικροοργανισμών, αλλά ακόμα και μεταξύ μεμονωμένων στελεχών. Με διαφορετικούς μικροοργανισμούς και διαφορετικές συνθήκες καλλιέργειας (όπως θερμοκρασία, ph, χρόνος καλλιέργειας, κτλ.) η περιεκτικότητα σε έλαια και η σύνθεση αυτών διαφέρει. [23], [24], [26], [27], [28], [29], [30], [31], [32] ~ 26 ~

29 Ι.4.7 ΜΙΚΡΟΒΙΑΚΟ ΛΙΠΟΣ ΓΙΑ ΤΗΝ ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΒΙΟΝΤΙΖΕΛ Η παραγωγή μικροβιακού λίπους έχει προκαλέσει το βιομηχανικό ενδιαφέρον λόγω των ιδιαίτερων χαρακτηριστικών του. Διάφορες ανανεώσιμες πρώτες ύλες έχουν χρησιμοποιηθεί ως υποστρώματα για την παραγωγή μικροβιακού λίπους, όπως φυτικά έλαια, ακατέργαστα έλαια, απόβλητα τυροκομείου, μελάσα, άχυρα, προϊόντα σαπωνοποίησης και υδρογονάνθρακες. Υπάρχουν πολλές ζύμες και μύκητες οι οποίοι μπορούν να συσσωρεύουν ενδοκυτταρικά υψηλές ποσότητες μικροβιακού λίπους (SCO), το οποίο έχει την ίδια σύνθεση λιπαρών οξέων με τα φυτικά έλαια. Το μικροβιακό λίπος μπορεί να χρησιμοποιηθεί είτε για εφαρμογές υψηλής προστιθέμενης αξίας (πρόσθετα τροφίμων για παράδειγμα) είτε για την παραγωγή βιοντίζελ. Η βιομηχανική εφαρμογή του μικροβιακού λίπους για την παραγωγή βιοντίζελ εξαρτάται από την εξέλιξη της μικροβιακής ζύμωσης, η οποία θα πρέπει να επιτυγχάνει υψηλή απόδοση μετατροπής της πηγής άνθρακα σε μικροβιακό λίπος, υψηλή παραγωγικότητα, υψηλή περιεκτικότητα λιπιδίων στην ενδοκυτταρική βιομάζα και υψηλές συγκεντρώσεις μικροβιακού λίπους. Τα προηγούμενα κριτήρια αποτελούν ένα χρήσιμο εργαλείο έτσι ώστε να επιλεχθούν οι κατάλληλοι μικροοργανισμοί, οι οποίοι θα διευκολύνουν την βιομηχανική εφαρμογή της παραγωγής βιοντίζελ από μικροβιακό λίπος. [26] Ι.4.8 ΒΙΟΧΗΜΕΙΑ ΣΥΣΣΩΡΕΥΣΗΣ ΕΝΔΟΚΥΤΤΑΡΙΚΟΥ ΛΙΠΟΥΣ Ζωτικής σημασίας για την περαιτέρω ανάπτυξη των διαδικασιών παραγωγής βιοντίζελ με τη χρήση μικροβιακών λιπιδίων (SCO: single cell oils) είναι η κατανόηση του τρόπου με τον οποίο οι μικροοργανισμοί συνθέτουν τα λιπαρά τους οξέα και πως είναι ικανοί να συσσωρεύσουν τόσο πολύ λίπος εντός των κυττάρων τους. Παρά το γεγονός ότι όλοι οι ζωντανοί οργανισμοί πρέπει να συνθέσουν ένα ελάχιστο ποσοστό λιπιδίων για τις μεμβράνες τους και για άλλες δομικές και λειτουργικές ανάγκες, μόνο ένας αριθμός μικροοργανισμών είναι ικανός να συσσωρεύσει λίπος πάνω από 20% της βιομάζας του. Σε ορισμένους μικροοργανισμούς το περιεχόμενο σε λίπος μπορεί να υπερβεί το 70% της βιομάζας του. Τα τελευταία 20 χρόνια έχει γίνει κάθε προσπάθεια για να κατανοηθεί η διαδικασία της συσσώρευσης λιπιδίων από τα λεγόμενα ελαιογόνα είδη. Για παράδειγμα, ανάμεσα στα 600 είδη ζυμομυκήτων, λιγότερο από 30 μέχρι στιγμής έχουν αναγνωριστεί ως ικανά να συσσωρεύουν λίπος περισσότερο από 20% της βιομάζας τους. Στελέχη, όπως το Rhodotorula spp. και το Cryptococcus Curvatus μπορούν να συσσωρεύσουν λίπος 40-70% της βιομάζας τους, ενώ ο Saccharomyces cerevisiae και η ζύμη Candida Utilis είναι συνήθως σε θέση να συσσωρεύουν 5-10%, ακόμη και όταν μεγαλώνουν στις ίδιες συνθήκες. ~ 27 ~

30 Κατά την πρώτη θεώρηση, η βιοσυνθετική οδός λιπαρών οξέων στους περισσότερους ελαιογόνους μικροοργανισμούς είναι η ίδια με τα μη ελαιογόνα είδη. Υπάρχει ωστόσο μια σημαντική διαφορά ανάμεσα στα δύο είδη. Προκειμένου να επιτευχθεί συσσώρευση λίπους εντός των κυττάρων του μικροοργανισμού απαραίτητο είναι η καλλιέργεια του να πραγματοποιηθεί σε ένα περιβάλλον με περίσσεια πηγής άνθρακα και περιορισμένο σε άζωτο. Έτσι, όταν ο μικροοργανισμός μεγαλώνει, εξαντλεί ταχέως την ποσότητα του αζώτου, αλλά συνεχίζει να αφομοιώνει την πηγή άνθρακα (συνήθως γλυκόζη ή εναλλακτικοί υδατάνθρακες). Ο ελαιογόνος μικροοργανισμός μετατρέπει την πηγή άνθρακα σε τριγλυκερίδια, τα οποία συσσωρεύονται εντός των κυττάρων. Οι μη ελαιογόνοι μικροοργανισμοί, όταν βρεθούν στο ίδιο περιβάλλον, περιορισμένο σε άζωτο, είτε τείνουν να σταματήσουν τον περαιτέρω πολλαπλασιασμό των κυττάρων τους, είτε, εάν συνεχίσουν να αφομοιώνουν το διαθέσιμο υπόστρωμα υδατανθράκων, τότε αυτό μετατρέπεται σε διάφορους πολυσακχαρίτες. Η συσσώρευση λίπους είναι σε πολύ μικρά επίπεδα λιγότερο του 10% της βιομάζας των μικροοργανισμών. Ο λόγος για τον οποίο ορισμένοι μικροοργανισμοί καθίσταται ελαιογόνοι έχει διττή φύση: η ικανότητα συνεχούς παραγωγής ακετυλοσυνένζυμου Α (Acetyl-CoΑ) απευθείας στο κυτταρόπλασμα του κυττάρου δρώντας ως απαραίτητος πρόδρομος για τη σύνθεση των λιπαρών οξέων και η ικανότητα του μικροοργανισμού να παράγει επαρκείς ποσότητες NADPH, γεγονός το οποίο αποτελεί βασικό αναγωγικό μέσο κατά τη βιοσύνθεση των λιπαρών οξέων. Ο σχηματισμός ακετυλοσυνένζυμου Α (Acetyl-CoA) στους ελαιογόνους μικροοργανισμούς έχει αποδοθεί στην παρουσία του ενζύμου ATP: κιτρική λυάση (ACL), η οποία φαίνεται να μη βρίσκεται στους μη ελαιογόνους μικροοργανισμούς. Η αντίδραση η οποία γίνεται είναι η εξής: Κιτρικό οξύ + CoA + ATP -->CH3COSCoA + οξαλοξικό οξύ + ADP + Pi Πιο συγκεκριμένα η εξάντληση της πηγής αζώτου στο θρεπτικό υλικό από το μικροοργανισμό οδηγεί σε μια σειρά αντιδράσεων με αποτέλεσμα το σχηματισμό του ακετυλοσυνένζυμου Α. Έτσι, κατά την κατανάλωση του αζώτου ενεργοποιείται το ένζυμο AMP-απαμινάση με αποτέλεσμα την ταχύτατη πτώση της περιεκτικότητας του κυττάρου σε AMP και την παρεμπόδιση της δράσης του ενζύμου ισοκιτρική αφυδρογονάση. Με αυτό τον τρόπο το κιτρικό οξύ δεν μπορεί να μεταβολιστεί και συσσωρεύεται στο μιτοχόνδριο. Στη συνέχεια, το κιτρικό οξύ εισέρχεται στο κυτταρόπλασμα και διασπάται από την ATP: κιτρική λυάση (ACL) σε ακετυλοσυνένζυμο Α και σε οξαλοξικό οξύ. Έπειτα το ακετυλοσυνένζυμο Α χρησιμοποιείται ως πρόδρομος για τη βιοσύνθεση των λιπαρών οξέων, ενώ το οξαλοξικό οξύ μετατρέπεται μέσω της αφυδρογονάσης του μηλικού οξέος σε μηλικό, το οποίο στη συνέχεια χρησιμοποιείται στον κύκλο κιτρικού/μηλικού οξέος. ~ 28 ~

31 Εκτός όμως από την παραγωγή του ακετυλοσυνένζυμου Α σημαντική στη βιοσύνθεση των λιπαρών οξέων είναι η συνεισφορά του μηλικού ενζύμου ως προμηθευτού NADPH σύμφωνα με την αντίδραση που ακολουθεί: Μηλικό οξύ + NADPH+ πυροσταφυλικό + CO2 +NADPH Η δραστηριότητα του μηλικού ενζύμου φαίνεται να απαντάται στους περισσότερους ελαιογόνους μικροοργανισμούς και αποτελεί ένα μεταβολικό σύμπλοκο, το οποίο δρα συνεργατικά με την ATP: κιτρική λυάση και τη συνθάση των λιπαρών οξέων, έτσι ώστε να εξασφαλίζεται άμεση επικοινωνία κατά τη μετατροπή του ακετυλοσυνένζυμου Α σε λιπαρά οξέα, τα οποία τελικά εστεροποιούνται με γλυκερόλη σε τριγλυκερίδια και ενσωματώνονται μέσω του ενδοπλασματικού δικτύου σε σταγονίδια λιπαρών οξέων. Εικόνα 6: Απεικονίζονται ο κύκλος του κιτρικού / μηλικού οξέος (citrate/malate cycle) και ο κύκλος του Krebs (transhydrogenase cycle) και παρουσιάζεται πως μπορούν να παρέχουν επαρκείς «πρόδρομες» ουσίες ακετυλοσυνένζυμου Α και NADPH για τη λιπογένεση στους ελαιογόνους μικροοργανισμούς. Ένζυμα: 1. Αποκαρβοξυλάση του πυροσταφυλικού οξέος, 2. Αφυδρογονάση του μηλικού οξέος, 4. μηλικό ένζυμο, 5. Κιτρική συνθάση, 6. ATP: κιτρική λυάση, 7. ένζυμο υπεύθυνο για τη λειτουργία του συστήματος μεταφοράς κιτρικού/μηλικού οξέος μεταξύ μιτοχονδρίου και κυτταροπλάσματος. ~ 29 ~

32 Συμπερασματικά καταλήγουμε πως τα ένζυμα κλειδιά για τη σύνθεση ενδοκυτταρικού λίπους στους ελαιογόνους μικροοργανισμούς είναι δύο: η ATP: κιτρική λυάση (ACL) και το μηλικό ένζυμο. Τα δύο αυτά ένζυμα βρίσκονται στην πλειοψηφία των ελαιογόνων μικροοργανισμών, ωστόσο κάποιες έρευνες έχουν δείξει ότι υπάρχουν κάποιες ελαιογόνες ζύμες που δε διαθέτουν το μηλικό ένζυμο και εντούτοις μπορούν να βιοσυνθέτουν λίπος. Αυτό οφείλεται στο ότι μπορεί οι ζύμες αυτές να διαθέτουν κάποιο εναλλακτικό ενζυμο, το οποίο να είναι εξειδικευμένο στην παραγωγή NADPH για τη βιοσύνθεση λίπους. Ακόμα, έχει παρατηρηθεί ότι η παρουσία της ATP: κιτρικής λυάσης (ACL) σε κάποιες ζύμες δεν οδήγησε στην συσσώρευση ενδοκυτταρικού λίπους. Το γεγονός αυτό αποδεικνύει ότι απαιτείται η δραστικότητα και άλλων ενζύμων για την παραγωγή μικροβιακού λίπους. [25], [33], [34], [35], [36] Εικόνα 7: Απεικονίζεται η διαδικασία λιπογένεσης στους ελαιογόνους μικροοργανισμούς. Συγκεκριμένα, παρουσιάζεται η ροή της πηγής από το μιτοχόνδριο και μέσω του κύκλου του κιτρικού/μηλικού οξέος και του σχηματισμού του ακετυλοσυνένζυμου Α στο κυτταρόπλασμα, σχηματίζονται τα λιπαρά οξέα και στη συνέχεια τα πολυακόρεστα λιπαρά οξέα, PUFAs και κατ επέκταση τα LCPUFAs στις μεμβράνες του ενδοπλασματικού δικτύου. ΟΑΑ: οξαλοξικό, AC-CoA: ακετυλοσυνένζυμο Α, Mal-CoA: μηλονυλοσυνένζυμο Α (malonyl- CoA), FAS: σύνθεση λιπαρού οξέος, ACL: ATP:κιτρική λυάση, ACC: ακετυλοσυνένζυμο Α καρβοξυλάση, CMT: κιτρική/μηλική τρανσλοκάση (translocase), ΜΕ: μηλικό ένζυμο, PC: πυροσταφυλική καρβοξυλάση, MDH: μηλική αφυδραγονάση. Τα ένζυμα με το κίτρινο χρώμα συνιστούν τον κύκλου κιτρικού/μηλικού οξέος (citrate/malate cycle), ενώ τα ένζυμα με το μωβ χρώμα συνιστούν τον κύκλο του Krebs ((transhydrogenase cycle) Πηγή: Ratledge 2004 ~ 30 ~

33 Ι.4.9 ΣΥΝΘΗΚΕΣ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑΣ Έχει αναφερθεί εκτενώς ότι οι συνθήκες καλλιέργειας, όπως αναλογία άνθρακα αζώτου (C/N), οι πηγές αζώτου, η θερμοκρασία, το ph, το οξυγόνο και η συγκέντρωση των ιχνοστοιχείων και των ανόργανων αλάτων έχουν μεγάλη επίδραση στη συσσώρευση των ελαίων (oil, πετρέλαιο). Γενικά, έχει διαπιστωθεί από πειραματικές μελέτες ότι, όσο μεγαλύτερη είναι η συγκέντρωση αζώτου, που περιέχεται στο μέσο, τόσο λιγότερο έλαιο περιέχεται στα κύτταρα. Διαφορετικές πηγές αζώτου έχουν επίσης ποικίλη επίδραση σε σχέση με την παραγωγή ελαίου. Αμφότερες οι ανόργανες πηγές αζώτου και οι πηγές οργανικού αζώτου μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την καλλιέργεια ζυμών με διαφορετική επίδραση στην συσσώρευση ελαίου. Έχει αναφερθεί από ερευνητές ότι πηγές ανόργανου αζώτου ευνοούν την ανάπτυξη των κυττάρων, αλλά όχι την παραγωγή ελαίου, ενώ πηγές οργανικού αζώτου, όπως η πεπτόνη, ευνοούν την παραγωγή ελαίου, αλλά έχουν αντίθετα αποτελέσματα στην κυτταρική ανάπτυξη. Ίχνη μεταλλικών ιόντων επηρεάζουν επίσης τη συσσώρευση ελαίου. Αναφέρεται ότι το περιεχόμενο σε βιομάζα και έλαια θα μπορούσε να βελτιωθεί σημαντικά μέσω της βελτιστοποίησης των συγκεντρώσεων σε άλατα όπως Mg 2+, Zn 2+, Mn 2+, Cu 2+ και Ca 2+. Άλλες παράμετροι καλλιέργειας, όπως το διαλυμένο οξυγόνο, η θερμοκρασία, το ph, έχουν επίσης ποικίλη επιρροή στην κυτταρική ανάπτυξη και στη συσσώρευση ελαίου. Η συγκέντρωση του διαλυμένου οξυγόνου στο μέσο καλλιέργειας έχει θετική συσχέτιση με τη συσσώρευση ελαίων. Συνεπώς, για να επιτευχθεί υψηλή παραγωγή ελαίου, η βελτιστοποίηση στις προαναφερθείσες παραμέτρους καλλιέργειας είναι σημαντική. [33], [34] Ι.4.10 ΓΛΥΚΟ ΣΟΡΓΟ Το γλυκό σόργο (Sorghum bicolor {L.} Moench) είναι ένα C4 μονοετές φυτό, με μεγάλη φωτοσυνθετική ικανότητα, υψηλές αποδόσεις σε βιομάζα και υψηλό ποσοστό σε διαλυτά σάκχαρα (γλυκόζη, φρουκτόζη και σακχαρόζη) και αδιάλυτα (κυτταρίνη και ημικυτταρίνη) με προέλευση την Αφρική (Chohnan et al., 2011). Οι ποικιλίες γλυκού σόργου χαρακτηρίζονται από συσσώρευση υψηλών επιπέδων ζυμώσιμων υδατανθράκων (15-23%). ~ 31 ~

34 Ως μια καλλιέργεια με υψηλή φωτοσυνθετική απόδοση, δεν παράγει μόνο καρπούς, αλλά επίσης αποδίδει και μεγάλες ποσότητες μίσχων πλούσιων σε σάκχαρα. Τα σάκχαρα αυτά είναι κυρίως σακχαρόζη (έως 55% της ξηρής βιομάζας), φρουκτόζη και γλυκόζη, τα οποία αποτελούν ιδανικές επιλογές για την παραγωγή μέσων ζύμωσης. Εκτός αυτών, η υψηλή σταθερότητα σε διακυμάνσεις θερμοκρασίας, η μεγάλη προσαρμοστικότητά του στις διάφορες συνθήκες, η ανάπτυξη του σε μια ευρεία περιοχή συνθηκών εδάφους, από βαριά αργιλώδη εδάφη μέχρι εδάφη με ψιλή άμμο, με ph που κυμαίνεται από 5,00 έως 8,50, η υψηλή ανοχή του στην αλατότητα, όπως επίσης και το χαρακτηριστικό που έχει να γίνεται αδρανές ελλείψει κατάλληλης ποσότητας νερού, χωρίς όμως να μαραίνεται εύκολα, καθιστούν το γλυκό σόργο ως ένα από τα πιο δημοφιλή φυτά για καλλιέργεια σε όλο τον κόσμο. Τέλος, το γλυκό σόργο έχει σύντομη περίοδο ανάπτυξης (3-5 μήνες), η οποία το καθιστά κατάλληλο για την ανάπτυξή του μεταξύ κυρίων καλλιεργειών. Οι αποδόσεις του γλυκού σόργου διαφέρουν σημαντικά ανάλογα με τις ποικιλίες, την τοποθεσία (έδαφος, νερό, κλίμα, παράσιτα) και τις γεωργικές πρακτικές. Κατά την εξέταση του γλυκού σόργου για την παραγωγή βιοκαυσίμων μέσω συμβατικής ζύμωσης, η παραγωγή βιομάζας, η παραγωγή χυμού και η παραγωγή σακχάρων ανά στρέμμα αποτελούν τα πιο σημαντικά χαρακτηριστικά. [37], [38] Το γλυκό σόργο είναι μια πολύ γνωστή καλλιέργεια στην Κίνα, η οποία και έχει μεγάλη εμπειρία στην ανάπτυξη, καλλιέργεια και χρήση του. Θεωρείται η κύρια καλλιέργεια για την παραγωγή αιθανόλης στις ΗΠΑ, ενώ στην Ευρώπη τον τελευταίο αιώνα έχει θεωρηθεί ως μία πηγή ανανεώσιμης ενέργειας με μεγάλες προοπτικές. Πρόσφατα το γλυκό σόργο έχει προσελκύσει ιδιαίτερο ενδιαφέρον και στην Ελλάδα για τη χρήση του ως ενεργειακή καλλιέργεια. Οι αποδόσεις βιομάζας κάτω από τις ελληνικές συνθήκες καλλιέργειας (κλίμα, έδαφος) κυμαίνεται από 45 έως 141 τόνους / εκτάριο, ενώ η απόδοση ξηρής ύλης κυμαίνεται από 13 μέχρι 15 τόνους / εκτάριο. ~ 32 ~

35 Ι.4.11 ΖΥΜΕΣ ΓΙΑ ΤΗ ΣΥΣΣΩΡΕΥΣΗ ΕΝΔΟΚΥΤΤΑΡΙΚΟΥ ΛΙΠΟΥΣ LIPOMYCES STARKEYI Οι ελαιογόνοι μικροοργανισμοί κατατάσσονται μεταξύ των βακτηρίων, μυκήτων, ζυμών και μικροαλγών. Μεταξύ αυτών οι ζύμες, όπως αναφέρθηκε και παραπάνω, εμφανίζουν μια υπεροχή όσον αφορά την παραγωγή λιπιδίων σε σχέση με τις άλλες ομάδες μικροοργανισμών. Μεταξύ των πλεονεκτημάτων, που παρουσιάζουν, είναι και ο πολλαπλασιασμός τους, ο οποίος συμβαίνει σε λιγότερο από μία ώρα. Στα ελαιογόνα είδη ζυμομυκήτων συμπεριλαμβάνονται το Yarrowia, το Candida, το Rhodotorula, το Rhodosporidium, το Cryptococcus, το Trichosporon και το Lipomyces (Ageitos et al., 2011). Κάποια είδη ζυμών, όπως Rhodosporidium toruloides, Rhodotorula sp., Lipomyces starkeyi και Trichosporon fermentans μπορούν να συσσωρεύσουν ενδοκυτταρικά λίπος ακόμη και 50% του ξηρού βάρους των κυττάρων τους. Η ζύμη Lipomyces starkeyi έχει προσελκύσει πρόσφατα την προσοχή, καθώς μπορεί να αξιοποιήσει με μεγάλη αποδοτικότητα διάφορες πηγές άνθρακα, όπως γλυκόζη, φρουκτόζη, σακχαρόζη, ξυλόζη και αραβινόζη. Σύμφωνα με διάφορες πειραματικές μελέτες οι αποδόσεις της ζύμης L. starkeyi, όσον αφορά τη συσσώρευση ενδοκυτταρικών λιπιδίων, ήταν αρκετά υψηλές, συγκεκριμένα έφθασαν το 61,5% επί της συνολικής ξηρής βιομάζας, όταν η ανάπτυξη της ζύμης πραγματοποιήθηκε σε μίγματα γλυκόζης και ξυλόζης (Zhao et al., 2008), 56,3% και 72,3% σε γλυκόζη (Angerbauer et al., 2008), 40% σε μη ρευστοποιημένο άμυλο γλυκοπατάτας (Wild, 2010) και 31,2% σε άχυρο σίτου, που είχε υποστεί υδρόλυση με διάλυμα αραιού θειικού οξέος. Ακόμη σύμφωνα με μελέτες του δυναμικού συσσώρευσης λιπιδίων του L. starkeyi, κατά την καλλιέργειά του σε λυματολάσπη, παρατηρήθηκε ότι σε ένα συνθετικό μέσο η συσσώρευση λιπιδίων εξαρτάται σημαντικά από την αναλογία C/N και συγκεκριμένα η υψηλότερη περιεκτικότητα λιπιδίων βρέθηκε σε αναλογία C/N: 150 με 68% λιπίδια επί της ξηρής βιομάζας, ενώ σε μια αναλογία C/N: 60 η συσσώρευση λιπιδίων μειώθηκε σε 40%. Επιπλέον, το ph του μέσου καλλιέργειας φαίνεται να επηρεάζει την συσσώρευση λιπιδίων, καθώς σε ένα εύρος ph από 5,00 έως 7,50 η υψηλότερη συσσώρευση λιπιδίων βρέθηκε σε ph ίσο με 5,00, ενώ η υψηλότερη απόδοση ανά λίτρο σημειώθηκε σε ph ίσο με 6,50. Επίσης, μετά τη συγκριτική μελέτη των ζυμών Candida curvata, Trichosporon curuloides, Rhodosporidium toruloides και L. Starkeyi, ο τελευταίος μικροοργανισμός φάνηκε ότι μπορεί να αποθηκεύσει τις μεγαλύτερες ποσότητες λιπιδίων. [39], [40], [41] Εικόνα 8: Αποικίες του L. starkeyi στο μικροσκόπιο ~ 33 ~

36 ΙΙ. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΙΙ.1 ΥΛΙΚΟ Το γλυκό σόργο (Sorghum bicolor L.} {Moench) που χρησιμοποιήθηκε κατά τη διεξαγωγή της παρούσας διπλωματικής εργασίας άνηκε στην ποικιλία Keller και παραχωρήθηκε ευγενικά από τον καθηγητή Γιώργο Σκαράκη, Τμήμα Επιστήμης Φυτικής Παραγωγής, Γεωπονικό Πανεπιστήμιο Αθηνών. Το εν λόγω γλυκό σόργο καλλιεργήθηκε το Μάιο του 2010 και η συλλογή και συγκομιδή έγινε τον Οκτώβριο από την πεδιάδα της Κωπαΐδας. Οι σπόροι και τα φύλλα απομακρύνθηκαν από τους φρέσκους μίσχους με το χέρι και αποθηκεύτηκαν σε καταψύκτη στους -20 C μέχρι να γίνει χρήση του. Μετά την απόψυξη σε θερμοκρασία δωματίου, οι μίσχοι αφού αρχικά υπέστησαν ξήρανση (80 o C για μέχρι σταθερού βάρους), αλέσθηκαν σε κομμάτια των 0,75 χιλιοστών χρησιμοποιώντας εργαστηριακό μύλο. Η σύσταση του ξηρού γλυκού σόργου ήταν η ακόλουθη: σακχαρόζη 34,4% w/w, γλυκόζη 8,3% w/w, φρουκτόζη 8,06% w/w, κυτταρίνη και ημικυτταρίνη 19.6% w/w και 15.2% w/w αντίστοιχα. Η περιεκτικότητα σε λιγνίνη ήταν 3,2% w/w. Ακόμα στην παρούσα ερευνητική μελέτη για την παραγωγή ενδοκυτταρικού λίπους χρησιμοποιήθηκε η ζύμη Lipomyces starkeyi CBS 1807, η οποία προήλθε από την ολλανδική εταιρία CBS ( ΙΙ.2 ΘΡΕΠΤΙΚΑ ΥΠΟΣΤΡΩΜΑΤΑ Το στέλεχος της ζύμης επωαζόταν σε θερμοστατούμενο κλίβανο (GALLENKAMP Plus II, Αγγλία & WTBbinder B34, Γερμανία) στους 30 ο C σε δοκιμαστικούς σωλήνες (sland) με κεκλιμένο στερεό υπόστρωμα YPD με σύσταση: Γλυκόζη Meat peptone Yeast extract KH2PO4 Na2HPO4 Agar 20 g/l 10 g/l 10 g/l 6 g/l 2 g/l 20 g/l Αφού οι δοκιμαστικοί σωλήνες πωματίζονταν με βαμβάκι, αποστειρωνόταν και μετά τον εμβολιασμό τους με τη ζύμη, επωαζόταν για 3 ημέρες στους 30 o C. Μετά την πάροδο των τριών ημερών διατηρούνταν σε θερμοκρασία 4 o C. ~ 34 ~

37 Πριν από κάθε εμβολιασμό στο υγρό θρεπτικό υπόστρωμα της προκαλλιέργειας, το στέλεχος ανανεώνεται έτσι ώστε το εμβόλιο να είναι ηλικίας περίπου τριών ημερών. Εικόνα: Εμβολιασμός sland ΥΓΡΟ ΥΠΟΣΤΡΩΜΑ ΠΡΟ-ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑΣ Το διάλυμα που χρησιμοποιήθηκε για την αύξηση του μικροοργανισμού κατά την προκαλλιέργεια αποτελούταν από : Γλυκόζη Πεπτόνη Yeast extract KH2PO4 Na2HPO4 20 g/l 10 g/l 10 g/l 6 g/l 2 g/l Στο υγρό μέσο γινόταν διόρθωση του ph στο 6,00 και στη συνέχεια αποστειρώνονταν για 20 λεπτά στους 121 o C. Στη συνέχεια, εφόσον το στέλεχος του μύκητα είχε αναπτυχθεί επιτυχώς στους δοκιμαστικούς σωλήνες με στερεό YPD εμβολιάζονταν οι προκαλλιέργειες υπό ασηπτικές συνθήκες με τη βοήθεια βακτηριολογικού κρίκου. Έπειτα, η προκαλλιέργεια τοποθετούνταν σε ανακινούμενη τράπεζα προς επώαση (shaker) (ZHWY- 211C, Incubator Shaker) σε θερμοκρασία 30 0 C και 200 rpm για 24 ώρες. ~ 35 ~

38 ΘΡΕΠΤΙΚΟ ΜΕΣΟ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑΣ ΤΗΣ ΖΥΜΗΣ Σειρά είχε ο εμβολιασμός της κυρίως καλλιέργειας από την προκαλλιέργεια με τη βοήθεια αποστειρωμένου ογκομετρικού κυλίνδρου. Το εμβόλιο ήταν 5% επί του συνολικού όγκου της κύριας καλλιέργειας, δηλαδή 10 ml και μεταφερόταν σε κάθε κωνική φιάλη με το θρεπτικό μέσο. Οι κωνικές φιάλες της κυρίως καλλιέργειας τοποθετούνταν στην ανακινούμενο επωαστήρα στους 30 o C και 200 rpm, όπου ακολουθούσαν βυθισμένες καλλιέργειες ασυνεχούς τύπου μέχρι κατανάλωσης όλων των σακχάρων. Οι καλλιέργειες πραγματοποιούνταν σε κωνικές φιάλες 1L, πληρωμένες με 200mL υγρού καλλιέργειας, η σύσταση του οποίου έχει περιγραφεί παραπάνω. Εικόνα: Βυθισμένες καλλιέργειες ασυνεχούς τύπου σε ανακινούμενο επωαστήρα Οι πηγές άνθρακα που χρησιμοποιήθηκαν κατά τη διεξαγωγή των πειραμάτων ήταν: η γλυκόζη, η φρουκτόζη, η σακχαρόζη, καθώς και ένα μίγμα των τριών αυτών σακχάρων (στις αναλογίες στις οποίες βρίσκονται στο γλυκό σόργο), ενώ οι πηγές αζώτου που μελετήθηκαν ήταν: οι οργανικές πηγές, ουρία, πεπτόνη και yeast extract, και οι ανόργανες πηγές, χλωριούχο αμμώνιο (NH4Cl), θειικό αμμώνιο ((NH4)2SO4) και όξινο φωσφορικό αμμώνιο ((NH4)2HPO4). Σε κάθε περίπτωση στην κύρια καλλιέργεια προσθέτονταν και κάποια άλατα οι συγκεντρώσεις των οποίων παρουσιάζονται στον πίνακα που ακολουθεί. ~ 36 ~

39 KH2PO4 Na2HPO4 2H2O MgSO4 7H2O FeCl3 6H2O CaCl2 2H2O ZnSO4 7H2O MnSO4 H2O 7 g/l 2,5 g/l 1,5 g/l 0,15 g/l 0,15 g/l 0,02 g/l 0,06 g/l ΥΠΟΣΤΡΩΜΑ ΓΙΑ ΤΡΙΒΛΙΑ Το υπόστρωμα καλλιέργειας για την ανάπτυξη του μικροοργανισμού στα τριβλία είχε την εξής σύσταση: Γλυκόζη Πεπτόνη Yeast extract KH2PO4 Na2HPO4 Agar 20 g/l 10 g/l 10 g/l 6 g/l 2 g/l 17 g/l Το υγρό υπόστρωμα καλλιέργειας, αφού πρώτα ρυθμιζόταν το ph του στο 6,00, στη συνέχεια αποστειρωνόταν στους 121 ο C για 20 και αφού κρύωνε, μέχρι το σημείο όμως που δεν προλάβαινε να στερεοποιηθεί το agar στρώνονταν με μία ποσότητα αυτού τα τριβλία και στη συνέχεια αυτά φυλαγόταν στο ψυγείο μέχρι να χρησιμοποιηθούν. ΔΙΑΛΥΜΑ RINGER Το διάλυμα Ringer είναι ένα ισοτονικό διάλυμα χλωριούχων αλάτων (χλωριούχου νατρίου (NaCl), χλωριούχου καλίου (ΚCl) και χλωριούχου ασβεστίου (CaCl2)) και βοηθά στο να μη λυθούν τα κύτταρα λόγω οσμωτικής πίεσης. Η σύσταση του είναι η εξής: Η20 NaCl KCl CaCl NaHCO ml 9 g 0,42 g 0,24 g 0,20 g Το διάλυμα Ringer χρησιμοποιούταν, αφού πρώτα γινόταν αραίωση τέσσερις φορές. ~ 37 ~

40 ΙΙ.3 ΑΝΑΛΥΣΕΙΣ ΔΕΙΓΜΑΤΟΛΗΨΙΑ Κάθε ημέρα, ανά 24 ώρες περίπου, παραλαμβάνονταν δείγμα 15 ml με αποστειρωμένους ογκομετρικούς κυλίνδρους σε στείρες συνθήκες και τοποθετούνταν σε πλαστικό δοχείο τύπου falcon. Ακολουθούσαν αναλύσεις, όπως περιγράφονται ακολούθως. ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ PH Το ph της καλλιέργειας μετριόταν με ph-μετρο τύπου 537 (WTW Γερμανία). Συνήθως το ph της αρχικής καλλιέργειας ήταν κοντά στο 6,00 με μια μικρή ανοδική απόκλιση. Σε κάθε δείγμα γινόταν μέτρηση και καταγραφή του ph. ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΒΙΟΜΑΖΑΣ Ο προσδιορισμός της βιομάζας γινόταν με μέτρηση του ξηρού βάρους. Τα δείγματα καλλιέργειας (15 ml) κάθε ημέρας τα οποία ήταν τοποθετημένα σε falcon φυγοκεντρούνταν στις 5000 rpm για 15 min στις. H βιομάζα έμενε στον πυθμένα του σωλήνα και το υγρό υπόστρωμα συλλέγονταν για περαιτέρω ανάλυση. Ακολουθούσε έκπλυση με απιονισμένο νερό και τα κύτταρα φυγοκεντρούνταν για δεύτερη φορά για να είναι απαλλαγμένα από υπολείμματα υποστρώματος. Έπειτα η βιομάζα μεταφερόταν σε προζυγισμένα φιαλίδια τύπου McCartney και στη συνέχεια σε φούρνο για ξήρανση (60 o C) μέχρι σταθεροποίησης του βάρους τους. Το ξηρό υπόλειμμα ζυγιζόταν σε ζυγό ακριβείας ( 4 δεκαδικών ψηφίων) και εκφραζόταν σε g/l. ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΒΙΟΜΑΖΑΣ ΣΤΟ ΣΟΡΓΟ Κατά τη διεξαγωγή του πειράματος, όπου χρησιμοποιήθηκε το γλυκό σόργο ως υπόστρωμα, λόγω της παρουσίας στερεών στο μέσο καλλιέργειας, δεν ήταν δυνατή η μέτρηση της βιομάζας με ξήρανση και ζύγιση (όπως περιγράφηκε παραπάνω: προσδιορισμός της βιομάζας). Για το λόγο αυτό, ο προσδιορισμός της βιομάζας πραγματοποιούνταν με τη μέθοδο plate count agar, όπου γινόταν καλλιέργεια του συγκεκριμένου δείγματος κάθε φορά σε τριβλία. Μετά από τρεις μέρες περίπου επώασης των δειγμάτων στα τριβλία, μετρούνταν οι αποικίες που είχαν αναπτυχθεί σε αυτά. Για να μπορέσουν όμως να είναι εμφανείς οι αποικίες πραγματοποιήθηκαν αραιώσεις 10-3, 10-5, 10-7, 10-9, Οι αραιώσεις γινόταν με τη χρήση ισοτονικού διαλύματος Ringer. Για να μπορέσει να μετατραπεί ο αριθμός cfu/ml σε ξηρή βιομάζα (g/l), η ίδια διαδικασία πραγματοποιήθηκε και σε υγρή καλλιέργεια με μίγμα γλυκόζης, φρουκτόζης και σακχαρόζης, όπου λαμβανόταν δείγματα και προσδιοριζόταν, τόσο η ποσότητα της ξηρής βιομάζας (g/l), όσο και ο αριθμός των αποικιών (cfu/ml). ~ 38 ~

41 Από την καμπύλη αναφοράς που δημιουργήθηκε κατ αυτόν τον τρόπο, κατέστη δυνατή η αναγωγή του αριθμού cfu/ml από τα δείγματα που ελήφθησαν κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης σε γλυκό σόργο, σε συγκέντρωση ξηρής βιομάζας. Εικόνα: Προετοιμασία για καλλιέργεια δείγματος σε τριβλία. ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΟΛΙΚΩΝ ΣΑΚΧΑΡΩΝ O προσδιορισμός των συνολικών αναγωγικών σακχάρων γινόταν στο υπερκείμενο που είχε συλλεχθεί κατά την διαδικασία της φυγοκέντρισης, όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Στις περιπτώσεις όπου υπήρχε και σακχαρόζη στο υγρό καλλιέργειας, για να μπορέσει αυτή να προσδιοριστεί, προηγούνταν υδρόλυση της σε γλυκόζη και φρουκτόζη με την χρήση οξέως. Πιο συγκεκριμένα, μετά από κατάλληλη αραίωση του προς ανάλυση δείγματος μία ποσότητα συνολικά 4,5 ml τοποθετούνταν σε δοκιμαστικό σωλήνα. Εν συνεχεία γινόταν προσθήκη 0,5 ml πυκνού διαλύματος HCl (12N) και ακολουθούσε ανάδευση σε vortex και τοποθέτηση σε υδατόλουτρο στους 70 o C για 15 λεπτά. Κατόπιν γινόταν εξουδετέρωση με προσθήκη 0,5 ml ΝαΟΗ 12Μ και το δείγμα αναδευόταν ξανά. Ακολούθησε ο προσδιορισμός των αναγωγικών σακχάρων με τη φωτομετρική μέθοδο του δινιτροσαλικυλικού οξέος (DNS) (Miller, 1959). Η μέθοδος αυτή στηρίζεται στην αναγωγή του 3,4-δινιτροσαλικυλικού οξέος προς 3-αμινο-5-νιτροσαλικυλικό οξύ παρουσία καυστικού νατρίου (NaOH) και την ταυτόχρονη οξείδωση της γλυκόζης προς γλυκονικό οξύ. ~ 39 ~

42 glucose (g/l) Πιο συγκεκριμένα σύμφωνα με τη μέθοδο του DNS σε 250 μl του δείγματος σε δοκιμαστικό σωλήνα προστίθενται 250 μl αντιδραστηρίου DNS και κατόπιν ανάδευσης μεταφέρεται σε υδατόλουτρο (100 o C) για 5min. Μετά το πέρας της επώασης, γινόταν προσθήκη 2mL απιονισμένου νερού και μετά από ανάδευση μετρούνταν η απορρόφηση του δείγματος με φωτομέτρηση στα 540nm. Το φασματοφωτόμετρο που χρησιμοποιήθηκε ήταν τύπου Boeco S-20 Spectrophotometer (Γερμανία). Ο μηδενισμός του φωτομέτρου πραγματοποιούνταν με τη χρήση τυφλού δείγματος, όπου αντί για δείγμα καλλιέργειας περιέχονταν ίση ποσότητα νερού. Για τον υπολογισμό της συγκέντρωσης του δείγματος σε ανάγοντα σάκχαρα χρησιμοποιήθηκε η καμπύλη αναφοράς που ακολουθεί παρακάτω. Η καμπύλη αυτή προέκυψε από τη μέτρηση της απορρόφησης διαλυμάτων γνωστής συγκέντρωσης γλυκόζης. 1,8 1,6 1,4 1,2 1 y = 1,503x R² = 0,997 0,8 0,6 0,4 0, ,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 absorbance (540nm) Γράφημα 1: Πρότυπη καμπύλη αναφοράς γλυκόζης με τη μέθοδο DNS ~ 40 ~

43 ΕΚΧΥΛΙΣΗ ΛΙΠΑΡΩΝ Για τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης του ενδοκυτταρικού λίπους που παράγεται από τη ζύμη κατά τη διάρκεια της υγρής ζύμωσης, αφού ζυγιστεί η ξηρή βιομάζα προστίθεται στο φιαλίδιο McCartney μερικά ml διαλύματος folch. Το συγκεκριμένο διάλυμα είναι ένα μίγμα των διαλυτών χλωροφορμίου (CHCl3) μεθανόλης (CH3OH) σε αναλογία 2:1 (v/v). Στη συνέχεια τα φιαλίδια φυλάσσονται σε σκοτεινό μέρος, για να αποφευχθεί η οξείδωση των λιπαρών, για τουλάχιστον 3 ημέρες. Με το διάλυμα folch πραγματοποιείται εκχύλιση του συνολικού μικροβιακού λίπους, ητοι και τα αποθηκευτικά και τα δομικά λιπίδια. Μετά το πέρας των τριών ημερών (μπορεί να είναι και παραπάνω από τρεις όχι όμως λιγότερες) η βιομάζα μαζί με το διάλυμα υφίστατο διήθηση με ηθμό. Το διήθημα συλλέγονταν σε προζυγισμένη φιάλη εξάτμισης, η οποία προηγουμένως ήταν τοποθετημένη σε φούρνο στους 100 ο C, για να είναι πλήρως απαλλαγμένη υγρασίας και στη συνέχεια ακολουθούσε εξάτμιση σε περιστροφικό εξατμιστήρα (rotary evaporator) για την απομάκρυνση του διαλύτη. Ο εξατμιστήρας που χρησιμοποιήθηκε ήταν τύπου Buchi,RE 111, Rotavapor. Η θερμοκρασία στον εξατμιστήρα καθοριζόταν στους 65 o C, καθώς η θερμοκρασία εξάτμισης της μεθανόλης είναι 64,7 o C, ενώ του χλωροφορμίου 61,3 o C. Στη φιάλη εξάτμισης παρέμενε τελικά το μικροβιακό λίπος. Η φιάλη τοποθετούνταν ξανά για ξήρανση για 5min στους 100 ο C, ώστε να εξατμιστεί κάθε υπόλειμμα διαλύτη και στη συνέχεια αφού μεταφερόταν σε ξηραντήρα μέχρι να αποκτήσει θερμοκρασία δωματίου, ζυγιζόταν και κατόπιν υπολογιζόταν η συγκέντρωση του μικροβιακού λίπους σε g/l. Εικόνα: Εξάτμιση δείγματος με χρήση περιστροφικού εξατμιστήρα (Rotary evaporator) ~ 41 ~

44 ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΑΖΩΤΟΥ ΤΩΝ ΕΛΕΥΘΕΡΩΝ ΑΜΙΝΟΜΑΔΩΝ Η αναλυτική μέθοδος που χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό του αζώτου των ελεύθερων αμινομάδων (FAN, Free Amino Nitrogen) είναι η φωτομετρική μέθοδο της νινυδρίνης. Παρασκευή αντιδραστηρίων: Αντιδραστήριο χρώσης (Color reagent): Το αντιδραστήριο αυτό αποτελείται από: 49,71 g Να2ΗPΟ4 2Η2Ο, 5g νινυδρίνη, 3g φρουκτόζη και περίπου 60g KH2PO4, διαλυμένα σε 1L απεσταγμένου νερού. Κατά τη διάρκεια της παρασκευής του αντιδραστηρίου το ph του διαλύματος πρέπει να κυμαίνεται μεταξύ 6,60 και 6,80. Ως εκ τούτου, όποτε κρίνεται αναγκαίο το ph διορθώνεται, ώστε να κυμαίνεται εντός του προαναφερθέντος εύρους. Η διόρθωση γίνεται με προσθήκη κατάλληλης ποσότητας KH2PO4 στο διάλυμα. Το αντιδραστήριο χρώσης αποθηκεύεται σε μπουκάλι Duran σε θερμοκρασία 4 o C. Αντιδραστήριο αραίωσης (Dilution reagent): Αρχικά 2g KIO3 διαλύονται σε 616mL απεσταγμένου νερού. Ακολούθως, 384mL καθαρής αιθανόλης προστίθενται στο διάλυμα, το οποίο έχει τελικό όγκο 1L. Αποθεματικό διάλυμα γλυκίνης (Glycine stock solution): Το διάλυμα αυτό παρασκευάζεται με διάλυση 0,1072 g γλυκίνης σε 100mL απεσταγμένου νερού και αποθηκεύεται σε θερμοκρασία 4 o C. Πρότυπο διάλυμα γλυκίνης (Glycine standard solution): Για να εξασφαλιστεί συγκέντρωση FAN 2 mg/l, διαλύεται 1mL αποθεματικού διαλύματος γλυκίνης σε 100mL απεσταγμένου νερού. Το διάλυμα αποθηκεύεται σε θερμοκρασία 4 o C. Εικόνα: Δείγματα μετά την εφαρμογή της μεθόδου FAN ~ 42 ~

45 Εφαρμογή της μεθόδου: Αρχικά 2mL αραιωμένου δείγματος μεταφέρθηκαν σε δοκιμαστικό σωλήνα με βιδωτό πλαστικό καπάκι. Παρασκευάστηκαν επίσης ένα πρότυπο δείγμα, με προσθήκη 2mL πρότυπου διαλύματος γλυκίνης σε δοκιμαστικό σωλήνα και ένα τυφλό δείγμα με προσθήκη 2mL απιονισμένου νερού σε ένα δεύτερο δοκιμαστικό σωλήνα. Έπειτα 1mL του αντιδραστηρίου χρώσης μεταφέρθηκε σε κάθε έναν από τους παραπάνω δοκιμαστικού σωλήνες. Οι δοκιμαστικοί σωλήνες πωματίστηκαν και τοποθετήθηκαν σε υδατόλουτρο στους 100 o C για 16min ακριβώς. Στη συνέχεια, οι δοκιμαστικοί σωλήνες ψύχθηκαν σε υδατόλουτρο (20 o C) για περίπου 20min. Ακολούθως, σε κάθε δοκιμαστικό σωλήνα προστέθηκαν 5mL αντιδραστηρίου αραίωσης και τέλος μετρήθηκε η απορρόφηση στα 570nm με φασματοφωτόμετρο, αφού πρώτα μηδενίστηκε με το τυφλό διάλυμα. Η συγκέντρωση του δείγματος σε άζωτο ελεύθερων αμινομάδων (FAN) υπολογίστηκε με βάση την ακόλουθη πρότυπη καμπύλη αναφοράς εκφρασμένη σε μg FAN. Γράφημα 2: Καμπύλη αναφοράς αζώτου ελεύθερων αμινομάδων (FAN) με τη μέθοδο νινυδρίνης ~ 43 ~

46 ΕΝΖΥΜΙΚΗ ΥΔΡΟΛΥΣΗ ΞΗΡΟΥ ΣΟΡΓΟΥ Για να μπορέσει να χρησιμοποιηθεί το γλυκό σόργο ως μέσον για την ανάπτυξη της ζύμης L. starkeyi, προηγήθηκε της ανάπτυξης ένα στάδιο ενζυμικής υδρόλυσης (Optimization of ethanol production from high dry matter liquefied dry sweet sorghum stalks Matsakas & Christakopoulos, 2013). Πιο συγκεκριμένα, η διαδικασία πραγματοποιήθηκε σε αρχική συγκέντρωση στερεών 10% w/v και διήρκησε 8 ώρες και 36 λεπτά, ενώ ο όγκος ενζύμων που χρησιμοποιήθηκαν ήταν τέτοιος ώστε να επιτευχθεί ενεργότητα ίση με 8,32 FPU/g στερεού. Για την υδρόλυση χρησιμοποιήθηκαν τα ενζυμικά σκευάσματα της εταιρίας Novozymes, Celluclast 1.5L (από τον μύκητα Trichoderma reesei) και το Novozym 188 (από τον μύκητα Aspergillus niger) σε μίγμα 5:1 v/v. Λόγω του γεγονότος ότι το σκεύασμα Novozym 188 περιέχει και ινβερτάση (0.83 Unit/mg πρωτεΐνης), και για να μην υδρολύσει την σακχαρόζη (αυξάνοντας έτσι την παρεμπόδιση στις κυτταρινάσες) αυτό προστέθηκε με το που ξεκίνησε η ανάπτυξη του οργανισμού. Μετά το πέρας της υδρόλυσης, έγινε η προσθήκη των απαραίτητων θρεπτικών στοιχείων (όπως αυτά αναφέρθηκαν πιο πριν), διορθώθηκε το ph του υποστρώματος στο 6,00 και ακολούθησε αποστείρωση. Μετά την αποπεράτωση της αποστείρωσης (και αφού οι καλλιέργειες αφέθηκαν να κρυώσουν) ακολούθησε εμβολιασμός από προκαλλιέργεια με την ίδια διαδικασία που πραγματοποιούνταν και κατά την ανάπτυξη σε καθαρές πηγές. ~ 44 ~

47 ΣΧΕΔΙΑΣΜΟΣ ΠΕΙΡΑΜΑΤΩΝ Αρχικά πραγματοποιήθηκαν πειράματα με σκοπό να ελεγχθεί η ικανότητα ανάπτυξης και παραγωγής ενδοκυτταρικού λίπους του μικροοργανισμού στα σάκχαρα του γλυκού σόργου (σακχαρόζη, γλυκόζη και φρουκτόζη) και να διαπιστωθεί αν μπορεί να έχει μία ομαλή ανάπτυξη ή αν τυχόν παρουσιάζεται κάποιο πρόβλημα σε κάποιο από αυτά. Συγκεκριμένα πραγματοποιήθηκαν πειράματα με αρχική συγκέντρωση σακχάρων 40g/L για κάθε ένα από τα τρία σάκχαρα ξεχωριστά καθώς και ένα επιπλέον πείραμα με συνδυασμό των τριών παραπάνω σακχάρων στα αντίστοιχα ποσοστά που αυτά βρίσκονται στο σόργο (συγκεκριμένα: 68% σακχαρόζη, 16% γλυκόζη και 16% φρουκτόζη). Στη συνέχεια έγινε έλεγχος της επίδρασης της πηγής αζώτου κρατώντας σταθερές τις υπόλοιπες συνθήκες (την αρχική συγκέντρωση των συνολικών σακχάρων 40g/L και το λόγο άνθρακα / αζώτου ίσο με 100). Συγκεκριμένα διεκπεραιώθηκαν πειράματα τόσο με οργανικές πηγές αζώτου: ουρία, πεπτόνη, yeast extract, όσο και με ανόργανες πηγές: χλωριούχο αμμώνιο (NH4Cl), θειικό αμμώνιο [(NH4)2SO4], όξινο φωσφορικό αμμώνιο [(NH4)2HPO4]. Η πηγή άνθρακα που χρησιμοποιήθηκε ήταν το μίγμα γλυκόζης, φρουκτόζης, σακχαρόζης (mix) με τις αναλογίες που τα τρία αυτά σάκχαρα βρίσκονται στο σόργο. Ακολούθησε ο έλεγχος της επίδρασης του λόγο άνθρακα/αζώτου. Διεξήχθησαν πειράματα με λόγο άνθρακα/αζώτου 130, 160, 190, 220 και 250. Να σημειωθεί ότι για τη μεταβολή του λόγου κάθε φορά μειωνόταν αντίστοιχα η πηγή αζώτου (όπως αυτή επιλέχθηκε από τα προηγούμενα πειράματα), ενώ η πηγή του άνθρακα διατηρούταν σταθερή, συγκεκριμένα στα 40g/L. Ως πηγή αζώτου χρησιμοποιήθηκε το yeast extract που έδωσε τα καλύτερα αποτελέσματα όσον αφορά τη συγκέντρωση ενδοκυτταρικού λίπους σύμφωνα με την προηγούμενα σειρά πειραμάτων. Τέλος, μετά την διερεύνηση των συνθηκών που επηρεάζουν την ανάπτυξη του μικροοργανισμού και την ικανότητα συσσώρευσης ενδοκυτταρικού λίπους, πραγματοποιήθηκε ανάπτυξη του μικροοργανισμού σε γλυκό σόργο, όπου δεν πραγματοποιήθηκε προσθήκη πηγής αζώτου ούτως ώστε να διερευνηθεί η ικανότητα της ζύμης να αξιοποιήσει τις πρωτεΐνες που περιέχονται στο γλυκό σόργο ~ 45 ~

48 ΙΙΙ. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Στόχος της εκπόνησης της παρούσας διπλωματικής εργασίας είναι η μελέτη της βιοφυσιολογικής συμπεριφοράς της ζύμης Lipomyces starkeyi (δηλαδή η κινητική της αύξησής του, η κατανάλωση των σακχαρούχων υποστρωμάτων) καθώς και της ικανότητας βιοσύνθεσης ενδοκυτταρικού λίπους. Ο μικροοργανισμός που επιλέχθηκε έχει τη δυνατότητα να συσσωρεύσει λίπος σε αρκετά υψηλές συγκεντρώσεις, όταν καλλιεργείται κάτω από συνθήκες, οι οποίες ευνοούν την υψηλή συγκέντρωση μικροβιακού λίπους. Πραγματοποιήθηκαν κάποιες σειρές πειραμάτων στις οποίες κάθε φορά μεταβαλλόταν μια συγκεκριμένη παράμετρος (πηγή άνθρακα, πηγή αζώτου, λόγος άνθρακα/αζώτου, αρχική συγκέντρωση σακχάρων), ενώ οι άλλες διατηρούταν σταθερές, ώστε να βρεθούν οι βέλτιστες συνθήκες στις οποίες ο μύκητας θα μπορέσει να αποδώσει τη μεγαλύτερη συγκέντρωση μικροβιακού λίπους. Α. ΠΗΓΗ ΑΝΘΡΑΚΑ Η πρώτη σειρά πειραμάτων αφορούσε την επίδραση της πηγής άνθρακα και συγκεκριμένα ελέγχθηκε αν ο μικροοργανισμός Lipomyces starkeyi μπορούσε να αναπτυχθεί χωρίς πρόβλημα στα σάκχαρα του σόργου, γλυκόζη, φρουκτόζη και σακχαρόζη. Η αρχική συγκέντρωση σακχάρων καθορίστηκε σε όλες τις περιπτώσεις στα 40 g/l, και ο λόγος άνθρακας προς άζωτο ρυθμίστηκε στο 100 με την προσθήκη 0.5 g/l yeast extract και 0.5 g/l θειικού αμμωνίου. Για να υπολογιστούν οι λόγοι άνθρακα και αζώτου που χρησιμοποιήθηκαν τόσο κατά την διάρκεια αυτής της σειράς πειραμάτων, όσο και τον ακόλουθων, υπολογίστηκε η συγκέντρωση τόσο του άνθρακα όσο και του αζώτου στα διάφορα συστατικά που προστέθηκαν. Έτσι, για τα σάκχαρα η συγκέντρωση άνθρακα ήταν 42% στην σακχαρόζη και 40% στην γλυκόζη και την φρουκτόζη. Για τις πηγές αζώτου υπολογίστηκε η καθαρή ποσότητα αζώτου σε 21% στο θειικό αμμώνιο και το όξινο φωσφορικό αμμώνιο, 26% στο χλωριούχο αμμώνιο και 46% στην ουρία. Όσον αφορά τις πιο σύνθετες πηγές αζώτου (πεπτόνη και yeast extract) που περιέχουν και ποσότητα άνθρακα (λόγω της παρουσίας αμινοξέων), η συγκέντρωση ήταν η εξής: η πεπτόνη περιείχε 30% άνθρακα και 14% άζωτο, ενώ το yeast extract 12% άνθρακα και 11% άζωτο. Σε κάθε περίπτωση ο επιθυμητός λόγος άνθρακα προς άζωτο επιτυγχάνονταν με την προσθήκη κατάλληλης ποσότητας πηγής αζώτου. ~ 46 ~

49 Βιομάζα (g/l) Xf (g/l) Λίπος (g/l) σάκχαρα (g/l) Α.1) Καλλιέργεια της ζύμης L. starkeyi σε υπόστρωμα με πηγή άνθρακα τη γλυκόζη (αρχική συγκέντρωση γλυκόζης, S0 glucose = 40g/L) Στο διάγραμμα Α.1 που ακολουθεί παρουσιάζονται η αύξηση της βιομάζας (X), η ελεύθερη λίπους βιομάζα (Xf), η παραγωγή ενδοκυτταρικού λίπους και η κατανάλωση του υποστρώματος τη ζύμη L. starkeyi κατά την ανάπτυξή του σε μέσο καλλιέργειας που περιέχει γλυκόζη 40 g/l ως πηγή άνθρακα. Επίσης, στο διάγραμμα αποτυπώνονται τα σφάλματα των πειραματικών μετρήσεων. Να σημειωθεί ότι όλα τα πειράματα έγιναν διπλά για την ελαχιστοποίηση των σφαλμάτων και για πιο έγκυρα αποτελέσματα. Η ζύμωση ήταν ασυνεχούς τύπου σε ανακινούμενο επωαστήρα, με ανάδευση (200rpm) και σε θερμοκρασία 30 o C, κάτω από αερόβιες συνθήκες. Tο αρχικό ph των καλλιεργειών είχε ρυθμιστεί στο 6,00. Η λήψη των δειγμάτων γινόταν περίπου ανά εικοσιτέσσερις ώρες σε στείρες συνθήκες, μέχρι την κατανάλωση όλων των σακχάρων του υποστρώματος. Γλυκόζη (40g/L) 14,00 45,0 12,00 10,00 40,0 35,0 30,0 8,00 25,0 6,00 20,0 4,00 2,00 15,0 10,0 5,0 0,00 0, Χρόνος (h) Γράφημα A.1: Κινητική της εξέλιξης της βιομάζας ( ), της παραγωγής ενδοκυτταρικού λίπους ( ), της ελεύθερης λίπους βιομάζας ( ) και της κατανάλωσης υποστρώματος ( ) συναρτήσει του χρόνου κατά την καλλιέργεια της ζύμης L. starkeyi σε γλυκόζη, ως μόνη πηγή άνθρακα. ~ 47 ~

50 Από την παραπάνω γραφική παράσταση παρατηρείται ότι ο μικροοργανισμός καταναλώνοντας ως πηγή άνθρακα μόνο γλυκόζη, αρχίζει να παράγει σημαντικά βιομάζα από το δεύτερο εικοσιτετράωρο και μετά. Η αύξησή της με το πέρας του χρόνου φαίνεται να είναι σχεδόν γραμμική, ενώ η μέγιστη παραγωγή βιομάζας είναι 11,66 g/l και πραγματοποιείται περί τις 118 ώρες. Η κατανάλωση του υποστρώματος ξεκινά λίγο μετά τον εμβολιασμό και η εξάντληση της πηγής άνθρακα (διάγραμμα : κατανάλωση σακχάρων), δηλαδή της γλυκόζης ολοκληρώνεται στις 118h, στο χρονικό σημείο που γίνεται και η μεγαλύτερη παραγωγή βιομάζας. Η παραγωγή ενδοκυτταρικού λίπους από τη ζύμη L. starkeyi, καταναλώνοντας ως πηγή άνθρακα τη γλυκόζη, ξεκινά ουσιαστικά μετά τις τρεις ημέρες καλλιέργειας της εν λόγω ζύμης (στις 71h η παραγωγή ενδοκυτταρικού λίπους βρέθηκε 0,84 g/l, ενώ στις 94h ίση με 2,73 g/l) και φτάνει τη μέγιστη τιμή της στις 118h με 5,71 g/l. Η συσσώρευση του ενδοκυτταρικού λίπους ανήλθε στο 49% επί της συνολικής ξηρής βιομάζας. Όσον αφορά την παράμετρο Χf, η οποία αναπαριστά την ελεύθερη λίπους βιομάζα, παρατηρείται ότι αυξάνεται σχεδόν ανάλογα με τη βιομάζα μέχρι την τρίτη ημέρα (71h) και από εκεί και έπειτα παραμένει σταθερή ή έχει μια μικρή ελάττωση, αυτό είναι λογικό καθώς από τις 71h και μετά ξεκινά η μεγαλύτερη παραγωγή ενδοκυτταρικού λίπους. Τέλος, αναφέρονται ενδεικτικά για το τέλος της ζύμωσης, δηλαδή στις 118h, ο συντελεστής παραγωγής βιομάζας YX/S είναι ίσος με 0,30 g/g (δηλαδή παρήχθησαν 0,30g βιομάζας ανά g καταναλωθέντων σακχάρων), ο συντελεστής παραγωγής ελεύθερης λίπους βιομάζας, YXf/S ίσος με 0,15 g/g (δηλαδή 0,15g ελεύθερη λίπους βιομάζα ανά g καταναλωθέντων σακχάρων) και ο συντελεστής απόδοσης λίπους, YL/S 0,15 g/g (δηλαδή 0,15g λίπους ανά g καταναλωθέντων σακχάρων). A.2) Καλλιέργεια της ζύμης L. starkeyi σε υπόστρωμα με πηγή άνθρακα τη φρουκτόζη (αρχική συγκέντρωση φρουκτόζης, S0 fructose = 40g/L) Στο γράφημα Α.2, που απεικονίζεται, ακολούθως παρουσιάζονται η αύξηση της βιομάζας (X), η ελεύθερη λίπους βιομάζα (Xf), η παραγωγή ενδοκυτταρικού λίπους και η κατανάλωση του υποστρώματος της ζύμης L. starkeyi κατά την ανάπτυξή του σε μέσο καλλιέργειας που περιέχει φρουκτόζη 40 g/l ως πηγή άνθρακα. Ακόμη, στο διάγραμμα αποτυπώνονται τα σφάλματα των πειραματικών μετρήσεων. Να σημειωθεί ότι όλα τα πειράματα έγιναν διπλά για την ελαχιστοποίηση των σφαλμάτων και για πιο έγκυρα αποτελέσματα. ~ 48 ~

51 Βιομάζα (g/l) Xf (g/l) Λίπος (g/l) σάκχαρα (g/l) Για την ανάπτυξη του μικροοργανισμού και την παραγωγή λίπους, πραγματοποιήθηκε ασυνεχούς τύπου ζύμωση, σε ανακινούμενο επωαστήρα, με ανάδευση (200rpm) και σε θερμοκρασία 30 o C κάτω από αερόβιες συνθήκες. Το ph των καλλιεργειών ρυθμίστηκε αρχικά στο 6,00. Η λήψη των δειγμάτων γινόταν περίπου ανά εικοσιτέσσερις ώρες σε στείρες συνθήκες, μέχρι την κατανάλωση όλων των σακχάρων του υποστρώματος. Φρουκτόζη (40g/L) 12,00 40,0 10,00 8,00 35,0 30,0 25,0 6,00 20,0 4,00 2,00 0,00 15,0 10,0 5,0 0, Χρόνος (h) Γράφημα A.2: Κινητική της εξέλιξης της βιομάζας ( ), της παραγωγής ενδοκυτταρικού λίπους ( ), της ελεύθερης λίπους βιομάζας ( ) και της κατανάλωσης υποστρώματος ( ) συναρτήσει του χρόνου κατά την καλλιέργεια της ζύμης L. starkeyi σε φρουκτόζη, ως μόνη πηγή άνθρακα. Σύμφωνα με το παραπάνω διάγραμμα είναι εύκολο να γίνει αντιληπτό ότι η παραγωγή βιομάζας ουσιαστικά ξεκινά (όπως και στη γλυκόζη) το δεύτερο εικοσιτετράωρο, ενώ η μέγιστη παραγωγή βιομάζας παρουσιάζεται στις 118h και βρίσκεται ίση με 10,23 g/l. Η κατανάλωση του υποστρώματος ξεκινά λίγο μετά τον εμβολιασμό, ενώ η πηγή άνθρακα, δηλαδή η φρουκτόζη, εξαντλείται μέχρι τις 118h. Όσον αφορά το ενδοκυτταρικό λίπος φαίνεται ότι η παραγωγή του από το μικροοργανισμό καταναλώνοντας ως πηγή άνθρακα τη φρουκτόζη ξεκινά την τρίτη ημέρα (στις 47h η παραγωγή ενδοκυτταρικού λίπους βρέθηκε 0,72 g/l, ενώ στις 71h ίσο με 2,10 g/l), ενώ η μέγιστη συγκέντρωση παράγεται στις 118h και φθάνει τα 4,82 g/l με έναν συντελεστή απόδοσης του παραγόμενου λίπους ίσο με 47,2%. ~ 49 ~

52 Η ελεύθερη λίπους βιομάζα, Χf, παρατηρείται να αυξάνεται σχεδόν ανάλογα με τη βιομάζα μέχρι τη δεύτερη ημέρα (47h), ενώ από εκεί κ έπειτα, καθώς ξεκινά η συσσώρευση λίπους, φαίνεται η αύξηση της να είναι μικρότερη μέχρι τις 118h όπου και παρουσιάζει και μία ελάχιστη πτώση. Ακόμη, αναφέρονται για τις 118h της ζύμωσης ο συντελεστής παραγωγής βιομάζας YX/S ίσος με 0,27g/g, ο συντελεστής παραγωγής ελεύθερης λίπους βιομάζας, YXf/S ίσος με 0,14g/g και ο συντελεστής απόδοσης λίπους, Yl/S 0,13 g/g. A.3) Καλλιέργεια της ζύμης L. starkeyi σε υπόστρωμα με πηγή άνθρακα τη σακχαρόζη (αρχική συγκέντρωση σακχαρόζης, S0 sucrose = 40g/L) Η κινητική της παραγωγής βιομάζας, της κατανάλωσης του υποστρώματος καθώς και της παραγωγής ενδοκυτταρικού λίπους από τη ζύμη L. starkeyi κατά την ανάπτυξή του σε μέσο καλλιέργειας που περιέχει σακχαρόζη 40 g/l ως πηγή άνθρακα παριστάνονται στο γράφημα Α.3 που ακολουθεί. Στο διάγραμμα, ακόμη, αποτυπώνονται τα σφάλματα των πειραματικών μετρήσεων. Να σημειωθεί ότι όλα τα πειράματα έγιναν διπλά για την ελαχιστοποίηση των σφαλμάτων και για πιο έγκυρα αποτελέσματα. Η ζύμωση, που πραγματοποιήθηκε, ήταν ασυνεχούς τύπου, σε ανακινούμενο επωαστήρα με ανάδευση (200rpm) και σε θερμοκρασία 30 o C, κάτω από αερόβιες συνθήκες. Το αρχικό ph των καλλιεργειών είχε ρυθμιστεί στο 6,00. Η λήψη των δειγμάτων γινόταν περίπου ανά εικοσιτέσσερις ώρες σε στείρες συνθήκες, μέχρι την κατανάλωση όλων των σακχάρων του υποστρώματος. Από το γράφημα Α.3 παρατηρείται ότι ο μικροοργανισμός παρουσιάζει σημαντική κυτταρική αύξηση από το πρώτο εικοσιτετράωρο σε αντίθεση με την περίπτωση της γλυκόζης και της φρουκτόζης, καθώς έφτασε στα 3,13 g/l μετά από 24 ώρες καλλιέργειας. Η μέγιστη παραγωγή βιομάζας συμβαίνει στις 117h και είναι 9,35 g/l. Η κατανάλωση του υποστρώματος ξεκινά λίγο μετά τον εμβολιασμό, ενώ όλη η ποσότητα της πηγής άνθρακα καταναλώνεται μέχρι τις 117h. ~ 50 ~

53 Βιομάζα (g/l) Xf (g/l) Λίπος (g/l) σάκχαρα (g/l) Σακχαρόζη (40g/L) 12,00 45,0 10,00 8,00 40,0 35,0 30,0 6,00 25,0 20,0 4,00 15,0 2,00 10,0 5,0 0,00 0, Χρόνος (h) Διάγραμμα Α.3: Κινητική της εξέλιξης της βιομάζας ( ), της παραγωγής ενδοκυτταρικού λίπους ( ), της ελεύθερης λίπους βιομάζας ( ) και της κατανάλωσης υποστρώματος ( ) συναρτήσει του χρόνου κατά την καλλιέργεια της ζύμης L. starkeyi σε σακχαρόζη, ως μόνη πηγή άνθρακα. Η παραγωγή ενδοκυτταρικού λίπους από τη ζύμη L. starkeyi στο υπόστρωμα που χρησιμοποιεί ως πηγή άνθρακα μόνο τη σακχαρόζη φαίνεται να ξεκινά την τρίτη ημέρα, μετά τις 47h και φτάνει στις 118h στη μέγιστη συγκέντρωση, η οποία είναι ίση με 3,72 g/l. Ο συντελεστής απόδοσης για το λίπος που παράχθηκε στο συγκεκριμένο χρονικό σημείο έφθασε το 39,74%, δηλαδή περίπου 0,40 g λίπους ανά g παραγόμενης βιομάζας. Η ελεύθερη λίπους βιομάζα, Xf, φαίνεται να αυξάνεται σταθερά και να ακολουθεί τις αντίστοιχες τιμές που κυμαίνεται και η βιομάζα μέχρι τις πρώτες 47h. Στη συνέχεια, καθώς μεγαλώνει και η παραγωγή ενδοκυτταρικού λίπους, η αύξηση της είναι μειωμένη και στο τελευταίο εικοσιτετράωρο παρατηρείται και μία μικρή ελάττωση. Όσον αφορά τον συντελεστή παραγωγής βιομάζας YX/S ήταν ίσος με 0,24g/g, ο συντελεστής παραγωγής ελεύθερης λίπους βιομάζας, YXf/S ίσος με 0,14g/g και τέλος ο συντελεστής απόδοσης λίπους, Yl/S 0,09g/g. ~ 51 ~

54 A.4) Καλλιέργεια της ζύμης L. starkeyi σε υπόστρωμα με πηγή άνθρακα μίγμα σακχαρόζης, γλυκόζης και φρουκτόζης (αρχική συγκέντρωση συνολικών σακχάρων, S0 mix = 40g/L, So sucrose = 27,25 g/l, So glucose = 6,4g/L, So fructose = 6,4g/L) Η ζύμη L. starkeyi καλλιεργήθηκε σε θρεπτικό μέσο το οποίο περιείχε ένα μίγμα σακχαρόζης, γλυκόζης και φρουκτόζης στην αναλογία την οποία τα τρία αυτά σάκχαρα βρίσκονται στο σόργο. Συγκεκριμένα οι αναλογίες είναι 68%, σακχαρόζη, 16% γλυκόζη και 16% φρουκτόζη και οι αρχικές συγκεντρώσεις των σακχάρων είναι 27,25 g/l, 6,4 g/l και 6,4 g/l αντίστοιχα. Ακολουθεί το γράφημα Α.4, στον οποίο αναπαριστάνονται η αύξηση της βιομάζας (Χ), η ελεύθερη λίπους βιομάζα (Χf), η παραγωγή ενδοκυτταρικού λίπους και η κατανάλωση του υποστρώματος, κατά την ανάπτυξή του στο μέσο καλλιέργειας που προαναφέρθηκε. Ακόμη, στο διάγραμμα αποτυπώνονται τα σφάλματα των πειραματικών μετρήσεων. Να σημειωθεί ότι όλα τα πειράματα έγιναν διπλά για την ελαχιστοποίηση των σφαλμάτων και για πιο έγκυρα αποτελέσματα. Πραγματοποιήθηκε ζύμωση ασυνεχούς τύπου σε ανακινούμενο επωαστήρα, με ανάδευση (200rpm) σε θερμοκρασία 30 o C και κάτω από αερόβιες συνθήκες. Το αρχικό ph των καλλιεργειών ρυθμισμένο στο 6,00. Η λήψη των δειγμάτων γινόταν περίπου ανά εικοσιτέσσερις ώρες σε στείρες συνθήκες, μέχρι την κατανάλωση όλων των σακχάρων του υποστρώματος. Σύμφωνα με το γράφημα φαίνεται η παραγωγή βιομάζας από τον μικροοργανισμό να ξεκινά από τις πρώτες ώρες μετά τον εμβολιασμό της καλλιέργειας και να αυξάνεται με γρήγορο ρυθμό. Η μέγιστη παραγωγή βιομάζας είναι περίπου στις 93h, τη χρονική στιγμή που τελειώνει και η ζύμωση και ανέρχεται τα 10,87 g/l. Η κατανάλωση του υποστρώματος ξεκινά ουσιαστικά μετά το πρώτο εικοσιτετράωρο, ενώ η πλήρης κατανάλωση των σακχάρων ολοκληρώνεται στις 93h, μόλις την τέταρτη ημέρα δηλαδή. Σχετικά με την παραγωγή ενδοκυτταρικού λίπους από τον μικροοργανισμό, καταναλώνοντας το συγκεκριμένο υπόστρωμα, φαίνεται να ξεκινά ουσιαστικά μετά τις 47h ζύμωσης. Η μέγιστη ποσότητα του συσσωρευμένου λίπους λαμβάνεται στις 93h και είναι ίση με 4,49 g/l, ενώ ο συντελεστής απόδοσης λίπους τη χρονική αυτή στιγμή βρίσκεται ίσος με 41,30 %, δηλαδή παράχθηκαν 0,413 g λίπους ανά g βιομάζας. ~ 52 ~

55 Βιομάζα (g/l) Xf (g/l) Λίπος (g/l) σάκχαρα (g/l) Mix (40g/L) 12,00 40,0 10,00 35,0 30,0 8,00 25,0 6,00 20,0 4,00 15,0 10,0 2,00 5,0 0,00 0, Χρόνος (h) Γράφημα A.4: Κινητική της εξέλιξης της βιομάζας ( ), της παραγωγής ενδοκυτταρικού λίπους ( ), της ελεύθερης λίπους βιομάζας ( ) και της κατανάλωσης υποστρώματος ( ) συναρτήσει του χρόνου κατά την καλλιέργεια της ζύμης L. starkeyi σε μίγμα σακχαρόζης, γλυκόζης φρουκτόζης, ως πηγή άνθρακα. Ακόμα, η ελεύθερη λίπους βιομάζα, Χf, παρουσιάζει συνεχή αύξηση (σχεδόν ταυτίζεται με την αύξηση της βιομάζας) μέχρι τις πρώτες 47h, ενώ τις υπόλοιπες ώρες της ζύμωσης παρατηρείται μία σχεδόν στάσιμη φάση, καθώς αρχίζει να λαμβάνει χώρα η συσσώρευση ενδοκυτταρικού λίπους. Τέλος, αναφέρονται ενδεικτικά για τις 93h της ζύμωσης ο συντελεστής παραγωγής βιομάζας YX/S ίσος με 0,30g/g, ο συντελεστής παραγωγής ελεύθερης λίπους βιομάζας, YXf/S ίσος με 0,18g/g και ο συντελεστής απόδοσης λίπους, Yl/S 0,12g/g. ~ 53 ~

56 ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ ΠΡΩΤΗΣ ΣΕΙΡΑΣ ΠΕΙΡΑΜΑΤΩΝ (ΠΗΓΗ ΑΝΘΡΑΚΑ) Ο πίνακας που ακολουθεί παρουσιάζει συνοπτικά τα αποτελέσματα της πρώτης σειράς πειραμάτων που πραγματοποιήθηκαν προκειμένου να διαπιστωθεί αν το σόργο μπορεί να αποτελέσει κατάλληλο υπόστρωμα για την ανάπτυξη και την παραγωγή ενδοκυτταρικού λίπους της ζύμης L. starkeyi. Τα σάκχαρα του σόργου είναι η γλυκόζη, η φρουκτόζη και η σακχαρόζη (η οποία αποτελεί και το μεγαλύτερο κλάσμα) και γι αυτό το λόγο πραγματοποιήθηκαν πειράματα τόσο στο κάθε ένα σάκχαρο ξεχωριστά, όσο και σε ένα μίγμα των τριών σακχάρων στις αναλογίες που αυτά βρίσκονται στο σόργο. Πίνακας Α.1: Συνοπτικός πίνακας των εναπομεινάντων σακχάρων (g/l), της βιομάζας (g/l), του λίπους (g/l), της ελεύθερης λίπους βιομάζας (g/l) και του συντελεστή απόδοσης λίπους (%) για τις πηγές άνθρακα: γλυκόζη, φρουκτόζη, σακχαρόζη και mix κατά την τελευταία ημέρα της ζύμωσης Χρόνος (h) Εναπομείναντα σάκχαρα (g/l) Βιομάζα (g/l) Λίπος (g/l) xf (g/l) % Λίπος ΓΛΥΚΟΖΗ 118 0,1 11,66 5,71 5,95 49,00 ΦΡΟΥΚΤΟΖΗ 118 0,6 10,23 4,82 5,4 47,20 ΣΑΚΧΑΡΟΖΗ 117 0,1 9,35 3,72 5,64 39,74 MIX 93 0,0 10,87 4,49 6,38 41,30 Σύμφωνα με τον παραπάνω πίνακα διαπιστώνεται ότι το μεγαλύτερο ποσοστό συσσώρευσης ενδοκυτταρικού λίπους και μάλιστα σε ποσοστό 49%, παράγεται όταν πηγή άνθρακα στο μέσο καλλιέργειας αποτελεί μόνο η γλυκόζη. Ωστόσο, ο συντελεστής απόδοσης λίπους και στην περίπτωση του μίγματος σακχαρόζης, γλυκόζης και φρουκτόζης (mix) δεν παύει να είναι ιδιαίτερα σημαντικός, αφού βρέθηκε ίσος με 41,30%. Επομένως, όσον αφορά την παραγωγή ενδοκυτταρικού λίπους, το μίγμα των τριών σακχάρων (και επομένως και το σόργο) φαίνεται να αποτελεί κατάλληλο υπόστρωμα για τη ζύμη L. starkeyi. Ακόμα από τη σύγκριση των αποτελεσμάτων διαπιστώνεται ότι η μέγιστη παραγωγή βιομάζας εμφανίζεται όταν στο μέσο καλλιέργειας υπάρχει μόνο γλυκόζη ως πηγή άνθρακα, ενώ ακολουθεί με κάποια μικρή διαφορά το μίγμα σακχάρων και η φρουκτόζη. ~ 54 ~

57 Τέλος παρατηρείται ότι η εξάντληση της πηγής άνθρακα συμβαίνει πρώτα στο υπόστρωμα καλλιέργειας με το μίγμα των σακχάρων (miχ) και συγκεκριμένα στις 93h, ενώ όταν ως πηγή άνθρακα είναι το κάθε σάκχαρο ξεχωριστά η πλήρης εξάντλησή τους συμβαίνει περίπου στις 118h. Όσων αφορά την ημερήσια παραγωγικότητα σε λίπος, αυτή ήταν 1,14 g/l στην περίπτωση της γλυκόζης, μειώθηκες σε 0,96 g/l στην περίπτωση της φρουκτόζης λόγω της μείωσης της συγκέντρωσης του λίπους και περαιτέρω μειώθηκε σε 0,74 g/l στην περίπτωση της σακχαρόζης. Από την άλλη μεριά, λόγω της μείωσης του συνολικού χρόνου καλλιέργειας στην περίπτωση του μείγματος, αν και η παραγωγή λίπους ήταν μικρότερη σε σχέση με την περίπτωση της γλυκόζης, εν τούτοις η παραγωγικότητα ανήλθε στα 1,12 g/l την μέρα. Γράφημα Α.5: Συντελεστές απόδοσης λίπους (% lipid) για τις πηγές άνθρακα: γλυκόζη, φρουκτόζη, σακχαρόζη και mix (μίγμα γλυκόζης, φρουκτόζης και σακχαρόζης) την τελευταία ημέρα της ζύμωσης. ~ 55 ~

58 Β. ΠΗΓΗ ΑΖΩΤΟΥ Η δεύτερη σειρά πειραμάτων αφορούσε την επίδραση της πηγής αζώτου στην ανάπτυξη και ικανότητα συσσώρευσης λίπους από τη ζύμη L. Starkeyi. Για το σκοπό αυτό εξετάστηκαν τόσο οργανικές όσο και ανόργανες πηγές αζώτου. Οι οργανικές πηγές αζώτου που χρησιμοποιήθηκαν ήταν: ουρία, πεπτόνη, και yeast extract, ενώ οι ανόργανες ήταν: χλωριούχο αμμώνιο (NH4Cl), θειικό αμμώνιο ((NH4)2SO4) και όξινο φωσφορικό αμμώνιο (NH4)2HPO4. Ο λόγος άνθρακα/αζώτου ήταν σταθερός σε όλα τα πειράματα και ίσος με 100 και η αρχική συγκέντρωση σακχάρων ήταν και αυτή σταθερή και ίση με 40 g/l. Ως σάκχαρα χρησιμοποιήθηκε το μίγμα σακχαρόζης, γλυκόζης, φρουκτόζης (mix) στις αναλογίες που αναφέρθηκαν και προηγουμένως. Β.1) Καλλιέργεια της ζύμης L. starkeyi σε υπόστρωμα με πηγή αζώτου πεπτόνη (αρχική συγκέντρωση πεπτόνης, Ν0 peptone = 1,148 g/l). Στο διάγραμμα Β.1, που ακολουθεί, παρουσιάζονται η αύξηση της βιομάζας (Χ), η ελεύθερη λίπους βιομάζα (Χf), η παραγωγή ενδοκυτταρικού λίπους και η κατανάλωση του υποστρώματος της ζύμης L. starkeyi κατά την ανάπτυξή του σε μέσο καλλιέργειας που περιέχει ως πηγή αζώτου πεπτόνη (1,148 g/l). Ακόμα στο διάγραμμα αποτυπώνονται τα σφάλματα των πειραματικών μετρήσεων. Να σημειωθεί ότι όλα τα πειράματα έγιναν διπλά για την ελαχιστοποίηση των σφαλμάτων και για πιο έγκυρα αποτελέσματα. Η αρχική συγκέντρωση των σακχάρων (mix) ήταν 40 g/l και ο λόγος C/N ίσος με 100. Η ζύμωση ήταν ασυνεχούς τύπου σε ανακινούμενο επωαστήρα, με ανάδευση (200rpm) και σε θερμοκρασία 30 o C κάτω από αερόβιες συνθήκες, ενώ το αρχικό ph των καλλιεργειών είχε ρυθμιστεί στο 6,00. Η λήψη των δειγμάτων γινόταν περίπου ανά εικοσιτέσσερις ώρες σε στείρες συνθήκες, μέχρι την κατανάλωση όλων των σακχάρων του υποστρώματος. ~ 56 ~

59 Βιομάζα (g/l) Xf (g/l) Λίπος (g/l) σάκχαρα (g/l) Πεπτόνη Χρόνος (h) Διάγραμμα Β.1: Κινητική της εξέλιξης της βιομάζας ( ), της παραγωγής ενδοκυτταρικού λίπους ( ), της ελεύθερης λίπους βιομάζας ( ) και της κατανάλωσης υποστρώματος ( ) συναρτήσει του χρόνου κατά την καλλιέργεια της ζύμης L. starkeyi με πηγή αζώτου πεπτόνη. Σύμφωνα με το διάγραμμα, παρατηρείται ότι ο μικροοργανισμός αναπτύσσεται αρκετά ικανοποιητικά από τις πρώτες ώρες μετά τον εμβολιασμό της καλλιέργειας, ενώ η συνολική κατανάλωση σακχάρων επιτυγχάνεται στις 118h. Η μέγιστη παραγωγή βιομάζας επιτυγχάνεται, αφού έχει καταναλωθεί όλο το υπόστρωμα, στις 118h, και είναι ίση με 11,05 g/l. Ακόμα, από το διάγραμμα φαίνεται ότι η πεπτόνη, ως πηγή αζώτου, δίνει ικανοποιητικά αποτελέσματα όσον αφορά την παραγωγή ενδοκυτταρικού λίπους. Η σύνθεση λίπους από τη ζύμη L. starkeyi φαίνεται να ξεκινά ουσιαστικά στις 47h, ενώ η μέγιστη τιμή της σημειώθηκε στις 118h και έφθασε τα 4,86 g/l. Ο συντελεστής απόδοσης λίπους για το συγκεκριμένο χρονικό σημείο ήταν 44,02%, δηλαδή παράχθηκαν 0,44 g λίπους ανά g βιομάζας. Όσον αφορά την ελεύθερη λίπους βιομάζα, Xf, από το διάγραμμα φαίνεται ότι παρουσιάζει συνεχή αύξηση, παρόμοια με αυτή της βιομάζας μέχρι τις πρώτες 47h, ενώ στη συνέχεια, μετά τις 71h φαίνεται να μένει σχεδόν σταθερή, καθώς αρχίζει να αυξάνεται και η συσσώρευση ενδοκυτταρικού λίπους από το μικροοργανισμό. Τέλος, αναφέρονται ενδεικτικά για τις 118h της ζύμωσης ο συντελεστής παραγωγής βιομάζας YX/S ίσος με 0,29g/g, ο συντελεστής παραγωγής ελεύθερης λίπους βιομάζας, YXf/S ίσος με 0,16 g/g και ο συντελεστής απόδοσης λίπους, Yl/S 0,13g/g. ~ 57 ~

60 Βιομάζα (g/l) Xf (g/l) Λίπος (g/l) σάκχαρα (g/l) Β.2) Καλλιέργεια της ζύμης L. starkeyi σε υπόστρωμα με πηγή αζώτου ουρία (αρχική συγκέντρωση ουρίας, Ν0 urea = 0,348 g/l). Στο διάγραμμα Β.2, που ακολουθεί, παρουσιάζονται η αύξηση της βιομάζας (X), η ελεύθερη λίπους βιομάζα (Xf), η παραγωγή ενδοκυτταρικού λίπους, καθώς και η κατανάλωση του υποστρώματος από τη ζύμη L. starkeyi κατά την ανάπτυξή του σε μέσο καλλιέργειας που περιέχει ως πηγή αζώτου ουρία (0,348 g/l). Στο διάγραμμα επίσης σημειώνονται τα σφάλματα των πειραματικών μετρήσεων. Να σημειωθεί ότι όλα τα πειράματα έγιναν διπλά και η τιμή που παρουσιάζεται αποτελεί το μέσο όρο των δύο μετρήσεων. Η αρχική συγκέντρωση των σακχάρων (mix) ήταν 40 g/l και ο λόγος C/N ίσος με 100. Η ζύμωση ήταν ασυνεχούς τύπου σε ανακινούμενο επωαστήρα, με ανάδευση (200rpm) και σε θερμοκρασία 30 o C κάτω από αερόβιες συνθήκες. Το αρχικό ph των καλλιεργειών είχε ρυθμιστεί στο 6,00. Η λήψη των δειγμάτων γινόταν περίπου ανά εικοσιτέσσερις ώρες σε στείρες συνθήκες, μέχρι την κατανάλωση όλων των σακχάρων του υποστρώματος. Ουρία Χρόνος (h) Διάγραμμα Β.2: Κινητική της εξέλιξης της βιομάζας ( ), της παραγωγής ενδοκυτταρικού λίπους ( ), της ελεύθερης λίπους βιομάζας ( ) και της κατανάλωσης υποστρώματος ( ) συναρτήσει του χρόνου κατά την καλλιέργεια της ζύμης L. starkeyi με πηγή αζώτου ουρία. ~ 58 ~

61 Από το παραπάνω διάγραμμα φαίνεται η κυτταρική αύξηση της ζύμης L. starkeyi να είναι αρκετά ικανοποιητική. Η κατανάλωση των σακχάρων φαίνεται να πραγματοποιείται από τις 95h. Ωστόσο, η χρήση της ουρίας ως πηγή αζώτου δεν έδωσε τόσο καλά αποτελέσματα όσον αφορά την παραγωγή ενδοκυτταρικού λίπους. Πιο συγκεκριμένα από τα πειραματικά αποτελέσματα διαπιστώνεται ότι η παραγωγή βιομάζας ξεκινά μετά το πρώτο εικοσιτετράωρο (μετά τις 23h) και ενώ παρατηρείται μία μεγάλη αύξηση (από 1,19g/L σε 8g/L) μέχρι τις 47h στη συνέχεια η αύξησή της είναι ελάχιστη, καθώς σε αυτό το στάδιο που αναμένονταν η αύξηση της παραγωγής ενδοκυτταρικού λίπους, αυτή πραγματοποιήθηκε με πολύ χαμηλούς ρυθμούς. Η μέγιστη παραγωγή βιομάζας ήταν 9,85g/L περί τις 118h. Στο συγκεκριμένο πείραμα η εν λόγω ζύμη, καταναλώνοντας ως πηγή αζώτου την ουρία, φαίνεται να μην έχει μεγάλες αποδόσεις, όσον αφορά τη συσσώρευση σε ενδοκυτταρικό λίπος. Η παραγωγή λίπους ξεκινά μετά τις 47h, ενώ η μέγιστη συγκέντρωση παράγεται περί τις 118h και είναι 0,99g/L. Ο συντελεστής απόδοσης του παραγόμενου λίπους είναι περίπου ίσος με 10%, ένα αρκετά απογοητευτικό ποσοστό, που δείχνει ότι η ουρία δεν αποτελεί μια καλή επιλογή για το συγκεκριμένο μικροοργανισμό στην παραγωγή ενδοκυτταρικού λίπους. Τέλος, η ελεύθερη λίπους βιομάζα, Χf, ακολουθεί την ίδια πορεία με τη βιομάζα μέχρι τις πρώτες 47h, ενώ στη συνέχεια, καθώς αρχίζει η συσσώρευση λίπους μένει σχεδόν σταθερή μέχρι τις 118h. Για μια πιο ολοκληρωμένη παρουσίαση των αποτελεσμάτων αναφέρονται και οι παρακάτω συντελεστές, οι οποίοι απευθύνονται στις 118h ζύμωσης. Ο συντελεστής παραγωγής βιομάζας YX/S 0,25g/g, ο συντελεστής παραγωγής ελεύθερης λίπους βιομάζας, YXf/S ίσος με 0,23g/g και ο συντελεστής απόδοσης λίπους, Yl/S 0,03g/g. Β.3) Καλλιέργεια της ζύμης L. starkeyi σε υπόστρωμα με πηγή αζώτου yeast extract (αρχική συγκέντρωση yeast extract, Ν0 yeast = 1,460 g/l). Στο παρακάτω διάγραμμα Β.3, απεικονίζονται η αύξηση της βιομάζας (X), η ελεύθερη λίπους βιομάζα (Xf), η παραγωγή ενδοκυτταρικού λίπους και η κατανάλωση του υποστρώματος από το ζύμη L. starkeyi κατά την ανάπτυξή του σε μέσο καλλιέργειας που περιέχει ως πηγή αζώτου yeast extract (1,460 g/l). Στο διάγραμμα επίσης σημειώνονται τα σφάλματα των πειραματικών μετρήσεων. Να σημειωθεί ότι όλα τα πειράματα έγιναν διπλά και η τιμή που παρουσιάζεται αποτελεί το μέσο όρο των δύο μετρήσεων. ~ 59 ~

62 Βιομάζα (g/l) Xf (g/l) Λίπος (g/l) σάκχαρα (g/l) Η αρχική συγκέντρωση των σακχάρων (mix) ήταν 40 g/l και ο λόγος C/N ίσος με 100. Πραγματοποιήθηκε ζύμωση ασυνεχούς τύπου σε ανακινούμενο επωαστήρα με ανάδευση (200rpm), σε θερμοκρασία 30 o C κάτω από αερόβιες συνθήκες. Το αρχικό ph των καλλιεργειών είχε ρυθμιστεί στο 6,00. Η λήψη των δειγμάτων γινόταν περίπου ανά εικοσιτέσσερις ώρες σε στείρες συνθήκες, μέχρι την κατανάλωση όλων των σακχάρων του υποστρώματος. Yeast extract Χρόνος (h) Διάγραμμα Β.3: Κινητική της εξέλιξης της βιομάζας ( ), της παραγωγής ενδοκυτταρικού λίπους ( ), της ελεύθερης λίπους βιομάζας ( ) και της κατανάλωσης υποστρώματος ( ) συναρτήσει του χρόνου κατά την καλλιέργεια της ζύμης L. starkeyi με πηγή αζώτου yeast extract. Σύμφωνα με το γράφημα, παρατηρείται ότι ο μικροοργανισμός αναπτύσσεται αρκετά ικανοποιητικά παρουσία yeast extract. Η κατανάλωση των σακχάρων ξεκινά λίγες ώρες μετά τον εμβολιασμό, ενώ όλη η ποσότητα της πηγής άνθρακα ολοκληρώνεται στις 118h. Το δεύτερο εικοσιτετράωρο (από τις 22h μέχρι τις 46h) φαίνεται ότι ο μικροοργανισμός έχει μια στάσιμη φάση όσον αφορά την κατανάλωση των σακχάρων, αλλά στη συνέχεια η κατανάλωση συνεχίζεται με γρήγορο ρυθμό. Η παραγωγή βιομάζας ξεκινά ουσιαστικά μετά τις πρώτες 22h και φθάνει περί τις 118h τη μέγιστη παραγωγή ίση με 11,98 g/l. ~ 60 ~

63 Ακόμη, από το παραπάνω γράφημα φαίνεται ότι η παραγωγή ενδοκυτταρικού λίπους από την εν λόγω ζύμη χρησιμοποιώντας yeast extract ως πηγή αζώτου είναι ιδιαίτερα σημαντική. Αν και η ουσιαστική συσσώρευση λίπους ξεκινά μετά τις 70h, μέχρι τις 118h, όπου και ολοκληρώνεται η κυτταρική αύξηση της ζύμης, φθάνει τη μέγιστη τιμή της 5,23 g/l. Ο συντελεστής απόδοσης του παραγόμενου λίπους για τις 118h είναι 43,7%, δηλαδή 0,44 g λίπους ανά g παραγόμενης βιομάζας. Τόσο η μέγιστη τιμής της παραγωγής λίπους, όσο και ο συντελεστής απόδοσης λίπους δεικνύουν ότι το yeast extract αποτελεί μία κατάλληλη πηγή αζώτου για το L. starkeyi όσον αφορά την παραγωγή ενδοκυτταρικού λίπους. Η παράμετρος Xf (g/l), η οποία αποτελεί την ελεύθερη λίπους βιομάζα, φαίνεται να αυξάνεται ανάλογα με την αύξηση της βιομάζας μέχρι τις 70h, ακολουθεί μια στάσιμη φάση που ακολουθείται με μια πολύ μικρή αύξηση, ενώ η βιομάζα συνεχίζει να αυξάνεται με σχεδόν σταθερό ρυθμό, όμως τη χρονική στιγμή αυτή ξεκινά και η μεγαλύτερη παραγωγή λίπους. Επιπρόσθετα, ενδεικτικά αναφέρονται για το τέλος της ζύμωσης, δηλαδή περί τις 118h, ο συντελεστής απόδοσης βιομάζας ήταν 0,31 g/g, ο συντελεστής απόδοσης ελεύθερης λίπους βιομάζας ήταν 0,17 g/g, ενώ ο συντελεστής απόδοσης λίπους ήταν 0,14 g/g. Τέλος, μπορεί να γίνει μια επισήμανση που αφορά το ph των καλλιεργειών. Αρχικά το ph ρυθμίζεται στο 6,00, χρησιμοποιώντας όμως ως πηγή αζώτου το yeast extract παρατηρείται μια μεγάλη πτώση του ph, το οποίο φθάνει στις δύο τελευταίες ημέρες τις ζύμωσης, δηλαδή μετά τις 94h στο 3,60 περίπου. Η μείωση αυτή μπορεί να οφείλεται στην ύπαρξη διαφόρων οργανικών οξέων που παράγονται κατά τη διαδικασία της ζύμωσης. Ωστόσο, αυτό φαίνεται να μην επηρεάζει ούτε την παραγωγή βιομάζας, η οποία συνεχίζει αρκετά ικανοποιητικά μέχρι το τέλος της ζύμωσης, αλλά ούτε και την παραγωγή ενδοκυτταρικού λίπους, η οποία φθάνει μάλιστα και σε αρκετά μεγάλες τιμές. Β.4) Καλλιέργεια της ζύμης L. starkeyi σε υπόστρωμα με πηγή αζώτου χλωριούχο αμμώνιο, ΝΗ4Cl (αρχική συγκέντρωση NH4Cl, Ν0 NH4Cl = 0,620 g/l). Στο γράφημα Β.4, που ακολουθεί, παρουσιάζονται η αύξηση της βιομάζας, η ελεύθερη λίπους βιομάζα, η παραγωγή ενδοκυτταρικού λίπους και η κατανάλωση του υποστρώματος από τη ζύμη L. starkeyi κατά την ανάπτυξή του σε μέσο καλλιέργειας που περιέχει ως πηγή αζώτου χλωριούχο αμμώνιο (0,620 g/l). Ακόμα στο διάγραμμα σημειώνονται τα σφάλματα των πειραματικών μετρήσεων. Να σημειωθεί ότι όλα τα πειράματα έγιναν διπλά και η τιμή που παρουσιάζεται αποτελεί το μέσο όρο των δύο μετρήσεων. Η αρχική συγκέντρωση των σακχάρων (mix) ήταν 40 g/l και ο λόγος C/N ίσος με 100. ~ 61 ~

64 Βιομάζα (g/l) Xf (g/l) Λίπος (g/l) σάκχαρα (g/l) Η ζύμωση ήταν ασυνεχούς τύπου σε ανακινούμενο επωαστήρα με ανάδευση (200rpm) και σε θερμοκρασία 30 o C κάτω από αερόβιες συνθήκες, ενώ το αρχικό ph των καλλιεργειών είχε ρυθμιστεί στο 6,00. Η λήψη των δειγμάτων γινόταν περίπου ανά εικοσιτέσσερις ώρες σε στείρες συνθήκες, μέχρι την κατανάλωση όλων των σακχάρων του υποστρώματος. NH4Cl Χρόνος (h) Διάγραμμα Β.4: Κινητική της εξέλιξης της βιομάζας ( ), της παραγωγής ενδοκυτταρικού λίπους ( ), της ελεύθερης λίπους βιομάζας ( ) και της κατανάλωσης υποστρώματος ( ) συναρτήσει του χρόνου κατά την καλλιέργεια της ζύμης L. starkeyi με πηγή αζώτου ΝΗ4Cl. Η καλλιέργεια της ζύμης σε θρεπτικό υλικό που περιείχε ως πηγή αζώτου το χλωριούχο αμμώνιο φαίνεται, σύμφωνα με το διάγραμμα, να έδωσε ικανοποιητικά αποτελέσματα όσον αφορά στην κυτταρική ανάπτυξη και την παραγωγή βιομάζας, σε αντίθεση με την παραγωγή ενδοκυτταρικού λίπους που εκεί φαίνεται να υστερεί αρκετά. Πιο συγκεκριμένα, η κατανάλωση των σακχάρων φαίνεται να ξεκινά λίγες ώρες μετά τον εμβολιασμό του υποστρώματος και ολοκληρώνεται στις 118h. Η παραγωγή βιομάζας ξεκινά μετά τις πρώτες 22h, αρχίζει να αυξάνεται έντονα μέχρι τις 94h (από 0,65g/L το πρώτο εικοσιτετράωρο φθάνει τα 13,63g/L την τέταρτη ημέρα ζύμωσης), ενώ μέχρι το τέλος της ζύμωσης η αύξηση της συνεχίζεται αλλά σε πολύ μικρότερο βαθμό. Η μέγιστη παραγωγή βιομάζας επιτυγχάνεται περί τις 118h και ήταν 14,23 g/l. ~ 62 ~

65 Σχετικά με την παραγωγή ενδοκυτταρικού λίπους, η μέγιστη συσσώρευση έφθασε μόλις τα 2,64 g/l με έναν συντελεστή απόδοσης 18,53% και σημειώθηκε τη χρονική στιγμή, όπου παρατηρείται και η μέγιστη παραγωγή βιομάζας, δηλαδή στις 118h. Ο συντελεστής απόδοσης λίπους φαίνεται να μην είναι αρκετά ικανοποιητικός, πράγμα που δείχνει ότι το χλωριούχο αμμώνιο ως πηγή αζώτου δεν μπορεί να αξιοποιηθεί σωστά από την εν λόγω ζύμη όσον αφορά την παραγωγή ενδοκυτταρικού λίπους. Η βιομάζα ελεύθερη λίπους, Χf, εμφανίζει συνεχής αύξηση από τις 22h μέχρι και της 70h, λόγω της σημαντικής παραγωγής της βιομάζας. Από τις 70h και μετά παραμένει στάσιμη και στη συνέχεια εμφανίζει μια πολύ μικρή μείωση, εξ αιτίας της παραγωγής ενδοκυτταρικού λίπους το χρονικό αυτό διάστημα. Μια σημαντική παρατήρηση κατά την διεξαγωγή αυτού του πειράματος είναι η σημαντική παραγωγή βιομάζας ελεύθερης λίπους. Φαίνεται ότι η παρουσία χλωριούχου αμμωνίου, κατεύθυνε τον μεταβολισμό στην παραγωγή βιομάζας, παρά στην παραγωγή λίπους. Ακόμα για την πιο ολοκληρωμένη παρουσίαση των αποτελεσμάτων αναφέρονται ενδεικτικά για τις 118h της ζύμωσης ο συντελεστής παραγωγής βιομάζας YX/S ίσος με 0,29g/g, ο συντελεστής παραγωγής ελεύθερης λίπους βιομάζας, YXf/S ίσος με 0,16g/g και ο συντελεστής απόδοσης λίπους, Yl/S 0,13g/g. Β.5) Καλλιέργεια της ζύμης L. starkeyi σε υπόστρωμα με πηγή αζώτου θειικό αμμώνιο, (NH4)2SO4 (αρχική συγκέντρωση (NH4)2SO4, N0 (NH4)2SO4 = 0,770 g/l) Στο διάγραμμα Β.5 απεικονίζονται η αύξηση της βιομάζας (Χ), η ελεύθερη λίπους βιομάζα (Χf), η παραγωγή ενδοκυτταρικού λίπους και η κατανάλωση του υποστρώματος από τη ζύμη L. starkeyi όταν αυτή αναπτύχθηκε σε θρεπτικό μέσο το οποίο περιείχε ως πηγή αζώτου θειικό αμμώνιο, (NH4)2SO4 (0,770 g/l). Ακόμα, στη γραφική αποτυπώνονται τα σφάλματα των πειραματικών μετρήσεων. Όλα τα πειράματα που πραγματοποιήθηκαν ήταν διπλά και η τιμή που παρουσιάζεται αποτελεί το μέσο όρο των δύο μετρήσεων. Η αρχική συγκέντρωση των σακχάρων (mix) ήταν 40 g/l και ο λόγος C/N ίσος με 100. Πραγματοποιήθηκε ζύμωση ασυνεχούς τύπου σε ανακινούμενο επωαστήρα με ανάδευση (200rpm) και σε θερμοκρασία 30 o C κάτω από αερόβιες συνθήκες. Το αρχικό ph των καλλιεργειών είχε ρυθμιστεί στο 6,00. Η λήψη των δειγμάτων γινόταν περίπου ανά εικοσιτέσσερις ώρες σε στείρες συνθήκες, μέχρι την κατανάλωση όλων των σακχάρων του υποστρώματος. ~ 63 ~

66 Βιομάζα (g/l) Xf (g/l) Λίπος (g/l) σάκχαρα (g/l) (NH4)2SO Χρόνος (h) Διάγραμμα Β.5: Κινητική της εξέλιξης της βιομάζας ( ), της παραγωγής ενδοκυτταρικού λίπους ( ), της ελεύθερης λίπους βιομάζας ( ) και της κατανάλωσης υποστρώματος ( ) συναρτήσει του χρόνου κατά την καλλιέργεια της ζύμης L. starkeyi με πηγή αζώτου (ΝΗ4)2SO4. Με βάση το παραπάνω διάγραμμα, φαίνεται ότι ο μικροοργανισμός καταναλώνοντας ως πηγή αζώτου το θειικό αμμώνιο, δεν έδωσε ικανοποιητική ποσότητα βιομάζας, αλλά και η απόδοση σε ενδοκυτταρικό λίπος ήταν μικρή. Η κατανάλωση του θρεπτικού μέσου ξεκινά λίγες ώρες μετά τον εμβολιασμό, ενώ τα σάκχαρα φαίνεται να καταναλώνονται πλήρως στις 97h, αρκετά γρήγορα δηλαδή. Η παραγωγή βιομάζας ξεκινά από τις πρώτες ώρες μετά τον εμβολιασμό και μέχρι τις 72h αυξάνεται με γρήγορο ρυθμό. Στη συνέχεια και μέχρι το τέλος της ζύμωσης (97h) φαίνεται ότι σταθεροποιείται, καθώς η ζύμη εισέρχεται στη στατική φάση ανάπτυξής του. Η μέγιστη παραγωγή βιομάζας περί τις 97h ήταν 8,97g/L. Μια όχι και τόσο ικανοποιητική τιμή σε σχέση και με τα προηγούμενα πειράματα. Όσον αφορά την παραγωγή ενδοκυτταρικού λίπους, φαίνεται η εν λόγω ζύμη να αρχίζει να συσσωρεύει λίπος από τις 47h και μετά, ωστόσο η μέγιστη συσσώρευση ήταν μόλις 1,35 g/l. Ο συντελεστής απόδοσης 15,01%, δηλαδή 0,15g λίπους ανά g παραγόμενης βιομάζας, περί τις 97h είναι αρκετά μικρός, με αποτέλεσμα το θειικό αμμώνιο να μην αποτελεί μια καλή πηγή αζώτου για τη ζύμη. ~ 64 ~

67 Η ελεύθερη λίπους βιομάζα, Χf, συμβαδίζει με την αύξηση της παραγωγής βιομάζας μέχρι και τις 47h, ενώ από τη χρονική στιγμή αυτή και μετά συνεχίζει να αυξάνεται αλλά με πιο αργό ρυθμό μέχρι που σταθεροποιείται, καθώς σταθεροποιείται και η παραγωγή βιομάζας. Από το διάγραμμα φαίνεται να αρχίζει η στατική φάση ανάπτυξης του μικροοργανισμού μετά τις 72h, καθώς η κυτταρική του ανάπτυξη αρχίζει και μένει σταθερή. Αναφέρονται ενδεικτικά για τις 97h της ζύμωσης ο συντελεστής παραγωγής βιομάζας YX/S ίσος με 0,23g/g, ο συντελεστής παραγωγής ελεύθερης λίπους βιομάζας, YXf/S ίσος με 0,20g/g και ο συντελεστής απόδοσης λίπους, Yl/S 0,03g/g. Θα μπορούσε και εδώ, όπως και στην περίπτωση της χρήσης yeast extract ως πηγή αζώτου, να γίνει μία επισήμανση σχετικά με το ph. Το ph των καλλιεργειών με πηγή αζώτου το θειικό αμμώνιο φαίνεται να έπεσε αρκετά χαμηλά από τις 47h της ζύμωσης, αρκετά νωρίς δηλαδή. Το αρχικό ph του υποστρώματος είχε ρυθμιστεί στο 6,00, ενώ στις 47h μετρήθηκε ίσο με 3,39 και στο τέλος της ζύμωσης (97h) ίσο με 3,11. Η μείωση μπορεί να οφείλεται στην παραγωγή οργανικών οξέων κατά τη διαδικασία της ζύμωσης. Η μικρή παραγωγή βιομάζας, καθώς και η πολύ μικρή συσσώρευση ενδοκυτταρικού λίπους είναι πιθανόν να οφείλονται και στο ότι ο μικροοργανισμός κατεύθυνε τον μεταβολισμό του προς την παραγωγή οργανικών οξέων αντί για τη βιοσύνθεση λίπους. Β.6) Καλλιέργεια της ζύμης L. starkeyi σε υπόστρωμα με πηγή αζώτου όξινο φωσφορικό αμμώνιο, (NH4)2HPO4 (αρχική συγκέντρωση (NH4)2HPO4, N0 (NH4)2HPO4 = 0,770 g/l). Η κινητική της παραγωγής βιομάζας (X), η ελεύθερη λίπους βιομάζα (Xf), η παραγωγή ενδοκυτταρικού λίπους, καθώς και η κατανάλωση του υποστρώματος από τη ζύμη L. starkeyi κατά την ανάπτυξή του σε μέσο καλλιέργειας που περιέχει όξινο φωσφορικό αμμώνιο, (NH4)2HPO4, παρουσιάζονται στο διάγραμμα Β.6, που ακολουθεί. Στο διάγραμμα ακόμα αποτυπώνονται τα σφάλματα των πειραματικών μετρήσεων Όλα τα πειράματα έγιναν διπλά και η τιμή που παρουσιάζεται αποτελεί το μέσο όρο των δύο μετρήσεων. Η αρχική συγκέντρωση των σακχάρων (mix) ήταν 40 g/l και ο λόγος C/N ίσος με 100. Η ζύμωση που πραγματοποιήθηκε ήταν ασυνεχούς τύπου σε ανακινούμενο επωαστήρα με ανάδευση (200rpm), σε θερμοκρασία 30 o C κάτω από αερόβιες συνθήκες. Το αρχικό ph των καλλιεργειών είχε ρυθμιστεί στο 6,00. Η λήψη των δειγμάτων γινόταν περίπου ανά εικοσιτέσσερις ώρες σε στείρες συνθήκες, μέχρι την κατανάλωση όλων των σακχάρων του υποστρώματος. ~ 65 ~

68 Βιομάζα (g/l) Xf (g/l) Λίπος (g/l) σάκχαρα (g/l) (NH4)2HPO Χρόνος (h) Διάγραμμα Β.6: Κινητική της εξέλιξης της βιομάζας ( ), της παραγωγής ενδοκυτταρικού λίπους ( ), της ελεύθερης λίπους βιομάζας ( ) και της κατανάλωσης υποστρώματος ( ) συναρτήσει του χρόνου κατά την καλλιέργεια της ζύμης L. starkeyi με πηγή αζώτου (ΝΗ4)2HPO4. Σύμφωνα με τα πειραματικά αποτελέσματα, όπως διαπιστώνεται από το παραπάνω γράφημα, η ζύμη L. starkeyi καταναλώνοντας όξινο φωσφορικό αμμώνιο ως πηγή αζώτου, ενώ δείχνει να παράγει αρκετή ποσότητα βιομάζας μέχρι το τέλος της ζύμωσης, τα αποτελέσματα όσον αφορά τη συσσώρευση ενδοκυτταρικού λίπους είναι αρκετά μέτρια. Συγκεκριμένα, η κατανάλωση των σακχάρων, που ξεκινά αμέσως μετά τον εμβολιασμό, ολοκληρώνεται αρκετά γρήγορα, όπως και στην περίπτωση του θειικού αμμωνίου, στις 97h. Η παραγωγή βιομάζας ξεκινά μετά το πρώτο εικοσιτετράωρο, ακολουθεί μια έντονη αύξηση τη δεύτερη και την τρίτη ημέρα, ενώ μετά τις 72h η αύξηση της μετριάζεται και η παραγωγή της φαίνεται να αρχίζει να σταθεροποιείται. Η μέγιστη παραγωγή επιτυγχάνεται με το τέλος της ζύμωσης, περί τις 97h και ήταν 11,93 g/l. Όσον αφορά τη συσσώρευση ενδοκυτταρικού λίπους, έφθασε τα 2,17g/L τη χρονική στιγμή που παρατηρήθηκε και η μέγιστη παραγωγή βιομάζας, δηλαδή περί τις 97h. Η παραγωγή λίπους ξεκίνησε μετά τις 47h, ενώ δεν κατάφερε να φθάσει υψηλές τιμές. Ο συντελεστής απόδοσης λίπους στις 97h βρέθηκε ίσος με 18,17% (δηλαδή 0,182 g λίπους ανά g παραγόμενης βιομάζας) ήταν αρκετά χαμηλός. Από τα αποτελέσματα φαίνεται ότι το (ΝΗ4)2HPO4 δεν αποτελεί κατάλληλη πηγή αζώτου για το συγκεκριμένο μικροοργανισμό σχετικά με την παραγωγή λίπους. ~ 66 ~

69 Η ελεύθερη λίπους βιομάζα, Χf, φαίνεται από το διάγραμμα να έχει κοινή πορεία με την παραγωγή βιομάζας μέχρι τις 72h, ενώ το τελευταίο εικοσιτετράωρο της ζύμωσης παραμένει σταθερή, καθώς στο χρονικό αυτό διάστημα επιτυγχάνεται η έστω και μικρή παραγωγή ενδοκυτταρικού λίπους. Για την πιο ολοκληρωμένη εικόνα της πειραματικής μελέτης αναφέρονται ενδεικτικά για τις 97h της ζύμωσης ο συντελεστής παραγωγής βιομάζας YΧ/S ίσος με 0,30g/g, ο συντελεστής παραγωγής ελεύθερης λίπους βιομάζας, YXf/S ίσος με 0,25g/g και ο συντελεστής απόδοσης λίπους, Yl/S με 0,06g/g. Τέλος και στην περίπτωση του όξινου φωσφορικού αμμωνίου ως πηγή αζώτου, παρατηρείται αρκετά μεγάλη πτώση του ph. Στις 47h ζύμωσης το ph των καλλιεργειών είχε πέσει στο 3,47, ενώ μέχρι το τέλος της ζύμωσης, στις 97h, το ph μετρήθηκε ίσο με 3,18. Όπως και όταν χρησιμοποιήθηκε το θειικό αμμώνιο ως πηγή αζώτου έτσι και στο παρόν πείραμα οι αποδόσεις σε βιομάζα και ενδοκυτταρικού λίπους δεν ήταν ικανοποιητικές και αυτό ίσως να οφείλεται στη μεγάλη μείωση του ph. Η ζύμη L. starkeyi γνωρίζουμε ότι μπορεί να αναπτυχθεί σωστά σε περιοχές ph κοντά στο 6,00 και γι αυτό το ph κοντά στο 3,00 ίσως να μη το βοήθησαν στην παραγωγή βιομάζας και λίπους. ~ 67 ~

70 ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ ΔΕΥΤΕΡΗΣ ΣΕΙΡΑΣ ΠΕΙΡΑΜΑΤΩΝ (ΠΗΓΗ ΑΖΩΤΟΥ) Στη συνέχεια ακολουθεί ο πίνακας Β.1, ο οποίος παρουσιάζει συνοπτικά τα αποτελέσματα της δεύτερης σειράς πειραμάτων που αφορούσαν την πηγή αζώτου που μπορεί να χρησιμοποιηθεί ώστε η ζύμη Lipomyces starkeyi να έχει τις καλύτερες αποδόσεις όσον αφορά την παραγωγή ενδοκυτταρικού λίπους. Πίνακας Β.1: Συνοπτικός πίνακας των καταναλωθέντων σακχάρων (g/l), της βιομάζας (g/l), του λίπους (g/l), της ελεύθερης λίπους βιομάζας (g/l) και του συντελεστή απόδοσης λίπους(%) για τις οργανικές πηγές αζώτου: πεπτόνη, ουρία και yeast extract και τις ανόργανες πηγές αζώτου: χλωριούχο αμμώνιο (NH4Cl), θεϊικό αμμώνιο ((NH4)2SO4) και όξινο φωσφορικό αμμώνιο (NH4)2HPO4. Όλες οι τιμές αναφέρονται στην τελευταία ημέρα της ζύμωσης. Χρόνος (h) Εναπομείναντα Σάκχαρα (g/l) Βιομάζα (g/l) Λίπος (g/l) xf (g/l) % Λίπος Οργανικές πηγές: ΠΕΠΤΟΝΗ 118 0,09 11,05 4,86 6,19 44,02 ΟΥΡΙΑ 118 0,00 9,85 0,98 8,86 10,02 YEAST 118 0,10 11,98 5,23 6,75 43,70 Ανόργανες πηγές: NH 4Cl 118 0,24 14,23 2,64 11,60 18,53 (NH 4) 2SO ,34 8,97 1,35 7,62 15,06 (NH 4) 2HPO ,00 11,93 2,17 9,76 18,17 Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της δεύτερης σειράς πειραμάτων, φαίνεται γενικά οι οργανικές πηγές αζώτου να δίνουν καλύτερα αποτελέσματα κυρίως στη συσσώρευση ενδοκυτταρικού λίπους. Από τις οργανικές πηγές αζώτου, η πεπτόνη και το yeast extract έδωσαν πολύ ικανοποιητικές αποδόσεις, καθώς παρουσιάζουν, 44,02% και 43,70% αντίστοιχα, απόδοση σε λίπος. Η μέγιστη παραγωγή βιομάζας για το yeast extract, ως πηγή αζώτου, ήταν σχεδόν 12 g/l, ενώ για την πεπτόνη σχεδόν 11 g/l, ενώ οι αντίστοιχες συγκεντρώσεις λίπους ήταν 5,23 g/l και 4,86g/L. ~ 68 ~

71 πηγές αζώου Επομένως, και το yeast extract και η πεπτόνη φαίνεται να αποτελούν δύο πολύ καλές επιλογές ως πηγή αζώτου για τη ζύμη L. starkeyi όσον αφορά τη συσσώρευση ενδοκυτταρικού λίπους. Η ουρία από την άλλη μεριά, φαίνεται να μην αποτελεί καλή επιλογή, καθώς τα αποτελέσματα της συσσώρευσης ενδοκυτταρικού λίπους είναι πολύ μέτρια. Η μέγιστη παραγωγή βιομάζας ήταν 11,85 g/l, ενώ η συσσώρευση ενδοκυτταρικού λίπους μόλις 0,98 g/l. Να σημειωθεί ότι η ουρία είχε την πιο χαμηλή απόδοση σε λίπος από όλες τις πηγές αζώτου που χρησιμοποιήθηκαν, τόσο οργανικές όσο και ανόργανες, και η οποία ανερχόταν μόλις στο 10%, δηλαδή 10g λίπους ανά g παραγόμενης βιομάζας. Σχετικά με τις ανόργανες πηγές αζώτου, οι αποδόσεις σε ενδοκυτταρικό λίπος και για τις τρεις πηγές που χρησιμοποιήθηκαν ήταν σχετικά χαμηλές, με το χλωριούχο αμμώνιο και το όξινο φωσφορικό αμμώνιο γύρω στο 18,2 με 18,5%, ενώ το θειικό αμμώνιο στο 15%. Η μέγιστη παραγωγή βιομάζας όταν χρησιμοποιήθηκε χλωριούχο αμμώνιο ήταν ιδιαίτερα υψηλή, 14,23 g/l, σε αντίθεση με το θειικό αμμώνιο που έφθασε μόλις περίπου τα 9 g/l. Τέλος, θα μπορούσε ακόμα να παρατηρηθεί ότι στην περίπτωση του θειικού αμμωνίου και του όξινου φωσφορικού αμμωνίου, ως πηγές αζώτου, η ζύμωση τελείωσε αρκετά γρήγορα, στις 97h. Μάλιστα στο (NH4)2HPO4 φαίνεται ότι αυτό δεν είχε κανένα αντίκτυπο στην παραγωγή βιομάζας, αφού ήταν σε γενικές γραμμές ικανοποιητική. 18,17 15,06 18,53 43,7 10,02 44, % lipid (NH4)2HPO4 (ΝΗ4)2SO4 NH4Cl yeast extract Ουρία πεπτόνη Διάγραμμα Β.7: Συντελεστές απόδοσης λίπους (% lipid) για τις πηγές αζώτου: πεπτόνη, ουρία, yeast extract, χλωριούχο αμμώνιο (NH4Cl), θεϊικό αμμώνιο ((NH4)2SO4) και όξινο φωσφορικό αμμώνιο (NH4)2HPO4 την τελευταία ημέρα της ζύμωσης. ~ 69 ~

72 Από όλα τα παραπάνω γίνεται σαφές, ότι η ζύμη L. starkeyi παρουσιάζει υψηλή ικανότητα βιοσύνθεσης ενδοκυτταρικού λίπους, όταν το παρεχόμενο άζωτο ήταν με τη μορφή αμινοξέων (πεπτόνη και yeast extract). Το γεγονός αυτό είναι ιδιαίτερα σημαντικό, καθώς σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν να αναπτυχθεί ο μικροοργανισμός σε ρευστοποιημένο ξηρό σόργο όπου υπάρχει σημαντική πιθανότητα να υπάρχουν πρωτεΐνες, οι οποίες θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν και ως πηγή αζώτου. Επιπλέον, μπορεί να παρατηρηθεί, ότι στην περίπτωση παρουσίας αζώτου με άλλες μορφές (πχ αμμωνιακή μορφή), η ζύμη κατεύθυνε τον μεταβολισμό της προς την βιοσύνθεση βιομάζας, η οποία έφτασε στην μέγιστη τιμή της όταν χρησιμοποιήθηκε χλωριούχο αμμώνιο ,86 5,23 4 lipid (g/l) 3 2 0,98 2,64 1,35 2, πηγές αζώτου πεπτόνη ουρία yeast extract NH4Cl (NH4)2SO4 (NH4)2HPO4 Διάγραμμα Β.8: Παραγωγή ενδοκυτταρικού λίπους (g/l) για τις πηγές αζώτου: πεπτόνη, ουρία, yeast extract, χλωριούχο αμμώνιο (NH4Cl), θειικό αμμώνιο ((NH4)2SO4) και όξινο φωσφορικό αμμώνιο (NH4)2HPO4 την τελευταία ημέρα της ζύμωσης. ~ 70 ~

73 Γ. ΛΟΓΟΣ ΑΝΘΡΑΚΑ ΑΖΩΤΟΥ (C/N) Στην τρίτη σειρά πειραμάτων έγινε έλεγχος για να βρεθεί η επίδραση του λόγου άνθρακα/αζώτου στην ανάπτυξη και ικανότητα βιοσύνθεσης ενδοκυτταρικού λίπους από τη ζύμη L. Starkeyi. Γενικά, σύμφωνα με διάφορες πειραματικές μελέτες, είναι γνωστό ότι η παραγωγή λίπους ευνοείται σε υψηλούς λόγους άνθρακα/αζώτου. Τα πειράματα που διεξήχθηκαν είχαν λόγο άνθρακα/αζώτου 130, 160, 190, 220 και τέλος 250. Για την αύξηση του λόγου C/N η συγκέντρωση της πηγής άνθρακα παρέμενε σταθερή, ενώ μειωνόταν αντίστοιχα η πηγή αζώτου. Ως πηγή αζώτου χρησιμοποιήθηκε το yeast extract, το οποίο σύμφωνα με την προηγούμενη σειρά πειραμάτων, έδωσε τα πιο ικανοποιητικά αποτελέσματα, όσον αφορά την παραγωγή ενδοκυτταρικού λίπους, αλλά και την παραγωγή βιομάζας. Η αρχική συγκέντρωση σακχάρων ήταν σταθερή και ίση με 40 g/l. Ως σάκχαρα χρησιμοποιήθηκε το μίγμα σακχαρόζης, γλυκόζης, φρουκτόζης (mix) στις αναλογίες που τα τρία αυτά σάκχαρα βρίσκονται στο σόργο (δηλαδή 68% σακχαρόζη, 16% γλυκόζη και 16% φρουκτόζη). Γ.1) Καλλιέργεια της ζύμης L. starkeyi σε υπόστρωμα με πηγή αζώτου yeast extract και λόγο άνθρακα/άζωτο:130 (αρχική συγκέντρωση yeast extract, Ν0 yeast =1,17 g/l). H κινητική της παραγωγής βιομάζας (Χ), η ελεύθερη λίπους βιομάζα (Χf), η παραγωγή ενδοκυτταρικού λίπους και η κατανάλωση υποστρώματος από τη ζύμη L. starkeyi κατά την ανάπτυξή του σε μέσο καλλιέργειας που έχει λόγο C/N 130 παρουσιάζονται στο γράφημα Γ.1 που ακολουθεί. Ακόμη, στο γράφημα αποτυπώνονται τα σφάλματα των πειραματικών μετρήσεων. Όλα τα πειράματα έγιναν διπλά και η τιμή που παρουσιάζεται αποτελεί το μέσο όρο των δύο μετρήσεων. Η αρχική συγκέντρωση των σακχάρων (mix) ήταν 40 g/l, ενώ ως πηγή αζώτου χρησιμοποιήθηκε το yeast extract. H αρχική συγκέντρωση του yeast extract, προκειμένου να επιτευχθεί ο λόγος C/N 130, ήταν 1,17 g/l. Πραγματοποιήθηκε ζύμωση ασυνεχούς τύπου σε ανακινούμενο επωαστήρα με ανάδευση (200rpm) και σε θερμοκρασία 30 o C κάτω από αερόβιες συνθήκες. Το αρχικό ph των καλλιεργειών είχε ρυθμιστεί στο 6,00. Η λήψη των δειγμάτων γινόταν περίπου ανά εικοσιτέσσερις ώρες σε στείρες συνθήκες, μέχρι την κατανάλωση όλων των σακχάρων του υποστρώματος. ~ 71 ~

74 Βιομάζα (g/l) Xf (g/l) Λίπος (g/l) σάκχαρα (g/l) C/N : Χρόνος (h) Διάγραμμα Γ.1: Κινητική της εξέλιξης της βιομάζας ( ), της παραγωγής ενδοκυτταρικού λίπους ( ), της ελεύθερης λίπους βιομάζας ( ) και της κατανάλωσης υποστρώματος ( ) συναρτήσει του χρόνου κατά την καλλιέργεια της ζύμης L. starkeyi με πηγή αζώτου το yeast extract και λόγο C/N 130. Παρατηρώντας το γράφημα φαίνεται η ανάπτυξη της ζύμης L. starkeyi να είναι ικανοποιητική σε λόγο C/N 130. Συγκεκριμένα η κατανάλωση των σακχάρων, ξεκινά αρκετά έντονα το δεύτερο εικοσιτετράωρο μετά τον εμβολιασμό, ενώ όλη η ποσότητα της πηγής άνθρακα εξαντλείται στις 115h. Η παραγωγή βιομάζας, φαίνεται να ξεκινά επίσης μετά τις πρώτες 20h (στις 20h ήταν 0,49g/L, ενώ στις 43h έφθασε τα 3,58g/L), η αύξηση της συνεχίζει μέχρι και τις 91h, ενώ στη συνέχεια φαίνεται να σταθεροποιείται. Η μέγιστη παραγωγή βιομάζας πραγματοποιείται περί τις 115h και είναι 11,60g/L. Σχετικά με τη παραγωγή ενδοκυτταρικού λίπους φαίνεται να είναι αρκετά ικανοποιητική. Από τις 67h της ζύμωσης και μέχρι τις 91h παρουσιάζει μια μεγάλη αύξηση, από 0,74g/L φθάνει τα 4,58g/L, ενώ η μέγιστη συσσώρευση ενδοκυτταρικού λίπους συμβαίνει περί τις 115h, στο τέλος της ζύμωσης δηλαδή, και είναι ίση με 5,25 g/l. Ο συντελεστής απόδοσης για το χρονικό αυτό σημείο είναι 45,24%, περίπου 45g λίπους ανά g παραγόμενης βιομάζας. ~ 72 ~

75 Όσον αφορά την παράμετρο Χf, δηλαδή την βιομάζα ελεύθερη λίπους, από το γράφημα φαίνεται να έχει κοινή πορεία με την παραγωγή βιομάζας μέχρι τις πρώτες 43h, καθώς η συσσώρευση ενδοκυτταρικού λίπους είναι ελάχιστη. Στη συνέχεια η αύξησή της μειώνεται σταδιακά (συμπίπτει με το χρονικό διάστημα που συμβαίνει και η μεγαλύτερη παραγωγή ενδοκυτταρικού λίπους) και από τις 91h της ζύμωσης και μετά σταθεροποιείται. Για μια πιο ολοκληρωμένη εικόνα των αποτελεσμάτων αναφέρονται οι συντελεστές απόδοσης παραγωγής βιομάζας YX/S ίσος με 0,2g/g, ο συντελεστής παραγωγής ελεύθερης λίπους βιομάζας, YXf/S ίσος με 0,16g/g και τέλος ο συντελεστής απόδοσης λίπους, Yl/S ίσος με 0,13g/g. Γ.2) Καλλιέργεια της ζύμης L. starkeyi σε υπόστρωμα με πηγή αζώτου yeast extract και λόγο άνθρακα/άζωτο:160 (αρχική συγκέντρωση yeast extract, Ν0 yeast = 0,95 g/l) Στο διάγραμμα Γ.2 παρουσιάζονται η κινητική της παραγωγής βιομάζας (Χ), η ελεύθερη λίπους βιομάζα (Χf), η παραγωγή ενδοκυτταρικού λίπους και η κατανάλωση υποστρώματος από τη ζύμη L. starkeyi κατά την ανάπτυξή του σε μέσο καλλιέργειας που έχει λόγο C/N 160. Στο διάγραμμα που ακολουθεί αποτυπώνονται επίσης τα σφάλματα των πειραματικών μετρήσεων. Όλα τα πειράματα έγιναν διπλά και η τιμή που παρουσιάζεται αποτελεί το μέσο όρο των δύο μετρήσεων. Η αρχική συγκέντρωση των σακχάρων (mix) ήταν 40 g/l, ενώ ως πηγή αζώτου χρησιμοποιήθηκε το yeast extract. Συγκεκριμένα για να επιτευχθεί ο λόγος C/N 160, η αρχική συγκέντρωση του yeast ήταν 0,95g/L. Η ζύμωση που πραγματοποιήθηκε ήταν ασυνεχούς τύπου σε ανακινούμενο επωαστήρα με ανάδευση (200rpm) και σε θερμοκρασία 30 o C κάτω από αερόβιες συνθήκες. Το αρχικό ph των καλλιεργειών είχε ρυθμιστεί στο 6,00. Η λήψη των δειγμάτων γινόταν περίπου ανά εικοσιτέσσερις ώρες σε στείρες συνθήκες, μέχρι την κατανάλωση όλων των σακχάρων του υποστρώματος. ~ 73 ~

76 Βιομάζα (g/l) Xf (g/l) Λίπος (g/l) σάκχαρα (g/l) C/N : Χρόνος (h) Διάγραμμα Γ.2: Κινητική της εξέλιξης της βιομάζας ( ), της παραγωγής ενδοκυτταρικού λίπους ( ), της ελεύθερης λίπους βιομάζας ( ) και της κατανάλωσης υποστρώματος ( ) συναρτήσει του χρόνου κατά την καλλιέργεια της ζύμης L. starkeyi με πηγή αζώτου το yeast extract και λόγο C/N 160. Σύμφωνα με το παραπάνω διάγραμμα φαίνεται ότι η εν λόγω ζύμη καταναλώνοντας yeast extract ως πηγή αζώτου σε λόγο C/N 160 να δίνει αρκετά ικανοποιητικά αποτελέσματα όσον αφορά την παραγωγή ενδοκυτταρικού λίπους, ενώ στην παραγόμενη βιομάζα τα αποτελέσματα είναι κάπως μέτρια. Η κατανάλωση των σακχάρων, ξεκινά λίγες ώρες μετά τον εμβολιασμό, ενώ όλη η ποσότητα της πηγής άνθρακα εξαντλείται μέχρι τις 95h. Σχετικά με την παραγωγή βιομάζας, φαίνεται να ξεκινά μετά τις πρώτες 22h, ενώ η μέγιστη παραγωγή συμβαίνει περί τις 95h και είναι 11,18g/L. Ακόμα, από το γράφημα παρατηρείται ότι το τελευταίο εικοσιτετράωρο της ζύμωσης, δηλαδή μέχρι τις 119h, η κυτταρική αύξηση του μύκητα μειώνεται ελάχιστα. Αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι η ζύμη μετά την εξάντληση των σακχάρων, χρησιμοποίησε το ενδοκυτταρικό λίπος ως πηγή άνθρακα. Η συσσώρευση ενδοκυτταρικού λίπους είναι αρκετά ικανοποιητική με έναν συντελεστή απόδοσης για τις 95h ζύμωσης ίσο με 46,68% (0,47g λίπους ανά g βιομάζας) και μέγιστη παραγωγή 5,22g/L για την ίδια χρονική στιγμή. Συγκεκριμένα, η παραγωγή λίπους ξεκινά μετά την τρίτη ημέρα, αλλά αυξάνεται με πολύ γρήγορο ρυθμό (στις 69h η παραγωγή λίπους ήταν 0,81g/L και στις 95h έφθασε τα 5,22g/L). Στο τέλος της ζύμωσης, περί τις 119h, η παραγωγή λίπους έχει μία μικρή μείωση, όπως φαίνεται και από το γράφημα. ~ 74 ~

77 Όπως και στην παραγωγή βιομάζας, η οποία μειώνεται το τελευταίο εικοσιτετράωρο της ζύμωσης, έτσι και στην παραγωγή ενδοκυτταρικού λίπους η μείωση αυτή οφείλεται στην στάσιμη φάση του αυξητικού κύκλου του μικροοργανισμού. Όσον αφορά την βιομάζα ελεύθερη λίπους (Χf) σύμφωνα με το διάγραμμα εμφανίζει συνεχή αύξηση μετά τις πρώτες 22h και μέχρι τις 69h, λόγω της σημαντικής παραγωγής βιομάζας και της μικρής συσσώρευσης ενδοκυτταρικού λίπους. Μετά τις 69h, καθώς αυξάνεται η παραγωγή λίπους η παράμετρος xf μένει σταθερή μέχρι και το τέλος της ζύμωσης. Τέλος, αναφέρονται οι συντελεστές απόδοσης παραγωγής βιομάζας YX/S 0,24g/g, ο συντελεστής παραγωγής ελεύθερης λίπους βιομάζας, YXf/S 0,13g/g και ο συντελεστής απόδοσης λίπους, Yl/S 0,10g/g. Γ.3) Καλλιέργεια της ζύμης L. starkeyi σε υπόστρωμα με πηγή αζώτου yeast extract και λόγο άνθρακα/άζωτο:190 (αρχική συγκέντρωση yeast extract, N0 yeast = 0,80 g/l). Η κινητική της παραγωγής βιομάζας (X), η ελεύθερη λίπους βιομάζα (Xf), η παραγωγή ενδοκυτταρικού λίπους και η κατανάλωση υποστρώματος από τη ζύμη L. starkeyi κατά την ανάπτυξή του σε μέσο καλλιέργειας που έχει λόγο C/N 190 παρουσιάζονται στο γράφημα Γ.3 που ακολουθεί παρακάτω. Ακόμα, στο διάγραμμα αποτυπώνονται τα σφάλματα των πειραματικών μετρήσεων. Όλα τα πειράματα έγιναν διπλά και η τιμή που παρουσιάζεται αποτελεί το μέσο όρο των δύο μετρήσεων. Η αρχική συγκέντρωση των σακχάρων (mix) ήταν 40 g/l, ενώ ως πηγή αζώτου χρησιμοποιήθηκε το yeast extract. Συγκεκριμένα για να επιτευχθεί ο λόγος C/N 190, η αρχική συγκέντρωση του yeast extract ήταν 0,80 g/l. Η ζύμωση που πραγματοποιήθηκε ήταν ασυνεχούς τύπου σε ανακινούμενο επωαστήρα, με ανάδευση (200rpm), σε θερμοκρασία 30 o C κάτω από αερόβιες συνθήκες, ενώ το αρχικό ph των καλλιεργειών είχε ρυθμιστεί στο 6,00. Η λήψη των δειγμάτων γινόταν περίπου ανά εικοσιτέσσερις ώρες σε στείρες συνθήκες, μέχρι την κατανάλωση όλων των σακχάρων του υποστρώματος. ~ 75 ~

78 Βιομάζα (g/l) Xf (g/l) Λίπος (g/l) σάκχαρα (g/l) C/N : Χρόνος (h) Διάγραμμα Γ.3: Κινητική της εξέλιξης της βιομάζας ( ), της παραγωγής ενδοκυτταρικού λίπους ( ), της ελεύθερης λίπους βιομάζας ( ) και της κατανάλωσης υποστρώματος ( ) συναρτήσει του χρόνου κατά την καλλιέργεια της ζύμης L. starkeyi με πηγή αζώτου το yeast extract και λόγο C/N 190. Από το παραπάνω γράφημα φαίνεται ότι η ζύμη L. starkeyi, καταναλώνοντας yeast extract ως πηγή αζώτου με λόγο C/N 190, να εμφανίζει ικανοποιητική κυτταρική αύξηση και αξιόλογη παραγωγή ενδοκυτταρικού λίπους. Πιο συγκεκριμένα, η κατανάλωση του θρεπτικού μέσου ξεκινά λίγες ώρες μετά τον εμβολιασμό και τα σάκχαρα καταναλώνονται πλήρως στις 119h της ζύμωσης. Η παραγωγή βιομάζας ξεκινά από τις 22h και μετά, καθώς η ζύμη περνά στην εκθετική φάση ανάπτυξής του. Η μέγιστη παραγωγή βιομάζας ανέρχεται στα 12,28g/L περί τις 119h και συμπίπτει με το τέλος της ζύμωσης. Ακόμα, σύμφωνα με το διάγραμμα, μπορεί να παρατηρηθεί ότι ενώ η παραγωγή βιομάζας αυξάνεται έντονα τη δεύτερη, τρίτη και τέταρτη ημέρα ζύμωσης (λήψη δειγμάτων στις 47h, 69h και στις 95h), την πέμπτη και τελευταία ημέρα φαίνεται να αρχίζει να σταθεροποιείται, καθώς είναι και η τελευταία ημέρα της ζύμωσης και σχεδόν όλα τα σάκχαρα έχουν καταναλωθεί από τη ζύμη. Η συσσώρευση ενδοκυτταρικού λίπους ξεκινά μετά τις 47h, ενώ φαίνεται ο λόγος C/N 190 να είναι πολύ ικανοποιητικός για τον εν λόγω μικροοργανισμό στην απόδοση λίπους, καθώς στο τέλος της ζύμωσης (119h) η παραγωγή λίπους φθάνει τα 5,81g/L. Ο συντελεστής απόδοσης για το συγκεκριμένο χρονικό σημείο είναι 47,33%, δηλαδή παράγονται περίπου 0,47g λίπους ανά g παραγόμενης βιομάζας. ~ 76 ~

79 Η βιομάζα ελεύθερη λίπους (Χf) φαίνεται από το γράφημα να εμφανίζει παράλληλη αύξηση με την παραγωγή βιομάζας μέχρι τις πρώτες 47h τις ζύμωσης. Από το χρονικό σημείο αυτό, καθώς αρχίζει η συσσώρευση ενδοκυτταρικού λίπους, η αύξηση της παραμέτρου Χf αρχίζει να περιορίζεται και στη συνέχεια, καθώς ακολουθεί και η στάσιμη παραγωγή βιομάζας η ελεύθερη λίπους βιομάζας αρχίζει να σταθεροποιείται. Ακόμη, ενδεικτικά αναφέρονται ο συντελεστές απόδοσης παραγωγής βιομάζας YΧ/S 0,28g/g, ο συντελεστής παραγωγής ελεύθερης λίπους βιομάζας, YXf/S 0,15g/g και τέλος ο συντελεστής απόδοσης λίπους, Yl/S 0,13g/g. Γ.4) Καλλιέργεια της ζύμης L. starkeyi σε υπόστρωμα με πηγή αζώτου yeast extract και λόγο άνθρακα/άζωτο:220 (αρχική συγκέντρωση yeast extract, N0 yeast = 0,69 g/l). Στο διάγραμμα Γ.4, που ακολουθεί, παρουσιάζονται η κινητική της παραγωγής βιομάζας (X), η ελεύθερη λίπους βιομάζα (Xf), η παραγωγή ενδοκυτταρικού λίπους και η κατανάλωση υποστρώματος από τη ζύμη L. starkeyi κατά την ανάπτυξή του σε μέσο καλλιέργειας που έχει λόγο C/N 220. Επίσης, αποτυπώνονται στο γράφημα τα σφάλματα των πειραματικών μετρήσεων. Όλα τα πειράματα έγιναν διπλά και η τιμή που παρουσιάζεται αποτελεί το μέσο όρο των δύο μετρήσεων. Η αρχική συγκέντρωση των σακχάρων (mix) ήταν 40 g/l, ενώ ως πηγή αζώτου χρησιμοποιήθηκε το yeast extract. Συγκεκριμένα για να επιτευχθεί ο λόγος C/N 220, η αρχική συγκέντρωση του yeast ήταν 0,69g/L. Η ζύμωση που πραγματοποιήθηκε ήταν ασυνεχούς τύπου, σε ανακινούμενο επωαστήρα με ανάδευση (200rpm) και σε θερμοκρασία 30 o C κάτω από αερόβιες συνθήκες. Το αρχικό ph των καλλιεργειών είχε ρυθμιστεί στο 6,00. Η λήψη των δειγμάτων γινόταν περίπου ανά εικοσιτέσσερις ώρες σε στείρες συνθήκες, μέχρι την κατανάλωση όλων των σακχάρων του υποστρώματος. Παρατηρώντας το γράφημα, φαίνεται ότι η κατανάλωση του θρεπτικού υλικού ξεκινά αμέσως μετά τον εμβολιασμό των καλλιεργειών. Η κατανάλωση των σακχάρων ολοκληρώνεται περί τις 138h, ενώ μπορεί να σημειωθεί ότι σε αυτήν την περίπτωση η ζύμωση διήρκησε περισσότερες ώρες. ~ 77 ~

80 Βιομάζα (g/l) Xf (g/l) Λίπος (g/l) σάκχαρα (g/l) C/N : Χρόνος (h) Διάγραμμα Γ.4: Κινητική της εξέλιξης της βιομάζας ( ), της παραγωγής ενδοκυτταρικού λίπους ( ), της ελεύθερης λίπους βιομάζας ( ) και της κατανάλωσης υποστρώματος ( ) συναρτήσει του χρόνου κατά την καλλιέργεια της ζύμης L. starkeyi με πηγή αζώτου το yeast extract και λόγο C/N 220. Η παραγωγή βιομάζας αρχίζει μετά τις 21h ζύμωσης, ενώ αυξάνεται με γρήγορο ρυθμό μέχρι και τις 92h. Τις επόμενες δύο ημέρες (δείγματα στις 115h και 138h) συνεχίζει να αυξάνεται, αλλά σαφώς με μικρότερο ρυθμό, όπως διαπιστώνεται και από την κλίση της στο διάγραμμα Γ.4. Η ζύμη φαίνεται να εισέρχεται στη στάσιμη φάση του αυξητικού της κύκλου. Η μέγιστη παραγωγή βιομάζας είναι 11,74 g/l περί τις 138h, δηλαδή στο τέλος της ζύμωσης. Επομένως, η εν λόγω ζύμη χρησιμοποιώντας υπόστρωμα με λόγο C/N 220 φαίνεται να εμφανίζει ικανοποιητική κυτταρική ανάπτυξη. Όσον αφορά τη συσσώρευση ενδοκυτταρικού λίπους, τα αποτελέσματα είναι ικανοποιητικά, καθώς η μέγιστη παραγωγή λίπους ήταν 5,34 g/l στο τέλος της ζύμωσης (138h), μια αρκετά υψηλή τιμή. Πιο αναλυτικά, η παραγωγή λίπους αρχίζει ουσιαστικά μετά τις 45h (στις 45h η παραγωγή λίπους ανερχόταν στα 0,22g/L και στις 69h έφθασε τα 1,40g/L) και συνεχίζει να αυξάνεται μέχρι και το τέλος της ζύμωσης, τις δύο τελευταίες ημέρες της ζύμωσης με λίγο πιο αργούς ρυθμούς. Ο συντελεστής απόδοσης του ενδοκυτταρικού λίπους για τις 138h ανέρχεται στο 45,50%, δηλαδή 0,46g λίπους ανά g παραγόμενης βιομάζας. ~ 78 ~

81 Η παράμετρος Χf, που αναπαριστά την ελεύθερη λίπους βιομάζα, σχεδόν ταυτίζεται με την παραγωγή βιομάζας μέχρι τις πρώτες 45h ζύμωσης, καθώς η παραγωγή ενδοκυτταρικού λίπους είναι ελάχιστη. Στη συνέχεια και μέχρι τις 92h συνεχίζει να αυξάνεται, αλλά σαφώς με πολύ αργότερο ρυθμό, άλλωστε τους χρόνους αυτούς υπάρχει και μεγάλη παραγωγή λίπους, ενώ το τελευταίο εικοσιτετράωρο η ελεύθερη λίπους βιομάζα φαίνεται να μένει σχεδόν σταθερή. Ακόμη, για μια πιο ολοκληρωμένη εικόνα, αναφέρονται οι εξής συντελεστές: ο συντελεστής απόδοσης παραγωγής βιομάζας YΧ/S ίσος με 0,28g/g, ο συντελεστής παραγωγής ελεύθερης λίπους βιομάζας, YXf/S ίσος με 0,15g/g και τέλος ο συντελεστής απόδοσης λίπους, Yl/S ίσος με 0,13g/g. Γ.5) Καλλιέργεια της ζύμης L. starkeyi σε υπόστρωμα με πηγή αζώτου yeast extract και λόγο άνθρακα/άζωτο:250 (αρχική συγκέντρωση yeast extract, N0 yeast = 0,605 g/l). Η κινητική της παραγωγής βιομάζας (X), η ελεύθερη λίπους βιομάζα (Xf), η παραγωγή ενδοκυτταρικού λίπους, καθώς και η κατανάλωση υποστρώματος από της ζύμης L. starkeyi κατά την ανάπτυξή του σε μέσο καλλιέργειας που έχει λόγο C/N 250 αναπαριστάνονται στο διάγραμμα Γ.5 που ακολουθεί. Επιπλέον, στο διάγραμμα αποτυπώνονται τα σφάλματα των πειραματικών μετρήσεων. Όλα τα πειράματα έγιναν διπλά και η τιμή που παρουσιάζεται αποτελεί το μέσο όρο των δύο μετρήσεων. Η αρχική συγκέντρωση των σακχάρων (mix) ήταν 40 g/l, ενώ ως πηγή αζώτου χρησιμοποιήθηκε το yeast extract. Συγκεκριμένα για να επιτευχθεί ο λόγος C/N 250, η αρχική συγκέντρωση του yeast ήταν 0,605g/L. Η ζύμωση που πραγματοποιήθηκε ήταν ασυνεχούς τύπου σε ανακινούμενο επωαστήρα, με ανάδευση (200rpm) και σε θερμοκρασία 30 o C κάτω από αερόβιες συνθήκες, ενώ το αρχικό ph των καλλιεργειών είχε ρυθμιστεί στο 6,00. Η λήψη των δειγμάτων γινόταν περίπου ανά εικοσιτέσσερις ώρες σε στείρες συνθήκες, μέχρι την κατανάλωση όλων των σακχάρων του υποστρώματος. ~ 79 ~

82 Βιομάζα (g/l) Xf (g/l) Λίπος (g/l) σάκχαρα (g/l) C/N : Χρόνος (h) Διάγραμμα Γ.5: Κινητική της εξέλιξης της βιομάζας ( ), της παραγωγής ενδοκυτταρικού λίπους ( ), της ελεύθερης λίπους βιομάζας ( ) και της κατανάλωσης υποστρώματος ( ) συναρτήσει του χρόνου κατά την καλλιέργεια της ζύμης L. starkeyi με πηγή αζώτου το yeast extract και λόγο C/N 250. Η κατανάλωση των σακχάρων φαίνεται, από το γράφημα, να αρχίζει λίγες ώρες μετά τον εμβολιασμό, ενώ όλη η ποσότητα της πηγής άνθρακα εξαντλείται μέχρι τις 118h. Ακόμη, σύμφωνα με ο διάγραμμα Γ.5 η ζύμη φαίνεται να παρουσιάζει σημαντική κυτταρική αύξηση με μέγιστη παραγωγή βιομάζας 10,54g/L περί τις 138h. Πιο αναλυτικά, η παραγωγή βιομάζας αρχίζει από τις πρώτες ώρες μετά τον εμβολιασμό των καλλιεργειών, παρουσιάζει μια αρκετά μεγάλη αύξηση μέχρι και τις 115h, ενώ την τελευταία ημέρα της ζύμωσης η παραγωγή βιομάζας αρχίζει να σταθεροποιείται, καθώς η ζύμη εισέρχεται στη στάσιμη φάση ανάπτυξης της. Όσον αφορά την παραγωγή ενδοκυτταρικού λίπους, κατά την ανάπτυξη της ζύμης σε υπόστρωμα με λόγο C/N 250, είναι και εδώ ικανοποιητικά τα αποτελέσματα. Συγκεκριμένα, η συσσώρευση λίπους ξεκινά μετά τις πρώτες 21h, αυξάνεται με πολύ αργό ρυθμός μέχρι τις 92h, αλλά το επόμενο εικοσιτετράωρο παρατηρείται μια θεαματική αύξηση (στις 92h η παραγωγή λίπους ήταν 0,93 g/l, ενώ στις 115h έφθασε τα 2,07g/L). Η παραγωγή ενδοκυτταρικού λίπους έχει μέγιστη τιμή 4,61g/L στις 138h, δηλαδή στο τέλος της ζύμωσης. Ο συντελεστής απόδοσης λίπους για τη συγκεκριμένη χρονική στιγμή ανέρχεται στο 43,72% (0,44g λίπους ανά g παραγόμενης βιομάζας). ~ 80 ~

83 Επίσης στο γράφημα απεικονίζεται η ελεύθερη λίπους βιομάζα, Χf. Ταυτόχρονα με τη συσσώρευση ενδοκυτταρικού λίπους, η οποία μέχρι και τις 92h της ζύμωσης είναι αρκετά μικρή, η εν λόγω ζύμη εμφανίζει σημαντική κυτταρική αύξηση με αποτέλεσμα η παράμετρος Χf να αυξάνεται. Από τις 92h και μετά αρχίζει απότομα μεγάλη παραγωγή λίπους με αποτέλεσμα η Χf να παραμένει σταθερή μέχρι και το τέλος της ζύμωσης. Τέλος, αναφέρονται ενδεικτικά οι συντελεστές απόδοσης παραγωγής βιομάζας YX/S 0,25g/g, ο συντελεστής παραγωγής ελεύθερης λίπους βιομάζας, YXf/S 0,14g/g και ο συντελεστής απόδοσης λίπους, Yl/S 0,11g/g. ~ 81 ~

84 ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ ΤΡΙΤΗΣ ΣΕΙΡΑΣ ΠΕΙΡΑΜΑΤΩΝ (ΛΟΓΟΣ ΑΝΘΡΑΚΑ/ΑΖΩΤΟ) Ακολουθεί ο πίνακας Γ.1, στον οποίο παρουσιάζονται συνοπτικά τα αποτελέσματα της τρίτης σειράς πειραμάτων, σχετικά με τον βέλτιστο λόγο C/N στον οποίο μπορεί να αναπτυχθεί σωστά η ζύμη L. starkeyi και να έχει τις καλύτερες αποδόσεις στην παραγωγή βιομάζας και κυρίως στη συσσώρευση ενδοκυτταρικού λίπους. Πίνακας Γ.1: Συνοπτικός πίνακας των εναπομεινάντων σακχάρων (g/l), της βιομάζας (g/l), του λίπους (g/l), της ελεύθερης λίπους βιομάζας (g/l) και του συντελεστή απόδοσης λίπους (%) για λόγους C/N: 100, 130, 160, 190, 220 και 250, χρησιμοποιώντας yeast extract ως πηγή αζώτου. Όλες οι τιμές αναφέρονται στην ημέρα της ζύμωσης που παρουσιάστηκαν οι μεγαλύτερες αποδόσεις σε λίπος. Χρόνος (h) Εναπομείναντα Σάκχαρα (g/l) Βιομάζα (g/l) Λίπος (g/l) Xf (g/l) % Λίπος C/N: ,10 11,98 5,23 6,75 43,70 C/N: ,13 11,60 5,25 6,35 45,24 C/N: ,59 11,18 5,22 5,96 46,68 C/N: ,54 12,28 5,81 6,47 47,33 C/N: ,41 11,74 5,34 6,40 45,50 C/N: ,46 10,54 4,89 5,93 43,72 Όπως φαίνεται και από τον παραπάνω πίνακα, με την αύξηση του λόγου C/N, παρατηρείται μια σταδιακή αύξηση της % συγκέντρωσης του ενδοκυτταρικού λίπους σε σχέση με την συνολική ξηρή βιομάζα, έως της τιμής C/N 190. Από εκεί και έπειτα με την αύξηση της αναλογίας του άνθρακα, παρατηρείται μια μικρή μείωση της % συγκέντρωσης λίπους. Όσον αφορά το παραγόμενο λίπος εκφρασμένο σε g/l (το οποίο αποτελεί και το ζητούμενο για την παραλαβή υψηλής ποσότητας λίπους), αυτό παραμένει σχετικά σταθερό στην αρχή και μόνο στην περίπτωση του λόγου C/N ίσο με 190, παρατηρείται μια αύξηση. Περαιτέρω αύξηση του λόγου C/N σε 220 οδηγεί σε μείωση της συγκέντρωσης του λίπους σε 5,34 g/l (συγκέντρωση η οποία είναι μεγαλύτερα από αυτήν που αποκτήθηκε σε λόγο ίσο με 100). Τέλος, αύξηση του λόγου C/N σε 250, οδήγησε σε σημαντική μείωση της συγκέντρωσης του ενδοκυτταρικού λίπους, η οποία ανήλθε σε 4,89g/L. ~ 82 ~

85 %lipid Από τα παραπάνω γίνεται φανερό, ότι η αύξηση του λόγου C/N, οδήγησε σε μια μικρή αύξηση της % συγκέντρωσης του λίπους (από 43,7% σε λόγο 100, ανήλθε στο 47,33% σε λόγο 190), καθώς και σε μια μικρή αύξηση της συγκέντρωσης του παραγόμενου λίπους (από 5,23 g/l σε λόγο 100, ανήλθε στα 5,81 g/l σε λόγο 190). Γίνεται φανερό, ότι ο βέλτιστος λόγος C/N για την παραγωγή ενδοκυτταρικού λίπους είναι ο 190. Από την άλλη, η αύξηση της συγκέντρωσης του ενδοκυτταρικού λίπους δεν είναι πάρα πολύ μεγάλη (η αύξηση ήταν 11% σε σχέση με την απόδοση σε λόγο C/N ίσο με 100), θα μπορούσε κάποιος να συμπεράνει, ότι η ζύμη έχει την ικανότητα να συσσωρεύει σημαντικές ποσότητες λίπους σε ένα εύρος λόγων C/N (από 100 έως και 220). Αυτό θα μπορούσε να καταστεί ιδιαίτερα σημαντικό, κατά την διεξαγωγή της καλλιέργειας της ζύμης στο ρευστοποιημένο γλυκό σόργο, καθώς υπάρχει πιθανότητα, η διαθεσιμότητα των ενδογενών πρωτεϊνών του σόργου να μειώσουν τον λόγο C/N. Ακολουθεί ένα γράφημα στο οποίο απεικονίζονται οι αποδόσεις σε λίπος (% lipid) για τους διάφορους λόγους C/N ,7 45,24 46,68 47,33 45,5 43, C/N Γράφημα Γ.6: Συντελεστές απόδοσης λίπους (% lipid) για λόγους C/N: 100, 130, 160, 190, 220 και 250, χρησιμοποιώντας yeast extract ως πηγή αζώτου. Όλες οι τιμές αναφέρονται στην ημέρα της ζύμωσης που παρουσιάστηκαν οι μεγαλύτερες αποδόσεις σε λίπος. ~ 83 ~