ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΣΠΟΥΔΩΝ ΒΙΟΛΟΓΙΚΗ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟΥ ΔΙΠΛΩΜΑΤΟΣ

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΣΠΟΥΔΩΝ ΒΙΟΛΟΓΙΚΗ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟΥ ΔΙΠΛΩΜΑΤΟΣ Δια-ειδική ενίσχυση μικροδορυφορικων δεικτών της Μεσογειακής Μύγας, Ceratitis Capitata, σε είδη της οικογένειας Tephritidae ΠΑΥΛΟΠΟΥΛΟΣ ΙΩΑΝΝΗΣ ΒΙΟΛΟΓΟΣ ΠΑΤΡΑ 2006

2 Η παρούσα εργασία εκπονήθηκε στο εργαστήριο της Γενετικής του τομέα Γενετικής, Βιολογίας Κυττάρου και Ανάπτυξης του Τμήματος Βιολογίας του Πανεπιστήμιου Πατρών. Θέλω μέσα από τη καρδιά μου να ευχαριστήσω την κύρια Αντιγόνη Ζαχαροπούλου, Καθηγήτρια του Τμήματος Βιολογίας, για την εμπιστοσύνη που μου έδειξε και την ευκαιρία που μου έδωσε να συμπεριληφθώ στην ερευνητική της ομάδα καθώς και για την υπομονή που έδειξε απέναντι μου. Ακόμα θέλω να ευχαριστήσω τον κύριο Κίλια Γεώργιο, Επίκουρο Καθηγητή του Τμήματος Βιολογίας για τις πολύτιμες συμβουλές του κατά την διάρκεια εκπόνησης της εργασίας αυτής καθώς και τον κύριο Σταμάτη Νικόλαο, Επίκουρο Καθηγητή του Τμήματος Βιολογίας για την επιστημονική του συμβολή στην ολοκλήρωση αυτής της εργασίας. Ιδιαίτερα πρέπει να ευχαριστήσω τον Διδάκτωρα του Τμήματος Βιολογίας Αυγουστίνο Αντώνιο που με τις συμβουλές του και τις παραινέσεις του βοήθησε καίρια στην ολοκλήρωση της εργασίας. Ένα μεγάλο ευχαριστώ στις συνεργάτες και φίλες μου από το εργαστήριο κυρία Οικονόμου Αικατερίνη και Παπαγγελή Ήριννα για την αμέριστη συμπαράσταση και βοήθεια καθώς και για το εξαιρετικό κλίμα που επικρατούσε καθ όλη τη διάρκεια αυτής της περιόδου. Δεν πρέπει να λησμονήσω τους φίλους μου που με στήριξαν κατά την διάρκεια της χρονιάς και ιδιαίτερα τη Σίσσυ. Οφείλω ένα μεγάλο ευχαριστώ στην οικογένεια μου αφού χωρίς την στήριξη και την υπομονή τους τίποτα από τα παραπάνω δεν θα ήταν εφικτό

3 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ 1) ΕΙΣΑΓΩΓΗ Α) Τα έντομα.2 i) Ceratitis capitata...4 ii) Ceratitis fasciventris..6 iii) Anastrepha ludens 7 iv) Anastrepha obliqua...9 v) Anastrepha striata 10 vi) Anastrepha serpentina 11 vii) Anastrepha fraterculus..12 viii) Bactrocera dorsalis..14 ix)bacrocera oleae x) Rhagoletis cerasi..18 B) Μικροδορυφόροι...19 i) Γενικά...19 ii) Χρήση των μικροδορυφόρων στη σύγχρονη έρευνα...20 iii) Μηχανισμοί μετάλλαξης των μικροδορυφόρων.21 iv) Λειτουργικός ρόλος των μικροδορυφόρων 24 v) Σχέση των μικροδορυφόρων με διάφορες γενετικές ασθένειες..27 Γ) Δια ειδική ενίσχυση i) Χρήση δια-ειδικής ενίσχυσης...29 ii) Δια-ειδική ενίσχυση στα έντομα..31 iii) Δια-ειδική ενίσχυση στο γένος Ceratitis...31 iv) Περιορισμοί στη χρήση των μικροδορυφόρων...32 Δ. Σκοπός της εργασίας. 33 2) ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Α) Βιολογικό υλικό Β) Απομόνωση γονιδιωματικού DNA...36 Γ) Ηλεκτροφόρηση γονιδιωματικού DNA σε πήκτωμα αγαρόζης...38 Δ) Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) Ε) Καθαρισμός προϊόντων PCR...42 i) Kαθαρισμός προϊόντων PCR (PCR Purification) ii) Απομόνωση DNA από πήκτωμα αγαρόζης (Gel extraction) ΣΤ) Κλωνοποίηση προϊόντων PCR i)αντίδραση σύνδεσης προϊόντων PCR. 45 ii) Προετοιμασία δεκτικών βακτηριακών κυττάρων για μετασχηματισμό...46 iii) Δημιουργία δεκτικών κυττάρων με χρήση χλωριούχου ρουβιδίου..46 iv) Μετασχηματισμός βακτηριακών κυττάρων με πλασμιδιακό DNA.. 48 Z) Καλλιέργεια και απομόνωση πλασμιδιακού DNA...50 i) Mέθοδος λύσης με βρασμό...50 ii) Πέψη πλασμιδιακού DNA.51 iii) Ανάλυση πρωτοδιατάξης..52 Η) Επεξεργασία των DNA αλληλούχιων

4 3) ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Α) Μικροδορυφόροι. 54 Β) Δια-ειδική ενίσχυση. 57 i) Δια-ειδική ενίσχυση στα γένη Anastrepha, Bactrocera και Rhagoletis 57 ii) Δια-ειδική ενίσχυση στο γένος Ceratitis...61 Γ) Αλληλούχιση προϊόντων δια-ειδικής ενίσχυσης.. 66 Δ) Φυλογενετικές σχέσεις μεταξύ των ειδών..99 4) ΣΥΖΗΤΗΣΗ Α) Συζήτηση..103 Β) Στόχοι Προοπτικές ) ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ Α) Βιβλιογραφία..111

5 Εισαγωγή

6 Α. Τα έντομα Τα έντομα αποτελούν την πλέον πολυπληθή ομάδα ζωντανών οργανισμών. Έχουν παγκόσμια γεωγραφική εξάπλωση, ενώ μπορούν να βρεθούν σε μια ποικιλία περιβαλλοντικών συνθηκών. Είναι η πλέον ετερόκλιτη ομάδα ζωικών οργανισμών του πλανήτη. Πιστεύεται ότι αριθμούν περισσότερα από ένα εκατομμύριο είδη, ενώ έχουν ήδη περιγραφεί περίπου Στην ομάδα αυτή ανήκουν είδη με τεράστια ετερογένεια όχι μόνο ως προς τα μορφολογικά χαρακτηριστικά αλλά και τη βιολογία τους. Κοινό χαρακτηριστικό γνώρισμα όλων των εντόμων αποτελεί η ετερογενής μεταμέρεια του σώματός τους, το οποίο χωρίζεται σε κεφαλή, θώρακα και κοιλία. Από αυτή τη χαρακτηριστική τμηματοποίηση του σώματός τους προέρχεται και η ονομασία τους (έντομο = τετμημένο). Ανάλογα με τις μορφολογικές αλλαγές που υφίστανται κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης, τα έντομα διακρίνονται σε αμετάβολα, ημιμετάβολα και ολομετάβολα. Στις δυο πρώτες ομάδες ανήκουν έντομα στα οποία η προνύμφη και το ενήλικο άτομο έχουν μικρές διαφορές, ενώ στα ολομετάβολα ανήκουν έντομα τα οποία υφίστανται πλήρη μεταμόρφωση κατά την ανάπτυξή τους. Υπάρχει δηλαδή σαφής διαφοροποίηση των ατόμων κατά τη μετάβαση από το έμβρυο σε προνύμφη, σε νύμφη και τελικά στο ακμαίο άτομο. Τα έντομα συνήθως ταυτίζονται με δυσάρεστες καταστάσεις, όπως καταστροφή σοδειών και πρώτων υλών και μπορούν να προκαλέσουν σημαντικές ασθένειες. Παράλληλα όμως είναι πολύ σημαντικά για την ισορροπία των διαφόρων οικοσυστημάτων. Τα έντομα αποτελούν σημαντικό κρίκο κάθε οικοσυστήματος και συμμετέχουν σε διαδικασίες όπως η γονιμοποίηση πολλών φυτών, η αποικοδόμηση οργανικών υλών, ο έλεγχος των πληθυσμών επιβλαβών ασπόνδυλων οργανισμών και η παραγωγή συγκεκριμένων τροφών (π.χ. μέλι) αλλά και πρώτων υλών (π.χ. μετάξι), τις οποίες εκμεταλλεύεται ο άνθρωπος. Είναι συνεπώς εμφανές ότι η σημασία των εντόμων στην οικολογία, την οικονομία αλλά και την υγεία είναι μεγάλη. Υπάρχουν παρασιτικά έντομα καθώς και έντομα που είναι υπεύθυνα για την μετάδοση ασθενειών (κουνούπια, μύγα τσε-τσε). Πολύ σημαντικές καταστροφές μπορούν να προκαλέσουν τα έντομα και στη γεωργική παραγωγή. Για τους παραπάνω λόγους η παγκόσμια ερευνητική κοινότητα προσπαθεί να βρει τρόπους ελέγχου των πληθυσμών τους έχοντας τις μικρότερες δυνατές επιπτώσεις στο οικοσύστημα.

7 Οικογένεια Tephritidae Η οικογένεια αυτή περιλαμβάνει ένα σημαντικό αριθμό παρασιτικών εντόμων των γεωργικών καλλιεργειών. Η συνολική ζημιά που μπορούν να προκαλέσουν ετησίως έχει υπολογιστεί ότι ξεπερνά τα εκατό εκατομμύρια δολάρια. Η κατάταξή της φαίνεται στο παρακάτω πίνακα: Ομοταξία: Έντομα Τάξη: Diptera Οικογένεια: Tephritidae Οι προνύμφες των εντόμων αυτών τρέφονται από καρπούς διαφόρων φυτών. Πολλά είδη της οικογένειας προκαλούν τεράστιες καταστροφές σε διάφορα φρούτα και λαχανικά. Τα περισσότερα παρασιτικά είδη της οικογένειας Tephritidae χρησιμοποιούν σαν ξενιστές φρούτα που στη πλειοψηφία τους ανήκουν στα γένη Anastrepha, Ceratitis, Bactrocera, Dacus και Rhagoletis. Οι ξενιστές τους περιλαμβάνουν μια ευρεία ποικιλία φυτικών ειδών και ένας μεγάλος αριθμός ανήκει σε φυτά με μεγάλη εμπορική σημασία. Συνολικά περίπου 150 είδη της οικογένειας έχουν ταυτοποιηθεί σαν παράσιτα φυτών με οικονομική και εμπορική σημασία. Διάφορα είδη της οικογένειας Tehpritidae παρασιτούν σ ένα μόνο φυτικό είδος (π.χ. B. oleae) και θεωρούνται μονοφάγα, ενώ σε άλλα, τα πολυφάγα, ο αριθμός των ξενιστών τους ποικίλει ανάλογα με τη διαθεσιμότητα τους στις διάφορες γεωγραφικές περιοχές και τις κλιματολογικές συνθήκες. Η μελέτη των ειδών αυτών στο επίπεδο της γενετικής και της μοριακής βιολογίας θα μπορούσε να συμβάλλει σημαντικά στην ανάπτυξη μεθόδων βιολογικού ελέγχου των πληθυσμών τους. Με εξαίρεση τη Μεσογειακή μύγα, Ceratitis capitata, που θεωρείται το καλύτερα μελετημένο είδος της οικογένειας, η πληροφορία για άλλα είδη είναι πολύ περιορισμένη. Η ανάπτυξη χρήσιμων γενετικών εργαλείων και σε άλλα είδη της οικογένειας είναι αναγκαία για την αναγνώριση και τον έλεγχο τους.

8 i.ceratitis capitata Η Μεσογειακή μύγα Ceratitis capitata (Wiedemann) είναι ένα δίπτερο, ολομετάβολο έντομο που ανήκει στην οικογένεια Tephritidae (Εικ. 1). Η Μεσογειακή μύγα είναι από γενετική και μοριακή άποψη το καλύτερα μέχρι σήμερα μελετημένο είδος της οικογένειας (Robinson & Zacharopoulou, 1996). Εικ.1 Ενήλικο αρσενικό άτομο της Μεσογειακής μύγας Κύκλος ζωής Το θηλυκό άτομο τρυπά με τον ωοαποθέτη του την επιφάνεια των φρούτων και γεννά μικροσκοπικά αυγά σε ομάδες των Σε φυσιολογικές συνθήκες κάθε θηλυκό άτομο μπορεί να γεννήσει κατά μέσο όρο 250 αυγά (Katsoyannos, 1996), τα οποία μετά από 2-4 ημέρες εκκολάπτονται σε προνύμφες πρώτου σταδίου. Η προνύμφη ζει μέσα στο φρούτο και τρέφεται από αυτό για 6-11 ημέρες κατά τη διάρκεια των οποίων υφίσταται δυο εκδύσεις. Όταν η προνύμφη είναι έτοιμη να βομβυκιωθεί ανέρχεται την επιφάνεια του καρπού και με χαρακτηριστικό τρόπο εκτινάσσεται στο έδαφος. Αμέσως εισέρχεται στο χώμα και εκεί μεταπίπτει στο στάδιο της νύμφης μέσα σε λίγες ώρες. Το βομβύκιο που σχηματίζεται έχει σκούρο καφέ χρώμα και μετά από 7-11 ημέρες εκκολάπτεται από αυτό το ενήλικο άτομο. Τα ενήλικα άτομα είναι αναπαραγωγικά ώριμα μετά από 2-4 ημέρες και συνήθως ζουν μέχρι 2 μήνες Στο φυσικό περιβάλλον ο κύκλος ζωής της Μεσογειακής μύγας ποικίλει ανάλογα με τις εξωτερικές συνθήκες και μπορεί να διαρκέσει έως και 3 μήνες. Σε εργαστηριακές συνθήκες (25 o C και 75% υγρασία) ο κύκλος ζωής του εντόμου διαρκεί περίπου 25 ημέρες. Τα στάδια ανάπτυξης του εντόμου φαίνονται σχηματικά στην Εικόνα 2.

9 Α. Δ. Β. Γ. Εικ. 2: Κύκλος ζωής της Μεσογειακής μύγας. Σύζευξη θηλυκού και αρσενικού ατόμου (Α), στάδιο αυγού-εμβρύου (Β), στάδιο προνύμφης (Γ) και στάδιο νύμφης (Δ). Γεωγραφική εξάπλωση Η Μεσογειακή μύγα C. capitata είναι ένα γηγενές είδος της Αφρικής με πιθανό σημείο προέλευσης την περιοχή νοτιοανατολικά της ερήμου Σαχάρα (Hancock, 1989). Τα τελευταία 200 χρόνια έχει εξαπλωθεί σε πολλές τροπικές, υποτροπικές και εύκρατες περιοχές της γης, όπως τη λεκάνη της Μεσογείου, την κεντρική και νότια Αμερική, νότιες περιοχές των Η.Π.Α. και την Αυστραλία (Fletcher, 1989). Η ραγδαία εξάπλωσή της οφείλεται κυρίως σε δραστηριότητες του ανθρώπου (εμπόριο και τουρισμός) και λιγότερο σε μεταφορά με τη βοήθεια του ανέμου ή σε φυσική μετανάστευση (Back and Pemberton, 1918). Η πρώτη καταγραφή αυτού του παρασίτου σε Μεσογειακές χώρες όπως η Ισπανία και η Ιταλία έγινε στα μέσα του 18 ου αιώνα (Malacrida et al., 1992). Στις αρχές του περασμένου αιώνα η Μεσογειακή μύγα καταγράφηκε για πρώτη φορά στην Αμερικανική ήπειρο και συγκεκριμένα στη Βραζιλία το 1905 (Malacrida et al., 1992). Μέχρι το 1930 είχε φτάσει τις Ηνωμένες Πολιτείες, όπου και ανιχνεύτηκε σε Φλόριδα, Τέξας και Καλιφόρνια.

10 Οικονομική σημασία και έλεγχος της Μεσογειακής μύγας Η C. capitata προσβάλλει περισσότερα από 350 είδη φρούτων, προκαλώντας κάθε χρόνο τεράστιες καταστροφές σε τροπικές-υποτροπικές και εύκρατες περιοχές του πλανήτη. Η καταστροφή αυτή προκαλείται τόσο από την εναπόθεση των αυγών στους καρπούς του όσο και από το γεγονός ότι οι περιοχές ωοαπόθεσης αποτελούν εστίες μόλυνσης από μικροοργανισμούς όπως βακτήρια και μύκητες. Η παρασιτική αυτή δράση της Μεσογειακής μύγας σε συνδυασμό με τη μεγάλη και γρήγορη γεωγραφική της εξάπλωση, δικαίως την κατατάσσουν στα έντομα μεγάλης οικονομικής σημασίας και καθιστούν αναγκαίο τον έλεγχο των φυσικών πληθυσμών της ή και την καταπολέμησή της. Για τον έλεγχο των φυσικών πληθυσμών αυτού του εντόμου χρησιμοποιούνται διάφορες μέθοδοι όπως η μαζική παγίδευση (Haniotakis et al., 1991), η εφαρμογή δολωματικών ψεκασμών, η απολύμανση των εξαγώγιμων φρούτων (Mansour and Franz, 1996) και κυρίως η χρήση εντομοκτόνων. Οι δυσμενείς όμως επιπτώσεις από τη χρήση εντομοκτόνων επιβάλλουν την ανάπτυξη και εφαρμογή εναλλακτικών μεθόδων, φιλικών προς το περιβάλλον. Η εφαρμογή μεθόδων βιολογικού ελέγχου των φυσικών πληθυσμών επιβλαβών εντόμων βρίσκεται σήμερα σε προτεραιότητα τόσο στον Ευρωπαϊκό χώρο αλλά και σε διεθνές επίπεδο, με κυρίαρχη μέθοδο την απελευθέρωση στείρων ατόμων (SIT, Sterile Insect Technique). ii. Ceratitis fasciventris Στην παρούσα εργασία χρησιμοποιήθηκε και ένα ακόμα είδος του γένους Ceratitis, τη Ceratitis fasciventris (Bezzi) το οποίο είχε θεωρηθεί αρχικά ως υπό-είδος της Ceratitis rosa και πρόσφατα αναγνωρίστηκε ως ξεχωριστό είδος (De Meyer 2001) Εικ.3 Ενήλικο θηλυκό άτομο της C. fasciventris Γεωγραφική εξάπλωση Η γεωγραφική εξάπλωση του συγκεκριμένου είδους αφορά την Αφρικανική Ήπειρο και εντοπίζεται κυρίως στη Κεντρική Αφρική. Κρούσματα μολύνσεων από το έντομο έχουν αναφερθεί στη Ανγκόλα, στην Ουγκάντα έως και το Μάλι.

11 Ξενιστές Το είδος αυτό είναι πολυφάγο και μπορεί να προκαλέσει καταστροφές σε ένα ευρύ φάσμα φρούτων αλλά και λαχανικών. Το μάνγκο, ο καφές και ο ανανάς είναι κάποιοι από τους κύριους ξενιστές της C. fasciventris. Έλεγχος Ο έλεγχος αφορά κυρίως την αποφυγή εξάπλωσης του εντόμου που μέχρι στιγμής είναι περιορισμένο στην Αφρική. Η χρήση καραντίνας καθώς και ελέγχου των εξαγωγών σε χώρες που απουσιάζει το είδος, είναι μέθοδοι για να αποφευχθεί η εξάπλωση του. iii.anastrepha ludens Η Anastrepha ludens (Loew) είναι η κοινά ονομαζόμενη μεξικάνικη φρουτόμυγα και ένα σημαντικό παράσιτο διαφόρων φρούτων. Το είδος είναι επίσης γνωστό με τα ονόματα Acrotoxa ludens (Loew), Tryprta ludens (Loew 73) Anastrepha lathana (Stone 42) Εικ.4 Ενήλικο θηλυκό άτομο της A. ludens Γεωγραφική εξάπλωση Το συγκεκριμένο είδος εντοπίζεται κυρίως στη Κεντρική Αμερική (Μεξικό έως Κόστα Ρίκα) Κρούσματα έχουν αναφερθεί και στις νότιες πολιτείες των Η.Π.Α. όπου η καλλιέργεια φρούτων είναι μια σημαντική πλουτοπαραγωγική πηγή. Χάρτης 1 Γεωγραφική εξάπλωση της A.ludens

12 Κύκλος ζωής Το θηλυκό άτομο ωοαποθέτει σε ώριμα φρούτα όταν αυτά ξεκινούν να εμφανίζουν χρωματισμούς. Τα αυγά αποθέτονται σε δεκάδες και εκκολάπτονται συνήθως σε μια χρονική διάρκεια έξι έως δέκα ημερών. Οι εκκολαπτόμενες προνύμφες τρέφονται και διαβιούν εσωτερικά του καρπού αποκτώντας το χρωματισμό του και γίνονται έτσι δυσδιάκριτες όταν έχουν μικρό μέγεθος. Όταν είναι πλήρως αναπτυγμένες ανοίγουν διαδρόμους στο καρπό και όταν αυτός πέφτει στο έδαφος τότε περνούν στο στάδιο του βομβυκίου στο χώμα. Η ανάπτυξη της προνύμφης απαιτεί τρεις έως τέσσερις εβδομάδες, γεγονός που κυρίως εξαρτάται από τη θερμοκρασία του περιβάλλοντος. Τα ενήλικα άτομα μπορούν να επιβιώσουν για αρκετούς μήνες, ενώ έχουν παρατηρηθεί περιπτώσεις αντοχής σε όλη τη διάρκεια του έτους με τα αρσενικά άτομα να έχουν μεγαλύτερη διάρκεια ζωής από τα θηλυκά. Ξενιστές Προτίμηση φαίνεται να έχουν σε παπάγια, μήλα, γκρέϊπφρουτ και δευτερευόντως στα πορτοκάλια. Κάποια ακόμα φρούτα και καρποί που φαίνεται να προτιμούν είναι το ροδάκινο, το αβοκάντο και ο καφές. Αν και στη φύση χρησιμοποιούν μια πληθώρα ξενιστών, στο εργαστήριο μπορούν να προσβάλουν ακόμα περισσότερα φρούτα αλλά και λαχανικά. Παρακάτω παρουσιάζονται κάποιοι από τους φυσικούς ξενιστές σύμφωνα με τους Elson-Harris (1992) και Hernandez-Ortiz (1992): Anacardium occidentale, Annona cherimola, Annona reticulata, Carica papaya, Casimiroa edulis, Citrus maxima, Coffea arabica, Inga spp., Malus domestica, Prunus persica. Έλεγχος Το συγκεκριμένο είδος δεν έχει ελεγχθεί σε μικρή κλίμακα, όπως για παράδειγμα από ιδιοκτήτες μικρών εκτάσεων. Τα αυγά και οι προνύμφες είναι ασφαλείς μέσα στα φρούτα από την όποια επέμβαση. Στο ώριμο στάδιο η χρήση εντομοκτόνων είναι μια από τις μεθόδους ελέγχου. Η μίξη εντομοκτόνων ουσιών με προσελκυστικές πρωτεΐνες και ο ψεκασμός στα φυλλώματα των δένδρων είναι μια συνηθισμένη διαδικασία. Η υψηλή κινητικότητα όμως των εντόμων τους επιτρέπει την αλλαγή της τροφής και συνεπώς την αποφυγή του εντομοκτόνου. Η μαζική απελευθέρωση στείρων ατόμων (SIT) είναι μία ακόμα μέθοδος που μπορεί να συμβάλλει σημαντικά στον έλεγχο των πληθυσμών του συγκεκριμένου είδους (Rodacher et al., 1993).

13 iv.anastrepha obliqua Η Anastrepha obliqua (Macquart) είναι ένα από τα πιο άφθονα είδη της οικογένειας Anastrepha στη δυτική πλευρά της Νοτίου Αμερικής. Είναι το σημαντικότερο παράσιτο των καλλιεργειών μάνγκο στις περισσότερες τροπικές χώρες, καθιστώντας την παραγωγή μερικών ποικιλιών ασύμφορη. Η A. obliqua ονομάζεται και φρουτόμυγα των Αντιλλών. Εικ.5 Ενήλικο θηλυκό άτομο της A. obliqua Γεωγραφική εξάπλωση Το συγκεκριμένο είδος απαντάται σε Αντίλλες, Τζαμάικα, Τρινιντάντ, Rio Grande Valley του Τέξας, Μεξικό έως τον Παναμά, Βενεζουέλα και Ισημερινό και στην περιοχή του Rio de Janeiro της Βραζιλίας. Ο πληθυσμός της Βραζιλίας ίσως αντιπροσωπεύει μια εισαγωγή του είδους στο λιμάνι του Rio de Janeiro. Κύκλος ζωής Η περίοδος πριν την ωοτοκία σε υποτροπικές περιοχές ποικίλει από μια εβδομάδα το καλοκαίρι έως δυο με τρεις εβδομάδες το χειμώνα. Τα αβγά αποθέτονται ένα-ένα, γενικά σε ώριμα φρούτα εκτός από μερικές ποικιλίες μάνγκο που μπορεί να προσβληθούν όταν είναι ακόμα άωρα. Το στάδιο της προνύμφης διαρκεί 10 με 13 ημέρες το καλοκαίρι, λίγο περισσότερο το χειμώνα και το νυμφικό στάδιο διαρκεί το ίδιο χρονικό διάστημα. Υπολογίζεται ότι υπάρχουν έξι ή επτά γενιές ανά έτος. Ξενιστές Ένας μεγάλος αριθμός ξενιστών έχει βρεθεί για το συγκεκριμένο είδος αλλά εξαιτίας της σύγχυσης μεταξύ A. obliqua, A. fraterculus και άλλων σε αυτό το σύμπλεγμα ειδών δεν είναι ξεκάθαρο ποιο είναι το πραγματικό εύρος ξενιστών για κάθε είδος. Ο Weems (1980) επισήμανε ένα μεγάλο αριθμό τροπικών φρούτων ως ξενιστών για το «σύμπλεγμα fraterculus». Μια μεγάλη λίστα καταγεγραμμένων ξενιστών για την A.obliqua επίσης επισημάνθηκε από τους Noorbom και Kim (1988), με τα μάνγκο (Mangifera indica L.), guava (Psidium guajava L.), και hog plums (Spondias sp.) να

14 είναι οι πιο συχνά αναφερόμενοι ξενιστές. Το ροδάκινο, ο καφές, το γκρέϊπφρουτ, το δαμάσκηνο, τα αμύγδαλα και κάποιες ποικιλίες σταφυλιών είναι και αυτοί εν δυνάμει ξενιστές. Παρακάτω αναφέρονται οι κυριότεροι ξενιστές του συμπλέγματος fraterculus. Anacardium occidentale, Annona hayesii, Averrrhoa carambola, Citrus aurantium, Citrus grandis, Citrus x paradisi, Dovyalis hebecarpa, Eriobotrya japonica, Eugenia jambos, Eugenia malaccensis, Eugenia nesiotica, Mangifera indica, Diospyros digyna, Pouteria mammosa, Prunus amygdalus, Prunus dulcis, Psidium guajava, Spondias dulcis, Spondias mombin, Spondias nigrescens, Spondias purpurea, Coffea arabica. v.anastrepha striata Η Anastrepha striata είναι ένα από τα πιο κοινά είδη του γένους Anastrepha. Παρόλα αυτά δεν έχει λάβει ένα καλά εδραιωμένο κοινό όνομα όπως έχουν άλλα είδη (π.χ. η μεξικανική, η καραϊβική, η Μεσογειακή μύγα). Αυτό πιθανόν συμβαίνει επειδή δε θεωρείται πρωτεύουσας οικονομικής σημασίας, αν και συχνά είναι άφθονη και μπορεί να γίνει πολύ καταστροφική. Εικ.6 Ενήλικο θηλυκό άτομο της A. striata Γεωγραφική εξάπλωση Η γεωγραφικής εξάπλωση του είδους περιλαμβάνει τροπικές και υποτροπικές περιοχές της Αμερικής (Κεντρική και Νότια, από το Μεξικό έως Βολιβία και Βραζιλία). Μερικά δείγματα έχουν συλλεχθεί στις Η.Π.Α. (νότιο Τέξας και Καλιφόρνια), αλλά η A. striata δεν έχει έως σήμερα εδραιωθεί εκεί (Norrbum, 2001). Ξενιστές Αν και το Guava, Psidium guajava L., είναι ο κύριος ξενιστής, το συγκεκριμένο είδος έχει μια ποικιλία ξενιστών όπως το ροδάκινο, το μήλο και κάποιες ποικιλίες πορτοκαλιού. Παρακάτω αναφέρονται οι κυριότεροι ξενιστές του Psidium sartorianum, Mangifera indica; Spondias sp., Spondias mombin, Manihot esculenta, Persea americana, Diospyros digyna, Pouteria viridis, Psidium guineense,

15 Manihot escullenta, Prunus persica, Syzgium jambos, Chrysophyllum cainito, Psidium littorale, Citrus sinensis, Terminalia catappa, Psidium friedrichsthalianum. (White and Elson-Harris, 1994). vi.anastrepha serpentina Η Anastrepha serpentina (Wiedemann), που αποκαλείται και οφιοειδής φρουτόμυγα, είναι ένα σημαντικό είδος στο Μεξικό και η προνύμφη του προσβάλει φρούτα όπως sapote (Caloca.rpum spp.), sapodilla (Achras zapota), willowleaf lucuma (Lucuma salicifolia) και συγγενικά φρούτα. Εικ.7 Ενήλικο θηλυκό άτομο της A. serpentina Γεωγραφική εξάπλωση Η εξάπλωση του εντόμου περιλαμβάνει ένα μεγάλο μέρος της Κεντρικής και Νότιας Αμερικής και εμφανίζεται σε χώρες όπως: Μεξικό, Κόστα Ρίκα, Γουατεμάλα, Παναμάς, Περού, Τρινιντάντ, Βραζιλία, Αργεντινή, Κολομβία, Ισημερινός και Βενεζουέλα. Όσο αφορά την εξάπλωση του εντόμου στις Η.Π.Α., μεγάλοι αριθμοί ενηλίκων ατόμων έχουν ανιχνευθεί στην κοιλάδα Rio Grande του Τέξας, ενώ έντομα έχουν εντοπισθεί στα λιμάνια των Η.Π.Α. σε διάφορα εισαγόμενα φρούτα. Η Anastrepha serpentina θα μπορούσε να αποτελέσει σοβαρό παράσιτο για τα τροπικά φρούτα στη νότια Φλόριντα εάν εμφανιζόταν σε αυτή την περιοχή. Κύκλος ζωής Τα θηλυκά στη φύση μπορούν να ωοαποθέσουν μέχρι και 600 αυγά σε περίπου ενάμιση μήνα. Για την ωοαπόθεση προτιμούνται κυρίως ώριμα φρούτα. Σε εργαστηριακές συνθήκες τα θηλυκά συνεχίζουν την ωοαπόθεση σε περίοδο που εκτείνεται μέχρι 29 εβδομάδες. Η προσβολή φρούτων που ωριμάζουν στα δέντρα είναι συχνά τόσο μεγάλη που σε μέρη της χώρας που αυτά τα φρούτα παράγονται, ειδικά στην Veracruz, οι παραγωγοί

16 δεν τα αφήνουν να ωριμάσουν στα δέντρα, αλλά τα συλλέγουν πράσινα και τα αφήνουν να ωριμάσουν υπό τεχνητές συνθήκες για αποφυγή της προσβολής. Τα φρούτα που ωριμάζουν με αυτόν τον τρόπο είναι παρόλα αυτά κατώτερης ποιότητας από αυτά που ωριμάζουν στα δέντρα. Ξενιστές Τα προτιμώμενα φυτά είναι μέλη της οικογένειας Sapotaceae, κυρίως star-apple (Chrysophyllum cainito) και sapodilla (Achras zapota). Τα μήλα και τα ροδάκινα μπορούν να αποτελέσουν εν δυνάμει ξενιστές του συγκεκριμένου είδους. Παρακάτω αναφέρονται οι κυριότεροι ξενιστές του Achras zapota, Annona glabra, Bumelia laetevirens, Calocarpum sapota, Calcocarpum viride, Chrysophyllum cainito, Chrysophyllum panamense, Citrus mitis, Citrus paradisi, Citrus sinensis, Cydonia oblonga, Dovyalis hebecarpa, Ficus sp., Labatia standleyana, Lucuma obovata, Lucuma salicifolia, Malus sylvestris, Mammea americana, Mangifera indica, Manilkara zapotilla, Mimusops coriacea, Persea americana, Prunus persica, Psidium guajava, Pyrus communis, Sideroxylon tempisque, Spondias mombin, Zschokkea panamaensi vii.anastrepha fraterculus Η Anastrepha fraterculus είχε ταξινομηθεί στο γένος Dacus από τον Wiedemann (1830), βάσει δειγμάτων από τη Βραζιλία. Αυτό το είδος είναι μεγάλης οικονομικής σημασίας εξαιτίας της μεγάλης ποικιλίας φυτών τα οποία χρησιμοποιεί ως ξενιστές και της μεγάλης εξάπλωσής του. Στις περισσότερες περιοχές της νότιας Αμερικής είναι πιθανόν το πιο σημαντικό είδος του γένους Anastrepha. Παρά τη σημασία του δεν έχει λάβει κοινό όνομα. Έχει ονομαστεί Νοτιοαμερικάνικη φρουτόμυγα αλλά αυτό είναι ακατάλληλο όνομα εφόσον το είδος απαντάται σε όλη την κεντρική Αμερική και τις Η.Π.Α. Εικ.8 Ενήλικο θηλυκό άτομο της Α..fraterculous

17 Το σύμπλεγμα fraterculus Ο Alan Stone (1942) πρότεινε ότι η A. fraterculus είναι ένα είδος με μεγάλη ποικιλομορφία που εκτείνεται από το Τέξας έως την Κεντρική και Νότια Αμερική. Η παρατηρούμενη ποικιλότητα τον ώθησε να διατυπώσει την άποψη ότι πληθυσμοί που υπάρχουν από το Τέξας έως την Αργεντινή είναι δυνατόν να ανήκουν σε ένα σύμπλεγμα ειδών παρά σε ένα είδος. Ο Baker (Baker et al., 1944) θεώρησε τη μεξικανική μορφή διακριτή από το είδος A. fraterculus, σημειώνοντας διαφορές μεταξύ βραζιλιάνικων και μεξικανικών μορφών. Παρατήρησε ότι η βραζιλιάνικη A. fraterculus έχει σημάδια στα φτερά που διαφέρουν από αυτά της μεξικανικής μορφής ενώ διαφορές παρατηρούνται και στους ωοαποθέτες τους. Στην επιστημονική κοινότητα θεωρείται ότι υπάρχουν τέσσερις τουλάχιστον βιολογικά διακριτοί πληθυσμοί που περιλαμβάνονται στο σύμπλεγμα της A. fraterculus. Υπάρχουν πολλά άλλα είδη του γένους Anastrepha που μοιάζουν στενά με το σύμπλεγμα A. fraterculus, έτσι ώστε είναι δύσκολο να καθοριστούν συγκεκριμένα όρια. Για να διευκρινιστούν οι διαφορές μεταξύ των ειδών απαιτούνται περαιτέρω βιολογικές και ταξινομικές μελέτες, με δειγματοληψία πληθυσμών σε όλο το εύρος αυτού του συμπλέγματος και σε συσχέτιση με διάφορα φρούτα ξενιστές. Προφανώς όλοι οι τύποι αυτού του συμπλέγματος προσβάλλουν σημαντικά από οικονομικής άποψης φυτά. Γεωγραφική εξάπλωση Το εύρος εξάπλωσης είναι η Αμερικάνικη Ήπειρος από την Κοιλάδα του Rio Grande Valley του Τέξας έως την Αργεντινή, το Τρινιντάντ και το Τομπάγκο. Υπάρχουν ενδείξεις προσβολής στη Χιλή, αλλά δεν έχουν ακόμα επιβεβαιωθεί (White and Elson-Harris 1994). Ξενιστές Όπως έχει ήδη αναφερθεί δεν έχει γίνει δυνατό να ξεκαθαρίσουν ποια φυτά παρασιτούνται από το A. fraterculus και ποία από το A. obliqua και έτσι υπάρχει ένας κατάλογος φυτών που αναφέρεται ως ξενιστές του «συμπλέγματος fraterculus». Γενικά μπορούμε να αναφέρουμε ότι από τα καλλιεργούμενα φρούτα το surinam cherry, το ροδάκινο και το guava φαίνεται να συγκεντρώνουν την προτίμηση του

18 εντόμου. Στο εργαστήριο μπορεί να προσβάλλει και είδη τα οποία δεν αποτελούν φυσικούς ξενιστές του. viii Bactrocera dorsalis Το γένος Bactrocera, με 350 έως 375 είδη προέρχεται από την Αφρική ενώ εντοπίζεται και στην ανατολική Ασία, την Αυστραλία και τον Ειρηνικό ωκεανό. Το είδος Bactrocera dorsalis είναι ένα από τα σημαντικότερα παράσιτα του συγκεκριμένου γένους. Γεωγραφική εξάπλωση Εικ.9 Ενήλικο αρσενικό άτομο της Bactrocera dorsalis Η Bactrocera dorsalis ή ανατολίτικη φρουτόμυγα είναι ευρύτατα διαδεδομένη σε χώρες της ανατολικής Ασίας όπως το Πακιστάν, Ινδία, Ινδονησία και τη Σρί Λάνκα. Αναφορές για το έντομο έχουν γίνει και στην περιοχή της Ινδοκίνας με αναφορές μολύνσεων στην νότ ια Κίνα στις Φιλιππίνες και το Βιετνάμ. Κρούσματα παρασιτικής δράσης του εντόμου έχουν βρεθεί και στον Ειρηνικό ωκεανό με αναφορές στην Μικρονησία και στα νησιά της Χαβάης. Χάρτης 2 Γεωγραφική εξάπλωση της B. dorslis Αναφορές υπάρχουν και για κρούσματα σε καλλιέργειες πορτοκαλιού στην πολιτεία της Καλιφόρνια των Η.Π.Α.. Η μεγαλύτερη προσβολή των καλλιεργειών Η.Π.Α. παρατηρήθηκε από το 1960 έως το στις Κύκλος ζωής

19 Η ανάπτυξη του εντόμου από αυγό έως ενήλικο άτομο τους θερινούς μήνες απαιτεί 16 ημέρες.. Η ώριμη προνύμφη εξέρχεται από το καρπό πέφτει στο έδαφος όπου σχηματίζεται το βομβύκιο σκούρου καστανού χρώματος. Η βομβυκίωση πραγματοποιείται στο χώμα. Περίπου εννέα ημέρες απαιτούνται για να αποκτήσει το έντομο τη σεξουαλική το υ ωριμότητα. Η αναπτυξιακή περίοδος μπορεί να διαρκέσει περισσότερο όταν η θερμοκρασία του περιβάλλοντος είναι χαμηλότερη. Σ ε ιδανικές συνθήκες έν α θηλυκό άτομο μπορεί να ωοαποθέσει περισσότερα από 3000 κατά τη διάρκεια της ζωής του αλλά συνήθως αυτό ς ο αριθμός δεν ξεπερνά τα 1500 αυγά. Τα ώριμα φρούτα προτιμούνται για την ωοαπόθεση. Εικ.10 Ωοαπόθεση της B.dorsalis Ξενιστές Το Bactrocera dorsalis έχει καταγραφεί να έχει περισσότερους από 150 ξενιστές. Σε αυτούς συγκαταλέγονται ένας σημαντικούς αριθμός τροπικών φρούτων αλλά και λαχανικών. Το μάνγκο, η παπάγια, το αβοκάντο, η τομάτα, το ροδάκινο, το μήλο, το βερίκοκο, οι καφές και ο ανανάς συγκαταλέγονται σε αυτά. Το φρούτο τραυματίζεται κατά τη διάρκεια της ωοαπόθεσης και την ανάπτυξη των προνυμφών. Αυτό έχει σαν αποτέλεσμα την πτώση του καρπού από το δένδρο και την πολύ σημαντική μείωση της εμπορικής του αξίας. Ο έλεγχος για την αποφυγή της επέκτασης των πληθυσμών είναι αναγκαίος. Έλεγχος Χαρακτηριστικό της προσπάθειας ελέγχου του εντόμου είναι ο συνδυασμός τεχνικών για την μείωση των φυσικών πληθυσμών. Παράδειγμα αποτελεί η προσπάθεια από το Ιαπωνικό κράτος όπου έγινε δυνατόν να εξολοθρεύσουν τους φυσικούς πληθυσμούς το 1985 μετά από 18 χρόνια συστηματικού ελέγχου. Η παγίδευση ατόμων, η χρήση εντομοκτόνων και η SIT συνδυάσθηκαν ώστε να παρέχουν ικανοποιητικά αποτελέσματα. ix.bactrocera oleae

20 Ο δάκος της ελιάς, Bactrocera oleae, είναι ένα πολύ σημαντικό παράσιτο της ελιάς στις χώρες της λεκάνης την Μεσογείου. Οι προνύμφες του είναι μονοφάγες και τρέφονται αποκλειστικά με τον καρπό της ελιάς. Τα ενήλικα άτομα χρησιμοποιούν σαν τροφή το νέκταρ και το μέλι καθώς και άλλες τροφές ρευστής ή ημίρευστης μορφής. Η ζημία που προκαλείται από την ύπαρξη των προνυμφών στους καρπούς της ελιάς είναι πολύ σημαντική αφού μπορεί να φτάσει ακόμα και το 30% της παραγωγής σε χώρες όπως η Ελλάδα ή η Ιταλία όπου η παραγωγή ελιάς και ελαιολάδου είναι πάρα πολύ σημαντική. Η προέλευση και ο τρόπος εξάπλωσης του είδους δεν έχουν αναλυθεί ιδιαίτερα. Είναι σίγουρο ότι ο δάκος και η ελιά έχουν ακολουθήσει παράλληλη και άρρηκτα συνδεδεμένη πορεία για πάρα πολλά χρόνια, με κύριο αίτιο την αποκλειστική εξάρτηση που έχουν από τον καρπό της ελιάς οι προνύμφες του είδους. Ήδη από τον 3 ο αιώνα π.χ. υπάρχουν μαρτυρίες για την προσβολή του ελαιοκάρπου από το δάκο στην περιοχή της Μεσογείου (Δήμου Εικ.11 Ενήλικο θηλυκό άτομο της Bactrocera oleae ΙΕ, διδακτορική διατριβή). Η γεωγραφική διασπορά πολλών συγγενικών ειδών στην περιοχή της Ινδίας είναι μία ένδειξη ότι ο δάκος μπορεί να προέρχεται από την περιοχή αυτή, αν και σήμερα εμφανίζει σχεδόν παντελή έλλειψη ελαιοδέντρων (Goulielmos et al., 2003) Γεωγραφική εξάπλωση Η γεωγραφική εξάπλωση του εντόμου ακολουθεί αυτή του ελαιοδένδρου και εμφανίζεται κυρίως στις χώρες της Μεσογείου, σε ένα πολύ μεγάλο μέρος της Αφρικής καθώς και στα Κανάρια Νησιά, την Ινδία και Μέση Ανατολή. Όσο άφορα το δυτικό ημισφαίριο κρούσματα μόλυνσης των καλλιεργειών από το έντομο έχουν σημειωθεί και στις Ηνωμένες Πολιτείες όπως παραδείγματος χάρη στην πολιτεία της Καλιφόρνια.

21 Κύκλος ζωής Στην περιοχή της μεσογείου κάθε χρόνο αναπτύσσονται δυο έως πέντε γενιές του εντόμου. Το χειμώνα τα έντομα είναι στο στάδιο του βομβυκίου αρκετά εκατοστά κάτω από την επιφάνεια του εδάφους. Οι ενήλικες μύγες εμφανίζονται την άνοιξη από τον Μάρτιο έως τον Μάϊο πράγμα που εξαρτάται από το υψόμετρο και την θερμοκρασία. Σε θερμές περιβαλλοντικές συνθήκες μετά την εκκόλαψη των ενηλίκων υπάρχει μια περίοδος που διαρκεί έξι έως δέκα ημέρες, ανάλογα με την θερμοκρασία, χαρακτηρίζει την περίοδο πριν την αναπαραγωγική ωριμότητα. Κατά την περίοδο της προ-ωοαπόθεσης στο θηλυκό άτομο ωριμάζουν οι ωοθήκες και τα πρώτα αυγά. Στις αρχές Ιουνίου τα θηλυκά γονιμοποιούνται και ωοαποθέτουν σε μηώριμους καρπούς. Από δέκα έως δώδεκα αυγά αφήνονται, συνήθως ανά καρπό, και συνολικά διακόσια κατά την διάρκεια της ζωής του εντόμου. Το θηλυκό άτομο τρυπά των καρπό με τον ωοαποθέτει και αφήνει τα αυγά του αμέσως κάτω από την επιδερμίδα του καρπού. Οι προνύμφες τρέφονται από το ιστό του καρπού προκαλώντας τελικά την αποκόλλησή του και την πτώση του από το δένδρο. Το στάδιο του εμβρύου συνήθως διαρκεί τρεις ημέρες, το στάδιο της προνύμφης από δέκα έως δεκατέσσερις ημέρες ενώ το στάδιο του βομβυκίου δεν ξεπερνά τις δέκα ημέρες.. Ξενιστές Όπως έχει ήδη αναφερθεί το είδος Bactrocera oleae είναι αποκλειστικό παράσιτο της ελιάς Έλεγχος του εντόμου Για την καταπολέμηση του εντόμου χρησιμοποιείται σήμερα η συνδυασμένη δράση πολλών διαφορετικών μεθόδων, φιλικών ή μη προς το περιβάλλον. Δυστυχώς η βάση της καταπολέμησης παραμένει η χρήση εντομοκτόνων. Θα πρέπει να τονιστεί ότι η σύγχρονη τάση για την αντιμετώπιση των επιβλαβών εντόμων είναι η ολοκληρωμένη διαχείριση επιβλαβών εντόμων (IPM ή integrated pest management), η οποία είναι μια στρατηγική που συνδυάζει διάφορες πρακτικές και προσπαθεί να βελτιστοποιήσει τα πλεονεκτήματα κάθε μιας από αυτές, ενώ παράλληλα ελαχιστοποιεί τα μειονεκτήματά τους.

22 x.rhagoletis cerasi Η ευρωπαϊκή μύγα του κερασιού είναι ένα μικρό ολομετάβολο έντομο που το μέγεθος του δεν ξεπερνά τα 6.5 mm. Είναι ένα παρασιτικό είδος που αφορά τις καλλιέργειες των κερασιών και μπορεί να προκαλέσει σημαντικές φθορές. Στη βιβλιογραφία βρίσκονται πολλά συνώνυμα όπως: Musca cerasi, Trypeta signata, Urophora cerasorum, Urophora liturata Εικ.12 Ενήλικο άτομο της Rhagoletis cerasi Γεωγραφική εξάπλωση Η γεωγραφική εξάπλωση του εντόμου ακολουθεί την εξάπλωση του ξενιστή του στην ευρωπαϊκή ήπειρο και την λεκάνη της Μεσογείου. Κύκλος ζωής Το ενήλικο άτομο εμφανίζεται στα τέλη Μαϊου έως τον Ιούλιο. Τα πρώτα αυγά αποτίθενται δέκα έως δεκαπέντε ημέρες από την στιγμή που αρχίζουν να εμφανίζονται τα ώριμα θηλυκά άτομα. Το θηλυκό άτομο μπορεί να αποθέσει πενήντα έως ογδόντα αυγά τα οποία αφήνονται στον ιστό του καρπού κάτω από την επιδερμίδα όταν ο καρπός ξεκινά να αποκτά το χρώμα του. Οι προνύμφες τρέφονται από τον ιστό και η ανάπτυξη τους διαρκεί περίπου τριάντα ημέρες. Οι προνύμφες εγκαταλείπουν τον καρπό και πέφτουν στο χώμα όπου και βομβυκιώνονται. Το συγκεκριμένος είδος εμφανίζει διάπαυση έχοντας μια μόνο γενιά ανά έτος. Είναι όμως δυνατόν η διάπαυση να διαρκέσει έως και τρία χρόνια. Ξενιστές Οι ξενιστές του συγκεκριμένου παρασίτου είναι φυτά των οικογενειών Caprifoliaceae (Lonicera ssp.) και Rosaceae (Prunus ssp.). Κύριος ξενιστής είναι το κεράσι (Prunus subhirtella) όπως άλλωστε φανερώνει και το όνομα του είδους. Οι οικονομικές ζημίες που προκαλεί το έντομο αυτό ποικίλουν από χρονιά σε χρονιά. Σε χρονιές με υψηλές θερμοκρασίες η ζημιά μπορεί να γίνει αρκετά σημαντική αφού το έντομο έχει πολύ γρήγορη ανάπτυξη. Η προσβολή των καρπών μειώνουν σημαντικά την ποιότητα τους.

23 Β.Μικροδορυφόροι i.γενικά Οι μικροδορυφόροι (microsatellites) είναι μικρές, διαδοχικές επαναλήψεις νουκλεοτιδικών μοτίβων, των οποίων οι επαναλαμβανόμενες μονάδες έχουν μήκος 1 έως 6 βάσεις. Το σύνηθες μήκος μιας μικροδορυφορικής αλληλουχίας είναι βάσεις (Brown, 2002), ενώ σπάνια υπερβαίνουν τις 70 μονάδες επανάληψης (Schlotterer, 1998). Μικροδορυφόροι μ ένα μοτίβο επανάληψης ονομάζονται απλοί, ενώ όταν στον ίδιο μικροδορυφόρο υπάρχουν περισσότερα του ενός μοτίβα επανάληψης, τότε ο μικροδορυφόρος αυτός ονομάζεται σύνθετος. Τέλος, όταν η μικροδορυφορική αλληλουχία σε κάποιο σημείο της διακόπτεται προσωρινά από κάποια βάση που δεν ανήκει στο συγκεκριμένο μοτίβο επανάληψης, τότε ο μικροδορυφόρος ονομάζεται διακοπτόμενος (Weber, 1990). Οι μικροδορυφόροι έχουν ανιχνευθεί στο γονιδίωμα κάθε οργανισμού που έχει αναλυθεί ως τώρα (Tautz and Schlotterer, 1994). Οι μικροδορυφόροι έχουν χαρακτηριστικά τα οποία τους καθιστούν πολύ σημαντικούς δείκτες στη γενετική χαρτογράφηση και εύχρηστα εργαλεία σε γενετικές και πληθυσμιακές μελέτες. Tα χαρακτηριστικά αυτά είναι τα εξής: 1. είναι άφθονοι στα γονιδιώματα όλων των οργανισμών που έχουν μελετηθεί ως σήμερα, ενώ είναι ιδιαίτερα άφθονοι στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς, σε σχέση με τους προκαρυωτικούς. Στα θηλαστικά έχει υπολογιστεί ότι μικροδορυφόροι που έχουν ως μονάδα επανάληψης το δινουκλεοτίδιο CA/GT απαντώνται κάθε 30 kb περίπου. 2. είναι υψηλά πολυμορφικοί δείκτες, διότι έχουν πολύ υψηλό ρυθμό μεταλλακτικότητας. 3. κληρονομούνται ως συνυπερέχοντες Μεντελικοί δείκτες, γεγονός που καθιστά εφικτή τη διάκριση αλληλομόρφων πατρικής και μητρικής προέλευσης. 4. είναι διάσπαρτοι στο γονιδίωμα 5. η ανάλυσή τους γίνεται με τη χρήση της τεχνικής της PCR, που σημαίνει ότι απαιτείται μικρή μόνο ποσότητα DNA από κάθε άτομο που αναλύεται (ιδιαίτερα χρήσιμο σε αναλύσεις με πολλούς δείκτες). Το γεγονός αυτό προσδίδει μεγάλο πλεονέκτημα όταν το DNA είναι λίγο ή κακής ποιότητας, οπότε οι μικροδορυφόροι

24 προτιμούνται για την ανάλυση υπολειμμάτων οστών, μουσειακών ειδών, ρίζες τριχών και περιττωμάτων. 6. η απομόνωσή τους δεν παρουσιάζει ιδιαίτερες δυσκολίες. 7. είναι εύκολη η χαρτογράφησή τους με in situ υβριδοποίηση, γεγονός σημαντικό στη χαρτογράφηση τους. 8. εμφανίζουν εξελικτική σταθερότητα μεταξύ των ειδών. ii. Χρήση των μικροδορυφόρων στη σύγχρονη έρευνα Τα μεγάλα πλεονεκτήματα των μικροδορυφόρων τους έχουν κάνει απαραίτητα εργαλεία σε πολλούς τομείς της σύγχρονης έρευνας. Μερικές από αυτές είναι: α) Κατασκευή και εμπλουτισμός γενετικών χαρτών: Πολλοί γενετικοί και κυτταρογενετικοί χάρτες έχουν φτιαχτεί με τη βοήθεια των μικροδορυφόρων. Αυτό γιατί είναι άφθονοι (άρα μπορούν να φτιάξουν χάρτες μεγάλης ανάλυσης), είναι υψηλά πολυμορφικοί και μπορούν να χαρτογραφηθούν κυτταρολογικά στα χρωμοσώματα. Παραδείγματα τέτοιων χαρτών έχουμε από διάφορους οργανισμούς, όπως το κουνούπι Anopheles gambiae (Zheng et al., 1993; 1996), τη Μεσογειακή Μύγα (Στρατικόπουλος, 2004), κ. α. (Μenotti-Raymond et al., 1999; Shimoda et al., 1999; Burt et al., 2003). β) Πληθυσμιακές μελέτες: Οι μικροδορυφόροι αποτελούν πολύ χρήσιμα εργαλεία για την ανάλυση φυσικών πληθυσμών (Caracristi and Schlotterer, 2003). Λόγω των χαρακτηριστικών τους που ήδη αναφέρθηκαν, η χρησιμοποίησή τους μπορεί να ανιχνεύσει πολύ μικρές διαφορές μεταξύ των πληθυσμών. Μπορούν να δώσουν απάντηση σε πλήθος ερωτημάτων της πληθυσμιακής γενετικής, όπως ανίχνευση φαινομένων στενωπού (Waldick et al., 2002), μελέτη της πορείας εξάπλωσης ενός είδους (Bonizzoni et al., 2002), στην ανάλυση του δραστικού μεγέθους και της αναπαραγωγικής ικανότητας ενός πληθυσμού (Matocq, 2004), ανίχνευση φαινομένων εισβολής, γονιδιακής ροής και μετανάστευσης (π.χ. για τον εντοπισμό της προέλευσης ειδών που δεν προϋπήρχαν σε κάποια περιοχή) (Meixner et al., 2002; Gasperi et al., 2002), στον υπολογισμό των γενετικών αποστάσεων μεταξύ δύο ή περισσότερων πληθυσμών (Goldstein et al., 1995), ακόμα και στη μελέτη της συμπεριφοράς ζευγαρώματος ειδών με οικονομική σημασία ή προστατευμένων ειδών (Estoup et al., 1995; Bonizzoni et al., 2002; Moore and Ball, 2002). Από την άλλη, θα

25 πρέπει να αναφερθεί ότι ο υψηλός πολυμορφισμός τους σε συνδυασμό με το γεγονός ότι α) δεν είναι δυνατή η εξακρίβωση της προέλευσης ενός αλληλομόρφου (αν προήλθε δηλαδή από κάποιο αλληλόμορφο με περισσότερες ή λιγότερες επαναλήψεις) και β) φαινόμενα ομοπλασίας (αλληλόμορφα με το ίδιο μέγεθος και ίσως τον ίδιο αριθμό επαναλήψεων, που όμως δεν έχουν ίδια εξελικτική πορεία) δεν τους κάνει ιδιαίτερα χρήσιμους δείκτες σε φυλογενετικές και ειδογενετικές μελέτες ή για τη μελέτη πληθυσμών που έχουν διαφοροποιηθεί αρκετά. Εντούτοις χρησιμοποιούνται με τη μέθοδο της δια-ειδικής ενίσχυσης (cross-species amplification), ελέγχονται δηλαδή οι εκκινητές που έχουν σχεδιαστεί σε ένα είδος στις μοναδικές περιοχές εκατέρωθεν της αλληλουχίας των επαναλήψεων για το κατά πόσο μπορούν να ενισχύσουν το ίδιο ή παρόμοιο προϊόν σε διαφορετικά, αλλά συγγενικά, είδη (Schlotterer et al., 1991; Rico et al., 1996). γ) Εφαρμογή επίσης βρίσκουν στην εγκληματολογία και στην ανίχνευση πατρότητας. Επειδή είναι άφθονοι και υψηλά πολυμορφικοί, είναι αδύνατο αν γίνει ανάλυση πολλών μικροδορυφόρων σε διαφορετικά άτομα, αυτά να εμφανίσουν το ίδιο ακριβώς πρότυπο. Λειτουργούν συνεπώς ως ένα είδος αποτυπώματος του ατόμου (γενετικό αποτύπωμα) που μπορεί να δείξει σχέσεις συγγένειας μεταξύ κάποιων ατόμων και να πιστοποιήσει ή να αποκλείσει την προέλευση ενός υλικού (αίμα, τρίχα, σπέρμα) από κάποιο συγκεκριμένο άτομο. iii.μηχανισμοί μετάλλαξης των μικροδορυφόρων Δυο είναι οι μηχανισμοί που έχουν προταθεί για να εξηγήσουν την αλλαγή στον αριθμό των μονάδων επανάληψης μιας μικροδορυφορικής αλληλουχίας. Ο πρώτος και πιο πιθανός από τα μέχρι τώρα στοιχεία αποδίδεται στο φαινόμενο του γλιστρήματος του DNA (DNA slippage) που συμβαίνει κατά την αντιγραφή του (Tachida and Iizuka, 1992). Συγκεκριμένα, κατά τη διάρκεια του διπλασιασμού του DNA, ανοίγει η διπλή έλικα του DNA και η πολυμεράση αντιγράφει τους δυο κλώνους, το μεν οδηγό κλώνο συνεχώς το δε συνοδό κλώνο ασυνεχώς, μέσω των κομματιών Okazaki. Όταν η νεοσυντιθέμενη αλυσίδα γλιστρά κατά μια επαναλαμβανόμενη μονάδα επάνω στην παλιά αλυσίδα μήτρα, η DNA πολυμεράση εξαναγκάζεται να προσθέσει μια επιπλέον επαναλαμβανόμενη μονάδα στη

26 νεοσυντιθεμένη αλυσίδα ώστε να κλείσει το κενό που δημιουργείται. Το αποτέλεσμα είναι η αύξηση του αριθμού των επαναλαμβανόμενων μονάδων του μικροδορυφόρου. Αντίθετα μείωση των μονάδων επανάληψης παρατηρείται όταν γλιστρά η αρχική αλυσίδα μήτρα, οπότε επιδιορθωτικά ένζυμα απομακρύνουν την πλεονάζουσα επαναλαμβανόμενη αλληλουχία (Moxon et al., 1994). Η σχηματική αναπαράσταση της διαδικασίας αυτής φαίνεται στο Σχήμα 1. Σχήμα 1 Σχηματική αναπαράσταση του φαινομένου γλiστρήματος του DNA Ορισμένες από τις αλλαγές αυτές στο μήκος της μικροδορυφορικής αλληλουχίας διορθώνονται είτε από τη δράση εξωνουκλεάσης της DNA πολυμεράσης είτε από επιδιορθωτικά ένζυμα. Μόνο όταν αυτές οι αλλαγές ξεφύγουν από τους επιδιορθωτικούς μηχανισμούς του κυττάρου έχουμε τη δημιουργία ενός διαφορετικού αλληλομόρφου, μιας μετάλλαξης. Για παράδειγμα, στη ζύμη έχει βρεθεί ότι οι τριπλέτες CTG/CAG και CGG/CCG μπορούν να σχηματίσουν δευτεροταγείς δομές (δομή φουρκέτας) που μπορούν να ξεφύγουν από το σύστημα επιδιόρθωσης λαθών (Moore et al., 1999). Συνεπώς, η αστάθεια των μικροδορυφόρων αντικατοπτρίζει μια ισορροπία μεταξύ της δημιουργίας λαθών κατά την αντιγραφή λόγω γλιστρήματος των αλυσίδων του DNA και της διόρθωσης ορισμένων από αυτά τα λάθη από την ίδια την πολυμεράση αλλά και τους μηχανισμούς επιδιόρθωσης. Όταν τα γονίδια που κωδικοποιούν ένζυμα που συμμετέχουν στους μηχανισμούς επιδιόρθωσης μεταλλάσσονται, τότε η αστάθεια των μικροδορυφόρων αυξάνεται. Η αποτελεσματικότητα του συστήματος επιδιόρθωσης λαθών μπορεί να επηρεαστεί από

27 πολλούς παράγοντες όπως η θέση του αντικανονικού ζευγαρώματος στο γονιδίωμα, η περιβάλλουσα αλληλουχία καθώς και ο βαθμός μεθυλίωσης (Eisen, 1999). Αν και τα γονίδια αυτά με τη δράση τους μειώνουν το ρυθμό μετάλλαξης των μικροδορυφόρων, αποτελεί παράδοξο το γεγονός ότι ορισμένα από αυτά περιέχουν μικροδορυφορικές αλληλουχίες εντός κωδικών τους περιοχών κάτι που καθιστά και τα ίδια ευάλωτα σε μεταλλάξεις (Chang et al., 2001). Μια δεύτερη θεωρία που έχει διατυπωθεί για να εξηγήσει το συγκεκριμένο είδος μετάλλαξης των μικροδορυφορικών αλληλουχιών είναι ο ανασυνδυασμός (Harding et al., 1992). Ο μηχανισμός αυτός μπορεί να οδηγήσει σε αλλαγή του μεγέθους ενός μικροδορυφόρου είτε με άνισο διασκελισμό είτε με γονιδιακή μετατροπή (Brohele and Ellegren, 1999; Hancock, 1999; Jakupciak and Wells, 2000; Richard and Paques, 2000). Υπάρχουν αρκετές μελέτες στις οποίες φαίνεται αφενός ο σημαντικός ρόλος της γονιδιακής μετατροπής στην αποσταθεροποίηση επαναλαμβανόμενων αλληλουχιών και αφετέρου η συνδυαστική δράση του άνισου διασκελισμού και της γονιδιακής μετατροπής στη συσσώρευση επαναλαμβανόμενων αλληλουχιών στο γονιδίωμα (Charlesworth et al., 1994). Παρότι ο ανασυνδυασμός μπορεί να οδηγήσει σε αλλαγή του μεγέθους ενός μικροδορυφόρου δεν φαίνεται να είναι και ο κύριος υπεύθυνος γι αυτήν τους την αστάθεια. Πειράματα των Levinson και Gutman, στα οποία χρησιμοποιήθηκαν στελέχη E. coli τα οποία διέθεταν ή όχι λειτουργικό σύστημα για ανασυνδυασμό, εμφάνισαν παρόμοιο ρυθμό μετάλλαξης (Levinson and Gutman, 1987). Επιπλέον, στις περιπτώσεις που μελετήθηκαν, δεν παρατηρήθηκε ταυτόχρονα ανασυνδυασμός και γειτονικών προς τους μικροδορυφόρους γενετικών μαρτύρων (Tautz and Schlotterer, 1994), χωρίς αυτό βέβαια να αποκλείει την περίπτωση μικρού εύρους ανασυνδυασμού ή άνισου διασκελισμού μεταξύ μη αδελφών χρωματίδων. Και η συνδυαστική όμως δράση των δυο παραπάνω μηχανισμών, του γλιστρήματος του DNA κατά την αντιγραφή και ανασυνδυασμός, μπορεί να είναι υπεύθυνη για την αστάθεια των μικροδορυφόρων.

28 iv. Λειτουργικός ρόλος των μικροδορυφόρων Ο λειτουργικός ρόλος ενός σημαντικού ποσοστού των μικροδορυφόρων έχει αποδειχτεί με διάφορα πειράματα σε διάφορα βιολογικά φαινόμενα (Treco and Arnheim, 1986; Dutreix, 1997; Kashi et al., 1997; Kashi and Soller, 1999; Marcotte et al., 1999; Saito and Tomita, 1999; Gur-Arie et al., 2000). Οργάνωση χρωματίνης α) Χρωμοσωμική οργάνωση: η διασπορά των μικροδορυφόρων στα γονιδιώματα δείχνει εν μέρει ένα πιθανό ρόλο στη συγκρότηση της χρωμοσωμικής δομής, η οποία είναι ειδική για κάθε ταξονομική ομάδα. Για παράδειγμα, μικροδορυφόροι βρέθηκαν σε αντίστοιχες χρωμοσωμικές θέσεις, ανεξαρτήτως του μοτίβου που περιείχαν και έδειξαν παρόμοια διασπορά στο σιτάρι και τη σίκαλη. Το γεγονός αυτό υποδηλώνει ένα ειδικό ρόλο των μικροδορυφόρων στη χρωμοσωμική οργάνωση του κοινού προγόνου των ειδών (Cuadrado and Schwarzacher, 1998). β) Δομή του DNA: Οι μικροδορυφορικές DNA αλληλουχίες μπορούν να σχηματίζουν μια σειρά από ασυνήθιστες δομές με απλά και σύνθετα πρότυπα διπλώματος (θηλιές). Για παράδειγμα, η φουρκέτα που σχηματίζεται από την επανάληψη (CCG) n του εύθραυστου Χ χρωμοσώματος και ο σύνθετος μικροδορυφόρος που αποτελείται από τις επαναλήψεις (GAA) n /(TTC) n δείχνουν ένα απλό δίπλωμα θηλιάς. Τέτοιες δομές μπορεί να έχουν σημαντική ρυθμιστική επίδραση στη γονιδιακή έκφραση (Fabregat et al., 2001). Ο αριθμός των επαναλήψεων φαίνεται να είναι μια κρίσιμη παράμετρος που καθορίζει την ισορροπία μεταξύ του πλεονεκτήματος που αποκτάται από μια ασυνήθιστη δομή κατά τη γονιδιακή έκφραση και του μειονέκτηματος της ίδιας δομής κατά την αντιγραφή (Catasti et al., 1999). γ) Κεντρομέρη και τελομέρη: Σε πολλά είδη, η κεντρομερική περιοχή αποτελείται από πολλές διαφορετικές επαναλήψεις που επηρεάζουν την οργάνωση του κεντρομέρους. Μικροδορυφορικές αλληλουχίες μεγάλου μήκους, με μοτίβο επανάληψης που αποτελείται από ένά ως τέσσερα ζεύγη βάσεων είναι συγκεντρωμένες στις κεντρομερικές περιοχές διαφόρων ειδών (Areshchencova and Ganal, 1999; Brandes et al., 1997; Schmidt and Heslop-Harisson, 1996). Το γεγονός ότι υπάρχει ποικιλία επαναλήψεων ειδικά στα κεντρομέρη και μάλιστα σε υψηλότερη οργάνωση φαίνεται ότι είναι ένα κοινό χαρακτηριστικό της οργάνωσης των

29 κεντρομερών πολλών οργανισμών, πράγμα που αποδεικνύει ότι οι εξελικτικοί μηχανισμοί που δημιουργούν και διατηρούν υψηλής τάξεως επαναλήψεις είναι συντηρημένοι μεταξύ των γονιδιωμάτων (Jansen et al., 1999). Το ότι οι επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες βρίσκονται σε πολλά διαφορετικά είδη σε θέσεις πρωτογενούς περίσφιξης επίσης δείχνει μια ισχυρή εξελικτική σχέση μεταξύ δομής και λειτουργίας κεντρομέρους (Eichler, 1999). Ίσως αυτές οι αλληλουχίες εκατέρωθεν των κεντρομερών να έχουν δύο λειτουργίες: α) τη σύνδεση των αδελφών χρωματίδων και β) την έμμεση βοήθεια στο σχηματισμό και τη λειτουργία του κινητοχώρου. Ρύθμιση μεταβολικών διεργασιών του DNA α) Ανασυνδυασμός: Πολλοί μίνι- και μικροδορυφόροι έχουν προταθεί ως περιοχές με αυξημένη συχνότητα ανασυνδυασμού (recombination hot-spots) (Jeffreys et al., 1998; Templeton et al., 2000). Το γεγονός αυτό έχει επιβεβαιωθεί με πειράματα σε διάφορους οργανισμούς (Wahls and Moore, 1990a; 1990b; Treco and Arnheim, 1986; Aharoni et al., 1993; Majewski and Ott, 2000; Murphy and Stringer, 1986). β) Αντιγραφή DNA και κυτταρικός κύκλος: Οι μικροδορυφόροι μπορούν να επηρεάζουν την αντιγραφή (Field and Wills, 1996) ή να επηρεάζουν ένζυμα που ελέγχουν τον κυτταρικό κύκλο. Οι περισσότεροι όγκοι που παρουσιάζουν μικροδορυφορική αστάθεια έχουν μεταλλάξεις σε περισσότερα του ενός από αυτά τα γονίδια και οι μεγαλύτερες επαναλήψεις αποτελούν συχνότερο στόχο της μεταλλαξιγένεσης (Johannsdottir et al., 2000). Υπάρχουν ακόμη ενδείξεις για σύνδεση μεταξύ των σημείων ελέγχου της επιδιόρθωσης του DNA και του κυτταρικού κύκλου: το σύστημα επιδιόρθωσης παράταιρων ζευγών (MMR) αλληλεπιδρά με το G2 σημείο ελέγχου του κυτταρικού κύκλου, ως απόκριση σε βλάβες του DNA που επάγονται από (TG) 6 επαναλήψεις και άλλους παράγοντες (Hawn et al., 1995). γ) Οι μικροδορυφόροι στα γονίδια MMR ως ρυθμιστές του εξελικτικού μεταλλακτικού ρυθμού: Οι MMR πρωτεΐνες διορθώνουν τα λάθη της αντιγραφής και ενεργά εμποδίζουν τον ανασυνδυασμό μεταξύ αλυσίδων που διαφέρουν (Chen and Jinks-Robertson, 1998; Kolodner and Marsischky, 1999), ελέγχοντας συνεπώς τους ρυθμούς μεταλλαξιγένεσης. Έχει βρεθεί ότι η ύπαρξη Α n μικροδορυφορικών αλληλουχιών στις κωδικές περιοχές των μικρότερων MMR γονιδίων (MSH3, MSH6, PMS2, MLH3) είναι ένα γενικό χαρακτηριστικό μεταξύ των ευκαρυωτικών

30 οργανισμών, συμπεριλαμβανομένων των Mus musculus, Sacharomyces cerevisiae, S. pombe, Drosophila melenogaster, A. thaliana, του προκαρυωτικού οργανισμού E. coli και του ανθρώπου (Chang et al., 2001). Επειδή οι αλληλουχίες αυτές είναι ευάλωτες σε μεταλλάξεις προσθαφαίρεσης βάσεων και από τη στιγμή που βρίσκονται εντός των κωδικών περιοχών των γονιδίων, είναι αναμενόμενο ότι συχνά προκαλούν απώλεια της λειτουργίας των γονιδίων τους λόγω μεταλλάξεων μετατόπισης αναγνωστικού πλαισίου (Moxon et al., 1994) Ρύθμιση της γονιδιακής δραστηριότητας α) Μικροδορυφόροι και μεταγραφή: Υπάρχουν πολλές ενδείξεις ότι οι μικροδορυφόροι που βρίσκονται σε περιοχές υποκινητών μπορούν να επηρεάσουν τη μεταγραφική δραστηριότητα. Η (CT) n αλυσίδα σε περιοχές υποκινητών έχει βρεθεί ότι λειτουργεί ως μεταγραφικό στοιχείο για το γονίδιο των θερμοεπαγώμενων hsp26 πρωτεϊνών σε διάφορους οργανισμούς (Sandaltzopoulos et al., 1995; Punt et al., 1990; Chen and Roxby, 1997). Οι μικροδορυφόροι που βρίσκονται σε εσώνια μπορούν επίσης να επηρεάσουν τη γονιδιακή δραστηριότητα. Π.χ. ένας τετρανουκλεοτιδικός μικροδορυφόρος στο πρώτο εσώνιο του γονιδίου της υδροξυλάσης της τυροσίνης δρα ως στοιχείο ρύθμισης της μεταγραφής (Meloni et al., 1998). Ακόμα, μια (CA) n αλυσίδα που τοποθετείται στο πρώτο εσώνιο του γονιδίου EGFR επηρεάζει τη μεταγραφική δραστηριότητα (Gebhardt et al., 1999; 2000). Είναι αξιοσημείωτο ότι οι τρινουκλεοτιδικοί μικροδορυφόροι μπορεί να βρίσκονται σε περίσσεια σε ρυθμιστικά γονίδια που σχετίζονται με τη μεταγραφή και τη μεταβίβαση σήματος, ενώ υπο-αντιπροσωπεύονται σε γονίδια δομικών πρωτεϊνών (Young et al., 2000). Το γεγονός αυτό επίσης αποτελεί ένδειξη του ρόλου των μικροδορυφόρων στη ρύθμιση της μεταγραφής. β) Επίδραση του αριθμού των επαναλήψεων στη γονιδιακή έκφραση: Σε πολλές περιπτώσεις, ο αριθμός των επαναλήψεων εμφανίζεται να είναι ένας βασικός παράγοντας για τη γονιδιακή έκφραση, αλλά και τα επίπεδά της. Μερικά γονίδια μπορούν να εκφράζονται μόνο όταν υπάρχει ένας συγκεκριμένος αριθμός επαναλήψεων στους μικροδορυφόρους τους. Για παράδειγμα, η (GAA) 12 αλληλουχία στον υποκινητή του lacz γονιδίου της E. coli επιτρέπει την έκφραση του γονιδίου, ενώ οι αλληλουχίες (GAA) 5-11 και (GAA) δεν επιτρέπουν την έκφραση (Liu et al., 2000). Πολλά γονίδια εκφράζονται εντός ενός στενού εύρους επαναλήψεων και εκτός

31 αυτού η δραστηριότητα σταματάει. Στη ζύμη, ο υποκινητής του γονιδίουura3 περιέχει μία (CTG/CAG) n αλληλουχία, όπου το n=25 επιτρέπει την έκφραση, ενώ το n>30 την εμποδίζει (Miret et al., 1998). Πολλές παρατηρήσεις, τόσο in vivo όσο και in vitro, σε ελεγχόμενα πειράματα με διάφορους οργανισμούς, δείχνουν τη σημασία του αριθμού των επαναλήψεων στη - σχετιζόμενη με μικροδορυφόρους- ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης. γ) Δέσμευση πρωτεϊνών: Πολλοί μικροδορυφόροι, σε αλληλουχίες ενεργοποίησης που βρίσκονται ανοδικά των γονιδίων, δρουν ως θέσεις δέσμευσης για μια ποικιλία ρυθμιστικών πρωτεϊνών (Lue et al., 1989; Csink and Henikoff, 1998). Πρωτεΐνες που δεσμεύονται σε μονόκλωνες πολύ-gt και πολύ-ga αλυσίδες έχουν αναγνωριστεί σε ανθρώπινους ινοβλάστες (Aharoni et al., 1993). Αλληλουχίες (GT) n ή (GT) n (GA) m είναι συντηρημένες σε γονίδια που σχετίζονται με το ανοσοποιητικό σύστημα για τουλάχιστον 70Χ10 6 χρόνια και δεσμεύουν πυρηνικά πρωτεϊνικά μόρια με υψηλή συγγένεια (Epplen et al., 1993). Ο αριθμός των επαναλήψεων μπορεί επίσης να επηρεάσει τη δέσμευση των πρωτεϊνών. Για παράδειγμα, η πρωτεΐνη datin δεσμεύεται σε πολύ-τ αλυσίδες με 19, 15 και 11 νουκλεοτίδια αλλά δεν δεσμεύεται όταν υπάρχουν 3, 5, 7 ή 8 νουκλεοτίδια (Winter and Varshavsky, 1989). Παρόμοια αποτελέσματα υπάρχουν και από τον πράσινο αφρικανικό πίθηκο για την α-ssr δεσμευόμενη πρωτεΐνη (Solomon et al., 1986). δ) Μικροδορυφόροι και μετάφραση: Πολλές μελέτες δείχνουν την επίδραση των μικροδορυφόρων στη μετάφραση. Ένα από τα παραδείγματα που φανερώνει τη σχέση αυτή αφορά την (CA) n αλληλουχία που βρίσκεται καθοδικά διαφόρων γονιδίων και αυξάνει τη μετάφραση τους στο mrna της E. coli (Martin-Farmer and Janssen, 1999). Μια μετρίου μεγέθους επέκταση της CGG αλληλουχίας μπορεί να μειώσει σημαντικά τη μετάφραση του CAT γονιδίου (Sandberg and Schalling, 1997). v. Σχέση των μικροδορυφόρων με διάφορες γενετικές ασθένειες Διάφοροι μικροδορυφόροι φαίνεται να εμπλέκονται σε πολλές μορφές καρκίνου και σε διάφορες γενετικές ασθένειες στον άνθρωπο. Περίπου το 15% των περιπτώσεων καρκίνου του ορθού, όπως και σε πολλές άλλες θέσεις, παρουσιάζουν αστάθεια μικροδορυφόρων (Atkin, 2001). Η σταδιακή συσσώρευση αστάθειας ενοχοποιείται και για την ανάπτυξη καρκίνου του στομάχου (Leung et al., 2000).