Βιοτεχνολογία Φυτών. Μοριακοί Δείκτες (Εισαγωγή στη Μοριακή Βιολογία)

Transcript

1 Βιοτεχνολογία Φυτών ΔΠΘ / Τμήμα Αγροτικής Ανάπτυξης ΠΜΣ Αειφορικά Συστήματα Παραγωγής και Περιβάλλον στη Γεωργία Μοριακοί Δείκτες (Εισαγωγή στη Μοριακή Βιολογία) Αριστοτέλης Χ. Παπαγεωργίου Εργαστήριο Δασικής Γενετικής / ΔΠΘ

2 Πλάνο μαθήματος Εισαγωγή στη Μοριακή Βιολογία Βασικές έννοιες Γενετικής Μοριακοί δείκτες Απομόνωση DNA PCR Ηλεκτροφόρηση Γενετική ποικιλότητα (επανάληψη) Ανάλυση εργαστηριακών αποτελεσμάτων

3 Μοριακή Βιολογία Ο κλάδος της βιολογίας που μελετά την δομή, τη σύνθεση και τη λειτουργία της γενετικής πληροφορίας(dna και RNA) σε μοριακό επίπεδο, καθώς και το πώς αυτή αλληλεπιδρά με πρωτεΐνες. Σύνθετη επιστήμη που σχετίζεται με τη Γενετική, τη Βιοχημεία και την Πληροφορική (μεταξύ άλλων). Οι εφαρμογές της αξιοποιούνται σε πολλά πεδία της επιστήμης, της τεχνολογίας και της καθημερινότητάς μας. Έδωσε πειραματικό πεδίο στη Γενετική και μέσα από τους Γονιδιακούς Δείκτες μπορούμε να μελετήσουμε τη γενετική ποικιλότητα.

4 Το φυτικό κύτταρο

5 Το γένωμα Γένωμα ή γονιδίωμα (genome) Το σύνολο της γενετικής πληροφορίας ενός οργανισμού Βρίσκεται κωδικοποιημένη (η πληροφορία) στο DNA σε κάποιους ιούς στο RNA

6 Το ανθρώπινο γένωμα

7 DNA και RNA μεγάλα αλυσιδωτά πολυμερή (μακρομόρια) δομική μονάδα το νουκλεοτίδιο

8 Νουκλεοτίδιο Δεσοξυριβόζη ή ριβόζη (πεντόζη), με 3 OH Φώσφορος (στον άνθρακα 5 ) Αζωτούχα βάση

9 Δύο τύποι βάσεων στο DNA Οι πουριμιδίνες είναι βάσεις με ένα δαχτυλίδι. N N C OC C N C Οι πουρίνες σχηματίζουν δύο κύκλους. N N C C C N C N NC

10 Πουρίνες και πουριμιδίνες

11 Συνδεσιμότητα βάσεων

12 Διπλή έλικα

13 Γονίδιο και αλληλόμορφο Μαθηματική έννοια: φορέας της κληρονομικής πληροφορίας Μοριακή έννοια: τμήμα του μορίου DNA έχει συγκεκριμένη αλληλουχία νουκλεοτιδίων κωδικοποιεί ένα πολυπεπτίδιο καταλαμβάνει θέση πάνω στο χρωμόσωμα που λέγεται γονιδιακή θέση (gene locus) Αλληλόμορφο: εναλλακτική μορφή του ίδιου γονιδίου εναλλακτική αλληλουχία του DNA στην ίδια γονιδιακή θέση κάθε διπλοειδής οργανισμός έχει δύο αλληλόμορφα, ένα από κάθε γονέα

14 Δομή ενός γονιδίου Κάθε γονίδιο περιέχει μικρά εξώνια στα οποία παρεμβάλλονται μεγαλύτερα εσώνια, που δεν μεταφράζονται.

15 Οργάνωση του DNA

16 Το RNA Μονόκλωνο μακρομόριο με παρόμοια σύνθεση με το DNA σκελετός από ριβόζη U αντί για Τ (που συνδέεται με την Α) Τρεις κατηγορίες RNA messenger RNA (mrna) transfer RNA (trna) ribosomal RNA (rrna)

17 Αγγελιοφόρο RNA Προκύπτει από τη μεταγραφή των γονιδίων πάνω στο DNA Περιέχει και μεταφέρει κωδικοποιημένη την πληροφορία που απαιτείται για την παραγωγή ενός πολυπεπτιδίου Μεταφέρει τη γενετική πληροφορία από τον πυρήνα στο κυτόπλασμα (ριβοσώματα)

18 Μεταφορικό RNA

19 Ριβοσωμικό RNA Κεντρική δομή του ριβοσώματος σύμπλοκο rrna και πρωτεϊνών Παρέχει ένα μηχανισμό αποκωδικοποίησης του mrna σε πρωτεΐνη

20 Κεντρικό δόγμα της Μοριακής Βιολογίας

21 Κεντρικό δόγμα της Μοριακής Βιολογίας

22 Αντιγραφή του DNA

23 Μεταγραφή (DNA -> RNA)

24 Μετάφραση (RNA -> πρωτεΐνη)

25 Δομή του mrna

26 Πρωτεΐνες Αλυσιδωτά πολυμερή από λίγα ως χιλιάδες αμινοξέα Αμινοξέα αντιστοιχούν σε κωδικώνια mrna τρία νουκλεοτίδια Δομή σε τέσσερα επίπεδα πρωτοταγής: αλυσίδα αμινοξέων δευτεροταγής: αλυσίδα αμινοξέων που συνδέονται με σημεία με δεσμούς υδρογόνου (διπλώνει) τριτοταγής: δημιουργείται τρισδιάσταση δομή (πολυπεπτίδιο) τεταρτοταγής: σύμπλοκο από τριτοταγείς δομές

27 Δομή πρωτεϊνών

28 Γενετική ποικιλομορφία Είναι η βάση της εξέλιξης Προϋπόθεση προσαρμογής σε νέα περιβάλλοντα Το μέρος της ποικιλότητας που κληρονομείται Η μελέτη της είναι σημαντική για τη βιοτεχνολογία Περιγραφή γενετικών διαφορών μεταξύ οργανισμών Περιγραφή ή σήμανση συγκεκριμένων γονιδίων Ταυτοποίηση ποικιλιών και γενοτύπων Μέτρηση εξελικτικών παραμέτρων Μετανάστευση Αναπαραγωγή Παρακολούθηση προγραμμάτων βιοτεχνολογίας ή βελτίωσης

29 Στο εργαστήριο Θέλουμε να δούμε τη γενετική ποικιλότητα Χρειαζόμαστε χαρακτηριστικά όπου ο φαινότυπος να φανερώνει το γενότυπο απλό πρότυπο κληρονόμησης ανεξαρτησία από το περιβάλλον Επίσης θέλουμε συγκυριαρχία να μην κοστίζει να εμφανίζεται πολυμορφισμός Ακόμα θα θέλαμε: να βλέπουμε πολυμορφισμό που να ξέρουμε τι σημαίνει Να έχουμε αντιπροσωπευτική εικόνα του γενώματος τα γονίδια που βλέπουμε να σχετίζονται με την προσαρμογή τα γονίδια που βλέπουμε να ελέγχουν σημαντικούς χαρακτήρες Πολλά θέλουμε...

30 Χαρακτηριστικά που βλέπουμε Στο πεδίο (φύση, χωράφι, κλπ.) χαρακτηριστικά που έχουν νόημα για την πράξη επίδραση από το περιβάλλον και πολλαπλά γονίδια Στο εργαστήριο μοριακοί δείκτες συνήθως τμήματα DNA 100% γενετικές διαφορές Δεν ξέρουμε πάντα τι σημαίνουν οι πολυμορφισμοί Όλα αυτά πλέον αλλάζουν (βλ. Γενωμική)

31 Μοριακοί δείκτες Δείκτες που βασίζονται στη Μοριακή Βιολογία Επίπεδο DNA ή ενζύμων (συνήθως) Βασικές κατηγορίες Ισοένζυμα Μήκος τμημάτων DNA Αλληλουχίες τμημάτων των γενωμάτων (ή ολόκληρων)

32 Ηλεκτροφόρηση

33 Ηλεκτροφόρηση

34 Ισοένζυμα A B heterozygous A A B B homozygous allele B allele A Zymogram +

35 PCR Σήμερα οι δείκτες DNA βασίζονται στην PCR Διαδικασία πολλαπλασιασμού (πολυμερισμού) συγκεκριμένων τμημάτων DNA Βασίζεται πάνω στην εναλλαγή των θερμοκρασιών Παράγει εκατομμύρια αντίτυπα από ένα αρχικό τμήμα DNA

36 Διαδικασία PCR

37 Συσκευή PCR

38 Ουδέτεροι κυρίαρχοι δείκτες Random Amplified Polymorphic DNA RAPD PCR Ηλεκτροφόρηση

39 Ουδέτεροι κυρίαρχοι δείκτες Random Amplified Polymorphic DNA RAPD

40 Ουδέτεροι κυρίαρχοι δείκτες

41 Ουδέτεροι κυρίαρχοι δείκτες Inter-Simple Sequence Repeat (ISSR)

42 Ένζυμα περιορισμού

43 Ουδέτεροι κυρίαρχοι δείκτες Amplified Fragments Length Polymorphism

44 Ουδέτεροι κυρίαρχοι δείκτες AFLP

45 Ηλεκτροφόρηση στηλών

46 Αποτελέσματα AFLP

47 Ουδέτεροι κυρίαρχοι δείκτες Παράγουν μια σειρά δυαδικών αποτελεσμάτων (0/1) Στοχεύουν τυχαία σημεία στο γένωμα Αντιπροσωπευτικότητα Εύκολοι στη χρήση και σχετικά οικονομικοί δείκτες Ιδανικοί δείκτες αν δεν γνωρίζουμε στοιχεία του γενώματος από πριν Δεν είναι εύκολα επαναλήψιμοι και απαιτούν σύγκριση όλων των δειγμάτων σε μία αντίδραση Είναι κυρίαρχοι δείκτες και απαιτούν τη χρήση θεωρητικών μοντέλων για την περιγραφή της ποικιλότητας Ιδανικοί για ταυτοποίηση γενοτύπων.

48 Ανάλυση στοχευμένων τμημάτων DNA Δείκτες που εξετάζουν τον πολυμορφισμό σε συγκεκριμένα τμήματα του DNA Χρειάζεται να σχεδιαστούν πάνω σε γνωστές αλληλουχίες και συχνά είναι εξειδικευμένοι για συγκεκριμένα είδη γένη Το πρώτο στάδιο της ανάλυσης είναι πάντα ο πολυμερισμός ενός συγκεκριμένου τεμαχίου DNA με PCR Στη συνέχεια εξετάζεται η ποικιλότητα ανάμεσα στα δείγματα της ανάλυσης Με χώνευση ενζύμων περιορισμού και σύγκριση μήκους τεμαχίων Με σύγκριση του μήκους των τεμαχίων Με αλληλούχιση των τεμαχίων

49 PCR RFLP Πολυμερισμός συγκεκριμένου τεμαχίου DNA Χώνευση με ένζυμα περιορισμού που στοχεύουν σε σημείο πολυμορφισμού (SNP) Ηλεκτροφόρηση και διαχωρισμός τεμαχίων DNA με διαφορετικό μήκος

50 Μικροδορυφόροι SSR Συχνές μεταλλάξεις, προκαλούν μεγάλο πολυμορφισμό στον αριθμό των επαναλαμβανόμενων μοτίβων

51 SSR δείκτες

52 SSR δείκτες

53 SSR δείκτες

54 Αλληλούχιση μικροδορυφόρων

55 Αλληλούχιση μικροδορυφόρων

56 Πολυμορφισμοί σε μία θέση (SNP)

57 Αλληλούχιση τεμαχίων DNA (sequencing) Αλληλούχιση κατά Sanger Απόκτηση τεμαχίου και πολυμερισμός με PCR Απόκτηση πλήρους αλληλουχίας του τεμαχίου και σύγκριση μεταξύ διαφορετικών δειγμάτων Εντοπισμός SNPs

58 Συσκευή αλληλούχισης Sanger

59 Εντοπισμός SNP σε αλληλουχίες

60 Εντοπισμός πιθανού indel

61 Πολυμορφισμός σε επίπεδο DNA

62 Δίκτυο απλοτύπων cpdna

63 Γεωγραφική κατανομή απλοτύπων

64 Γενωμική (genomics) Μελέτη αλληλουχιών συγκεκριμένων γονιδίων που γνωρίζουμε τη λειτουργία τους Πολυμορφισμός Έρευνα προσαρμογών Σημαντική εφαρμογή σε επιστήμες υγείας και αγροτικής παραγωγής βιοτεχνολογίας