ΑΡΧΕΣ ΥΓΡΗΣ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑΣ ΥΨΗΛΗΣ ΑΠΟΔΟΣΕΩΣ (HPLC)

Transcript

1 - 1 - ΕΝΟΤΗΤΑ Α ΑΡΧΕΣ ΥΓΡΗΣ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑΣ ΥΨΗΛΗΣ ΑΠΟΔΟΣΕΩΣ (HPLC) Ο καθορισμός της δομής και η μελέτη των ιδιοτήτων μιας ουσίας προϋποθέτουν την απομόνωσή της σε καθαρή κατάσταση. Για τον καθαρισμό των οργανικών ενώσεων υπάρχουν διάφορες μέθοδοι, όπως η ανακρυστάλλωση, η απόσταξη, η εξάχνωση κ.α. Για το διαχωρισμό όμως ουσιών με παραπλήσια δομή χρησιμοποιείται κυρίως η μέθοδος της χρωματογραφίας η οποία είναι όχι μόνο αποτελεσματική αλλά και εύκολη και γρήγορη. Η αρχή της μεθόδου στηρίζεται στη διαφορετική κατανομή των συστατικών ενός μίγματος μεταξύ δύο φάσεων, μιας ακίνητης (stationary phase) και μιας κινητής (mobile phase). Η κινητή φάση μετακινεί τα συστατικά του μίγματος επί της ακίνητης με διαφορετική ταχύτητα. Μια ουσία, η οποία συγκρατείται ισχυρότερα από την ακίνητη φάση, μετακινείται με μικρότερη ταχύτητα από κάποια άλλη, η οποία συγκρατείται λιγότερο ισχυρά. Επειδή τα μόρια του μίγματος κατανέμονται συγχρόνως και στις δύο φάσεις αποκαθίσταται μια δυναμική ισορροπία για κάθε κατηγορία μορίων. Η κατανομή των μορίων ενός δείγματος μεταξύ των δύο φάσεων εξαρτάται από μια σταθερά ισορροπίας, η οποία ονομάζεται συντελεστής κατανομής κ. Οι συγκεντρώσεις της ουσίας στις δύο φάσεις και ο συντελεστής κατανομής συνδέονται μεταξύ τους με τη σχέση κ=c A /C B, όπου C A η συγκέντρωση της ουσίας στην ακίνητη φάση και C B η συγκέντρωση της ουσίας στην κινητή φάση. Ανάλογα με τη φυσική κατάσταση της κινητής και της ακίνητης φάσης διακρίνονται τα παρακάτω είδη χρωματογραφίας:

2 Αέρια χρωματογραφία (GC, κινητή φάση αέριο), η οποία διακρίνεται σε δυο κατηγορίες: Χρωματογραφία αερίου-στερεού (GSC, ακίνητη φάση στερεό) Χρωματογραφία αερίου-υγρού (GLC, ακίνητη φάση υγρό, προσροφημένο επί κατάλληλου αδρανούς στερεού υλικού) 2. Υγρή χρωματογραφία (LC, κινητή φάση υγρό), η οποία διακρίνεται σε δύο κατηγορίες: Χρωματογραφία υγρού-στερεού (LSC, ακίνητη φάση στερεό) Χρωματογραφία υγρού-υγρού (LLC, ακίνητη φάση υγρό προσροφημένο επί κατάλληλου στερεού υλικού) Η κλασική χρωματογραφία στήλης χρησιμοποιείται ευρέως στην προκατεργασία πολύπλοκων δειγμάτων, τα οποία χρειάζονται προκαταρκτικό διαχωρισμό, πριν αναλυθούν με μία ενόργανη αναλυτική τεχνική. Εξαιτίας των χρησιμοποιούμενων στηλών (σχετικά μεγάλης διαμέτρου και πληρωμένες με μεγάλης διαμέτρου σωματίδια πληρωτικού υλικού) και των μικρών ταχυτήτων ροής της κινητής φάσεως, ο χρόνος ο οποίος απαιτείται για ένα διαχωρισμό με την κλασική χρωματογραφία στήλης είναι σχετικά μεγάλος. Με την ανάπτυξη της υγρής χρωματογραφίας υψηλής αποδόσεως (High Performance Liquid Chromatography, HPLC) οι χρόνοι διαχωρισμού μειώθηκαν σημαντικά. Κατά την τεχνική αυτή το υλικό πληρώσεως της στήλης είναι λεπτότατου διαμερισμού (σωματίδια πολύ μικρής διαμέτρου) και έχει υψηλή σφαιρική κανονικότητα έτσι, ώστε να επιτυγχάνονται μεγάλου βαθμού ομοιομορφία και πυκνότητα πληρώσεως. Η υψηλή πυκνότητα πληρώσεως όμως με αυτά τα πολύ μικρά σωματίδια μειώνει τη ταχύτητα ροής της κινητής φάσεως μέσα από τη στήλη (μεγάλη αντίσταση μεταφοράς) και για να επιτευχθεί μία λογική ταχύτητα ροής απαιτείται η εφαρμογή υψηλής πιέσεως στην κινητή φάση. Τα βασικά τμήματα μιας συσκευής HPLC είναι: 1) σύστημα παροχής κινητής φάσεως, 2) σύστημα εισαγωγής δείγματος, 3) στήλη, 4) ανιχνευτής και 5) καταγραφέας.

3 - 3 - Το σύστημα παροχής κινητής φάσεως αποτελείται από μία αντλία υψηλής πιέσεως και ένα σύστημα για τη βαθμιαία αλλαγή της συστάσεως της κινητής φάσεως. Όταν η κινητή φάση έχει σταθερή σύσταση έχουμε ισοκρατική έκλουση (isocratic elution), ενώ όταν μεταβάλλεται βαθμιαία έχουμε βαθμιδωτή έκλουση (gradient elution). Για την επίτευξη της βαθμιδωτής εκλούσεως, απαιτείται μια μονάδα προγραμματισμού και ελέγχου του συστήματος παροχής. Οι χρησιμοποιούμενοι διαλύτες πρέπει να είναι διαφορετικής πολικότητας (πλήρως αναμίξιμοι), ή διαλύματα διαφορετικού ph, ή διαφορετικής ιονικής ισχύος ή συγκεντρώσεως κάποιου άλατος, ανάλογα με το είδος του επιδιωκόμενου μηχανισμού διαχωρισμού. Οι χρησιμοποιούμενοι διαλύτες πρέπει επίσης να είναι υψηλής καθαρότητας και πριν τη χρήση τους διηθούνται από ειδικά φίλτρα υπό κενό και απαερώνονται. Το σύστημα εισαγωγής δείγματος (injector) είναι μια περιστρεφόμενη βαλβίδα υψηλής πιέσεως, με βρόχο δείγματος. Στη θέση φορτώσεως η κινητή φάση προωθείται προς τη στήλη χωρίς να περνά από το βρόχο ο οποίος έχει πληρωθεί με το προς ανάλυση διάλυμα του δείγματος, ενώ στη θέση εισαγωγής η κινητή φάση παρασύρει ποσοτικά τον όγκο του δείγματος και τον προωθεί προς τη στήλη. Οι χρησιμοποιούμενοι ανιχνευτές πρέπει να έχουν υψηλή ευαισθησία ικανοποιητικού κατώτατου ορίου ανίχνευσης, χαμηλά επίπεδα θορύβου, να μην επηρεάζονται από

4 - 4 - μεταβολές της θερμοκρασίας και της ταχύτητας ροής του υγρού εκλούσεως κ.ά.. Οι πιο συχνά χρησιμοποιούμενοι ανιχνευτές είναι οι διαφορικοί ανιχνευτές δείκτη διαθλάσεως, οι ανιχνευτές υπεριώδους-ορατού, οι ανιχνευτές φθορισμού, οι ανιχνευτές υπερύθρου, οι ηλεκτροχημικοί ανιχνευτές. Η τεχνική HPLC μπορεί να χρησιμοποιηθεί για διαχωρισμούς βασισμένους σε προσρόφηση, κατανομή, ιονανταλλαγή και μοριακό αποκλεισμό, ενώ για κάθε μία εφαρμογή διατίθενται από διάφορες παρασκευάστριες εταιρείες οι κατάλληλες στήλες. Οι χρησιμοποιούμενες στήλες είναι ευθύγραμμοι σωλήνες από χάλυβα, οι οποίες αγοράζονται έτοιμες από τις διάφορες παρασκευάστριες εταιρείες. Εξαιτίας των υψηλών πιέσεων που ασκούνται (μέχρι 5000 p.s.i) τα κλασσικά υλικά πληρώσεως των στηλών, όπως Sephadex και Sepharose, δεν μπορούν να χρησιμοποιηθούν. Έτσι στην HPLC χρησιμοποιούνται συνήθως πολυμερή διοξειδίου του πυριτίου (silica) ή αλουμίνας (alumina). Στην περίπτωση εκείνη, όπου η στατική φάση είναι πολικότερη από την κινητή φάση και τα πολικότερα συστατικά του δείγματος προσκολλώνται ισχυρότερα στην στατική φάση και επομένως εκλούονται αργότερα από τα λιγότερο πολικά συστατικά, η τεχνική ονομάζεται υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης κανονικής φάσεως (Normal Phase High Performance Liquid Chromatography). Κατά την τεχνική αυτή ο χρόνος έκλουσης (t R ) των συστατικών μπορεί να μεταβληθεί μεταβάλλοντας την πολικότητα του διαλύτη έκλουσης. Στην περίπτωση εκείνη, όπου η στατική φάση είναι λιγότερο πολική από την κινητή φάση και τα πολικότερα συστατικά του δείγματος προσκολλώνται ασθενέστερα στην στατική φάση και επομένως εκλούονται γρηγορότερα από τα λιγότερο πολικά συστατικά, η τεχνική ονομάζεται υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης ανάστροφης φάσεως (Reversed Phase High Performance Liquid Chromatography, RP-HPLC). Κατά την RP-HPLC χρησιμοποιούνται υλικά πληρώσεως (κυρίως μικροπορώδη σωματίδια πηκτής διοξειδίου του πυριτίου) με χημικά συνδεδεμένες στατικές φάσεις (chemically bonded stationary phases). Τα σωματίδια αυτά είναι συνήθως διαμέτρου 5 10 μm με πόρους 20 nm και διαθέτουν μεγάλη επιφάνεια επαφής στην οποία συνδέονται ομοιοπολικά οι στατικές φάσεις (αλκυλομάδες και άλλες δραστικές ομάδες). Στατικές φάσεις αλκυλομάδων με αλυσίδες C 8 Η 17 (octyl) και C 18 Η 37 (octadecyl) δεσμευμένες στη silica είναι ευρέως διαδεδομένες και

5 - 5 - βρίσκουν εφαρμογές σε διαχωρισμούς αμινοξέων, πεπτιδίων, πρωτεϊνών, βιταμινών, λιπών, στεροειδών, αντιβιοτικών, νουκλεοτιδίων, σακχάρων κ.ά. Κατά την RP-HPLC η ισχύς έκλουσης αυξάνει με την παράλληλη μείωση της πολικότητας του διαλύτη, διότι έτσι ελαττώνεται η συγκράτηση μιας ουσίας στη στατική φάση. Στην περίπτωση ουσιών που μπορούν να υποστούν ιονισμό, μια αλλαγή στο ph μπορεί να επηρεάσει την συγκράτηση και την εκλεκτικότητά τους. Σε ένα καλό χρωματογραφικό σύστημα αναλύσεως πρέπει να επιτυγχάνεται διαφορετική ταχύτητα μετακινήσεως των ζωνών των συστατικών, λόγω του διαφορετικού βαθμού συγκρατήσεως τους στη στατική φάση. Συχνά είναι αναγκαίο να εκτελεσθεί μία προκαταρκτική χρωματογραφική κλασμάτωση ενός μείγματος πολλών συστατικών και να ακολουθήσει ανάλυση κάθε κλάσματος με την HPLC. Στο παρακάτω σχήμα παρουσιάζεται ένα χρωματογράφημα HPLC στο οποίο είναι σχεδιασμένη η απόκριση του ανιχνευτή έναντι του χρόνου. Χρωματογράφημα HPLC, όπου t o χρόνος που χρειάζεται το μέτωπο του διαλύτη για να εξέλθει από τη στήλη και t R ο χρόνος συγκράτησης της ουσίας που εκλούεται Γενικά, ο διαχωρισμός μιας συγκεκριμένης ουσίας εξαρτάται από το μοριακό βάρος, τη διαλυτότητα και τη χημική της δομή. Τα κριτήρια για την επιλογή διαλύτη κατάλληλου για έκλουση εξαρτώνται από τις φυσικοχημικές ιδιότητες του δείγματος και της εκλουστικής ικανότητας του διαλύτη.

6 - 6 - Τέλος η συνδυασμένη τεχνική υγρής χρωματογραφίας-φασματομετρίας μάζας (LC- MS) χαρακτηρίζεται από εξαιρετική ευαισθησία, εκλεκτικότητα και αξιοπιστία. Η τεχνική LC-MS χρησιμοποιείται για την ταυτοποίηση ουσιών σε πολύπλοκα βιολογικά δείγματα. Σύστημα υγρής χρωματογραφίας-φασματομετρίας μάζας (LC-MS) ΑΣΚΗΣΗ 1 ΔΙΑΧΩΡΙΣΜΟΣ ΣΥΣΤΑΤΙΚΩΝ ΑΙΘΕΡΙΩΝ ΕΛΑΙΩΝ ΜΕ ΤΗ ΧΡΗΣΗ ΥΓΡΗΣ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑΣ ΥΨΗΛΗΣ ΑΠΟΔΟΣΗΣ (HPLC) Η υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC) μπορεί να χρησιμοποιηθεί για το διαχωρισμό και την ποιοτική και ποσοτική ανάλυση πολύπλοκων μειγμάτων ουσιών ποικίλης προελεύσεως. Αποτελεί την τεχνική επιλογής σε πολλά προβλήματα φαρμακευτικής ανάλυσης και χρησιμοποιείται ευρέως στην ανάλυση βιολογικών δειγμάτων, τα οποία περιέχουν τα φυσιολογικά συστατικά, τα χορηγούμενα φάρμακα και τους μεταβολίτες τους. Για την ποσοτική ανάλυση χρησιμοποιούνται καμπύλη αναφοράς, μέθοδος εσωτερικού προτύπου, χρήση σχετικής επιφάνειας κορυφών. Στην συγκεκριμένη άσκηση η τεχνική της HPLC θα χρησιμοποιηθεί για τον διαχωρισμό και την ταυτοποίηση των συστατικών δύο αιθέριων ελαίων, λεμονιού και κάρου.

7 - 7 - Το αιθέριο έλαιο από το περικάρπιο του λεμονιού (Citron limon) περιέχει 94% (+)- λεμονένιο, 4% κιτράλη (55% γερανιάλη και 45% νεράλη), κιτρονελλάλη, οξικό γερανυλεστέρα και άλλους εστέρες. Στη φαρμακευτική, το έλαιον λεμονιού χρησιμοποιείται ως βελτιωτικό γεύσεως. Το μεγαλύτερο μέρος της παραγωγής χρησιμοποιείται από τις βιομηχανίες τροφίμων και τις αρωματοποιίες. CH 3 O CH 3 C O C O H H H 3 C CH 2 H 2 C CH 3 (+)-Λεμονένιο Γερανιάλη Νεράλη (+)-Καρβόνη Ο καρπός κάρου (Carvi fructus) περιέχει 5-7% αιθέριο έλαιο σε ειδικές κοιλότητες. Το έλαιο αποτελείται σε ποσοστό 50% από (+)-καρβόνη, ενώ το υπόλοιπο είναι κυρίως (+)-λεμονένιο. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ Πειραματική πορεία Σε ογκομετρικές φιάλες των 10 ml ετοιμάζονται τα δείγματα Α, Β, Γ, Δ, Χ & Ψ. Το δείγμα Α περιέχει 150 μl S(-)-Λεμονενίου σε 10 ml MeOH, το δείγμα Β 150 μl R(+)- Λεμονενίου σε 10 ml MeOH, το δείγμα Γ 25 μl R(-) Καρβόνης σε 10 ml MeOH, το δείγμα Δ 20 μl Κιτράληs σε 10 ml MeOH, το δείγμα Χ αιθέριο έλαιο από περικάρπιο λεμονιού και το δείγμα Ψ αιθέριο έλαιο καρπού κάρου. 50 μl από κάθε διάλυμα εισάγεται στη στήλη του χρωματογράφου και χρωματογραφείται ακολουθώντας τις παρακάτω χρωματογραφικές συνθήκες: Αναλυτική στήλη: C 18 Nucleosil, 150 x 4.6 mm, 5 μm Σύστημα: έκλουσης: σύστημα διαλυτών μεταβαλλόμενης σύστασης CH 3 CN/H 2 O (από 25% CH 3 CN έως 45% CH 3 CN για 5 min, από 45% CH 3 CN έως 100% CH 3 CN για 25 min, από 100% CH 3 CN έως 100% CH 3 CN για 2 min και από 100% CH 3 CN έως 25% CH 3 CN για 5 min) σε 0,05% CF 3 COOH/H 2 O Ταχύτητα ροής: 1ml/min Ανιχνευτής: UV/Vis (215 nm, 230 nm, 254 nm)

8 - 8 - Οι χρόνοι συγκράτησης (t R ) για τις ενώσεις Α, Β, Γ και Δ για το παραπάνω χρωματογραφικό σύστημα είναι αντίστοιχα: t RΑ = min, t RΒ = min, t RΓ =15.93 min, t RΔ = min ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 1. D.L. Paiva, G.M. Lampman and G.S. Kriz Introduction to Organic Laboratory Techniques, Second Edition Saunders college publishing, New York (1998) 2. L. M. Harwood, C.J. Moody and J. M. Percy Experimental Organic Chemistry, Second Edition Blackwell Science Ltd, London (1999) 3. R.L. Pecsok, L.D. Shields, T. Cairns and I.G. McWilliam, Σύγχρονες Μέθοδοι στη Χημική Ανάλυση, (Απόδοση στα Ελληνικά Σταύρος Βολιώτης), Εκδόσεις Γ. Α. Πνευματικός, Αθήνα (1980) 4. Θ. Π. Χατζηιωάννου και Μ. Α. Κουπάρη, Ενόργανη Ανάλυση, Εκδόσεις Δ. Μαυρομμάτη, Αθήνα (1990) 5. Δ. Παπαϊωάννου, Γ. Σταυρόπουλος και Θ. Τσεγενίδης Σημειώσεις Πειραματικής Οργανικής Χημείας, Εκδόσεις Πανεπιστημίου Πατρών, Πάτρα (1996)