1.1. Χρωματογραφικές τεχνικές

Transcript

1 1. ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ Η χρωματογραφία είναι μέθοδος διαχωρισμού χημικών ουσιών, η οποία στηρίζεται στην διαφορετική κατανομή των συστατικών ενός μίγματος μεταξύ μιας κινούμενης και μια στατικής φάσης. Ανάλογα με τη φύση της κινούμενης και της στατικής φάσης, η χρωματογραφία χαρακτηρίζεται ως αέριος ή υγρή. Ανάλογα με την αρχή στην οποία στηρίζεται ο διαχωρισμός, η χρωματογραφία χαρακτηρίζεται σαν κατανομής, προσρόφησης, ιονανταλλαγής ή πηκτής. Τέλος ανάλογα με την τεχνική συγκράτησης της στατικής φάσης, έχουμε χρωματογραφία στήλης, λεπτής στιβάδας και χαρτοχρωματογραφία. Στην χρωματογραφία κατανομής η στατική φάση αποτελείται από ένα λεπτό σώμα υγρού προσροφημένου στην επιφάνεια ενός αδρανούς υλικού. Ο διαχωρισμός στηρίζεται στον διαφορετικό συντελεστή κατανομής των συστατικών ενός μίγματος σε ορισμένο σύστημα διαλυτών. Στην χρωματογραφία προσρόφησης, η κινούμενη φάση είναι υγρή και η στατική ένα λεπτοτριμμένο στερεό υλικό με προσροφητικές ιδιότητες. Ο διαχωρισμός στηρίζεται στην εκλεκτική προσρόφηση των συστατικών του μίγματος πάνω στην επιφάνεια του στερεού Στην χρωματογραφία ιονανταλλαγής διαχωρίζουμε μίγμα ουσιών διαφορετικής ιοντικής ισχύος. Οι δυνάμεις συγκράτησης μεταξύ των συστατικών του μίγματος και της στερεής φάσης είναι ηλεκτροστατικής φύσης. Στην χρωματογραφία πηκτής την στατική φάση αποτελεί πορώδες υλικό υπό την μορφή πηκτής, το οποίο ανάλογα με το μέγεθος των πόρων του είναι δυνατόν να διαχωρίσει μίγμα ουσιών που διαφέρουν σημαντικά στην τιμή του μοριακού τους βάρους. Η χρωματογραφία πηκτής στηρίζεται στο φαινόμενο της διάχυσης των ουσιών σχετικά μικρού μοριακού βάρους εντός της πηκτής. Εκτός από τις χρωματογραφικές μεθόδους κατανομής και προσρόφησης, άλλοι διαχωρισμοί βασίζονται στις διαφορές στο μοριακό βάρος (χρωματογραφία πηκτής, gel permeation chromatography ή gel filtration). Σ αυτή την τεχνική ένα υλικό τύπου πηκτής παίζει τον ρόλο της στατικής φάσης και ο διαχωρισμός επιτυγχάνεται με βάση την διαφορετική επιβράδυνση των μορίων λόγω της διαφορετικής διάχυσής τους (εξ αιτίας του μεγέθους) δια μέσου των πόρων του υλικού. 1

2 1.1. Χρωματογραφικές τεχνικές Χρωματογραφία λεπτής στιβάδας (Thin Layer Chroma-tography- TLC) Σ αυτή την τεχνική συνήθως χρησιμοποιούνται πλάκες από γυαλί, οι οποίες είναι επιστρωμένες με τη στερεή στατική φάση. Ως υλικό επίστρωσης συνήθως χρησιμοποιείται διοξείδιο του πυριτίου (silica gel), τριοξείδιο του αργιλίου (alumina) και κυτταρίνη (cellulose), πολλά από τα οποία περιέχουν μία ουσία φθορισμού, προκειμένου να διευκολυνθεί η ανίχνευση των συστατικών του αναλυμένου μίγματος κάτω από το υπεριώδες φως. Άλλα υλικά κατάλληλα για ειδικές εφαρμογές είναι πολυαμίδια, κατεργασμένες κυτταρίνες με ιονανταλλακτικές ιδιότητες και ειδικές μορφές οργανικής πηκτής με ιδιότητες μοριακού κόσκινου (π.χ. Sephadex, Biogel P). Οι υάλινες πλάκες πριν επιστρωθούν, πρέπει να καθαρισθούν καλά και να ξηραθούν. Η τοποθέτηση πάνω στην πλάκα, του προς ανάλυση δείγματος, γίνεται με κατάλληλους τριχοειδής σωλήνες, ανάλογα με το αν πρόκειται για αναλυτικούς ή παρασκευαστικούς σκοπούς. Η ανάπτυξη του χρωματογραφήματος γίνεται μέσα σε ειδικούς θαλάμους, οι οποίοι περιέχουν το κατάλληλο μίγμα διαλυτών που αποτελεί την υγρή κινούμενη φάση. Τέτοιοι θάλαμοι απεικονίζονται στο σχήμα 2, ενώ στο σχήμα 3 απεικονίζεται ένα χρωματογράφημα πριν και μετά την ανάπτυξή του. Σχήμα 1 Στον θάλαμο ανάπτυξης τοποθετείται μικρή ποσότητα διαλύτη μέχρι ύψους 1-2cm. Στον θάλαμο τοποθετείται και διηθητικό χαρτί το οποίο είναι εμποτισμένο από τον διαλύτη έτσι ώστε η συγκέντρωση των ατμών του διαλύτη να είναι η παντού η ίδια. Κατά τη διάρκεια λήψης του χρωματογραφήματος, δεν μετακινείται ο θάλαμος ανάπτυξης για να εξασφαλιστεί ομοιόμορφη ανάπτυξη. 2

3 Μέτωπο Διαλύτη Αρχική Κηλίδα (α) (β) Σχήμα 2: Χρωματογράφημα πριν (α) και μετά (β) την ανάπτυξη Ως R f αναφέρεται μια χαρακτηριστική σταθερά για κάθε ουσία, που ορίζεται ως εξής: απόσταση διανυθείσα από την ουσία R f = απόσταση διανυθείσα από τον διαλύτη ανάπτυξης Συνεπώς για την περίπτωση του χρωματογραφήματος του σχήματος 2, θα ισχύει: R f( της ουσίας 1) απόσταση διανυθείσα από την ουσία 1 = απόσταση διανυθείσα από τον διαλύτη ανάπτυξης R f( της ουσίας 2) απόσταση διανυθείσα από την ουσία 2 = απόσταση διανυθείσα από τον διαλύτη ανάπτυξης Το R f εξαρτάται από την ικανότητα προσρόφησης της ουσίας επί του προσροφητικού ή την ικανότητα διάλυσής της σε μία ακίνητη υγρή φάση συγκρατούμενη επί ενός αδρανούς στερεού φορέα. Η ανίχνευση των κηλίδων των συστατικών του μίγματος, μετά το τέλος του χρωματογραφήματος και την εξάτμιση του διαλύτη ανάπτυξης, για μεν τις έγχρωμες ουσίες γίνεται από το ίδιο τους το χρώμα, για δε τις άχρωμες, με κατάλληλο ψεκασμό έτσι ώστε να δώσουν μια χαρακτηριστική έγχρωμη αντίδραση. Για την περίπτωση ενώσεων που φθορίζουν, ο εντοπισμός των κηλίδων μπορεί να γίνει πολύ εύκολα με μία λάμπα υπεριώδους, κάτι το οποίο συνίσταται να γίνεται ούτως ή άλλως πριν από οποιονδήποτε ψεκασμό. Οι τιμές R f επηρεάζονται και από τους εξής παράγοντες, οι οποίοι πρέπει να λαμβάνονται πάντα υπ όψη, ώστε οι τιμές να είναι επαναλήψιμες: Το μέγεθος των τεμαχιδίων διαφορετικών παρτίδων προσροφητικού υλικού Η σύνθεση του διαλύτη ανάπτυξης και ο βαθμός κορεσμού του θαλάμου με τους ατμούς του διαλύτη 3

4 Οι συνθήκες ενεργοποίησης και αποθήκευσης των πλακών Το πάχος της προσροφητικής στιβάδας Η χρωματογραφία λεπτής στιβάδας παρουσιάζει τα εξής πλεονεκτήματα, έναντι των άλλων τεχνικών υγρής χρωματογραφίας: 1. Έχει μεγαλύτερη διακριτική ικανότητα 2. Είναι περισσότερο ευέλικτη γιατί σ αυτή μπορεί να χρησιμοποιηθεί ποικιλία στατικών φάσεων και διάφοροι μηχανισμοί διαχωρισμού 3. Είναι ταχύτερη. Μπορούν να επιτευχθούν χρόνοι ανάπτυξης μέχρι και 5 λεπτών 4. Χρησιμοποιείται εύκολα στο διαχωρισμό υδρόφοβων ουσιών 5. Είναι πολύ ευαίσθητη μέθοδος και απαιτεί μικρότερες ποσότητες προσροφητικού μέσου και δείγματος (από μερικά μg ως 1mg) 6. Επιτρέπει την εύκολη παραλαβή των ουσιών, που έχουν διαχωριστεί, με απόξυση κάθε κηλίδας μαζί με το επίστρωμα και εκχύλισή του με κατάλληλο διαλύτη 7. Μπορεί να χρησιμοποιηθεί με επιτυχία στην ποσοτική ανάλυση Χρωματογραφία στήλης (Column Chromatography) Διαχωρισμοί, σε παρασκευαστική κλίμακα, με αυτή την τεχνική επιτυγχάνονται με τοποθέτηση της ουσίας σε μία κυλινδρική στήλη, η οποία πληρώνεται με στερεή στατική φάση, δια μέσου της οποίας περνά η κινούμενη υγρή φάση είτε λόγω βαρύτητας είτε με μικρή πίεση (Flash chromatography) που εφαρμόζεται στη δεξαμενή των διαλυτών, όπως φαίνεται στο σχήμα 4. Σχήμα 3 4

5 Η εκλογή του κατάλληλου υλικού που χρησιμοποιείται για την πλήρωση της στήλης εξαρτάται από το είδος της χρωματογραφικής μεθόδου που θα εφαρμοστεί για το συγκεκριμένο διαχωρισμό, π.χ. χρωματογραφία προσρόφησης, χρωματογραφία ιονανταλλαγής ή χρωματογραφία πηκτής. Η χρωματογραφία προσρόφησης εφαρμόζεται αρκετά στην παρασκευαστική Οργανική Χημεία, όπου γίνεται συνήθως καθαρισμός των αρχικών ουσιών και των προϊόντων της αντίδρασης. Ο χρωματογραφικός διαχωρισμός με ιονανταλλακτικές ρητίνες είναι μια χρήσιμη αναλυτική και παρασκευαστική τεχνική για τον διαχωρισμό μιγμάτων οξέων και βάσεων (π.χ. αμινοξέων, αμινοφαινολών κ.λ.π.) και για την απομόνωση ουδέτερων οργανικών υλικών από υδατικά διαλύματα που περιέχουν κατιονικές ή ανιοντικές ουσίες. Η χρωματογραφία πηκτής είναι μια σημαντική τεχνική για την ποσοτική ανάλυση μιγμάτων φυσικών προϊόντων μεγάλου μοριακού βάρους ( π.χ. πρωτεΐνες, πεπτίδια, ένζυμα, ορμόνες κ.λ.π.) Στη χρωματογραφία προσρόφησης η αλουμίνα ( Al 2 3, οξείδιο του αργιλίου) είναι το συνήθως χρησιμοποιούμενο υλικό στη βασική (ph = 10), ουδέτερη (ph = 7) και όξινη μορφή του (ph = 4). Σε κάθε περίπτωση πρέπει να χρησιμοποιείται το σωστό είδος αλουμίνας, προκειμένου να αποφευχθούν ανεπιθύμητες αντιδράσεις. Η βασική αλουμίνα π.χ. είναι δυνατόν να οδηγήσει σε αφυδάτωση των εστέρων, ενώ η όξινη είναι δυνατόν να οδηγήσει σε αφυδάτωση των αλκοολών (ιδιαίτερα των τριτοταγών) ή να προκαλέσει ισομερίωση διπλών δεσμών. Σε τέτοιες περιπτώσεις συνίσταται η ουδέτερη αλουμίνα. Άλλα υλικά που χρησιμοποιούνται στη χρωματογραφία προσρόφησης είναι το διοξείδιο του πυριτίου (silica gel) όταν δεν περιέχει περισσότερο από ορισμένο ποσό νερού, πέρα από το οποίο ο διαχωρισμός θα στηρίζεται πλέον στην κατανομή και λιγότερο στην προσρόφηση, το Mg, το MgC 3, το BaC 3, το Ca(H) 2, το CaS 4, η λακτόζη, το άμυλο και η κυτταρίνη. Η προσροφητική ισχύς εξαρτάται από το προσροφητικό υλικό, αλλά και από την προσροφούμενη ουσία. Έχει βρεθεί ότι η προσροφητική ισχύς για ενώσεις που έχουν τους ακόλουθους τύπους πολικών ομάδων, αυξάνει γενικά με την εξής σειρά: Cl, Br, I C C CH 3 C 2 R C CH SH NH 2 H C 2 H 5

6 Η ευκολία έκλουσης συνεπώς των παρακάτω κατηγοριών οργανικών ουσιών μικραίνει με την εξής σειρά: Κορεσμένοι υδρογονάνθρακες > αλκένια, αλκίνια, αρωματικοί υδρογονάνθρακες > εστέρες, αλδεΰδες, κετόνες > αμίνες, αλκοόλες, θειόλες > φαινόλες, καρβοξυλικά οξέα Η φύση της κινούμενης φάσης (διαλυτών) είναι μεγάλης σπουδαιότητας για κάθε χρωματογραφικό πείραμα. Ο διαλύτης μπορεί επίσης να προσροφηθεί πάνω στο στερεό υλικό με συνέπεια, να παρατηρείται ένας ανταγωνισμός μεταξύ διαλυτών και συστατικών του προς ανάλυση μίγματος ως προς την προσροφητικότητά τους στην επιφάνεια του προσροφητικού υλικού. Αν ο διαλύτης που χρησιμοποιείται στην έκλουση είναι περισσότερο πολικός και προσροφάται ισχυρότερα από τα συστατικά του μίγματος, τα συστατικά θα παραμένουν, σχεδόν πλήρως, στην κινούμενη φάση και δεν θα γίνει ο διαχωρισμός. Για να γίνει ένας αποτελεσματικός διαχωρισμός, ο διαλύτης έκλουσης πρέπει να είναι λιγότερο πολικός από τα συστατικά του μίγματος. Επί πλέον τα συστατικά του προς ανάλυση δείγματος πρέπει να είναι αρκετά διαλυτά στο διαλύτη έκλουσης, γιατί σε αντίθετη περίπτωση θα παραμείνουν μόνιμα προσροφημένα στη στατική φάση της στήλης. Όσο περισσότερο πολικοί διαλύτες χρησιμοποιούνται, τόσο γρηγορότερα εκλούονται τα συστατικά ενός μίγματος. Οι μη πολικές ουσίες δεν διαχωρίζονται με έναν πολικό διαλύτη, όπως επίσης πολικές ουσίες δεν διαχωρίζονται με έναν μη πολικό διαλύτη. Για να ξεπερασθεί αυτό το πρόβλημα και να διαχωριστούν τόσο οι πολικές όσο και οι μη πολικές ουσίες σε ένα μίγμα, μπορούμε να αυξάνουμε σταδιακά την αναλογία του πιο πολικού διαλύτη σε ένα μίγμα δύο διαλυτών. Η εκλουστική δύναμη διαφόρων διαλυτών για μια δεδομένη ουσία αυξάνει ως εξής: 6

7 Εξάνιο Κυκοεξάνιο Τολουόλιο Βενζόλιο Διχλωρομεθάνιο Χλωροφόρμιο Κυκλοεξάνιο-οξικός αιθυλεστέρας 80:20 Διχλωρομεθάνιο-διαιθυλαιθέρας 80:20 Διχλωρομεθάνιο-διαιθυλαιθέρας 60:40 Κυκλοεξάνιο-οξικός αιθυλεστέρας 20:80 Διαιθυλαιθέρας Αιθυλαιθέρας-μεθανόλη 99:1 Οξικός αιθυλεστέρας Τετραϋδροφουράνιο 1-Προπανόλη Αιθανόλη Μεθανόλη ΑΥΞΑΝΟΜΕΝΗ ΕΚΛΟΥΣΤΙΚΗ ΔΥΝΑΜΗ Χρωματογραφία ξηρής στήλης (Dry Column Chromatography) Η χρωματογραφία ξηρής στήλης είναι μία τεχνική στην οποία το στερεό προσροφητικό υλικό χύνεται σε μία ξηρή, από γυαλί ή νάιλον στήλη, όσο γίνεται πιο ομοιόμορφα. Το προς διαχωρισμό μίγμα προσροφάται σε μία άλλη ποσότητα προσροφητικού υλικού και προστίθεται στην κορυφή της στήλης. Ο διαλύτης αφήνεται να κατέβει από την κορυφή της στήλης μέχρι το κάτω μέρος αυτής. Η πορεία της ανάπτυξης παρακολουθείται πολύ εύκολα με μία λάμπα υπεριώδους για ουσίες που φθορίζουν. Μετά το τέλος της ανάπτυξης τα συστατικά απομονώνονται με εκχύλιση των διαχωρισμένων ζωνών του προσροφητικού υλικού με τον κατάλληλο διαλύτη Χρωματογραφία κατανομής σε στήλη (Partition Chromatography) Όπως έχει αναφερθεί παραπάνω, στην τεχνική της χαρτοχρωματογραφίας, ο διαχωρισμός των συστατικών ενός μίγματος με την υγρή χρωματογραφία κατανομής, εξαρτάται από τους διαφορετικούς συντελεστές κατανομής που έχει 7

8 κάθε συστατικό μεταξύ των δύο διαλυτών, Το πιο πολικό σύστημα διαλυτών, παρακρατείται ως ένα στατικό λεπτό στρώμα πάνω σε κατάλληλο υλικό ως υποστήριγμα και το λιγότερο πολικό σύστημα δρα ως κινούμενη υγρή φάση. Στην χρωματογραφία κατανομής αντιστρόφου φάσεως (Reversed phase partition chromatography) ο λιγότερο πολικός διαλύτης δρα ως στατική φάση και ο πιο πολικός ως κινούμενη φάση. Σ αυτή την περίπτωση το υλικό που χρησιμοποιείται ως υποστήριγμα, κατεργάζεται με διχλωροδιμεθυλοπυρίτιο, το οποίο αντιδρά με τις υδροξυλομάδες της επιφάνειας του υποστηρίγματος, του οποίου κατ αυτό τον τρόπο μειώνεται η ικανότητα να συγκρατεί νερό. Τα πιο συνηθισμένα υλικά υποστηρίγματα είναι το silica gel, ο σελίτης και η κυτταρίνη. Η στατική φάση είναι συχνά νερό ή υδατικά ρυθμιστικά διαλύματα, αραιό θειικό ή υδροχλωρικό οξύ ή μεθανόλη. Η κινούμενη φάση μπορεί να είναι μίγματα βουτανόλης χλωροφορμίου, μίγματα βουτανόλης βενζολίου, τετραχλωράνθρακας, οξικός αιθυλεστέρας, εξάνιο ή 2,2,4-τριμεθυλοπεντάνιο. Παραδείγματα διαλυτών στην τεχνική της αντιστρόφου φάσεως είναι το οκτάνιο (στατική φάση) 60% υδατική μεθανόλη (κινούμενη φάση) και τολουόλιο φορμαμίδιο. Οι δύο υγρές φάσεις αναδεύονται σε μια διαχωριστική χοάνη και ξεχωρίζεται η φάση που θα χρησιμοποιηθεί ως στατική, μέσα στην οποία τοποθετείται το υλικό που θα χρησιμοποιηθεί ως υποστήριγμα προκειμένου να εξισορροπηθεί με τη στατική φάση. Οι εφαρμογές της χρωματογραφίας κατανομής με στήλη είναι πάρα πολλές, ιδιαίτερα στο διαχωρισμό ομολόγων με δραστική ομάδα, τα οποία δεν θα μπορούσαν να διαχωριστούν με χρωματογραφία προσρόφησης Άλλες τεχνικές χρωματογραφίας Δύο άλλες βασικές τεχνικές χρωματογραφίας είναι η αέριος χρωματογραφία ( Gas Chromatography GC)και η υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (High Performance Liquid Chromatography HPLC). Οι δύο αυτές τεχνικές, λόγω της μεγάλης ανάπτυξης της τεχνολογίας, προσφέρουν μεγάλη αναλυτική ακρίβεια σε ελάχιστο χρόνο και έχουν πολύ καλή εφαρμογή σε παρασκευαστικούς σκοπούς. Αέρια χρωματογραφία Η αέρια χρωματογραφία αναπτύχθηκε ιδιαίτερα ως αναλυτική τεχνική τα τελευταία τριάντα χρόνια. Η τεχνική αυτή είναι σχετικά απλή εάν λάβουμε υπ όψιν τις μεγάλες δυνατότητες εφαρμογής που παρέχει. 8

9 Στην αέρια χρωματογραφία χρησιμοποιείται ως κινητή φάση ένα αέριο (φέρον αέριο), το οποίο συνήθως είναι άζωτο, αργό ή υδρογόνο, και ως σταθερή φάση είτε μία στερεή (αέρια-στερεή χρωματογραφία, Gas Solid Chromatography, GSC), είτε μία υγρή ουσία(αέρια-υγρή χρωματογραφία, Gas Liquid Chromatography, GLC). Πιο συχνή εφαρμογή έχει η δεύτερη, δηλαδή η αέρια-υγρή χρωματογραφία. Στην τεχνική της αέριας-υγρής χρωματογραφίας ο διαχωρισμός των συστατικών βασίζεται στην κατανομή τους μεταξύ ενός μη πτητικού υγρού (στατική φάση), καθηλωμένου σε στερεό φορέα ή στα τοιχώματα ανοικτών τριχοειδών στηλών και του φέροντος αερίου (κινητή φάση). Ο διαχωρισμός οφείλεται στις διαφορετικές δυνάμεις συγκράτησης και έκλουσης μεταξύ των συστατικών του μείγματος και του υλικού πλήρωσης της στήλης κατά τη ροή του φέροντος αερίου. Η επιτυχής χρησιμοποίηση του αερίου ως κινητή φάση σ ένα χρωματογραφικό σύστημα οφείλεται στα εξής πλεονεκτήματα: Το χαμηλό ιξώδες των αερίων επιτρέπει τη χρήση στηλών μεγάλου μήκους, αυξάνοντας έτσι την αποτελεσματικότητα της στήλης. Η αδράνεια των αερίων όσον αφορά την αλληλεπίδραση τους με τα προς προσδιορισμό συστατικά καθιστά την ισορροπία κατανομής μεταξύ των δύο φάσεων πρακτικώς ανεξάρτητη από το αέριο. Υπάρχουν πολλοί απλοί, ευαίσθητοι και ταχείας αποκρίσεως ανιχνευτές, ικανοί να παρακολουθούν τις συγκεντρώσεις των ουσιών στην αέρια φάση. Η σχηματική απεικόνιση των βασικών μερών ενός αερίου χρωματογράφου φαίνεται στο παρακάτω σχήμα. B Δ Ε Η Θ Α B B Το φέρον αέριο από τη φιάλη υψηλής πίεσης, που βρίσκεται στο σημείο Α, οδηγείται μέσω ρυθμιστών παροχής που βρίσκονται στο σημείο Β στη στήλη Δ. Στο σημείο Γ βρίσκεται η βαλβίδα εισαγωγής του δείγματος. Τα συστατικά του δείγματος συμπαρασύρονται από το φέρον αέριο κατά μήκος της στήλης και διαχωρίζονται. Στη συνέχεια τα κλάσματα ανιχνεύονται από τον ανιχνευτή Ε και τα σήματα καταγράφονται από το καταγραφικό ή οδηγούνται σε υπολογιστή. Τέλος υπάρχει 9

10 μια διάταξη Η όπου συλλέγονται τα διάφορα κλάσματα και στη θέση Θ ένα ροόμετρο που ελέγχει την ταχύτητα ροής του φέροντος αερίου Η GLC χρησιμοποιείται ευρύτατα στην ποιοτική και ποσοτική ανάλυση, κυρίως για την ανίχνευση, την ταυτοποίηση και τον προσδιορισμό οργανικών ουσιών σε πολύπλοκα δείγματα, όπως επίσης και στον προσδιορισμό διαφόρων φυσικοχημικών μεγεθών. Οι κυριότερες αναλυτικές εφαρμογές της GLC είναι οι αναλύσεις πετρελαιοειδών, φυσικών προϊόντων, βιολογικών δειγμάτων, τροφίμων, αιθέριων ελαίων, εντομοκτόνων, παρασιτοκτόνων, στεροειδών ορμονών, ναρκωτικών και αναλύσεις για τον έλεγχο της ρύπανσης το περιβάλλοντος. Για την υπερνίκηση δυσκολιών, που παρουσιάζονται κατά την ανάλυση πολύπλοκων μειγμάτων με την GLC, αυτή συχνά συνδυάζεται με άλλες τεχνικές ανάλυσης όπως χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας, φασματοφωτομετρία, φασματομετρία μαζών κ.α. Ο συνδυασμός γίνεται είτε με ανάλυση των εκλουσμάτων που συλλέγονται, είτε με απ ευθείας σύνδεση του αερίου χρωματογράφου με το όργανο της βοηθητικής αναλυτικής τεχνικής. Η δεύτερη περίπτωση παρέχει αναλυτικά συστήματα εξαιρετικής εκλεκτικότητας και αξιοπιστίας. Τα κυριότερα από αυτά είναι ο αεριοχρωματογράφος-φασματογράφος μαζών (GC-MS) και ο αεριοχρωματογράφος-φασματοφωτόμετρο υπερύθρου με μετασχηματισμό Fourier (GC-FTIR). Υγρή Χρωματογραφία Υψηλής Απόδοσης (High Performance Liquid Chromatography HPLC) Σ αυτή την τεχνική υγρής χρωματογραφίας, η διαβίβαση της υγρής κινητής φάσης, μέσα από την στατική φάση που αποτελείται από πολύ μικρής διαμέτρου και επομένως μεγάλης αντίστασης σωματίδια υψηλής διαχωριστικής απόδοσης, γίνεται με τη χρησιμοποίηση αντλιών υψηλής πίεσης. Η HPLC είναι η περισσότερο χρησιμοποιούμενη χρωματογραφική τεχνική για την ποσοτική ανάλυση πολύπλοκων μιγμάτων. Στην κλασσική υγρή χρωματογραφία στήλης, η ταχύτητα μερισμού των συστατικών του μίγματος μεταξύ της στατικής και της κινητής φάσης εξαρτάται κυρίως από τη διάχυση. Η διάχυση στα υγρά είναι εξαιρετικά αργή και για την ελαχιστοποίηση του χρόνου που απαιτείται για τη μετακίνηση των συστατικών, πρέπει να τηρούνται δύο προϋποθέσεις. Πρώτον, το υλικό πληρώσεως της στήλης να είναι λεπτότατου διαμερισμού και δεύτερο, σε περιπτώσεις διαχωρισμού κατανομής, η υγρή στατική φάση να είναι της μορφής λεπτότατου ομοιόμορφου υμένα. Η υψηλή πυκνότητα πλήρωσης με αυτά τα πολύ μικρά σωματίδια μειώνει την ταχύτητα ροής της κινητής 10

11 φάσης μέσα από τη στήλη (μεγάλη αντίσταση μεταφοράς) και για να επιτευχθεί μια λογική ταχύτητα ροής, απαιτείται η εφαρμογή υψηλής πίεσης στην κινητή φάση. Για το λόγο αυτό, η συγκεκριμένη τεχνική αναφέρεται και ως Υγρή Χρωματογραφία Υψηλής Πίεσης (High Pressure Liquid Chromatography, HPLC) και επειδή με αυτή πετυχαίνονται ταχείς διαχωρισμοί και αναλύσεις, αναφέρεται και ως Υγρή Χρωματογραφία Υψηλής Ταχύτητας (High Speed Liquid Chromatography, HSLC) Σχήμα 4 Σχηματική απεικόνιση συσκευής HPLC Μία συσκευή HPLC αποτελείται από πέντε βασικά τμήματα: 1) το σύστημα παροχής κινητής φάσης 2) το σύστημα εισαγωγής δείγματος 3) τη στήλη 4) τον ανιχνευτή και 5) τον καταγραφέα. Μία τέτοια διάταξη απεικονίζεται στο παραπάνω σχήμα. Τα περισσότερα μίγματα ουσιών μπορούν να διαχωριστούν και να αναλυθούν με την HPLC, αρκεί να επιλεγεί το κατάλληλο σύστημα στατικής και κινητής φάσης ή πρόγραμμα βαθμιδωτής έκλουσης. Σε γενικές γραμμές επιδιώκεται η εύρεση συνθηκών, στις οποίες τα συστατικά ενός μίγματος συγκρατούνται σε κάποιο βαθμό στη στατική φάση, αλλά όχι πολύ ισχυρά. Αποδοτικός διαχωρισμός μπορεί να επιτευχθεί μόνο αν εξασφαλισθεί διαφορετική ταχύτητα μετακίνησης των ζωνών των συστατικών, λόγω του διαφορετικού βαθμού συγκρατήσεώς τους στη στατική φάση. Η HPLC μπορεί να χρησιμοποιηθεί για το διαχωρισμό και την ποιοτική και ποσοτική ανάλυση μιγμάτων ουσιών ποικίλης προέλευσης. Αποτελεί σήμερα την τεχνική επιλογής σε πολλά προβλήματα φαρμακευτικής ανάλυσης και ανάλυσης βιολογικών 11

12 δειγμάτων, τα οποία περιέχουν τα φυσιολογικά συστατικά, τα χορηγούμενα φάρμακα και τους μεταβολίτες τους, συνήθως σε πολύ χαμηλές συγκεντρώσεις. Συνήθως πριν από την εισαγωγή του δείγματος στο χρωματογράφο προηγείται εκχύλιση ή άλλη τεχνική προκαταρκτικού διαχωρισμού. 12

13 2. ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΟΥΣΙΩΝ ΜΕ ΤΗ ΜΕΘΟΔΟ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑΣ ΛΕΠΤΗΣ ΣΤΙΒΑΔΑΣ ΚΑΙ ΚΑΘΑΡΙΣΜΟΣ ΟΥΣΙΑΣ ΜΕ ΤΗ ΧΡΗΣΗ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑΣ ΣΤΗΛΗΣ Σκοπός του πειράματος είναι ο ποιοτικός προσδιορισμός ενώσεων που αποτελούν φαρμακευτικά σκευάσματα και πρόδρομων ενώσεων αυτών με τη χρήση χρωματογραφίας λεπτής στιβάδας. Οι χημικοί τύποι των ενώσεων απεικονίζονται στο σχήμα 5. H H H CH 3 HN CH 3 HN CH 3 H Σαλικυλικό οξύ Ακετυλοσαλικυλικό οξύ Ακετανιλίδιο Παρακεταμόλη H 3 C CH 3 CH 3 H Ιμπουπροφένη Σχήμα 5 Στη συνέχεια ακολουθεί ο ποσοτικός διαχωρισμός των κύριων συστατικών από φύλλα σπανάκι και έλεγχος της καθαρότητας με χρωματογραφία TLC. Οι χρωστικές ουσίες στα λαχανικά, τα λουλούδια και τα φύλλα μπορούν να χωριστούν ανάλογα με το χρώμα τους. Οι πράσινες χρωστικές ουσίες, που είναι γνωστές ως χλωροφύλλες, λειτουργούν ως υποδοχείς της φωτεινής ακτινοβολίας (φωτοδέκτες) των φυτών. Τα καροτενοειδή, κίτρινες χρωστικές ουσίες, βοηθούν τα φυτά στη διαδικασία φωτοσύνθεσης. Επιπλέον, οι ξανθοφύλλες (xanthrophylls) είναι συστατικά των χλωροπλαστών. 13

14 H H β-ξανθοφύλλη (κίτρινο) β-καροτένιο (πορτοκαλί) N N Mg N N H 3 CC χλωροφύλλη-α (μπλε πράσινο) N N Mg N C H N H 3 CC χλωροφύλλη-β (πράσινο) Πίνακας 1 Τιμές R f ουσιών που υπάρχουν στα φυτά Χρωστική (Pigment) Χρώμα (Color) Τιμή R f Καροτένιο (carotene) κίτρινο-πορτοκαλί 0.93 Φαιοφυτίνη a (pheophytin a) γκρίζο 0.55 Φαιοφυτίνη b (pheophytin b) Ελαφρώς γκρίζο (πιθανά μη ορατό) Χλωροφύλλη a (chlorophyll a) μπλέ-πράσινο 0.46 Χλωροφύλλη b (chlorophyll b) πράσινο

15 Ξανθοφύλλη (xanthophylls) κίτρινο 0.41 Ξανθοφύλλη (xanthophylls) κίτρινο 0.31 Ξανθοφύλλη (xanthophylls) κίτρινο Εκτέλεση του πειράματος Χρωματογραφία Λεπτής Στιβάδας Διαλύονται κόκκοι των 5 ενώσεων σε 5 διαφορετικούς δοκιμαστικούς σωλήνες με ελάχιστη ποσότητα ακετόνης. Προετοιμάζεται κατάλληλα πλάκα TLC Silica gel και με μολύβι ορίζονται η γραμμή εκκίνησης και η γραμμή τερματισμού του διαλύτη, καθώς και τα σημεία που θα μεταφερθούν οι ουσίες. Με τη βοήθεια τριχοειδούς σωλήνα μεταφέρονται στα σημεία που ορίστηκαν μικρές ποσότητες των διαλυμάτων και στεγνώνονται προκειμένου να φύγει ο διαλύτης και να μείνουν πάνω στην πλάκα οι ουσίες. Ταυτόχρονα προετοιμάζεται ο θάλαμος ανάπτυξης με διαλύτη ανάπτυξης μίγμα 65:30:5 εξάνιο, οξικό αιθυλεστέρα και οξικό οξύ αντίστοιχα. Μόλις ολοκληρωθεί η ανάπτυξη η πλάκα στεγνώνεται και εμφανίζεται. Επαναλαμβάνεται τη διαδικασία με διαλύτη ανάπτυξης μίγμα 45:50:5 υπολογίζοντας ξάνιο, οξικό αιθυλεστέρα και οξικό οξύ αντίστοιχα. Με ποια μέθοδο μπορεί να γίνει γρήγορα η εμφάνιση των ενώσεων που προσπαθείτε να ταυτοποιήσετε; Υπολογίστε τα R f των ενώσεων και προσδιορίστε ποια ή ποιες ενώσεις υπάρχουν στο δείγμα που σας δόθηκε. Προετοιμασία στήλης χρωματογραφίας Προετοιμάζεται η στήλη τοποθετώντας ένα μικρό κομμάτι υαλοβάμβακα ή βαμβάκι στο κάτω μέρος της εφόσον αυτό είναι απαραίτητο. Παρασκευάζεται μίγμα διαλυτών εξάνιο-ακετόνη (70:30). Σε ένα ποτήρι ζέσεως αναμιγνύονται ~20g Si 2 με το μίγμα των διαλυτών. Με τη βοήθεια ενός διηθητικού χωνιού προστίθεται ουδέτερη άμμο πάνω από τον υαλοβάμβακα ή το βαμβάκι, εφόσον κρίνεται πως είναι απαραίτητο. Αποχύνεται προσεκτικά το μίγμα-αιώρημα του Si 2, προσέχοντας η στάθμη του διαλύτη να είναι πάνω από τo Si 2 (όπως και σε όλη τη διάρκεια του πειράματος). Αφήνεται να περάσει 2-3 φορές από τη στήλη μίγμα διαλυτών, έτσι ώστε να πακτωθεί καλά το Si 2 και προσέχοντας να μην δημιουργηθούν ρωγμές στο 15

16 μέσο πλήρωσης. Αφήνονται περίπου 3 cm διαλύτη πάνω από το ύψος του Si 2 και προστίθεται ξανά άμμο. Προετοιμασία δείγματος Τοποθετούνται περίπου 1g φύλλα σπανάκι σε ιγδίο και πολτοποιούνται. Προστίθεται 2ml διαλύτη ακετόνης και αναμιγνύεται με το στερεό. Μεταφέρεται το υγρό και ξεπλένεται με 3-4ml ακετόνης σε διαχωριστική χοάνη (διηθείται εφόσον κρίνεται αποραίτητο) και προστίθενται 10ml εξανίου και 20ml 10% NaCl. Γίνεται εκχύλιση και απομακρύνεται η υδατική στιβάδα και στην οργανική γίνεται εκχύλιση με 5ml απιονισμένο νερό. Η οργανική μεταφέρεται σε κωνική φιάλη και γίνεται ξήρανση για 5min με Na 2 S 4. Με πιπέτα παστέρ μεταφέρεται το εκχύλισμα μέσα στην άμμο και γίνεται έκλουση με διαλύτη εξάνιο-ακετόνη (70:30). Συλλέγονται κλάσματα των ~15mL σε αριθμημένους δοκιμαστικούς σωλήνες. Γίνεται έλεγχος των κλασμάτων με TLC προκειμένου να βρεθεί σε ποιους δοκιμαστικούς σωλήνες περιέχεται καθαρές οι ουσίες. Η κολώνα διακόπτεται μόλις εξέλθουν όλες οι επιθυμητές ουσίες. Συγκεντρώνονται όλα τα καθαρά κλάσματα των ουσιών σε ξεχωριστές σφαιρικές και εξατμίζεται ο διαλύτης στον περιστροφικό εξατμιστήρα. Ζυγίζονται οι ουσίες και υπολογίζεται το ποσοστό της κάθε καθαρής ουσίας που βρισκόταν στο μίγμα. 16