ΕΠΙΔΡΑΣΗ της ΘΕΡΜΟΚΡΑΣΙΑΣ ΑΝΑΠΤΥΞΗς ΣΤΗΝ ΚΟΛΥΜΒΗΤΙΚΗ ΙΚΑΝΟΤΗΤΑ ΤΩΝ ΕΝΗΛΙΚΩΝ ZEBRAFISH [DANIO RERIO (HAMILTON, 1822)]

Transcript

1 ΕΠΙΔΡΑΣΗ της ΘΕΡΜΟΚΡΑΣΙΑΣ ΑΝΑΠΤΥΞΗς ΣΤΗΝ ΚΟΛΥΜΒΗΤΙΚΗ ΙΚΑΝΟΤΗΤΑ ΤΩΝ ΕΝΗΛΙΚΩΝ ZEBRAFISH [DANIO RERIO (HAMILTON, 1822)] Συμεωνίδη Δ., Γεώργα Ι., Αγγελοπούλου Α., Κουμουνδούρος Γ. Τμήμα Βιολογίας, Πανεπιστήμιο Πατρών, Περίληψη Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε η επίδραση της θερμοκρασίας ανάπτυξης (DT) στην κολυμβητική ικανότητα ενήλικων ατόμων zebrafish. Τρεις πληθυσμοί zebrafish υποβλήθηκαν σε διαφορετική θερμοκρασία ανάπτυξης (22, 28 και 32 o C) από το εμβρυϊκό στάδιο (28 ο dpf, ημέρες μετά τη γονιμοποίηση) μέχρι την ηλικία των 308 o dpf. Ύστερα από εφαρμογή κοινών συνθηκών μέχρι την ενηλικίωση (90 dpf) των τριών πληθυσμών, τα άτομα υποβλήθηκαν σε δοκιμασίες κολύμβησης σε τέσσερις θερμοκρασίες άσκησης (20, 24, 28 και 32 o C). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η θερμοκρασία ανάπτυξης επηρέασε σημαντικά (p<0,05) την κολυμβητική επίδοση (σχετική κρίσιμη κολυμβητική ταχύτητα, RU crit ) και των δύο φύλων. Σε αντίθεση με την RU crit των ατόμων των 28 και 32 ο C DT, στους 22 ο C DT η RU crit αποδείχθηκε ανεξάρτητη τόσο του φύλου όσο και της θερμοκρασίας άσκησης. Τα αποτελέσματα συζητούνται ως προς τη χρήση του zebrafish ως πειραματικού οργανισμού για την καλύτερη κατανόηση της θερμο-εξαρτώμενης μορφολειτουργικής πλαστικότητας που χαρακτηρίζει πολλά είδη ψαριών. Λέξεις κλειδιά: κρίσιμη κολυμβητική ταχύτητα, θερμοκρασία, οντογενετικός προγραμματισμός. EFFECT OF DEVELOPMENTAL TEMPERATURE ON THE SWIMMING PERFORMANCE OF ADULT ZEBRAFISH [DANIO RERIO (HAMILTON, 1822)] Symeonidi D., Georga I., Angelopoulou A., Koumoundouros G. Biology Department, University of Patras, disymeonidi@upatras.gr, igeorga@upatras.gr, anangelopo@upnet.gr, koumound@upatras.gr Abstract The present study examined the effect of developmental temperature (DT) on the swimming performance of adult zebrafish. Three zebrafish populations were submitted at different developmental temperatures (22, 28, and 32 o C) from the embryonic stage (28 o dpf, days post fertilization) up to 308 o dpf. The different populations were kept under common conditions until adulthood (90 dpf). Critical swimming speed (U crit ) was estimated separately for the two genders and the three different populations, at four exercise temperatures (20, 24, 28 and 32 o C). Results showed that developmental temperature significantly affected (p<0.05) the swimming performance (critical swimming speed, RU crit =U crit /TL) of both genders. The effect of exercise temperature on RU crit was significant only in the case of fish developed at 28 or 32 o C (p<0.05), but not of those developed at 22 o C. Results are discussed in respect to the use of zebrafish as a model species to study the mechanisms controlling morphological and functional plasticity in fish. Keywords: critical swimming speed, temperature, ontogenetic programming. 1. Εισαγωγή Η κολυμβητική ικανότητα είναι σημαντική για την επιτυχή διαβίωση των ψαριών στο φυσικό περιβάλλον (εξασφάλιση τροφής, αποφυγή θηρευτών, μεταναστεύσεις, αναπαραγωγή κλπ, Fisher et al., 2005; Spence et al., 2008). Η κολυμβητική επίδοση επηρεάζεται τόσο από μορφολογικούς, όσο και περιβαλλοντικούς παράγοντες. Από αυτούς, η θερμοκρασία του νερού επιδρά στην κολυμβητική επίδοση των ψαριών άμεσα (Koumoundouros et al., 2002) και έμμεσα μέσω της θερμοεξαρτώμενης φαινοτυπικής πλαστικότητας χαρακτήρων, όπως η δομή των πτερυγίων, το σχήμα του σώματος (Georgakopoulou et al., 2007), ο αριθμός των μυϊκών ινών (Matschak & Stickland, 1995; Xie et al., 2001) και η δομή του καρδιαγγειακού συστήματος (Pelster 2002; Bagatto 2006). Η πιθα

2 9 th Symposium on Oceanography & Fisheries, Proceedings, Volume ΙΙ νή σχέση των θερμοεπαγόμενων φαινοτυπικών αλλαγών και της κολυμβητικής δραστηριότητας δεν έχει μέχρι σήμερα μελετηθεί σε κανένα είδος ψαριού. Στην παρούσα εργασία εξετάσθηκε το αν η θερμοκρασία ανάπτυξης επιδρά στην κολυμβητική ικανότητα των ενήλικων ατόμων. Χρησιμοποιήθηκε το είδος Danio rerio (Hamilton, 1822) το οποίο αφενός παρουσιάζει το τυπικό πρότυπο οντογένεσης των ψαριών (εκκόλαψη σε σχετικά αδιαφοροποίητο στάδιο ανάπτυξης, τυπική νυμφική περίοδο), και αφετέρου αποτελεί οργανισμό-μοντέλο με αναπτυγμένο γνωστικό υπόβαθρο σε θέματα μοριακής και αναπτυξιακής βιολογίας. Επιπρόσθετα, o χαρακτηριστικός φυλετικός διμορφισμός του zebrafish, επιτρέπει τη συγκριτική μελέτη της κολυμβητικής επίδοσης μεταξύ των δυο φύλων (Spence et al., 2008). Άλλα πλεονεκτήματα που καθιστούν το zebrafish σημαντικό εργαλείο στην παρούσα εργασία, αφορούν στη σύντομη γενεά, στο συνεχή αναπαραγωγικό κύκλο (Westerfield, 1995), στην υψηλή γονιμότητα και στην εύκολη διατήρησή τους στο εργαστήριο. 2. Υλικά και Μέθοδοι 2.1 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟΣ ΣΧΕΔΙΑΣΜΟΣ Οι πειραματικοί πληθυσμοί προήλθαν από γεννήτορες «άγριου» τύπου» (ZF WT2 F5, Wageningen Agricultural University, The Netherlands). Για τον έλεγχο της επίδρασης της θερμοκρασίας ανάπτυξης, κοινό απόθεμα 3000 αυγών χωρίσθηκε σε τρεις ομάδες οι οποίες υποβλήθηκαν σε τρεις διαφορετικές θερμοκρασίες (DT, 22, 28, 32 ο C). Η έκθεση στις διαφορετικές συνθήκες ξεκίνησε 24 ώρες μετά τη γονιμοποίηση και διήρκησε 280 ο d. Τρεις μήνες μετά τη γονιμοποίηση, τα ενήλικα άτομα των τριών πληθυσμών διατηρήθηκαν στους 26 ο C (ύστερα από βαθμιαία προσαρμογή διάρκειας 1 ώρας) για διάστημα τριών εβδομάδων, οπότε και ξεκίνησαν τα πειράματα υπολογισμού της κολυμβητικής ικανότητας. Η διατήρηση και η εκτροφή των νυμφών και των ενήλικων ψαριών πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τον Westerfield (1995). 2.2 ΕΚΤΙΜΗΣΗ ΤΗΣ ΚΟΛΥΜΒΗΤΙΚΗΣ ΙΚΑΝΟΤΗΤΑΣ Η κολυμβητική ικανότητα εκτιμήθηκε σε τέσσερις θερμοκρασίες άσκησης (20 ο C, 24 ο C, 28 ο C και 32 ο C). Οι δοκιμές πραγματοποιήθηκαν σε μια ειδικά κατασκευασμένη κολυμβητική συσκευή, με τη μέθοδο των κατά βήμα αυξανόμενων ταχυτήτων (Εικ. 1, Koumoundouros et al., 2002). Πριν από τις δοκιμές κολύμβησης, εφαρμόστηκε νηστεία των ατόμων και εγκλιματισμός στην επικείμενη θερμοκρασία άσκησης. Η κρίσιμη ταχύτητα κολύμβησης (Brett, 1967) υπολογίσθηκε σύμφωνα με τον τύπο U crit = U i + U ii (T i /T ii ), όπου, U i, η μέγιστη ταχύτητα του ψαριού κατά την έξοδό του από το κανάλι κολύμβησης (mm sec -1 ), U ii, το βήμα αύξησης της ταχύτητας (mm sec -1 ), T i, το χρονικό διάστημα παραμονής του ψαριού στο τελευταίο βήμα μέχρι την έξοδό του (sec), και T ii, ο χρόνος που παρεμβάλλεται μεταξύ των βημάτων αύξηση της ταχύτητας της ροής του νερού (sec) (Plaut, 2000). Η ευρισκόμενη τιμή ταχύτητας του κάθε ψαριού διαιρέθηκε με το ολικό μήκος του (TL) σύμφωνα με τον τύπο RU crit =U crit /TL (σχετική κρίσιμη ταχύτητα κολύμβησης). To TL κάθε ατόμου μετρήθηκε σε ατομικές ψηφιακές φωτογραφίες με τη βοήθεια του λογισμικού TPSdig (έκδοση 1.19). O έλεγχος των διαφορών στην ταχύτητα κολύμβησης μεταξύ των διαφορετικών πληθυσμών πραγματοποιήθηκε με τις μη παραμετρικές δοκιμές Kruskal-Wallis και Mann-Whitney

3 Εικ. 1: Κολυμβητική συσκευή που χρησιμοποιήθηκε στην παρούσα εργασία. (Α) Πλευρική όψη, (Β) κάτοψη. Τα βέλη υποδεικνύουν την κυκλοφορία του νερού. 3. Αποτελέσματα Η στατιστική ανάλυση έδειξε ότι η θερμοκρασία άσκησης επηρέασε σημαντικά την κολυμβητική επίδοση των αρσενικών ατόμων των 28 ο C (m28) και των 32 ο C (m32), καθώς και των θηλυκών των 32 ο C (f32) θερμοκρασία ανάπτυξης (DT) (Εικ. 2, Πίνακας 1). Αντίθετα, για τις υπόλοιπες ομάδες ατόμων που εξετάστηκαν, η επίδραση της θερμοκρασίας άσκησης στην κρίσιμη ταχύτητα κολύμβησης δεν αποδείχθηκε σημαντική (p>0,05). Η καμπύλη απόκρισης της RU crit στη θερμοκρασία άσκησης ακολούθησε κωδωνοειδές πρότυπο στους πληθυσμούς m28 και m32 (Εικ. 2). Η επίδραση του φύλου στη RU crit αποδείχθηκε στατιστικά σημαντική για τον πληθυσμό των 28 ο C DT (m/f 28), υπό 28 ο C θερμοκρασία άσκησης (p<0,01), και των 32 ο C DT (m/f 32), υπό 20, 24 και 28 ο C θερμοκρασίες άσκησης (p<0,01, p<0,05 και p<0,01 αντίστοιχα). H επίδραση της θερμοκρασίας ανάπτυξης στην κολυμβητική επίδοση (RU crit ) κάθε φύλου αποδείχθηκε στατιστικά σημαντική για τη θερμοκρασία άσκησης των 28 ο C, μεταξύ των αρσενικών ατόμων των 22 ο C DT και των ο C DT (p<0,01 και p<0,001 αντίστοιχα), τη θερμοκρασία άσκησης των 20 ο C, μεταξύ των θηλυκών ατόμων των 32 ο C DT με αυτά των 22 και 28 ο C DT (p<0,01 και p<0,05 αντίστοιχα), και τη θερμοκρασία άσκησης των 24 ο C, μεταξύ των θηλυκών ατόμων των 32 ο C DT ανάπτυξης με αυτά των 22 ο C DT (p<0,01). Πίνακας 1: Επίπεδα σημαντικότητας της επίδρασης της θερμοκρασίας άσκησης (Τ) στη RU crit (Mann-Whitney U test). *, p<0,05. **, p<0,01. ***, p<0,001. -, p>0,05. m28, αρσενικά άτομα των 28 ο C DT. m32, τα αρσενικά άτομα των 32 ο C DT. f32, τα θηλυκά άτομα των 32 ο C DT. m28 m32 f32 T ( o C) T ( o C) T ( o C) ** ** ** 20 - ** *** *** 24 * - 24 ** - 24 * * 28 * 28 ** Συμπεράσματα - Συζήτηση Η οικολογική σημασία της κολύμβησης απαιτεί την κατανόηση των μηχανισμών που την ελέγχουν. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει η θερμοκρασία ανάπτυξης, ως παράγοντας που προκαλεί

4 9 th Symposium on Oceanography & Fisheries, Proceedings, Volume ΙΙ Εικ. 2: Επίδραση της θερμοκρασίας ανάπτυξης στην απόκριση της ταχύτητας κολύμβησης (RU crit ) των αρσενικών ( ) και θηλυκών ( ) zebrafish στη θερμοκρασία άσκησης. Τα τρία γραφήματα αντιστοιχούν στους τρεις πληθυσμούς που αρχικά αναπτύχθηκαν σε διαφορετική θερμοκρασία (22, 28 ή 32 ο C DT). Οι γραμμές σφάλματος αντιστοιχούν σε ±1 SE. Εντός παρένθεσης δίνεται ο αριθμός των αρσενικών και θηλυκών ατόμων που εξετάστηκαν σε κάθε θερμοκρασία άσκησης. μορφολογικές και λειτουργικές αλλαγές μέσω του φαινομένου της οντογενετικής πλαστικότητας (Johnston, 2006; Pigliucci et al., 2006). Στη μόνη μέχρι σήμερα γνωστή εργασία, μελετήθηκε η επίδραση της θερμοκρασίας ανάπτυξης στην ταχύτητα κολύμβησης των νυμφών του Clupea harengus κατά τη φάση σχηματισμού του ουραίου πτερυγίου, δηλαδή κατά τη διάρκεια υποβολής των πληθυσμών στις διαφορετικές συνθήκες (Johnston et al., 2001). Άγνωστο παραμένει μέχρι σήμερα το αν η θερμοκρασία του νερού κατά το εμβρυϊκό και νυμφικό στάδιο είναι ικανή να επηρεάσει την κολυμβητική επίδοση των ενήλικων ατόμων. Τα αποτελέσματα της παρούσας εργασίας αποδεικνύουν πρώτη φορά ότι η θερμοκρασία του νερού κατά τη διάρκεια του νυμφικού σταδίου επιδρά σημαντικά στην κολυμβητική επίδοση των ενήλικων ατόμων ενός είδους (zebrafish), δηλαδή αρκετό καιρό μετά το τέλος των εφαρμογής των διαφορετικών συνθηκών. Προηγούμενες εργασίες για την επίδραση της θερμοκρασίας ανάπτυξης στη φαινοτυπική πλαστικότητα του zebrafish δείχνουν σημαντική διαφοροποίηση του πρωτεομικού προτύπου (Καρίνος, 2006) και του σχήματος του σώματος (Γεώργα, 2007), τόσο μεταξύ των διαφορετικών πληθυσμών ανάπτυξης, όσο και μεταξύ των δύο φύλων. Τα παραπάνω αποτελέσματα θα μπορούσαν να εξηγήσουν τις διαφορές στην κολυμβητική επίδοση μεταξύ των ομάδων της παρούσας εργασίας. Ωστόσο, χρειάζεται περαιτέρω διερεύνηση της θερμοεξαρτώμενης πλαστικότητας των υποκείμενων χαρακτήρων της κολύμβησης (ανάλυση μυών, σκελετικών στοιχείων, μεταβολικών και νευρορυθμιστικών μονοπατιών), ώστε να κατανοηθούν άμεσα οι μηχανισμοί της θερμοεξαρτώμενης μορφολειτουργικής πλαστικότητας. 5. Ευχαριστίες Ευχαριστούμε το Ευρωπαϊκό Κοινoτικό Ταμείο (ΕΚΤ), Επιχειρησιακό Πρόγραμμα Εκπαίδευση και Αρχική Επαγγελματική Κατάρτιση (ΕΠΕΑΕΚ ΙΙ), και ειδικότερα το Πρόγραμμα ΠΥΘΑΓΟΡΑΣ

5 Ι, για τη χρηματοδότηση του ανωτέρω έργου. Επίσης, ευχαριστούμε την κ. Ε. Γεωργακοπούλου και τον κ. Μ. Ventafrinda για τη συμβολή τους στη διεξαγωγή των πειραμάτων. 6. Βιβλιογραφικές Αναφορές Bagatto, B., Ontogeny of cardiovascular control in zebrafish (Danio rerio): Effects of developmental environment. Comparative Biochemistry and Physiology - A Molecular and Integrative Physiology, 141 (4): Brett, J.R., Swimming performance of sockeye salmon (Oncorhynchus nerka) in relation to fatigue time and temperature. Journal of the Fisheries Research Board of Canada, 24 (8): Fisher, R., Leis, J. M., Clark, D.L. & Wilson, S.K., Critical swimming speeds of late-stage coral reef fish larvae: Variation within species, among species and between locations. Marine Biology, 147 (5): Georgakopoulou, E., Sfakianakis, D.G, Kouttouki, S., Divanach, P., Kentouri, M. & Koumounodouros, G., The influence of temperature during early life on phenotypic expression at later ontogenetic stages in sea bass. Journal of Fish Biology, 70 (1): Johnston, I.A., Environment and plasticity of myogenesis in teleost fish. Journal of Experimental Biology, 209 (12): Johnston, I.A., Vieira, V.L.A. & Temple, G.K., Functional consequences and population differences in the developmental plasticity of muscle to temperature in Atlantic herring Clupea harrengus. Marine Ecology Progress Series, 213 (1): Koumoundouros, G., Sfakianakis, D.G., Divanach, P., & Kentouri, M., Effect of temperature on swimming performance of sea bass juveniles. Journal of Fish Biology, 60 (4): Matschak, T.W. & Stickland, N.C., The growth of Atlantic salmon (Salmo salar L.) myosatellite cells in culture at two different temperatures. Experientia, 51 (3): Pelster, B., Developmental plasticity in the cardiovascular system of fish, with special reference to the zebrafish. Comparative Biochemistry and Physiology - A Molecular and Integrative Physiology, 133 (3): Pigliucci, M., Murren, C.J. & Schlichting, C.D., Phenotypic plasticity and evolution by genetic assimilation. Journal of Experimental Biology, 209 (12): Plaut, I., Effects of fin size on swimming performance, swimming behaviour and routine activity of zebrafish (Danio rerio). Journal of Experimental Biology, 203 (4): Spence, R., Gerlach, G., Lawrence, C. & Smith, C The behaviour and ecology of the zebrafish, Danio rerio. Biological reviews, 83 (1): Westfield, M., The Zebrafish Book, a Guide for the Laboratory use of Zebrafish (Danio rerio). 3rd edition. University of Oregon Press, Eugene, Oregon, 385pp. Xie, S.Q., Mason, P.S., Stickland, N.C., Wilkes, D., Goldspink, G. & Fauconneau, B., Lower environmental temperature delays and prolongs myogenic regulatory factor expression and muscle differentiation in rainbow trout (Onchrhynchus mykiss) embryos. Differentiation, 68 (2-3): Καρινός, Θ., Μελέτη πρωτεόματος του zebrafish (Danio rerio) και φυλοειδικές διαφορές στο πρωτομικό προφίλ. Πανεπιστήμιο Πατρών, Διατριβή μεταπτυχιακού διπλώματος ειδίκευσης, 148pp. Γεώργα, Ι., Περιβαλλοντικά ελεγχόμενος προγραμματισμός του φαινοτύπου στο zebrafish, Danio rerio (Hamilton, 1822). Πανεπιστήμιο Πατρών, Διατριβή μεταπτυχιακού διπλώματος ειδίκευσης, 142pp