Θέμα διατριβής «Περιβαλλοντικά ελεγχόμενη οντογενετική και φαινοτυπική πλαστικότητα του zebrafish, Danio rerio (Hamilton 1822)»

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ Υποψήφια Διδάκτορας Γεώργα Ιωάννα Θέμα διατριβής «Περιβαλλοντικά ελεγχόμενη οντογενετική και φαινοτυπική πλαστικότητα του zebrafish, Danio rerio (Hamilton 1822)» Τριμελής Συμβουλευτική Επιτροπή Φλυτζάνης Κ. Αν. Καθηγητής (Τμήμα Βιολογίας, Πανεπιστήμιο Πατρών) Κουμουνδούρος Γ. Αν. Καθηγητής (Τμήμα Βιολογίας, Πανεπιστήμιο Κρήτης) Δημητριάδης Γ. Καθηγητής (Τμήμα Βιολογίας, Πανεπιστήμιο Πατρών) ΠΑΤΡΑ 2015

2

3 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ Υποψήφια Διδάκτορας Γεώργα Ιωάννα Θέμα διατριβής «Περιβαλλοντικά ελεγχόμενη οντογενετική και φαινοτυπική πλαστικότητα του zebrafish, Danio rerio (Hamilton 1822)» Τριμελής Συμβουλευτική Επιτροπή Φλυτζάνης Κ. Αν. Καθηγητής (Τμήμα Βιολογίας, Πανεπιστήμιο Πατρών) Κουμουνδούρος Γ. Αν. Καθηγητής (Τμήμα Βιολογίας, Πανεπιστήμιο Κρήτης) Δημητριάδης Γ. Καθηγητής (Τμήμα Βιολογίας, Πανεπιστήμιο Πατρών) H παρούσα έρευνα έχει συγχρηματοδοτηθεί από την Ευρωπαϊκή Ένωση (Ευρωπαϊκό Κοινωνικό Ταμείο - ΕΚΤ) και από εθνικούς πόρους μέσω του Επιχειρησιακού Προγράμματος «Εκπαίδευση και Δια Βίου Μάθηση» του Εθνικού Στρατηγικού Πλαισίου Αναφοράς (ΕΣΠΑ) Ερευνητικό Χρηματοδοτούμενο Έργο: Ηράκλειτος ΙΙ. Επένδυση στην κοινωνία της γνώσης μέσω του Ευρωπαϊκού Κοινωνικού Ταμείου. ΠΑΤΡΑ 2015

4

5 Επταμελής Συμβουλευτική Επιτροπή Φλυτζάνης Κ. (Αναπληρωτής Καθηγητής, Τμήμα Βιολογίας, Πανεπιστήμιο Πατρών) Δημητριάδης Γ. (Καθηγητής, Τμήμα Βιολογίας, Πανεπιστήμιο Πατρών) Κουμουνδούρος Γ. (Αναπληρωτής Καθηγητής, Τμήμα Βιολογίας, Πανεπιστήμιο Κρήτης) Μίντζας Α. (Καθηγητής, Τμήμα Βιολογίας, Πανεπιστήμιο Πατρών) Κουτσικόπουλος Κ. (Καθηγητής, Τμήμα Βιολογίας, Πανεπιστήμιο Πατρών) Μπέης Δ. (Ερευνητής Γ', δρυμα Ιατροβιολογικών Ερευνών, Ακαδημίας Αθηνών) Βερροιόπουλος Γ. (Καθηγητής, Τμήμα Βιολογίας, Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών)

6

7

8

9 Στον Γιάννη Ν. Στον Σαντίκ M. Σε όλους όσους δε δόθηκε η δυνατότητα, σε οποιοδήποτε χώρο και χρόνο

10

11 Αντί Προλόγου Η εργασία αυτή πραγματοποιήθηκε στο Πανεπιστήμιο Πατρών υπό την ισότιμη επίβλεψη του Αναπληρωτή Καθηγητή κ. Φλυτζάνη Κωνσταντίνου και του επίσης Αναπληρωτή Καθηγητή κ. Κουμουνδούρου Γιώργου. Σας ευχαριστώ για τη δυνατότητα (συν)εργασίας στο χώρο των εργαστηρίων σας, τη βοήθεια που παρείχατε, τις συμβουλές και την υπομονή σας, μα και για τις διαφωνίες μας. Υπήρξατε η αναγκαστική μου «οικογένεια», όπως και εγώ για εσάς. Μέσω της αντιμετώπισής σας έχω καταλάβει τη σημασία της αποδοχής και της βοήθειας από τους ανθρώπους που έχουν τη δύναμη και τη γνώση να καθοδηγούν. Ο καθηγητής κ. Δημητριάδης αποδέχτηκε να είναι το τρίτο μέλος της συμβουλευτικής επιτροπής αυτού του διδακτορικού. Θα ήθελα να σας ευχαριστήσω για την εμπιστοσύνη που δείξατε στη διεξαγωγή αυτού του διδακτορικού και για τη συμμετοχή σας στην επιτροπή. Θα ήθελα να ευχαριστήσω και τους κυρίους Μίντζα Αναστάσιο, Κουτσικόπουλο Κωνσταντίνο, Μπέη Δημήτριο και Βερροιόπουλο Γεώργιο για το ότι αποδέχτηκαν να συμμετάσχουν στην επταμελή επιτροπή αυτού του διδακτορικού, καθώς και για τις παρατηρήσεις τους. Κύριε Μίντζα σας ευχαριστώ ιδιαίτερα για την απλόχερη βοήθεια που μου παρείχατε κατά τη διεξαγωγή των αναλύσεων στο εργαστήριο, αλλά κυρίως για τη φιλική και ανοιχτόκαρδη αντιμετώπισή σας... Είναι προφανές για όσους έχουν περάσει από μια παρόμοια διαδικάσια, ότι χωρίς τη βοήθεια πολλών ανθρώπων η έναρξη και η ολοκλήρωση αυτής της διατριβής θα ήταν ακατόρθωτη. Από το 2008 μέχρι σήμερα έχουν βοηθήσει πολλοί άνθρωποι, ο καθένας με τον τρόπο του. Συνήθως την οικογένεια τη βάζουμε στο τέλος, μα επειδή είναι εκείνοι που υπήρξαν παρόντες στην όλη πορεία και κυρίως όταν όταν εγώ απογοητευόμουν - θα «τοποθετηθούν» στην αρχή. Ευχαριστώ λοιπόν το Θανάση και τη Μαρίνα για την υπομονή και την αγάπη τους, αλλά και για την έμπρακτη βοήθειά τους, όποτε και αν την είχα ανάγκη. Σας ευχαριστώ τον καθένα ξεχωριστά μια και είστε αντίρροπες δυνάμεις αλλά και τους δυο μαζί γιατί έτσι έχετε προσφέρει ό,τι πιο σταθερό έχω γνωρίσει. Ευχαριστώ την αδερφή μου Κωνσταντίνα για τους ίδιους λόγους και ακόμα περισσότερους, που δε νομίζω ότι μπορώ να τους ονοματίσω ή να τους αριθμίσω. Σας ευχαριστώ για τη σταθερότητα της παρουσίας σας και γιατι είστε κοντά μου όσο καλύτερα μπορείτε... για την εμπιστοσύνη σας και για την ανοχή και υπομονή σας στην απουσία μου. Κατά τη διεξαγωγή των πειραμάτων έτυχα δίπλα σε τέσσερις από τους καλύτερους προπτυχιακούς (τότε) φοιτητές που θα μπορούσαν να υπάρχουν. Ο Μιχαλης Λοϊζίδης, η Σοφία Νικούλη, η Μαρία Χρίστου και η Δανάη Πάτσιου είναι τα παιδιά με τα οποία πραγματοποιήσαμε μαζί τα περισσότερα από τα πειράματα και υπήρξαν ιδανικοί συνεργάτες, εκτός από όμορφη παρέα. Θεωρώ μεγάλη τύχη το ότι σας έχω γνωρίσει και σας ευχαριστώ για όλα. Οι πειραματικές διαδικασίες και οι αναλύσεις έγιναν ευκολότερες εξαιτίας σας, το δε εργαστήριο έγινε ένας από τους πιο ομορφους χώρους εργασίας που έχω ποτέ βρεθεί. Μαριώ σε ευχαριστώ ιδιαίτερα και για τη φιλία σου... τη βοήθειά σου, στα μικρά και στα μεγάλα. Ανδριάνα θα ήθελα να ευχαριστώ και εσένα για τη συνεργασία μας το Φθινοπωρο που μας πέρασε, στους πάγκους της Μοριακής. Έλενα, διαδικτυακά ή απο κοντά, όποια και αν είναι η απόσταση που μας χωρίζει η απλά γεμίζει το μεταξύ μας κενό χώρο, είσαι καταφύγιο. Δε σε ευχαριστώ (ίσως μόνο για ένα πιάτο μακαρόνια μια μέρα που το μόνο που άξιζε ήταν η παρέα μας) παρά αφήνω ανοιχτούς λογαριασμούς μεταξύ μας για να επιστρέφουμε πάντα στα σημαντικά (στον κ. Αυγό δηλαδή) και στα άλλα... Ευχομαι απλά να είσαι καλά (και) για να σε έχω δίπλα μου.

12 Η Αναστασία Γεωργίου είναι ένας από τους ανθρώπους που προσφέρουν αθόρυβα, αποτελεσματικά και επί της ουσίας, ό,τι καλύτερο έχουν. Αναστάσω μου σε ευχαριστώ για τη δοτικότητα σου και όχι μόνο... Είμαι τυχερή που σε έχω βρει στο δρόμο μου. Φανή σε ευχαριστώ για όλα και αυτά τα όλα είναι πολλά. Η φιλία σου είναι από τα πολυτιμότερα πράγματα που κέρδισα ερχόμενη στην Κρήτη. Ματίνα οι ωκεανοί ξινίζουν και πρέπει να κάνουμε κάτι για αυτό. Σε ευχαριστώ για τη ματιά σου και πάντα για τη φιλία σου. Μαριανή, σε ευχαριστώ για όλες τις φορές μου με στήριξες. Δώρα σε ευχαριστώ για τις υποστηρικτικές παρεμβολές σου, για την ψύχραιμη ματιά σου. Κανέλλο μου σε ευχαριστώ για την ελευθερία που παρέχεις, για τις βόλτες, για τη βοήθεια... Λάμπρο θα σε ευχαριστώ πάντα για τη φιλία σου. Γιάννη σε ευχαριστώ για τις διαδικτυακές κουβέντες μας. Ευθυμία και Σταυρούλα σας ευχαριστώ για τα πολύτιμα λιθαράκια σας. Αλεξάνδρα και Γεράσιμε σας ευχαριστώ για τη φιλία και την όμορφη παρέα σας... Είστε οι καλύτεροι γείτονες που θα μπορούσε να έχει κανείς! Τούλα σε ευχαριστώ για τους καφέδες, τα γλυκά, τα φαγητά... το αγκάλιασμα. Κασμπαχόγιαννε (μία λέξη) σε ευχαριστώ για το ρούμι και κυρίως τη γωνιά στο μπαρ. Σάββα σε ευχαριστώ για την αδρή προστασία σου. Johan, David, Perro, σας ευχαριστώ για τρεις μήνες ομορφιάς, ζεστασιάς, σπιτιού και επανεκκίνησης. Φωτίου! σε ευχαριστώ για την απλοχεριά σου, τη ζεστασιά της κουβέντας σου και το γέλιο σου. Αναστασόπουλε για την τετράγωνη βοήθειά σου και την πρώτη στροφή. Μαέστρο σε ευχαριστώ για τα τέσσερα (συν ένα) χαρακτηριστικά του ήχου, το χώρο, το χρόνο και τη δυνατότητα στην εκπνοή τους. Νεμίρ, Σαντίκ, Αμπντάλα, Σαμάντ, Ρεζά, Οσμάν, Ομάρ, Dr. Μάκη, Μοζάμελ, Φαϊζά, και όλο το τμήμα... συγγνώμη που ξέχασα τα ονόματά σας, μα σας ευχαριστώ για το αντίβαρο και την ομορφιά που κουβαλήσατε με χίλιες δυσκολίες μέχρι εδώ και τη δώσατε δώρο σε όσους ήταν ανοιχτοί και άξιοι να τη λάβουν. Λυπάμαι που «δεν ήταν και δεν είναι καλύτερα τα πράγματα» μα είμαι ευγνώμων που σας γνώρισα. Αντώνη σε ευχαριστώ για «τα χέρια στων παντελονιών τις τσεπες» και για το τραγούδι που σιγοψιθυρίζες στο πιο δύσκολο από όλα. Χρήστο σε ευχαριστώ για την ορμητικότητά σου, το θάρρος, τη ματιά σου... Αποστόλη σε ευχαριστώ γιατί χωρίς να το γνωρίζεις και χωρίς να υπάρχει η δυνατότητα πια να το μάθεις, μας άλλαξες τη ζωή. Είμαι τυχερή που βρεθήκατε στην πορεία μου και δεν εννοώ φυσικά μόνο την πορεία του διδακτορικού, μα τη μέχρι σήμερα διαδρομή. Καλά ταξίδια σε όλους μας. Ο καθένας στο μονοπάτι του και στις θάλασσές του, με την ευχή να ανταμώνουμε. Ιούνιος 2015

13 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Ι. Κατάλογος συντομογραφιών ΙΙ. Πρόλογος για την εργασία ΙΙΙ. Περίληψη IV. Abstract Σκοπός της εργασίας ΕΙΣΑΓΩΓΗ Φαινοτυπική πλαστικότητα Πρότυπα αντίδρασης (Reaction norms) Το φαινόμενο του ετεροχρονισμού και το πρόβλημα της ηλικίας των ψαριών Πλαστικότητα Φαινοτύπων στα ψάρια Πλαστικότητα στο φυλοκαθορισμό των ψαριών Το zebrafish ως ερευνητικό μοντέλο για την κατανόηση του φαινομένου της πλαστικότητας στα ψάρια Ο φυλοκαθορισμός του zebrafish Οντογένεση του zebrafish Γενικά χαρακτηριστικά του zebrafish ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟΔΟΙ Επίδραση της θερμοκρασίας ανάπτυξης στη φαινοτυπική και οντογενετική πλαστικότητα του zebrafish Πειραματικός Σχεδιασμός Δειγματοληψίες Δειγματοληψίες για τη μελέτη του ρυθμού αύξησης Δειγματοληψίες για τη μελέτη του χρονισμού της οντογένεσης Δειγματοληψίες για τη μελέτη του οντογενετικού προφίλ της γονιδιακής έκφρασης, για τη μελέτη της γονιδιακής έκφρασης στα ενήλικα άτομα και για τον προσδιορισμό της αναλογίας φύλου Απομόνωση ολικού RNA Ποσοτικός και ποιοτικός έλεγχος του απομονωμένου RNA Φωτομέτρηση Ηλεκτροφόρηση RNA σε πήκτωμα αγαρόζης Σύνθεση cdna Σχεδιασμός Εκκινητών Ποσοτική PCR Πραγματικού Χρόνου Quantitative Real Time PCR Μέθοδος ανάλυσης των αποτελεσμάτων της Quantitative Real Time PCR Η τεχνολογία των Nanostring Ανάλυση του σχήματος του σώματος των ενήλικων zebrafish - Γεωμετρική Μορφομετρία

14 Μελέτη του τρόπου δράσης της θερμοκρασίας ανάπτυξης στην πλαστικότητα του zebrafish- Συνδυαστική ανάλυση Σύσταση & εκτροφή των πειραματικών πληθυσμών Επίδραση της πυκνότητας του πληθυσμού στη φαινοτυπική πλαστικότητα (σχήμα σώματος και αναλογία φύλου) του zebrafish Πειραματικός Σχεδιασμός Δειγματοληψίες Δειγματοληψίες για τη μελέτη του ρυθμού αύξησης Δειγματοληψία για τον προσδιοριμό της αναλογίας φύλου Ανάλυση του σχήματος του σώματος των ενήλικων zebrafish-γεωμετρική Μορφομετρία Σύσταση & εκτροφή των πειραματικών πληθυσμών Συνεπίδραση της θερμοκρασίας και της φωτοπεριόδου κατά την πρώιμη ανάπτυξη, στη φαινοτυπική και στην οντογενετική και πλαστικότητα του zebrafish Πειραματικός Σχεδιασμός Δειγματοληψίες Δειγματοληψίες για τη μελέτη του ρυθμού αύξησης Δειγματοληψία για τον προσδιορισμό της αναλογίας φύλου Δειγματοληψίες για τη μελέτη του χρονισμού της οντογένεσης ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Επίδραση της θερμοκρασίας ανάπτυξης στη φαινοτυπική και στην οντογενετική πλαστικότητα τoυ zebrafish Επίδραση της θερμοκρασίας ανάπτυξης στο ρυθμό αύξησης Επίδραση της θερμοκρασίας ανάπτυξης στην αναλογία φύλου Επίδραση της θερμοκρασίας ανάπτυξης στο χρονισμό της οντογένεσης των μεριστικών χαρακτήρων Επίδραση της θερμοκρασίας ανάπτυξης στο σχήμα σώματος των νυμφών και των ενήλικων αρσενικών και θηλυκών zebrafish Επίδραση της θερμοκρασίας ανάπτυξης στη γονιδιακή έκφραση των ενήλικων αρσενικών και θηλυκών zebrafish Οντογενετικό προφίλ της γονιδιακής έκφρασης, κατά την εφαρμογή των διαφορετικών θερμοκρασιακών συνθηκών Έλεγχος της πιθανής αθροιστικής δράσης της θερμοκρασίας ανάπτυξης στο σχήμα του σώματος των ενήλικων zebrafish-συνδυαστική ανάλυση Επίδραση της πυκνότητας του πληθυσμού στη φαινοτυπική πλαστικότητα του zebrafish Επίδραση της πυκνότητας του πληθυσμού, στο ρυθμό αύξησης Επίδραση της πυκνότητας του πληθυσμού, στην αναλογία φύλου Επίδραση πυκνότητας του πληθυσμού, στο σχήμα του σώματος των ενήλικων θηλυκών και αρσενικών zebrafish Συνεπίδραση της θερμοκρασίας και της φωτοπεριόδου κατά την πρώιμη ανάπτυξη, στη φαινοτυπική και στην οντογενετική πλαστικότητα του zebrafish

15 Συνεπίδραση της θερμοκρασίας και της φωτοπεριόδου κατά την πρώιμη ανάπτυξη, στο ρυθμό αύξησης Συνεπίδραση της θερμοκρασίας και της φωτοπεριόδου κατά την πρώιμη ανάπτυξη, στην αναλογία φύλου Συνεπίδραση της θερμοκρασίας και της φωτοπεριόδου κατά την πρώιμη ανάπτυξη, στο χρονισμό της οντογένεσης ΣΥΖΗΤΗΣΗ Επίδραση της πυκνότητας και της θερμοκρασίας κατά την ανάπτυξη, στο ρυθμό αύξησης, καθώς και της συνεπίδρασης θερμοκρασίας φωτοπεριόδου Επίδραση της θερμοκρασίας ανάπτυξης, της πυκνότητας και της συνεπίδρασης θερμοκρασίας φωτοπεριόδου κατά την ανάπτυξη στην αναλογία φύλου Επίδραση της θερμοκρασίας ανάπτυξης και της συνεπίδρασης θερμοκρασίας φωτοπεριόδου κατά την ανάπτυξη στο χρονισμό της οντογένεσης των μεριστικών χαρακτήρων Επίδραση της πυκνότητας και της θερμοκρασίας κατά την ανάπτυξη, στο σχήμα του σώματος νυμφών και ενήλικων zebrafish και έλεγχος της πιθανής αθροιστική δράσης της θερμοκρασίας στο σχήμα του σώματος των ενήλικων zebrafish Επίδραση της θερμοκρασίας ανάπτυξης στο οντογενετικό προφίλ της γονιδιακής έκφρασης και στη γονιδιακή έκφραση των ενήλικων θηλυκών και αρσενικών zebrafish Επίλογος V. Βιβλιογραφία ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ Ι Georga I, Koumoundouros G (2010) Thermally Induced Plasticity of Body Shape in Adult Zebrafish Danio rerio (Hamilton, 1822). Journal of Morphology, 271: ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ ΙΙ-Α Προϊόντα αλληλούχησης από τη Real Time q-pcr ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ ΙΙ-Β Λίστα δειγμάτων προοριζόμενων για την απομόνωση ολικού RNA και την ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ ΙΙ-Γ Αποτελέσματα από την ποσοτικοποίηση της γονιδιακής έκφρασης με την τεχνολογία των Nanostring...241

16 14

17 Ι. Κατάλογος συντομογραφιών hpf Hours Post Fertilization dpf Days Post Fertilization dph Days Post hatching NL Notochord Length TL Total Length SL Standard Length FL Fork Length PCR Polymerase Chain reaction Real Time q-rt PCR Real Time Quantitative Reverse Transcriptase Polymerase Chain reaction Real Time qpcr Real Time Quantitative Polymerase Chain reaction SD Sex Determination TSD Temperature Sex Determination ESD Enviromental Sex Determination GSD Genetic Sex Determination PSD Polygenic sex determination DNA Deoxyribonucleic acid RNA Ribonucleic acid CpG CpG sites (CG sites) αλληλουχίες DNA όπου τα νουκλεοτίδια κυτοσίνης βρίσκονται δίπλα σε νουκλεοτίδια γουανίνης SGR Specific Groeth Rate CV Canonical Variate TGF Transforming Growth Factors TGF-β Transforming Growth Factor beta BMPs Bone Morphogenetic Proteins GDFs Growth Differentiation Factors bhlh basic Helix-Loop-Helix bactin actin, beta 1 ef1a eukaryotic translation elongation factor 1 alpha 1, like 1 rl13a ribosomal protein ar androgen receptor bmp15 bone morphogenetic protein cryaa crystallin, alpha A cyp19a1a cytochrome P450, family 19, subfamily A, polypeptide 1a cyp19a1b cytochrome P450, family 19, subfamily A, polypeptide 1b dmrt1 doublesex and mab-3 related transcription factor 1 (dmrt1), transcript variant 1 dnmt3 DNA (cytosine-5-)-methyltransferase 3 eda ectodysplasin A figla factor in the germline alpha mstn myostatin a gdf9 growth differentiation factor 9 hsd11b2 hydroxysteroid 11-beta dehydrogenase 2 igf1 insulin-like growth factor 1 15

18 osteocalcin (bglap) osteocalcin / bone gamma-carboxyglutamate (gla) protein (bglap) mgp matrix gla protein myog myogenin mstn myostatin a npy neuropeptide Y pes pescadillo sox9a SRY-box containing gene 9a tnni2a.3 troponin I, skeletal, fast 2a.3 tp53 tumor protein p53 16

19 ΙΙ. Πρόλογος για την εργασία Η παρούσα εργασία, εστιάζει στην «περιβαλλοντικά ελεγχόμενη οντογενετική και φαινοτυπική πλαστικότητα του zebrafish, Danio rerio». Ως πλαστικότητα ορίζεται η δυνατότητα ενός συγκεκριμένου γονοτύπου να εκφράσει ένα εύρος φαινοτύπων, ως απόκριση στις περιβαλλοντικές συνθήκες στις οποίες υπόκειται (Fordyce 2006). Η θερμοκρασία ανάπτυξης θεωρείται ως ένας από τους σημαντικότερους παράγοντες πρόκλησης πλαστικότητας στα ψάρια και η μελέτη της θερμο-εξαρτώμενης οντογενετικής πλαστικότητας καταλαμβάνει τον κύριο όγκο αυτής της εργασίας. Δευτερευόντως, έχει ελεγθεί η επίδραση της πληθισμιακής πυκνότητας και της συνδυαστικής δράσης θερμοκρασία - φωτοπεριόδου, στην πλαστικότητα του είδους. 17 Το zebrafish αποτελεί είδος μοντέλο σε διάφορους τομείς της Βιολογίας, ενώ έχει αποδειχθεί ότι εμφανίζει θερμο-εξαρτώμενη πλαστικότητα, γεγονός που - μαζί με άλλα χαρακτηριστικά του - το καθιστούν ιδανικό υποψήφιο για τη μελέτη του φαινομένου της πλαστικότητας στην ομάδα των τελεόστεων ιχθύων. Έτσι, σχεδιάστηκε ένα πείραμα σύμφωνα με το οποίο γονιμοποιημένα αυγά zebrafish τοποθετήθηκαν σε τρεις διαφορετικές θερμοκρασιακές συνθήκες από την 1 η ημέρα μετά τη γονιμοποίηση (dpf) μέχρι το ολικό μήκος σώματος (ΤL) των νεαρών ατόμων να φτάσει τα 13-14mm οπότε έχει ολοκληρωθεί η μεταμόρφωση και ο φυλοκαθορισμός. Εξετάστηκε η επίδραση της θερμοκρασίας ανάπτυξης στον τελικό (ενήλικο) φαινότυπο των ατόμων, καθώς και στο χρονισμό της οντογένεσης, κατά τη διάρκεια της εφαρμογής των διαφορετικών θερμοκρασιακών συνθηκών. Στην πρώτη περίπτωση, προσδιορίστηκε η αναλογία φύλου των πληθυσμών και μελετήθηκε το σχήμα του σώματος των ενήλικων ατόμων που είχαν αναπτυχθεί στις διαφορετικές θερμοκρασιακές συνθήκες. Για να ελεγθεί η επίδραση της θερμοκρασίας στο χρονισμό της οντογένεσης, εξετάστηκε η ανάπτυξη μεριστικών χαρακτήρων και η έκφραση γονιδίων που σχετίζονται με την ανάπτυξη, την αύξηση και το φυλοκαθορισμό, σε σχέση με το μήκος του σώματος των ψαριών, το οποίο αποτέλεσε μέτρο προσδιορισμού του σταδίου ανάπτυξής των αναπτυσσόμενων ιχθύων. Αν και τον κύριο όγκο αυτης της εργασίας, καταλαμβάνει η επίδραση της θερμοκρασίας ανάπτυξης στην πλαστικότητα του zebrafish, σε δύο δευτερεύοντα πειράματα που πραγματοποιήθηκαν, εξετάστηκε η επίδραση της πυκνότητας του πληθυσμού και η συνεπίδραση της θερμοκρασίας ανάπτυξης-φωτοπεριόδου στην πλαστικότητα του είδους. Η επίδραση της θερμοκρασίας κατά την ανάπτυξη, διαφοροποιεί το ρυθμό και το χρονισμό των αναπτυξιακών διαδικασιών, φαινόμενο το οποίο ορίζεται ως ετεροχρονισμός και συνδέεται με την οντογενετική πλαστικότητα. Ο όρος του ετεροχρονισμού εμπεριέχει την έννοια του χρόνου στις αναπτυξιακές διαδικασίες. Κατά συνέπεια, ο τρόπος μέτρησης του βιολογικού χρόνου και ο προσδιορισμός του εκάστοτε οντογενετικού σταδίου, αποκτά κεφαλαιώδη σημασία κατά τη μελέτη τέτοιων φαινομένων. Η σχέση οντογένεσης, ηλικίας (π.χ. σε ημέρες μετά τη γονιμοποίηση ή την εκκόλαψη) και μεγέθους (μήκος σώματος) αποτέλεσε αναπόφευκτα παράλληλο αντικείμενο μελέτης στην παρούσα εργασία. Δύο ξεχωριστά πειράματα διεξήχθησαν προκειμένου να μελετηθεί η επίδραση της πυκνότητας του πληθυσμού στο ρυθμό αύξησης, την αναλογία φύλου και το σχήμα του σώματος των zebrafish, καθώς και η συνεπίδραση της θερμοκρασίας ανάπτυξης και της φωτοπεριόδου στο ρ υθμό αύξησης, στην αναλογία φύλου και στο χρονισμό της οντογένεσης (με τη μελέτη της ανάπτυξης μεριστικών χαρακτήρων) του είδους. Προκειμένου να διeυκολυνθεί ο αναγνώστης, ακολουθεί μια συνοπτική περιγραφή της δομής της εργασίας.

20 Στο Εισαγωγικό Κεφάλαιο, αρχικά επιδιώκεται μια αναλυτική περιγραφή του φαινομένου της φαινοτυπικής πλαστικότητας, καθορίζοντας τους σχετικούς όρους που χρησιμοποιούνται για την περιγραφή του και αναλύοντας τη σημασία του από εξελικτικής-αναπτυξιακής σκοπιάς (evo-devo approach). Εστιάζουμε στα φαινόμενα της οντογενετικής πλαστικότητας και του ετεροχρονισμού, τα οποία απασχολούν την παρούσα εργασία. Η έννοια του ετεροχρονισμού εμπερικλείει την έννοια του χρόνου και η ανάλυση του φαινομένου αναδεικνύει το ζήτημα του (επιστημονικά ακριβή) προσδιορισμού της «ηλικίας» των ψαριών και τη σχέση οντογένεσης, ηλικίας και μεγέθους, όροι εξαιρετικής σημασίας για την άρτια διεξαγωγή της πειραματικής διαδικασίας και την ερμηνεία των αποτελεσμάτων. Ακολουθεί μια σύντομη αναφορά του φαινομένου της πλαστικότητας στην ομάδα των ιχθύων γενικά, με έμφαση στη θερμο - εξαρτώμενη πλαστικότητα. Στο ίδιο κεφάλαιο επιχειρείται μια γενική περιγραφή της διαδικασίας του φυλοκαθορισμού των ψαριών, χαρακτήρας ο οποίος εμφανίζει πλαστικότητα. Αναλύεται η υπάρχουσα βι βλιογραφία που σχετίζεται με την πλαστικότητα του zebrafish, ενώ περιγράφονται τα όσα είναι γνωστά μέχρι σήμερα, σχετικά με το φυλοκαθορισμό του είδους. Ακολουθεί η περιγραφή της ανάπτυξης και των σταδίων της οντογένεσης του είδους, διαδικασίες εξαρτώμενες από περιβαλλοντικούς παράγοντες, όπως είναι η θερμοκρασία ανάπτυξης. Στο τέλος του Κεφαλαίου αναφέρονται ορισμένα γενικά χαρακτηριστικά για το είδος του zebrafish και η αιτιολόγηση της χρήσης του ως πειραματόζωο για τη μελέτη του φαινομένου της πλαστικότη τας στα ψάρια. 18 Στο 2 ο Κεφάλαιο (Υλικά και Μέθοδοι), περιγράφεται αναλυτικά ο σχεδιασμός του πειράματος που ακολουθήθηκε για τη μελέτη της θερμο-εξαρτώμενης πλαστικότητας στο zebrafish, καθώς επίσης ο σχεδιασμός των δύο δευτερεύοντων πειραμάτων που πραγματοποιήθηκαν για τη μελέτη της επίδρασης της πληθυσμιακής πυκνότητας και της συνεπίδρασης θερμοκρασίας ανάπτυξης-φωτοπεριόδου, στη φαινοτυπική και οντογενετική πλαστικότητα του είδους. Περιγράφονται οι μέθοδοι που χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση των αποτελεσμάτων και την εκτροφή των πληθυσμών, ξεχωριστά για κάθε πείραμα. Στο Κεφάλαιο των Αποτελεσμάτων, αναγράφονται τα αποτελέσματα των τριών πειραμάτων. Στο πρώτο πείραμα εξετάζεται η επίδραση της θερμοκρασίας ανάπτυξης στο ρυθμό αύξησης, στην αναλογία φύλου, στην ανάπτυξη των μεριστικών χαρακτήρων και στο σχήμα του σώματος των ενήλικων zebrafish. Σε μοριακό επίπεδο, αναλύεται η επίδραση της θερμοκρασίας ανάπτυξης στη γονιδιακή έκφραση κατά τη διάρκεια της εφαρμογής των διαφορετικών θερμοκρασιακών συνθηκών (οντογενετικό προφίλ της γονιδιακής έκφρασης), καθώς και στους ιστούς (μύες, εγκέφαλος και γονάδες) ενήλικων αρσενικών και θηλυκών zebrafish που είχαν υποβληθεί στις διαφορετικές θερμοκρασίες ανάπτυξης. Ακολουθούν τα αποτελέσματα του πειράματος που πραγματοποιήθηκε για τη μελέτη της επίδρασης της πυκνότητας του πληθυσμού στο ρυθμό αύξησης, την αναλογία φύλου και το σχήμα του σώματος των zebrafish, και του πειράματος που αφορούσε στη μελέτη της συνεπίδρασης της θερμοκρασίας ανάπτυξης και της φωτοπεριόδου στο ρυθμό αύξησης, στην αναλογία φύλου και στο χρονισμό της οντογένεσης (με τη μελέτη της ανάπτυξης μεριστικών χαρακτήρων). Στο ίδιο Κεφάλαιο γίνεται μια συνδυαστική μελέτη των αποτελεσμάτων που αφορούν στην επίδραση της θερμοκρασίας ανάπτυξης στο σχήμα του σώματος των ενήλικων zebrafish της παρούσας εργασίας, με τα αποτελέσματα της δημοσιευμένης εργασίας των Georga & Koumoundouros (2010), η οποία παρατίθεται στο Παράρτημα Ι. Στην εργασία αυτή είχε μελετηθεί η επίδραση της θερμοκρασίας ανάπτυξης σε δύο διαφορετικά αναπτυξιακά παράθυρα, ένα κατά την πρώιμη και ένα κατά την όψιμη νυμφική περίοδο, στο σχήμα του σώματος

21 των ενήλικων zebrafish. Οι δύο αυτές οντογενετικές περίοδοι, συμπεριλαμβάνονται στο πρώτο πείραμα της παρούσας μελέτης. Η μετα - ανάλυση αυτών των αποτελεσμάτων πραγματοποιήθηκε στα πλαίσια της παρούσας διδακτορικής διατριβής, με στόχο να προσδιοριστεί η σημασία της χρονικής διάρκειας επίδρασης της θερμοκρασιακής ανάπτυξης, η πιθανή αθροιστική δράση της θερμοκρασίας ανάπτυξης στο σχήμα του σώματος ή / και η πιθανή διαφορετική ευαισθησία των εκάστοτε οντογενετικών σταδίων έναντι της επίδρασης της θερμοκρασίας. 19 Το Κεφάλαιο της Συζήτησης, εστιάζει στο συνδυασμό των αποτελεσμάτων και στα συμπεράσματα που προκύπτουν, ενώ θέτει τους πιθανούς μελλοντικούς στόχους. Το Παράρτημα Ι περιλαβάνει τη δημοσιευμένη εργασία (Georga & Koumoundouros 2010). Στο Παράρτημα ΙΙ παρατίθενται λεπτομέρεις που σχετίζονται με τις δειγματοληψίες που έλαβαν χώρα κατά τη διεξαγωγή των πειραμάτων και με την ανάλυση των αποτελεσμάτων.

22 20

23 ΙΙΙ. Περίληψη Τα ψάρια αποτελούν μια ομάδα οργανισμών που εμφανίζει υψηλού βαθμού πλαστικότητα. Με τον ότο φαινοτυπική πλαστικότητα (phenotypic plasticity) χαρακτηρίζεται η ιδιότητα ενός γονοτύπου να παράγει διαφορετικούς φαινοτύπους, όταν εκτίθεται σε διαφορετικές περιβαλλοντικές συνθήκες (Stearns 1989, West-Eberhard 1989, West-Eberhard 2005, Pigliucci et al. 2006). Η περιβαλλοντικά προκλειόμενη φαινοτυπική πλαστικότητα μπορεί να εξεταστεί και υπό το πρίσμα του ετεροχρονισμού, ο οποίος ορίζεται ως μια «ομοιόμορφη αλλαγή στο ρυθμό ή στο χρονισμό μιας οντογενετικής διαδικασίας» (Rice 1997). Η μέτρηση του οντογενετικού χρόνου, της ηλικίας και ο καθορισμός του οντογενετικού σταδίου, αποτελούν ορόσημα κατά τη μελέτη του ρυθμού ανάπτυξης και διαφοροποίησης, παράγοντες που ήδη εμπεριέχουν τη λειτουργική έννοια του χρόνου στον ορισμό τους και την πρακτική εφαρμογή τους. Έτσι, επειδή στην παρούσα εργασία εξετάζεται η περιβαλλοντικά προκλειόμενη πλαστικότητα στο zebrafish, και η παρουσία ετεροχρονικών φαινομένων στην αλληλουχία της οντογένεσης, ένα από τα αντικείμενα της μελέτης βρέθηκε να αποτελεί και ο ακριβέστερος τρόπος προσδιορισμού των οντογενετικών σταδίων των ιχθύων σε dpf / dph ή SL / TL. Το μήκος του σώματος θεωρήθηκε ως το ιδανικότερο για τον προσδιορισμό των οντογενετικών σταδίων και σχετικά αποτελέσματα εξάχθηκαν και αναλύθηκαν σε σε συνάρτηση με αυτό. Απο κει και πέρα, ο κύριος όγκος της παρούσας εργασίας αφορά στην επίδραση της θερμοκρασίας ανάπτυξης (από τη γονιμοποίηση μέχρι και την ολοκλήρωση της μεταμόρφωσης) στη φαινοτυπική πλαστικότητα του zebrafish, Danio rerio (Hamilton, 1822). Η επίδραση της θερμοκρασίας εξετάστηκε στην αναλογία φύλου, στο σχήμα του σώματος των νυμφών και των ενήλικων αρσενικών και θηλυκών zebrafish, στο χρονισμό της οντογένεσης των μεριστικών χαρακτήρων και στην έκφραση γονιδίων που σχετίζονται με την ανάπτυξη (igf1, npy, myog, mstna, tnni2a.3, osteocalcin, mgp, eda, cryaa, pes) και το φυλοκαθορισμό, άμεσα ή έμμεσα (ar, dmrt1, sox9a, cyp19a1a, cyp19a1b, figla, bmp15, gdf9, hsd11b2, tp53) κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης (οντογενετικό προφίλ έκφρασης γονιδίων) (με την τεχνολογία των NanoString), όσο και δευτερογενώς σε ιστούς ενήλικων αρσενικών και θηλυκών ατόμων (igf1, npy, myog, mstna, tnni2a.3, ar, dmrt1, sox9a, cyp19a1a, cyp19a1b, figla, bmp15, gdf9) (με τη μέθοδο της Real Time q-pcr). Επίσης, εξετάζεται η επίδραση της πληθυσμιακής πυκνότητας και της συνεπίδρασης της θερμοκρασίας ανάπτυξηςφωτοπεριόδου στο SGR, στην αναλογία φύλου των zebrafish, στο σχήμα του σώματος των ενήλικων αρσενικών και θηλυκών ατόμων (μόνο υπό την επίδραση της πυκνότητας), και στο στο χρονισμό της οντογένεσης των μεριστικών χαρακτήρων (μόνο υπό τη συνεπίδραση θερμοκρασίας - φωτοπεριόδου). Στόχος ήταν μια όσο το δυνατόν πιο ολοκληρωμένη μελέτη της περιβαλλοντικά ελεγχόμενης φαινοτυπική πλαστικότητας του είδους, υπό την επίδραση των παραπάνω περιβαλλοντικών παραγόντων, με κύριο τη θερμοκρασία ανάπτυξης. Κάθε πείραμα διεξήχθει σε δύο πειραματικές επαναλήψεις. Στο πείραμα επίδρασης της θερμοκρασίας στην πλαστικότητα του zebrafish, η θερμοκρασία (22, 28 και 32 C) επέδρασε καθόλη τη διάρκεια του εμβρυικού και νυμφικού σταδίου, μέχρι και τη μεταμόρφωση (1 η dpf μέχρι ~14mm TL). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι στη θερμοκρασία των 22 C η αναλογία φύλου μετατοπίστηκε υπέρ των αρσενικών ατόμων, με τα ποσοστά των θηλυκών ατόμων (21,65% και 26,19% για την πρώτη και τη δεύτερη πειραματική επανάληψη, αντίστοιχα) να είναι σημαντικά χαμηλότερα σε σχέση με τους 28 C (50,83% και 54,22% για την πρώτη και τη δεύτερη πειραματική επανάληψη, αντίστοιχα) (p<0,001 G-test) και τους 32 C (47,24% και 56,80% για την πρώτη και τη δεύτερη πειραματική επανάληψη, αντίστοιχα) (p<0,001 G-test). Προκειμένου να μελετηθεί η επίδραση της θερμοκρασίας στο χρονισμό της οντογένεσης, καταγράφηκε το μέσο SL 50 στο 21

24 οποίο ολοκληρώνεται η εμφάνιση ανάπτυξη των ακόλουθων οντογενετικών χαρακτήρων / γεγονότων: πρώτο υπουραίο οστό, επουραίο οστό, αριθμός των πτερυγιοφόρων του ραχιαίου πτερυγίου, αριθμός των πτερυγιοφόρων του εδρικού πτερυγίου, προραχιαία οστά, ουρόστυλο, κοιλιακά πτερύγια, και οστεοποίηση του πρώτου πτερυγιοφόρου του εδρικού πτερυγίου, του πρώτου πτερυγιοφόρου του ραχιαίου πτερυγίου, και του επουραίου. Η θερμοκρασία των 32 C επιτάχυνε την ανάπτυξη όλων σχεδόν των μεριστικών χαρακτήρων, με εξαίρεση αυτή του επουραίου οστού, ενώ παρατηρήθηκαν πιθανά ετεροχρονικά φαινόμενα που διαφοροποιούν τους 22 C, από τους 28 και 32 C και αφορούν στην αλληλουχία της ανάπτυξης των εξεταζόμενων οντογενετικών χαρακτήρων. Η ανάλυση γεωμετρικής μορφομετρίας έδειξε ότι η θερμοκρασία ανάπτυξης επέδρασε στο σχήμα του σώματος των νυμφών zebrafish (Wilks' λ=0,0779, p<0,001), με τις δύο κανονικές μεταβλητές (CV1 and CV2) να διαχωρίζουν πλήρως τα άτομα των τριών θερμοκρασιακών συνθηκών, ενώ επέδρασε σημαντικά και στο σχήμα του σώματος των ενήλικων αρσενικών και θηλυκών ατόμων (Wilks' λ=0,0315, p<0,001), με τη CV1 να διαχωρίζει τα άτομα με βάση το φύλο τους, και τη CV2 να διαχωρίζει τα άτομα αναπτύχθηκαν στους 22 C από τα άτομα των δύο θερμότερων συνθηκών. Θερμο-εξαρτώμενες διαφορές στη γονιδιακή έκφραση, των ενήλικων zebrafish, παρατηρήθηκαν μόνο στην έκφραση της myogenin (υψηλότερη στα αρσενικά των 22 C, σε σχέση με των 32 C) και της cyp19a1a (χαμηλότερη στα αρσενικά των 22 C, σε σχέση με των 32 C) (Mann-Whitney U test, p<0,05). Οι υπόλοιπες διαφορές αφορούσαν στα φυλοκαθοριστικά γονίδια και συνδέονταν με τις αναμενόμενες διαφοροποιήσεις μεταξύ των θηλυκών και αρσενικών ατόμων. Κατά τη μελέτη του οντογενετικού προφίλ της έκφρασης των υπό μελέτη γονιδίων κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης, ως εξαιρετική σημασίας θα αναφερθούν τα αποτελέσματα που αφορούν στα γονίδια osteocalcin και tnni2a.3, που συνδέονται με την ανάπτυξη των οστών και των μυών αντίστοιχα. Μείωση της θερμοκρασίας ανάπτυξης, έχει ως αποτέλεσμα την μετατόπιση της αλλαγής του προτύπου της έκφρασης αυτών των γονιδίων σε μεγαλύτερο μήκος σώματος (t-test, p<0,01), επιβεβαιώνοντας τη μερική αποσύνδεση του ρυθμού αύξησης από το ρυθμό διαφοροποίησης, υπό την επίδραση της θερμοκρασίας. Επίσης, μελετήθηκε η ευαισθησία των zebrafish έναντι της επίδρασης της θερμοκρασίας ανάπτυξης, ανάλογα με το αναπτυξιακό στάδιο στο οποίο δρα η θερμοκρασία και ανάλογα με το συνολικό χρόνο δράσης της. Αυτό πραγματοποιήθηκε συγκρίνοντας τα αποτελέσματα που αφορούν στην επίδραση της θερμοκρασίας ανάπτυξης (22, 28, 32 C) στο σχήμα του σώματος των ενήλικων αρσενικών και θηλυκών zebrafish από την εργασία των Georga & Koumoundouros (2010) (Παράρτημα I) όπου μελετήθηκε η επίδραση της θερμοκρασίας ανάπτυξης κατά την πρώιμη και κατά την όψιμη οντογενετική περίοδο στο σχήμα του σώματος των ενήλικων ατόμων, με αυτά της παρούσας εργασίας, όπου η δράση της θερμοκρασίας (22, 28, 32 C) πραγματοποιήθηκε για χρονικό διάστημα που περιλαμβάνει τις δύο οντογενετικές περιόδους που εξετάζονται στην εργασία των Georga & Koumoundouros (2010). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η οντογενετική περίοδος και άρα η χρονική διάρκεια επίδρασης της θερμοκρασίας είναι αυτή που πρωτίστως διαχωρίζει τους πειραματικούς πληθυσμούς, και δευτερευόντως η θερμοκρασία ανάπτυξης. Σε ό,τι αφορά στην επίδραση της πυκνότητας στην πλαστικότητα του zebrafish, σχεδιάστηκαν δύο πειράματα. Το πρώτο μελετούσε την επίδραση της πυκνότητας του πληθυσμού κατά τα πρώιμα οντογενετικά στάδια και μέχρι τα 10 mm TL, ενώ το δεύτερο μελετούσε την επίδραση της πυκνότητας μετά από μήκος σώματος 8 mm TL. Τα αποτελέσματα κατέδειξαν στατιστικά σημαντικές διαφορες στην αύξηση (G-test, p<0,05) μόνο εντός των ίδιων συνθηκών πυκνότητας μεταξύ της πρώτης και της δεύτερης φάσης ανάπτυξης, ενώ η τελική αναλογία φύλου δε φαίνεται να επηρεάστηκε. Τα αποτελέσματα της γεωμετρικής μορφομετρίς, κατέδειξαν μεγάλες διαφορές στην τελική διαμόρφωση του 22

25 σχήματος του σώματος, τόσο μεταξύ των θηλυκών και αρσενικών ατόμων, όσο και μεταξύ των ατόμων που αναπτύχθηκαν στις διαφορετικές συνθήκες πυκνότητας. Εφαρμόστηκαν έξι συνδυασμοί θερμοκρασίας νερού (22, 28, 32 C) και φωτοπεριόδου (14:10, 8:16 L:D) από την 1 η dpf μέχρι τα mm ΤL. Τα αποτελέσματα υπέδειξαν σημαντική συνεπίδραση της θερμοκρασίας και της φωτοπερίοδου στο SGR (p<0,05). Στη φωτοπερίοδο 14:10 L:D ο SGR αυξήθηκε γραμμικά με την αύξηση της θερμοκρασίας και στις τρεις θερμοκρασιακές συνθήκες (22, 28, 32 C), ενώ στη φωτοπερίοδο 8:16 L:D ο SGR επηρεάστηκε σημαντικά μόνο στο εύρος των C. Ο ρυθμός αύξησης του ολικού μήκους αποδείχθηκε ανεξάρτητος της φωτοπεριόδου στις χαμηλές θερμοκρασιακές συνθήκες (22, 28 C, p>0,05), ενώ στους 32 C η αύξηση της φωτοπεριόδου προκάλεσε σημαντική αύξηση του SGR (p<0,05). Οι παραπάνω παρατηρήσεις επιβεβαιώθηκαν και στις δύο πειραματικές επαναλήψεις. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα, η θερμοκρασία και η φωτοπερίοδος συνεπιδρούν στο ρυθμό σωματικής αύξησης, με τον καθένα από αυτούς να ελέγχει τη δράση του άλλου. Μόνο στην θερμοκρασία των 22 C σε συνδυασμό με την φωτοπερίοδο 14:10 (L:D) και στη μία εκ των δύο πειραματικών επαναλήψεων, παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά (G-test, p<0,05) στην αναλογία φύλου, με τα θηλυκά άτομα να είναι λιγότερα από τα αρσενικά (31% θηλυκά έναντι 69% αρσενικά zebrafish) (Εικόνα , Πίνακας 26). Τέλος, εξετάστηκε η οντογένεση των ακόλουθων μεριστικών χαρακτήρων: Αρχή κάμψης της νωτοχορδής (Flexion), εμφάνιση του εδρικού πτερυγίου (Anal), εμφάνιση του ραχιαίου πτερυγίου (Dorsal), ολοκλήρωση κάμψης της νωτοχορδής (Post-flexion), ολοκλήρωση του σχηματισμού της ουραίας διχάλας (Caudal) και εμφάνιση προπλασμάτων των κοιλιακών πτερυγίων (Abdominal). Εντός της ίδιας συνθήκης φωτοπεριόδου (14:10 L:D και 8:16 L:D), σχεδόν σε όλες τις περιπτώσεις, αύξηση της θερμοκρασίας από τους 22 C στους 28 ή στους 32 C, προκάλεσε επιτάχυνση της εμφάνισης ολοκλήρωσης των εκάστοτε οντογενετικών χαρακτήρων. Με εξαίρεση την ανάπτυξη του εδρικού πτερυγίου στους 22 C, σε κάθε άλλη περίπτωση που παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ των ίδιων θερμοκρασιών στις διαφορετικές συνθήκες φωτοπεριόδου, αυτή οφειλόταν σε καθυστέρηση της εμφάνισης ή της ολοκλήρωσης της ανάπτυξής τους στη μεγάλη φωτοπερίοδο, σε σχέση με τη μικρή. 23

26 24

27 IV. Abstract Fish are considered as a highly plastic group of organisms, capable of modifying their phenotype in relation to environmental conditions (Meyer 1987, Snyder & Dingle 1990, Swain & Foote 1990, Baker et al. 2005, Kristjansson, 2005, Sharpe et al. 2008, Gonda et al, 2009). The term phenotypic plasticity characterizes the ability of a single genotype to produce a variety of phenotypes, as a response to the different environmental conditions experienced during development. Environmentally induced phenotypic differences can be a result of differences in developmental timing and environmental factors may act upon the overall growth pattern, affecting the timing of developmental events and having long-term effects. Those uniform changes in the rate, or in the relative timing of developmental events, are defined by the term heterochrony (Rice 1997, McNamara 1997, Klingenberg 1998, Smith 2002, McNamara 2012, Odentaal & Adriaens 2014, Gunter et al. 2014). Ontogenetic time, age and developmental stages, are used as milestones in studies concerning growth and differentiation and that is because those two parameters already contain the functional concept of time in their definition and therefore in their practical application. So, since this study concerns the environmentally induced plasticity and heterochrony in zebrafish, one of the objects of this study turned to be the most accurate way of determining the ontogenetic stages of the developing fish, in dpf / dph or SL / TL. The length of the body was used as the most appropriate indicator of the ontogenetic stages and results were extracted and analyzed in relation to it. From there on, the main purpose of this work was to study the effect of developmental temperature (from fertilization up until the completion of the stage of metamorphosis) in zebrafish, Danio rerio (Hamilton, 1822) phenotypic plasticity. The effect of temperature was examined in the sex ratio, the body shape of zebrafish larvae and adults, the timing of the ontogeny of meristic characters and the expression of genes associated with development (igf1, npy, myog, mstna, tnni2a. 3, osteocalcin, mgp, eda, cryaa, pes) and sex determination, directly or indirectly (ar, dmrt1, sox9a, cyp19a1a, cyp19a1b, figla, bmp15, gdf9, hsd11b2, tp53). Gene expression was studies during development (ontogenetic gene expression profile) (NanoString technologies), and secondarily in tissues of adult male and female zebrafish (igf1, npy, myog, mstna, tnni2a.3, ar, dmrt1, sox9a, cyp19a1a, cyp19a1b, figla, bmp15, gdf9) (Real Time q-pcr). The effect of population density and co-effect of temperature and photoperiod was also examined in the SGR, in the sex ratio of zebrafish, the shape of the body of adult males and females (only under the influence of density) and the timing of the ontogeny of the meristic characters (only under the co-effect of temperature and photoperiod). The ultimate goal was the intergraded study (to the limits of the possible) of environmentally controlled phenotypic plasticity, under the influence of the above environmental factors, and mostly under the influence of the critical developmental temperature. Each experiment was conducted twice. The temperature effect (22, 28 and 32 C) on zebrafish plasticity was examined throughout the whole larval period, from the 1 st dpf, up until 14mm TL. Results demonstrated a significant affect od temperature conditions in sex ratio, with the 22 C shifting the ratio in favor of males and differentiating statistically significant from the two warmer temperature regimes (p <0,001 G-test). In order to study the effect of temperature on the timing of ontogenesis, the average SL 50 in which each of the examined meristic characters developed, or each of the ontogenetic events (ossifications) completed, was estimated. The development of the following meristic characters, were examined: (1) the number of the pterygiophores of the anal fin (2) the number of the pterygiophores of the dorsal fin (3) ossification of the first pterygiophore of the pelvic fin (4) ossification of the first 25

28 pterygiophore of the dorsal fin (5) development of urostyle (6) development of the first hypoural bone (7) development of the epural bone (8) ossification of the epural (9) development of pre-dorsals (10) development of the pelvic fins. 32 C accelerated the development of almost all meristic characters examined, except that of the epural, while possible heterochronic effects were observed, since when comparing individuals of the same thermal treatment among them, it is shown that at 28 and 32 C the development of the pelvic fins took place earlier than the ossification of the pterygiophores of the anal fin and the ossification of the epural, which is not the case at 22 C. Also, the development of urostyle preceded the development of pterygiophores of the anal fin at 22 C, while the opposite happened at 28 C. Geometric morphometric analysis revealed that developmental temperature significantly affected zebrafish larval body shape (Wilks' lambda = 0,0779, p <0,001), with CV1 and CV2 fully separating individuals grown under the three different temperature regimes. Fish body shape differences were established in adult female and male zebrafish, also (Wilks' lambda = 0,0315, p <0,001), with CV1 separating individuals based on their gender, and CV2 separating individuals developed at 22 C from the two warmer conditions. Thermo-dependent differences in gene expression in adult zebrafish, were observed only in the expression of myogenin (higher in males of 22 C, compared to 32 C) and cyp19a1a (lower in males of 22 C, compared to 32 C) (Mann-Whitney U test, p <0,05). Other gene expression differences concerned sex determination genes and were linked to the expected differences between females and males. In the study of the ontogenetic profiles of gene expression, results concerning osteocalcin and tnni2a.3 (associated with bone and muscle development, respectively), are considered of great importance. Reduced developmental temperature resulted in a significant displacement of the change of the expression pattern that was observed, to a greater body length (t-test, p <0,01), confirming a partial decoupling of growth rate from differentiation rate, under the influence of temperature. The sensitivity of zebrafish against the effect of temperature was studied, in order to reveal the importance of the time that temperature during development acts, as well as if the duration of temperature effect has profound additive effect on the occurrence of plasticity. This was done by comparing the results related to the effect of developmental temperature (22, 28, 32 C) in adult female and male zebrafish body shape from the study of Georga & Koumoundouros (2010) (Annex I), in which the effect of developmental temperature was studied in early and late ontogeny, with the respective results of this study, where developmental temperature (22, 28, 32 C) acted upon zebrafish over a time period that includes both ontogenetic periods examined in the work of Georga & Koumoundouros (2010). Results showed that the developmental period and hence the duration of the temperature effect are the factors primarily distinguishing experimental populations of the different temperature regimes, and secondarily developmental temperature itself. In regard to the effect of density on zebrafish the plasticity, two experiments were designed. The first studied the effect of population density in the early ontogenetic stages, up until 10 mm TL, while the second studied the effect of density after the body length of the fish reached 8 mm TL. Results showed statistically significant differences (G-test, p <0,05) in growth rate, only within the same density conditions, between the first and second phase of development, while the final sex ratio did not seem to be affected. The results of geometric morfometris demonstrated large differences in the final shaping of body shape, both among females and males, and among those developed in different density conditions. Concerning the experiment studying the co-effect of temperature and photoperiod in zebrafish plasticity, the following should be noted: Experimental populations were submitted under a combination of three temperature conditions (22, 28 και 32 C) with two photoperiod regimes (14:10, 8:16 L:D), from 1 st dpf, up until mm TL. Results demonstrated a 26

29 significant co-effect of temperature and photoperiod on SGR (p<0.05), since at 14:10 L:D, larval SGR was linearly correlated with temperature, whereas at 8:16 L:D thermal effect on SGR was evident only at C. Growth rate proved to be independent of photoperiod at low temperature conditions (22, 28 C, p> 0,05), while at 32 C increased photoperiod caused a significant increase in SGR (p <0,05). These observations were confirmed in both experimental repetitions. There was no co-effect of temperature and photoperiod regimes in the sex ratio of zebrafish, since only at the temperature condition of 22 C combined with photoperiod 14:10 (L:D) and in only one of the two experimental replicates statistically significant differences were observed in the in the sex ratio (G-test, p <0,05), with the percentage of females beinf significant lower than the percentage of males (31% vs. 69%) Finally, the ontogeny of the following meristic characters was studied: Notochord flexion, development of the anal fin (Anal), development of the dorsal fin (Dorsal), the completion of notochord flexion (Post-flexion), the completion of the formation of the caudal fork (Caudal) and the development of the pelvic fins (Abdominal). Within the same photoperiod treatment (14:10 L: D and 8:16 L: D), in almost all cases the increase of temperature from 22 C to 28 or at 32 C, caused an acceleration in the appearance or integration of each of the ontogenetic characters examined. Excluding the development of the pelvic fins at 22 C, in any other case the statistically significant differences observed between the same temperature conditions under the effect of different photoperiod regimes, was due to a delay on the onset or completion of their development in the photoperiod of 14:10 L: D, in relation to the photoperiod of 8:16 L: D. 27

30 28

31 1. Σκοπός της εργασίας Σκοπός της διατριβής είναι η μελέτη της περιβαλλοντικά ελεγχόμενης οντογενετικής και φαινοτυπικής πλαστικότητας του zebrafish. Ο κύριος όγκος της εργασίας αφορά στην επίδραση της θερμοκρασίας ανάπτυξης (γονιμοποίηση μέχρι και την ολοκλήρωση της μεταμόρφωσης): Στην αναλογία φύλου Στο σχήμα του σώματος των ενήλικων αρσενικών και θηλυκών zebrafish Στο χρονισμό της οντογένεσης, εκτιμώντας το SL 50 όπου επιτελείται η ανάπτυξη ορισμένων μεριστικών χαρακτήρων, καθώς και στο ρυθμό αύξησης. Στη γονιδιακή έκφραση τόσο κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης (οντογενετικό προφίλ έκφρασης γονιδίων), όσο και στα ενήλικα άτομα. Τα γονίδια που επιλέχθηκαν αφορούν στο φυλοκαθορισμό του είδους, καθώς και στην ανάπτυξη γενικά (π.χ. IGF1) ή ειδικά των μυών (π.χ. myogenin) και των οστών (π.χ. osteocalcin). 29 Επίσης, εξετάζεται η επίδραση της πληθυσμιακής πυκνότητας και της συνεπίδρασης της θερμοκρασίας ανάπτυξης-φωτοπεριόδου στην οντογενετική και φαινοτυπική πλαστικότητα του zebrafish. Αναλυτικότερα, εξετάστηκε η επίδραση της πυκνότητας: Στην αναλογία φύλου του zebrafish και Στο σχήμα του σώματος των ενήλικων αρσενικών και θηλυκών ατόμων H συνεπίδραση της θερμοκρασίας ανάπτυξης-φωτοπεριόδου εξετάστηκε Στην αναλογία φύλου του zebrafish Στο χρονισμό της οντογένεσης, εκτιμώντας το ΤL 50 όπου επιτελείται η ανάπτυξη ορισμένων μεριστικών χαρακτήρων, καθώς και στο ρυθμό αύξησης. Τέλος, μελετάται η ευαισθησία των zebrafish έναντι της επίδρασης της θερμοκρασίας ανάπτυξης, ανάλογα με το αναπτυξιακό στάδιο στο οποίο δρα η θερμοκρασία και ανάλογα με το συνολικό χρόνο δράσης της. Αυτό πραγματοποιείται συγκρίνοντας τα αποτελέσματα που αφορούν στην επίδραση της θερμοκρασίας ανάπτυξης στο σχήμα του σώματος των ενήλικων αρσενικών και θηλυκών zebrafish της παρούσας εργασίας, με τα αποτελέσματα από την εργασία των Georga & Koumoundouros (2010) (Παράρτημα I) όπου μελετήθηκε η επίδραση της θερμοκρασίας ανάπτυξης κατά την πρώιμη και κατά την όψιμη οντογενετική περίοδο στο σχήμα του σώματος των ενήλικων ατόμων. Στην παρούσα εργασία η δράση της θερμοκρασίας πραγματοποιείται για χρονικό διάστημα που περιλαμβάνει τις δύο οντογενετικές περιόδους που εξετάζονται στην εργασία των Georga & Koumoundouros (2010).

32 2. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 2.1. Φαινοτυπική πλαστικότητα Όλα τα χαρακτηριστικά που εκδηλώνει ένας οργανισμός και είναι δυνατό να παρατηρηθούν, ορίζουν το φαινότυπο αυτού και περιλαμβάνουν τη μορφολογία, την ανάπτυξη, τις βιοχημικές και φυσιολογικές διαδικασίες, καθώς και ηθολογικά - συμπεριφορικά πρότυπα. Ένα από τα κρισιμότερα ερωτήματα της Βιολογίας, είναι το πως ένας γονότυπος μεταφράζεται σε ένα δεδομένο φαινότυπο. Είναι πια γνωστό ότι αυτή η μετάφραση δεν ορίζεται από μια γραμμική σχέση, ενώ σε πολλές περιπτώσεις αποδεικνύεται ότι ένας γονότυπος μπορεί να καθορίζει ένα εύρος φαινοτύπων. Εξωτερικοί περιβαλλοντικοί παράγοντες μπορεί να επηρεάσουν το ρυθμό της ανάπτυξης και τη διαδικασία της οντογένεσης, οδηγώντας στην παραγωγή διαφορετικών φαινοτύπων, από τον ίδιο γονότυπο, ενώ κατά περίπτωση, είναι δυνατό να προκύψει ο ίδιος φαινότυπος από διαφορετικούς γονοτύπους. Ο γονότυπος, το περιβάλλον, καθώς και η μεταξύ τους αλληλεπίδραση είναι οι γενεσιουργοί παράγοντες ενός φαινοτύπου, ο οποίος με τη σειρά του καθορίζει τη σχέση ενός οργανισμού με το περιβάλλον του, βιοτικό και αβιοτικό (Stearns 1991, Price et al. 2003, Whitman & Agrawal 2009, Kelly et al. 2012). Ο όρος φαινοτυπική πλαστικότητα (phenotypic plasticity) περιγράφει την ιδιότητα ενός γονοτύπου να παράγει διαφορετικούς φαινοτύπους, όταν εκτίθεται σε διαφορετικές περιβαλλοντικές συνθήκες (Stearns 1989, West-Eberhard 2003, Pigliucci et al. 2006). Η παραγωγή εναλλακτικών φαινοτύπων μπορεί να είναι είτε αποτέλεσμα τροποποιήσεων των αναπτυξιακών γεγονότων έναντι των περιβαλλοντικών συνθηκών, είτε αποτέλεσμα της ικανότητας ενός οργανισμού να αλλάξει το φαινότυπό του αποκρινόμενος στις περιβαλλοντικές αλλαγές (Kelly et al. 2012). Η πλαστικότητα, σύμφωνα με τον Bradshaw (1965) είναι εγγενές-κληρονομήσιμο χαρακτηριστικό του γονοτύπου ενός χαρακτήρα και μπορεί να υπόκειται στη διαδικασία της φυσικής επιλογής. Ως εκ τούτου, μπορεί να εξελιχθεί. Το πρώτο παράδειγμα φαινοτυπικής πλαστικότητας σε ζωικούς οργανισμούς δόθηκε από τον Woltereck, το 1909, ο οποίος μελέτησε τις επιπτώσεις της διατροφής και της θήρευσης στη μορφολογία της Daphnia (Εικόνα 2.1-1). 30 Εικόνα 2.1-1: Η ανάπτυξη άκανθας στην περιοχή του κεφαλιού και της ουράς, στο κλαδοκαιρεωτό Daphnia, ως αποτέλεσμα θηρευτικής πίεσης. Αποτελεί το πρώτο περιγεγραμμένο παράδειγμα φαινοτυπικής πλαστικότητας. (Από Woltereck, 1909).

33 Ο Mayr, το 1963, χρησιμοποίησε τον όρο polyphenism για χαρακτηρίσει τη μορφολογική ποικιλία των φαινοτυπων σε ένα πληθυσμό, η οποία δεν ήταν αποτέλεσμα γενετικών διαφορών. Σήμερα ο ίδιος όρος χρησιμοποιείται για να περιγράψει εκείνη την περίπτωση φαινοτυπικής πλαστικότητας, κατα την οποία ένα χαρακτήρας έχει δύο ή περισσότερες διακριτές μορφές, εντός ενός εύρους περιβαλλοντικών συνθηκών (σε αντίθεση με μία διαβαθμισμένη ποικιλία φαιντυπικών μορφών) (Fusco & Minelli 2010). Κάπως έτσι, και για πολλές δεκαετίες, η έννοια της φαινοτυπικής πλαστικότητας φαίνεται ότι συνδέθηκε με τη μορφολογία. Αν και ορισμένοι ερευνητές επιχειρηματολογούν υπέρ της χρήσης ενός αυστηρού ορισμού της έννοιας της φαινοτυπικής πλαστικότητας, συνδεδεμένου με τη μορφολογία (ή / και τη μορφογένεση) (Nicoglou, 2011), είναι πλέον κοινώς αποδεκτό ότι η φαινοτυπική πλαστικότητα εκφράζεται σε επίπεδο μορφολογίας, βιοχημείας, και φυσιολογίας, καθώς και στα πρότυπα συμπεριφοράς, ενώ όταν εκφράζεται κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης, αναφερόμαστε στην οντογενετική πλαστικότητα. Η οντογενετική πλαστικότητα αναφέρεται και ως αναπτυξιακή πλαστικότητα (developmental plasticity) 1. Ένας οργανισμός που εμφανίζει πλαστικότητα, εκφράζει διαφορετικούς φαινοτύπους ανάλογα με το βιοτικό ή / και αβιοτικό περιβάλλον του (Price et al. 2003). Το φαινόμενο της πλαστικότητας μπορεί να τροποποιήσει άμεσα ή έμμεσα τις αλληλεπιδράσεις που αναπτύσσονται μεταξύ των ατόμων ή / και μεταξύ των ατόμων και του περιβάλλοντός τους (Miner et al. 2005) δρώντας σε διάφορα επίπεδα της οικολογικής οργάνωσης. Μπορεί να μεταβάλλει τις τροφικές σχέσεις, να αλλάξει τη δομή των πληθυσμών, να επιδράσει στη δυναμική των βιοκοινοτήτων και να επηρεάσει τη σταθερότητα ενός πληθυσμού και την βιοποικιλότητα, αρχικά σε τοπικό επίπεδο (Agrawal 2001). Η εξέταση του φαινομένου της πλαστικότητας σε οργανισμικό και πληθυσμιακό επίπεδο ή / και σε επίπεδο βιοκοινότητας, υπό το πρίσμα της εξέλιξης, αποτέλεσε αντικείμενο μελέτης πολλών εργασιών. Η ολοκληρωμένη μελέτη του φαινομένου δεν μπορεί παρά να συμπεριλάβει τους μοριακούς και αναπτυξιακούς μηχανισμούς που συνοδεύουν την εμφάνισή του στους οργανισμούς, κατεύθυνση προς την οποία κινούνται οι μελέτες των τελευταίων ετών. Η βιβλιογραφία που σχετίζεται με το φαινόμενο της φαινοτυπικής πλαστικότητας, στη συντριπτική πλειοψηφία των περιπτώσεων ασχολείται εισαγωγικά με τον καθορισμό των σχετικών εννοιών και αυτό γιατί πέρα από τη βιολογική σημασία του φαινομένου, η ίδια η έννοια της φαινοτυπικής πλαστικότητας έχει αποτελέσει αντικείμενο συζήτησης (Εικόνα 2.1-2). Οι Schlichting & Smith (2002) όπως και άλλοι ερευνητές - επιχειρηματολογούν υπέρ ενός γενικότερου ορισμού, σύμφωνα με τον οποίο ως φαινοτυπική πλαστικότητα ορίζεται οποιαδήποτε περιβαλλοντικά ελεγχόμενη αλλαγή στα χαρακτηρισικά γνωρίσματα ενός οργανισμού. Αυτός ο ορισμός, εκτός της αναπτυξιακής πλαστικότητας, περιλαμβάνει τη μεταμόρφωση και τη διαφοροποίηση (Schlichting & Smith 2002), καθώς επίσης τη μάθηση, τον εγκλιματισμό και την απόκριση του ανοσοποιητικού συστήματος (Gilbert & Epert 2001, αναφερόμενοι από Fusco & Minelli 2010). Επίσης ο όρος «περιβαλλοντικό ερέθισμα» χρησιμοποιείται με μια ευρύτερη έννοια, υποδηλώνοντας τόσο το εξωτερικό (περιβαλλοντική θερμοκρασία, διατροφή, θήρευση κ.ο.κ.) όσο και το εσωτερικό (π.χ. ορμονικός έλεγχος) 31 1 Οι όροι ανάπτυξη (development) και οντογένεση (ontogeny) συχνά συγχέονται μεταξύ τους. Η έννοια της ανάπτυξης είναι ευρύτερη, προσδιορίζοντας το σύνολο των αλλαγών στις οποίες υπόκεινται οι οργανισμοί από την εμβρυακή κατάσταση στην ωριμότητα, ή αλλιώς από ένα χαμηλότερο επίπεδο οργάνωσης, σε ένα υψηλότερο. Από την άλλη πλευρά, ο ορισμός της οντογένεσης περιλαμβάνει την έννοια της ανάπτυξης. Ως οντογένεση ορίζεται «ολόκληρη η ακολουθία των γεγονότων που εμπλέκονται στην ανάπτυξη ενός οργανισμού» (Collins English Dictionary Complete and Unabridged, HarperCollins Publishers, 2003). Αν και σε πολλές εργασίες επικρατεί ο όρος αναπτυξιακή πλαστικότητα, ο όρος οντογενετική πλαστικότητα θεωρείται ακριβέστερος σε αυτή την εργασία.

34 περιβάλλον ενός οργανισμού. Υποστηρίζουν, δε, ότι η πλαστικότητα θα μπορούσε να μελετηθεί σε επίπεδο μεμονωμένων οργανισμών και όχι απαραίτητα σε πληθυσμιακό επίπεδο. Παρά το πλήθος των διαφορετικών ενδεχομένως προσεγγίσεων στον ορισμό του φαινομένου της φαινοτυπικής πλαστικότητας (Εικόνα 2), παραμένει σταθερό το σχήμα της φαινοτυπικής διαφοροποίησης ως αποτέλεσμα της περιβαλλοντικής επίδρασης. 32 Εικόνα 2.1-2: Ορισμοί της φαινοτυπικής πλαστικότητας (από Whitman & Argawal, 2009). Ερευνητές όπως ο Pigliucci, αναφέρονται στις θεωρητικές διαφορές του ορισμού και της έννοιας της πλαστικότητας, υπό το πρίσμα της Εξελικτικής (η φυσική επιλογή δρά επί του μέσου φαινοτύπου σε κάθε περιβάλλον και όχι σε αυτή καθ εαυτή την πλαστικότητα), Αναπτυξιακής (μη αναστρέψιμες, μακροπρόθεσμες μορφολογικές αλλαγές) και Μοριακής (πλαστικότητα γονιδίων) Βιολογίας. Είναι φανερό ότι η ανάγκη σαφούς ορισμού για την έννοια της πλαστικότητας και η εκτενέστατη πλέον σχετική βιβλιογραφία, συνδέεται με την εξαιρετική σημασία του φαινομένου σε αναπτυξιακό και εξελικτικό επίπεδο (Εικόνα 2.1-3). Θα πρέπει εδώ να σημειωθεί ότι οι οργανισμοί προκειμένου να ανταπεξέλθουν στο συνεχώς μεταβαλλόμενο περιβάλλον τους αναγκάζονται σε μεταβολές στη μορφολογία τους, τη φυσιολογία ή / και τη συμπεριφορά τους, πλαστικότητα η οποία δεν είναι απαραιτήτως προσαρμοστική (adaptive) (Ghalabor et al. 2007), με την εξελικτική έννοια του όρου. Αναστρέψιμες, περιβαλλοντικά ελεγχόμενες αλλαγές αποκλειστικές του φαινοτύπου ενήλικων ατόμων, όπως π.χ. ο εγκλιματισμός, αποτελούν μορφές πλαστικότητας όπως αναφέρθηκε και παραπάνω με βάση των ευρύτερο ορισμό του φαινομένου - αλλά διαφοροποιούνται πλήρως από την πλαστικότητα που προέρχεται από την επίδραση του

35 περιβάλλοντος κατά την ανάπτυξη (Beldade et al. 2011). Ο όρος προσαρμοστική αναπτυξιακή πλαστικότητα (μπορεί να βρεθεί και ως προσαρμοστική φαινοτυπική πλαστικότητα) χρησιμοποιείται για τις περιπτώσεις στις οποίες η περιβαλλοντικά προκλειόμενη φαινοτυπική ποικιλομορφία είναι αποτέλεσμα αλλαγών που καθιερώθηκαν πριν από την ενηλικίωση (Beldade et al. 2011). Ως οντογενετική πλαστικότητα λοιπόν, ορίζεται η ιδιότητα ενός συγκεκριμένου γονοτύπου να παράγει διαφορετικούς (ενήλικους) φαινοτύπους, ως αποτέλεσμα της περιβαλλοντικά ελεγχόμενης ρύθμισης της ανάπτυξης (Beldade et al. 2011). Θεωρείται, δε, οτι έχει προσαρμοστικό ρόλο, όταν οι περιβαλλοντικά ελεγχόμενες αλλαγές καταλήγουν στην δημιουργία ενός καταλληλότερου - για το περιβάλλον του - ενήλικου φαινοτύπου, ενώ παράλληλα μπορεί να «κοστίζει ενεργειακά» (Pigliucci 2001, Pigliucci 2006) Εικόνα 2.1-3: Αριθμός δημοσιεύσεων όπου αναφέρεται ο όρος φαινοτυπική πλαστικότητα, στον τίτλο, την περίληψή ή / και στις λέξεις κλειδιά, από το 1967 μέχρι το (Χρησιμοποιώντας τη μηχανή αναζήτησης Το φαινόμενο της πλαστικότητας έχει μελετηθεί εκτενώς σε πλήθος οργανισμών (έντομα, φυτά, ψάρια) και - εξελικτικά - θεωρείται ότι παίζει ρόλο στην προσαρμοστικότητα αυτών, συμβάλλωντας θετικά στην επιβίωση και την αναπαραγωγή τους σε καινούργια περιβάλλοντα ή απλά σε περιβαλλοντικές αλλαγές (Gotthard & Nylin 1995, West-Eberhard 2003, Pigliucci et al. 2006), καθοδηγώντας κατά αυτόν τον τρόπο την ποικιλομορφία των οργανισμών (Price et al. 2003, West-Eberhard 2003). Πράγματι, δεν είναι δύσκολο να φανταστεί κανείς ότι εντός των ορίων ενός πληθυσμού, η φαινοτυπική διακύμανση όπως αυτή οριοθετείται από την αλληλεπίδραση του γενετικού υπόβαθρου με το περιβάλλον - 2 Είναι γνωστό ότι ο προσαρμοστικός ρολος ενός φαινοτύπου σχετίζεται με την αύξηση της δυνατότητας και πιθανότητας επιβίωσης των ατόμων που τον φέρουν. Η δημιουργία κατάλληλων φαινοτύπων αναφέρεται πολύ συχνά σε ενήλικες οργανισμούς. Όμως, όπως τόνισε ο Orton το 1955, «η σχετική επιτυχία ή αποτυχία ενός είδους, μπορεί να καθορίζεται σε μεγάλο βαθμό από γεγονότα που επιδρούν στα πρώιμα αναπτυξιακά στάδια, πολύ περισσότερο από ότι στον ενήλικα οργανισμό». Επιπλεον, σήμερα γνωρίζουμε ότι η ίδια η οντογένεση υπόκειται στη διαδικασία της φυσικής επιλογής, καθορίζοντας ποιες οντογενετικές δαφοροποιήσεις θα κληρονομηθούν ή όχι (Adriaens & Verraes 2002). Κατά συνέπεια, δε θα ήταν λάθος να διευρύνουμε την πρόταση των Beldade et al. (2011), ορίζοντας ως οντογενετική πλαστικότητα την ιδιότητα ενός γονοτύπου να παράγει διαφορετικούς φαινοτύπους γενικά, καθ όλη τη διάρκεια της οντογένεσης, μέχρι και την ενηλικίωση. Κατ επέκταση, ο προσαρμοστικός ρόλος των περιβαλλοντικά ελεγχόμενων αλλαγών (θα) κρίνεται από τη δημιουργία ενός καταλληλότερου φαινοτύπου όχι μόνο για τον ενήλικα οργανισμό, αλλά και για τον αναπτυσσόμενο.

36 αποτελεί «συστατικό στοιχείο» της φυσικής επιλογής. «Ενας γονότυπος είναι τόσο καλός, όσο του επιτρέπει το περιβάλλον μέσα στο οποίο βρίσκεται» (Gibson 2008). Κατά τους Fusco & Minelli (2010), όταν ένα περιβαλλοντικός παράγοντας έχει μια απρόβλεπτη και πρόσκαιρη επίδραση επί ενός οντογενετικού γεγονότος, για «χρονικό διάστημα συγκρίσιμο με το σύνολικό κύκλο ζωής του οργανισμού» τότε η αναπτυξιακή πλαστικότητα οδηγεί στην παραγωγή εναλλακτικών φαινοτύπων με αυξημένη καταλληλότητα σε μια σειρά από διαφορετικές καταστάσεις. Για παράδειγμα, ανάλογα με το είδος της τροφής που είναι διαθέσιμο, οι φρύνοι του είδους Spea multiplicata, μπορούν να εξελιχθούν σε δύο διακριτές μορφές η εμφάνιση των οποίων είναι περιβαλλοντικά ελεγχόμενη. Οι διαφορές αυτές εντοπίζονται στη σιαγόνα και την πεπτική συσκευή (Pfennig 1990, Fusco & Minelli 2010). Ο ρόλος των περιβαλλοντικών επιδράσεων κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης στην πλαστικότητα των οργανισμών και κατ επέκταση ο ρόλος της φαινοτυπικής πλαστικότητας στην εξέλιξη των ειδών, μέσω της παραγωγής ενήλικων φαινοτύπων, κατάλληλων έναντι των περιβαλλοντικών διακυμάνσεων, αποτέλεσε με το πέρασμα των ετών κεντρικό ερώτημα πολλών εργασιών. Σύμφωνα με τους Whitman & Agrawal (2009), τα τελευταία είκοσι χρόνια η σχετική με τη φαινοτυπική πλαστικότητα βιβλιογραφία έχει αυξηθεί σημαντικά, ενώ με το πέρασμα των ετών οι σχετικές μελέτες στοχεύουν στη σφαιρική κατανόηση του φαινομένου και τη σύνδεσή του με το αντίστοιχο γενετικό και μοριακό υπόβαθρο. Οι νέες μελέτες συνδυάζουν τον τομέα της Οικολογίας με αυτόν της Αναπτυξιακής Βιολογίας, με σκοπό τη μελέτη του φαινομένου της πλαστικότητας σε όλα τα επίπεδα της βιολογικής οργάνωσης: Από το γενετικό και μοριακό υπόβαθρο των περιβαλλοντικά ελεγχόμενων αναπτυξιακών αλλαγών σε οργανισμικό επίπεδο, στην ποικιλομορφία σε φαινοτυπικό επίπεδο και στην προσαρμοστικότητα σε επίπεδο πληθυσμών (Sterans 1991, Stearns 2000, Beldade et al. 2011). Η μελέτη της οικολογικής σημασίας της περιβαλλοντικά εξαρτώμενης φαινοτυπικής ποικιλομορφίας υπό το πρίσμα της εξέλιξης και η ανάλυση των υποκείμενων μοριακών μηχανισμών ελέγχου του φαινομένου, οδήγησαν στην γένεση της εξελικτικής - οικολογικής αναπτυξιακής πλαστικότητας (evolutionary-developmental approach / evo-devo approach). Ενώ όμως Εξελικτική Βιολογία αφορά φαινοτυπικές αλλαγές προερχόμενες από αντίστοιχες αλλαγές στην αλληλουχία των γονιδίων, η εξελικτική αναπτυξιακή προσέγγιση της πλαστικότητας αφορά φαινοτυπικές αλλαγές που προκαλούνται αποκλειστικά από τις περιβαλλοντικές επιδράσεις, χωρίς να αλλάζει η αλληλουχία των γονιδίων. Το γενετικό και μοριακό υπόβαθρο αυτών των αλλαγών, αφορά - όπως θα δούμε παρακάτω - τα πρότυπα της γονιδιακής έκφρασης. Όροι όπως πρωτέομα και μετάγραφο, άρχισαν να χρησιμοποιούνται προκειμένου να κατανοηθεί το μοριακό υπόβαθρο της περιβαλλοντικά ελεγχόμενης πλαστικότητας. Η αρχή της Βιολογίας, σύμφωνα με την οποία το γονιδίωμα μεταγράφεται και τελικά μεταφράζεται με την παραγωγή πρωτεϊνών, δίνοντας έτσι το φαινότυπο, αποτελεί τη βάση της μελέτης του πιθανού ελέγχου που ασκούν περιβαλλοντικοί παράγοντες επί της ρύθμισης της μεταγραφής και της μετάφρασης, καθώς και της ενεργοποίησης του γονιδιώματος. Ο έλεγχος αυτός είναι μια διαδικασία δυναμική και φαίνεται ότι ενορχηστρώνεται από τα κύτταρα με στόχο την απόκριση έναντι των περιβαλλοντικών επιδράσεων (Schlichting & Smith, 2002). Σύμφωνα με τους Schlichting & Smith (2002), το κάθε είδους περιβαλλοντικό σήμα λαμβάνεται και επεξεργάζεται απο μεμονωμένα κύτταρα και κάθε είδους πλαστική απόκριση είναι αποτέλεσμα της επίδρασης περιβαλλοντικών παραγόντων σε κυτταρικό επίπεδο. Η προερχόμενη από την επίδραση του περιβάλλοντος σε ένα γονότυπο, φαινοτυπική ποικιλομορφία, μπορεί να είναι αποτέλεσμα διαφορικής γονιδιακής έκφρασης. Ήδη από το 1930 ο Goldschmidt, αλλά και αργότερα οι Ford και Huxley αναφέρουν ότι τα γονίδια μπορούν να επηρεάσουν το ρυθμό των αναπτυξιακών διαδικασιών (Raff 1996). Ο κλάδος της Επιγενετικής (Epigenetics) εξετάζει όλους εκείνους τους παράγοντες που μεταβάλλουν τη 34

37 γονιδιακή έκφραση ως απόκριση σε ερεθίσματα (κυρίως περιβαλλοντικά, αλλά μπορούμε να αναφερθούμε γενικά σε ερεθίσματα, εξωγενή και ενδογενή), χωρίς να αλλάζει η αλληλουχία των γονιδίων (Ho and Burggren, 2010). Εναλλακτικά πρότυπα γονιδιακής έκφρασης ή διαφορετικού είδους αλληλεπιδράσεις των ίδιων γονιδίων, παράγουν διαφορετικού είδους αποκρίσεις έναντι των περιβαλλοντικών ερεθισμάτων (Gibson 2008). Η μεθυλίωση του DNA (DNA methylation) προκαλεί αλλαγή στη γονιδιακή έκφραση, άσχετη με αλλαγές στη νουκλεοτιδική αλληλουχία. Για παράδειγμα, οι Siegfried & Simon (2010), έδειξαν ότι «η μεθυλίωση των CpG δινουκλεοτιδίων στο DNA (σε φυσιολογικές συνθήκες, η μεθυλίωση της κυτοσίνης παρατηρείται μόνο σε κυτοσίνες που προηγούνται της βάσης της γουανίνης, δηλαδή στις θέσεις CpG) προκαλεί μείωση της γονιδιακής έκφρασης, με το να παρεμποδίζεται η πρόσδεση των μεταγραφικών παραγόντων. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι οι θέσεις στις οποίες οι αλληλουχίες CpG εμφανίζουν μεγάλη συχνότητα βρίσκονται συχνά σε περιοχές που προηγούνται των γονιδίων και σχετίζονται με τη ρύθμιση της έκφρασής τους». Έχει βρεθεί ότι πραγματοποιούνται θερμο-εξαρτώμενες αλλαγές στο πρότυπο μεθυλίωσης του DNA, και άρα αντίστοιχες αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση (Hashida et al. 2006) και αυτό είναι ένας τρόπος περιβαλλοντικά ελεγχόμενης γονιδιακής έκφρασης που οδηγεί στην εμφάνιση πλαστικότητας. Χαρακτηριστική εργασία που επιβεβαιώνει την παραπάνω πρόταση αποτελεί αυτή των Navarro-Martín et al. (2011), οι οποίοι απέδειξαν ότι τα επίπεδα μεθυλίωσης του υποκινητή του γονιδίου cyp19a στο λαβράκι εξαρτώνται από το φύλο των ατόμων και επηρεάζονται από τη θερμοκρασία ανάπτυξης κατά την πρώιμη οντογενετική περίοδο. Απέδειξαν ότι η μεθυλίωση του υποκινητή του cyp19a (γονίδιο υπέυθυνο για τη μετατροπή των ανδρογόνων σε οιστρογόνα) είναι η αιτία της μειωμένης έκφρασης του cyp19α στις αρρενοποιητικές (υψηλές, >17 C) θερμοκρασίες (Navarro-Martín et al. 2011). Γίνεται λοιπόν κατανοητό, ότι η ίδια γονιδιακή έκφραση μπορεί να αποτελέσει πλαστικό χαρακτήρα, εξαρτώμενη από την επίδραση του γονοτύπου και μεταβαλλόμενη ανάλογα με τις περιβαλλοντικές αλλαγές (Cote et al. 2007, Aubin-Horth & Renn 2009). Όπως σημειώνουν οι Angers et al. (2010), «...μια σημαντική ιδιότητα των περιβαλλοντικά προκλειόμενων φαινοτύπων, είναι ότι οι σχετικές με τη γονιδιακή ρύθμιση διαφοροποιήσεις, δεν είναι απαραίτητα κληρονομήσιμες. Ένα γονίδιο μεταβιβάζεται πάντα, όχι όμως και η κατάσταση έκφρασής του». Εκτός από τις διακριτές διαφορές - δυαδικού τύπου σε οποιοδήποτε μελετούμενο φαινοτυπικό γνώρισμα, η επίδραση των περιβαλλοντικών παραγόντων μπορεί να δρα στο συνολικό αναπτυξιακό πρότυπο, επηρεάζοντας το χρονισμό της οντογένεσης. Η παραπάνω πρόταση μπορεί να επεκταθεί σε μοριακό επίπεδο, όπου η επίδραση των περιβαλλοντικών παραγόντων μπορεί να αλλάξει το οντογενετικό πρότυπο της γονιδιακής έκφρασης συνολικά, ή απλά να το μετατοπίσει χρονικά (ετεροχρονισμός), επιδρώντας κατά αυτό τον τρόπο στον παραγόμενο φαινότυπο. Το φαινόμενο του ετεροχρονισμού και η σύνδεσή του με την οντογενετική πλαστικότητα, περιγράφεται παρακάτω. 35

38 Phenotypic trait 2.2. Πρότυπα αντίδρασης (Reaction norms) Σε δεδομένο εύρος διαφορετικών περιβαλλοντικών συνθηκών, η πλαστικότητα ενός φαινοτύπου που παράγεται από ένα συγκεκριμένο γονότυπο, περιγράφεται με ένα πρότυπο αντίδρασης (reaction norm) (Pigliucci et al. 1996, Sarkar 1999, Gilbert 2001, Beldade et al. 2011). Πρόκειται για τη γραφική αναπαράσταση (γραμμές ή καμπύλες) της περιβαλλοντικής εξάρτησης φαινοτύπων που παράγονται από ένα συγκεκριμένο γονότυπο, έναντι διαφορικών περιβαλλοντικών συνθηκών (πολλαπλά περιβάλλοντα ή διαβάθμιση περιβαλλοντικών συνθηκών) (Gotthard & Nylin 1995, Schlichting & Pigliucci 1998, Gilbert 2001, Aubin- Horth & Renn 2009, Beldade et al. 2011) (Εικόνα 2.2-1). C 36 B A Environmental parameter Εικόνα 2.2-1: Ένα πρότυπο αντίδρασης (reaction norm), αποτελεί τη γραφική αναπαράσταση της μεταβολής ενός φαινοτυπικού χαρακτήρα σε σχέση με το περιβάλλον, και προσδιορίζει το επίπεδο πλαστικότητας του εν λόγω χαρακτήρα (και κατ επέκταση του αντίστοιχου γονοτύπου). Απεικονίζονται υποθετικά πρότυπα αντίδρασης τριών φαινοτυπικών χαρακτήρων. Κάθε φαινότυπος (και ο αντίστοιχος γονότυπος) παρουσιάζει διαφορετικό πρότυπο αντίδρασης, δηλαδή παρουσιάζει διαφορετική απόκριση έναντι των περιβαλλοντικών αλλαγών (x-άξονας). Ο γονότυπος Α δεν παρουσιάζει πλαστικότητα για το συγκεκριμένο φαινοτυπικό χαρακτήρα (παράλληλο πρότυπο αντίδρασης), ενώ οι γονότυποι B και C εμφανίζουν πλαστικότητα. Σε πολλαπλά περιβάλλοντα ή σε συνεχόμενες περιβαλλοντικές διαβαθμίσεις, τα πρότυπα αντίδρασης μπορεί να είναι καμπυλόγραμμα (B) ή ασυνεχή (C) στην περίπτωση που ένας γονότυπός δίνει διακριτούς φαινοτύπους υπό την επίδραση διαφορετικών περιβαλλοντικών συνθηκών (Roff 1996, Emlen & Nijhout 2000, David et al. 2004, Whitman & Argawal, 2009). Ένας οργανισμός ή πιο σωστά ένας φαινοτυπικός χαρακτήρας μπορεί να παρουσιάζει υψηλή ή χαμηλή πλαστικότητα εντός ενός συγκεκριμένου εύρους περιβαλλοντικών συνθηκών, ενώ υπάρχουν περιπτώσεις όπου κατά την ανάπτυξη παράγεται ο ίδιος φαινότυπος, οριοθετούμενος αποκλειστικά από το γονότυπο, ανεξάρτητα από την οποιαδήποτε περιβαλλοντική επίδραση (canalization / robustness) (Εικόνα 2.2-1). Στην τελευταία περίπτωση ο χαρακτήρας αποκαλείτε μη πλαστικός (στα αγγλικά χρησιμοποιείται ο όρος monophenic). Είναι σημαντικό, τέλος, να τονιστεί ότι ένας φαινοτυπικός χαρακτήρας μπορεί να παρουσιάζει πλαστικότητα καθόλη τη διάρκεια της ανάπτυξης, ή να είναι πλαστικός σε συγκεκριμένες χρονικές περιόδους (time windows), εκτός των οποίων ο ίδιος χαρακτήρας εμφανίζεται σταθερός και ανεξάρτητος των περιβαλλοντικών επιδράσεων (Beldade et al. 2011). Τα πρότυπα αντίδρασης δε δίνουν πληροφορίες για την εξέλιξη της πλαστικότητας, τις συνέπειες αυτής και τους υποκείμενους μοριακούς μηχανισμούς που τη συνοδεύουν (Whitman & Argawal, 2009). Τέλος, η αναπαράσταση της πλαστικότητας μέσω των προτύπων αντίδρασης (reaction norms) πραγματοποιείται υπολογίζοντας

39 (ποσοτικοποιώντας) το μέσο φαινότυπο μιας ομάδας ατόμων (ενός πληθυσμού) που φέρουν τον ίδιο γονότυπο, έναντι συγκεκριμένων περιβαλλοντικών συνθηκών και όχι σε μεμονωμένα άτομα. Η χρήση των προτύπων αντίδρασης είναι λοιπόν συνδεδεμένη με τον ορισμό της φαινοτυπικής πλαστικότητας των West-Eberhard (2003) και Pigliucci et al. (2006) Το φαινόμενο του ετεροχρονισμού και το πρόβλημα της ηλικίας των ψαριών Κατά την ανάπτυξη, οι οργανισμοί από μονοκύτταρα γονιμοποιημένα ωάρια μετατρέπονται σε ενήλικες με εξαιρετικά πολύπλοκη μορφολογική (και όχι μόνο) οργάνωση, ύστερα από τις δραματικές μορφογενετικές αλλαγές στις οποίες υπόκεινται. Οι όροι «οντογένεση» και «ανάπτυξη» συγχέονται συχνά μεταξύ τους. Η οντογένεση περιλαμβάνει όλα εκείνα τα στάδια τα οποία αφορούν στην ανάπτυξη ενός οργανισμού από την ώρα της σύλληψής του, μέχρι την ενηλικίωσή του. Μπορεί να γίνει επίσης λόγος για την οντογένεση όχι ενός οργανισμού, αλλά ενός χαρακτήρα ανατομικού ή ενός προτύπου συμπεριφοράς. Το σύνολο των αλλαγών σε επίπεδο μορφολογίας και φυσιολογίας ενός οργανισμού, συστήματος, οργάνου, συνιστά την οντογένεση, ενώ «ο όρος ανάπτυξη χρησιμοποιείται με την ευρύτερη έννοια χαρακτηρίζοντας το σύνολο των αλλαγών που έρχονται ως αποτέλεσμα της οντογένεσης, της αύξησης και της αποκτηθείσας εμπειρίας» (Fuiman 1994, Fuiman & Higgs 1997, αναφερόμενοι από Kamler 2002). Η οντογένεση, λοιπόν, αποτελεί μια συνεχόμενη διαδικασία και ο διαχωρισμός της σε στάδια (π.χ. εμβρυϊκό, νυμφικό. κοκ) γίνεται με βάση διακριτά μορφολογικά γνωρίσματα, τα οποία χρησιμεύουν ως ορόσημα. Παράλληλα, η διαδικασία της οντογένεσης δεν είναι εγκαθιδρυμένη, αλλά ευέλικτη, με το περιβάλλον να επιδρά στην εξέλιξή της και το παραγόμενο αποτέλεσμα να εξαρτάται από το (συγ)χρονισμό των επιμέρους αναπτυξιακών διαδικασιών που τη συνιστούν (Kovac 2002). Το περιβάλλον επιδρά στο χρονισμό της οντογένεσης επιμηκύνοντας ή επιβραδύνοντας τη διάρκεια της ανάπτυξης επί του συνόλου, ή των επιμέρους αναπτυξιακών σταδίων. Επιπλέον, είναι δυνατό να διακόψει την ανάπτυξη για ένα συγκεκριμένο χρονικό διάστημα (π.χ. διάπαυση εντόμων) (Klingenberg 1998, Smith 2002). Ο όρος ετεροχρονισμός (heterochrony) αναφέρεται σε αλλαγές στο ρυθμό ή/και στο χρονισμό των οντογενετικών γεγονότων, σε εξελικτικό χρόνο (Gould 1977, Raff & Kaufman 1983, McNamara 1986, McKinney & McNamara 1991). Ο παραπάνω ορισμός έχει, όχι άδικα, χαρακτηριστεί πολύ γενικός (Rice 1997). Ο όρος «ετεροχρονισμός» πρωτο-χρησιμοποιήθηκε από τον Haeckel προκειμένου να περιγράψει περιπτώσεις όπου η οντογενετική αλληλουχία γεγονότων δεν αντικατόπτριζε (ανακεφαλαίωνε) τη φυλογενετική αλληλουχία (Russell 1916, αναφερόμενος από Smith, 2002) 3. Ο De Beer (1958) (αναφερόμενος από Kleineberg περιόρισε την έννοια του ετεροχρονισμού στις περιπτώσεις εκείνες όπου νεαρά ή ενήλικα άτομα έφεραν διακριτά μορφολογικά γνωρίσματα τα οποία δε συναντούσε στους προγόνους τους, ή το αντίστροφο. Μετέπειτα ερευνητές (Gould 1977, Albrech et al. 1979, Albrech 1991, Rice 1997) εισήγαγαν τις έννοιες του σχήματος και του μεγέθους στον ετεροχρονισμό και συνέκριναν τις τιμές αυτών των μεγεθών σε ένα συγκεκριμένο αναπτυξιακό στάδιο, μεταξύ απογόνων προγόνων. 3 Σύμφωνα με τον Haeckel «η οντογένεση ανακεφαλαίωνε τη φυλογένεση, αποτελώντας μια σύντομη επανάληψη αυτής. Σήμερα γνωρίζουμε ότι αυτή η θέση, δεν ισχύει.

40 Phenotype Οι Albrech et al. (1979) συνέλαβαν την ιδέα της συνεχούς διαφοροποίησης του σχήματος και του μεγέθους κατά την οντογένεση, στο χώρο και στο χρόνο (Rice 1997) (Εικόνα 2.3-1). Αυτή η αντίληψη καθιέρωσε την αντιμετώπιση της ανάπτυξης ως μiα συνεχή και δυναμική μέσα στο χρόνο διαδικασία, αναφερόμενη ως οντογενετική πορεία (ontogenetic trajectory) (Εικόνα 2.3-1). Υπό το πρίσμα αυτό, η έννοια του ετεροχρονισμού χρησιμοποιείται προκειμένου να περιγράψει το διαφορικό έλεγχο του ρυθμού της (συνολικής) ανάπτυξης ενός είδους, σε σχέση με προγονικές του μορφές (McKinney & McNamara 1991, Klingenberg 1997), ή μεταξύ δύο συγγενικών taxa (Smith 2002). Έτσι πλέον δεν αναφερόμαστε σε αλλαγές στο χρονισμό της οντογένεσης σε ένα μόνο συγκεκριμένο χαρακτήρα, αλλά και σε ολόκληρο τον οργανισμό, επηρεάζοντας τελικά τη συνολική δομή και μορφολογία του (Gould, 1977, Zelditch & Fink 1996, Klingenberg, 1998). 38 Time Εικόνα 2.3-1: Γραφική απεικόνιση της ανάπτυξης ως μiα συνεχή και δυναμική μέσα στο χρόνο διαδικασία, αναφερόμενη ως οντογενετική πορεία (ontogenetic trajectory), όπως προτάθηκε από τους Albrech et al. (1979) (Rice 1997). Στην εικόνα, με διακεκομμένη γραμμή αναπαρίσταται μια οντογενετική πορεία της οποία ο ρυθμός έχει επιταχυνθεί ομοιόμορφα σε σχέση με την οντογενετική πορεία που αναπαρίσταται από την ενιαία γραμμή (Rice 1997). (Εικόνα τροποποιημένη, από Rice 1997). Εικόνα 2.3-2: Ορίζουμε ως ετεροχρονισμο την ομοιόμορφη αλλαγή στο ρυθμό (επιτάχυνση ή επιβράδυνση) ή / και τη χρονική μετατόπιση μιας οντογενετικής διαδικασίας. Ο περιορισμός της χρήσης του όρου του ετεροχρονισμού κατά αυτό τον τρόπο, τον καθιστά εύχρηστο στη βιολογική ερμηνεία των αντίστοιχων φαινομένων, χωρίς να χαρακτηρίζεται ως ετεροχρονισμός οποιαδήποτε αλλαγή στο ρυθμό ή στο χρονισμό μιας αναπτυξιακής διαδικασίας (Rice 1997). Στην εικόνα, με διακεκομμένη γραμμή αναπαρίσταται μια οντογενετική πορεία της οποία ο ρυθμός έχει επιβραδυνθεί σε σχέση με αυτή που απεικονίζεται με την ενιαία γραμμή (Rice 1997). (Εικόνα τροποποιημένη από Rice 1997).

41 Έτσι., ως ετεροχρονισμός ορίζεται μια «ομοιόμορφη αλλαγή στο ρυθμό ή στο χρονισμό μιας οντογενετικής διαδικασίας, χωρίς καμία αλλαγή στη φύση των βιολογικών διαδικασιών αυτής της διαδικασίας. Βιολογικά, αυτό σημαίνει ότι ως ετεροχρονισμό ορίζονται οι αλλαγές που επιταχύνουν, επιβραδύνουν ή μετατοπίζουν μια αναπτυξιακή διαδικασία, ως ενιαία μονάδα» (Rice 1997) (Εικόνα 3.3-2). Η παραπάνω διασαφήνιση κρίνεται απαραίτητη, αφού έτσι περιορίζεται ναι μεν η έννοια και (άρα η χρήση) του όρου του ετεροχρονισμού, αλλά αποκτά σαφή λειτουργική σημασία στην επεξήγηση των αντίστοιχων βιολογικών φαινομένων, χωρίς να θεωρείται ετεροχρονισμός μια οποιαδήποτε αλλαγή στο ρυθμό ή το χρονισμό της ονοτγένεσης γενικά (Rice 1997). Γενικά, οι ετεροχρονικές μετατοπίσεις κατά την οντογένεση περιλαμβάνουν τις περιπτώσεις όπου ο ρυθμός ανάπτυξης επιταχύνεται ή έχουμε προσθήκη οντογενετικών σταδίων (peramorphosis), και περιπτώσεις που ο ρυθμός ανάπτυξης επιβραδύνεται ή παρατηρείται μειωμένος αριθμός οντογενετικών σταδίων (παιδομόρφωση, paedomorphosis), κατα τη σύγκριση απογόνων-προγόνων (Albrech et al. 1979, Rice 1997, Gunter et al. 2014) (Εικόνα 2.3-3). Κατά τη παιδομόρφωση (περιλαμβάνει τις διαδικασίες τις προγένεσης και της νεοταινίας) διατηρούνται στα ενήλικα άτομα ενός απογόνου, χαρακτήρες που εμφανίζονται στα πρώιμα οντογενετικά στάδια του προγόνου (Gunter et al. 2014) (Εικόνα 2.3-3). Κατά τη peramorphosis (περιλαμβάνει τις διαδικασίες τις επιτάχυνσης και της υπερμόρφωσης) υπάρχουν προγονικοί χαρακτήρες οι οποίοι «υπερ-αναπτύσσονται» στα ενήλικα άτομα των απογόνων (Gunter et al. 2014) (Εικόνα 2.3-3). Όμως, η αλλαγή στο χρόνο εμφάνισης μιας αναπτυξιακής διαδικασίας, ή στην ταχύτητά της, δεν πραγματοποιείται μόνο μεταξύ του προγόνου - απογόνου. Οι Schmidt & Starck (2010), ακολουθώντας την άποψη προηγούμενων ερευνητών (McNamara 1997, Smith 2002), προεκτείνουν την έννοια του ετεροχρονισμού συγκρίνοντας την οντογένεση διαφορετικών ατόμων του ίδιου είδους κάτω από την επίδραση διαφορετικών περιβαλλοντικών συνθηκών και προσδιορίζουν διαφοροποιήσεις στο χρονισμό της οντογένεσης μεταξύ τους. Εξετάζουν το φαινόμενο του ετεροχρονισμού υπό το πρίσμα της περιβαλλοντικά εξαρτώμενης φαινοτυπικής πλαστικότητας, μελετώντας το ρυθμό και το χρονισμό των οντογενετικών γεγονότων υπό την επίδραση διαφορετικών περιβαλλοντικών συνθηκών, όπως επιχειτείται και στην παρούσα εργασία. Σε αυτή την περίπτωση, διαπιστώνονται διαφοροποιήσεις στο χρονισμό της οντογένεσης μεταξύ ατόμων που έχουν δεχτεί την επίδραση διαφορετικών περιβαλλοντικών παραγόντων κατά την ανάπτυξή τους. Όπως και με την κλασσική έννοια του ετεροχρονισμού, έτσι και τώρα, είναι δυνατό να προκληθεί μια ομοιόμορφη χρονική μετατόπιση της αναπτυξιακής διαδικασίας, ή μια αλλαγή στην ταχύτητά της, ως αποτέλεσμα επιγενετικών τροποποιήσεων (π.χ. διαφορική γονιδιακή έκφραση, μεθυλίωση, χρονική μετατόπιση του οντογενετικού γονιδιακού προτύπου κοκ) λόγω της επίδρασης διαφορετικών περιβαλλοντικών συνθηκών (π.χ. θερμοκρασία), κατά την οντογένεση. Το αποτέλεσμα μπορεί να είναι η παραγωγή φαινοτυπικών διαφοροποιήσεων στα άτομα που έχουν δεχτεί τη διαφορετική περιβαλλοντική επίδραση και το όλο φαινόμενο εντάσσεται στα πλαίσια της πλαστικότητας. Ο ρυθμός αύξησης και διαφοροποίησης, καθώς και το απόλυτο ή το σχετικό μέγεθος στο οποίο επιτελούνται τα αναπτυξιακά γεγονότα σε έναν οργανισμό μπορεί να έχουν σοβαρή επίπτωση στις μορφογενετικές διαδικασίες (Alberch 1979). Το 1933 ο J. Needham πρότεινε την την ιδέα της «διάσπασης» της αναπτυξιακής μηχανής, χρησιμοποιώντας διάφορες έννοιες που ανήκουν στον τομέα της μηχανικής, όπως τροχοί, ταχύτητες και άξονες (Raff 1996). Η ιδέα αυτή αναδύει το «διαχωρισμό της διαφοροποίησης από την ανάπτυξη ή την κυτταρική διαίρεση, τη βιογεωχημική διαφοροποίηση από τη μορφογένεση, αλλά και και τις διάφορες όψεις της μορφογένεσης μεταξύ τους» (Raff 1996) τονίζοντας ότι οι αναπτυξιακές διαδικασίες μπορούν αν αποσυνδεθούν μεταξύ τους, παράγοντας νέες οντογενετικές τροχιές μέσω των αναπτυξιακών διαδικασιών που ήδη υπάρχουν. Μοναδικός 39

42 περιορισμός η παραγωγή ενός ολοκληρωμένου αναπτυξιακού προγράμματος που θα παρέχει έναν λειτουργικό ενήλικο φαινότυπο, αλλά και έναν λειτουργικό φαινότυπο καθόλη τη διάρκεια της ανάπτυξης. Οποιαδήποτε μεταβολή στο χρονισμό της οντογένεσης μπορεί να οδηγήσει στην εκτροπή της καθιερωμένης οντογενετικής διαδικασίας και σε μορφολογική ποικιλία κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης, με αποτελέσματα διακριτά ακόμα και στα ενήλικα άτομα. Η δε ποικιλία των παραγόμενων δομών, αποτελεί την πρώτη ύλη πάνω στην οποία δρα η φυσική επιλογή και πραγματοποιείται η διαδικασία της εξέλιξης (Klingenberg 1998). 40 Εικόνα 2.3-3: Οι τέσσερις περιπτώσεις ετεροχρονικών μετατοπίσεων κατά τη σύγκριση των αναπτυξιακών διαδικασιών, μεταξύ οργανιsμών που έχουν διατηρήσει προγονικά γνωρίσματα (ancestral) και εκείνων που δεν τα φέρουν (derived). Η σύγκριση πραγματοποιείται εντός μιας συγκεκριμένης οντογενετικής περιόδου. (Εικόνα από Gunter et al. 2014). Μέσω εναλλακτικών αναπτυξιακών μονοπατιών, ο ετεροχρονισμός οδηγεί στην παραγωγή καινοτομιών σε μορφολογικό επίπεδο και στη δημιουργία νέων ειδών (Raff 1996), οπότε θεωρείται παράγοντας εξελικτικής αλλαγής (Klingenberg 1998, Smith 2002). Για τους παραπάνω λόγους, το φαινόμενο του ετεροχρονισμού θεωρείται σημαντικό στον τομέα της Εξελικτικής Βιολογίας. Το μέγεθος και το σχήμα, η αλλαγή στη μορφή, αποτέλεσαν μάλλον το αρχικό σημείο έρευνας των φαινομένων του ετεροχρονισμού και της πλαστικότητας, ως παράγοντες εξελικτικής αλλαγής. Οι επιγενετικές τροποποιήσεις (αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση, χωρίς να αλλάζει η αλληλουχία των βάσεων του DNA, όπως συμβαίνει κατά τη μεθυλίωση του DNA, ή την αλλαγή του προτύπου της γονιδιακής έκφρασης) φαίνεται ότι αποτελούν το μοριακό υπόβαθρο της πλαστικότητας και του ετεροχρονισμού. Μικρές αλλαγές στα οντογενετικά μονοπάτια, που συνοδεύονται από αντίστοιχες αλλαγές σε μοριακό επίπεδο, φαίνεται να είναι πολλές φορές η αιτία δημιουργίας ποικιλομορφίας. Ο ετεροχρονισμός συμπεριλαμβάνει την έννοια του χρόνου στις αναπτυξιακές διαδικασίες. Οπότε ο χρόνος και η μέτρηση αυτού αποκτά κεφαλαιώδη σημασία (Klingenberg 1998). Απλουστεύοντας την παραπάνω θέση, ανακύπτει το εξής ερώτημα: Για να χαρακτηριστεί, για παράδειγμα, μια χρονική μετατόπιση μιας μελετούμενης οντογενετικής διαδικασίας ως ετεροχρονική, θα πρέπει να «ποσοτικοποιηθεί» απακριβώς ο χρόνος. Πως

43 μετράται λοιπόν η βιολογική ηλικία ενός οργανισμού; Ως χρονολογική ηλικία (π.χ. ημέρες μετά τη γονιμοποίηση) ή ως στάδιο ανάπτυξης (μέγεθος σώματος); Και πως σχετίζονται αυτές οι δύο παράμετροι; Η χρονολογική ηλικία αποτελεί την πραγματική ηλικία ενός οργανισμού (π.χ. στα ψάρια ορίζεται ως ώρες ή ημέρες μετά τη γονιμοποίηση ή την εκκόλαψη), ενώ ο αναπτυξιακός χρόνος ισοδυναμεί με τη χρονική περίοδο που λαμβάνει χώρα ένα συγκεκριμένο οντογενετικό γεγονός (Adriaens & Verraes 2002). Ακριβώς λόγο των διακυμάνσεων που παρουσιάζονται σε γενετικό επίπεδο, αλλά και λόγω των εξωγενών επιδράσεων, η ανάπτυξη των οργανισμών γενικά, και των ιχθύων ειδικότερα, παρουσιάζει ποικιλομορφία, άρα ο καθορισμός της σχέσης της οντογένεσης, με την ηλικία και μέγεθος, καθίσταται απαραίτητος. Τα ψάρια αποτελούν ομάδα οργανισμών που εμφανίζουν υψηλού βαθμού πλαστικότητα έναντι στην επίδραση του περιβάλλοντος (γίνεται σύντομη σχετική αναφορά στα επόμενα κεφάλαια, και αναλυτικότερη σχετικά με την πλαστικότητα στο zebrafish). Στη βιβλιογραφία, σε πολλές περιπτώσεις, τα οντογενετικά στάδια των ιχθύων συγκρίνονται βάσει της χρονολογικής τους ηλικίας (ενδεικτικά, Jorgensen et al. 2008, Gunter et al. 2014). Όμως, αλλαγές στο ρυθμό αύξησης και διαφοροποίησης που προκύπτουν από την επίδραση διαφορετικών περιβαλλοντικών συνθηκών, έχουν σαν αποτέλεσμα άτομα της ίδιας χρονολογικής ηλικίας να βρίσκονται σε διαφορετικό στάδιο ανάπτυξης. Έχει διαπιστωθεί ότι τα ψάρια που έχουν την ίδια χρονολογική ηλικία, παρουσιάζουν μεγάλη ποικιλία στο μήκος του σώματός τους (Kimmel et al. 1995, Parichy et al. 2009, Schmidt & Starck 2010) γεγονός το οποίο υποδεικνύει ότι τα άτομα αυτά βρίσκονται σε διαφορετικό στάδιο ανάπτυξης. Αυτή η διαφοροποίηση στο μήκος σώματος, μειώνεται καθώς η ανάπτυξη προχωρά. Το μήκος σώματος έχει προταθεί ως καταλληλότερο προκειμένου να προσδιοριστεί το στάδιο ανάπτυξης των ψαριών και αρκετές πλέον μελέτες είτε συνηγορούν υπέρ αυτής της θέσης, είτε χρησιμοποιούν το μέγεθος (μήκος σώματος) ως αντιπροσωπευτικό του σταδίου ανάπτυξης (Adriaens & Verraes 2002, Nikolioudakis et al. 2010, Nikolioudakis et al. 2014, Gunter et al. 2014). 41

44 2.4. Πλαστικότητα Φαινοτύπων στα ψάρια Τα ψάρια, διαβιώνοντας σε άμεση εξάρτηση με ένα συνεχώς μεταβαλλόμενο περιβάλλον, αποτελούν ομάδα οργανισμών που εμφανίζει υψηλού βαθμού πλαστικότητα. Έχουν τη δυνατότητα να τροποποιούν το φαινότυπό τους, προσαρμοζόμενα στις εκάστοτε περιβαλλοντικές συνθήκες, ενώ παράλληλα διατηρούν την ομοιόστασή τους χωρίς να διαφεύγουν από το γενετικά καθορισμένο αρχικό πρότυπο (Debat & David 2001) βάσει του οποίου καθίσταται δυνατή η σταθερότητα των ζωτικής σημασίας σταδίων ανάπτυξης. Το φαινόμενο της φαινοτυπικής πλαστικότητας έχει μελετηθεί εκτενώς στην ομάδα των ιχθύων και οι παράγοντες που ευθύνονται για την εμφάνισή του, είναι πολλοί. Ο ρυθμός αύξησης και διαφοροποίησης είναι δύο από τους πιο πλαστικούς χαρακτήρες που σχετίζονται άμεσα και με την προσαρμοστικότητα των ατόμων (Roff 1992, Stearns 1992). Η θερμοκρασία ανάπτυξης (Fuiman and Batty 1997, Pavlidis et al. 2000, Koumoundouros et al. 2001, Koumoundouros et al. 2002, Sfakianakis et al. 2004, Georgakopoulou et al. 2007, Georga & Koumoundouros 2010, Schulte et al. 2011), η συγκέντρωση του διαλυμένου οξυγόνου (Marks et al. 2005, Shang et al. 2006, Widmer et al. 2006, Miller et al. 2008), η φωτοπερίοδος και η αλατότητα (Lindsey 1969, Lindsey 1998), η παρουσία θηρευτών (Eklov and Svanback 2006), καθώς και το είδος, η πυκνότητα της τροφής ή η μέθοδος εκτροφής των ψαριών (Meyer 1987, Koumoundouros et al. 1999), έχει βρεθεί ότι επηρεάζουν το σχήμα του σώματος των ψαριών, την κολυμβητική τους δραστηριότητα, τους μεριστικούς χαρακτήρες, το ρυθμό ανάπτυξης και διαφοροποίησης, τη μυογένεση και την αναλογία φύλου. Η θερμοκρασία αναπτυξης επιδρά άμεσα ή έμμεσα (πιθανώς μέσω της συγκέντρωσης του διαλυμένου οξυγόνου ή μέσω του ιξώδους) σε διάφορους λειτουργικούς χαρακτήρες, ορισμένοι εκ των οποίων είναι σημαντικοί για την επιβίωση των ατόμων. Εκτός από βραχυπρόθεσμες επιπτώσεις, όπως μπορεί να είναι η αύξηση της θνησιμότητας, η θερμοκρασία ανάπτυξης φαίνεται ότι αποτελεί κύριο παράγοντα πρόκλησης φαινοτυπικής πλαστικότητας στην ομάδα των ψαριών επιδρώντας σε όλα τα στάδια ανάπτυξής τους, και κυρίως στα πρώιμα: έμβρυα, νύμφες και ιχθύδια. Υπό την επίδραση της θερμοκρασίας μεταβάλλεται ο ρυθμός αύξησης και διαφοροποίησης και τροποποιείται το σωματικό μέγεθος όπου επιτελούνται τα διάφορα αναπτυξιακά γεγονότα, ενώ μακροπρόθεσμα καθορίζει τον τελικό φαινότυπο των ατόμων (Stickland et al. 1988, Koumoundouros et al. 2001, Kamler 2002, Sfakianakis et al. 2004, Jordaan et al. 2006). Μεταξύ των μακροπρόθεσμων επιπτώσεων της θερμοκρασίας ανάπτυξης, είναι η επίδραση στο μεταβολισμό και την ανάπτυξη των μυών (Johnston 1993, Guderley & Johnston 1996, Johnston et al. 2001, Johnston & Temple 2002, Guderley 2004, Johnston & Hall 2004, Martell & Kieffer 2007) στη δομή των μυών (Guderley and Johston 1996, Johston 2006, Ochi & Westerfield 2007, Martel & Kieffer 2007, Macqueen et al. 2008, Koumoundouros et al. 2009), στους μεριστικούς χαρακτήρες (Lindsey 1998, Georgakopoulou et al. 2007), στο σχήμα του σώματος (Loy et al. 1996a, Loy et al. 1996b, Georgakopoulou et al. 2007, Georga & Koumoundouros 2010), στην κολυμβητική ικανότητα (Fuiman and Batty 1997, Koumoundouros et al. 2009) και στην αναλογία φύλου (Pavlidis et al. 2000, Koumoundouros et al. 2002, Piferrer et al. 2005, Navarro-Martín et al. 2011, Sfakianakis et al. 2011). Το πεδίο των επιγενετικών τροποποιήσεων (αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση, χωρίς να αλλάζει η αλληλουχία των βάσεων του DNA) προσφέρει το πιθανό μοριακό υπόβαθρο των φαινομένων της πλαστικότητας και του ετεροχρονισμού (Navarro-Martín et al. 2011, Gunter et al. 2014). Η πυκνότητα των πληθυσμών παίζει σημαντικό ρόλο στη διατήρηση των πληθυσμών και στη ρύθμιση των σχέσεων και επιδράσεων που αναπτύσσονται τόσο μεταξύ των ατόμων που συνιστούν έναν πληθυσμό, όσο και με το ευρύτερο περιβάλλον τους (Murdoch 1994). 42

45 Στα ψάρια, η εξαρτώμενη από την πυκνότητα θνησιμότητα των νεαρών ιχθυδίων, στους φυσικούς πληθυσμούς, θεωρείται ως ένας από τους σημαντικότερους παράγοντες διατήρησης του μεγέθους των ιχθυοπληθυσμών (Myers & Cadigan 1993, Rose et al. 2001), είτε μέσω της θήρευσης (Myers & Cadigan, 1993), είτε επιδρώντας στην ανάπτυξη των νεαρών ή / και των ενήλικων ατόμων (Rose et al. 2001). Εκτός όμως από το ρόλο της πυκνότητας στη δομή των πληθυσμών, είναι αποδεδειγμένος και ο ρόλος της ως περιβαλλοντικός παράγοντας που προάγει την παραγωγή εναλλακτικών φαινοτύπων, ως αποτέλεσμα διαφορικής γονιδιακής έκφρασης (Gilbert 2001). Η πληθυσμιακή πυκνότητα μπορεί να επηρεάζει τη συγκέντρωση του διαλυμένου οξυγόνου, την πυκνότητα της τροφής ή / και να είναι υπεύθυνη για την πρόκληση στρες και την αλλαγή των επιπέδων κορτιζόλης στο αίμα, παράγοντες οι οποίοι έχει αποδειχθεί ότι είναι υπεύθυνοι για την πρόκληση φαινοτυπικής πλαστικότητας στα ψάρια (Lindsey 1988, Koumoundouros et al. 1999, Fuiman et al. 1998, Spicer & Burggren 2003). Όπως και στην περίπτωση της - καλά μελετημένης - επίδρασης της θερμοκρασίας ανάπτυξης στην πρόκληση πλαστικότητας στα ψάρια, έτσι και κατά μελέτη της πληθυσμιακής πυκνότητας είναι σημαντική η οντογενετική περίοδος επίδρασης αυτής. Σύμφωνα με τους Pigliucci et al. (1996), η προκλειόμενη φαινοτυπική πλαστικότητα εξαρτάται τόσο από τον υπό εξέταση περιβαλλοντικό παράγοντα, όσο και από την οντογενετική περίοδο εντός των χρονικών ορίων της οποίας επιδρά ο εκάστοτε παράγοντας. Τα ψάρια έχουν πολύπλοκη οντογένεση, στα διάφορα στάδια της οποίας διαφέρουν σημαντικά σημαντικά όχι μόνο ως προς το μέγεθος, αλλά και ως προς τη μορφολογία τους και τις οικολογικές τους απαιτήσεις. Ανάλογα λοιπόν με το οντογενετικό στάδιο στο οποίο αναφερόμαστε, και ο βαθμός εξάρτησης τους από τον παράγοντα της πυκνότητας, αλλά και ο χαρακτήρας ο οποίος επηρεάζεται και μπορεί να είναι η αύξηση ή η ανάπτυξη, η αναπαραγωγική επιτυχία και φυσικά η επιβίωσή (Hazlerigg et al. 2012). Ανάλογα δε με το υπό μελέτη φαινοτυπικό γνώρισμα, η ευαίσθητη οντογενετική περίοδος μπορεί να διαφοροποιείται (Lindsey 1988, Pigliucci et al Koumoundouros et al. 2002). Γενικά, τα πρώιμα οντογενετικά στάδια ειναι περισσότερο ευαίσθητα στις διάφορες περιβαλλοντικές επιδράσεις και οι διάφορων παραγόντων, όπως είναι η θερμοκρασία, η περιεκτικότητα σε οξυγόνο ή η φωτοπερίοδος, μπορεί να επηρεάσουν το χρονισμό της οντογένεσης και την ανάπτυξη εν γένει (Fuiman 2002). Μαζί όμως με τη θερμοκρασία, η πληθυσμιακή πυκνότητα και η διαθεσιμότητα της τροφής, η θήρευση και η φωτοπερίοδος αποτελούν καθοριστικούς παράγοντες για την ανάπτυξη των τελεόστεων ιχθύων και για τον καθορισμό της δομής των πληθυσμών τους (Thorpe et al. 1989). Η θερμοκρασία και η φωτοπερίοδος είναι δύο παράγοντες που συνεπιδρούν και στη φύση οι οργανισμοί «υποβάλλονται» σε μεταβολές αυτών, τόσο εποχικές, όσο και ημερήσιες. Η φωτοπερίοδος και η ένταση του φωτός αποτελούν ρυθμιστή των βιολογικών ρυθμών των οργανισμών γενικά, και φυσικά των ιχθύων, ενώ προείνεται ότι η θερμοκρασία ανάπτυξης μπορεί να ρυθμίσει τους βιολογικούς ρυθμούς, μα κύριος ρυθμιστή αποτελεί η φωτοπερίοδος (Lopez-Olmeda et al. 2009). Υπάρχει ένας ενδογενής ρυθμός, ένα βιολογικό ρολόι, το οποίο καθορίζει τις βασικές φυσιολογικές διεργασίες των ψαριών, μα μπορεί να επηρεαστεί από εξωγενείς περιβαλλοντικούς παράγοντες. Η φωτοπερίοδος, έχει βρεθεί ότι επιδρά στην αύξηση των ιχθύων, άμεσα, αυξάνοντας την αντιληπτική και άρα τη θηρευτική τους ικανότητα και, έμμεσα, μέσω της ρύθμισης της έκφρασης γονιδίων που σχετίζονται με το ενδογενές βιολογικό ρολόι, όπως είναι per4, cry3, cry2a, clock1 (clock genes) (Thorpe 1986). Επίσης η αυξημένη φωτοπερίοδος αυξάνει την κολυμβητική ικανότητα, όπως άλλωστε και η αυξημένη θερμοκρασία (εντός φυσιολογικών ορίων) (Lopez-Olmeda et al. 2009). 43

46 2.5. Πλαστικότητα στο φυλοκαθορισμό των ψαριών Η αναλογία φύλου είναι το προϊόν της γενετικής ή / και περιβαλλοντικής διαδικασίας που καθορίζει το φύλο ενός οργανισμού (Penman & Piferrer 2008, Piferrer et al. 2012), καθώς και της διαφοροποίησης του φύλου, δηλαδή των διάφορων γενετικών και φυσιολογικών διεργασιών που μετατρέπουν μια αδιαφοροποίητη γονάδων σε όρχεις ή ωοθήκες (Piferrer & Guiguen 2008). Η κατανόηση των μηχανισμών του φυλοκαθορισμού και της διαφοροποίησης του φύλου στην ομάδα των ψαριών αποτελούν ένα σημαντικό πεδίο έρευνας (Chiang et al. 2001). Συγκεκριμένα γνωρίσματα που είναι σε μικρότερο ή μεγαλύτερο βαθμό σταθερά στα υπόλοιπα σπονδυλωτά, στα ψάρια δεν είναι: Καίριο παράδειγμα αποτελεί ο φυλοκαθορισμός, ο οποίος παρουσιάζει μια τεράστια ποικιλία σε ότι αφορά τα πρότυπα που παρατηρούνται μεταξύ γενών, οικογενειών, αλλά και μεμονωμένων ειδών, όντας ευέλικτος στις επιδράσεις διάφορων παραγόντων. Στους τελεόστεους, η τελική διαφοροποίηση του φύλου, πλην του γενετικού υπόβαθρου, είναι συνδυαστικό αποτέλεσμα ορμονικών, κοινωνικών και περιβαλλοντικών παραγόντων ενώ η χορήγηση εξωγενών στεροειδών επιδρά κατά βάση στη διαφοροποίηση του φύλου και όχι στον καθορισμό αυτού (Devlin & Nagahama 2001, Guero- Estevez & Moreno-Medoza 2009). Η χαρακτηριστική ποικιλία των ψαριών στο μεγάλης βιολογικής σημασίας φαινόμενο του φυλοκαθορισμού, είναι αποτέλεσμα κατοχής ισχυρών εξελικτικών εργαλείων, που δίνουν τη δυνατότητα στα ψάρια να τροποποιούν τη δομή και τη ρύθμιση των γονιδίων τους, ή ακόμα και να αναδιοργανώσουν μεγαλύτερα τμήματα του γονιδιώματός τους, γεγονός που τους δίνει τη δυνατότητα να προσαρμόζονται στο διαρκώς μεταβαλλόμενο υδάτινο στοιχείο.οι τελεόστεοι εμφανίζουν υψηλού βαθμού πλαστικότητα, σε ό,τι αφορά στα σωματικά και γεννητικά τους κύτταρα, ιδιότητα που διατηρείται σε όλη τους τη ζωή (Trukhina et al. 2013). Ο καθορισμός του φύλου (sex determination) αφορά στα αρχικά αναπτυξιακά γεγονότα που καθορίζουν το αν οι γονάδες θα αναπτυχθούν ως όρχεις ή ωοθήκες και είναι αποτέλεσμα συνδυασμού γενετικών και περιβαλλοντικών παραγόντων (Guero-Estevez & Moreno-Medoza 2009, Piferrer et al. 2012) (Εικόνα 2.5-1). O όρος διαφοροποίηση του φύλου (sex differentiation) αφορά στις γενετικές και φυσιολογικές διαδικασίες που κατευθύνουν την αδιαφοροποίητη γονάδα στο να μετατραπεί σε όρχεις ή ωοθήκες (Guero- Estevez & Moreno-Medoza 2009, Piferrer et al. 2012) (Εικόνα 2.5-1). Τα ψάρια διαθέτουν μια ποικιλία φυλοκαθοριστικών μηχανισμών, οι οποίοι κυμαίνονται μεταξύ γενετικού (GSD) και περιβαλλοντικού φυλοκαθορισμού (ESD), με το θερμο-εξαρτώμενο φυλοκαθορισμό (TSD) να αποτέλεί μάλλον τον πιο κοινό τύπο ESD 4. Ο ορισμός των δύο αυτών τύπων φυλοκαθορισμού προδιαθέτει ίσως ένα πλήρη διαχωρισμό τους (Sarre et al. 2004), παραβλέποντας τις πιθανές μεταξύ τους σχέσεις. Η αλήθεια είναι ότι ο GSD και ο ESD μπορεί, κατά περίπτωση, να αποτελούν δύο ακραίες συνθήκες μιας σύνθετης ενιαίας 44 4 Ο όρος «γενετικός φυλοκαθορισμός» χρησιμοποιείται όταν το φύλο του αναπτυσσόμενου εμβρύου καθορίζεται αποκλειστικά από το γονότυπό του, όπως αυτός διαμορφώνεται την ώρα της γονιμοποίησης, με τα αρσενικά άτομα να είναι ετερογαμετικά, οπότε τα θηλυκά είναι ομογαμετικά, ή το αντίθετο. Τα αρσενικά και τα θηλυκά άτομα φέρουν διαφορετικά αλληλόμορφα και διαφορετικά γονίδια τα οποία καθορίζουν τη μορφολογία (και κατ επέκταση τη λειτουργία) των χαρακτήρων που σχετίζονται με το φύλο, ενώ οι διαφορές αυτές μπορεί να συνοδεύονται και από χρωμοσωματικές διαφορές, οπότε μπορεί να έχουμε την ύπαρξη φυλετικών χρωμοσωμάτων. Με τον όρο περιβαλλοντικός φυλοκαθορισμός (environmental sex determination, ESD) περιγράφεται ο μηχανισμός φυλοκαθορισμού κατά τον οποίο το φύλο ενός ατόμου καθορίζεται από τις συνθήκες του περιβάλλοντος κατά την πρώιμη ανάπτυξη. Όταν ο καθοριστικός περιβαλλοντικός παράγοντας είναι η θερμοκρασία, τότε μιλάμε για «θερμο-εξαρτώμενο φυλοκαθορισμό» (temperature-dependent sex determination, TSD).

47 διαδικασίας που συμβάλλουν στο εκάστοτε ενιαίο πρότυπο φυλοκαθορισμού, όπως αυτό διαμορφώνεται για το κάθε είδος. (Valenzuela et al. 2003). 45 Εικόνα 2.5-1: (a) Αναπαρίσταται η διαδικασία του φυλοκαθορισμού, της διαφοροποίησης του φύλου και της αλλαγής του φύλου, σε σχέση με την ανάπτυξη, στα διαδοχικά ερμαφρόδιτα. Η αλλαγή του φύλου συμβαίνει μόνο στα διαδοχικά ερμαφρόδιτα. (b) Οι τρεις βασικοί τρόποι φυλοκαθορισμού στα ψάρια: Γονιδιακός (GSD), περιβαλλοντικός (ESD) και πολυπαραγοντικός (polyfactorial). (Εικόνα τροποποιημένη από Piferrer et al. 2012). Σε άλλες περιπτώσεις, το φύλο μπορεί να καθορίζεται από άλλους περιβαλλοντικούς παράγοντες, όπως είναι το ph, ή ακόμα και από κοινωνικούς παράγοντες (π.χ. το μέγεθος ενός οργανισμού σε σχέση με το μέγεθος των ατόμων του υπόλοιπου πληθυσμού). Ο ESD και ο TSD εντάσσονται στον πολυγονιδιακό τύπο φυλοκαθορισμού (PSD), κατά τον οποίο το φύλο καθορίζεται από ένα αριθμό γονιδίων στο σύνολο των χρωμοσωμάτων, κάθε ένα από τα οποία έχει μικρή επίδραση στον τελικό καθορισμού του φύλου (Kirpichnikov 1981, Bulmer 1982, Moore & Roberts 2012). O PSD θεωρείται εξελικτικά κατώτερος και ασταθής ενώ έχει χαρακτηριστεί και ως ενδιάμεσος τύπος φυλοκαθορισμού (Rice 1986). Από το σύνολο των ψαριών που έχουν μέχρι σήμερα μελετηθεί, μόνο το 10% φέρει φυλετικά χρωμοσώματα (Trukhina et al. 2013, Guero-Estevez & Moreno-Medoza 2009). Στα ψάρια δεν υπάρχει ένα απλό μοντέλο γονοτυπικού φυλοκαθορισμού, αλλά σε αντιστοιχία με τις ομάδες των ερπετών και των αμφιβίων, άλλοτε είναι ετερογαμετικά τα αρσενικά άτομα, και άλλοτε τα θηλυκά., υπάρχουν και εδώ είδη με αρσενική ετερογαμία (ΧΧ/ΧΥ) και είδη με θηλυκή ετερογαμία (ZW/ZZ). Υποστηρίζεται δε, ότι τα XY συστήματα φυλοκαθορισμού υιοθετούνται εξελικτικά από είδη στα οποία η προσαρμοστικότητά τους σχετίζεται θετικά με το μέγεθος των αρσενικών, ενώ τα ZW συστήματα φυλοκαθορισμού εμφανίζονται όταν η προσαρμοστικότητα του είδους σχετίζεται θετικά με το μέγεθος των θηλυκών ατόμων. Επιπλέον, έχουν βρεθεί και πιο πολύπλοκες μορφές γoνοτυπικού φυλοκαθορισμού στις οποίες συμμετέχουν πολλαπλά φυλετικά χρωμοσώματα, αλλά και παράγοντες που εδράζονται σε αυτοσωμικά χρωμοσώματα και που τροποποιούν το φύλο (π.χ. πολυγονιδιακός φυλοκαθορισμός στο Xiphophorus helleri και στο Menidia menidia, Devlin & Nagahama 2002). Υπάρχουν είδη γονοχωριστικά και είδη ερμαφρόδιτα. Διακρίνουμε δύο βασικές στρατηγικές στα γονοχωριστικά είδη ψαριών: Τα διαφοροποιημένα ή πρωτογενή γονοχωριστικά και τα δευτερογενή γονοχωριστικά. Στην πρώτη περίπτωση, η πρώιμη γονάδα εξελίσσεται απευθείας από την αδιαφοροποίητη κατάσταση σε όρχεις ή ωοθήκες (π.χ. στα

48 είδη Abramis brama, Dicentrarchus labrax και Cyprinus Carpio, είδη της οικογένειας Labridae) (Devlin & Nagahama 2002, Trukhina et al. 2013). Τα δευτερογενή γονοχωριστικά (π.χ. το Cheimerius nufar και το Epinephelus striatus) δεν αναπτύσσονται κατευθείαν ως αρσενικά ή θηλυκά, αλλά αρχικά φέρουν ερμαφρόδιτες και αμφιδυναμικές (bipotential) γονάδες, σε αντίθεση με τα θηλαστικά στα οποία οι γονάδες παραμένουν αμφιδυναμικές μόνο κατά την εμβρυική φάση ανάπτυξης (Devlin & Nagahama 2002, Wilhelm et al. 2007, Kopman & Wilhelm 2011). Πολλά είδη μπορεί να αλλάξουν το φύλο τους ή να παραμείνουν ως διαφυλετικά μέχρι την τελική τους ωρίμανση. Το στάδιο ανάπτυξης των γονοχοριστικών τελεόστεων ιχθύων στο οποίο οι γονάδες πριν από την τελική τους διαφοροποίηση είναι ερμαφρόδιτες, ονομάζεται ερμαφροδιτισμός ιχθυδίου (Αnguilla anguilla, A. Japonica, Danio rerio) (Strussman & Nakamura 2002, Wang et al. 2007). Τα ερμαφρόδιτα ιχθύδια φέρουν μια αμφιδύναμη διαφυλετική γονάδα, η οποία στη συνέχεια μπορεί να αναπτυχθεί είτε ως αρσενική, είτε ως θηλυκή (Devlin & Nagahama 2002, Strussman & Nakamura 2002), δίνοντας λειτουργικούς όρχεις ή ωοθήκες, αντίστοιχα. Αυτή η πλαστικότητα των γονάδων κατά τη διαρκεια της ανάπτυξης, συνδέεται με μια αντίστοιχη πλαστικότητα σε επίπεδο εγκεφάλου (Le Page et al. 2010). Σε ό,τι αφορά στα λειτουργικά ερμαφρόδιτα είδη, αυτά μπορεί αρχικά να ωριμάσουν είτε ως αρσενικά (πρώτανδρα), είτε ως θηλυκά (πρωτόγυνα), ή να διαθέτουν λειτουργικές ωοθήκες και όρχεις ταυτόχρονα καθόλη τη διάρκεια της ζωής τους. Εάν ισχύει η δεύτερη περίπτωση, τότε αναφερόμαστε στα σύγχρονα ερμαφρόδιτα τα οποία παράγουν ταυτόχρονα αρσενικούς και θηλυκούς γαμέτες. Κάποια από αυτά τα είδη μπορεί να εναλλάσσουν την απόθεση σπερματοζωαρίων με ωάρια, ή το αντίστροφο (Serranus sp.), ενώ άλλα είναι ικανά για αυτογονιμοποίηση (Rivulus marmoratus). Τέλος, έχουν βρεθεί περιπτώσεις ερμαφροδιτισμού, όπου υπό συνθήκες περιβαλλοντικής πίεσης θηλυκά άτομα έχουν μετατραπεί σε αρσενικά (Xiphophorus helleri). Πρόκειται για αναστροφή του φύλου σε είδη που ο τρόπος διαφοροποίησης του φύλου τους είναι ιδιαίτερα πλαστικός (Devlin & Nagahama 2002, Strussman & Nakamura 2002). Στα γενετικά συστήματα καθορισμού του φύλου, η γονιδιακή επίδραση μπορεί να κυριαρχήσει έναντι της περιβαλλοντικής, στη διαδικασία καθορισμού του φύλου. Αν και τα ψάρια έχουν εξελιχθεί έτσι ώστε τα έμβρυά τους να μπορούν να αντεπεξέρχονται ακόμα και στις έντονες θερμοκρασιακές μεταβολές, είναι αποδεδειγμένη η επίδραση της θερμοκρασίας στον καθορισμό του φύλου του ψαριών. Πρόσφατες μελέτες αναδεικνύουν τον ισχυρό ρόλο της επίδρασης του περιβάλλοντος και των προκλειόμενων επιγενετικών τροποποιήσεων στον καθορισμό του φύλου γονοχωριστικών ειδών, όπως στο λαβράκι, όπου η επίδραση της θερμοκρασίας διαφοροποιεί την αναλογία φύλου των πληθυσμών, ως αποτέλεσμα διαφορικής μεθυλίωσης του υποκινητή του γονιδίου της αρωματάσης που ρυθμίζει τη μετατροπή των οιστρογόνων σε ανδρογόνα (Navarro-Martín et al. 2011). Η αναλογία του φύλου στα ψάρια υπό την επίδραση της θερμοκρασίας ποικίλει, αλλά όχι τόσο όσο στα ερπετά, όπου έχουν παρατηρηθεί ακόμα και περιπτώσεις που η επώαση των αυγών σε ορισμένες θερμοκρασίες οδηγεί στην παραγωγή αποκλειστικά θηλυκών ή αρσενικών ατόμων (Kraak & Pen, 2002). Οι Ospina-Alvarez & Piferrer (2008) ασχολούνται στην εργασία τους με 59 είδη ιχθύων στα οποία υπάρχουν είτε σαφείς αποδείξεις, είτε ενδείξεις θερμοεξαρτώμενου φυλοκαθορισμού (TSD) και καταλήγουν στο ότι o TSD αποτελεί εξαίρεση παρά γενικό κανόνα στο φυλοκαθορισμό των τελεόστεων. Με εξαίρεση τα είδη του γένους Apistogamma, στο ~75% των ειδών που θεωρούνταν ότι έχουν θερμο-εξαρτώμενο σύστημα φυλοκαθορισμού φαίνεται ότι η μεταβαλλόμενη αναλογία φύλου ήταν αποτέλεσμα δράσης ακραίων θερμοκρασιακών συνθηκών πάνω στο γενετικό σύστημα φυλοκαθορισμού (π.χ. στο είδος M. menidia, η αναλογία φύλου αυξάνει υπέρ των αρσενικών σε υψηλές θερμοκρασίες, οι οποίες όμως είναι υψηλότερες από τις φυσιολογικές). Επίσης, σε αντίθεση με 46

49 προηγούμενες εργασίες, υποστηρίζουν ότι στα είδη (τόσο γλυκού νερού, όσο και θαλάσσια) με διαπιστωμένο TSD η αύξηση της θερμοκρασίας, εντός των φυσιολογικών ορίων για κάθε είδος, οδηγεί σε αύξηση της αναλογίας φύλου υπέρ των αρσενικών (Ospina-Alvarez & Piferrer 2008). Σε περιπτώσεις που δεν παρουσιάζονται ισχυρά γενετικά φυλοκαθοριστικά συστήματα, η πυκνότητα ενός ιχθυοπληθυσμού και οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ των ατόμων αυτού, καθώς και η διαθέσιμη τροφή, έχει βρεθεί ότι επηρεάζουν την αναλογία φύλου ορισμένων ειδών (π.χ. Trimma okinawae και στο Xyrichtys pentadactylus) (Devlin & Nagahama 2002, Janzen & Krenz 2004). Οι μηχανισμοί που χρησιμοποιούνται από τα ψάρια προκειμένου να μεταφράσουν τις διάφορες κοινωνικές πληθυσμιακές μεταβολές είναι περίπλοκοι. Είναι όμως γνωστό ότι βασίζονται στη θέση του κάθε ατόμου μέσα στην ομάδα και την ικανότητά του να ζευγαρώνει με όλα τα υπόλοιπα άτομα του αντίθετου φύλου. Τα κριτήρια για την αναστροφή του φύλου είναι ποικίλα. Πρότυπα συμπεριφοράς και αλληλεπιδράσεις μεταξύ των ατόμων των δύο φύλων, το σχετικό μέγεθος και πιθανά χημικά ερεθίσματα, όπως αυτά των φερομονών συγκαταλέγονται μεταξύ των παραγόντων που ελέγχουν αυτή την αναστροφή. (Devlin & Nagahama 2002, Janzen & Krenz 2004). Μεταξύ των σπονδυλωτών έχουν εντοπιστεί τέσσερα γονίδια (το sry για τα θηλαστικά, το dmrt1 για τα πτηνα, το dmy για το ψάρι medaka και το dmw για το Xenopus laevis) που παίζουν κυρίαρχο ρόλο στον καθορισμό του φύλου και βρίσκονται στην κορυφή των αντίστοιχων μοριακών μονοπατιών (Kikuchi & Hamaguchi 2013). Σε τέσσερα είδη ψαριών (Patagonian pejerrey, Oryzias luzonensis, fugu, rainbow trout) έχουν εντοπιστεί τέσσερα επιπλέον γονίδια (amhy, gsdf, amhr2, sdy) που φαίνεται ότι έχουν φυλοκαθοριστικό ρόλο (Kikuchi & Hamaguchi 2013). Από την άλλη πλευρά, πολλά από τα γονίδια που σχετίζονται με τον καθορισμό και τη διαφοροποίηση του φύλου στους ιχθύες και βρίσκονται downstream των σχετικών μοριακών μονοπατιών, όπως είναι το ένζυμο αρωματάση, φαίνεται ότι είναι συντηρημένα μεταξύ των σπονδυλωτών (Devlin & Nagahama 2002). Στα θηλαστικά, στα οποία το φύλο καθορίζεται χρωμοσωμικά, η δραστηριότητα της αρωματάσης μειώνεται σταδιακά μετά τη γέννηση, κάτι το οποίο δεν ισχύει για τους τελεόστεους (Diotel et al. 2010). Η αρωματάση είναι είναι το ένζυμο που καταλύει τη μετατροπή των ανδρογόνων σε οιστρογόνα. Στο zebrafish, όπως και σε πολλά άλλα είδη ψαριών, υπάρχουν δύο γονίδια που υπεύθυνα για την κωδικοποίηση αρωματάσης: το cyp19a1a και το cyp19a1b, τα οποία προήλθαν από το διπλασιασμό ενός προγονικού (Chiang et al. 2001). Το cyp19a1a εκφράζεται αποκλειστικά στις γονάδες, ενώ η έκφραση του cyp19a1b είναι ισχυρή στον εγκέφαλο (Simpson et al. 1994, Chiang et al. 2001). Οι ενήλικες τελεόστεοι εμφανίζουν αυξημένη δραστηριότητα αρωματάσης κατά την ανάπτυξη και την ενηλικίωση εξαιτίας της ισχυρής έκφρασης ενός εκ των δύο αυτών γονιδίων, γενονός το οποίο συνδέεται πιθανότατα με την πλαστικότητα της διαδικασίας του φυλοκαθορισμού (Diotel et al. 2010). Η αναφορά σε αυτό το γονίδιο είναι σημαντική σε μελέτες που αφορούν στην πλαστικότητα των ιχθύων, μια και έχει ήδη αποδειχθεί ο ισχυρός ρόλος της επίδρασης του περιβάλλοντος (συγκεκριμένα της θερμοκρασίας ανάπτυξης) στην έκφραση του γονιδίου της αρωματάσης στο λαβράκι (Navarro-Martín et al. 2011), μέσω μεθυλίωσης του υποκινητή του. Η μελέτη της πλαστικότητας και του ετεροχρονισμού σε επίπεδο γονιδιακής έκφρασης, μπορεί να διαφωτίσει την πηγή της μεγάλης ποικιλίας στο φαινόμενο του φυλοκαθορισμού των ιχθύων. Το zebrafish αποτελεί κατάλληλο είδος μοντέλο για αυτό το σκοπό, γεγονός το οποίο αναλύεται ακολούθως. 47

50 2.6. Το zebrafish ως ερευνητικό μοντέλο για την κατανόηση του φαινομένου της πλαστικότητας στα ψάρια Το zebrafish Danio rerio (Hamilton, 1822) αποτελεί σήμερα οργανισμό μοντέλο στα πεδία της αναπτυξιακής και μοριακής βιολογίας, της γενετικής, της νευροβιολογίας και της οικοτοξικολογίας (Westerfield 1995, Lele & Krone 1996, Nagel & Isberner 1998, Raz 2002, Maack & Segner 2003, Hill et al. 2005, Ochi & Westerfield 2007, Bolker 2012, Ribas and Piferrer 2013). Ο μικρός χρόνος γενιάς των zebrafish καθώς και η άρτια χαρακτηρισμένη οντογένεση από τους Kimmel et al. (1995) καθιστούν το είδος ιδανικό για τη μελέτη των αναπτυξιακών διαδικασιών. Παράλληλα, όντας ευρύθερμο είδος (Spence et al. 2007) καθίσταται κατάλληλο για τη μελέτη της θερμο-εξαρτώμενης πλαστικότητας. Η πραγματοποίηση της εκκόλαψης των αυγών σε σχετικά αδιαφοροποίητο στάδιο ανάπτυξης και το επακόλουθο εκτενές νυμφικό στάδιο που προηγείται της φάσης της μεταμόρφωσης των νυμφών σε ιχθύδια (Westerfield 1995), οριοθετούν ένα πρότυπο ανάπτυξης παρόμοιο με αυτό των υπόλοιπων τελεόστεων, δίνοντας έτσι τη δυνατότητα επέκτασης των αποτελεσμάτων σε άλλα είδη. Η πλαστικότητα του zebrafish έχει εξεταστεί από πλήθος ερευνητών, μελετώντας την επίδραση διαφόρων συνθηκών στο φαινότυπο και στην οντογένεση του είδους, καθώς επίσης και στο φυλοκαθορισμό. Έτσι, έχει εξεταστεί η επίδραση συνθηκών υποξίας κατά την οντογένεση στο καρδιαγγειακό σύστημα των zebrafish (Moore et al. 2006), η επίδραση της διακύμανσης των διατροφικών συνθηκών στο μέγεθος των ατόμων και στην κολυμβητική τους ικανότητα (Marks et al. 2012), η (συν)επίδραση της θερμοκρασίας και της φωτοπεριόδου στην κολυμβητική ικανότητα και στο ρυθμό κατανάλωσης τροφής (Condon et al. 2010), καθώς και οι αλλαγές που προκαλούνται στη γονιδιακή έκφραση και στους ενζυμικούς μεταβολίτες των σκελετικών μυών, επαγόμενες από ψυχρό εγκλιματισμό και κολυμβητική άσκηση (McClelland et al. 2006). Αν και η διαδικασία φυλοκαθορισμού του είδους δεν έχει πλήρως διευκρινιστεί μέχρι σήμερα, φαίνεται ότι η θερμοκρασία ανάπτυξης επιδρά στην αναλογία φύλου, η οποία αυξάνει υπέρ των θηλυκών ατόμων σε υψηλές θερμοκρασίες (Sfakianakis at al. 2011) ενώ τα στοιχεία συνηγορούν υπέρ ενός πολυγονιδιακού τύπου φυλοκαθορισμό (PSD) (Anderson et al. 2012, Liew et al. 2012, Liew and Orbán 2014), σύμφωνα με τον οποίο καθορισμός του φύλου είναι αποτέλεσμα συνδυασμού της δράσης αλληλομορφων γονιδίων που εδράζονται σε διάφορες θέσεις του γονιδιώματος. Στο επόμενο αναλύεται η διαδικασία διαφοροποίσησης και καθορισμού του φύλου του zebrafish. Ένας από τους καλύτερα μελετημένους περιβαλλοντικούς παράγοντες πρόκλησης πλαστικότητας, αποτελεί η θερμοκρασία ανάπτυξης. Οι Schaefer & Ryan (2006) εξέτασαν την επίδραση της θερμοκρασίας από τη γονιμοποίηση μέχρι και την ενηλικίωση στη θερμική αντοχή (acclimation) του zebrafish, καθώς και το ρόλο που παίζει η εφαρμογή μιας σταθερής θερμοκρασίας, έναντι της εφαρμογής μεταβλητών θερμοκρασιακών συνθηκών, στη θερμική αντοχή και στην ανάπτυξη του zebrafish. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα άτομα τα οποία αναπτύχθηκαν σε μεταβλητές θερμοκρασιακές συνθήκες είχαν μεγαλύτερη αντοχή και μικρότερο μέγεθος από αυτά που αναπτύχθηκαν σε σταθερά θερμοκρασιακά περιβάλλοντα. Το μέσο τυπικό μήκος (SL) των zebrafish που αναπτύχθηκαν στις διαφορετικές (σταθερές ή μη) θερμοκρασιακές συνθήκες, μετρήθηκε τις πρώτες 110 ημέρες μετά τη γονιμοποίηση και όπως ήταν αναμενόμενο, τα άτομα που αναπτύχθηκαν σταθερά στην υψηλότερη θερμοκρασία (στους 28 C) είχαν μεγαλύτερο μήκος σώματος από αυτά των άλλων θερμοκρασιακών συνθηκών. 48

51 Οι Johnston et al. (2009) έδειξαν με την εργασία τους ότι οι θερμοκρασιακές συνθήκες κατά την πρώιμη ανάπτυξη επηρεάζουν την ανάπτυξη των μυών του zebrafish. Εξέτασαν την επίδραση της θερμοκρασίας (22, 26 and 31 C) κατά την πολύ πρώιμη ανάπτυξη και για μικρό χρονικό διάστημα (εμβρυϊκό στάδιο 1 4 κυττάρων μέχρι και την εκκόλαψη) στην ανάπτυξη / στρατολόγηση των λευκών μυϊκών ινών στα μυοτόμια των ενήλικων ατόμων. Μετά την εκκόλαψη τα άτομα αναπτύχθηκαν στους 26 / 27 C. Τα ψάρια που δέχτηκαν τη θερμοκρασιακή επίδραση των 22 C, ολοκλήρωσαν την παραγωγή των λευκών μυϊκών ινών μέχρι το ολικό μήκος (TL) του σώματός τους να φτάσει τα 25mm, ενώ αυτά των 26 C και 31 C ολοκλήρωσαν την παραγωγή των λευκών μυϊκών ινών σε TL=28mm και 23mm, αντίστοιχα. Ο τελικός αριθμός ινών για τα ψάρια των 26 C, ήταν κατά 19% και 14% υψηλότερος από τον αντίσοιχο αριθμό για τα ψάρια που αναπτύχθηκαν στους 22 και 31 C. Η τεχνολογία των Microarrays και η μέθοδος της Real Time qpcr, χρησιμοποιήθηκαν προκειμένου να ελεγχθούν αλλαγές στην έκφραση των micrornas (mirna). Η μέλέτη των Johnston et al. (2009), αποδεικνύει ότι η επίδραση της θερμοκρασίας κατά την πρώιμη ανάπτυξη και μάλιστα για πολύ μικρό χρονικό διάστημα, επηρεάζει σημαντικά την ανάπτυξη και δομή των μυών των ενήλικων ατόμων. Οι Scott & Johston (2012) εξέτασαν την επίδραση της θερμοκρασίας (22, 27 και 32 C) στη θερμική αντοχή (acclimation) του zebrafish, όπως είχαν κάνει αρκετά νωρίτερα οι Schaefer & Ryan (2006), αλλά περιόρισαν αυτή τη δράση στα πολύ πρώιμα αναπτυξιακά στάδια: Από τη γονιμοποίηση μέχρι και την εκκόλαψη, ενώ η ανάπτυξη στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε σε κοινές θερμοκρασιακές συνθήκες (27 C). Ύστερα από εγκλιματισμό στους 16 C, τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η επίδοση (αερόβια κολύμβηση) σε νερά χαμηλής ή υψηλής θερμοκρασίας (34 C) διαφοροποιήθηκε ανάλογα με τη θερμοκρασία ανάπτυξης. Σημαντικές ήταν οι παρατηρήσεις που αφορούσαν στη σημαντικά υψηλότερη επίδοση στα ψάρια των 32 C και 22 C, σε σχέση με αυτά των 27 C, (~20%). Αυτές οι διαφορές σχετίστηκαν μερικώς με την ποικιλία των τύπων των μυϊκών ινών που συνθέτουν τους μύες της κολύμβησης. Βρεθηκαν δε διαφορές στην έκφραση γονιδίων που σχετίζονται με το μεταβολισμό, την αγγειογένεση και τη μυϊκή συστολή. Η μελέτη των Scott & Johston (2012) δείχνει ότι η επίδραση της θερμοκρασίας κατά την κρίσιμη εμβρυϊκή περίοδο, μέχρι την εκκόλαψη, είχε ως αποτέλεσμα την εγκαθίδρυση διαφορών στο μυϊκό σύστημα που επηρεάζουν την απόδοση των ατόμων καθόλη τη διάρκεια της ζωής τους. Απο μελέτες που πραγματοποιήθηκαν στο εργαστήριό μας, στα πλαίσια του ελέγχου που ασκεί η θερμοκρασία ανάπτυξης στην πλαστικότητα του zebrafish, αποδείχτηκε ότι η θερμοκρασία ανάπτυξης (22, 28 και 32 C) κατά την πρώιμη ( d) και όψιμη ( d) οντογενετική περίοδο, επηρεάζει το σχήμα του σώματος των ενήλικων αρσενικών και θηλυκών zebrafish (Georga & Koumoundouros 2010) (Παράρτημα Ι). Η ανάλυση γεωμετρικής μορφομετρίας, έδειξε ότι τα ενήλικα αρσενικά και θηλυκά zebrafish διαχωρίστηκαν πλήρως μεταξύ τους, με βάση τη θερμοκρασιακή επίδραση που είχαν δεχτεί, γεγονός που μπορεί να οφείλεται στη διαφορική επίδραση της θερμοκρασίας στο σχετικό ρυθμό αύξησης μεταξύ των ιστών, οργάνων ή / και σωματικών μερών. Όπως έχει ήδη περιγραφεί, η οντογένεση των ψαριών δεν είναι μία σταθερή διαδικασία, καθώς εξαρτάται από τις περιβαλλοντικές συνθήκες (Blaxter 1988, Wimberger 1993) και εμφανίζει υψηλού βαθμού πλαστικότητα. Οι Schmidt & Starck (2010), εξέτασαν αν η επίδραση εξωγενών / περιβαλλοντικών παραγόντων (θερμοκρασία, αλατότητα και συγκέντρωση οξυγόνου) κατά την πρώιμη εμβρυϊκή ανάπτυξη του zebrafish προκαλεί φαινοτυπικές αλλαγές (πλαστικότητα / ετεροχρονισμός) στο φυλοτυπικό στάδιο του εμβρύου το οποίο από πολλούς ερευνητές θεωρείται εξελικτικά συντηρημένο και ότι παρουσιάζει χαμηλή φαινοτυπική ποικιλομορφία (Bininda-Emonds et al. 2003). Οι Schmidt & Starck (2010), μελέτησαν την εμφάνιση και ανάπτυξη 14 ανατομικών χαρακτήρων σε έμβρυα 49

52 zebrafish τα οποία αναπτύσσονταν σε διαφορετικές συνθήκες θερμοκρασίας, αλατότητας ή συγκέντρωσης οξυγόνου, κατά τη διάρκεια των 24 πρώτων ωρών μετά τη γονιμοποίηση. Τα έμβρυα εμφανίστηκαν ευέλικτα στην εμφάνιση αλλαγών ως αποτέλεσμα της επίδρασης των διαφορετικών συνθηκών, ακόμα και κατά το (θεωρητικά τουλάχιστον) συντηρημένο φυλοτυπικό στάδιο ανάπτυξης. (Στα Χορδωτά, ως φυλοτυπικό ορίζεται το φαρυγγικό στάδιο ανάπτυξης όπου τα έμβρυα των Σπονδυλωτών φέρουν όλα τα τυπικά χαρακτηριστικά του Υπο-φύλου τους: νωτοχορδή, νευρικό σχοινί με ραχιαία αύλακα, μετα-εδρική ουρά και μια σειρά από ζεύγη βραγχιακών τόξων). Σε συνθήκες υποξίας καθυστέρησε (heterochronic delay) η έναρξη της αρχικής συγκέντρωσης των εμβρυϊκών κυττάρων από τα οποία αναπτύσσεται το μάτι (anlagen of the eye), καθώς και η εμφάνιση του ωτικού κυστιδίου και οδηγήθηκαν στο συμπέρασμα ότι οι δύο αυτοί χαρακτήρες αναπτύσσονται ως ένα βαθμό ανεξάρτητα από το υπόλοιπο έμβρυο. Σχετικά με την επίδραση της θερμοκρασίας, οι Schmidt & Starck (2010) διαπίστωσαν μεταξύ άλλων ότι αυτή επηρέασε το χρονισμό της ανάπτυξης: Ανάλογα με τη θερμοκρασία ανάπτυξης (24, 27 ή 30 C) η ανάπτυξη κάποιων χαρακτήρων στα έμβρυα καθυστέρησε ή επιταχύνθηκε, σε σχέση με το χρόνο (hpf). Μεγαλύτερη επίδραση της θερμοκρασίας παρατηρήθηκε στο μήκος των εμβρύων και στο ύψος του 5 ου σωμίτη, καθώς και στον αριθμό των σωμιτών, όπως αυτοί μετρήθηκαν σε διαφορετικές χρονικές στιγμές (σε hpf). Τα έμβρυα που αναπτύσσονταν στους 30 C είχαν μεγαλύτερο αριθμό σωμιτών και μεγαλύτερο μήκος από αυτά που αναπτύσσονταν στους 24 και 27 C. Βρήκαν, δε, ότι στους 30 C η αύξηση του μεγέθους ήταν μικρότερη από την αντίστοιχη στους 24 και 27 C, με αποτέλεσμα τα έμβρυα αν και αναπτύσσονταν γρηγορότερα, να παρέμεναν μικρότερα (ετεροχρονικό φαινόμενο). Σημαντικό είναι το γενικό συμπέρασμα που προέκυψε από την εργασία τους, σύμφωνα με το οποίο η οντογενετική διαδικασία και ειδικότερα η φυλοτυπική περίοδος είναι συντηρημένη όταν πρόκειται για περιβαλλοντικές / εξωγενείς επιδράσεις εκτός των φυσιολογικών ορίων, γεγονός που εξασφαλίζει τη δημιουργία του καθιερωμένου σωματικού προτύπου σε αυτές τις περιπτώσεις. Όταν πρόκειται για εξωγενείς επιδράσεις που δεν τοποθετούνται εκτός των φυσιολογικών ορίων, αλλαγές στο ρυθμό της ανάπτυξης και του προτύπου οντογένεσης είναι επιτρεπτές καθώς δεν διακυβεύεται η δημιουργία του καθιερωμένου σωματικού προτύπου, ενώ παρέχουν ένα είδος ευελιξίας κατά την ανάπτυξη και επιτρέπουν την εμφάνιση ποικιλομορφίας. 50 Εικόνα 2.6-1: Το μήκος σώματος και το αναπτυξιακό στάδιο, ποικίλλουν σημαντικά μεταξύ των νυμφών zebrafish. Κάθε γραμμή δείχνει το SL για ψάρια που εκτρέφονται μεμονωμένα (Ν=54), σε τρεις διαφορετικές ομάδες. Αριστερά παρουσιάζονται τα αποτελέσματα μεταξύ 3 και 280dpf. Δεξιά, μεταξύ 3-84dpf. (Από Parichy et al. 2009).

53 Το 2008, οι Jorgensen et al. πρότειναν τη χρήση των επιπέδων έκφρασης των αρρενοειδικών (ar, sox9a, dmrt1a) και θηλεοειδικών (fig alpha, cyp19a1a) γονιδίων ως κατάλληλων δεικτών πρώιμου λέγχου της αναλογίας φύλου των πληθυσμών zebrafish, αλλά και ως κατάλληλων μοριακών εργαλείων για τη κατανόηση της δράσης του περιβάλλοντος στο φυλοκαθορισμό του είδους. Η μελέτη των επιπέδων έκφρασης των γονιδίων έγινε σε διαφορετικά στάδια ανάπτυξης τα οποία κάλυπταν την φάση του φυλοκαθορισμού και της διαφοροποίησης του φύλου του zebrafish (από τη 2 η μέχρι την 40 η dph). Παρέχοντας το οντογενετικό προφίλ της γονιδιακής έκφρασης των παραπάνω γονιδίων, παρατήρησαν ότι η πρώτη σημαντική κορύφωση στην έκφραση φυλοκαθοριστικού γονιδίου ήταν στις 10dph, για το dmrt1, γεγονός που υποδυκνείει την εμπλοκή αυτού του στη διαφοροποίηση των αρσενικών ατόμων κατά τα πρώιμα αναπτυξιακά στάδια. Από την προαναφερθείσα εργασία των Schmidt & Starck (2010), φαίνεται ότι στον ίδιο χρόνο, όπως αυτός μετράται με βάση τις ώρες μετά τη γονιμοποίηση (hpf), το στάδιο στο οπoίο βρίσκονται τα έμβρυα που αναπτύσσονται σε διαφορετικές θερμοκρασιακές συνθήκες, προσδιοριζόμενο με βάση τον αριθμό των σωμιτών, διαφέρει σημαντικά. Γενικά, το μέγεθος των ψαριών σχετίζεται θετικά με την αύξηση / ανάπτυξη και την ηλικία (σε dpf ή dph) (Piferrer et al. 2012), όμως άτομα που αναπτύσονται κάτω από διαφορετικές θερμοκρασιακές συνθήκες, δε βρίσκονται στο ίδιο οντογενετικό στάδιο, την ίδια ημέρα μετά τη γονιμοποίηση / εκκόλαψη. Ο φυσιολογικός χρόνος, όπως αυτός μετράται σε ώρες ή ημέρες (hpf / dpf) μετά τη γονιμοποίηση μπορεί να είναι αντιπροσωπευτικός του εκάστοτε οντογενετικού σταδίου στο οποίο βρίσκονται τα zebrafish σε καθιερωμένες συνθήκες θερμοκρασίας και εκτροφής. Ακόμα όμως και κάτω από καθιερωμένες συνθήκες ανάπτυξης (εντός του ίδιου πληθυσμού και υπό κοινές συνθήκες) τα άτομα ενός πληθυσμού μπορεί να επιδεικνύουν ποικιλομορφία σε ό,τι αφορά στο στάδιο που βρίσκονται μια δεδομένη χρονική στιγμή, οπότε σε διαφορετικές θερμοκρασιακές συνθήκες αυτή η ποικιλομορφία αυξάνεται (Kimmel et al. 1995, Parichy et al. 2009). Έτσι, κατά τα πρώιμα αναπτυξιακά στάδια, σε δεδομένη ηλικία το μέγεθος των αναπτυσσόμενων ιχθύων (και κατ επέκταση το στάδιο ανάπτυξης) (μπορεί να) διαφοροποιείται σημαντικά. Καθώς προχωράει η ανάπτυξη των νεαρών νυμφών μετά την εκκόλαψή τους και περνάνε στο ετερότροφο στάδιο, γενετικοί και περιβαλλοντικοί παράγοντες επηρεάζουν το ρυθμό αύξησης και ανάπτυξης κάθε ατόμου, με αποτέλεσμα τα άτομα ενός πληθυσμού να μη βρίσκονται στο ίδιο οντογενετικό στάδιο την ίδια ημέρα μετά τη γονιμοποίηση / εκκόλαψη (Εικόνα 2.6-1) (Parichy et al. 2009). Γενικά, σε προχωρημένα αναπτυξιακά στάδια τα άτομα ενός πληθυσμού που έχουν την ίδια ηλικία, εμφανίζουν μεγάλη διακύμανση στο στάδιο ανάπτυξης. Η εργασία των Jorgensen et al. (2008) συνθέτει το οντογενετικό προφίλ των φυλοκαθοριστικών γονιδίων χρησιμοποιώντας την ηλικία (dpf / dph) ως αντιπροσωπευτική του εκάστοτε οντογενετικού σταδίου. Λαμβάνοντας όμως υπόψη την προαναφερόμενη ποικιλομορφία των σταδίων ανάπτυξης των ατόμων ενός πληθυσμού ιχθύων μια δεδομένη χρονική στιγμή, όπως αυτή μετράται σε dpf ή dph, τα αποτελέσματα καθίστανται εν μέρει επισφαλή ή / και μη συγκρίσιμα μεταξύ τους, αφού την ίδια ημέρα μετά τη γονιμοποίηση (ή την εκκόλαψη), τα προς εξέταση άτομα έχουν πιθανότατα διαφορετικό μήκος και άρα βρίσκονται σε διαφορετικό οντογενετικό στάδιο. Έτσι, οι τιμές της γονιδιακής έκφρασης, όπως αυτές υπολογίζονται από το μέσο όρο ενός συνόλου ατόμων που βρίσκονται στην ίδια ηλικία, δεν είναι αντιπροσωπευτικές ενός συγκεκριμένου σταδίου ανάπτυξης, αφού το μέγεθος των ατόμων που αποτελούν το δείγμα, και άρα το οντογενετικό στάδιο στο οποίο βρίσκονται, ποικίλει. Από τα παραπάνω προκύπτει ότι σε έρευνες που σχετίζονται με το οντογενετικό προφίλ έκφρασης γονιδίων, είναι απαραίτητο να υπάρχει μια σαφώς καθορισμένη κλίμακα 51

54 που να είναι αντιπροσωπευτική των οντογενετικών σταδίων, και όσο το δυνατόν ανεξάρτητη από εξωγενείς παράγοντες. Έχοντας διαπιστωμένη την επίδραση της θερμοκρασίας ανάπτυξης στο χρονισμό της οντογένεσης, είναι εύλογη η υπόθεση μιας ανάλογης επίδρασης της θερμοκρασίας στη γονιδιακή έκφρασης, όχι μόνο μέσω αύξησης ή μείωσης των επιπέδων έκφρασης, αλλά στο συνολικό οντογενετικό πρότυπο έκφρασης. Μελετώντας το οντογενετικό προφίλ έκφρασης των γονιδίων και χρησιμοποιώντας το μήκος σώματος ως αντιπροσωπευτικό του εκάστοτε οντογενετικού σταδίου, είναι δυνατό να εντοπιστούν αντίστοιχες ετεροχρονικές μετατοπίσεις στην έκφραση των υπό μελέτη γονιδίων που συνδέονται με την εμφάνιση πλαστικότητας σε φαινοτυπικό επίπεδο Ο φυλοκαθορισμός του zebrafish Πολλές εργασίες σχετίζονται με το φυλοκαθορισμό του zebrafish, η διαδικασία του οποίου δεν έχει πλήρως διευκρινιστεί μέχρι σήμερα. Το διπλοειδές γονιδίωμα του zebrafish αποτελείται από 50 χρωμοσώματα (Hofsten & Olsson 2005), μεταξύ των οποίων δεν έχει αναγνωριστεί κάποιο ζεύγος φυλετικών χρωμοσωμάτων (Sola & Gornung, 2001, Wallace & Wallace 2003, Uchida et al. 2004,). Οι Uchida et al. (2002), μελετώντας διάφορα πρότυπα κληρονομικότητας πρότειναν ότι τα zebrafish έχουν σύστημα φυλοκαθορισμού που προσομοιάζει με το ΧΥ, ενώ οι Devlin & Nagahama (2002) υποστήριξαν την ακριβώς αντίθετη περίπτωση φυλοκαθορισμού, με ετερογαμετικά θηλυκά άτομα. Φαίνεται πιθανότερο να μην ισχύει καμία από τις δύο παραπάνω περιπτώσεις, με τους Liew et al. (2012) να υποστηρίζουν στην εργασία τους ότι το φύλο του zebrafish καθορίζεται πρωτογενώς πολυγονιδιακά, ενώ, δευτερογενώς, φαίνεται ότι είναι σημαντική η επίδραση περιβαλλοντικών παραγόντων. Οι γονότυποι των γονέων φαίνεται ότι παίζουν σημαντικό ρόλο στην αναλογία φύλου των απογόνων (Abozaid et al. 2011, Abozaid et al. 2012, Liew et al. 2012) ενώ σε συνθήκες εκτροφής με υψηλή πυκνότητα (Pelegri & Schulte Merker 1998, Liew et al. 2012), καθώς και σε συνθήκες που εμποδίζεται η γρήγορη ανάπτυξη (Lawrence et al. 2008) η αναλογία φύλου μετατοπίζεται υπέρ των αρσενικών ατόμων. Οι Anderson et al. (2012) υποστήριξαν στην εργασία τους έναν πολυγονιδιακό τύπο φυλοκαθορισμού στο zebrafish, κατά τον οποίο διαφορετικά γονίδια ελέγχουν τον καθορισμό του φύλου σε διαφορετικά στελέχη ή ο ρόλος διάφορων γονιδίων καθίσταται πιο σημαντικός υπό την επίδραση διαφορετικών περιβαλλοντικών συνθηκών, συνδέοντας έτσι το πολυγονιδιακό φυλοκαθορισμό (PSD) με τον περιβαλλοντικό (ESD) και κυρίως με το θερμο-εξαρτώμενο (TSD), μια και η θερμοκρασία ανάπτυξης αποτελεί έναν από τους καλύτερα μελετμημένους παράγοντες επίδρασης στην αναλογία φύλου των ιχθύων (Liew & Orban 2013). Το zebrafish εμφανίζει νεανικό «juvenile» ερμαφροδιτισμό (Uchida et al. 2002). Όλα τα zebrafish, πριν από τη διαφοροποίηση του φύλου τους και ανεξάρτητα από το γενετικό τους υπόβαθρο, αναπτύσσουν αρχικά αδιαφοροποίητες γονάδες όμοιες με ωοθήκες οι οποίες είτε θα ωριμάσουν δίνοντας θηλυκά άτομα, είτε θα αναστραφούν σε όρχεις, μέσω απόπτωσης των ωοκυττάρων, δίνοντας τελικά αρσενικά άτομα (Uchida et al. 2002). Η απόπτωση αυτή ελέγχεται από την αρωματάση P450 (Uchida et al. 2004). Υπάρχουν δύο γονίδια αρωματάσης, το cyp19a1a (γοναδική μορφή) και to cyp19a1b (εγκεφαλική μορφή) τα οποία εκφράζουν διαφορετικές πρωτεΐνες και ελέγχονται από διαφορετικούς ρυθμιστικούς μηχανισμούς (Trant et al. 2001). Το cyp19a1a φαίνεται ότι ελέγχει τη διαφοροποίηση των ωοθηκών και των όρχεων σε γονοχωριστικά είδη ιχθύων, αλλά και σε ερμαφρόδιτα. Σύμφωνα με αυτή την υπόθεση, αυξημένη έκφραση του cyp19a1a ενεργοποιεί και διατηρεί την διαφοροποίηση των γονάδων σε ωοθήκες, ενώ μειωμένη έκφρασή του αρκεί προκειμένου

55 οι αναπτυσσόμενες γονάδες να ακολουθήσουν το αρρενοποιητικό μονοπάτι (Guiguen et al. 2010). Γενικά, σε περιπτώσεις θερμοεξαρτώμενης αρρενοποίησης των ψαριών, καθώς και σε πρωτόγυνα ερμαφρόδιτα είδη, η έκφραση του cyp19a1a διακόπτεται (Guiguen et al. 2010). Μέχρι σήμερα, έχει βρεθεί ότι υπάρχουν 3 κυρίαρχα αναπτυξιακά μονοπάτια που σχετίζονται με τη διαφοροποίση του φύλου στα zebrafish και σχετίζονται με προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο (programmed cell death) (Liew & Orban 2013). Στα περιβάλλοντα που διαβιώνει το zebrafish, η θερμοκρασία κυμαίνεται φυσιολογικά από τους 16 έως 38 C (Engeszer et al. 2007, Spence et al. 2008). Στο παρελθόν είχε διαπιστωθεί η αρρενοποίηση γυνογενετικών θηλυκών ατόμων σε υψηλές, εκτός φυσιολογικών ορίων, θερμοκρασίες (Uchida et al. 2002). Σε υψηλές εντός των φυσιολογικών ορίων - θερμοκρασίες η αναλογία φύλου μετατοπίζεται υπέρ των αρσενικών ατόμων (Uchida et al. 2004, Abozaid et al. 2011, Abozaid et al. 2011, Abozaid et al. 2012), αν και έχει βρεθεί και η ακριβώς αντίθετη επίδραση της θερμοκρασίας (Sfakianakis et al. 2011). Γενικά, ο θερμοεξαρτώμενος φυλοκαθορισμός σχετίζεται με διατάραξη ή και τη διακοπή της παραγωγής στεροειδών ορμονών κατά τη γοναδογένεση, μέσω ρύθμισης της γονιδιακής έκφρασης του γονιδίου της αρωματάσης (Godwin et al. 2003). Η αύξηση της θερμοκρασίας επηρεάζει διαδικασίες που σχετίζονται με το μετασχηματισμό και τη διαφοροποίηση των γονάδων. Αυξημένες θερμοκρασίες επηρεάζουν την απόπτωση των ωοκυττάρων στο zebrafish (Uchida et al. 2004), τη σύνθεση των στεροειδών μέσω μεθυλίωσης του υποκινητή του γονιδίου της αρωματάσης και κατ επέκταση τη διαφορική ρύθμιση της έκφρασής του στο λαβράκι (Navarro-Martin et al. 2011) και τη μειωτική διαίρεση των γεννητικών κυττάρων στο είδος Paralichthys olivaceus (Yamaguchi et al. 2012). Είναι δε σημαντικό να τονιστεί ότι ο γονότυπος των γονέων καθορίζει το βαθμό επίδρασης της θερμοκρασίας στον καθορισμό του φύλου του zebrafish (Abozaid et al. 2011, Abozaid et al. 2012). Οι Uchida et al. (2004) έδειξαν ότι όταν ιχθύδια zebrafish αναπτυχθούν σε υψηλές θερμοκρασίες κατά την περίοδο της διαφοροποίησης των γονάδων, αυξήθηκε η απόπτωση των ωοκυττάρων και μειώθηκε η δραστηριότητα της αρωματάσης, δίνοντας τελικά μια αναλογία φύλου αυξημένη υπέρ των αρσενικών ατόμων. Ανάλογη ήταν και η επίδραση της θερμοκρασίας κατά το νυμφικό στάδιο: Αύξηση της θερμοκρασίας για 5-24 hpf είχε σαν αποτέλεσμα την παραγωγή περισσότερων αρσενικών ατόμων (Abozaid et al. 2012). Στο στάδιο του ερμαφρόδιτου ιχθυδίου, η διδυναμική γονάδα φέρει πρώιμα ωοκύτταρα και εκφράζει θηλεοειδικά (cyp19a1a) και αρρενοειδικά (amh) γονίδια (Rodriguez-Mari et al. 2010). Τα ωοκύτταρα θα πρέπει να ολοκληρώσουν φυσιολογικά τη φάση της μείωσης (παιρνόντας από το στάδιο της παχυταινίας στο στάδιο της διπλοταινίας) προκειμένου να αναγκάσουν το σώμα των αναπτυσσόμενων γονάδων να διατηρήσει την πορεία προς το θηλυκό μονοπάτι (Rodriguez-Mari et al. 2010, Shive et al. 2010, Rodriguez-Mari & Postlethwait 2011). Τα ωοκύτταρα είναι απαραίτητα για τη διατήρηση της έκφρασης του cyp19a1a στα σωματικά κύτταρα των γονάδων και η επιβίωσή τους από τη διαδικασία της μείωσης είναι σημαντική για την τελική διαφοροποίηση των διδυναμικών γονάδων σε ωοθήκες (Rodriguez-Mari & Postlethwait 2011). Προτείνεται λοιπόν ότι τα αρσενικά και θηλυκά zebrafish διαφοροποιούνται φυσιολογικά σε σχέση με γενετικούς παράγοντες που ελέγχουν τον αριθμό των ωοκυττάρων που βρίσκονται σε μείωση και τα οποία με τη σειρά τους ελέγχουν την ένταση του σήματος που φτάνει στο σώμα των γονάδων. Θεωρείται δε ότι είναι απαράιτητο να «επιβιώσει» της μείωσης ένας κρίσιμος αριθμός ωοκυττάρων, ικανός να ωθήσει τις αδιαφοροποίητες γονάδες να διαφοροποιηθούν σε ωοθήκες, ενώ σε διαφορετική περίπτωση, ακολουθεί απόπτωση των ωοκυττάρων, μέσω ενεργοποίησης της Tumor Protein p53 (tp53) (Shive et al. 2010, Rodriguez-Mari et al. 2010, Rodriguez-Mari & Postlethwait 2011) (Εικόνα 2.7-1). 53

56 54 Εικόνα 2.7-1: Προτεινόμενο μοντέλο φυλοκαθορισμού για το zebrafish: Η επιβίωση των ωοκυττάρων από την απόπτωση που ρυθμίζεται από τη δράση της TP53, μπορεί να αλλάξει την τύχη των αναπτυσσόμενων γονάδων. (Από Rodríguez-Marí et al. 2010). Εκτός από τους γενετικούς παράγοντες, περιβαλλοντικοί παράγοντες φαίνεται ότι επιδρούν στην παραπάνω διαδικασία και ο έλεγχος της απόπτωσης μπορεί να αποτελεί στόχο τόσο των περιβαλλοντικών όσο και των γενετικών σημάτων με αποτέλεσμα τις εκάστοτε τροποποιήσης στο φυλοκαθορισμό του zebrafish. Τα παραπάνω αποτελέσματα συνηγορούν όχι υπέρ ενός περιβαλλοντικά ελεγχόμενου φυλοκαθορισμού, αλλά υπέρ ενός γενετικού φυλοκαθορισμού (πιθανότατα πολυγονιδιακού) επί του οποίου μπορεί να δράσει η θερμοκρασία ή και άλλοι περιβαλλοντικοί παράγοντες που θα ελέγξουν την απόπτωση των ωοκυττάρων. Το μοντέλο αυτό είναι σύμφωνο και με τα πρόσφατα αποτελέσματα των Ospina-Alvarez & Piferrer (2008), βάσει των οποίων o TSD αποτελεί εξαίρεση παρά γενικό κανόνα στο φυλοκαθορισμό των τελεόστεων και στη συντριπτική πλειοψηφία των περιπτώσεων πρόκειται για γενετικό φυλοκαθορισμό επί του οποίου δρα η θερμοκρασία ανάπτυξης. Οι Jorgensen et al. (2008) πρότειναν τη χρήση των επιπέδων έκφρασης των αρρενοειδικών (ar, sox9a, dmrt1a) και θηλεοειδικών (fig alpha, cyp19a1a, cyp19a1b) γονιδίων ως κατάλληλων δεικτών πρόβλεψης της αναλογίας φύλου των πληθυσμών zebrafish, αλλά και ως κατάλληλων μοριακών εργαλείων για τη κατανόηση της δράσης του περιβάλλοντος και κυρίως της θερμοκρασίας ανάπτυξης - στο φυλοκαθορισμό του είδους. Εξέτασαν την έκφραση των παραπάνω γονιδίων τις πρώτες 40 dph. Οι μελέτες που σχετίζονται με την οντογένεση του zebrafish και αναφέρονται σε οντογενετικά στάδια προσδιορίζοντας τη χρονική στιγμή της εμφάνισής τους με βάση την ηλικία (dpf, dph) δεν είναι επαρκείς. Αρκεί να θυμηθούμε ότι ο ρυθμός αύξησης και ανάπτυξης εξαρτάται από περιβαλλοντικούς παράγοντες, όπως είναι η θερμοκασία, προκειμένου να καταλάβουμε ότι όταν τα ψάρια βρίσκονται στην ίδια ηλικία, δε βρίσκονται στο ίδιο οντογενετικό στάδιο. Παρ όλα αυτά επειδή η συντριπτική πλειοψηφία αυτού του τύπου των μελετών μετρά την

57 ηλικία των zebrafish σε dpf / dph, όταν γίνεται αναφορά στα διάφορα γεγονότα που σχετίζονται με το φυλοκαθορισμό αυτά τοποθετούνται χρονικά με βάση τις ημέρες μετά τη γονιμοποίηση / εκκόλαψη. Τα zebrafish γίνονται αναπαραγωγικά ώριμα σε ηλικία περίπου 3 μηνών, αν και το φύλο των ατόμων μπορεί να προσδιοριστεί ιστολογικά μετά τις dpf (Uchida et al. 2002). Η ωοθηκική ανάπτυξη αποτελεί το προκαθορισμένο (default) μονοπάτι το οποίο ξεκινά στις 10 dpf και συνεχίζει-ολοκληρώνεται μέχρι την 20 η dpf. Από την 21 η dpf μέχρι περίπου την 30 η dpf αρχίζει η ανάπτυξη των όρχεων, με την απόπτωση των ωοκυττάρων (Uchida et al. 2002). Η εργασία των Jorgensen et al. (2008) συνθέτοντας το οντογενετικό προφίλ των φυλοκαθοριστικών γονιδίων και χρησιμοποιώντας τις ημέρες μετά την εκκόλαψη ως προσδιοριστικό της ηλικίας των ψαριών, κατέληξαν, μεταξύ άλλων, στο ότι η πρώτη σημαντική αύξηση στη γονιδιακή έκφραση αφορούσε το dmrt1 στις 10 dph. Για τους λόγους που έχουν ήδη αναφερθεί, τα αποτελέσματα αυτά καθίστανται εν μέρει επισφαλή ή / και μη συγκρίσιμα μεταξύ τους, αφού την ίδια ημέρα ετά τη γονιμοποίηση / εκκόλαψη, τα προς εξέταση άτομα έχουν πιθανότατα διαφορετικό μήκος και άρα βρίσκονται σε διαφορετικό οντογενετικό στάδιο / στάδιο ανάπτυξης Οντογένεση του zebrafish Ερώτημα πολλών ερευνητών, έχει αποτελέσει το πως δομείται και ερμηνεύεται μια αναπτυξιακή αλληλουχία γεγονότων σε στάδια. Εντός μια ταξινομικής ομάδας (taxon) τα έμβρυα και οι οργανισμοί μετέπειτα σταδίων μπορούν να ταξινομηθούν βάση της ηλικίας τους, τους μεγέθους τους (όπως ορίζεται αυτό, κατά περίπτωση) του σταδίου στο οποίο βρίσκονται ή με ένα συνδυασμό των παραπάνω παραγόντων. Όπως γίνεται εύκολα ίσως κατανοητό, η οντογένεση αποτελεί μια συνεχόμενη διαδικασία, ενώ ο διαχωρισμός αυτής σε στάδια εξυπερετεί ερευνητικούς κυρίως σκοπούς (πειραματικoύς και αναλυτικών διαδικασιών). Η οντογένεση των τελεόστεων ιχθύων, όπως είναι το zebrafish, μπορεί να διαχωριστεί αδρά σε δύο κύρια στάδια: Το εμβρυϊκό κατά την οποίο τα άτομα παραμένουν μέσα στο χόριο και το μετα-εμβρυϊκό, το οποίο περιλαμβάνει όλα τα υπόλοιπα στάδια μέχρι και την ενηλικίωση του ατόμου (νυμφικό, ιχθυδίου και ενήλικου ατόμου). Το zebrafish, Danio rerio (Hamilton, 1822), παρουσιάζει παρόμοιο πρότυπο ανάπτυξης με την πλειονότητα των ειδών ψαριών. Η εκκόλαψη των αυγών πραγματοποιείται σε σχετικά αδιαφοροποίητο στάδιο ανάπτυξης, ακολουθείται από ένα εκτενές νυμφικό στάδιο, τη φάση της μεταμόρφωσης των νυμφών σε ιχθύδια και τη μετάβαση από το πλαγκτονικό στο βενθοπελαγικό τρόπο διαβίωσης (Spence et al. 2008, Westerfield, 1995). Θα πρέπει να σημειωθεί η αξαιρετική σημασία της οντογένεσης στην τελική μορφή ενός φαινοτυπου, η οποία καθορίζεται σε μεγάλο βαθμό από πολύ νωρίς, κατά την πρώιμη οντογένεση, όπου ο τρόπος πρόσληψης της τροφής δεν πραγματοποιείται ακόμα πλήρως εξωγενώς, αλλά είναι ενδογενής / αυτότροφος, ή μικτός (Balon 1985). Οι παράγοντες που επιιδρούν σε αυτή την πρώιμη αναπτυξιακή περίοδο, έχουν σημαντικές επιπτωσεις σε ολόκληρη τη ζωή των ατόμων. 1. Στάδιο του εμβρύου (embryo): Η αρχή του εμβρυϊκού σταδίου ορίζεται από τη γονιμοποίηση και η λήξη του από την εκκόλαψη των νεαρών νυμφών. Στο στάδιο του εμβρύου το zebrafish βρίσκεται μέχρι να πραγματοποιηθεί η εκκόλαψη των γονιμοποιημένων αυγών (~72 hpf στους 28.5 C, κατά το δτάδιο προεξέχοντος στόματος, Kimmel et al. 1995). Στο zebrafish, όπως και στους περισσότερους τελεόστεους ιχθύες, η εκκόλαψη των εμβρύων θεωρείται ως ένα στάδιο ορόσημο κατά την ανάπτυξη και αυτό γιατί πριν από την

58 εκκόλαψη τα νεαρά άτομα είναι αδύνατο να ξεφύγουν ενεργητικά από τους πιθανούς θηρευτές τους. Οι περιβαλλοντικοί παράγοντες, μεταξύ των οποίων βασικό ρόλο παίζει η θερμοκρασία ανάπτυξης, επηρεάζουν το ρυθμό διαφοροποίησης των εμβρυϊκών ιστών, αλλά και την ίδια τη διαδικασία της εκκόλαψης. Έτσι, η εκκόλαψη μπορεί να διαρκέσει από κάποιες ώρες μέχρι και ημέρες μετά τη γονιμοποίηση, εξαρτώμενη από το προς αναφορά είδος και από τις περιβαλλοντικές συνθήκες στις οποίες αναπτύσσονται τα έμβρυα (Kamler 2002, Fuiman & Werner 2002). Μετά την εκκόλαψη, το zebrafish διατηρεί το λεκιθικό του σάκο. Η πλήρης απορρόφηση του λεκιθικού σάκου και η μετάβαση από την ενδογενή στην εξωγενή διατροφή, αποτελεί επίσης ένα στάδιο-ορόσημο κατά την ανάπτυξη των ψαριών, καθοριστικό για την επιβίωσή τους (Balon 1982, αναφερόμενος από Gibb et al. 2007, Kendall 1984). Πριν από την πλήρη κατανάλωση του λεκιθικού σάκου, το αναπτυσσόμενο ψάρι θα πρέπει να αναπτύξει όλες εκείνες τις δομές που το καθιστούν ικανό να βρει ενεργητικά την τροφή του (Kendall 1984). 2. Στάδιο της νύμφης (larva): Πρόκειται για το στάδιο εκείνο κατά το οποίο ένα άτομο έχει βγει από το στάδιο του εμβρύου και δεν έχει μπει στο στάδιο του ιχθυδίου (Parichy et al. 2009). Ο παραπάνω ορισμός δε δίνει σαφή μορφολογικά χαρακτηριστικά του σταδίου. Σύμφωνα με τον Kendall (1984) η νυμφική περίοδος περιλαμβάνει το χρονικό διάστημα από την εκκόλαψη μέχρι την ολοκλήρωση της ανάπτυξης. Οι Kimmel et al. (1995) τοποθετούν τη διάρκεια του σταδίου από τις ~72hpf μέχρι την 21 η -29 η dpf, όπου το ολικό μήκος (TL) της νύμφης φτάνει τα 7 έως 8mm. Στο στάδιο αυτό, η νύμφη φέρει την αρχέγονη περιφερειακή πτερυγιοπτυχή (primordial marginal finfold). Θα πρέπει να σημειωθεί, ότι σύμφωνα με τον Kendall (1984) το στάδιο από την εκκόλαψη μέχρι την πλήρη κατανάλωση της λεκίθου αποτελεί ένα μεταβατικό νυμφικό στάδιο και όχι εμβρυϊκό. Ένα καθοριστικό οντογενετικό γεγονός μεταξύ του νυμφικού σταδίου και του σταδίου του ιχθυδίου που ακολουθεί, αποτελεί η κάμψη της νωτοχορδής όπου η νωτοχορδή στην περιοχή του ουραίου πτερυγίου, κοιλιακά της σπονδυλικής στήλης, γίνεται εύκαμπτη (Flexion) (Kendall 1984). Η αρχή του σταδίου τοποθετείται όταν αρχίζει η προς τα άνω κάμψη της νωτοχορδής και τελειώνει με την ολοκλήρωση του σχηματισμού των υπουραίων οστών. Το νυμφικό στάδιο μετά την κάμψη της νωτοχορδής (post-flexion larva) αρχίζει από το σχηματισμό του ουραίου πτερυγίου (με το υπουραίο σε κάθετη θέση), μέχρι την ολοκλήρωση του σχηματισμού των ακτίνων των πτερυγίων. Το στάδιο κάμψης της νωτοχορδής είναι μεταβατικό μεταξύ του νυμφικού σταδίου και του σταδίου του ιχθυδίου. Στάδιο της μεταμόρφωσης (metamorphosis): Μετά την εκκόλαψη, ακολουθεί το στάδιο της λεκιθοφόρου νύμφης, ενώ η διαδικασία της μεταμόρφωσης σηματοδοτεί το πέρασμα από το στάδιο της εξώτροφης πλέον νύμφης στο στάδιο του ιχθυδίου, όπου τα αναπτυσσόμενα ψάρια μοιάζουν με μικρογραφίες των ενήλικων ατόμων (McCormick & Makey 1997). Οι μορφολόγοι και οι εξελικτικοί βιολόγοι, ορίζουν ως μεταμόρφωση το σύνολο των αλλαγών που συμβαίνει σε ένα στάδιο ανάπτυξης μεταξύ δύο διακριτών μετεμβρυϊκών σταδίων που φέρουν χαρακτηριστικές σωματικές μορφές (Rose & Reiss 1993, αναφερόμενοι από Rose 2004 στο Hall et al. 2000). 3. Τα ψάρια που ανήκουν στην τάξη των Ακτινοπτερυγιων (superclass Gnathostomata) (καθώς και όλα τα Άγναθα της τάξης Petromyzontiformes) έχουν έμμεση ανάπυξη (indirect development) και περνούν από το στάδιο της μεταμόρφωσης (Youson 2000, στο Hall et al. 2004, αναφερόμενο στο Hall et al. 2000). Η έμμεση ανάπτυξη απαιτεί την ύπαρξη ενός νυμφικού σταδίου και (growth-feeding phase, free-living larva) και ενός σταδίου μεταμόρφωσης όπου ο νυμφικός φαινότυπος αντικαθίσταται από το φαινότυπο του ιχθυδίου (Youson 1988, Youson 2000, στο Hall et al. 2004). Η περίοδος αυτή χαρακτηρίζεται απο δραματικές αναπτυξιακές αλλαγές με κατά το οποίο τυπικά χαρακτηριστικά της νύμφης χάνονται (όπως για παράδειγμα η πτερυγιοπτυχή στο zebrafish), ενώ παράλληλα 56

59 αναδιαμορφώνονται οργανικά συστήματα, όπως το πεπτικό και το νευρικό (Youson 2000, στο Hall et al. 2004, Parichy et al. 2009). Κατά την έμμεση ανάπτυξη, γονίδια που εκφράζονται στα ενήλικα άτομα δεν εκφράζονται πριν από την έναρξη της μεταμόρφωσης, ενώ η έναρξη της μεταμόρφωσης είναι συνδεδεμένη με την καταστολή της έκφρασης γονιδίων που εκφράζονται ειδικά στο νυμφικό στάδιο (Youson 2000, στο Hall et al. 2004). Η όλη διαδικασία κατευθύνεται από ορμόνες του υποθαλάμου, της υπόφυσης και του θυρεοειδούς. Σύμφωνα με τον Kendall (1984) το στάδιο της μεταμόρφωσης αρχίζει με την ολοκλήρωση της μετάβασης από το νυμφικό στάδιο στο στάδιο του ιχθυδίου, όταν η αναπτυσσόμενη νύμφη αρχίσει να φέρει τα χαρακτηριστικά του ιχθυδίου (ακτίνες πτερυγίων και ανάπτυξη λεπιών) και ολοκληρώνεται όταν το άτομο καθίσταται αναπαραγωγικά ώριμο. Αν και οι Parichy et al. (2009) αποφεύγουν να προσδιορίσουν χρονικά το στάδιο της μεταμόρφωσης στο zebrafish, λόγω έλλειψης σχετικών επιβεβαιωτικών πειραματικών δεδομένων, οι Parichy & Turner (2003) συνδυάζουν το στάδιο αυτό με την αλλαγή του χρωματικού προτύπου. Στα ψάρια που περνούν από τη διαδικασία της μεταμόρφωσης, το νυμφικό ενδιάμεσο στάδιο (και άρα ο νυμφικός φαινότυπος) είναι απαραίτητο για την επιβίωση των αναπτυσσόμενων ατόμων, και για τη διασπορά τους στο περιβάλλον, εντός ενός ενός περιορισμένου θερμοκλινούς (Youson 2000, στο Hall et al. 2004). Όπως συμβαίνει με την εκκόλαψη, έτσι και η μεταμόρφωση αποτελεί μια δυναμική και ευέλικτη οντογενετική διαδικασία, επιταχυνόμενη ή επιβραδυνόμενη χρονικά, ανάλογα με τη δράση περιβαλλοντικών παραγόντων (Balon 1999). 4. Στάδιο του ιχθυδίου (juvenile): Το στάδιο του ιχθυδίου τοποθετείται από την 30 η dpf, μέχρι το άτομο να φτάσει ολικό μήκος (TL) περίπου ίσο με τα 14mm (στάδιο ολοκλήρωσης της διαφοροποίησης των γονάδων και της μεταμόρφωσης Hsiao & Tsai 2003, Parichy et al. 2009). Το στάδιο του ιχθυδίου κατά Kimmel et al. (1995) χωρίζεται στην περίοδο όπου ολοκληρώνεται ο σχηματισμός των πτερυγίων και ο χρωματισμός (30 η -44 η dpf) και στην περίοδο όπου ολοκληρώνεται η εμφάνιση των 12 δοντιών (45 η -89 η dpf). Σύμφωνα με τους Parichy et al. (2009), στο στάδιο του ιχθυδίου ολοκληρώνεται η εμφάνιση όλων εκείνων των τυπικών χαρακτηριστικών που φέρει ένα ενήλικο άτομο, απουσία της διαφοροποίησης του φύλου, που στην περίπτωση του zebrafish αφορά στην εμφάνιση των λεπιών και την πλήρη απώλεια (αλλομετρική αξάλειψη) του ενιαίου νυμφικού πτερυγίου. Όπως συμβαίνει και με τα υπόλοιπα είδη ψαριών, έτσι και με το zebrafish, το τέλος του σταδίου του ιχθυδίου δεν είναι σαφώς καθορισμένο, υπό την έννοια του ότι δεν υπάρχει σαφές οντογενετικό ορόσημο συνδεόμενο με τη λήξη αυτής της περιόδου. Η πλήρης οστεοποίηση, η πλήρης κάλυψη του ψαριού με λέπια και η ολοκλήρωση του γνωστού χρωματικού προτύπου είναι χαρακτηριστικά της λήξης του σταδίου (Fuiman & Werner 2002, Parichy 2008). 5. Στάδιο του ενηλικου ατόμου (adult): Το στάδιο αυτό καθορίζεται από την παραγωγή βιώσιμων γαμετών, από τα αναπαραγωγικά ώριμα πλέον αρσενικά και θηλυκά άτομα, καθώς και από την εμφάνιση των δευτερογενών φυλετικών χαρακτηριστικών (όπως είναι η στρογγυλή κοιλιά των θηλυκών ατόμων, αλλά και οι χαρακτηριστικές διαφορές στο χρωματισμό των ενήλικων zebrafish). Η έναρξη του σταδίου θα μπορούσε να τοποθετηθεί χρονικά περίπου στις 90dpf, οπότε το μήκος τυπικό μήκο σώματος των ιχθύων είναι περίπου ίσο με 3,5cm. Είναι αποδεδειγμένο ότι η θερμοκρασία αποτελεί σημαντικό παράγοντα του εξαιρετικά κρίσιμου σταδίου της μεταμόρφωσης, όπως άλλωστε και των υπόλοιπων οντογενετικών σταδίων. Στο Άγναθο P. marinus έχει αποδειχτεί ότι η διαδικασία της μεταμόρφωσης μπορεί να καθυστερήσει ή ακόμα και να παρεμποδιστεί, αν τα αναπτυσσόμενα άτομα παραμείνουν το χειμώνα στις υψηλές θερμοκρασίες της καλοκαιρινής περιόδου, ή εάν οι χαμηλές (χειμερινές) θερμοκρασίες παραμείνουν την περίοδο της άνοιξης όπου τα ψάρια αυτά περνούν από τη φάση της μεταμόρφωσης (Holmes and Youson 1998). Η 57

60 θερμοκρασία ανάπτυξης αποτελεί έναν από τους κυριότερους παράγοντες πρόκλησης πλαστικότητας στα εξώθερμα ψάρια, μεταβάλλοντας τη σχέση ρυθμού αύξησης και διαφοροποίησης. Διαφορετικοί ρυθμοί αύξησης και διαφοροποίησης λόγω επίδρασης της θερμοκασίας μπορεί να επηρεάσουν το μέγεθος στο οποίο συμβαίνουν τα διάφορα οντογενετικά γενονότα (Koumoundouros et al. 2002). Η διάρκεια οποιουδήποτε οντογενετικού γεγονότος σε έναν εξώθερμο οργανισμό, υπολογιζόμενη χρονολογικά σε ημέρες μετά τη γονιμοποίηση, είναι αντιστρόφως ανάλογη της θερμοκρασίας, αφού αυξάνεται σε χαμηλές θερμοκρασίες και μειώνεται σε υψηλές (εντός φυσιολογικών ορίων). Όμως, η θερμοκρασία ανάπτυξης επιδρά όχι μόνο στη χρονική διάρκεια των εκάστοτε σταδίων και στο ρυθμό αύξησης, αλλά συνολικά στο χρονισμό της οντογένεσης. Η έναρξη και η χρονική διάρκεια των διαφόρων οντογενετικών σταδίων στους τελεόστεους ιχθύες εξαρτάται από τις συνθήκες ανάπτυξης και εντασσόμενη στο φαινόμενο του ετεροχρονισμού, η αλλαγή του οντογενετικού προτύπου κατά την ανάπτυξη είναι ένα σύνηθες φαινόμενο σε αυτή την ομάδα οργανισμών Γενικά χαρακτηριστικά του zebrafish Το zebrafish, είναι ένα μικρό βενθο-πελαγικό ψάρι που ανήκει στην οικογένεια των Κυπρινοειδών. Είναι τροπικό είδος, γηγενές της νοτιανατολικής Ασίας (ΝΑ Ινδία, Μπαγκλαντές, Νεπάλ) (Εικόνα 2.9-1), όπου διαβιεί σε μια ποικιλία ενδιαιτημάτων (ποτάμια, ρυάκια ή / και στάσιμα νερά ορυζώνων), προτιμώντας κατά βάση τα ρηχά και αργά κινούμενα νερά με θερμοκρασίες που κυμαίνονtαι από τους 16.0 έως 38.6 C (Engeszer et al. 2007, Spence et al. 2008). Πρόκειται λοιπόν για ένα ευρύθερμο είδος. Τα ενδιαιτήματα αυτά φαίνεται ότι είναι ακατάλληλα για πολλά άλλα είδη οργανισμών. Έτσι, στο φυσικό περιβάλλον η αναπαραγωγή των zebrafish πραγματοποιείται σε μάζες νερού χωρίς υψηλή ποικιλότητα (αφού πρόκειται για ενδιαιτήματα αφιλόξενα για πολλά είδη οργανισμών) και ακτ επέκταση χωρίς την παρουσία θηρευτών. Η αναπαραγωγή των zebrafish απαιτεί μακρά διάρκεια ημέρας και στα φυσικά περιβάλλοντα η ωοτοκία συμπίπτει με την αρχή των μουσώνων. Σε περιοχές όπου υπάρχουν μικρές και ρηχές λίμνες (π.χ. στο Μπαγκλαντές) στις οποίες επιτελείται η ωοτοκία, οι εκτεταμένοι μουσώνες οδηγούν στην ενωποίηση αυτών των λιμνών και τη δημιουργία πανμικτικών πληθυσμών. Το αποτέλεσμα είναι η δημιουργία ομοιόρφων φαινοτυπικά και γενετικά πληθυσμών. Σε άλλες περιοχές, όπως είναι η Myanmar, οι πληθυσμοί είναι γεωγραφικά απομονωμένοι (σε διαφορετικές κοιλάδες ποταμών) και η ποικιλότητα (φαινοτυπική και γενετική) είναι αυξημένη.

61 Publications Per Year 59 Εικόνα 2.9-1: Γεωγραφική κατανομή του zebrafish (Από Spence et al. 2008) Εικόνα 2.9-2: Αριθμός δημοσιεύσεων από το 1972 μέχρι σήμερα, στις λέξεις κλειδιά των οποίων περιέχονται οι λέξεις zebrafish, Danio rerio, ή ο συνδυασμος τους. Για το διάγραμμα χρησιμοποιήθηκε η μηχανή αναζήτησης Scopus ( Ένα μορφολογικό χαρακτηριστικό που καθιστά τα zebrafish εύκολα αναγνωρίσιμα, είναι η παρουσία πέντε ομοιόμορφα χρωματισμένων οριζόντιων μαύρων γραμμών, παράλληλων μεταξύ τους, που εκτείνονται από το πρόσθιο μέχρι το οπίσθιο άκρο του σώματος, συμπεριλαμβανομένου του ουραίου πτερυγίου. Μεταξύ αυτών των μαύρων γραμμών, στα αρσενικά άτομα διακρίνεται έντονο χρυσαφί χρώμα, ενώ στα θηλυκά, ασημί (πιο σκουρόχρωμο ραχιαία και πιο ανοιχτόχρωμο κοιλιακά και στην περιοχή των βραγχίων). Τα αρσενικά άτομα έχουν λεπτό «τορπιλοειδές» σώμα και διακρίνονται εύκολα από τα ογκώδη στην κοιλιακή περιοχή θηλυκά, λόγω των αυγών που φέρουν (Parichy 2009, Georga & Koumoundouros 2010). Το μέσο μήκος των ενήλικων ατόμων φτάνει περίπου τα 5mm (SL). Το zebrafish ως είδος «ακολουθεί» την r-επιλογή επιβίωσης χαρακτηριστική της διαβίωσης σε ευμετάβλητα (ασταθή) περιβάλλοντα στα οποία τα επίπεδα θνησιμότητας είναι

62 υψηλά πριν φτάσουν τα άτομα σε αναπαραγωγική ηλικία. Ο μικρός χρόνος γενιάς και η παραγωγή πολλών αυγών από τα θηλυκά άτομα, αποτελούν χαρακτηριστικά αυτής της στρατηγικής, ενώ αυτά τα χαρακτηριστικά σε συνδυασμό με το ότι έμβρυα είναι διάφανα, την καλά περιγεγραμμένη ανάπτυξη και την αποκωδικοποίηση του γονιδιώματος, το καθιστούν ιδανικό πειραματικό μοντέλο για πλήθος πεδίων στον τομέα της Βιολογίας. Η βιολογία των σπονδυλωτών έχει μελετηθεί εκτενώς χάρη στην ύπαρξη ειδών-μοντέλων στη Βιολογία, μεταξύ των οποίων κυρίαρχη θέση κατέχει το zebrafish, σε επίπεδο βασικής έρευνας και εφαρμοσμένης, με τη χρήση του να αυξάνεται αλματωσώς από τη δεκαετία του 1990 και μετά (Εικόνα 2.9-2). 60 Kingdom Animalia Subkingdom Bilateria Infrakingdom Deuterostomia Phylum Chordata Subphylum Vertebrata Infraphylum Gnathostomata Superclass Osteichthyes Class Actinopterygii Subclass Neopterygii Infraclass Teleostei Superorder Ostariophysi Order Cypriniformes Superfamily Cyprinoidea Family Cyprinidae Genus Danio Hamilton, 1822 Species Danio rerio (Hamilton, 1822) Εικόνα 2.9-3: Η συστηματική κατάταξη του zebrafish (Danio rerio) (από

63 3. ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟΔΟΙ Στο κεφάλαιο που ακολουθεί περιγράφεται αναλυτικά ο σχεδιασμός του πειράματος που ακολουθήθηκε για τη μελέτη της θερμο-εξαρτώμενης πλαστικότητας στο zebrafish, καθώς επίσης ο σχεδιασμός των δύο δευτερεύοντων πειραμάτων που πραγματοποιήθηκαν για τη μελέτη της επίδρασης της πληθυσμιακής πυκνότητας και της συνεπίδρασης θερμοκρασίας ανάπτυξης-φωτοπεριόδου, στη φαινοτυπική και οντογενετική πλαστικότητα του είδους. Περιγράφονται οι μέθοδοι που χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση των αποτελεσμάτων και την εκτροφή των πληθυσμών, ξεχωριστά για κάθε πείραμα. Η επίδραση της θερμοκρασίας ανάπτυξης στην οντογενετική και φαινοτυπική πλαστικότητα του zebrafish, Danio rerio στην παρούσα εργασία, περιλαμβάνει τις δύο επιμέρους οντογενετικές περιόδους που είχαν ελεγχθεί από τους Georga & Koumoundouros (2010) (Παράρτημα Ι). Προκειμένου να εξεταστεί η πιθανή αθροιστική δράση της θερμοκρασίας ανάπτυξης στη διαφοροποίηση του σχήματος του σώματος των ενήλικων ατόμων, πραγματοποιήθηκε μια συνδυαστική μελέτη των αποτελεσμάτων που προέκυψαν από αυτή την εργασία, σε συνδυασμό με τα αποτελέσματα που προέκυψαν από τη μελέτη των Georga & Koumoundouros (2010). Η μέθοδος της ανάλυσης που ακολουθήθηκε, περιλαμβάνεται στην παράγραφο «Μελέτη του τρόπου δράσης της θερμοκρασίας ανάπτυξης στην πλαστικότητα του zebrafish» του παρόντος Κεφαλαίου. Η δομή του Κεφαλαίου των έχει ως ακολούθως: Επίδραση της θερμοκρασίας ανάπτυξης στη φαινοτυπική και οντογενετική πλαστικότητα του zebrafish Πειραματικός Σχεδιασμός Δειγματοληψίες Δειγματοληψίες για τη μελέτη του ρυθμού αύξησης Δειγματοληψίες για τη μελέτη του χρονισμού της οντογένεσης Δειγματοληψίες για τη μελέτη του οντογενετικού προφίλ της γονιδιακής έκφρασης, για τη μελέτη της γονιδιακής έκφρασης στα ενήλικα άτομα και για τον προσδιορισμό της αναλογίας φύλου Απομόνωση ολικού RNA Ποσοτικός και ποιοτικός έλεγχος του απομονωμένου RNA Φωτομέτρηση Ηλεκτροφόρηση RNA σε πήκτωμα αγαρόζης Σύνθεση cdna Σχεδιασμός Εκκινητών Ποσοτική PCR Πραγματικού Χρόνου Quantitative Real Time PCR Μέθοδος ανάλυσης των αποτελεσμάτων της Quantitative Real Time PCR Η τεχνολογία των Nanostring Ανάλυση του σχήματος του σώματος των ενήλικων zebrafish - Γεωμετρική Μορφομετρία Έλεγχος της πιθανής αθροιστικής δράσης της θερμοκρασίας ανάπτυξης στο σχήμα του σώματος των ενήλικων zebrafish-συνδυαστική ανάλυση Σύσταση & εκτροφή των πειραματικών πληθυσμών 3.2. Επίδραση της πυκνότητας του πληθυσμού στη φαινοτυπική πλαστικότητα (σχήμα σώματος και αναλογία φύλου) του zebrafish Πειραματικός Σχεδιασμός Δειγματοληψίες Δειγματοληψίες για τη μελέτη του ρυθμού αύξησης

64 Δειγματοληψία για τον προσδιοριμό της αναλογίας φύλου Ανάλυση του σχήματος του σώματος των ενήλικων zebrafish-γεωμετρική Μορφομετρία Σύσταση & εκτροφή των πειραματικών πληθυσμών 3.3. Συνεπίδραση της θερμοκρασίας και της φωτοπεριόδου κατά την πρώιμη ανάπτυξη, στη φαινοτυπική και στην οντογενετική και πλαστικότητα του zebrafish Πειραματικός Σχεδιασμός Δειγματοληψίες Δειγματοληψίες για τη μελέτη του ρυθμού αύξησης Δειγματοληψία για τον προσδιορισμό της αναλογίας φύλου Δειγματοληψίες για τη μελέτη του χρονισμού της οντογένεσης 62

65 3.1. Επίδραση της θερμοκρασίας ανάπτυξης στη φαινοτυπική και οντογενετική πλαστικότητα του zebrafish Πειραματικός Σχεδιασμός 63 Το συγκεκριμένο πείραμα είχε ως σκοπό τη μελέτη της επίδρασης της θερμοκρασίας ανάπτυξης στην οντογενετική και φαινοτυπική πλαστικότητα του zebrafish, Danio rerio (Hamilton 1822). Η θερμοκρασία επέδρασε καθόλη τη διάρκεια του εμβρυικού και νυμφικού σταδίου, μέχρι και τη μεταμόρφωση (1 η dpf μέχρι ~14mm TL). Σύμφωνα με τον πειραματικό σχεδιασμό που ακολουθήθηκε (Εικόνα ), τρεις πληθυσμοί zebrafish υποβλήθηκαν σε τρεις διαφορετικές θερμοκρασίες ανάπτυξης (22, 28 και 32 C) από την πρώτη ημέρα μετά τη γονιμοποίηση, μέχρι το μέσο ολικό μήκος σώματος (TL) να φτάσει περίπου τα 14 mm (οπότε και έχει ολοκληρωθεί το στάδιο της μεταμόρφωσης και η διαφοροποίηση των γονάδων). Την πρώτη μέρα μετά τη γονιμοποίηση καθώς και μετά την λήξη της εφαρμογής των διαφορετικών θερμοκρασιακών συνθηκών, η ανάπτυξη πραγματοποιήθηκε σε κοινές συνθήκες (με τους πληθυσμούς να παραμένουν φυσικά διαχωρισμένοι) και σε θερμοκρασία 28±1 C. Το πείραμα πραγματοποιήθηκε εις διπλούν. T 1 =22 C T=28 C T 2 =28 C T=28 C T 3 =32 C T=28 C 2dpf TL 14mm TL 35-40mm Εικόνα : Σχηματική αναπαράσταση του πειραματικού σχεδιασμού. Τρεις πληθυσμοί zebrafish υποβλήθηκαν σε τρεις διαφορετικές θερμοκρασίες ανάπτυξης από τη δεύτερη ημέρα μετά τη γονιμοποίηση (day post fertilization-dpf), μέχρι το ολικό μήκος (ΤL) να φτάσει περίπου τα 14 mm. Την πρώτη μέρα μετά τη γονιμοποίηση καθώς και μετά την λήξη της εφαρμογής των διαφορετικών θερμοκρασιών, η ανάπτυξη πραγματοποιήθηκε σε κοινές συνθήκες (με τους πληθυσμούς να παραμένουν φυσικά διαχωρισμένοι) και σε θερμοκρασία 28±1 C. Το πείραμα πραγματοποιήθηκε εις διπλούν.

66 Δειγματοληψίες Κατά τη διάρκεια του πειράματος, από κάθε πειραματική συνθήκη και επανάληψη, λαμβάνονταν δείγματα προκειμένου να ελεγχθεί η επίδραση της θερμοκρασίας ανάπτυξης: Στην αναλογία φύλου των πειραματικών πληθυσμών Στο ρυθμό αύξησης των πειραματικών πληθυσμών Στο χρονισμό της οντογένεσης, εκτιμώντας το SL 50 όπου επιτελείται η ανάπτυξη ορισμένων μεριστικών χαρακτήρων Στη γονιδιακή έκφραση κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης (οντογενετικό προφίλ έκφρασης γονιδίων) και στα ενήλικα άτομα (σε ιστούς εγκεφάλου, μυών και γονάδων ενήλικων αρσενικών και θηλυκών zebrafish). Στο σχήμα του σώματος των ενήλικων αρσενικών και θηλυκών ατόμων zebrafish, 265 ημέρες μετά τη γονιμοποίηση, δηλαδή αρκετά μετά την εφαρμογή των διαφορετικών θερμοκρασιακών συνθηκών. Ο προσδιορισμός της αναλογίας φύλου έγινε Δειγματοληψίες για τη μελέτη του ρυθμού αύξησης Η πρώτη δειγματοληψία πραγματοποιήθηκε κατά την εκκόλαψη, η οποία έλαβε χώρα στις 3 dpf για τους 32 C, στις 4 dpf για τους 28 C και στις 5 dpf για τους 22 C. Η δεύτερη δειγματοληψία πραγματοποιήθηκε την ημέρα που οι νύμφες των zebrafish αποκολλήθηκαν από τα τοιχώματα των ενυδρείων και άρχισαν να κολυμπούν ενεργητικά. Ακολούθως, οι δειγματοληψίες πραγματοποιούνταν κάθε 3-5 ημέρες (Πίνακας 14, ). Σε κάθε περίπτωση γινόταν λήψη τυχαίου δείγματος 10 ατόμων, αναισθητοποίησή τους (ethynlenglycol-mono-phenylether, C 0,15-0,25ml/L), φωτογράφιση με ψηφιακή μηχανή (Canon PowerShot G9) σε στερεοσκόπιο και συντήρηση σε ρυθμιστικό διάλυμα φορμαλίνης 5% (Markle, 1984). Η φωτογράφιση και η συντήρηση ήταν πάντα ατομική. Από τις ατομικές φωτογραφίες αυτών των δειγμάτων προσδιορίστηκε το μήκος σώματος κάθε ατόμου (Εικόνα ) και στη συνέχεια το μέσο μήκος σώματος που είχε ο κάθε πειραματικός πληθυσμός την ημέρα της δειγματοληψίας (Πίνακας 14, ). Oι λήψεις ατομικών δειγμάτων συνεχίστηκαν μέχρι το μέσο μήκος σώματος κάθε πειραματικού πληθυσμού να φτάσει περίπου τα 14mm TL, οπότε ολοκληρώθηκε και η εφαρμογή των διαφορετικών θερμοκρασιακών συνθηκών. Μετέπειτα, τα άτομα παρέμειναν σε ξεχωριστά ενυδρεία, αλλά οι συνθήκες ανάπτυξης ήταν κοινές (28 C±1 C). Λόγω υψηλών ποσοστών επιβίωσης (και άρα αυξημένης πυκνότητας) στις θερμοκρασίες των 28 C και 32 C τα ψάρια χωρίστηκαν σε δύο υπο-ομάδες (π.χ. 28-Α1 και 28-Α2), προκειμένου να διατηρηθούν ευνοϊκές πυκνότητες για τη διεξαγωγή μιας ομαλής αναπτυξιακής πορείας. Μετά το τέλος της θερμοκρασιακής αγωγής ακολούθησαν φωτογραφίσεις δειγμάτων ψαριών από κάθε ενυδρείο, ανά 15 ημέρες, χωρίς παράλληλη συλλογή και συντήρηση ατόμων, τα οποία επανατοποθετούνταν στα ενυδρεία μετά τη\ο πέρας της διαδικασίας. Οι μετρήσεις του μήκους συνεχίστηκαν μέχρι τα 3,5 4 cm TL, τιμή που αντιστοιχεί στο τυπικό μήκος σώματος ενήλικων zebrafish. Το μήκος σώματος του κάθε ατόμου μετρήθηκε από τις ατομικές φωτογραφίες του, με τη βοήθεια του λογισμικού tpsdig (έκδοση 1.37, Bookstein 1991). Το μήκος που μετρήθηκε είναι το μήκος της νωτοχορδής (NL) και το ολικό μήκος σώματος (TL) - στα πρώτα στάδια της ζωής των zebrafish - και στη συνέχεια το τυπικό (SL) και το ολικό (ΤL) μήκος σώματος (Εικόνα ). Ο ρυθμός αύξησης κάθε πληθυσμού εκτιμήθηκε μετά από προσαρμογή

67 των πειραματικών δεδομένων στο μοντέλο αύξησης TL = a e SGR t (Ricker 1978). Όπου, TL, το ολικό μήκος σώματος. SGR= ln(tl)t 1 -ln(tl)t 0 Δt -1. Πρόκειται για τον «ειδικό ρυθμό αύξησης» (specific growth rate), ο οποίος ισούται με το φυσικό (νεπέριο) λογάριθμο (ln) του μέσου ολικού μήκους σώματος ΤL, τη χρονική στιγμή t 1, μείον το φυσικό λογάριθμο (ln) του μέσου ολικού μήκους σώματος ΤL, τη χρονική στιγμή t 0 (με t 1 >t 0 ). a, το ΤL τη χρονική στιγμή t=0. e, είναι ο αριθμός Euler (άρρητος αριθμός, ). t, ο χρόνος t 1 -t 0 (σε dpf). Για τη μελέτη της επίδρασης των διαφορετικών συνθηκών -για όλη την εξεταζόμενη περίοδο- χρησιμοποιήθηκε το γραμμικό μοντέλο αύξησης, μετά από λογαριθμοποίηση των τιμών του μήκους σώματος. Ο στατιστικός έλεγχος της επίδρασης της θερμοκρασίας στο ρυθμό αύξησης των πληθυσμών έγινε με ANCOVA (Stagraphics Plus v.5). 65 Total Length (TL) Notochord Length (NL) / Standard Length (SL) Standard Length (SL) Total Length (TL) Εικόνα : Σχηματική αναπαράσταση της θέσης των μορφομετρικών σημείων (1, 2 και 3) που χρησιμοποιήθηκαν για τη μέτρηση του μήκους της νωτοχορδής (NL, 1-2) του τυπικού (SL, 1-2) και του ολικού (ΤL, 1-3) μήκους σώματος νυμφών zebrafish, ιχθυδίων και ενήλικων ατόμων Δειγματοληψίες για τη μελέτη του χρονισμού της οντογένεσης Προκειμένου να μελετηθεί η επίδραση της θερμοκρασίας στο χρονισμό της οντογένεσης, εξετάστηκε η επίδραση της θερμοκρασίας στο SL όπου πραγματοποιείται η ανάπτυξη των ακόλουθων μεριστικών χαρακτήρων: 1. Ο αριθμός των πτερυγιοφόρων του εδρικού πτερυγίου 2. Ο αριθμός των πτερυγιοφόρων του ραχιαίου πτερυγίου 3. Οστεοποίηση του πρώτου πτερυγιοφόρου του εδρικού πτερυγίου 4. Οστεοποίηση του πρώτου πτερυγιοφόρου του ραχιαίου πτερυγίου 5. Ανάπτυξη του ουρόστυλου 6. Ανάπτυξη του πρώτου υπουραίου οστού 7. Ανάπτυξη του επουραίου οστού 8. Οστεοποίηση του επουραίου 9. Ανάπτυξη προραχιαίων 10. Ανάπτυξη των κοιλιακών πτερυγίων

68 Ο αρχικός στόχος ήταν να παρατηρηθεί η ανάπτυξη των εν λόγω δομών μέσω των ψηφιακών φωτογραφιών που χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό του ρυθμού αύξησης κάθε πειραματικού πληθυσμού. Αποδείχτηκε ότι μια τέτοια παρατήρηση δεν ήταν εφικτή, λόγω του ότι δεν παρείχε την απαιτούμενη ακρίβεια, οπότε προχωρήσαμε σε διπλή χρώση των συντηρημένων δειγμάτων με Αλιζαρίνη (Alizarin Red S) και Κυανό της Αλσατίας (Alcian Blue) (Εικόνα ), χρωστικές οι οποίες βάφουν τα οστά και τους χόνδρους αντίστοιχα. Τα δείγματα στη συνέχεια φωτογραφήθηκαν ατομικά και μέσω των ψηφιακών φωτογραφιών μετρήθηκε το τυπικό μήκος σώματος (SL) του κάθε ατόμου με τη βοήθεια του λογισμικού tpsdig (έκδοση 1.37, Bookstein 1991) (Πίνακας 2). Ακολούθησε η παρατήρηση των ψηφιακών φωτογραφιών και η μελέτη της ανάπτυξης των ζητούμενων δομών. Τα άτομα που χρησιμοποιήθηκαν για τη μελέτη ήταν κανονικά κατανεμημένα στην οντογενετική κλίμακα (1-4 άτομα ανά 0,5 mm μήκους σώματος), προκειμένου να έχουμε μια πλήρη οντογενετική σειρά. 66 Εικόνα : Νύμφες zebrafish ύστερα από διπλή χρώση με Αλιζαρίνη (Alizarin Red S) και Κυανό της Αλσατίας (Alcian Blue). Όπου μελετήθηκε η εμφάνιση ενός μεριστικού χαρακτήρα, μέσω των ψηφιακών φωτογραφιών, ελεγχθηκε η παρουσία / απουσία (1/0) του χόνδρου αυτού του χαρακτήρα. Όπου μελετήθηκε η οστεοποίηση κάποιου μεριστικού χαρακτήρα, μέσω των ψηφιακών φωτογραφιών, ελεγχθηκε η παρουσία / απουσία (1/0) οστίτη ιστού σε αυτό τον χαρακτήρα (με το χαρακτηριστικό κόκκινο χρώμα που δίνει το κόκκινο της Αλιζαρίνης). Τέλος, σε ό,τι αφορά στα πτερυγιοφόρα, πραγματοποιήθηκε καταμέτρηση αυτών καθόλη την εξεταζόμενη περίοδο. Η ανάπτυξη των πτερυγιοφόρων του εδρικού πτερυγίου ολοκληρώνεται όταν ο αριθμός τους φτάσει τα 13-15, ενώ ο αντίστοιχος αριθμός για τα πτερυγιοφόρα του ραχιαίου πτερυγίου φτάνει τα Έτσι, ειδικά για τα πτερυγιοφόρα, αρχικά προσδιορίστηκε το τυπικό μήκος στο οποίο η ανάπτυξη του συγκεκριμένου χαρακτήρα ολοκληρώνεται (φτάνει σε plateau). Για τα μεν πτερυγιογόρα του εδρικού, το plateau προσδιορίζεται όταν ο αριθμός τους φτάσει τα 13, για τα δε πτερυγιοφόρα του ραχιαίου το plateau προσδιορίζεται όταν ο αριθμός τους φτάσει τα 8. Όσα άτομα είχαν λιγότερα από 10 πτερυγιοφόρα εδρικού πτερυγίου, σημειώθηκαν ως άτομα στα οποία ο χαρακτήρας απουσιάζει (0), ενώ όσα έφεραν πτερυγιοφόρα σημειώθηκαν ως άτομα στα οποία η ανάπτυξη του εν λόγω χαρακτήρα έχει ολοκληρωθεί (1). Τα αντίστοιχα πραγματοποιήθηκαν και για τα πτερυγιοφόρα του ραχιαίου: Σημειώθηκε ότι η ανάπτυξη του χαρακτήρα έχει ολοκληρωθεί (1) όταν ο αριθμός των πτερυγιοφόρων ήταν από 8-10, ενώ σημειώθηκε απουσία του χαρακτήρα σε οποιαδήποτε περίπτωση τα πτερυγιοφόρα ήταν λιγότερα από 8.

69 Για την εξέταση της επίδρασης της θερμοκρασίας στο χρονισμό της οντογένεσης, εκτιμήθηκε το SL 50 όπου επιτελείται η ανάπτυξη των παραπάνω μεριστικών χαρακτήρων (Koumoundouros et al. 2001). Η μέθοδος για να πραγματοποιηθεί η παραπάνω εκτίμηση, βασίζεται στην παρουσία / απουσία (1/0) των εξεταζόμενων μεριστικών χαρακτήρων. Πρόκειται δηλαδή για μία περίπτωση κατά την οποία η (εξαρτημένη) μεταβλητή είναι δίτιμη (διακριτή μεταβλητή απόκρισης, η οποία παίρνει την τιμή 0 όταν απουσιάζει το χαρακτηριστικό και την τιμή 1 όταν υπάρχει το χαρακτηριστικό). Έτσι, καταγράφηκε σε έναν πίνακα, το τυπικό μήκος (SL) των ατόμων (ανεξάρτητη μεταβλητή) και σημειώθηκε η παρουσία / απουσία του κάθε μεριστικού χαρακτήρα με 1 / 0 (εξαρτημένη μεταβλητή). Επί αυτών των δεδομένων εφαρμόστηκε μια ειδική μορφή μη γραμμικής παλινδρόμησης (non linear estimation), η quick probit (probability+unit) regression. Μέσω αυτής υπολογίζονται οι παράμετροι Β 0 και B 1 της σχέσης Υ=ZCF(Β 0 + Β 1 X). Ο λόγος -Β 0 /Β 1, μας δίνει το μέσο SL 50 όπου επιτελείται η ανάπτυξη του εξεταζόμενου μεριστικού χαρακτήρα και ο λόγος 1/Β 1 μας παρέχει την τυπική απόκληση (SD). Για κάθε μεριστικό χαρακτήρα, ο στατιστικός έλεγχος των διαφορών μεταξύ των SL 50 των διαφορετικών θερμοκρασιακών συνθηκών έγινε με t-test (p<0,01). Η ανάλυση πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με την εργασία των Fuiman et al. (1998), όπου η μετάβαση από την απουσία, στην παρουσία του εκάστοτε μεριστικού χαρακτήρα, αποτελεί μια κανονική κατανομή. Αυτή η κανονική κατανομή ορίζεται από την περιοχή επικάλυψης των ατόμων που εμφανίζουν και δεν εμφανίζουν το εκάστοτε υπό μελέτη μεριστικό χαρακτήρα, και άρα από τον αριθμό των αντίστοιχων ατόμων, ο οποίος αποτέλεσε και το πλήθος των ατόμων που χρησιμοποιήθηκε κατά την εφαρμογή του t-test. Επίσης, για όλους τους εξεταζόμενους χαρακτήρες, υπολογίστηκε ο συντελεστής θερμοκρασίας Q 10, ο οποίος αντιπροσωπεύει το συντελεστή με τον οποίο αυξάνεται (ή μεταβάλλεται) ο ρυθμός (ή η ταχύτητα) μιας υπό διερεύνηση φυσιολογικής διεργασίας σε δύο διαφορετικές θερμοκρασίες Τ 1 και Τ 2, όπου η Τ 2 είναι μεγαλύτερη της Τ 1 κατά 10 C (Gillooly et al. 2001). O συντελεστής θερμοκρασίας Q 10, μπορεί να υπολογιστεί από μετρήσεις σε οποιεσδήποτε θερμοκρασίες, με τη χρήση της ακόλουθης εξίσωσης: Q 10 =(K 2 /K 1 ) 10/(T2-T1), όπου Κ 1 και Κ 2 η ταχύτητα (ή ο ρυθμός ή το μέτρο) με τον οποίο συμβαίνει μια φυσιολογική διεργασία σε θερμοκρασίες Τ 1 και Τ 2, αντίστοιχα (με Τ 1 <Τ 2 ). Πρέπει να σημειωθεί ότι οι θερμοκρασίες Τ 1 και Τ 2 δεν είναι απαραίτητο να διαφέρουν μεταξύ τους κατά 10 C προκειμένου να χρησιμοποιηθεί η εξίσωση. Βάζοντας όπου Κ 1 και Κ 2 το μέσο SL 50 όπου επιτελείται η ανάπτυξη του εκάστοτε εξεταζόμενου μεριστικού χαρακτήρα, στην αντίστοιχη θερμοκρασιακή συνθήκη, προσδιορίστηκε, σε κάθε περίπτωση, ο συνελεστής θερμοκρασίας Q 10. Εάν η προκύπτουσα τιμή του Q 10 ισούται με τη μονάδα, η μεταβολή είναι μηδενική (άρα το μελετούμενο φαινόμενο είναι ανεξάρτητο της θερμοκρασίας). Εάν έχουμε επιτάχυνση της εξέλιξης της βιολογικής διαδικασίας με αύξηση της θερμοκρασίας, τότε ο δείκτης Q 10 θα είναι μεγαλύτερος της μονάδας, και - ποσοστιαία - ίσος με (1-Q 10 )x100. Το αρνητικό πρόσημο που προκύπτει, δηλώνει επιβράδυνση του ρυθμού ολοκλήρωσης της ανάπτυξης του αντίστοιχου υπό μελέτη μεριστικού χαρακτήρα (δηλαδή μεγαλύτερο SL 50 ) κατά τη μετάβαση από τη χαμηλότερη στην υψηλότερη θερμοκρασία. 67

70 Δειγματοληψίες για τη μελέτη του οντογενετικού προφίλ της γονιδιακής έκφρασης, για τη μελέτη της γονιδιακής έκφρασης στα ενήλικα άτομα και για τον προσδιορισμό της αναλογίας φύλου Προκειμένου να μελετηθεί το οτογενετικό προφίλ της έκφρασης γονιδίων που σχετίζονται με το φυλοκαθορισμό, την ανάπτυξη, τη διαφοροποίηση και το μεταβολισμό και να συσχετιστεί με τη θερμοκρασία ανάπτυξης, πραγματοποιήθηκαν δειγματοληψίες νυμφών και ιχθυδίων zebrafish κατά τη διάρκεια της εφαρμογής των διαφορετικών θερμοκρασιακών συνθηκών. Παράλληλα, κρίθηκε απαραίτητη η μελέτη της ποσοτικής έκφρασης γονιδίων στις γονάδες, στους μύες και στον εγκέφαλο ενήλικων αρσενικών και θηλυκών zebrafish. Στόχος ήταν να γίνει σύγκριση της ποσοτικής έκφρασης των γονιδίων αυτών μεταξύ των ενήλικων θηλυκών και αρσενικών ατόμων zebrafish που αναπτύχθηκαν στις ίδιες θερμοκρασιακές συνθήκες, καθώς και μεταξύ ατόμων του ίδιου φύλου τα οποία όμως αναπτύχθηκαν σε διαφορετικές θερμοκρασιακές συνθήκες. Από τα δείγματα των ατόμων που λαμβάνονταν για τη μελέτη του ρυθμού αύξησης, προσδιοριζόταν κάθε φορά το μέσο μήκος του κάθε πειραματικού πληθυσμού. Όταν το μέσο μήκος προσδιορίστηκε στα 5-6mm TL, 8mm TL και 14mm TL, λήφθηκαν 50 επιπλέον άτομα και από τις δύο πειραματικές επαναλήψεις κάθε θερμοκρασιακής συνθήκης (22, 28 και 32 C), μαζί. Τα άτομα αυτά αναισθητοποιήθηκαν (ethynlenglycol-mono-phenylether, C 0,15-0,25ml/L), φωτογραφήθηκαν ατομικά (Canon PowerShot G9) σε στερεοσκόπιο και συντηρήθηκαν επίσης ατομικά και άμεσα, αρχικά σε υγρό άζωτο και στη συνέχεια στους -80 C. Συνολικά λοιπόν συντηρήθηκαν στους -80 C, 450 άτομα (150 από κάθε θερμοκρασιακή συνθήκη) (Παράρτημα ΙΙ). Η ταχεία και ατομική ψύξη των δειγμάτων σε υγρό άζωτο (-80 C) πραγματοποιείται προκειμένου να αποφευχθεί η δράση των ενδογενών RNA νουκλεασών. Τα δείγματα παρέμειναν αποθηκευμένα στους - 80 C μέχρι να ακολουθήσει η απομόνωση ολικού RNA. Στο κάθε ατομικό δείγμα δόθηκε ένας κωδικός έτσι ώστε να καθίσταται δυνατή η εύρεση του συγκεκριμένου ψαριού με το δεδομένο μήκος, όπως αυτό μετρήθηκε μέσω των ψηφιακών φωτογραφιών και με τη βοήθεια του λογισμικού tpsdig (έκδοση 1.37, Bookstein 1991). Τα άτομα από τα οποία απομονώθηκε ολικό RNA με στόχο να μελετηθεί η γονιδιακή έκφραση, επιλέχθηκαν κατά τέτοιο τρόπο ώστε να έχουμε μια πλήρη οντογενετική σειρά με κανονική κατανομή (2 άτομα ανά ~1mm μήκους σώματος), για κάθε θερμοκρασιακή συνθήκη (Πίνακας 2). Η ποσοτικοποίηση της γονιδιακής έκφρασης και η δημιουργία του οντογενετικού της προφίλ, πραγματοποιήθηκε με την τεχνολογία των Nanostring ( 3.1.9). Στις 265 dpf, τα ενήλικα πλέον zebrafish από κάθε πειραματική συνθήκη αναισθητοποιήθηκαν (ethynlenglycol-mono-phenylether, C 0,15-0,25ml/L), φωτογραφήθηκαν ατομικά (Canon PowerShot G9) ζυγίστηκαν (0,001g) και στη συνέχεια θυσιάστηκαν (Πίνακας 3). Από 6-14 άτομα ανά φύλο, από κάθε πειραματική συνθήκη και επανάληψη, απομονώθηκε με ανατομία ο εγκέφαλος, οι γονάδες και σωματικοί μύες (Πίνακας 3). Οι ιστοί αυτοί τοποθετήθηκαν σε υγρό άζωτο, μεμονωμένα, σε κατάλληλα κωδικοποιημένα φιαλίδια (cryovials). Μέσω των ψηφιακών φωτογραφιών μετρήθηκε το τυπικό και ολικό μήκος (SL, ΤL) του κάθε ατόμου με τη βοήθεια του λογισμικού tpsdig (έκδοση 1.37, Rohlf 1996). Απομονώθηκε ολικό RNA από 6-8 δείγματα των παραπάνω ιστών, ανά φύλο και ανά πειραματική συνθήκη. Η ποσοτικοποίηση της γονιδιακής έκφρασης σε αυτούς τους ιστούς έγινε με Real Time q-rt PCR. Σε αυτή τη δειγματοληψία προσδιορίστηκε και η αναλογία φύλου των πληθυσμών zebrafish που αναπτύχθηκαν σε διαφορετικές θερμοκρασιακές συνθήκες. Το φύλο τους προσδιορίστηκε μακροσκοπικά (από το ογκώδες σφαιρικό σχήμα της κοιλιακής περιοχής των θηλυκών και το τορπιλοειδές σχήμα των αρσενικών ατόμων) και 68

71 επιβεβαιώθηκε με παρατήρηση των γονάδων στο στερεοσκόπιο (Georga & Koumoundouros 2010). Πίνακας 1: Σε κάθε έναν από τους πειραματικούς πληθυσμούς (Τ=22, 28 και 32 C), όταν το μέσο μήκος προσδιορίστηκε στα 5-6 mm TL, 8 mm TL και 14mm TL, λήφθηκαν 50 άτομα από κάθε συνθήκη (και από τις δύο πειραματικές επαναλήψεις (A & B) τα οποία φωτογραφήθηκαν ατομικά και συντηρήθηκαν, επίσης ατομικά, αρχικά σε σε υγρό άζωτο και στη συνέχεια στους -80 C. Τα άτομα αυτά προορίστηκαν για τη μελέτη της επίδρασης της θερμοκρασίας ανάπτυξης στο οντογενετικό προφίλ της γονιδιακής έκφρασης. Σε κάθε άτομο δόθηκε ένας κωδικός αριθμός (D1-D450). Από τις ατομικές φωτογραφίες προσδιορίστηκε το μήκος σώματος του κάθε ατόμου, ενώ μέσω του κωδικού ήταν δυνατή η εύρεση του συγκεκριμένου ψαριού με το δεδομένο μήκος, προκειμένου να ακολουθήσει η απομόνωση ολικού RNA από αυτό και η ποσοτικοποίησητης έκφρασης των υπό εξέταση γονιδίων. D1-D450, οι κωδικοί των ατόμων. N, το πλήθος των ατόμων. TL±SD, το μέσο ολικό μήκος των ατόμων του κάθε δείγματος, σε mm. (Η λίστα των 450 ατόμων περιλαμβάνεται στο Παράρτημα ΙΙ-Β). 69 Codes Ν T ( C) mean TL ± SD (mm) D A 5,85±0,51 D B 5,71±0,45 D A 6,03±0,48 D B 6,11±0,48 D A 5,19±0,35 D B 5,83±0,45 D A 8,24±1,22 D B 8,61±1,66 D A 8,15±0,75 D B 8,29±0,87 D A 8,81±0,54 D B 9,16±0,50 D A 12,90±2,67 D B 13,70±2,57 D A 16,18±2,03 D B 15,39±2,43 D A 12,17±0,99 D B 12,68±0,98

72 Πίνακας 2: Το μήκος της νωτοχορδής (NL), το τυπικό μήκος (SL) και το ολικό (TL) μήκος των zebrafish από τα οποία απομονώθηκε ολικό RNA, με στόχο τη μελέτη του οντογενετικού προφίλ της γονιδιακής έκφρασης στις τρεις θερμοκρασίες ανάπτυξης (Τ=22, 28 και 32 C). Δίνεται η συγκέντρωση του RNA (C, ng/λ) για το κάθε δείγμα, όπως προσδιορίστηκε μετά από φωτομέτρηση. Με πλάγια, γκρι χρώμαtος, γράμματα δίνονται οι μετρήσεις NL. Nr Τ ( C) / rep. C (ng/λ) NL/SL (mm) TL (mm) Nr Τ ( C) / rep. C (ng/λ) NL/SL (mm) TL (mm) 19 32A 148 5,1 5, B 236 5,8 6, A 132 5,4 5, B 644 6,5 7, A 128 5,7 6, B 320 6,6 7, A 268 6,2 7, B 436 6,6 7, A 280 6,6 7, B 376 6,8 7, A 388 6,9 7, B 512 6,8 7, A 624 8,1 9, B 312 7,2 8, A 732 8,9 10, B 652 7,3 8, A 512 9,5 10, B 328 7,6 8, A 824 9,4 10, B 440 7,9 8, A ,3 11, B 648 8,2 9, A 80 10,5 12, B 396 8,8 10, A ,6 12, B 260 8,8 10, A ,2 12, B ,6 13, A ,2 13, B ,9 13, B 64 4,9 5, A ,0 13, B 96 5,1 5, B 560 5,1 5, B 316 5,5 6, B 132 5,5 6, B 196 5,7 6, B 116 6,0 6, B 480 6,7 7, B 540 7,9 9, B 468 7,2 8, A 504 8,3 9, B 444 7,6 8, B 600 8,5 9, B 580 8,0 9, B 180 8,1 9, B 500 8,4 9, B 496 7,7 8, B ,0 10, A 80 9,4 11, A ,3 10, B ,9 11, A ,1 11, B ,3 11, B ,6 12, B ,8 12, B ,0 12, B ,5 12, B 80 11,5 13, B ,0 11, B ,8 13, B ,3 13, B 80 12,1 13, B ,6 14, A 212 4,6 5, A 156 4,7 5, A 436 5,3 5, A 152 5,0 5, A 288 5,4 6, B 100 5,7 6, A 268 5,7 6, A 196 7,0 7, A 472 6,0 6, A 292 7,5 8, B 80 8,3 7, A 344 7,8 8, A 384 6,5 7, A 400 7,9 9, A 444 6,9 7, A 432 8,3 9, A 488 7,5 8, B 80 11,3 13, A 900 8,3 9, A ,8 11, A 548 8,3 9, A ,0 11, B ,5 12, A ,6 12, A ,3 13, A ,8 12, A ,0 14, A 80 11,4 13, B 208 5,0 5, A ,6 13, B 172 5,4 5, B 80 10,6 12,6 70

73 Πίνακας 3: Στις 265 dpf, πραγματοποιήθηκε δειγματοληψία στην οποία απομονώθηκαν δείγματα εγκεφάλου (Βr), μυών (Μs) και γονάδων (Gn) από τα ενήλικα αρσενικά (M) και θηλυκά (F) zebrafish κάθε πειραματικής συνθήκης (22, 28 και 32 C) και επανάληψης (Α και Β). Τα δείγματα τοποθετήθηκαν μεμονωμένα σε κατάλληλα κωδικοποιημένα φιαλίδια (cryovials). 6-8 δείγματα των παραπάνω ιστών, ανά φύλο και ανά πειραματική συνθήκη, χρησιμοποιήθηκαν για τη μελέτη της ποσοτικής έκφρασης γονιδίων που σχετίζονται με το φυλοκαθορισμό του είδους και την ανάπτυξη. Παραθέτονται οι λίστες των δειγμάτων. Αναγράφεται το φύλο (sex), ο αύξοντας αριθμός (Nr) του εκάστοτε ατόμου (όπως προσδιορίστηκε κατά τη δειγματοληψία), και το βάρος του (weight). Η μαύρη κουκίδα υποδηλώνει την ύπαρξη δείγματος, ενώ τα κενά κελιά αντιστοιχούν στις περιπτώσεις που υπήρχε αδυναμία απομόνωσης του αντίστοιχου ιστού. 71 T ( C)/rep Sex Br Ms Gn Nr Weight (mg) T ( C)/rep Sex Br Ms Gn Nr Weight (mg) 22Α Μ B M Α Μ B M Α Μ B M Α Μ B M Α Μ B M Α Μ B M Α Μ B M Α Μ B M A M B M A M B M A M B M A M B M A M B M A M B M A M B M A M B M A M B M A M B M A M B M A M B M A M B M A M B M A M B M A M B F A M B F A F B F A F B F A F B F A F B F A F B F A F B F A F B F A F B F A F B F A F B F A F B F A F B F A F B F A F B F A F B F A F B F A F B F A F B F B M B F B M B F B M B F B M B F B M B F B M B F B M

74 Απομόνωση ολικού RNA Ολικό RΝΑ απομονώθηκε ατομικά από τον εγκέφαλο, τις γονάδες και τους μύες 6-8 θηλυκών και 6-8 αρσενικών ενήλικων zebrafish (από τα άτομα του Πίνακα 3), καθώς και από τις νύμφες και τα ιχθύδια zebrafish του Πίνακα 2, προκειμένου να ακολουθήσει η μελέτη της γονιδιακής έκφρασης με τη μέθοδο της Real Time Q-PCR και τη τεχνολογία των Nanostring. Ένθετο 1 Πρωτόκολλο απομόνωσης ολικού RNA 1. Προσθήκη 250, 500 ή 1000μl Tripure (ανάλογα με το βάρος του ιστού, 1 ml Tripure ανά mg ιστού) και ανάμιξη μέχρι πλήρους ομογενοποίησης των δειγμάτων. 2. Τοποθέτηση του ομογενοποιημένου δείγματος σε φιαλίδιο eppendorf (όγκου 1,5ml). 3. Επώαση για 5-10min σε θερμοκρασία δωματίου. 4. Προσθήκη 2μl Glycogen (5μg / μl) και 50, 100 ή 200μl χλωροφορμίου (CHCl 3 ). 5. Aνάμιξη με μηχανική ανάδευση (vortex) για περίπου 30sec. 6. Επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για περίπου 15min. 7. Φυγοκέντρηση των δειγμάτων στους 4 C στα 10700rpm (12000g) για 15min. 8. Μεταφορά της υπερκείμενης υδατικής φάσης (περιέχει το RNA) σε νέο φιαλίδιο eppendorf (όγκου 1,5ml). οργανική φάση περιέχεται DNA και πρωτεΐνες. 9. Προσθήκη ίσου όγκου (125, 250 ή 500μl) ισοπροπανόλης [CH 3 CH(OH)CH 3 ]. 10. Τοποθέτηση στους -20 C για 30min. 11. Φυγοκέντρηση στους 4 C στα 10700rpm (12000g) για 10min και απόρριψη του υπερκείμενου. 12. Προσθήκη 250, 500 ή 1000μl αιθανόλης (CH 3 CH 2 ΟΗ) 75% και έντονη μηχανική ανάδευση (vortex). 13. Φυγοκέντρηση στους 4 C στα 8400rpm (7500g) για 5min. Στη βάση του σωλήνα υπάρχει ίζημα υπόλευκου χρώματος το οποίο περιέχει το απομονωμένο RNA δεσμευμένο από το γλυκογόνο. Απορρίπτεται το υπερκείμενο, ενώ το ίζημα διαλύεται σε 50μl νερού DΕPC. 14. Διατήρηση του δείγματος στους -80 C. 72 Προσαρμογές στο πρωτόκολλο, ανάλογα με τις ανάγκες που προέκυψαν. Ειδικά για τους μύες, μετά από απομονώσεις που δεν έδιναν καλό ή αρκετό RNA, προστέθηκε ένα επιπλέον βήμα, αμέσως μετά την ομογενοποίηση με Tripure: Φυγοκέντρηση στους 4 C στα 10700rpm (12000g) για 10min. Στη συνέχεια το υπερκείμενο μεταφερόταν σε νέο φιαλίδιο eppendorf (όγκου 1,5ml) ενώ το προκύπτον ίζημα (το οποίο περιείχε αδιάλυτα συστατικά, όπως λιπίδια και πρωτεΐνες) απομακρυνόταν. Ακολουθούσαν τα βήματα 4-13, όπως περιγράφονται παραπάνω. Για την απομόνωση του ολικού RNA χρησιμοποιήθηκε το Tripure Isolation Reagent (Roche). Η ομογενοποίηση των δειγμάτων με Tripure Isolation Reagent προκαλεί τη (χημική) λύση των κυττάρων, ενώ παράλληλα αδρανοποιούνται οι ριβονουκλεάσες και προφυλάσσεται έτσι η ακεραιότητα του απομονωμένου RNA. Ειδικά για τους μύες, προηγούνταν μηχανική λειοτρίβιση με υγρό άζωτο, μέχρι ο ιστός των μυών να κονιορτοποιηθεί πλήρως. Η ποσότητα του Tripure που χρησιμοποιείται κατά την ομογενοποίηση, εξαρτάται από την ποσότητα του ιστού. Εφαρμόστηκε το προτεινόμενο από την εταιρία πρωτόκολλο, με κάποιες μικρές τροποποιήσεις (Ένθετο 1). Η ποσότητα και η καθαρότητα του απομονωμένου RNA προσδιορίστηκε με φωτομέτρηση στα 260, 280 και 230nm. Η ποιότητά του προσδιορίστηκε με ηλεκτροφόρηση. Την απομόνωση του ολικού RNA, ακολούθησε ο ποσοτικός και ποιοτικός έλεγχός του και στη συνέχεια η σύνθεση cdna.

75 Ποσοτικός και ποιοτικός έλεγχος του απομονωμένου RNA Φωτομέτρηση Η καθαρότητα του απομονωμένου RNA εκτιμήθηκε με φωτομέτρηση των δειγμάτων στα 260 και 280nm. Ο λόγος της οπτικής πυκνότητας στα 260nm προς την οπτική πυκνότητα στα 280nm μας δίνει τη δυνατότητα εκτίμησης της καθαρότητας του απομονωμένου RNA. Όταν ο λόγος αυτός είναι μεταξύ 1,7-2, η ποιότητα του απομονωμένου RNA είναι ικανοποιητική έως καλή προκειμένου να ακολουθήσουν αναλύσεις Real Time PCR. Επιπλέον, λαμβάνοντας υπόψη ότι στα 260nm η οπτική πυκνότητα 40μg /ml RNA είναι ίση με 1, μέσω της φωτομέτρησης προσδιορίζεται η ποσότητα του απομονωμένου RNA. Η διαδικασία της φωτομέτρησης περιλαμβάνει τα ακόλουθα βήματα: 1. Περίπου 250μl νερού DEPC φωτομετρούνται στα 260nm (μηδενισμός του φωτομέτρου τυφλό διάλυμα) 2. Λήψη 5μl δείγματος και αραίωση σε DEPC νερό μέχρι τελικού όγκου 250μl. 3. Τοποθέτηση του αραιωμένου δείγματος στην κυψελίδα και φωτομέτρηση σε φασματοφωτόμετρο υπεριώδους ορατού στα 260nm. 4. Υπολογισμός του λόγου 260nm/280nm για την εκτίμηση της καθαρότητας του εκάστοτε δείγματος. 5. Υπολογισμός της συγκέντρωσης του απομονωμένου RNA (σε μg/ml), βάσει του τύπου ABS (260nm) x 40μg/ml x dilution factor [dilution factor=αναλογία του τελικού όγκου του δείγματος μετά την αραίωση (250μl), προς τον όγκο του δείγματος (5μl) που χρησιμοποιήθηκε για να γίνει η φωτομέτρηση] Ηλεκτροφόρηση RNA σε πήκτωμα αγαρόζης Από κάθε δείγμα, χρησιμοποιήθηκε μικρή ποσότητα RNA (περίπου 500ng) προκειμένου να ηλεκτροφορηθεί για να διαπιστωθεί η ακεραιότητα του απομονωμένου RNA (σε πηκτώματος περιεκτικότητας σε αγαρόζη περίπου 0,9%). Η ηλεκτροφόρηση είναι μία διαδικασία που χρησιμοποιείται για το διαχωρισμό μορίων πρωτεϊνών και νουκλεϊκών οξέων. Τα μόρια των νουκλεϊκών οξέων κινούνται με διαφορετικές ταχύτητες μέσα σε ένα ηλεκτρικό πεδίο και σε κατάλληλες συνθήκες διαχωρίζονται. Η ταχύτητα αυτή εξαρτάται από το ηλεκτρικό τους φορτίο, το μέγεθος και το σχήμα τους. Ο διαχωρισμός των (γραμμικών) και αρνητικά φορτιμένων μορίων RNA είναι ανάλογος με το μέγεθος των μορίων. Τα μικρά τμήματα κινούνται γρηγορότερα από τα μεγάλα. Τα μόρια αυτά γίνονται ορατά με τη χρήση βρωμιούχου αιθιδίου, χρωστική η οποία φθορίζει παρουσία υπεριώδους ακτινοβολίας. Αναλυτικά ή διαδικασία έχει ως εξής: Σε 40ml δις απεσταγμένο νερό διαλύονται (με θέρμανση σε φούρνο μικροκυμάτων) 0,5gr αγαρόζης. Το διάλυμα αφήνεται για 5min σε θερμοκρασία δωματίου και στη συνέχεια προστίθενται σε αυτό 5ml MOPS 10x και 9ml φορμαλδεΰδης. Ύστερα από ανάδευση, το διάλυμα της αγαρόζης τοποθετείται στη μήτρα της συσκευής ηλεκτροφόρησης και αφήνεται σε σταθερό μέρος και σε θερμοκρασία δωματίου προκειμένου να πήξει. Στη μήτρα έχει προηγουμένως τοποθετηθεί κατάλληλη χτένα προκειμένου να σχηματιστούν οι οπές φόρτωσης (πηγαδάκια) των δειγμάτων στο πήκτωμα. Μετά την πήξη του διαλύματος αγαρόζης, αφαιρείται προσεχτικά η χτένα και η μήτρα βυθίζεται στη συσκευή ηλεκτροφόρησης, στην οποία έχει προστεθεί διάλυμα MOPS 1x (τόσο

76 ώστε το πήκτωμα να είναι εξολοκλήρου βυθισμένο στο διάλυμα). Σε 9μl δείγματος (τα οποία περιέχουν την απαραίτητη ποσότητα RNA) προστίθενται 9μl sample cocktail 2x (περιέχει το βρωμιούχο αιθίδιο). Σε κάθε πηγαδάκι τοποθετούνται τα 18μl δείγματος με το sample cocktail, αφού προηγουμένως έχουν αφεθεί για 5min σε υδατόλουτρο C, προκειμένου τα μόρια RNA να γίνουν γραμμικά (να ανοίξουν τα δίκλωνα τμήματα που έχουν τυχόν σχηματιστει). Σε ένα πηγαδάκι τοποθετούνται 18ml διαλύματος χρωστικής - δείκτης της ταχύτητας των. Δύο ηλεκτρόδια συνδέονται με τη συσκευή της ηλεκτροφόρησης και το τροφοδοτικό. Η τάση ρυθμίζεται στα Volt για 30-40min. Μετά από αυτό το χρονικό διάστημα, το πήκτωμα αγαρόζης τοποθετείται σε συσκευή εκπομπής υπεριώδους ακτινοβολίας και - λαμβάνοντας της απαραίτητες προφυλάξεις - παρατηρούνται οι ζώνες του RNA που έχουν διαχωριστεί κατά την ηλεκτροφόρηση. Το πήκτωμα φωτογραφείται ώστε να μπορεί να καθίσταται δυνατή η παρατήρηση των ζωνών που έχουν διαχωριστεί. 74 Εικόνα : Η ποιότητα του ολικού RNA που απομονώθηκε από τον εγκέφαλο, τους μύες και τις γονάδες των ενήλικων αρσενικών και θηλυκών zebrafish, καθώς και από τις νύμφες και τα ιχθύδια zebrafish, ελέγχθηκε ύστερα από ηλεκτροφόρηση μιας μικρής σε κάθε περίπτωση - ποσότητας αυτού. Με την μέθοδο απομόνωσης RNA που ακολουθήθηκε, επιτυγχάνεται η απομόνωση όλων των μορίων RNA (28S και 18S, καθώς επίσης 5,8S rrna, 5S rrna) Σύνθεση cdna Την απομόνωση του ολικού RNA, ακολούθησε η σύνθεση cdna με την αντίστροφης μεταγραφής αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction, RT-PCR), μέθοδος που αποτελεί μια παραλλαγή της κλασσικής PCR. Με την αντίδραση της αντίστροφης μεταγραφής (reverse transcription) γίνεται η in vitro σύνθεση cdna (complementary DNA ή copy DNA) αλληλουχιών, έχοντας ως μήτρα μια αλυσίδα RNA (mrna). Η αντίδραση καταλύεται από το ένζυμο αντίστροφη μεταγραφάση (reverse transcriptase). Με την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) το cdna πολλαπλασιάζεται in vitro σε διάλυμα πολυμεράσης, δεοξυριβονουκλεοτιδίων (dntps - dgtp, dctp, datp, dttp) και εκκινητών. Το είδος των εκκινητών που χρησιμοποιείται (oligo-dt, sequence-specific, random primers), εξαρτάται από το προϊόν που θέλουμε να πάρουμε. Επαναλαμβανόμενοι κύκλοι (30-40) 3 βασικών βημάτων (αποδιάταξη του δίκλωνου DNA denaturation, υβριδισμός των εκκινητών primer annealing και σύνθεση συμπληρωματικών κλώνων primer extension) (Εικόνα ) οδηγούν στη σύνθεση πανομοιότυπων μορίων cdna. Το DNA είναι πιο σταθερό μόριο από το RNA (το οποίο μπορεί εύκολα να αποικοδομηθεί παρουσία RNase ενζύμων), για αυτό και προτιμάται κατά τη μελέτη της έκφρασης γονιδίων με τη μέθοδο της Real Time PCR. Σε κάθε ένα από τα δείγματα RNA εφαρμόστηκε η PCR με αντίστροφη μεταγραφή και το παραγόμενο συμπληρωματικό DNA (cdna) χρησιμοποιήθηκε για τις αναλύσεις γονιδιακής έκφρασης με

77 τη Real Time PCR. Χρησιμοποιήθηκαν τα τυποποιημένα αντιδραστήρια της TaKaRa [PrimeScript RT reagent Kit (Perfect real Time)-TAKARA BIO INC.]. Πίνακας 4: Συστατικά που χρησιμοποιήθηκαν για την κατασκευή του cdna και για τον πολλαπλασιασμό της κάθε αλληλουχίας, καθώς και η συγκέντρωση αυτών (ανά δείγμα RNA). Χρησιμοποιήθηκαν τα τυποποιημένα αντιδραστήρια της TaKaRa [PrimeScript RT reagent Kit (Perfect real Time)-TAKARA BIO INC.]. Reaction components Volume (μl) i. 5x PrimeScript Buffer (for Real Time) 4 ii. PrimeScript RT Enzyme Mix I 1 iii. Oligo dt Primers (50 μμ) 1 iv. Random 6 mers (100 μμ) 1 v. Total RNA X μl (500ng) vi. Rnase free dh20 Up to 20 μl 75 Πίνακας 5: Τα βήματα της Reverse Transcription PCR, για τη σύνθεση cdna. Step Temperature Time 1. Reverse transcription 37 C min 2. Inactivation of RTase 85 C min 3. cdna synthesis 4. Denaturation 94 C 1min 5. Annealing 54 C 45sec 6. Extension 72 C 2min cycles of step 4 to 6 8. Reaction termination 85 C min 9. Cooling of the sample 4 C Εικόνα : Στη PCR, το είδος των εκκινητών που χρησιμοποιείται (oligo-dt, sequence-specific, random primers), εξαρτάται από το προϊόν που θέλουμε να πάρουμε (

78 76 Εικόνα : Στάδια μιας PCR. Με την PCR καθίστατι δυνατός ο εκθετικός πολλαπλασιασμός αλληλουχιών DNA. Στην Reverse Transcription PCR το DNA (cdna) προέρχεται απο την αντίστροφη μεταγραφή ενός μονόκλωνου mrna. Η μέθοδος της PCR βασίζεται στην πραγματοποίηση διαδοχικών κύκλων αντιγραφής του DNA (30-40) που ξεκινούν από διάφορες θέσεις μιας μήτρας DNA (με τη χρήση τυχαίων εκκινητών). Κάθε κύκλος αντιγραφής αποτελείται από τα εξής 3 στάδια: (1) Αποδιάταξη της μήτρας DNA (Denaturation, 94 C). (2) Υβριδοποίηση των εκκινητών στις συμπληρωματικές προς αυτούς αλληλουχίες (Annealing, C, ανάλογα με τους χρησιμοποιούμενους εκκινητές και την αντίδραση). (3) Επιμήκυνση των εκκινητών και σύνθεση DNA με κατεύθυνση 5' 3', με τη βοήθεια της DNA πολυμεράσης (Extension, 72 C). ( Σχεδιασμός Εκκινητών Η ποσοτικοποίηση της γονιδιακής έκφρασης στους ιστούς πραγματοποιήθηκε με τη μέθοδο της Real Time Q-PCR, ενώ στις νύμφες και τα ιχθύδια (μελέτη του οντογενετικού προφίλ της γονιδιακής έκφρασης) με τη τεχνολογία των Nanostring. Στο παρόν κεφάλαιο περιγράφεται η διαδικασία σχεδιασμού των εκκινητών για τα γονίδια που εξετάστηκαν στους ιστούς. Στο κεφάλαιο περιγράφεται η διαδικασία που ακολουθήθηκε για τη μελέτη της γονιδιακής έκφρασης κατά την οντογένεση, με την τεχνολογία των Nanostring, καθώς και τα γονίδια που μελετήθηκαν σε αυτή την περίπτωση. Στους απομονωμένους ιστούς (εγκέφαλος, γονάδες, μύες) των ενήλικων αρσενικών και θηλυκών zebrafish, ποσοτικοποιήθηκε η έκφραση των ακόλουθων γονιδίων: igf, npy και cyp19a1b στον εγκέφαλο, figlα, dmrt1, ar, bmp15, cyp19a1a και gdf9 στις γονάδες, myogenin, myostatin και troponin-tnni2a.3 στους μύες (Πίνακας 6 και Πίνακας 7). Ως γονίδιο αναφοράς (house-keeping gene) χρησιμοποιήθηκε η bactin (McCurley & Callard, 2008) (Πίνακας 6 και Πίνακας 7). Προκειμένου να πραγματοποιηθεί η ποσοτικοποίηση της έκφρασης των παραπάνω γονιδίων, απαιτείται η χρήση κατάλληλων εκκινητών. Σε ό,τι αφορά στα γονίδια που σχετίζονται με το φυλοκαθορισμό ar, sox9a, cyp19a1a, cyp19a1b, dmrt1a και figla,

79 χρησιμοποιήθηκαν εκκινητές (primers) από τη δημοσίευση των Jørgensen et al. (2008). Για το σχεδιασμό των εκκινητών των υπόλοιπων γονιδίων (igf1, npy, bmp15, gdf9, myogenin, myostatin), καθώς και για το γονίδιο αναφοράς (bactin), έγινε αναζήτηση στη βάση δεδομένων (NCBI) των αντίστοιχων αλληλουχιών, για το είδος Danio rerio. Οι αλληλουχίες που βρέθηκαν, χρησιμοποιήθηκαν με το πρόγραμμα Primer-BLAST (NCBI) για το σχεδιασμό των ειδικών - για κάθε γονίδιο εκκινητών (Πίνακας 6 και Πίνακας 7). Για το σχεδιασμό των εκκινητών λήφθηκαν υπόψη οι εξής παράμετροι: Η αλληλουχία στόχος να μην ξεπερνά τα ζεύγη βάσεων, τα Tm s (melting temperature) των primers να βρίσκονται μεταξύ των C και μεταξύ του κάθε ζεύγους primers (forward και reverse) να παρεμβάλλεται αλληλουχία εσωνίου. Τέλος, αποφεύχθηκαν περιοχές με πολυπουρίνες ή πολυπυριμιδίνες, καθώς και περιοχές με επαναλήψεις νουκλεοτιδίων. 77 Πίνακας 6: Στους ιστούς (εγκέγαλος, γονάδες και μύες) των ενήλικων αρσενικών και θηλυκών zebrafish, ποσοτικοποιήθηκε η έκφραση των γονιδίων που αναγράφονται στον παρακάτω πίνακα, με τη μέθοδο της real time Q-PCR. Δίνεται το πλήρες όνομα των γονιδίων, καθώς και κωδικός (accession number) από NCBI. Gene Complete name NCBI bactin actin, beta 1 ΝΜ_ ar androgen receptor EU dmrt1 doublesex and mab-3 related transcription factor 1, transcript variant 1 NM_ sox9a SRY-box containing gene 9a NM_ cyp19a1a cytochrome P450, family 19, subfamily A, polypeptide 1a NM_ cyp19a1b cytochrome P450, family 19, subfamily A, polypeptide 1b ΝΜ_ figla factor in the germline alpha NM_ bmp15 bone morphogenetic protein 15 ΝΜ_ gdf9 growth differentiation factor 9 BC igf1 insulin-like growth factor 1 NM_ npy neuropeptide Y ΝΜ_ myog myogenin NM_ mstn myostatin AY tnni2a.3 troponin I, skeletal, fast 2a.3 ΝΜ_ Πίνακας 7: Οι αλληλουχίες των εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν για τη μελέτη της έκφρασης των γονιδίων IGF1, NPY, cyp19a1b, BMP15 (στον εγκέφαλο), figlα, dmrt1, ar, BMP15, cyp19a1a, GDF9 (στις γονάδες) και myogenin, myostatin, troponin (στους μύες) στα ενήλικα αρσενικά και θηλυκά άτομα zebrafish. Οι πρώτοι πέντε εκκινητές (με γκρί γραμματοσειρά) προέρχονται από τη δημοσίευση των Jørgensen et al. (2008), ενώ οι υπόλοιποι σχεδιάστηκαν από την ομάδα του εργαστηρίου. Όπου Τ ( C), η θερμοκρασία υβριδοποίησης των εκκινητών κατά τη διεξαγωγή των αντιδράσεων Real Time qpcr. Primer Amplicon Τ( C) Sense primer 5'-3' Antisense primer 5'-3' bactin 137nt 60 GGCACGAGAGATCTTCACTCCCCTT ACGAGGGGCATCATCTCCAGCA ar 242nt 59 AGCAGCAGCACCACTACCA TTCCTTCCTGCCTCTCGTTC sox9a 719nt 60 CGGTGAAGAACGGCCAGAGC CTGTAGAGTCAGCAATGGGT cyp19a1b 230nt 60 AACATTGGACGCATGCATAA TGTTTGATGGTGCTGATGGT dmrt1a 151nt 60 ATGGCAGAGCAGAACGATTT TAGTCCCACAACAGCATGGA cyp19a1a 131nt 60 AGATGTCGAGTTAAAGATCCTGCA CGACCGGGTGAAAACGTAGA figla 130nt 60 TGCGGGTGAGGAGCCTGAACA TGTACTGGGTTGCAGCCTTCAGCA igf1 142nt 61 TGCGGGGCGGAGCTTGTAGAC CCACGATGCCACGGTTGTGTGAC npy 155nt 60 CGGAGGAGCTCGCCAAGTATTAT AGTGGATGAGATCACCATGCCAAA bmp15 146nt 59 GACGTCACACGATTAGAGGCGCA CGTACGCACGAGTGCCACCT gdf9 146nt 56 TGCTACTAAATGCGCTTGTCGAT TCTTCATAATGAGAATGCCCAGTGC myogenin 134nt 61 GCAGCGCGTCGTCTGATCACTGTGT TGCCTGTGTTCCCGTTATGCTGTCC myostatin 373nt 60 CTTACCCAAAGCACCTCCGCTGC TCCCACAAGCTGGATGGCT tnni2a.3 199nt 62 GATGACATCGAGCCGTAGGCACC CCATGTAAGCCTCTTTGGCCGCA Η δοκιμή της καταλληλότητας των ζευγών primers πραγματοποιήθηκε αρχικά με δείγματα RNA από ιχθύδια zebrafish μήκους 10-12mm TL, με τη μέθοδο Real Time Q-PCR.

80 Η δοκιμή των primers πραγματοποιήθηκε και με τα δείγματα cdna που παρασκευάστηκαν από τα απομονωμένα ολικά RNAs. Για τα πειράματα αυτά έγινε χρήση του μηχανήματος Light Cycler 1.5 (Roche). Κατά τη δοκιμή των εκκινητών, έχοντας ως υπόστρωμα (template) RNA πραγματοποιούνταν τρεις αντιδράσεις: (1) Mε υπόστρωμα δείγματος RNA, (2) Xωρίς υπόστρωμα, για να καθοριστεί ο πιθανός διμερισμός των εκκινητών και άρα η παραγωγή προϊόντων προερχόμενων μόνο από αυτούς και (3) μία αντίδραση με υπόστρωμα δείγματος RNA αλλά χωρίς το ένζυμο αντίστροφη μεταγραφάση, ώστε να καθοριστεί αν τα προϊόντα της αντίδρασης προέρχονται από το περιεχόμενο υπόστρωμα RNA ή από την πιθανή ύπαρξη προσμίξεων DNA. Όπως έχει ήδη αναφερθεί, οι εκκινητές κάθε ζεύγους είναι σχεδιασμένοι ώστε να υβριδοποιούνται σε διαφορετικά εξόνια, έτσι μειώνεται σημαντικά η πιθανότητα παραγωγής προϊόντος από πιθανό υπολειμματικό γονιδιωματικό DNA. Οι παραπάνω αντιδράσεις πραγματοποιούνταν εις τριπλούν, προκειμένου να διαπιστωθεί ή / και να αποφευχθεί η πιθανότητα ανθρώπινου σφάλματος. 78 Πίνακας 8: Ενδεικτικό θερμικό προφίλ για τις αντιδράσεις qrt-pcr. Τα παρακάτω βήματα χρησιμοποιούνται ως έχουν κατά τη δοκιμή των εκκινητών, έχοντας ως υπόστρωμα RNA. Κατά τη χρήση cdna ως υπόστρωμα για τη μελέτη της γονιδιακής έκφρασης, παραλείπονται τα στάδια (1) και (2), ενώ το τρίτο στάδιο (αποδιάταξη του cdna) διαρκεί 2 λεπτά. Στάδιο / βήμα Θερμοκρασία Χρόνος / 1. αντίστροφη μεταγραφή 42 C 5min 2. απενεργοποίηση RT, ενεργοποίηση πολυμεράσης 95 C 5min 3. αποδιάταξη DNA 95 C 3sec 4. υβριδοποίηση εκκινητών - 20sec 5. Πολυμερισμός 72 C 2sec κύκλοι από το βήμα 3 στο βήμα 5 7. αποδιάταξη προϊόντωνdna 95 C 1sec 8. υβριδοποίηση προϊόντων DNA 65 C 15sec C/sec, σταδιακή αποδιάταξη DNA, μέτρηση Tm C ~5min 10. υβριδοποίηση προϊόντων DNA τερματισμός της 40 C 30sec Κατά τη δοκιμή των εκκινητών με υπόστρωμα RNA, τα συστατικά της αντίδρασης, σε τελικό όγκο 20μl, είναι τα ακόλουθα: 1. 10μl 2xMaster Mix SYBR-Green (ΚΑPA SYBR qrt-pcr master mix) 2. 0,4μl ανοδικός εκκινητής (10mM Forward primer) 3. 0,4μl καθοδικός εκκινητής (10mM Reverse Primer) 4. 2μl BSA (2μg/μl, RNAse-free) 5. 0,4μl ΚΑPA RTmix 6. x-μl RNA ( ng) 7. y-μl H2O (DEPC) μέχρι τον τελικό όγκο των 20µl. Τα συστατικά αναμιγνύονταν όλα μαζί (mastermix), εκτός από το ΚΑPA RTmix και το υπόστρωμα δείγματος RNA. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι για τις δύο αντιδράσεις ελέγχου - χωρίς αντίστροφη μεταγραφάση (RT) και χωρίς υπόστρωμα, RNA - παραλείπονται από την αντίδραση το ΚΑPA RTmix και το RNA (5 και 6) και προστίθεται DEPC νερό. Για κάθε ένα από τα ζευγάρια εκκινητών πραγματοποιούνταν όπου αυτό κρινόταν απαραίτητο - αντιδράσεις σε διαφορετικές θερμοκρασίες υβριδοποίησης, ώστε να βελτιστοποιηθούν οι συνθήκες ποσοτικοποίησης της έκφρασης του αντίστοιχου γονιδίου. Οι θερμοκρασίες υβριδοποίησης αναγράφονται στον Πίνακα 7. Η συγκέντρωση του υποστρώματος για τα δείγματα RNA νυμφών και ιχθυδίων zebrafish, κυμαινόταν από ng/20μl αντίδρασης. Στους ιστούς, η συγκέντωση αυτή κυμαινόταν από ng/20μl αντίδρασης.

81 Ποσοτική PCR Πραγματικού Χρόνου Quantitative Real Time PCR Η Quantitative Real Time PCR βασίζεται στις ίδιες αρχές λειτουργίας με την κλασσική PCR και αποτελεί παραλλαγή αυτής. Λόγω της αυξημένης ευαισθησίας της, η Real Time PCR έχει χρησιμοποιηθεί εκτεταμένα σε πλήθος μελετών. Με τη χρήση εξειδικευμένων εκκινητών για την ανίχνευση της έκφρασης ενός συγκεκριμένου γονιδίου και έχοντας ως υπόστρωμα είτε δείγμα RNA (two step Quantitative Real Time PCR), είτε cdna (one step Quantitative Real Time PCR), ο πολλαπλασιασμός της συγκεκριμένης αλληλουχίας επιτυγχάνεται με τη χρήση ενός θερμικού κυκλοποιητή. Επαναλαμβανόμενοι κύκλοι (στην περίπτωσή μας, 45) των 3 βασικών βημάτων της PCR (Εικόνα ) α) αποδιάταξη του δίκλωνου DNA (denaturation) β) υβριδισμός των εκκινητών (primer annealing) και γ) σύνθεση συμπληρωματικών κλώνων (primer extension), τα οποία οδηγούν στον εκθετικό πολλαπλασιασμό της συγκεκριμένης αλληλουχίας-στόχου. Και σε αυτή την περίπτωση, ο πολλαπλασιασμός των προϊόντων, δηλαδή ο πολλαπλασιασμός της αλληλουχίας-στόχου, είναι εκθετικός, αφού τα προϊόντα κάθε κύκλου αποτελούν τα αντιδρώντα του επόμενου κύκλου. Στα νέα μόρια DNA που παράγονται, βρίσκονται οι αλληλουχίες-στόχοι πάνω στις οποίες προσδένονται οι εκκινητές για να ακολουθήσει η σύνθεση των νέων - συμπληρωματικών κλώνων. Ο (εκθετικός) πολλαπλασιασμός των προϊόντων (της αλληλουχίας στόχου), μπορεί να παρακολουθείται σε πραγματικό χρόνο (real time), γεγονός που αποτελεί σημαντικό πλεονέκτημα της μεθόδου, σε συνδυασμό με την υψηλή ανιχνευτική της ικανότητα. Η παρακολούθηση σε πραγματικό χρόνο γίνεται με τη χρήση φθοριζόντων χρωστικών (hybridization probes, scorpions probes, taqman probes, molecular beacons) και με τη βοήθεια του μηχανήματος παρέχεται η δυνατότητα ποσοτικοποίησης και ανάλυσης του ανιχνεύσιμου σήματος σε κάθε κύκλο της αντίδρασης (LightCycler 1.5 Instrument Operator's Manual). Στην παρούσα μελέτη, ο θερμικός κυκλποποιητής που χρησιμοποιήθηκε για την πραγματοποιήση των αντιδράσεων Real-time PCR, είναι ο Light Cycler 1.5 της Roche. Όπως και για όλα τα αντίστοιχου τύπου όργανα, έτσι και στο συγκεκριμένο, η αρχή λειτουργίας του βασίζεται στην ανίχνευση σήματος φθορισμού, η οποία είναι ανάλογη με την αύξηση της συγκέντρωσης του εξειδικευμένου προϊόντος της αντίδρασης, δηλαδή της αλληλουχίας στόχου, που λαμβάνει χώρα κατά την πραγματοποίηση της αντίδρασης. Ο φθορισμός επιτυγχάνεται με τη χρήση ενός φθορίζοντος μορίου που στη συγκεκριμένη περίπτωση είναι το SYBR Green (Εικόνα ). Το SYBR Green Ι (Εικόνα ) χρησιμοιποιείται ως χρωστική των νουκλεικλεϊκών οξέων στη μοριακή βιολογία. Όταν βρίσκεται σε ελεύθερη κατάσταση δε φθορίζει ή φθορίζει ελάχιστα, αλλά ο φθορισμός του αυξάνεται μέχρι και 1000 φορές κατά τη (μη εξειδικευμένη) πρόσδεσή του σε δίκλωνο DNA. Όπως γίνεται κατανοητό, ο συνολικός φθορισμός (και το σήμα που εκπέμπεται) κατά την πραγματοποίηση μιας αντίδρασης, PCR είναι ανάλογος με την ποσότητα του δίκλωνου DNA και αυξάνεται με τον πολλαπλασιασμό του προϊόντος (αλληλουχίας στόχου). Το σύμπλεγμα DNA-SYBR Green I, απορροφά στο υπεριώδες (λ=497nm) και εκπέμπει στο πράσινο (λ=520nm). Όπως έιναι αναμενόμενο, με την αντιγραφή και τη δημιουγία νέων μορίων DNA, όλο και περισσότερα μόρια της χρωστικής SYBR Green προσδένονται στα δίκλωνα μόρια DNA, γεγονός που οδηγεί στην αύξηση της έντασης του φθορισμού, η οποία προσμετράται από το ειδικό φωτόμετρο που διαθέτει το μηχάνημα. Ο φθορισμός μετράται συνέχεια και είναι δυνατή η συνεχής παρατήρηση της πορείας της αντίδρασης. Η μέτρηση του φθορισμού στο τέλος κάθε κύκλου, δηλαδή στο τέλος του 79

82 σταδίου της επιμήκυνσης των εκκινητών και της σύνθεσης των συμπληρωματικών κλώνων (primer extension), μας δίνει τις καμπύλες απόκρισης της αντίδρασης (Εικόνα ). 80 Εικόνα : Επάνω αριστερά. Δομή του μορίου της χρωστικής SYBR Green I που χρησιμοποιείται στις αντιδράσεις της Quantitative Real Time PCR, για την ποσοτικοποίηση της γονιδιακής έκφρασης [N',N'- dimethyl-n-[4-[(e)-(3-methyl-1,3-benzothiazol-2-ylidene)methyl]-1-phenylquinolin-1-ium-2-yl]-npropylpropane-1,3-diamine] (http: //en.wikipedia.org/wiki/ File:SYBR_Green_I.png) Επάνω δεξιά και κάτω. Αρχή της ανίχνευσης των προϊόντων της PCR με τη χρήση της χρωστικής SYBR Green I, στη Real Time Q-PCR (Critical Factors for Successful Real-Time PCR, Sample and Assay technologies, Qiagen). Το SYBR Green Ι, όταν βρίσκεται σε ελεύθερη κατάσταση δε φθορίζει, αλλά φθορίζει όταν προσδένεται σε δίκλωνο DNA. Το σύμπλεγμα DNA-SYBR Green I, απορροφά στο υπεριώδες (λ=494nm) και εκπέμπει στο πράσινο (λ=520nm) (LightCycler 1.5 Instrument Operator s Manual, Roche Applied Science). Στην αρχή της αντίδρασης, λόγω του ότι το προϊόν βρίσκεται σε πολύ χαμηλή ποσότητα, δεν είναι ανιχνεύσιμο. Όταν η ένταση του φθορισμού ξεπεράσει ένα κατώφλιο όριο (Κατώφλιος Κύκλος, Cycle Threshold, Ct), όταν δηλαδή υπερβεί τον φθορισμό του υπόβαθρου (μη ειδικός φθορισμός, background fluorescence) τότε αρχίζει να γίνεται ανιχνεύσιμη από το μηχάνημα. Ακολουθεί η εκθετική φάση της αντίδρασης κατά την οποία θεωρητικά η ποσότητα του ανιχνεύσιμου προϊόντος διπλασιάζεται σε κάθε κύκλο (ο μη ειδικός φθορισμός απομακρύνεται απο την ανάλυση των αποτελεσμάτων, μέσω αλγορίθμων που παρέχονται αυτοματοποιημένα από το λογισμικό του μηχανήματος). Η αντίδραση φτάνει σε ένα πλατώ (plateau phase), όταν δεν έχουμε πλέον σύνθεση νέων μορίων cdna. Το Ct είναι αντιστρόφως ανάλογο με την αρχική συγκέντρωση της αλληλουχίας στόχου και η τιμή του χρησιμοποιείται για την ποσοτικοποιήση και ανάλυση των αποτελεσμάτων. Η ποσοτικοποίηση της γονιδιακής έκφρασης (ο υπολογισμός του αρχικού ποσού του υποστρώματος) γίνεται με ειδικούς μαθηματικούς τύπους, με βάση το Ct της αλληλουχίας

83 στόχου και του υποστρώματος και το Ct των ενδογενών μαρτύρων, δηλαδή των γονιδίων αναφοράς (π.χ. bactin, tubulin alpha 1(tuba1), glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (gapdh), 18s ribosomal RNA (18s) και άλλων). 81 Εικόνα : Τυπική καμπύλη απόκρισης-ενίσχυσης (amplification plot) κατά την πραγματοποίηση της Quantitative Real Time PCR, στην οποία φαίνεται η σχέση μεταξύ του αριθμού των κύκλων της αντίδρασης και της τιμής της έντασης του φθορισμού κάθε δείγματος. Όταν η ένταση του φθορισμού ξεπεράσει ένα οριακό κατώφλι (Cycle Threshold, Ct) τότε γίνεται ανιχνεύσιμη από το μηχάνημα και ακολουθεί η εκθετική φάση (exponential growth phase) της αντίδρασης. Είναι η φάση κατά την οποία έχει αρχίσει ο πολλαπλασιασμός της αλληλουχίας στόχου και φάση κατά την οποία - θεωρητικά - η ποσότητα του ανιχνεύσιμου προϊόντος διπλασιάζεται σε κάθε κύκλο. Στη φάση plateau, η παραγωγή νέων αντιγράφων έχει σταματήσει λόγω εξάντλησης των αντιδραστηρίων (LightCycler 1.5 Instrument Operator's Manual, Roche Applied Science). Εικόνα : Ο φθορισμός σε σχέση με τη θερμοκρασία (πάνω) και η καμπύλη αποδιάταξης (η οποία βασίζεται στη θερμοκρασία αποδιάταξης, Τm) (κάτω) των προϊόντων (αλληλουχία cdna - στόχος) μιας αντίδρασης Real TimeQ-PCR. Παρατηρείτε την κορυφή που αντιστοιχεί στο Tm του προϊόντος της αντίδρασης (~84 C). Με τις παραπάνω καμπύλες είναι δυνατή η αξιολόγηση των προϊόντων της αντίδρασης (Houghton et al. 2006). Η ύπαρξη μίας ξεκάθαρης κορυφής, δηλώνει την ύπαρξη ενός εξειδικευμένου προϊόντος. Περισσότερες, ασθενέστερες, ή μη, κορυφές υποδηλώνουν την ύπαρξη μη εξειδικευμένων παρα-προϊόντων. Οι παραπάνω καμπύλες προέρχονται από την ανίχνευση της έκφρασης του γονιδίου BMP15 σε 15 δείγματα (x 2 τεχνικά duplicates) σε γονάδες ενήλικων αρσενικών και θηλυκών zebrafish (LightCycler 1.5 Instrument Operator's Manual, Roche Applied Science).

84 Ως Tm (melting temperature), ορίζεται η θερμοκρασία τήξης του εξειδικευμένου προϊόντος που σχηματίζεται κατά την PCR. Εξαρτάται από το μέγεθος της αλληλουχίας και την περιεκτικότητα σε νουκλεοτίδια GC. Είναι η θερμοκρασία στην οποία το 50% του DNA έχει αποδιαταχθεί (άρα το 50% βρίσκεται σε δίκλωνη κατάσταση και το άλλο 50% σε μονόκλωνη). Μετά τον τελευταίο κύκλο της Real Time PCR, η θερμοκρασία αυξάνεται ταχύτατα (1sec) στους 95 C οπότε αποδιατάσσονται τα δίκλωνα μόρια του DNA και στη συνέχεια επανέρχεται στη θερμοκρασία υβριδοποίησης (65 C για 15sec) και τα μόρια DNA επαναδιατάσσονται. Τα επόμενα 5min πραγματοποιείται σταδιακή αποδιάταξη των προϊόντων (με σταδιακή αύξηση της θερμοκρασίας, από τους 65 C στους 95 C). Όταν το 50% του δίκλωνου DNA έχει πλέον αποδιαταχθεί, ο φθορισμός μειώνεται απότομα (πλήρης διαχωρισμός της διπλής έλικας των παραχθέντων μορίων DNA). Στο τελικό στάδιο, η θερμοκρασία πέφτει στους 40 C και ακολουθεί ο τερματισμός της αντίδρασης με την υβριδοποίηση των μορίων DNA. Η Tm αναπαρίσταται από το μηχάνημα με τη βοήθεια ενός διαγράμματος, ως μία συγκεκριμένη κορυφή (Eικόνα ). Μία ξεκάθαρη κορυφή στο διάγραμμα που αφορά στο Tm του προϊόντος [melting curve(s) analysis, melting peak(s)], αποτελεί απόδειξη ύπαρξης ενός μοναδικού, καθαρού, εξειδικευμένου προϊόντος. Η ύπαρξη περισσότερων κορυφών, υποδεικνύει τον πιθανό σχηματισμό διμερών από τους εκκινητές, μη εξειδικευμένο πολλαπλασιασμό του προϊόντος, ύπαρξη γενομικού DNA ή πρόσδεση των εκκινητών σε δύο παρόμοιες - συμπληρωματικές - αλληλουχίες (με ταυτόσημες περιοχές πρόσδεσης των εκκινητών) (Liu & Saint 2002) Μέθοδος ανάλυσης των αποτελεσμάτων της Quantitative Real Time PCR Υπάρχουν δύο βασικές μέθοδοι, βάσει των οποίων πραγματοποιείται η ποσοτικοποίηση και η ανάλυση των αποτελεσμάτων που προκύπτουν από τη Real Time PCR: I. Απόλυτη ποσοτικοποίηση (Absolute Quantification) II. Σχετική ποσοτικοποίηση (Relative Quantification) Η απόλυτη ποσοτικοποίηση επιτρέπει την ακριβή μέτρηση των αντιγράφων της αλληλουχίας στόχου στο δείγμα μας, συσχετίζοντας το σήμα φθορισμού της PCR με μια καμπύλη αναφοράς (standard curve) (για περισσότερες πληροφορίες, βλ. Absolute Quantification of Gene Expression using SYBR Green in the Eco Real-Time PCR System. Technical Note: Real-Time PCR. Illumine, καθώς και Larionov et al., 2005). Η μέθοδος της σχετικής ποσοτικοποίησης στηρίζεται στη σύγκριση των C Τ τιμών (δηλαδή της έντασης του φθορισμού) του γονιδίου στόχου (target gene) με ένα γονίδιο αναφοράς (reference gene), του ίδιου πάντα οργανισμού. Πρόκειται για τη 2 -ΔΔCT μέθοδο (comparative C T method). Ως γονίδιο αναφοράς, χρησιμοποιείται ένα γονίδιο του οποίου η έκφραση δε διαφέρει μεταξύ των δειγμάτων (housekeeping gene). Αναλυτικότερα, έχουμε τα ακόλουθα: Η τιμή ΔC T περιγράφει τη διαφορά μεταξύ της C T τιμής του γονιδίου στόχου και τη C T τιμή του γονιδίου αναφοράς, το οποίο χρησιμοποιείται για την κανονικοποίηση των τιμών που αφορούν στην ποσότητα του χρησιμοποιούμενου υποστρώματος (RNA ή cdna). ΔC T = CT (target gene) - C T (endogenous reference gene) Η τιμή ΔΔC T περιγράφει τη διαφορά μεταξύ της μέσης τιμής ΔC T του προς εξέταση δείγματος και της μέσης τιμής ΔC T ενός δείγματος αναφοράς (εσωτερικός calibrator,

85 calibrator sample). Όλα τα προς εξέταση δείγματα θα πρέπει να κανονικοποιηθούν σε αυτή την περίπτωση με τον εσωτερικό calibrator, όταν πραγματοποιείται η ανάλυση της σχετικής ποσοτικοποίησης. ΔΔC T = average ΔC T (sample of interest) - average ΔC T (reference sample) Η ανάλυση των αποτελεσμάτων, πραγματοποιήθηκε βάσει των προτεινόμενων μεθόδων από Livak και Schmittgen (2008). Αρχικά υπολογίστηκε για κάθε δείγμα cdna η μέση τιμή C T (όπως αυτή προέκυψε από τις τεχνικές επαναλήψεις της PCR). Αυτή η μέση τιμή κάθε ενός δείγματος, χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό του ΔC Τ. Σε αυτές τις τιμές εφαρμόστηκε ο μετασχηματισμός 2 -ΔCΤ. Τελικά τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως μέση τιμή του 2 -ΔCΤ ± 1SD, ενώ με την εφαρμογή Mann-Whitney U-test, (p<0,05) διαπιστώθηκε η ύπαρξη στατιστικά σημαντικής διαφοράς, μεταξύ της γονιδιακής έκφρασης των υπό εξέταση ομάδων. Τα πρωταρχικά δεδομένα (Raw Data) των αναλύσεων, περιέχονται στο Παράρτημα II. Η αποδοτικότητα των αντιδράσεων (PCR efficiency) ήταν παρόμοια για όλα τα γονίδια που εξετάστηκαν. 83 Εικόνα : Κατά τη μελέτη του προφίλ της γονιδιακής έκφρασης διαφορετικών γονιδίων με τη Real Time PCR, είναι απαραίτητη η γνώση της αποδοτικότητας της αντίδρασης (PCR efficiency). Η αποδοτικότητα μιας αντίδρασης PCR, κυμαίνεται από 1,8 έως 2 (όταν το ποσό των προϊόντων κατά την εκθετική φάση της αντίδρασης, διπλασιάζεται σε κάθε κύκλο). Σύφωνα με τους Livak και Schmittgen (2008), όταν οι καμπύλες απόκρισης διαφορετικών γονιδίων κατά την εφαρμογή της PCR σε ένα συγκεκριμένο δείγμα (cdna ή RNA) είναι παρόμοιες, αυτό σηματοδοτεί παρόμοια αποδοτικότητα της PCR για αυτά τα γονίδια. (Εικόνα από Livak & Schmittgen, 2008).

86 Η τεχνολογία των Nanostring Όπως έχει ήδη περιγραφεί στο παρόν Κεφάλαιο, 150 άτομα από κάθε θερμοκρασιακή συνθήκη του πειράματος συντηρήθηκαν στους -80 C (Παράρτημα I). Το σύνολο των 450 αυτών ατόμων προέρχεται από 3 τυχαίες δειγματοληψίες, όταν το μέσο μήκος σώματος κάθε πειραματικού πληθυσμού έφτασε τα 5, 8 και 14mm TL. Από αυτά επιλέχθηκαν 96 άτομα (33 από κάθε θερμοκρασιακή συνθήκη) (Πίνακας 2), από τα οποία απομονώθηκε ολικό RNA με στόχο να χρησιμοποιηθεί για τη δημιουργία του οντογενετικού προφίλ της έκφρασης γονιδίων που σχετίζονται με το φυλοκαθορισμό και την ανάπτυξη και να μελετηθεί η θερμοεξαρτώμενη πλαστικότητα σε επίπεδο γονιδιακής έκφρασης. Τα άτομα επιλέχθηκαν κατά τέτοιο τρόπο ώστε να έχουμε μια πλήρη οντογενετική σειρά με κανονική κατανομή (2 άτομα ανά ~1mm μήκους), για κάθε θερμοκρασιακή συνθήκη (Πίνακας 2). Η ποσοτικοποίηση της γονιδιακής έκφρασης κατά την οντογένεση, πραγματοποιήθηκε με την τεχνολογία των Nanostring (NanoString ncounter Analysis System, NanoString Technologies, Nucleomics Core, VIB Facility). Η μισή ποσότητα από κάθε δείγμα εστάλει στη NanoString Technologies, μέσα σε ξηρό πάγο και με όλα τα απαραίτητα στοιχεία (κωδικοί δειγμάτων, συγκέντρωση απομονωμένου ολικού RNA). Παράλληλα αποστέλλονται τα γονίδια στόχοι η έκφραση των οποίων θα πρέπει να ποσοτικοποιηθεί, καθώς και οι αλληλουχίες των housekeeping γονιδίων που θα χρησιμεύσουν ως γονίδια κανονικοποίσης των τιμών που προκύπτουν για τα γονίδια στόχους (χρήση αντίστοιχη των house-keeping γονιδίων στη Real Time Q-PCR) (Πίνακας 9). Προκειμένου να αποφευχθεί η επαναληψιμότητα σχετικά με το λόγο επιλογής των γονιδίων, αυτός αναλύεται μαζί με την ανάλυση των προκυπτόντων αποτελεσμάτων στο Κεφάλαιο της Συζήτησης ( 5.5). 84 Πίνακας 9: Με την τεχνολογία των Nanostring, μελετήθηκε το οντογενετικό προφίλ της έκφρασης των γονιδίων που αναγράφονται στον παρακάτω πίνακα, καθώς και των house-keeping γονιδίων (bactin1, efl1a, rpl13a). Δίνεται το πλήρες όνομα των γονιδίων, καθώς και κωδικός (accession number) από τη βάση δεδομένων NCBI. Gene Full name Accession (NCBI) bactin1 actin, beta 1 NM_ ef1a eukaryotic translation elongation factor 1 alpha 1, like 1 NM_ rpl13a ribosomal protein L13a NM_ ar androgen receptor NM_ bmp15 bone morphogenetic protein 15 NM_ cryaa crystallin, alpha A NM_ cyp19a1a cytochrome P450, family 19, subfamily A, polypeptide 1a NM_ cyp19a1b cytochrome P450, family 19, subfamily A, polypeptide 1b NM_ dmrt1 doublesex and mab-3 related transcription factor 1 NM_ (dmrt1), transcript variant 1 dnmt3 DNA (cytosine-5-)-methyltransferase 3 NM_ eda ectodysplasin A NM_ figla factor in the germline alpha NM_ mstn myostatin a NM_ gdf9 growth differentiation factor 9 NM_ hsd11b2 hydroxysteroid 11-beta dehydrogenase 2 NM_ igf1 insulin-like growth factor 1 NM_ osteocalcin (bglap) osteocalcin / bone gamma-carboxyglutamate (gla) protein (bglap) NM_ mgp matrix gla protein NM_ myog myogenin NM_ npy neuropeptide Y NM_ pes pescadillo NM_ sox9a SRY-box containing gene 9a NM_ tnni2a.3 troponin I, skeletal, fast 2a.3 NM_ tp53 tumor protein p53 NM_

87 Πίνακας 10: Οι αλληλουχίες στόχοι (target sequence) των γονιδίων (gene) των οποίων η έκφραση ποσοτικοποιήθηκε με την τεχνολογία των Nanostring, με απώτερο στόχο τη τη μελέτη του οντογενετικού προφίλ της γονιδιακής έκφρασης στα zebrafish των τριών υπό εξέταση διαφορετικών θερμοκρασιακών συνθηκών. Gene Target Sequence Accession (NCBI) bactin1 GATCTTGCAGGACTTCCCTAGGGTATGTGAATAAGGGATGTCCCTTGAAA NM_ ATGTAAGCCAGGGTGTCTCTGTACACTGACAAGTCAACCCAAATAAAACG ef1a CCAAGTGAATTTCCCTCAATCACACCGTTCCAAAGGTTGCGGCGTGTTCT NM_ TCCCAACCTCTTGGAATTTCTCTAAACCTGGGCACTCTACTTAAGGACTG rpl13a GAAGAACAGCTAATCCTAACGTCATTTCCGATGACGCGAAAGCTCCGCC NM_ CTCGCCCCTGTCTTTTACGCCAGGCGGCCCCGCGTGTCTTTCTTTTCCCAC ar CATCTCACAGTCATTAGGGAGTTGCCTCCTCTAGACAGCAGACTTTTGTT NM_ AAGACAGTGCAGATTGCCCGTATTTACAACCTGGATATTGCGGTGCAGGT bmp15 GTCACATTTTGGCGTCGCCAGTACAGAAGTTCACCGAAATCGACACCCAA NM_ AAAGGAGAAACCCTCATTTTAGACCTCCCGTAGAAAGCCGAACTGACGAT cryaa CTTACTATCGACACTCACTCTTCCGCAACATCCTGGACTCCTCCAACTCA NM_ GGTGTCTCTGAGGTGAGGTCTGACAGAGAAAAATTTACAGTTTACCTGGA cyp19a1a GAGTCGTTTCTTCCAGCCGTTCGGATCGGGTCCTCGGTCGTGTGTGGGGA NM_ AGCACATTGCCATGGTGATGATGAAGTCTATTCTGGTGGCTCTGCTGTCT cyp19a1b GGGACAAACCTAATCCTGAACATTGGACGCATGCATAAGACAGAGTTCTT NM_ CAAAAAACCCAACGAATTCAGCTTGGAGAACTTCGAGAACACTGTTCCCA dmrt1 GATGGGCATCTGTAGCCCGATTAACCTTTCCGGTTCAGACACTCTGGTGA NM_ AGAACGAGGCCGTGGGTGAAAACGTGTTTACTCTTAGCTCAGGACCGCCA dnmt3 GGAAGCAGCATATCCGATGTCATTGACCTTACTGAAATGGATGAGATAGG NM_ TCCAGTGGAAATAGAGGACATTGCACCAATGGATGTGGATGATATTGTGT eda GTGCCAAAGCCAATGCAACAACTGCAAAATCTTCCTGAGTTTGTTCATCC NM_ TCTCGCTCTCTCTGCACCTCGTCACGCTCTTCTGCTACCTGGACCTGCGC figla ACAAGGGTAATGAGAATGCTAATGTGTTCCTGGAGACTGGAATCAACTAC NM_ CCAAGCATAAACCCTGACTGCTCCGATCTCTGGAACATGGAGGATGCTCT mstn ATATCTCACCTGGAGTCTTCTTCTGAAGGGAACAATCACTCGAGAATACGT NM_ GCGCAAAAAATTGACGTGAATGCCCGGACAAATTCCTGGCAGCACATCG gdf9 GACCGATGATTGTGACCTGTATGATTTCAGAGTGAGCTTCAAAGAGCTCA NM_ AACTGGACCATTGGATCATTGAGCCTAAAAAATACAATCCGAGGTACTGC hsd11b2 CTGAGTCCTGTCATCGACACCATTGTGGAAGCGCTCCTTTCTCCTCAACC NM_ CCAGGTGCGATACTACGCTGGGCCTGGTTTAATACTCATGTACTTCATCT igf1 CATTGGTGTGATGTCTTTAAGTGTACCATGCGCTGTCTCCCGAGTACCCA NM_ CACCCTCTCACTGGTGCTGTGCGTCCTCGCGTTGACTCCCGCGACTCTGG LOC (bgla) CCTGACTCCTCAGATACTAAACCATTGAGTGCTGCAGAATCTCCTAATCA NM_ TGAAGGTGTGTTTGTGAAGCGTGACGTGGCCTCTATCATCATGAGACAGA mgp TTCTGCTTGTAGAGGATTTGCTGAACATGAGGAGCTCTCAATAAACCCTG NM_ GACACGCTTCATGATGGAGACGTGTGCTGCACAGCATTTATTCAAAAAAA myog TCAGTGGACATTAGCAAATAAATCAGAAGGCCGACTCACCGTTACCTTCA NM_ GACCAGCTTTCACTGACCACAACAGCAACATTAGACAAAGCTTTTGCAAG npy TGATGAATCCAAACATGAAGATGTGGATGAGCTGGGCAGCGTGCGCGTT NM_ TCTCTTGTTCGTCTGCTTGGGGACTCTCACAGAAGGGTATCCAACAAAACC pes CTATCAGGCAGAGGTTTTGGGACAGACCATCACATGGATCGTACCATATC NM_ AGTTTGCCCATAATCATCCTACAGATGTGGACTACAGAGTTATGGCCACA sox9a AGCGAGCACCGTGGATTTGCAGGAATTAAAAGCTACAAAGGATTTTTTGG NM_ AGGCGCGCTCGAATTCTCTGAGATCGTCCATCTACGGTGTTCGCATGAAT tnni2a.3 CTGCAGGAGCTGTGCAAGAAACTTCACCAGCAAATCGACAAAGTTGATGA NM_ GGAGAGATATGACTTGGAGTCTAAAGTGGGCAAAGCAGCTAAAGAGATTG tp53 TGAGGGGCAGGGAGCGTTATGAAATTTTAAAGAAATTGAACGACAGTCTG NM_ GAGTTAAGTGATGTGGTGCCTGCCTCAGATGCTGAAAAGTATCGTCAGAA 85 Τα γονίδια-στόχοι περιλαμβάνονται στον Πίνακα 9, ενώ στον Πίνακα 10 αναγράφονται οι αλληλουχίες στόχοι των γονιδίων με τους κωδικούς από τη βάση δεδομένων NCBI (accession number). Η τεχνολογία των Nanostring αποτελεί μια ισχυρή και με υψηλή ευαισθησία μέθοδο για την για την ανίχνευση της έκφρασης μέχρι και 800 γονιδίων σε μία μόνο αντίδραη, σε ένα ευρύ φάσμα των επιπέδων έκφρασης. Θεωρείται μια μέθοδος που

88 Gene expression Gene expression Gene expression τοποθείται, τεχνικά και αναλυτικά, μεταξύ αυτής των Μicroarrays και της Real-Time Quantitative PCR. Bασίζεται στην άμεση ψηφιακή ανίχνευση των mrnas στόχων, με τη χρήση target-specific, color-coded probe pairs. Δεν απαιτείται η μετατροπή του mrna σε cdna με αντίστροφη μεταγραφή, ούτε και ενίσχυση του cdna με PCR. Κάθε γονίδιοστόχος ανιχνεύεται με τη χρήση δύο ζευγών ανιχνευτών (probes). Το δύο ζεύγη (reporter και capture probes) φέρουν αλληλουχίες βάσεων, ειδικές για τα γονίδια-στόχους. Κάθε reporter probe φέρει ένα μοναδικό «κωδικό χρώμα» στο 5' άκρο, το οποίο επιτρέπει το μοριακό barcoding του εκάστοτε γονιδίου-στόχου. Οι capture probes φέρουν μια biotin label στο 3' άκρο, η οποία παρέχει a molecular handle for attachment of target genes to facilitate downstream digital detection. Το επίπεδο έκφρασης ενός γονιδίου μετράται με απαρίθμηση του αριθμού των φορών που η χρωματική κωδικοποίηση (Barcode color-coded barcode) για το εν λόγω γονίδιο ανιχνεύεται (Kulkarni, 2011). Η εταιρεία αρχικά προχωρά στον προσδιορισμό της ποιότητας και ποσότητας των δειγμάτων (Nanodrop) και αποστέλει τα σχετικά στοιχεία (Πίνακας 11). Ακολουθεί η ανάλυση των δειγμάτων και η αποστολή των αποτελεσμάτων απο την εταιρεία. Με λογαρίθμιση (Log 2 ) των κανονικοποιημένων τιμών που αφορούν στη γονιδιακή έκφραση, για κάθε δείγμα και για κάθε γονίδιο προς εξέταση, προκύποτουν οι τελικές τιμές έκφρασης. Οι τιμές αυτές χρησιμοποιήθηκαν για τη διαγραμματικη αναπαράσταση των αποτελεσμάτων της γονιδιακής έκφρασης σε σχέση με το στάδιο ανάπτυξης, όπως έχει προσδιοριστεί με τη μέτρηση του μήκους σώματος. 12 (a) (b) (c) (d) (e) (f) SL (mm) SL (mm) Εικόνα : Διάγραμματα αναπαράστασης των διαφορετικών προτύπων γονιδιακής έκφρασης που παρατηρήθηκαν κατά την εξέταση του οντογενετικού προφίλ της γονιδιακής έκφρασης, με την τεχνολογία των Nanostring. (a) Η γονιδιακή έκφραση αυξάνεται καθόλη τη διάρκεια της εξεταζόμενης οντογενετικής περιόδου. (b) Η γονιδιακή έκφραση αυξάνεται μέχρι ενός συγκεκριμένου μήκους σώματος και στη συνέχεια ανεξαρτητοποιείται του σωματικού μεγέθους). (c) Η γονιδιακή έκφραση μειώνεται καθόλη τη διάρκεια της εξεταζόμενης οντογενετικής περιόδου. (d) Η γονιδιακή έκφραση μειώνεται μέχρι ενός συγκεκριμένου μήκους σώματος και στη συνέχεια ανεξαρτητοποιείται του σωματικού μεγέθους. (e) Η γονιδιακή έκφραση είναι ανεξάρτητη του σωματικού μεγέθους καθόλη τη διάρκεια της εξεταζόμενης οντογενετικής περιόδου. (f) Δεν παρατηρείται κάποιο συγκεκριμένο πρότυπο στη γονιδιακή έκφραση, ενώ κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης υπάρχουν άτομα στα οποία η έκφραση είναι μη ανιχνεύσιμη. Άξονας x, μήκος σώματος. Άξονας y, γονιδιακή έκφραση. Σε ό,τι αφορά στο προφίλ της γονιδιακή έκφρασης κατά τη διάρκεια της οντογένεσης, διακρίνονται αδρά - δύο βασικές κατηγορίες. Στην πρώτη κατηγορία ανήκουν τα γονίδια

89 των οποίων η έκφραση εμφανίζεται ανεξάρτητη του μήκους του σώματος των ιχθύων, ενώ στη δεύτερη ανήκουν τα γονίδια των οποίων η έκφραση εξαρτάται από το σωματικό μέγεθος. Αναλυτικότερα, παρατηρήθηκαν οι εξής περιπτώσεις: Η γονιδιακή έκφραση ήταν ανεξάρτητη του σωματικού μεγέθους (μήκος σώματος) καθόλη τη διάρκεια της εξεταζόμενης οντογενετικής περιόδου (Εικόνα , e). Η γονιδιακή έκφραση αυξανόταν καθόλη τη διάρκεια της εξεταζόμενης οντογενετικής περιόδου, ή αυξανόταν μέχρι ενός συγκεκριμένου μήκους σώματος και στη συνέχεια ανεξαρτητοποιούταν του σωματικού μεγέθους (Εικόνα , a και b). Η γονιδιακή έκφραση μειωνόταν καθόλη τη διάρκεια της εξεταζόμενης οντογενετικής περιόδου, ή μειωνόταν μέχρι ενός συγκεκριμένου μήκους σώματος και στη συνέχεια ανεξαρτητοποιούταν του σωματικού μεγέθους (Εικόνα , c και d). 87 Φαίνεται ότι η θερμοκρασία ανάπτυξης διαφοροποίησε το πρότυπο έκφρασης ορισμένων γονιδίων. Έτσι, ενώ σε ορισμένες περιπτώσεις η γονιδιακή έκφραση ακολούθησε το ίδιο πρότυπο και στις τρεις θερμοκρασιακές συνθήκες (22, 28 και 32 C) (π.χ. τα γονίδια osteocalcin και cyp19a1b), σε άλλες διαφοροποιήθηκε ανάλογα με τη θερμοκρασία ανάπτυξης (π.χ. τα γονίδια cryaa και figla). Η στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων πραγματοποιήθηκε ως περογράφεται ακολούθως. Όπου η έκφραση των γονιδίων ήταν σταθερή και ανεξάρτητη του σωματικού μεγέθους καθόλη τη διάρκεια της εξεταζόμενης οντογενετικής περιόδου, ο στατιστικός έλεγχος πραγματοποιήθηκε με Kruskal-Wallis (p<0,05). Όπου η γονιδιακή έκφραση παρουσίαζε εξάρτηση από το σωματικό μέγεθος (μήκος σώματος) καθόλη τη διάρκεια της εξεταζόμενης οντογενετικής περιόδου, ο στατιστικός έλεγχος μεταξύ των διαφορετικών θερμοκρασιακών συνθηκών, πραγματοποιήθηκε με ανάλυση συνδιασπορας (ANCOVA). Στις περιπτώσεις που το πρότυπο έκφρασης άλλαζε κατά τη διάρκεια της εξεταζόμενης οντογενετικής περιόδου (Εικόνα , b και d), αρχικά προσδιορίστηκε το μήκος σώματος στο οποίο συνέβαινε αυτή η αλλαγή (αλλαγή της κλίσης της ευθείας που αναπαριστά τη γονιδιακή έκφραση). Έτσι, εφαρμόζοντας μια ειδική μορφή γραμμικής παλινδρόμησης (κατά τμήματα γραμμική παλινδρόμηση, piecewise linear regression), προσδιορίστηκε το μήκος σώματος στο οποίο άλλαζε το πρότυπο της γονιδιακής έκφρασης. Η εξίσωση που εφαρμόστηκε ήταν: y=b 0 + b 1 SL + b 2 (SL- Lm) με (SL Lm) (Nikolioudakis et al. 2013). Όπου y, εξαρτημένη μεταβλητή (γονιδιακή έκφραση). SL, ανεξάρτητη μεταβλητή (το τυπικό μήκος σώματος των ιχθύων). b 0, το σημείο τομής του μοντέλου με τον άξονα των τεταγμένων. b 1, η κλίση της ευθείας, ως προς τον άξονα των τετμημένων. b 2, η αλλαγή κλίσης της ευθείας. Lm, το τυπικό μήκος SL, στο οποίο αλλάζει το πρότυπο της γονιδιακής έκφρασης (Nikolioudakis et al. 2013). Απο κει και πέρα, ανάλογα με το πρότυπο έκφρασης που παρατηρούνταν πριν και μετά το σημείο (μήκος σώματος) στο οποίο παρατηρούνταν η αλλαγή του προτύπου της γονιδιακής έκφρασης, ο στατιστικός έλεγχος πραγματοποιούνταν είτε με ANCOVA (p<0,01) (η έκφραση παρουσίαζε εξάρτηση από το μήκος σώματος), είτε με Κruskal-Wallis (p<0,05) (όταν η έκφραση ήταν σταθερή και ανεξάρτητη του σωματικού μεγέθους), ο στατιστικός έλεγχος πραγματοποιούνταν με Kruskal-Wallis. Στις περιπτώσεις που υπήρχε αδυναμία προσδιορισμού ενός συγκεκριμένου προτύπου γονιδιακής έκφρασης, πραγματοποιήθηκε περιγραφή του παρατηρούμενου μοντέλου. Στο Παράρτημα ΙΙ περιλαμβάνονται οι λεπτομέρειες που αφορούν στην ανάλυση των αποτελεσμάτων, όπως έχουν αποσταλεί από την εταιρεία. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι η επιλογή των house-keeping γονιδίων (actb1, eef1a1l1, rpl13a) έγινε βάσει βιβλιογραφίας

90 (Tang et al. 2007, McCurley & Callard 2008, Casadei et al. 2011) αλλά και ύστερα από σχετικές υποδείξεις εκπροσώπου της ίδιας της εταιρείας. Πίνακας 11: Τα δείγματα RNA από τις νύμφες και τα ιχθύδια zebrafish των τριών θερμοκρασιακών συνθηκών (22, 28 και 32 C, πειραματική επανάληψη A και B), που στάλθηκαν για ποσοτικοποίηση της γονιδιακής έκφρασης με την τεχνοlογία των Nanostring. Αναγράφεται η συγκέντρωση του RNA κάθε δείγματος (C) όπως είχε προσδιοριστεί μέσω φωτομέτρησης από το εργαστήριό μας και η αντίστοιχη συγκέντωση (C ) όπως προσδιορίστηκε από τη Nanostring (Nanodrop). Δίνεται ο λόγος 260/280 και 260/230 για το κάθε δείγμα (τιμές που προσδιορίστηκαν από την εταιρεία). SL και TL το τυπικό και ολικό μήκος σώματος κάθε ψαριού από το οποίο απομονώθηκε το ολικό RNA. Οι αριθμοί της πρώτης στήλης, αντιστοιχούν στο κωδικό αριθμό που είχε δοθεί σε κάθε δείγμα, κατά την ατομική του συντήρηση στους -80 C. 88 Nr Sample Τ ( C) / replicate C ng/λ SL (mm) TL(mm) C ng/ul 260/ / A 148 5,10 5,50 131,63 1,63 0, A 132 5,43 5,95 114,60 1,91 0, A 128 5,69 6,27 128,66 1,77 0, A 268 6,18 6,95 96,99 1,74 0, A 280 6,64 7,42 84,05 1,85 0, A 388 6,93 7,85 70,16 1,81 1, A 624 8,06 9,30 96,20 1,88 0, A 732 8,90 10,11 134,54 1,90 1, A 512 9,49 10,75 84,33 1,86 1, A 824 9,38 10,89 155,27 2,08 0, A ,27 11,78 105,17 1,84 1, A 80 10,50 12,04 96,92 1,87 1, A ,64 12,21 139,88 1,91 1, A ,21 12,88 205,66 1,85 1, A ,22 13,87 138,53 1,89 1, B 64 4,89 5,22 72,35 1,90 0, B 96 5,13 5,58 66,47 2,00 0, B 316 5,48 6,02 73,55 1,81 1, B 196 5,68 6,34 122,98 1,92 1, B 480 6,71 7,53 51,79 2,05 1, B 468 7,17 8,13 62,81 1,85 2, B 444 7,61 8,59 83,42 1,99 0, B 580 7,97 8,96 117,86 1,81 2, B 500 8,36 9,59 173,94 1,90 1, B ,03 10,23 63,05 1,81 1, A ,29 10,60 89,27 1,84 2, A ,08 11,37 156,14 1,95 1, B ,64 12,16 198,91 1,79 2, B ,97 12,60 155,94 1,75 2, B 80 11,50 13,14 141,02 1,87 1, B ,78 13,63 266,88 1,94 2, B 80 12,10 13,92 134,44 1,91 1, A 212 4,57 4,99 55,70 1,81 1, A 436 5,31 5,80 71,85 1,95 1, A 288 5,42 5,96 65,88 1,89 1, A 268 5,73 6,43 71,45 1,86 1, A 472 5,98 6,79 59,29 1,86 2, B 80 8,30 7,29 98,84 1,92 1, A 384 6,50 7,46 58,07 1,97 1, A 444 6,90 7,95 65,80 1,94 0, A 488 7,50 8,57 87,88 1,95 2, A 900 8,27 9,44 66,55 1,86 2, A 548 8,28 9,64 94,04 1,94 2, B ,47 12,06 59,12 1,90 2, A ,33 13,51 112,87 1,93 2, A ,96 14,06 94,00 1,89 1, B 208 5,04 5,58 83,75 1,80 0, B 172 5,39 5,89 136,42 2,00 0, B 236 5,82 6,47 110,00 1,97 0,22

91 Nr Sample Τ ( C) / replicate C ng/λ SL (mm) TL(mm) C ng/ul 260/ / B 644 6,49 7,23 177,03 1,92 1, B 320 6,58 7,26 87,35 1,95 1, B 436 6,58 7,52 155,22 2,00 1, B 376 6,82 7,67 95,94 1,87 1, B 512 6,81 7,71 128,41 1,93 1, B 312 7,17 8,02 88,94 1,85 1, B 652 7,33 8,27 181,56 1,95 0, B 328 7,59 8,48 102,33 1,93 1, B 440 7,89 8,85 104,04 1,88 1, B 648 8,24 9,36 96,03 1,89 1, B 396 8,81 10,02 86,15 1,97 1, B 260 8,84 10,08 106,91 1,92 1, B ,57 13,19 848,60 2,03 1, B ,88 13,50 117,54 1,86 2, A ,01 13, ,36 2,06 1, B 560 5,05 5,46 142,35 1,94 1, B 132 5,52 5,99 106,43 1,95 0, B 116 5,97 6,49 106,49 1,95 1, B 540 7,89 8,98 74,53 1,96 1, A 504 8,32 9,69 88,30 1,94 0, B 600 8,53 9,80 202,74 1,95 1, B 180 8,12 9,44 174,60 1,93 1, B 496 7,67 8,63 166,57 1,98 1, A 80 9,40 11,17 80,73 1,83 2, B ,86 11,70 110,25 1,88 2, B ,26 11,87 151,74 1,96 1, B ,77 12,49 119,61 1,86 2, B ,54 12,81 171,35 1,91 1, B ,96 11,76 122,80 1,93 1, B ,30 13,41 76,58 1,92 1, B ,60 14,15 211,42 1,92 2, A 156 4,71 5,00 139,86 1,90 1, A 152 5,00 5,48 104,34 1,88 1, B 100 5,72 6,12 158,34 1,94 1, A 196 6,99 7,85 102,36 1,90 1, A 292 7,53 8,45 109,16 2,02 1, A 344 7,82 8,78 151,84 1,89 2, A 400 7,93 9,03 212,77 1,97 1, A 432 8,31 9,61 105,40 1,88 1, B 80 11,28 13,40 39,99 1,91 1, A ,75 11,35 108,03 1,89 1, A ,01 11,93 108,16 1,88 1, A ,55 12,45 137,47 1,89 2, A ,77 12,69 207,58 1,91 0, A 80 11,40 13,01 93,50 2,00 0, A ,61 13,67 122,52 1,88 2, B 80 10,60 12,62 137,11 2,00 0,79 89

92 Ανάλυση του σχήματος του σώματος των ενήλικων zebrafish - Γεωμετρική Μορφομετρία Η επίδραση της θερμοκρασίας στο σχήμα του σώματος των zebrafish έναντι της θερμοκρασίας κατά τη διάρκεια του εμβρυικού και νυμφικού σταδίου (μέχρι και τη μεταμόρφωση), εξετάστηκε σε δείγματα ενήλικων zebrafish (265dpf), καθώς και σε δείγματα ιχθυδίων στο τέλος εφαρμογής των διαφορετικών συνθηκών (13-14mm TL) (Πίνακας 12). Χρησιμοποιήθηκαν ψηφιακές φωτογραφίες (αριστερή πλάγια όψη) από 60 ενήλικα zebrafish (30 θηλυκά και 30 αρσενικά) από κάθε συνθήκη (22, 28 και 32 C), 15 από την Α επανάληψη και 15 από τη Β (Πίνακας 13). Στους 22 C, στην Α πειραματική επανάληψη, υπήρχαν μόνο 3 θηλυκά άτομα, οπότε και χρησιμοποιήθηκαν μόνο αυτά. Σε ό, τι αφορά στα ιχθύδια, χρησιμοποιήθηκαν 30 άτομα από τις θερμοκρασίες των 22 και 28 C και 29 από τη συνθήκη των 32 C. Ο έλεγχος των διαφορών σχήματος μεταξύ των πληθυσμών πραγματοποιήθηκε με τη μέθοδο της γεωμετρικής μορφομετρίας. Με τη βοήθεια εξειδικευμένου λογισμικού (tpsdig, έκδοση 1.37), τοποθετήθηκαν 14 ομολογα μορφομετρικά σημεία σε ευδιάκριτες ανατομικές περιοχές στα ιχθύδια και 15 στα ενήλικα άτομα (Εικόνα ) Εικόνα : Θέση των 14 μορφομετρικών σημείων που τοποθετήθηκαν στα ιχθύδια (πάνω) και των 15 μορφομετρικών σημείων που τοποθετήθηκαν στα ενήλικα άτομα zebrafish (κάτω). (1) Άκρο του ρύγχους. (2) Εγγύς ως προς το ρύγχος σημείο του οφθαλμού. (3) Σημείο τομής του οφθαλμού από την ευθεία που σχηματίζεται από τα σημεία 1 και 2. (4) Βάση της πρώτης ακτίνας του ραχιαίου πτερυγίου. (5) Βάση της τελευταίας ακτίνας του ραχιαίου πτερυγίου. (6) Άνω άκρο της βάσης των ουραίων λεπιδοτριχίων. (7) Μέσο της βάσης των ουραίων λεπιδοτριχίων. (8) Κάτω άκρο της βάσης των ουραίων λεπιδοτριχίων. (9) Οπίσθιο άκρο της βάσης του εδρικού πτερυγίου. (10) Πρόσθιο άκρο της βάσης του εδρικού πτερυγίου. (11) Πρόσθιο άκρο βάσης του κοιλιακού πτερυγίου. (12) Κάτω άκρο γναθικού οστού. (13) Κάτω άκρο βραγχιακού επικαλύμματος. (14) Οπίσθιο άκρο βραγχιακού επικαλύμματος. (15) Βάση της πρώτης ακτίνας του θωρακικού πτερυγίου. Τα μορφομετρικά σημεία των δειγμάτων των υπό εξέταση πληθυσμών, επεξεργάστηκαν με το λογισμικό πρόγραμμα ΙΜΡ (CoordGen6d, Rohlf and Slice 1990), οπότε και καθορίστηκε η μέση διαμόρφωση σχήματος και το κεντροειδές μέγεθος. Στη συνέχεια υπολογίστηκε ο πίνακας βαρύτητας (weight matrix), αφού πρώτα εφαρμόστηκε ο αλγοριθμος thin plate spline στο σύνολο των μορφομετρικών σημείων κάθε δείγματος (TpsRelw, έκδοση 1.07, Rohlf 1996). Ακολούθως πραγματοποιήθηκε ανάλυση κανονικών συνιστωσών (Statistica version 7) για την εκτίμηση της σημαντικότητας των διαφορών

93 σχήματος μεταξύ των υπό εξέταση πληθυσμών (Georgakopoulou et al. 2007, Georga & Koumoundouros 2010). Για την εκτίμηση των πλεγμάτων παραμόρφωσης, με τα οποία παρουσιάζονται οι διαφορές σώματος μεταξύ των πληθυσμών που δέχτηκαν τη διαφορετική θερμοκρασιακή επίδραση, έγινε ανάλυση πολλαπλής παλινδρόμησης των ομοιόμορφων και μη ομοιόμορφων συνιστωσών του σχήματος, με τις μεταβλητές ανάλυσης των κανονικών συνιστωσών (tpsregr, έκδοση 1.07, Rohlf 1996) (Georgakopoulou et al. 2007, Georga & Koumoundouros 2010). Στον Πίνακα 12 παρουσιάζεται το πλήθος των ιχθυδίων που χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση ανά θερμοκρασία, καθώς και ο αντίστοιχος μέσος όρος του μήκους τους. 91 Πίνακας 12: Ο αριθμός (n), η ηλικία (σε dpf) και το μέσο ολικό μήκος (TL±SD) των ατόμων που χρησιμοποιήθηκαν στην ανάλυση της γεωμετρικής μορφομετρίας των ιχθυδίων. Περιέχονται και οι δύο επαναλήψεις. T ( C) (n) mean TL ± SD (mm) Age (dpf) ± ± ± Πίνακας 13: Ο αριθμός (n) και το μέσο μεσουραίο μήκος (FL±SD) των ενήλικων αρσενικών (Male) και θηλυκών (Female) zebrafish που χρησιμοποιήθηκαν στην ανάλυση της γεωμετρικής μορφομετρίας. Περιέχονται και οι δύο επαναλήψεις. T ( C) Sex (n) mean FL ± SD (mm) Female ± 2.3 Male ± 1.5 Female ± 2.3 Male ± 1. 6 Female ± 2.1 Male ± Μελέτη του τρόπου δράσης της θερμοκρασίας ανάπτυξης στην πλαστικότητα του zebrafish- Συνδυαστική ανάλυση Η υπό εξέταση περίοδος της επίδρασης της θερμοκρασίας στην πλαστικότητα του zebrafish, στην παρούσα εργασία, περιλαμβάνει τις δύο επιμέρους οντογενετικές περιόδους που είχαν ελεγχθεί από τους Georga & Koumoundouros (2010). (Παράρτημα Ι). Στην εργασία των Georga and Koumoundouros (2010) μελετήθηκε η επίδραση της θερμοκρασίας ανάπτυξης στο σχήμα του σώματος ενήλικων αρσενικών και θηλυκών zebrafish, κατά τη διάρκεια του πρώιμου εμβρυϊκού και νυμφικού σταδίου [G1: d] και κατά το όψιμο νυμφικό στάδιο [G2: d]. Η επίδραση της θερμοκρασίας στην παρούσα εργασία [G: 2 η dpf εως 14mm TL] περιλαμβάνει τις δύο προαναφερόμενες οντογενετικές περιόδους και θέτει το ερώτημα της πιθανής αθροιστικής δράσης της θερμοκρασίας και άρα της όξυνσης των παραγόμενων διαφορών στο σχήμα του σώματος των ενήλικων zebrafish. Προκειμένου να

94 εξεταστεί η ύπαρξη μιας τέτοιας δράσης, πραγματοποιήθηκε συνδυαστική (και κατά φύλο) ανάλυση γεωμετρικής μορφομετρίας στην οποία χρησιμοποιήθηκαν zebrafish από τα πειράματα G1, G2 και G (μία επανάληψη σε κάθε περίπτωση). Η ανάλυση γεωμετρικής μορφομετρίας πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τους Georga & Koumoundouros (2010) σε 15 μορφομετρικά ορόσημα (Εικόνα ). Ο έλεγχος των διαφορών στο σχήμα του σώματος μεταξύ των διαφορετικών συνθηκών έγινε με ανάλυση κανονικών συνιστωσών (CVA, Canonical Variate Analysis). Τα δεδομένα των Georga & Koumoundouros (2010) αναλύθηκαν συνδυαστικά με τα δεδομένα της παρούσας εργασίας, με εφαρμογή της γεωμετρικής ανάλυσης και ακολούθως με ανάλυση ιεραρχικής ομαδοποίησης (Cluster Analysis) επί των Mahalanobis αποστάσεων κάθε δείγματος Σύσταση & εκτροφή των πειραματικών πληθυσμών Οι πειραματικοί πληθυσμοί αποτελούν γενιές που προέρχονται από κοινό απόθεμα γεννητόρων «άγριου τύπου» (ZF WT2 F5, Wageningen Agricultural University, The Netherlands). Η διατήρηση και η εκτροφή των νυμφών και των ενήλικων ψαριών πραγματοποιήθηκε βάσει μεθοδολογίας όπως αυτή περιγράφεται στο «The Zebrafish Book» (Westerfield 1995). Αναλυτικότερα, οι γεννήτορες, διατηρούνταν σε ενυδρεία χωρητικότητας 9L τα οποία αποτελούν μέρος του αυτοματοποιημένου συστήματος εκτροφής zebrafish ZebTEC (Aquatics Zebrafish Housing System, Techniplast, Italy). Στο σύστημα αυτό η θερμοκρασία βρισκόταν στους 28±1 C, η φωτοπερίοδος ήταν σταθερή στις 14 : 10 h L:D. Το ph ήταν ίσο με 7,0-7,5 και η συγκέντρωση των αμμωνιακών και νιτρώδων ιόντων διατηρούνταν σε τιμές χαμηλότερες από 0,1mg/L. Ο κορεσμός του οξυγόνου στο νερό ήταν %. Στα ενυδρεία, η ανανέωση του νερού ήταν 100% / h, ενώ το σύνολο του κλειστού συστήματος υποβαλλόταν σε 20% ημερήσια ανανέωση του νερού. Στο σύστημα αυτό υπάρχει βιολογικό και μηχανικό φίλτρο για την ανακύκλωση του νερού και την κατακράτηση απεκκριμάτων ή/και άλλων αιωρούμενων σωματιδίων, αερισμός του νερού και UV για την αποστείρωση του νερού και την απομάκρυνση παθογόνων μικροοργανισμών). Το νερό των ενυδρείων, προερχόταν από το νερό του αστικού δικτύου επεξεργασμένο με σύστημα αντίστροφης ώσμωσης (reverse osmosis). Οι γεννήτορες τρέφονταν ad libitum δύο φορές την ημέρα με βιομηχανική τροφή σε μορφή νιφάδων (το πρωί με Brine Shrimp Flakes-Ocean Nutrition και το απόγευμα με Cichlid Omni-Ocean Nutrition). Επίσης, οι γεννήτορες τρέφονταν με σκουλήκια μια φορά την εβδομάδα καθώς και μία μέρα πριν από την τοποθέτηση των ειδικών δοχείων για την απόθεση των αυγών («γεννήστρες») για τη συλλογή αυγών. Οι γεννήστρες, τοποθετούνταν μετά το βραδινό τάισμα. Η ωοτοκία και η γονιμοποίηση λάμβανε χώρα το επόμενο πρωί μία περίπου ώρα μετά την έναρξη του φωτισμού. Οι γεννήστρες τοποθετούνταν στα ενυδρεία των γεννητόρων, το προηγούμενο βράδυ. Τα αυγά εμβαπτίζονταν για 3 περίπου λεπτά σε διάλυμα υπεροξειδίου του υδρογόνου συγκέντρωσης 300ppm για την απαλλαγή τους από πιθανούς μύκητες. Στη συνέχεια αφέθηκαν σε θερμοκρασία 28 C, όπου παρέμεναν τις πρώτες 24 ώρες της ανάπτυξής τους προκειμένου να ολοκληρωθεί επιτυχώς το στάδιο της γαστριδίωσης. Την επόμενη ημέρα ακολουθούσε καταμέτρηση των αυγών προκειμένου να τοποθετηθούν τελικά 400 αυγά σε κάθε πειραματικό ενυδρείο. Συγκεκριμένα, εντός κάθε ενυδρείου υπήρχε ένας επωαστήρας ελεγχόμενης ροής στον οποίο αφήνονταν τα αυγά, προκειμένου να αποφευχθεί η απευθείας επίδραση της ροής του νερού σε αυτά. Το πείραμα πραγματοποιήθηκε εις διπλούν, οπότε χρησιμοποιήθηκαν συνολικά έξι ενυδρεία, χωρητικότητας 10L το καθένα, τα οποία ανά δύο

95 είχαν την ίδια θερμοκρασία (28 C-Α και 28 C-Β, 22 C-Α και 22 C-Β, 32 C-Α και 32 C-Β). Μετά το τέλος της διαφορετικής θερμοκρασιακής αγωγής, τα ψάρια παρέμειναν διαχωρισμένα ανάλογα με τη θερμοκρασιακή επίδραση που είχαν δεχτεί, αλλά η επακόλουθη ανάπτυξη πραγματοποιήθηκε σε κοινές συνθήκες (σε θερμοκρασία 28±1 C). Η ανάπτυξη των πειραματικών πληθυσμών, διεξαγόταν σε παρόμοια, αλλά ξεχωριστά συστήματα από αυτό των γεννητόρων, μέχρι και την ενηλικίωσή τους, προκειμένου να αποφευχθεί η πιθανή δράση ορμονών που εκκρίνονται από τα ενήλικα zebrafish και μέσω του κλειστού συστήματος κυκλοφορίας νερού θα μπορούσε να μεταφερθούν στα αναπτυσσόμενα νεαρά ψάρια επηρεάζοντας ίσως τη διαφοροποίηση του φύλου τους. Ο κορεσμός του οξυγόνου στα πειραματικά συστήματα κυμαινόταν από 70-90%, ενώ η συγκέντρωση της αμμωνίας και των νιτρωδών διατηρούνταν σε επίπεδα χαμηλότερα από 0,1mg/L. Ο ρυθμός ανανέωσης του νερού σε αυτά τα ενυδρεία ήταν περίπου ίσος με 0,19 %/h. Στα ψάρια, η έναρξη και η ολοκλήρωση της εκκόλαψης των νυμφών εξαρτάται φυσικά από το εκάστοτε προς αναφορά είδος αλλά και από τις περιβαλλοντικές συνθήκες στις οποίες αναπτύσσονται τα έμβρυα (Kamler 2002). Οι περιβαλλοντικοί παράγοντες, μεταξύ των οποίων βασικό ρόλο παίζει η θερμοκρασία ανάπτυξης, επηρεάζουν το ρυθμό διαφοροποίησης των εμβρυϊκών ιστών αλλά και την ίδια τη διαδικασία της εκκόλαψης. Έτσι, οι υψηλές θερμοκρασίες αυξάνουν το ρυθμό διαφοροποίησης των εμβρυϊκών ιστών, τη δραστηριότητα των αδένων που προάγουν την εκκόλαψη και την κινητικότητα του εμβρύου άμεσα (μέσω της ταχύτερης αναπνοής), και έμμεσα (μέσω της χαμηλής παροχής οξυγόνου) (Kamler 2002). Στην παρούσα μελέτη, η εκκόλαψη των αυγών στη θερμοκρασία των 32 C πραγματοποιήθηκε 3 dpf, ενώ τα άτομα που αναπτύσσονταν στους 28 και 22 C εκκολάφθηκαν 4 και 5 dpf, αντίστοιχα. Οι νύμφες, αφού κατανάλωναν τη λέκιθο, τρέφονταν τέσσερεις φορές την ημέρα με πρωτόζωa του γένους Paramecium (BLADES BIOLOGICAL, Paramoecium LZA 020, ~10 άτομα Paramecium/ml) που καλλιεργούνταν στο εργαστήριο. Αφού γίνονταν πιο δραστήριες και μεγάλωναν σε μέγεθος, περίπου κατά την 11η 15η ημέρα μετά τη γονιμοποίηση ανάλογα με τη θερμοκρασία ανάπτυξης - οι νύμφες τρέφονταν παράλληλα με ναύπλιους Artemia sp. (Salt Creek, Select Brine Shrimp Eggs, Nitro Pak) στο στάδιο Instar I, ενώ σταδιακά η χορήγηση πρωτόζωων έπαυε. Στις dpf η τροφή των ιχθυδίων ήταν πλέον βιομηχανική σε μορφή νιφάδων (Brine Shrimp Flakes-Ocean Nutrition), όπως έχει προηγουμένως αναφερθεί και για τα ενήλικα zebrafish, με τη διαφορά ότι η τροφή σε αυτή την περίπτωση ήταν «αλεσμένη» ώστε να μπορεί να ληφθεί από τα νεαρά άτομα. Πριν από την πλήρη αντικατάσταση των γευμάτων Artemia sp. από τη βιομηχανική τροφή, μεσολαβούσε ένα μικρό χρονικό διάστημα στο οποίο συνδυάζονταν και τα δύο είδη τροφής. Μετά το τέλος της διαφορετικής θερμοκρασιακής αγωγής αφαιρούνταν οι επωαστήρες και τα ψάρια τοποθετούνταν σε ενυδρεία χωρητικότητας 10L, όπου πλέον η ανανέωση του νερού αυξανόταν για να φτάσει τελικά το 200%/h. 93

96 3.2. Επίδραση της πυκνότητας του πληθυσμού στη φαινοτυπική πλαστικότητα (σχήμα σώματος και αναλογία φύλου) του zebrafish Πειραματικός Σχεδιασμός 94 Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν στο εργαστήριο της Ιχθυολογίας του Τμήματος Βιολογίας του Πανεπιστημίου Πατρών. Σχεδιάστηκαν δύο πειράματα, προκειμένου να ελεγθεί η επίδραση της πληθυσμιακής πυκνότητας στο ρυθμό αύξησης του zebrafish, καθώς και στη φαινοτυπική πλαστικότητα του είδους, μελετώντας το σχήμα σώματος και την αναλογία φύλου, καθώς και να διαπιστωθεί η ευαισθησία ευαισθησία-εξάρτηση δύο πρώιμων οντογενετικών περιόδων έναντι της δράσης της πυκνότητας. Το κάθε πείραμα πραγματοποιείθηκε εις διπλούν (Εικόνα , Εικόνα ). Στο πρώτο πείραμα ελέγχθηκε η επίδραση της πυκνότητας του πληθυσμού κατά τη διάρκεια του νυμφικού σταδίου, από την κατανάλωση λεκιθικών αποθεμάτων, μέχρι το μέσο τυπικό μήκος σώματος (SL) των αναπτυσσόμενων zebrafish να φτασει περίπου τα 10mm. Αμέσως μετά τη γονιμοποίηση, αυγά zebrafish τοποθετήθηκαν σε πυκνότητες 215 ατόμων/l και 130 ατόμων/l, σε ενυδρεία χωρητικότητας 3L. Μετά την κατανάλωση των λεκιθικών αποθεμάτων και την αποκόλληση των νεαρών νυμφών από τα τοιχώματα των ενυδρείων, 400 άτομα από την πρώτη συνθήκη και 200 από τη δεύτερη μετακινήθηκαν σε νέα ενυδρεία και διατηρήθηκαν σε πυκνότητες 130 ατόμων/l (400Α και 400Β, Εικόνα ) και 65 ατόμων/l (200Α και 200Β, Εικόνα ), αντίστοιχα, σε ενυδρεία χωρητικότητας 3L. Παρέμειναν εκεί μέχρι το τυπικό μήκος του σώματός τους να φτάσει τα περίπου τα 10mm, το οποίο πραγματοποιήθηκε στις 20dpf για τους πληθυσμούς 200Α και 200Β, και στις 27dpf για τους πληθυσμούς 400Α και 400Β. Η διαφορά αυτή οφείλεται στο μειωμένο ρυθμό αύξησης στις συνθήκες υψηλής πυκνότητας, σε σχέση με τις συνθήκες χαμηλής πυκνότητας. Στη συνέχεια μεταφέρθηκαν σε κοινές συνθήκες πυκνότητας με 100 ατομα ανα ενυδρείο, χωρητικότητας 10L (πυκνότητα 10 άτομα/l.). Σε αυτή την πυκνότητα διατηρήθηκαν μέχρι το τέλος του πειράματος. Το μέσο μήκος των ψαριών την ημέρα της μεταφοράς στους σε πυκνότητα 10 ατόμων/l, ήταν 9,09±1,13 mm SL και 9,25±1,08 mm SL, για τους πληθυσμούς 200Α και 200B και 11,10±2,56 mm SL και 10,00±2,68 mm SL, για τους πληθυσμούς 400Α και 400B, αντίστοιχα. Tο πείραμα πραγματοποιήθηκε εις διπλούν και έλαβε τέλος όταν τα άτομα έφθασαν περίπου τα 25mm SL. Διατηρήθηκαν δηλαδή στις ίδιες πυκνότητες για 4 περίπου μήνες, μέχρι την ενηλικίωση. Καθ όλη την διάρκεια του πειράματος, διατηρούνταν οι ίδιες συνθήκες θερμοκρασίας και φωτοπεριόδου (28±1 C και 14hL:10hD). Ο κορεσμός του νερού σε οξυγόνο, ήταν 70-95%. Η συγκέντρωση των αμμωνιακών και νιτρώδων ιόντων ήταν μικρότερη από 0,1 mg/l. Η κυκλοφορία του νερού στα ενυδρεία ήταν 100% h -1. Στο πρώτο πείραμα ελέγχθηκε η επίδραση της πυκνότητας του πληθυσμού κατά τη διάρκεια του νυμφικού σταδίου, από την κατανάλωση λεκιθικών αποθεμάτων, μέχρι το μέσο τυπικό μήκος σώματος (SL) των αναπτυσσόμενων zebrafish να φτασει περίπου τα 10mm. Αμέσως μετά τη γονιμοποίηση, αυγά zebrafish τοποθετήθηκαν σε πυκνότητες 215 ατόμων/l και 130 ατόμων/l, σε ενυδρεία χωρητικότητας 3L. Μετά την κατανάλωση των λεκιθικών αποθεμάτων και την αποκόλληση των νεαρών νυμφών από τα τοιχώματα των ενυδρείων, 400 άτομα από την πρώτη συνθήκη και 200 από τη δεύτερη μετακινήθηκαν σε νέα ενυδρεία και διατηρήθηκαν σε πυκνότητες 130 ατόμων/l (400Α και 400Β,, Εικόνα ) και 65 ατόμων/l (200Α και 200Β, Εικόνα ), αντίστοιχα, σε ενυδρεία χωρητικότητας 3L.

97 95 Εικόνα : Σχηματική αναπαράσταση του πρώτου πειράματος που πραγματοποιήθηκε προκειμένου να ελεγχθεί η επίδραση της πληθυσμιακής πυκνότητας στο σχήμα σώματος και στην αναλογία φύλου του zebrafish, κατά τη διάρκεια του νυμφικού σταδίου: Από την ημέρα κατανάλωσης λεκιθικών αποθεμάτων έως SL=10 mm. Αυγά zebrafish τοποθετήθηκαν, αμέσως μετά τη γονιμοποίηση, σε ενυδρεία χωρητικότητας 3L και σε πυκνότητες 215 ατόμων/l και 130 ατόμων/l. Μετά από την κατανάλωση των λεκιθικών αποθεμάτων, 400 και 200 άτομα από τα ενυδρεία χωρητικότητας 215 και 130 ατόμων/l, αντίστοιχα, μετακινήθηκαν και διατηρήθηκαν σε πυκνότητες 130 ατόμων/l και 65 ατόμων/l, μέχρι να φτάσουν σε μήκος SL 10 mm. Στη συνέχεια, 100 άτομα από κάθε ενυδρείο μεταφέρθηκαν και τοποθετήθηκαν σε νέα ενυδρεία χωρητικότητας 10L, πυκνότητες οι οποίες διατηρήθηκαν μέχρι το τέλος του πειράματος, όταν τα άτομα έφτασαν σε μήκος σώματος SL 25 mm. Το πείραμα πραγματοποιήθηκε εις διπλούν. Οι συνθήκες θερμοκρασίας ήταν 28±1 C και οι συνθήκες φωτοπεριόδου ήταν 14hL:10hD. (n=αριθμός ατόμων, A, B= επαναλήψεις πειράματος). Εικόνα : Σχηματική αναπαράσταση του δεύτερου πειράματος που πραγματοποιήθηκε προκειμένου να ελεγχθεί η επίδραση της πληθυσμιακής πυκνότητας στο σχήμα σώματος και στην αναλογία φύλου του zebrafish, από τη περίοδο της ανάπτυξης κατά την οποία το μήκος σώματος, SL, φτάνει τα 8mm, περίπου, και μετά. Δύο χιλιάδες αυγά zebrafish τοποθετήθηκαν αμέσως μετά τη γονιμοποίηση σε ενυδρείο χωρητικότητας 40L (50 άτομα/l). Όταν το μέσο τυπικό μήκος σώματος (SL) των ιχθυδίων έφτασε τα 8mm, μεταφέρθηκαν σε νέα ενυδρεία με τις πυκνότητες των πληθυσμών να είναι ίσες με 14 άτομα/l και 7 άτομα/l. Οι πληθυσμοί παρέμειναν σε αυτές τις πυκνότητες μέχρι το τέλος του πειράματος, όταν τα άτομα έφτασαν σε μήκος SL 25mm. Το πείραμα πραγματοποιήθηκε εις διπλούν. Οι συνθήκες θερμοκρασίας ήταν 28±1 C και οι συνθήκες φωτοπεριόδου ήταν 14hL:10hD. (n=αριθμός ατόμων, A, B= επαναλήψεις πειράματος). Παρέμειναν εκεί μέχρι το τυπικό μήκος του σώματός τους να φτάσει τα περίπου τα 10mm, το οποίο πραγματοποιήθηκε στις 20dpf για τους πληθυσμούς 200Α και 200Β, και στις 27dpf για τους πληθυσμούς 400Α και 400Β. Η διαφορά αυτή οφείλεται στο μειωμένο ρυθμό αύξησης στις συνθήκες υψηλής πυκνότητας, σε σχέση με τις συνθήκες χαμηλής πυκνότητας. Στη συνέχεια μεταφέρθηκαν σε κοινές συνθήκες πυκνότητας με 100 ατομα ανα ενυδρείο,

98 χωρητικότητας 10L (πυκνότητα 10 άτομα/l.). Σε αυτή την πυκνότητα διατηρήθηκαν μέχρι το τέλος του πειράματος. Το μέσο μήκος των ψαριών την ημέρα της μεταφοράς στους σε πυκνότητα 10 ατόμων/l, ήταν 9,09±1,13 mm SL και 9,25±1,08 mm SL, για τους πληθυσμούς 200Α και 200B και 11,10±2,56 mm SL και 10,00±2,68 mm SL, για τους πληθυσμούς 400Α και 400B, αντίστοιχα. Tο πείραμα πραγματοποιήθηκε εις διπλούν και έλαβε τέλος όταν τα άτομα έφθασαν περίπου τα 25mm SL. Διατηρήθηκαν δηλαδή στις ίδιες πυκνότητες για 4 περίπου μήνες, μέχρι την ενηλικίωση. Καθ όλη την διάρκεια του πειράματος, διατηρούνταν οι ίδιες συνθήκες θερμοκρασίας και φωτοπεριόδου (28±1 C και 14hL:10hD). Ο κορεσμός του νερού σε οξυγόνο, ήταν 70-95%. Η συγκέντρωση των αμμωνιακών και νιτρώδων ιόντων ήταν μικρότερη από 0,1 mg/l. Η κυκλοφορία του νερού στα ενυδρεία ήταν 100% h -1. Το δεύτερο πείραμα είχε ως σκοπό να ελέγξει την επίδραση της πυκνότητας μετά το τυπικό μήκος SL 8mm. Αμέσως μετά τη γονιμοποίηση, 2000 αυγά τοποθετήθηκαν σε ενυδρείο χωρητικότητας 40L, άρα η πυκνότητα ήταν ίση με 50 άτομα/l. Μετά από περίπου 20dpf οπότε το μήκος των αναπτυσσόμενων ιχθυδίων προσδιορίστηκε στα 8mm SL, περίπου, τα άτομα μετακινήθηκαν και τοποθετήθηκαν σε 4 ενυδρεία χωρητικότητας 10L ανά δύο όμοια μεταξύ τους - και με πυκνότητες 14 ατόμων/l και 7 ατόμων/l (140Α & 140Β, 70Α & 70Β). Οι πληθυσμοί παρέμειναν σε αυτές τις πυκνότητες μέχρι το τέλος του πειράματος. Όπως και στο πρώτο πείραμα, έτσι και εδώ, το τέλος καθορίστηκε από τη στιγμή που το μέσο τυπικό μήκος σώματος των ατόμων έφτασε περίπου τα 25mm SL, δηλαδή όταν τα ψάρια ενηλικιώθηκαν. Το πείραμα πραγματοποιήθηκε εις διπλουν. Οι συνθήκες θερμοκρασίας ήταν 28±1 C και οι συνθήκες φωτοπεριόδου ήταν 14hL:10hD καθ όλη τη διάρκεια του πειράματος. Ο κορεσμός του νερού σε οξυγόνο, ήταν 70-95%. Η συγκέντρωση των αμμωνιακών και νιτρώδων ιόντων ήταν μικρότερη από 0,1 mg/l. Η κυκλοφορία του νερού στα ενυδρεία ήταν 100% h Δειγματοληψίες Κατά τη διάρκεια του πειράματος, από κάθε πειραματική συνθήκη και επανάληψη, λαμβάνονταν δείγματα προκειμένου να ελεγχθεί η επίδραση της θερμοκρασίας ανάπτυξης: Στην αναλογία φύλου των πειραματικών πληθυσμών Στο ρυθμό αύξησης των πειραματικών πληθυσμών Στο σχήμα του σώματος των ενήλικων αρσενικών και θηλυκών ατόμων zebrafish, 265 ημέρες μετά τη γονιμοποίηση, δηλαδή αρκετά μετά την εφαρμογή των διαφορετικών θερμοκρασιακών συνθηκών. Ο προσδιορισμός της αναλογίας φύλου έγινε Δειγματοληψίες για τη μελέτη του ρυθμού αύξησης Κάθε 5-10 ημέρες λαμβάνονταν από τα ενυδρεία τυχαίο δείγμα 5-10 ατόμων, για τον υπολογισμό του ρυθμού αύξησης κάθε πληθυσμού. Τα άτομα, αφού αναισθητοποιούνταν (ethylenglycolmono-phenylether, σε συγκέντρωση C 0,15-0,25 ml/l), φωτογραφίζονταν ατομικά. Το μήκος κάθε ατόμου υπολογίστηκε από τις ψηφιακές φωτογραφίες, με το λογισμικό tpsdig (έκδοση 1.37) (Εικόνα ). Μέχρι την έναρξη του σχηματισμού των υπουραίων οστών πραγματοποιούνταν μέτρηση του μήκους της νωτοχορδής (NL), ενώ στη συνέχεια του τυπικού μήκους (SL). Ο ρυθμός αύξησης για κάθε πληθυσμό εκτιμήθηκε μετά από προσαρμογή των πειραματικών δεδομένων στο μοντέλο αύξησης SL = a e SGR t (Ricker,

99 1978). Για την μελέτη του ειδικού ρυθμού αύξησης (SGR) για όλη την εξεταζόμενη περίοδο χρησιμοποιήθηκε το εκθετικό μοντέλο αύξησης, ενώ για τη μελέτη της επίδρασης της πυκνότητας του πληθυσμού στο στάδιο πριν και μετά την παρέλευση των 20 dpf, χρησιμοποιήθηκε το γραμμικό μοντέλο αύξησης μετά από λογαριθμοποίηση των τιμών SL Έτσι, για το κάθε πείραμα, υπολογίστηκαν οι ρυθμοί αύξησης για τις δύο φάσεις ανάπτυξης. Στη συνέχεια έγινε στατιστική σύγκριση των ρυθμών αύξησης για κάθε πείραμα ξεχωριστά (Κεφάλαιο Αποτελεσμάτων). Ο στατιστικός έλεγχος των διαφορών του SGR μεταξύ των πληθυσμών έγινε με χρήση ANCOVA (Statgraphics Plus v.5) Εικόνα : Θέση των μορφομετρικών σημείων που τοποθετήθηκαν για τη μέτρηση του μήκους της νωτοχορδής, NL, (πάνω) και του τυπικού μήκους, SL, (κάτω) στις νύμφες και στα ενήλικα zebrafish, αντίστοιχα. Τα δείγματα δε βρίσκονται υπό κλίμακα Δειγματοληψία για τον προσδιοριμό της αναλογίας φύλου Πολύ μετά το τέλος της εφαρμογής των πειραματικών συνθηκών, προσδιορίστηκε η αναλογία φύλου των - ενήλικών πλέον - zebrafish. Όλοι οι πειραματικοί πληθυσμοί υποβλήθηκαν σε αναισθητοποίηση (ethylenglycolmono-phenylether, C 0,15-0,25 ml/l), ατομική ψηφιακή φωτογράφηση και ζύγιση (0,001gr). Το φύλο αρχικά προσδιορίστηκε μακροσκοπικά, έχοντας ως βάση τους χαρακτήρες της διογκωμένης κοιλιάς των θηλυκών ατόμων και του κίτρινου χρώματος των αρσενικών, ενώ τα αποτελέσματα επιβεβαιώθηκαν με μακροσκοπική με ανατομία των γονάδων και εξέτασή τους στο στερεοσκόπιο Ανάλυση του σχήματος του σώματος των ενήλικων zebrafish-γεωμετρική Μορφομετρία Για τη μελέτη της επίδρασης της πυκνότητας του πληθυσμού στην εξωτερική μορφολογία του σώματος των ενήλικων zebrafish, 30 τυχαία επιλεγμένα άτομα ανά φύλο, πειραματικό πληθυσμό και συνθήκη υποβλήθηκαν σε ανάλυση γεωμετρικής μορφομετρίας. Στη ψηφιακή φωτογραφία κάθε ατόμου τοποθετήθηκαν 15 ομόλογα μορφομετρικά σημεία σε αντίστοιχες διακριτές ανατομικές θέσεις, χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα tpsdig (έκδοση 1.37) (Εικόνα ). Στο Κεφάλαιο , της παρούσας εργασίας αναλύεται λεπτομερώς η μέθοδος της γεωμετρικής μορφομετρίας. Για την εκτίμηση των πλεγμάτων παραμόρφωσης, με τα οποία παρουσιάζονται οι διαφορές σώματος μεταξύ των πληθυσμών που δέχτηκαν την επίδραση διαφορετικής πυκνότητας πληθυσμού, έγινε ανάλυση πολλαπλής παλινδρόμησης των ομοιόμορφων και μη ομοιόμορφων συνιστωσών του σχήματος, με τις μεταβλητές ανάλυσης των κανονικών συνιστωσών (tpsregr, έκδοση 1.07, Rohlf 1996) (Georga & Koumoundouros, 2010).

100 Εικόνα : Θέση των 15 μορφομετρικών σημείων που χρησιμοποιήθηκαν στα ενήλικα άτομα zebrafish. (1) Άκρο του ρύγχους. (2) Βάση της πρώτης ακτίνας του ραχιαίου πτερυγίου. (3) Βάση της τελευταίας ακτίνας του ραχιαίου πτερυγίου. (4) Άνω άκρο της βάσης των ουραίων λεπιδοτριχίων. (5) Μέσο της βάσης των ουραίων λεπιδοτριχίων. (6) Κάτω άκρο της βάσης των ουραίων. (7) Οπίσθιο άκρο της βάσης του εδρικού πτερυγίου. (8) Πρόσθιο άκρο βάσης εδρικού πτερυγίου. (9) Πρόσθιο άκρο της βάσης του κοιλιακού πτερυγίου. (10) Βάση της πρώτης ακτίνας του θωρακικού πτερυγίου. (11) Κάτω άκρο βραγχιακού επικαλύμματος. (12) Οπίσθιο άκρο βραγχιακού επικαλύμματος. (13) Εγγύς ως προς το ρύγχος σημείο του οφθαλμού. (14) Σημείο τομής του οφθαλμού από την ευθεία που σχηματίζεται από τα σημεία 1 και 13. (15) Κάτω άκρο γναθικού οστού Σύσταση & εκτροφή των πειραματικών πληθυσμών Οι πειραματικοί πληθυσμοί προήλθαν από κοινό απόθεμα αυγών, προερχόμενο από κοινό απόθεμα γεννητόρων «άγριου τύπου» (ZF WT2 F5, Wageningen Agricultural University, The Netherlands), οι οποίοι διατηρούνταν σε ενυδρεία χωρητικότητας 8L. Τα ενυδρεία αυτά αποτελούσαν μέρος του αυτοματοποιημένου συστήματος εκτροφής zebrafish ZebTEC (Aquatics Zebrafish Housing System, Techniplast, Italy). Η διατήρηση και η εκτροφή των νυμφών και των ενήλικων ψαριών πραγματοποιήθηκε βάσει της μεθοδολογίας που περιγράφεται στο «The Zebrafish Book» (Westerfield 1995). Η θερμοκρασία παρέμενε σταθερή στους 28±1 C και η φωτοπερίοδος ήταν 14:10h L:D. Το ph ήταν ίσο με 7,0-7,2 και η συγκέντρωση των αμμωνιακών και νιτρώδων ιόντων διατηρούνταν μικρότερη του 0,1mg/L. Ο κορεσμός του οξυγόνου στο νερό κυμαινόταν μεταξύ %. Η ανανέωση του νερού των ενυδρείων έφτανε το 100% h -1, ενώ το κλειστό σύστημα ZebTEC ήταν ρυθμισμένο έτσι ώστε να υποβάλλεται καθημερινά σε 20% ανανέωση του νερού. Το νερό των ενυδρείων προερχόταν από το νερό του αστικού δικτύου ύδρευσης, το οποίο προηγουμένως επεξεργαζόταν από σύστημα ανάστροφης ώσμωσης (reverse osmosis). Οι γεννήτορες ταΐζονταν με βιομηχανική τροφή (Brine Shrimp Flakes, Ocean Nutrition και Cichlid Omni, Ocean Nutrition το πρωί και το απόγευμα, αντίστοιχα). Οι γεννήστρες για την απόθεση των αυγών τοποθετούνταν αρκετές ώρες μετά το απογευματινό τάισμα. Τα γονιμοποιημένα αυγά λαμβάνονταν την επόμενη ημέρα το πρωί και εμβαπτίζονταν δύο περίπου λεπτά σε διάλυμα υπεροξειδίου του υδρογόνου (3%) για την απομάκρυνση μυκήτων. Και στα δύο πειράματα, μετά την κατανάλωση της λεκίθου οι νύμφες ταΐζονταν 4 φορές την ημέρα με πρωτόζωα του γένους Paramecium (BLADES BIOLOGICAL, Paramecium LZA 020) ( 10 πρωτόζωα / ml), η καλλιέργεια των οποίων γινόταν στο εργαστήριο. Μετά από περίπου 14dpf, τη διατροφή των νυμφών συνιστούσαν πρωτόζωα και ναύπλιοι Artemia sp. (στάδιο Instar I) (Salt Creek, Select Brine Shrimp Eggs, Nitro Pak). Στη συνέχεια, 25-30dpf, τα ιχθύδια άρχιζαν να τρέφονται με βιομηχανική τροφή, όπως και τα ενήλικα άτομα (Brine Shrimp Flakes, Ocean Nutrition και Cichlid Omni, Ocean Nutrition, το πρωί και το απόγευμα, αντίστοιχα). Όπως έχει ειπωθεί κατά την επεξήγηση του πειραματικού σχεδιασμού, από την αρχή μέχρι το τέλος του κάθε πειράματος η θερμοκρασία ήταν 28±1 C, και η φωτοπερίοδος 14:10h L:D. Ο κορεσμός νερού σε οξυγόνο στα ενυδρεία ήταν 70-95%. Η συγκέντρωση των αμμωνιακών και νιτρώδων ιόντων ήταν μικρότερη από 0,1 mg/l. Η κυκλοφορία του νερού στα ενυδρεία ήταν 100% h -1.

101 3.3. Συνεπίδραση της θερμοκρασίας και της φωτοπεριόδου κατά την πρώιμη ανάπτυξη, στη φαινοτυπική και στην οντογενετική και πλαστικότητα του zebrafish Πειραματικός Σχεδιασμός 99 Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν στο εργαστήριο της Ιχθυολογίας του Τμήματος Βιολογίας του Πανεπιστημίου Πατρών. Στόχος ήταν να μελετηθεί η συνεπίδραση θερμοκρασίας φωτοπεριόδου κατά τη διάρκεια των πρώιμων και όψιμων οντογενετικών σταδίων, στην αναλογία φύλου, στο ρυθμό αύξησης και στη σχέση ανάπτυξης και διαφοροποίσης, μελετώντας το ρυθμό διαφοροποίησης των ατόμων, σε σχέση με το ολικό μήκος σώματος, TL. Σύμφωνα με τον πειραματικό σχεδιασμό που ακολουθήθηκε, εφαρμόστηκαν τρεις συνθήκες θερμοκρασίας (22, 28, 32 C) συνδυαστικά με δύο συνθήκες φωτοπεριόδου (14:10 ή 8:16 ώρες φωτός : σκότους, L:D) από τη γονιμοποίηση μέχρι τα 12-14mm ολικό μήκος σώματος TL, στάδιο στο οποίο έχει ολοκληρωθεί η διαφοροποίηση γονάδων (Jorgensen et al. 2008). Η διατήρηση και η εκτροφή των αυγών, νυμφών και των ενήλικων ατόμων πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τον Westerfield (1995) (όπως περιγράφεται στο ). Αυγά zebrafish προερχόμενα από κοινό γενετικό απόθεμα [κοινό απόθεμα γεννητόρων «άγριου τύπου» (ZF WT2 F5, Wageningen Agricultural University, The Netherlands)], αφέθηκαν για 24 ώρες σε θερμοκρασία 28 ±1 C προκειμένου να ολοκληρωθεί το στάδιο της γαστριδίωσης και στη συνλεχεια διαχωρίστηκαν σε έξι πλυθυσμούς, οι οποίοι υποβλήθηκαν σε συνδυασμό τριών θερμοκρασιακών συνθηκών (22, 28, 32 C) με δύο συνθήκες φωτοπεριόδου (14:10 ή 8:16 ώρες φωτός : σκότους, L:D). Αυτές οι πειραματικές συνθήκες επικράτησαν μέχρι το μέσο ολικό μήκος σώματος (TL) των αναπτυσσόμενων ιχθύων να φτάσει περίπου τα 12-14mm. Μετά το τέλος της περιόδου των διαφορετικών αυτών συνθηκών, η ανάπτυξη πραγματοποιήθηκε σε κοινές συνθήκες θερμοκρασίας (28±1 C) και φωτοπεριόδου (14h:10h L:D). Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις διπλούν. Η αρχική πυκνότητα πληθυσμών ήταν άτομα ανά λίτρο Δειγματοληψίες Κατά τη διάρκεια του πειράματος, από κάθε πειραματική συνθήκη και επανάληψη, λαμβάνονταν δείγματα προκειμένου να ελεγχθεί η επίδραση της θερμοκρασίας ανάπτυξης: Στην αναλογία φύλου των πειραματικών πληθυσμών Στο ρυθμό αύξησης των πειραματικών πληθυσμών Στο χρονισμό της οντογένεσης Δειγματοληψίες για τη μελέτη του ρυθμού αύξησης Κάθε 2-8 ημέρες λαμβάνονταν από τα ενυδρεία τυχαίο δείγμα 5-10 ατόμων, για τον υπολογισμό του ρυθμού αύξησης κάθε πληθυσμού. Τα άτομα, αφού αναισθητοποιούνταν (ethylenglycolmono-phenylether, σε συγκέντρωση C 0,15-0,25 ml/l), φωτογραφίζονταν ατομικά. Το ολικό μήκος κάθε ατόμου υπολογίστηκε από τις ψηφιακές φωτογραφίες, με το λογισμικό tpsdig (έκδοση 1.37) (Εικόνα ). Ο ρυθμός αύξησης για κάθε πληθυσμό

102 εκτιμήθηκε μετά από προσαρμογή των πειραματικών δεδομένων στο μοντέλο αύξησης SL = a esgr t (Ricker, 1978) με λογαριθμοποίηση των τιμών TL. O στατιστικός έλεγχος των διαφορών του SGR μεταξύ των πληθυσμών έγινε με χρήση ANCOVA (Statgraphics Plus v.5) Εικόνα : Θέση των μορφομετρικών σημείων που τοποθετήθηκαν για τη μέτρηση του ολικού μήκους σώματος (TL) στις νύμφες και στα ενήλικα zebrafish Δειγματοληψία για τον προσδιορισμό της αναλογίας φύλου Πολύ μετά το τέλος της εφαρμογής των πειραματικών συνθηκών, προσδιορίστηκε η αναλογία φύλου των - ενήλικών πλέον - zebrafish. Όλοι οι πειραματικοί πληθυσμοί υποβλήθηκαν σε αναισθητοποίηση (ethylenglycolmono-phenylether, C 0,15-0,25 ml/l), ατομική ψηφιακή φωτογράφηση και ζύγιση (0,001gr). Το φύλο αρχικά προσδιορίστηκε μακροσκοπικά, έχοντας ως βάση τους χαρακτήρες της διογκωμένης κοιλιάς των θηλυκών ατόμων και του κίτρινου χρώματος των αρσενικών, ενώ τα αποτελέσματα επιβεβαιώθηκαν με μακροσκοπική με ανατομία των γονάδων και εξέτασή τους στο στερεοσκόπιο Δειγματοληψίες για τη μελέτη του χρονισμού της οντογένεσης Τα δείγματα που πάρθηκαν για τη μελέτη του ρυθμού αύξησης, χρησιμοποιήθηκαν και για τη μελέτη της πλαστικότητας της οντογενετικής κλίμακας. Τα οντογενετικά χαρακτηριστικά που εξετάστηκαν ήταν: 1. Η εμφάνιση του ραχιαίου πτερυγίου (Dorsal) 2. Η εμφάνιση του εδρικού πτερυγίου (Anal). 3. Η εμφάνιση προπλασμάτων των κοιλιακών πτερυγίων (Abdominal) 4. Η αρχή κάμψης της νωτοχορδής (Flexion) 5. Ολοκλήρωση κάμψης της νωτοχορδής (Post-flexion) 6. Η ολοκλήρωση του σχηματισμού της ουραίας διχάλας (Caudal) Η παρουσία / απουσία (1 / 0) του κάθε οντογενετικού χαρακτηριστικού (δυαδικά δεδομένα) εκτιμήθηκε από την εξέταση ατομικών φωτογραφιών και συσχετίστηκε με το ολικό μήκος TL (μετρικά δεδομένα). Το TL 50 χρησιμοποιήθηκε για την εκτίμηση του σχετικού μήκους εμφάνισης των παραπάνω οντογενετικών χαρακτηριστικών των νυμφών. (αναλυτική περιφραφή στην , σελ. 66). Τα δεδομένα αυτά εφαρμόστηκαν στο λογιστικό μοντέλο TL 50 των Petrakis & Stergiou (1997) και εκτιμήθηκε το ολικό μήκος σώματος TL 50 στο οποίο ολοκληρώνεται η εμφάνιση / ανάπυξη των εξεταζόμενων οντογενετικών χαρακτήρων / σταδίων, καθώς και τα όρια εμπιστοσύνης αυτών των τιμών (95%).

103 4. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Στο Κεφάλαιο αυτό, αναλύονται τα αποτελέσματα των τριών πειραμάτων που πραγματοποιήθηκαν κατά τη μελέτη της φαινοτυπικής και οντογενετικής πλαστικότητας στo zebrafish, υπό την επίδραση της θερμοκρασίας, της πυκνότητας του πληθυσμού και της συνεπίδρασης θερμοκρασίας-φωτοπεριοδου κατά την πρώιμη ανάπτυξη. Επίσης παρατίθενται τα αποτελέσματα που προέκυψαν από τη συνδυαστική ανάλυση των αποτελεσμάτων που σχετίζονται με την επίδραση της θερμοκρασίας ανάπτυξης στο σχήμα του σώματος των ενήλικων αρσενικών και θηλυκών zebrafish, με τα αντίστοιχα αποτελέσματα από την εργασία των Georga & Koumoundouros (2010), όπου η επίδραση της θερμοκρασίας είχε πραγματοποιηθεί κατά την πρώιμη και κατά την όψιμη οντογενετική περίοδο, οι οποίες συμπεριλαμβάνονται στην παρούσα μελέτη. Η δομή του Κεφαλαίου των Αποτελεσμάτων έχει ως ακολούθως: Επίδραση της θερμοκρασίας ανάπτυξης στη φαινοτυπική και στην οντογενετική πλαστικότητα τoυ zebrafish Επίδραση της θερμοκρασίας ανάπτυξης στο ρυθμό αύξησης Επίδραση της θερμοκρασίας ανάπτυξης στην αναλογία φύλου Επίδραση της θερμοκρασίας ανάπτυξης στο χρονισμό της οντογένεσης Επίδραση της θερμοκρασίας ανάπτυξης στο σχήμα σώματος των νυμφών και των ενήλικων αρσενικών και θηλυκών zebrafish Επίδραση της θερμοκρασίας ανάπτυξης στη γονιδιακή έκφραση των ενήλικων αρσενικών και θηλυκών zebrafish Οντογενετικό προφίλ της γονιδιακής έκφρασης, κατά την εφαρμογή των διαφορετικών θερμοκρασιακών συνθηκών 4.2. Έλεγχος της πιθανής αθροιστικής δράσης της θερμοκρασίας ανάπτυξης στο σχήμα του σώματος των ενήλικων zebrafish-συνδυαστική ανάλυση 4.3. Επίδραση της πυκνότητας του πληθυσμού στη φαινοτυπική πλαστικότητα του zebrafish Επίδραση της πυκνότητας του πληθυσμού, στο ρυθμό αύξησης Επίδραση της πυκνότητας του πληθυσμού, στην αναλογία φύλου Επίδραση πυκνότητας του πληθυσμού, στο σχήμα του σώματος των ενήλικων θηλυκών και αρσενικών zebrafish 4.4. Συνεπίδραση της θερμοκρασίας και της φωτοπεριόδου κατά την πρώιμη ανάπτυξη, στη φαινοτυπική και στην οντογενετική πλαστικότητα του zebrafish Συνεπίδραση της θερμοκρασίας και της φωτοπεριόδου κατά την πρώιμη ανάπτυξη, στο ρυθμό αύξησης Συνεπίδραση της θερμοκρασίας και της φωτοπεριόδου κατά την πρώιμη ανάπτυξη, στην αναλογία φύλου Συνεπίδραση της θερμοκρασίας και της φωτοπεριόδου κατά την πρώιμη ανάπτυξη, στο χρονισμό της οντογένεσης

104 4.1. Επίδραση της θερμοκρασίας ανάπτυξης στη φαινοτυπική και στην οντογενετική πλαστικότητα τoυ zebrafish Επίδραση της θερμοκρασίας ανάπτυξης στο ρυθμό αύξησης 102 Στο παρόν κεφάλαιο εξετάζεται η επίδραση της θερμοκρασίας στο ρυθμό αύξησης των πληθυσμών. Το αρχικό μέσο ολικό μήκος σώματος των νυμφών κυμαίνεται από - περίπου - 3,6 mm TL (στους 22 C-A πειραματική επανάληψη) έως 4,0 mm TL (στους 32 C-Β πειραματική επανάληψη) (Πίνακας 14). Όσο προχωράει η ανάπτυξη, το μέσο ολικό μήκος σώματος των νυμφών κατά τις ίδιες ημέρες μετά τη γονιμοποίηση (dpf), είναι μεγαλύτερο όσο υψηλότερη είναι η θερμοκρασία (Πίνακας 14, Εικόνα ). Τα άτομα που αναπτύχθηκαν στους 32 C έχουν μεγαλύτερο μήκος σώματος σε σύγκριση με τους 28 C στον ίδιο χρόνο (σε dpf) και αυτά με τη σειρά τους μεγαλύτερο μήκος σε σύγκριση με τους 22 ο C (Εικόνα ). Εικόνα : Καμπύλες αύξησης του μέσου ολικού μήκους (TL±1SD) των νυμφών zebrafish στις διαφορετικές συνθήκες θερμοκρασίας (22, 28, 32 C), για την πρώτη (Α) και δεύτερη (Β) πειραματική επανάληψη. Ο λευκός ρόμβος αντιστοιχεί στους 22 C, ο γκρι κύκλος στους 28 C και το μαύρο τετράγωνο στους 32 C. dpf, ημέρες μετά τη γονιμοποίηση. Ο ρυθμός αύξησης κάθε πληθυσμού εκτιμήθηκε ύστερα από προσαρμογή των πειραματικών δεδομένων στο μοντέλο αύξησης TL=a e SGR t (Ricker, 1978), με λογαρίθμηση των τιμών TL. Η επίδραση της θερμοκρασίας στο ρυθμό αύξησης, ελέγχθηκε με ανάλυση συνδιασποράς ANCOVA (Statgraphics Plus v.5). Τα πειραματικά δεδομένα είχαν καλή προσαρμογή στο θεωρητικό μοντέλο αύξησης που εφαρμόστηκε (Πίνακας 15). Ανάλογα με τις πειραματικές συνθήκες, ο ρυθμός αύξησης (SGR) των νυμφών Danio rerio κατά την εξεταζόμενη οντογενετική περίοδο κυμάνθηκε από 0,035 έως 0,050d -1 (Πίνακας 15). Η σύγκριση των ρυθμών αύξησης, εντός κάθε πειραματικής επανάληψης, έδωσε τα ακόλουθα αποτελέσματα: Κατά την πρώτη πειραματική επανάληψη, αύξηση της θερμοκρασίας από τους 22 στους 28 C και από τους 22 στους 32 C, προκάλεσε αύξηση του ρυθμού αύξησης (με p<0,05 και p<0,01, αντίστοιχα) (Πίνακας 15). Ανάλογα ήταν τα αποτελέσματα και κατά τη δεύτερη πειραματική επανάληψη (με p<0,1 για τη σύγκριση του SGR μεταξύ 22 και 28 C και με p<0,001 για τη σύγκριση του SGR μεταξύ 22 και 32 C). Κατά τη δεύτερη πειραματική επανάληψη, αύξηση της θερμοκρασίας από τους 28 στους 32 C, προκάλεσε αύξηση του ρυθμού αύξησης (p<0,05) (Πίνακας 15). Ο στατιστικός έλεγχος δεν επιβεβαίωσε

105 σημαντική διαφορά μεταξύ του SGR των 28 C και των 32 C της πρώτης πειραματικής επανάληψης. Πίνακας 14: Κατά τη διάρκεια του πειράματος, από κάθε πειραματική συνθήκη (Τ=22, 28 και 32 C) και επανάληψη (A και B) λαμβάνονταν ανά τακτά χρονικά διαστήματα δείγματα 10 ατόμων για τον προσδιορισμό του ρυθμού αύξησης (SGR) κάθε πληθυσμού. Η 1 η δειγματοληψία πραγματοποιήθηκε κατά την εκκόλαψη (3dpf-32 C, 4dpf-28 C και 5dpf-22 C), ενώ η 2 η πραγματοποιήθηκε την ημέρα που οι νύμφες αποκολλήθηκαν από τα τοιχώματα των ενυδρείων. Ακολούθως, οι δειγματοληψίες πραγματοποιούνταν κάθε 3-5 ημέρες. Στον παρακάτω πίνακα, αναγράφεται η ημέρα λήψης των δειγμάτων (σε dpf), η θερμοκρασιακή συνθήκη Τ ( C) για κάθε πειραματική επανάληψη (Α ή Β), καθώς και το μέσο μήκος των ατόμων που αποτέλεσαν το δείγμα σε κάθε φωτογράφηση (TL±1SD). 103 dpf T ( C) TL±1SD dpf T ( C) TL±1SD dpf T ( C) TL±1SD Replicate A ,59±0, ,94±0, ,77±0, ,21±0, ,26±0, ,05±0, ,66±0, ,35±0, ,26±0, ,54±0, ,96±0, ,20±0, ,49±0, ,74±0, ,16±0, ,00±0, ,33±0, ,91±0, ,55±0, ,87±0, ,28±0, ,14±1, ,48±0, ,67±2, ,89±0, ,69±0, ,81±2,43 Replicate B ,87±0, ,74±0, ,95±0, ,15±0, ,19±0, ,89±0, ,27±0, ,28±0, ,38±0, ,94±0, ,87±0, ,19±0, ,38±0, ,90±0, ,59±0, ,32±0, ,03±0, ,41±0, ,24±1, ,89±0, ,72±1, ,65±0, ,43±0, ,66±1, ,61±0, ,73±1, ,37±1,69 Πίνακας 15: Οι παράμετροι της σχέσης ΤL = a e SGR t για κάθε πειραματική συνθήκη (Τ) και επανάληψη (Replicate Α και Β). a, the total length of the fish, when t 0 =0. SGR, o ειδικός ρυθμός αύξησης του ολικού μήκους σώματος των ιχθύων. R 2, ο συντελεστής συσχέτισης που αποδεικνύει την καλή προσαρμογή των δεδομένων στο θεωρητικό μοντέλο αύξησης. n, ο αριθμός των δειγματοληψιών. p, το μικρότερο παρατηρούμενο επίπεδο σημαντικότητας για τις στατιστικά σημαντικές διαφορές των τιμών SGR μεταξύ των διαφορετικών θερμοκρασιακών συνθηκών. Εντός κάθε πειραματικής επανάληψης. Οι κοινοί εκθέτες των τιμών SGR υποδεικνύουν διαφορετικούς ρυθμούς αύξησης, εντός κάθε επανάληψης. Replicate T ( C) SGR lna R² n p 22 0,037 1,121 a, b 0,974 9 a ** A 28 0,045 1,141 a 0, b *** 32 0,050 1,138 b 0, ,035 1,158 c, e 0, c * B 28 0,042 1,168 c, d 0,992 9 d * 32 0,049 1,156 d, e 0,971 9 e ***

106 Επίδραση της θερμοκρασίας ανάπτυξης στην αναλογία φύλου Στις 265 dpf προσδιορίστηκε η αναλογία φύλου των πληθυσμών που είχαν δεχτεί τη διαφορετική θερμοκρασιακή επίδραση. Για κάθε πειραματικό πληθυσμό, προσδιορίστηκε το μέσο βάρος (W±1SD, σε mg) και το μέσο τυπικό μήκος (SL±1SD, σε mm) των θηλυκών και αρσενικών ατόμων (Πίνακας 17). Σε όλους τους πειραματικούς πληθυσμούς, με εξαίρεση τον πληθυσμό των 32 C της 2 ης πειραματικής επανάληψης, ήταν αδύνατο να προσδιοριστεί το φύλο 34 συνολικά ψαριών, ακόμα και ύστερα από ανατομία των γονάδων τους (Πίνακας 16). Τα ψάρια αυτά είχαν μικρότερο μέγεθος συγκριτικά με όλα τα υπόλοιπα, το φύλο των οποίων προσδιορίστηκε αρχικά μακροσκοπικά και επιβεβαιώθηκε στη συνέχεια με ανατομία των γονάδων τους. Το τυπικό μήκος σώματος των απροσδιόριστων ατόμων μετρήθηκε στα 19,13±1,31mm (mean SL±1SD) και το βάρος τους ήταν 150,78±72,28mg (mean W±1SD), τιμές σημαντικά διαφορετικές (t-test, p<0,001) από τις αντίστοιχες τιμές μήκους και βάρους των αρσενικών και των θηλυκών ατόμων κάθε θερμοκρασιακής συνθήκης και επανάληψης, όπως αυτές δίνονται στον Πίνακα 17. Τα απροσδιόριστου φύλου άτομα ήταν πιθανότατα αδιαφοροποίητα, αφού η ανατομία των γονάδων τους και η μικροσκοπική παρατήρηση δεν μπορούσε να οδηγήσει σε ασφαλές συμπέρασμα για το αν πρόκεται για ωοθηκικό ή ορχικο ιστό. Η αναλογία φύλου για κάθε πειραματικό πληθυσμό, υπολογίστηκε από το σύνολο των ατόμων που το φύλο τους ήταν δυνατό να προσδιοριστεί (Πίνακας 16, Εικόνα ). 104 Πίνακας 16: Το πλήθος (n) και το ποσοστό (%) των θηλυκών (Females) και αρσενικών (Males) ατόμων στις θερμοκρασίες (T) των 22 C, 28 C και 32 C, στην πρώτη (A) και στη δεύτερη (B) επανάληψη. Σε όλους τους πειραματικούς πληθυσμούς, με εξαίρεση τον πληθυσμό των 32 C της 2ης πειραματικής επανάληψης, ήταν αδύνατο να προσδιοριστεί το φύλο 34 συνολικά ψαριών (Indefinable). Rep. Τ ( ο (n) (n) % % (n) C) Females Males Females Males Indefinable ,65 78,35 2 Α ,83 49, ,24 52, ,19 73,81 5 Β ,22 45, ,80 43,20 0 Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι στη θερμοκρασία των 22 C η αναλογία φύλου μετατοπίστηκε υπέρ των αρσενικών ατόμων. Πιο συγκεκριμένα, και στις δύο πειραματικές επαναλήψεις, η θερμοκρασία ανάπτυξης επέδρασε σημαντικά στην αναλογία φύλου του zebrafish, με τα ποσοστά των θηλυκών ατόμων (21,65% και 26,19% για την πρώτη και τη δεύτερη πειραματική επανάληψη, αντίστοιχα) να είναι σημαντικά χαμηλότερα στη θερμοκρασία των 22 C σε σχέση με τους 28 C (50,83% και 54,22% για την πρώτη και τη δεύτερη πειραματική επανάληψη, αντίστοιχα) (p<0,001 G-test) και τους 32 C (47,24% και 56,80% για την πρώτη και τη δεύτερη πειραματική επανάληψη, αντίστοιχα) (p<0,001 G-test). Μεταξύ των 28 και 32 C, δεν παρατηρήθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές στην αναλογία φύλου, τόσο στην πρώτη, όσο και στη 2 η πειραματική επανάληψη (p>0,05 G-test).

107 % Females Replicate A Replicate B *** *** *** *** Temperature ( C) Temperature ( C) Εικόνα : Επί τοις εκατό ποσοστό των θηλυκών ατόμων zebrafish στους τρεις πειραματικούς πληθυσμούς των 22, 28 και 32 C. Παρουσιάζονται τα αποτελέσματα για την πρώτη (Replicate A) και τη δεύτερη (Replicate B) πειραματική επανάληψη. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι στη θερμοκρασία των 22 C η αναλογία φύλου μετατοπίστηκε υπέρ των αρσενικών ατόμων. Και στις δύο πειραματικές επαναλήψεις, παρατηρήθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές στην αναλογία φύλου μεταξύ των πληθυσμών που αναπτύχθηκαν στους 22 και 28 C (p<0,01 G-test) και μεταξύ των πληθυσμών που αναπτύχθηκαν στους 22 και 32 C (p<0,01 G-test). Δεν υπήρξαν στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ των πληθυσμών που αναπτύχθηκαν στους 22 και 32 C. Πίνακας 17: Μέσο βάρος (W±1SD, mg) και μέσο τυπικό μήκος (SL±1SD, mm) των αρσενικών και θηλυκών zebrafish που χρησιμοποιήθηκαν για τον καθορισμό της αναλογίας φύλου των πληθυσμών που αναπτύχθηκαν στις τρεις διαφορετικές θερμοκρασιακές συνθήκες (22, 28 και 32 C). Α: 1 η πειραματική επανάληψη. Β: 2 η πειραματική επανάληψη. Females Males Rep. T ( C) Weight (mg) SL±SD (mm) Weight (mg) SL±SD (mm) ,45±251,23 29,26 ± 1,14 460,81±90,05 29,05 ± 1,25 A ,78±138,31 30,71 ± 2,04 352,42±89,10 28,11 ± 1, ,34±124,81 30,02 ± 2,11 361,04±74,84 29,01 ± 0, ,38±132,56 27,34 ± 2,41 296,04±83,67 27,10 ± 1,15 B ,78±149,33 29,35 ± 2,47 319,39±77,69 26,99 ± 2, ,85±160,28 30,91 ± 2,05 386,46±67,69 29,27 ± 1,15

108 Επίδραση της θερμοκρασίας ανάπτυξης στο χρονισμό της οντογένεσης των μεριστικών χαρακτήρων Προκειμένου να μελετηθεί η επίδραση της θερμοκρασίας στο χρονισμό της οντογένεσης, καταγράφηκε το μέσο SL 50 στο οποίο ολοκληρώνεται η εμφάνιση ανάπτυξη των ακόλουθων οντογενετικών χαρακτήρων (Πίνακας 18, Εικόνα , ): 1. Ανάπτυξη του πρώτου υπουραίου οστού 2. Ανάπτυξη του επουραίου οστού 3. Αριθμός των πτερυγιοφόρων του ραχιαίου πτερυγίου 4. Αριθμός των πτερυγιοφόρων του εδρικού πτερυγίου 5. Ανάπτυξη προραχιαίων 6. Ανάπτυξη του ουρόστυλου 7. Ανάπτυξη των κοιλιακών πτερυγίων 8. Οστεοποίηση του πρώτου πτερυγιοφόρου του εδρικού πτερυγίου 9. Οστεοποίηση του πρώτου πτερυγιοφόρου του ραχιαίου πτερυγίου 10. Οστεοποίηση του επουραίου Όπως έχει ειπωθεί, όπου μελετήθηκε η ανάπτυξη ενός οντογενετικού χαρακτήρα, μέσω των ψηφιακών φωτογραφιών, ελεγχθηκε η παρουσία / απουσία (1/0) του χόνδρου αυτού του χαρακτήρα, ενώ όπου μελετήθηκε η οστεοποίηση ενός χαρακτήρα, ελεγχθηκε η παρουσία / απουσία (1/0) οστίτη ιστού σε αυτόν. Σε ό,τι αφορά στα πτερυγιοφόρα του εδρικού πτερυγίου, όσα άτομα είχαν λιγότερα από 10, σημειώθηκαν ως άτομα στα οποία ο χαρακτήρας απουσιάζει (0), ενώ όσα έφεραν πτερυγιοφόρα, σημειώθηκαν ως άτομα στα οποία η ανάπτυξη του εν λόγω χαρακτήρα έχει ολοκληρωθεί (1). Αντίστοιχα, για τα πτερυγιοφόρα του ραχιαίου πτερυγίου, όσα άτομα είχαν λιγότερα από 8 πτερυγιοφόρα σημειώθηκαν ως άτομα στα οποία ο χαρακτήρας απουσιάζει (0), ενώ όπου ο αριθμός των πτερυγιοφόρων ήταν από 8-10, η ανάπτυξη του εν λόγω χαρακτήρα καταγράφηκε ως ολοκληρωμένη (1). 106 Εικόνα : Οι μεριστικοί χαρακτήρες που εξετάστηκαν κατά τη μελέτη του χρονισμού της οντογένεσης, υπό την επίδραση της θερμοκρασίας. Το εικονιζόμενο ψάρι έχει τυπικό μήκος σώματος (SL) ίσο με 7,5 mm. Δεν έχουν άρχίσει να φαίνονται τα προπλάσματα των κοιλιακών πτερυγίων.

109 Εικόνα : Οντογένεση των εξεταζόμενων μεριστικών χαρακτήρων, στο zebrafish. Τα δείγματα δε βρίσκονται υπό κλίμακα. Το τυπικό μήκος σώματος των εικονιζόμενων ψαριών, αναγράφεται ακολούθως: (Ι) 3,4 mm SL (ΙΙ) 4 mm SL (ΙΙΙ) 5 mm SL (IV) 5,5 mm SL (V) 6 mm SL (VII) 7 mm SL (VIII) 7,5 mm SL (IX) 8,2 mm SL (X) 9,4 mm SL (XI) 10,7 mm SL. Δεξιά, εικονίζονται υπό μεγένθυνση και σε διαφορετικά στάδια ανάπτυξης οι ακόλουθοι μεριστικοί χαρακτήρες: Πτερυγιοφόρα του εδρικού πτερυγίου (Anl). Πτερυγιοφόρα του ραχιαίου πτερυγίου (Drs). Υπουραίο οστό (Hyp). Επουραίο οστό (Epr). Προ-ραχιαία οστά (Prd). Κοιλιακά πτερύγοα (Plv). H οστεοποίηση του πρώτου πτερυγιοφόρου του εδρικού πτερυγίου, του πρώτου πτερυγιοφόρου του ραχιαίου πτερυγίου, και του επουραίου, γίνεται αισθητή από την αλλαγή του μπλε χρώματος (από το κυανό της Ασαλτίας που βάφει τους χόνδρους) σε κόκκινο (από το Κόκκινο της Αλιζαρίνης που βάφει τον οστίτη ιστό). Στη φάση της αλλαγής τα οστά μπορεί να φαίνονται ως άχρωμα / διάφανα. Τα δείγματα δε βρίσκονται υπό κλίμακα. 107

110 Στις εικόνες , και αναπαρίστανται γραφικά τα αποτελέματα από τον παραπάνω έλεγχο. Ο στατιστικός έλεγχος των διαφορών μεταξύ των SL 50, μεταξύ διαφορετικών θερμοκρασιακών συνθηκών, έγινε με t-test (p<0,01) (αναλυτικά στο Κεφάλαιο Υλικά & Μέθοδοι, Παράγραφος ) (Εικόνα ). Επίσης, χρησιμοποιώντας τον τύπο Q 10 =(K 2 /K 1 ) 10/(T2-T1), και βάζοντας όπου Κ 1 και Κ 2 το μέσο SL 50 όπου επιτελείται η ανάπτυξη του εκάστοτε οντογενετικού χαρακτήρα, στην αντίστοιχη θερμοκρασιακή συνθήκη (Τ 1 και Τ 2 ), προσδιορίστηκε, σε κάθε περίπτωση, ο συνελεστής θερμοκρασίας Q 10 (Πίνακας 19). 108 Πίνακας 18: Επίδραση της θερμοκρασίας πρώιμης ανάπτυξης (22, 28 και 32 C) στην οντογένεση των μεριστικών χαρακτήρων που εξετάστηκαν στην παρούσα εργασία. Δίνεται το SL 50 ±1SD (mm), δηλαδή το μέσο τυπικό μήκος στο οποίο το 50% του πλήθους των ατόμων (Ν) που εξετάστηκε από κάθε πειραματικό πληθυσμό, έχει ολοκληρώσει την εμφάνιση του εν λόγω χαρακτήρα. Ίδιοι εκθέτες υποδεικνύουν όμοιο SL 50 μεταξύ των διαφορετικών θερμοκρασιακών συνθηκών (t-test, p>0,01). 1. development 1 st hypural (ανάπτυξη πρώτου υπουραίου οστού) 2. development epural (ανάπτυξη επουραίου οστού 3. n pterygiophores dorsal (αριθμός πτερυγιοφόρων ραχιαίου πτερυγίου) 4. n pterygiophores anal (αριθμός πτερυγιοφόρων εδρικού πτερυγίου) 5. development predorsal (ανάπτυξη προραχιαίων) 6. development urostyle (ανάπτυξη ουρόστυλου) 7. development pelvic (ανάπτυξη κοιλιακών πτερυγίων) 8. ossification 1 st anal pterygiophore (οστεοποίηση πρώτου πτερυγιοφόρου εδρικού πτερυγίου) 9. Ossification 1 st dorsal pterygiophore (οστεοποίηση πρώτου πτερυγιοφόρου ραχιαίου πτερυγίου) 10. ossification epural (οστεοποίηση επουραίου). SL 50 ±1SD(mm) Examined character 22 C (N=221) 28 C (N=190) 32 C (N=179) 1. development 1 st hypural 4,08±0,59 d 4,25±0,15 4,10±0,11 d 2. development epural 6,39±0,50 5,97±0,10 6,17±0,19 3. n pterygiophores dorsal 7,06±0,42 6,85±0,26 6,59±0,14 4. n pterygiophores anal 7,36±0,54 7,12±0,18 6,53±1,56 5. development predorsal 7,39±0,46 e 7,32±0,27 e 7,39±1,19 e 6. development urostyle 7,19±0,66 7,39±0,19 6,81±0,41 7. development pelvic 9,20±0,30 8,30±0,30 8,00±0,30 8. ossification 1 st anal pterygiophore 8,26±1,24 a 8,61±0,44 b 8,27±1,53 a, b 9. ossification 1 st dorsal pterygiophore 9,61±1,11 9,09±0,58 c 8,85±1,36 c 10. ossification epural 8,86±0,63 9,15±0,95 8,36±1,45 Η ανάπτυξη του 1 ου υπουραίου οστού ολοκληρώνεται νωρίτερα από όλους τους υπόλοιπους εξεταζόμενους χαρακτήρες (Πίνακας 18), ενώ η οστεοποίηση των πτερυγιοφόρων του εδρικού και του ραχιαίου πτερυγίου, καθώς και του επουραίου οστού είναι χαρακτήρες των οποίων η ανάπτυξη ολοκηρώνεται στο τέλος της εξεταζόμενης οντογενετικής περιόδου (Πίνακας 18). Με εξαίρεση την ανάπτυξη των προραχιαίων οστών και την ανάπτυξη του υπουραίου οστού, σε όλες τις άλλες περιπτώσεις παρατηρήθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ τουλάχιστων δύο εκ των τριών διαφορετικών θερμοκρασιακών συνθηκών (Εικόνα , Πίνακας 18). Τα αποτελέσματα αναλύονται ακολούθως, σε συνδυασμό με το συνελεστή θερμοκρασίας Q 10. Στον πίνακα 19 παρουσιάζονται τα ποσοτά μεταβολής του ρυθμού ανάπτυξης του εκάστοτε μεριστικού χαρακτήρα, κατά τη μετάβαση από τη χαμηλότερη στην υψηλότερη πειραματική θερμοκρασία. Η θερμοκρασία ανάπτυξης δεν έχει καμία επίδραση στην οντογένεση των προραχιαίων οστών (p>0,01 t-test, Q 10 =1). Γενικά, η θερμοκρασία των 32 C επιταχύνει την ανάπτυξη όλων σχεδόν των μεριστικών χαρακτήρων, με εξαίρεση αυτή του επουραίου οστού η οποία πραγματοποιείται νωρίτερα (δηλαδή σε μικρότερο μήκος σώματος) στους 28 C, ενώ ακολουθούν οι 32 C και τελικά οι 22 C. Όμως, η παρατηρούμενη διαφορά στην ανάπτυξη του επουραίου οστού, δεν είναι στατιστικά σημαντική μεταξύ 28 και 32 C (p>0,01 t-test), αλλά μόνο μεταξύ των 22 C με τις δύο υψηλότερες θερμοκρασίες (p<0,01 t-test). Αύξηση της θερμοκρασίας από τους 22 στους 28 C προκαλεί αύξηση του ρυθμού ανάπτυξης του επουραίου οστού κατά 11%, ενώ η

111 αντίστοιχη τιμή, όταν η θερμοκρασία αυξάνεται από τους 22 στους 32 C, ισούται με 3%. Από τους υπόλοιπους μεριστικούς χαρακτήρες που μελετώνται, καθαρά θερμοκρασιακή απόκριση, υπό την έννοια του ότι αύξηση της θερμοκρασίας ανάπτυξης προκαλεί μείωση του σωματικού μεγέθους όπου επιτυγχάνονται τα διάφορα αναπτυξιακά γεγονότα, εμφανίζουν οι εξής χαρακτήρες: Η ανάπτυξη των πτερυγιοφόρων του ραχιαίου και του των πτερυγιοφόρων του εδρικού πτερυγίου, η ανάπτυξη των κοιλιακών πτερυγίων και η οστεοποίηση των πτερυγιοφόρων του ραχιαίου πτερυγίου. Σε αυτές τις περιπτώσεις, η ανάπτυξη των εξεταζόμενων μεριστικών χαρακτήρων πραγματοποιείται σε μικρότερο μήκος σώματος στους 32 C, ακολουθούν οι 28 C και τελικά οι 22 C. Από τον κατά ζεύγη στατιστικό έλεγχο μεταξύ των διαφορετικών θερμοκρασιακών συνθηκών, αποδείχτηκε ότι οι παρατηρούμενες διαφορές στο μήκος σώματος όπου επιτελείται η ανάπτυξη των παραπάνω εξεταζόμενων μεριστικών χαρακτήρων είναι σε κάθε περίπτωση στατιστικά σημαντικές (p<0,01 t-test), με εξαίρεση την ανάπτυξη των πτερυγιοφόρων του ραχιαίου πτερυγίου και την οστεοποίηση των πτερυγιοφόρων του ραχιαίου, μεταξύ 28 και 32 C (p>0,01 t-test). Ο ρυθμός με τον οποίο αυξάνεται η ανάπτυξη των παραπάνω μεριστικών χαρακτήρων, με αύξηση της θερμοκρασίας, αναγράφεται στον Πίνακα 19 και κυμαίνεται από 5-20%. Η ανάπτυξη του 1 ου υπουραίου οστού και η οστεοποίηση των πτερυγιοφόρων του εδρικού, συμβαίνει στο ίδιο περίπου μήκος σώματος για τους 22 και 32 C (p>0,01 t-test, Q 10 =1) και νωρίτερα (δηλαδή σε μικρότερο μήκος σώματος) από ότι στους 28 C. Η ανάπτυξη του 1 ου υπουραίου οστού διαφοροποιείται στατιστικά μόνο μεταξύ 28 και 32 C (p<0,01 t- test), όπου η αύξηση της θερμοκρασίας από τους 28 στους 32 C αυξάνει το ρυθμό ανάπτυξης (μείωση του SL 50 ) κατά 9%. Η οστεοποίηση των πτερυγιοφόρων του εδρικού στους 28 C διαφοροποιείται στατιστικά τόσο από τους 22, όσο και 32 C. Τέλος, η ανάπτυξη του ουρόστυλου και η οστεοποίηση του επουραίου οστού, συμβαίνει περίπου στα 6,81 και 8,38 mm SL, αντίστοιχα, στα άτομα των 32 C, ενώ ακολουθούν οι 22 C (στα 7,19 και 8,86 mm SL) και τελικά οι 28 C (7,39 και 9,15 mm SL). Από τον κατα ζεύγη στατιστικό έλεγχο των παρατηρούμενων διαφορών μεταξύ των τριών διαφορετικών θερμοκρασιακών συνθηκών, προέκυψε ότι οι 32 C διαφοροποιούνται στατιστικά από τις δύο χαμηλότερες θερμοκρασίες (p<0,01 t-test), ενώ οι διαφορές μεταξύ 22 και 28 C, δεν είναι στατιστικά σημαντικές. Στους 32 C η ανάπτυξη των πτερυγιοφόρων του εδρικού πτερυγίου συμβαίνει σε μήκος σώματος πολύ μικρότερο από ότι στους 22 και 28 C και μάλιστα προηγούνται της ανάπτυξης των πτερυγιοφόρων του ραχιαίου και της ανάπτυξης του ουρόστυλου στα άτομα της ίδιας θεμοκρασιακής συνθήκης. Στους 32 C συμβαίνει πολύ νωρίτερα και η οστεοποίηση των επουραίων, σε σχέση με τους 22 και 28 C. Η ανάπτυξη των κοιλιακών πτερυγίων και η οστεοποίηση των πτερυγιοφόρων του εδρικού πτερυγίου καθυστερεί σημαντικά στους 22 C. Μάλιστα, στους 28 και 32 C η ανάπτυξη των κοιλιακών πτερυγίων συμβαίνει πολύ νωρίτερα από την οστεοποίηση των πτερυγιοφόρων του εδρικού και την οστεοποίηση των επουραίων, στα άτομα της ιδιας θερμοκρασιακής συνθήκης, κατί το οποίο δεν ισχύει στους 22 C, γεγονός που σηματοδοτεί διαφοροποίηση στην αλληλουχία αυτών των οντογενετικών γεγονότων, ως αποτέλεσμα της δράσης της θερμοκρασίας. Αντίστοιχα, η εμφάνιση του ουρόστυλου προηγείται της ανάπτυξης των πτερυγιοφόρων του εδρικού στους 22 C, ενώ συμβαίνει το αντίθετο στους 28 C. 109

112 110 Εικόνα : Τα διαγράμματα αφορούν στην επίδραση της θερμοκρασίας πρώιμης ανάπτυξης (22, 28 και 32 C) στην οντογένεση των ακόλουθων μεριστικών χαρακτήρων: ανάπτυξη ουρόστυλου (development urostyle), ανάπτυξη 1ου υπουραίου οστού (development 1 st hypural), ανάπτυξη επουραίου οστού (development epural), ανάπτυξη προραχιαίων οστών (development predorsal) και ανάπτυξη κοιλιακών πτερυγίων (development pelvic). Άξονας x : Τυπικό μήκος (SL). Άξονας y : Αριθμός πτερυγιοφόρων εδρικού και ραχιαίου πτερυγίου, ή παρουσία/απουσία (1/0) του εκάστοτε εξεταζόμενου μεριστικού χαρακτήρα.

113 111 Εικόνα : Τα διαγράμματα που αφορούν στην επίδραση της θερμοκρασίας πρώιμης ανάπτυξης (22, 28 και 32 C) στην οντογένεση των ακόλουθων μεριστικών χαρακτήρων: αριθμός πτερυγιοφόρων εδρικού πτερυγίου (n pterygiophores anal) και αριθμός πτερυγιοφόρων ραχιαίου πτερυγίου (n pterygiophores dorsal). Άξονας x : Τυπικό μήκος (SL). Άξονας y : Αριθμός πτερυγιοφόρων εδρικού και ραχιαίου πτερυγίου, ή παρουσία/απουσία (1/0) του εκάστοτε εξεταζόμενου μεριστικού χαρακτήρα. Εικόνα : Τα διαγράμματα αφορούν στην επίδραση της θερμοκρασίας πρώιμης ανάπτυξης (22, 28 και 32 C) στην οντογένεση των ακόλουθων μεριστικών χαρακτήρων: οστεοποίηση 1ου πτερυγιοφόρου εδρικού πτερυγίου (ossification 1 st anal pterygiophore), οστεοποίηση 1ου πτερυγιοφόρου ραχιαίου πτερυγίου (ossification 1 st dorsal pterygiophore), οστεοποίηση επουραίου (ossification epural). Άξονας x : Τυπικό μήκος (SL). Άξονας y : Αριθμός πτερυγιοφόρων εδρικού και ραχιαίου πτερυγίου, ή παρουσία/απουσία (1/0) του εκάστοτε εξεταζόμενου μεριστικού χαρακτήρα.

114 112 Εικόνα : Επίδραση της θερμοκρασίας πρώιμης ανάπτυξης (22, 28 και 32 C) στην οντογένεση των μεριστικών χαρακτήρων που εξετάστηκαν στην παρούσα εργασία: 1. Development 1st hypural (ανάπτυξη πρώτου υπουραίου οστού) 2. development epural (ανάπτυξη επουραίου οστού 3. n pterygiophores dorsal (αριθμός πτερυγιοφόρων ραχιαίου πτερυγίου) 4. n pterygiophores anal (αριθμός πτερυγιοφόρων εδρικού πτερυγίου) 5. development predorsal (ανάπτυξη προραχιαίων) 6. development urostyle (ανάπτυξη ουρόστυλου) 7. development pelvic (ανάπτυξη κοιλιακών πτερυγίων) 8. ossification 1 st anal pterygiophore (οστεοποίηση πρώτου πτερυγιοφόρου εδρικού πτερυγίου) 9. οssification 1 st dorsal pterygiophore (οστεοποίηση πρώτου πτερυγιοφόρου ραχιαίου πτερυγίου) 10. ossification epural (οστεοποίηση επουραίου). Δίνεται το μέσο τυπικό μήκος σώματος (SL 50 ±1SD, mm) κατά το οποίο το 50% των ατόμων κάθε θερμοκρασιακής συνθήκης έχει ολοκληρώσει την εμφάνιση του εκάστοτε μεριστικού χαρακτήρα. Τα ίδια γράμματα υποδεικνύουν στατιστικά σημαντικές διαφορές στο μέσο SL 50 μεταξύ των διαφορετικών θερμοκρασιακών συνθηκών, για τον εκάστοτε μελετούμενο μεριστικό χαρακτήρα. Ο στατιστικός έλεγχος έγινε με t-test (p<0,01).

115 Πίνακας 19: Ο συντελεστής θερμοκρασίας Q 10 και το ποσοστό μεταβολής του ρυθμού ανάπτυξης του εκάστοτε υπό μελέτη μεριστικού χαρακτήρα, κατά τη μετάβαση από τους 22, στους 28 C, από τους 28 στους 32 C και από τους 22 στους 32 C. Αρνητικό πρόσημο στο ποσοστό μεταβολής, υποδηλώνει αύξηση του SL 50 κατά τη μετάβαση από τη χαμηλότερη στην υψηλότερη θερμοκρασιακή συνθήκη, δηλαδή επιβράδυνση της ανάπτυξης του εν λόγω μεριστικού χαρακτήρα. Hyp, ανάπτυξη υπουραίου οστού. Epr, ανάπτυξη επουραίου οστού. (n)drs, αριθμός πτερυγιοφόρων ραχιαίου πτερυγίου. (n)anl, αριθμός πτερυγιοφόρων εδρικού πτερυγίου. Prd, ανάπτυξη προραχιαίων οστών. Urs, ανάπτυξη ουρόστυλου. Plv, ανάπτυξη κοιλιακών πτερυγίων. (o)anl οστεοποίηση 1ου πτερυγιοφόρου εδρικού πτερυγίου. (o)drs οστεοποίηση 1ου πτερυγιοφόρου ραχιαίου πτερυγίου. (o)epr, οστεοποίηση επουραίου. 113 Group_T ( C) hyp epr (n) drs (n) anl prd urs plv (o) anl (o) drs (o) epr Q ,07 0,89 0,95 0,95 0,98 1,05 0,84 1,07 0,91 1, ,91 1,09 0,91 0,80 1,02 0,82 0,91 0,91 0,94 0, ,00 0,97 0,93 0,89 1,00 0,95 0,87 1,00 0,92 0,94 %

116 Επίδραση της θερμοκρασίας ανάπτυξης στο σχήμα σώματος των νυμφών και των ενήλικων αρσενικών και θηλυκών zebrafish Η επίδραση της θερμοκρασίας στο σχήμα του σώματος των zebrafish εξετάστηκε στο τέλος της εφαρμογής των διαφορετικών θερμοκρασιακών συνθηκών (το οποίο ήταν στις 41dpf για τους 22 C, στις 33dpf για τους 28 C και στις 20dpf για τους 32 C), καθώς και σε ενήλικα αρσενικά και θηλυκά zebrafish στην ηλικία των 265 dpf, δηλαδή πολύ μετά την εφαρμογή των διαφορετικών θερμοκρασιακών συνθηκών. Σε ό,τι αφορά στα ιχθύδια, χρησιμοποιήθηκαν 30 άτομα από τις θερμοκρασίες των 22 και 28 C και 29 από τη συνθήκη των 32 C (Πίνακας 20). Από τον κατα ζεύγη στατιστικό έλεγχο του μήκους σώματος των ατόμων που χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση της γεωμετρικής μορφομετρίας, προέκυψε ότι το μήκος σώματος των ατόμων διαφέρει σημαντικά μεταξύ των τριών διαφορετικών θερμοκρασιακών (p<0,05 t-test) (Πίνακας 20). 114 Πίνακας 20: Πλήθος (n) και μέσο τυπικό μήκος σώματος (SL ± 1SD, mm) των ατόμων που χρησιμοποιήθηκαν για την επίδραση της θερμοκρασίας ανάπτυξης (Τ) στο σχήμα του σώματος των ιχθυδίων. Τα άτομα προέρχονται και από τις δύο πειραματικές επαναλήψεις. Ίδιοι εκθέτες υποδεικνύουν διαφορετικό SL μεταξύ των ατόμων των τριών διαφορετικών πειραματικών συνθηκών (p<0,05 t-test). T ( C) (n) SL ± 1SD (mm) ,84 ± 0,76 a ,23 ± 1,87 a ,44 ± 2,03 a Πίνακας 21: Πλήθος (n) και τυπικό μήκος σώματος (SL±SD, mm) των ενήλικων θηλυκών (female) και αρσενικών (male) zebrafish που χρησιμοποιήθηκαν για την επίδραση της θερμοκρασίας ανάπτυξης (Τ) στο σχήμα του σώματος. επαναλήψεις. Ίδιοι εκθέτες υποδεικνύουν όμοιο SL μεταξύ των ομάδων. Ο στατιστικός έλεγχος έγινε με t-test (p<0,001). T ( C) Females Males (n) SL ± 1SD (mm) (n) SL ± 1SD (mm) ,7 ± 2, ,1 ± 1,5 b ,0 ± 2,3 a 30 27,6 ± 1,6 b ,5 ± 2,1 a 30 29,1 ± 1,1 Σε ό,τι αφορά στα ενήλικα άτομα, χρησιμοποιήθηκαν 60 ενήλικα zebrafish (30 θηλυκά και 30 αρσενικά) από κάθε θερμοκρασιακή συνθήκη (22, 28 και 32 C), με εξαίρεση τη συνθήκη των 22 C, στην 1η πειραματική επανάληψη της οποίας υπήρχαν μόνο 3 θηλυκά άτομα (Πίνακας 21). Από τον κατά ζεύγη και κατά φύλο στατιστικό έλεγχο του SL των ατόμων που χρησιμοποιήθηκαν στην ανάλυση του σχήματος του σώματος, προέκυψαν στατισικά σημαντικές διαφορές σε κάθε σύγκριση (p<0,05 t-test), με εξαίρεση τα θηλυκά άτομα των 28 και 32 C και τα αρσενικά άτομα των 22 και 28 C (p<0,05 t-test). Πρέπει να σημειωθεί ότι στο πεδίο της γεωμετρικής μορφομετρίας, ως σχήμα ορίζεται η γεωμετρική πληροφορία που απομένει όταν από ένα αντικείμενο εξαλειφθεί η επίδραση της θέσης, του προσανατολισμού και του μεγέθους του (Kendall 1977). Κατά συνέπεια, αφού η μέθοδος της γεωμετρικής μορφομετρίας εξετάζει διαφορές στο σχήμα των εκάστοτε υπό μελέτη αντικειμένων, χωρίς να λαμβάνει υπόψη το μέγεθος αυτών, η παρατηρούμενη διαφορά στο μήκος του σώματος των ατόμων δε δρα επιβαρυντικά στην ανάλυση.

117 115 Εικόνα : Επίδραση της θερμοκρασίας ανάπτυξης (22 C, 28 C, or 32 C) κατά μήκος των δύο κανονικών μεταβλητών (CV1 και CV2). Δίνονται οι μέσες τιμές των κανονικών μεταβλητών, Mean±2SE. Στις παρενθέσεις αναγράφεται το ποσοστό της συνολικής ποικιλομορφίας του σχήματος του σώματος που ερμηνεύει η κάθε κανονική μεταβλητή. Η ανάλυση γεωμετρικής μορφομετρίας έδειξε ότι η θερμοκρασία ανάπτυξης επέδρασε στο σχήμα του σώματος των νυμφών zebrafish (Wilks' λ=0,0779, p<0,001). Η πρώτη κανονική μεταβλητή (CV1) διαχώρισε πλήρως τα άτομα που αναπτύσσονταν στους 22 C, από αυτά των 28 και 32 C, ερμηνεύοντας το 86% της συνολικής ποικιλομορφίας του σχήματος του σώματος. Η δεύτερη κανονική μεταβλητή (CV2) ερμήνευσε το 14% της συνολικής ποικιλομορφίας, και διαχώρισε τα άτομα των 28 C από αυτά των 32 C (Εικόνα ). Οι σωματικές δομές που τροποποιήθηκαν και ο τρόπος με τον οποίο τροποποιήθηκαν, περιγράφονται ακολούθως. Kατά μήκος της CV1, η διαφοροποίηση του σχήματος του σώματος, αφορά στις ακόλουθες ανατομικές τροποποιήσεις των ατόμων που αναπτύχθηκαν στους 22 C, συγκριτικά με τα άτομα των 28 και 32 C: 1. Πρόσθια και ραχιαία μετατόπιση του ρύγχους 2. Οπίσθια και κοιλιακή μετατόπιση του οφθαλμού 3. Πρόσθια μετατόπιση του πρόσθιου άκρου του ραχιαίου πτερυγίου 4. Οπίσθια και ραχιαία μετατόπιση του οπίσθιου άκρου του ραχιαίου πτερυγίου 5. Πρόσθια και ραχιαία μετατόπιση του πρόσθιου άκρου του εδρικού πτερυγίου 6. Κοιλιακή μετατόπιση του οστού της κάτω γνάθου 7. Οπίσθια μετατόπιση του κάτω άκρου του βραγχιακού επικαλύμματος 8. Ραχιαία μετατόπιση του απώτερου άκρου του βραγχιακού επικαλύμματος 9. Τα ορόσημα της περιοχής της ουράς μετατοπίζονται ελάχιστα κοιλιακά Kατά μήκος της CV2, η διαφοροποίηση του σχήματος του σώματος αφορά κυρίως στις ακόλουθες ανατομικές τροποποιήσεις των ατόμων που αναπτύχθηκαν στους 32 C σε σχέση με αυτά των 28 C: 1. Πρόσθια και ραχιαία μετατόπιση του ρύγχους 2. Πρόσθια και ραχιαία μετατόπιση του οφθαλμού 3. Οπίσθια και κοιλιακή μετατόπιση του πρόσθιου άκρου του ραχιαίου πτερυγίου

118 4. Πρόσθια μετατόπιση του πρόσθιου άκρου του εδρικού πτερυγίου 5. Οπίσθια μετατόπιση του οπίσθιου άκρου του εδρικού πτερυγίου 6. Οπίσθια μετατόπιση του οστού της κάτω γνάθου 7. Οπίσθια μετατόπιση του κάτω άκρου του βραγχιακού επικαλύμματος 8. Από τα ορόσημα της περιοχής της ουράς, το 8 ο μετατοπίζεται ραχιαία και ελάχιστα προς τα πίσω. 116 Το πρόσθιο τμήμα του κορμού των ατόμων που έχουν αναπτυχθεί στους 28 και 32 C, και ειδικά η περιοχή της κεφαλής, εμφανίζεται πιο συμπιεσμένο και στενόμακρο σε σχέση με αυτό των ατόμων των 22 C. Είναι σημαντικό ίσως να τονιστεί ότι η περιοχή που οριοθετείται από τα ορόσημα 4, 5, 9, 10 και 11 (δηλαδή η περιοχή μεταξύ κοιλιάς και ουράς) εμφανίζεται περισσότερο σφαιρική και κυρίως ομαλή στα άτομα των 28 και 32 C, σε σχέση με αυτά των 22 C. Στη διαφοροποίηση αυτή συμβάλει η έντονη ραχιαία μετατόπιση του πρόσθιου τμήματος του εδρικού πτερυγίου στα ιχθύδια της ψυχρής θερμοκρασιακής συνθήκης. Κατά μήκος της δεύτερης κανονικής μεταβλητής, διαχωρίζονται τα άτομα των 28 από αυτά των 32 C. Τα ιχθύδια της θερμότερης συνθήκης φαίνεται ότι έχουν λιγότερο τορπιλοειδές σχήμα σε σχέση με αυτά των 28 C, τα οποια εμφανίζονται πιο συμπιεσμένα στην πρόσθια περιοχή και πιο συγκεκριμένα στην περιοχή που ορίζεται από την άκρη του ρύγχους, μέχρι το βραγχιακό επικάλλυμα. Τα ιχθύδια των 32 C φαίνονται επίσης πιο διευρυμένα ραχιαιοκοιλιακά, στην περιοχή της κοιλιάς. Η ανάλυση γεωμετρικής μορφομετρίας έδειξε ότι η θερμοκρασία ανάπτυξης επέδρασε σημαντικά στο σχήμα του σώματος των ενήλικων αρσενικών και θηλυκών ατόμων (Wilks' λ=0,0315, p<0,001). Η ανάλυση γεωμετρικής μορφομετρίας έδειξε ότι η θερμοκρασία ανάπτυξης επέδρασε σημαντικά στο σχήμα του σώματος των ενήλικων αρσενικών και θηλυκών ατόμων (Wilks' λ=0,0315, p<0,001). Η πρώτη κανονική μεταβλητή (CV1) διαχώρισε τα άτομα με βάση το φύλο τους, ενώ η δεύτερη κανονική μεταβλητή (CV2) διαχώρισε πλήρως τα άτομα που αρχικά αναπτύχθηκαν στους 22 C από τα άτομα των δύο θερμότερων συνθηκών (Εικόνα ). Oι δύο πρώτες κανονικές μεταβλητές (CV1 και CV2) ερμηνεύουν συνολικά το 87% της της συνολικής διακύμανσης του σχήματος του σώματος, με τη CV1 να ερμηνεύει το 68% και τη CV2 το 19% (Εικόνα ). Η τρίτη κανονική μεταβλητή (CV3) ερμηνεύει μόλις το 7% της συνολικής διακύμανσης και διαχωρίζει τα άτομα που αναπτύχθηκαν στους 28 C από αυτά των 32 C (Εικόνα ). Προκειμένου να μελετηθεί ο τρόπος με τον οποίο τροποποιήθηκαν οι σωματικές δομές των ενήλικων θηλυκών και αρσενικών zebrafish που είχαν υποβληθεί στις διαφορετικές θερμοκρασιακές συνθήκες, ακολούθησε κατά φύλο ανάλυση γεωμετρικής μορφομετρίας και παραγωγή των άντίστοιχων πλεγμάτων παραμόρφωσης (Εικόνα , Εικόνα ). Όπως ήταν αναμενόμενο, από την κατά φύλο ανάλυση της γεωμετρικής μορφομετρίας, προέκυψε ότι η θερμοκρασία ανάπτυξης επέδρασε σημαντικά στο σχήμα του σώματος των ενήλικων αρσενικών (Wilks' λ=0,1697, p<0,001) και θηλυκών ατόμων (Wilks' λ=0,1797, p<0,001), με τους πληθυσμούς να διαχωρίζονται πλήρως μεταξύ τους, ανάλογα με τη θερμοκρασία ανάπτυξης στην οποία είχαν υποβληθεί. Τόσο στα θηλυκά, όσο και στα αρσενικά άτομα, η πρώτη κανονική μεταβλητή (CV1) διαχώρισε τους 22 C από τους 28 και 32 C, ενώ η δεύτερη κανονική μεταβλητή (CV2) διαχώρισε πλήρως τα άτομα που αρχικά αναπτύχθηκαν στους 28 C από τα άτομα των 32 C (Εικόνα ). Οι ανατομικές δομές που τροποποιήθηκαν περιγράφονται παρακάτω.

119 CV1 (75%) CV1 (68%) CV1 (19%) C F 22 C M 28 C M 28 C F 22 C F C F 32 C F 32 C M 28 C M C M 32 C F 22 C M -4 CV2 (19%) -4 CV3 (7%) Εικόνα : Επίδραση της θερμοκρασίας ανάπτυξης (22 C, 28 C, or 32 C) και του φύλου (F, θηλυκά άτομα και M, αρσενικά άτομα) κατά μήκος των τριών πρώτων κανονικών μεταβλητών (CV1, CV2, CV3). Δίνονται οι μέσες τιμές των κανονικών μεταβλητών, Mean±2SE. Στις παρενθέσεις αναγράφεται το ποσοστό της συνολικής ποικιλομορφίας του σχήματος του σώματος που ερμηνεύει η κάθε κανονική μεταβλητή. Females 4 28 C C 32 C -4 CV2 (25%) Εικόνα : Επίδραση της θερμοκρασίας ανάπτυξης (22 C, 28 C, or 32 C) στα ενήλικα θηλυκά zebrafish, κατά μήκος των δύο κανονικών μεταβλητών (CV1 και CV2). Δίνονται οι μέσες τιμές των κανονικών μεταβλητών, Mean±2SE. Στις παρενθέσεις αναγράφεται το ποσοστό της συνολικής ποικιλομορφίας του σχήματος του σώματος που ερμηνεύει η κάθε κανονική μεταβλητή. Σε ό,τι αφορά στα θηλυκά άτομα, από τα πλέγματα παραμόρφωσης προέκυψε ότι τα ενήλικα zebrafish των 22 C, διαφέρουν ως προς αυτά των 28 και 32 C (CV1), ως προς τα ακόλουθα ανατομικά χαρακτηριστικά: 1. Κοιλιακή μετατόπιση του ρύγχους 2. Οπίσθια και ραχιαία μετατόπιση του οπίσθιου άκρου του οφθαλμού 3. Οπίσθια και κοιλιακή μετατόπιση των κοιλιακών πτερυγίων 4. Πρόσθια μετατόπιση του οστού της κάτω γνάθου 5. Κοιλιακή μετατόπιση του κάτω άκρου του βραγχιακού επικαλύμματος 6. Οπίσθια και ραχιαία μετατόπιση του απώτερου άκρου του βραγχιακού επικαλύμματος

120 7. Μικρού βαθμού πρόσθια μετατόπιση του οπίσθιου άκρου του εδρικού πτερυγίου και πρόσθια και ραχιαία μετατόπιση του οπίσθιου άκρου του ραχιαίου πτερυγίου Τα ενήλικα θηλυκά zebrafish των 32 C, διαφέρουν από αυτά των 28 C (CV2), ως προς τα ακόλουθα ανατομικά χαρακτηριστικά: 1. Μικρού βαθμού ραχιαία μετατόπιση του του ρύγχους και του πρόσθιου άκρου του οφθαλμού 2. Κοιλιακή μετατόπιση των κοιλιακών πτερυγίων 3. Κοιλικακή μετατόπιση του οστού της κάτω γνάθου 4. Ραχιαία μετατόπιση του άπω άκρου του βραγχιακού επικαλύμματος 5. Οπίσθια μετατόπιση του οπίσθιου άκρου του εδρικού πτερυγίου 6. Πρόσθια μετατόπιση των ορόσημων που αντιστοιχούν στο ουραίο πτερύγιο 118 Σε ό,τι αφορά στα αρσενικά άτομα, από τα πλέγματα παραμόρφωσης προέκυψε ότι τα ενήλικα zebrafish των 22 C, διαφέρουν ως προς αυτά των 28 και 32 C (CV1), ως προς τα ακόλουθα ανατομικά χαρακτηριστικά: 1. Οπίσθια και ραχιαία μετατόπιση του οπίσθιου άκρου του οφθαλμού 2. Πρόσθια και ραχιαία μετατόπιση του ραχιαίου πτερυγίου 3. Κοιλιακή μετατόπιση του οπίσθιου άκρου του εδρικού πτερυγίου 4. Κοιλιακή μετατόπιση των κοιλιακών πτερυγίων 5. Κοιλιακή μετατόπιση του κάτω άκρου του βραγχιακού επικαλύμματος Τα ενήλικα αρσενικά zebrafish των 32 C, διαφέρουν από αυτά των 28 C (CV2), ως προς τα ακόλουθα ανατομικά χαρακτηριστικά: 1. Κοιλιακή μετατόπιση του οπίσθιου άκρου του οφθαλμού 2. Ραχιαία μετατόπιση του πρόσθιου άκρου του ραχιαίου πτερυγίου 3. Οπίσθια μετατόπιση του πρόσθιου άκρου του εδρικού πτερυγίου 4. Οπίσθια και κοιλιακή μετατόπιση του οστού της κάτω γνάθου 5. Ραχιαία μετατόπιση του κάτω άκρου του βραγχιακού επικαλύμματος 6. Μικρού βαθμού πρόσθια μετατόπιση του ουραίου πτερυγίου Από τα πλέγματα παραμόρφωσης, προκύπτει ότι το σχήμα του σώματος των θηλυκών ατόμων που αναπτύχθηκαν στους 22 C είναι περισσότερο διευρυμένο νωτιαιοκοιλιακά από το σχήμα των zebrafish που αναπτύχθηκαν στους 28 και 32 C. Στα θηλυκά άτομα των 22 C, εμφανίζεται περισσότερο διευρυμένη και η περιοχη που οριοθετείται από τα ορόσημα του ρύγχους, της κάτω γνάθου και του βραγχιακού επικαλύμματος. Τα θηλυκά zebrafish των 32 C, φέρουν πιο φουσκωμένη την περιοχή της κοιλιάς σε σχέση με των 28 C, ενώ η περιοχή που οριοθετείται από τα ορόσημα του ρύγχους, της κάτω γνάθου και του βραγχιακού επικαλύμματος εμφανίζεται πιο συμπιεσμένη προσθιοπίσθια. Η κοιλιακή περιοχή των ενήλικων αρσενικών zebrafish που αναπτύχθηκαν στους 22 C είναι πιο διευρυμένη νωτιαιοκοιλιακά, έναντι των 28 και 32 C. Επίσης, η περιοχή που οριοθετείται από τα τα ορόσημα του ρύγχους, της κάτω γνάθου και του βραγχιακού επικαλύμματος, εμφανίζεται πιο δευρυμένη, τόσο ραχιαιοκοιλιακά, όσο και προσθιοπίσθια στα αρσενικά zebrafish των 22 C. Τα αρσενικά zebrafish των 28 και 32 C εμφανίζουν συνολικά πιο επίμηκες και στενόμακρο σχήμα σώματος, σε σχέση με τους 22 C. Τέλος, τα αρσενικά zebrafish των 32 C διαφέρουν ως προς αυτά των 28 C, κυρίως στην περιοχή του κεφαλιού, εμφανίζοντας πιο οξυμένο ρύγχος, ενώ παράλληλα τα ορόσημα που αντιστοιχούν στην κάτω γνάθο και στο κάτω άκρο του βραγχιακού επικαλύμματος βρίσκονται πιο κοντά μεταξύ τους. Το ουραίο πτερύγιο είναι πιο συμπιεσμένο νωταιοκοιλιακά στα άτομα των 32 C, έναντι των 28 C.

121 CV1 (74%) Males 3 22 C 28 C C -3 CV2 (26%) Εικόνα : Επίδραση της θερμοκρασίας ανάπτυξης (22 C, 28 C, or 32 C) στα ενήλικα αρσενικά zebrafish, κατά μήκος των δύο κανονικών μεταβλητών (CV1 και CV2). Δίνονται οι μέσες τιμές των κανονικών μεταβλητών, Mean±2SE. Στις παρενθέσεις αναγράφεται το ποσοστό της συνολικής ποικιλομορφίας του σχήματος του σώματος που ερμηνεύει η κάθε κανονική μεταβλητή.

122 Επίδραση της θερμοκρασίας ανάπτυξης στη γονιδιακή έκφραση των ενήλικων αρσενικών και θηλυκών zebrafish Σε κάθε περίπτωση, πραγματοποιήθηκε κατά ζεύγη στατιστικός έλεγχος (Mann-Whitney U test, p<0,05) μεταξύ θηλυκών και αρσενικών ατόμων που αναπτύχθηκαν στην ίδια θερμοκρασία (22, 28 ή 32 C), προκειμένου να διαπιστωθούν διαφορές που οφείλονται στο φύλο. Επίσης πραγματοποιήθηκε κατά ζεύγη και κατά φύλο (θηλυκά / αρσενικά) - στατιστικός έλεγχος (Mann-Whitney U test, p<0,05) μεταξύ των ατόμων των τριών διαφορετικών θερμοκρασιακών συνθηκών (22, 28 ή 32 C), προκειμένου να μελετηθεί η επίδραση της θερμοκρασίας στη γονιδιακή έκφραση. 120 Εικόνα : Επίδραση της θερμοκρασίας ανάπτυξης (22, 28, 32 C), στη σχετική έκφραση των γονιδίων igf1 και npy, στον εγκέφαλο ενήλικων θηλυκών (F) και αρσενικών (M) zebrafish. Ως γονίδιο αναφοράς, χρησιμοποιήθηκε η ακτίνη (b-actin). Εντός των παρενθέσεων (n) αναγράφεται ο αριθμός των δειγμάτων που χρησιμοποιήθηκαν κατά την ανάλυση. Οι αστερίσκοι υποδεικνύουν στατιστικώς σημαντικές διαφορές στη σχετική έκφραση του εκάστοτε υπό μελέτη γονιδίου (Mann-Whitney U test, p<0,05). (*) p<0,05 (**) p<0,01 (***) p<0,0001. Θερμο-εξαρτώμενες διαφορές στη γονιδιακή έκφραση, παρατηρήθηκαν μόνο στην έκφραση των γονιδίων myogenin και cyp19a1a, μεταξύ των αρσενικών ατόμων των 22 και 32 C. Η έκφραση της myogenin βρέθηκε σημαντικά υψηλότερη στα αρσενικά άτομα των 22 C, σε σχέση με αυτή των ατόμων των 32 C (Mann-Whitney U test, p<0,05), ενώ η έκφραση του cyp19a1a, βρέθηκε σημαντικά χαμηλότερη στα αρσενικά άτομα των 22 C, σε σχέση με αυτή των ατόμων των 32 C (Mann-Whitney U test, p<0,05). Σχετικά με τις φυλο-ειδικές διαφορές στην έκφραση των εξεταζόμενων γονιδίων, η κατά ζεύγη σύγκριση μεταξύ των θηλυκών και αρσενικών ατόμων της ίδιας θερμοκρασιακής συνθήκης, έδωσε τα ακόλουθα αποτελέσματα: Η έκφραση των γονιδίων myogenin και myostatin σχετιζόμενα με την ανάπτυξη των μυών βρέθηκε σημαντικά χαμηλότερη στα θηλυκά άτομα των 22 C, σε σχέση με τα αρσενικά της ίδιας θερμοκρασιακής συνθήκης (Mann-Whitney U test, p<0,05). Η έκφραση των θηλεο-ειδικών φυλοκαθοριστικών γονιδίων bmp15, cyp19a1a και figla, βρέθηκε σημαντικά υψηλότερη (Mann-Whitney U test, p<0,05) στις γονάδες των θηλυκών ατόμων σε σχέση με αυτή των αρσενικών ατόμων και στις τρεις θερμοκρασιακές συνθήκες, για το bmp15, στους 22 και 28 C για το cyp19a1a και στους 22

123 και 32 C, για το figla. Όμως, η έκφραση του bmp15 βρέθηκε σημαντικά χαμηλότερη (Mann- Whitney U test, p<0,05) στον εγκέφαλο των θηλυκών ατόμων των 32 C, σε σχέση με αυτή των αρσενικών. Η έκφραση των αρρενο-ειδικών ar, dmrt1 και sox9a είναι σημαντικά χαμηλότερη (Mann-Whitney U test, p<0,05) στις γονάδες των θηλυκών ατόμων, σε σχέση με τα αρσενικά, και στις τρεις θερμοκρασιακές συνθήκες. Η έκφραση της εγκεφαλικής μορφής του cyp19α, cyp19a1b, εμφανίστηκε σημαντικά υψηλότερη στα θηλυκά άτομα των 22 C, σε σχέση με αυτή των αρσενικών. Η έκφραση του igf1 φαίνεται ότι είναι χαμηλότερη στα θηλυκά άτομα, από ότι στα αρσενικά της ίδια κάθε φορά θερμοκρασιακής συνθήκης, χωρίς όμως να επιβεβαιώνεται στατιστικά μια τέτοια διαφοροποίηση (Mann-Whitney U test, p>0,05). Καμία στατιστικά σημαντική διαφορά δεν παρατηρείται επίσης στην έκφραση των γονιδίων npy και gdf. Φαίνεται ότι η έκφραση των γονιδίων dmrt1 και sox9a, είναι σχεδόν αποκλειστική των όρχεων. 121 Εικόνα : Επίδραση της θερμοκρασίας ανάπτυξης (22, 28, 32 C), στη σχετική έκφραση των γονιδίων myogenin, myostatin και tnni2α.3, στους μύες ενήλικων θηλυκών (F) και αρσενικών (M) zebrafish. Ως γονίδιο αναφοράς, χρησιμοποιήθηκε η ακτίνη (b-actin). Εντός των παρενθέσεων (n) αναγράφεται ο αριθμός των δειγμάτων που χρησιμοποιήθηκαν κατά την ανάλυση. Οι αστερίσκοι υποδεικνύουν στατιστικώς σημαντικές διαφορές στη σχετική έκφραση του εκάστοτε υπό μελέτη γονιδίου (Mann-Whitney U test, p<0,05). (*) p<0,05 (**) p<0,01 (***) p<0,0001.

124 Εικόνα : Επίδραση της θερμοκρασίας ανάπτυξης (22, 28, 32 C), στη σχετική έκφραση των γονιδίων bmp15, cyp19a1a, grf9 και figla στις γονάδες ενήλικων θηλυκών (F) και αρσενικών (M) zebrafish. Ως γονίδιο αναφοράς, χρησιμοποιήθηκε η ακτίνη (b-actin). Εντός των παρενθέσεων (n) αναγράφεται ο αριθμός των δειγμάτων που χρησιμοποιήθηκαν κατά την ανάλυση. Οι αστερίσκοι υποδεικνύουν στατιστικώς σημαντικές διαφορές στη σχετική έκφραση του εκάστοτε υπό μελέτη γονιδίου (Mann-Whitney U test, p<0,05). (*) p<0,05 (**) p<0,01 (***) p<0,

125 Εικόνα : Επίδραση της θερμοκρασίας ανάπτυξης (22, 28, 32 C), στη σχετική έκφραση των γονιδίων ar, dmrt1 και sox9a στις γονάδες ενήλικων θηλυκών (F) και αρσενικών (M) zebrafish. Ως γονίδιο αναφοράς, χρησιμοποιήθηκε η ακτίνη (b-actin). Εντός των παρενθέσεων (n) αναγράφεται ο αριθμός των δειγμάτων που χρησιμοποιήθηκαν κατά την ανάλυση. Οι αστερίσκοι υποδεικνύουν στατιστικώς σημαντικές διαφορές στη σχετική έκφραση του εκάστοτε υπό μελέτη γονιδίου (Mann-Whitney U test, p<0,05). (*) p<0,05 (**) p<0,01 (***) p<0,

126 Οντογενετικό προφίλ της γονιδιακής έκφρασης, κατά την εφαρμογή των διαφορετικών θερμοκρασιακών συνθηκών Ακολουθεί η ανάλυση των αποτελεσμάτων του προφίλ της έκφρασης των υπό μελέτη γονιδίων κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης, για κάθε θερμοκρασιακή συνθήκη. Η γονιδιακή έκφραση ποσοτικοποιήθηκε σε σχέση με το τυπικό μήκος σάματος των ιχθύων, από ~4,5-14mm, SL. Θα μπορούσαν να διακριθούν δύο βασικές κατηγορίες σε ό,τι αφορά στο οντογενετικό προφίλ της γονιδιακή έκφρασης: Στην πρώτη κατηγορία ανήκουν τα γονίδια εκείνα των οποίων η έκφραση ήταν ανεξάρτητη του μήκους του σώματος των ιχθύων, ενώ στη δεύτερη κατηγορία ανήκουν τα γονίδια των οποίων η έκφραση εξαρτάται από το μήκος του σώματος των ιχθύων. Φαίνεται ότι η θερμοκρασία ανάπτυξης έχει παίξει ρόλο στο πρότυπο έκφρασης ορισμένων γονιδίων, έτσι ώστε υπάρχουν περιπτώσεις κατά τις οποίες ορισμένα γονίδια ακολουθούν το ίδιο πρότυπο έκφρασης και στις τρεις θερμοκρασιακές συνθήκες (22, 28 και 32 C) (π.χ. τα γονίδια osteocalcin και cyp19a1b), ενώ άλλες που το πρότυπο έκφρασης διαφοροποιείται ανάλογα με τη θερμοκρασία ανάπτυξης (π.χ. τα γονίδια cryaa και figla). Για διευκόλυνση των αναλύσεων και της επεξεργασίας των δεδομένων, διαχωρίστηκαν 2 βασικές κατηγορίες ομάδες γονιδιακής έκφρασης: η ομάδα (Α) και η ομάδα (Β). Στην ομάδα (Α) ανήκουν τα γονίδια εκείνα των οποίων η έκφραση είναι ανεξάρτητη από το μήκος σώματος των ιχθύων κατά τη διάρκεια της εξεταζόμενης οντογενετικής περιόδου, και στις τρεις θερμοκρασιακές συνθήκες. Αυτά είναι τα εξής: cyp19a1b, dmnt3, mstn. Ο στατιστικός έλεγχος των διαφορών στην έκφραση των παραπάνω γονιδίων, μεταξύ των τριών διαφορετικών συνθηκών, πραγματοποιήθηκε με (Mann-Whitney U test, p<0,05). Στην ομάδα (Β), εντάχθηκαν τα γονίδια των οποίων η έκφραση εξαρτάται από το μήκος σώματος των αναπτυσσόμενων ιχθύων, είτε και στις τρεις θερμοκρασιακές συνθήκες (22, 28 και 32 C) (ομάδα B1), είτε σε μία τουλάχιστον από αυτές (ομάδα Β2). Η έκφραση των γονιδίων της ομάδας B1 μπορεί να μεταβάλλεται στις τρεις θερμοκρασιακές συνθήκες είτε κατά τον ίδιο τρόπο (π.χ. osteocalcin), είτε με διαφορετικό (π.χ. sox9a). Στην ομάδα (Β1) ανήκουν τα εξής γονίδια: cyp19a1a, osteocalcin, mgp, tnni2a.3, npy, sox9a. Η έκφραση των τριών πρώτων γονιδίων εμφανίζει αυξάνεται με την αύξηση του μήκους του σώματος των ιχθύων κατά τη διάρκεια της εξεταζόμενης οντογενετικής περιόδου και στις τρεις θερμοκρασιακές συνθήκες. Σε κάποια φάση της ανάπτυξης, δηλαδή σε κάποιο μήκος σώματος το οποίο δεν είναι απαραίτητα το ίδιο για κάθε γονίδιο και κάθε θερμοκρασιακή συνθήκη, αλλάζει ο ρυθμός με τον οποίο αυξάνεται η έκφραση των γονιδίων σε σχέση με το μήκος σώματος (osteocalcin, tnni2a.3) ή η έκφραση σταθεροποιείται γύρω από μια συγκεκριμένη τιμή, δηλαδή ανεξαρτητοποιείται από το μήκος σώματος των αναπτυσσόμενων ιχθύων (mgp). Σε κάθε περίπτωση, για τα γονίδια των οποίων η έκφραση παρουσίασε εξάρτηση από τη θερμοκρασία ανάπτυξης μέχρι ένα ορισμένο στάδιο και στη συνέχεια η έκφρασή τους σταθεροποιήθηκε, ή άλλαξε ο ρυθμός μεταβολής της έκφρασής τους από το μήκος του σώματος, εφαρμόστηκε μια ειδική μορφή γραμμικής παλινδρόμησης (piece-wise linear regression) μέσω της οποίας εκτιμήθηκε τυπικό μήκος σώματος, SL, στο οποίο πραγματοποιήθηκε η εν λόγω αλλαγή (Πίνακας 22). Η σύγκριση των κλίσεων (slopes) των ευθειών που αναπαριστούν τη γονιδιακή έκφραση μεταξύ των διαφορετικών θερμοκρασιακών συνθηκών (22, 28 και 32 C) πραγματοποιήθηκε με ανάλυση συνδιακύμανσης, ANCOVA, (Stagraphics Plus v.5) (p<0,05). Ο στατιστικός έλεγχος της γονιδιακής έκφρασης μεταξύ των διαφορετικών θερμοκρασιακών συνθηκών, όταν η έκφραση ήταν ανεξάρτητη του μήκους σώματος των αναπτυσσόμενων ιχθύων, πραγματοποιήθηκε με Mann-Whitney U test (p<0,05). 124

127 Στην ομάδα Β2, ανήκουν τα εξής γονίδια: igf1, myogenin, pescadillο, cryaa, eda, ar, dmrt1, hsd11b2, tp53, bmp15, figla, gdf9. Όπως ειπώθηκε παραπάνω, σε αυτή την ομάδα ανήκουν τα γονίδια των οποίων η έκφραση παραμένει σταθερή σε μία τουλάχιστον θερμοκρασιακή συνθήκη, ενώ σε κάποια άλλη θερμοκρασιακή συνθήκη η γονιδιακή έκφραση μεταβαλλεται (αυξάνεται ή μειώνεται) σε σχέση με το μήκος. Παρατηρούνται διάφορες περιπτώσεις: Έτσι, μπορεί η γονιδιακή έκφραση να μεταβάλλεται καθόλη τη διάρκεια της ανάπτυξης (π.χ. η έκφραση του cyp19a1a στους 22 C), να σταθεροποιείται μετά από ένα συγκεκριμένο μήκος σώματος (plateau) (π.χ. η έκφραση του cryaa στους 22 C), ή να συνεχίζει να μεταβάλλεται, αλλά με άλλο ρυθμό (π.χ. η έκφραση του pescadillo στους 32 C). Όπως και στα γονίδια της ομαδας (Β1), έτσι και για τα γονίδια της ομάδας (B2) η έκφραση των οποίων παρουσίασε εξάρτηση από τη θερμοκρασία ανάπτυξης μέχρι ένα ορισμένο στάδιο και στη συνέχεια η έκφρασή τους σταθεροποιήθηκε, ή άλλαξε πρότυπο/ρυθμό μεταβολής σε σχέση με το μήκος σώματος, εφαρμόστηκε μια ειδική μορφή γραμμικής παλινδρόμησης (piece-wise linear regression) μέσω της οποίας εκτιμήθηκε SL στο οποίο συμβαίνει η αλλαγή του παρατηρούμενου προτύπου της γονιδιακής έκφρασης (Πίνακας 22). Συγκρίθηκαν οι κλίσεις (slopes) των ευθειών που αναπαριστούν τη γονιδιακή έκφραση μεταξύ των διαφορετικών θερμοκρασιακών συνθηκών (22, 28 και 32 C) με ανάλυση συνδιακύμανσης (ANCOVA, p<0,05), όπου αυτό ήταν δυνατό, ενώ μετά το σημείο μεταβολής του προτύπου της γονιδιακής έκφρασης ο στατιστικός έλεγχος πραγματοποιήθηκε με Mann-Whitney U test (p<0,05) αν η έκφραση είχε φτάση σε plateau, ή με ANCOVA (p<0,01), αν η γονιδιακή έκφραση μεταβαλλοταν σε σχέση με την ανάπτυξη. 125 Εικόνα : Οντογενετικό προφίλ της γονιδιακής έκφρασης κατά τη διάρκεια της εφαρμογής των τριών διαφορετικών θερμοκρασιακών συνθηκών (22, 28 και 32 C). Αφορά στα γονίδια cyp19a1b, dmnt3, mstn, των οποίων η έκφραση είναι ανεξάρτητη του μήκους σώματος (SL) κατά τη διάρκεια της υπό εξέταση οντογενετικής περιόδου. Τα ίδια γράμματα υποδεικνύουν στατιστικά σημαντικές διαφορές στη γονιδιακή έκφραση μεταξύ των διαφορετικών θερμοκρασιακών συνθηκών (Mann-Whitney U test, p<0,05). Άξονας x : SL, standard length,τυπικό μήκος σώματος, σε mm. Άξονας y : RNA expression values, μονάδες έκφρασης. Αναλυτικά, λοιπόν, έχουμε τα παρακάτω: Η έκφραση των γονιδίων cyp19a1b, dnmt3, mstn δεν παρουσιάζει εξάρτηση από το σωματικό μέγεθος των αναπτυσσόμενων ιχθύων, σε καμία από τις τρεις θερμοκρασίες ανάπτυξης (22, 28 και 32 C) (Εικόνα ).

128 Η μέση τιμή έκφρασης του cyp19a1b διαφέρει μεταξύ C (υψηλότερη στους 22 C) και μεταξύ C (υψηλότερη στους 28 C) (Mann-Whitney U test, p<0,05,). Η έκφραση του γονιδίου dnmt3 δε διαφοροποιείται στατιστικά μεταξύ των τριών διαφορετικών θερμοκρασιακών συνθηκών (Mann-Whitney U test, p<0,05). Δεν παρατηρούνται στατιστικά σημαντικές διαφορές έκφραση της mstn μεταξύ των διαφορετικών θερμοκρασιών ανάπτυξης (Mann-Whitney U test, p<0,05). Και στις τρεις εξεταζόμενες θερμοκρασιακές συνθήκες, υπάρχουν άτομα στα οποία δεν ανιχνεύεται έκφραση του mstn. Η έκφραση των γονιδίων της ομάδας (Β1), cyp19a1a, osteocalcin, mgp, tnni2a.3, npy και sox9a, μεταβάλλεται σε σχέση με το μήκος σώματος των αναπτυσσόμενων ιχθύων. H έκφραση των τριών πρώτων γονιδίων αυξάνεται όσο αυξάνεται το μήκος σώματος, ενώ από κάποια φάση της ανάπτυξης και μετά, η έκφραση της μεν osteocalcin και της tnni2a.3 συνεχίζει να αυξάνεται, αλλά με χαμηλότερο ρυθμό, της δε mgp ανεξαρτητοποιείται από το μήκος σώματος (plataeu). Η έκφραση του sox9a και του npy μειώνεται σε σχέση με το μήκος σώματος. Η έκφραση του cyp19a1a μειώνεται καθώς προχωρά η ανάπτυξη (μειώνεται όσο αυξάνεται το μήκος του σώματος των νυμφών zebrafish) και στις τρεις θερμοκρασιακές συνθήκες. Ο ρυθμός με τον οποίο μειώνεται η έκφραση του cyp19a1a είναι παρόμοιος και για τις τρεις θερμοκρασίες ανάπτυξης (ANCOVA, p>0,01) Το μήκος στο οποίο μεταβάλλεται το πρότυπο της έκφρασης του γονιδίου osteocalcin, ισούται με 11,6±0,7mm στους 22 C και με 7,9±0,2mm SL στους 28 C (Πίνακας 22). Στους 32 C, η απότομη αύξηση της έκφρασης της osteocalcin στα πολύ πρώιμα αναπτυξιακά στάδια είχε σαν αποτέλεσμα να μην μπορεί να ανιχνευθεί το μήκος στο οποίο μεταβάλλεται το πρότυπο της γονιδιακής έκφρασης. Η διαφορά στο μέσο μήκος σώματος στο οποίο παρατηρήθηκε η αλλαγή του προτύπου έκφρασης, μεταξύ των 22 και 28 C, αποδείχθηκε στατιστικά σημαντική (t-test, p<0,01). Τα παραπάνω αποδεικνύουν την ισχυρή επίδραση της θερμοκρασίας ανάπτυξης στην έκφραση της osteocalcin, επίδραση ανάλογη της πλαστικότητας που παρατηρείται σε μορφολογικό επίπεδο και σύμφωνα με την οποία τα γεγονότα της ανάπτυξης μετατοπίζονται σε σχέση με το μήκος σώματος, ανάλογα με τη θερμοκρασία ανάπτυξης. Στατιστικά συγκρίθηκαν και οι κλίσεις των ευθειών που αναπαριστούν τη γονιδιακή έκφραση μεταξύ των διαφορετικών θερμοκρασιακών συνθηκών (22, 28 και 32 C), με ANCOVA (p<0,01). Η σύγκριση πραγματοποιήθηκε μεταξύ 22 και 28 C, κατά την πρώτη φάση ανάπτυξης-έκφρασης, και χρησιμοποιήθηκαν τα άτομα μήκους SL μέχρι 11,5mm και 8,0mm αντίστοιχα, και μεταξύ 22, 28 και 32 C κατά τη δεύτερη φάση ανάπτυξης, οπότε χρησιμοποιήθηκαν τα άτομα μήκους SL>11,5mm για τους 22 C, SL>8,0mm για τους 28 C και όλα τα άτομα των 32 C. Από τη σύγκριση των κλίσεων των εξισώσεων που περιγράφουν τη γονιδιακή έκφραση κατά την πρώτη φάση της ανάπτυξης μεταξύ 22 και 28 C, προέκυψε ότι αύξηση της θερμοκρασίας από τους 22 στους 28 C προκάλεσε αύξηση του ρυθμού αύξησης της έκφρασης της osteocalcin σε σχέση με την ανάπτυξη (ANCOVA, p<0,05). Δεν παρατηρήθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές κατά τη δεύτερη φάση της ανάτπυξης (ANCOVA, p>0,05). Για το γονίδιο mgp, η αλλαγή του προτύπου στην έκφρασης παρατηρήθηκε σε μήκος σώματος SL περίπου ίσο με 8,0mm για όλες τις θερμοκρασιακές συνθήκες (22, 28, 32 C) (Πίνακας 22), οπότε και δεν παρατηρήθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές σε αυτό το επίπεδο (t-test, p>0,01). Στατιστικά, συγκρίθηκαν οι κλίσεις των ευθειών που αναπαριστούν τη γονιδιακή έκφραση μεταξύ των διαφορετικών θερμοκρασιακών συνθηκών (22, 28 και 32 C) με ANCOVA (p<0,01), μεταξύ 22, 28 C και 32 C, κατά την πρώτη φάση ανάπτυξηςέκφρασης, χρησιμοποιώντας τα άτομα των τριών θερμοκρασιακών συνθηκών που έχουν μήκος σώματος SL<8mm). Στατιστικά σημαντικές διαφορές παρατηρήθηκαν μεταξύ των 22 C και των δύο θερμότερων συνθηκών (ANCOVA, p<0,05). Και στις δύο περιπτώσεις, 126

129 αύξηση της θερμοκρασίας οδήγησε σε αύξηση της κλίσης της ευθείας που περιγράφει την έκφραση της mgp. Με Mann-Whitney U test, (p<0,05) ελέγχθηκαν στατιστικά οι διαφορές στην έκφραση του mgp μεταξύ των τριών θερμοκρασιών ανάπτυξης, για τα άτομα μήκους SL 8mm και πάνω, δηλαδή κατά τη διάρκεια της οντογενετικής περιόδου όπου η έκφραση του mgp ανεξαρτητοποιείται από το μήκος σώματος των ιχθύων. Και πάλι οι 22 C διαφοροποιήθηκαν από τους 28 και 32 C (Mann-Whitney U test, p<0,05) έχοντας υψηλότερη μέση τιμή έκφρασης (Πίνακας 22). 127 Εικόνα : Οντογενετικό προφίλ της γονιδιακής έκφρασης κατά τη διάρκεια της εφαρμογής των τριών διαφορετικών θερμοκρασιακών συνθηκών (22, 28 και 32 C). Αφορά στα γονίδια cyp19a1a, osteocalcin, mgp, tnni2a.3, npy και sox9a. Τα ίδια γράμματα υποδεικνύουν στατιστικά σημαντικές διαφορές στη γονιδιακή έκφραση μεταξύ των διαφορετικών θερμοκρασιακών συνθηκών. Για τα γονίδια osteocalcin, mgp, tnni2a.3, npy, ANCOVA (p<0,01). Για το sox9a, Mann-Whitney U tes ( p<0,05). Οι αστερίσκοι υποδυκνείουν στατιστικά σημαντιή διαφορά στο μήκος σώματος SL στο οποίο παρατηρείται η αλλαγή του προτύπου έκφρασης ή του ρυθμού με τον οποίο η έκφραση αυξάνεται ή μειώνεται σε σχέση με το μήκος σώματος. Άξονας x : SL, standard length,τυπικό μήκος σώματος, σε mm. Άξονας y : RNA expression values, μονάδες έκφρασης.

130 Στο zebrafish, tα mrnas των γονιδίων osteocalcin και mgp, εντοπίζονται σε όλους τους ιστούς στους οποίους εναποτίθενται άλατα, τόσο κατά τη διάρκεια της ασβεστοποίησής τους, όσο και μετέπειτα. Στους ιστούς αυτούς συμπεριλαμβάνονται τα οστά και οι ασβεστοποιημένοι χόνδροι των βραγχιακών τόξων (Gavaia et al. 2006). Όπως είδαμε, η ανάπτυξη στους 32 C, είχε σαν αποτέλεσμα την απότομη αύξηση στην έκφραση της osteocalcin σε μήκος 6-8mm SL, από μηδενικές τιμές στις 7 μονάδες. Στους δε 22 και 28 C o ρυθμός αύξησης της γονιδιακής έκφρασης άλλαξε σε κάποια φάση της ανάπτυξης, δηλαδή σε κάποιο συγκεκριμένο μήκος σώματος, SL. Η αλλαγή αυτή (inflexion point) στο πρότυπο έκφρασης στους 22 C (11,6±0,7mm SL), πραγματοποιήθηκε σε μήκος σώματος μεγαλύτερο κατά 3mm, περίπου σε σχέση με τους 28 C (8,5±0,3mm SL), γεγονός ανάλογο της φαινοτυπικής πλαστικότητας σε μορφολογικό επίπεδο. Δεν παρατηρήθηκε ανάλογη επίδραση της θερμοκρασίας ανάπτυξης στην έκφραση της mgp, αφού η αλλαγή του προτύπου έκφρασης παρατηρήθηκε στο ίδιο μήκος σώματος (SL 8mm) και στις τρεις θερμοκρασίες ανάπτυξηςτο γονίδιο tnni2a.3 (troponin I, skeletal, fast 2a, tandem duplicate 3) ανιχνεύεται στους σωμίτες μετά από της 16hpf και αποτελεί πρωτεΐνη ειδική των γρήγορων μυϊκών ινών (CY et al. 2009). Η έκφρασή του γονιδίου συτού κατά την εξεταζόμενη οντογενετική περίοδο στην παρούσα μελέτη, αυξάνεται με την αύξηση του μήκους του σώματος. Σε μήκος σώματος SL 11,2±0,6mm, για τους 22 C, 8,5±0,3mm, για τους 28 C και 7,9±0,2mm, για τους 32 C, ο ρυθμός αύξησης μειώνεται. Από τον κατά ζεύγη στατιστικό έλεγχο των τιμών που αντιστοιχούν στο μήκος σώματος SL στο οποίο παρατηρείται αλλαγή του ρυθμού αύξησης στην έκφραση της tnni2a.3, μεταξύ των τριών θερμοκρασιακών συνθηκών, προέκυψε ότι οι διαφορές είναι στατιστικά σημαντικές (t-test p<0,01). Έτσι, μείωση της θερμοκρασίας ανάπτυξης, έχει ως αποτέλεσμα την μετατόπιση της αλλαγής του προτύπου της γονιδιακής έκφρασης σε μεγαλύτερο μήκος σώματος. Στατιστικά, συγκρίθηκαν και οι κλίσεις των ευθειών που αναπαριστούν τη γονιδιακή έκφραση, μεταξύ των διαφορετικών θερμοκρασιακών συνθηκών (22, 28 και 32 C) με ANCOVA (p<0,01), πριν (πρώτη φάση ανάπτυξης) και μετά (δεύτερη φάση ανάπτυξης) από την αλλαγή του προτύπου της γονιδιακής έκφρασης. Από τη σύγκριση των κλίσεων των εξισώσεων που περιγράφουν τη γονιδιακή έκφραση κατά την πρώτη φάση της ανάπτυξης προέκυψαν στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ των 22 C και των δύο θερμότερων συνθηκών, υποδεικνύοντας ότι αύξηση της θερμοκρασίας ανάπτυξης έχει σαν αποτέλεσμα αύξηση του ρυθμού με τον οποίο αυξάνεται η έκφραση της tnni2a.3 σε σχέση με την ανάπτυξη (ANCOVA, p<0,05). Κατά τη δεύτερη φάση της ανάπυξης, οι 22 C διαφοροποιήθηκαν στατιστικά από τους 32 C, έχοντας μεγαλύτερη κλίση (ANCOVA, p<0,05). Η έκφραση του npy μειώνεται σε σχέση με το μήκος σώματος και στις τρεις θερμοκρασίες ανάπτυξης. Στους 32 C, η έκφραση του npy μειώνεται καθώς προχωράει η ανάπτυξη, ενώ στη συνέχεια σταθεροποιείται, ανεξαρτητοποιούμενη από το μήκος σώματος. Από την εφαρμογή της piece-wise linear regression επί των τιμών που αντιστοιχούν στην έκφραση του NPY στους 32 C, υπολογίστηκε ότι η αλλαγή του προτύπου έκφρασης παρατηρείται στα 8,0±0,8mm SL. Στους 22 C, η έκφραση του npy μειώνεται καθόλη τη διάρκεια της υπό εξέταση οντογενετικής περιόδου, ενώ στους 28 C μειώνεται και φαίνεται να σταθεροποιείται από κάποιο μήκος σώματος και μετά, γεγονός όμως που δεν μπορεί να επιβεβαιωθεί, πιθανότατα λόγω έλλειψης ατόμων μήκους από 10 μέχρι 12,5 mm SL σε αυτή τη θερμοκρασιακή συνθήκη. Στατιστικά, συγκρίθηκαν οι κλίσεις των ευθειών που αναπαριστούν τη γονιδιακή έκφραση, μεταξύ των διαφορετικών θερμοκρασιακών συνθηκών (22, 28 και 32 C) και από τα αποτελέσματα προέκυψε ότι η γονιδιακή έκφραση στους 22 C μειώνεται με μικρότερο ρυθμό, σε σχέση με το μήκος σώματος των ιχθύων, σε σχέση με τους 28 C (ANCOVA, p<0,05). Στην ανάλυση, δεν συμπεριλήφθηκαν τα άτομα μήκους σώματος 128

131 SL μεγαλύτερο από 9mm, στη θερμοκρασιακή συνθήκη των 32 C, καθώς και τα άτομα μήκους σώματος SL μεγαλύτερο από τα 12mm, στη συνθήκη των 28 C. Στους 22 και στους 28 C, η έκφραση του sox9a εμφανίζεται ανεξάρτητη του μήκους σώματος αρχικά, ενώ στη συνέχεια μειώνεται. Η αλλαγή του προτύπου παρατηρείται στα 9,4±1,4mm SL στους 22 C και στα 7,6±0,6 mm SL στους 28 C (Πίνακας 22), διαφορά στατιστικά σημαντική (t-test, p<0,01). Στους 32 C η έκφραση του sox9a μειώνεται καθόλη τη διάρκεια της εξεταζόμενης οντογενετικής περιόδου. Ο στατιστικός έλεγχος της γονιδιακής έκφρασης μεταξύ 22 και 28 C κατά τα πρώιμα αναπτυξιακά στάδια, όπου εμφανίζεται ανεξαρτησία της έκφρασης από το μήκος σώματος, έδειξε στατιστικά σημαντική διαφορά στην έκφραση του sox9a, με τη μέση τιμή να είναι πιο αυξημένη στους 22 από ότι στους 28 C (Mann Whitney U-test, p<0,05). Mεταξύ των 32 C, και των ατόμων των 22 και 28 C τα οποία είχαν μήκος σώματος SL>10mm, για τους 22 C και SL>8mm, για τους 28 C, δεν παρατηρήθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές (ANCOVA, p>0,05). Ακολουθεί η ανάλυση των αποτελεσμάτων για την πολυπληθή ομάδα B2, στην οποία ανήκουν τα γονίδια igf1, myogenin, pescadillο, cryaa, eda, ar, hsd11b2, tp53, bmp15 και figla, gdf9. Η έκφραση του igf1 στους 22 Cαυξάνεται σε σχέση με το μήκος σώματος, μέχρι αυτό να φτάσει τα 10 περίπου χιλιοστά (SL=10±0,9mm), οπότε και σταθεροποιείται, δηλαδή ανεξαρτητοποιείται του μήκους σώματος (Πίνακας 22). Στατιστικά, εξετάστηκαν με Mann- Whitney U test, (p<0,05) οι διαφορές στην έκφραση μεταξύ των τριών διαφορετικών θερμοκρασιακών συνθηκών, χρησιμοποιώντας όλα τα άτομα των 28 και 32 C, και τα άτομα των 22 C που παρουσίασαν ανεξαρτησία της γονιδιακής έκφρασης από το μήκος σώματος, δηλαδή τα άτομα μήκους SL>10mm. Διαφοροποιήθηκαν οι 22 C από τους 28 και 32 C, επιδεικνύοντας υψηλότερες τιμές έκφρασης για τον igf1 (Mann-Whitney U test, p<0,05). Η έκφραση της myogenin στους 22 και στους 32 C είναι ανεξάρτητη του μήκους του σώματος καθόλη τη διάρκεια της εξεταζόμενης οντογενετικής περιόδου. Στους 28 C, σε μήκος σωματος SL=8,7±0,5mm η έκφραση της μυογενίνης αλλάζει πρότυπο και ενώ αρχικά αυξάνεται με την αύξηση του μήκους του σώματος, ακολούθως σταθεροποιείτα. Στατιστικά, εξετάστηκαν με Mann Whitney U test (p<0,05) οι διαφορές στην έκφραση μεταξύ των τριών διαφορετικών θερμοκρασιακών συνθηκών, χρησιμοποιώντας όλα τα άτομα των 22 και 32 C, και τα άτομα των 28 C που παρουσίασαν ανεξαρτησία της έκφρασης από το μήκος σώματος. Διαφοροποιήθηκαν οι 32 C από τους 22 και 28 C, έχοντας χαμηλότερες τιμές έκφρασης (Mann Whitney U test, p<0,05). Στους 22 C, η έκφραση του pescadillo είναι σταθερή και ανεξάρτητη από το μήκος σώματος. Στους 28 C, η έκφραση του pescadillo φαίνεται να μειώνεται καθώς προχωρά η ανάπτυξη, αλλά η έλλειψη ατόμων μήκους από 10 μέχρι 12,5 mm SL, περίπου, δεν καθιστά δυνατό να κατανοήσουμε αν αλλάζει η κλίση της ευθείας που περιγράφει την έκφραση σε κάποια φάση της οντογενετικής περιόδου ή όχι. Στους 32 C, η έκφραση του pescadillo μειώνεται καθόλη τη διάρκεια της εξεταζόμενης οντογενετικής περιόδου, ενώ η ειδικής μορφής της γραμμικής παλινδρόμησης που εφαρμόστηκε, προσδιόρισε αλλαγή στο πρότυπο έκφρασης στα 7,0±01,4mm SL. Η στατιστική σύγκριση της γονιδιακής έκφρασης μεταξύ όλων των ατόμων των 28 C με τα άτομα των 32 C που φέρουν μήκος σώματος SL>7mm, δεν έδωσε σημαντικές διαφορές (ANCOVA, p>0,05). Στους 28 και 32 C, η έκφραση της cryaa εμφανίζεται ανεξάρτητη του μήκους σώματος των ιχθύων. Στους 22 C, η έκφραση της cryaa αυξάνεται με την αύξηση του μήκους του σώματος μέχρι περίπου τα 11mm SL, και στη συνέχεια να σταθεροποιείται, όμως αυτή η παρατηρούμενη αλλαγή του προτύπου έκφρασης δεν επιβεβαιώθηκε με την εφαρμογή της ειδικής μορφής γραμμικής παλινδρόμησης. Ο στατιστικός έλεγχος της γονιδιακής έκφρασης της cryaa μεταξύ των 28 και 32 C, δέν έδωσε στατιστικά σημαντικές διαφορές (Mann-Whitney U test, p>0,05). 129

132 130 Εικόνα : Οντογενετικό προφίλ της γονιδιακής έκφρασης κατά τη διάρκεια της εφαρμογής των τριών διαφορετικών θερμοκρασιακών συνθηκών (22, 28 και 32 C). Αφορά στα γονίδια igf1, myogenin, pescadillο, cryaa, eda. Τα ίδια γράμματα υποδεικνύουν στατιστικά σημαντικές διαφορές στη γονιδιακή έκφραση μεταξύ των διαφορετικών θερμοκρασιακών συνθηκών (Mann-Whitney U test, p<0,05). Άξονας x : SL, standard length,τυπικό μήκος σώματος, σε mm. Άξονας y : RNA expression values, μονάδες έκφρασης. Η έκφραση του γονιδίου eda μειώνεται στους 28 C σε σχέση με το μήκος του σώματος των αναπτυσσόμενων ιχθύων, ενώ μετά τα 12mm SL φαίνεται ότι αυξάνεται. Στους 32 C η έκφραση του eda μειώνεται επίσης σε σχέση με το μήκος σώματος, ενώ μετά τα 12mm SL περίπου υπάρχουν άτομα που έχουν τιμές έκφρασης χαμηλότερες από πριν, και άλλα υψηλότερες. Στους 22 C, η έκφραση παραμένει σταθερή, με τιμές μεταξύ των 4,5-6 μονάδων (6,1±0,2 mean RNA exp. values±sd). Στατιστικά, συγκρίθηκαν οι κλίσεις (slopes) των ευθειών που αναπαριστούν τη γονιδιακή έκφραση, μεταξύ των 28 και 32 C, χωρίς να προκύψουν σημαντικές διαφορές (ANCOVA, p>0,05). Η έκφραση του ar στους 28 και στους 32 C, παραμένει ανεξάρτητη του μήκους σώματος, καθόλη τη διάρκεια της ανάπτυξης. Στους 22 C, η έκφραση του ar αυξάνεται όσο προχωράει η ανάπτυξη, ενώ ακολούθως παρατηρείται ότι η έκφραση ανεξαρτητοποιείται από το μήκος σώματος. Από την εφαρμογή της piece-wise linear regression επί των τιμών που αντιστοιχούν στην έκφραση του ar στους 22 C, υπολογίστηκε ότι η αλλαγή του προτύπου

133 έκφρασης παρατηρείται σε μήκος περίπου ίσο με SL=13,7±0,4mm. Επειδή η αλλαγή του προτύπου παρατηρείται ουσιαστικά στο τέλος της οντογενετικής περιόδου, η έκφρασή του θα μπορούσε να θεωρηθεί ότι αυξάνεται καθόλη τη διάρκεια της εξεταζόμενης οντογενετικής περιόδου, με χαμηλό ρυθμό. Από τη στατιστική σύγκριση των μέσων τιμών έκφρασης του ar μεταξύ των 28 και 32 C, δεν προέκυψαν στατιστικά σημαντικές διαφορές (Mann-Whitney U test, p>0,05). Η έκφραση του dmrt1 παραμένει σταθερή (αν και με μεγάλο εύρος διακύμανσης τιμών) στους 28 C. Στους 32 C, στα πρώιμα στάδια της υπό εξέταση οντογενετικής περιόδου, η έκφραση του dmrt1 αυξάνεται σε σχέση με το μήκος, ενώ σε μήκος σώματος SL 10,60±0,98mm αλλάζει το πρότυπο έκφρασης, αφού κυμαίνεται γύρω από ένα εύρος τιμών ανεξάρτητο το μήκους σώματος. Στους 22 C δεν επιβεβαιώνεται αλλαγή του προτύπου έκφρασης του ar με την εφαρμογή της piece-wise linear regression, αν και φαίνεται ότι η έκφραση μειώνεται μέχρι τα 6mm SL, στη συνέχεια αυξάνεται μέχρι τα 10mm SL και ακολούθως μειώνεται και πάλι. Τα παραπάνω καθιστούν δύσκολη τη στατιστική σύγκριση της έκφρασης του dmrt1 μεταξύ των τριών θερμοκρασιών ανάπτυξης. Από τον κατά ζεύγη στατιστικό έλεγχο των τιμών έκφραης μεταξύ των τριών θερμοκρασιακών συνθηκών, προέκυψε ότι η έκφραση στους 22 C είναι χαμηλότερη από την έκφραση του dmrt1 στους 28 και 32 C (Mann-Whitney U test, p<0,05). Για τον στατιστικό έλεγχο, χρησιμοποιήθηκαν όλα τα άτομα των 22 και 28 C, ενώ από τους 32 C χρησιμοποιήθηκαν τα άτομα που είχαν τυπικό μήκος σώματος SL 10,5mm και εμφανίζουν ανεξαρτησία της έκφρασης του dmrt1 από το μήκος σώματος. Η έκφραση του γονιδίου hsd11b2 παραμένει σταθερή και ανεξάρτητη από το μήκος σώματος στους 22 και 32 C, ενώ στους 28 C μειώνεται σε σχέση με το μήκος, μέχρι τα 8,5mm SL και στη συνέχεια αυξάνεται. Από την εφαρμογή της piece-wise linear regression επί των τιμών που αντιστοιχούν στην έκφραση της στους 28 C, το μέσο SL στο οποίο αλλάζει το πρότυπο της γονιδιακής έκφρασης υπολογίστηκε στα 7,9±0,3mm SL. Ο στατιστικός έλγχος της έκφρασης του hsd11b2 μεταξύ των 22 και 32 C, δεν έδωσε σημαντικές διαφορές (Mann Whitney U-test, p<0,05). Η έκφραση του γονιδίου tp53 στους 28 και 32 C, μειώνεται καθώς αυξάνεται το μήκος σώματος, ενώ στους 22 C παραμένει σταθερή και ανεξάρτητη του μήκους σώματος. Από το στατιστικό έλεγχο για τον προδιορισμό των διαφορών στην έκφραση της tp53 μεταξύ 28 και 32 C, διαπιστώθηκε ότι η έκφραση στους 28 C μειώνεται με χαμηλότερο ρυθμό από ότι στους 32 C (ANCOVA, p<0,05). Το bmp15 εκφράζεται κυρίως στις γονάδες των zebrafish, (όρχεις και ωοθήκες), και σε μικρότερο βαθμό στον εγκέφαλο, το ήπαρ, στην καρδιά και στους μύες (Clelland et al. 2006). Σύμφωνα με τους Clelland et al. (2006), η έκφραση του bmp15 παίζει σημαντικό ρόλο στην ωρίμανση των ωοκυττάρων. Είναι δύσκολο να αποδοθεί ένα συγκεκριμένο πρότυπο στην έκφραση του bmp15 κατά τη διάρκεια της εξεταζόμενης οντογενετικής περιόδου, στις τρεις διαφορετικές θερμοκρασίες ανάπτυξης. Στους 22 C, δίνεται μια εικόνα μείωσης της έκφρασης του γονιδίου αυτού, σε σχέση με το μήκος σώματος των ιχθύων, ενώ υπάρχουν άτομα διαφόρων μηκών στα οπoία η έκφραση του bmp15 δεν ανιχνεύεται. Στους 28 C, η έκφραση του bmp15 δεν ανιχνεύεται σε 3 μόλις άτομα και σε ένα παρατηρείται πολύ χαμηλή τιμή, ενώ γενικά υπάρχουν μεγάλες διακυμάνσεις. Δεν εμφανίζεται εξάρτηση της έκφρασης του bmp15 από το μήκος σώματος. Στους 32 C, αρκετά άτομα διαφορετικού μήκους σώματος (SL) εμφανίζουν μηδενική έκφραση bmp15, ενώ μέχρι τα 11mm SL περίπου δίνεται η εικόνα αύξησης της έκφρασης με το μήκος του σώματος. Από τα 11mm SL και πάνω, υπάρχει μεγάλη διακύμανση στην έκφραση του εν λόγω γονιδίου. 131

134 132 Εικόνα : Οντογενετικό προφίλ της γονιδιακής έκφρασης κατά τη διάρκεια της εφαρμογής των τριών διαφορετικών θερμοκρασιακών συνθηκών (22, 28 και 32 C). Αφορά στα γονίδια ar, dmrt1, hsd11b2, tp53, bmp15, gdf9 και figla. Η έκφραση μεταβάλλεται σε σχέση με το μήκος σώματος (SL) κατά τη διάρκεια της υπό εξέταση οντογενετικής περιόδου σε μία τουλάχιστον από της εξεταζόμενες θερμοκρασιακές συνθήκες ανάπτυξης. Τα ίδια γράμματα υποδεικνύουν στατιστικά σημαντικές διαφορές στη γονιδιακή έκφραση μεταξύ των διαφορετικών θερμοκρασιακών συνθηκών. Για το dmrt1, Mann-Whitney U test (p<0,05), ενώ για τα tp53 και figla, ANCOVA (p<0,01). Άξονας x : SL, standard length,τυπικό μήκος σώματος, σε mm. Άξονας y : RNA expression values, μονάδες έκφρασης.

135 Πίνακας 22: Τα αποτελέσματα από την εφαρμογή της ειδικής μορφή γραμμικής παλινδρόμησης (piece-wise linear regression) μέσω της οποίας εκτιμήθηκε το τυπικό μήκος σώματος, SL, στο οποίο πραγματοποιήθηκε αλλαγή του προτύπου της γονιδιακής έκφρασης. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ανά εξεταζόμενο γονίδιο (Gene) και θερμοκρασιακή συνθήκη (Τ, C). Parametres Piecewise Regression / Estimates Gene T( C) b 0 b 1 b 2 L m 95% C.I. of L m r 2 osteoocalcin 22-7,05 1,30-0,85 11,63 10,18-13,08 0,97 osteoocalcin 28-20,11 3,24-2,60 7,86 7,43-8,30 0,95 mgp 22-1,00 1,12-1,05 7,97 6,94-8,99 0,88 mgp 28 2,77 0,63-0,63 8,14 7,55-8,72 0,82 mgp 32 0,47 0,94-1,02 8,13 7,40-8,86 0,88 tnni2a ,19 1,10-0,66 11,17 9,90-12,43 0,98 tnni2a ,80 2,14-1,85 8,48 7,90-9,06 0,93 tnni2a ,40 2,28-2,13 7,90 7,44-8,36 0,97 NPY 32 9,00-0,31 0,27 7,99 6,42-9,55 0,78 IGF 22 5,11 0,33-0,23 10,03 8,13-11,92 0,94 pescadillo 32 13,06-0,61 0,39 6,95 4,06-9,85 0,87 ar 22 6,90 0,17-1,22 13,67 12,92-14,42 0,76 dmrt1 32 1,61 0,24-0,39 10,89 8,01-13,77 0,48 sox9a 22 10,38-0,05-0,12 9,44 6,50-12,38 0,83 sox9a 28 8,53 0,15-0,30 7,62 6,37-8,88 0,74 hsd11b ,41-0,95 1,16 7,92 7,36-8,47 0,77 myogenin 28 3,14 0,72-0,82 8,70 7,69-9,72 0, Η έκφραση του γονιδίου gdf9 στους 32 C δεν ανιχνεύεται ή εμφανίζεται χαμηλή από τα 4 έως τα 6mm SL, περίπου, ενώ στη συνέχεια εμφανίζεται μάλλον ανεξάρτητη από το μήκος σώματος των ιχθύων, καθόλη τη διάρκεια της υπό εξέταση οντογενετικής περιόδου. Αν και φαίνεται ότι περίπου στα 10 mm SL αλλάζει το πρότυπο έκφρασης του gdf9, με την εφαρμογή της piece-wise linear regression επί των δεδομένων, δεν επιβεβαιώθηκε η παραπάνω υπόθεση. Η έκφραση του gdf9 στους 28 C είναι ανεξάρτητη του μήκους του σώματος, αν συμπεριληφθούν μόνο τα άτομα στα οποία ανιχνεύεται η έκφραση του γονιδίου. Αν συμπεριληφθούν όλα τα άτομα, τότε φαίνεται ότι η έκφραση του gdf9 μειώνεται καθώς προχωρά η ανάπτυξη (δηλαδή μειώνεται σε σχέση με το μήκος σώματος SL). Στους 22 C η έκφραση του gdf9 δεν ανιχνεύεται σε αρκετά άτομα καθόλη τη διάρκεια της ανάπτυξης, ακόμα και προς το τέλος της εξεταζόμενης οντογενετικής περιόδου. Τα παραπάνω καθιστούν δυσχερή τη στατιστική σύγκριση της έκφρασης του gdf9 μεταξύ των τριών θερμοκρασιακών συνθηκών. Το figla εκφράζεται στα ωοκύτταρα και έχει θεωρηθεί ως αξιόπιστος δείκτης της διαφοροποίησης των γονάδων σε ωοθήκες (Onichtchouk et al. 2003, Jorgensen et al. 2008). Όπως και στο BMP-15, έτσι και για το figla, είναι δύσκολο να αποδοθεί ένα συγκεκριμένο πρότυπο στην έκφρασή του, στις τρεις διαφορετικές θερμοκρασίες ανάπτυξης. Στους 22 και 32 C, σε αρκετά άτομα με διαφορετικό μήκος σώματος (SL) μεταξύ τους, δεν ανιχνεύεται έκφραση του figla. Στους 22 C η έκφραση φαίνεται να είναι ανεξάρτητη του μήκους σώματος. Στους 28 C, μέχρι περίπου τα 10mm SL, η έκφραση του figla αυξάνεται σε σχέση με το μήκος του σώματος, ενώ μεταξύ 12-14mm SL παρατηρείται μεγάλη διακύμανση στην έκφραση. Η έλλειψη ατόμων ατόμων μήκους από 10 μέχρι 12,5 mm SL σε αυτή τη θερμοκρασιακή συνθήκη, καθιστά δυσχερεί την κατανόηση του οντογενετικού προτύπου έκφρασης του figla. Στους 32 C, η έκφραση του figla αυξάνεται σε σχέση με το μήκος του

136 σώματος, όπως συνέβει και στους 28 C, με τη διαφορά ότι η αύξηση σε αυτή την περίπτωση συμβαίνει μέχρι τα 8mm SL, ενώ στη συνέχεια παρατηρείται και σε αυτή την περίπτωση μεγάλη διακύμανση στις τιμές έκφρασης. Η στατιστική σύγκριση στην έκφραση του figla μεταξύ των 28 και 32 C, έδειξε ότι ο ρυθμός αύξησης του γονιδίου αυτού στους 32 C είναι μεγαλύτερος από ότι στους 28 C (ANCOVA, p<0,05) 134

137 4.2. Έλεγχος της πιθανής αθροιστικής δράσης της θερμοκρασίας ανάπτυξης στο σχήμα του σώματος των ενήλικων zebrafish- Συνδυαστική ανάλυση Στην εργασία των Georga & Koumoundouros (2010) μελετήθηκε η επίδραση της θερμοκρασίας ανάπτυξης στο σχήμα του σώματος ενήλικων αρσενικών και θηλυκών zebrafish, κατά τη διάρκεια δύο διαφορετικών πρώιμων οντογενετικών περιόδων, διάρκειας 280 d (όπου, d το προϊόν του γινομένου ημέρες x θερμοκρασία) η κάθε μία. Η πρώτη οντογενετική περίοδος (G1: d) περιελάμβανε το εμβρυϊκό και πρώιμο νυμφικό στάδιο ανάτυξης ενώ η δεύτερη (G2: d) αφορούσε στο όψιμο νυμφικό στάδιο και περιελάμβανε και το στάδιο του ιχθυδίου. Οι πειραματικοί πληθυσμοί, είχαν υποβληθεί στους 22 C, 28 C και 32 C είτε κατά την πρώτη, είτε κατά τη δεύτερη υπό εξέταση οντογενετική περίοδο, ενώ πριν και μετά από την εφαρμογή των διαφορετικών θερμοκρασιακών συνθηκών η ανάπτυξη και εκτροφή των πειραματικών πληθυσμών είχε διεξαχθεί στους 28 C. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν σε δύο επαναλήψεις. Πέντε έως δέκα μήνες μετά την εφαρμογή των διαφορετικών θερμοκρασιακών συνθηκών, μελετήθηκε το σχήμα του σώματος των ενηλίκων πλέον zebrafish, με τη μέθοδο της γεωμετρικής μορφομετρίας. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα που προέκυψαν, η θερμοκρασία ανάπτυξης και το φύλο επέδρασαν σημαντικά στο σχήμα του σώματος ενήλικων zebrafish, αποδεικνύοντας ότι η θερμική ιστορία κατά τη διάρκεια μιας σύντομης περιόδου κατά την πρώιμη ανάπτυξη, επηρεάζει τη μορφή σχήμα του σώματος των ενήλικων zebrafish, με πιθανές επακόλουθες συνέπειες σε λειτουργικό επίπεδο. Στο προηγούμενο κεφάλαιο, είδαμε ότι η επίδραση της θερμοκρασίας από την 1 η dpf μέχρι το ολικό μήκος σώματος (TL) των ιχθύων να φτάσει περίπου τα 14mm, είχε σαν αποτέλεσμα τη διαφοροποίηση του σχήματος του σώματος των ενήλικων zebrafish που αναπτύχθηκαν στις τρεις διαφορετικές θερμοκρασιακές συνθήκες. Η υπό εξέταση οντογενετική περίοδος (G: 1 η dpf-14mm TL), περιλαμβάνει τις δύο οντογενετικές περιόδους (G1 και G2) που είχαν εξεταστεί στην εργασία των Georga & Koumoundouros (2010). Ένα από τα ερωτήματα που τέθηκαν, ήταν, αν η επίδραση της θερμοκρασίας για χρονικό διάστημα που περιλαμβάνει τις δύο παραπάνω οντογενετικές περιόδους, από το στάδιο του αυγού μέχρι και την ολοκλήρωση της μεταμόρφωσης, είναι αθροιστική και οδηγεί στην όξυνση των παρατηρούμενων διαφορών στο σχήμα του σώματος των ενήλικων αρσενικών και θηλυκών zebrafish. Προκειμένου να διαπιστωθεί ο τρόπος με τον οποίο επιδρά η θερμοκρασία στη διαφοροποίηση του σχήματος του σώματος, ακολούθησε μια συνδυαστική και κατά φύλο ανάλυση γεωμετρικής μορφομετρίας, στην οποία χρησιμοποιήθηκαν τα zebrafish από τα πειράματα G1, G2 και G (και οι δύο πειραματικές επαναλήψεις από κάθε πείραμα). Από την την κατά φύλο ανάλυση της γεωμετρικής μορφομετρίας, προέκυψε ότι η οντογενετική περίοδος εντός της οποίας εφαρμόζονται οι διαφορετικές θερμοκρασιακές συνθήκες, πρωτίστως, και δευτερευόντως η θερμοκρασία ανάπτυξης, επέδρασαν σημαντικά στο σχήμα του σώματος των ενήλικων θηλυκών (Wilks' λ=0,012, p<0,001) και αρσενικών (Wilks' λ= 0,013, p<0,001) zebrafish. Γενικά, κατά μήκος των δύο πρώτων κανονικών μεταβλητών (CV1 και CV2) διαχωρίστηκαν πλήρως τα άτομα των τριών οντογενετικών περιόδων (G, G1 και G2) μεταξύ τους, ανεξάρτητα από τη θερμοκρασία ανάπτυξης, ενώ κατά μήκος της τρίτης κανονικής μεταβλητής (CV3) διαχωρίστηκαν τα άτομα τα zebrafish που αναπτύχθηκαν στους 22 C, και των τριών υπό εξέταση οντογενετικών περιόδων, από αυτά που αναπτύχθηκαν στους 28 και 32 C. Εξαίρεση αποτέλεσαν τα άτομα των 28 C της ομάδας G1 τα οποία ομαδοποιήθηκαν με αυτά των 22 C στα θηλυκά zebrafish. 135

138 Για τα θηλυκά άτομα, η πρώτη κανονική μεταβλητή (CV1) διαχώρισε πλήρως τα zebrafish της οντογενετικής περιόδου G, από αυτά της G1 και G2, ερμηνεύοντας το 54% της συνολικής ποικιλομορφίας του σχήματος του σώματος, ενώ η δεύτερη κανονική μεταβλητή (CV2) ερμήνευσε το 27% της συνολικής ποικιλομορφίας, και διαχώρισε τα άτομα της οντογενετικής περιόδου G1, από αυτά της G2 (Εικόνα 4.2-1). Η τρίτη κανονική μεταβλητή (CV3) ήταν υπεύθυνη για το διαχωρισμό των ατόμων με βάση τη θερμοκρασία ανάπτυξης, διαχωρίζοντας τα άτομα των 22 C και των τριών οντογενετικών περιόδων (G, G1, G2), από αυτά των 28 και 32 C, με εξαίρεση τα zebrafish των 28 C της πρώτης οντογενετικής περιόδου (G1), τα οποία ομαδοποιήθηκαν με τα zebrafish των 22 C της πρώτης και δεύτερης (G1 και G2) οντογενετικής περιόδου (Εικόνα 4.2-2). Η CV3 ερμηνεύει το 7% της συνολικής ποικιλομορφίας του σχήματος του σώματος (Εικόνα 4.2-2). Κατα την ανάλυση του σχήματος του σώματος των αρσενικών zebrafish, η πρώτη κανονική μεταβλητή (CV1) διαχώρισε πλήρως τα άτομα της οντογενετικής περιόδου G2, από αυτά της G και G1, ερμηνεύοντας το 56% της συνολικής ποικιλομορφίας του σχήματος του σώματος, ενώ η δεύτερη κανονική μεταβλητή (CV2) ερμήνευσε το 27% της συνολικής ποικιλομορφίας, και διαχώρισε πλήρως τα άτομα της οντογενετικής περιόδου G1, από τα υπόλοιπα (Εικόνα 4.2-3). Η τρίτη κανονική μεταβλητή (CV3) ήταν υπεύθυνη για το διαχωρισμό των ατόμων με βάση τη θερμοκρασία ανάπτυξης, διαχωρίζοντας τα άτομα των 22 C και των τριών οντογενετικών περιόδων (G, G1, G2), από αυτά των 28 και 32 C (Εικόνα 4.2-4). Η CV3 ερμηνεύει το 8% της συνολικής ποικιλομορφίας του σχήματος του σώματος (Εικόνα 4.2-4). 136 Σε ό,τι αφορά στα θηλυκά άτομα, κατά μήκος της CV1 διαχωρίστηκαν αυτά της ομάδας G, από εκείνα της G1 και G2, ανεξάρτητα από τη θερμοκρασία ανάπτυξης (Εικόνα 4.2-1). Έτσι τα άτομα που δέχτηκαν την επίδραση της θερμοκρασίας καθόλη τη διάρκεια της νυμφικής περιόδου, διαφέρουν ως προς τα θηλυκά άτομα που δέχτηκαν την επίδραση της θερμοκρασίας κατά την πρώιμη (G1) και την όψιμη (G2) οντογενετική περίοδο, ως προς τα ακόλουθα χαρακτηριστικά: 1. Ραχιαία μετατόπιση του ρύγχους 2. Ραχιαία μετατόπιση του πρόσθιου σημείου του οφθαλμού 3. Πρόσθια μετατόπιση του οπίσθιου σημείου του οφθαλμού 4. Οπίσθια μετατόπιση του οπίσθιου άκρου του ραχιαίου πτερυγίου 5. Πρόσθια μετατόπιση του άνω άκρου του ουραίου πτερυγίου 6. Πρόσθια (ορόσημο 6) και ραχιαία και πρόσθια (ορόσημα 7 και 8) μετατόπιση του ουραίου πτερυγίου 7. Οπίσθια μετατόπιση του οπίσθιου άκρου του εδρικού πτερυγίου 8. Οπίσθια και κοιλιακή μετατόπιση του πρόσθιου άκρου του εδρικού πτερυγίου 9. Κοιλιακή μετατόπιση του οστού της κάτω γνάθου 10. Μικρού βαθμού κοιλιακή μετατόπιση του άπω άκρου του βραγχιακού επικαλύμματος Kατά μήκος της CV2, διαχωρίστηκαν τα θηλυκά zebrafish της ομάδας G1 από αυτά της G2, ανεξάρτητα από τη θερμοκρασία ανάπτυξης (Εικόνα 4.2-2). Έτσι, τα άτομα που δέχτηκαν την επίδραση των διαφορετικών θερμοκρασιακών συνθηκών κατά την όψιμη οντογενετική περίοδο (G2), διαφέρουν από αυτά που δέχτηκαν την αντίστοιχη επίδραση κατά την πρώιμη οντογενετική περίοδο (G1), ως προς τα εξής χαρακτηριστικά: 1. Ραχιαία και οπίσθια μετατόπιση του ρύγχους 2. Ραχιαία και οπίσθια μετατόπιση του πρόσθιου σημείου του οφθαλμού 3. Κοιλιακή μετατόπιση του οπίσθιου σημείου του οφθαλμού 4. Πρόσθια μετατόπιση του οπίσθιου άκρου του ραχιαίου πτερυγίου 5. Οπίσθια μετατόπιση του κάτω άκρου του ουραίου πτερυγίου 6. Πρόσθια μετατόπιση του οπίσθιου άκρου του εδρικού πτερυγίου 7. Οπίσθια και κοιλιακή μετατόπιση του πρόσθιου άκρου του εδρικού πτερυγίου

139 CV1 (54%) CV1 (54%) 8. Κοιλιακή μετατόπιση των κοιλιακών πτερυγίων 9. Ραχιαία μετατόπιση του οστού της κάτω γνάθου G1_32 C G1_28 C Females G1_22 C -6 G2_28 C G28 C 6 G2_32 C G22 C G2_22 C G32 C -4 CV2 (27%) Εικόνα 4.2-1: Επίδραση της θερμοκρασίας ανάπτυξης (22 C, 28 C, or 32 C) και της οντογενετικής περιόδου εντός της οποίας επέδρασε η θερμοκρασία (G1: d, G2: d και G: 1 η dpf - TL 14mm), στο σχήμα του σώματος ενήλικων θηλυκών zebrafish (Females), κατά μήκος της πρώτης και της δεύτερης κανονικής μεταβλητής (CV1 και CV2). Δίνεται η μέση τιμή, Mean±2SE. Οι δύο πρώτες κανονικές μεταβλητές (CV1 και CV2) διαχώρισαν τα άτομα των τριών ομάδων (G, G1 και G2) μεταξύ τους, άσχετα από τη θερμοκρασία ανάπτυξης. H CV1 διαχώρισε πλήρως τα άτομα της ομάδας G, από αυτά των ομάδων G1 και G2, ενω η CV2, διαχώρισε πλήρως τα άτομα της G1 από τη G2. Στις παρενθέσεις αναγράφεται το % ποσοστό της συνολικής ποικιλομορφίας του σχήματος του σώματος που ερμηνεύει η κάθε κανονική μεταβλητή. Females 3 G2_22 C G22 C G1_22 C G1_28 C -6 G2_32 C G28 C 6 G2_28 C G1_32 C -3 CV3 (7%) G32 C Εικόνα 4.2-2: Επίδραση της θερμοκρασίας ανάπτυξης (22 C, 28 C, or 32 C) και της οντογενετικής περιόδου εντός της οποίας επέδρασε η θερμοκρασία (G1: d, G2: d και G: 1 η dpf - TL 14mm), στο σχήμα του σώματος ενήλικων θηλυκών zebrafish (Females), κατά μήκος της πρώτης και της τρίτης κανονικής μεταβλητής (CV1 και CV3). Δίνεται η μέση τιμή, Mean±2SE. Η CV1 διαχώρισε πλήρως τα άτομα της ομάδας G, από τα άτομα των ομαδων G1 και G2, ενώ η CV3 διαχώρισε τα άτομα των 22 C των τριών οντογενετικών περιόδων (G, G1 και G2), από αυτά των 28 και 32 C, με εξαίρεση τα άτομα των 28 C της 1 ης οντογενετικής περιόδου (G1), τα οποία ομαδοποιήθηκαν με αυτά των 22 C. Στις παρενθέσεις αναγράφεται το % ποσοστό της συνολικής ποικιλομορφίας του σχήματος του σώματος που ερμηνεύει η κάθε κανονική μεταβλητή. Kατά μήκος της CV3, διαχωρίστηκαν τα zebrafish που αναπτύχθηκαν στους 22 C, και των τριών υπό εξέταση οντογενετικών περιόδων, από αυτά που αναπτύχθηκαν στους 28 και 32 C, με εξαίρεση τα άτομα των 28 C της ομάδας G1 τα οποία ομαδοποιήθηκαν με αυτά των 22 C.

140 Έτσι, τα άτομα των 22 C, διαφέρουν από αυτά των 28 και 32 C, ως προς τα εξής χαρακτηριστικά: 1. Ραχιαία και πρόσθια μετατόπιση του ρύγχους 2. Πρόσθια μετατόπιση του οπίσθιου άκρου του εδρικού πτερυγίου 3. Οπίσθια μετατόπιση των κοιλιακών πτερυγίων 4. Πρόσθια μετατόπιση του οστού της κάτω γνάθου 5. Κοιλιακή μετατόπιση του κάτω άκρου του βραγχιακού επικαλύμματος 6. Οπίσθια μετατόπιση του άπω του βραγχιακού επικαλύμματος 7. Οπίσθια μετατόπιση των θωρακικών πτερυγίων 138 Συνολικά, από τα πλέγματα παραμόρφωσης, κατά μήκος της πρώτης κανονικής μεταβλητής (CV1), η οποία διαχωρίζει τα θηλυκά άτομα της ομάδας G από αυτά των G1 και G2, παρατηρούνται διαφορές οι οποίες αφορούν κυρίως σε διαφοροποίηση του σχήματος στην περιοχή της κεφαλής και της ουράς. Η περιοχή της ουράς στα άτομα της ομάδας G εμφανίζεται πιο στενή και ατρακτοειδής, ενώ η περιοχή της κεφαλής εμφανίζεται περισσότερο δευρυμένη ραχιαιοκοιλιακά. Η διαφοροποίηση του σχήματος του σώματος των ατόμων της ομάδας G1 σε σχέση με τα άτομα των ομάδων G και G2 (κατα μήκος της CV2), οφείλεται κυρίως σε διαφοροποιήσεις που εντοπίζονται στην περιοχή της του κορμού κοιλιάς και σε μικρότερο βαθμό στην περιοχή του κεφαλιού. Έτσι, τα άτομα της ομάδας που δέχτηκε την επίδραση της θερμοκρασίας κατά την πρώιμη οντογενετική περίοδο (G1), εμφανίζουν πιο συμπιεσμένη κοιλιακή περιοχή σε σχέση με τα υπόλοιπα, ενώ τα ορόσημα 1 (άκρη ρύγχους) και 2 (πλησίον στο ρύγχος σημείο του οφθαλμού) βρίσκονται πιο απομακρυσμένα μεταξύ τους, σε σχέση με τα άτομα των ομάδων G και G2. Τέλος, κατά μήκος της CV3 που διαχωρίζει τα άτομα των τριών οντογενετικών περιόδων που αναπτύχθηκαν στους 22 C, καθώς και αυτά των 28 C της ομάδας G1, σε σχέση με τα υπόλοιπα, η διαφοροποιηση του σχήματος του σώματος εντοπίζεται σε αλλαγές στην περιοχή του κεφαλιού. Τα άτομα των 22 C εμφανίζουν πιο διευρυμένο το τμήμα που οριοθετείται από τα ορόσημα της κεφαλής (άκρη του ρύγχους) και του βραγχιακού επικαλύμματος, σε σχέση με τα άτομα των 28 και 32 C. Σε ό,τι αφορά στην ανάλυση της γεωμετρικής μορφομετρίας για τα αρσενικά zebrafish, κατά μήκος της CV1 διαφοροποιήθηκαν τα άτομα που δέχτηκαν την επίδραση των διαφορετικών θερμοκρασιακών συνθηκών κατά την όψιμη οντογενετική περίοδο (G2), από αυτά των ομάδων G και G1 (Εικόνα 4.2-3). Η διαφοροποίηση του σχήματος του σώματός των αρσενικών zebrafish της ομάδας G2 από τα υπόλοιπα, αφορά στις ακόλουθες ανατομικές τροποποιήσεις: 1. Κοιλιακή μετατόπιση του ρύγχους 2. Κοιλιακή μετατόπιση του πρόσθιου σημείου του οφθαλμού 3. Οπίσθια μετατόπιση του οπίσθιου σημείου του οφθαλμού 4. Πρόσθια μετατόπιση του οπίσθιου άκρου του ραχιαίου πτερυγίου 5. Οπίσθια (ορόσημο 6) και κοιλιακή (ορόσημα 7 και 8) μετατόπιση του ουραίου πτερυγίου 6. Πρόσθια μετατόπιση του οπίσθιου άκρου του εδρικού πτερυγίου 7. Μικρού βαθμού οπίσθια και κοιλιακή μετατόπιση των κοιλιακών πτερυγίων 8. Ραχιαία και μικρού βαθμού πρόσθια μετατόπιση του του οστού της κάτω γνάθου 9. Κοιλιακή και οπίσθια μετατόπιση του κοιλιακού πτερυγίου 10. Ραχιαία μετατόπιση του κάτω και του άπω άκρου του βραγχιακού επικαλύμματος

141 CV1 (56%) CV1 (56%) Males 4 G1_28 C G1_22 C G1_32 C G2_32 C G28 C 6 G32 C G2_28 C G2_22 C G22 C -4 CV2 (27%) Εικόνα 4.2-3: Επίδραση της θερμοκρασίας ανάπτυξης (22 C, 28 C, or 32 C) και της οντογενετικής περιόδου εντός της οποίας επέδρασε η θερμοκρασία (G1: d, G2: d και G: 1 η dpf - TL 14mm), στο σχήμα του σώματος ενήλικων αρσενικών zebrafish (Μales), κατά μήκος της πρώτης και της δεύτερης κανονικής μεταβλητής (CV1 και CV2). Δίνεται η μέση τιμή, Mean±2SE. Οι δύο πρώτες κανονικές μεταβλητές, διαχώρισαν τα άτομα των τριών ομάδων (G, G1 και G2) μεταξύ τους, άσχετα από τη θερμοκρασία ανάπτυξης. H CV1 διαχώρισε τα άτομα της ομάδας G2, από αυτά των ομάδων G και G1, ενω η CV2, διαχώρισε πλήρως τα άτομα της G1 από τα άτομα των ομάδων G και G2. Στις παρενθέσεις αναγράφεται το % ποσοστό της συνολικής ποικιλομορφίας του σχήματος του σώματος που ερμηνεύει η κάθε κανονική μεταβλητή. Males 3 G2_32 C G1_32 C G28 C G2_28 C G1_28 C G32 C -6 6 G1_22 C G2_22 C G22 C -3 CV3 (8%) Εικόνα 4.2-4: Επίδραση της θερμοκρασίας ανάπτυξης (22 C, 28 C, or 32 C) και της οντογενετικής περιόδου εντός της οποίας επέδρασε η θερμοκρασία (G1: d, G2: d και G: 1 η dpf - TL 14mm), στο σχήμα του σώματος ενήλικων αρσενικών zebrafish (Males), κατά μήκος της πρώτης και της τρίτης κανονικής μεταβλητής (CV1 και CV3). Δίνεται η μέση τιμή, Mean±2SE. Η CV1 διαχώρισε τα άτομα της ομάδας G2, από τα άτομα των ομαδων G1 και G3, ενώ η CV3 διαχώρισε τα άτομα των 22 C και των τριών οντογενετικών περιόδων (G, G1 και G2), από αυτά των 28 και 32 C. Στις παρενθέσεις αναγράφεται το % ποσοστό της συνολικής ποικιλομορφίας του σχήματος του σώματος που ερμηνεύει η κάθε κανονική μεταβλητή. Kατά μήκος της CV2, διαφοροποιήθηκαν τα άτομα που δέχτηκαν την επίδραση των διαφορετικών θερμοκρασιακών συνθηκών κατά την πρώιμη οντογενετική περίοδο (G1), από αυτά των ομάδων G και G2 (Εικόνα 4.2-4). Η διαφοροποίηση του σχήματος του σώματός των αρσενικών zebrafish της ομάδας G2 από τα υπόλοιπα, αφορά στις ακόλουθες ανατομικές τροποποιήσεις:

142 1. Πρόσθια και κοιλιακή μετατόπιση του ρύγχους 2. Κοιλιακή μετατόπιση του πρόσθιου σημείου του οφθαλμού 3. Ραχιαία και οπίσθια μετατόπιση του οπίσθιου σημείου του οφθαλμού 4. Οπίσθια μετατόπιση του οπίσθιου άκρου του ραχιαίου πτερυγίου 5. Πρόσθια και κοιλιακή (ορόσημα 7 και 8) μετατόπιση του ουραίου πτερυγίου 6. Οπίσθια μετατόπιση του οπίσθιου άκρου του εδρικού πτερυγίου 7. Πρόσθια και κοιλιακή μετατόπιση του οπίσθιου άκρου του εδρικού πτερυγίου 8. Ραχιαία μετατόπιση των κοιλιακών πτερυγίων 9. Κοιλιακή μετατόπιση του του οστού της κάτω γνάθου 10. Οπίσθια μετατόπιση του κάτω και του άπω άκρου του βραγχιακού επικαλύμματος 11. Ραχιαία μετατόπιση των θωρακικών πτερυγίων 140 Kατά μήκος της CV3, διαφοροποιήθηκαν τα αρσενικά zebrafish που αναπτύχθηκαν στους 22 C, και των τριών υπό εξέταση οντογενετικών περιόδων (G, G1, G2), από αυτά που αναπτύχθηκαν στους 28 και 32 C. Η τρίτη, λοιπόν, κανονική μεταβλητή, διαχωρίζει τα άτομα με βάση τη θερμοκρασία ανάπτυξης. Η διαφοροποίηση του σχήματος του σώματός των zebrafish που αναπτύχθηκαν στους 22 C από τα υπόλοιπα, αφορά στις ακόλουθες ανατομικές τροποποιήσεις: 1. Πρόσθια μετατόπιση του ρύγχους 2. Οπίσθια μετατόπιση του οπίσθιου σημείου του οφθαλμού 3. Πρόσθια και ραχιαία μετατόπιση του οπίσθιου άκρου του ραχιαίου πτερυγίου 4. Πρόσθια και κοιλιακή (ορόσημα 7 και 8) μετατόπιση του ουραίου πτερυγίου 5. Πρόσθια μετατόπιση του του οστού της κάτω γνάθου 6. Κοιλιακή μετατόπιση του κάτω άκρου του βραγχιακού επικαλύμματος 7. Οπίσθια μετατόπιση του άπω άκρου του βραγχιακού επικαλύμματος 8. Οπίσθια μετατόπιση των θωρακικών πτερυγίων Συνολικά, από τα πλέγματα παραμόρφωσης, ο διαχωρισμός των αρσενικών zebrafish της ομάδας G2, από αυτά των G και G1 (κατά μήκος της CV1), οφείλεται κυρίως σε ανατομικές διαφοροποιήσεις που εντοπίζονται στο οπίσθιο τμήμα του κορμού, οριοθετούμενο από τα πίσω άκρα του εδρικού και ραχιαίου πτερυγίου, μέχρι την ουρά, και σε μικρότερο βαθμό στην περιοχή του κεφαλιού. Έτσι, το οπίσθιο τμήμα του κορμού εμφανίζεται περισσότερο διευρυμένο νωτιαιοκοιλιακά στα άτομα της ομάδας G2, ενώ η περιοχή που οριοθετείται από τα ορόσημα του ρύγχους και του βραγχιακού επικαλύμματος, εμφανίζεται περισσότερο συμπιεσμένη. Η έντονη πρόσθια μετατόπιση των ορόσημων που αντιστοιχούν στο οπίσθιο τμήμα του εδρικού και του ραχιαίου πτερυγίου, των ατόμων της ομάδας G2, δίνει την εικόνα ενός περισσότερο «συμπιεσμένου» σχήματος σώματος, προσθιοπίσθια. Η διαφοροποίηση του σχήματος του σώματος των ατόμων της ομάδας G1 σε σχέση με τα άτομα των ομάδων G και G2 (κατα μήκος της CV2), οφείλεται κυρίως σε διαφοροποιήσεις που εντοπίζονται στην περιοχή της του κορμού κοιλιάς και σε μικρότερο βαθμό στην περιοχή του κεφαλιού. Έτσι, τα άτομα της ομάδας που δέχτηκαν την επίδραση της θερμοκρασίας κατά την πρώιμη οντογενετική περίοδο (G1), εμφανίζουν πιο συμπιεσμένη - νωτιαιοκοιλιακά - κοιλιακή περιοχή σε σχέση με τα υπόλοιπα, ενώ η οπίσθια μετατόπιση της οπίσθιας βάσης του ραχιαίου και εδρικού πτερυγίου, καταλήγει σε ένα περισσότερο τορπιλοειδές σχήμα σώματος σε σχέση με τα άτομα των ομάδων G και G2 που είναι πιο διευρυμένα ραχιαιοκοιλιακά. Τέλος, κατά μήκος της CV3 που διαχωρίζει τα άτομα των τριών οντογενετικών περιόδων που αναπτύχθηκαν στους 22 C, από αυτά των 28 και 32 C, η διαφοροποιηση του σχήματος του σώματος εντοπίζεται κατά βάση σε αλλαγές στην περιοχή του κεφαλιού, και λιγότερο της ουράς. Τα άτομα των 22 C εμφανίζουν πιο διευρυμένο το τμήμα που οριοθετείται από τα ορόσημα της κεφαλής (άκρη του ρύγχους) και του βραγχιακού επικαλύμματος, σε σχέση με τα άτομα των 28 και 32 C (το οποίο ισχύει και για τα θηλυκά άτομα των 22 C), ενώ το ουραίο τμήμα εμφανίζεται πιο στενό ραχιαιοκοιλιακά.

143 G1_32 G1_28 G1_22 G2_32 G2_28 G2_22 G28 G32 G22 G1_32 G1_28 G1_22 G2_32 G2_28 G2_22 G32 G28 G22 Similarity (%) Cluster A Cluster B Cluster A Cluster B 80 Females 60 Males I II I II Εικόνα 4.2-5: Ανάλυση δενδρογράμματος των πειραματικών πληθυσμών ενήλικων θηλυκών (Females) και αρσενικών (Males) zebrafish που είχαν αναπτυχθεί στους 22, 28 και 32 C, κατά την πρώιμη οντογενετική περίοδο (G1: d) που περιελάμβανε το εμβρυϊκό και πρώιμο νυμφικό στάδιο ανάπτυξης, κατά την όψιμη οντογενετική περίοδο (G2: d) καθ όλη τη διάρκεια της ανάπτυξης, που περιλαμβάνει τις δύο προ-αναφερόμενες οντογενετικές περιόδους (G: 1 η dpf-14mm TL). Η ανάλυση ιεραρχικής ομαδοποίησης (Cluster Analysis) πραγματοποιήθηκε επί των αποστάσεων Mahalanobis, οι οποίες προέκυψαν από τις μεταβλητές που περιγράφουν τη διαφοροποίηση του σχήματος του σώματος των πληθυσμών zebrafish εννιά πειραματικών πληθυσμών. Ακολούθησε η κατά φύλο ανάλυση σε ομάδες (cluster analysis) και η δημιουργία δενδρογράμματος (Εικόνα 4.2-5), με τους πειραματικούς πληθυσμούς των zebrafish που είχαν αναπτυχθεί στους 22, 28 και 32 C, κατά τις τρεις υπό εξέταση οντογενετικές περιόδους (G1, G2 και G). Η ανάλυση δενδρογράμματος, έδειξε ότι σε επίπεδο σημαντικότητας 80% περίπου για τα θηλυκά άτομα, και 57% περίπου, για τα αρσενικά, σχηματίστηκαν δύo κύριες ομάδες: Η μία περιλαμβάνει τους πειραματικούς πληθυσμούς της οντογενετικής περιόδου G (Cluster B), ενώ η άλλη, τους πειραματικούς πληθυσμούς G1 (υπο-ομάδα Ι-Cluster A) και G2 (υπο-ομάδα ΙI-Cluster A) (Εικόνα 4.2-5). Τα αποτελέματα αυτά δρουν επιβεβαιωτικά των αναλύσεων γεωμετρικής μορφομετρίας, διαχωρίζοντας τους πειραματικούς πληθυσμούς όχι βάσει της θερμοκρασία ανάπτυξης, αλλά βάσει της οντογενετικής περιόδου εντός των χρονικών ορίων της οποίας εφαρμόζονται οι διαφορετικές θερμοκρασιακές συνθήκες. Ή διαφορετικά- η μεταξύ των διαφορετικών θερμοκρασιακών συνθηκών ομοιότητες, όταν πρόκειται για τους πειραματικούς πληθυσμούς μιας οντογενετικής περιόδου (G, G1, G2), είναι τόσο ισχυρές ώστε οι πληθυσμοί αυτοί να ομαδοποιούνται μεταξύ τους. Το γενονός ότι τα άτομα των 28 C δεν ομαδοποιούνται μεταξύ τους, αλλά με αυτά των 22 και 32 C της εκάστοτε υπό εξέταση οντογενετικής περιόδου, συνηγορεί υπέρ της επίδρασης του κοινού γενετικού υπόβαθρου των πειραματικών πληθυσμών που ανήκουν στην ίδια γενιά, δηλαδή προέρχονται από κοινό απόθεμα αυγών. Όμως, ο πλήρης διαχωρισμός της ομάδας G από τις G1 και G2, συνηγορεί υπέρ μιας αθροιστικής δράσης της θερμοκρασίας ανάπτυξης, σύμφωνα με την οποία το σχήμα των ατόμων που υποβάλλονται στην επίδραση των διαφορετικών θερμοκρασιακών συνθηκών καθ όλη τη διάρκεια της ανάπτυξής τους, μέχρι την ολοκλήρωση της μεταμόρφωσης και τη διαφοροποίηση και καθορισμό του φύλου τους, διαφοροποιείται πλήρως.

144 4.3. Επίδραση της πυκνότητας του πληθυσμού στη φαινοτυπική πλαστικότητα του zebrafish Επίδραση της πυκνότητας του πληθυσμού, στο ρυθμό αύξησης 142 Ο ρυθμός αύξησης κάθε πληθυσμού εκτιμήθηκε ύστερα από προσαρμογή των πειραματικών δεδομένων στο μοντέλο αύξησης TL = a e SGR t (όπου t η ηλικία σε dpf, και a το TL για t=0) (Ricker, 1978), με λογαρίθμηση των τιμών TL. Η επίδραση της θερμοκρασίας στο ρυθμό αύξησης, ελέγχθηκε με ανάλυση συνδιασποράς ANCOVA (Statgraphics Plus v.5). Τα πειραματικά δεδομένα είχαν καλή προσαρμογή στο θεωρητικό μοντέλο αύξησης που εφαρμόστηκε (Πίνακας 23). Συνολικά πραγματοποιήθηκαν 11 δειγματοληψίες 5-10 ατόμων προκειμένου να μελετηθεί ο ρυθμός αύξησης των ατόμων του πρώτου πειράματος, που αφορά στην επίδραση της πυκνότητας κατά το νυμφικό στάδιο. Το αρχικό μέσο μήκος σώματος (ΝL) των νυμφών, για το πρώτο πείραμα, είναι περίπου 4,5mm, για τη συνθήκη 400 και 4,9mm για τη συνθήκη των 200. Όσο προχωράει η ανάπτυξη, το μέσο μήκος σώματος των νυμφών κατά τις ίδιες ημέρες μετά τη γονιμοποίηση (dpf), είναι μεγαλύτερο στη συνθήκη χαμηλότερης πυκνότητας (Εικόνα ). Και στις δύο συνθήκες πυκνότητας, στις 42dpf παρατηρήθηκε αλλαγή του ρυθμού αύξησης. Σε εκείνη τη φάση, το μέσο μήκος σώματος (SL) των αναπτυσσόμενων ιχθύων είναι περίπου 15mm για τη συνθήκη των 400 και 17,5mm για τη συνθήκη των 200, το οποίο επιβεβαιώνει ότι σε υψηλές πυκνότητες η αύξηση των ιχθύων είναι πιο αργή από ότι σε χαμηλότερες πυκνότητες. Από τις 42dpf και μετά, μειώνεται σημαντικά ο ρυθμός αύξησης, ο οποίος κυμαίνεται από 0,0055d -1 (συνθήκη 200Β), έως 0,0103 d -1 (συνθήκη 400Β). Από τη σύγκριση των ρυθμών αύξησης, εντός κάθε πειραματικής επανάληψης, για το πρώτο πείραμα, προέκυψε ότι υπάρχει στατιστικά σημαντική διαφορά στο ρυθμό αύξησης μεταξύ της πρώιμης και της όψιμης οντογενετικής περιόδου, για όλες τις συνθήκες: 200Α, 200Β, 400Α, 400Β. Δεν παρατηρήθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές κατά τη σύγκριση των ρυθμών αύξησης της πρώιμης οντογενετικής περιόδου κάθε συνθήκης, όταν αυτές συγκρίθηκαν μεταξύ τους ξεχωριστά (Εικόνα , Πίνακας 23). Τα ίδια ισχύουν και κατά τη σύγκριση των ρυθμών αύξησης της όψιμης οντογενετικής περιόδου. Οι δειγματοληψίες που πραγματοποιήθηκαν κατά το δεύτερο πείραμα, όπου εξετάζεται η επίδραση της πυκνότητας από τη στιγμή που το μέσο μήκος σώματος (SL) των νυμφών είναι περίπου ίσο με 8mm και μετά, είναι λιγότερες (συνολικά έξι) από αυτές που πραγματοποιήθηκαν στο πρώτο πείραμα, λόγω μικρού αριθμού ατόμων. Το αρχικό μέσο μήκος σώματος (ΝL) των νυμφών του δεύτερου πειράματος, είναι ίσο 5,1mm SL. Στις 20dpf το μήκος σώματος (SL) των αναπτυσσόμενων ιχθύων έφτασε τα 8,39mm, οπότε διαχωρίστηκαν στις πυκνότητες που είχαν οριστεί και περιγράφονται στον πειραματικό σχεδιασμό. Σε αυτό το πείραμα, παρατηρείται μείωση του ρυθμού αύξησης στις 60dpf, για όλες τις συνθήκες. Σε εκείνη τη φάση, το μέσο μήκος σώματος (SL) των αναπτυσσόμενων ιχθύων είναι ίσο με 20,2 και 22,5mm για τις συνθήκες 70Α και 70Β, και ίσο με 18,1 και 19,8mm, για τις συνθήκες 140Α και 140B. Δηλαδή ισχύει και πάλι ότι σε υψηλές πυκνότητες η αύξηση των ιχθύων είναι πιο αργή από ότι σε χαμηλότερες πυκνότητες. Από τις 60dpf και μετά, μειώνεται σημαντικά ο ρυθμός αύξησης, ο οποίος κυμαίνεται από 0,0027d -1 (συνθήκη 140Β), έως 0,0074d -1 (συνθήκη 70Α).

145 Εικόνα : Διαγράμματα του ρυθμού αύξησης στις διαφορετικές συνθήκες πυκνότητας (200 & 400, 70 & 140) που ελέγχθηκαν κατά τη διεξαγωγή των δύο πειραμάτων αυτής της μελέτης. Περιλαμβάνονται και οι δύο πειραματικές επαναλήψεις, Α & Β. Στο πρώτο πείραμα ( ) ο ρυθμός αύξησης μειώθηκε στις 42 dpf. Στο δεύτερο πείραμα (70-140) ο ρυθμός αύξησης μειώθηκε στις 60 dpf. SL, τυπικό μήκος. 143

146 Πίνακας 23: Ρυθμός αύξησης (SGR) κατά την πρώιμη και κατά την όψιμη οντογενετική περίοδο, στις επιμέρους ομάδες. Οι κοινοί εκθέτες εκφράζουν στατιστικά σημαντικές διαφορές, όπως αυτές προέκυψαν κατά τη σύγκριση των ρυθμών αύξησης της πρώιμης με την όψιμη οντογενετική περίοδο, στο πρώτο ( ) και δεύτερο πείραμα (70-140) και στις δύο επαναλήψεις (Α Β). lna, κλίση ευθείας, n, αριθμός δειγμάτων. Early Ontogenetic period Late Ontogenetic period Exp. Population SGR lna R 2 n 200A 0,0407 a 3,4351 0, B 0,0390 b 3,5229 0, A 0,0375 c 3,0387 0, B 0,0345 d 3,2861 0, A 0,0283 e 4,4293 0, B 0,0260 f 4,5306 0, A 0,0236 4,9202 0, B 0,0256 4,6725 0, A 0,0084 a 12,365 0, B 0,0055 b 14,203 0, A 0,0076 c 11,592 0, B 0,0103 d 9,8276 0, A 0,0074 e 19, B 0,0061 f 18, A 0, , B 0, , Από τη σύγκριση των ρυθμών αύξησης, εντός κάθε πειραματικής επανάληψης, για το πρώτο πείραμα, προέκυψε ότι υπάρχει στατιστικά σημαντική διαφορά στο ρυθμό αύξησης μεταξύ της πρώιμης και της όψιμης οντογενετικής περιόδου στη συνθήκη χαμηλής πυκνότητας, και στις δύο επαναλήψεις (70Α και 70Β) ( , Πίνακας 23). Η σύγκριση των ρυθμών αύξησης της όψιμης οντογενετικής περιόδου δέν ήταν δυνατή λόγω του ότι έχουμε μικρό αριθμό δεδομένων, προερχόμενων από δύο μόλις δειγματοληψίες. Όπως ειπώθηκε στην εισαγωγή, η πυκνότητα παίζει σημαντικό ρόλο στη δομή των ιχθυοπληθυσμών επηρεάζοντας την επιβίωση των ιχθύων στα αρχικά στάδια ανάπτυξής τους. Κατά τη διάρκεια του πειράματος καταγράφηκε η θνησιμότητα και τα αποτελέσματα έδειξαν ότι υπήρχαν στατιστικά σημαντικές διαφορές στο μέσο ποσοστό της επιβίωσης μεταξύ των συνθηκών 200 και 400 κατά την πρώιμη οντογενετική περίοδο (p<0,05, G-test), όπου το μέσο ποσοστό επιβίωσης 74±0,05% για τη συνθήκη των 200 και 49±0,15 για τη συνθήκη των 400. Δεν παρατηρήθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές στο μέσο ποσοστό της επιβίωσης μεταξύ των συνθηκών 70 και 140 κατά την όψιμη οντογενετική περίοδο, δηλαδή από την αλλαγή του ρυθμού αύξησης και μετά. Το μέσο ποσοστό της επιβίωσης στη συνθήκη των 70 ήταν 73±0,08%, έναντι του 73±0,01%, στη συνθήκη των 140 ήταν (p>0,05, G-test).

147 Επίδραση της πυκνότητας του πληθυσμού, στην αναλογία φύλου Όταν τα άτομα ενηλικιώθηκαν, προσδιορίστηκε η αναλογία φύλου των πληθυσμών που είχαν δεχτεί την επίδραση της διαφορετικής πυκνότητας. Σε όλους τους πειραματικούς πληθυσμούς, με εξαίρεση τον πληθυσμό των 70A, ήταν αδύνατο να προσδιοριστεί το φύλο 25 συνολικά ψαριών, ακόμα και ύστερα από ανατομία των γονάδων τους (Πίνακας 24). Τα απροσδιόριστου φύλου άτομα ήταν πιθανότατα αδιαφοροποίητα, αφού η ανατομία των γονάδων τους και η μικροσκοπική παρατήρηση δεν μπορούσε να οδηγήσει σε ασφαλές συμπέρασμα για το αν πρόκεται για ωοθηκικό ή ορχικο ιστό. Η αναλογία φύλου για κάθε πειραματικό πληθυσμό, υπολογίστηκε από το σύνολο των ατόμων που το φύλο τους ήταν δυνατό να προσδιοριστεί (Πίνακας 24, Εικόνα ) % Females ( ) 60 % Females (70-140) A 200B 400A 400B 0 70A 70B 140A 140B Εικόνα : Επί τοις εκατό ποσοστό των θηλυκών ατόμων zebrafish ατόμων στις διαφορετικές συνθήκες πυκνότητας που χρησιμοποιήθηκαν κατά τη διεξαγωγή των δύο πειραμάτων ( και ) της παρούσας μελέτης. Παρουσιάζονται τα αποτελέσματα για την πρώτη (A) και τη δεύτερη (B) πειραματική επανάληψη. Από τα δεδομένα δεν προέκυψαν στατιστικά σημαντικές διαφορές στην αναλογία φύλου μεταξύ των διαφορετικών πυκνοτήτων κάθε πειράματος. (p>0,05 G-test). Πίνακας 24: Το πλήθος (n) και το ποσοστό (%) των θηλυκών (Females) και αρσενικών (Males) ατόμων στις διαφορετικές συνθήκες πυκνότητας που χρησιμοποιήθηκαν κατά τη διεξαγωγή των δύο πειραμάτων ( και ) της παρούσας μελέτης. Τα αποτελέσματα αφορούν στις δύο πειραματικές επαναλήψεις, A και B. Σε όλους τους πειραματικούς πληθυσμούς, με εξαίρεση τον 70Α, ήταν αδύνατο να προσδιοριστεί το 25 συνολικά ψαριών (Indefinable). Rep. Α Β Τ (n) (n) % % (n) ( ο C) Females Males Females Males Indefinable 200A ,5 45, B ,4 52, A ,0 45, B ,4 58,6 4 70A ,3 61,7 0 70B ,1 51, A ,8 59, B ,0 54,0 4 Δεν προέκυψαν στατιστικά σημαντικές διαφορές στην αναλογία φύλου μεταξύ των πληθυσμών διαφορετικής πυκνότητας, τόσο στο πρώτο ( ), όσο και στο δεύτερο πείραμα (70-140), και στις δύο πειραματικές επαναλήψεις (p>0,05, G-test). Τα ποσοστά των θηλυκών ατόμων για τη συνθήκη 200 ήταν 54,5 και 47,4%, κατά την πρώτη και δεύτερη πειραματική επανάληψη, αντίστοιχα, ενώ τα αντίσοιχα ποσοστά για τη συνθήκη των 400,

148 ήταν 55 και 41,4%. Τα ποσοστά των θηλυκών ατόμων για τη συνθήκη 70 ήταν 38,3 και 48,1%, κατά την πρώτη και δεύτερη πειραματική επανάληψη, αντίστοιχα, ενώ τα αντίσοιχα ποσοστά για τη συνθήκη των 140, ήταν 40,8 και 40,6%. (Πίνακας 24) Επίδραση πυκνότητας του πληθυσμού, στο σχήμα του σώματος των ενήλικων θηλυκών και αρσενικών zebrafish 146 Για τη μελέτη της επίδρασης της πυκνότητας του πληθυσμού στην εξωτερική μορφολογία του σώματος των ενήλικων zebrafish, τυχαία επιλεγμένα άτομα ανά φύλο, πειραματικό πληθυσμό και συνθήκη υποβλήθηκαν σε ανάλυση γεωμετρικής μορφομετρίας. Χρησιμοποιήθηκαν 133 άτομα από την πρώτη πειραματική επανάληψη του πείραματος και 135 από τη δεύτερη, 107 άτομα από την πρώτη πειραματική επανάληψη του πείραματος και 144 από τη δεύτερη (Εικόνα ). Από την ανάλυση κανονικών συνιστωσών αποδείχτηκε ότι το φύλο, πρωταρχικά, και η πυκνότητα του πληθυσμού, δευτερευόντως, επιδρούν στο σχήμα του σώματος των ενήλικών αρσενικών και θηλυκών zebrafish. Τα αποτελέσματα αυτά ήταν επαναλήψιμα και ισχύουν και για τα δύο πειράματα ( και ). Πιο συγκεκριμένα, η πρώτη κανονική μεταβλητή (CV1) διαχώρισε πλήρως τα άτομα με βάση το φύλο τους, ανεξάρτητα από την πυκνότητα του κάθε πληθυσμού και η δεύτερη κανονική μεταβλητή (CV2) διαχώρισε τα άτομα πλήρως με βάση την πυκνότητα του πληθυσμού κατά την οντογένεση, ανεξάρτητα από το φύλο. Στο πρώτο πείραμα ( ), όπου ελέγχθηκε η επίδραση της πυκνότητας του πληθυσμού κατά τη διάρκεια του νυμφικού σταδίου, από την κατανάλωση λεκιθικών αποθεμάτων, μέχρι το μέσο τυπικό μήκος σώματος (SL) των αναπτυσσόμενων zebrafish να φτασει περίπου τα 10mm, η ανάλυση γεωμετρικής μορφομετρίας έδειξε ότι η πρώτη κανονική μεταβλητή διαχώρισε πλήρως τα άτομα με βάση το φύλο τους, ενώ κατα μήκος της δεύτερης κανονικής μεταβλητής ομαδοποιήθηκαν τα αρσενικά και τα θηλυκά zebrafish της πυκνότητας 200 μεταξύ τους, διαχωριζόμενα πλήρως από αυτά της πυκνότητας 400 (1 η πειραματική επανάληψη, Wilks λ=0,0264, 2 η πειραματική επανάληψη, Wilks λ=0,0314). Η πρώτη κανονική μεταβλητή (CV1) ερμήνευσε το 53% και το 67% της συνολικής ποικιλομορφίας του σχήματος του σώματος, στην πρώτη και στη δεύτερη πειραματική επανάληψη, αντίστοιχα, ενώ η δεύτερη κανονική μεταβλητή (CV2) ερμήνευσε το 40% και το 28% της συνολικής ποικιλομορφίας του σχήματος του σώματος (Εικόνα ). Οι σωματικές δομές που τροποποιήθηκαν και ο τρόπος με τον οποίο τροποποιήθηκαν, περιγράφονται ακολούθως. Kατά μήκος της CV1, η διαφοροποίηση του σχήματος του σώματος, αφορά στις ακόλουθες ανατομικές τροποποιήσεις των θηλυκών από τα αρσενικά zebrafish: 1. Κοιλιακή μετατόπιση των κοιλιακών πτερυγίων 2. Οπίσθια μετατόπιση πρόσθιου άκρου του εδρικού πτερυγίου 3. Πρόσθια μετατόπιση του ουραίου πτερυγίου 4. Πρόσθια και μικρού βαθμού ραχιαία μετατόπιση του απώτερου άκρου του βραγχιακού επικαλύμματος 5. Οπίσθια μετατόπιση του οστού της κάτω γνάθου

149 CV2 (67%) CV2 (53%) (A) 4 (33) 200F 200M (27) -4 (25) 4 400F 400M 147 (32) -4 CV2 (40%) 200M (38) (B) 3 200F (36) M 400F (41) (29) -3 CV2 (28%) Εικόνα : Επίδραση του φύλου (κατά μήκος της CV1) και της πυκνότητας (κατά μήκος της CV2) στο σχήμα του σώματος ενήλικων θηλυκών (F) και αρσενικών zebrafish, για το πρώτο πείραμα της παρούσας μελέτης ( ), στο οποίο ελέγχεται η επίδραση της πυκνότητας κατά τη διάρκεια του νυμφικού σταδίου. Δίνεται η μέση τιμή, Mean±2SE. Στις παρενθέσεις αναγράφεται το ποσοστό της συνολικής ποικιλομορφίας του σχήματος του σώματος που ερμηνεύει η κάθε κανονική μεταβλητή (A), 1 η πειραματική επανάληψη (Β), 2 η πειραματική επανάληψη. Οι αριθμοί με πλάγια γράμματα, υποδηλώνουν τον αριθμό των ατόμων που χρησιμοποιήθηκαν στην ανάλυση. Από τις παραπάνω παρατηρούμενες ανατομικές τροποποιήσεις, που αφορούν στο φύλο των ενήλικων ατόμων, η μετατόπιση των κοιλιακών πτερυγίων και και του πρόσθιου άκρου του εδρικού πτερυγίου, είναι αυτές που συμμετέχουν κατά βάση στη διαφοροποίηση του σχήματος του σώματος των θηλυκών σε σχέση με τα αρσενικά zebrafish. Οι τροποποιήσεις αυτές αφορούν στο σφαιρικότερο σχήμα των θηλυκών ατόμων σε σχέση με τα τορπιλοειδούς σχήματος αρσενικά zebrafish. Παρά την ισχυρή επίδραση του φύλου, κατά μήκος της δεύτερης κανονικής μεταβλητής διαχωρίζονται πλήρως τα άτομα που αναπτύχθηκαν σε χαμηλή πυκνότητα (200) από αυτά της υψηλής πυκνότητας (400). Η επίδραση της πυκνότητας είναι επίσης ισχυρή, αφού η δεύτερη κανονικά μεταβλητή

150 ερμηνεύει όπως είδαμε - υψηλό ποσοστό της συνολικής ποικιλομορφίας του σχήματος του σώματος των zebrafish (40% και 28% στην πρώτη και στη δεύτερη πειραματική επαναλήψη, αντίστοιχα). Μάλιστα, παρατηρούνται σημαντικές (μεγάλου βαθμού) τροποποιήσεις σε αρκετές ανατομικές περιοχές. Αναλυτικά, κατά μήκος της CV2, η διαφοροποίηση του σχήματος του σώματος αφορά στις ακόλουθες ανατομικές τροποποιήσεις των ατόμων της χαμηλής πυκνότητας (200) από αυτά της υψηλής (400): Κοιλιακή και μικρού βαθμμού πρόσθια μετατόπιση του ραχιαίου πτερυγίου (μορφομετρικά σημεία 2 και 3) 2. Οπίσθια μετατόπιση του ουραίου πτερυγίου (μορφομετρικά σημεία 4, 5 και 6). 3. Πρόσθια μετατόπιση του πρόσθιου άκρου του εδρικού πτερυγίου 4. Ραχιαία και μικρού βαθμού πρόσθια μετατόπιση των κοιλιακών πτερυγίων 5. Οπίσθια και μικρού βαθμού κοιλιακή μετατόπιση του οστού της κάτω γνάθου 6. Ραχιαία μετατόπιση των θωρακικών πτερυγίων 7. Οπίσθια μετατόπιση του άπω άκρου του βραγχιακού επικαλύμματος Συνολικά, από τα πλέγματα παραμόρφωσης, φαίνεται ότι η διαφοροποίηση του σχήματος του σώματος λόγω της πυκνότητας οφείλεται σε αλλαγές που εντοπίζονται σε όλο το μήκος του κορμού, καθώς και της ουράς. Το σχήμα των ατόμων της χαμηλής πυκνότητας φαίνεται περισσότερο πεπλατυσμένο νωτιαιο-κοιλιακά αλλά και πιο δευρυμένο πρισθιοπίσθια. Είναι ίσως σημαντικό να σημειωθεί η μετατόπιση των ορόσημων 10, 11 και 12 που αντιστοιχούν στο βραγχιακό επικάλυμμα και τα θωρακικά πτερύγια. Στα άτομα της υψηλής πυκνότητας, τα ορόσημα αυτά μετατοπίζονται έτσι ώστε βρίσκονται τελικά πιο απομακρυσμένα μεταξύ τους, δευρύνοντας την περιοχή που οριοθετείται από αυτά τα ορόσημα. Θα μπορούσε πιθανά να συσχετιστεί με μια μεγαλύτερη επιφάνεια επαφής των βραγχίων με το νερό, προκειμένου να καθίσταται αποτελεσματική η πρόσληψη του οξυγόνου. Κατά αντιστοιχία με τα αποτελέσματα του πρώτου πειράματος, και στο δεύτερο πείραμα, τα θηλυκά και αρσενικά άτομα της πυκνότητας των 70 ομαδοποιήθηκαν μεταξύ τους και διαχωρίστηκαν πλήρως από τα άτομα της πυκνότητας των 140 (1 η πειραματική επανάληψη, Wilks λ=0,0663 και 2 η πειραματική επανάληψη, Wilks λ=0,0233). Η CV1 ερμήνευσε το 66% και το 64% της συνολικής ποικιλομορφίας του σχήματος του σώματος, στην πρώτη και στη δεύτερη πειραματική επανάληψη, αντίστοιχα, ενώ CV2 ερμήνευσε το 30% της συνολικής ποικιλομορφίας του σχήματος του σώματος, και στις δύο πειραματικές επαναλήψεις (Εικόνα ). Οπως και στο πρώτο πείραμα, έτσι και εδώ η CV1 διαχώρισε πλήρως τα άτομα βάσει του φύλου τους. Οι ανατομικές τροποποιήσεις σε αυτή την περίπτωση, είναι ανάλογες με αυτές που παρατηρήθηκαν και στο πρώτο πείραμα, οφειλόμενες κατά βάση στο ραχιαιο-κοιλιακά διευρυμένο σχήμα σώματος των θηλυκών ατόμων, λόγω της ύπαρξης των ωοθηκων. Όμως, όπως θα δούμε αμέσως παρακάτω, σε αυτή την πειραματική συνθήκη υπάρχουν διαφοροποιήσεις και στην περιοχή της ουράς, του ρύγχους, καθώς και της περιοχής που οριοθετείται από τα ορόσημα του βραγχιακού επικαλύμματος και των θωρακικών πτερυγίων.

151 CV1 (64%) CV1 (66%) (A) 4 70F 70M (28) (16) -5 (51) 5 (38) 140M 140F CV2 (30%) 4 (23) 70M (B) (23) 70F -5 (46) (44) 5 140M 140F -4 CV2 (30%) Εικόνα : Επίδραση του φύλου (κατά μήκος της CV1) και της πυκνότητας (κατά μήκος της CV2) στο σχήμα του σώματος ενήλικων θηλυκών (F) και αρσενικών zebrafish, για το δεύτερο πείραμα της παρούσας μελέτης (70-140), στο οποίο ελέγχεται η επίδραση της πυκνότητας, αφού τα αναπτυσσόμενα ψάρια αποκτήσουν μήκος σώματος SL 8mm. Δίνεται η μέση τιμή, Mean±2SE. Στις παρενθέσεις αναγράφεται το ποσοστό της συνολικής ποικιλομορφίας του σχήματος του σώματος που ερμηνεύει η κάθε κανονική μεταβλητή (A), 1 η πειραματική επανάληψη (Β), 2 η πειραματική επανάληψη. Οι αριθμοί με πλάγια γράμματα, υποδηλώνουν τον αριθμό των ατόμων που χρησιμοποιήθηκαν στην ανάλυση. Αναλυτικά λοιπόν, η διαφοροποίηση του σχήματος του σώματος κατά μήκος της CV1, και πιο συγκεκριμένα των θηλυκών από τα αρσενικά zebrafish, αφορά στις ακόλουθες ανατομικές τροποποιήσεις: 1. Κοιλιακή μετατόπιση των κοιλιακών πτερυγίων 2. Οπίσθια μετατόπιση πρόσθιου άκρου του εδρικού πτερυγίου 3. Ραχιαία μετατόπιση οπίσθιου άκρου του εδρικού πτερυγίου 4. Πρόσθια μετατόπιση του ουραίου πτερυγίου (ορόσημα 4, 5 και 6) 5. Ραχιαία και ελάχιστα οπίσθια μετατόπιση του ρύγχους 6. Πρόσθια μετατόπιση του απώτερου άκρου του βραγχιακού επικαλύμματος

152 7. Πρόσθια και κοιλιακή μετατόπιση των θωρακικών πτερυγίων 8. Μικρού βαθμού ραχιαία μετατόπιση του οστού της κάτω γνάθου Η δεύτερη κανονική μεταβλητή ερμηνεύει το 30% της συνολικής ποικιλομορφίας στο σχήμα του σώματος, και στις δύο πειραματικές επαναλήψεις. Οι διαφοροποιήσεις σε αυτή την περίπτωση αφορούν στην επίδραση της πυκνότητας. Οι σωματικές δομές που τροποποιήθηκαν και ο τρόπος με τον οποίο τροποποιήθηκαν, περιγράφονται ακολούθως. 150 Τα zebrafish της χαμηλής πυκνότητας διαφέρουν ως προς αυτά της υψηλής ως προς τα ακόλουθα χαρκτηριστικά: 1. Οπίσθια μετατόπιση του οπίσθιου άκρου του ραχιαίου πτερυγίου 2. Πρόσθια μετατόπιση των κοιλιακών πτερυγίων 3. Πρόσθια μετατόπιση του πρόσθιου άκρου του εδρικού πτερυγίου 4. Κοιλιακή μετατόπιση του απώτερου άκρου του βραγχιακού επικαλύμματος 5. Πρόσθια μετατόπιση του κάτω άκρου του βραγχιακού επικαλύμματος 6. Κοιλιακή μετατόπιση των θωρακικών πτερυγίων 7. Ραχιαία μετατόπιση του οστού της κάτω γνάθου 8. Μικρού βαθμού οπίσθια μετατόπιση του ρύγχους και της πρόσθιας περιοχής του οφθαλμού. Συνολικά, από τα πλέγματα παραμόρφωσης, φαίνεται ότι η διαφοροποίηση του σχήματος του σώματος των ατόμων που αναπτύχθηκαν σε χαμηλότερη πυκνότητα είναι πιο διευρυμένο ραχιαιο-κοιλιακά στην περιοχή της κεφαλής και καθόλο το μήκος του κορμού πιο συμπιεσμένο προσθιοπίσθια. Τα άτομα της υψηλότερης πυκνότητας φαίνεται ότι έχουν πιο ανασηκωμένο το πρόσθιο άκρο του ραχιαίου πτερυγίου, το οποίο θα μπορούσε ίσως να συνδεθεί με μια πιθανή αύξηση της αντίστασης στην κίνηση εντός του υδάτινου στοιχείου (αντίστοιχο της αύξησης ίσως του ιξώδους στα κρύα νερά), σε υψηλές πληθυσμιακές πυκνότητες. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι όπως προκύπτει από την παρατήρηση των πλεγμάτων παραμόρφωσης των δύο πειραμάτων - οι διαφορές που προκύπτουν κατά την επίδραση της πυκνότητας στο νυμφικό στάδιο (πρώτο πείραμα ) είναι εντονότερες από αυτές που προκύπτουν από την επίδραση της πυκνότητας μετά από μήκος σώματος SL 8mm.

153 TL (mm) TL (mm) 4.4. Συνεπίδραση της θερμοκρασίας και της φωτοπεριόδου κατά την πρώιμη ανάπτυξη, στη φαινοτυπική και στην οντογενετική πλαστικότητα του zebrafish Συνεπίδραση της θερμοκρασίας και της φωτοπεριόδου κατά την πρώιμη ανάπτυξη, στο ρυθμό αύξησης 151 Ο ρυθμός αύξησης κάθε πληθυσμού εκτιμήθηκε μετά από προσαρμογή των πειραματικών δεδομένων στο μοντέλο αύξησης TL = a e SGR t (Ricker 1978), με λογαριθμοποίηση των τιμών TL. O στατιστικός έλεγχος των διαφορών του SGR μεταξύ των πληθυσμών έγινε με χρήση ANCOVA (Statgraphics Plus v.5). Τα πειραματικά δεδομένα είχαν καλή προσαρμογή στο θεωρητικό μοντέλο αύξησης που εφαρμόστηκε. Ανάλογα με τις πειραματικές συνθήκες, ο ρυθμός αύξησης του ολικού μήκους (SGR) του D. rerio κυμάνθηκε μεταξύ 0,033 (στη συνθήκη 8:16 L:D-Α πειραματική επανάληψη) και 0,083 d -1 (στη συνθήκη 14:10 L:D-Β πειραματική επανάληψη) (Εικόνα , Πίνακας 25) :10 L:D Replicate (A) y = 3,2892e 0,0544x R² = 0,9735 y = 3,3395e 0,0497x R² = 0, :16 L:D Replicate (A) y = 3,4383e 0,0407x R² = 0,9708 y = 3,4383e 0,0411x R² = 0, y = 3,5079e 0,0328x R² = 0, :10 L:D y = 3,2316e 0,055x 8:16 L:D y = 3,204e 0,0465x 14 Replicate (B) R² = 0, Replicate (B) R² = 0, y = 2,9506e 0,0764x R² = 0,9827 y = 3,4078e 0,0399x R² = 0, y = 3,2374e 0,0463x R² = 0,9753 y = 3,3042e 0,0409x R² = 0, days post hatching (dph) days post hatching (dph) Εικόνα : Καμπύλες αύξησης του μέσου ολικού μήκους (TL±1SD) των νυμφών (από την αρχή του νυμφικού σταδίου μέχρι και την ολοκλήρωση της μεταμόρφωσης) στις διαφορετικές συνθήκες φωτοπεριόδου (14:10 και 8:16 L:D) και θερμοκρασίας (22, 28, 32 C). Ο λευκός ρόμβος αντιστοιχεί στους 22 C, ο μαύρος κύκλος αντιστοιχεί τους 28 C και το γκρι τρίγωνο στους 32 C. dph, ημέρες μετά την εκκόλαψη. Α και Β, πρώτη και δεύτερη πειραματική επανάληψη αντίστοιχα. Σε συνθήκες κοινής φωτοπεριόδου, στη συνθήκη 14:10 L:D, παρατηρήθηκε γραμμική αύξηση του SGR με τη θερμοκρασία του νερού (Εικόνα ). Αντίθετα στη φωτοπερίοδο 8:16 L:D, το SGR παρέμεινε αμετάβλητο στο θερμοκρασιακό εύρος C (Εικόνα ). Και στις δύο πειραματικές επαναλήψεις, δεν επιβεβαιώθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές του SGR και στις δύο πειραματικές επαναλήψεις (Πίνακας 25). Ο ρυθμός αύξησης του ολικού μήκους αποδείχθηκε ανεξάρτητος της φωτοπεριόδου στις

154 SGR χαμηλές θερμοκρασιακές συνθήκες (22, 28 C, p>0,05), ενώ στους 32 C η αύξηση της φωτοπεριόδου προκάλεσε σημαντική αύξηση του SGR (p<0,05). Οι παραπάνω παρατηρήσεις επιβεβαιώθηκαν και στις δύο πειραματικές επαναλήψεις. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα, η θερμοκρασία και η φωτοπερίοδος συνεπιδρούν στο ρυθμό σωματικής αύξησης, με τον καθένα από αυτούς να ελέγχει τη δράση του άλλου. 0,1 0,09 0,08 14:10 L:D 8:16 L:D Rep. B 152 0,07 0,06 0,05 0,04 0,03 Rep. A Rep. B Rep. A 0, Εικόνα : Ρυθμός αύξησης του TL (SGR) των αναπτυσσόμενων ιχθύων, στις διαφορετικές συνθήκες φωτοπεριόδου (14:10 και 8:16 L:D) και θερμοκρασίας (22, 28 και 32 C), για τις δύο πειραματικές επαναλήψεις (Α και Β). Πίνακας 25: Παράμετροι της σχέσης ΤL = a esgr t για κάθε θερμοκρασία ανάπτυξης (Τ), φωτοπερίοδο (L:D, ώρες) και πειραματική επανάληψη (A και Β). a, σημείο τομής με τον άξονα του TL (ολικό μήκος σώματος). SGR, ρυθμός αύξησης του σώματος. r, συντελεστής συσχέτισης. n, αριθμός δειγματοληψιών. p L:D, επίπεδο σημαντικότητας της διαφοράς του SGR μεταξύ των δύο συνθηκών φωτοπεριόδου, για κάθε επανάληψη και θερμοκρασία. Οι κοινοί εκθέτες των τιμών SGR υποδεικνύουν ομοιογενείς ρυθμούς αύξησης εντός κάθε επανάληψης και συνθήκης φωτοπεριόδου. Rep L:D T ( ο C) ln a SGR R 2 n p L:D 22 1,233 0,035 a 0, : ,216 0,048 b 0, A 32 1,166 0,056 b 0, * 22 1,249 0,033 a 0, : ,232 0,041 b 0, ,239 0,041 b 0, ,251 0,040 a 0, : ,159 0,056 b 0, B 32 1,000 0,083 c 0, * 22 1,250 0,040 a 0, : ,156 0,050 a 0, ,143 0,048 a 0,9727 9

155 Percentage (%) Συνεπίδραση της θερμοκρασίας και της φωτοπεριόδου κατά την πρώιμη ανάπτυξη, στην αναλογία φύλου Μόνο στην θερμοκρασία των 22 C σε συνδυασμό με την φωτοπερίοδο 14:10 (L:D) παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά (G-test, p<0,05) στην αναλογία φύλου, με τα θηλυκά άτομα να είναι λιγότερα από τα αρσενικά (31% θηλυκά έναντι 69% αρσενικά zebrafish) (Εικόνα , Πίνακας 26). Αυτή η διαφορά παρατηρήθηκε μόνο στη μία από τις δύο πειραματικές επαναλήψεις (B), υποδεικνύοντας πιθανόν ότι η χαμηλή θερμοκρασία ανάπτυξης ευνοεί την αρρενοποίηση. Σε καμία από τις άλλες πειραματικές συνθήκες δεν διαφοροποιήθηκε σημαντικά η αναλογία φύλου (G-test, p>0,05) (Εικόνα , Πίνακας 26) η οποία παρέμεινε κοντά στο 1: Πίνακας 26: Το πλήθος (n) και το ποσοστό (%) των θηλυκών (Females) και αρσενικών (Males) ατόμων στις θερμοκρασίες (T) των 22 C, 28 C και 32 C και στις δύο συνθήκες φωτοπεριόδου (14:10 και 8:16 L:D) στην πρώτη (A) και στη δεύτερη (B) επανάληψη. Δίνεται και το σύνολο του αριθμού των ατόμων κάθε πληθυσμού (N). Κοινοί εκθέτες υποδηλώνουν στατιστικά σημαντικές διαφορές στην αναλογία φύλου (G-test, p<0,05). Rep. Photoperiod_L:D Τ ( ο C) Females (n) Males (n) N Males (%) Females (%) : A : a 31 a 14: Β : * 14:10 (L:D) mean values (±SD) 80 8:16 (L:D) mean values (±SD) 60 * C 28 C 32 C Εικόνα : Επίδραση της θερμοκρασίας ανάπτυξης (22 C, 28 C και 32 C) και της φωτοπεριόδου (14:10 και 8:16 L:D) στην αναλογία φύλου του zebrafish. Δίνονται τα μέσα % ποσοστά των δύο φύλων (±SD), όπως αυτά προέκυψαν από τις δύο πειραματικές επαναλήψεις. Με αστερίσκο υποδεικνύονται οι στατιστικά σημαντικές διαφορές στην αναλογία φύλου (G-test, p<0,05). Τα θηλυκά άτομα υποδεικνύονται με σκούρο γκρι χρώμα, ενώ τα αρσενικά με ανοιχτό γκρι C 28 C 32 C

156 Συνεπίδραση της θερμοκρασίας και της φωτοπεριόδου κατά την πρώιμη ανάπτυξη, στο χρονισμό της οντογένεσης Μελετήθηκαν η Αρχή κάμψης της νωτοχορδής (Flexion), η εμφάνιση του εδρικού πτερυγίου (Anal), η εμφάνιση του ραχιαίου πτερυγίου (Dorsal), η ολοκλήρωση κάμψης της νωτοχορδής (Post-flexion), η ολοκλήρωση του σχηματισμού της ουραίας διχάλας (Caudal) και η εμφάνιση προπλασμάτων των κοιλιακών πτερυγίων (Abdominal) (Εικόνα ) Πραγματοποιήθηκε στατιστικός έλεγχος (t-test, p<0,05) του μέσου SL 50 στο οποίο πραγματοποιείται η ολοκλήρωση της εμφάνισης των εξεταζόμενων οντογενετικών χαρακτήρων, μεταξύ των ίδιων θερμοκρασιακών συνθηκών στις διαφορετικές συνθήκες φωτοπεριόδου (Εικόνα , Πίνακας 27) και μεταξύ των διαφορετικών θερμοκρασιακών συνθηκών, στην ίδια φωτοπερίοδο (Εικόνα και , Πίνακας 27). Μεταξύ των διαφορετικών φωτοπεριόδων, στατιστικά σημαντικές διαφορές (t-test, p<0,05) παρατηρήθηκαν στους 22 C στους χαρακτήρες Anal και Caudal, στους 28 C χαρακτήρες Abdominal και Post-Flexion και στους 32 C στους χαρακτήρες Anal και Post Flecxion (Εικόνα Εικόνα , Πίνακας 27). Αναλυτικότερα, στους 22 C, η εμφάνιση του εδρικού πτερυγίου καθυστέρησε στη μικρή φωτοπερίοδο (8:16 L:D) σε σχέση με τη μεγάλη (14:10 L:D), ενώ η ολοκλήρωση σχηματισμού της ουραίας διχάλας καθυστέρησε σημαντικά στη μεγάλη φωτοπερίοδο σε σχέση με τη μικρή. Στους 28 C η ολοκλήρωση της κάμψης της νωτοχορδής και η εμφάνιση των κοιλιακών πτερυγίων καθυστέρησε (δηλαδή πραγματοποιήθηκε σε μεγαλύτερο μήκος σώματος) στη μεγάλη φωτοπερίοδο, σε σχέση με τη μικρή. Τέλος, στους 32 C η εμφάνιση του εδρικού πτερυγίου και η ολοκλήρωση της κάμψης της νωτοχορδής πραγματοποιήθηκαν σε μικρότερο μήκος σώματος στη μικρή φωτοπερίοδο από ότι στη μεγάλη. Με εξαίρεση λοιπόν την εμφάνιση του εδρικού πτερυγίου στους 22 C, οι στατιστικά σημαντικές διαφορές που παρατηρήθηκαν μεταξύ των ίδιων θερμοκρασιών στις διαφορετικές συνθήκες φωτοπεριόδου, στους υπόλοιπους εξεταζόμενους χαρακτήρες, οφείλονταν σε καθυστέρηση της εμφάνισης ή της ολοκλήρωσης της ανάπτυξής τους στη μεγάλη φωτοπερίοδο, σε σχέση με τη μικρή (Πίνακας 27). Στη φωτοπερίοδο 14:10 (L:D) μεταξύ 28 και 32 C παρατηρήθηκε στα στατιστικά σημαντική διαφορά (t-test, p<0,05) μόνο στην εμφάνιση του εδρικού πτερυγίου, η οποία πραγματοποιήθηκε σε μεγαλύτερο μήκος σώματος στους 32 από ότι στους 28 C. Μεταξύ 22 και 28 C, παρατηρήθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές (t-test, p<0,05) στους χαρακτήρες Dorsal, Flexion, Post-flexion και Caudal. Σε όλες τις περιπτώσεις, αύξηση της θερμοκρασίας από τους 22 C στους 28 C προκάλεσε επιτάχυνση στην εμφάνιση ολοκλήρωση του εξεταζόμενου οντογενετικού χαρακτήρα. Μεταξύ 22 και 32 C, παρατηρήθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές (t-test, p<0,05) στους χαρακτήρες Anal, Flexion, Post-flexion και Caudal. Με εξαίρεση την εμφάνιση του εδρικού πτερυγίου, στις άλλες τρεις περιπτώσεις αύξηση της θερμοκρασίας από τους 22 C στους 32 C προκάλεσε επιτάχυνση στην εμφάνιση ολοκλήρωση του εξεταζόμενου οντογενετικού χαρακτήρα. Η εμφάνιση του εδρικού πραγματοποιείται σε μεγαλύτερο μήκος σώματος στους 32 από ότι στους 22 C. Στην κοινή φωτοπερίοδο των 14:10 L:D, το γενικό χαρακτηριστικό θα λέγαμε ότι είναι η διαφοροποίηση της χαμηλότερης θερμοκρασίας των 22 C από τις δύο θερμότερες συνθήκες των 28 και 32 C, ειδικά για τους χαρακτήρες Flexion, Post-Flexion και Caudal, των οποίων η εμφάνιση πραγματοποιείται σε μεγαλύτερο μήκος σώματος στους 22 C. Καμία στατστικά σημαντική διαφορά (t-test, p>0,05) δεν παρατηρείται στην εμφάνιση των κοιλιακών πτερυγίων (Εικόνα , Πίνακας 27). 154

157 SL ± 1SD SL ± 1SD SL ± 1SD 6 Flexion 7 6 -*- Anal -* Dorsal Post-Flexion 6 7 -*- -* Caudal Abdominal 8 7 -*- -* T ( C) T ( C) Εικόνα : Μέσο SL 50 (±1SD, mm) στο οποίο εμφανίζονται οι εξεταζόμενοι οντογενετικοί χαρακτήρες υπό την επίδραση των τριών διαφορετικών θερμοκρασιακών συνθηκών (22, 28 και 32 C) και των δύο συνθηκών φωτοπεριόδου: 14:10 (λευκός κύκλος) και 8:16 (μαύρο τρίγωνο) L:D. Ο αστερίσκος υποδεικνύει στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ των διαφορετικών φωτοπεριόδων, υπό κοινή θερμοκρασιακή συνθήκη (t-test, p<0,05). Αρχή κάμψη νωτοχορδής (Flexion), εμφάνιση του εδρικού πτερυγίου (Anal), εμφάνιση του ραχιαίου πτερυγίου (Dorsal), ολοκλήρωση κάμψης της νωτοχορδής (Post-flexion), ολοκλήρωση του σχηματισμού της ουραίας διχάλας (Caudal) και εμφάνιση προπλασμάτων των κοιλιακών πτερυγίων (Abdominal). Στη φωτοπερίοδο 8:16 (L:D) μεταξύ 22 και 28 C παρατηρήθηκε στα στατιστικά σημαντική διαφορά (t-test, p<0,05) στους χαρακτήρες Abdominal, Anal, Flexion και Postflexion. Σε όλες τις περιπτώσεις, αύξηση της θερμοκρασίας από τους 22 C στους 28 C προκάλεσε επιτάχυνση στην εμφάνιση ολοκλήρωση του εξεταζόμενου οντογενετικού χαρακτήρα. Μεταξύ 22 και 32 C, παρατηρήθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές (t-test, p<0,05) στους χαρακτήρες Flexion και Post-flexion, όπου και πάλι, αύξηση της θερμοκρασίας από τους 22 C στους 32 C προκάλεσε επιτάχυνση στην εμφάνιση ολοκλήρωση του εξεταζόμενου οντογενετικού χαρακτήρα. Όμως, είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι μεταξύ 28 και 32 C, η εμφάνιση των κοιλιακών πτερυγίων (Abdominal) και η αρχή της κάμψης της νωτοχορδής (Flexion) πραγματοποιείται σε μεγαλύτερο μήκος σώματος στους 32 από ότι στους 28 C. Αύξηση της θερμοκρασίας από τους 28 στους 32 C προκαλεί καθυστέρηση της εμφάνισης ολοκλήρωσης αυτών των οντογενετικών χαρακτήρων. Καμία στατστικά σημαντική διαφορά (t-test, p>0,05) δεν παρατηρείται στην εμφάνιση του ραχιαίου

158 SL ± 1SD SL ± 1SD SL ± 1SD πτερυγίου και στην ολοκλήρωση του σχηματισμού της διχάλας της ουράς (Εικόνα , Πίνακας 27). Photoperiod 14:10 L:D 6 Flexion 7 Anal a, b a b 6 5 a b a, b Dorsal 6 a a Post-Flexion 7 6 a, b a b Caudal a, b Abdominal 7 a b T ( C) T ( C) Εικόνα : Επίδραση της θερμοκρασίας πρώιμης ανάπτυξης (22, 28 και 32 C) στην οντογένεση των χαρακτήρων που εξετάστηκαν στην παρούσα εργασία, στη φωτοπερίοδο 14h:10h L:D. Δίνεται το μέσο SL 50 (±1SD, mm) στο οποίο εμφανίζονται οι εξεταζόμενοι οντογενετικοί χαρακτήρες. Τα ίδια γράμματα υποδεικνύουν στατιστικά σημαντικές διαφορές στο μέσο SL 50 μεταξύ των διαφορετικών θερμοκρασιακών συνθηκών (t-test, p<0,05). Αρχή κάμψη νωτοχορδής (Flexion), εμφάνιση του εδρικού πτερυγίου (Anal), εμφάνιση του ραχιαίου πτερυγίου (Dorsal), ολοκλήρωση κάμψης της νωτοχορδής (Post-flexion), ολοκλήρωση του σχηματισμού της ουραίας διχάλας (Caudal) και εμφάνιση προπλασμάτων των κοιλιακών πτερυγίων (Abdominal).

159 SL ± 1SD SL ± 1SD SL ± 1SD Photoperiod 8:16 L:D 6 Flexion 7 Anal 5 a, b a, c b, c 6 5 a a Dorsal Post-Flexion a, b a b Caudal Abdominal 8 7 a a, b b T ( C) T ( C) Εικόνα : Επίδραση της θερμοκρασίας πρώιμης ανάπτυξης (22, 28 και 32 C) στην οντογένεση των χαρακτήρων που εξετάστηκαν στην παρούσα εργασία, στη φωτοπερίοδο 8h:16h L:D. Δίνεται το μέσο SL 50 (±1SD, mm) στο οποίο εμφανίζονται οι εξεταζόμενοι οντογενετικοί χαρακτήρες. Τα ίδια γράμματα υποδεικνύουν στατιστικά σημαντικές διαφορές στο μέσο SL 50 μεταξύ των διαφορετικών θερμοκρασιακών συνθηκών (t-test, p<0,05). Αρχή κάμψη νωτοχορδής (Flexion), εμφάνιση του εδρικού πτερυγίου (Anal), εμφάνιση του ραχιαίου πτερυγίου (Dorsal), ολοκλήρωση κάμψης της νωτοχορδής (Post-flexion), ολοκλήρωση του σχηματισμού της ουραίας διχάλας (Caudal) και εμφάνιση προπλασμάτων των κοιλιακών πτερυγίων (Abdominal).

160 Πίνακας 27: Οι οντογενετικοί χαρακτήρες που εξετάζονται και οι τιμές SL 50 (±SD, mm) για κάθε φωτοπερίοδο και θερμοκρασία ανάπτυξης. Συνολικά εξετάστηκαν 118 άτομα από κάθε πειραματική συνθήκη. Ν, αριθμός των ατόμων που χρησιμοποιήθηκε στο t-test. (Oρίζεται από την περιοχή επικάλυψης των ατόμων που εμφανίζουν και δεν εμφανίζουν το εκάστοτε υπό μελέτη μεριστικό χαρακτήρα, κατα αυξανόμενο μήκος και άρα από αριθμό τους). Αρχή κάμψη νωτοχορδής (Flexion), εμφάνιση του εδρικού πτερυγίου (Anal), εμφάνιση του ραχιαίου πτερυγίου (Dorsal), ολοκλήρωση κάμψης της νωτοχορδής (Post-flexion), ολοκλήρωση του σχηματισμού της ουραίας διχάλας (Caudal) και εμφάνιση προπλασμάτων των κοιλιακών πτερυγίων (Abdominal). Flexion Anal Dorsal Photoperiod T ( C) SL 50 SD N SL 50 SD N SL 50 SD N 22 5,00 0,17 7 5,47 0,14 5 6,31 0, _ ,40 0, ,35 0, ,88 0, ,55 0, ,78 0,23 9 6,09 0, ,11 0,14 8 5,79 0,14 2 5,98 0,15 2 8_ ,49 0, ,52 0, ,89 0, ,64 0, ,53 0, ,11 0,15 4 Post Flexion Caudal Abdominal SL 50 SD N SL 50 SD N SL 50 SD N 22 6,63 0,31 4 7,14 0,21 2 7,14 0, _ ,13 0,17 4 6,24 0,18 2 7,21 0, ,09 0,15 7 6,22 0,16 2 7,17 0, ,20 0,16 2 6,20 0,16 2 7,45 0, _ ,84 0, ,07 0, ,87 0, ,61 0, ,11 0,15 4 7,11 0,

161 5. ΣΥΖΗΤΗΣΗ Ως φαινοτυπική πλαστικότητα ορίζεται η δυνατότητα ενός συγκεκριμένου γονότυπου να εκφράσει ένα εύρος φαινοτύπων, ως απόκριση στις περιβαλλοντικές συνθήκες στις οποίες υπόκειται (Fordyce 2006). Από τον Woltereck (1909), που μελέτησε την ανάπτυξη άκανθας στο κλαδοκαιρεωτό του γένους Daphnia ως απόκριση έναντι στη θηρευτική πίεση, και τον Bradshaw (1965) που διερεύνησε τη σημασία της πλαστικότητας στην εξέλιξη των φυτών, οι πρώτες μελέτες που αφορούσαν στην πλαστικότητα των οργανισμών εστίαζαν κυρίως στις φαινοτυπικές διαφοροποιήσεις των ενήλικων ατόμων, ως αποτέλεσμα της επίδρασης διαφορετικών περιβαλλοντικών συνθηκών. Παράλληλα, βασικό ερώτημα ήταν ο ρόλος του φαινομένου στην οικολογία και στην εξέλιξη. Στα 1942, ο Waddington όρισε ως επιγενετική «τον κλάδο της Βιολογίας που μελετά την αλληλεπίδραση (για την ακρίβεια τα αίτια της αλληλεπίδρασης) μεταξύ των γονιδίων και των παραγόμενων από αυτά προϊόντων, τα οποία σχηματίζουν τελικά το φαινότυπο». Δεκαπέντε χρόνια αργότερα πρότεινε την ιδέα του επιγενετικού τοπίου (epigenetic landscape, Εικόνα 5-1), προκειμένου να προσδιορίσει νοηματικά, αλλά και να αναπαραστήσει σχηματικά, τη δυνατότητα των κυττάρων να ακολουθήσουν διαφορετικές - γενετικά καθορισμένες - πορείες κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης, οδηγώντας σε διαφορετικά αποτελέσματα. Η διαφοροποίηση των κυττάρων καθ εαυτή, κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης, μπορεί να θεωρηθεί ως επιγενετικό φαινόμενο. 159 Εικόνα 5-1: Απεικόνιση της έννοιας του επιγενετικού τοπίου, όπως τη συνέλαβε ο Waddington, το Η παραπάνω ιδέα, απλή στη βάση της, έδωσε στον κλάδο της επιγενετικής το ρόλο της γέφυρας μεταξύ γονότυπου και φαινότυπου (Goldberg et al. 2007), αποσυνδέοντας την παραγωγή εναλλακτικών φαινότυπων από αλλαγές σε επίπεδο αλληλουχίας του DNA, αποκλειστικά. Παράλληλα, βοήθησε στην καθιέρωση της οντογένεσης ως διαδικασίας δυναμικής που ελέγχεται από γενετικούς και επιγενετικούς παράγοντες. Στην παρούσα εργασία, ελέγχθηκε η οντογενετική πλαστικότητα του zebrafish, υπό την επίδραση της θερμοκρασίας ανάπτυξης, της πυκνότητας του πληθυσμού, και τέλος υπό τη συνεπίδραση της θερμοκρασίας με τη φωτοπερίοδο (Εικόνα 5.1). Η επίδραση της

162 θερμοκρασίας στην πλαστικότητα του zebrafish υπήρξε το κυρίως ερευνητικό αντικείμενο της παρούσας μελέτης, ενώ τα άλλα δύο πειράματα, τα οποία προηγήθηκαν χρονικά, βοήθησαν τόσο στον ακριβέστερο σχεδιασμό του βασικού πειράματος, όσο και στη διαμόρφωση μιας πληρέστερης εικόνας σε σχέση με τον τρόπο δράσης των μελετούμενων περιβαλλοντικών παραγόντων στην πλαστικότητα του zebrafish. Το φαινόμενο της οντογενετικής πλαστικότητας, μελετάται πλέον εκτενώς, και σε επίπεδο ετεροχρονισμών. Ως ετεροχρονισμός ορίζεται μια «ομοιόμορφη αλλαγή στο ρυθμό ή στο χρονισμό μιας οντογενετικής διαδικασίας, χωρίς καμία αλλαγή στη φύση των βιολογικών διαδικασιών αυτής της διαδικασίας. Βιολογικά, αυτό σημαίνει ότι ως ετεροχρονικές ορίζονται οι αλλαγές που επιταχύνουν, επιβραδύνουν ή μετατοπίζουν μια αναπτυξιακή διαδικασία, ως ενιαία μονάδα» (Rice 1997). Το φαινόμενο του ετεροχρονισμού αναφέρεται σε αλλαγέςμετατοπίσεις στο ρυθμό ή/και στο χρονισμό των οντογενετικών γεγονότων, σε εξελικτικό χρόνο (Gould 1977, Raff & Kaufman 1983, McKinney & McNamara 1991). Οι περιβαλλοντικά προκλειόμενες και ελεγχόμενες μεταβολές στη χρονική αλληλουχία των αναπτυξιακών γεγονότων αποτέλεσε αντικείμενο μελέτης των Albrech et al. (1979) και Gould (1977), πάντα υπό το πρίσμα του εξελικτικού χρόνου. Σύμφωνα με τους Wilbur (1980) και Hanken (1992) «ένας βασικός στόχος των αναλύσεων σε σχέση με τον ετεροχρονισμό αποτελεί η κατανόηση των αναπτυξιακών αποκρίσεων και της ενδοειδικής ποικιλομορφίας στις οντογενετικές διαδικασίες, έναντι της επίδρασης περιβαλλοντικών παραγόντων» (Reilly 1994 B). Υπό αυτό το πρίσμα, το φαινόμενο του ετεροχρονισμού αφορά στην πλαστικότητα των οντογενετικών διαδικασιών στα άτομα του ίδιου είδους ή και των ίδιων πληθυσμών. Η έννοια του ετεροχρονισμού έχει έτσι διευρυνθεί, προσδιορίζοντας διαφοροποιήσεις στο χρονισμό της οντογένεσης μεταξύ διαφορετικών ατόμων του ίδιου είδους κάτω από την επίδραση διαφορετικών περιβαλλοντικών συνθηκών (McNamara 1997, Smith 2001, Schmidt & Starck 2010), όπως για παράδειγμα στην περίπτωση της ερμηνείας της ποικιλομορφίας στο χρονισμό της διαδικασίας της μεταμόρφωσης στα αμφίβια, ως απόκριση έναντι στην περιβαλλοντική ποικιλομορφία (Reilly 1994 B). Στην παρούσα εργασία εξετάζεται η επίδραση της θερμοκρασίας, της πληθυσμιακής πυκνότητας και της συνεπίδρασης θερμοκρασίας φωτοπεριόδου, στην πλαστικότητα του zebrafish, με μια σειρά από πειράματα που σχεδιάστηκαν έτσι ώστε η επίδραση του κάθε παράγοντα να πραγματοποιείται κατά την οντογένεση του είδους, μέχρι την ολοκλήρωση της μεταμόρφωσης και του φυλοκαθορισμού (Εικόνα 5-1). To δε φαινόμενο του ετεροχρονισμού, εξετάζεται υπό το πρίσμα της περιβαλλοντικά εξαρτώμενης οντογενετικής πλαστικότητας, μελετώντας το ρυθμό και το χρονισμό των οντογενετικών γεγονότων υπό την επίδραση της θερμοκρασίας ανάπτυξης και δευτερευόντως υπό τη συνεπίδραση θερμοκρασίαςφωτοπεριόδου κατά την ανάπτυξη. Εξετάζεται επίσης σε μοριακό επίπεδο, μελετώντας το οντογενετικό προφίλ της έκφρασης γονιδίων που σχετίζονται με το φυλοκαθορισμό και την αύξηση-ανάπτυξη των μυών, των οστών ή των πτερυγίων ειδικά, ή γενικά του οργανισμού. Ένα από τα βασικότερα ζητήματα που απασχόλησαν κατά το σχεδιασμό του εκάστοτε πειράματος, υπήρξε ο καθορισμός της χρονικής διάρκειας της επίδρασης του εκάστοτε μελετούμενου παράγοντα και κατ επέκταση ο καθορισμός του οντογενετικού σταδίου τον αναπτυσσόμενων ιχθύων. Ο χρόνος - με την έννοια που του έχει δοθεί εξελίσσεται με έναν σταθερό ρυθμό, όπως αυτός έχει οριστεί. Παράλληλα, αποτελεί θεμελιώδη πτυχή όλων των αναπτυξιακών διαδικασιών, επιδρώντας στην αύξηση και στη διαφοροποίηση των κυττάρων, των ιστών και εν γένει του οργανισμού (Moss 2007, Geuten & Coenen 2013). Ορίζουμε έτσι τον αναπτυξιακό χρόνο, ο οποίος συνδέεται με την ηλικία των οργανισμών και είναι πλέον διαπιστωμένο ότι επηρεάζεται τόσο από ενδογενείς μηχανισμούς, όσο και από περιβαλλοντικά ερεθίσματα (Geuten & Coenen 2013). Μπορεί για παράδειγμα να επιταχύνεται ή να επιβραδύνεται, όπως συμβαίνει π.χ. κατά τη παιδομόρφωση και κατά την 160

163 περαμόρφωση, αντίστοιχα. Η επιτάχυνση ή η επιβράδυνση του αναπτυξιακού χρόνου, συνδέεται με την επιτάχυνση ή την επιβράδυνση του ρυθμού ανάπτυξης σε σχέση με το ρυθμό διαφοροποίησης. Ο αναπτυξιακός χρόνος, ο ρυθμός αύξησης (υπολογιζόμενος από το σωματικό μέγεθος) και η διαφοροποίηση, είναι παράγοντες που σχετίζονται μεταξύ τους (Roff 2000, Nijhout et al. 2010) και πρέπει να λαμβάνονται σοβαρά υπόψη στη μελέτη της δράσης περιβαλλοντικών παραγόντων κατά την ανάπυξη, όπως συμβαίνει και κατά τη μελέτη της πλαστικότητας των ιχθύων. Οι περιβαλλοντικά προκλειόμενες αλλαγές στο ρυθμό αύξησης σε σχέση με το ρυθμό διαφοροποίησης, έχει ως αποτέλεσμα άτομα της ίδιας χρονολογικής ηλικίας να βρίσκονται σε διαφορετικό στάδιο ανάπτυξης. Η επιτάχυνση ή επιβράδυνση της διαφοροποίησης σε σχέση με την ανάπτυξη, μπορεί να έχει σαν αποτέλεσμα τα ίδια οντογενετικά γεγονότα να επιτυγχάνονται σε διαφορετικό μήκος σώματος στα ψάρια (Loizides et al. 2014), ή, ειπωμένο διαφορετικά, ψάρια που έχουν την ίδια χρονολογική ηλικία παρουσιάζουν μεγάλη ποικιλία στο μήκος του σώματός τους (Kimmel et al. 1995, Parichy et al. 2009, Schmidt & Starck 2010), γεγονός το οποίο υποδεικνύει ότι τα άτομα αυτά βρίσκονται σε διαφορετικό στάδιο ανάπτυξης. Αφού οι περιβαλλοντικοί παράγοντες επιδρούν στο ρυθμό αύξησης και άρα στον αναπτυξιακό χρόνο, η έννοια του χρόνου πρέπει να είναι σαφώς καθορισμένη και το χρονικό διάστημα επίδρασης των περιβαλλοντικών παραγόντων κατά την ανάπτυξη πρέπει επίσης να είναι σαφώς καθορισμένο. Η χρονολογική ηλικία αποτελεί την πραγματική ηλικία ενός οργανισμού (π.χ. στα ψάρια ορίζεται ως ώρες ή ημέρες μετά τη γονιμοποίηση dpf - ή την εκκόλαψη-dph), ενώ ο αναπτυξιακός χρόνος ισοδυναμεί με τη χρονική περίοδο που λαμβάνει χώρα ένα συγκεκριμένο οντογενετικό γεγονός (Adriaens & Verraes 2002). Τα φαινόμενα της φαινοτυπικής πλαστικότητας και του ετεροχρονισμού συνδέονται με τη δημιουργία φαινοτυπικής ποικιλίας, υλικό πάνω στο οποίο δρά η Φυσική Επιλογή και βασίζεται η Εξέλιξη. Η Φυσική Επιλογή λοιπόν, δρά επί των οντογεντικών σταδίων και το μέγεθος είναι αυτό που θα καθορίσει την προσαρμοστικότητα του εκάστοτε οντογενετικού σταδίου, όχι η ηλικία (Adriaens & Verraes 2002). Η μετάβαση, για παράδειγμα, από τον λεκιθικό, στον εξώτροφο τρόπο διαβίωσης μιας νύμφης ιχθύος, εξαρτάται από το αν η νύμφη αυτή φέρει όλα τα απαραίτητα χαρακτηριστικά προκειμένου να περάσει σε αυτό το στάδιο. Μια χρονική μετατόπιση στη μετάβαση από το λεκιθικό στο εξώτροφο νυμφικό στάδιο, δε θα εξαρτηθεί από την ηλικίας της αναπτυσσόμενης νύμφης, αλλά από το εάν το μέγεθός της σε αυτή τη φάση ανάπτυξης της φέρει εξελικτικό πλεονέκτημα, αυξάνοντας την προσαρμοστικότητά της. Οι Parichy et al. (2009) στην εργασία τους, διερευνώντας τη σχέση μεγέθους και πορείας της ανάπτυξης στο zebrafish. αποδεικνύουν ότι αυτή η σχέση μεταβάλλεται ανάλογα με τη θερμοκρασία και την πληθυσμιακή πυκνότητα. Παράλληλα, συσχετίζοντας οντογενετικά γεγονότα, όπως είναι η κάμψη της νωτοχορδής, η πορεία της οστεοποίησης, το χρωματικό πρότυπο, αλλά και άλλα, με την ηλικία (μετρούμενη σε dpf) των αναπτυσσόμενων zebrafish και το μέγεθός τους (σε SL), καταλήγουν στο ότι το μέγεθος αποτελεί ακροβέστερο δείκτη της αναπτυξιακής πορείας, σε σχέση με την ηλικία. Έτσι το μήκος σώματος (SL, TL) και όχι οι ημέρες μετά τη γονιμοποίηση ή την εκκόλαψη (dpf / dph) κρίνονται ως καταλληλότερο μέσο προσδιορισμού της ηλικίας και κυρίως του οντογενετικού σταδίου των ιχθύων (Adriaens & Verraes 1998, Parichy et al. 2009, Nikolioudakis et al. 2010, Gunter et al. 2014). Το μήκος σώματος αποτέλεσε ορόσημο στον προσδιορισμό του εκάστοτε σταδίου και στην παρούσα μελέτη. Στην εικόνα 5-1 αναπαρίσταται γραφικά η χρονική διάρκεια επίδρασης του εκάστοτε μελετούμενου παράγοντα στην πλαστικότητα του zebrafish, της παρούσας μελέτης. 161

164 162 Εικόνα 5-2: Επίδραση της θερμοκρασίας ανάπτυξης (1ο Πείραμα), της πληθυσμιακής πυκνότητας κατά την πρώιμη (2ο Πείραμα-Ι) και κατά την όψιμη (2ο Πείραμα-ΙΙ) οντογενετική περίοδο και της συνεπίδρασης της θερμοκρασίας και της φωτοπεριόδου κατά την ανάπτυξη (3ο Πείραμα), στη φαινοτυπική και οντογενετική πλαστικότητα ου zebrafish. Απεικονίζεται διαγραμματικά ο σχεδιασμός του κάθε πειράματος και η χρονική διάρκεια επίδρασης του εκάστοτε εξεταζόμενου παράγοντα, χρησιμοποιώντας ως παράγοντα καθορισμού των οντογενετικών σταδίων το μήκος του σώματος (SL, TL) των αναπτυσσόμενων ιχθύων Επίδραση της πυκνότητας και της θερμοκρασίας κατά την ανάπτυξη, στο ρυθμό αύξησης, καθώς και της συνεπίδρασης θερμοκρασίας φωτοπεριόδου. Τα ψάρια, ζώντας στο συνεχώς μεταβαλλόμενο υδάτινο περιβάλλον, επηρεάζονται άμεσα από τις διακυμάνσεις του. Όπως ειπώθηκε αναλυτικά στην Εισαγωγή αυτής της αργασίας, οι εξωγενείς παράγοντες παίζουν ιδιαίτερα σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη των Τελεόστεων ιχθύων, με τη θερμοκρασία να αποτελεί έναν από τους σημαντικότερους. Στα διάφορα είδη των ιχθύων, υπάρχει ένα βέλτιστο θερμοκρασιακό εύρος για την ανάπτυξη και την αύξησή τους (Gadomski & Cadell 1991), το οποίο μπορεί να διαφοροποιείται σε σχέση με την ηλικία και το μέγεθος των ατόμων (Pedersen & Joblin 1989, Handeland et al. 2008). Τα νεαρά στάδια της ζωής των ιχθύων, δηλαδή το εμβρυϊκό, το νυμφικό και το στάδιο του ιχθυδίου, χαρακτηρίζονται απο δραματικές μορφογενετικές αλλαγές που σχετίζονται με την αύξηση και τη διαφοροποίηση των ατόμων και είναι τα πλέον κρίσιμα για την επιβίωση των ατόμων, γεγονός που επιβεβαιώνεται και από τα εξαιρετικά υψηλά ποσοσστά θνησιμότητας

165 σε αυτή τη φάση. Ειδικότερα στους Τελεόστεους με πλαγκτονικά πρώιμα οντογενετικά στάδια, όπως και στο zebrafish, η θνησιμότητα λόγω των θηρευτών, αρχικά, και της μη διαθεσιμότητας τροφής, στη συνέχεια, είναι πολύ μεγάλη. Το μέγεθος των οργανισμών γενικά και των ψαριών ειδικότερα, παίζει καθοριστικό ρόλο στους μεταβολικούς ρυθμούς, στις ενεργειακές απαιτήσεις, τη θνησιμότητα και τα πρότυπα διατροφής ή / και θήρευσης (Jennings et al. 2001) και παράγοντες όπως ο ρυθμός αύξησης είναι καθοριστικοί για την επιβίωση. Το μέγεθος των ψαριών στα πρώιμα οντογενετικα στάδια, σχετίζεται αρχικά με τη δυνατότητα αποφυγής της θήρευσης και μετέπειτα με τη δυνατότητα εύρεσης τροφής. Γίνεται λοιπόν κατανοητός ο καθοριστικός ρόλος της αύξησης και της διαφοροποίησης (εν γένει και του μεγέθους) για την επιβίωση των ατόμων (Fuiman 1997), «συστατικά» που συνδέονται με την αποφυγή των θηρευτών και τη μετάβαση από το λεκιθικό - ενδογενή τρόπος διατροφής, στον εξωγενή. Καθοριστικός είναι κατά συνέπεια και ο ρόλος των εξωγενών ερεθισμάτων που επηρεάζουν το μέγεθος και το ρυθμό αύξησης. Ο ρυθμός ανάπτυξης και διαφοροποίησης επηρεάζουν την προσαρμοστικότητα και κατ επέκταση την επιβίωση των πληθυσμών, ενώ ταυτόχρονα αποτελούν χαρακτήρες που εμφανίζουν μεγάλου βαθμού πλαστικότητα (Roff 1992, Stearns 1992), επιδρώντας παράλληλα άμεσα στην προσαρμοστικότητα των ατόμων. Όπως έχει ειπωθεί στην εισαγωγή του κυρίως κεφαλαίου αυτής της εργασίας, η θερμοκρασία ανάπτυξης αποτελεί έναν από τους σημαντικότερους παράγοντες καθορισμού της ανάπτυξης των ψαριών, τα οποία βρίσκονται σε άμεση επαφή με το συνεχώς μεταβαλλόμενο υδάτινο περιβάλλον. Στα πειράματα της παρούσας εργασίας μελετήθηκε ο ρυθμός αύξησης των πειραματικών πληθυσμών zebrafish, υπό την επίδραση της θερμοκρασίας, της πυκνότητας, αλλά και της συνεπίδρασης θερμοκρασίας - φωτοπεριόδου. Σε κάθε περίπτωση, ο ρυθμός αύξησης κάθε πληθυσμού εκτιμήθηκε ύστερα από προσαρμογή των πειραματικών δεδομένων στο μοντέλο αύξησης (SL) / TL=a e SGR t (Ricker, 1979). Το μοντέλο αυτό επιτρέπει τη στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων και παρέχει τη δυνατότητα της εκτίμησης των περιβαλλοντικών παραγόντων, στο ρυθμό αύξησης (Hopkins 1992). Στο πείραμα επίδρασης των τριών διαφορετικών θερμοκρασιακών συνθηκών (22, 28 και 32 C) από την 1 η dpf, μέχρι 14mm TL (ολοκλήρωση μεταμόρφωσης), είδαμε ότι αύξηση της θερμοκρασίας από τους 22 στους 28 C και από τους 22 στους 32 C, προκάλεσε αύξηση του ρυθμού αύξησης και στις δύο πειραματικές επαναλήψεις. Στη μία από τις δύο πειραματικές επαναλήψεις, η αύξηση της θερμοκρασίας από τους 28 στους 32 C, είχε σαν αποτέλεσμα στατιστικά σημαντική αύξηση του ρυθμού αύξησης. Οι υψηλές θερμοκρασίες αυξάνουν το ρυθμό διαφοροποίησης των εμβρυϊκών ιστών, τη δραστηριότητα των αδένων που προάγουν την εκκόλαψη και την κινητικότητα του εμβρύου άμεσα (μέσω της ταχύτερης αναπνοής), και έμμεσα (μέσω της χαμηλής παροχής οξυγόνου) (Kamler 2002), γεγονός που μπορεί να είναι η αιτία της διαφοροποίησης του ρυθμού αύξησης των 22 C, σε σχέση με τους 28 και 32 C. Στο δεύτερο πείραμα, ελέγθηκε η επίδραση της πυκνότητας του πληθυσμού: (I) από το στάδιο της κατανάλωσης των λεκιθικών αποθεμάτων έως το τυπικό μήκος σώματος (SL) να φτάσει 10mm (συνθήκη ) και (II) από τα 8mm SL, και μετά (συνθήκη ). Στο Πείραμα Ι, και στις δύο συνθήκες πυκνότητας, παρατηρήθηκε αλλαγή (μείωση) του ρυθμού αύξησης στις 42dpf, για όλες τις συνθήκες. Το μήκος των αναπτυσσόμενων ιχθύων ήταν 15mm SL για τη συνθήκη των 400 και 17,5mm SL για τη συνθήκη των 200 στις 42dpf. Ανίστοιχα, στο Πείραμα ΙΙ, παρατηρήθηκε αλλαγή (μείωση) του ρυθμού αύξησης στις 60dpf, για όλες τις συνθήκες. Έτσι, διαπιστώθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ του ρυθμού αύξησης της πρώτης (μέχρι τις 42 dpf) με τη δεύτερη φάση (μετά τις 42 dpf) για όλες τις συνθήκες και πειραματικές επαναλήψεις (200Α, 200Β, 400Α, 400Β) του πρώτου πειράματος και μεταξύ του ρυθμού αύξησης της πρώτης (μέχρι τις 60 dpf) με τη δεύτερη 163

166 φάση (μετά τις 60 dpf) στη συνθήκη χαμηλής πυκνότητας του Πειράματος ΙΙ (70Α και 70Β). Αν και επιβεβαιώνεται ότι σε υψηλές πυκνότητες η αύξηση των ιχθύων είναι πιο αργή από ότι σε χαμηλότερες πυκνότητες, όπως έχει παρατηρηθεί και σε άλλες μελέτες για το zebrafish (Parichy et al. 2009), η σύγκριση του ρυθμού αύξησης της πρώτης φάσης και της δεύτερης φάσης ξεχωριστά για τις διαφορετικές συνθήκες πυκνότητας (μεταξύ και μεταξύ ) δεν έδειξε στατιστικά σημαντικές διαφορές. Ο Morman (1987) υποστήριξε ότι η πυκνότητα ασκεί σημαντική επίδραση στην στην αύξηση τους είδους P. Marinus, υποστηρίζοντας ότι μόνο τα άτομα που βρίσκονται σε χαμηλές νυμφικές πυκνότητες περνούν στη φάση της μεταμόρφωσης. Η παραπάνω υπόθεση διαψεύστηκε από τους και Holmes & Youson (1997), οι οποίοι υποστήριξαν επιπρόσθετα ότι είναι πιθανό η πληθυσμιακή πυκνότητα να έχει μια τέτοια ισχυρή επίδραση στην αύξηση, εάν και εφόσον υπάρχουν διαφορές στην ποιότητα των ενδιαιτημάτων συνδεόμενες με την ποιότητα της διατροφής και τη δημιουργία ανταγωνισμού μεταξύ των ατόμων για χώρο. Στην περίπτωσή μας, η διατροφή πραγματοποιούνταν at libitum, γεγονός που μπορεί να εξηγεί την απουσία στατιστικά σημαντικών διαφορών στο ρυθμό αύξησης των zebrafish που αναπτύχθηκαν σε διαφορετικές συνθήκες πυκνότητας (κατά τη σύγκριση του ρυθμού αύξησης της πρώτης φάσης μεταξύ και μεταξύ και κατά τη σύγκριση του ρυθμού αύξησης της δεύτερης φάσης μεταξύ και μεταξύ ). Φαίνεται και απο άλλες μελέτες ότι η πληθυσμιακή πυκνότητα έχει ισχυρή επίδραση στο ρυθμό αύξησης, εάν και εφόσον υπάρχει ταυτόχρονος ανταγωνισμός για πόρους (ενδεικτικά, κατά τη μελέτη των Amundsen et al. 2007, για το είδος Salvelinus alpinus. Επίσης, είναι πιθανό τα zebrafish να ανέχονται το συνωστισμό περισσότερο από άλλα είδη ιχθύων. Από την άλλη πλευρά, ο παρατηρούμενος πιο αργός ρυθμός αύξησης στις υψηλές πυκνότητες, σε σχέση με τις χαμηλές, δεν μπορεί να οφείλεται σε περιορισμένους πόρους, μια και η διατροφή γινόταν at libitum, αλλά ίσως στη μείωση του ζωτικού χώρου, καθώς όσο το μέγεθος των ψαριών μεγαλώνει αυτός μειώνεται, γεγονός που μπορεί να οδηγεί σε αύξηση των επιπέδων κορτιζόλης λόγω στρές και τελικά σε μείωση του ρυθμού αύξησης των ψαριών (Montero 1999, Tort L. Stress in farmed fish: Its consequences in health and performance). Σε ό,τι αφορά στο πείραμα συνεπίδρασης θερμοκρασίας-φωτοπεριόδου, έχουμε τα εξής: Στη φωτοπερίοδο 14:10 L:D, παρατηρήθηκε γραμμική αύξηση του SGR με τη θερμοκρασία του νερού, ενώ στη φωτοπερίοδο 8:16 L:D, το SGR παρέμεινε αμετάβλητο στο θερμοκρασιακό εύρος C. Ο ρυθμός αύξησης αποδείχθηκε ανεξάρτητος της φωτοπεριόδου στις χαμηλές θερμοκρασίες (22, 28 C, p>0,05), ενώ στους 32 C η αύξηση της φωτοπεριόδου προκάλεσε σημαντική αύξηση του SGR (p<0,05). Σύμφωνα με τα αποτελέσματα, η θερμοκρασία και η φωτοπερίοδος συνεπιδρούν στο ρυθμό σωματικής αύξησης, με τον καθένα από αυτούς να ελέγχει τη δράση του άλλου. Ο ρυθμός αύξησης των ψαριών επηρεάζεται από πλήθος παραγόντων, όπως είναι η συμπεριφορά, η διατροφή, και πλήθος περιβαλλοντικών παραγόντων με τη θερμοκρασία ανάπτυξης να αποτελεί έναν από τους σημαντικότερους (Martinez-Palacios et al. 1996, Azaza et al. 2007). Το zebrafish είναι ένα ευρύθερμο είδος, που στη φύση διαβιώνει σε θερμοκρασιακό εύρος που κυμαίνεται από τους 6 C έως τους 38 C, ενώ η κύρια «περίοδος στρατολόγησης» (recruitment period) βρίσκεται από τον Απρίλιο μέχρι τον Αύγουστο, όπου η θερμοκρασία είναι πιο υψηλή (Spence et al. 2006, 2007a, 2007b). Γενικά αύξηση της θερμοκρασίας σε συνδυασμό με τη διατροφή έχει ως αποτέλεσμα την αύξηση του ρυθμου αύξησης, το οποίο συνεπάγεται αυξημένη δυνατότητα επιβίωσης, εφόσον πρόκειται για θερμοκρασίες εντός του βέλτιστου εύρους επιβίωσης. Ο μεγαλύτερος ρυθμός αύξησης στους 32 C, βρίσκεται εντός του φυσιολογικού θερμοκρασιακού εύρους που έχει επισημανθεί για το zebrafish. Προηγούμενες μελέτες αναφέρουν ότι για τα είδη Salmo trutta και Solea solea, αύξηση της θερμοκρασίας αυξάνει το ρυθμό αύξησης των νυμφών, όταν η θερμοκρασία φυσικά βρίσκεται εντός των 164

167 ορίων ανοχής του εκάστοτε είδους (Brown 1957, Amara et al. 1994). Επίσης για τα είδη Pagrus aurata, Palalichthis lethostigma, Oncorhynchus mykiss Scophthalmus maximus (Imsland et al. 2001, Fielder et al. 2002, Moustakas et al. 2004, Barimani et al. 2013) έχει βρεθεί ότι σε σταθερή θερμοκρασία, η μεγάλη διάρκεια φωτός οδηγεί σε αύξηση του SGR. Τα αποτελέσματα αυτά συμφωνούν με τα αποτελέσματα της παρούσας εργασίας. Η φωτοπερίοδος ελέγχει την ανάπτυξη μέσω της επίδρασης που έχει στον ενδοκρινικό σύστημα και στα επίπεδα των αυξητικών ορμονών της κυκλοφορίας του αίματος, ενώ ο βαθμός επίδρασής της εξαρτάται από το προς αναφορά είδος, καθώς και την ηλικία του (Simensen et al. 2000, Adewolu et al. 2008). Σύμφωνα με τους Imsland et al. (2001), η επίδραση της φωτοπεριόδου είναι πιο έντονη στα ψάρια του γλυκού νερού, σε σχέση με αυτά του αλμυρού, το οποίο θα μπορούσε να έχει ισχύ για το zebrafish σκεπτόμενοι τον ελεγκτικό ρόλο της μικρής φωτοπεριόδου στον SGR (αφού στη φωτοπερίοδο 8:16 L:D, το SGR παρέμεινε αμετάβλητο στο θερμοκρασιακό εύρος C) Επίδραση της θερμοκρασίας ανάπτυξης, της πυκνότητας και της συνεπίδρασης θερμοκρασίας φωτοπεριόδου κατά την ανάπτυξη στην αναλογία φύλου Σε ό,τι αφορά στην αναλογία φύλου, στο 1 ο πείραμα, τα αποτελέσματα έδειξαν ότι στη θερμοκρασία των 22 C η αναλογία φύλου μετατοπίστηκε υπέρ των αρσενικών ατόμων. Και στις δύο πειραματικές επαναλήψεις, παρατηρήθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές στην αναλογία φύλου μεταξύ των πληθυσμών που αναπτύχθηκαν στους 22 και 28 C (p<0,01 G-test) και μεταξύ των πληθυσμών που αναπτύχθηκαν στους 22 και 32 C (p<0,01 G-test). Δεν υπήρξαν στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ των πληθυσμών που αναπτύχθηκαν στους 28 και 32 C. Από τα πειράματα μελέτης επίδρασης της πυκνότητας στην αναλογία φύλου, δεν προέκυψαν στατιστικά σημαντικές διαφορές στην αναλογία φύλου μεταξύ των διαφορετικών πυκνοτήτων κάθε πειράματος. Από το πείραμα συνεπίδρασης θερμοκρασίαςφωτοπεριόδου στην αναλογία φύλου, παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά (G-test, p<0,05) στην αναλογία φύλου μόνο στην θερμοκρασία των 22 C, σε συνδυασμό με την φωτοπερίοδο 14:10 (L:D), με τα θηλυκά άτομα να είναι λιγότερα από τα αρσενικά, γεγονός το οποίο συμφωνεί με τα αποτελέσματα του πρώτου πειράματος. Γενικά η θερμοκρασία ανάπτυξης αποτελεί ίσως τον καλύτερα μελετημένο παράγοντα σε σχέση με την επίδραση που έχουν διάφοροι οι περιβαλλοντικοί παράγοντες, στην στην αναλογία φύλου των ιχθύων (ενδεικτικά, Blaxter 1992, Fuiman et al. 1998, Pavlidis et al. 2000, Koumoudouros et al. 2002, Ospina-Alvarez & Piferrer 2008, Blazquez et al. 2009, Sfakianakis et al. 2011, Blanco-Vives et al. 2011). Ο φυλοκαθορισμός του zebrafish και οι παράγοντες που επιδρούν σε αυτόν, έχουν αποτελέσει αντικείμενο ευρύτατης βιβλιογραφίας. Το zebrafish υποστηρίζεται ότι φέρει πολυγονιδιακό τύπο φυλοκαθορισμου (Polygenic sex determination - PSD) (Orban et al. 2009, Siegfried 2010, Liew et al. 2012, Liew & Orbán 2014), ενώ οι Tong et al. (2010) υποστηρίζουν την ύπαρξη ισχυρών θηλεοποιητικών γενετικών παραγόντων. Σύμφωνα με τους Ospina-Alvarez & Pierrer (2008), στα είδη ιχθύων που έχει διαπιστωθεί η ύπαρξη φυλετικών χρωμοσωμάτων, η παρατηρούμενη διαφοροποίηση στην αναλογία φύλου λόγω της επίδρασης της θερμοκρασίας είναι αποτέλεσμα γενετικού φυλοκαθορισμού, παρά θερμοεξαρτώμενου. Το zebrafish αποτελεί αδιαφοροποίητο γονοχωριστικό είδος, στο οποίο δεν έχουν βρεθεί φυλετικά χρωμοσώματα ή φυλοκαθοριστικά γονίδια (Wallace & Wallace 2003, Hofsten & Olsson 2005) και εμφανίζει

168 ερμαφροδιτισμό ιχθυδίου (Takahashi 1977, Maack & Segner 2003). Σύμφωνα με την εργασία του Takahashi (1977), τα zebrafish μέχρι την ηλικία των dph ( 15 dpf) φέρουν γονάδες με δομή όμοια με αυτή των ωοθηκών. Στις dph, αρχίζει η διαφοροποίηση των γονάδων σε όρχεις στα άτομα που προορίζονται να γίνουν αρσενικά, ενώ στα άτομα που προορίζονται να γίνουν θηλυκά συνεχίζει η ανάπτυξη των ωοθηκών. Η διαφοροποίηση των όρχεων πραγματοποιείται παράλληλα με σταδιακό εκφυλισμό του ωοθηκικού ιστού (Takahashi 1977, Maack & Segner 2003, Wang et al. 2007) ο οποίος πραγματοποιείται με απόπτωση των ωοκυττάρων (Uchida et al. 2002). Η θερμοκρασία εκτροφής των αναπτυσσόμενων ιχθύων στην εργασία του Takahashi (1977), ήταν C και το μήκος σώματος στις dph κυμαινόταν από 6,4 έως 8,6 mm TL, ενώ στις dph το μήκος κυμαινόταν από 12,1-20,5 mm TL. Ας τονιστεί εδώ ότι το μήκος των ατόμων διαφοροποιούνταν σημαντικά μεταξύ των τεσσάρων στελεχών που εκτρέφονταν για τη διεξαγωγή του πειράματος. Οι Wang et al. (2007), χρησιμοποιώντας διαγονιδιακά vas::egfp στελέχη zebrafish, μελέτησαν την ανάπτυξη των γονάδων ιστολογικά και ανοσοϊστοχημικά. Διαπίστωσαν ότι η έναρξη και η χρονική διάρκεια έκφρασης του γονιδίου vas, χαρακτηριστικό του ωοθηκικού ιστού, ποικίλει κατά τη φάση του ερμαφροδιτισμού του ιχθυδίου. Όλα τα άτομα που διαφοροποιήθηκαν τελικά ως θηλυκά, εμφάνιζαν ισχυρή έκφραση του γονιδίου, καθόλη τη διάρκεια της περιόδου διαφοροποίησης. Τα άτομα που εξελίχθηκαν ως αρσενικά χωρίστηκαν σε τρεις κατηγορίες-τύπους, ανάλογα με την ένταση της έκφρασης του γονιδίου vas::egfp κατά την περίοδο της διαφοροποίησης: Στον τύπο Ι η έκφραση ήταν μη ανιχνεύσιμη, στον τύπο ΙΙ ήταν ασθενική και στον τύπο ΙΙΙ ήταν ανάλογη των ατόμων που εξελίχθηκαν ως θηλυκά, δηλαδή ισχυρή. Σε κάθε περίπτωση, στα άτομα και των τριών τύπων η έκφραση του vas::egfp ήταν μη ανιχνεύσιμη από τις 42 dpf και μετά. Σε κάθε περίπτωση, κατά τη διάρκεια της διαφοροποίησής του, ο ορχικός ιστός είναι μορφολογικά ανάλογος των πρωτόγυνων ερμαφρόδιτων ειδών. Κατέληξαν στο συμπέρασμα ότι ενώ όλα τα αρσενικά άτομα φέρουν ερμαφρόδιτες γονάδες κατά το στάδιο του ιχθυδίου, ο βαθμός δέσμευσής τους στο αρρενοποιητικό μονοπάτι, ποικίλει. Σημαντικό είναι να τονιστεί ότι η αναλογία των ατόμων που εμφάνιζαν διαφορετική ένταση έκφρασης δεν ήταν σταθερή στις διαφορετικές γενιές και δε σχετιζόταν με το μέγεθος των ατόμων. Η θερμοκρασία εκτροφής των αναπτυσσόμενων ιχθύων στην εργασία των Wang et al. (2007), ήταν C. Σε αυτή τη θερμοκρασία, διαπίστωσαν ότι τα zebrafish βρίσκονται στο στάδιο του ερμαφρόδιτου ιχθυδίου στις dpf, ενώ στις 42 dpf προσδιόρισαν χρονικά (ηλικιακά) τον καθορισμό των αρσενικών ατόμων. Οι ημέρες προσδιορισμού του σταδίου του ερμαφρόδιτου ιχθυδιου, και του τελικού καθορισμού των γονάδων, είναι αρκετά κοντά με αυτές που αναφέρονται από την εργασία του Takahashi (1977). Είναι σημαντικό εδώ να σημειωθεί ότι οι Wang et al. (2007) παρατήρησαν ότι τα αρσενικά του τύπου ΙΙΙ έφεραν αρχικά γονάδες με την τυπική δομή των ωοθηκών, με μοναδική εξαίρεση ότι το μέγεθός τους ήταν μικρότερο. Αυξημένη έκφραση vas::egfp συνδέθηκε με πολλά ωοκύτταρα, τα οποία συνοδεύονταν από μεγαλύτερους ωαγωγούς και πιο επιμηκυσμένες γονάδες. Σύμφωνα με την αρκετά διαφωτιστική εργασία των Rodriguez-Mari et al. (2010) και την ανασκόπηση των Rodriguez-Mari & Postlethwait (2011), φυσιολογικά, κατά το φυλοκαθορισμό του zebrafish τα ωοκύτταρα που βρίσκονται στη φάση της μείωσης κατά την κυτταρική διαίρεση, σηματοδοτούν το σώμα της γονάδας προκειμένου να διατηρήσει της έκφραση του γονιδίου της αρωματάσης, η οποία καταλύει τη μετατροπή των ανδρογόνων σε οιστρογόνα. Σύμφωνα με τους ίδιους ερευνητές, η διαφοροποίηση των ατόμων σε αρσενικά και θηλυκά εξαρτάται από τους γενετικούς παράγοντες που έλεγχουν την ένταση αυτού του σήματος. Σύμφωνα με το προτεινόμενο μοντέλο, σε φυσιολογικές συνθήκες, οι διδυναμικές ερμαφρόδιτες γονάδες των zebrafish, στο στάδιο του ιχθυδίου, περιέχουν πρώιμα - ανώριμα ωοκύτταρα. Τα σωματικά κύτταρα αυτών των γονάδων, εκκρίνουν γονίδια χαρακτηριστικά 166

169 των θηλυκών και των αρσενικών ατόμων (aromatase, foxl2 και sox9a, amh, αντίστοιχα). Τα πρώιμα ωοκύτταρα, θα πρέπει να συνεχίσουν τη μειωτική τους διαίρεση, μπαίνοντας στο στάδιο της διπλοταινίας, προκειμένου να επιβιώσουν, γεγονός απαραίτητο για τη διατήρηση της έκφρασης cyp19a1a στα σωματικά κύτταρα των γονάδων και τελικά για τη διαφοροποίηση των γονάδων σε ωοθήκες. Ένας κρίσιμος αριθμός (αναπτυσσόμενων) ωοκυττάρων φαίνεται ότι είναι απαραίτητος προκειμένου οι αδιαφοροποίητες διδυναμικές γονάδες να διαφοροποιηθούν σε ωοθήκες (Siegfried & Nusslein-Volhard 2008, Rodriguez- Mari et al. 2010). Από την άλλη πλευρά, όπως έχει ήδη ειπωθεί, η διαφοροποίηση των γονάδων σε όρχεις, σχετίζεται με τον εκφυλισμό του ωοθηκικού ιστού. Η διαπίστωση αυτή προέκυψε από τη μελέτη των γονιδίων fancl, στο zebrafish. Τα γονίδια fancl εκφράζονται στα γεννητικά κύτταρα κατά τη διαφοροποίηση των γονάδων στα zebrafish (Rodriguez-Mari et al. 2010). Υπάρχουν 15 γονίδια fancl, τα οποία εξελικτικά δεν έχουν διπλασιαστεί, κατά τον εκτεταµένo-ολικό γονιδιακό διπλασιασµό (teleost genome duplication-tgd) των αρχέγονων γονιδίων (Rodriguez-Mari & Postlethwait 2011). Τα γονίδια αυτά σχετίζονται με την επιδιόρθωση βλαβών στο DNA (όπως αυτές δημιουργούνται κατά την κυτταροδιαίρεση) και μεταλλάξεις αυτών, οδηγούν στην αρρενοποίηση των γονάδων στα zebrafish. Η λειτουργία των γονιδίων fancl φαίνεται ότι σχετίζεται με την επιβίωση των αναπτυσσόμενων ωοκυττάρων από τη διαδικασία της μείωσης, επιδιορθώνοντας βλάβες στο DNA. Τα ωοκύτταρα, ευρισκόμενα στην πρώτη φάση της μειωτικής διαίρεσης, υπόκεινται σε βλάβες από διπλά σπασίματα στο DNA (double strand DNA breaks), που διορθώνονται με ομόλογο ανασυνδυασμό και εισέρχονται έτσι στο στάδιο της διπλοταινίας στη μειωτική διαίρεση. Τα ωοκύτταρα που βρίσκονται σε αυτό ακριβώς το στάδιο, σηματοδοτούν το σώμα της γονάδας προκειμένου να διατηρήσει ή και ενδεχομένως να αυξήσει την έκφραση του cyp19a1a, γεγονός που προκαλει την μείωση της έκφρασης της amh και τη διατήρηση των σωματικών κυττάρων στο θηλεο-ποιητικό μονοπάτι. Έτσι η γονάδα διαφοροποιείται και καθορίζεται ως ωοθήκη. Έχουν αναγνωριστεί μεταλλάξεις σε δύο από τα 15 γονίδια (Rodriguez-Mari & Postlethwait 2011) του zebrafish, οι οποίες στα ομοζυγα άτομα έδωσαν 100% αρσενικό φαινότυπο. Όμως, σε τέτοια ομόζυγα μεταλλαγμένα άτομα, η προκλειόμενη αύξηση της έκφρασης του γονιδίου tp53 (p53, tumor protein p53), είχε σαν αποτέλεσμα να περιοριστεί η διαδικασία της απόπτωσης των ωοκυττάρων και οι γονάδες των αναπτυσσόμενων ατόμων να διαφοροποιηθούν σε ωοθήκες (Rodriguez-Mari et al. 2010). Μειωμένη έκφραση της tp53, έχει ως αποτέλεσμα να μην επιτελείται αποτελεσματικά η απόπτωση των ωοκυττάρων, οπότε τα εν λόγω άτομα εξελίσσονται σε θηλυκά. Η έκφραση λοιπόν του γονιδίου tp53 φαίνεται ότι αποτελεί κλειδί στην ενεργοποίηση της απόπτωσης των ωοκυττάρων και στη διαφοροποίηση των γονάδων σε όρχεις. Το συμπέρασμα είναι ότι αν ο αριθμός των μειωτικών ωοκυττάρων πέσει κάτω από ένα κρίσιμο-κατώφλιο όριο, τότε η έκφραση του cyp19a1a θα μειωθεί και τα επίπεδα οιστρογόνων δε θα επαρκούν προκειμένου να διατηρηθεί η ανάπτυξη των ωοθηκών και να ανασταλλεί η ανάπτυξη των όρχεων. Οι Rodriguez-Mari et al. (2010) υποστηρίζουν ότι «η ελεγχόμενη από την tp53 απόπτωση των ωοκυττάρων, μπορεί να ρυθμίζεται από περιβαλλοντικούς ή και γενετικούς παράγοντες, τροποποιώντας το φυλοκαθορισμό στο zebrafish». Έχει διαπιστωθεί στο παρελθόν, ότι η θερμοκρασια επιδρά στη ρύθμιση της έκφρασης του γονιδίου της αρωματάσης, κατά την πρώιμη ανάπυξη των γονάδων, διακόπτωντας τη στεροϊδογένεση (Godwin et al. 2003). Σύμφωνα με τα παραπάνω είναι πιθανό η θερμοκρασία να επιδρά στη δράση του γονιδίου tp53 και άρα έμμεσα στην έκφραση του γονιδίου της αρωματάσης, σύμφωνα με το μονοπάτι που υποστηρίζει ότι η αύξηση της tp53, περιορίζει την απόπτωση των ωοκυττάρων, άρα αυξάνεται η έκφραση του cyp19a1a, γεγονός που προκαλει την μείωση της έκφρασης της amh και τη διατήρηση των σωματικών κυττάρων στο θηλεο-ποιητικό μονοπάτι. Είδαμε επίσης οτι είναι απαραίτητος ένας κρίσιμος 167

170 αριθμός μειωτικών ωοκυττάρων στην αναπτυσσόμενη γονάδα, προκειμένου η έκφραση του cyp19a1a άπό τα σωματικά κύτταρα των γονάδων να μη μειωθεί και τα επίπεδα οιστρογόνων να είναι αρκετά για να διατηρηθεί η ανάπτυξη των ωοθηκών και να έχουμε αναστολή της ανάπτυξης των όρχεων. Συνδυάζοντας τα παραπάνω στοιχεία, θα λέγαμε ότι σύμφωνα με τις εργασίες των Uchida et al. (2004), Wang et al. (2007) και Rodriguez-Mari et al. (2010) το μέγεθος των γονάδων είναι πιθανό να παίζει ρόλο, και κυρίως, περιβαλλοντικοί παράγοντες όπως είναι η θερμοκρασία ανάπτυξης, σχετίζονται με την απόπτωση των ωοκυττάρων και κατ επέκταση με τη διαφοροποίηση και τον καθορισμό του φύλου στο zebrafish. Το κρίσιμο χρονικό διάστημα στη διαφοροποίησης του φύλου, ορίζεται μεταξύ των dpf (Rodriguez-Mari et al. 2010). Οι παράγοντες που ελέγχουν την απόπτωση των ωοκυττάρων και πιθανόν το μέγεθος των γονάδων (ή το μέγεθος των γονάδων σε σχέση με το σωματικό μέγεθος) είναι σημαντικοί για τη διαφοροποήση και τον καθορισμό του φύλου zebrafish. Ίσως μεγάλου μεγέθους γονάδες, σημαίνουν περισσότερα ωοκύτταρα που παιρνούν στη φάση της διπλοταινίας κατά τη μειωτική διαίρεση προκειμένου η έκφραση του cyp19a1a άπό τα σωματικά κύτταρα των γονάδων να μη μειωθεί και να ανασταλεί έτσι η ανάπτυξη των όρχεων. Η τοποθέτηση του κρίσιμου χρονικού διαστήματος μεταξύ dpf θα μπορούσε να γίνει πιο συγκεκριμένη (και οντογενετικά λιγότερο διευρυμένη) με τη χρήση του μήκους σώματος ως προσδιοριστικό του αναπτυξιακού σταδίου και άρα της κρίσιμης οντογενετικής περιόδου για τον καθορισμό του φύλου. 168 Εικόνα 5.2-1: Διαγραμματική αναπαράσταση της σχέσης μεταξύ ηλικίας, μεγέθους (μήκος σώματος) και διαφοροποίησης του φύλου στο λαβράκι. Temperature effects: Βαθμός επίδρασης της θερμοκρασίας στην παραπάνω διαδικασία. Labile period: Εντοπισμός της ευαίσθητης περιόδου στα εξωγενή στεροειδή. Germ cell number / Gonadal aromatase: Εντοπισμός της χρονικής περιόδου αύξησης του αριθμού των γεννητικών κυττάρων και της συγκέντρωσης της αρωματάσης στις γονάδες, αντίστοιχα. Ενώ η διαφοροποίηση του φύλου εξαρτάται περισσότερο από το μήκος, παρά από την ηλικία, η σχέση ηλικίας - μήκους εξαρτάται και από τη θερμοκρασία ανάπτυξης. DPH: Ημέρες μετά την εκκόλαψη (days post-hatch) (Από Piferrer et al. 2005). Το πρώτο είδος στο οποίο καταγράφηκε θερμοεξαρτώμενος φυλοκαθορισμός (TSD), ήταν το Menidia menidia, όπου η υψηλές θερμοκρασίες οδηγούσαν σε αύξηση της αναλογίας φύλου υπέρ των θηλυκών, ενώ οι χαμηλές υπέρ των αρσενικών ατόμων (Conover & Kynard 1981). Από τοτε, ο TSD καταγράφηκε σε πολλά είδη ιχθύων, αλλά η μελέτη των Ospina- Alvarez & Piferrer (2008), περιόρισε αυτόν τον αριθμό σε μόλις 59 είδη ψαριών (τα οποία ανήκουν σε 13 Οικογένειες και μόλις 4 Τάξεις) (βλ. και Εισαγωγή παρούσας εργασίας). Στο

171 zebrafish είδος χωρίς φυλετικά χρωμοσώματα φαίνεται ότι ο πολυπαραγοντικός τύπος φυλοκαθορισμού και ο TSD βρίσκουν αντίκρισμα. Στη μελέτη των Uchida et al. (2004), η εκτροφή γυνογενετικών zebrafish σε υψηλές θερμοκρασιακές συνθήκες, οδηγεί στη μετατόπιση της αναλογίας φύλου υπέρ των αρσενικών ατόμων. Στη μελέτη των Sfakianakis et al. (2011), η εκτροφή σε διαφορετικές θερμοκρασιακές συνθήκες (22, 25, 28 και 31 C), έδειξε ότι οι χαμηλές θερμοκρασίες αυξάνουν την αναλογία φύλου υπέρ των αρσενικών ατόμων, γεγονός που έρχεται σε συμφωνία με την παρούσα μελέτη. Θα πρέπει εδώ να τονιστεί ότι οι θερμοκρασίες που χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη των Uchida et al. (2004) και στις οποίες παρατηρήθηκε αρρενοποίηση μέχρι και 100%, ήταν ιδιαίτερα υψηλές, της τάξεως των 35 και 37 C. Οι θερμοκρασίες αυτές βρίσκονται εκτός του φυσιολογικού θερμοκρασιακού εύρους του είδους, το ανώτατο όριο του οποίου έχει σημειωθεί στους 34 C. Επίσης, η επίδραση της θερμοκρασίας στην ίδια μελέτη ήταν μεταξύ dph, δηλαδή για σχετικά περιορισμένο χρονικό διάστημα κατά την οντογένεση. Οι Castranova et al. (2011), μελέτησαν την επίδραση της πυκνότητας των πληθυσμών στην αναπαραγωγική επιτυχία των zebrafish, προκειμένου να καθορίσουν τις βέλτιστες συνθήκες εκτροφής για το είδος. Χρησιμοποιώντας πυκνότητες 3, 6 και 12 ατόμων / L, κατέληξαν στο ότι δεν υπάρχουν στατιστικά σημαντικές διαφορές στην αναπαραγωγική επιτυχία των πληθυσμών (Castranova et al. 2011). Οι Lawrence et al. (2008), μελέτησαν - έμμεσα - την επίδραση της πυκνότητας στην αναλογία φύλου των zebrafish. Στην εργασία τους, απέδειξαν ότι ο αργός ρυθμός ανάπτυξης, προκλειόμενος από περιορισμένη χορήγηση τροφής, είχε σαν αποτέλεσμα να επηρεαστεί η διαφοροποίηση του φύλου, οδηγώντας τελικά σε υψηλότερο ποσοστό αρσενικών ατόμων. Αντίθετα, η γρήγορη ανάπτυξη οδήγησε στην αύξηση της αναλογίας φύλου υπέρ των θηλυκών ατόμων. (Η περιορισμένη χορήγηση τροφής αποτελεί συνθήκη ανάλογη της υψηλής πληθυσμιακής πυκνότητας). Οι Hazlerigg et al. (2012), έκαναν την υπόθεση ότι υπάρχει ένα συγκεκριμένο πρότυπο αντίδρασης έναντι της πληθυσμιακής πυκνότητας για τους τελεόστεους, σύμφωνα με το οποίο η θνησιμότητα λόγω πυκνότητας είναι αυξημένη κατά τη δάρκεια του νυμφικού σταδίου μέχρι και τα πρώιμα στάδια του ιχθυδίου, ενώ μειώνεται καθώς προχωράμε στα όψιμα στάδια του ιχθυδίου και στα ενήλικα άτομα. Θέλοντας να μελετήσουν την ισχύ αυτής της υπόθεσης, χρησιμοποιήσαν το zebrafish και μελέτησαν την επίδραση της πληθυσμιακής πυκνότητας στην ανάπτυξη και τη θνησιμότητα του είδους, καθώς και στην αναλογία φύλου, σε δύο διαφορετικές περιόδους του κύκλου ζωής του. Όπως και στην εργασία των Lawrence et al. (2008), έτσι και οι Hazlerigg et al. (2012) μελέτησαν την ισχύ του παραπάνω προτύπου, χρησιμοποιώντας δύο διαφορετικές συνθήκες εκτροφής, μία σταθερή-περιορισμένη και μία ανάλογη με τις ανάγκες του πληθυσμού. Οι πυκνότες που χρησιμοποίησαν ήταν 2, 5, 10, 20 και 50 άτομα/l. Τα αποτελέσματά τους τα συσχέτισαν οντογενετικά, χρησιμοποιώντας το μήκος σώματος των ιχθύων. Από την εργασία τους προέκυψε ότι ξεκινώντας από πληθυσμούς ψαριών μήκους σώματος μικρότερο των 10mm, η θνησιμότητα λόγω πυκνότητας είναι υψηλή στα πρώιμα στάδια και σταδιακά μειώνεται. Ξεκινώντας απο πληθυσμούς ψαριών με μήκος σώματος μεγαλύτερο των 15mm δε διαπίστωσαν διαφορές στην εξαρτώμενη από την πυκνότητα, θνησιμότητα, αλλά διαπίστωσαν σημαντικές διαφορές στην αύξηση στη συνθήκη σταθερής διατροφής, όπου παρατηρήθηκε μείωση του ρυθμού αύξησησης των ιχθύων καθώς αυξάνεται η πυκνότητα. Σε αντίθεση με την εργασία των Lawrence et al. (2008), δεν παρατηρήθηκαν διαφορές στην αναλογία φύλου, σε καμία από τις δύο περιπτώσεις. Με την εργασία τους οι οι Hazlerigg et al. (2012) θέλησαν να εξάγουν ένα οντογενετικό πρότυπο εξάρτησης της ανάπτυξης από την πληθυσμιακή πυκνότητα, το οποίο επιβεβαιώθηκε εν μέρει από τα αποτελέσματα της αύξησης και της θνησιμότητας. Στην παρούσα μελέτη, πραγματοποιήθηκαν δύο πειράματα προκειμένου να εξεταστεί η πρόκληση φαινοτυπικής 169

172 πλαστικότητας στο zebrafish, υπό την επίδραση του παράγοντα της πυκνότητας, σε διαφορετικές οντογενετικές περιόδους του κύκλου ζωής του. Το μήκος σώματος χρησιμοποιήθηκε προκειμένου να προσδιοριστούν τα οντογενετικά στάδια επίδρασης της πυκνότητας. Ο καθορισμός του φύλου επηρεάζεται απο την πυκνότητα του πληθυσμού στο είδος Macropodus opercularis και σε φυσικούς και εκτρεφόμενους πληθυσμούς του είδους Anguilla rostrata. Στο είδος M. Opercularis, χαμηλές πυκνότητες οδηγούν σε αύξηση της αναλογίας φύλου υπέρ των αρσενικών ατόμων (Francis 1984). Στο είδος A. rostrata η αυξημένη πυκνότητα κατά την ανάπτυξη επάγει την αρσενική ανάπτυξη, ενώ σε χαμηλές πυκνότητες πληθυσμού η αναλογία φύλου αυξάνεται υπέρ των θηλυκών ατόμων (Krueger & Oliveira 1999). Φαίνεται ότι ο ρυθμός αύξησης παίζει ρόλο στη διαμόρφωση της αναλογίας φύλου. Στο είδος A. Rostrata, η υψηλή πληθυσμιακή πυκνότητα κατά την ανάπτυξη μειώνει τους ρυθμούς αύξησης γεγονός που συνδέεται με την επικράτηση των αρσενικών ατόμων σε αυτή την περίπτωση. Η υπόθεση ότι ο ρυθμός αύξησης μπορεί να παίζει καθοριστικό ρόλο στον καθορισμό του φύλου σε είδη ιχθύων με πολυπαραγοντικό τρόπο φυλοκαθορισμού, φαίνεται να έχει ισχύ για το zebrafish, αφού, όπως ειπώθηκε οι Lawrence et al. (2008), έδειξαν ότι ο υψηλός ρυθμός αύξησης ευνοει στη θηλυκοποίηση.. Θα πρέπει εδώ να τονιστεί ότι οποιοσδήποτε περιβαλλοντικός παράγοντας επηρεάζει το ρυθμό αύξησης σε μια κρίσιμη περίοδο ανάπτυξης μπορεί σε αυτή την περίπτωση να είναι καθοριστικός στη διαμόρφωση του φύλου (Kraak & De Looze 1992). Θα περιμέναμε ότι πιθανή μείωση του ρυθμού αύξησης σε συνθήκες υψηλής πληθυσμιακής πυκνότητας, θα αύξανε την αναλογία φύλου υπέρ των αρσενικών ατόμων στους πειραματικούς πληθυσμούς αυτής της εραγασίας, ωστόσο τα αποτελέσματά μας δεν έδειξαν σημαντική επίδραση της πυκνότητας του πληθυσμού στο ρυθμό αύξησης, ούτε στην αναλογία φύλου. Μελέτες τόσο σε άλλα είδη ιχθύων, όσο και στο zebrafish, υποδεικνύουν ότι ο ρυθμός αύξησης συνδέεται με τη διαφοροποίηση και τον καθορισμό του φύλου. Στο είδος Dicentrarchus labrax η διαφοροποίηση και o καθορισμός του φύλου εξαρτάται από τη θερμοκρασία ανάπτυξης, το οντογενετικό στάδιο εφαρμογής των διαφορετικών θερμοκρασιακών συνθηκών, καθώς και το ρυθμό αύξησης. Σε αυτό το είδος, χαμηλές θερμοκρασιακές συνθήκες [13 έναντι 20 C στη μελέτη των Pavlidis et al. (2000) και 15 C έναντι 20 C στη μελέτη των Koumoundouros et al. (2002)] μετατοπίζουν την αναλογία φύλου υπέρ των θηλυκών, ενώ υψηλές θερμοκρασίες, υπέρ των αρσενικών, με την απόκριση στο φυλοκαθοριστικό ρόλο της θερμοκρασίας να είναι συνεχής - από το στάδιο της επιβολής μέχρι την ολοκλήρωση της μεταμορφωσης αλλά με μεγαλύτερη ευαισθησία κατά τη διάρκεια της αυτότροφης φάσης (Koumoundouros et al. 2002). Τα αποτελέσματα αυτά είναι αντίθετα σε σχέση με τα αποτελέσματα που αναφέρονται για το zebrafish, όμως και στις δύο περιπτώσεις έχουμε την επίδραση της θερμοκρασίας σε μια περίοδο που οι γονάδες δεν έχουν σχηματιστεί, διαμορφώνοντας εν τέλει την τελική αναλογία φύλου. Εστιάζοντας στην επίδραση του ρυθμού αύξησης στην αναλογία φύλου, από τη μελέτη των Koumoundouros et al. (2002) στο λαβράκι προκύπτει ότι εντός των ίδιων θερμοκρασιακών συνθηκών (εφαρμοζόμενες κατά την ίδια θερμο-ευαίσθητη οντογενετική περίοδο), τα μεγαλύτερου μεγέθους ψάρια έδωσαν περισσότερα θηλυκά άτομα σε σχέση με τα μικρότερου μεγέθους ψάρια (Koumoundouros et al. 2002). Το παραπάνω αποτελεί ένδειξη ότι απαιτείται ένα ελάχιστο κρίσιμο μέγεθος από τα αναπτυσσόμενα ιχθύδια λαβρακιού, προκειμένου να διαφοροποιηθούν ως θηλυκά. Κατά τους Kraak & De Looze (1992), οποιοσδήποτε περιβαλλοντικός παράγοντας επηρεάζει το ρυθμό αύξησης σε μια κρίσιμη περίοδο ανάπτυξης είναι καθοριστικός του φύλου. Oι Lawrence et al. (2007), μελέτησαν την επίδραση της πυκνότητας στην αναλογία φύλου των zebrafish και έδειξαν ότι ο αργός ρυθμός ανάπτυξης (προκλειόμενος από περιορισμένη χορήγηση τροφής) είχε σαν αποτέλεσμα τη μετατόπιση της αναλογίας φύλου υπέρ των αρσενικών ατόμων, ενώ η 170

173 γρήγορη ανάπτυξη ευνόησε τη θηλυκοποίηση. Στην παρούσα εργασία, στο πείραμα των πυκνοτήτων, δε διαπιστώθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές στην αναλογία φύλου. Όμως, στο πείραμα επίδρασης της θερμοκρασίας, η ψυχρή θερμοκρασία των 22 C, ευνόησε την αναλογία φύλου υπέρ των θηλυκών ατόμων. Παρόμοιο ήταν και το αποτέλεσμα κατά τη συνεπίδραση θερμοκρασίας φωτοπεριόδου, στην φωτοπερίοδο 14:10, στη μία από τις δύο πειραματικές επαναλήψιες, όπου στους 22 C παρατηρήθηκε σημαντικά υψηλό ποσοστό αρσενικών ατόμων. Ίσως τα αποτελέσματα στην αναλογία φύλου να μπορούν να συνδυαστούν με το μειωμένο ρυθμό αύξησης στους 22 C, σε σχέση με τους 28 και τους 32 C, όπως διαπιστώθηκε κατά τη μελέτη του ρυθμού αύξησης στο εκάστοτε πείραμα. Σε πληθυσμούς του είδους M. Menidia η αναλογία φύλου είναι μετατοπισμένη υπέρ των θηλυκών ατόμων στις ψυχρότερες θερμοκρασίες της αρχής της αναπαραγωγικής περιόδου, συγκριτικά με τις υψηλότερες θερμοκρασίες που λαμβάνουν χώρα κατά το τέλος της αναπαραγωγικής περιόδου και οι οποίες δίνουν μια αναλογία φύλου μετατοπισμένη υπέρ των αρσενικών ατόμων (Conover and Kynard, 1981). Το ότι η χαμηλές θερμοκρασίες οδηγούν στη μετατόπιση της αναλογίας φύλου υπέρ των θηλυκών ατόμων, συνδέεται με το γεγονός ότι το μέγεθος, η γονιμότητα και η προσαρμοστικότητα είναι παράγοντες που χαρακτηρίζουν κυρίως τα θηλυκά, παρά τα αρσενικά άτομα, οπότε η γέννηση κατά την έναρξη της αναπαραγωγικής περιόδου «συμφέρει» τα θηλυκά, παρά τα αρσενικά άτομα (Conover 1984). Αν αντίστοιχα θεωρήσουμε ότι οι παράγοντες «μέγεθος, γονιμότητα και προσαρμοστικότητα» χαρακτηρίζουν τα θηλυκά άτομα και στο zebrafish, γίνεται ίσως κατανοητό ότι στις χαμηλές θερμοκρασίες που δεν ευνοούν το γρήγορο ρυθμό ανάπτυξης, ευνοείται η αρρενοποίηση. Μια πρόσφατη μελέτη των Wilson et al. (2014) απέδειξε ότι οι φυσικοί πληθυσμοί zebrafish φέρουν φυλοκαθοριστικό μηχανισμό, όμοιο με αυτόν που παρατηρείται στα πτηνά, δηλαδή με ετερογαμετικά θηλυκά και ομογαμετικά αρσενικά άτομα. Φαίνεται ότι στα εργαστηριακά στελέχη, τα οποία έχουν υποβληθεί μεταξύ άλλων σε συνθήκες εντατικής εκτροφής, έχει διακοπεί η φυσιολογική λειτουργία του φυλοκαθορισμού, με αποτέλεσμα αυτά να αναπτυχιούν εναλλακτικές μέθοδοι προσδιορισμού του φύλου, ή να ενισχυθούν ήδη υπάρχουσες εναλλακτικές μέθοδοι, οι οποίες εξαρτώνται σε μεγάλο βαθμό από το περιβάλλον και την ύπαρξη πολλαπλών ασθενών γενετικών παραγόντων (Wilson et al. 2014). Στα Σπονδυλωτά υπάρχουν δύο χρωμοσωμικού τύπου φυλοκαθοριστικοί μηχανισμοί, ο ZW/ZZ (θηλυκά ετερογαμετικά) και ο XX/XY (αρσενικά ετερογαμετικά). Σύμφωνα με τους Kraak & De Looze (1992), και από εξελικτικής σκοπιάς, η μετάβαση από τον περιβαλλοντικό στο γενετικό τύπο φυλοκαθορισμού μπορεί να προκύψει όταν ένα αλληλόμορφο το οποίο επιταχύνει την εμβρυϊκή ή τη νυμφική ανάπτυξη αναλάβει το ρόλο του περιβάλλοντος στην πρόκληση διαφορετικής ανάπτυξης. Έτσι, τα είδη με ESD που φέρουν μεγαλύτερα θηλυκά άτομα, «είναι προδιατεθειμένα» να εξελίξουν ένα ZW / ZZ φυλοκαθοριστικό σύστημα, ενώ τα είδη με μεγαλύτερα αρσενικά άτομα «είναι προδιατεθειμένα» να εξελίξουν ένα XX / XY φυλοκαθοριστικό σύστημα Kraak & De Looze (1992). Έχοντας το παραπάνω υπόψη, σε συνδυασμό με το γεγονός ότι οι Wilson et al. (2014) απέδειξαν ότι οι φυσικοί πληθυσμοί zebrafish φέρουν φυλοκαθοριστικό μηχανισμό με ετερογαμετικά θηλυκά άτομα, μπορούμε πράγματι να στηρίξουμε την υπόθεση ότι οι συνθήκες που ευνοούν τη γρήγορη ανάπτυξη οδηγούν στη θηλυκοποίηση των zebrafish, αφού στο είδος αυτό τα θηλυκά άτομα είναι μεγαλύτερα από τα αρσενικά. Τα παραπάνω καθιστούν ίσως το zebrafish ιδανικό μοντέλο μελέτης εναλλακτικών τρόπων φυλοκαθορισμού στα σπονδυλωτά, όπως έχει ειπωθεί και από τους Wilson et al. (2014), μια και καθίσταται δυνατή η μελέτη της δράσης των περιβαλλοντικών παραγόντων στην τελική διαφοροποίηση του φύλου σε ένα είδος που έχει χάσει το γενετικό τρόπο φυλοκαθορισμού, σε εργαστηριακό επίπεδο. Το γεγονός αυτό δείχνει ότι ότι η διαδικασία της εξέλιξης 171

174 λαμβάνει χώρα όχι μόνο στη φύση, αλλά και στα εργαστήρια, όμως τα εκα στοτε αποτελέσματα χρήζουν ιδιαίτερης προσοχής αφού μπορεί να διαφοροποιούνται σε μεγάλο βαθμό, ανά περίπτωση. Ένα από τα σημαντικότερα προβλήματα που αναδύθηκαν κατά την επίδραση της θερμοκρασίας στην αναλογία φύλου του καλά μελετημένου λαβρακιού, ήταν η φύση των υποκείμενων μηχανισμών που καθοριζουν την επίδραση της θερμοκρασίας στον καθορισμό των γονάδων σε όρχεις ή ωοθήκες, όταν ακόμα οι γονάδες δεν έχουν στοιχειωδώς σχηματιστεί. Το παραπάνω ερώτημε τέθηκε από τους Navarro-Martín et al. ( 2011), για να διαπιστώσουν στην εργασία τους ότι ένας επιγενετικός μηχανισμός, συγκεκριμένα η μεθυλίωση του υποκινητή του πολυαναφερόμενου γονιδίου της αρωματάσης που καταλύει τη μετατροπη των οιστρογόνων σε ανδρογόνα, συνδέεται με τον ισχυρό ρόλο της θερμοκρασίας ανάπτυξης στην αναλογία φύλου. Αποδείχτηκε ότι η αυξημένη θερμοκρασία κατά τη διάρκεια μιας κρίσιμης περιόδου κατά στην πρώιμη ανάπτυξη, αυξάνει τη μεθυλίωση του DNA του υποκινητή του γονιδίου της αρωματάσης, αποτρέποντας την έκφρασή του (Navarro-Martín et al. 2011), καθορίζοντας τα αναπτυσσόμενα άτομα σε αρσενικά. Το ερώτημα αν υπάρχει κάποιος αντίστοιχος μηχανισμός στο zebrafish, παραμένει αναπάντητο. Οι Jorgensen et al. (2008), προσπάθησαν να εξηγήσουν τη διαφοροποίηση και το καθορισμό του φύλου στο zebrafish, αναλύοντας το οντογενετικό προφίλ έξι φυλοκαθοριστικών (αρρενο-ειδικών και θηλεο-ειδικών) γονιδίων στο zebrafish (ar, sox9a, dmrt1, fig alpha, cyp19a1a, cyp19a1b), από τη 2 η dph μέχρι την 40 η dph. Αρχικά χώρισαν τα άτομα με βάση το αν παρουσίαζαν αυξημένη ή μειωμένη έκφραση του εκάστοτε μελετούμενου θηλεο-ειδικού ή αρρενο-ειδικού γονιδίου και παρατήρησαν το αναδυόμενο οντογενετικό προφίλ στην ομάδα της αυξημένης έκφρασης. Ένα από τα βασικότερα συμπεράσματά τους, ήταν ότι η πρώτη σημαντική κορυφή στη γονιδιακή έκφραση παρουσιάστηκε στις 10 dph, στο γονίδιο dmrt1. Πρότειναν λοπόν ότι το dmrt1 παίζει κυρίαρχο ρόλο στη πρώιμη διαφοροποίηση των γονάδων, ως αρσενικές. Τα αποτελέσματα των Jorgensen et al. (2008), σε συνδυασμό με αυτά της παρούσας μελέτης, αναλύονται λεπτομερώς παρακάτω, στην επίδραση της θερμοκρασίας ανάπτυξης στο οντογενετικό προφίλ της γονιδιακής έκφρασης. Προς το παρόν, σημειώνονται δύο παρατηρήσεις: Η αύξηση της έκφρασης του αρρενοποιητικού dmrt1 στις 10 dph ( 13 dpf), τοποθετείται περίπου όταν τα άτομα βρίσκονται στο στάδιο του ερμαφρόδιτου ιχθυδίου. H αύξηση της έκφρασης του επίσης αρρενοποιητικού sox9a, στις 22 dph τοποθετείται λίγο πριν από την απόπτωση των ωοκυττάρων, η οποία ορίζεται στις dph, όπως αυτή ορίζεται από τις προηγούμενες μελέτες που έχουν αναφερθεί. Τα παραπάνω λοιπόν μπορεί να έχουν ισχύ, σκεπτόμενοι ότι αυξανόμενης της απόπτωσης των ωοκυττάρων αρχίζει η έκφραση αρρενοποιητικών γονιδίων στος γονάδες, ή μποροούμε ακόμα να υποθέσουμε ότι η ισχυρή έκφραση του dmrt1 αρκετά νωρίς, όταν το αναπτυσσόμενο ψάρι βρίσκεται στο στάδιο του ερμφρόδιτου ιχθυδίου, σηματοδοτεί τον καθορισμό των γονάδων ως αρσενικές. Όμως, η μελέτη του οντογενετικού προφίλ της γονιδιακής έκφρασης σε σχέση με τις dpf ή dph, αναδύει ένα πρόβλημα που έχει ήδη αναφερθεί και αφορά στον προδσιορισμό του οντογενετικού σταδίου των ιχθύων. Αν αποδεχτούμε ότι αναπτυσσόμενα ψάρια της ίδιας ηλικίας σε dpf (ή dph) έχουν διαφορετικό μήκος σώματος και άρα βρίσκονται σε διαφορετικό οντογενετικό στάδιο, τότε τα αποτελέσματα της μελέτης των Jorgensen et al. (2008), καθίστανται εν μέρει επισφαλή. Στην ανασκόπηση των Piferrer et al. (2005) σε σχέση με τους γενετικούς και περιβαλλοντικούς παράγοντες που σχετίζονται με τη διαφοροποίηση και τον καθορισμό του φύλου στο λαβράκι (Dicentrarchus labrax L.), βλέπουμε ότι «η διαφοροποίηση του φύλου εξαρτάται περισσότερο από το μήκος, παρά από την ηλικία, ενώ η σχέση ηλικίας - μήκους εξαρτάται και από τη θερμοκρασία ανάπτυξης» (Εικόνα 5.2-1). Γίνεται άρα κατανοητό ότι και κατά τη μελέτη του οντογενετικού προφίλ της γονιδιακής 172

175 έκφρασης, τα αποτελέσματα είναι ασφαλέστερο και ακριβέστερο να σχετίζονται με το μήκος σώματος των αναπτυσσόμενων ιχθύων. Επίσης, αν η έκφραση των γονιδιών συσχετιστεί με το μήκος του σώματος των αναπτυσσόμενων ιχθύων, μπορεί να διαλευκανθεί η πιθανή σύνδεση μεγέθους κατά την κρίσιμη περίοδο καθορισμού των γονάδων με τη διαφοροποίηση του φύλου. (Αν διαπιστωθεί για παράδειγμα η αυξημένη έκφραση αρρενο-ειδικών γονιδίων σε ψάρια μικρού μεγέθους, ή / και η αυξημένη έκφραση θηλεο-ειδικών γονιδίων σε ψάρια μεγάλου μεγέθους). Οι εποχικές και ημερήσιες διακυμάνσεις της θερμοκρασίας, συμπίπτουν με διακυμάνσεις στις περιόδους φωτός σκότους, με αποτέλεσμα οι δύο αυτοί παράγοντες να συνεπιδρούν στην ανάπτυξη των οργανισμών. Η φωτοπερίοδος το μήκος δηλαδή της ημέρας και άρα του φωτός καθώς και η ένταση του φωτός, αποτελούν ρυθμιστή των βιολογικών ρυθμών των οργανισμών γενικά, και φυσικά των ιχθύων. Στο είδος Leuresthes tenuis διαβιώνει σε σχετικά σταθερές θερμοκρασιακές συνθήκες, αλλά οι διακυμάνσεις της φωτοπεριόδου είναι μεγάλες. Πρόσφατες μελέτες από τους Brown et al. (2014), έδειξαν ότι η η θερμοκρασία έπαιξε σημαντικό ρόλο στην αναλογία φύλου του είδους, αφού στη χαμηλή θερμοκρασία (17 C) η αναλογία φύλου μετατοπίστηκε υπέρ των θηλυκών ατόμων, ενώ στις υψηλότερες θερμοκρασίες (21 C και 25 C) το αντίστοιχο ποσοστό ήταν χαμηλότερο. Όμως, η σημασία αυτής της μελέτης έγκειται στην επίδραση της φωτοπεριόδου στην αναλογία φύλου. Αποδείχθηκε ότι η μεγαλύτερη φωτοπερίοδος που χρησιμοποιήθηκε οδήγησε σε σημαντικά υψηλότερο ποσοστό θηλυκών ατόμων, ενώ η μικρότερη φωτοπερίοδος οδήγησε στο μεγαλύτερο ποσοστό αρσενικών. Αν και η φωτοπερίοδος έχει αποδειχθεί ότι επηρεάζει την αναλογία φύλου στα ασπόνδυλα, όπως είναι οι γαρίδες (Naylor et al. 1988), στα σπονδυλωτά δεν έχει περιγραφεί αντίστοιχη επίδραση, με εξαίρεση στο είδος Leuresthes tenuis, όπως περιγράφηκε παραπάνω. Η φωτοπερίοδος, έχει βρεθεί ότι επιδρά στην αύξηση των ιχθύων, άμεσα, αυξάνοντας την αντιληπτική και άρα τη θηρευτική τους ικανότητα (Thorpe 1986). Στην παρούσα εργασία, αν και ο ρυθμός αύξησης βρέθηκε να επηρεάζεται από τη συνδυαστική δράση της θερμοκρασίας ανάπτυξης με τη φωτοπερίοδο, με τον κάθε έναν παράγοντα να ελέγχει τη δράση του άλλου, όπως ειπώθηκε νωρίτερα, δεν παρατηρήθηκαν διαφορές στην αναλογία φύλου Επίδραση της θερμοκρασίας ανάπτυξης και της συνεπίδρασης θερμοκρασίας φωτοπεριόδου κατά την ανάπτυξη στο χρονισμό της οντογένεσης των μεριστικών χαρακτήρων Ως μεριστικοί χαρακτήρες, ορίζονται επαναλαμβανόμενες μορφολογικές δομές (ή σωματικά τμήματα) που μπορούν να μετρηθούν, όπως έιναι οι πλευρές, οι ακτίνες των πτερυγίων και τα λέπια στα ψάρια. Κατά την οντογένεση, στα έμβρυα των ψαριών οι σωμίτες είναι οι πρώτες επαναλαμβανόμενες δομές που σχηματίζονται τοποθετημένοι κατά μήκος μιας γραμμής, ακολουθώντας μια απλούστατη, αλλά παράλληλα ακριβή γεωμετρία (Lindsey 1988). Οι μεριστικοί χαρακτήρες και οι παραλλαγές αυτών, τόσο στο χρόνο εμφάνισής τους, όσo και στη χρονική διάρκεια ολοκλήρωσης της ανάπτυξής τους, μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως εργαλείο για τη μελέτη του χρονισμού της οντογένεσης. Οντογενετικά γεγονότα, όπως η ολοκληρωση της οστεοποίησης των μεριστικών χαρακτήρων, ο σχηματισμός της ουραίας διχάλας ή και η κάμψη της νωτοχορδής, μπορούν επίσης να χρησιμοποιηθούν κατά τη μελέτη του χρονισμού στην οντογένεση. Η ανάπτυξη των μεριστικών χαρακτήρων εξαρτάται από γενετικούς και περιβαλλοντικούς παράγοντες (Barlow 1961). Μικρές αλλαγές του περιβάλλοντος κατά την πρώιμη οντογένεση είναι δυνατό να επηρεάσουν τον αριθμό των μεριστικών χαρακτήρων ή / και τη χρονική στιγμή της

176 εμφάνισής τους, καθιστώντας δυνατές παράλληλες αλλαγές στο φαινότυπο των αναπτυσσόμενων ατόμων. Οι περιβαλλοντικοί παράγοντες που έχει βρεθεί ότι επηρεάζουν τους μεριστικούς χαρακτήρες (θερμοκρασία, φως, διαλυμένο οξυγόνο, πυκνότητα πληθυσμού) δρουν κατά τη διάρκεια της περιόδου από τη γονιμοποίηση μέχρι τη μεταμόρφωση (Lindsey 1988, Georgakopoulou et al. 2007). Έτσι, οι μεριστικοί χαρακτήρες επηρεάζονται σημαντικά από τις περιβαλλοντικές συνθήκες κατά τα πρώιμα αναπτυξιακά στάδια, αλλά στη συνέχεια σταθεροποιούνται και παραμένουν αμετάβλητοι, άσχετα από τις μετέπειτα αλλαγές του περιβάλλοντος, ή αλλαγές στο μέγεθος και στο σχήμα του σώματος (Lindsey 1988). Σε αντίθεση δηλαδή με τα μορφομετρικά στοιχεία, τα μεριστικά παραμένουν αμετάβλητα από τη φάση της μεταμόρφωσης και μετά. Κατά συνέπεια, οι εκάστοτε παρατηρούμενες διαφοροποιήσεις στα σε αυτά, αντανακλούν περιβαλλοντικές επιδράσεις που περιορίζονται χρονικά στο σχετικά σύντομο διάστημα της ιχθυονυμφικής περιόδου. Τέλος, αξίζει να σημειωθεί ότι η ανάπτυξη των μεριστικών χαρακτήρων επηρεάζεται και από τη θερμοκρασία στην οποία έχουν αναπτυχθεί οι γονείς των μελετούμενων ατόμων, καθώς και η ηλικία τους. Ο μηχανισμός που βρίσκεται πίσω από αυτές τις επιδράσεις, δεν είναι γνωστός (Lindsey 1988). Η ένταση του φωτός, το μήκος κύματος και η φωτοπερίοδος έχει βρεθεί ότι επηρεάζουν την ανάπτυξη των ιχθύων γενικά (Villamizar et al. 2011), και του σκελετού ειδικότερα (Fjelldal et al. 2005). Μεταξύ άλλων επηρεάζεται η εναπόθεση αλάτων στα οστά, γεγονός που σχετίζεται με την ισχυροποίηση του σκελετικού συστήματος. Τα ψάρια που υποβάλλονται σε μακρές συνθήκες φωτός (μεγάλες φωτοπεριόδους) αποκτούν μεγαλύτερο βάρος και μήκος σώματος (Moustakas et al. 2004, Fjelldal et al. 2005, Blanco-Vives et al. 2010), ενώ είναι διαπιστωμένη η σημαντική επίδραση της έντασης του φωτός, του μήκους κύματος και της φωτοπεριόδου κατά την πρώιμη νυμφική ανάπτυξη (Villamizar et al. 2011). Έχει λεχθεί ότι σε συνθήκες μεγάλης φωτοπεριόδου, παρέχεται καλύτερη δυνατότητα εύρεσης τροφής (Boeuf & Le Bail, 1999), αλλά στην παρούσα εργασία οι συνθήκες διατροφής ήταν τέτοιες (ad libitum) ώστε να αποφευχθεί όσο το δυνατόν μια τέτοια επίδραση. Ο σχετικός ρυθμός ανάπτυξης και διαφοροποίησης με οστεολογικούς-μεριστικούς χαρακτήρες, εξετάστηκε στο 1 ο κύριο πείραμα της παρούσας εργασίας, όπου μελετήθηκε η επίδραση της θερμοκρασίας ανάπτυξης (22, 28 και 32 C) στο χρονισμό της οντογένεσης, καθώς και στο 3 ο πείραμα, όπου μελετήθηκε η συνεπίδραση της θερμοκρασίας ανάπτυξης (22, 28 και 32 C) με τη φωτοπερίοδο (14h:10h L:D, 8h:16h L:D). Να σημειωθεί ότι η θερμοκρασία των 28 C, σε συνδυασμό με την φωτοπερίοδο 14h:10h L:D, θεωρούνται ως βέλτιστες συνθήκες ανάπτυξης για το zebrafish (Westerfield 1995, Lawrence 2007, Spence et al. 2008). Στο πρώτο πείραμα μελετήθηκε η ανάπτυξη του πρώτου υπουραίου οστού, του επουραίου οστού, ο αριθμός των πτερυγιοφόρων του ραχιαίου πτερυγίου και του εδρικού πτερυγίου, η ανάπτυξη των προραχιαίων οστών, του ουρόστυλου και των προπλασμάτων των κοιλιακών πτερυγίων. Επίσης, προσδιορίστηκε ο χρόνος (το μήκος σώματος και άρα το οντογενετικό στάδιο) όπου άρχισε η οστεοποίηση του πρώτου πτερυγιοφόρου του εδρικού πτερυγίου, του πρώτου πτερυγιοφόρου του ραχιαίου πτερυγίου και του επουραίου οστού. Στο δεύτερο πείραμα μελετήθηκε η εμφάνιση (ανάπτυξη) του εδρικού πτερυγίου, η εμφάνιση του ραχιαίου πτερυγίου και η εμφάνιση των προπλασμάτων των κοιλιακών πτερυγίων. Τέλος, προσδιορίστηκε το μήκος σώματος όπου καταγράφηκε η αρχή της κάμψης νωτοχορδής, η ολοκλήρωση κάμψης της νωτοχορδής και η ολοκλήρωση του σχηματισμού της ουραίας διχάλας. 174

177 Flexion Anal Dorsal Post-Flexion Caudal Abdominal Flexion Anal Dorsal Post-Flexion Caudal Abdominal NL / SL (mm) 8,0 7,5 7,0 6,5 6,0 5,5 5,0 4,5 14:10 L:D 8:16 L:D 8,0 7,5 7,0 6,5 6,0 5,5 5,0 4, ,0 4, Εικόνα 5.3-1: Διάγραμμα, στο οποίο παρατίθενται οι μέσες απόλυτες τιμές του SL 50 (χωρίς την τυπική απόκλιση, SD) όπου ολοκληρώνεται η οντογένεση των μεριστικών χαρακτήρων που εξετάζονται στην παρούσα μελέτη, στους 22 C (ρόμβος), στους 28 C (τετράγωνο) και στους 32 C (τρίγωνο) και στις δύο συνθήκες φωτοπεριόδου (14:10 και 8:16 L:D). Αρχή κάμψη νωτοχορδής (Flexion), εμφάνιση του εδρικού πτερυγίου (Anal), εμφάνιση του ραχιαίου πτερυγίου (Dorsal), ολοκλήρωση κάμψης της νωτοχορδής (Postflexion), ολοκλήρωση του σχηματισμού της ουραίας διχάλας (Caudal) και εμφάνιση προπλασμάτων των κοιλιακών πτερυγίων (Abdominal). Η σειρά ολοκλήρωσης του σχηματισμού (ανάπτυξης) των εξεταζόμενων οντογενετικών χαρακτήρων (από αυτό που συμβαίνει νωρίτερα, δηλαδή σε μικρότερο μήκος σώματος, σε αυτό που συμβαίνει αργότερα), κατά τη μελέτη της συνεπίδρασης θερμοκρασίας φωτοπεριόδου, έχει ως εξής: Αρχή κάμψη νωτοχορδής (Flexion), εμφάνιση του εδρικού πτερυγίου (Anal), εμφάνιση του ραχιαίου πτερυγίου (Dorsal), ολοκλήρωση κάμψης της νωτοχορδής (Post-flexion), ολοκλήρωση του σχηματισμού της ουραίας διχάλας (Caudal) και εμφάνιση προπλασμάτων των κοιλιακών πτερυγίων (Abdominal) (Εικόνα 5.3-1). Στη συνθήκη 8:16 L:D, στους 28 και 32 C, η ολοκλήρωση της κάμψης της νωτοχορδής πραγματοποιείται νωρίτερα (σε μικρότερο μήκος σώματος) από την ανάπτυξη του ραχιαίου πτερυγίου, ξεφεύγοντας από την παραπάνω σειρά ολοκλήρωσης της ανάπτυξης των οντογενετικών χαρακτήρων. Αυτή η καθυστέρηση ανάπτυξης του ραχιαίου πτερυγίου ή εναλλακτικά η επιτάχυνση της κάμψης της νωτοχορδής στους 28 και 32 C, στη συνθήκη 8:16 L:D, θα μπορούσε να χαρακτηριστεί ως μια ετεροχρονική μετατόπιση. Είδαμε ότι μεταξύ των διαφορετικών φωτοπεριόδων, στατιστικά σημαντικές διαφορές (t-test, p<0,05) παρατηρήθηκαν στους 22 C στην ανάπτυξη του εδρικού πτερυγίου και στην ολοκλήρωση του σχηματισμού της ουραίας διχάλας, ενώ στους 28 και στους 32 C στην ανάπτυξη των κοιλιακών πτερυγίων και στην ολολήρωση της κάμψης της νωτοχορδής. Με εξαίρεση την ανάπτυξη του εδρικού πτερυγίου στους 22 C, σε κάθε άλλη περίπτωση που παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ των ίδιων θερμοκρασιών στις διαφορετικές συνθήκες φωτοπεριόδου, αυτή οφειλόταν σε καθυστέρηση της εμφάνισης ή της ολοκλήρωσης της ανάπτυξής τους στη μεγάλη φωτοπερίοδο, σε σχέση με τη μικρή. Αντίθετα, στους 22 C, η εμφάνιση του εδρικού πτερυγίου καθυστέρησε στη μικρή φωτοπερίοδο (8:16 L:D) σε σχέση με τη μεγάλη (14:10 L:D). Εντός της ίδιας συνθήκης φωτοπεριόδου (14:10 L:D και 8:16 L:D), σε κάθε περίπτωση, αύξηση της θερμοκρασίας από τους 22 C στους 28 ή στους 32 C, προκάλεσε επιτάχυνση της εμφάνισης ολοκλήρωσης των εκάστοτε οντογενετικών χαρακτήρων. Όμως, αύξηση της θερμοκρασίας από τους 28 στους 32 C, είχε ως αποτέλεσμα την καθυστέρηση της ανάπτυξης του εδρικού πτερυγίου στη μεγάλη φωτοπερίοδο και καθυστέρηση της

178 εμφάνισης των προπλασμάτων των κοιλιακών πτερυγίων και της αρχής της κάμψης της νωτοχορδής στη μικρή φωτοπερίοδο (κελιά γκρι χρώματος στον Πίνακα 28). Σύμφωνα με τα παραπάνω, ως γενικό συμπέρασμα θα μπορούσε να ειπωθεί ότι η φωτοπερίοδος και η θερμοκρασία συνεπιδρούν στην ανάπτυξη των εξεταζόμενων χαρακτήρων, και κυρίως όσων έχουν σχέση με το ουραίο πτερύγιο (αρχή και ολοκλήρωση της κάμψης της και νωτοχορδής και ολοκλήρωση του σχηματισμού της ουραίας διχάλας). Επίσης, στη μεγάλη φωτοπερίοδο καθυστερεί σημαντικά η ανάπτυξη του ραχιαίου στους 22 C σε σχέση με τους 32 C, ενώ στη μικρή φωτοπερίοδο καθυστερεί η ανάπτυξη του εδρικού και των κοιλιακών πτερυγίων στους 22 C σε σχέση με τους 32 C. Φαίνεται ότι οι λιγότερο ευνοϊκές συνθήκες φωτοπεριόδου (8:16 L:D) και θερμοκρασίας (22 C), καθυστερούν σημαντικά την ανάπτυξη των εν λόγω χαρακτήρων. 176 Πίνακας 28: Συγκεντρωτικός πίνακας, όπου σημειώνονται με αστερίσκο οι περιπτώσεις που διαπιστώθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές (t test, p<0,05) στην ανάπτυξη των εξεταζόμενων οντογενετικών χαρακτήρων, μεταξύ των διαφορετικών θερμοκρασιακών συνθηκών (22-28, 22-32, C) εντός της ίδιας συνθήκης φωτοπεριόδου (14:10 L:D, 8:16 L:D) (έξι πρώτες στήλες), καθώς και μεταξύ των δύο διαφορετικών συνθηκών φωτοπεριόδου [(14:10 vs 8:16 (L:D)] εντός της ίδια θερμοκρασιακής συνθήκης (22, 28, 32 C) (τρεις τελευταίες στήλες). Εντός της ίδιας συνθήκης φωτοπεριόδου (14:10 L:D και 8:16 L:D), αύξηση της θερμοκρασίας από τους 22 C στους 28 ή στους 32 C, προκάλεσε επιτάχυνση της ανάπτυξης των εκάστοτε οντογενετικών χαρακτήρων. Εξαίρεση αποτελούν η ανάπτυξη του εδρικού πτερυγίου στη μεγάλη φωτοπερίοδο και η εμφάνιση των προπλασμάτων των κοιλιακών πτερυγίων και η αρχή της κάμψης της νωτοχορδής στη μικρή φωτοπερίοδο (κελιά γκρι χρώματος), αφού αύξηση της θερμοκρασίας από τους 28 στους 32 C, είχε ως αποτέλεσμα την καθυστέρηση της ανάπτυξης των εν λόγω χαρακτήρων. Μεταξύ των ίδιων θερμοκρασιών στις διαφορετικές συνθήκες φωτοπεριόδου (3 τελευταίες στήλες), όπου παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά αυτή οφειλόταν σε καθυστέρηση της εμφάνισης ή της ολοκλήρωσης της ανάπτυξής στη μεγάλη φωτοπερίοδο, σε σχέση με τη μικρή. Εξαίρεση αποτελεί η ανάπτυξη του εδρικού πτερυγίου στους 22 C (κελί γκρι χρώματος). Αρχή κάμψη νωτοχορδής (Flexion), εμφάνιση του εδρικού πτερυγίου (Anal), εμφάνιση του ραχιαίου πτερυγίου (Dorsal), ολοκλήρωση κάμψης της νωτοχορδής (Post-flexion), ολοκλήρωση του σχηματισμού της ουραίας διχάλας (Caudal) και εμφάνιση προπλασμάτων των κοιλιακών πτερυγίων (Abdominal). 14:10 L:D 8:16 L:D 14:10 vs 8:16 (L:D) ( C) Abdominal * * * Dorsal * Anal * * * * * Flexion * * * * * Post Flexion * * * * * * Caudal * * * Η αιτία εμφάνισης των εξεταζόμενων μεριστικών χαρακτήρων σε μικρότερο μήκος σώματος στη μικρή φωτοπερίοδο, σε σχέση με τη μεγάλη, δεν μπορεί να αιτιολογηθεί βάση προϋπάρχουσας βιβλιογραφίας. Σύμφωνα με τους Koumoundouros et al. (2001) το κρανίο και κατ επέκταση οι σχηματισμοί που σχετίζονται με την εξερεύνηση του περιβάλλοντος και την εύρεση τροφής - αποτελούν τις πρώτες δομές που διαμορφώνονται. Το κρανίο και οι σχηματισμοί που φέρει (στόμα, οφθαλμοί, βράγχια) αποτελούν στοιχεία απαραίτητα για τη διαδικασία της αναπνοής, για την εξερεύνηση του περιβάλλοντος και για τη διατροφή, όντας άμεσα συνδεδεμένα με την επιβίωση των ατόμων (Koumoundouros et al. 2001). Απο κει και πέρα, η αποφυγή θηρευτών επιβάλλει την ανάπτυξη της κολυμβητικής ικανότητας (Koumoundouros et al. 2001), χαρακτήρας που εμφανίζει υψηλού βαθμού πλαστικότητα. Η ανάπτυξη των πτερυγίων συνδέεται άμεσα με την κολυμβητική ικανότητα. Ίσως η νωρίτερη ανάπτυξη του ουραίου, του εδρικού και των κοιλιακών πτερυγίων στη μικρή φωτοπερίοδο, να συνδέεται με μια ενδεχόμενη αυξημένη κολυμβητική ικανότητα αυτών των ιχθύων σε νεαρότερα στάδια, προκειμένου να αντισταθμίζεται η δυσμενής επίδραση της μικρής

179 SL (mm) φωτοπεριόδου στην αύξησή τους. Έτσι, τα τα άτομα αυτά θα μπορούν μέσω της κολυμβητικής τους δραστηριότητας να ψάξουν ενεργητικά για τροφή ή / και νέα ενδιαιτήματα, καθώς και να αποφύγουν πιθανούς θηρευτές. Παράλληλα, βάσει του «βιοενεργητικού μοντέλου», όπως προτείνεται από τον Ernst (2000), τα ψάρια αποκτούν την απαρίτητη για αυτά ενέργεια απο την κατανάλωση της τροφής (Ι) και αυτή αποθηκεύεται μέσω της ανάπτυξης (G), χάνεται μέσω της απέκκρισης (E) ή δαπανάται μέσω της διαδικασίας του μεταβολισμού (Μ) (Ι=G+E+M). Η παροχή αρκετής τροφής (ad libitum) και στις δύο φωτοπεριοδικές πειραματικές συνθήκες προσέφερε την απαραίτητη ενέργεια για την αύξηση των ατόμων και τη διαφοροποίησή τους. Οι χαμηλότεροι ρυθμοί αύξησης στη μικρή φωτοπερίοδο, μπορεί να συνδέονται με τη δυνατότητα παροχής περισσότερης ενέργειας στη διαδικασία της διαφοροποίησης, δίνοντας έτσι μια πιθανή εξήγηση στη νωρίτερη ανάπτυξη (σε μικρότερο μήκος σώματος) των πτερυγίων στη μικρή φωτοπερίοδο hyp 1 epr 2 (n)drs 3 (n)anl 4 prd 5 urs 6 plv 7 (o)anl 8 (o)drs 9 (o)epr 10 Εικόνα 5.3-2: Διάγραμμα, στο οποίο παρατίθενται οι απόλυτες μέσες τιμές του SL 50 (χωρίς την τυπική απόκλιση, SD) όπου ολοκληρώνεται η οντογένεση των μεριστικών χαρακτήρων που εξετάζονται στην παρούσα μελέτη, σε θερμοκρασία ανάπτυξης 22 C (ρόμβος), 28 C (τετράγωνο) και 32 C (τρίγωνο). Hyp, ανάπτυξη 1 ου υπουραίου οστού. Epr, ανάπτυξη επουραίου οστού. (n)drs, αριθμός πτερυγιοφόρων ραχιαίου πτερυγίου. (n)anl, αριθμός πτερυγιοφόρων εδρικού πτερυγίου. Prd, ανάπτυξη προραχιαίων οστών. Urs, ανάπτυξη ουρόστυλου. Plv, ανάπτυξη κοιλιακών πτερυγίων. (o)anl οστεοποίηση 1ου πτερυγιοφόρου εδρικού πτερυγίου. (o)drs οστεοποίηση 1ου πτερυγιοφόρου ραχιαίου πτερυγίου. (o)epr, οστεοποίηση επουραίου. Από τα αποτελέσματα του πειράματος επίδρασης της θερμοκρασίας, είδαμε ότι η θερμοκρασία των 32 C επιταχύνει την ανάπτυξη όλων σχεδόν των εξεταζόμενων μεριστικών χαρακτήρων, με την ανάπτυξη των πτερυγιοφόρων του ραχιαίου και του των πτερυγιοφόρων του εδρικού πτερυγίου, την ανάπτυξη των κοιλιακών πτερυγίων και την οστεοποίηση των πτερυγιοφόρων του ραχιαίου πτερυγίου να παρουσιάζουν καθαρά θερμοκρασιακή απόκριση, υπό την έννοια του ότι αύξηση της θερμοκρασίας ανάπτυξης προκαλεί μείωση του σωματικού μεγέθους όπου επιτυγχάνονται τα διάφορα αναπτυξιακά γεγονότα καθώς μετακινούμαστε από τους 22, στους 28 και έπειτα στους 32 C. Αξίζει να σημειωθεί ότι τρεις μεριστικοί χαρακτήρες που αφορούν στην περιοχή της ουράς, η ανάπτυξη του ουρόστυλου και η οστεοποίηση του επουραίου, καθυστερεί σημαντικά (t-test, p<0,05) στους 28 C όχι μόνο σε σχέση με τους 32 C, το οποίο είναι αναμενόμενο, αλλά και σε σχέση με τους 22 C, όπου η διαφορά είναι στατιστικά σημαντική για την ανάπτυξη του ουρόστυλου και την οστεοποίηση του επουραίου, όχι όμως και για την ανάπτυξη του 1 ου υπουραίου. Το ουραίο

180 πτερύγιο και η ανάπτυξή του, σχετίζονται με την κολυμβητική ικανότητα των zebrafish, τα οποία χρησιμοποιούν το οπίσθιο μισό τμήμα του σώματός τους προκειμένου να κολυμπήσουν (subcarangiform type) (Plaut & Gordon 1994). Ίσως τα άτομα που μεγαλώνουν στις σχετικά δυσμενείς συνθήκες των 22 C να αντισταθμίζουν το μειωμένο ρυθμό αύξησής τους με την ανάπτυξη εκείνου του σωματικού τους τμήματος το οποίο είναι απαραίτητο για την κολυμβητική τους ικανότητα, δηλαδή του ουραίου τμήματος, παρέχοντας έτσι μια δυνατή εξήγηση της νωρίτερης ανάπτυξης του ουρόστυλου και της οστεοποίησης του επουραίου στους 22 C, σε σχέση με τους 28 C. Αντίστοιχα, βάσει του προαναφερόμενου «βιοενεργητικού μοντέλου» (Ernst 2000), η διαφοροποίηση ή η ενίσχυση του ουραίου τμήματος στα άτομα των 22 C μπορεί να πραγματοποιείται λόγω της προσφερόμενης ενέργειας από τη διατροφή, η οποία δεν προσφέρεται τόσο στην αύξηση ή στους μειωμένους μεταβολικούς ρυθμούς των ψυχρότερων θερμοκρασιακών συνθηκών, αλλά στην ενίσχυση της διαφοροποίησης συγκεκριμένων δομών που παρέχουν κάποιο πλεονέκτημα στην επιβίωση των ατόμων. Στους 32 C οι αυξημένοι μεταβολικοί ρυθμοί και ο αυξημένος ρυθμός αύξησης, μπορούν αντίστοιχα να εξηγήσουν την ανάπτυξη συγκεκριμένων μεριστικών χαρακτήρων ή την ολοκλήρωση κάποιων ονοτγενετικών γεγονότων σε μικρότερο μήκος σώματος, κατά τη σύγκριση με τις ψυχρότερες θερμοκρασιακές συνθήκες. Σε συμφωνία με προηγούμενες εργασίες σε άλλα είδη ψαριών (Fuiman et al. 1998, Koumoundouros et al. 2001), τα αποτελέσματα της παρούσας εργασίας δείχνουν γενικά πως η αύξηση της θερμοκρασίας ανάπτυξης προκαλεί σημαντική μείωση του σωματικού μεγέθους όπου επιτυγχάνονται τα διάφορα αναπτυξιακά γεγονότα, γεγονός που αποδίδεται στο ότι η αύξηση της θερμοκρασίας επιταχύνει περισσότερο το ρυθμό διαφοροποίησης από ότι το ρυθμό αύξησης του σώματος (Fuiman et al. 1998). Είναι δε σημαντικό να παρατηρηθούν (πιθανά) φαινόμενα ετεροχρονισμού, κατα τα οποία ορισμένοι μεριστικοί χαρακτήρες εμφανίζονται νωρίτερα από άλλους σε κάποιες θερμοκρασιακές συνθήκες και αργότερα σε άλλες. Έτσι, η εμφάνιση των κοιλιακών πτερυγίων προηγείται της οστεοποίησης των πτερυγιοφόρων του εδρικού και της οστεοποίησης των επουραίων στους 28 και 32 C, ενώ στους 22 C πραγματοποιείται μετά. Επίσης, η ολοκλήρωση της ανάπτυξης των πτερυγιοφόρων του εδρικου προηγείται της εμφάνισης του ουρόστυλου στους 28 C και στους 32 C, ενώ συμβαίνει το αντίθετο στους 22 C (Εικόνα 5.3-2). 178 Εικόνα 5.3-3: Οντογένεση των πτερυγιοφόρων του εδρικού πτερυγίου σε σχέση με το τυπικό μήκος σώματος αναπτυσσόμενων zebrafish υπό διαφορετικές θερμοκρασιακές συνθήκες (22, 28 και 32 C), από την 1 η dpf μέχρι 14 mm SL. Ο αριθμός των πτερυγιοφόρων του ραχιαίου πτερυγίου στους 22 C φτάνει τα δέκα, ενώ στους 28 και 32 C φτάνει τα εννιά. Ο αριθμός των μεριστικών στοιχείων καθορίζεται από το ρυθμό ανάπτυξης και οι μεγαλύτερης διάρκειας αναπτυξιακές περίοδοι καταλήγουν στην παραγωγή μεγαλύτερου αριθμού επαναλαμβανόμενων δομικών στοιχείων (Barlow 1961, Costa et al. 2003). Οι Murray & Beacham (1989) επιβεβαιώνουν την παραπάνω θέση, υποστηρίζοντας ότι οι χαμηλές θερμοκρασίες ανάπτυξης έχουν σαν αποτέλεσμα την παραγωγή μεγαλύτερου

181 αριθμού επαναλαμβανόμενων δομικών στοιχείων στους μεριστικούς χαρακτήρες. Η επιτάχυνση της ανάπτυξης έχει βρεθεί ότι μειώνει τον αριθμό των λεπιών και ο μηχανισμός που συνδέεται με αυτή την αριθμητική διαφοροποίηση σχετίζεται με το φαινόμενο του ετεροχρονισμού (μετατόπιση του σχετικού χρόνου σχηματισμού των λεπιών) (Levin 2011). Στο zebrafish, η πρώιμη ανάπτυξη στους 22C, έναντι των 25, 28 και 31 C οδήγησε σε μεγαλύτερο αριθμό σπονδύλων και ακτίνων του ραχιαίου και του εδρικού πτερυγίου (Sfakianakis et al. 2011). Αυτό βρίσκει ισχύ και στην παρούσα εργασία, κατά την εξέταση του αριθμού των πτερυγιοφόρων του ραχιαίου πτερυγίου, ο οποίος σε αρκετά από τα εξεταζόμενα άτομα των 22 C φτάνει τα δέκα (10) πτερυγιοφόρα, ενώ στους 28 και στους 32 C φτάνει τα εννιά (9) (Εικόνα 5.3-3). Εξαίρεση αποτελεί ένα άτομο των 28 C στο οποίο καταμετρήθηκαν δέκα πτερυγιοφόρα. Σύμφωνα με τον Pavlov (2007), η θερμοκρασία ανάπτυξης επηρεάζει περισσότερο από οποιονδήποτε άλλον παράγοντα τη διάρκεια της ανάπτυξης. Κατ επέκταση επηρεάζει σημαντικά το ρυθμό αύξησης και διαφοροποίησης και αποτελεί βασικό παράγοντα ελέγχου της οντογενετικής και φαινοτυπικής πλαστικότητας τροποποιώντας το σωματικό μέγεθος όπου επιτελούνται τα διάφορα αναπτυξιακά γεγονότα (Fuiman et al. 1998; Koumoundouros et al. 2001, Georgakopoulou et al. 2007). Η επίδραση της θερμοκρασίας κατά την πρώιμη ανάπτυξη στην οντογένεση των μεριστικών χαρακτήρων, έχει μελετηθεί και στο παρελθόν, διαπιστώνοντας σχετική ποικιλομορφία (ενδεικτικά, Georgakopoulou et al. 2007, Parichy et al. 2009, Sfakianakis et al. 2011). Η αναλυτικότατη εργασία των Parichy et al. (2009) στο zebrafish, που αφορά μεταξύ άλλων την οντογένεση διάφορων χαρακτήρων σε σχέση με τη θερμοκρασία ανάπτυξης και την πυκνότητα των πληθυσμών, επιβεβαίωσε ότι η σχέση μεγέθους και ανάπτυξης / διαφοροποίησης ποικίλει σε συνάρτηση με τη θερμοκρασία και το ρυθμό αύξησης, κυρίως στους χαρακτήρες που εμφανίζονται αργότερα κατά την οντογένεση. Είδαν μάλιστα ότι στις υψηλότερες θερμοκρασίες ανάπτυξης (33 C έναντι 24 και 28,5 C) πέραν του ότι οι εξεταζόμενοι χαρακτήρες εμφανίζονταν σε μεγαλύτερο μήκος σώματος (π.χ. η εμφάνιση των κοιλιακών πτερυγίων), εμφανίζονται και σε μεγαλύτερο εύρος μήκους σώματος. Ισχύει ότι στους 32 C, και κυρίως στους χαρακτήρες που εμφανίζονται αργότερα κατά την ανάπτυξη, το εύρος του μήκους του σώματος στο οποίο ολοκληρώνεται η ανάπτυξη ή η οστεοποίηση του εκάστοτε εξεταζόμνου χαρακτήρα, είναι μεγαλύτερο (Πίνακας 18, 4.1.3). Από προσωπικές παρατηρήσεις κατά τη διεξαγωγή των πειραμάτων, το μέγεθος (μήκος σώματος) των ατόμων που αναπτύσσονται σε υψηλότερες θερμοκρασίες, ποικίλλει πολύ περισσότερο συγκρινόμενο με το μήκος σώματος των ατόμων που αναπτύσσονται σε ψυχρότερες θερμοκρασιακές συνθήκες. Ενδεικτικό αποτελεί ότι στο τέλος της εφαρμογής των διαφορετικών θερμοκρασιακών συνθηκών της παρούσας μελέτης, το ολικό μήκος σώματος των ψαριών που αναπτύχθηκαν στους 28 και 32 C κυμαινόταν εντός ενός πολύ μεγαλύτερου εύρους τιμών, σε σχέση με αυτό των ατόμων που αναπτύχθηκαν στους 22 C (βλ. Πινακα 1, ). Κατά τον Parichy et al. (2009), η ανάπτυξη σε δυσμενείς συνθήκες προκαλεί αύξηση της ποικιλίας στο μέγεθος των νυμφών, αφού μικρές διαφορές στην αρχή της ανάπτυξης έχουν σαν αποτέλεσμα οι μεγαλύτερες νύμφες να διεκδικούν για παράδειγμα αποτελεσματικότερα την τροφή, αυξάνοντας παραπέρα τις ήδη υπάρχουσες διαφοροποιήσεις στο μέγεθος. Ίσως η ανάπτυξη στους 32 C να ευνοεί τέτοια φαινόμενα. 179

182 5.4. Επίδραση της πυκνότητας και της θερμοκρασίας κατά την ανάπτυξη, στο σχήμα του σώματος νυμφών και ενήλικων zebrafish και έλεγχος της πιθανής αθροιστική δράσης της θερμοκρασίας στο σχήμα του σώματος των ενήλικων zebrafish Η μορφολογία των οργανισμών αλλάζει στο πέρασμα του εξελικτικού χρόνου κυρίως μέσω μεταβολών στο σχήμα και στο σχετικό μέγεθος ήδη υπάρχουσων δομών και όχι μέσω της εμφάνισης νέων (Garland & Rose 2009). Τέτοιες αλλαγές υπόκεινται στη διαδικασία της φυσικής επιλογής, παράγοντας τελικά εναλλακτικούς φαινότυπους. Στο κλασσικό πια έργο του D Arcy Thompson «Ανάπτυξη και μορφή στο φυσικό κόσμο» (Of growth and form, 1917), η ποικιλομορφία στο σχήμα του σώματος αποδώθηκε σε «παραμορφώσεις» στις διαστάσεις και στο σχετικό μέγεθος των σωματικών μερών. Σύμφωνα με τον ίδιο συγγραφέα, τη μορφή ενός αντικειμένου την ορίζουμε όταν γνωρίζουμε το πραγματικό ή σχετικό μέγεθός του και τις διάφορες διαστάσεις του στο χώρο (D Arcy Thompson, 1917). Τα παραπάνω σχετίζεται και με άλλη μία διάσταση, αυτή του «χρόνου» (D Arcy Thompson, 1917), αφού το χρονικό διάστημα που διαρκεί η ανάπτυξη ενός οργανισμού, συνοδεύεται από μεταβολές στο σχήμα του σώματός του. Ό,τι επηρεάζει την ανάπτυξη ενός οργανισμού, επηρεάζει και το παραγόμενο σχήμα σώματος. Η ανάλυση του σχήματος και των μεταβολών αυτού, παίζει σημαντικό ρόλο σε διάφορες βιολογικές μελέτες. Πλήθος βιολογικών διαδικασιών (όπως είναι η προσαρμογές σε τοπικούς γεωγραφικούς παράγοντες) είναι δυνατό να προκαλέσουν ποικίλες διαφορές μεταξύ των ατόμων ή / και των δομών τους, έτσι ώστε διαφορές στο σχήμα μπορεί να υποδηλώνουν διαφορετικούς λειτουργικούς ρόλους ίδιων δομών, αλλά και διαφορετικές διαδικασίες ανάπτυξης ή μορφογένεσης. Η φαινοτυπική πλαστικότητα, είναι μια αναπτυξιακή διαδικασία-αιτιατό της παραγόμενης ποικιλομορφίας και άρα της εξελικτικής διαδικασίας, μέσω της φυσική επιλογής. Ο ίδιος ο αναπτυξιακός χρόνος υπόκειται στη διαδικασία της φυσικής επιλογής. Η ανάλυση του σχήματος και η ποσοτικοποίηση της μορφολογικής ποικιλομορφίας (Bookstein 1991, Zelditch et al. 2004), αποτελεί ένα διαφορετικό τρόπο προσέγγισης για την κατανόηση της φύσης και των αιτιών που τη συνοδεύουν. Ενώ όμως φυλογενετικά μπορούμε πολλές φορές να επεξηγήσουμε τη «διαδρομη» των μορφολογικών διακυμάνσεων, οι οντογενετικές αλλαγές που τις παράγουν είναι δύσκολο να προσδιοριστούν (Garland & Rose 2009, Chapter 15). Ένας τρόπος ελέγχου του τρόπου δράσης των περιβαλλοντικών παραγόντων στην πλαστικότητα του ψαριών είναι η ανάλυση του σχήματος του σώματος. Στην παρούσα μελέτη, για την ανάλυση του σχήματος του σώματος των zebrafish, χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος της γεωμετρικής μορφομετρίας, στην οποία οι διαφορές στο σχήμα παρουσιάζονται ως πλέγματα παραμόρφωσης (deformation grids / splines), όπου η μέση στερεοδιαμόρφωση παραμορφώνεται ή στρεβλώνεται σε μια άλλη (σε σχέση με ένα σχήμα αναφοράς), με τη χρήση του αλγόριθμου thin plate spline (Rohlf and Slice 1990, Rohlf 1996, Loy et al. 1998). Η μέθοδος της γεωμετρικής μορφομετρίας αποτελεί κλάδο της μαθηματικής ανάλυσης των σχημάτων και θεωρείται ως ένα από τα πιο δυναμικά εργαλεία που αφορούν στην ανάλυση του σχήματος, τόσο γιατί καθίστατι δυνατή η οπτική απεικόνιση και η σύγκριση των διαφορών σχήματος μέσω των πλεγμάτων παραμόρφωσης, όσο γιατί η γεωμετρική πληροφορία που λαμβάνεται κατά την ανάλυση ενός σχήματος με αυτή τη μέθοδο, είναι ανεξάρτητη των διαφορών λόγω θέσης, μεγέθους και περιστροφής. Στη γεωμετρική μορφομετρία, το σχήμα ορίζεται ως η γεωμετρική πληροφορία που απομένει, όταν από ένα αντικείμενο εξαλειφθεί η επίδραση της θέσης, του προσανατολισμού και του μεγέθους (Kendall 1977). Στην παρούσα εργασία, εξετάστηκαν διαφοροποιήσεις στο σχήμα 180

183 του σώματος των zebrafish στο πείραμα επίδρασης της πυκνότητας και στο κυρίως πείραμα επίδρασης της θερμοκρασίας ανάπτυξης (22, 28, 32 C). Σε σχέση με το πείραμα επίδρασης της πυκνότητας στο σχήμα του σώματος, έχουμε τα ακόλουθα: Στο πρώτο πείραμα πυκνοτήτων ( ) ελέγχθηκε η επίδραση της πυκνότητας κατά τη διάρκεια του νυμφικού σταδίου (από την κατανάλωση λεκιθικών αποθεμάτων, μέχρι 10 mm SL) στο σχήμα του σώματος των ενήλικων zebrafish. H ανάλυση γεωμετρικής μορφομετρίας έδειξε ότι η CV1 διαχώρησε πλήρως τα άτομα με βάση το φύλο τους, ενώ κατα μήκος της CV2 ομαδοποιήθηκαν τα αρσενικά και τα θηλυκά zebrafish της χαμηλής πυκνότητας μεταξύ τους, διαχωριζόμενα πλήρως από αυτά της υψηλής ( 4.3.3). Στο δεύτερο πείραμα (70-140) ελέγχθηκε η επίδραση της πυκνότητας από μήκος σώματος SL 8mm και μετά. Η CV1 διαχώρησε πλήρως τα άτομα με βάση το φύλο τους, ενώ κατά μήκος της CV2 τα αρσενικά και τα θηλυκά zebrafish της χαμηλής πυκνότητας ομαδοποιήθηκαν μεταξύ τους και διαχωρίστηκαν πλήρως από τα άτομα της υψηλής πυκνότητας ( 4.3.3). Σε κάθε περίπτωση ανάλυσης θηλυκών και αρσενικών ατόμων μαζί, τόσο στο πείραμα των πυκνοτήτων, όσο και στο πείραμα επίδρασης της θερμοκρασίας, η πρώτη κανονική μεταβλητη (CV1) διαχώρισε τα αρσενικά από τα θηλυκά άτομα, γεγονός το οποίτο οφείλεται στις έντονες μορφολογικές διαφορές των δύο φύλων. Αυτές αφορούν στο σφαιρικότερο σχήμα των θηλυκών ατόμων σε σχέση με τα τορπιλοειδούς σχήματος αρσενικά zebrafish (Eaton & Farley 1974, Georga & Koumoundouros 2010). Ανατομικά, με βάση τα αποτελέσματα από τα πλέγματα παραμόρφωσης, οι διαφορές στο σχήμα του σώματος μεταξύ θηλυκών και αρσενικών ατόμων οφείλονται κυρίως σε ανάλογες μετατοπίσεις των κοιλιακών πτερυγίων και του πρόσθιου άκρου του εδρικού πτερυγίου. Τα θηλυκά άτομα φέρουν σαφώς πιο διογκωμένη τη σωματική περιοχή που ορίζεται από τις παραπάνω ανατομικές δομές, ενώ τα αρσενικά έχουν επίμηκες σχήμα το οποιό χαρακτηρίζεται και από ένα συμπιεσμένο νωτιαιοκοιλιακά οπίσθιο σωματικό τμήμα (το τμήμα που αντιστοιχεί στην ουρά). Σε μικρότερο βαθμό φαίνεται ότι συμμετέχουν και τα μορφομετρικά σημεία που αφορούν στο βραγχιακό επικάλυμμα. Έτσι, ο χαρακτήρας της σφαιρικότερης κοιλιακής περιοχής των θηλυκών ατόμων, συνδέεται όχι μόνο με την προς τα κάτω μετατόπιση των κοιλιακών πτερυγίων, αλλά και με το διαφορετικού σχήματος κρανίο, όπως αυτό οριοθετείται από την περιοχή του στόματος και της παρυφής του βραγχιακού επικαλύμματος). Τα αποτελέσματα αυτά έρχονται σε συμφωνία με την εργασία των Georga & Koumoundouros (2010). Παρά την ισχυρή επίδραση του φύλου, κατά μήκος της δεύτερης κανονικής μεταβλητής διαχωρίζονται πλήρως τα άτομα που αναπτύχθηκαν σε χαμηλή πυκνότητα (200) από αυτά της υψηλής πυκνότητας (400). Στο πρώτο πείραμα επίδρασης της πυκνότητας ( ) φαίνεται ότι η διαφοροποίηση του σχήματος του σώματος λόγω της πυκνότητας οφείλεται σε αλλαγές που εντοπίζονται σε όλο τον κορμό, καθώς και την ουρά. Το σχήμα των ατόμων της χαμηλής πυκνότητας φαίνεται περισσότερο πεπλατυσμένο (συμπιεσμένο) νωτιαιο-κοιλιακά αλλά και πιο διευρυμένο προσθιοπίσθια, δύνοντας την εικόνα ενός περισσότερο υδροδυναμικού τορπιλοειδούς σχήματος. Στα άτομα της υψηλής πυκνότητας, τα ορόσημα που αντιστοιχούν στο βραγχιακό επικάλυμμα και τα θωρακικά πτερύγια μετατοπίζονται έτσι ώστε βρίσκονται τελικά πιο απομακρυσμένα μεταξύ τους, δευρύνοντας την περιοχή που οριοθετούν. Θα μπορούσε πιθανά να συσχετιστεί με μια μεγαλύτερη επιφάνεια επαφής των βραγχίων με το νερό, προκειμένου να καθίσταται αποτελεσματική η πρόσληψη του οξυγόνου. Στο δεύτερο πείραμα επίδρασης της πυκνότητας (70-140), από τα πλέγματα παραμόρφωσης, φαίνεται ότι η διαφοροποίηση του σχήματος του σώματος των ατόμων που αναπτύχθηκαν σε χαμηλότερη πυκνότητα είναι πιο διευρυμένο ραχιαιο-κοιλιακά στην περιοχή της κεφαλής και καθόλο το μήκος του κορμού, ενώ προσθιοπίσθια εμφανίζεται πιο συμπιεσμένο. Τα δε άτομα της υψηλότερης πυκνότητας φαίνεται ότι έχουν πιο ανασηκωμένο 181

184 το πρόσθιο άκρο του ραχιαίου πτερυγίου. Μέσω των πτερυγίων γίνεται δυνατό να διαχειριστούν οι ιχθύες τη ροή, προκειμένου να επιτύχουν σταθερότητα κατά τη διεξαγωγή των διάφορων κολυμβητικών κινήσεων είτε ενεργητικά, μέσω μυϊκού ελέγχου, είτε παθητικά, μέσω δομικού ελέγχου (Maia & Wilga 2013). Σε μια προσπάθεια επεξήγησης του μηχανικού υπόβαθρου-υπεύθυνο για την προαναφερθείσα διαφοροποίηση (ανασηκωμένο πρόσθιο άκρο του ραχιαίου πτερυγίου στα άτομα της υψηλής πυκνότητας) θα μπορούσαμε να υποθέσουμε ότι ή αύξηση της αντίστασης στην κολύμβηση σε υψηλές πληθυσμιακές πυκνότητες αντισταθμίζεται μέσω της παραπάνω ανατομικής (δομικής) διαφοροποίησης του πρόσθιου άκρου του ραχιαίου πτερυγίου. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι όπως προκύπτει από την παρατήρηση των πλεγμάτων παραμόρφωσης των δύο πειραμάτων - οι διαφορές που προκύπτουν κατά την επίδραση της πυκνότητας στο νυμφικό στάδιο (πρώτο πείραμα ) είναι εντονότερες από αυτές που προκύπτουν από την επίδραση της πυκνότητας μετά από μήκος σώματος SL 8mm. Επίσης τα άτομα χαμηλής πυκνότητας στο πρώτο πείραμα ( ) εμφάνισαν πιο πλατυσμένο νωτιαιοκοιλιακά σχήμα, σε σχέση με αυτά της υψηλής πυκνότητας, το οποίο έρχεται σε αντίθεση με τη διαφοροποίηση του σχήματος του σώματος των ατόμων χαμηλής πυκνότητας του δεύτερου πειράματος (70-140), τα οποία είναι πιο διευρυμένα νωτιαιοκοιλιακά. Σε σχέση με την επίδραση της θερμοκρασίας στο σχήμα του σώματος, έχουμε τα ακόλουθα: Οι διαφοροποιήσεις στο σχήμα του σώματος στο κυρίως πείραμα επίδρασης της θερμοκρασίας, εξετάστηκαν στο τέλος της εφαρμογής των διαφορετικών θερμοκρασιακών συνθηκών (το οποίο ήταν στις 41dpf για τους 22 C, στις 33dpf για τους 28 C και στις 20dpf για τους 32 C), καθώς και σε ενήλικα αρσενικά και θηλυκά zebrafish στην ηλικία των 265 dpf, δηλαδή πολύ μετά την εφαρμογή των διαφορετικών θερμοκρασιακών συνθηκών. Η ανάλυση γεωμετρικής μορφομετρίας έδειξε ότι η θερμοκρασία ανάπτυξης επέδρασε σημαντικά στο σχήμα του σώματος των νυμφών zebrafish, με τις δύο πρώτες κανονικές μεταβλητές να διαχωρίζουν πλήρως τα άτομα που αναπτύχθηκαν στις τρεις διαφορετικές θερμοκρασιακές συνθήκες (22 C, 28 C και 32 C). Η επίδραση της θερμοκρασίας ήταν σημαντική στη διαφοροποίηση του σχήματος του σώματος των ενήλικων zebrafish Η CV1διαχώρισε τα άτομα με βάση το φύλο τους, ενώ η CV2 διαχώρισε πλήρως τα άτομα που αρχικά αναπτύχθηκαν στους 22 C από τα άτομα των δύο θερμότερων συνθηκών. Από την κατά φύλο ανάλυση της γεωμετρικής μορφομετρίας, προέκυψε ότι η θερμοκρασία ανάπτυξης επέδρασε σημαντικά στο σχήμα του σώματος των ενήλικων αρσενικών και θηλυκών ατόμων, με τους πληθυσμούς να διαχωρίζονται πλήρως μεταξύ τους, ανάλογα με τη θερμοκρασία ανάπτυξης στην οποία είχαν υποβληθεί ( 4.1.4). Το πρόσθιο τμήμα του σώματος των ιχθυδίων που αναπτύχθηκαν στους 22 C, είναι πιο διευρυμένο ραχιαιοκοιλιακα σε σχέση με αυτό των 28 και 32 C, κυρίως σε ό,τι αφορά στο πρόσθιο τμήμα του κορμού, μέχρι την αρχή του εδρικού πτερυγίου. Απο κει και πέρα, εξαιτίας της έντονης πρόσθιας και ραχιαίας μετατόπισης του πρόσθιου άκρου του εδρικού πτερυγίου στα ιχθύδια των 22 C, δίνεται η εικόνα συμπιεσμένων - ραχιαιοκοιλιακά ατόμων στο οπίσθιο τμήμα του κορμού τους. Η περιοχή της κεφαλής των ιχθυδίων που έχουν αναπτυχθεί στους 28 και 32 C, συγκρινόμενα με αυτά των 22 C, φαίνεται να είναι λιγότερο διευρυμένη (δίνεται η εικόνα μιρκότερης κεφαλικής περιοχής), ενώ τα ιχθύδια της θερμότερης συνθήκης φαίνεται ότι έχουν λιγότερο τορπιλοειδές σχήμα σε σχέση με αυτά των 28 C, τα οποια εμφανίζουν πιο συμπιεσμένη προσθιοπίσθια την περιοχή που ορίζεται από την άκρη του ρύγχους μέχρι το βραγχιακό επικάλυμμα. Αφού η ανάπτυξη στους 22 C καθυστερεί σε σχέση με αυτή των ατόμων που αναπτύσσονται σε θερμότερες συνθήκες, η πιο αναπτυγμένη (διευρυμένη) κεφαλική περιοχή μπορεί να δίνει καλύτερες δυνατότητες εύρεσης τροφής και άρα επιβίωσης. Σε μια αρκετά παλιά μελέτη, στο είδος Salmo gairdneri είχε παρατηρηθεί ότι η εκτροφή σε υψηλότερες θερμοκρασακές συνθήκες, είχε σαν αποτέλεσμα 182

185 την ταχύτερη ανάπτυξη των ατόμων, τα οποία όμως έφεραν μικρότερου μεγέθους κεφάλια σε σχέση με τα άτομα που αναπτύχθηκαν σε χαμηλότερες θερμοκρασίες (Martin 1949, Wimberger 1992). Προηγούμενη εργασία σε σχέση με την επίδραση της θερμοκρασίας ανάπτυξης, από την επιβολή μέχρι και τη μεταμόρφωση, σε ιχθύδια zebrafish (Sfakianakis et al. 2011) είχε επίσης διαχωρίσει τα ιχθύδια με βάση τη θερμοκρασία στην οποία αναπτύχθηκαν. Η μελέτη αυτή δεν έχει πραγματοποιηθεί με τη μέθοδο της γεωμετρικής μορφομετρίας και δεν αναφέροναι ακριβείς μορφοανατομικές διαφορές στα άτομα, όμως αναφέρεται ότι η διαφοροποίηση στο σχήμα του σώματος μεταξύ των ατόμων οφειλόταν κυρίως σε διαφοροποιήσεις που αφορούσαν στο ραχιαίο πτερύγιο, το κοιλιακό, καθώς και στις αποστάσεις που ορίζονται μεταξύ ραχιαίου-κοιλιακού και εδρικού-ουραίου πτερυγίου. Τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης συνηγορούν υπέρ της ισχυρής επίδραση της θερμοκρασίας ανάπτυξης στο σχήμα του σώματος των ενήλικων zebrafish. Όπως είδαμε από τα σχετικά πλέγματα παραμόρφωσης, το πρόσθιο τμήμα του σώματος των θηλυκών ατόμων που αναπτύχθηκαν στους 22 C είναι περισσότερο διευρυμένο νωτιαιοκοιλιακά (μέχρι την περιοχή που οριοθετείται από το πρόσθιο τμήμα του εδρικού πτερυγίου), ενώ περισσότερο διευρυμένη εμφανίστηκε και η περιοχη που οριοθετείται από τα ορόσημα του ρύγχους, της κάτω γνάθου και του βραγχιακού επικαλύμματος (πιο διευρυμένη κεφαλική περιοχή). Τα αρσενικά zebrafish των 32 C διαφέρουν ως προς αυτά των 28 C, κυρίως στην περιοχή του κεφαλιού, εμφανίζοντας πιο οξυμένο ρύγχος, ενώ παράλληλα τα ορόσημα που αντιστοιχούν στην κάτω γνάθο και στο κάτω άκρο του βραγχιακού επικαλύμματος βρίσκονται πιο κοντά μεταξύ τους, δίνοντας την εικόνα μικρότερης κεφαλικής περιοχής. Η «μικρότερης επιφάνειας» κεφαλική περιοχή των ατόμων που αναπτύχθηκαν στις θερμότερες συνθήκες βρίσκεται σε μια λογική συνέχεια με τα αποτελέσματα που αφορούν στο σχήμα του σώματος των ιχθυδίων, όπου είδαμε ότι κατά το τέλος της εφαρμογής των διαφορετικών θερμοκρασιακών συνθηκών τα ιχθύδια 22 C χαρακτηρίζονταν από πιο διευρυμένη κεφαλική περιοχή. Τέλος, το ότι τα θηλυκά zebrafish των 32 C φέρουν πιο φουσκωμένη την περιοχή της κοιλιάς σε σχέση με των 28 C μπορεί να σχετίζεται μια πιο αυξημένη γονιμότητα των ατόμων που έχουν αναπτυχθεί στη θερμότερη θερμοκρασιακή συνθήκη, αλλά προφανώς μια τέτοια θεώρηση απαιτεί επιβεβαιωτικά πειραματικά δεδομένα. Τα αρσενικά zebrafish των 28 και 32 C, εμφανίζουν συνολικά πιο επίμηκες και στενόμακρο σχήμα σώματος σε σχέση με αυτό των 22 C. Η θερμοκρασία μεταβάλλει της ιδιότητες του νερού, όπως π.χ. το ιξώδες, επηρεάζοντας εν γένει την κίνηση του ψαριού (Fuiman & Batty 1997, Johnston et al. 1998) το οποίο είναι αλληλένδετο με το σχήμα του σώματός τους. Το περισσότερο τορπιλοειδές σχήμα των αρσενικών ατόμων των δύο θερμότερων συνθηκών, έρχεται σε αντίθεση με τη θεωρία που στηρίζει την ανάπτυξη ενός πιο λεπτού σώματος σε συνθήκες ψυχρότερων θερμοκρασιακών συνθηκών (Fuiman & Batty 1997, Johnson et al. 1998), όπου επειδή τα άτομα συναντούν αυξημένη αντίσταση κατά την κολύμβηση στα πιο πυκνά ψυχρά νερά καταλήγουν να φέρουν ένα πιο υδροδυναμικό σχήμα σώματος. 183

186 184 First Second Replicate T ( C) dpf days TL Replicate / FL (mm) TL / FL (mm) G1 ( d) ,1±0,2 4,2±0, ,0±0,2 5,3±0, ,5±0,2 5,1±0,4 G2( d) ,2±0,5 7,9±1, ,7±0,8 10,2±1, ,8±0,9 9,9±1,2 G (1dpf - 14 mm) TL) ,89±0,78 11,61±0, ,69±0,73 11,73±1, ,81±2,43 13,37±1,69 Εικόνα 5.4-1: Διαγραμματική απεικόνιση του πειραματικού σχεδιασμού που ακολουθήθηκε κατα τη μελέτη του σχήματος του σώματος των zebrafish υπο την επίδραση διαφορετικών θερμοκρασιακών συνθηκών (22, 28, 32 C) σε μία πρώιμη (G1, d) και μία όψιμη (G2, d) οντογενετική περίοδο (Georga & Koumoundouros, 2010) καθώς και για χρονικό διάστημα που περιλαμβάνει τις δύο παραπάνω οντογενετικές περιόδους (G, 1dpf-14 mm TL). Στον πίνακα που παρατίθεται δίνεται το μήκος σώματος (TL, FL) των ατόμων των πειραματικών πληθυσμών, κατά το τέλος της εφαρμογής των διαφορετικών θερμοκρασιακών συνθηκών, το οπίο έλαβε χώρα στις 308 d για το πείραμα G1, στις 560 d για το πείραμα G2 και όταν το ολικό μήκος σώματος των ιχθύων έφτασε τα 14mm TL, για το πείραμα G. Δίνεται επίσης το χρονικό διάστημα στο οποίο οι πειραματικοί πληθυσμοί μπήκαν στις διαφορετικές θερμοκρασιακές συνθήκες, σε dpf, καθώς και οι ημέρες (days) που αφέθηκαν στις διαφορετικές θερμοκρασιακές συνθήκες. Κατά τον έλεγχο της πιθανής αθροιστικής δράσης της θερμοκρασίας ανάπτυξης στο σχήμα του σώματος των ενήλικων zebrafish ( 4.2-Κεφάλαιο Αποτελεσμάτων), συνδυάστηκαν τα σχετικά αποτελέσματα από την εργασία των Georga & Koumoundouros (2010) (Παράρτημα Ι) με τα αποτελέσματα που αφορούν στη μελέτη της επίδρασης της θερμοκρασίας ανάπτυξης στο σχήμα του σώματος των ενήλικων zebrafish, της παρούσας μελέτης. Όπως φαίνεται και στην Εικόνα 5.5-1, η θερμοκρασία ανάπτυξης στην παρούσα μελέτη επέδρασε από την 1 η dpf μέχρι 14 mm SL (G: 1 η dpf-14mm TL), δηλαδή για χρονικό διάστημα που συμπεριλαμβάνει τις δύο υπό εξέταση οντογενετικές περιόδους που μελετώνται στην εργασία των Georga & Koumoundouros (2010): μιας πρώιμης (G1: d) και μιας όψιμης (G1: d) (Εικόνα 5.5-1). Το ερώτημα ήταν αν η επίδραση της θερμοκρασίας για χρονικό διάστημα που περιλαμβάνει τις δύο παραπάνω οντογενετικές περιόδους (G1 και G2), από το στάδιο του αυγού μέχρι και την ολοκλήρωση της μεταμόρφωσης, είναι αθροιστική και οδηγεί στην όξυνση των παρατηρούμενων διαφορών στο σχήμα του σώματος των ενήλικων αρσενικών και θηλυκών zebrafish. Από την συνδυαστική και κατά φύλο ανάλυση της γεωμετρικής

187 μορφομετρίας ( 4.2) στην οποία χρησιμοποιήθηκαν τα zebrafish από τα πειράματα G1, G2 και G (και οι δύο πειραματικές επαναλήψεις από κάθε πείραμα). προέκυψε ότι η οντογενετική περίοδος εντός της οποίας εφαρμόζονται οι διαφορετικές θερμοκρασιακές συνθήκες, πρωτίστως, και δευτερευόντως η θερμοκρασία ανάπτυξης, επέδρασαν σημαντικά στο σχήμα του σώματος των ενήλικων θηλυκών και αρσενικών zebrafish. Στα μεν θηλυκά zebrafish, η CV1 διαφοροποίησε πλήρως τα άτομα που είχαν δεχτεί την αθροιστική δράση της θερμοκρασίας από εκείνα που τη δέχτηκαν κατά τις δύο επιμέρους οντογενετικές περιόδους, ενώ στα αρσενικά, διαχωρίστηκαν πλήρως τα zebrafish που δέχτηκαν την επίδραση της θερμοκρασίας κατά των όψιμη οντογενετική περίοδο, από όλα τα υπόλοιπα. Σε ό,τι αφορά στο σχήμα σώματος των θηλυκών ατόμων, η περιοχή της ουράς στα άτομα της ομάδας G εμφανίζεται πιο στενή και ατρακτοειδής, ενώ η περιοχή της κεφαλής εμφανίζεται περισσότερο δευρυμένη ραχιαιοκοιλιακά. Τα άτομα της ομάδας G1 εμφανίζουν διαφοροποιήσεις στην περιοχή της του κορμού κοιλιάς (πιο συμπιεσμένη κοιλιακή περιοχή) και σε μικρότερο βαθμό στην περιοχή του κεφαλιού, αφού τα ορόσημα που αντιστοιχούν στην άκρη ρύγχους και στο πλησίον του ρύγχους σημείο του οφθαλμού βρίσκονται πιο απομακρυσμένα μεταξύ τους, σε σχέση με τα άτομα των ομάδων G και G2, δίνοντας την εικόνα πιο διευρυμένης κεφαλικής περιοχής. Σε ό,τι αφορά στο σχήμα σώματος των αρσενικών zebrafish, το οπίσθιο τμήμα του κορμού των ατόμων της ομάδας G2 εμφανίζεται περισσότερο διευρυμένο νωτιαιοκοιλιακά, ενώ η κεφαλική περιοχή (οριοθετούμενη από τα ορόσημα του ρύγχους και του βραγχιακού επικαλύμματος) εμφανίζεται περισσότερο συμπιεσμένη κατά μήκος του ίδιου άξονα. Τα άτομα της ομάδας G2 δίνουν την εικόνα ενός περισσότερο «συμπιεσμένου» σχήματος σώματος και προσθιοπίσθια. Τα άτομα της ομάδας που δέχτηκαν την επίδραση της θερμοκρασίας κατά την πρώιμη οντογενετική περίοδο (G1), καταλήγουν να φέρουν ένα περισσότερο τορπιλοειδές σχήμα σώματος σε σχέση με τα άτομα των ομάδων G και G2 που είναι πιο διευρυμένα ραχιαιοκοιλιακά. Και στα αρσενικά και στα θηλυκά zebrafish, κατά μήκος της CV3 διαχωρίζονται τα άτομα των τριών οντογενετικών περιόδων που αναπτύχθηκαν στους 22 C, από αυτά των 28 και 32 C, αν και στα θηλυκά τοποθετούνται οριακά μαζί με τα άτομα των 22 C και αυτά των 28 C της όψιμης οντογενετικής περιόδου (G2). Σε κάθε περίπτωση, τα άτομα των 22 C εμφανίζουν πιο διευρυμένο το τμήμα που οριοθετείται από τα ορόσημα της κεφαλής (άκρη του ρύγχους) και του βραγχιακού επικαλύμματος, σε σχέση με τα άτομα των 28 και 32 C, ενώ το ουραίο τμήμα εμφανίζεται πιο στενό ραχιαιοκοιλιακά. Παρατηρούμε λοιπόν ένα επαναλαμβανόμενο πρότυπο, σύμφωνα με το οποίο οι θερμότερες θερμοκρασιακές συνθήκες, και κυρίως αυτή των 32 C, έχει ως αποτέλεσμα την «παραγωγή» μικρότερης επιφάνειας κεφαλική περιοχή. Τα αποτελέματα από την ανάλυση δενδρογράμματος έδρασαν επιβεβαιωτικά των αναλύσεων γεωμετρικής μορφομετρίας, διαχωρίζοντας τους πειραματικούς πληθυσμούς όχι βάσει της θερμοκρασία ανάπτυξης, αλλά βάσει της οντογενετικής περιόδου εντός των χρονικών ορίων της οποίας εφαρμόζονται οι διαφορετικές θερμοκρασιακές συνθήκες. Και στις τρεις υπό εξέταση οντογενετικές περιόδους, υπήρχαν πληθυσμοί οι οποίοι είχαν αφεθεί στους 28 C καθ όλη τη διάρκεια της ανάπτυξης και εκτροφής τους. Στην ανάλυση της γεωμετρικής μορφομετρίας, αυτοί οι πληθυσμοί δεν ομαδοποιήθηκαν μεταξύ τους, αλλά ομαδοποιηθηκαν με τους πειραματικούς πληθυσμούς των 22 και 32 C που άνηκαν στην ίδια υπό εξέταση οντογενετική περίοδο (G, G1 ή G2) και κατ επέκταση στην ίδια γενιά. Οι μεταξύ των διαφορετικών θερμοκρασιακών συνθηκών ομοιότητες, όταν πρόκειται για τους πειραματικούς πληθυσμούς μιας οντογενετικής περιόδου (G, G1, G2), είναι τόσο ισχυρές ώστε οι πληθυσμοί αυτοί να ομαδοποιούνται μεταξύ τους. Τα άτομα της εκάστοτε πειραματικής ομάδας (G, G1 ή G2) προέρχονταν από κοινό απόθεμα αυγών και άρα φέρουν κοινό γενετικό υπόβαθρο. Το γενονός ότι τα άτομα των 28 C δεν ομαδοποιούνται 185

188 μεταξύ τους, αλλά με αυτά των 22 και 32 C της εκάστοτε υπό εξέταση οντογενετικής περιόδου, τόσο στην ανάλυση γεωμετρικής μορφομετρίας, όσο και στην ανάλυση δενδρογράματος, συνηγορεί υπέρ της επίδρασης του κοινού γενετικού υπόβαθρου των πειραματικών πληθυσμών που ανήκουν στην ίδια γενιά, δηλαδή προέρχονται από κοινό απόθεμα αυγών. Φαίνεται λοιπόν ότι το κοινό γενετικό υπόβαθρο κατεύθυνε την επιγενετική δράση της θερμοκρασίας ανάπτυξης στη διαφοροποίηση του σχήματος του σώματος των ενήλικων zebrafish, καταλήγοντας στην ομαδοποίηση των πληθυσμών ανεξάρτητα από τη θερμοκρασία ανάπτυξης, ανάλογα με το αν άνηκαν στην ομάδα G, G1 ή G2. Από τα παραπάνω, καθίσταται κατανοητό ότι η οντογενετική περίοδος (G, G1, G2) εντός της οποίας εφαρμόστηκαν οι διαφορετικές θερμοκρασιακές συνθήκες (22, 28 και 32 C), και όχι η θερμοκρασία ανάπτυξης καθεαυτή, είναι πρωτίστως υπεύθυνη για την πρόκληση των εκάστοτε διαφοροποιήσεων στο σχήμα του σώματος των ενήλικων zebrafish. Ο πλήρης διαχωρισμός της ομάδας G από τις G1 και G2, συνηγορεί υπέρ μιας αθροιστικής δράσης της θερμοκρασίας ανάπτυξης, σύμφωνα με την οποία το σχήμα των ατόμων που υποβάλλονται στην επίδραση των διαφορετικών θερμοκρασιακών συνθηκών καθόλη τη διάρκεια της ανάπτυξής τους, διαφοροποιείται πλήρως. Σε μια προσπάθεια εξαγωγής ενδεχόμενου κοινού συμπεράσματος σε ό,τι αφορά στην επίδραση της θερμοκρασίας στο σχήμα του σώματος των zebrafish, βλέπουμε τα εξής: Τα αρσενικά και θηλυκά άτομα των 22C, εμφανίζουν κοιλιακή περιοχή διευρυμένη ραχιαιοκοιλιακά σε σχέση με τα άτομα των θερμότερων συνθηκών, που φέρουν σχήμα σώματος περισσότερο επίμηκες. Επίσης η περιοχή που οριοθετείται από το ρύγχος και το το βραγχιακό επικάλυμμα, εμφανίζεται πιο διευρυμένη στα άτομα των 22 C, σε σχέση με τους 28 και 32 C. Οι διαφορές αυτές πρωτο-εντοπίστηκαν στα ιχθύδια της ομάδας G, αμέσως μετά το τέλος της εφαρμογής των διαφορετικών θερμοκρασιακών συνθηκών και - από ότι φαίνεται ενδραιώνονται στα ενήλικα άτομα, ακόμα και όταν η θερμοκρασιακή επίδραση περιορίζεται κατά την πρώιμη ή την όψιμη οντογενετική περίοδο. Γενικά, κατά τη διάρκεια της οντογένεσης, τα ψάρια έχουν διαφορετική απόκριση έναντι της επίδρασης των περιβαλλοντικών παραγόντων και άρα φέρουν διαφορετικού βαθμού πλαστικότητα (Lindsey 1988, Koumoundouros et al. 2002). Η εμβρυϊκή και πρώιμη νυμφική φάση έχει αποδειχεί ότι είναι πιο ευαίσθητες στην θερμοκρασιακή επίδραση για το λαβράκι (Koumoudouros et al. 2002). Τα ψάρια που μπαίνουν αργότερα (σε μεγαλύτερο μήκος σώματος) στο εξώτροφο στάδιο, παρουσιάζουν χαμηλότερου βαθμού πλαστικότητα (Wimberger 1992). Στην παρούσα μελέτη διαπιστώθηκε η αθροιστική δράση της θερμοκρασίας, ενώ υπό την επίδραση της πληθυσμιακής πυκνότητας, οι διαφορές στο σχήμα του σώματος ήταν πιο έντονες κατά την επίδραση στο νυμφικό στάδιο, από ότι σε SL 8mm. Οι περιβαλλοντικές επιδράσεις στω σώμα των ιχθύων έχουν εξεταστεί από πλήθος μελετών (ενδεικτικά, Corti et al. 1996, Day & McPhail 1996, Koumoundouros et al. 2001, Robinson & Parsons 2002, Peres-Neto & Magnan, 2004, Georgakopoulou et al. 2007). Από την εργασία αυτή είδαμε ότι η επίδραση της θερμοκρασίας κατά το νυμφικό στάδιο και κατά το στάδιο του ιχθυδίου, αλλά και η επίδραση της πληθυσμιακής πυκνότητας κατά την ανάπτυξη, αντανακλάται στα ενήλικα άτομα, εδραιώνοντας σωματικές διαφοροποιήσεις που σχετίζονται με την οντογενετική πλαστικότητα που παρουσιάζει το zebrafish. Σε προηγούμενες μελέτες των Georgakopoulou et al. (2007) και των Sfakianakis et al. (2011), είχε δειχθεί ότι η θερμοκρασία ανάπτυξης κατα την εμβρυϊκή και νυμφική περίοδο επηρέασε το σχήμα του σώματος των ιχθυδίων λαβρακιού και zebrafish, αντίστοιχα. Οι διαφορές αυτές, στην περίπτωση του λαβρακιού, εξαλείφθηκαν μετά την εφαρμογή των διαφορετικών θερμοκρασιακών συνθηκών, πριν από την ενηλικίωση των ατόμων, στην περίπτωση του λαβρακιού. Στο zebrafish, η εργασία των Georga & Koumoundouros (2010) αποδεικνύει την εδραίωση των παραγόμενων διαφορών κατά την επίδραση της θερμοκρασίας στην εμβρυϊκή 186

189 και νυμφικά περίοδο, στο σχήμα του σώματος των ενήλικων αρσενικών και θηλυκών ατόμων, ενώ η παρούσα μελέτη διαπιστώνει την αθροιστική επίδραση της θερμοκρασίας και τη σημασία της οντογενετική περιόδου εφαρμογής των εκάστοτε διαφορετικών περιβαλλοντικών συνθηκών, στο τελικό σχήμα του σώματος. Όπως έχει ειπωθεί και στην αρχή αυτής της εργασίας, η πλαστικότητα ενός χαρακτήρα εξαρτάται τόσο από τον εξεταζόμενο χαρακτήρα καθεαυτό, το είδος της εξωγενούς επίδρασης (π.χ. θερμοκρασία, πυκνότητα), αλλά και την περίοδο στην οποία δρα ο εκάστοτε περιβαλλοντικός παράγοντας (Pigliucci 1998, Koumoundouros et al. 2002). Από τα αποτελέσματα της συνδυαστική ανάλυσης, επιβεβαιώνεται η αρχή σύμφωνα με την οποία τα ψάρια έχουν διαφορετική ευαισθησία έναντι στην επίδραση των περιβαλλοντικών συνθηκών, ανάλογα με το αναπτυξιακό στάδιο στο οποίο βρίσκονται (Koumoundouros et al. 2002, Georga & Koumoundouros 2010). Ένα σημαντικό ερώτημα αφορά στην αιτία της δημιουργίας αυτών των διαφοροποιήσεων στο σχήμα του σώματος. Η μελέτη των Johnston et al. (2009), στην πλαστικότητα των μυών έδειξε ότι οι θερμοκρασιακές συνθήκες κατά την εμβρυϊκή ανάπτυξη (από το στάδιο του 1-4 κύτταρα μέχρι και την εκκόλαψη) επέδρασε σημαντικά στην πλαστικότητα των μυών. Το γεγονός αυτό συνηγορεί υπέρ της μεταβολικής-οντογενετικής απόκρισης της πλαστικότητας στο σχήμα του σώματος έναντι της θερμοκρασίας (μεταβολική-οντογενετική/αναπτυξιακή υπόθεση, metabolic-developmental hypothesis, Lindsey 1988, Fuiman et al. 1998, Spicer and Burggren 2003), αφού σε αυτά τα στάδια τα zebrafish δεν κολουμπούν και άρα αποκλείεται η μηχανιστική-λειτουργική αιτιολογία των διαφοροποιήσεων (mechanistic-functional hypothesis, μηχανιστική-λειτουργική απόκριση, Winberger 1993), λόγω αναδιαμόρφωσης των μυών και των οστών, ως αποτέλεσμα διαφορετικής κολυμβητικής απόκρισης στις διαφορετικές θερμοκρασιακές συνθήκες. Δε θα μπορούσε παρ όλα αυτά να αποκλειστεί μια συνδυαστική δράση των παραπάνω εκδοχών στη διαφοροποίηση του σχήματος στην παρούσα εργασία, ενώ η αποδεδειγμένη πλαστικότητα σε επίπεδο μορφολογίας (σχήμα σώματος), καθώς και στους μύες (Johston 2009) είναι υποστηρικτική της μηχανιστικής υπόθεσης, σχετιζόμενη και με την κολυμβητική ικανότητα των αναπτυσσόμενων ιχθύων στα διαφορετικής θερμοκρασίας νερά. Η ανάπτυξη και αναδιαμόρφωση των οστών συνδέεται με την ανάπτυξη και διαφοροποίηση των οστεοβλαστών και χονδροκυττάρων, την ανάπτυξη των μυών που βρίσκονται σε άμεση συνάφεια με τα αναπτυσσόμενα οστά, και φυσικά με την αγγειογένεση. Αλλαγή στο ρυθμό αύξησης και διαφοροποίησης των παραπάνω ιστών και κατ επέκταση των σωματικών δομών και των οργάνων με τα οποία συνδέονται, υποστηρίζουν τη μεταβολική-αναπτυξιακή υπόθεση στην αλλαγή σχήματος. Κατά τη μελέτη του χρονισμού της οντογένεσης στην ανάπτυξη των μεριστικών χαρακτήρων, είδαμε ότι αύξηση της θερμοκρασίας ανάπτυξης προκάλεσε σημαντική μείωση του σωματικού μεγέθους όπου επιτυγχάνονται τα διάφορα αναπτυξιακά γεγονότα ενώ παρατηρήθηκαν και (πιθανά) φαινόμενα ετεροχρονισμού. Για παράδειγμα, η εμφάνιση των κοιλιακών πτερυγίων προηγήθηκε της οστεοποίησης των πτερυγιοφόρων του εδρικού και της οστεοποίησης των επουραίων στους 28 και 32 C, ενώ στους 22 C πρααγματοποιήθηκε μετά. Επίσης, η ολοκλήρωση της ανάπτυξης των πτερυγιοφόρων του εδρικου προηγήθηκε της εμφάνισης του ουρόστυλου στους 28 C και στους 32 C, ενώ συνέβη το αντίθετο στους 22 C. Ρισκάροντας μια πιθανή ερμηνεία, θα λέγαμε οτί στους 22 C «δίνεται» μεγαλύτερη βαση στην ανάπτυξη των δομών που σχετίζονται με το ουραίο πτερύγιο. Ετεροχρονικές μετατοπίσεις στην ανάπτυξη σκελετικών δομών ή στην οστεοποίησή τους, λόγω της επίδρασης εξωτερικών περιβαλλοντικών παραγόντων, μπορεί να συνδέονται με τη διαφοροποίηση του σχήματος του σώματος των αναπτυσσόμενων ιχθύων. Οι Young & Badyaev (2007) σημειώνουν ότι πρώιμη οστεοποίηση μπορεί να έχει σαν αποτέλεσμα τη μείωση της επίδρασης εξωτερικών περιβαλλοντικών 187

190 παραγόντων (επιγενετικών τροποποιήσεων) στην οντογένεση του σκελετού. Υποστηρίζουν ότι τέτοιες ετεροχρονικές μετατοπίσεις στην ανάπτυξη σκελετικών δομών, ως απόκριση στην επίδραση εξωτερικών περιβαλλοντικών παραγόντων, είναι δυνατό να προκαλέσουν αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση που συνοδεύονται από ποικιλία σε επίπεδο μορφολογίας. 188

191 5.5. Επίδραση της θερμοκρασίας ανάπτυξης στο οντογενετικό προφίλ της γονιδιακής έκφρασης και στη γονιδιακή έκφραση των ενήλικων θηλυκών και αρσενικών zebrafish Η γονιδιακή έκφραση αφορά στη λειτουργία των γονιδίων, δηλαδή στην παραγωγή ενός λειτουργικού προϊόντος, στο χώρο και στο χρόνο που «πρέπει». Το προϊόν αυτό είναι κατά βάση οι πρωτεΐνες, αλλά συναντάμε φυσικά και τα μεταφορικά RΝΑs (trnas) ή τα μικρά πυρηνικά RNAs (snrnas). Το πρότυπο της γονιδιακής έκφρασης (gene expression pattern) αφορά στη γονιδιακή έκφραση σε περιοχές του αναπτυξιακού χώρου και χρόνου, όπου το εκάστοτε υπό εξέταση γονίδιο είναι ενεργό (Wolf 2002). Η οντογένεση καθοδηγεί την έκφραση του γονότυπου στο φαινότυπο, υπό την επίδραση του περιβάλλοντος (Beldade et al. 2011). Οι διάφοροι μηχανισμοί που ελέγχουν τη γονιδιακή έκφραση, καθορίζουν εναλλακτικά αναπτυξιακά μονοπάτια γενετικά καθορισμένα κατά την οντογενετική πλαστικότητα. Πρόκειται για μια περίπλοκη διαδικασία, υπό την έννοια του ότι αλλάζει μια ήδη δυναμική κατάσταση (Wolf 2002). Αλλάζει η ίδια η αναπτυξιακή διαδικασία μέσω περιβαλλοντικά ελεγχόμενων αλλαγών στην γονιδιακή συχνότητα και τη δημιουργία εναλλακτικών οντογενετικών μονοπατιών (Young & Badyaev 2007), ή μέσω ετεροχρονισμών που προσφέρουν ευελιξία στην αναπτυξιακή διαδικασία έναντι των περιβαλλοντικών επιδράσεων (Wolf 2002, Young & Badyaev 2007). Οι μοριακοί μηχανισμοί που συνδέονται με την οντογεντική απόκριση έναντι της επίδρασης περιβλλοντικών ερεθισμάτων, εξηγούν την ποικιλομορφία μεταξύ των ατόμων μιας γενεάς, όσο και μεταξύ των διαφορετικών taxa. Ο φαινότυπος συνδέεται με το γονότυπο και η μεταξύ τους σχέση καθορίζεται κατά την οντογένεση υπό την ενορχήστρωση των περιβαλλοντικών ερεθισμάτων. Πολλές φορές η πλαστικότητα έχει εξεταστεί σε επίπεδο ενήλικων φαινοτύπων, όμως η ίδια η οντογένεση αποτελεί πλαστική διαδικασία και αντικείμενο δράσης της Φυσικής Επιλογής. Ο οντογενετικός χρόνος υπόκειται επίσης στη διαδικασία της Φυσικής Επιλογής, μέσω της οποίας μπορεί να προτιμηθεί ένα συγκεκριμένο αναπτυξιακό μονοπάτι, γενετικά καθορισμένο, αλλά διαφοροποιημένο. Το περιβάλλον μπορεί να διαφοροποιήσει τη μορφή των οργανισμών μέσω της οντογενετικής πλαστικότητας, αλλά και «αποκαλύπτοντας» την ήδη υπάρχουσα γενετική ποικιλομορφία που πριν δεν εκφραζόταν. Το πρότυπο της γονιδιακής έκφρασης στην παρούσα εργασία, εξετάστηκε κατά την ανάπτυξη των zebrafish στις τρεις διαφορετικές θερμοκρασιακές συνθήκες (22, 28 και 32 C) του κυρίως πειράματος, προκειμένου να μελετηθεί ο χρονισμός της οντογένεσης σε επίπεδο γονιδιακής έκφρασης. Αν και το φαινόμενο της πλαστικότητας έχει μελετηθεί εκτενώς στα ψαρια, όπως έχει ήδη ειπωθεί, και η γονιδιακή έκφραση σε σχέση με την πλαστικότητα έχει αποτελέσει αντικείμενο διερεύνησης, δεν έχει πραγματοποιηθεί εκτενής μελέτη που να συνδέει το πρότυπο της γονιδιακής έκφρασης με την οντογενετική πλαστικότητα μέσω ετεροχρονικών φαινομένων (ανάλογων όσων παρουσιάζονται για πααράδειγμα σε επίπεδο μεριστικών χαρακτήρων). Η διαφοροποίηση του ρυθμού αύξησης σε σχέση με την ανάπτυξη, υπό την επίδραση εξωγενών περιβαλλοντικών παραγόντων δεν έχει μελετηθεί σε μοριακό επίπεδο. Κυρίως όμως, δεν έχει πραγματοποιηθεί μια τέτοια μελέτη που να σχετίζει τα αποτελέσματα με το οντογενετικό στάδιο των αναπτυσσόμενων ιχθύων και όχι με την ηλικία τους (dpf, dph) όπως συμβαίνει κατά τη μελέτη του οντογενετικού προφίλ της έκφρασης φυλοκαθοριστικών γονιδίων στο zebrafish, κατά την εργασία των Jorgensen et al. (2008). Εχει ήδη ειπωθεί η μέτρηση του οντογενετικού χρόνου, της ηλικίας και ο καθορισμός του οντογενετικού σταδίου, αποτελούν ορόσημα κατά τη μελέτη του ρυθμού ανάπτυξης και διαφοροποίησης, παράγοντες που ήδη εμπεριέχουν τη λειτουργική έννοια του χρόνου στον ορισμό τους και την πρακτική εφαρμογή τους. Θα αναφερθούμε και παρακάτω, σχετικά. 189

192 Ετεροχρονικές μετατοπίσεις στη γονιδιακή έκφραση κατά την οστεοποίηση μπορεί να έχουν ρυθμιστική δράση επί της ανάπτυξης, έναντι της επίδρασης των περιβαλλοντικών διακυμάνσεων, διατηρώντας παράλληλα την ευαισθησία απέναντι στην επίδραση περιβαλλοντικών επιγενετικών τροποποιήσεων (Young & Badyaev 2007). Συνδεόμενη άμεσα με μορφολογικές αναπροσαρμογές, η οστεοποίηση αποτελεί βασικό πεδίο μελέτης επίδρασης επιγενετικών τροποποιήσεων στη σχετική γονιδιακή έκφραση. Οι μορφολογικές αναπροσαρμογές είναι πιθανότερο να προκύψουν μέσω διαφοροποίησης του ήδη υπάρχοντος γενετικού υπόβαθρου μέσω διαφοροποίησης της γονιδιακής έκφρασης παρά μέσω της δημιουργίας νέων γονιδίων ή εξολοκλήρου νέων οντογενετικών μονοπατιών (Young & Badyaev 2007). Λαμβάνοντας υπόψη τα παραπάνω, για την παρούσα μελέτη επιλέχθηκαν κατ αρχήν γονίδια τα οποία σχετίζονται με την ανάπτυξη των οστών (osteoocalcin, mgp). Σε άμεση συνάφεια με την ανάπτυξη του σκελετικού συστήματος βρίσκεται το μυϊκό, οπότε επιλέχθηκαν γονίδια σχετικά με την ανάπτυξη των μυών (myogenin, mstn, tnni2a.3). Άλλωστε, έχοντας ήδη διαπιστωμένη την πλαστικότητα του zebrafish σε επίπεδο μυών, (ενδεικτικά Johnston et al. 2008) κρίθηκε απαραίτητη η διερεύνηση του οντογενετικού προφίλ της έκφρασης γονιδίων σχετικών με την ανάπτυξη του μυϊκού συστήματος, υπό την επίδρση διαφορετικών θερμοκρασιακών συνθηκών. Προκειμένου να αποφευχθεί η επαναληψιμότητα σχετικά με το λόγο επιλογής των γονιδίων και τη λειτουργία τους, αυτός αναλύεται μαζί με τα προκύπτοντα αποτελέσματα στο - παρόν - Κεφάλαιο της Συζήτησης. Ειδικά για για τον έλεγχο της πλαστικότητας στο φυλοκαθορισμό του zebrafish σε μοριακό επίπεδο, επιλέχθηκαν τα ακόλουθα γονίδιδα: ar, cyp19a1a, cyp19a1b, dmrt1, figla, sox9a, bmp15 και gdf9. Τα γονίδια αυτά, πλην του bmp15 και του gdf9, πέραν της σημασίας τους στο φυλοκαθορισμό των ψαριών γενικά, αλλά και του zebrafish ειδικότερα (ενδεικτικά βλ. εργασίες των Chiang et al. 2001, Su et al. 2004, Hofsten & Olsson 2005, Wang et al. 2007, Halm et al. 2008, Jorgensen et al. 2008, Siegfried et al. 2008, Sun et al. 2013, Tzung et al. 2014), επιλέχθηκαν και προκειμένου να πραγματοποιηθεί η σχετική σύγκριση με ανάλογα αποτελέσματα από την εργασία των Jorgensen et al. (2008). Η έκφραση των ar, dmrt1 και sox9a σχετίζεται με το αρρενοποιητικό μονοπάτι, ενώ η έκφραση των cyp19a1a και figla είναι υψηλή στα άτομα που προορίζονται να γίνουν θηλυκά και τα ίδια τα γονίδια χαρακτηρίζονται ως θηλεο-ειδικοί δείκτες (Hofsten & Olsson 2005, Jorgensen et al. 2008, Sun et al. 2013, Tzung et al. 2014). Το cyp19a1a χαρακτηρίζεται ως πρώιμος θηλεο-ειδικός δείκτης του σώματος των αναπτυσσόμενων γονάδων, που προορίζονται να διαφοροποιηθούν σε ωοθήκες (Wang et al. 2007, Siegfried et al. 2008). Εκφράζεται σε υψηλά ποσοστά στις αναπτυσσόμενες ωοθήκες, πριν απο τη μορφολογική τους διαφοροποίηση. Το cyp19a1b εκφράζεται στον εγκέφαλο και συμβάλλει στη ρύθμιση των οιστρογόνων, έχοντας πιθανό ρόλο στη διαφοροποίηση του φύλου (Chiang et al. 2001, Hofsten & Olsson 2005). Όπως είδαμε στο κεφάλαιο των Αποτελεσμάτων, τα εξεταζόμενα γονίδια διαχωρίστηκαν σε τρεις ομάδες, ανάλογα με το οντογενετικό προφίλ έκφρασης που εμφάνισαν. Στην ομάδα (Α) τοποθετήθηκαν τα γονίδια των οποίων η έκφραση εμφανίστηκε ανεξάρτητη από το μήκος σώματος των ιχθύων κατά τη διάρκεια της εξεταζόμενης οντογενετικής περιόδου, και στις τρεις θερμοκρασιακές συνθήκες (π.χ. cyp19a1b). Στην ομάδα (Β1) εντάχθηκαν τα γονίδια των οποίων η έκφραση εξαρτήθηκε από το μήκος σώματος των αναπτυσσόμενων ιχθύων και στις τρεις θερμοκρασιακές συνθήκες (22, 28 και 32 C), με τον ίδιο (π.χ. osteocalcin) ή με διαφορετικό τρόπο (π.χ. sox9a) και στην ομάδα Β2 εντάχθηκαν τα γονίδια των οποίων η έκφραση εξαρτήθηκε από το μήκος σώματος σε μία τουλάχιστον από τις πειραματικές συνθήκες (π.χ. igf1). Η έκφραση των γονιδίων cyp19a1b, dnmt3 και mstn είναι ανεξάρτητη του μήκους σώματος των αναπτυσσόμενων ιχθύων, ενώ στατιστικά σημαντική διαφορά στη μέση τιμή 190

193 έκφρασης παρατηρήθηκε μόνο στην έκφραση του cyp19a1b, αφού η έκφρασή του στους 22 C ήταν σημαντικά υψηλότερη από ότι στους 28 C (Mann-Whitney U test, p<0,05). Τo γονίδιο cyp19 κωδικοποιεί το ένζυμο αρωματάση (κυτόχρωμα p450 της αρωματάσης), υπεύθυνο για την μετατροπή των ανδρογόνων σε οιστρογόνα και η ρύθμισή του καθορίζει την αναλογία ανδρογόνων προς οιστρογόνα (Simpson et al. 1994). Το γονίδιο της αρωματάσης είναι διπλασιασμένο στα ψάρια (με μοναδική εξαίρεση τα χέλια) τα οποία το φέρουν σε δύο ισομορφές: την cyp19a1a (εκφραζόμενη κυρίως στις γονάδες) και τη cyp19a1b (εκφραζόμενη κυρίως στον εγκέφαλο) (Chiang et al. 2001, Cheshenko et al. 2008). Στη μελέτη μας, η έκφραση του cyp19a1a μειωνόταν σε σχέση με την ανάπτυξη και στις τρεις θερμοκρασιακές συνθήκες, χωρίς όμως να παρατηρηθούν στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ αυτών (ANCOVA, p>0,01), ενώ - όπως ειπώθηκε στην προηγούμενη παράγραφο - η έκφραση του cyp19a1b ήταν ανεξάρτητη του μήκους του σώματος στις τρεις θερμοκρασιακές συνθήκες, και σημαντικά υψηλότερη στους 22 C σε σχέση με τους 28 C (Mann-Whitney U test, p<0,05). Επειδή τα δύο γονίδια βρίσκονται σε στενή συσχέτιση μεταξύ τους, αναφέρονται μαζί στην παρούσα συζήτηση, παρά το ότι παρουσίασαν άλλο πρότυπο έκφρασης. Οι δύο ισομορφές του cyp19 κωδικοποιούν δύο διαφορετικές δομικά πρωτεΐνες, την p450aroma και p450aromb, οι οποίες εκφράζονται αντίστοιχα στις γονάδες και στον εγκέφαλο (Piferrer & Blaquez 2005). Το cyp19a1a χαρακτηρίζεται ως πρώιμος θηλεο-ειδικός δείκτης του σώματος των αναπτυσσόμενων γονάδων, που προορίζονται να διαφοροποιηθούν σε ωοθήκες και εκφράζεται σε υψηλά ποσοστά στις αναπτυσσόμενες ωοθήκες, πριν απο τη μορφολογική τους διαφοροποίηση (Wang et al. 2007, Siegfried et al. 2008). Το cyp19a1b δρα έμμεσα μέσω υποθαλάμου-υπόφυσης και συμβάλλει στη ρύθμιση των οιστρογόνων, έχοντας πιθανό ρόλο στη διαφοροποίηση του φύλου (Chiang et al. 2001, Hofsten & Olsson 2005, Kallivretaki et al. 2007). Οι Trant et al. (2001) κατά τη μελέτη της έκφρασης των μεταγράφων των δύο ισομορφών του cyp19a1a από την 0-41dpf, εντόπισαν την αρχή της έκφρασης των cyp19a1a και cyp19a1b, στις 3 και 4 dpf, αντίστοιχα, ενώ στις 5 dpf, εντοπίστηκε το μέγιστο επίπεδο έκφρασης και για τις δύο ισομορφές. Στις 13 dpf και στις 25 dpf παρατηρήθηκαν μικρότερες κορυφές στην έκφραση, ενά μεταξύ dpf παρατηρήθηκε αύξηση της έκφρασης στις νύμφες που θεωρητικά θα αναπτυσσονταν ως θηλυκές λόγω της υψηλής έκφρασης του εν λόγω γονιδίου. Στην εργασία αυτή, οι ερευνητές διαπίστωσαν ποικιλία στο επίπεδο έκφρασης των δύο ισομορφών κατά τη διάρκεια της οντογένεσης (0-41dpf), ενώ η έκφραση του cyp19a1b φαίνεται ότι διαχώριζε τα άτομα σε δύο πληθυσμούς, με την υψηλή να αντιστοιχή στις νύμφες που προορίζονταν να γίνουν θηλυκά άτομα και τη χαμηλή στα μελλοντικά αρσενικά, γεγονός που υποδεικνύει τον πιθανό φυλοκαθοριστικό ρόλο του γονιδίου, έστω έναν σημαντικό ρόλο στη διαφοροποίησή του (Trant et al. 2001). Τα δεδομένα από την εργασία των Kallivretaki et al. (2007), δεν επιβεβαίωσαν τη συσχέτιση των επιπέδων έκφρασης cyp19a1b στις νύμφες zebrafish με την ανάπτυξη των ωοθηκών και των όρχεων, αποκόπτωντας την πρώιμη υψηλή έκφραση της εγκεφαλικής μορφής του cyp19a από τη διαδικασία του φυλοκαθορισμού, γεγονός το οποίο συμφωνεί με την παρούσα μελέτη. Οι Jorgensen et al. (2008) κατά την εξαγωγή του οντογενετικού προφίλ της έκφρασης των φυλοκαθοριστικών γονιδίων, από την 1 η -40 η dph, διαχώρισαν τις αναπτυσσόμενες νύμφες με βάση το αν είχαν αυξημένη έκφραση των θηλεοειδικών (fig alpha και cyp19a1a) ή των αρρενο-ειδικών γονιδίων (ar, sox9a και dmrt1). Στην εισαγωγή της εργασίας τους, δεν συμπεριέλαβαν σε αυτό το διαχωρισμό το γονίδιο cyp19a1b ως θηλεο-ειδικό ή αρρενο-ειδικό, όπως έκαναν με τα υπόλοιπα (ar, sox9a, dmrt1, fig alpha και cyp19a1a). Στα άτομα στα οποία η έκφραση των θηλεο-ειδικών εμφανιζόταν υψηλή, η έκφραση του cyp19a1a εμφάνισε δύο κορυφές, μία κατά την 18 η και μία κατά την 30 η dph, ενώ στο ίδιο γκρουπ η έκφραση του cyp19a1b εμφάνισε μία κορυφή κατά την 14dph (Jorgensen et al. 2008). Το πρότυπο έκφρασης του cyp19a1b στη μελέτη των Trant et al. 191

194 2001 δε συμφωνεί με αυτό των Jorgensen et al. (2008), με εξαίρεση ίσως την κορυφή που διαπιστώνουν οι δεύτεροι στις 13 dpf. Ας σημειωθεί ότι στη μελέτη των Trant et al. (2001) ο οντογενετικός χρόνος μετράται σε dph, ενώ στη μελέτη των Jorgensen et al. (2008) σε dpf, ενώ κατά τη σύγκριση των αποτελεσμάτων οι Jorgensen et al. (2008) θέτουν 2.5 dpf = 0 dph. Έχονας ήδη αναφέρει τις διαφορές στο χρόνο εκκόλαψης των zebrafish (και των ιχθύων γενικότερα) ανάλογα με τις περιβαλλοντικές συνθήκες, αλλά και την ποικιλία στο μήκος σώματος και άρα στο οντογενετικό στάδιο κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης, όταν αυτή προσδιορίζεται χρονικά σε dpf ή dph, η σύγκριση των αποτελεσμάτων μεταξύ τους καθίσταται εν μέρει επισφαλής. Στη δική μας μελέτη δεν παρατηρείται κάποια κορύφωση στην έκφραση του cyp19a1b κατά την εξεταζόμενη οντογενετική περίοδο, σε καμία από τις τρεις θεμοκρασιακές συνθήκες. Παράλληλα, η έκφραση του εν λόγω γονιδίου είναι ανεξάρτητη του μήκους του σώματος των ατόμων και άρα σταθερή καθόλη τη διάρκεια της ανάπτυξης. Στο πείραμά μας είδαμε ότι οι 22 C αποτελούν αρρενοποιητική θερμοκρασία για το zebrafish, ενώ η έκφραση του cyp19a1b ήταν σημαντικά χαμηλότερη στους 32 C σε σχέση με τις δύο ψυχρότερες θερμοκρασιακές συνθήκες. Σε είδη ψαριών, όπως η πέστροφα, η έκφραση του cyp19a1b έχει βρεθεί σε υψηλότερα επίπεδα στον εγκέφαλο των αρσενικών ατόμων από ότι στα θηλυκά, κατα την περίοδο διαφοροποίησης του φύλου (Vizziano-Cantonnet et al. 2011), το οποίο αν ίσχυε και στην περίπτωση της παρούσας μελέτης θα έπρεπε να είχαμε υψηλή έκφραση του cyp19a1b στους 22 C, γεγονός που προφανώς δεν ισχύει. Η ρέγγα, Odontesthes bonariensis, παρουσιάζει θερμοεξαρτώμενο φυλοκαθορισμό με τις οι χαμηλές θερμοκρασίες ανάπτυξης (15-19 C έναντι 29C ) να μετατοπίζουν την αναλογία φύλου υπέρ των θηλυκών ατόμων, αντίθετα από ότι συμβαίνει με το zebrafish (Strussmann et al. 1997, Strobl-Mazzulla et al. 2008). Κατά την εκτροφή ατόμων O. bonariensis στους 17 και 29 C, η έκφραση της εγκεφαλικής μορφής της αρωματάσης βρέθηκε σημαντικά υψηλότερη στη θερμοκρασία που ευνοεί την αναλογία φύλου υπέρ των αρσενικών ατόμων, όπως αυτή προσδιορίστηκε κατά τη θερμο-ευαίσθητη φάση της οντογενετικής περιόδου, πριν από τη διαφοροποίηση του φύλου (Strobl-Mazzulla et al. 2008). Ανάλογα λοιπόν με την πέστροφα, έτσι και εδώ η έκφραση του cyp19a1b φαίνεται ότι σχετίζεται με τα αρσενικά άτομα, όμως στη δεύτερη περίπτωση οι αναφερόμενες θερμοκρασίες είναι ακραίες και επηρεάζουν το ρυθμό αύξησης και ανάπτυξης των ατόμων, καθίστωντας τα αποτελέσματα επισφαλή. Στη μελέτη των Trant et al. (2001) και Kallivretaki et al. (2007), όπου παρατηρείται ότι η έκφραση του cyp19a1b σε πειραματικούς πληθυσμούς νυμφών zebrafish εμφανίζει φυλετικό διμορφισμό κατά την οντογένεση (υπό την έννοια του ότι οι νύμφες διαχωρίζονται σε δύο διακριτές ομάδες, χαρακτηριζόμενες από υψηλή ή χαμηλή έκφραση του cyp19a1b) δε διαπιστώνεται η τελική αναλογία φύλου των ατόμων και στη μελέτη των Jorgensen et al. (2008) στο zebrafish, το cyp19a1b δεν χαρακτηρίζεται ως αρρενο-ειδικό ή θηλεο-ειδικό γονίδιο, αν και υποστηρίζεται ότι η έκφρασή του διαφοροποιείται ανάλογα με το φύλο κατά την ανάπτυξη των νυμφών, όχι όμως και στα ενήλικα άτομα. Στην περίπτωσή μας δε βρέθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές στην έκφραση του cyp19a1b στον εγκέφαλο των ενήλικων zebrafish, τόσο κατά τη σύγκριση μεταξύ θηλυκών και αρσενικών zebrafish της ίδιας κάθε φορά θερμοκρασιακής συνθήκης, όσο και μεταξύ των θηλυκών ή των αρσενικών ατόμων των τριών θερμοκρασιακών συνθηκών (Mann-Whitney U test, p>0,05). Σύμφωνα με τους Santos et al. (2008), κατά τη σύγκριση ώριμων ενήλικων ιχθύων, οι διαφοροποιήσεις στην έκφραση γονιδίων που σχετίζονται με τη διαφοροποίηση του φύλου δεν είναι κοινές στον εγκέφαλο, σε σχέση με άλλους ιστούς, γεγονός το οποίο θα μπορούσε να δικαιολογεί την απουσιά στατιστικά σημαντικών διαφορών στην προαναφερόμενη έκφραση του cyp19a1b. Είναι γνωστό από παλιότερες εργασίες ότι το λαβράκι παρουσιάζει θερμοεξαρτώμενο φυλοκαθορισμό. Υψηλές θερμοκρασίες (>17 C) κατά πρώιμα οντογενετικά στάδια, πριν από 192

195 τη διαφοροποίηση και τον καθορισμό των γονάδων (από τη γονιμοποίηση μέχρι τις 60dpf), έχουν σαν αποτέλεσμα τη μετατόπιση της αναλογίας φύλου υπέρ των αρσενικών (Pavlidis et al. 2000, Koumoundouros et al. 2002). Οι Navarro-Martín et al. (2011), απέδειξαν με την εργασία τους ότι η έκθεση σε υψηλή θερμοκρασία αύξησε τα επίπεδα μεθυλίωσης του υποκινητή του γονιδίου cyp19a των θηλυκών ατόμων λαβρακού, υποδεικνύοντας ότι η επαγόμενη από την αύξηση της θερμοκρασίας αρρενοποίηση συνδέεται με τον έλεγχο της γονιδιακής έκφρασης της αρωματάσης μέσω μεθυλίωσης του DNA. Η αυξημένη μεθυλίωση παρατηρείται στις γονάδες και όχι στον εγκέφαλο, ενώ η σχέση μεταξύ μεθυλίωσης και έκφρασης είναι αντίστροφη, έτσι ώστε η μεθυλίωση παρεμποδίζει την έκφραση της αρωματάσης και κατ επέκταση τη μετατροπή των ανδρογόνων σε οιστρογόνα, οπότε επάγεται αρρενοποίηση. Οι Navarro-Martín et al. (2011), υποστηρίζουν ότι η μεθυλίωση του DNA (στον υποκινητή της αρωματάσης) είναι υπεύθυνη για τη χαμηλή έκφραση του cyp19a (της γοναδικής μορφής), κατέχοντας βασικό ρόλο στο μηχανισμό που συνδέει την επίδράση της θερμοκρασίας με την παραγόμενη αναλογία φύλου, σε σπονδυλωτά με TSD. Τα γονίδια dnmt3a και dnmt3b στα θηλαστικά σχετίζονται με τη μεθυλίωση των CpG δινουκλεοτιδίων στο DNA (εκτενή αναφορά στην 2.1) και φαίνεται ότι παίζουν κρίσιμο ρόλο κατά την ανάπτυξη, κυρίως στη διαφοροποίηση των ιστών και μάλιστα κατά τον επιγενετικό επαναπρογραμματισμό των κυττάρων (Hu et al. 2012). To zebrafish φέρει έξι dnmt γονίδια (dnmt3-dnmt8) (Seritrakul & Gross, 2014). Οι Campos et al. (2012) απέδειξαν με την εργασία τους το ρόλο των δύο παραλογων του γονιδίου dnmt3 (dnmt3a και dnmt3b) στον θερμο-εξαρτώμενο επιγενετικό έλεγχο της γονιδιακής έκφρασης κατά την πρώιμη ανάπτυξη του zebrafish. Ακριβώς λόγω της συμμετοχής του γονιδίου αυτού στη de novo μεθυλίωση του DNA και λόγω της αποδεδειγμένης θερμοεξαρτώμενης έκφρασής του κατά την πολύ πρώιμη ανάπτυξη (Campos et al. 2012), σε συνδυασμό με τα αποτελέσματα της εργασίας των Navarro-Martín et al. (2011) σε σχέση με τη μεθυλίωση του υποκινητή του γονιδίου cyp19a, κρίθηκε χρήσιμη η διεξαγωγή του οντογενετικού προφίλ έκφρασης του dnmt3 στην παρούσα μελέτη. Η έκφραση του dnmt3 δεν εμφάνισε στατιστικά σημαντικές διαφορές σε καμία από τις τρεις θερμοκρασιακές συνθήκες του πειράματός μας, οπότε δεν μπορεί να συχετιστεί κανένας πιθανός ρόλος αυτού του γονιδίου με τη μεθυλίωση της γοναδικής μορφής του cyp19a και την προκύπτουσα αναλογία φύλου. Εξάλλου, η έκφραση του cyp19a1a δε διαφοροποιήθηκε μεταξύ των τριών θερμοκρασιακών συνθηκών, παρά μειωνόταν με παρόμοι ρυθμό (ANCOVA, p>0,01) καθόλη τη διάρκεια της ανάπτυξης τόσο στους 22, όσο και στους 28 και 32 C. Η μυοστατίνη είναι ανήκει στην TGF-beta υπεροικογένεια των πρωτεΐνών (εδώ ανήκουν και οι BMPs και GDFs), οι οποίες σχετίζονται μεταξύ τους δομικά και συμμετέχουν στον έλεγχο του πολλαπλασιασμού και της διαφοροποίησης των κυττάρων. Η μυοστατίνη εκκρίνεται από τα κύτταρα των μυών, αποτελώντας αρνητικό ρυθμιστή της αύξησης και της ανάπτυξης των σκελετικών μυών (Kerr et al. 2005, Helterline et al. 2007). Στους Τελεόστεους, όπως και στο zebrafish, έχουν αναγνωριστεί δύο γονίδια μυοστατίνης (mstn), το mstn-1 και mstn-2. Μελέτες του προφίλ έκφρασης των δύο γονιδίων στο zebrafish, είναι εντοπισμένες στα πολύ πρώιμα αναπτυξιακά στάδια, μέχρι και τις 72hpf (Helterline et al. 2007), ή μέχρι και την εκόλλαψη (Vianello et al. 2003), ενώ πριν αναφερθεί η ύπαρξη 2 γονιδίων μυοστατίνης στο zebfrafish, οι Xu et al. (2003) διαπίστωση ασθενή έκφραση αυτής στα πρώιμα αναπτυξιακά στάδια του zebrafish, και ισχυρή στις νύμφες που παρουσίαζαν κολυμβητική δραστηριότητα, στα ιχθύδια και στους σκελετικούς μύες των ενήλικων ατόμων. Οι ίδιοι ερευνητές, κατέληξαν στη μελέτη τους στο ότι η μυοστατίνη παίζει ανασταλτικό ρόλο στην υπερπλαστική ανάπτυξη των μυών του zebrafish, ενώ οι Acosta et al. (2005) υποστήριξαν ότι παίζει αντίστοιχο ρόλο και στην υπερτροφική ανάπτυξη των μυών. Στη μελέτη μας, η έκφραση του γονιδίου mstn εμφανίστηκε μάλλον σταθερή καθόλη τη διάρκεια 193

196 RNA exp. values της ανάπτυξης, παρουσιάζοντας όμως ένα μεγάλο εύρος τιμών έκφρασης, ενώ σε κάποιες περιπτώσεις παρατηρήθηκαν άτομα με μηδενικές τιμές έκφρασης και στις τρεις θερμοκρασιακές συνθήκες. Στα ενήλικα άτομα, η μόνη διαφορά που παρατηρήθηκε ήταν η σημαντικά αυξημένη έκφραση του γονιδίου στους σκελετικούς μύες των ενήλικων αρεσνικών zebrafish, σε σχέση με τα θηλυκά (Mann Whitney U-test, p<0,05, Εικόνα ). Στην κατηγορία όπου η έκφραση των γονιδίων μεταβάλλεται και στις τρεις θερμοκρασιακές συνθήκες, ανήκουν τα γονίδια cyp19a1a, osteocalcin, mgp, tnni2a.3, npy και sox9a (Εικόνα ). Από τα γονίδια αυτά, η έκφραση του cyp19a1a αναλύθηκε παραπάνω, ενώ η έκφραση των γονιδίων osteocalcin και tnni2a.3, κυρίως, αλλά και του mgp, αποτελεί σημαντικό σημείο αναφοράς της παρούσας μελέτης, μια και συνδέονται με την περιβαλλοντικά ελεγχόμενη διαφοροποίηση του ρυθμού αύξησης των ιχθύων, σε σχέση με το ρυθμό διαφοροποίησης, σε μοριακό επίπεδο. Όπως είδαμε, η έκφραση αυτών των γονιδίων αυξάνεται όσο αυξάνεται το μήκος σώματος, ενώ από κάποια φάση της ανάπτυξης και μετά η έκφραση της μεν osteocalcin και της tnni2a.3 συνεχίζει να αυξάνεται, αλλά με χαμηλότερο ρυθμό, της δε mgp ανεξαρτητοποιείται από το μήκος σώματος (plataeu) osteocalcin 16 tnni2a C ( ) 8 22 C ( ) 28 C ( ) 0 28 C ( ) SL (mm) 4 32 C ( ) SL (mm) Εικόνα 5.5-1: Έκφραση της osteocalcin και tnni2a.3 στο zebrafish, κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης και υπό την επίδραση των τριών διαφορετικών συνθηκών (22, 28 kai 32C ) της παρούσας εργασίας. Με κάθετες γραμμές σημειώνεται το οντογενετικό στάδιο όπως αυτό προσδιορίζεται με βάση το μήκος σώματος SL (mm) - των αναπτυσσόμενων ατόμων όπου παρατηρήθηκε αλλαγή του ρυθμού ή του προτύπου έκφρασης των εν λόγω γονιδίων, στις τρεις εφαρμοζόμενες θερμοκρασίες. RNA exp. values, μονάδες έκφρασης RNA. Το μήκος στο οποίο μεταβάλλεται το πρότυπο της έκφρασης του γονιδίου osteocalcin, ισούται με 11,6±0,7mm στους 22 C και με 7,9±0,2mm SL στους 28 C, ενώ στους 32 C η απότομη αύξηση της έκφρασης της osteocalcin στα πολύ πρώιμα αναπτυξιακά στάδια είχε σαν αποτέλεσμα να μην μπορεί να ανιχνευθεί το μήκος στο οποίο μεταβάλλεται το πρότυπο της γονιδιακής έκφρασης (Εικόνα 5.6-1). Η διαφορά στο μέσο μήκος σώματος στο οποίο παρατηρήθηκε η αλλαγή του προτύπου έκφρασης, μεταξύ των 22 και 28 C, αποδείχθηκε στατιστικά σημαντική (t-test, p<0,01). Η έκφρασή του γονιδίου tnni2a.3 κατά την εξεταζόμενη οντογενετική περίοδο, αυξάνεται με την αύξηση του μήκους του σώματος. Σε μήκος σώματος SL 11,2±0,6mm, για τους 22 C, 8,5±0,3mm, για τους 28 C και 7,9±0,2mm, για τους 32 C, ο ρυθμός αύξησης μειώνεται (Εικόνα 5.6-1). Από τον κατά ζεύγη στατιστικό έλεγχο των τιμών που αντιστοιχούν στο μήκος σώματος SL στο οποίο παρατηρείται αλλαγή του ρυθμού αύξησης στην έκφραση της tnni2a.3, μεταξύ των τριών θερμοκρασιακών συνθηκών, προέκυψε ότι οι διαφορές είναι στατιστικά σημαντικές (t-test p<0,01). Έτσι, μείωση της θερμοκρασίας ανάπτυξης, έχει ως αποτέλεσμα την μετατόπιση της αλλαγής του προτύπου της γονιδιακής έκφρασης σε μεγαλύτερο μήκος σώματος (Εικόνα 5.6-1). Η στατιστική σύγκριση των κλίσεων των ευθειών που αναπαριστούν τη γονιδιακή έκφραση μεταξύ των διαφορετικών θερμοκρασιακών συνθηκών (ANCOVA, p<0,05) μετά από την αλλαγή του προτύπου της γονιδιακής έκφρασης, έδειξε στατιστικά σημαντική

197 διαφορά μεταξύ των 22 και 28 C για την osteocalcin και μεταξύ των 22 C και των δύο θερμότερων συνθηκών για την tnni2a.3 (ANCOVA, p<0,05). Αύξηση της θερμοκρασίας ανάπτυξης έχει σαν αποτέλεσμα αύξηση της κλίσης της ευθείας που αντιστοιχεί στην έκφραση της tnni2a.3, δηλαδή αύξηση του ρυθμού μεταβολής της γονιδιακής έκφρασης. Ο ρυθμός αυτός είναι χαμηλότερες στις ψυχρότερες θερμοκρασιακές συνθήκες. Η αλλαγή του προτύπου έκφρασής του γονιδίου mgp παρατηρήθηκε σε μήκος σώματος SL περίπου ίσο με 8,0 mm για όλες τις θερμοκρασιακές συνθήκες (22, 28, 32 C) (t-test, p>0,01), ενώ κατά την πρώτη φάση της ανάπτυξης οι 22 C παρουσίασαν σημαντικά υψηλότερο ρυθμό αύξησης στην έκφραση του mgp σε σχέση με τους 28 και 32 C (ANCOVA, p<0,05). Κατά τη δεύτερη φάση της ανάπτυξης η μέση τιμή έκφρασης των 22 C διαφοροποιήθηκε και πάλι σε σχέση με τον αντίστοιχο ρυθμό των δύο θερμότερων συνθηκών (Kruskal Wallis, p<0,01), εμφανίζοντας υψηλότερη μέση τιμή έκφρασης. Στα πλαίσια του φαινομένου της πλαστικότητας, το περιβάλλον μπορεί να αλλάξει το φαινότυπο των ψαριών, αλλάζοντας το οντογενετικό πρότυπο. Η θερμοκρασία ανάπτυξης επηρεάζει το ρυθμό αύξησης και διαφοροποίησης, μεταβάλλοντας τη μεταξύ τους σχέση, γεγονός που έχει δειχθεί μέσω της μελέτης της ανάπτυξης των μεριστικών χαρακτήρων στο χρονισμό της οντογένεσης, από την παρούσα μελέτη, καθώς και από άλλες (ενδεικτικά, Koumoundouros et al. 2001). Η μετατόπιση του παρατηρούμενου προτύπου της γονιδιακής έκφρασης της osteocalcin και tnni2a.3 σε μεγαλύτερο μήκος σώματος, και άρα σε πιο προχωρημένο στάδιο ανάπτυξης, στις χαμηλότερες θερμοκρασίες, προσδίδει τη δυνατότητα μελέτης της διαφοροποίησης του ρυθμού ανάπυξης σε σχέση με το ρυθμό διαφοροποίησης, σε μοριακό επίπεδο. Φαίνεται ότι η έκφραση των γονιδίων osteocalcin και tnni2a.3, αποτελεί ικανοποιητικό δείκτη για τη μελέτη του χρονισμού της οντογένεσης, σε μοριακό επίπεδο. Ο υδροξυαπατίτης εποτελεί βασικό συστατικό των οστών και σχηματίζεται από ασβέστιο μαζί με φωσφορικά ιόντα (πρωταρχικά ανόργανα υλικά των οστών). Γενικά, τα οστά αποτελούνται από ασβεστοποιημένες πρωτεΐνες που βρίσκονται εξωκυτταρικά και αποτελούν το οστεοειδές. Το οστεοειδές αποτελείται από κολλαγόνο τύπου Ι και γλυκοζαμινογλυκάνες που περιέχουν γλυκοπρωτεΐνες οι οποίες μπορούν να δεσμεύσουν μεγάλες ποσότητες ασβεστίου. Τα άλατα ασβεστίου δίνουν στο οστό την απαραίτητη μηχανική ισχύ. Μια τέτοια πρωτεϊνη η οποία σχετίζεται με τη δέσμευση του ασβεστίου στα Σπονδυλωτά, είναι η οστεοκαλσίνη (η πιο άφθονη μη κολλαγονούχος εξωκυτταρική πρωτεΐνη των οστών). Συντίθεται από τους οστεοβλάστες (οστεοπαραγωγικά κύτταρα που παράγουν τη μεσοκυττάρια ουσία) για αυτο και χαρακτηρίζεται ως δείκτης (marker) αυτών. Χαρακτηρίζεται από την παρουσία γ-καρβοξυγλουταμικού οξέος (Gla) στο οποίο δεσμεύεται ο υδροξυ-απατίτης. Σύμφωνα με τους Gavaia et al. (2006) τα γονίδια osteocalcin και mgp κωδικοποιούν γονίδια σημαντικά για το μεταβολισμό του ασβεστίου και την σκελετική ανάπτυξη. Στο zebrafish, τα mrnas των osteocalcin και mgp εντοπίζονται σε όλους τους ιστούς στους οποίους εναποτίθενται άλατα, τόσο κατά τη διάρκεια της ασβεστοποίησής τους, όσο και μετέπειτα. Στους ιστούς αυτούς συμπεριλαμβάνονται τα οστά και οι ασβεστοποιημένοι χόνδροι των βραγχιακών τόξων (Gavaia et al. 2006). Η αντίδραση καθίζησης μεταξύ του ασβεστίου και του φωσφόρου για να σχηματίστει υδροξυαπατίτης είναι τόσο ευνοϊκή, ώστε θα πρέπει ενεργά να παρεμποδίζεται προκειμένου να αποφευχθεί η ασβεστοποίηση των συνδετικών ιστών, γεγονός το οποίο επιτυγχάνεται μέσω παραγόντων που βρίσκονται στην κυκλοφορία του αίματος. Ένας από αυτούς τους παράγοντες είναι η πρωτεΐνη MGP. Η πρωτεΐνη MGP στο είδος Sparus aurata εκφράζεται σε μεγάλο βαθμό στα οστά και στους χόνδρους και σύμφωνα με τους Pinto et al. (2003) φαίνεται ότι ο ρόλος της είναι η αναστολή της εναπόθεσης αλάτων (inhibitor of mineralization). Αν το παραπάνω ισχύει και για το zebrafish, ο αυξημένος ρυθμός αύξησης της έκφρασης του mgp, καθώς και η 195

198 αυξημένη μέση τιμή έκφρασης του mgp στους 22 C, μπορεί να υποδεικνύει αυξημένη αναστολή της εναπόθεσης αλάτων σε αυτή τη θερμοκρασιακή συνθήκη. Στους τελεόστεους η οστεοκαλσίνη αντιπροσωπεύεται από δύο ισομορφές (οc1, οc2) κωδικοποιούμενες από δύο διαφορετικά γονίδια. Στο zebrafish, η oc2 εκφράζεται από την 7 η dpf και μετά, ενώ η oc1 είναι μητρικής προέλευσης και θεωρείται ότι παίζει ρόλο σε διαδικασίες που πραγματοποιούνται πριν από το σχηματισμό των οστών, αφού είναι ανιχνεύσιμη πριν απο τη διαφοροποίηση των οστεοβλαστών και πριν από τη διαδικασία εναπόθεσης αλάτων ασβεστίου και φωσφόρου στα οστά. Σύμφωνα με τους Cavaco et al. 2014, ο ρόλος της οστεοκαλσίνης στους Τελεόστεους είναι η δέσμευση ιόντων ασβεστίου ή κρυστάλλων υδροξυαπατίτη, συνδεόμενη έτσι άρρηκτα με την ανάπτυξη των οστών. Στο πείραμά μας, η πρώτη δειγματοληψία πραγματοποιήθηκε κατά την εκκόλαψη, η οποία έλαβε χώρα στις 3 dpf για τους 32 C, στις 4 dpf για τους 28 C και στις 5 dpf για τους 22 C. Η δεύτερη δειγματοληψία πραγματοποιήθηκε την ημέρα που οι νύμφες των zebrafish αποκολλήθηκαν από τα τοιχώματα των ενυδρείων και άρχισαν να κολυμπούν ενεργητικά. Τα δείγματα από τα οποία απομονώθηκε ολικό RNA για την ποσοτικοποίηση της έκφρασης των γονιδίων της παρούσας μελέτης, πάρθηκαν όταν το ολικό μήκος σώματος των νυμφών προσδιορίστηκε στα 5-6 mm TL, το οποίο τοποθετείτε χρονικά πέραν της 7 ης pdf. Πέραν του ότι το παραπάνω καθιστά για άλλη μια φορά προβληματικό τον προσδιορισμό των οντογενετικών σταδίων βάσει των ημερών μετά τη γονιμοποίηση, είναι ασφαλές να θεωρήσουμε ότι στην εργασία μας ελέγχθηκε η έκφραση του γονιδίου που κωδικοποιεί την oc2. Από κει και πέρα, το τι μπορεί να σημαίνει ανατομικά και λειτουργικα η μετατόπιση της αλλαγής του προτύπου έκφρασης της οστεοκαλσίνης σε μεγαλύτερα μήκη σώματος, υπό την επίδραση ψυχρότερων θερμοκρασιακών συνθηκών, αποτελεί ένα θέμα που χρήζει διερεύνησης. Αρκεί να θυμηθούμε την εικόνα 5.3-2, όπου δίνεται η διαγραμματική απεικόνιση της ολοκλήρωσης της οντογένεσης των υπό εξέταση μεριστικών χαρακτήρων, στην παρούσα μελέτη. Στα 8 περίπου mm TL, στους 28 C, όπου παρατηρείται η αλλαγή του προτύπου έκφρασης της osteocalcin, έχει ολοκληρωθεί η ανάπτυξη των κοιλιακών πτερυγίων, ενώ στα 11, 5mm TL, που αποτελεί το αντίστοιχο μήκος για τα άτομα των 22 C, έχει ολοκληρωθεί η οντογένεση όλων των εξεταζόμενων μεριστικών χαρακτήρων. Πέραν των παραπάνω μηκών, ο ρυθμός αύξησης της έκφρασης της οστεοκαλσίνης γίνεται πολύ πιο αργός. Οι επιπτώσεις που μπορεί να έχουν τα παραπάνω στο σχηματισμό των οστών, στη δέσμευση των ιόντων ασβεστίου και κατ επέκταση στη μηχανική ισχύ των οστών και τελικά στη φυσιολογική, ανατομική και λειτουργική απόκριση των αναπτυσσόμενων zebrafish, μπορει να είναι πολλές και να σχετίζονται τόσο με τις παρατηρούμενες αλλαγές στο σχήμα του σώματος για παράδειγμα, όσο και με αλλαγές που σχετίζονται με την κολυμβητική δραστηριότητα κοκ. Η καθυστέρηση της αλλαγής του προτύπου έκφρασης της osteocalcin και tnni2a.3 αποτελεί ετεροχρονική μετατόπιση, όπως αυτή ορίστηκε στην Εισαγωγή της παρουσας εργασίας ( 2.3, Εικόνα 2.3-2) αφού αφορά σε μια ομοιόμορφη μετατόπιση της γονιδιακής έκφρασης. Οι παρατηρούμενοι διαφορετικοί ρυθμοί αύξησης των τριών πειραματικών πληθυσμών, σε σχέση με το ρυθμό διαφοροποίησης (οντογένεση μεριστικών χατακτήρων) και σε συνδυασμό με το πρότυπο της γονιδιακής έκφρασης, μπορεί να αποτελούν διαφοροποιημένα θερμο-εξαρτώμενα οντογενετικά μονοπάτια. Η μελέτη της έκφρασης περισσότερων γονιδίων που σχετίζονται με τη σκελετική ανάπτυξη, όπως για παράδειγμα γονιδίων που σχετίζονται με τον πολλαπλασιασμό των οστεοβλαστών (ενδεικτικά calmodulin, Gunter et al. 2014), θα μπορούσε να συσχετίσει τη γονιδιακή έλφραση με την περιβαλλοντικά ελεγχόμενη ετεροχρονική ανάπτυξη και να δώσει απαντήσεις στη δημιουργία των μορφολογικών διαφοροποιήσεων. Το μυϊκό σύστημα των ψαριών αποτελείται από λευκές (γρήγορες) και κόκκινες (αργές) μυϊκές ίνες. Η tnni2a.3 αποτελεί μόριο χαρακτηριστικό των γρήγορων μυϊκών ινών 196

199 και μετάγραφα του γονιδίου ανιχνεύονται από το στάδιο των σωμιτών, μετά τις 16hpf (Fu et al. 2009, Yang et al. 2009). Οι κόκκινες μυϊκές ίνες είναι (ίνες αργής συστολής) έχουν υψηλή συγκέντρωση σε μιτοχόνδρια και είναι πιο αποτελεσματικές στην αερόβια αναπνοή, δηλαδή στη χρησιμοποίηση του οξυγόνουν για την παραγωγή ATP, προσφέροντας αντοχή (Jackson & Ingham, 2013). Οι λευκές μυΐκές ίνες (ίνες ταχείας συστολής) έχουν χαμηλή περιεκτικότητα σε μιτοχόνδρια και επιτελούν αναερόβια αναπνοή (μετατρέπουν το γλυκογόνο σε γαλακτικό οξύ), ενεργοποιούμενες κατά την απότομη και σύντομης διάρκειας (<20 sec) κολύμβηση, ενώ σε χαμηλές εντάσεις άσκησης, κινητοποιούνται οι αργές ίνες (Jackson & Ingham, 2013). Αυτή η απότομη κολύμβηση επιτελείται μέσω αναερόβιων διαδικασιών, επιφέροντας γρήγορα μυϊκό κάματο. Οι μύες παίζουν σημαντικό ρόλο στην κολυμβητική δραστηριότητα, αλλά και στη ρύθμιση της μεταβολικής ομοιόστασης του οργανισμού, ενώ η αναλογία των μυϊκών ινών ποικίλει μεταξύ των ατόμων ενός είδους, αφού οι σκελετικοί μύες εμφανίζουν υψηλού βαθμού φαινοτυπική πλστικότητα, τόσο κατά την ανάπτυξη, όσο και υπό την επίδραση περιβαλλοντικών παραγόντων (McClelland et al. 2006). Η πλαστικότητα των μυών και το αν θα διαφοροποιηθεί ή αερόβια ή η αναερόβια μυϊκή μάζα, εξαρτάται από τον τύπο και τη διάρκεια του παράγοντα πρόκλησης της πλαστικότητας (McClelland et al. 2006). Η θερμοκρασία ανάπτυξης επηρεάζει τη διαφοροποίηση των αργών και γρήγορων μυϊκών ινών (Johnston 2006), ενώ μπορεί να προκαλέσει μόνιμες αλλαγές στον αριθμό τους (Matschak & Stickland 1995, Johnston et al. 1997). Τα ψάρια αντισταθμίζουν την επιβραδυντική επίδραση του μεταβολισμού στις χαμηλές θερμοκρασιακές συνθήκες, με το να αυξάνουν τον αριθμό των μιτοχονδρίων τους (McClelland et al. 2006). Οι θερμοκρασιακές διακυμάνσεις κατά τα πρώιμα (νυμφικά) οντογενετικά στάδια φαίνεται να έχουν σημαντική επίδραση πυκνότητα των λευκών σκελετικών μυϊκών ινών και στο μέγεθος της περιοχής που αυτές καλύπτουν (Stickland et al. 1988, Johnston 2006). Για παράδειγμα, έχει βρεθεί ότι στο λαβράκι, αύξηση της θερμοκρασίας κατά το λεκιθογενετικό στάδιο, αυξάνει τη δυναμική του ρυθμού αύξησης των μυών και μπορεί να προκαλέσει υπερτροφία και υπερπλασία των λευκών μυϊκών ινών (Lopez-Albors et al. 2002). Στο ίδιο είδος, αυξημένες θερμοκρασίες κατά το νυμφικό στάδιο, έχουν σαν αποτέλεσμα να εμφανίζουν τα άτομα μεγαλύτερη μυϊκή μάζα (Johnston et al. 2009). Επιπλέον, έχουν παρατηρηθεί μεταβολές στην πυκνότητα μιτοχονδρίων, στον αριθμό και την πυκνότητα των πυρήνων και στον αριθμό των μελλοντικών μυϊκών δορυφορικών κυττάρων (Johnston et al. 2009). Σύμφωνα με τα παραπάνω, και λαμβάνοντας υπόψη ότι το γονίδιο tnni2a.3 είναι χαρακτηριστικό των λευκών μυϊκών ινών, η αύξηση του ρυθμού μεταβολής (αύξησης) της έκφρασης της tnni2a.3, με την αύξηση της θερμοκρασίας ανάπτυξης, συνδέεται πιθανότατα με αύξηση της μάζας των λευκών μυϊκών ινών. Στα εξώθερμα σπονδυλωτά, έχει παρατηρηθεί ότι η χρόνια έκθεση σε χαμηλές θερμοκρασίες ευνοεί την ανάπτυξη πιο αερόβιων μυϊκών φαινοτύπων, γεγονός το οποίο έχει βρεθεί ότι ισχύει και για το zebrafish (McClelland et al. 2006). Mελέτες που πραγματοποιήθηκαν στο λαβράκι (Koumoundouros et al. 2009), έδειξαν ότι η θερμοκρασία ανάπτυξης έχει έχει σημαντική επίδραση στην κολυμβητική επίδοση των ιχθύων, με τους πληθυσμούς των ψυχρών θερμοκρασιακών συνθηκών να εμφανίζουν υψηλότερη αερόβια κολυμβητική απόδοση, μεγαλύτερο ποσοστό κόκκινων μυϊκών ινών και αυξημένο αριθμό μιτοχονδρίων συγκριτικά με εκείνους των ψυχρότερων θερμοκρασιακών συνθηκών. Ίσως σε υψηλότερες θερμοκρασίες να ευνοείται ο αναερόβιος φαινότυπος, βάσει των αποτελεσμάτων της παρούσας μελέτης. Η ετεροχρονική καθυστέρηση της αλλαγής του ρυθμού μεταβολής της έκφρασης του γονιδίου tnni2a.3 (μετατόπιση σε μεγαλύτερα μήκη σώματος), στις ψυχρότερες θερμοκρασιακές συνθήκες, πιθανότατα συνδυάζεται με την πιο καθυστερημένη ανάπτυξη των μυών σε αυτές τις θερμοκρασίες και ίσως να είναι αποτέλεσμα ενός εναλλακτικού οντογενετικού μονοπατιού, προκλειόμενο από τη θερμοκρασία ανάπτυξης. 197

200 Δεδόμένης της συμμετοχής των λευκών μυϊκών ινών στην απότομη κολύμβηση (burst swimming) η οποία παρατηρείται στα ψάρια κατά τη προσπάθεια αποφυγής κάποιου θηρευτή και γενικά ως αντίδραση σε άξαφνα και έντονα ερεθίσματα (Hammer 1995), γίνεται ίσως κατανοητός ο βαθμός επίδρασης της θερμοκρασίας σε επίπεδο φυσιολογίας, συμπεριφοράς, αλλά και της λειτουργικότητας του οργανισμού εν γένει. Θα ήταν ενδιαφέρουσα η παράλληλη εξέταση της έκφρασης γονιδίων που να σχετίζονται με την ανάπτυξη των κόκκινων μυϊκών ινών. Το αν οι αλλαγές αυτές είναι για παράδειγμα αποτέλεσμα αλλαγών στους μεταβολικούς ρυθμούς, ή της διαφορετικής κολυμβητικής δραστηριότητας που ακολουθούν οι πληθυσμοί, ή εάν οι αλλαγές αυτές συμβάλλουν στη διαφοροποίηση των μεταβολικών ρυθμών ή της κολυμβητικής δραστηριότητας, αποτελεί ερώτημα που πιθανότατα αφορά σε ένα σύστημα επιδράσεων, όπου το κάθε επί μέρος συστατικό αποτελεί αίτιο και αποτέλεσμα ταυτόχρονα, συνδιαμορφώνοντας το προκύπτον εναλλακτικό οντογενετικό πρότυπο και την εγκαθίδρυση των φαινοτυπικών αλλαγών. Η απουσία στατιστικά σημαντικών διαφοροποιήσεων στην έκφραση της tnni2a.3 στους μύες των ενήλικων αρσενικών και θηλυκών πειραματικών zebrafish, μπορεί να οφείλεται στο σχετικά μικρό αριθμό δειγμάτων, ή και στο γεγονός ότι κατά την απομόνωση των μυών πέρναμε ένα τυχαίο δείγμα πλευρικά του κορμού των zebrafish, το οποίο μπορεί να μην παρέχει ικανοποιητική ποσότητα λευκών μυΐκών ινών. Στην κατηγορία όπου η έκφραση των γονιδίων μεταβάλλεται σε σχέση με το μήκος του σώματος και στις τρεις θερμοκρασιακές συνθήκες, ανήκουν τέλος και τα γονίδια npy και sox9a (Εικόνα ). Είδαμε ότι η έκφραση του npy μειώνεται σε σχέση με το μήκος σώματος και στις τρεις θερμοκρασίες ανάπτυξης. Στους 32 C, η έκφραση του npy μειώνεται καθώς προχωράει η ανάπτυξη, ενώ μετά τα 8,0±0,8mm SL σταθεροποιείται, ανεξαρτητοποιούμενη από το μήκος σώματος. Στους 22 C και στους 28 C, η έκφραση του npy μειώνεται καθόλη τη διάρκεια της υπό εξέταση οντογενετικής περιόδους, ενώ η γονιδιακή έκφραση στους 22 C διαπιστώθηκε ότι μειώνεται με μικρότερο ρυθμό, σε σχέση με τους 28 C (ANCOVA, p<0,05). Στα ενήλικα zebrafish δεν επιβεβαιώθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές στην έκφραση του npy, σε κανένα επίπεδο. Η πρωτεΐνη NPY διανέμεται στο περιφερικό και κεντρικό νευρικό σύστημα και και έχει πολλαπλούς φυσιολογικούς ρόλους, μεταξύ των οποίων είναι διέγερση και η ρύθμιση πρόσληψης τροφής (Söderberg et al. 2000, Larson et al. 2003, Yokobori et al. 2012), συνδεόμενη έτσι άμεσα με την αύξηση και ανάπτυξη των ατόμων. Με την εφαρμογή της piece-wise linear regression δεν αποδείχτηκε αλλαγή του προτύπου έκφρασης του npy στους 22 και 28 C,, είτε γιατί αυτό πραγματοποιείται πολύ αργά στους 22 C, είτε λόγω του κενού στον αριθμό δειγμάτων σε μήκη σώματος mm SL, στους 28 C. H παρουσία περισσότερων δειγμάτων σε αυτή την περίπτωση, ίσως έδινε μια πιο σαφή εικόνα για το οντογενετικό προφίλ έκφρασης του npy και τη συμμετοχή του στις θερμο-εξαρτώμενες διαφοροποιήσεις στο ρυθμό αύξησης, ή να αποδείκνυε μια ετεροχρονική μετατόπιση, ανάλογη με αυτή που παρατηρήθηκε στα γονίδια osteocalcin και tnni2a.3. Στο zebrafish έχουν βρεθεί δύο γονίδια sox9, το sox9a και το sox9b (Chiang et al. 2001). Κατά τη διάρκεια της εμβρυογένεσης, το sox9a έχει βρεθεί ότι εκφράζεται στον εγκέφαλο, τα νεφρά, στους μύες, στα θωρακικά πτερύγια και όρχεις των ατόμων, ενώ το sox9b μόνο στην ωοθήκη (Hofsten & Olsson 2005). Η έκφραση του sox9a είναι απαραίτητη για την ανάπτυξη των χονδρογενών οστών (Hofsten & Olsson 2005). Εκφραζόμενο στους όρχεις, το sox9a σχετίζεται με το αρρενοποιητικό μονοπάτι, θεωρείται δε ως γονίδιο το οποίο βρίσκεται στην κορυφή του αρρενοποιητικού μονοπατιού (Jorgensen et al. 2008). Στους 22 και στους 28 C, η έκφραση του sox9a εμφανίζεται ανεξάρτητη του μήκους σώματος αρχικά, ενώ από τα 9,4±1,4mm SL στους 22 C και από τα 7,6±0,6 mm SL στους 28 C και έπειτα, η έκφραση μειώνεται σε σχέση με το μήκος του σώματος. Αυτή η διαφορά στο μήκος του 198

201 NL / SL (mm) σώματος που παρατηρείται η αλλαγή της γονιδιακής έκφρασης, βρέθηκε στατιστικά σημαντική (t-test, p<0,01), επιβεβαιώνοντας ταυτόχρονα και τη μετατόπιση της αλλαγής του προτύπου έκφρασης σε μεγαλύτερα μήκη σώματος στην ψυχρότερη θερμοκρασιακή συνθήκη. Ίσως επειδή η έκφραση του sox9a εμπλέκεται στην ανάπτυξη διάφορων δομών, όπως αναφέρθηκε παραπάνω, να διακιολογεί ένα πρότυπο έκφρασης ανάλογο με αυτό της osteocalcin και tnni2a.3, μια και ανάλογο πρότυπο δεν παρατηρήθηκε σε κανένα άλλο εκ των φυλοκαθοριστικών γονιδίων που μελετήθηκαν από την παρούσα μελέτη. Στους 32 C, η έκφραση του sox9a μειώνεται καθόλη τη διάρκεια της εξεταζόμενης οντογενετικής περιόδου. Το γιατί δεν παρατηρήθηκε αλλαγή στο πρότυπο της έκφρασης του sox9a στους 32 C, όπως συνέβη στους 22 και 28 C, δεν είναι γνωστό, αλλά είναι προφανές ότι το πρότυπο έκφρασης διαφοροποιήθηκε σε αυτή τη θερμοκρασιακή συνθήκη.. Η μέση τιμή έκφρασης του sox9a είναι σημαντικά πιο αυξημένη στην αρρενοποιητική θερμοκρασία των 22 C, από ότι στους 28 C (Mann Whitney U-test, p<0,05), στην πρώτη φάση ανάπτυξης, γεγονός που μπορεί να συνδέεται με την παραγωγή περισσότερων αρσενικών ατόμων σε αυτή τη θερμοκρασιακή συνθήκη. Η έκφραση του sox9a βρέθηκε όπως ήταν αναμενόμενο σημαντικά χαμηλότερη (Mann-Whitney U test, p<0,05) και σχεδόν μηδενική στις γονάδες των θηλυκών ατόμων, σε σχέση με των αρσενικών, και στις τρεις θερμοκρασιακές συνθήκες, γεγονός που συμφωνεί με την υπάρχουσα βιβλιογραφία (Jorgensen et al. 2008). Οι Jorgensen et al. (2008) διαπίστωσαν κορύφωση της έκφρασης του sox9a στα άτομα που φαίνεται ότι είχαν δεσμευτεί στο αρρενοποιητικό μονοπάτι, στις 4, 18 και 22 dph, γεγονός το οποίο δεν παρατηρείται στη δική μας μελέτη. Αυτή η κορύφωση στις 18 dph τοποθετείται χρονικά ακριβώς πριν την έναρξη της απόπτωσης των ωοκυττάρων, η οποία συμβαίνει στις dph (Jorgensen et al. 2008). Οι ίδιοι ερευνητές, θέτουν στην εργασία τους ότι 2.5 dpf = 0 dph, άρα η κορύφωση της έκφρασης του sox9a στις 18dph θα μπορούσε να θεωρηθεί ότι εντοπίζεται χρονικά στις 21 dpf. Εξετάζοντας τις καμπύλες αύξησης που αντιστοιχούν στους τρεις πειραματικούς πληθυσμούς μας (Εικόνα , Πίνακας 14) και λαμβάνοντας υπόψη τη σχέση μεταξύ SL- TL, όπως προέκυψε από τη μέτρηση των σχετικών μηκών στην παρούσα εργασία (Εικόνα 5.5-2), θα λέγαμε ότι η αλλαγή του προτύπου έκφρασης του sox9a στη θερμοκρασιακή συνθήκη των 22 C (9,4±1,4mm SL) αντιστοιχεί στις 22dpf σε περίπου στις, ενώ στους 28 C (7,6±0,6 mm SL) αντιστοιχεί στις 18dpf. Ίσως λοιπόν και η δική μας παρατηρούμενη αλλαγή στο πρότυπο έκφρασης να συμπίπτει χρονικά με την περίοδο πριν από την έναρξη της απόπτωσης των ωοκυττάρων. Παρ όλα αυτά καθίσταται για άλλη μια φορά κατανοητή η σημασία της χρήσης του μήκους σώματος ως προσδιοριστικό των οντογενετικών σταδίων και κατ επέκταση των οντογενετικών γεγονότων T=22 C y = 0,7741x + 0, TL (mm) T=28 C y = 0,8338x + 0, TL (mm) T=32 C y = 0,8371x + 0, TL (mm) Εικόνα 5.5-2: Σχέση μήκους νωτοχορδής (NL)-ολικού μήκους σώματος (TL) ή τυπικού (SL) ολικού μήκους σώματος (TL) των αναπτυσσόμενων νυμφών zebrafish, στις τρεις θερμοκρασίες ανάπτυξης (22, 28, 32 C) του πειράματος. Το μήκος σώματος μετράται σε mm. Ακολουθούν λίγα λόγια για τα γονίδια igf1, myogenin, pescadillο, cryaa, eda, ar, dmrt1, hsd11b2, tp53, bmp15, figla, gdf, των οποίων η έκφραση παραμένει σταθερή σε μία τουλάχιστον θερμοκρασιακή συνθήκη, ενώ σε κάποια άλλη θερμοκρασιακή συνθήκη η

202 γονιδιακή έκφραση μεταβαλλεται (αυξάνεται ή μειώνεται) σε σχέση με το μήκος σώματος. Από αυτά τα γονίδια, τα ar, dmrt1, hsd11b2, tp53, bmp15, figla, gdf σχετίζονται άμεσα ή έμμεσα με τη διαφοροποίηση του φύλου, όπως έχει ήδη ειπωθεί στην αρχή της 5.5. Τα προϊόντα των igfs (igf1 and igf2) αποτελούν ρυθμιστές της αύξησης και της ανάπτυξης των οργανισμών (Maures & Duan 2002, Zou et al. 2009). Η έκφραση του igf1 ενεργοποιείται από τη σωματοτροπίνη (somatotrophin-αυξητική ορμόνη) και προάγει την κυτταροδιαίρεση (Butler & LeRoith 2001, Maures & Duan 2002). Τα γονίδια igf1 και igf2 σχετίζονται με την προγεννητική και μεταγεννητική ανάπτυξη των σκελετικών μυών (Florini et al. 1996, Anusha Amali et al. 2004). Το προϊόν του γονιδίου igf1 σχετίζεται με την αύξηση του μεγέθους του σώματος εξολοκλήρου, και όχι με αυτή του εγκεφάλου, ενώ ο igf2 εκφραζόμενος κατά την πρώιμη ανάπτυξη αυξάνει την κυτταροδιαίρεση στον εγκέφαλο και στο σώμα (McNamara 1997 B). Αλλαγές στο στο χρονισμό ή και στο ρυθμό παραγωγής τέτοιων αυξητικών παραγόντων έχουν σημαντικές επιδράσεις στην εξέλιξη των οργανισμών (McNamara 1997 B). Η έκφραση του igf1 βρέθηκε να αυξάνεται στους 22 C σε σχέση με το μήκος του σώματος, μέχρι αυτό να φτάσει τα 10±0,9 mm SL, οπότε και σταθεροποιείται. Στους 28 και 32 C η έκφραση του igf1 είναι ανεξάρτητη της ανάπτυξης καθόλη τη διάρκεια της εξεταζόμενης οντογενετικής περιόδου. Στατιστικά, διαφοροποιήθηκαν οι 22 C (δεύτερη φάση ανάπτυξης όπου η έκφραση είναι ανεξάρτητη του μήκους σώματος) από τους 28 και 32 C, επιδεικνύοντας υψηλότερες τιμές έκφρασης για τον igf1 (Mann-Whitney U test, p<0,05). Δεν μπόρεσε να διαεξαχθεί κάποιο συμπέρασμα σχετικά με τη διαφοροποίηση του προτύπου του οντογενετικού προφίλ της έκφρασης του γονιδίου igf1, σε σχέση με τη θερμοκρασία ανάπτυξης. Ίσως η χαμηλότερη έκφραση στους 22 C να συνδέεται με τους χαμηλούς μεταβολικούς ρυθμούς και χαμηλούς ρυθμούς αύξησης που απαντώνται στις ψυχρές θερμοκρασιακές συνθήκες. Το γονίδιο pes (pescadillo) επιλέχθηκε έχοντας ήδη διαπιστώσει τη διαφοροποίηση της έκφρασής του ανάλογα με τη θερμοκρασία ανάπτυξης, κατά τη μελέτη του ολικού μεταγραφικού προτύπου νυμφών zebrafish υπό την επίδραση διαφορετικών θερμοκρασιακών συνθηκών (Συμεωνίδη 2011). Στα πειράματα της εργασίας της Συμεωνίδη (2011), zebrafish είχαν αναπτυχθεί στους 22, 28 και 32 C από την 1 η -20 η dpf και από τη 10 η -20 η dpf και στο τέλος των διαφορετικών θερμοκρασιακών συνθηκών είχε πραγματοποιηθεί ανάλυση του ολικού μεταγραφικού προτύπου των νυμφών της κάθε πειραματικής συνθήκης. Το pescadillo βρέθηκε ως ένα από τα 37 γονίδια τα οποία εκφράζονταν στην στην περιοχή του ματιού και υπερεκφράζονταν στους 22 C, ενώ υποεκφράζονταν στους 28 C και 32 C (Συμεωνίδη 2011). Η έκφραση του γονιδίου αυτού στο zebrafish, σχετίζεται με τον πολλαπλασιασμό τωn κυττάρων (ρυθμιστής του κυτταρικού κύκλου) στους αναπτυσσόμενους εμβρυϊκούς ιστούς, θεωρούμενο απαραίτητο για την εμβρυϊκή ανάπτυξη (Allende et al. 1996, Kinoshita et al. 2000). Στην εργασία μας, στους 22 C, η έκφραση του pescadillo είναι σταθερή και ανεξάρτητη από το μήκος σώματος. Στους 28 C, η έκφραση του pescadillo φαίνεται να μειώνεται καθώς προχωρά η ανάπτυξη, ενώ στους 32 C, μειώνεται καθόλη τη διάρκεια της εξεταζόμενης οντογενετικής περιόδου, με ρυθμό που μεταβάλλεται (μειώνεται) απο τα 7,0±01,4 mm SL και μετά. Η στατιστική σύγκριση της γονιδιακής έκφρασης μεταξύ όλων των ατόμων των 28 C με τα άτομα των 32 C που φέρουν μήκος σώματος SL>7mm, δεν έδωσε σημαντικές διαφορές (ANCOVA, p>0,05), όμως το γεγονός ότι η κεφραση του pescadillo παραμένει σταθερή και ανεξάρτητη της ανάπτυξης στους 22 C, ενώ μειώνεται στις δύο θερμότερες θερμοκρασιακές συνθήκες, έρχεται σε συμφωνία με τα αποτελέσματα της Συμεωνίδη (2011). Υπάρχουν οι aa-crystallin και αβ- Crystallin πρωτεϊνες, οι οποίες στα Σπονδυλωτά εκφράζονται σε υψηλές συγκεντρώσεις στο φακό του ματιού (αποτελούν το 30% του συνόλου των πρωτεΐνών του), συμβάλλοντας στη διαφάνεια και διαθλαστικότητά του. Και οι 200

203 δύο πρωτεΐνες αποτελούν ταυτόχρονα μέλη της οικογένειας των small heat shock πρωτεΐνών (shsp) και δρουν και ως μοριακοί συνοδοι, παρεμποδίζοντας την in vitro τη συσσωμάτωση μετουσιωμένων πρωτεϊνών, προκλειόμενης από θερμικό στρες (Horwitz 1992, Runkle et al. 2002, Postner 2003). Η aa-crystallin στο zebrafish, κωδικοποιούμενη από το γονίδιο cryaa, παρουσιάζει παρόμοια δομή και λειτουργικότητα με την ομόλογή της στον άνθρωπο, και αυξημένη δραστηριότητα ως μοριακός συνοδός (Postner 2003). Στους 28 και 32 C, η έκφραση της cryaa εμφανίζεται ανεξάρτητη του μήκους σώματος των ιχθύων, ενώ στους 22 C η έκφραση της cryaa αυξάνεται με την αύξηση του μήκους του σώματος μέχρι περίπου τα 11mm SL, και στη συνέχεια φαίνεται να σταθεροποιείται. Όμως αυτή η αλλαγή στο πρότυπο έκφρασης δεν δεν επιβεβαιώθηκε με την εφαρμογή της ειδικής μορφής γραμμικής παλινδρό μησης, ούτε παρατηρήθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές (Mann-Whitney U test, p>0,05). Ίσως η μειωμένη αρχικά έκφραση της cryaa στα πρώιμα νυμφικά στάδια του zebrafish στους 22 C, να σχετίζεται με την προαναφερόμενη λειτουργικότητα της πρωτεΐνης η οποία αυξάνει τη συγκέντρωσή της κατά βάση στο φακό του ματιού και στα πρώιμα αναπτυξιακά στάδια ύστερα από θερμικό στρες (Marvin et al. 2008). Οι ανάπτυξη των σκελετικών μυών ελέγχεται από την έκφραση τεσσάρων bhlh μεταγραφικών παραγόντων: myogenin, MyoD, Myf5 και Myf6 (Blais et al. 2005). Η myogenin σχετίζεται με τη μυογένεση και αποτελεί μέλος της οικογένειας bhlh (basic Helix-Loop_helix) μεταγραφικών παραγόντων, με σημαντικό ρόλο στην τελική διαφοροποίηση των μυοβλαστών, από τα πολυδύναμα εμβρυϊκά κύτταρα. Από τους μυοβλάστες προέρχεται ο πληθυσμός των πρόδρομων μυϊκών κυττάρων (myogenic progenitor cells, MPC). Τα πρόδρομα MPCs περνούν στη φάση του πολλαπλασιασμού, η οποία ρυθμίζεται από σήματα που επάγουν ή αναστέλλουν τον εν λόγω πολλαπλασιασμό. Η έκφραση του γονιδίου εντοπίζεται ειδικά στους αναπτυσσόμενους σωμίτες των zebrafish, καθώς και στους σκελετικούς μύες (Chen et al. 2000, Du et al. 2003). Ουσιαστικά η έναρξη της διαδικασίας της μυογένεσης απαιτεί την έκφραση των MyoD μεταγραφικών παραγόντων που ανήκουν στην οικογένεια bhlh, στους οποίους ανήκει η μυογενίνη (Johnston 2004). Η έκφραση της myogenin στους 22 και στους 32 C είναι ανεξάρτητη του μήκους του σώματος καθόλη τη διάρκεια της εξεταζόμενης οντογενετικής περιόδου. Στατιστικά, διαφοροποιήθηκαν οι 32 C από τους 22 και 28 C (κατά τη φάση όπου η έκφραση είναι ανεξάρτητη της ανάπτυξης), παρουσιάζοντας χαμηλότερες τιμές έκφρασης (Mann Whitney U test, p<0,05). Στα ενήλικα άτομα, η έκφραση της myogenin εμφανίστηκε χαμηλή στα θηλυκά των 22 C, σε σχέση με τα αρσενικά της ίδιας θερμοκρασιακής συνθήκης, και υψηλότερη στα αρσενικά των 22 C σε σχέση με αυτή των των αρσενικών των 32 C (Mann Whitney U test, p<0,05). Γενικά, η επίδραση της θερμοκρασίας στην ανάπτυξη των μυοινιδίων η οποία παρουσιάζει υψηλού βαθμού πλαστικότητα χαρακτηρίζεται ως πολυπαραγοντική, ενώ μπορεί να συμβαίνει είτε προγενέστερα της μυϊκής υπερπλασίας, είτε μεταγενέστερα. Παράλληλα, σε πολύ πρώιμα αναπτυξιακά στάδια, η έκφραση των μεταγραφικών παραγόντων MyoD και myogenin έχει βρεθεί να μην επηρεάζεται από τη θερμοκρασία στο στάδιο των σωμιτών, στο είδος Clyde herring (Johnston 1995, Jonston & Hall 2004), ενώ παρατηρούνταν αλλαγές στο χρονισμό μυογενετικών οντογενετικών γεγονότων (όπως στη συγκρότηση των μυοϊνιδίων και στην έκφραση της ακετυλοχολινεστεράσης, AchEδιεγερτικός νευροδιαβιβαστής σε νευρομυϊκές κόμβους στους σκελετικούς μυς). Οι ερευνητές υποστήριξαν οτο η επίδραση της θερμοκρασίας στη διαφοροποίηση των μυϊκών ινών οφείλεται κυρίως σε αλλαγές μεταγενέστερες της μεταγραφής της βαριάς αλυσίδας της μυοσίνης (Temple et al. 2001, Jonston & Hall 2004). Έτσι, για τον εντοπισμό θερμικά προκλειόμενων ετεροχρονισμών στην έκφραση γονιδίων που σχετίζονται με την ανάπτυξη των μυών, να είναι αποδοτικότερη η ανάλυση γονιδίων που κωδικοποιούν πρωτεϊνες των μυών, όπως είναι η τροπονίνη, που είδαμε, η μυοσίνη, και άλλες, παρά η χρήση 201

204 μεταγραφικών παραγόντων που σχετίζονται με τη διαφοροποίηση των πρόδρομων κυττάρων. Σε σχέση με το οντογενετικό πρότυπο έκφρασης της μυογενίνης στις τρεις θερμοκρασιακές συνθήκες, δεν μπορεί να εξαχθεί κάποιο συμπέρασμα. Ίσως η χαμηλότερη έκφραση του γονιδίου myogenin στους 32 C κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης, να εδραιώνεται και στα ενήλικα άτομα, για αυτό και να παρατηρείται στατιστικά σημαντική μείωση της έκφρασής της στα ενήλικα αρσενικά zebrafish των 22 C, σε σχέση με τους 32 C. Η έκφραση του γονιδίου eda δε σχετίζεται με την πρώιμη ανάπτυξη του zebrafish, αλλά παίζει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη των σκελετικών και οδοντικών δομών των ενήλικων κυρίως - ατόμων (Harris et al. 2008). Οι Harris et al. (2008) επέλεξαν να μελετήσουν τη γενετική βάση της ποικιλομορφίας των ενήλικων μορφών στα Σπονδυλωτά και στόχευσαν στην αναγνώριση εκείνων των γονιδίων που είναι απαραίτητα για το σχηματισμό των ενήλικων σκελετικών δομών στο zebrafish. Αναζήτησαν το μοριακό υπόβαθρο σε μεταλλαγμένους φαινότυπους ατόμων στα οποία απουσίαζαν δομές του δερματικού σκελετού, όπως οι ακτίνες των πτερυγίων και των λεπιών, καθώς και τα φαρυγγικά δόντια. Κατέληξαν σε μεταλλάξεις που συνδέονταν με την απώλεια λειτουργίας αλληλομορφων των γονιδίων eda και του υποδοχέα αυτού, edar, που όμως έδιναν βιώσιμους ενήλικους φαινοτυπους. Το γονίδιο λοιπόν eda και ο υποδοχέας του αποδείχτηκαν απαραίτητα για την ανάπτυξη της μορφολογίας των ενήλικων ατόμων, για την ανάπτυξη των ενήλικων δομών. Ο δερμικός σκελετός συνδέεται άμεσα με την εξωτερική μορφολογία των ενήλικων ιχθύων, σχετιζόμενος με το δερματοκράνιο, τα οστά του βραγχιακού επικαλύμματος, τα λέπια και τα λεπιδοτρίχια, τα δόντια και τα οστά που στηρίζουν τα βράγχια των Τελεόστεων (Sire & Huysseune 2003, Harris et al. 2008). Έχοντας διαπιστωμένη τη θερμο-εξαρτώμενη πλαστικότητα σε επίπεδο εξωτερικής μορφολογίας στα ενήλικα zebrafish (βλ. 5.4), και λόγω του ρόλου του γονιδίου eda στις δομές που σχετίζονται με το δερματικό σκελετό των ιχθύων, η εξαγωγή του οντογενετικού προφίλ έκφρασης του γονιδίου υπό την επίδραση των διαφορετικών θερμοκρασιακών συνθηκών της παρούσας μελέτης πραγματοποιήθηκε για να διαλευκάνει μια πιθανή ανάμειξη της διαφορικής έκφρασής του κατά την ανάπτυξη, στην ποικιλία των ενήλικων μορφών των zebrafish. Στη μελέτη μας η έκφραση του eda ήταν σταθερή στους 22 C, κυμαινόμενη γύρω από ένα στενό εύρος τιμών, ενώ στους 28 και 32 C φαίνεται ότι μειωνόταν σε σχέση με το μήκος του σώματος, με έναν πολύ χαμηλό ρυθμό. Καμία στατιστικά σημαντική διαφορά δεν διαπιστώθηκε, ίσως γιατί η έκφραση του eda συνδέεται με την ανάπτυξη των σκελετικών και οδοντικών δομών των ενήλικων κυρίως - ατόμων (Harris et al. 2008). Τα γονίδια gdf9 και bmp15 (μέλη της υπερ-οικογένειας TGF-β μεταγραφικών παραγόντων - transforming growth factor-β superfamily) σχετίζονται με την ωορρηξία στα θηλαστικά (Su et al. 2004) ενώ είναι υπό διερεύνηση ένας αντίστοιχος ρόλος τους στους τελεόστεους. Στο λαβράκι (European sea bass) έχει βρεθεί ότι το bmp15 και το gdf9 παίζουν σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη των πρώιμων ωοκυττάρων (Halm et al. 2008). Σύμφωνα με τους McClelland et al. (2006) το bmp15 παίζει σημαντικό τόλο στην ωρίμανση των ωοκυττάρων του zebrafish. Η πρωτεΐνη gdf9 κατέχει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της ανάπτυξης των ωοθυλακίων (Liu et al. 2011) και αποτελεί ένα εξαιρετικά συντηρημένο γονίδιο στα Σπονδυλωτά, με την έκφρασή του αρχικά να θεωρείται ως αποκλειστική των ωοκυττάρων, γεγονός που διαψεύστηκε αργότερα (Liu & Ge 2007). Στο zebrafish, ο gdf9 εκφράζεται αρχικά στα θυλάκια και στα ωοκύτταρα, ενώ στα ενήλικα άτομα συναντάται στις γονάδες και των δύο φύλων, μα με υψηλότερη έκφραση στα θηλυκά (Liu & Ge cyp19a1b 2007), γεγονός το οποίο δε βρήκε ισχύ στην παρούσα μελέτη, αφού η έκφραση του gdf9 δε βρέθηκε να είναι στατιστικά σημαντικά υψηλότερη στα θηλυκά από ότι στα αρσενικά άτομα. Αντίθετα κάτι τέτοιο βρέθηκε να ισχύει για το bmp15. Γενικά, δεν υπάρχουν μελέτες σχετικά με το οντογενετικό προφίλ έκφρασης του γονιδίου gdf9 κατά τη διάρκεια της οντογένεσης 202

205 του zebrafish, μέχρι και τον καθορισμό του φύλου. Η μελέτη των Liu & Ge (2007) στα πολύ πρώιμα αναπτυξιακά στάδια (μετά τη γονιμοποίηση, μέχρι και φαρυγγικό στάδιο), έδειξε ότι η έκφραση του gdf9 διατηρήθηκε από τη γονιμοποίηση μέχρι και τη γαστριδίωση, ενώ ακολούθως και μειώθηκε δραματικά, έτσι ώστε στο τέλος της γαστριδίωσης η έκφρασή του ήταν σχεδόν μηδενική. Η έκφραση του gdf9 στην παρούσα μελέτη, εμφανίστηκε ανεξάρτητη του οντογενετικού σταδίου στους 28 C, αυξανόταν σε σχέση με το μήκος σώματος στους 22 C και μειωνόταν στους 32 C. Αντίστοιχο ήταν το πρότυπο έκφρασης του bmp15 στις τρεις θερμοκρασιακές συνθήκες, εδραιώνοντας τη θέση των Peng & Clelland (2008), η οποίοι υποστηρίζουν ότι η έκφραση των δύο γονιδίων είναι στενά συνδεδεμένη μεταξύ τους, δομικά και λειτουργικά. Μια σημαντική, ίσως, παρατήρηση αφορά στο γεγονός ότι πολλά άτομα που αναπτύχθηκαν στην αρρενοποιητική θερμοκρασία των 22 C, δεν ανιχνεύτηκε η έκφραση του gdf9, κάτι το οποίο δεν ίσχυε για τα άτομα των 28C, ενώ ίσχυε για δύο μόλις άτομα των 32 C και μάλιστα στα πρώιμα αναπτυξιακά στάδια, σε μήκος σώματος 5-6 mm SL. Στους 22 C, το μήκος των ατόμων στα οποία το gdf9 ανιχνεύτηκε, ποικίλει και κατανέμεται καθόλη τη διάρκεια της υπό εξέτασης οντογενετικής περιόδου, ακόμα και σε άτομα mm SL. Κάτι παρόμοιο ισχύει και για την έκφραση του bmp15, αν και σε αυτή την περίπτωση παρατηρήθηκε ένας μικρός αριθμός ατόμων με μηδενική έκφραση στους 28 και 32 C. Δημιουργείται λοιπόν το ακόλουθο ερώτημα: Θα μπορούσε η θερμοκρασία των 22 C να κατευθύνει κάποια άτομα ισχυρά προς την αρρενοποίηση, γεγονός το οποίο συνδέεται με τη μηδενική έκφραση του gdf9 και του bmp15 σε ορισμένες νύμφες zebrafish; Επίσης, είναι πιαθνό η αύξηση της έκφρασης των δύο γονιδίων σε σχέση με το μήκος του σώματος στους 32 C, να συνδέεται με τη δέσμευση περισσότερων ατόμων στο θηλεοειδικό μονοπάτι, σε αυτή τη θερμοκρασιακή συνθήκη. Είναι πάντως φανερή η επίδραση της θερμοκρασίας στη διαφοροποίηση του προτύπου έκφρασης των δύο αυτών γονιδίων. Το γονίδιο figla αποτελεί γονίδιο μεταγραφικού παράγοντα και η έκφρασή του έχει θεωρηθεί ως αξιόπιστος δείκτης της διαφοροποίησης των γονάδων σε ωοθήκες (Onichtchouk et al. 2003, Jorgensen et al. 2008). Στο είδος Oryzias latipes, με χρωμοσωμικό φυλοκαθορισμό ομογαμετικό (XX) για τα θηλυκά άτομα, το figlα συνδέεται με την ανάπτυξη των ωοθηκων (Matsuda 2003). Εκφράζεται από τα αρχέγονα γεννητικά κύτταρα και δημιουργώντας σύμπλοκα με άλλα μόρια επάγει την έκφραση γονιδίων απαραίτητων για τη διαφοροποίηση και την ανάπτυξη των αρχέγονων ωοθυλακίων και εν γένει για τη ρύθμιση της ωοθυλακιογένεσης. Τα γονίδια των οποίων η έκφραση επάγεται από το figla, συνδέονται με τη σύνθεση των πρωτεΐνών της διάφανης ζώνης (zona pellucida) η οποία είναι απαραίτητη για την προστασία του ωογονίου και την ωρίμανσή του σε ωοκύτταρο. Στο zebrafish, η έκφραση του figlα και των γονιδίων zpc της διάφανης ζώνης, τοποθετείται στις 22dpf, οπότε αρχίζει η διαφοροποίηση των γονάδων σε ωοθήκες (Onichtchouk et al. 2003). Οι Onichtchouk et al. (2003) διαπίστωσαν αυξημένη έκφραση στις ωοθήκες ενήλικων θηλυκών zebrafish και μηδενική στους όρχεις αρσενικών, γεγονός το οποίο έρχεται εν μέρει σε αντίθεση με τα δικά μας αποτελέσματα, αφού η έκφραση του figla δεν ήταν μηδενικοί στους όρχεις, αλλά σημαντικά χαμηλότερη στα αρσενικά άτομα των 22 και 32 C, σε σχέση με τα θηλυκά των αντίστοιχων θερμοκρασιακών συνθηκών. Και πάλι η ύπαρξη περισσότερων ατόμων για τη διεξαγωγή της ανάλυσης, κρίνεται σε αυτή την περίπτωση απαραίτητη. Οι Jorgensen et al. (2008), διαπίστωσαν κορύφωση της έκφρασης του figla stiw 25 dph, περίοδος που συπμίπτει με την έναρξη της τελικής διαφοροποίησης και καθορισμού των γονάδων σε ωοθήκες. Στη μελέτη μας, στους 22 και 32 C δεν ανιχνεύεται έκφραση του figla σε άτομα που βρίσκονται σε διάφορα στάδια ανάπτυξης (δηλαδή σε άτομα με αρκετά διαφορετικό μήκος σώματος (SL) μεταξύ τους). Στους 22 C η έκφραση φαίνεται να είναι ανεξάρτητη του μήκους σώματος. Στους 28 C, μέχρι περίπου τα 10mm SL, η έκφραση του figla αυξάνεται σε σχέση με το μήκος του σώματος, ενώ μεταξύ 12-14mm SL παρατηρείται 203

206 μεγάλη διακύμανση στην έκφραση. Στους 32 C, η έκφραση του figla αυξάνεται σε σχέση με το μήκος του σώματος, όπως συνέβει και στους 28 C, με τη διαφορά ότι η αύξηση σε αυτή την περίπτωση συμβαίνει μέχρι τα 8mm SL, ενώ στη συνέχεια παρατηρείται και σε αυτή την περίπτωση μεγάλη διακύμανση στις τιμές έκφρασης. Πιθανότατα η αύξηση της έκφρασης του figla στους 28 και 32 C καθώς προχωρά η ανάπτυξη, να αντανακλά την ύπαρξη περισσότερων ατόμων που έχουν «δεσμευτεί» στο θηλυκό μονοπάτι σε αυτές τις θερμοκρασιακές συνθήκες, σε σχέση με την ψυχρότερη συνθήκη των 22 C. Από τη μελέτη μας, δεν μπορεί να διεξαχθεί ένα σαφές οντογενετικό προφίλ έκφρασης του γονιδίου dmrt: Η έκφραση παραμένει σταθερή στους 28 C, αλλα κυμαίνεται εντός ενός μεγάλου εύρους τιμών, αυξάνεται στους 32 Cμέχρι τα 10,60±0,98mm SL, οπότε στη συνέχεια ανεξαρτητοποιείται από το μήκος σώματος και στους 22 C αυξομειώνεται καθόλη τη διάρκεια της εξεταζόμενης οντογενετικής περιόδου. Τα μόρια Dmrt φέρουν μία συντηρημένη περιοχή πρόσδεσης DNA, γνωστή ως DM (Doublesex and Mab-3) και αρχικά είχε βρεθεί ότι παίζουν ρόλο στο φυλοκαθορισμό της Drosophila και του Caenorhabditis elegans, εδραιώνοντας το φυλετικό διμορφισμό σε σωματικό επίπεδο (Herpin & Skhartl 2010). Στα Σπονδυλωτά, το γονίδιο dmrt1 είναι συδεδεμένο λειτουργικά και δομικά με το γονίδιο dsx της Drosophila και mab-3 του C. elegans, υπό το πρίσμα του καθορισμού και της διαφοροποίησης του φύλου. Στο είδος O. latipes υπάρχει ένα ομόλογο του dmrt1 γονίδιο, γνωστό πλέον ως dmrt1by ή dmy το οποίο βρίσκεται στο Y χρωμόσωμα των αρσενικών ετερογαμετικών ατόμων (Herpin et al. 2010). Αυτό το γονίδιο προέκυψε από το διπλασιασμό του αυτοσωμικού dmrt1α και ουσιαστικά βρέθηκε να καθορίζει τον αρσενικό χαρακτήρα των ιχθύων του είδους O. latipes, χαρακτηριζόμενο ως γονίδιο διακόπτης της διαφοροποιήσης των όρχεων χτο ψάρι αυτό. Από την άλλη, βρέθηκε να απουσιάζει σε πολλά στενά συγγενικά του είδη, καταλήγοντας στην υπόθεση ότι το προϊόν του dmrt1 γονιδίου στους Τελεόστεους συντελεί στην ανάπτυξη των όρχεων και στη σπερματογένεση. Ανάλογα με τον τρόπο φυλοκαθορισμού στα ψάρια, το dmrt1 εμφανίζει διμορφική και αρρενο-ειδική έκφραση στα γονοχωριστικά είδη, ενώ η έκφρασή του συνοδεύει την ανάπτυξη των όρχεων στα πρωτόγυνα είδη (π.χ. Sparus aurata), ή την «υποχώρηση» των όρχεων στα πρώτανδρα είδη (π.χ. Epinephlus coioides) (Herpin et al. 2010). Φαίνεται ότι η έκφραση του dmrt1 εμφανίζει πλαστικότητα ανάλογη αυτής του φυλοκαθορισμού των ιχθύων. Οι Jorgensen et al. (2008), διαπίστωσαν η έκφραση του dmrt1 κατά την εξεταζόμενη οντογενετική περίοδο στην εργασία τους (0-40dph), εμφάνιζε δύο κορυφές στα τα άτομα χαρακτηρίζονταν από υψηλή έκφραση του dmrt1 και άρα προορίζοντας να διαφοροποιηθούν ως αρσενικά: Μία στις 10dph και μία στις 14dph. Επειδή αυτή η κορύφωση της έκφρασης τοποθετείται χρονικά πολύ νωρίς στην ανάπτυξη, θεώρησαν ότι το dmrt1 μπορεί να αποτελέσει δείκτη της ανάπτυξης των zebrafish ως αρσενικά. Από τη μελέτη μας δεν μπορεί να προκύψει κάποιο αντίστοιχο συμπέρασμα. Ας σημειωθεί μόνο, ότι πολλά άτομα εμφάνισαν μηδενική έκφραση dmrt1 στην αρρενοποιητική θερμοκρασία των 22 C, κάτι που δεν παρατηρήθηκε στους 28 και 32 C. Τέλος, η έκφραση του dmrt1, όπως και του sox9a, βρέθηκε σημαντικά χαμηλότερη (Mann- Whitney U test, p<0,05) και σχεδόν μηδενική στις γονάδες των θηλυκών ατόμων, σε σχέση με των αρσενικών, και στις τρεις θερμοκρασιακές συνθήκες, γεγονός που συμφωνεί με την υπάρχουσα βιβλιογραφία (Jorgensen et al. 2008). Η έκφραση του γονιδίου hsd11b2 σχετίζεται με τo μεταβολισμό των γλυκοκορτικοστεροειδών ορμονών, αλλά και των ανδρογόνων, παίζοντας ρόλο κλειδί στο τελευταίο βήμα της βιοσύνθεσης των ανδρογόνων στα ψάρια, δηλαδή της σύνθεσης της 11- ΚΤ (11-ketotestosterone). Η 11-ΚΤ η τεστοστερόνη υδροξυλιώνεται από την 11-hydroxylase (cyp11) και μετατρέπεται σε 11-hydroxytestosterone (11-OHT) (διυδροτεστοστερόνη), η οποία αποτελεί υπόστρωμα για την hsd11b2 για τη σύνθεση της 11-KT (Lokman et al. 2002). Λόγω του ρόλου του γονιδίου αυτού στο τελευταίο βήμα της βιοσύνθεσης των 204

207 ανδρογόνων, αποφασίστηκε η μελέτη της έκφρασης του οντογενετικού του προφίλ υπό την επίδραση διαφορετικών θερμοκρασιακών συνηθκών. Στη μελέτη μας, η έκφραση του γονιδίου hsd11b2 παρέμεινε σταθερή και ανεξάρτητη από το μήκος σώματος στους 22 και 32 C, ενώ στους 28 C μειωνόταν σε σχέση με το μήκος του σώματος μέχρι τα 7,9±0,3mm SL, και στη συνέχεια άρχισε να αυξάνεται. Ο στατιστικός έλεγχος της έκφρασης του hsd11b2 μεταξύ των 22 και 32 C, δεν έδωσε σημαντικές διαφορές (Mann Whitney U-test, p<0,05). Λίγο παραπάνω, είδαμε ότι η έκφραση του sox9a στους 28 C άλλαξε πρότυπο στα 7,6±0,6 mm SL, μήκος το οποίο αντιστοιχεί στις 18dpf, χρονική περίοδος η οποία φαίνεται ότι μπορεί να συμπίπτει με με την περίοδο πριν από την έναρξη της απόπτωσης των ωοκυττάρων (Jorgensen et al. 2008). Η αλλαγή του προτύπου έκφρασης του hsd11b2 στα 7,9mm SL, στους 28 C, μπορεί να συμπίπτει και πάλι με την εν λόγω περίοδο. Το γονίδιο ar, κωδικοποιεί των υποδοχέα των ανδρογόνων. Τόσο η τεστοστερόνη, όσο και η διυδροτεστοστερόνη, που αναφέρθηκαν παραπάνω, προσδένονται στον ίδιο πυρηνικό υποδοχέα, τον υποδοχέα των ανδρογόνων (androgen receptor, ar), προκειμένου να ασκήσουν τη δράση τους. Έτσι, το γονίδιο ar ανήκει στο αρρενο-ειδικό μοριακό μονοπάτι. Η έκφρασή του βρέθηκε να είναι σημαντικά χαμηλότερη (Mann-Whitney U test, p<0,05) στις ωοθήκες σε σχέση με τους όρχεις, γεγονός που όπως είδαμε ίσχυε τόσο για το sox9a, όσο και για το dmrt1. Φαίνεται ότι ενώ τα θηλεο-ειδικά γονίδια εκφράζονται και στις ωοθήκες και στους όρχεις των zebrafish, τα αρρενοειδικά είναι σχεδόν αποκλειστικά της ορχικής κατάστασης. Να σημειωθεί ότι οι Jorgensen et al. (2008), βρήκαν παρόμοια έκφραση του ar στις ωοθήκες και στους όρχεις. Από κει και πέρα, κατά την εξεταζόμενη οντογενετική περίοδο της παρούσας μελέτης, διαπιστώθηκε ότι η έκφραση του ar στους 28 και στους 32 C παραμένει ανεξάρτητη του μήκους σώματος, ενώ στους 22 C αυξάνεται καθόλη τη διάρκεια της εξεταζόμενης οντογενετικής περιόδου, με χαμηλό όμως ρυθμό. Δε βρέθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές στην στην έκφραση του του ar μεταξύ των 28 και 32 C (Mann-Whitney U test, p>0,05). Οι Jorgensen et al. (2008), διαπίστωσαν στη μελέτη τους ότι η έκφραση του ar στα άτομα που προορίζονταν ως αρσενικά, εμφάνισε κορύφωση στις 16dph και στις 22dph, ακριβώς πριν τον καθορισμό της διδυναμικής ερμαφρόδιτης γονάδας των ιχθυδίων zebrafish στο αρσενικό ή στο θηλυκό μονοπάτι. Κανένα τέτοιο συμπέρασμα δεν μπορεί να εξαχθεί από τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης. Τα γονίδιο tp53 δε σχετίζεται άμεσα με τη διαφοροποίηση και τον καθορισμό του φύλου, υπό την έννοια του ότι δεν είναι αρρενο-ειδικό ή θηλεο-ειδικό. Κατά την ανάπτυξη του zebrafish, στην περίοδο που το σώμα των γονάδων των νυμφών είναι δι-δυναμικό (περίοδος ερμαφρόδιτου ιχθυδίου), τα πρώιμα κύτταρα των γονάδων εκφράζουν τόσο θηλεοειδικά, όσο και αρρενο-ειδικά γονίδια (Rodriguez-Mari et al. 2005, Siegfried & Nusslein- Volhard 2008). Σύμφωνα με τους Sun et al. (2013), ένα σήμα το οποίο σχετίζεται με την έκφραση του γονιδίου sox9, ελέγχει τη μεταμόρφωση των ωοθηκών σε όρχεις, ενώ η έκφραση του cyp19a1a είναι απαραίτητη για τη δέσμευση της αναπτυσόμενη γονάδας στο θηλεο-ειδικό μονοπάτι (Rodriguez-Mari et al. 2010). Η επιβίωση ενός κρίσιμου αριθμού ωοκυττάρων είναι απαραίτητη προκειμένου να διατηρηθεί το σήμα και η έκφραση της αρωματάσης (κωδικοποιούμενης από το cyp19a1a) στα σωματικά κύτταρα των αναπτυσσόμενων γονάδων, προκειμένου να μετατραπουν σε ωοθήκες. Τα ωοκύτταρα μπορεί να παράγουν ένα σήμα το οποίο προκαλεί τα σωματικά κύτταρα των γονάδων να εκφράσουν θηλεο-ειδικά γονίδια, προκαλώντας έτσι τη δέσμευση της γονάδας στο θηλεο-ειδικό μονοπάτι (Dranow et al. 2014). Σημαντικό ρόλο στην όλη διαδικασία φαίνεται ότι παίζει η απόπτωση των ωοκυττάρων, ελεγχόμενη από την έκφραση της tp53. Η έκφραση λοιπόν του γονιδίου tp53 φαίνεται ότι αποτελεί κλειδί στην ενεργοποίηση της απόπτωσης των ωοκυττάρων και στη διαφοροποίηση των γονάδων σε όρχεις (μειωμένη έκφραση της tp53 έχει ως αποτέλεσμα να μην επιτελείται αποτελεσματικά η απόπτωση των ωοκυττάρων, οπότε τα άτομα 205

208 εξελίσσονται σε θηλυκά). Αν τα ωοκύτταρα επιβιώσουν και επιτραπεί η «ασφαλής» συνέχιση της κυτταρικής τους διαίρεσης, θα εισέλθουν στο στάδιο της διπλοταινίας και τα άτομα εν γένει θα διαφοροποιηθούν ως θηλυκά (Rodriguez-Mari et al. 2010, Rodriguez-Mari & Postlethwait 2011). Ένας ενδεχόμενος θερμοκρασιακός έλεγχος στην έκφραση του γονιδίου της tp53, θα μπορούσε να έχει επιπτώσεις στην τελική διαφοροποίηση του φύλου των zebrafish, για αυτό επιλέχθηκε η μελέτη της έκφρασης του γονιδίου αυτού, υπό την επίδραση της θερμοκρασίας. Η έκφραση του γονιδίου tp53 στους 28 και 32 C, μειωνόταν καθώς η ανάπτυξη προχωρούσε, ενώ στους 22 C παρέμεινε σταθερή και ανεξάρτητη του μήκους σώματος. Από το στατιστικό έλεγχο για τον προδιορισμό των διαφορών στην έκφραση της tp53 μεταξύ 28 και 32 C, διαπιστώθηκε ότι η έκφραση στους 28 C μειωνόταν με χαμηλότερο ρυθμό από ότι στους 32 C (ANCOVA, p<0,05). Η σταθερή έκφραση του tp53 καθόλη τη διάρκεια της εξεταζόμενης οντογενετικής περιόδου στην αρρενοποιητική θερμοκρασία των 22 C, σε σχέση με τη μειούμενη έκφραση του ίδιου γονιδίου στις δύο θερμότερες θερμοκρασιακές συνθήλες, μπορεί να συνδέεται με μια αυξημένη απόπτωση των ωοκυττάρων κατά την κρίσιμη οντογενετική περίοδο, και τη διαφοροποίηση του φύλου των αναπτυσσόμενων ατόμων ως αρσενικά Επίλογος «Η οντογένεση δε δημιουργεί αθάνατους φαινότυπους, αλλά κάθε πράξη αναπαραγωγής συμπυκνώνει έναν πολυκύτταρο οργανισμό σε ένα σύνολο μεμονομένων αδιαφοροποίητων κυττάρων, δίνοντας σε ένα φαινότυπο τη δυνατότητα να δημιουργείται ξανά και ξανά κατά τη διάρκεια της ύπαρξής του, με το γενότυπο αποτελεί το εναρκτήριο σημείο του επιγενετικού ελέγχου και το φαινότυπο το σημείο λήξης του» (Hall 1992). Ένας φαινότυπος δημιουργείται σε συνεργασία με το υπάρχον περιβάλλον και κατά τη διάρκεια της δημιουργίας του προστίθενται «αναπτυξιακές» πληροφορίες βασιζόμενες στις υπάρχουσες γενετικές (Balon 1983). «Οι επιγενετικές τροποποιήσεις είναι πρωταρχικός κατευθυντήριος παράγοντας της μορφολογικής εξέλιξης, ακόμα και σε ήδη εξελιγμένα αναπτυξιακά συστήματα» (Muller 2010), με το περιβάλλον αποτελεί παράγοντα ανάπτυξης και επιλογής, ταυτόχρονα (West Eberhart 2005). Σύμφωνα με τον Moss (2007) «o κυτταρικός κύκλος, η αύξηση-ανάπτυξη των ιστών και τα πρότυπα γονιδιακής έκφρασης, η δημιουργία των διάφορων δομών και των οργάνων, απαιτείται να πραγματοποιηθεί στο σωστό χρόνο» προεμβρυϊκά και μετεμβρυϊκά. Η αλλαγή της θέσης ομάδων κυττάρων, στο χώρο και στο χρόνο, είναι υπεύθυνη για τη δημιουργία νέων δομών-μορφολογιών και ίσως τελικά, μέσω της διαδικασίας της Φυσικής Επιλογής, νέων οργανισμών (McNamara 1997). Τα μορφογενετικά μόρια (morhogens), όπως αυτά πρωτο-ονομάστηκαν από τον Alan Turing το 1950, συνδεόμενα με υποδοχείς των εμβρυϊκών κυττάρων, μεταδίδουν σήματα σε γονίδια του πυρήνα τα οποία καθοδηγούν τα κύτταρα σε συγκεκριμένες θέσεις και ορίζουν το πότε θα πρέπει να διαιρεθούν και να διαφοροποιηθούν στις διάφορες εξειδικευμένες δομές (π.χ. μύες ή οστα) που συνιστούν έναν οργανισμό. Για τη τη διεξαγωγή της ανάπτυξης, αυτά τα μορφογενετικά μόρια απαιτείται να παραχθούν στο σωστό χρόνο, στο σωστό μέρος και στη σωστή ποσότητα. Οποιαδήποτε διατάραξη στο χρονισμό των παραπάνω γεγονότων ή στο ρυθμό τους, μπορεί να αλλάξει το καθορισμένο αναπτυξιακό μονοπάτι, οδηγώντας σε ριζικές διαφοροποιήσεις (McNamara 1997). Το ερώτημα που έχει απασχολήσει πολλούς ερευνητές μέχρι σήμερα, είναι αν ο χρονισμός των οντογενετικών γεγονότων εγκαθιδρύεται από μοριακούς μηχανισμούς, ή εάν εαν είναι και ο ίδιος αποτέλεσμα των ρυθμιστικών μηχανισμών στους οποίους υπόκειται η ανάπτυξη (Moss 2007).

209 Οι Parichy et al. (2009) έδειξαν πως η θερμοκρασία ανάπτυξης ασκεί σημαντική δράση στο πρότυπο οντογένεσης του zebrafish, αλλάζοντας το σωματικό μέγεθος όπου επιτελούνται τα διάφορα αναπτυξιακά γεγονότα και προκαλώντας μερική αποσύνδεση του ρυθμού διαφοροποίησης από το ρυθμό αύξησης (Fuiman et al. 1998). Ο χρονισμός των οντογενετικών γεγονότων, αποτελεί μια διάσταση της ρύθμισης της αναπτυξιακής διαδικασίας, αλλά η παρατήρηση του φαινομένου στα Σπονδυλωτά καθίσταται εν μέρει προβληματική, μια και τα διάφορα αναπτυξιακά στάδια δεν είναι τόσο διακριτά μεταξύ τους, όσο στο C. Elegans (Moss 2007) για παράδειγμα, το οποίο έχει αποτελέσει είδος μοντέλο στη μελέτη ετεροχρονικών φαινομένων. Τα ετεροχρονικά πρότυπα, περιγράφουν αλλαγές / διαφοροποιήσεις στο χρονισμό της οντογένεσης, για τα προϊόντα της οντογένεσης, συνδεδεμένες με το ρυθμό αύξησης ή με αλλαγές στο μέγεθος (Gould 2000), ενώ σύμφωνα με τον Wake (2004 Β), η επιτάχνση ή η επιβράδυνση της ανάπτυξης (αναφερόμενη υπό την σκοπιά του ετεροχρονισμού) αποτελεί φαινόμενο εξαρτώμενο από το στάδιο (ανάπτυξης) και όχι από το χρόνο. Για παράδειγμα, οι χαμηλές θερμοκρασίες συνδέονται με το φαινόμενο της παιδομόρφωσης, όπου ο ενήλικας οργανισμός ενός απογόνου, διατηρεί χαρακτηριστικά που φέρουν τα νεαρά προγονικά άτομα του είδους του. Η παιδομόρφωση περιλαμβάνει την προγένεση (άτομα γενετικά ώριμα σε μικρότερη ηλικία) και τη νεοταινία (αργός ρυθμός ανάπτυξης) και ενώ η εμφάνιση των συγκεκριμένων χαρακτήρων εξαρτάται από το χρονισμό των οντογενετικών γεγονότων, δεν μπορεί παρά να καθορίζεται από το στάδιο της ανάπτυξης. Τα παραπάνω καθιστούν κατανοητό ότι για τη μελέτη ετεροχρονικών φαινομένων και των μοριακών μηχανισμών που τα διέπουν στους ιχθύες, είναι απαραίτητος ο σαφής διαχωρισμός των οντογενετικών σταδίων, έτσι ώστε να είναι διακριτή η έναρξη και ο τερματισμός τους, καθώς και η διάρκειά τους. Είδαμε σε πολλές περιπτώσεις κατά την πορεία αυτής της εργασίας να καθίσταται εν μέρει προβληματικός ο καθορισμός των οντογενετικών σταδίων στο zebrafish, με βάση τις dpf ή τις dph, ιδιαίτερα υπό την επίδραση περιβαλλοντικών παραγόντων που μεταβάλλουν το ρυθμό αύξησης, σε σχέση με το ρυθμό διαφοροποίησης, προτείνοντας έτσι το μήκος του σώματος ως καταλληλότερο μέσο προσδιορισμού του εκάστοτε οντογενετικού σταδίου. Σύμφωνα με των Reznick (1990) «η μελέτη της ανάπτυξης, αποτελεί βασικά τον καθορισμό του σωματικού μεγέθους ως συνάρτηση της ηλικίας», ενώ ο όρος αναπτυξιακή τροχιά (developmental trajectory) από τον Waddington, καθορίζει τη φύση της αναπτυξιακής διαδικασίας και την απεγκλωβίζει από την έννοια μιας σταθερής κατάστασης (state). Τα βιολογικά συστήματα, όντας δυναμικά, δεν είναι ομοιοστατικά 5, υπό την έννοια του ότι δε παραμένουν σε μια σταθερή κατάσταση, αλλά ομόρροα (ομοιόρηση, ομορροη / homeorhesis), όρος που πρωτοχρησιμοποιήθηκε από τον Waddington, περίπου το 1940, θέλοντας να περιγράψει την τάση των αναπτυσσόμενων οργανισμών να συνεχίσουν να αναπτύσσονται, ή και να προσαρμόζονται στο περιβάλλον τους, να συνεχίζουν να αλλάζουν προς μία συγκεκριμένη κατάσταση. Η ανάγκη χαρακτηρισμού των δυναμικών συστημάτων από μια έκφραση που να υποδηλώνει μία ρευστή κατάσταση, έρχεται από το γεγονός ότι τα δυναμικά συστήματα είναι συνεχώς μεταβαλλόμενα εντός του χωροχρονικού συνεχούς, λόγω αλληλεπιδράσεων με το συνεχός μεταβαλλόμενο περιβάλλον. Με βάση τα παραπάνω, η διαδικασία της ανάπτυξης ως σύστημα ανοιχτό - δεν αποτελεί μια σταδιακή μετάβαση από στάδιο σε στάδιο, αλλά είναι αποτέλεσμα ακανόνιστων ρυθμών αλματωδών ομορροών (irregular rates of salutatory homeorhesis) (Hall 1992). Οι αλματώδης οντογένεση των οργανισμών μπορεί να περiγραφει με μια σειρά από (ομόρροα) βήματα-περιόδους της ανάπτυξης, διαχωριζόμενες μεταξύ τους από φυσικά όρια: έμβρο (embryo), νύμφη (larva), νεαρό άτομο (juvenile), ενήλικος Ομοιόσταση είναι η φυσική τάση του ενός ζώντος οργανισμού για να διατηρήσει μια σταθερή ισορροπία, με την θερμοδυναμική έννοια.

210 οργανισμός (adult) και περίοδος γήρανσης. Ένα τέτοιο μοντέλο παρέχει τη δυνατότητα αναγνώρισης και ερμηνείας ετεροχρονικών μετατοπίσεων που οδηγούν σε νέες μορφές ανάπτυξης (Hall 1992). Φαίνεται ότι ο χρονισμός των οντογενετικών γεγονότων είναι τόσο αποτέλεσμα ενδογενών (γενετικό υπόβαθρο) παραγόντων, όσο και εξωτερικών επιδράσεων (περιβαλλοντικών παραγόντων) και ταυτόχρονα αποτελεί αιτία δημιουργίας δοαφοροποιήσεων στις οντογενετικές διαδικασίες και στους τελικούς φαινοτυπους. Το όλο σύστημα φαίνεται να έχει συνδεδεμένα τα συστατικά του στοιχεία στο χώρο και στο χρόνο, έτσι ώστε ταυτόχρονα κάθε ένα από αυτά τα στοιχεία (γονιδιακή έκφραση, ανάπτυξη δομών κοκ) να είναι αποδέκτης και να διαφοροποιείται ανάλογα με τις περιβαλλοντικές για παράδειγμα συνθήκες, και το δοθέν γενετικό υπόβαθρό, και ταυτόχρονα να αποτελεί αίτιο πρόκλησης νέων αλλαγών στο συγχρονισμό των οντογενετικών γεγονότων. Ο ετεροχρονισμός αποτελεί σημαντικό εξελικτικό - αναπτυξιακό μηχανισμό, συνδέοντας αλλαγές στην οντογένεση με αλλαγές σε φυλογενετικό επίπεδο, αλλά και ερμηνεύοντας πλέον περιβαλλοντικά ελεγχόμενες αλλαγές μεταξύ των ατόμων ενός είδους. Στην παρούσα εργασία είδαμε ότι οι περιβαλλοντικοί παράγοντες, με κύριο τη θερμοκρασία ανάπτυξης, επηρέασαν την εξέλιξη της οντογενετικής διαδικασίας (χρονισμό οντογένεσης μεριστικών χαρακτήρων, σχήμα σώματος νυμφών, οντογενετικό προφίλ γονιδιακής έκφρασης), και τον τελικό φαινότυπο των ατόμων (σχήμα σώματος ενηλίκων, γονιδιακή έκφραση στους ιστούς των ενήλικων zebrafish, τελικά αναλογία φύλου). Από προηγούμενες μελέτες που έχουν διεξαχθεί από το εργαστήριό μας, σχετικά με την επίδραση της θερμοκρασίας (22, 28, 32 C) κατά την ανάπτυξη, στο ολικό μεταγραφικό πρότυπο των νυμφών zebrafish, διαπιστώθηκε ότι η γονιδιακή έκφραση των νυμφών που είχαν αναπτυχθεί στους 22 C, διαφοροποιήθηκε πολύ σε σχέση με τις δύο θερμότερες θερμοκρασιακές συνθήκες των 28 και 32 C (Συμεωνίδη, 2011). Η αναλογία φύλου διαφοροποιήθηκε σημαντικά μεταξύ των 22 C και των δύο θερμότερων συνθηκών αυτής της μελέτης (28 και 32 C), χαρακτηρίζοντάς την ως αρρενοποιητική. Φαίνεται ότι οι 22 C έχουν γενικά πιο ισχυρή επίδραση επι των εξεταζόμενων χαρακτήρων, σε σχέση με τις δύο θερμότερες συνθήκες. Οι νύμφες που χρησιμοποιήθηκαν σε στη μελέτη της Συμεωνίδη (2011), είχαν δεχτεί τη διαφορετική θερμοκρασιακή επίδραση για χρονικό διάστημα που καθορίστηκε από τον παράγοντα «θερμοημέρες» ( d) (Georga & Koumoundouros 2010, Συμεωνίδη 2011), και, χονδρικά, θα μπορούσαμε να πουμε - χωρίς πολύ μεγάλο σφάλμα - ότι αυτή η επίδραση αφορούσε στο πρώτο και στο δεύτερο δεκαήμερο της ανάπτυξης. Επειδή η μελέτη της θερμοκρασιακής επίδρασης στο μεταγραφικό πρότυπο πραγματοποιήθηκε στο τέλος της εφαρμογής των διαφορετικών θερμοκρασιακών συνθηκών και τα σχετικά αποτελέσματα επιβεβαίωσαν τη διαφοροποίηση του τελικού μεταγραφικού προτύπου, δημιουργήθηκε το ερώτημα της αιτίας των υποκείμενων μηχανισμών αυτών των διαφοροποιήσεων. Αντίστοιχα, από την εργασία των Georga & Koumoundouros (2010), αλλά και άλλων εργασιών στο zebrafish και όχι μόνο, έχει διαπιστωθεί η επίδραση περιβαλλοντικών παραγόντων κατά την ανάπτυξη στον τελικό φαινότυπο (ενδεικτικά Stickland et al. 1988, Koumoundouros et al. 2001, Kamler 2002, Sfakianakis et al. 2004) και οι υποκείμενοι μηχανισμοί που τα συνοδεύουν αποτελούν βασικό ερώτημα. Από την παρούσα μελέτη έγινε λοιπόν μια προσπάθεια προσέγγισης του φαινομένου της περιβαλλοντικά προκλειόμενης φαινοτυπικής πλαστικότητας στα zebrafish, μεταξύ άλλων μέσω της μελέτης της αλληλουχίας των οντογενετικών γεγονότων και των πιθανών μεταβολών στο χρονισμό τους. Αντιλαμβανόμενοι την αναπτυξιακή πορεία ως μια δυναμική διαδικασία και προσπαθώντας παράλληλα για έναν ακριβή διαχωρισμό των σταδίων ανάπτυξης, βάσει του μήκους σώματος των αναπτυσσόμενων ιχθύων, διαπιστώθηκαν ετεροχρονικές μετατοπίσεις στην οντογένεση των μεριστικών χαρακτήρων και στην έκφραση γονιδίων που σχετίζονται με την ανάπτυξη 208

211 των οστών (osteocalcin) και των μυών (tnni2a.3). Πρόκειται για περιβαλλοντικά προκλειόμενες διαφοροποιήσεις που πιθανότατα αποτελούν αιτία της τελικής διαφοροποίησης του σχήματος του σώματος, αλλά και γενικότερα του τελικού φαινοτύπου των ενήλικων ατόμων. Οι Mabee et al. (2000) τονίζουν ότι ενώ τα ετεροχρονικά φαινόμενα κατέχουν κυρίαρχη θέση στην πρόκληση εξελικτικών αλλαγών και εξηγούν φυλογενετικές διαφοροποιήσεις στο χρονισμό και στο ρυθμό της ανάπτυξης, δεν έχουν χρησιμοποιηθεί επαρκώς στην ερμηνεία ενδο-ειδικών διαφοροποιήσεων στον τελικό φαινότυπο, αλλά κυρίως κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης. Στη μελέτη τους, επισημαίνουν τη φράση των Albrech & Blanco (1996), σύμφωνα με την οποία «Είναι σαφές ότι μια ευρεία, ολοκληρωμένη εμπειρική μελέτη είναι αναγκαία για μια αντικειμενική μελέτη της σταθερότητας της οντογενετικής ακολουθίας» και συμπληρώνουν ότι «...η σύνδεση των διακυμάνσεων που εμφανίζονται στην αλληλουχία των αναπτυξιακών γεγονότων εντός των ατόμων του ίδιου είδους (ενδοειδικές), με τις ετεροχρονικές διαφοροποιήσεις που εμφανίζονται μεταξύ διαφορετικών ειδών (διαειδικές), απαιτεί πρωταρχικώς τη συγκρότηση δεδομένων σχετικών με τις ενδοειδικές διαφορές στο χρονοδιάγραμμα της αναπτυξιακής πορείας (Mabee et al. 2000). Λαμβάνοντας τα παραπάνω υπόψη, οι Mabee et al. (2000), διεξήγαγαν μια μελέτη στην οποία μελέτησαν το χρονισμό στην ανάπτυξη των οστών του κρανίου στο zebrafish Danio rerio, υπό την επίδραση διαφορετικών θερμοκρασιακών συνθηκών (26,5, 28,5, 32,5 C), με στόχο να διαπιστώσουν εάν η θερμοκρασία ανάπτυξης μεταβάλλει σημαντικά την αλληλουχία της οστεοποίησης (τη σειρά με την οποία οστεοποιούνται τα διάφορα οστά) και να προχωρήσουν έπειτα σε διαειδικές συγκρίσεις. Από την εργασία της Balon (1980) είχε διαπιστωθεί ότι τα ψάρια που μεγαλώνουν σε υψηλότερες θερμοκρασιακές συνθήκες, φτάνουν σε ένα στάδιο όπου τα οστά τους είναι περισσότερο οστεοποιημένα (ή περισσότερα οστά έχουν οστεοποιηθεί) σε μικρότερο μέγεθος και ηλικία, σε σχέση με αυτά που εκτρέφονται σε χαμηλότερες θερμοκρασιακές συνθήκες, ενώ αναφέρεται μια ήδη υπάρχουσα ποικιλομορφία στην οστεοποίηση, προφανώς στα πλαίσια ενός ευέλικτου γενετικού υπόβαθρου. Σαν πρώτη υποσημείωση, θα πρέπει να αναφέρουμε ότι οι μελέτες που πραγματοποιούνται από ερευνητές σχετικούς με την ανάπτυξη των ιχθύων (π.χ. ενδεικτικά η αναφερόμενη μελέτη από Balon 1980), σχεδόν πάντα αναφέρουν το μήκος του σώματος αυτών και το χρησιμοποιούν ως προσδιοριστικό του οντογενετικού σταδίου, ενώ οι μελέτες που διεξάγονται από Μοριακούς Βιολόγους και αφορούν στην ανάπτυξη των ιχθύων, και κυρίως του zebrafish, οι ημέρες μετά τη γονιμοποίηση ή την εκόλλαψη αποτελούν το κύριο προσδιοριτικό του σταδίου ανάπτυξης. Το γεγονός είναι μεγάλης σημασίας, μια και η σφαιρική μελέτη των διάφορων βιολογικών φαινομένων, όπως του πολυαναφερόμενου ετεροχρονισμού, απαιτεί τη σύγκριση των εκάστοτε αποτελεσμάτων στα διάφορα αναπτυξιακά στάδια, και άρα απαιτεί το σαφή προσδιορισμό τους. Απο κει και πέρα, οι Mabee et al. (2000) στη μελέτη τους, όπου συμπεριέλαβαν τα 71 διαφορετικά είδη οστεοποίησης του κρανίου του zebrafish (κατανεμημένα σε 9 κρανιακές περιοχές), διαπίστωσαν χαμηλού βαθμού ποικιλομορφία στο χρονισμό των εξεταζόμενων οντογενετικών γεγονότων (ανάπτυξη επιμέρους οστών και αλληλουχία οστεοποίησης), υπό την επίδραση της θερμοκρασίας, με την υψηλότερη θερμοκρασία (30,5 C) να είναι υπεύθυνη για την εμφάνιση περισσότερων διαφοροποιήσεων. Στην ίδια θερμοκρασία, ο χρονισμός στην οστεοποίηση των δομών που οστεοποιούνται νωρίς κατά την ανάπτυξη, παρουσίαζε μικρότερη ποικιλία σε σχέση με τις κρανιακές δομές που οστεοποιούνται αργότερα. Από τη δική μας μελέτη σε σχέση με την οντογένεση των εξεταζόμενων μεριστικών χαρακτήρων, υπό την επίδραση των διαφορετικών θερμοκρασιών ανάπτυξης (ή υπό τη συνεπίδραση διαφορετικών συνθηκών θερμοκρασίας φωτοπεριόδου), ως πιθανό φαινόμενο ετεροχρονισμού μπορούμε να θεωρήσουμε την νωρίτερη εμφάνιση των κοιλιακών πτερυγίων από την οστεοποίηση των πτερυγιοφόρων του εδρικού και την οστεοποίηση των επουραίων 209

212 στους 28 και 32 C, σε σχέση με τους 22 C, καθώς και την ολοκλήρωση της ανάπτυξης των πτερυγιοφόρων του εδρικου πριν από την εμφάνιση του ουρόστυλου στους 28 C και στους 32 C, σε σχέση με τους 22 C (Εικόνα 5.3-2). Λαμβάνοντας υπόψη και την έκφραση γονιδίων που σχετίζονται με την οστεοποίηση για παράδειγμα, όπως της osteocalcin, αλλά και πολλών άλλων, μπορούμε να διαπιστώσουμε την ύπαρξη ετεροχρονισμών μεταξύ των διάφορων οντογενετικών γεγονότων, όχι μόνο γραμμικά, υπό την έννοια της παρακολούθησης μιας οντογενετικής σειράς που σχετίζεται με έναν μορφολογικό χαρακτήρα, αλλά πολυεπίπεδα, χρησιμοποιώντας πολλαπλούς χαρακτήρες κατά μήκος του σώματος των ιχθύων και μοριακούς δείκτες που σχετίζονται με την ανάπτυξή τους. Η πολυεπίπεδη μελέτη της ανάπτυξης ποικίλων οντογενετικών γεγονότων, σε επίπεδο μορφολογίας, αλλά και σε μοριακό επίπεδο, απαιτούν μεγάλα πληθυσμιακά μεγέθη, το οποίο έχει ήδη σημειωθεί ως απαραίτητο για τον εντοπισμό ενδοειδικών διαφοροποιήσεων, περιβαλλοντικά ή μη προκλειόμενων (Mabee et al. 2000). Η διαπίστωση ότι η περιβαλλοντική ποικιλομορφία οδηγεί σε αλλαγή στο χρονισμό των οντογενετικών γεγονότων ενδοειδικά, απαιτεί την αντίληψη του οργανισμού ως ολότητα, τη μελέτη των ετεροχρονικών φαινομένων και την ερμηνεία της αναπτυξιακής διαδικασίας όχι ως μία σταθερή κατάσταση, αλλά ως μια δυναμική, που τα συsτατικά της στοιχεία αποκρίνονται στις επιγενετικές τροποποιήσεις και ρυθμίζουν την αναπτυξιακή διαδικασία ως ενιαία τροχιά. 210

213 V. Βιβλιογραφία Abozaid H, Wessels S, Hörstgen-Schwark G (2011) Effect of Rearing Temperatures during Embryonic Development on the Phenotypic Sex in Zebrafish (Danio rerio). Sex Dev 5: Abozaid H, Wessels S, Hörstgen-Schwark G (2012) Elevated temperature applied during gonadal transformation leads to male bias in zebrafish (Danio rerio). Sex Dev. 6(4): Acosta J, Carpio Y, Borroto I, González O, Estrada MP (2005) Myostatin gene silenced by RNAi show a zebrafish giant phenotype. J Biotechnol 119(4): Adewolu MA, Adeniji CA, Adejobi AB (2008) Feed utilization, growth and survival of Clarias gariepinus (Burchell 1822) fingerlings cultured under different photoperiods. Aquaculture 283: Adriaens D, Verraes W (1998) An Empirical Approach to Study the Relation between Ontogeny, Size and Age Using Geometric Morphometrics. P. Aerts, K. D Août, A. Herrel & R. Van Damme, Eds. Topics in Functional and Ecological Vertebrate Morphology Agrawal AA (2001) Phenotypic plasticity in the interactions and evolution of species. Science 294: Alberch P (1991) From genes to phenotype: dynamic systems and evolvability. Genetica 84:5-11. Alberch PG, Gould SJ, Oster GF, Wake DB (1979) Size and shape in ontogeny and phylogeny. Paleobiology 5: Allende ML, Amsterdam A, Becker T, Kawakami K, Gaiano N, Hopkins N (1996) Insertional mutagenesis in zebrafish identifies two novel genes, pescadillo and dead eye, essential for embryonic development..genes Dev 10(24): Amara R (2003) Seasonal ichthyodiversity and growth patterns of juvenile flatfish on a nursery ground in the Southern Bight of the North Sea (France). Environ Biol Fish 67: Amundsen PA, Knudsen R, Klemetsen A (2007) Intraspecific competition and density dependence of food consumption and growth in Arctic charr. J Animal Ecol 76: Anderson JL, Rodriguez Mari A, Braasch I, Amores A, Hohenlohe P, Batzel P, Postlethwait JH (2012) Multiple sex-associated regions and a putative sex chromosome in zebrafish revealed by RAD mapping and population genomics. PLoS One, 7 (2012), p. e Angers B, Castonquay E, Massicotte R (2010) Environmentally induced phenotypes and DNA methylation: how to deal with unpredictable conditions until the next generation and after. Mol Ecol. 19: Aubin-Horth N, Renn CPS (2009) Genomic reaction norms: using integrative biology to understand molecular mechanisms of phenotypic plasticity. Mol Ecol. 18: Azaza MS, Dhraief MN, Kraiem MM (2008) Effects of water temperature on growth and sex ratio of juvenile Nile tilapia Oreochromis niloticus (Linnaeus) reared in geothermal waters in southern Tunisia. J Thermal Biol 33: Baker JA, Cresko WA, Foster SA, Heins DC (2005) Life-history differentiation of benthic and limnetic ecotypes in a polytypic population of threespine stickleback (Gasterosteus aculeatus). Evol Ecol Res 7: Balon EK (1999) Alternative ways to become a juvenile or a definitive phenotype (and on some persisting linguistic offences). Environ Biol Fish 56: Barimani S, Kazemi MB, Hazaei K (2013) Effects of Different Photoperiod Regimes on Growth and Feed Conversion Rate of Young Iranian and French Rainbow Trout (Oncorhynchus mykiss). WASJ 21(10): Barlow CG, Pearce MG, Rodgers LJ, Clayton P (1995). Effects of photoperiod on growth, survival and feeding periodicity of larval and juvenile barramundi Lates calcarifer (Bloch). Aquaculture, 138(1-4): Beldade P, Mateus ARA, Keller RA (2011) Evolution and molecular mechanisms of adaptive developmental plasticity. Mol Ecol 20: Bininda-Emonds ORP, Jeffery JE, Richardson MK (2003). Inverting the hourglass: quantitative evidence against the phylotypic stage in vertebrate development. Proc. Biol. Sci. 270: Blais A, Tsikitis M, Acosta-Alvear D, Sharan R, Kluger Y, Dynlacht BD (2005) An initial blueprint for myogenic differentiation. Genes & Dev 19(5): Blanco Vives B, Villamizar N, Ramos J (2010) Effect of daily thermo and photo-cycles of different light spectrum on the development of Senegal sole (Solea senegalensis) larvae. Aquaculture 306: Blaxter J (1991) The effect of temperature on larval fishes.neth J Zool 42(3):

214 Blaxter JHS (1988) Pattern and variety of development. In W.S. Hoar and D.J. Randall (editors), Fish physiology, Vol. HA, p Acad. Press, N.Y. Boeuf G, Bail PY (1999) Does light have an influence on fish growth? Aquaculture 177: Bolker JA (2012) Model species in evo devo: a philosophical perspective. Evolution and Development 16(1): Bookstein FL (1991) Morphometric tools for land- mark data: Geometry and biology. Cambridge Univ. Press, New York. Bradshaw AD (1965) Evolutionary significance of phenotypic plasticity in plants. Adv Genet. 13: Brown ME (1957) The growth of brown trout, Salmo trutta Linn. II. The growth of two-year-old trout at a constant temperature of 11.5 C. J Exp Biol 22: Bulmer MG, Bull JJ (1982) Models of polygenic sex determination and sex-ratio control. Evolution 36: Casadei R, Pelleri MC, Vitale L, Facchin F, Lenzi L, Canaider S, Strippoli P, Frabetti F (2011) Identification of housekeeping genes suitable for gene expression analysis in the zebrafish. Gene Expr Patterns 11(3-4): Cheshenko K, Brion F, Le Page Y, Hinfray N, Pakdel F, Kah O, Segner H, Eggen RI (2007) Expression of Zebra Fish Aromatase cyp19a and cyp19b Genes in Response to the Ligands of Estrogen Receptor and Aryl Hydrocarbon Receptor. Toxicol Sci 96(2): Chiang E, Yan Y, Tong S, Hsiao P, Guiguen Y, Postlethwait J, Chung B (2001). Characterization of Duplicated Zebrafish cyp19 Genes. J Exp Zool 290: Chiang EF, Pai CI, Wyatt M, Yan YL, Postlethwait J, Chung B (2001) Two sox9 genes on duplicated zebrafish chromosomes: expression of similar transcription activators in distinct sites. Dev Biol 231: Chiang EF, Yan YL, Guiguen Y, Postlethwait J, Chung BC: Two Cyp19 (P450 aromatase) genes on duplicated zebrafish chromosomes are expressed in ovary or brain. Mol Biol Evol 2001, 18: Condon CH, Chenoweth SF, Wilson RS (2010) Zebrafish take their cue from temperature but not photoperiod for the seasonal plasticity of thermal performance. J Exp Biol 1;213(Pt 21): Conover DO, Fleisher MH (1986). Temperature-sensitive period of sex determination in the atlantic silverside, Menidia menidia. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences, 43(3): Conover DO & Kynard BE (1981). Environmental sex determination: interaction of temperature and genotype in a fish Science 213: Corti M, Loy A, Cataudella S (1996) Form changes in the sea bass, Dicentrarchus labrax (Moronidae: Teleostei), after acclimation to freshwater: an analysis using shape coor- dinates. Environ Biol Fish 47(2): Cote G, Perry G, Blier P, Bernatchez L (2007) The influence of gene-environment interactions on GHR and IGF-1 expression and their association with growth in brook charr, Salvelinus fontinalis (Mitchill). BMC Genetics 8:87. D Cotta H, Fostier A, Guiguen Y, Govoroun M & Baroiller JF (2001). Aromatase plays a key role during normal and temperature induced sex differentiation of tilapia Oreochromis niloticus. Mol. Reprod. Dev 59: D'Arcy WT (1917). Ανάπτυξη και μορφή στο φυσικό κόσμο. Μτφρ. Αμαλία Κώνστα. Πανεπιστημιακές εκδόσεις ΕΜΠ, D Cott JR, Johnston IA (2012) Temperature during embryonic development has persistent effects on thermal acclimation capacity in zebrafish. PNAs 109(35): De Beer GR (1958) Embryos and Ancestors. Third Edition. Clarendon Press, Oxford. Debat V & David P (2001). Mapping phenotypes: canalization, developmental stability and phenotypic plasticity. Trends Ecol Evol 16: Devlin RH, Nagahama Y (2002) Sex determination and sex differentiation in fish: an overview of genetic, physiological, and environmental influences. Review article. Aquaculture 208: Diotel N, Page YL, Mouriec K, et al. (2010) Aromatase in the brain of teleost fish: expression, regulation and putative functions. Front Neuroendocrinol 31: Eklov P, Svanback R (2006) Predation Risk Influences Adaptive Morphological Variation in Fish Populations. 167(3): Engeszer RE, Patterson LB, Rao AA, Parichy DM (2007). Zebrafish in the wild: A review of natural history and new notes from the field. Zebrafish 4(1): Ernst DH (2000). Performance engineering. p In:/ Encyclopedia of Aquaculture/ R. R Stickney (Eds), New York, Chichester, Weinheim, Brisbane, Singapore, Toronto, Wiley- Interscience Publication. 212

215 Fjelldal, PG, Nordgarden U, Berg A, Grotmol S, Totland GK, Wargelius A, Hansen T (2004) Vertebrae of the trunk and tail display different growth rates in response to photoperiod in Atlantic salmon,salmo salar L., post-smolts. Aquaculture 250: Fordyce JA (2006) The evolutionary consequences of ecological interactions mediated through phenotypic plasticity. J Exp Biol 209: Francis RC (1984) The effects of bidirectional selection for social dominance on agonistic behavior and sex ratios in the paradise fish (Macropodus opercularis). Behaviour 90:25 45 Franz Odentaal T, Adriaens D (2014) Comparative developmental osteology of the seahorse skeleton reveals heterochrony amongst Hippocampus sp. and progressive caudal fin loss. EvoDevo 2014, 5:45. Fuiman LA (1994) The interplay of ontogeny and scaling in the interactions of fish larvae and their predators. J Fish Biol 45(Suppl A): Fuiman LA (2002) Special Considerations of Fish Eggs and Larvae. In: Fuiman LA & Werner RG (Eds.), Fishery Science.The Unique Contributions of Early Life Stages. Blackwell Science Ltd., Oxford, Malden, Iowa, Carlton, Berlin. pp Fuiman LA, Batty RS (1997) What a drag it is getting cold: Partitioning the physical and physiological effects of temperature on fish swimming. J Exp Biol 200: Fuiman LA, Higgs DM (1997) Ontogeny, growth, and the recruitment process. In: Chambers RC, Trippel EA (Eds.) Early life history and recruitment in fish populations. Chapman and Hall, London, pp Fuiman LA, Poling KR & Higgs DM (1998). Quantifying developmental progress for comparative studies of larval fishes. Copeia 1998: Fusco G, Minelli A (2010) Phenotypic plasticity in development and evolution: facts and concepts. Philos Trans R Soc B 365: Gadomski DM, Caddell SM (1991) Effects of temperature on early-life-history stages of California halibut Paralichthys californicus. Fish Bull 89: Gavaia PJ, Simes DC, Ortiz-Delgado JB, Viegas CS, Pinto JP, Kelsh RN, Sarasquete MC, Cancela ML (2006) Osteocalcin and matrix Gla protein in zebrafish (Danio rerio) and Senegal sole (Solea senegalensis): comparative gene and protein expression during larval development through adulthood. Gene Expr Patterns 6(6): Georga I, Koumoundouros G (2010) Thermally Induced Plasticity of Body Shape in Adult Zebrafish Danio rerio (Hamilton, 1822). J Morphol 271: Georgakopoulou E, Sfakianakis DG, Kouttouki S, Divanach P, Kentouri M, Koumoundouros G (2007) The influence of temperature during early life on phenotypic expression at later ontogenetic stages in sea bass. J Fish Biol 70: Georgakopoulou E, Sfakianakis DG, Kouttouki S, Divanach P, Kentouri M, Koumoundouros G (2007) The influence of temperature during early life on phenotypic expression at later ontogenetic stages in sea bass. J Fish Biol 70: Ghalambor CK, McKay JK, Carroll SP, Reznick DN (2007) Adaptive versus non-adaptive phenotypic plasticity and the potential for contemporary adaptation in new environments. Funct Ecol 21: Gibb AC, Liu C, Swanson BO (2007) Heterochrony and the development of the escape response: prehatching movements in the rainbow trout Oncorhynchus mykiss. J Exp Zool 307A: Gibson G (2008) The environmental contribution to gene expression profiles. Nat Rev Genet 9: Gilbert SF (2001) Ecological developmental biology: Developmental biology meets the real world. Dev Biol 233(1):1-12. Gilbert SF, Epel D (2009) Ecological developmental biology: integrating epigenetics, medicine, and evolution. Sunderland, MA: Sinauer. Godwin J, Luckenbach JA, Borski RJ (2003) Ecology meets endocrinology: environmental sex determination in fishes. Evol Dev 5: Gonda A, Herczeg G, Merila J (2009) Habitat-dependent and -independent plastic responses to social environment in the nine-spined stickleback (Pungitius pungitius) brain. Proc R Soc Lond Biol 276: Gotthard K, Nylin S (1995) Adaptive plasticity and plasticity as an adaptation: a selective review in animal morphology and life history. Oikos 74:3 17. Gould SJ (1966). Allometry And Size In Ontogeny And Phylogeny. Biol Rev 41: Gould SJ (1977) Ontogeny and Phylogeny. Belknap Press of Harvard University Press, Cambridge, MA. Guderley H (2004) Metabolic responses to low temperature in fish muscle. Biol Rev 79: Guderley H, Johston IA (1996) Plasticity of fish muscle mitochondria with thermal acclimation. The Journal of Exp Biol 199:

216 Guerro-Estevez S, Moreno-Mendoza N (2009) Sexual determination and differentiation in teleost fish. Rev. Fish Biol Fish 20: Guiguen Y, Fostier A, Piferrer F, Chang CF (2010). Ovarian aromatase and estrogens: A pivotal role for gonadal sex differentiation and sex change in fish. Gen Comp Endocrinol. 165: Gunter HM, Koppermann C, Meyer A (2014). Revisiting de Beer s textbook example of heterochrony and jaw elongation in fish: calmodulin expression reflects heterochronic growth, and underlies morphological innovation in the jaws of belonoid fishes. EvoDevo 5:8. Hall BK (1992) Waddington's legacy in development and evolution. Amer Zool Hall BK, Pearson RD and Müller GB (eds.) (2004). Environment, Development and Evolution. Toward a Synthesis. The MIT Press, Cambridge. Handeland SO, Imsland AK, Stefanssona SO (2008) The effect of temperature and fish size on growth, feed intake, food conversion efficiency and stomach evacuation rate of Atlantic salmon postsmolts. Aquaculture 283: Harris MP, Rohner N, Schwarz H, Perathoner S, Konstantinidis P, Nüsslein-Volhard C (2008) Zebrafish eda and edar mutants reveal conserved and ancestral roles of ectodysplasin signaling in vertebrates..plos Genet 4(10):e Hashida SN, Uchiyama T, Martin C, Kishimab Y, Sanob Y, Mikami T (2006) The temperature dependent change in methylation of the Antirrhinum transposon Tam3 is controlled by the activity of its transposase. Plant Cell 18: Hazlerigg CRE, Lorenzen K, Thorbek P, Wheeler JR, Tyler CR (2012) Density-Dependent Processes in the Life History of Fishes: Evidence from Laboratory Populations of Zebrafish Danio rerio. PLoS One 7(1): Helterline DL, Garikipati D, Stenkamp DL, Rodgers BD (2007) Embryonic and tissue-specific regulation of myostatin-1 and -2 gene expression in zebrafish. Gen Comp Endocrinol 151(1): Herpin A, Braasch I, Kraeussling M, Schmidt C, Thoma EC, Nakamura S (2010) Transcriptional Rewiring of the Sex Determining dmrt1 Gene Duplicate by Transposable Elements. PLoS Genet 6(2):e Hill AJ, Teraoka H, Heideman W, Peterson RE (2005) Zebrafish as a Model Vertebrate for Investigating Chemical Toxicity. Toxicol. Sci. 86(1):6-19. Ho DH, Burggren WW (2010) Epigenetics and transgenerational transfer: a physiological perspective. J Exp Biol 213:3 16. Holmes JA, Youson JH (1997) Laboratory study of the effects of spring warming and larval density on the metamorphosis of sea lampreys. Trans Am Fish Soc 126: Holmes JA, Youson JH (1998) Limits and optimal environmental temperatures for metamorphosis in sea lampreys. Trans Am Fish Soc 127: Hopkins KD (1992) Reporting Fish Growth: A Review of the Basics. 23(3): Hsiao CD, Tsai HJ (2003). Transgenic zebrafish with fluorescent germ cell: a useful tool to visualize germ cell proliferation and juvenile hermaphroditism in vivo. Dev Biol 262: Imsland AK, Foss A, Gunnarsson S, Berntssen M, FitzGerald R, Bonga SW, van Ham E, Nævdal G, Stefansson SO (2001). The interaction of temperature and salinity on growth and food conversion in juvenile turbot (Scophthalmus maximus). Aquaculture 198: Janzen FJ Krenz JG (2004) Phylogenetics: Which was First, TSD or GSD? Pp in Temperature dependent sex determination in vertebrates (N. Valenzuela & V. A. Lance, Eds.) Smithsonian Institution. Jennings S, Pinnegar JK, Polunin NVC, Boon TW (2001) Weak cross-species relationships between body size and trophic level belie powerful size-based trophic structuring in fish communities. J Animal Ecol 70: Johnston IA (1993) Temperature influences muscle differentiation and the relative timing of organogenesis in herring (Clupea harengus) larvae. Mar Biol 116: Johnston IA (2006). Environment and plasticity of myogenesis in teleost fish. J Exp Biol 209(12): Johnston IA, Abercromby M, Andersen O (2006) Muscle fibre number varies with haemoglobin phenotype in Atlantic cod as predicted by the optimal fibre number hypothesis. Biol Lett 2(4): Johnston IA, Lee HT, Macqueen DJ, Paranthaman K, Kawashima C, Anwar A, Kinghorn JR, Dalmay T (2009) Embryonic temperature affects muscle fibre recruitment in adult zebrafish: Genomewide changes in gene and microrna expression associated with the transition from hyperplastic to hypertrophic growth phenotypes. J Exp Biol 212: Johnston IA, Temple GK (2002) Thermal plasticity of skeletal muscle phenotype in ectothermic vertebrates and its significance for locomotory behaviour. J Exp Biol 205:

217 Johnston IA, Vieira VLA, Temple GK (2001) Functional consequences population differences in the developmental plasticity of muscle to temperature in Atlantic herring Clupea harengus. Mar Ecol Prog Ser 213: Jordaan, A, Hayhurst SE Kling LJ (2006) The influence of temperature on the stage at hatch of laboratory reared Gadus morhua and implications for comparisons of length and morphology. J Fish Biol 68:7 24. Jørgensen A, Morthorst JE, Andersen O, Rasmussen LJ, Bjerregaard P (2008) Expression profiles for six zebrafish genes during gonadal sex differentiation. Reprod Biol Endocrinol 6:25. Kallivretaki E, Eggen RI, Neuhauss SC, Kah O, Segner H (2007) The zebrafish, brain-specific, aromatase cyp19a2 is neither expressed nor distributed in a sexually dimorphic manner during sexual differentiation. Dev Dyn 236(11): Kamler E. (1992) Early Life History of Fish: An Energetics Approach. London: Chapman & Hall. Kamler E. (2002). Ontogeny of yolk-feeding fish: An ecological perspective. Reviews in Fish Biology and Fisheries 12(1): Kelly SA, Panhuis TM, Stoehr AM (2012) Phenotypic plasticity: molecular mechanisms and adaptive significance. Compr Physiol 2: Kendall AW Jr Ahlstrom EH, Moser HG (1984) Early life history stages of fishes and their characters, p In: H.G. Moser, W.J. Richards, D.M. Cohen, M.P. Fahay, A.W. Kendall, Jr., and S.L. Richardson (Eds.), Ontogeny and Systematics of Fishes. Amer. Soc. Ichthyol. Herpetol. Spec. Publ. No. 1. Allen Press, Lawrence, Kansas. Kerr T, Roalson EH, Rodgers BD (2005) Phylogenetic analysis of the myostatin gene sub-family and the differential expression of a novel member in zebrafish. Evol Dev 7(5): Kikuchi K, Hamaguchi S (2013) Novel sex-determining genes in fish and sex chromosome evolution. Dev Dyn 42: Kimmel CB, Ballard WW, Kimmel SR, Ullmann B, Schilling TF (1995) Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn 203(3): Kinoshita Y, Jarell AD, Flaman JM, Foltz G, Schuster J, Sopher BL, Irvin DK, Kanning K, Kornblum HI, Nelson PS, Hieter P, Morrison RS. (2000) Pescadillo, a novel cell cycle regulatory protein abnormally expressed in malignant cells. J Biol Chem 276(9): Kirpichnikov VS (1981). Genetic Bases of Fish Selection. Springer, Berlin. Klingenberg CP (1998) Heterochrony and allometry: the analysis of evolutionary change in ontogeny. Biol Rev 73: Koopman P, Wilhelm D (2011) SRY, Sex Determination and Gonadal Differentiation. In: els. John Wiley & Sons Ltd. Koumoundouros G, Ashton C, Sfakianakis DG, Divanach P, Kentouri M, Anthwal N, Stickland NC (2009) Thermally induced phenotypic plasticity of swimming performance in European sea bass [Dicentrarchus labrax (Linnaeus 1758)] juveniles. J Fish Biol 74: Koumoundouros G, Divanach P, Kentouri M (1999) Ontogeny and allometric plasticity of Dentex dentex (Osteichthyes: Sparidae) in rearing conditions. Mar Biol 135(3), Koumoundouros G, Divanach P, Anezaki L, Kentouri M (2001) Temperature-induced ontogenetic plasticity in sea bass (Dicentrarchus labrax). Mar Biol 139(5): Koumoundouros G, Pavlidis M, Anezaki L, Kokkari C, Divanach P & Kentouri M (2002) Temperature sex determination in the European sea bass, Dicentrarchus labrax (L., 1758) (Teleostei, Perciformes, Moronidae). Exp Zool 292: Koumoundouros G. Sfakianakis DG, Divanach P. Kentouri M (2002). Effect of temperature on swimming performance of sea bass juveniles. J Fish Biol 60: Kovac V (2002) Synchrony and heterochrony in ontogeny. J Theor Bio 217: Kraak SBM, De Looze EMA (1993) A new hypothesis on the evolution of sex determination in vertebrates big females ZW, big males XY. Neth J Zool 43: Kristjansson BK (2005) Rapid morphological changes in threespine stickleback. Gasterosteus aculeatus, in freshwater. Environ Biol Fish 74: Krueger W, Oliveira K (1999) Evidence for environmental sex determination in the American eel, Anguilla rostrata. Environ Biol Fish 55: Kulkarni MM (2011) Digital multiplexed gene expression analysis using the NanoString ncounter system. Curr Protoc Mol Biol 2011 Apr;Chapter 25:Unit25B.10. Larionov A, Krause A. Miller WA (2005) A Standard curve based method for relative real time PCR data processing. BMC Bioinform 6:62. Lawrence C, Ebersole JP, Kesseli RV (2008) Rapid growth and out-crossing promote female development in zebrafish (Danio rerio) Environ Biol Fish 81: Le Page Y, Diotel N, Vaillant C, Pellegrini E, Anglade I, Merot Y, Olivier K (2010) Aromatase, brain sexualization and plasticity: the fish paradigm 32:

218 Lele Z, Krone P H (1996). The zebrafish as a model system in developmental, toxicological and transgenic research. Biotechnology Advances 14(1), Liew WC Orbán L (2013) Zebrafish sex: a complicated affair Brief Funct Genomics. 13(2): Liew WC, Bartfai R, Lim Z, Sreenivasan R, Siegfried KR, Orban L (2012) Polygenic Sex Determination System in Zebrafish. PLoS ONE 7(4): e Lindsey CC (1969) Factors controlling meristic variation. p In:/Fish Physiology, Vol. XI, W. S. Hoar & D. J. Randall (Eds.), New York, Academic Press. Lindsey CC (1988) Factors controlling meristic variation. In: Hoar WS, Randall DJ, (Eds.). Fish Physiology, Vol. XIA. London: Academic Press. pp Liu L, Ge W (2007) Growth Differentiation Factor 9 and Its Spatiotemporal Expression and Regulation in the Zebrafish Ovary. Biol. Reprod. 76(2): Liu W, Saint DA (2002) Validation of a quantitative method for real time PCR kinetics. Biochem Biophys Res Commun 294: Liu Z, Chen A, Yang Z, Wei H, Leng X (2011) Molecular characterization of growth differentiation factor 9 and its spatio-temporal expression pattern in gibel carp (Carassius auratus gibelio). Mol. Biol. Rep. 39(4): López-Olmeda, JF, Sánchez-Vázquez FJ (2009) Zebrafish temperature selection and synchronization of locomotor activity circadian rhythm to ahemeral cycles of light and temperature. Chronobiology International, 26(2): Loy A, Cataudella S, Corti M (1996a) Changes in shape during the growth if sea bass, Dicentrarchus labrax (Teleosea: Perciformes), in relation to different rearing conditions: an application of the Thin-Plate Splines regression analysis. In: Marcus, L. F., Corti M., Loy A., Naylor G. J. P., Slice D. E. (Eds.), Advances in Morphometrics, NATO ASI series A, No 284. Plenum Press, New York: Loy A, Ciccotti, E., Ferrucci L, Cataudella, S. (1996b). An application of automated feature extraction and geometric morphometrics: Temperature-related changes in body form of Cyprinus carpio juveniles. Aquacultural Engineering, 15(4): Maack G, Segner H (2003) Morphological development of the gonads in zebrafish. J Fish Biol 62(4): Mabee PM1, Olmstead KL, Cubbage CC (2000) An experimental study of intraspecific variation, developmental timing, and heterochrony in fishes. Evolution. 54(6): Macqueen DJ, Robb DH, Olsen T, Melstveit L, Paxton CG, Johnston IA (2008) Temperature until the eyed stage of embryogenesis programmes the growth trajectory and muscle phenotype of adult Atlantic salmon. Biology Letters. 2008;4(3): Marks C, Lombardo SM, Formanik KL, Moore FBG, Bagatto B (2012) The influence of ontogenetic dietary fluctuations on zebrafish size and swimming performance. Front Physiol 3:310. Marks C, West TN, Bagatto, B, Moore FBG (2005) Developmental environment alters conditional aggression in zebrafish. Copeia 2005: Martell DJ, Kieffer JD (2007) Persistent effects of incubation temperature on muscle development in larval haddock (Melanogrammus aeglefinus L.). J Exp Biol 210: Martin WR (1949) The mechanics of environmental control of body form in fishes. University of Toronto. Biological Serie. No 58. Publications of the Ontario Fish Research Lab, No. 70. Martinez-Palacios CA, Chavez-Sanchez MC, Ross LG (1996) The effects of the water temperature on food intake, growth and body composition of Cichasoma urophthalmus (Gunther) juveniles. Aquaculture Research 2: Marvin M, O'Rourke D, Kurihara T, Juliano CE, Harrison KL, Hutson LD (2008) Developmental expression patterns of the zebrafish small heat shock proteins. Dev Dyn 237(2): Mayr E (1963) Animal Species and Evolution. Belknap Press, Cambridge, MA. McClelland GB, Craig PM, Dhekney K Dipardo S (2006). Temperature-and exercise-induced gene expression and metabolic enzyme changes in skeletal muscle of adult zebrafish (Danio rerio). J Physiol 557: McCormick MI, Makey L, Dufour V (2002) Comparative study ofmetamorphosis in tropical reef fishes. Mar Biol 141(5): McCurley AT, Callard GV (2008) Characterization of housekeeping genes in zebrafish: male-female differences and effects of tissue type, developmental stage and chemical treatment. BMC Mol Biol 9:102. McKinney ML, McNamara KJ (1991) Heterochrony: The evolution of ontogeny. New York: Plenum Press. McNamara KJ (1986) A guide to the nomenclature of heterochrony. J Paleon 60: McNamara KJ (1997) Shapes of time: the evolution of growth and development. Baltimore: Johns Hopkins University Press. McNamara KJ (2012) The Evolution of Development. Evo-Devo 5:

219 Meyer A (1987) Phenotypic plasticity and heterochrony in Cichlasoma managuense (Pisces. Cichlidae) and their implications for speciation in cichlid fishes. Evolution 41: Meyer A (1987) Phenotypic plasticity and heterochrony in Cichlasoma managuense (Pisces. Cichlidae) and their implications for speciation in cichlid fishes. Evolution 41: Moore EC, Roberts RB (2013) Polygenic sex determination. Curr Biol 23:R510-R512. Moore FBG, Hosey M, Bagatto B (2006) Cardiovascular system in larval zebrafish responds to developmental hypoxia in a family specific manner. Frontiers in zoology 3:4-14. Morman RH (1987) Relationship of density to the growth and metamorphosis of caged larval sea lampreys, Petromyzon marinus Linnaeus, in Michigan streams, J Fish Biol 30: Moss EG (2007) Heterochronic Genes and the Nature of Developmental Time. Current Biology 17(11) R425 R434. Moustakas CT, Watanabe WO, Copeland KA (2004) Combined effects of photoperiod and salinity on growth, survival, and osmoregulatory ability of larval flounder Paralichthys lethostigma. Aquaculture 229: Muller GB (2010) Epigenetic Innovation-Chapter 12. In Evolution The extended Synthesis. Pigliucci M. and G.B. Muller (Eds.) MIT Press. Murdoch WW (1994) Population regulation in theory and practice. Ecology 75: Murray CB, Beacham T (1989) Responses of meristic characters in chum salmon (Oncorhynchus keta) to temperature changes during development. Can J Zool. 67(3): Can J Zool 67(3): Myers RA, Cadigan NG (1993) Density-Dependent Juvenile Mortality in Marine Demersal Fish. Can J Fis Aquat Scie 50(8): Nagel R, Isberner K (1998) Testing of chemicals with fish - a critical evaluation of tests with special regard to zebrafish. Fish Ecotoxicology 86: Navarro-Martín L, Viñas J, Ribas L, Díaz N, Gutiérrez A, Di Croce L, et al. (2011) DNA Methylation of the Gonadal Aromatase (cyp19a) Promoter Is Involved in Temperature-Dependent Sex Ratio Shifts in the European Sea Bass. PLoS Genet 7(12): e doi: /journal.pgen Nicoglou A (2011) Defining the Boundaries of Development with Plasticity. Biological Theory 6(1): Nijhout HF, Roff DA, Davidowitz G. (201o) Conflicting processes in the evolution of body size and development time. Philos Trans R Soc B Biol 365(1540): Nikolioudakis N, Koumoundouros G, Kiparissis S, Somarakis S. (2010). Defining length-atmetamorphosis in fishes: a multi-character. Mar Biol 157: Nikolioudakis N, Koumoundouros G, Somarakis S (2014) Synchronization in allometric and morphological changes during metamorphosis: comparison among four sparid species. Aquat Biol 21: Ochi H, & Westerfield M (2007) Signaling networks that regulate muscle development: Lessons from zebrafish. Dev Growth Differ 49(1), Ochi H, Westerfield M (2007) Signaling networks that regulate muscle development: Lessons from zebrafish. Dev Growth Differ 49(1):1-11. Odendaal TA, Dominique D (2014) Comparative developmental osteology of the seahorse skeleton reveals heterochrony amongst Hippocampus sp. and progressive caudal fin loss. EvoDevo 5:45. Onichtchouk D, Aduroja K, Belting HG, Gnugge L, Driever W (2003) Transgene Driving GFP Expression From the Promoter of the Zona Pellucida Gene zpc Is Expressed in Oocytes and Provides an Early Marker for Gonad Differentiation in Zebrafish. Dev Dynamics 228: Orban L. Sreenivasan R. Olsson PE (2009). Long and winding roads: testis differentiation in zebrafish. Mol. Cell. Endocrinol. 312: Ospina-Alvarez N, Piferrer F. Temperature-dependent sex determination in fish revisited: prevalence, a single sex ratio response pattern, and possible effects of climate change. PLoS One 2008;3:e2837. Parichy DM, Elizondo MR, Mills MG, Gordon TN, Engeszer RE (2009) Normal table of postembryonic zebrafish development: staging by externally visible anatomy of the living fish. Dev Dyn 238(12): Parichy DM, Turne JM (2003) Zebrafish puma mutant decouples pigment pattern and somatic metamorphosis. Dev Biol 256: Pavlidis M, Koumoundouros G, Sterioti A, Somarakis S, Divanach P, Kentouri M (2000) Evidence of temperature-dependent sex determination in the european sea bass (Dicentrarchus labrax L.). J Exp Zool 287(3): Pedersen T, Jobling M (1989) Growth rates of large, sexually mature cod, Gadus morhua, in relation to condition and temperature during an annual cycle. Aquaculture 81:

220 Pelegri F, Schulte-Merker S (1998) A gynogenesis-based screen for maternal-effect genes in the zebrafish Danio rerio. In: Detrich HW, Westerfield M, Leonard IZ, editors. Methods in Cell Biology. Waltham, MA: Academic Press. pp Penman DJ, Piferrer F (2008) Fish gonadogenesis. Part I: genetic and environmental mechanisms of sex determination. Rev Fish Sci 16(S1): Peres-Neto PR & Magnan P (2004) The influence of swimming demand on phenotypic plasticity and mor- phological integration: a comparison of two polymor- phic charr species. Oecologia 140: Pfennig DW (1990) The adaptive significance of an environmentally cued developmental switch in an anuran tadpole. Oecologia 85: Piferrer F, Blázquez M, Navarro L, González A (2005) Genetic, endocrine, and environmental components of sex determination and diverentiation in the European sea bass (Dicentrarchus labrax L.). Gen Comp Endoc 142: Piferrer F, Blázquez M, Navarro L, Gonzalez A (2008). Genetic, endocrine, and environmental components of sex determination and differentiation in the European sea bass (Dicentrarchus labrax L.) Gen Comp Endocrinol 142: Piferrer F, Guiguen Y (2008) Fish gonadogenesis. Part II: molecular biology and genomics of sex differentiation. Rev Fish Sci 16(S1): Piferrer F, Ribas L, Díaz N (2012) Genomic Approaches to Study Genetic and Environmental Influences on Fish Sex Determination and Differentiation. Mar Biotech (New York, N.y). 14(5): Piferrer F, Ribas L, Díaz N. (2012) Genomic Approaches to Study Genetic and Environmental Influences on Fish Sex Determination and Differentiation. Mar Biotech 14(5): Pigliucci M (2001) Phenotypic Plasticity: Beyond Nature and Nurture. Baltimore, MD: Johns Hopkins University Press. Pigliucci M, Schlichting CD, Jones CS & Schwenk K (1996). Developmental reaction norms: The interactions among allometry, ontogeny and plasticity. Plant Species Biol, 11: Pigliucci M., Murren CJ, Schlichting CD (2006) Phenotypic plasticity and evolution by genetic assimilation. J Exp Biol 209(12): Pinto JP, Conceição N, Gavaia PJ, Cancela ML (2003) Matrix Gla protein gene expression and protein accumulation colocalize with cartilage distribution during development of the teleost fish Sparus aurata. Bone 32(3): Plaut I, Gordon M (1994) Swimming metabolism of wild-type and cloned zebrafish Brachydanio rerio. J Exp Biol 194(1):209. Posner M (2003) A Comparative View of Alpha Crystallins: The contribution of comparative studies to understanding function. Integr Comp Biol 43(4): Price, TD, Qvarnstrom A, Irwin DE (2003) The role of phenotypic plasticity in driving genetic evolution. Proc R Soc Lond B Biol Sci 270: Raff RA (1996) The shape of life: genes, development and the evolution of animal form. Chicago: Chicago University Press. Raff RA, Kaufman TC (1983) Embryos, genes, and evolution: The developmental-genetic Ramler D, Mitteroecker P, Shama LNS, Wegner KM, Ahnelt H (2014) Nonlinear effects of temperature on body form and developmental canalization in the threespine stickleback. J Evol Biol 27: Raz E (2002) Primordial germ cell development in zebrafish. Seminars in Cell and Developmental Biology, 13(6): Reznick DN, Shaw FH, Rodd HF, Shaw RG (1997) Evaluation of the rate of evolution in natural populations of guppies (Poecilia reticulata) Science 275: Ribas L, Piferrer F (2013) The zebrafish (Danio rerio) as a model organism, with emphasis on applications for finfish aquaculture research. Rev. Aquac. 5:1 32. Rice SH (1997) The analysis of ontogenetic trajectories: when a change in size or shape is not heterochrony. Proceedings of the National Academy of Sciences, U.S.A. 94: Rice WR (1986) On the instability of polygenic sex determination - the effect of sex-specific selection. Evolution 40: Ricker WE (1979) Growth rates and models. In fish physiology vol. VIII. Academic Press, New York, pp Robinson BW, Parsons KJ (2002) Changing times, spaces, and faces: tests and implications of adaptive morphological plasticity in the fishes of northern postglacial lakes. Cana- dian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences 59: Rodríguez-Marí A, Cañestro C, Bremiller RA, Nguyen-Johnson A, Asakawa K, Kawakami K, Postlethwait JH (2010) Sex reversal in zebrafish fancl mutants is caused by Tp53-mediated germ cell apoptosis. PLoS Genet Jul 22;6(7):e

221 Rodriguez-Mari, A., and Postlethwait, J.H. (2011) The Role of Fanconi Anemia/BRCA Genes in Zebrafish Sex Determination. Chapter 20. Meth Cell Biol 105: Roff DA (1992) The Evolution of Life Histories: Theory and Analysis. Chapman and Hall, London. pp Roff DA (1992). The Evolution of Life Histories: Theory and Analysis. Chapman and Hall, London. pp Rohlf (1996). Morphometric spaces, shape components and the effects of linear transformations. Pp in Marcus et al. Advances in morphometrics. Rohlf and Slice (1990). Extensions of the Procrustes method for the optimal superimposition of landmarks. Systematic Zool 39: Rohlf FJ (2008) tpsdig, version Stony Brook, NY: Department of Ecology and Evolution, State University of New York. Rose KA, Cowan JH Jr, O Winemiller K, Myers RA, Hilborn R (2001) Compensatory density dependence in fish populations: importance, controversy, understanding and prognosis. Fish and Fisheries 2: Ross CS, Reiss JI (1993) Metamorphosis and the vertebrate skull: Ontogenetic patterns and developmental mechanisms. In: Hanken J & Hall BK (Eds.), The Vertebrate Skull, vol. 1, Chicago, University of Chicago Press. Sarkar S (1999) From the Reaktionsnorm to the adaptive norm: the norm of reaction, Biology and Philosophy 14: Sarre SD, Georges A. Quinn A (2004) Τhe ends of a continuum: genetic and temperature dependent sex determination in reptiles. BioEssays 26: Schaefer JF, Ryan A (2006) Developmental plasticity in the thermal tolerance of zebrafish Danio rerio. J Fish Biology 69(3): Schlichting CD, Smith H (2002) Phenotypic plasticity: linking molecular mechanisms with evolutionary outcomes. Evol Ecol 16: Schmidt K, Starck JM (2011) Testing evolutionary hypotheses about the phylotypic period of zebrafish. J. Exp. Zool. (Mol. Dev. Evol.) 316: Schmidt K, Starck JM (2011) Testing evolutionary hypotheses about the phylotypic period of zebrafish. J. Exp. Zool. (Mol. Dev. Evol.) 316: Schmittgen TD & Livak KJ (2008) Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method. Nature Protocols 3: Scott GR, Johnston IA (2012) Temperature during embryonic development has persistent effects on thermal acclimation capacity in zebrafish. PNAS 109: Seikai T, Shimozaki M Watanabe T (1987) Estimation of larval stage determining the appearance of albinism in hatchery-reared flounder Paralichthys olivaceus. Nippon Suisan Gakkaishi 53: Sfakianakis DG, Leris I, Kentouri M. (2011). Effect of developmental temperature on swimming performance of zebrafish (Danio rerio) juveniles. Environ Biol Fish 90: Sfakianakis DG, Koumoundouros G, Divanach P, Kentouri M (2004). Osteological development of the vertebral column and of the fins in Pagellus erythrinus (L. 1758). Temperature effect on the developmental plasticity and morpho-anatomical abnormalities. Aquaculture 232: Sfakianakis DG, Leris I, Mylonas CC, Kentouri M (2011) Temperature during early life determines sex in zebrafish, Danio rerio (Hamilton, 1822). J Biol Res-Thessaloniki 17: Shang EH. Yu RMK Wu RSS (2006) Hypoxia Affects Sex Differentiation and Development, Leading to a Male-Dominated Population in Zebrafish (Danio rerio). Environmental Science and Technology 40: Sharpe DMT, Rasanen K, Berner D, Hendry AP (2008) Genetic and environmental contributions to the morphology of lake and stream stickleback: Implications for gene flow and reproductive isolation. Evol Ecol Res 10: Shive HR, West RR, Embree LJ, Azuma M, Sood R, Liu P Hickstein DD (2010) brca2 in zebrafish ovarian development, spermatogenesis, and tumorigenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 107: Siegfried KR, Nusslein-Volhard C (2008) Germ line control of female sex determination in zebrafish. Dev Biol 324: Siegfried Z, Simon I (2010) DNA methylation and gene expression. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med Issue 2(3): Simensen LM, Jonassen TM, Imsland AK (2000) Photoperiod regulation of growth of juvenile Atlantic halibut (Hippoglossus hippoglossus L.). Aquaculture 190: Simpson ER, Mahendroo MS, Means GD, Kilgore MW, Hinshelwood MM, Graham-Lorence S (1994) Aromatase cytochrome P450, the enzyme responsible for estrogen biosynthesis. Endocr. Rev. 15:

222 Sire JY, Huysseune A (2003) Formation of dermal skeletal and dental tissues in fish: a comparative and evolutionary approach. Biological Reviews 78: Smith KK (2002) Sequence heterochrony and the evolution of development. J Morphol 252: Snyder RJ, Dingle H (1990) Effects of freshwater and marine overwintering environments on life histories of threespine sticklebacks: Evidence for adaptive variation between anadromous and resident freshwater populations. Oecologia 84: Sola L, Gornung E (2001) Classical and molecular cytogenetics of the zebrafish, Danio rerio (Cyprinidae, Cypriniformes): an overview. Genetica 111: Spence R, Fatema MK, Ellis S, Ahmed ZF, Smith C (2007) Diet, growth and recruitment of wild zebrafish in Bangladesh. J Fish Biol 71: Spence R, Gerlach G, Lawrence C, Smith C (2007). The behaviour and ecology of the zebrafish (Danio rerio). Spence R, Runa KF, Reichard M, Huq KA, Wahab MA, Ahmed ZF, Smith C (2006) The distribution and habitat preferences of the zebrafish in Bangladesh. J Fish Biol 69: Spicer JI, Burggren WW (2003) Development of physiological regulatory systems: altering the timing of crucial events. Zool 106: Stearns SC (1989) The Evolutionary Significance of Phenotypic Plasticity. BioScience 39(7): Stearns SC (2000). Life history evolution: Successes, limitations, and prospects. Naturwissenschaften 87(11): Stearns SC, De Jong G, Newman R (1991) The effects of phenotypic plasticity on genetic correlations. Trends Ecol Evol 6: Stearns, SC (1992). The Evolution of Life Histories/. Oxford University Press, Oxford, pp Stickland NC, White RN, Mescall PE, Crook AR & Thorpe JE (1988) The effect of temperature on myogenesis in embryonic development of the Atlantic salmon (Salmo salar L). Anat Embryol 178: Strüssman CA, Nakamura M (2002). Morphology, endocrinology, and environmental modulation of gonadal sex differentiation in teleost fishes. Fish Physiology and Biochemistry 26: Swain DP, Foote CJ (1990) Stocks and chameleons: The use of phenotypic variation in stock identification. Fish Res 43: Takahashi H (1977) Juvenile hermaphroditism in the zebrafish Brachydanio rerio. Bull. Fac. Fish. Hokkaido Univ. 28: Tang R, Dodd A, Lai D, Mcnabb WC, Love DR (2007) Validation of Zebrafish (Danio rerio) Reference Genes for Quantitative Real-time RT-PCR Normalization. Acta Biochim Biophys Sin 39: Taylor JF, Migaud H, Porter MJR (2005) Photoperiod influences growth rate and plasma insulin-like growth factor-i levels in juvenile rainbow trout, Oncorhynchus mykiss. Gen Comp Endocr 142: Thorpe JE (1986) Age at first maturity in Atlantic salmon, Salmo salar: freshwater period influences and conflicts with smolting. Can Spec Publ Fish Aquat Sci 89:7-14. Trant JM, Gavasso S, Ackers J, Chung BC, Place AR (2001) Developmental expression of cytochrome P450 aromatase genes (CYP19a and CYP19b) in zebrafish fry (Danio rerio). J Exp Zool 290(5): Trukhina AV, Lukina NA, Wackerow-Kouzova ND Smirnov AF (2013) The Variety of Vertebrate Mechanisms of Sex Determination. BioMed Research International, vol. 2013, Article ID , 8 pages, Uchida D, Yamashita M, Kitano T, Iguchi T (2002) Oocyte apoptosis during the transition from ovarylike tissue to testes during sex differentiation of juvenile zebrafish. J Exp Biol. 205(Pt 6): Uchida D, Yamashita M, Kitano T, Iguchi T (2004) An aromatase inhibitor or high water temperature induce oocyte apoptosis and depletion of P450 aromatase activity in the gonads of genetic female zebrafish during sex-reversal. Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol 137: Villamizar N, Blanco-Vives B, Migaud H (2011) Effects of light during early larval development of some aquacultured teleosts: A review. Aquaculture 315: Vizziano-Cantonnet D, Baron D, Mahe S, Cauty C, Fostier A, Guiguen Y (2008) Estrogen treatment up-regulates female genes but does not suppress all early testicular markers during rainbow trout male-to-female gonadal transdifferentiation. J Mol Endocrinol 41: Von Hofsten J, Olsson P (2005) Zebrafish sex determination and differentiation: involvement of FTZ- F1 genes. Reprod Biol Endocrinol 3: 63. Wallace BMN, Wallace H (2003) Synaptonemal complex karyotype of zebrafish. Heredity 90: Wang XG, Orban L (2007) Anti-Mullerian hormone and 11 beta-hydroxylase show reciprocal expression to that of aromatase in the transforming gonad of zebrafish males. Dev Dyn 236:

223 Wang XG, Orban L (2007) Anti-Mullerian hormone and 11 beta-hydroxylase show reciprocal expression to that of aromatase in the transforming gonad of zebrafish males. Dev Dyn 236: Wang XG, Orban L. Anti-Mullerian hormone and 11 beta-hydroxylase show reciprocal expression to that of aromatase in the transforming gonad of zebrafish males. Dev Dyn 236: Werner RG (2002). Habitat requirements. In: Fuiman LA & Werner RG (Eds), Fishery Science: The Unique Contributions of Early Life Stages. Blackwell Science, Oxford. pp West-Eberhard MJ (1989) Phenotypic plasticity and the origins of diversity. Ann. Rev. Ecol. Syst. 20: West-Eberhard MJ (2005) Phenotypic accommodation: adaptive innovation due to developmental plasticity. J Exp Zool B Mol Dev Evol 304B(6): Westerfield M (1995). The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio), Third edition. University of Oregon Press, Eugene, OR. pp Whitman DW, Agrawal AA (2009) What is phenotypic plasticity and why is it important? In: Whitman DW, Ananthakrishna TN, editors. Phenotypic plasticity of insects: mechanisms and consequences. Enfield, NH: Science Widmer S, Moore FBG, Bagatto B (2006) The effects of chronic developmental hypoxia on swimming performance in zebrafish. J Fish Biol 69(6): Wilhelm D, Palmer S, Koopman P (2007) Sex determination and gonadal development in mammals. Physiol Rev 87:1 28. Wilson CA, BM, McCluskey A, Amores Y, Yan TA, Titus JL, Anderson P, Batzel M J Carvan M, Schartl, Postlethwait JH (2014). Wild Sex in Zebrafish: Loss of the Natural Sex Determinant in Domesticated Strains. Genetics 198(3): Wimberger PH (1992) Plasticity of fish body shape. The effects of diet, development, family and age in two species of Geophagus (Pisces: Cichlidae) Biol J Linn Soc 45: Winberger PH (1993) Effects of vitamin C deficiency on body shape and skull osteology in Geophagus brasiliensis: Implications for interpretations of morphological plasticity. Copeia 1993: Woltereck R (1909) Weitere experimentelle Untersuchungen über Artveränderung, speziell über das Wesen quantitativer Artunterschiede bei Daphnien. Yamaguchi T, Yamaguchi S, Hirai T, Kitano T (2007) Follicle-stimulating hormone signaling and Foxl2 are involved in transcriptional regulation of aromatase gene during gonadal sex differentiation in Japanese flounder, Paralichthys olivaceus. Biochem Biophys Res Commun 359(4): Young RL, Badyaev AV (2007) Evolution of ontogeny: linking epigenetic remodeling and genetic adaptation in skeletal structures. Integr Comp Biol 47: Youson JH (1988) First metamorphosis. p In Fish Physiology, vol 11B, W.S. Hoar, D. J. Randall (Eds.), New York, Academic Press. Zelditch ML, Fink WL (1995) Allometry and developmental integration of body growth in a piranha, Pygocentrus nattereri (Teleostei: Ostariophysi). J Morphol 223: Zelditch ML, Swiderski DL, Sheets HD, Fink WL (2004) Geometric Morphometrics for Biologists: A Primer. Academic Press, New York. Συμεωνίδη Δ (2011) Βιοπληροφορική ανάλυση και χαρακτηρισμός γονιδίων που εμπλέκονται στη φαινοτυπική πλαστικότητα του zebrafish (Danio rerio, Hamilton 1822). Μεταπτυχιακή Διατριβή. 221

224 222

225 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ Ι Georga I, Koumoundouros G (2010) Thermally Induced Plasticity of Body Shape in Adult Zebrafish Danio rerio (Hamilton, 1822). Journal of Morphology, 271:

226 224

227 JOURNAL OF MORPHOLOGY 271: (2010) Thermally Induced Plasticity of Body Shape in Adult Zebrafish Danio rerio (Hamilton, 1822) Ioanna Georga and George Koumoundouros* Biology Department, University of Patras, Rio, Patras, Greece ABSTRACT We examined the effect of temperature during the early development on the phenotypic plasticity of Danio rerio. The effect of temperature was examined during two different early developmental periods of 2808d (the product of days 3 temperature) each, d or d, by subjecting the experimental populations to three different water temperatures (228C, 288C, and 328C). Before and after the end of the 2808d period of the different thermal exposure, all populations were cultured in standard temperature (288C). Five to 10 months after exposure to the different thermal regimes, the body shape of the adults was analyzed by geometric morphometrics. In both ontogenetic windows and experimental repetitions, the results showed that developmental temperature and sex significantly affected the body shape of adult zebrafish. Thermally induced shape variation discriminated the fish that developed at 228C from those developed at 288C 328C. In the early developmental period (DP1, d postfertilization), dorsal, anal, and caudal fin structures differed between the animals that developed at 228C and 288C 328C. In the later developmental period (DP2, d postfertilization), caudal, anal, pectoral, and pelvic fins, as well as the gill cover and lower jaw, were affected when animals developed at different temperatures. These results show that thermal history during a short period of embryonic and larval life affects the body form of adult zebrafish with potentially functional consequences. Based on previous data on the effects of temperature on fish development, we suggest thermally induced muscle and bone remodelling as possible mechanism underlying the observed plasticity. J. Morphol. 271: , _ 2010 Wiley-Liss, Inc. KEY WORDS: zebrafish; phenotypic plasticity; developmental temperature; sexual dimorphism; teleosts is adaptive, by maximizing the organisms fitness in a fluctuating environment (Pigliucci et al., 2006). The importance of phenotypic plasticity is underlined by the fact that by affecting the phenotypic expression of a single genotype, the environment controls the phenotypes that are exposed to natural selection. In addition, as the direction and degree of environmentally driven plastic responses are genetically variable, phenotypic plasticity itself is subjected to natural selection (West-Eberhard, 1989). Fish constitute a highly plastic group of organisms, with a great ability to modify their phenotype in relation to environmental conditions (Meyer, 1987; Snyder and Dingle, 1990; Swain and Foote, 1990; Baker et al., 2005; Kristjansson, 2005; Sharpe et al., 2008; Gonda et al., 2009). Developmental temperature is one of the environmental factors inducing plasticity in fish, either by temporary modification in the relative timing of development (Johnston et al., 2001; Koumoundouros et al., 2001; Green and Fisher, 2004) or by permanent alterations of sex (Conover and Heins, 1987; Koumoundouros et al., 2002), meristic characters (Lindsey, 1988; Georgakopoulou et al., 2007), and number of muscle fibers (Albokhadaim et al., 2007; Johnston et al., 2009). With the exception of sex and meristic characters, most studies on fish phenotypic plasticity focus on single developmental stages. However, there is increasing evidence that environmental conditions experienced early in ontogeny affect the later phenotype and functional capabilities of individuals (Albokhadaim et al., 2007; Johnston et al., 2009; Koumoundouros et al., 2009). To our knowledge, previous studies on the effect of developmental temperature on fish body INTRODUCTION Phenotypic plasticity describes the ability of a genotype to produce a variety of phenotypes in response to different environmental regimes. This response can express itself at a morphological, biochemical, physiological, or developmental level or even through changes in the behavior (Fuiman et al., 1998; Agrawal, 2001; Gilbert, 2001; Pigliucci et al., 2006). Phenotypic plasticity is considered to play an important role in the evolutionary and ecological level, because it is generally believed that it Contract grant sponsors: The European Social Fund (ESF) and The Operational Program for Educational and Vocational Training II (EPEAEK II): Program Pythagoras II. *Correspondence to: George Koumoundouros, Biology Department, University of Patras, Rio 26500, Patras, Greece. koumound@upatras.gr Received 27 June 2009; Revised 28 May 2010; Accepted 5 June 2010 Published online 16 August 2010 in Wiley Online Library (wileyonlinelibrary.com) DOI: /jmor _ 2010 WILEY-LISS, INC. ǀ225

228 1320 I. GEORGA AND G. KOUMOUNDOUROS Fig. 1. Experimental design of this study. Three populations of fish were subjected to three different developmental temperature conditions (228C, 288C, and 328C) for a period of 2808d during (a) d or (b) d postfertilization. Before and after the different temperature conditions, all fish populations were developed under common conditions (288C). Numbers in brackets indicate the duration of fish exposure to the different temperature conditions. shape extend only up to the juvenile stage (Beacham, 1990, Oncorhynchus keta; Marcil et al., 2006, Gadus morhua; Georgakopoulou et al., 2007, Dicentrarchus labrax). It is therefore important to investigate whether the adult body shape of fish is affected by temperature conditions experienced during the early ontogenetic stages. This study examined whether different water temperatures during early development (embryonic to early larval) affect the body shape of adult Danio rerio, a fish species widely used in biology as a model organism (e.g., Spence et al., 2008). As zebrafish presents a clear sexual dimorphism of body shape (Eaton and Farley, 1974), the phenotypic response to early water temperature was examined in both sexes. MATERIALS AND METHODS Experimental Design and Fish Maintenance The effect of water temperature on body shape was examined during two different early developmental periods of 2808d (the product of days 3 temperature) each (DP1, d postfertilization, and DP2, d postfertilization). During these periods, fish were exposed to three different thermal conditions (228C, 288C, and 328C for 13, 10, and 9 days, respectively), whereas standard thermal conditions (28.08C C) were applied before and after the period of 2808d (see Fig. 1). All trials were performed in duplicate. The same batch of eggs was used for the constitution of the experimental groups of each replicate. Zebrafish eggs were obtained from wild-type breeders of the same genetic origin (ZF WT 2 F 5, Wageningen Agricultural University, The Netherlands). Breeders were kept in 10 l aquaria (2 4 individuals per liter), which was connected to a 220 l water recirculation system. Water temperature was maintained at 28.08C (61.08C), ph at , oxygen saturation at 80% 95%, and photoperiod at 14/10 h light/dark. Adult zebrafish were fed ad libitum on commercial diet (Color Growth and Health Formula, Ocean Nutrition Europe, Essen, Belgium) twice a day. Artemia nauplii were additionally provided to the breeders three times a week. The fertilized eggs were collected 3 4 h after spawning. Eggs were incubated and larvae were reared in 10 l aquaria (20 40 individuals per liter), which were connected to three different 90 l water recirculation systems (one for each experimental thermal treatment). Temperature before and after the experimental period was maintained at 28.08C C, ph at , oxygen saturation at 70% 95%, and photoperiod at 14/10 h light/dark. Concentration of ammonia, nitrite, and nitrate was <0.1 mg l 21. After the consumption of yolk, larvae were fed Paramecium sp. (Blades Biological, Paramecium LZA 020, four times a day), whereas after d postfertilization (depending on water temperature), Artemia nauplii were additionally provided (2 4 times per day). Gradually, as larvae were growing, feeding with Paramecium sp. was replaced by Artemia nauplii. For each feeding, the concentration of protozoans and Artemia was adjusted to 10 and 2 8 individuals per milliliter, respectively. After d postfertilization, depending on developmental temperature, a commercial diet was provided to experimental populations (Color Growth and Health Formula, Ocean Nutrition Europe, Essen, Belgium), and provision of Artemia nauplii was gradually terminated. The water exchange rate was adjusted to 8 10 l h 21 during Paramecium feeding and l h 21 later on. Fish Sampling At the end of the thermal treatment of each developmental period, fish length (distance between the tip of snout and the posterior tip of body) of individuals was measured using a stereoscope equipped with a scaling optic (Table 1). To study the effect of water temperature on the adult body shape, 30 individuals per sex and experimental population were randomly selected and submitted to geometric morphometric analysis. Samples were taken at the age of 5 10 months (Table 2). All experimental animals were anesthetized (ethylene glycol phenyl ether, ml l 21 ), individually photographed, and weighed (to the nearest 0.1 mg). Digital images were taken of the left lateral view of the fish using a Canon PowerShot G9 digital camera. The camera was attached to a tripod stand and was positioned perpendicular to the specimens. A length measure reference was positioned next to each specimen. The fork length (i.e., the distance between the tip of snout and the distal tip of the central caudal ray, Fig. 2) of all individuals from each experimental population was measured on the digital photographs with the use of the tpsdig2 software (Rohlf, 2008a). TABLE 1. Mean total (TL, 3088d) or fork length (FL, 5608d) of zebrafish larvae and juveniles at the end of the application of the three different temperature conditions (et) in the first ( d post fertilization, DP1) or the second ( d post fertilization, DP2) developmental period studied First replicate Second replicate et (8C) n TL/FL (mm) n TL/FL (mm) DP1 (3088d) DP2 (5608d) Journal of Morphology ǀ226

229 PHENOTYPIC PLASTICITY IN ZEBRAFISH 1321 TABLE 2. Number (n) and age (dpf, days post fertilization) of adult male (#) and female ($) zebrafish, which were used in morphometric analysis Age (dpf) n (#) FL (mm) n ($) FL (mm) DP1a 228C C C DP1b 228C C C DP2a 228C C C DP2b 228C C C a or b indicate the two replicates of each experiment.fl, mean fork length (6 SD); DP1, first developmental period studied ( d postfertilization); DP2, second developmental period studied ( d postfertilization). Individuals sex was determined macroscopically (based on the characters of the swollen belly of female individuals and the yellow color of males; Eaton and Farley, 1974) and verified microscopically by dissection of the gonads. Geometric Morphometrics To test the effects of developmental period (DP1 and DP2), water temperature, and sex on the adult body shape, we performed a geometric morphometric analysis. To test the effects of water temperature and sex on the adult body shape in each replicate (DP1a, DP1b, DP2a, and DP2b), geometric analysis was repeated for each replicate. On the image of each fish, a total of 15 landmarks were scored using the tpsdig2 software (Rohlf, 2008a) (see Fig. 2). A generalized least square method was applied with the use of the CoordGen6f software package (Sheets, 2001) to adjust for centroid size and to remove the effects of scale, orientation, and position from the data sets (superimposition of landmark configurations; Rohlf and Slice, 1990). The tpssmall software was Fig. 2. Landmarks collected on in vivo photographed zebrafish. (1) Anterior tip of upper jaw; (2) anterior margin of the eye; (3) posterior margin of the eye; (4) anterior base of the dorsal fin; (5) posterior base of the dorsal fin; (6) upper base of the caudal fin; (7) lower base of the caudal fin; (8) base of the central caudal ray; (9) posterior base of the anal fin; (10) anterior base of the anal fin; (11) base of the pelvic fins; (12) distal tip of the angular; (13) ventral tip of the gill cover; (14) posterior tip of the gill cover; (15) upper base of the left pectoral fin. (a) Distal tip of the central caudal ray. Landmark (a) was used only for the measurement of fork length (FL, distance between landmarks 1 and a) and was not included in the geometric morphometric analysis. TABLE 3. Results of multivariate analysis of variance with partial warps and uniform components (weight matrix of all groups studied) as the dependent variables and developmental period (DP1, DP2), sex (males, females), and early water temperature (et, 228C, 288C, or 328C) as the independent factors F d.f. d.f. Factor Wilk s k appr. effect error P DP (1, 2) <0.001 Sex <0.001 et <0.001 DP 3 sex <0.001 DP 3 et <0.001 Sex 3 et <0.001 DP 3 sex 3 et <0.05 used to verify that shape variation in the data set was sufficiently small to permit the accurate approximation of shape space by the tangent space (Rohlf, 2003). The correlation between Euclidean distances in the tangent space and Procrustes distances in shape space (Rohlf, 1998) was extremely high (r > in all data sets tested). After verification of the data sets, the tpsrelw software (Rohlf, 2008b) was applied to the superimposed landmark configurations to calculate the weight matrix (partial warp scores, including uniform and nonuniform components). Multivariate analysis of variance was applied to the resulted weight matrices to test the significance of the effects of sex, developmental temperature, and developmental period on the body shape (variables of the weight matrices) of adult zebrafish. Shape differences between samples in each replicate were tested by canonical variate analysis on the weight matrix. To show the interpopulation shape differences, shape components were regressed on the canonical variate scores and vector displacements were obtained (tpsregr software; Rohlf, 2007). The theory of the geometric morphometrics is described in detail elsewhere (Bookstein, 1991; Rohlf and Marcus, 1993; Loy et al., 1998, 2000; Adams et al., 2004; Zelditch et al., 2004; Georgakopoulou et al., 2007). The SPSS v.13 package was used to perform statistical analyses. RESULTS In DP1 trials, mortality up to hatching reached 25% 35% in the group treated at 228C versus 10% 20% in the groups treated at 288C and 328C. In DP2, the mortality up to hatching was homogenous for all populations (8% 10%). Overall (different temperatures and developmental periods), the mortality after hatching was minimal (up to 5%). Multivariate analysis of variance showed a significant effect of all factors studied (sex, developmental temperature, and developmental period) on adult zebrafish body shape (Table 3). For both developmental periods (DP1 or DP2), and in both experimental repetitions (a or b), the morphometric analysis showed a significant effect of the sex and developmental temperature on adult zebrafish body shape (Table 4, Fig. 3). In all cases, sex-related shape variation was evident along the first canonical axis (49.2% 67.7% explained variance; Fig. 3). In all treatments and replicates, sex-induced shape variation was mainly related to landmarks 10, 11, 14, and 15 (except landmarks Journal of Morphology ǀ227

230 1322 I. GEORGA AND G. KOUMOUNDOUROS TABLE 4. Results of multivariate analysis of variance with partial warps and uniform components (weight matrices of fish in each treatment and replicate) as the dependent variables and sex (males, females) and early water temperature (et, 228C, 288C, or 328C) as the independent factors Factor Wilk s k DP1a et Sex et 3 sex DP1b et Sex et 3 sex DP2a et Sex et 3 sex DP2b et Sex et 3 sex F appr. d.f. effect d.f. error P 298 < < < < < < < < < < < and 15 in DP2b). Landmarks 5 (DP1, DP2), 2 (DP1), 3, and 9 (DP2) did not contribute to the sex-related shape variation, whereas all the other landmarks had a slight, but repeated, contribution (Figs. 4 and 5). Compared with the female individuals, male zebrafish were characterized by a proximal transposition of landmarks 4, 10, 11, 14, and 15 (smaller abdominal area); a ventral transposition of landmarks 1 and 12 (upper and lower jaw elements); and by a posterior transposition of landmarks 6, 7, and 8 (longer caudal peduncle; Figs. 4 and 5). Temperature-related shape variation was mainly expressed along the second canonical axis (15.3% 41.9% explained variance), discriminating the 228C groups from those that were initially developed at 288C and 328C (see Fig. 3). In the DP1a trial, females of 288C were grouped with females of 228C and not with females of 328C (see Fig. 3). Vector diagrams of landmark displacements demonstrated that the temperature effect on body shape was not fully repeated between the DP1 or DP2 replicates (Figs. 4 and 5). However, based on a common pattern presented in the replicates of DP1, vector diagrams of landmark displacements showed that the 228C groups were characterized by the anterior transposition of landmarks 4, 5, 9, and 10 (base of the dorsal and anal fins) and by a posterior transposition of landmark 8 (base of the central caudal ray; Fig. 4). Similarly, based on a common pattern presented in the replicates of DP2, vector diagrams of landmark displacements showed that when compared with the 288C and 328C groups, the 228C groups were characterized by the anterior shift of landmark 12 (angular), ventral shift of landmark 13 (ventral tip of the gill cover), dorsal shift of landmark 11 (base of the pelvic fins), and by the posterior shift of landmark 15 (base of the pectoral fin; Fig. 5). Finally, in all experimental treatments and replicates, a smaller amount of thermally induced shape variation (4.8% 12.8% explained variance) was expressed along the third canonical axis (see Fig. 3). However, vector diagrams of landmark displacements demonstrated a nonrepeated pattern of shape variation among the different replicates of both thermal treatments. DISCUSSION The results show that thermal history significantly affected the body shape of male and female fish. Environmental effects on body shape of fish have been widely studied (Corti et al., 1996; Day and McPhail, 1996; Koumoundouros et al., 2001; Robinson and Parsons, 2002; Peres-Neto and Magnan, 2004; Baker et al., 2005; Georgakopoulou et al., 2007). However, we show a significant effect of temperature during early life on adult body shape. In a similar study, Georgakopoulou et al. (2007) showed that water temperature during embryonic and larval stages can influence the body shape of the juvenile European sea bass (Dicentrarchus labrax). However, body shape differences in D. labrax diminished during the period following the end of the different thermal treatments, well before the adult stage. The different thermal regimes applied during early ontogeny in this study are within the range of temperature requirements for zebrafish development. Zebrafish is considered a eurythermal species, because in its natural habitat, the water temperature range from 68C to 388C. Under natural conditions (Bangladesh), the main recruitment period extends from April to August (hottest period), but spawning can start as early as January as a result of combined temperature and food availability (Spence et al., 2007, 2008). The optimal thermal regime for normal embryonic development of zebrafish was suggested by Schirone and Gross (1968) to be between 238C and 348C, although it is not clear what methodology was used for egg acclimation from the spawning temperature (268C) to the tested regimes. Bagatto (2005) demonstrated that incubation of zebrafish eggs at 208C resulted in only 28% survival after the 24 h postfertiliza- Journal of Morphology ǀ228

231 PHENOTYPIC PLASTICITY IN ZEBRAFISH 1323 Fig. 3. Effect of developmental temperature (228C, 288C, or 328C) and sex (F, M) on the scores of canonical variate analysis (CV1, CV2, and CV3). Mean 6 2SE of the canonical scores are given. Different developmental temperatures were applied during the period of d postfertilization (DP1) or of d postfertilization (DP2) in duplicates (a or b). Numbers in brackets correspond to the percentage of shape variance explained along each canonical axis. tion period. In this study, such a potentially negative effect on the survival rate of the low-temperature group (228C) in DP1 was avoided by maintaining all experimental populations at 288C for the first 24 h postfertilization. During the different developmental periods, fish exhibit different responsiveness to environmental factors and thus altered levels of phenotypic plas- ticity (Lindsey, 1988; Koumoundouros et al., 2002). It is generally accepted that the most responsive, ontogenetic periods vary with respect to the phenotypic trait and the environmental factor under examination (Pigliucci et al., 1996; Pigliucci, 1998). In agreement with previous studies, we show here that body shape differences between the experimental populations were influenced by the devel- Journal of Morphology ǀ229

232 1324 I. GEORGA AND G. KOUMOUNDOUROS Fig. 4. Effect of different temperatures during developmental period 1, i.e., d postfertilization (DP1). Vector diagrams demonstrating the components of shape change relative to the extreme values (2, 1, 33) of the canonical axes (CV1 CV3). Top and bottom diagrams correspond to the first and second experimental replicate, respectively. Landmarks description is given in Figure 2. opmental period during which the thermal regimes were applied. In the first developmental period under examination (DP1, d postfertilization), dorsal, anal, and caudal fin were the structures mainly affected by the water temperature, whereas in the second developmental period (DP2, d postfertilization), caudal, anal, and pelvic fins, as well as the gill cover and lower jaw, mainly participated in the shape differentiation between the adult zebrafish, which developed initially at 228C, 288C, and 328C. For both developmental periods, a significant amount of shape variation was due to the differen- ces between adults that were initially developed at 228C versus 288C and 328C (CV2 axis, 15.3% 41.9% of the total variance, Fig. 3). This differentiation was evident for both sexes and replicates of each treatment, except for DP1. During the latter developmental period, the response of body shape to water temperature exhibited a higher variability with respect to the resulting phenotype of the 288C female fish, which were grouped either with females of 228C (DP1a) or 328C (DP1b) (see Fig. 3). As the major source of shape variation along CV2 in the DP1a trial was linked to the base of pelvic fins (see Fig. 4), the higher shape variability of Journal of Morphology ǀ230

233 PHENOTYPIC PLASTICITY IN ZEBRAFISH 1325 Fig. 5. Effect of different temperatures during developmental period 2, i.e., d postfertilization (DP1).Vector diagrams demonstrating the components of shape change relative to the extreme values (2, 1, 33) of the canonical axes (CV1 CV3). Top and bottom diagrams correspond to the first and second experimental replicate, respectively. Landmarks description is given in Figure 2. females exposed to 288C during DP1 could be attributed to a respectively variable development of the basipterygium (pelvic-fin supporting element). The body shape plasticity in the adult zebrafish of this study might be attributed to muscle and bone remodelling, which is induced by different kinematic responses to different thermal conditions (mechanistic-functional approach; Winberger, 1993). Additionally or alternatively, shape plasticity could be attributed to the differential effect of temperature on the relative growth rate of the different tissues, organs, and parts of the body (meta- bolic-developmental hypothesis, Lindsey, 1988; Murray and Beacham, 1989; Fuiman et al., 1998; Spicer and Burggren, 2003). Although the effects of temperature on the ontogeny of zebrafish have not been extensively studied, a recent study of Johnston et al. (2009) clearly demonstrates that muscle development in this species is highly responsive to early temperature conditions. Specifically, Johnston et al. (2009) showed that in adult zebrafish, the number of fast muscle fibers significantly depends on the thermal conditions during the period from 1 4 cell stage up to hatching. This result supports the metabolic-developmental Journal of Morphology ǀ231

234 1326 I. GEORGA AND G. KOUMOUNDOUROS hypothesis in explaining the results of this study, but additional data are required in respect to the effect of water temperature on bone development in zebrafish. Moreover, because shape variation is established by alterations of the allometric growth during development (e.g., Svanback and Eklov, 2002; Wright and McConnaughay, 2002; Georgakopoulou et al., 2007), it would be interesting to examine how thermally induced shape variation in adult zebrafish is established during ontogeny (ontogenetic allometry). Such an approach would be valuable in examining the source of variable responses of female phenotype at 288C during the first developmental period examined. Sexual dimorphism is a common phenomenon in fish, spanning from size difference between the two sexes to sexual parasitism, e.g., in the Ceratioid anglerfish (Bond, 1996; Pietsch, 2005). In zebrafish, morphological sexual dimorphism involves the swollen belly of female individuals and the yellowish color of males (Eaton and Farley, 1974). The results presented herein demonstrated that the swollen belly female phenotype is not only linked to a ventral disposition of the pelvic fins but also to substantial revisions of the position of the rest of the fins, as well as to different skull shape (mouth and gill cover position). The swollen belly of female zebrafish could be considered a character aiming to increase fecundity, but it could also be linked to an altered swimming mode. In future studies, it should be interesting to examine whether this sexual shape dimorphism, together with the thermally induced shape plasticity in zebrafish, is linked to different functional capabilities and/or to differences in respiratory and cardiovascular organs. The thermally induced shape (this study) and muscle (Johnston et al., 2009) plasticity strongly supports the hypothesis of developmental programming of zebrafish swimming capabilities by the early water temperature. Finally, given that zebrafish exhibits a complex reproductive behavior, largely depending on the swimming activity of both sexes, i.e. male to female active pursuit and male to male territoriality (Spence et al., 2007, 2008), it is worthwhile to examine whether thermally induced phenotypic plasticity affects the reproduction success of individuals. Environmental conditions experienced early in development may act as a predictor of the ensuing environmental conditions, leading to certain developmental pathways and eventually to phenotypic adaption (Meyers and Bull, 2002). In this hypothesis, the different thermal conditions experienced by zebrafish embryos and larvae (this study) might have molded the adult phenotype. However, it is still unclear whether the observed phenotypic plasticity of adult zebrafish has significant implications for vital functions of the population (e.g., swimming capabilities, feeding, and fecundity). ACKNOWLEDGMENTS The authors thank Mrs. E. Georgakopoulou, S. Christodoulopoulou, and A. Aggelopoulou for their participation in the maintenance of fish populations. LITERATURE CITED Adams DC, Rohlf FJ, Slice DE Geometric morphometrics: Ten years of progress following the revolution. Ital J Zool 71:5 16. Agrawal AA Ecology: Phenotypic plasticity in the interactions and evolution of species. Science 294: Albokhadaim I, Hammond CL, Ashton C, Simbi BH, Bayol S, Farrington S, Stickland N Larval programming of post-hatch muscle growth and activity in Atlantic salmon (Salmo salar). J Exp Biol 210: Bagatto B Ontogeny of cardiovascular control in zebrafish (Danio rerio): Effects of developmental environment. Comp Biochem Phys A 141: Baker JA, Cresko WA, Foster SA, Heins DC Life-history differentiation of benthic and limnetic ecotypes in a polytypic population of threespine stickleback (Gasterosteus aculeatus). Evol Ecol Res 7: Beacham TD A genetic analysis of meristic and morphometric variation in chum salmon (Oncorhynchus keta) at three different temperatures. Can J Zool 68: Bond CE Biology of Fishes. Australia, Canada, Mexico, Songapore, Spain, UK, USA: Brooks Cole. 750 p. Bookstein FL Morphometric Tools for Landmark Data: Geometry and Biology. Cambridge, NY, Melbourne: Cambridge University Press. 435 p. Conover DO, Heins SW Adaptive variation in environmental and genetic sex determination in a fish. Nature 32: Corti M, Loy A, Cataudella S Form changes in the sea bass. Dicentrarchus labrax (Moronidae: Teleostei), after acclimation to freshwater: An analysis using shape coordinates. Environ Biol Fish 47: Day T, McPhail JD The effect of behavioural and morphological plasticity on foraging efficiency in the threespine stickleback (Gasterosteus sp.). Oecologia 108: Eaton RC, Farley RD Growth and the reduction of depensation of zebrafish, Brachydanio rerio, reared in the laboratory. Copeia 1974: Fuiman LA, Poling KR, Higgs DM Quantifying developmental progress for comparative studies of larval fishes. Copeia 1998: Georgakopoulou E, Sfakianakis DG, Kouttouki S, Divanach P, Kentouri M, Koumoundouros G The influence of temperature during early life on phenotypic expression at later ontogenetic stages in sea bass. J Fish Biol 70: Gilbert SF Ecological developmental biology: Developmental biology meets the real world. Dev Biol 233:1 12. Green BS, Fisher R Temperature influences swimming speed, growth and larval duration in coral reef fish larvae. J Exp Mar Biol Ecol 299: Gonda A, Herczeg G, Merila J Habitat-dependent and - independent plastic responses to social environment in the nine-spined stickleback (Pungitius pungitius) brain. Proc R Soc Lond Biol 276: Johnston IA, Vieira VLA, Temple GK Functional consequences population differences in the developmental plasticity of muscle to temperature in Atlantic herring Clupea harengus. Mar Ecol Prog Ser 213: Johnston IA, Lee HT, Macqueen DJ, Paranthaman K, Kawashima C, Anwar A, Kinghorn JR, Dalmay T Embryonic temperature affects muscle fibre recruitment in adult zebrafish: Genome-wide changes in gene and microrna expression Journal of Morphology ǀ232

235 PHENOTYPIC PLASTICITY IN ZEBRAFISH 1327 associated with the transition from hyperplastic to hypertrophic growth phenotypes. J Exp Biol 212: Koumoundouros G, Divanach P, Anezaki L, Kentouri M Temperature-induced ontogenetic plasticity in sea bass (Dicentrarchus labrax). Mar Biol 139: Koumoundouros G, Pavlidis M, Anezaki L, Kokkari C, Sterioti A, Divanach P, Kentouri M Temperature sex determination in the European sea bass, Dicentrarchus labrax (L., 1758) (Teleostei, Perciformes, Moronidae): Critical sensitive ontogenetic phase. J Exp Zool 292: Koumoundouros G, Ashton C, Sfakianakis DG, Divanach P, Kentouri M, Anthwal N, Stickland NC Thermally induced phenotypic plasticity of swimming performance in European sea bass [Dicentrarchus labrax (Linnaeus 1758)] juveniles. J Fish Biol 74: Kristjansson BK Rapid morphological changes in threespine stickleback. Gasterosteus aculeatus, in freshwater. Environ Biol Fish 74: Lindsey CC Factors controlling meristic variation. In: Hoar WS, Randall DJ, editors. Fish Physiology, Vol. XIA. London: Academic Press. pp Loy A, Mariani L, Bertelletti M, Tunesi L Visualizing allometry: Geometric morphometrics in the study of shape changes in the early stages of the two-banded sea bream. Diplodus vulgaris (Perciformes, Sparidae). J Morphol 237: Loy A, Boglione C, Gagliardi F, Ferrucci L, Cataudella S Geometric morphometries and internal anatomy in sea bass shape analysis (Dicentrarchus labrax L., Moronidae). Aquaculture 186: Marcil J, Swain DP, Hutchings JA Genetic and environmental components of phenotypic variation in body shape among populations of Atlantic cod (Gadus morhua L.). Biol J Linn Soc 88: Meyer A Phenotypic plasticity and heterochrony in Cichlasoma managuense (Pisces. Cichlidae) and their implications for speciation in cichlid fishes. Evolution 41: Meyers LA, Bull JJ Fighting change with change: adaptive variation in an uncertain world. Trends Ecol Evol 17: Murray CB, Beacham T Responses of meristic characters in chum salmon (Oncorhynchus keta) to temperature changes during development. Can J Zool 67: Peres-Neto PR, Magnan P The influence of swimming demand on phenotypic plasticity and morphological integration: A comparison of two polymorphic charr species. Oecologia 140: Pietsch TW Dimorphism, parasitism, and sex revisited: Modes of reproduction among deep-sea ceratioid anglerfishes (Teleostei: Lophiiformes). Ichthyol Res 52: Pigliucci M Developmental phenotypic plasticity: Where internal programming meets the external environment. Curr Opin Plant Biol 1: Pigliucci M, Schlichting CD, Jones CS, Schwenk K Developmental reaction norms: The interactions among allometry, ontogeny and plasticity. Plant Species Biol 11: Pigliucci M, Murren CJ, Schlichting CD Phenotypic plasticity and evolution by genetic assimilation. J Exp Biol 209: Robinson BW, Parsons KJ Changing times, spaces, and faces: Tests and implications of adaptive morphological plas- ticity in the fishes of northern postglacial lakes. Can J Fish Aquat Sci 59: Rohlf FJ On applications of geometric morphometrics to studies of ontogeny and phylogeny. Syst Biol 47: Rohlf FJ tpssmall, version Stony Brook, NY: Department of Ecology and Evolution, State University of New York. Rohlf FJ, tpsregr, version Stony Brook, NY: Department of Ecology and Evolution, State University of New York. Rohlf FJ, 2008a. tpsdig, version Stony Brook, NY: Department of Ecology and Evolution, State University of New York. Rohlf FJ, 2008b. tpsrelw, version Stony Brook, NY: Department of Ecology and Evolution, State University of New York. Rohlf FJ, Marcus LF A revolution in morphometrics. Trends Ecol Evol 8: Rohlf FJ, Slice D Extensions of the Procrustes method for the optimal superimposition of landmarks. Syst Zool 39: Schirone RC, Gross L Effect of temperature on early embryological development of the zebra fish, Brachydmio rerio. J Exp Zool 169: Sharpe DMT, Rasanen K, Berner D, Hendry AP Genetic and environmental contributions to the morphology of lake and stream stickleback: Implications for gene flow and reproductive isolation. Evol Ecol Res 10: Sheets HD CoordGen 6f. Available at: canisius.edu/sheets/morphsoft.html. Snyder RJ, Dingle H Effects of freshwater and marine overwintering environments on life histories of threespine sticklebacks: Evidence for adaptive variation between anadromous and resident freshwater populations. Oecologia 84: Spence R, Fatema MK, Ellis S, Ahmed ZF, Smith C Diet, growth and recruitment of wild zebrafish in Bangladesh. J Fish Biol 71: Spence R, Gerlach G, Lawrence C, Smith C The behaviour and ecology of the zebrafish, Danio rerio. Biol Rev 83: Spicer JI, Burggren WW Development of physiological regulatory systems: Altering the timing of crucial events. Zoology 106: Svanback R, Eklov P Effects of habitat and food resources on morphology and ontogenetic growth trajectories in perch. Oecologia 131: Swain DP, Foote CJ Stocks and chameleons: The use of phenotypic variation in stock identification. Fish Res 43: West-Eberhard MJ Phenotypic plasticity and the origins of diversity. Annu Rev Ecol Syst 20: Winberger PH Effects of vitamin C deficiency on body shape and skull osteology in Geophagus brasiliensis: Implications for interpretations of morphological plasticity. Copeia 1993: Wright SD, McConnaughay KDM Interpreting phenotypic plasticity: The importance of ontogeny. Plant Species Biol 17: Zelditch ML, Swiderski DL, Sheets HD, Fink WL Geometric morphometrics for biologists: A Primer. London, San Diego, CA: Elsevier Academic Press. 443 p. Journal of Morphology ǀ233

236 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ ΙΙ - Α Παραθέτονται τα αποτελέσματα της αλληλούχησης των προϊόντων της Real Time q-pcr. Η αναζήτηση της ομολογίας των αποτελεσμάτων της αλληλούχησης έγινε στη διαδικτυακή βάση δεδομένων Blast ( figla GCGGCGTATTGTGCCGGTGAGGCCTCGAGATCGAAAGCCAAGTAAAGTGGACATGCTGAAGG CTGCAACCGAGTACAA igf1 GGGCTTTTATTTCAGCAAACCGACAGGATATGGACCTAGTTCAAGAAGGTCACACAACCGTG GCATCGTGGA myogenin ATCTGCTGAACGACGACTCGTCAGAGCAATCCAACCTGGAGGTCTCTGACGTCTATAGAGGA CAGCATAACGGGAACAGAGAGGCAA 235

237 tnni2a.3 TTCWSAGTTGGTGTTGAGMTCACAAAGGCCTTCTGGAGAAGGAAGTTGTGGATACCGCTGCG GCCAAAGAGGCTTACWTGGAAGATAGATTTTCCGCTCTCCTRCTSTWKKTGGKCRCYYACCC CGCTYTGCAGCYKCGCCGACTACTCAGTTYACAGTTTGTCCTCKACYGGCTGCTCTTCTTYW CTTTCTAATAAA bmp15 CCAGTGTGGCGTMGCTGATGTTMGGTTGAATTCCGCCCGCTGATTGTCTTAGACGATGGTAG CCTTTCAGGTGGCACCCCGTRMACGCGASGGGGTTGTTAAATAGAATGMKRATYRTTTKGCA YGRTGRTCTCYTYYCCAGTGKG cyp19a1a GCTGGCCAGAGCCTCCAGCACTCGCATCTGTCCAAGCTGCAGATCCTGGAGAGTTTTATCAA CGAGTCTCTACGTTTTCACCCGGTCGA 236

238 cyp19a1b ACGATTMGCTTGGAGAACTTCGAGAACACTGTTCCCAGTCGTTACTTCCAGCCATTCGGT TGTGGTCCGCGGGCCTGTGTTGGGAAGCACATTGCTATGGTGATGACGAAGGCCATCCTA GTAACCATGTTATCAAGGTTTACAGTTTGTCCTCGTCACGGCTGCACCATCAGCACCATC AAACAA dmrt1 CSWACYACGATGAGCTCATATTGCTGTCATTGGCCTAATGGATAATCTAACTTCCTTCCCGC GACCTTCATGATGCAAWCTATATGAGGGCTTTTCCAGCATCTCCATGCTGTTGTGGGACTAA ACGATATC npy AWAWGAACTAMTCACCTCATAACAAGGCAGAGGTATGGGAAAAGGTCAAGCGCTGACACC TTAATTTCAGACCTTCTGATTGGTGAAACAGAGTCCCGCCCCCAGACCAGATATGAGGAT CATTTGGCATGGTGATCYCWTCCMYAYGACCTCCT 237