ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ, ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΥΤΤΑΡΟΥ & ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ Βιοπληροφορική ανάλυση και χαρακτηρισµός γονιδίων που εµπλέκονται στη φαινοτυπική πλαστικότητα του zebrafish (Danio rerio, Hamilton 1822) ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥ ΩΝ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΙΠΛΩΜΑ ΕΙ ΙΚΕΥΣΗΣ ΣΤΗ ΒΙΟΛΟΓΙΚΗ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ιονυσία Συµεωνίδη Βιολόγος ΠΑΤΡΑ, Ιούλιος 2011

2 Τα µέλη της Τριµελούς Εξεταστικής Επιτροπής Κλάπα Μαρία Κουµουνδούρος Γεώργιος Φλυτζάνης Κωνσταντίνος Κύρια Ερευνήτρια Αναπληρωτής Καθηγητής Αναπληρωτής Καθηγητής ΙΤΕ/ΕΙΧΗΜΥΘ Τµήµα Βιολογίας Τµήµα Βιολογίας Πανεπιστήµιο Κρήτης Πανεπιστήµιο Πατρών Ο Επιβλέπων Καθηγητής Φλυτζάνης Κωνσταντίνος 2

3 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η παρούσα εργασία εκπονήθηκε στα πλαίσια του µεταπτυχιακού προγράµµατος Βιολογική Τεχνολογία και αποτελεί το πάντρεµα της Βιολογίας ιχθύων, της Μοριακής Βιολογίας και της Βιοπληροφορικής. Ευχαριστώ θερµά την Κύρια Ερευνήτρια Μαρία Κλάπα για τη συνεργασία, τη συνεχή καθοδήγηση, τις πολύτιµες συµβουλές και τη φιλοξενία που µου προσέφερε στο Εργαστήριο Μεταβολοµικής Μηχανικής και Συστηµικής Βιολογίας στο ΙΤΕ/ΕΙΧΗΜΥΘ. Η παραµονή µου στο εργαστήριο της ασκάλας, µου έδειξε µια διαφορετική προσέγγιση της βιολογίας και µου έµαθε πολλά πράγµατα. Ένα µεγάλο ευχαριστώ οφείλω στον Αναπληρωτή Καθηγητή Γιώργο Κουµουνδούρο για τις εύστοχες παρατηρήσεις, την προθυµία του για συζήτηση και την ενθάρρυνση που µου προσέφερε κατά τη διάρκεια της παρούσας εργασίας. Επίσης, ευχαριστώ ιδιαιτέρως τον επιβλέποντα καθηγητή µου, Αναπληρωτή Καθηγητή Κωνσταντίνο Φλυτζάνη για την εµπιστοσύνη που έδειξε στο πρόσωπό µου και γιατί πάντα φρόντιζε να µου επισηµαίνει την αναζήτηση της Βιολογίας µέσα στο χάος των γονιδίων, που είχα να αντιµετωπίσω. Τέλος, θα ήθελα να ευχαριστήσω τους δικούς µου ανθρώπους, οι οποίοι βρίσκονται δίπλα µου και µε στηρίζουν όλα αυτά τα χρόνια. 3

4 Σε όσους ξέρουν να ακούν να καταλαβαίνουν να ενθαρρύνουν Α λ. Ξ. Σ. Χ. Α δ. Σ. Π.. Ν. Φ. Ε.. Γ.. Γ. & Ζ. 4

5 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ - Περίληψη 8 - Abstract Εισαγωγή Φαινοτυπική πλαστικότητα Το φαινόµενο της φαινοτυπικής πλαστικότητας στα ψάρια Η θερµοκρασία ανάπτυξης ως παράγοντας φαινοτυπικής πλαστικότητας Ο πειραµατικός οργανισµός zebrafish Danio rerio, Hamilton Τεχνολογία & Εφαρµογές των Μικροσυστοιχιών (Microarrays) Αρχή της µεθόδου των µικροσυστοιχιών Ολιγονουκλεοτιδικές µικροσυστοιχίες (Affymetrix GeneChip) Το Affymetrix GeneChip για το zebrafish Σκοπός εργασίας Υλικά & Μέθοδοι Πειραµατικός σχεδιασµός ειγµατοληψίες Υβριδοποίηση του RNA των δειγµάτων σε ολιγονουκλεοτιδικές µικροσυστοιχίες Affymetrix Εξαγωγή δεδοµένων από τις υβριδοποιηµένες µικροσυστοιχίες Ανάλυση µεταγραφικών προτύπων από µικροσυστοιχίες Κανονικοποίηση των πειραµατικών δεδοµένων των µικροσυστοιχιών Εξαγωγή των τιµών έκφρασης για κάθε µικροσυστοιχία Φιλτράρισµα των πειραµατικών δεδοµένων των µικροσυστοιχιών Πολυπαραµετρική στατιστική ανάλυση Οµαδοποίηση Ιεραρχική οµαδοποίηση (HCL, Hierarchical Clustering) Ανάλυση Κύριων Συνιστωσών (PCA, Principal Component Analysis) Ανάλυση Σηµαντικότητας για Μικροσυστοιχίες (SAM, Significant Analysis of Microarrays) Ανάλυση Γονιδιακής Οντολογίας 48 5

6 3. Αποτελέσµατα Αποτελέσµατα µέτρησης του ολικού µήκους (TL) σώµατος Αποτελέσµατα ανάλυσης µεταγραφικών προτύπων Κανονικοποίηση Εξαγωγή των τιµών έκφρασης για κάθε µικροσυστοιχία Φιλτράρισµα Αποτελέσµατα Πολυπαραµετρικής Στατιστικής Ανάλυσης Ανάλυση των 20 µεταγραφικών προτύπων Ανάλυση των 17 µεταγραφικών προτύπων Ανάλυση Σηµαντικότητας (SAM) Ανάλυση των 20 µεταγραφικών προτύπων µετά την Κανονικοποίηση των Ανάλυση των 17 µεταγραφικών προτύπων µετά την Κανονικοποίηση των Ανάλυση Σηµαντικότητας (SAM) Αποτελέσµατα ανάλυσης γονιδιακής οντολογίας Σύγκριση των προτύπων 28 o C & 32 o C µε τα 22 o C του 1 ου πειράµατος Σύγκριση των προτύπων 28 o C & 32 o C µε τα 22 o C του 2 ου πειράµατος Σύγκριση των προτύπων 22 o C του 1 ου πειράµατος µε όλα τα 28 o C (µετά την Κανονικοποίηση των 28 ) Σύγκριση των προτύπων 22 o C του 2 ου πειράµατος µε όλα τα 28 o C (µετά την Κανονικοποίηση των 28 ) Σύγκριση των προτύπων 22 o C του 1 ου πειράµατος µε όλα τα 28 o C και 32 o C (µετά την Κανονικοποίηση των 28 ) Σύγκριση των προτύπων 22 o C του 2 ου πειράµατος µε όλα τα 28 o C και 32 o C (µετά την Κανονικοποίηση των 28 ) Σύγκριση των προτύπων 22 o C του 1 ου πειράµατος µε τα πρότυπα των22 o C του 2 ου πειράµατος (µετά την Κανονικοποίηση των 28 ) Σύγκριση των προτύπων 22 o C του 1 ου πειράµατος µε τα πρότυπα των10d_28 o C (µετά την Κανονικοποίηση των 28 ) Αναπτυξιακή σύγκριση των προτύπων 10d_28 o C µε τα πρότυπα των20d_28 o C (µετά την Κανονικοποίηση των 28 ) 92 6

7 4. Συζήτηση Επίδραση της θερµοκρασίας ανάπτυξης στο µεταγραφικό πρότυπο Σύγκριση των προτύπων πριν την κανονικοποίηση των Σύγκριση των προτύπων µετά την κανονικοποίηση των Επίδραση της περιόδου και της διάρκειας της θερµοκρασιακής αγωγής στο µεταγραφικό πρότυπο Η διαφοροποίηση των µεταγραφικών προτύπων στις 2 διαφορετικές ηλικίες (10d vs 20d) Η βιοπληροφορική µελέτη του µεταγραφικού προτύπου (transcriptomics) στο zebrafish και η σηµασία της κανονικοποίησης των Συµπεράσµατα Βιβλιογραφία Παράρτηµα Σύσταση και διατήρηση των πειραµατικών πληθυσµών Αποµόνωση ολικού RNA µε Nucleospin RNA II Υπολογισµός της συγκέντρωσης του RNA µε φωτοµέτρηση Ηλεκτροφόρηση του RNA σε πήκτωµα αγαρόζης Παρασκευή του πηκτώµατος αγαρόζης Προετοιµασία των δειγµάτων RNA για ηλεκτροφόρηση Πολυπαραµετρική στατιστική ανάλυση των προτύπων από το PM-MM µοντέλο Ανάλυση των 20 µεταγραφικών προτύπων Ανάλυση των 17 µεταγραφικών προτύπων Ανάλυση των 20 µεταγραφικών προτύπων µετά την Κανονικοποίηση των Ανάλυση των 17 µεταγραφικών προτύπων µετά την Κανονικοποίηση των Αποτελέσµατα λειτουργικής γονιδιωµατικής ανάλυσης από DAVID Πριν την κανονικοποίηση των Μετά την κανονικοποίηση των

8 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Η θερµοκρασία ανάπτυξης αποτελεί παράγοντα µεγάλης σηµασίας στην οντογένεση των ιχθύων, αφού ως ποικιλόθερµοι οργανισµοί είναι συνεχώς εκτεθειµένοι στις µεταβολές του περιβάλλοντός τους. Έχει παρατηρηθεί πως η θερµοκρασία ανάπτυξης δύναται να προκαλέσει µετατόπιση του χρονοδιαγράµµατος των οντογενετικών γεγονότων και πλαστικότητα σε µορφολογικούς και φυσιολογικούς χαρακτήρες (πχ στο µυοσκελετικό και το καρδιαγγειακό σύστηµα). Ωστόσο, µέχρι σήµερα δεν έχει µελετηθεί η επίδραση της θερµοκρασίας ανάπτυξης στο πρότυπο της γονιδιακής έκφρασης του zebrafish και σκοπός της παρούσας εργασίας είναι η µελέτη του ολικού µεταγραφικού προτύπου νυµφών zebrafish. Για το λόγο αυτό σχεδιάστηκαν δύο πειράµατα, όπου τρεις θερµοκρασιακές συνθήκες ανάπτυξης (22, 28 και 32 o C) εφαρµόστηκαν στην πρώιµη οντογενετική περίοδο: για το διάστηµα 0-20 dpf * (1 ο πείραµα) και dpf (2 ο πείραµα). Πραγµατοποιήθηκε αποµόνωση ολικού RNA από τα άτοµα ηλικίας 20 dpf όλων των πληθυσµών και από τα άτοµα ηλικίας 10 dpf του πληθυσµού των 28 o C του 2 ου πειράµατος και ακολούθησε υβριδοποίηση σε ολιγονουκλεοτιδικές µικροσυστοιχίες Affymetrix, µε αντιπροσωπευτικές αλληλουχίες γονιδίων (probe sets). Τα 21 µεταγραφικά προφίλ επεξεργάσθηκαν µε τα εξειδικευµένα προγράµµατα ανάλυσης µικροσυστοιχιών, dchip και MeV (v.4.5.1). Η κανονικοποίηση και το φιλτράρισµα των δεδοµένων των µικροσυστοιχιών απέδωσε µεταγραφικά πρότυπα µε probe sets. Με τεχνικές πολυπαραµετρικής στατιστικής ανάλυσης (HCL και PCA) πραγµατοποιήθηκαν οι συγκρίσεις των µεταγραφικών προτύπων µεταξύ των πειραµατικών πληθυσµών για κάθε θερµοκρασία ανάπτυξης και οντογενετικό στάδιο. Οι HCL και PCA αναλύσεις έδειξαν i) σαφή διαχωρισµό των µεταγραφικών προτύπων µεταξύ των δύο πειραµάτων, ii) σαφή διαχωρισµό των προτύπων των 28 o C και 32 o C ως προς αυτά των 22 o C και στα δύο πειράµατα, και iii) σαφή διαχωρισµό των προτύπων των 28 o C διαφορετικού οντογενετικού σταδίου (ηλικίας 10 dpf vs 20 dpf). Θα αναµέναµε τα πρότυπα έκφρασης των 28 o C να παρουσιάζουν παρόµοιο πρότυπο, κάτι που δεν παρατηρείται. Αυτό οφείλεται στο πειραµατικό σφάλµα που υπεισέρχεται από το διαφορετικό χρόνο πραγµατοποίησης των δύο πειραµάτων και τις ρυθµίσεις κατά την 8

9 υβριδοποίηση. Έτσι πραγµατοποιήθηκε η κανονικοποίηση των 28, που απαλείφει το πειραµατικό σφάλµα. Οι HCL και PCA αναλύσεις έδειξαν i) σαφή διαχωρισµό των µεταγραφικών προτύπων των 28 o C και 32 o C ως προς αυτά των 22 o C ως αποτέλεσµα της επίδρασης της θερµοκρασίας ανάπτυξης, ii) σαφή διαχωρισµό των προτύπων των 22 o C των δύο πειραµάτων ως αποτέλεσµα της επίδρασης της περιόδου εφαρµογής και διάρκειας της θερµοκρασιακής αγωγής και iii) σαφή διαχωρισµό των πρότυπων των 28 o C (ηλικίας 10 dpf vs 20 dpf) ως αποτέλεσµα της επίδρασης του οντογενετικού σταδίου. Ακολούθως, πραγµατοποιήθηκε ανάλυση σηµαντικότητας (SAM) και λειτουργική γονιδιωµατική ανάλυση (λογισµικό DAVID) των στατιστικώς σηµαντικών γονιδίων που διαφοροποιούν τα πρότυπα. Η ανάλυση των γονιδίων, ως προς την ιστοειδική έκφραση ανέδειξε γονίδια που σχετίζονται µε την ανάπτυξη του µατιού, των θωρακικών πτερυγίων και του εγκεφάλου στους πληθυσµούς των 22 o C έναντι των 28 o C και 32 o C. Η παρούσα εργασία αποδεικνύει την επίδραση της θερµοκρασίας ανάπτυξης και της διάρκειας της θερµοκρασιακής αγωγής, καθώς επάγει µηχανισµούς πλαστικότητας στο επίπεδο της γονιδιακής έκφρασης. Τέλος, υποδεικνύεται πως η πρώιµη οντογενετική περίοδος τείνει να είναι περισσότερο θερµοευαίσθητη, καθώς παρατηρείται εντονότερη επίδραση της θερµοκρασίας (στην περίπτωση των 22 ο C)στην ανάπτυξη του ατόµου. * dpf: days post fertilization 9

10 ABSTRACT Developmental temperature plays a principal role in the ontogeny of fish. It is known that developmental temperature may shift the initiation time of the ontogenetic stages and induce plasticity in morphological and physiological characters e.g. the musculoskeletal and the cardiovascular system. However, its effect on the gene expression pattern has not previously been attempted for zebrafish. In the present study, zebrafish Affymetrix microarrays of 15,509 probe sets were used to map the transcriptome profile of: a) 20 dpf * old zebrafish larvae at three developmental temperatures, i.e. 22 o C, 28 o C and 32 o C (1 st experiment) and b) 20 dpf old zebrafish larvae, which were all grown at 28 o C for the first 10 days and subsequently divided into three groups, which were grown at 22 o C, 28 o C and 32 o C, respectively; the profile of 10 dpf old larvae was also measured (2 nd experiment). We have isolated total RNA from the above populations and then, hybridization of RNA samples has been done on oligonucleotide Affymetrix microarrays of 15,509 probe sets. All 21 profiles were normalized and filtered (dchip software), and multivariate statistical analysis techniques were used on the normalized 9,488 probe set expression profiles (TM4 MeV software). Hierarchical Clustering (HCL) and Principal Component Analysis (PCA) on expression profiles indicated: a) clear separation of the two experiments based on their transcriptomic patterns, b) clustering of the 28 o C and 32 o C profiles of the 20 dpf old larvae separately from those at 22 o C in both experiments and c) clear separation of the 28 o C profiles based on the developmental stage. We would expect expression profiles of 28 o C to be clustered together, though this was not observed because of experimental parameters during the hybridization, as the two experiments were carried out independently on different dates. So the normalization of 28 profiles took place, in order to eliminate the experimental noise. HCL and PCA, then, indicated: a) clustering of the 28 o C and 32 o C profiles of the 20 dpf old larvae separately from those at 22 o C, as the effect of developmental temperature, b) clear separation of 22 o C profiles of the two experiments, based on the effect of the period and duration of thermal conditions and c) clear separation of the 28 o C profiles based on the developmental stage. Then, Significant Analysis of Microarrays (SAM) and Functional Genomic Classification 10

11 Analysis (DAVID software) of statistically significant genes was carried out. Analysis of genes based on tissue-specific expression indicated characteristic genes for the development of the eye, pectoral fins and brain in 22 o C profiles versus 28 o C and 32 o C profiles. The present study has proved that thermal effect is determinative among the early ontogenetic stage, especially in the case of longer cold thermal period, and developmental temperature may induce plastic response of gene expression, that could affect the fate of fish. * dpf: days post fertilization 11

12 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1.1. Φαινοτυπική πλαστικότητα Όταν το περιβάλλον µεταβάλλεται εκτός των ορίων αντοχής ενός είδους, τότε κάθε φαινότυπος θεωρείται απίθανο να µπορεί να παρέχει υψηλή προσαρµοστικότητα σε κάθε µεταβολή του περιβάλλοντος. Όταν όµως ο φαινότυπος υφίσταται αλλαγές, ως απόκριση στις µεταβολές του περιβάλλοντος, τότε µπορεί να παρέχει ανοχή στις νέες περιβαλλοντικές συνθήκες. Η απόκριση αυτή αφορά στο µηχανισµό της φαινοτυπικής πλαστικότητας, που έρχεται να δώσει τη λύση στο πρόβληµα ενός ετερογενούς περιβάλλοντος. Η φαινοτυπική πλαστικότητα αφορά στην ικανότητα ενός οργανισµού να ανταποκρίνεται σε µια αλλαγή του περιβάλλοντος, τροποποιώντας τη µορφή, την κατάσταση, την κίνηση ή τους µεταβολικούς ρυθµούς του (West-Eberhard 2003). Η φαινοτυπική πλαστικότητα αποτελεί αντικείµενο τόσο των οικοφυσιολόγων όσο και των εξελικτικών βιολόγων και αναδεικνύει την ετερογένεια των συνθηκών του περιβάλλοντος ως καθοριστικής σηµασίας παράγοντα στην οικολογία και την εξέλιξη των ειδών (Via et al. 1995). Με το µηχανισµό της φαινοτυπικής πλαστικότητας περιγράφεται η άµεση επίδραση του περιβάλλοντος στην παραγωγή νέων φαινοτύπων. Το εύρος των φαινοτύπων που εκφράζονται ως απόκριση στις περιβαλλοντικές συνθήκες ονοµάζονται πρότυπο αντίδρασης (Reaction Norm, Schlichting & Pigliucci 1998, εικόνα 1.1). Η συµβολή αυτού του µηχανισµού στην εξελικτική ποικιλότητα θεωρείται πολύ σηµαντική και πλέον έχει ενσωµατωθεί σε οικολογικά και εξελικτικά µοντέλα (Chevin et al. 2010). 12

13 Εικόνα 1.1: Επεξήγηση της έννοιας της φαινοτυπικής πλαστικότητας, όπου ένας γονότυπος έχει την ικανότητα να εκφράζεται µε ποικίλες µορφές ανάλογα µε τις περιβαλλοντικές συνθήκες στις οποίες υπόκειται και να διαµορφώνει ένα νέο φαινότυπο που ενδεχοµένως θα διατηρηθεί (τροποποίηση από Pigliucci et al. 2006). Όλοι οι οργανισµοί, τόσο οι ζωικοί όσο και οι φυτικοί, είναι άµεσα εξαρτώµενοι από το περιβάλλον στο οποίο διαβιούν, µε αποτέλεσµα να επηρεάζονται διάφορα χαρακτηριστικά τους. Αυτά τα χαρακτηριστικά µπορεί να εκφραστούν και να αφοµοιωθούν σε ένα νέο φαινότυπο που ενδεχοµένως να ενισχύσει την επιβίωση του ατόµου σε αυτό το περιβάλλον. Η διαµόρφωση του νέου φαινοτύπου υποστηρίζεται ότι προκύπτει είτε µετά από ενεργοποίηση συγκεκριµένων αλληλόµορφων γονιδίων για το δεδοµένο περιβάλλον (αλληλοµορφική ευαισθησία), είτε µετά από επαγωγή ή καταστολή συγκεκριµένων γονιδίων από ρυθµιστικούς παράγοντες (γονιδιακή ρύθµιση, Via et al. 1995). Όµως, επικρατεί κυρίως η άποψη πως η διαµόρφωση ενός νέου φαινότυπου ρυθµίζεται από διαφορική γονιδιακή έκφραση. Οι περιβαλλοντικοί παράγοντες, όπως η θερµοκρασία, η φωτοπερίοδος, η διατροφή, η πυκνότητα πληθυσµού ή η παρουσία θηρευτή, µπορούν να επάγουν ειδικούς φαινοτύπους, αλλάζοντας πιθανόν τα πρότυπα γονιδιακής έκφρασης (Gilbert 2001, εικόνα 1.2). 13

14 Εικόνα 1.2: Μεταβολή ενός περιβαλλοντικού παράγοντα (π.χ. θερµοκρασία) µπορεί να επάγει την έκφραση διαφορετικών γονιδίων (όπου γ 1, γ 2 κλπ διαφορετικά γονίδια). Η φαινοτυπική πλαστικότητα εκφράζεται σε χαρακτηριστικά που αφορούν στο µεταβολισµό, τα βιοχηµικά δίκτυα, τη φυσιολογία, την ανάπτυξη (οντογενετική πλαστικότητα) καθώς και τα πρότυπα συµπεριφοράς (Chevin et al. 2010). Καθώς αυτά τα χαρακτηριστικά µοιράζονται ένα κοινό γενετικό υπόβαθρο, το οποίο επάγει διαφορετικούς φαινοτύπους ανάλογα µε τις εκάστοτε περιβαλλοντικές συνθήκες, παρατηρείται διαφορετικός βαθµός αναστρεψιµότητας της εκάστοτε απόκρισης (ανάλογα µε την περίπτωση). Συνήθως, τόσο οι βιοχηµικές όσο και οι φυσιολογικές αποκρίσεις µπορούν να αντιστραφούν σε ορισµένο χρονικό διάστηµα, ενώ η οντογενετική πλαστικότητα τείνει να προκαλεί µόνιµες αλλαγές ή αλλαγές που µπορούν να διατηρηθούν για µεγάλο χρονικό διάστηµα. Ο τύπος και ο βαθµός της απόκρισης εξαρτάται άµεσα από το προς αναφορά είδος και τις περιβαλλοντικές συνθήκες. Για παράδειγµα, ένα χαρακτηριστικό µπορεί να επηρεάζεται και να εµφανίζει πλαστικότητα ως απόκριση σε µια θερµοκρασιακή αλλαγή αλλά να µένει ανεπηρέαστο σε µια διατροφική µεταβολή (Pigliucci et al. 2006). Η φαινοτυπική πλαστικότητα έχει µελετηθεί σε επίπεδο µορφολογικών και φυσιολογικών χαρακτηριστικών και πιστεύεται πως µπορεί να επάγει εξελικτικές µεταβολές (Phillips 2006). Όµως, ενώ έχουν πλέον χαρακτηρισθεί πολλές φυσιολογικές πτυχές του φαινοµένου, δεν έχει διερευνηθεί αρκετά σε µοριακό επίπεδο ο µηχανισµός µε τον οποίο ρυθµίζεται η απόκριση του οργανισµού στο περιβάλλον. Καθώς το 14

15 φαινόµενο χαρακτηρίζεται από έντονη πολυπλοκότητα κρίνεται αναγκαία η αξιοποίηση των υψηλής απόδοσης τεχνολογιών βιοµοριακής ανάλυσης για την ολιστική µελέτη της γονιδιακής έκφρασης µετά από κάποια περιβαλλοντική αλλαγή Το φαινόµενο της φαινοτυπικής πλαστικότητας στα ψάρια Τα ψάρια διαβιούν σε ένα συνεχώς µεταβαλλόµενο περιβάλλον. Η επιβίωση, η ανάπτυξη και το πρότυπο αναπαραγωγής (κυρίως το φύλο και η γονιµότητα) των ψαριών επηρεάζεται σε µεγάλο βαθµό τόσο από βιοτικούς όσο και από αβιοτικούς παράγοντες (θερµοκρασία του νερού, τροφή, αλατότητα, περιεκτικότητα σε οξυγόνο κ.λπ.). Σε δεδοµένη µεταβολή των περιβαλλοντικών συνθηκών τα ψάρια αναπτύσσουν διάφορα προσαρµοστικά χαρακτηριστικά, είτε σωµατικά είτε συµπεριφορικά, για την αποτελεσµατική απόκριση και επιβίωσή τους (Johnston 2006). Συχνά, οι αβιοτικοί παράγοντες αλλάζουν µε έναν εναρµονισµένο και σχετικά προβλέψιµο τρόπο ανά εποχή (π.χ. θερµοκρασία και διάρκεια ηµέρας) και συνδυάζονται µε ενδογενείς φυσιολογικούς ρυθµούς, οι οποίοι µπορούν να τροποποιηθούν από πλήθος οικολογικών παραγόντων (Johnston 2006). Σε µελέτες επίδρασης διαφόρων περιβαλλοντικών παραγόντων στην πλαστικότητα της µυογένεσης των ιχθύων, παρατηρήθηκε πως οι αλλαγές στην τροφή (στο Harpagifer bispinis) και τη φωτοπερίοδο (στο Salmo salar) ήταν ικανές να µεταβάλλουν τη ρύθµιση των σηµατοδοτικών µονοπατιών του πολλαπλασιασµού και της διαφοροποίησης των πρόδροµων µυϊκών κυττάρων (Johnston 2006). Επιπλέον, µεταβολές στην περιεκτικότητα σε οξυγόνο (% O 2 ) κατά την κρίσιµη οντογενετική περίοδο του zebrafish είναι δυνατό να προκαλέσουν µόνιµες αλλαγές στον αναπνευστικό ρυθµό, στην αναπνευστική απόκριση (Vulesevic & Perry 2006) και στο καρδιαγγειακό σύστηµα (Pelster 2002). Αντίστοιχες µελέτες έχουν πραγµατοποιηθεί σε διάφορα είδη ψαριών, όπου άλλοτε µεταβάλλεται το περιβάλλον τους ως προς τη ροή των υδάτων και άλλοτε υπάρχει χηµική επίδραση παραγόντων (π.χ. ορµονών). Τέλος, αξίζει να σηµειωθεί ότι τα ψάρια παρουσιάζουν ευρεία φαινοτυπική πλαστικότητα απέναντι στην θερµοκρασία του περιβάλλοντος και ιδιαιτέρως κατά τη διάρκεια των πρώιµων οντογενετικών σταδίων. Μάλιστα, ο παράγοντας της 15

16 θερµοκρασίας ανάπτυξης είναι ο πλέον σηµαντικός στην επαγωγή πλαστικότητας και για αυτόν το λόγο περιγράφεται στη συνέχεια Η θερµοκρασία ανάπτυξης ως παράγοντας φαινοτυπικής πλαστικότητας στα ψάρια Για όλους τους οργανισµούς υπάρχει ένα θερµοκρασιακό εύρος επιβίωσης, όπου µέσα σε αυτό το εύρος παρατηρούνται οι βέλτιστες τιµές θερµοκρασιών για την ανάπτυξη της δόµησης και άριστης λειτουργίας των οργανισµών (Rombough 1997), και πέραν αυτού του εύρους παρατηρούνται διάφορα πρότυπα απόκρισης. Τα ψάρια αποτελούν µια ιδιαιτέρως πλαστική οµάδα οργανισµών και µελέτες σε αυτά έχουν δείξει ότι η θερµοκρασία ανάπτυξης επηρεάζει το ρυθµό αύξησης και διαφοροποίησης και τον αναπτυξιακό χρόνο των οντογενετικών γεγονότων (Parichy et al. 2009). Επίσης, η θερµοκρασία ανάπτυξης έχει παρατηρηθεί πως µπορεί να προκαλέσει µόνιµες αλλαγές στο φύλο (Koumoundouros et al. 2002), το σκελετικό σύστηµα (Georgakopoulou et al. 2007), τον αριθµό των µυϊκών ινών (Matschak & Stickland 1995, Johnston et al. 1997, Xie et al. 2001), το σχήµα σώµατος (Georgakopoulou et al. 2007, Georga & Koumoundouros 2010) και το καρδιαγγειακό σύστηµα (Pelster 2002, Bagatto 2005). Συγκεκριµένα, µια µικρή αύξηση στα επίπεδα της θερµοκρασίας κατά τη διάρκεια του λεκιθογενετικού σταδίου στο λαβράκι (Dicentrarchus labrax L.) ήταν ικανή να βελτιώσει τη δυναµική του ρυθµού αύξησης των µυών και το ιστοχηµικό προφίλ των µυϊκών ινών µε χαρακτηριστικά παρατηρούµενη υπερτροφία και υπερπλασία των λευκών µυϊκών ινών (Lopez-Albors et al. 2002). Παράλληλα, έχει παρατηρηθεί πως νύµφες του ίδιου είδους (λαβρακιού) που έχουν επωασθεί σε υψηλότερη θερµοκρασία εµφανίζουν συνολικά µεγαλύτερη µυϊκή µάζα (Ayala et al. 2001, Johnston et al. 2009). Οµοίως, πλήθος ευρηµάτων καταδεικνύουν την επίδραση της θερµοκρασίας ανάπτυξης σε επιµέρους στοιχεία του µυϊκού συστήµατος. Ειδικότερα, διακυµάνσεις στη θερµοκρασία κατά τα πρώτα οντογενετικά στάδια επιδρούν σηµαντικά στην πυκνότητα και το µέγεθος της περιοχής των λευκών σκελετικών µυϊκών ινών (Stickland et al. 1988, Johnston 2006). Επιπλέον, έχουν παρατηρηθεί µεταβολές στην πυκνότητα µιτοχονδρίων, 16

17 στον αριθµό και την πυκνότητα των πυρήνων και στον αριθµό των µελλοντικών µυϊκών δορυφορικών κυττάρων (Johnston et al. 2009). Εξίσου σηµαντική είναι η επίδραση της θερµοκρασίας ανάπτυξης στη διαφοροποίηση των διαφόρων τύπων µυϊκών ινών και στη µετάβαση των διαφορετικών ισοµορφών µυοϊνιδιακών πρωτεϊνών (Johnston 2006), καθώς επίσης, στην έκφραση των ρυθµιστικών παραγόντων µυογένεσης και των βαριών αλυσίδων µυοσίνης (Wilkes et al. 2001, Xie et al. 2001). Η επίδραση της θερµοκρασίας ανάπτυξης, πέραν αυτής στη διαµόρφωση των µυϊκών δοµών, παρατηρείται και στη διαµόρφωση των µεριστικών χαρακτήρων του ψαριού, οι οποίοι είναι εύπλαστοι έναντι των περιβαλλοντικών συνθηκών και ιδιαιτέρως στη θερµοκρασία µέχρι το στάδιο της ολοκλήρωσης της ανάπτυξης. Οποιαδήποτε παρέκκλιση από τα φυσιολογικά όρια αντοχής επιφέρει αλλοιώσεις είτε στη µορφολογία είτε στον αριθµό των µεριστικών χαρακτηριστικών (Georgakopoulou et al. 2007, Γεώργα 2007). Επιπλέον, οι αλλαγές που έχουν παρατηρηθεί σε δοµές που σχετίζονται µε την κολυµβητική επίδοση (µύες, µεριστικοί χαρακτήρες, σχήµα σώµατος), υποστηρίζουν την υπόθεση ότι το θερµοκρασιακό παρελθόν κατά την πρώιµη ανάπτυξη δύναται να επηρεάζει την κολυµβητική επίδοση των ενήλικων ατόµων (µελέτη στο zebrafish, Sfakianakis et al. 2010, Συµεωνίδη 2008). Τέλος, άλλες εργασίες, καταδεικνύουν την επίδραση στο χρόνο οντογένεσης του καρδιαγγειακού συστήµατος και των καρδιαγγειακών αποκρίσεων. Χαµηλότερη θερµοκρασία ανάπτυξης από τη φυσιολογική έχει ως αποτέλεσµα την αργή ανάπτυξη του καρδιαγγειακού συστήµατος στο zebrafish (Bagatto 2005). 17

18 1.2. Ο πειραµατικός οργανισµός zebrafish Danio rerio, Hamilton 1822 Το zebrafish είναι ένα τροπικό είδος των γλυκών νερών, της οικογένειας των κυπρινοειδών. Τα φυσικά ενδιαιτήµατα του είδους εντοπίζονται σε ποτάµια και λίµνες των τροπικών περιοχών της Ν.Α. Ασίας, στο Πακιστάν, την Ινδία, το Μπαγκλαντές, το Νεπάλ και τη Μιανµάρ. H θερµοκρασία των νερών όπου διαβιεί κυµαίνεται από 18 C ως 25 C και το ph από 6.0 ως 8.0 (Westerfield 1995). Στη φύση, τόσο οι νύµφες όσο και τα ενήλικα άτοµα, τρέφονται µε πρωτόζωα, βενθικά και πελαγικά αρθρόποδα, προνύµφες εντόµων και πολύχαιτους. Φύλο Υποφύλο Υπεροµοταξία Οµοταξία Υφοµοταξία Τάξη Υπόταξη Οικογένεια Γένος Είδος Χορδωτά Σπονδυλωτά Γναθόστοµα Ακτινοπτερύγιοι Τελεόστεοι Κυπρινόµορφα Οσταριόφυσοι Κυπρινοειδή Danio Danio rerio Εικόνα 1.3: Το είδος Danio rerio (Hamilton 1822) και η συστηµατική του κατάταξη. Τα ιδιαίτερα µορφολογικά χαρακτηριστικά του zebrafish, το γεγονός ότι εµφανίζει το βασικό πρότυπο ανάπτυξης των ψαριών (εξωτερική γονιµοποίηση, λεκιθοφόρο στάδιο και στάδιο µεταµόρφωσης) και ο τεράστιος όγκος πληροφοριών που υπάρχει στη διεθνή βιβλιογραφία, το καθιστούν ιδανικό ερευνητικό µοντέλο. Ένα µορφολογικό χαρακτηριστικό, που καθιστά τα zebrafish εύκολα αναγνωρίσιµα, είναι η παρουσία πέντε οµοιόµορφα χρωµατισµένων οριζόντιων µαύρων γραµµών, παράλληλων µεταξύ τους, που εκτείνονται από το πρόσθιο µέχρι το οπίσθιο άκρο του σώµατος, συµπεριλαµβανοµένου του ουραίου πτερυγίου. Παρουσιάζει έντονο φυλετικό διµορφισµό µε τα αρσενικά να έχουν λεπτότερη εµφάνιση και πιο επιµηκυµένο ατρακτοειδές σώµα σε σχέση µε τα θηλυκά άτοµα (τα οποία ξεχωρίζουν από τις 18

19 διογκωµένες κοιλιές τους) (Georga & Koumoundouros 2010). Έχει, επίσης παρατηρηθεί πως τα θηλυκά άτοµα φέρουν εξωτερικό ωοαποθέτη (Parichy et al. 2009). Το µέσο ολικό µήκος (TL) ενός ενήλικου ατόµου κυµαίνεται µεταξύ 3,5 5,5 cm, ενώ η αναπαραγωγική ωριµότητα επιτυγχάνεται µετά τα 2,5 cm TL. Ο χρόνος γενεάς κυµαίνεται µεταξύ 3 4 µηνών και η διάρκεια ζωής από 5 ως 7 χρόνια (Westerfield 1995). Επιπρόσθετα χαρακτηριστικά του το καθιστούν εύκολο στη διαχείριση του σε εργαστηριακές συνθήκες. Έχει µικρό µέγεθος (ακόµα και ως ενήλικο) και είναι εφικτό να διατηρείται σε µεγάλες πυκνότητες σε ένα ενυδρείο. Τα θηλυκά άτοµα αποθέτουν µεγάλες ποσότητες αυγών. Παρουσιάζει εξωτερική γονιµοποίηση και τόσο τα αυγά όσο και τα έµβρυα καθ όλη τη διάρκεια της ανάπτυξής τους είναι διαφανή καθιστώντας εύκολη την παρατήρηση της ανάπτυξης των εσωτερικών τους οργάνων στο µικροσκόπιο. Ο χρόνος γενεάς είναι σύντοµος, ενώ εµφανίζει συνεχή αναπαραγωγικό κύκλο και υψηλά ποσοστά γονιµότητας (περίπου 70-80%). Επιπλέον, η εµβρυική του ανάπτυξη είναι πλήρως χαρακτηρισµένη (Spence et al. 2008). Επίσης, πέραν των παραπάνω πλεονεκτηµάτων, το zebrafish είναι ένας οργανισµός, που βρίσκεται σε άµεση εξάρτηση από το περιβάλλον του και για το λόγο αυτό αποτελεί ιδανικό υποψήφιο για τη µελέτη του φαινοµένου της φαινοτυπικής πλαστικότητας. Ήδη προηγούµενη εργασία στο εργαστήριό µας έχει δείξει πως ο παράγοντας της πυκνότητας των ατόµων κατά το νυµφικό στάδιο επιδρά σηµαντικά στο σχήµα σώµατος (Χρίστου 2010). Επιπλέον, έχει δειχθεί πως ο παράγοντας της θερµοκρασίας ανάπτυξης επιδρά καθοριστικά στο σχήµα σώµατος, την αναλογία φύλου και τους µεριστικούς χαρακτήρες (Georga & Koumoundouros 2010). Τέλος, όσον αφορά την ολιστική ανάλυση του µεταγραφικού προτύπου τα πλεονεκτήµατα του zebrafish έγκειται στο ότι: α) έχει ολοκληρωθεί η χαρτογράφηση του γονιδιώµατός του, β) έχουν σχεδιασθεί σύγχρονα ολιστικά εργαλεία (µικροσυστοιχίες) και γ) έχει αναπτυχθεί µια ολοκληρωµένη διαδικτυακή βάση δεδοµένων για το zebrafish, το (ZebraFish Information Network). Όλα τα παραπάνω χαρακτηριστικά καθιστούν το zebrafish ένα πολύτιµο πειραµατόζωο στη Μοριακή και Αναπτυξιακή Βιολογία, τη Γενετική και την Τοξικολογία (Sprague et al. 2006). 19

20 1.3. Τεχνολογία & Εφαρµογές των Μικροσυστοιχιών (Microarrays) Στη σύγχρονη βιολογία έχει γίνει η µετάβαση στην ολιστική προσέγγιση των βιολογικών ερωτηµάτων, χαρακτηρίζεται ως η εποχή των omics, όπου το ερευνητικό ενδιαφέρον εστιάζεται στην ολιστική µελέτη της φυσιολογίας του οργανισµού σε µοριακό επίπεδο. Καθώς οι βιολογικές διεργασίες αποτελούν το αποτέλεσµα της δυναµικής συνεργασίας των στοιχείων (γονιδίων, πρωτεϊνών, µεταβολιτών) του οργανισµού, η µελέτη των κυττάρων και των οργανισµών πρέπει να γίνεται ολιστικά. Έτσι, έχουν αναπτυχθεί νέες ολιστικές τεχνολογίες, που στόχο έχουν την κατανόηση των αλληλεπιδράσεων όλων των υποκυτταρικών στοιχείων σε ένα βιολογικό σύστηµα. Η τεχνολογία των µικροσυστοιχιών έφερε την επανάσταση στη µετα-γονιδιωµατική εποχή, καθώς επέτρεψε την ταυτόχρονη ποσοτικοποίηση της έκφρασης χιλιάδων γονιδίων ενός βιολογικού συστήµατος (µεταγραφικό πρότυπο). Σε αντίθεση µε τις µικρής-κλίµακας, εστιασµένες τεχνικές µοριακής ανάλυσης, που µελετούν ένα µόνο γονίδιο ή ένα µικρό αριθµό γονιδίων, οι µικροσυστοιχίες ως υψηλής-απόδοσης τεχνική παρέχουν µετρήσεις µεταξύ γονιδίων (ή/και διεργασιών) παρέχοντας τη δυνατότητα συσχετισµού µεταξύ των βιολογικών διαδικασιών και την ανακατασκευή δικτύων ρύθµισης. Στη βιολογία των ιχθύων, η τεχνολογία των µικροσυστοιχιών χρησιµοποιείται στην ανάλυση µοριακών µηχανισµών (Zhang et al. 2009). Συγκεκριµένα, σε πειράµατα µελέτης της αναπτυξιακής βιολογίας του zebrafish, έχουν εντοπιστεί γονίδια µε κοινό πρότυπο έκφρασης ανά οντογενετικό στάδιο (Ton et al. 2002, Linney et al. 2004). Το ερευνητικό ενδιαφέρον επεκτείνεται και στην αναπτυξιακή βιολογία ψαριών εµπορικής σηµασίας, όπως το λαβράκι (Darias et al. 2008). Πειράµατα µικροσυστοιχιών έχουν, επίσης, αναδείξει γονίδια µε ιστοειδική έκφραση και προτείνουν δίκτυα γονιδίων που συνεργούν στην οντογενετική διαδικασία ιστών και οργάνων (Nishidate et al. 2007, Lien et al. 2006). Επιπλέον, αφού τα ψάρια βρίσκονται σε άµεση εξάρτηση από το περιβάλλον τους, αποτελούν ιδανικό αντικείµενο µελέτης για τη γονιδιακή απόκρισή τους στις οικολογικές πιέσεις. Για αυτό το λόγο, η τεχνολογία των µικροσυστοιχιών αποτελεί πολύτιµο εργαλείο στη διαλεύκανση των προσαρµοστικών µηχανισµών στο επίπεδο της γονιδιακής ρύθµισης έναντι αλλαγών στο περιβάλλον, όπως η θερµοκρασία (Gracey 2007, Hirayama et al. 2008, Kassahn et al. 2007), η υποξία (Gracey 2007) και η διατροφή (Drew et al. 2008). Η 20

21 συµβολή των µικροσυστοιχιών ήταν καθοριστική και στην ανάπτυξη των toxicogenomics, όπου η παρουσία χηµικών και ρυπογόνων ουσιών προκαλεί διαφορετικά γονιδιακά πρότυπα έκφρασης των ψαριών (Zhang et al. 2009, Ju et al. 2006, Craig et al. 2010). Όσον αφορά στον τοµέα των υδατοκαλλιεργειών, η χρήση των µικροσυστοιχιών καθιστά δυνατή τη µελέτη των µεταγραφικών προτύπων ψαριών, που έχουν προσβληθεί από κάποιο βακτήριο ή ιό. Η ανάλυση των µεταγραφικών προτύπων αναδεικνύει γονίδια που σχετίζονται µε το ανοσοποιητικό σύστηµα και αποσαφηνίζει τους µοριακούς µηχανισµούς που υπόκεινται στην ανοσοποίηση των ψαριών. Με αυτόν τον τρόπο, έχει προχωρήσει ο σχεδιασµός αποτελεσµατικών εµβολίων για την καλύτερη απόδοση των υδατοκαλλιεργειών (Zhang et al. 2009). Για την εξαγωγή βιολογικών συµπερασµάτων από τα ολιστικά πειράµατα, που πραγµατοποιούνται µε τη χρήση των µικροσυστοιχιών, προκύπτει ένας µεγάλος αριθµός δεδοµένων, που καθιστούν δύσκολη την αξιοποίηση και τη βιολογική ερµηνεία τούς. Για το λόγο αυτό, έχουν αναπτυχθεί σύγχρονα υπολογιστικά και στατιστικά εργαλεία που αποσκοπούν στην καλύτερη εξόρυξη των δεδοµένων για τη διαλεύκανση του ρόλου των γονιδίων και των αλληλεπιδράσεών τους (Quackenbush 2001) Αρχή της µεθόδου των µικροσυστοιχιών Οι DNA µικροσυστοιχίες είναι µια υψηλής απόδοση τεχνολογία, που χρησιµοποιείται για την εκτίµηση της γονιδιακής έκφρασης χιλιάδων γονιδίων, ορισµένες φορές όλου του γονιδιώµατος ταυτόχρονα. Η βασική ιδέα της µεθόδου στηρίζεται στην αρχή της συµπληρωµατικότητας των βάσεων και υπολογίζει το ποσό µορίων mrna σε ένα κελί, ανιχνευτικό σηµείο της µικροσυστοιχίας. Έτσι για κάθε σηµείο επιτρέπεται η µέτρηση των επιπέδων έκφρασης των γονιδίων για δεδοµένο mrna. Οι πρώτες µικροσυστοιχίες (cdna microarrays) αναπτύχθηκαν στο πανεπιστήµιο του Stanford και περιγράφηκαν για πρώτη φορά από τους Shena et al. (1995) για τον οργανισµό-µοντέλο Arabidopsis thaliana. Η τεχνολογία των µικροσυστοιχιών αποτελεί µετεξέλιξη της τεχνικής Southern, κατά την οποία αναλύεται ένας µικρός αριθµός µορίων. 21

22 Κάθε µικροσυστοιχία είναι συνήθως µια στερεή γυάλινη επιφάνεια, πάνω στην οποία τοποθετούνται αλληλουχίες νουκλεοτιδίων (probes) σε προκαθορισµένες θέσεις (spots). Οι αλληλουχίες αυτές είναι είτε cdnas προερχόµενα από κλώνους (ESTs) είτε ολιγονουκλεοτίδια, ανάλογα µε τη µέθοδο. Κάθε αλληλουχία βρίσκεται σε συγκεκριµένη θέση της µικροσυστοιχίας και είναι συµπληρωµατική έναντι ενός ειδικού µετάγραφου του γονιδιώµατος. Η αλληλουχία αυτή αποτελεί τον ανιχνευτή του µετάγραφου του προς στόχευση γονιδίου στο υπό εξέταση βιολογικό δείγµα και έτσι προσδιορίζεται ειδικά η έκφραση του συγκεκριµένου γονιδίου για τη συγκεκριµένη θέση της µικροσυστοιχίας. Η ανίχνευση και ποσοτικοποίηση της έκφρασης κάθε γονιδίου προϋποθέτει τη σήµανση του mrna του δείγµατος, το οποίο στη συνέχεια υβριδοποιείται στη µικροσυστοιχία. Μετά την υβριδοποίηση, ακολουθεί αποµάκρυνση των µη υβριδοποιηµένων µορίων RNA και η µικροσυστοιχία διεγείρεται µε laser, στο κατάλληλο µήκος κύµατος απορρόφησης της φθορίζουσας χρωστικής. Τα σηµεία, όπου έχει λάβει χώρα η υβριδοποίηση των σηµασµένων µορίων RNA στους ανιχνευτές της µικροσυστοιχίας αποδίδουν φωτεινότητα, η οποία ανιχνεύεται από ένα σαρωτή (scanner). Η ένταση της φωτεινότητας αντιστοιχεί στην ποσότητα του συγκεκριµένου µετάγραφου στο δείγµα και µεταφράζεται σε επίπεδα γονιδιακής έκφρασης (Shena et al. 1995). Θεωρητικά, ένα σηµείο µε υψηλότερα επίπεδα φθορισµού δηλώνει πως περισσότερα µόρια mrna υβριδοποιήθηκαν στο συγκεκριµένο σηµείο και συνάγεται πως περισσότερα µόρια mrna του συγκεκριµένου γονιδίου περιέχονταν αρχικά στο δείγµα έναντι άλλων µορίων που υβριδοποιήθηκαν σε άλλες θέσεις και απέδωσαν µικρότερης έντασης φωτεινότητα. Οι πλέον διαδεδοµένοι τύποι, που χρησιµοποιούνται σήµερα, είναι οι µικροσυστοιχίες cdna και οι ολιγονουκλεοτιδικές µικροσυστοιχίες (τύπου Affymetrix, οι οποίες χρησιµοποιήθηκαν στην παρούσα εργασία και περιγράφονται στη συνέχεια) Ολιγονουκλεοτιδικές µικροσυστοιχίες (Affymetrix GeneChip) Ο τύπος µικροσυστοιχιών της εταιρείας Affymetrix (GeneChip ) χαρακτηρίζεται από 25µερή ανιχνευτικά µόρια, τα οποία συντίθενται in situ στη στερεή επιφάνεια της µικροσυστοιχίας µε τη µέθοδο της φωτολιθογραφίας (εικόνα 1.4). 22

23 Η διαδικασία περιλαµβάνει την τοποθέτηση µεµονωµένων βάσεων στην επιφάνεια της µικροσυστοιχίας και τη χηµική σύζευξη νέων βάσεων πάνω στις προηγούµενες. Τα 25µερή συντίθενται µε υψηλή ακρίβεια, καθώς η κάθε βάση είναι (φωτο)χηµικά τροποποιηµένη, δηλαδή φέρει µια προστατευτική οµάδα η οποία αποµακρύνεται µετά από επίδραση υπεριώδους ακτινοβολίας και αποτελεί το υπόστρωµα, όπου θα προσδεθεί η καινούργια βάση. Οι κύκλοι προσθήκης νέων βάσεων επαναλαµβάνονται µέχρι το σχηµατισµό του 25µερούς ολιγονουκλεοτιδίου στο συγκεκριµένο ανιχνευτικό σηµείο της µικροσυστοιχίας. Με αυτόν το στοχευµένο τρόπο επιτυγχάνεται η εκλεκτική επέκταση του ολιγονουκλεοτιδικού ανιχνευτή (probe) για κάθε ανιχνευτικό σηµείο (Lipshutz et al. 1999). Εικόνα 1.4: Φωτοκατευθυνόµενη σύνθεση των ολιγονουκλεοτιδίων. Σε στέρεο υπόστρωµα τοποθετούνται νουκλεοτιδικές βάσεις δηµιουργώντας οµοιοπολικό δεσµό µε αυτό. Κάθε βάση έχει φωτοευαίσθητη προστατευτική οµάδα, η οποία αποµακρύνεται µετά από την επίδραση ακτινοβολίας και έτσι ενεργοποιούνται οι θέσεις πρόσδεσης για τις καινούργιες βάσεις. Η διαδικασία επαναλαµβάνεται, ενεργοποιώντας κάθε φορά νέες θέσεις πρόσδεσης ανά ανιχνευτικό σηµείο, ώστε τελικά να παράγεται ένας 25µερής ανιχνευτής ανά ανιχνευτικό σηµείο (από Lipshutz et al. 1999). Οι ολιγονουκλεοτιδικοί ανιχνευτές στις µικροσυστοιχίες µελέτης της γονιδιακής έκφρασης σχεδιάζονται βάσει cdna ή EST αλληλουχιών (µήκους περίπου βάσεων). Ο σχεδιασµός αυτό πραγµατοποιείται in silico (µέσω υπολογιστή) χρησιµοποιώντας βάσεις δεδοµένων, και περιλαµβάνει τη σύνθεση 11 έως 16 ανιχνευτών που αντιστοιχούν σε µια δεδοµένη αλληλουχία αναφοράς. Η αλληλουχία αυτή επιλέγεται µε κριτήρια µοναδικότητας και ειδικότητας του µορίου. Συνήθως, οι ανιχνευτές υβριδοποιούνται σε ανεξάρτητες περιοχές της αλληλουχίας, όµως ορισµένες φορές µπορεί να έχουν µικρή αλληλοεπικάλυψη (εφόσον αυτό κρίνεται απαραίτητο). Οι 23

24 ολιγονουκλεοτιδικοί ανιχνευτές αναγνωρίζουν τµήµατα του 3 άκρου του γονιδίου και καλούνται Perfect Match (PM, πλήρους υβριδοποίησης). Η περίσσεια (αφθονία) των ανιχνευτών για διαφορετικές περιοχές του ίδιου RNA βελτιώνει σηµαντικά το λόγο της έντασης σήµατος ως προς το θόρυβο (λόγω του υπολογισµού της µέσης τιµής των εντάσεων των πολλαπλών ανιχνευτικών σηµείων), παρέχει ακρίβεια στην ποσοτικοποίηση του RNA, ενώ αποτρέπει φαινόµενα µερικής υβριδοποίησης (cross-hybridization effect) και µειώνει δραστικά το εύρος των ψευδώς θετικών σηµάτων (Lipshutz et al. 1999). Οι PM ανιχνευτές κάθε γονιδίου είναι διάσπαρτοι στη µικροσυστοιχία, ώστε να αποφευχθεί λανθασµένη εκτίµηση της ποσοτικοποίησης της έκφρασης λόγω φαινοµένου θέσης. Ένα επιπλέον επίπεδο ελέγχου επιτυγχάνεται από τη σύνθεση και χρήση µια σειράς Mismatch ανιχνευτών (MM, ατελούς υβριδοποίησης), που χρησιµοποιούνται ως µέτρο εκτίµησης της µη ειδικότητας των PM. Οι ΜΜ ανιχνευτές έχουν ακριβώς την ίδια αλληλουχία µε τα αντίστοιχα PM µε τη διαφορά ότι στη 13 η βάση υπάρχει η αντίθετη συµπληρωµατική βάση (εικόνα 1.5). Κάθε ΜΜ ανιχνευτής βρίσκεται στη διπλανή θέση από αυτή του αντίστοιχου PM για να αποκλεισθεί οποιαδήποτε επίδραση λόγω θέσης. Η παρουσία των ΜΜ επιτρέπει τη διάκριση µεταξύ των αληθινών σηµάτων από τα µη ειδικά ή τα µερικώς ειδικά σήµατα υβριδοποίησης. Η υβριδοποίηση των µορίων στόχων RNA στα PM παρέχει υψηλότερο σήµα από αυτό στα ΜΜ, αποδίδοντας ένα πρότυπο το οποίο δε γίνεται τυχαία. Ακόµη και σε χαµηλές συγκεντρώσεις RNA, η υβριδοποίηση στα PM/MM αποδίδει αναγνωρίσιµα πρότυπα που δύναται να ποσοτικοποιηθούν (Lipshutz et al. 1999). Όλα τα PM και ΜΜ ανιχνευτικά σηµεία για κάθε γονίδιο συνιστούν ένα σύνολο ανιχνευτικών σηµείων (probe set, στο εξής θα χρησιµοποιείται αυτός ο όρος), τα οποία παρέχουν µε υψηλή ακρίβεια τον υπολογισµό την έκφραση του γονιδίου-στόχου. 24

25 Εικόνα 1.5: Σχεδιασµός της µικροσυστοιχίας και των ανιχνευτών (probes). Οι ολιγονουκλεοτιδικοί ανιχνευτές επιλέγονται βάσει κριτηρίων µοναδικότητας έναντι µια αλληλουχίας αναφοράς. Για τους ευκαρυωτικούς οργανισµούς, οι ανιχνευτές επιλέγονται κυρίως βάσει του 3 άκρου του µεταγράφου ενός γονιδίου (κοντά στην polya ουρά), ώστε να ελαχιστοποιούνται τα τυχόν προβλήµατα, που µπορεί να προκύπτουν από τη χρήση µερικώς αποδοµηµένου mrna. Η χρήση της διαφοράς των ΜΜ από τα ΡΜ µειώνει σηµαντικά λάθη που υπεισέρχονται λόγω του θορύβου υποβάθρου (background) και της µερικής υβριδοποίησης, και αυξάνει την ακρίβεια της ποσοτικοποίησης της έκφρασης του κάθε γονιδίου (από Lipshutz et al. 1999) Το Affymetrix GeneChip για το zebrafish Το zebrafish αποτελεί ένα οργανισµό µοντέλο για τη µελέτη της ανάπτυξης των σπονδυλωτών και του ρόλου συγκεκριµένων γονιδίων και σηµατοδοτικών µονοπατιών τόσο στην ανάπτυξη όσο και σε ασθένειες στον άνθρωπο. Επιπλέον, το zebrafish χρησιµοποιείται ευρέως σε τοξικολογικές µελέτες, για τη αποσαφήνιση της επίδρασης του περιβάλλοντος στη φυσιολογία του zebrafish αλλά και άλλων ιχθύων. Για τους παραπάνω λόγους, η εταιρεία Affymetrix σχεδίασε την πλατφόρµα ολιγονουκλεοτιδικών µικροσυστοιχιών για το zebrafish. Το GeneChip Zebrafish Genome Array παρέχει ένα πολύτιµο εργαλείο στους ερευνητές στην αναζήτηση απαντήσεων που αφορούν στους µοριακούς µηχανισµούς, τις βιολογικές διεργασίες και την επίδραση διαφόρων παραγόντων στη γονιδιακή ρύθµιση του zebrafish. 25

26 Εικόνα 1.6: Το Affymetrix GeneChip σε πραγµατικό µέγεθος (από Σε κάθε µικροσυστοιχία zebrafish GeneChip υπάρχουν συνολικά σύνολα ανιχνευτικών σηµείων (probe sets), που αντιστοιχούν σε περισσότερα από µετάγραφα του zebrafish. Οι ολιγονουκλεοτιδικοί ανιχνευτές (probes) είναι 25µερείς και συντίθενται in situ στις µικροσυστοιχίες ακολουθώντας τη γενετική πληροφορία από τις βάσεις δεδοµένων RefSeq (2003), GenBank (2003), dbest (2003) και UniGene (2003). Συνήθως για κάθε µετάγραφο, υπάρχουν 16 ζεύγη ολιγονουκλεοτιδικών ανιχνευτών (16 ΡΜ & 16 ΜΜ). Η αλληλουχία ενός ανιχνευτή ορισµένες φορές είναι µερικώς επικαλυπτόµενη µε την αλληλουχία άλλου ανιχνευτή του ίδιου ανιχνευτικού συνόλου. Πέραν των ανιχνευτών που είναι ειδικοί για κάποιο µετάγραφο, υπάρχουν επιπλέον ανιχνευτές που χρησιµοποιούνται ως µάρτυρες για τον έλεγχο της υβριδοποίησης, ενώ υπάρχουν και ανιχνευτές που αντιστοιχούν στα γονίδια αναφοράς GADPH και alpha 1 Actin (Affymetrix Data Sheet, Η κωδική ονοµατολογία που ακολουθείται για κάθε probe set είναι της µορφής Dr A1_at, όπου το Dr δηλώνει το είδος Danio rerio, ο αλφαριθµητικός κωδικός αντιστοιχεί σε συγκεκριµένο µετάγραφο γονιδίου και το _at προσδιορίζει τον αντινοηµατικό προσανατολισµό (antisense target). Πέραν της παραπάνω γενικής ονοµατολογίας των probe sets, υπάρχουν probe sets µε χαρακτηριστικές καταλήξεις (_at, _a_at, _s_at και _x_at) που υποδηλώνουν την ειδικότητα του probe set έναντι του µεταγράφου. Συγκεκριµένα εµφανίζονται οι εξής καταλήξεις: 26

27 _at: συµβολισµός που προσδιορίζει το anti-sense προσανατολισµό και όταν δεν υπάρχει κάποιο άλλο πρόθεµα υποδηλώνει ότι το probe set είναι ειδικό έναντι του µετάγραφου (transcript specific) _a_at: αφορά σε probe set που αναγνωρίζεται/υβριδοποιείται από πολλαπλά εναλλακτικά µετάγραφα του ίδιου γονιδίου (gene specific) _s_at: αφορά σε probe set που αναγνωρίζεται/υβριδοποιείται από πολλαπλά εναλλακτικά µετάγραφα διαφορετικών γονιδίων _x_at: αφορά σε probe set που δεν είναι ειδικό για ένα µετάγραφο και µπορεί να υβριδοποιείται µε απρόβλεπτο τρόπο (cross hybridization) σε άλλες αλληλουχίες. Το zebrafish GeneChip αποτελεί σηµαντικό εργαλείο στη µελέτη του µεταγραφικού προτύπου υπό συγκεκριµένες πειραµατικές δοκιµές, τόσο για το zebrafish όσο και για άλλα είδη ψαριών (ακόµη και θηλαστικών), για τα οποία δεν έχει αναπτυχθεί ακόµα κατάλληλη µικροσυστοιχία (Zhang et al. 2009). Στην παρούσα εργασία, χρησιµοποιήθηκε το Zebrafish Genome Array (2004) για την εκτίµηση του µεταγραφικού προτύπου του zebrafish ως απόκριση στις διαφορετικές θερµοκρασίες ανάπτυξης που υποβλήθηκαν οι πληθυσµοί. 27

28 1.4. Σκοπός εργασίας Σε πλήθος εργασιών στα ψάρια έχει δειχθεί ότι η θερµοκρασία ανάπτυξης επιδρά στο ρυθµό ανάπτυξης και αύξησης (Johnston 2006, Koumoundouros et al. 2009), στην πλαστικότητα µορφολογικών και φυσιολογικών χαρακτήρων (Georgakopoulou et al. 2007, Georga & Koumoundouros 2010, Bagatto 2005), στην αναλογία φύλου (Pavlidis et al. 2000, Koumoundouros et al. 2002) και στο µεταβολισµό του κυττάρου (κυτταρική διαίρεση και πρωτεϊνική σύνθεση σε µελέτη στους µυς, Stickland et al. 1988). Ωστόσο, µέχρι σήµερα δεν έχει µελετηθεί η επίδραση της θερµοκρασίας ανάπτυξης στο µεταγραφικό πρότυπο. Σκοπός της παρούσας εργασίας είναι να προσεγγίσει ολιστικά το φαινόµενο της θερµο-επαγόµενης γονιδιακής έκφρασης και να αναδείξει ποια γονίδια παρουσιάζουν θερµοκρασιακή πλαστικότητα ως προς το πρότυπο απόκρισής τους και ποιες βιολογικές διεργασίες επηρεάζουν. Η χρήση της υψηλής απόδοσης τεχνολογίας των µικροσυστοιχιών είναι καθοριστική σηµασίας στην επίτευξη του στόχου αυτού. Η παρούσα εργασία αποσκοπεί ακόµη στο να προσδιορίσει ποια οντογενετική περίοδος είναι περισσότερο ευαίσθητη στις θερµοκρασιακές µεταβολές και κατά πόσο η επίδραση της θερµοκρασίας είναι ανάλογη της διάρκειας της θερµοκρασιακής αγωγής. Επίσης, αναζητούνται τα γονίδια των οποίων η έκφραση διαφοροποιείται µεταξύ των διαφορετικών οντογενετικών σταδίων (άτοµα ηλικίας 10 dpf vs 20dpf). Τέλος, η παρούσα εργασία παρουσιάζει όλη την ακολουθία των αναλύσεων που απαιτούνται για τη διαχείριση και την πληρέστερη αξιοποίηση των ολιστικών δεδοµένων για την ασφαλή εξαγωγή βιολογικών συµπερασµάτων, που θα ανάγονται στο φαινότυπο του υπό µελέτη οργανισµού. 28

29 2. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ 2.1. Πειραµατικός σχεδιασµός Για τη µελέτη της επίδρασης της θερµοκρασίας ανάπτυξης στη γονιδιακή έκφραση των νυµφών zebrafish σχεδιάστηκε µια γραµµή πειραµάτων, όπου τρεις θερµοκρασιακές συνθήκες ανάπτυξης (22 o C, 28 o C και 32 o C) εφαρµόστηκαν στην πρώιµη οντογενετική περίοδο. Η υπό εξέταση οντογενετική περίοδος αφορά στο πρώτο 20ήµερο µετά τη γονιµοποίηση του ωαρίου. Πραγµατοποιήθηκαν δύο πειράµατα µε διαφορετική διάρκεια της θερµοκρασιακής αγωγής. Η διάρκεια της κάθε θερµοκρασιακής αγωγής υπολογίζεται σε θερµοηµέρες ( o d), διότι όπως έχει ήδη αναφερθεί η θερµοκρασία µεταβάλλει το ρυθµό ανάπτυξης. Οι χαµηλές θερµοκρασίες επιβραδύνουν την ανάπτυξη, ενώ αντίθετα οι υψηλές θερµοκρασίες επιταχύνουν την ανάπτυξη (Koumoundouros et al. 2002, 2009). Η χρήση των θερµοηµερών εξασφαλίζει ότι οι επιµέρους πληθυσµοί θα βρίσκονται στο ίδιο οντογενετικό στάδιο, παρά τη διαφορετική θερµοκρασία ανάπτυξής τους. Όσον αφορά στον υπολογισµό των θερµοηµερών, αυτές αποτελούν το γινόµενο που προκύπτει από τον πολλαπλασιασµό της θερµοκρασίας ανάπτυξης µε το σύνολο των ηµερών διατήρησης στη συγκεκριµένη θερµοκρασία (1 ηµέρα στους 28 o C αντιστοιχεί σε 28 o d). Οι διαφορετικές θερµοκρασίες, που δοκιµάσθηκαν, επιλέχθηκαν µε κριτήριο το εύρος αντοχής του zebrafish, µε τη θερµοκρασία των 28 o C να αποτελεί τη βέλτιστη για την ανάπτυξη του είδους (Westerfield 1995). Στο πρώτο πείραµα, τα έµβρυα -µετά τη γονιµοποίηση- διατηρήθηκαν στους 28 o C για διάστηµα µιας ηµέρας (28 o d), ούτως ώστε να ολοκληρωθεί επιτυχώς η διαδικασία της γαστριδίωσης. Ακολούθως, τα άτοµα διαχωρίστηκαν και υπεβλήθησαν στις 3 διαφορετικές θερµοκρασίες ανάπτυξης (22 o C, 28 o C και 32 o C) για διάστηµα 560 o d (Εικόνα 2.1). Στο δεύτερο πείραµα, τα έµβρυα διατηρήθηκαν στους 28 o C για 10 ηµέρες, δηλαδή για 280 o d. Τη 10 η ηµέρα µετά τη γονιµοποίηση, τα άτοµα διαχωρίστηκαν και υπεβλήθησαν στις 3 διαφορετικές θερµοκρασίες ανάπτυξης για διάστηµα 280 o d (Εικόνα 2.1). Σηµειώνεται πως το διάστηµα της θερµοκρασιακής αγωγής είναι µισής διάρκειας από αυτό του πρώτου πειράµατος. 29

30 Και τα δυο πειράµατα πραγµατοποιήθηκαν εις τριπλούν, σε 3 βιολογικές επαναλήψεις, και εξετάστηκαν τα µεταγραφικά πρότυπα αυτών των πειραµατικών πληθυσµών. Εικόνα 2.1: Σχηµατική απεικόνιση του πειραµατικού σχεδιασµού. Τα γονιµοποιηµένα αυγά του 1 ου πειράµατος χωρίζονται µια µέρα µετά τη γονιµοποίηση (dpf) στις 3 θερµοκρασίες ανάπτυξης και διατηρούνται στους 22 o C, 28 o C και 32 o C για διάστηµα 560 o d. ειγµατοληψία πραγµατοποιείται στο τέλος της θερµοκρασιακής αγωγής, την 588 η o d. Τα γονιµοποιηµένα αυγά του 2 ου πειράµατος χωρίζονται τη 10 η dpf και διατηρούνται στις 3 θερµοκρασίες ανάπτυξης για διάστηµα 280 o d. ειγµατοληψία πραγµατοποιείται στο τέλος της θερµοκρασιακής αγωγής κατά την 560 η o d για τους πληθυσµούς των 3 θερµοκρασιών. Ειδικά για τους πληθυσµούς του 2 ου πειράµατος στη θερµοκρασία ανάπτυξης των 28 o C, πραγµατοποιείται δειγµατοληψία κατά τη 280 η o d, ώστε να είναι δυνατή η αναπτυξιακή σύγκριση του µεταγραφικού προτύπου των νυµφών zebrafish ηλικίας 10 dpf και 20 dpf. 30

31 2.2. ειγµατοληψίες Οι δειγµατοληψίες πραγµατοποιήθηκαν για το πρώτο πείραµα µετά το πέρας της θερµοκρασιακής αγωγής, κατά την 588 η o d. Για το δεύτερο πείραµα, οι δειγµατοληψίες πραγµατοποιήθηκαν µετά το πέρας της θερµοκρασιακής αγωγής, κατά τη 560 η o d για τους πειραµατικούς πληθυσµούς στις 3 θερµοκρασίες ανάπτυξης, και ειδικά για τους πληθυσµούς που αναπτύχθηκαν στους 28 o C πραγµατοποιήθηκε επιπλέον δειγµατοληψία κατά την 280 η o d. Οι δυο δειγµατοληψίες στους πληθυσµούς που αναπτύχθηκαν στους 28 o C, έγινε για να διαπιστωθούν οι διαφορές στα µεταγραφικά πρότυπα των νυµφών ηλικίας 10 dpf (days post fertilization) από αυτά των νυµφών ηλικίας 20 dpf. Πίνακας 2.1.: Τα δείγµατα από κάθε πληθυσµό ανά θερµοκρασιακή συνθήκη και οντογενετικό στάδιο για τα δυο πειράµατα. Η ονοµατολογία για κάθε δείγµα φέρει πληροφορίες που δηλώνουν το πείραµα, τη θερµοκρασία ανάπτυξης, την ηµέρα της δειγµατοληψίας (πριν -10d- ή µετά -20d- τη θερµοκρασιακή αγωγή) και τον πληθυσµό προέλευσης του δείγµατος ανά triplicate πληθυσµών. Πείραµα 1 Πείραµα 2 1_22C_20d_A 2_22C_20d_A 1_22C_20d_B 2_22C_20d_B 1_22C_20d_C 2_22C_20d_C - 2_28C_10d_A - 2_28C_10d_B - 2_28C_10d_C 1_28C_20d_A 2_28C_20d_A 1_28C_20d_B 2_28C_20d_B 1_28C_20d_C 2_28C_20d_C 1_32C_20d_A 2_32C_20d_A 1_32C_20d_B 2_32C_20d_B 1_32C_20d_C 2_32C_20d_C Οι δειγµατοληψίες περιελάµβαναν τη συλλογή περίπου 80 ατόµων από κάθε πειραµατικό πληθυσµό, όπου 10 από αυτά χρησιµοποιήθηκαν για τη µέτρηση του ολικού µήκους (TL) σώµατος των νυµφών (µόνο στο 1 ο πείραµα) και στα 70 από αυτά πραγµατοποιήθηκε αποµόνωση του ολικού RNA. Ο υπολογισµός της συγκέντρωσης του RNA γινόταν µε φωτοµέτρηση, ενώ ο έλεγχος της ποιότητας του RNA γινόταν µε ηλεκτροφόρηση σε gel αγαρόζης (βλ. Παράρτηµα). Ακολούθως, το κάθε δείγµα RNA (από 31

32 κάθε πειραµατικό πληθυσµό) υβριδοποιήθηκε στις ολιγονουκλεοτιδικές µικροσυστοιχίες Affymetrix (Zebrafish Genechip Array, 2004) από την εταιρεία ATLAS στη Γερµανία. Η µέτρηση του ολικού µήκους (TL) σώµατος των νυµφών πραγµατοποιήθηκε ούτως ώστε να εξετασθεί εάν όλοι οι πειραµατικοί πληθυσµοί από κάθε θερµοκρασιακή συνθήκη παρουσίασαν ανάλογη αύξηση. Η ανάπτυξη σε διαφορετική θερµοκρασία, όπως έχει ήδη αναφερθεί, δύναται να επηρεάζεται και µε τη µέτρηση του TL εκτιµήθηκε ο βαθµός επίδρασης της θερµοκρασίας ανάπτυξης. Κάθε άτοµο αναισθητοποιούταν (ethylenglycolmono-phenylether, 0,15-0,25 ml/l) και φωτογραφιζόταν υπό µεγέθυνση µικροσκοπίου στην αριστερή πλάγια όψη. Η µέτρηση του TL πραγµατοποιήθηκε µε το λογισµικό πακέτο tpsdig (v.1.37), µε την τοποθέτηση δυο µορφοµετρικών σηµείων (landmarks) σε διακριτά ανατοµικές δοµές του σώµατος των νυµφών (Εικόνα 2.2). Εικόνα 2.2.: Φωτογραφία νύµφης zebrafish. Τα µορφοµετρικά σηµεία (landmarks) στα άκρα του σώµατος της νύµφης αφορούν 1. στην κάθετη προέκταση του άκρου του ρύγχους και 2. στο ακραίο µέσο του των λοβών του ουραίου πτερυγίου. Εικόνα 2.3: Οι διαδικασίες που πραγµατοποιήθηκαν για κάθε δειγµατοληψία ανά πληθυσµό. 32

33 2.3. Υβριδοποίηση του RNA των δειγµάτων σε ολιγονουκλεοτιδικές µικροσυστοιχίες Affymetrix Μετά την αποµόνωση του RNA από κάθε πληθυσµό ανά θερµοκρασιακή συνθήκη των δυο πειραµάτων, τα συνολικά 21 δείγµατα RNA εστάλησαν στην εταιρεία ATLAS Biolabs στη Γερµανία, όπου πραγµατοποιήθηκε η υβριδοποίηση του κάθε δείγµατος σε µια µικροσυστοιχία Affymetrix Zebrafish Genome Array (έκδοση του 2004). Η απαραίτητη προεργασία του κάθε δείγµατος RNA πριν την υβριδοποίηση έλαβε χώρα στα εργαστήρια της εταιρείας ATLAS. Το ολικό RNA, που έχει αποµονωθεί από κάθε δείγµα, µετατρέπεται σε δίκλωνο cdna µε αντίστροφη µεταγραφή. Αυτή η µετατροπή πραγµατοποιείται γιατί το RNA δεν είναι ιδιαίτερα σταθερό µόριο, ενώ ως cdna είναι πιο σταθερό και µπορεί να διατηρηθεί για µεγάλο χρονικό διάστηµα. Ακολούθως, το cdna µεταγράφεται in vitro και πάλι προς RNA (γνωστό και ως crna) µε χρήση νουκλεοτιδίων σηµασµένων µε βιοτίνη (συγκεκριµένα κάθε βάση ουρακίλης είναι σηµασµένη µε βιοτίνη). Έτσι επιτυγχάνεται η παραγωγή ιχνηθετηµένου crna, το οποίο τµηµατοποιείται τυχαία σε κοµµάτια µήκους, που ποικίλλουν από 30 έως 400 βάσεις, και υβριδοποιείται στις µικροσυστοιχίες. Κάθε τµήµα RNA που είναι συµπληρωµατικό σε έναν ανιχνευτή, υβριδοποιείται στη θέση αυτή. Οι υβριδοποιηµένες µικροσυστοιχίες, στη συνέχεια, πλένονται -ώστε να αποµακρυνθούν κοµµάτια RNA που δεν υβριδοποιήθηκανκαι βάφονται µε ειδική φθορίζουσα χρωστική (Cy5 συζευγµένη µε στρεπταβιδίνη), που προσδένεται στη βιοτίνη. Τέλος, η κάθε µικροσυστοιχία τοποθετείται σε ειδικό σαρωτήσκάνερ, που διαβάζει τις µικροσυστοιχίες, δηλαδή ανιχνεύει το εκπεµπόµενο σήµα και ποσοτικοποιεί την ένταση της έκφρασης για κάθε γονίδιο (Εικόνα 2.4). 33

34 Εικόνα 2.4: Σχηµατική απεικόνιση των βηµάτων που ακολουθούνται κατά τη διάρκεια µιας υβριδοποίησης σε µικροσυστοιχίες Affymetrix (από την ιστοσελίδα Εξαγωγή δεδοµένων από τις υβριδοποιηµένες µικροσυστοιχίες Μετά την υβριδοποίηση των µικροσυστοιχιών ακολουθεί η σάρωση της κάθε µικροσυστοιχίας και προκύπτει η παραγόµενη εικόνα σε ένα αρχείο τύπου.dat. Η επεξεργασία εικόνας αποτελεί το πρώτο επίπεδο της ανάλυσης και από αυτή προκύπτουν άλλα αρχεία, τα οποία φέρουν όλα τα δεδοµένα για την ένταση όλων των probe sets (εικόνα 2.5). Το κάθε αρχείο φέρει συγκεκριµένες πληροφορίες και µε τη χρήση των κατάλληλων λογισµικών εργαλείων πραγµατοποιείται η ανάλυση των δεδοµένων µε στόχο τη µελέτη των µεταγραφικών προτύπων και την εξαγωγή βιολογικών συµπερασµάτων. Τα αρχεία των δεδοµένων των µικροσυστοιχιών που παραδόθηκαν από την εταιρεία ATLAS αφορούσαν στα παρακάτω:.dat (Image Data File) αφορά στην εικόνα της υβριδοποιηµένης µικροσυστοιχίας, που αναπαρίστανται όλες οι εντάσεις σήµατος ανά ανιχνευτικό σηµείο (probe) 34

35 .cel (Cell Intensity File) προκύπτει από την επεξεργασία εικόνας.dat και φέρει τις τιµές έντασης ανά ανιχνευτικό σηµείο (δηλαδή πρόκειται για την αριθµητική µορφή του.dat).chp (Probe Array Results File) φέρει τα πειραµατικά αποτελέσµατα που προκύπτουν από το.cel και το.cdf αρχείο.txt φέρει τις τιµές έκφρασης για κάθε probe set και συνοδεύεται από πληροφορίες που αφορούν στο κάθε probe set, όπως όνοµα γονιδίου κ.ά. (στην ουσία πρόκειται για αρχείο.chp µε µορφοποίηση.txt).exp (Experiment File) παρέχει πληροφορίες του πειράµατος (όνοµα, ηµεροµηνία κλπ.).rpt (Report File) προκύπτει από λογισµικό της Affymetrix και αποτελεί ένα αρχείο αναφοράς µε τεχνικές πληροφορίες ( (Chip Description File) παρέχεται από την εταιρεία Affymetrix και φέρει πληροφορίες για τα γονίδια και την τοπολογία αυτών στη µικροσυστοιχία Εικόνα 2.5: Η ροή των δεδοµένων που πραγµατοποιείται από τον ένα τύπο αρχείου σε άλλο τύπο αρχείου. Η εξαγωγή των δεδοµένων της µικροσυστοιχίας λαµβάνει χώρα µετά την επεξεργασία εικόνας (.dat) και επιτελείται µε τη χρήση του αλγόριθµουmas5 (MicroArray Suite 5.0). Η εταιρεία ATLAS για την επεξεργασία εικόνας -των.dat αρχείων- και την εξαγωγή των αρχείων.cel και.chp χρησιµοποιεί τον αλγόριθµο MAS5 (MicroArray Suite 5.0), το οποίο είναι ενσωµατωµένο σε κάθε σαρωτή. Η επεξεργασία των.dat αρχείων από κάθε υβριδοποιηµένη µικροσυστοιχία εξάγει δεδοµένα που αφορούν σε: α) την ένταση κάθε ανιχνευτικού σηµείου 35

36 β) την τιµή της έκφρασης και της τυπικής απόκλισης για κάθε probe set, όπως προκύπτει από τον υπολογισµό των PM µόνο ή των ΡΜ και MM ανιχνευτικών σηµείων (ανάλογα µε το µοντέλο που προτιµάται, PM-only ή PM-MM αντίστοιχα) γ) το χαρακτηρισµό της έκφρασης ως Present (P), Absent (A) ή Marginal (M) για κάθε probe set, ανάλογα µε τα κριτήρια που έχει θέσει η Affymetrix Ανάλυση µεταγραφικών προτύπων από µικροσυστοιχίες DNA Σκοπός της βιοπληροφορικής ανάλυσης των δεδοµένων των µικροσυστοιχιών στην παρούσα εργασία είναι η µελέτη του µεταγραφικού προτύπου ως απόκριση στη διαφορετική θερµοκρασιακή αγωγή των πληθυσµών zebrafish κατά την κρίσιµη οντογενετική περίοδο. Ως µεταγραφικό πρότυπο ορίζεται το διάνυσµα του οποίου κάθε στοιχείο είναι η έκφραση ενός γονιδίου σε επίπεδο mrna από το σύνολο όσων µετρώνται κάθε φορά (Brown et al., 1990). Η µελέτη του µεταγραφικού προτύπου, που προκύπτει από την εξαγωγή των δεδοµένων των µικροσυστοιχιών, απαιτεί τη χρήση εξειδικευµένων υπολογιστικών εργαλείων και περιλαµβάνει τα παρακάτω βασικά στάδια: α) Επεξεργασία εικόνας β) Κανονικοποίηση και φιλτράρισµα των µεταγραφικών προτύπων γ) Πολυπαραµετρική στατιστική ανάλυση των µεταγραφικών προτύπων δ) Εξαγωγή βιολογικών συµπερασµάτων Κανονικοποίηση των πειραµατικών δεδοµένων των µικροσυστοιχιών Η επεξεργασία εικόνας, όπως έχει ήδη αναφερθεί, αφορά στην εξαγωγή των δεδοµένων έκφρασης ανά probe set και πραγµατοποιείται από τον αλγόριθµο MAS5.0 από την εταιρεία ATLAS Biolabs. Ακολούθως, αναλύονται τα δεδοµένα των.chp αρχείων της κάθε µικροσυστοιχίας. Το πλέον σηµαντικό βήµα της ανάλυσης αποτελεί η κανονικοποίηση των µικροσυστοιχιών, ούτως ώστε να είναι δυνατή η σύγκριση µεταγραφικών προτύπων από διαφορετική πειραµατική συνθήκη ή στάδιο. Η διαδικασία της κανονικοποίησης αφορά σε 36

37 µετασχηµατισµούς που εφαρµόζονται στα δεδοµένα αρχεία των µικροσυστοιχιών προκειµένου να κατασταθούν βιολογικά συγκρίσιµα. Για να γίνει εφικτή η σύγκριση διαφορετικών µεταγραφικών προτύπων, οι µικροσυστοιχίες κανονικοποιούνται και έτσι εξαλείφεται η επίδραση µη βιολογικών παραγόντων που µπορούν να µεταβάλλουν τα αποτελέσµατα. Οι παράγοντες αυτοί µπορεί να αφορούν σε διαφορές στο ποσό και την ποιότητα του στόχου που υβριδοποιείται, στην ποσότητα της χρωστικής που χρησιµοποιείται και σε πειραµατικές µεταβλητές (π.χ. ρυθµίσεις του σαρωτή, διαφορετικός χρόνος διεξαγωγής των πειραµάτων). Η κανονικοποίηση των σηµάτων υβριδοποίησης µεταξύ των µικροσυστοιχιών µπορεί να γίνεται είτε επί συγκεκριµένων γονιδίων αναφοράς, των οποίων η έκφραση παραµένει σταθερή για όλα τα δείγµατα, είτε επί του συνόλου των γονιδίων ανά µικροσυστοιχία. Στην περίπτωση των ολιγονουκλεοτιδικών µικροσυστοιχιών χρησιµοποιείται κυρίως ο αλγόριθµος κανονικοποίησης µη διαφοροποιηµένου συνόλου (Invariant Set Normalization) του λογισµικού πακέτου dchip (έκδοση 2010, Στο στάδιο αυτό χρησιµοποιούνται τα.cel αρχεία (ή/και τα.chp). Ο συγκεκριµένος αλγόριθµος θέτει µια µικροσυστοιχία ως baseline (συστοιχία αναφοράς) και βάσει αυτής κανονικοποιεί τις υπόλοιπες. Η επιλογή της µικροσυστοιχίας αναφοράς γίνεται αυτόµατα από το πρόγραµµα ή σύµφωνα µε την κρίση του χρήστη, µε κριτήριο τη µέση τιµή έντασης σήµατος της υβριδοποίησης (median intensity) συνήθως η µικροσυστοιχία αναφοράς είναι αυτή µε τη διάµεσο τιµή έντασης έναντι των υπολοίπων. Η κανονικοποίηση µη διαφοροποιηµένου συνόλου βασίζεται στην τυχαία επιλογή ενός συνόλου ανιχνευτικών σηµείων (~ PM probes), τα οποία ταξινοµούνται µε την ίδια ακριβώς σειρά ως προς την τιµή έντασής τους, τόσο στη µικροσυστοιχία αναφοράς όσο και στη µικροσυστοιχία προς κανονικοποίηση (Saviozzi & Calogero 2003, Li & Wong 2001a). Από αυτό το σύνολο των ανιχνευτικών σηµείων προκύπτει µια καµπύλη των τιµών έντασης για κάθε µικροσυστοιχία, υπολογίζεται η διαφορά τους και πραγµατοποιείται η κανονικοποίηση της εν λόγω µικροσυστοιχίας, δηλαδή µεταβάλλονται ανάλογα οι τιµές έντασης των ανιχνευτικών σηµείων όπως προκύπτει από την καµπύλη κανονικοποίησης. Η καµπύλη κανονικοποίησης ουσιαστικά αποτελεί τη διάµεση καµπύλη στο καρτεσιανό διάγραµµα διασποράς των µη µεταβαλλόµενων probes των δυο µικροσυστοιχιών (dchip User s manual). 37

38 Στο στάδιο αυτό γίνεται ένας πρώτος έλεγχος των δεδοµένων µας ως προς το αποτέλεσµα της υβριδοποίησης και αποκλείονται από περαιτέρω ανάλυση µικροσυστοιχίες µε µη εµπιστεύσιµα δεδοµένα, πχ στην περίπτωση ασθενούς υβριδοποίησης του δείγµατος. Ένα επιπλέον επίπεδο κανονικοποίησης ενδέχεται να είναι απαραίτητο όταν τα υπό εξέταση µεταγραφικά πρότυπα προέρχονται από ξεχωριστά πειράµατα που πραγµατοποιήθηκαν σε διαφορετικό χρόνο ή/και σε διαφορετική πλατφόρµα µικροσυστοιχιών (Shabalin et al. 2008). Σε αυτήν την κανονικοποίηση επιχειρείται η απαλοιφή των πειραµατικών παραµέτρων που διαφοροποιούν τα δείγµατα, ώστε να καταταστούν συγκρίσιµα βάσει των βιολογικών χαρακτηριστικών τους. Στην παρούσα εργασία, πραγµατοποιείται Κανονικοποίηση Προτύπων από 2 Πειράµατα, αφού τηρείται το κριτήριο να υπάρχει κοινή κατάσταση οµολογίας ανά πείραµα και αφορά στα πρότυπα των πληθυσµών των 28 o C ηλικίας 20d. Η κανονικοποίηση της παρούσας εργασίας, στο εξής θα αναφέρεται ως Κανονικοποίηση των 28 Προτύπων και πραγµατοποιήθηκε από το εργαστήριό µας, προκειµένου να καλύψει τις διαφορές που εντοπίζονται µεταξύ των πληθυσµών 28 o C θερµοκρασίας ανάπτυξης (ηλικίας 20 dpf) των δύο πειραµάτων,. Οι πληθυσµοί αυτοί διατηρήθηκαν καθόλη τη διάρκεια των πειραµάτων στη θερµοκρασία των 28 o C και το αναµενόµενο ήταν να παρουσιάζουν κοινό µεταγραφικό πρότυπο. Ωστόσο, το γεγονός ότι τα δύο πειράµατα πραγµατοποιήθηκαν σε διαφορετικό χρόνο, υπεισέρχονται πειραµατικοί (και όχι βιολογικοί) παράγοντες που προκαλούν απόκλιση των µεταγραφικών προτύπων των εν λόγω πληθυσµών των δύο πειραµάτων. Τα δύο πειράµατα πραγµατοποιήθηκαν µε διαφορά 2 ετών και οι πειραµατικοί παράγοντες που επέδρασαν αφορούν κυρίως στις ρυθµίσεις του οργάνου-σαρωτή της εταιρείας ATLAS. Για το λόγο αυτό, υπολογίσθηκε για κάθε probe set ο αριθµητικός µέσος (average) της τιµής έντασης των µικροσυστοιχιών των 28 o C του κάθε πειράµατος. Ακολούθως, υπολογίσθηκε ο λόγος της µέσης τιµής έντασης των µικροσυστοιχιών του πειράµατος 1 ως προς το πείραµα 2 για κάθε probe set (AVE 1 /AVE 2 ). Τέλος, έλαβε χώρα ο πολλαπλασιασµός των τιµών έντασης όλων των µικροσυστοιχιών του πειράµατος 2 µε το λόγο AVE 1 /AVE 2 σε κάθε probe set (νέα τιµή = AVE 1 /AVE 2 x αρχική τιµή). 38

39 Έτσι, προέκυψαν οι νέες τιµές έντασης των probe sets για κάθε µικροσυστοιχία του 2 ου πειράµατος (για κάθε θερµοκρασιακή συνθήκη και οντογενετικό στάδιο). Με αυτόν τον τρόπο κανονικοποίησης εξαλείφεται η διαφοροποίηση µεταξύ των µεταγραφικών προτύπων που οφείλεται στα τεχνικά χαρακτηριστικά του πειράµατος και είναι πλέον δυνατό να παρατηρηθεί η διαφοροποίηση των µεταγραφικών προτύπων που οφείλεται σε βιολογικούς παράγοντες (δηλαδή την επίδραση της θερµοκρασίας ανάπτυξης και του οντογενετικού σταδίου). Μαθηµατική προσέγγιση της κανονικοποίησης των 28 για κάθε probe set των µικροσυστοιχιών του πειράµατος 2: Σηµείωση: η κανονικοποίηση πραγµατοποιήθηκε για κάθε τιµή όλων των probe sets για όλες τις µικροσυστοιχίες του πειράµατος 2. Σηµειώνεται πως η πολυπαραµετρική στατιστική ανάλυση των δειγµάτων και η βιοπληροφορική µελέτη των µεταγραφικών προτύπων έλαβε χώρα τόσο πριν όσο και µετά την κανονικοποίηση συγχώνευσης των µικροσυστοιχιών των 28 o C θερµοκρασίας ανάπτυξης. Ο λόγος για τον οποίο πραγµατοποιήθηκε η ανάλυση πριν και µετά τη συγχώνευση αφορά στο να µη χαθεί η παραµικρή βιολογική πληροφορία Εξαγωγή των τιµών έκφρασης για κάθε µικροσυστοιχία Μετά την κανονικοποίηση µη διαφοροποιηµένου συνόλου, πραγµατοποιείται η εξαγωγή των τιµών έκφρασης των probe sets για όλες τις µικροσυστοιχίες σε ένα αρχείο δεδοµένων έκφρασης (Expression data set,.xls). Το λογισµικό dchip παρέχει τη δυνατότητα υπολογισµού της έκφρασης των probe sets εφαρµόζοντας δύο διαφορετικούς αλγόριθµους, το PM-only µοντέλο και το PM-MM µοντέλο. Το PM-only µοντέλο υπολογίζει την τιµή έκφρασης κάθε probe set λαµβάνοντας υπ όψιν µόνο τα PM ανιχνευτικά σηµεία και αποτελεί το δείκτη της θετικής έκφρασης. Η αδυναµία του µοντέλου έγκειται στην µη αφαίρεση του θορύβου υπόβαθρου, όµως 39

40 προτιµάται στην περίπτωση υψηλότερης τιµής των ΜΜ από τα ΡΜ (ΜΜ>ΡΜ, dchip User s manual). Το PM-MM µοντέλο υπολογίζει την έκφραση κάθε probe set, µετά από αφαίρεση του σήµατος των ΜΜ από τα ΡΜ. Θεωρείται πιο ευαίσθητο καθώς τα ΜΜ ανιχνευτικά σηµεία αποτελούν µέτρο της µη ειδικότητας και υψηλές τιµές των ΜΜ υποδεικνύουν ενδεχόµενα φαινόµενα µερικής υβριδοποίησης (cross hybridization) του RNA στις θέσεις στόχους. Το µοντέλο βασίζεται στην παρατήρηση ότι η διακύµανση των τιµών ενός ανιχνευτικού σηµείου µεταξύ πολλαπλών µικροσυστοιχιών είναι µεγαλύτερη από τη διακύµανση µεταξύ των ανιχνευτικών σηµείων σε ένα probe set (Saviozzi & Calogero 2003). Επιπλέον, και τα δύο µοντέλα χρησιµοποιούν τον αλγόριθµο ανίχνευσης ακραίων τιµών (outlier detection algorithm), που εξαλείφει την πιθανότητα µερικής υβριδοποίησης στα ανιχνευτικά σηµεία. Άλλωστε, το dchip υπολογίζει και το τυπικό σφάλµα (SE) για την τιµή έντασης κάθε probe set, το οποίο αποτελεί ένα δείκτη της ποιότητας της υβριδοποίησης ανά probe set, παρέχοντας έτσι τη δυνατότητα απόρριψης αυτών των probe sets (dchip User s manual). Η επιλογή του ενός από τα δύο µοντέλα αποτελεί αντικείµενο διαφωνίας µεταξύ των επιστηµόνων, αφού θεωρείται πως ο αλγόριθµος του PM-MM είναι ανεπαρκής και υποστηρίζεται πως το λάθος που υπεισέρχεται στον υπολογισµό της τιµής έκφρασης ανά probe set ίσως είναι µεγαλύτερο από το σφάλµα που υπεισέρχεται αν δε ληφθούν υπ όψιν οι τιµές των ΜΜ στον υπολογισµό της έκφρασης των probe sets. Μάλιστα, εκτιµάται πως η συµβολή των ΜΜ ανιχνευτικών σηµείων είναι ελάχιστη, καθώς ο ρυθµός υβριδοποίησης των ΜΜ ανιχνευτικών σηµείων είναι κατά φορές µικρότερος από αυτόν των ΡΜ (Okoniewski & Miller 2006, Li & Wong 2001a, 2001b). Για το λόγο αυτό, προτείνεται η χρήση του PM-only µοντέλου, που υπολογίζει την έκφραση των probe sets λαµβάνοντας υπ όψιν µόνο τα PM ανιχνευτικά σηµεία. Ωστόσο ο αντίλογος υποστηρίζει πως το λάθος που υπεισέρχεται είναι µεγαλύτερο αν αγνοηθούν εντελώς τα ΜΜ από όταν συµπεριλαµβάνονται έστω και µε τον ανεπαρκή αλγόριθµο στον υπολογισµό της έκφρασης των probe sets. Στην παρούσα εργασία, αν και χρησιµοποιήθηκαν και τα δυο µοντέλα, προκρίνεται η χρήση του PM-only µοντέλου. 40

41 Φιλτράρισµα των πειραµατικών δεδοµένων των µικροσυστοιχιών Για να επιχειρηθεί η ανάλυση των µεταγραφικών προτύπων και για να εξαχθούν βιολογικά συµπεράσµατα, είναι απαραίτητο το φιλτράρισµα των πειραµατικών δεδοµένων των µικροσυστοιχιών από µη εµπιστεύσιµα δεδοµένα. Το φιλτράρισµα πραγµατοποιείται στο λογισµικό dchip, στα αρχεία δεδοµένων έκφρασης που φέρουν τις τιµές έκφρασης των probe sets, που προκύπτουν τόσο από το PM-only όσο και το ΡΜ-ΜΜ µοντέλο. Για κάθε probe set υπάρχει η τιµή έκφρασής του σε κάθε µικροσυστοιχία, ενώ η παρουσία έκφρασής του περιγράφεται από το Presence call. Το Presence call ορίζεται ως η επαρκής παρουσία έκφρασης πάνω από ένα κατώφλι, σύµφωνα µε κριτήρια που θέτει η Affymetrix (MAS5) και χαρακτηρίζει κάθε probe set ως Present (P, παρόν), Marginal (M, οριακά εκφραζόµενο) και Absent (A, απόν)(mieczkowski et al. 2010). Στην παρούσα εργασία, το φιλτράρισµα πραγµατοποιήθηκε θέτοντας τα εξής κριτήρια: Κάθε probe set να είναι Present (P) τουλάχιστον στο 80% των µικροσυστοιχιών Το επίπεδο της έκφρασης να είναι µεγαλύτερο ή ίσο της τιµής 50 ( 50) στο 100% των δειγµάτων (δηλαδή η ένταση σήµατος να είναι τουλάχιστον 50 για όλα τα probe sets σε όλες τις µικροσυστοιχίες). Ένα επιπλέον επίπεδο φιλτραρίσµατος πραγµατοποιήθηκε στο εργαστήριό µας για την αξιοποίηση των δεδοµένων µε τον πιο ακριβή τρόπο. Έτσι, φιλτραρίστηκαν εκτός τα probe sets µε τις χαρακτηριστικές καταλήξεις _s_at και _x_at, γιατί λειτουργούν ως hub-probesets, δηλαδή µπορούν να υβριδοποιηθούν µε µεγάλο αριθµό µεταγράφων. Η έκφρασή τους µπορεί να προέρχεται από την υβριδοποίηση σε αυτά πολλαπλών µεταγράφων διαφορετικών γονιδίων. Η δυνατότητα αυτών των probe sets να υβριδοποιούνται µε περισσότερα του ενός µετάγραφα, µπορεί να οδηγήσει σε λανθασµένα αποτελέσµατα όσον αφορά στον υπολογισµό της έκφρασης ενός γονιδίου (false positive expression) και επισφαλή συµπεράσµατα (Okoniewski & Miller 2006). Ωστόσο, µε την αφαίρεση αυτών των probe sets από την ανάλυση, χάνεται ένα µέρος βιολογικής πληροφορίας. Είναι προτιµότερο όµως να έχουµε λιγότερες πληροφορίες για κάποια γονίδια, από την πιθανότητα σφάλµατος που υπεισέρχεται σε αυτά και που δύναται να παραποιήσει όλη την ανάλυση. 41

42 2.6. Πολυπαραµετρική στατιστική ανάλυση Προκειµένου να εξαχθούν βιολογικά συµπεράσµατα από τα µεταγραφικά πρότυπα που ανακτώνται από µικροσυστοιχιών χρησιµοποιούνται εξειδικευµένα στατιστικά εργαλεία πολυπαραµετρικής ανάλυσης. Στην παρούσα εργασία χρησιµοποιήθηκε το λογισµικό ανοιχτού κώδικα MeV, MultiExperiment Viewer ( Saeed et al. 2003). Σκοπός της ανάλυσης είναι α) να βρεθούν παρόµοια πρότυπα έκφρασης µεταξύ των διαφορετικών δειγµάτων ανά θερµοκρασιακή συνθήκη και οντογενετικό στάδιο και β) να προσδιοριστούν τα γονίδια των οποίων η έκφραση διαχωρίζει στατιστικώς σηµαντικά δύο οµάδες βιολογικών δειγµάτων. Η οµαδοποίηση επιµέρους δειγµάτων παρέχει πληροφορίες για παρόµοια επίδραση της θερµοκρασιακής αγωγής που έχουν υποστεί οι πειραµατικοί πληθυσµοί όπως αυτή αποτυπώνεται στο µεταγραφικό πρότυπό τους. Από τη σύγκριση των µεταγραφικών προτύπων των επιµέρους οµάδων, αναδεικνύονται τα γονίδια που τα διαφοροποιούν στατιστικώς σηµαντικά και αναδεικνύεται ποια θερµοκρασιακή συνθήκη και η διάρκεια ποιας θερµοκρασιακής αγωγής δρα καθοριστικά στη µεταβολή του µεταγραφικού προτύπου από τη φυσιολογική κατάσταση (των 28 o C θερµοκρασίας ανάπτυξης). Σηµειώνεται πως όλες οι αναλύσεις έγιναν επί των κανονικοποιηµένων και φιλτραρισµένων προτύπων. Λόγω µεγάλης διαφοράς στην έκφραση µεταξύ γονιδίων επιλέχτηκε η ανάλυση να γίνει επί των σταθµισµένων (standardized) τιµών έκφρασης: stg k i k Gi G = σ G i i k όπου: stg i, η σταθµισµένη τιµή έκφρασης του γονιδίου i στο δείγµα j k G i, η τιµή έκφρασης του γονιδίου i στο δείγµα j G i, η µέση τιµή του γονιδίου i (όλων των δειγµάτων) σ, η τυπική απόκλιση της τιµής έκφρασης του γονιδίου i (όλων των δειγµάτων) G i 42

43 Οµαδοποίηση Η οµαδοποίηση παρόµοιων προτύπων (data clustering) στηρίζεται στον καθορισµό της οµοιότητας ως απόστασης στον πειραµατικό χώρο. Συγκεκριµένα, εάν Ν ο αριθµός των γονιδίων κάθε προτύπου, τότε σε ένα χώρο Ν διαστάσεων το κάθε πρότυπο ορίζεται ως ένα σηµείο του χώρου αυτού. Η οµαδοποίηση των δεδοµένων διακρίνεται σε 2 κατηγορίες που αφορούν σε επιβλεπόµενες (supervised) τεχνικές και µη επιβλεπόµενες (unsupervised) τεχνικές. Υπάρχουν διάφορες µετρικές απόστασης µεταξύ προτύπων µε πλέον χρησιµοποιούµενες τις εξής τρεις (που χρησιµοποιήθηκαν και στην παρούσα εργασίαsaeed et al. 2003): 1. Ευκλείδεια απόσταση: Αφορά στην απόσταση µεταξύ δύο σηµείων του ευκλείδειου χώρου, αποτελεί τη γενίκευση του πυθαγόρειου θεωρήµατος. Σε ένα χώρο Ν διαστάσεων η ευκλείδεια απόσταση µεταξύ των σηµείων x και y, περιγράφεται από την εξίσωση: 2. Απόσταση Manhattan: Σε ένα χώρο Ν διαστάσεων η απόσταση Manhattan µεταξύ των σηµείων x και y ορίζεται ως το άθροισµα των αποστάσεων των οριζόντιων και κάθετων προβολών τους και περιγράφεται από την εξίσωση: Εικόνα 2.6: ιαγραµµατική απεικόνιση των αποστάσεων σε ένα χώρο βάσει της Ευκλείδειας µετρικής (αριστερά) και της Manhattan (δεξιά, από /WebSiteDocs/Clustering/ Clustering_Parameters/ Manhattan_Distance_Metric.htm) 43

44 Τόσο η ευκλείδεια όσο και η Manhattan οµαδοποιούν τα πρότυπα ως προς την τιµή έκφρασης. Έτσι τα δείγµατα µε τιµές έκφρασης της ίδιας τάξης µεγέθους οµαδοποιούνται µαζί. 3. Συσχέτιση Pearson (Pearson s correlation): Η τιµή της ποικίλλει από -1 έως +1, που αντανακλά αρνητική και θετική συσχέτιση αντίστοιχα. Με τη συσχέτιση Pearson είναι δυνατό να οµαδοποιηθούν µαζί δύο πρότυπα που δε µοιάζουν τόσο στη τάξη µεγέθους τιµών έκφρασης όσο στο πρότυπο µεταβολής των τιµών έκφρασης. Έτσι, µεταγραφικά πρότυπα που παρουσιάζουν παρόµοια µεταβολή έκφρασης µεταξύ των γονιδίων τους, ανεξάρτητα από την τιµή έντασης ανά ανιχνευτικό σηµείο, θα οµαδοποιηθούν µαζί. Η συσχέτιση Pearson περιγράφεται από την εξίσωση: όπου Ιεραρχική οµαδοποίηση (HCL, Hierarchical Clustering) Ο αλγόριθµος ιεραρχικής οµαδοποίησης αποτελεί µια συνενωτική µέθοδο όπου παρόµοια πρότυπα ενώνονται σε µια οµάδα και σχηµατίζουν ένα κλάδο του ιεραρχικού δέντρου που σχηµατίζεται, του οποίου το µήκος αντανακλά το βαθµό οµοιότητας αυτών των στοιχείων. Ακολούθως συνενώνονται νέα πρότυπα ή οµάδες προτύπων σχηµατίζοντας ένα νέο κλάδο και η διαδικασία ολοκληρώνεται µε το σχηµατισµό ενός ιεραρχικού δενδρογράµµατος, όπου όλα τα πρότυπα ανήκουν σε µια οµάδα (Eisen et al. 1998). 44

45 Εικόνα 2.7: Ιεραρχικό δενδρόγραµµα όπου φαίνεται η οµαδοποίηση των δειγµάτων σε ξεχωριστούς κλάδους. Συγκεκριµένα η πλήρης περιγραφή των βηµάτων του ιεραρχικού αλγόριθµού, όπως περιγράφηκε από τον Johnson το 1967, αφορά σε ένα σύνολο Ν στοιχείων (που θα οµαδοποιηθούν) και σε ένα πίνακα αποστάσεων ΝxN: 1. Κάθε στοιχείο θεωρείται ότι είναι µια διακριτή οµάδα, έτσι για Ν στοιχεία υπάρχουν αντίστοιχα Ν οµάδες (µε ένα µόνο µέλος). Οι αποστάσεις µεταξύ των οµάδων είναι ίσες µε τις αποστάσεις των στοιχείων που περιέχονται στις οµάδες. 2. Εντοπισµός του πιο όµοιου ζεύγους οµάδων και συγχώνευση αυτών σε µια οµάδα (έτσι υπάρχουν πλέον Ν-1 οµάδες) 3. Υπολογισµός των αποστάσεων µεταξύ της νέας οµάδας που προέκυψε και των υπολοίπων. 4. Επανάληψη των βηµάτων 2 και 3, µέχρι όλα τα στοιχεία να συνιστούν µια µοναδική οµάδα µεγέθους Ν στοιχείων (Borgatti 1994). Είναι ο πλέον διαδεδοµένος τρόπος οµαδοποίησης στην ανάλυση προτύπων γονιδιακής έκφρασης και συνήθως το πρώτο στάδιο όποιας πολυπαραµετρικής ανάλυσης. Σηµειώνεται πως στην ανάλυση της παρούσας εργασίας πραγµατοποιήθηκε ιεραρχική οµαδοποίηση σύνδεσης µεταξύ του κέντρου βάρους των προτύπων (οµάδων) (average linkage clustering). Σε αυτήν την περίπτωση η απόσταση µεταξύ των οµάδων υπολογίζεται από το κέντρο βάρους (µέσο) της οµάδας. 45

46 Ανάλυση Κύριων Συνιστωσών (PCA, Principal Component Analysis) Η PCA αποτελεί µια µέθοδο µετατροπής του αρχικού πειραµατικού χώρου, που συνήθως επιτρέπει να απεικονιστεί το µεγαλύτερο ποσοστό της διακύµανσης µεταξύ των προτύπων του αρχικού χώρου στις πρώτες τρεις διαστάσεις του νέου. Έτσι γίνεται δυνατή η οπτικοποίηση της θέσης των προτύπων στον τρισδιάστατο χώρο. Εικόνα 2.8: Η PCA παρέχει την οπτικοποίηση της διαφοροποίησης των δειγµάτων σε γράφηµα 3 διαστάσεων. Η διαφοροποίηση των οµάδων υποδεικνύεται µε διαφορετικό χρώµα. Κάθε κύρια συνιστώσα εµπεριέχει ένα ορισµένο ποσοστό της συνολικής διαφοροποίησης των προτύπων στον αρχικό χώρο µε την πρώτη να φέρει το µεγαλύτερο, τη δεύτερη το αµέσως µικρότερο κ.ο.κ. Οι τρεις πρώτες κύριες συνιστώσες χρησιµοποιούνται για τη χαρτογράφηση του κάθε στοιχείου (γονίδιο ή δείγµα) στον τρισδιάστατο χώρο, παρέχοντας µια αξιόλογη και εµπιστεύσιµη οπτικοποίηση των δεδοµένων (Raychaudhuri et al. 2000). 46

47 Ανάλυση Σηµαντικότητας για Μικροσυστοιχίες (SAM, Significant Analysis of Microarrays) Η SAM είναι ανάλυση σηµαντικότητας που σχεδιάστηκε για την ανάλυση των προτύπων γονιδιακής έκφρασης από µικροσυστοιχίες (Tusher et al. 2001). Τα πλεονεκτήµατα της SAM για την ανάλυση οµικών δεδοµένων σε σχέση µε τις παραδοσιακές αναλύσεις σηµαντικότητας είναι ότι δεν απαιτούν τα δεδοµένα να ακολουθούν συγκεκριµένη κατανοµή. Επιπλέον επιτρέπουν, ενώ ο αλγόριθµος είναι εν εξελίξει, να υπολογιστεί ο αριθµός των ψευδών θετικών αποτελεσµάτων για κάθε κατώφλι σηµαντικότητας, επιτρέποντας µε αυτόν τον τρόπο την επιλογή του εκάστοτε κατωφλιού ανάλογα µε τις απαιτήσεις της µελέτης (Dutta et al. 2007). Εικόνα 2.9: Γράφηµα διασποράς των αναµενόµενων (άξονας Χ) και παρατηρούµενων (άξονας Υ) τιµών γονιδιακής έκφρασης µεταξύ των συγκρινόµενων οµάδων Α και Β. Για τα γονίδια των οποίων η διαφορά παρατηρούµενης από την αναµενόµενη τιµή υπερβαίνει κατά απόλυτη τιµή το κατώφλι σηµαντικότητας delta, θεωρούνται ως θετικώς ή αρνητικώς στατιστικώς σηµαντικά (κόκκινα και πράσινα σηµεία αντίστοιχα), δηλαδή η τιµή έκφρασης τους αυξάνεται ή µειώνεται αντίστοιχα στατιστικώς σηµαντικά στο πρότυπο Β ως προς το Α. Στην παρούσα εργασία, όλες οι αναλύσεις SAM πραγµατοποιήθηκαν για το µικρότερο κατώφλι σηµαντικότητας (delta) στο οποίο ο ρυθµός ανίχνευσης ψευδών θετικών γονιδίων FDR ήταν ίσος µε το µηδέν. 47

48 2.7. Ανάλυση Γονιδιακής Οντολογίας Η ανάλυση γονιδιακής οντολογίας επιτρέπει να συνδυαστούν τα αποτελέσµατα της πολυπαραµετρικής στατιστικής ανάλυσης µε την υπάρχουσα βιολογική γνώση για την εξαγωγή βιολογικών συµπερασµάτων. Μια συγκεκριµένη οντολογία έγκειται σε µια συγκεκριµένη κατηγοριοποίηση των γονιδίων µε βάση είτε το βιολογικό τους ρόλο (δηλαδή τη βιολογική διεργασία ή µοριακή λειτουργία στην οποία συµµετέχουν οι πρωτεΐνες τους) είτε µε βάση την κυτταρική περιοχή ή ιστό, όπου εκφράζονται τα γονίδια. Πραγµατοποιώντας ανάλυση γονιδιακής οντολογίας επιτυγχάνεται η σύνδεση απλών µοριακών ποσοτήτων (µονάδων), δηλαδή των γονιδίων, µε πιο πολύπλοκους µηχανισµούς (δηλαδή βιολογικές διεργασίες) ή µορφολογικές δοµές. Για την ανάλυση γονιδιακής οντολογίας χρησιµοποιήθηκε το λογισµικό εργαλείο λειτουργικής ταξινόµησης των γονιδίων DAVID (DAVID Bioinformatics resources Gene Functional Classification Tool). Το DAVID αποτελεί το ακρωνύµιο των λέξεων Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery. Είναι ένα δηµόσια διαθέσιµο λογισµικό ( και αποτελεί πολύτιµο εργαλείο για τους ερευνητές, αφού έχουν τη δυνατότητα να ερµηνεύουν τους βιολογικούς µηχανισµούς που σχετίζονται µε τις µεγάλου όγκου λίστες γονιδίων που εξετάζουν. (Dennis et al. 2003). Επίσης, παρέχει τη δυνατότητα ανάλυσης των προτύπων γονιδιακής έκφρασης ως προς διάφορες οντολογίες (βιολογική διεργασία, µοριακή λειτουργία, κυτταρική περιοχή ή µορφολογικές δοµές/ιστοί). Ως αποτέλεσµα παρέχει την τιµή εµπλουτισµού (enrichment score) µιας συγκεκριµένης οµάδας όρων γονιδιακής οντολογίας στα στατιστικώς σηµαντικά γονίδια που έχουν προσδιοριστεί µε την ανάλυση σηµαντικότητας. Η τιµή εµπλουτισµού υπολογίζεται από το DAVID λαµβάνοντας υπόψιν τόσο τον αριθµό των στατιστικώς σηµαντικών γονιδίων που µετέχουν σε αυτήν την οµάδα όρων γονιδιακής οντολογίας, όσο και το µέγεθος των όρων αυτών. Εποµένως, εάν δύο όροι γονιδιακής οντολογίας εκπροσωπούνται από τον ίδιο αριθµό γονιδίων στα στατιστικώς σηµαντικά γονίδια, αλλά ο ένας περιλαµβάνει δύο φορές περισσότερα γονίδια, τότε ο βαθµός εµπλουτισµού του όρου αυτού στα στατιστικώς σηµαντικά γονίδια του προβλήµατός µας θα είναι δύο φορές µικρότερος. 48

49 Συγκεκριµένα, στην ανάλυση χρησιµοποιήθηκε το Functional annotation clustering που οµαδοποιεί τους όρους µε τη µεγαλύτερη συχνότητα τις στατιστικώς σηµαντικές οµάδες γονιδίων και τις κατατάσσει ανά βαθµό σηµαντικότητας σύµφωνα µε την τιµή εµπλουτισµού. Η µέθοδος αυτή έχει το πλεονέκτηµα να παρέχει ένα αρκετά καλό επίπεδο βιολογικής ανάγνωσης των γονιδίων της λίστας που αναλύεται (Huang et al. 2009). Η λειτουργική γονιδιωµατική ανάλυση πραγµατοποιήθηκε σε δύο κατευθύνεις: i) την ιστοειδική έκφραση ως προς τις ανατοµικές δοµές του zebrafish, χρησιµοποιώντας τους όρους ανατοµίας όπως προκύπτουν από την κύρια βάση δεδοµένων για το zebrafish, το ZFIN ( ii) την ανάλυση γονιδιακής οντολογίας (Gene Ontology, GO), σύµφωνα µε τους όρους: Βιολογική διεργασία (BP, Biological Process) Μοριακή λειτουργία (MF, Molecular Function) Κυτταρικές δοµές/οργανίδια (CC, Cellular Component) 49

50 3. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 3.1. Αποτελέσµατα µέτρησης του ολικού µήκους (TL) σώµατος Η εκτίµηση του ολικού µήκους σώµατος πραγµατοποιήθηκε στους πληθυσµούς του πειράµατος 2, όπου υπέστησαν τη θερµοκρασιακή αγωγή διάρκειας 560 o d. Το µέσο ολικό µήκος κυµαίνεται µεταξύ 6 και 9 mm. Όπως παρατηρείται στο γράφηµα της εικόνας 3.1, οι πληθυσµοί 28C, 32A και 32C παρουσιάζουν τις µεγαλύτερες τιµές TL. Ωστόσο, το εύρος του µήκους σώµατος των υπολοίπων πληθυσµών παρουσιάζει µια οµοιόµορφη κατανοµή µεταξύ των 5,5 και 7,5mm. Ολικό µήκος (mm) A 22B 22C 28B 28C 32A 32B 32C Πληθυσµοί ανά θερµοκρασιακή συνθήκη Εικόνα 3.1: Γράφηµα απεικόνισης των µέσων τιµών (±SD) του ολικού µήκους σώµατος για κάθε πληθυσµό ανά θερµοκρασιακή συνθήκη. Πίνακας 3.1: Η µέση τιµή και η τυπική απόκλιση (SD) του ολικού µήκους σώµατος (TL) για κάθε πληθυσµό, µε τον αντίστοιχο αριθµό ατόµων, ανά θερµοκρασιακή συνθήκη. Πληθυσµοί ανά θερµοκρασιακή συνθήκη Αριθµός ατόµων Μέσο ολικό µήκος (mm) SD 22A B C B C A B C

51 3.2. Αποτελέσµατα ανάλυσης των µεταγραφικών προτύπων Μετά την υβριδοποίηση του RNA των δειγµάτων των πληθυσµών και την επεξεργασία εικόνας των µικροσυστοιχιών από την εταιρεία ATLAS Biolabs, εστάλησαν στο εργαστήριό µας τα αρχεία µε τα δεδοµένα των 21 µικροσυστοιχιών Κανονικοποίηση Με τη χρήση του λογισµικού dchip, τα 21.chp αρχεία για όλες τις µικροσυστοιχίες αναλύθηκαν και κανονικοποιήθηκαν µε τον αλγόριθµο µη διαφοροποιηµένου συνόλου. Από το dchip επιλέχθηκε ως µικροσυστοιχία αναφοράς (baseline), η 2_28C_20d_C (αφορά στον τρίτο πληθυσµό 28 o C θερµοκρασία ανάπτυξης και ηλικίας 20 dpf του 2 ου πειράµατος) µε τη διάµεσο τιµή έντασης του σήµατος υβριδοποίησης ίση µε 192. Ωστόσο οι πληθυσµοί της συγκεκριµένης θερµοκρασιακής συνθήκης του 2 ου πειράµατος εµφανίζουν µεγάλη ποικιλότητα. Όπως φαίνεται στον πίνακα 3.1. οι τιµές έντασης για τους τρεις πληθυσµούς αυτής της συνθήκης είναι 139, 399 και 192, χαρακτηρίζονται από τη µεγαλύτερη διακύµανση και προτιµήθηκε η baseline να µην είναι από αυτή τη συνθήκη. Για το λόγο αυτό, επιλέχθηκε η πλέον κοντινή στη διάµεσο τιµή έντασης µικροσυστοιχία, η 2_22C_20d_C (αφορά στον τρίτο πληθυσµό 22 o C θερµοκρασία ανάπτυξης και ηλικίας 20 dpf του 2 ου πειράµατος) µε µέση τιµή έντασης του σήµατος υβριδοποίησης ίση µε 206. Με βάση τη συγκεκριµένη µικροσυστοιχία ως baseline κανονικοποιήθηκαν οι υπόλοιπες µικροσυστοιχίες µε τον αλγόριθµο µη διαφοροποιηµένου συνόλου, του οποίου ο αριθµός των PM ανιχνευτικών σηµείων ποίκιλλε από περίπου έως Σε αυτό το στάδιο, συγκρίνοντας τις τιµές έντασης του σήµατος υβριδοποίησης των µικροσυστοιχιών των δύο πειραµάτων, παρατηρείται πως οι τιµές του 1 ου πειράµατος είναι χαµηλότερες (κυµαίνονται από ) του 2 ου πειράµατος (~200). Μάλιστα, παρατηρώντας µόνο τις τιµές του 2 ου πειράµατος, φαίνεται πως η τιµή της µικροσυστοιχίας 2_28C_20d_Α (αφορά στον πρώτο πληθυσµό 28 o C θερµοκρασία ανάπτυξης και ηλικίας 20 dpf του 2 ου πειράµατος) είναι ιδιαιτέρως χαµηλή, ίση µε 139, έναντι των υπολοίπων τιµών που κυµαίνονται περίπου στο 200. Από τη χαµηλή τιµή του σήµατος υβριδοποίησης 51

52 συνάγεται το συµπέρασµα πως στο συγκεκριµένο δείγµα η υβριδοποίηση ήταν ασθενής και κρίνεται σκόπιµο να αποκλεισθεί από την πολυπαραµετρική στατιστική ανάλυση. Από την κανονικοποίηση των µικροσυστοιχιών προκύπτει ο πίνακας 3.2. όπου για κάθε µικροσυστοιχία αναφέρεται η τιµή έντασής της πριν και µετά την κανονικοποίηση, επίσης ο αριθµός των PM ανιχνευτικών σηµείων που συµµετείχαν στο µη διαφοροποιηµένο σύνολο και τέλος το ποσοστό παρουσίας έκφρασης των probe sets (% των Present probe sets). Πίνακας 3.2.: Κατά την κανονικοποίηση κάθε µικροσυστοιχίας ως προς τη µικροσυστοιχία αναφοράς (baseline), η διάµεση τιµή έντασης του σήµατος υβριδοποίησης επαναπροσαρµόζεται ούτως ώστε όλα τα δεδοµένα να βρεθούν στην ίδια κλίµακα. Η µεταβολή της τιµής καθορίζεται από την έκφραση των PM probes που συµµετέχουν στο µη διαφοροποιηµένο σύνολο. Όνοµα µικροσυστοιχίας ιάµεση τιµή έντασης - πριν την κανονικοποίηση ιάµεση τιµή έντασης - µετά την κανονικοποίηση Αριθµός probes (PM) στο µη διαφοροποιηµένο σύνολο Παρουσία έκφρασης (P call %) 1_22C_20d_A _22C_20d_B _22C_20d_C _22C_20d_A _22C_20d_B _22C_20d_C 206 baseline _28C_20d_A _28C_20d_B _28C_20d_C _28C_10d_A _28C_10d_B _28C_10d_C _28C_20d_A _28C_20d_B _28C_20d_C _32C_20d_A _32C_20d_B _32C_20d_C _32C_20d_A _32C_20d_B _32C_20d_C

53 Εξαγωγή των τιµών έκφρασης για κάθε µικροσυστοιχία Ο υπολογισµός των επιπέδων έκφρασης για κάθε probe set των µικροσυστοιχιών πραγµατοποιήθηκε στο λογισµικό dchip, τόσο µε το PM-only όσο και το PM-MM µοντέλο. Για κάθε µοντέλο προέκυψε ένα αρχείο Excel (.xls) µε γραµµές για κάθε µικροσυστοιχία, όπου αντιστοιχούσαν σε probe sets µεταγράφων γονιδίων και τα υπόλοιπα σε probe sets ελέγχου. Στο αρχείο έκφρασης των probe sets, πέραν της τιµής έκφρασης, υπάρχει η τιµή του τυπικού σφάλµατος (Standard Error) και η παρουσία έκφρασης (P, A, M όπως ορίζεται από τα κριτήρια της Affymetrix) για κάθε probe set Φιλτράρισµα Το φιλτράρισµα πραγµατοποιήθηκε επί των probe sets, που προέκυψαν από το προηγούµενο στάδιο. Για να γίνει το φιλτράρισµα µη εµπιστεύσιµων probe sets, τέθηκαν δύο κριτήρια: 1. Κάθε probe set να είναι Παρόν (Present, P) τουλάχιστον στο 80% των µικροσυστοιχιών (δοκιµάσθηκαν επιπλέον τα ποσοστά 50%, 60%, 70%, 80%, 90% και 100%, όµως επιλέχθηκε το 80% όπου αρχίζει να φαίνεται µια τάση). 2. Το επίπεδο της έκφρασης να είναι µεγαλύτερο ή ίσο της τιµής 50 ( 50) στο 100% των δειγµάτων (δηλαδή η ένταση σήµατος να είναι τουλάχιστον 50 για όλα τα probe sets σε όλες τις µικροσυστοιχίες). Να σηµειωθεί πως τα παραπάνω κριτήρια εφαρµόστηκαν στην περίπτωση των τιµών έκφρασης των probe set που προέκυψαν από το PM-only µοντέλο. Έτσι το φιλτράρισµα οδήγησε σε µια λίστα probe sets. Το φιλτράρισµα των probe sets, των οποίων η τιµή έκφρασής τους υπολογίσθηκε µε το PM-MM µοντέλο, πραγµατοποιήθηκε επί της παραπάνω λίστας, των probe sets. Καταλήγοντας, έτσι, σε µια λίστα ισάριθµων probe sets, όπου η τιµή έκφρασης για κάθε probe set έχει υπολογισθεί βάσει του PM-MM µοντέλου. Στη συνέχεια, πραγµατοποιήθηκε το επιπλέον φιλτράρισµα των µη ειδικών probe sets µε κατάληξη _s_at και _x_at, καταλήγοντας στην τελική λίστα για την πολυπαραµετρική στατιστική ανάλυση µε probe sets. 53

54 3.3. Αποτελέσµατα Πολυπαραµετρικής Στατιστικής Ανάλυσης Από τις 21 µικροσυστοιχίες, όπως αναφέρθηκε ήδη, εξαιρέθηκε η 2_28C_20d_A λόγω ασθενούς υβριδοποίησης και οι υπόλοιπες 20 αποτέλεσαν το αντικείµενο της πολυπαραµετρικής στατιστικής ανάλυσης. Οι 20 µικροσυστοιχίες µελετήθηκαν ως προς τις διαφορετικές µετρικές αποστάσεις της ιεραρχικής οµαδοποίησης, εντοπίστηκαν ποιες µικροσυστοιχίες οµαδοποιούνται µαζί και ποιες αυξάνουν τη στατιστική διακύµανση και γι αυτό εξαιρέθηκαν στη συνέχεια. Για την κατανόηση των αποτελεσµάτων της ιεραρχικής οµαδοποίησης, σηµειώνεται πως σε κάθε κλαδόγραµµα εµφανίζονται τα προς ανάλυση δείγµατα και οι οµάδες που σχηµατίζουν βάσει των οµοιοτήτων στην τιµή έκφρασης των probe sets. Η έκφραση κάθε probe set για όλα τα δείγµατα, αφορά σε κανονικοποιηµένα δεδοµένα και περιγράφεται από τις οριζόντιες γραµµές έκφρασης, ενώ καλύπτουν ένα εύρος που κυµαίνεται από -2 έως +2. Οι χαµηλές τιµές έκφρασης υποδηλώνονται µε πράσινο χρώµα και οι υψηλές τιµές µε κόκκινο. Η πολυπαραµετρική στατιστική ανάλυση πραγµατοποιήθηκε στα δεδοµένα έκφρασης που προέκυψαν για το PM-only και το PM-MM µοντέλο (βλ. παράρτηµα) Ανάλυση των 20 µεταγραφικών προτύπων Από τα κλαδογράµµατα της εικόνας 3.2, µε τη χρήση της ευκλείδειας απόστασης και της απόστασης Manhattan, προκύπτουν 2 κύριοι κλάδοι που αφορούν στα δύο πειράµατα και διακρίνονται τα δείγµατα που αποκλίνουν σηµαντικά. Συγκεκριµένα, το πρότυπο έκφρασης της µικροσυστοιχίας 2_28C_10d_A είναι ιδιαιτέρως αποµακρυσµένο τόσο από τα δείγµατα του 2 ου πειράµατος όσο και από τα αντίστοιχα πρότυπα της ίδιας συνθήκης. Ακολούθως τα πρότυπα 1_32C_20d_A και 2_32C_20d_C διαχωρίζονται εµφανώς από τα αντίστοιχα της πειραµατικής συνθήκης από την οποία προέρχονται. 54

55 Α. Β. Εικόνα 3.2: Ιεραρχική οµαδοποίηση µε χρήση (A) της ευκλείδειας και (B) της απόστασης Manhattan. Στο κλαδόγραµµα της εικόνας 3.3, µε τη χρήση της συσχέτισης Pearson παρατηρείται, πως -και εδώ- τα πρότυπα 1_32C_20d_A και 2_32C_20d_C διαχωρίζονται εµφανώς από τα αντίστοιχα της πειραµατικής συνθήκης από την οποία προέρχονται. Όµως το 2_28C_10d_A διατάσσεται στον ίδιο κλάδο µε τα όµοιά του, δηλαδή των προτύπων των ατόµων ηλικίας 10d. Αυτό οφείλεται στο γεγονός πως αυτά τα πρότυπα βρίσκονται στον ίδιο κλάδο λόγω των οµοιοτήτων στην ιεραρχία και τη µορφή του προτύπου έκφρασης (και όχι λόγω των οµοιοτήτων στην έκφραση κατά απόλυτες τιµές). Εικόνα 3.3: Ιεραρχική οµαδοποίηση µε χρήση της συσχέτισης Pearson. 55

56 Στη συνέχεια, το αποτέλεσµα της ανάλυσης των κύριων συνιστωσών (PCA, εικόνα 3.4) αποτυπώνει καλύτερα τα αποτελέσµατα της ιεραρχικής οµαδοποίησης στο τρισδιάστατο χώρο. Κάθε σφαίρα στην PCA αντιστοιχεί στο πρότυπο έκφρασης κάθε µικροσυστοιχίας. Με γαλάζιο χρώµα αναπαρίστανται τα δείγµατα του 1 ου πειράµατος και µε ροζ τα δείγµατα του 2 ου πειράµατος. Όπως παρατηρείται, τα δείγµατα των δύο πειραµάτων διαχωρίζονται πλήρως ως προς την πρώτη κύρια συνιστώσα. Επίσης, είναι εµφανής η µεγάλη απόκλιση του προτύπου 2_28C_10d_A από τα υπόλοιπα της ίδιας συνθήκης. Τα πρότυπα 1_32C_20d_A και 2_32C_20d_C αν και αποκλίνουν από τα αντίστοιχα της πειραµατικής συνθήκης από την οποία προέρχονται, δε φαίνεται να ξεχωρίζουν εµφανώς στην τρισδιάστατη PCA. Η απόκλιση των 1_32C_20d_A και 2_32C_20d_C αποτυπώνεται καλύτερα στην PCA δυο διαστάσεων (εικόνα 3.5, Β και Γ). Εικόνα 3.4: Η PCA αποτυπώνει τα δείγµατα στο τρισδιάστατο χώρο. Με γαλάζιο χρώµα τα δείγµατα του 1 ου πειράµατος και µε ροζ του 2 ου. Με το κίτρινο βέλος υποδεικνύεται το 2_28C_10d_A. 56

57 Α. Β. Γ. Εικόνα 3.5: PCA δυο διαστάσεων. Α: PC1vsPC2, B: PC2vsPC3, Γ: PC1vsPC3. Με βέλη υποδεικνύονται τα προς εξαίρεση δείγµατα. 57

58 Η παραπάνω ανάλυση των 20 µεταγραφικών προτύπων πραγµατοποιήθηκε βάσει των προτύπων έκφρασης που έχουν προκύψει από το PM-only µοντέλο και βρέθηκαν ποια είναι τα δείγµατα που αποκλίνουν σηµαντικά από τα όµοιά τους (της ίδιας πειραµατικής συνθήκης). Η ίδια στατιστική ανάλυση έλαβε χώρα και στα 20 πρότυπα έκφρασης που έχουν προκύψει από το PM-MM µοντέλο (βλ. Παράρτηµα). Η HCL και η PCA οδήγησε στις ίδιες οµαδοποιήσεις και στην ανάδειξη των ίδιων 3 προτύπων ως σηµαντικά αποκλίνοντα από τα αντίστοιχα της ίδιας πειραµατικής συνθήκης. Συµπερασµατικά, ολοκληρώνοντας την ανάλυση των 20 µεταγραφικών προτύπων προκύπτει ότι τα πρότυπα έκφρασης ανά πειραµατική συνθήκη οµαδοποιούνται είτε µαζί σε κοινό κλάδο είτε σε γειτονικό κλάδο. Ωστόσο, παρατηρήθηκε πως 3 πρότυπα, τα 2_28C_10d_A, 1_32C_20d_A και 2_32C_20d_C αυξάνουν τη διακύµανση µεταξύ των προτύπων της ίδιας πειραµατικής συνθήκης και κρίθηκε αναγκαίο να εξαιρεθούν από περαιτέρω ανάλυση. Έτσι, καταλήξαµε σε 17 συνολικά µεταγραφικά πρότυπα προς ανάλυση Ανάλυση των 17 µεταγραφικών προτύπων Από τα κλαδογράµµατα της εικόνας 3.6 και 3.7, µε τη χρήση των τριών µετρικών αποστάσεων, προκύπτουν 2 κύριοι κλάδοι που αφορούν στα δύο πειράµατα. Α. Β. 1 ο πείραµα 2 ο πείραµα 1 ο πείραµα 2 ο πείραµα Εικόνα 3.6: Ιεραρχική οµαδοποίηση των 17 προτύπων µε χρήση (A) της ευκλείδειας και (B) της απόστασης Manhattan. Σχηµατίζονται 2 κύριοι κλάδοι, όπου οµαδοποιούνται τα δείγµατα του 1 ου πειράµατος (γαλάζιο χρώµα)και του 2 ου πειράµατος (ροζ). 58

59 Μάλιστα, παρατηρώντας πιο προσεχτικά τον κλάδο του 1 ου πειράµατος, φαίνεται πως τα πρότυπα που αφορούν στους 22 ο C θερµοκρασίας ανάπτυξης οµαδοποιούνται µαζί και διαχωρίζονται από τα υπόλοιπα. Αντίστοιχα, στο 2 ο πείραµα, παρατηρείται πως τα πρότυπα των 28 o C των 10 ηµερών οµαδοποιούνται και διαχωρίζονται από αυτά των 20 ηµερών του ίδιου πειράµατος. Ειδικά στο κλαδόγραµµα της εικόνας 3.7, µε χρήση της συσχέτισης Pearson, παρατηρείται πως οι κλάδοι είναι µικρότερου µήκους (σε σύγκριση µε τους κλάδους από την ευκλείδεια και τη Manhattan απόσταση). Οι µικρού µήκους κλάδοι υποδηλώνουν τις οµοιότητες µεταξύ των δειγµάτων όσον αφορά στη µορφή των προτύπων έκφρασης και όχι στην ποσοτική έκφραση σε απόλυτες τιµές. 1 ο πείραµα 2 ο πείραµα Εικόνα 3.7: Ιεραρχική οµαδοποίηση των 17 προτύπων µε χρήση της συσχέτισης Pearson. Σχηµατίζονται 2 κύριοι κλάδοι, όπου οµαδοποιούνται τα δείγµατα του 1 ου πειράµατος (γαλάζιο χρώµα) και του 2 ου πειράµατος (ροζ). Στη συνέχεια, το αποτέλεσµα της ανάλυσης των κύριων συνιστωσών (PCA, εικόνα 3.8) αποτυπώνει καλύτερα τα αποτελέσµατα της ιεραρχικής οµαδοποίησης στο τρισδιάστατο χώρο. Όπως παρατηρείται, τα δείγµατα των δύο πειραµάτων διαχωρίζονται πλήρως ως προς την πρώτη κύρια συνιστώσα (PC1). Παρατηρώντας τα πρότυπα του 1 ου πειράµατος (αριστερή πλευρά της PCA), τα πρότυπα που αφορούν στους 22 ο C θερµοκρασίας ανάπτυξης (άνω αριστερό τεταρτηµόριο) 59

60 διαχωρίζονται πλήρως από τα πρότυπα των 28 o C και 32 o C του ίδιου πειράµατος (κάτω αριστερό τεταρτηµόριο) ως προς τη δεύτερη κύρια συνιστώσα (PC2). Οµοίως, παρατηρώντας τα πρότυπα του 2 ου πειράµατος (δεξιά πλευρά της PCA), τα πρότυπα που αφορούν στους 22 ο C θερµοκρασίας ανάπτυξης (άνω δεξί τεταρτηµόριο) διαχωρίζονται πλήρως από τα πρότυπα των 28 o C και 32 o C του ίδιου πειράµατος (κάτω δεξί τεταρτηµόριο) ως προς τη δεύτερη κύρια συνιστώσα (PC2). Επίσης, τα πρότυπα των 28 o C της ηλικίας των 10 ηµερών (10d) διαχωρίζονται από τα αντίστοιχα των 28 o C των 20 ηµερών (20d) ως προς την τρίτη κύρια συνιστώσα (PC3). Τα πρότυπα των 10d αποτυπώνονται µε µικρότερες σφαίρες και αυτό γιατί βρίσκονται στο βάθος του τρισδιάστατου χώρου. Συµπερασµατικά, φαίνεται πως η PC1 διαχωρίζει τα δύο πειράµατα, ως αποτέλεσµα του διαφορετικού χρόνου που πραγµατοποιήθηκαν τα πειράµατα. Η PC2 διαχωρίζει τα δείγµατα βάσει της θερµοκρασίας ανάπτυξης, µε τη θερµοκρασία των 22 o C να έχει δράσει πιο έντονα στο πρότυπο έκφρασης και να διαφοροποιεί τα πρότυπα των 22 o C αρκετά από τα αντίστοιχα των 28 o C και 32 o C. Τέλος, η PC3 διαχωρίζει τα πρότυπα βάσει του οντογενετικού σταδίου, καθώς τα πρότυπα των 28 o C κατά τη 10d διαφοροποιούνται σηµαντικά τόσο από τα πρότυπα των 28 o C κατά τη 20d όσο και από όλα τα υπόλοιπα πρότυπα, που αφορούν επίσης σε πληθυσµούς ηλικίας 20d. 60

61 Εικόνα 3.8: Η PCA αποτυπώνει τα δείγµατα στο τρισδιάστατο χώρο. Με γαλάζιο χρώµα τα δείγµατα του 1 ου πειράµατος και µε ροζ του 2 ου, ενώ µε πράσινο τα δείγµατα των προτύπων των 10d. Ήδη από αυτό το στάδιο της ανάλυσης, συµπεραίνεται πως τα πρότυπα των 22 o C θερµοκρασίας ανάπτυξης διαχωρίζονται από τα πρότυπα των 28 ο C και 32 o C, τόσο στο 1 ο πείραµα όσο και στο 2 ο αν και το 2 ο πείραµα χαρακτηρίζεται από µεγαλύτερη διακύµανση µεταξύ των προτύπων των 28 ο C και 32 o C. Τα παραπάνω δεδοµένα υποστηρίζουν ότι υπάρχει θερµοκρασιακή πλαστικότητα σε µεταγραφικό επίπεδο, η οποία είναι πιο εµφανής στα πρότυπα των 22 o C θερµοκρασίας ανάπτυξης και λιγότερο εµφανής στα πρότυπα των 32 o C σε σχέση µε τα µεταγραφικά πρότυπα της βέλτιστης θερµοκρασίας ανάπτυξης, τους 28 o C. Τέλος, φαίνεται πως τα πρότυπα των 10 και 20 ηµερών είναι σαφώς διαχωρισµένα µεταξύ τους, κάτι που ήταν αναµενόµενο να συµβαίνει µιας και αφορούν σε διαφορετικό οντογενετικό στάδιο. Σηµείωση: η παραπάνω πολυπαραµετρική στατιστική ανάλυση των 17 µεταγραφικών προτύπων πραγµατοποιήθηκε επί των τιµών έκφρασης από το PM-only µοντέλο. Η αντίστοιχη ανάλυση επί των τιµών έκφρασης από το PM-MM µοντέλο οδήγησε στα ίδια συµπεράσµατα και τα αποτελέσµατα παρουσιάζονται στο παράρτηµα. 61

62 Ανάλυση Σηµαντικότητας (SAM) Από την ιεραρχική οµαδοποίηση και την ανάλυση κύριων συνιστωσών προέκυψε ότι τα πρότυπα από µια κοινή πειραµατική συνθήκη οµαδοποιούνται και διαχωρίζονται από τα πρότυπα άλλων συνθηκών. Συγκεκριµένα, ο διαχωρισµός των µεταγραφικών προτύπων αντανακλάται στο επίπεδο της θερµοκρασιακής αγωγής που έλαβε χώρα. Έτσι, για κάθε πείραµα παρατηρήθηκε πως τα πρότυπα των 22 o C οµαδοποιούνται και διαχωρίζονται από τα πρότυπα των 28 o C και 32 o C. Για το λόγο αυτό πραγµατοποιήθηκε σε κάθε πείραµα η ανάλυση σηµαντικότητας (SAM), όπου έλαβε χώρα η σύγκριση των προτύπων των 22 o C έναντι αυτών στους 28 o C και 32 o C. Από τη σύγκριση προέκυψε ο αριθµός των στατιστικώς σηµαντικών probesets/γονιδίων, των οποίων η έκφραση διαφοροποιεί σηµαντικά τα πρότυπα µεταξύ των οµάδων. Σηµείωση: Η SAM πραγµατοποιήθηκε µόνο στα πρότυπα έκφρασης που προέκυψαν από το PM-only µοντέλο. Σύγκριση προτύπων (20d) 1 ου πειράµατος: 28 o C & 32 o C vs 22 o C Η SAM από αυτή τη σύγκριση ανέδειξε 166 αρνητικώς στατιστικώς σηµαντικά γονίδια (βλ. Παράρτηµα σε ηλεκτρονική µορφή) για το κατώφλιο εύρος d=0,840 και για ρυθµό ανίχνευσης ψευδών γονιδίων ίσο µε µηδέν (FRD median =0). Αυτά τα 166 στατιστικώς σηµαντικά γονίδια υποεκφράζονται στα πρότυπα των πληθυσµών που έχουν αναπτυχθεί στους 28 o C και 32 o C και υποδεικνύονται µε τις πράσινες κουκίδες (εκτός του εύρους d) στην εικόνα 3.9α. Σύγκριση προτύπων (20d) 2 ου πειράµατος: 28 o C & 32 o C vs 22 o C Η SAM από αυτή τη σύγκριση ανέδειξε 33 συνολικά στατιστικώς σηµαντικά γονίδια (βλ. Παράρτηµα σε ηλεκτρονική µορφή) για το κατώφλιο εύρος d=0,525 και για ρυθµό ανίχνευσης ψευδών γονιδίων ίσο µε µηδέν (FRD median =0). Από τα 33 στατιστικώς σηµαντικά γονίδια, τα 25 υποεκφράζονται στα πρότυπα των πληθυσµών που έχουν αναπτυχθεί στους 28 o C και 32 o C και υποδεικνύονται µε τις πράσινες κουκίδες (εκτός του εύρους d) στην εικόνα 3.9β, ενώ τα 8 υπερεκφράζονται στα πρότυπα των πληθυσµών που έχουν αναπτυχθεί στους 28 o C και 32 o C και υποδεικνύονται µε τις κόκκινες κουκίδες (εκτός του εύρους d) στην εικόνα 3.9β. 62

63 α. 1_28 o C,32 o C vs 1_22 o C β. 2_28 o C,32 o C vs 2_22 o C Εικόνα 3.9: Το αποτέλεσµα της SAM για τη σύγκριση των προτύπων των 28 o C και 32 o C προς τα πρότυπα των 22 o C α) για το 1 ο πείραµα (d=0,840 FDR median =0) ανέδειξε 166 στατιστικώς σηµαντικά γονίδια (πράσινα σηµεία) που υποεκφράζονται στα 28 o C και 32 o C και β) για το 2 ο πείραµα (d=0,525 FDR median =0) 33 συνολικά στατιστικώς σηµαντικά γονίδια, όπου τα 25 υποεκφράζονται (πράσινα σηµεία) και τα 8 υπερεκφράζονται (κόκκινα σηµεία) στα πρότυπα των 28 o C και 32 o C. 63

64 Ανάλυση των 20 µεταγραφικών προτύπων µετά την Κανονικοποίηση των 28 Μετά την κανονικοποίηση των 28, όπου επιχειρήθηκε να εξαλειφθεί η διακύµανση που οφείλεται σε πειραµατικές αποκλίσεις, πραγµατοποιήθηκε πολυπαραµετρική στατιστική ανάλυση των 20 µεταγραφικών προτύπων, ώστε να διαπιστωθούν ποιες οµαδοποιήσεις λαµβάνουν χώρα. Από τα κλαδογράµµατα της εικόνας 3.10, µε τη χρήση της ευκλείδειας απόστασης και της απόστασης Manhattan, προκύπτουν 4 σαφείς κλάδοι και διακρίνονται τα δείγµατα που αποκλίνουν σηµαντικά. Οι οµαδοποιήσεις στους κλάδους αφορούν στα πρότυπα των 22 o C θερµοκρασίας ανάπτυξης του 1 ου πειράµατος, στα πρότυπα των 28 o C των 10 ηµερών (10d), στα πρότυπα των 22 o C του 2 ου πειράµατος και τέλος στα πρότυπα των 28 o C και 32 o C των δύο πειραµάτων. Αντίστοιχα, παρατηρούνται τα πρότυπα που αποκλίνουν σηµαντικά από αυτά της ίδιας πειραµατικής συνθήκης. Συγκεκριµένα, το πρότυπο έκφρασης της µικροσυστοιχίας 2_28C_10d_A είναι ιδιαιτέρως αποµακρυσµένο από τα αντίστοιχα πρότυπα των 10 ηµερών. Επίσης, το πρότυπα 1_32C_20d_A είναι αρκετά αποµακρυσµένο από τα άλλα πρότυπα των 32 o C, καθώς οµαδοποιείται µε τα πρότυπα των 22 o C του 1 ου πειράµατος. Τέλος, το 2_32C_20d_C δεν οµαδοποιείται µε κανένα από τα άλλα πρότυπα των 32 o C, καθώς αποτελεί από µόνο του έναν ακραίο κλάδο. Α. Β. Εικόνα 3.10: Ιεραρχική οµαδοποίηση µε χρήση (A) της ευκλείδειας και (B) της απόστασης Manhattan. 64

65 Στο κλαδόγραµµα της εικόνας 3.11, µε τη χρήση της συσχέτισης Pearson παρατηρείται, πως -και εδώ- το πρότυπο 1_32C_20d_A διαχωρίζεται εµφανώς από τα αντίστοιχα της πειραµατικής συνθήκης από την οποία προέρχονται. Όµως το 2_28C_10d_A διατάσσεται στον ίδιο κλάδο µε τα όµοιά του, δηλαδή των προτύπων των ατόµων ηλικίας 10d. Αυτό οφείλεται στο γεγονός πως αυτά τα πρότυπα βρίσκονται στον ίδιο κλάδο λόγω των οµοιοτήτων στην ιεραρχία και τη µορφή του προτύπου έκφρασης (και όχι λόγω των οµοιοτήτων στην έκφραση κατά απόλυτες τιµές). Τέλος, παρατηρείται πως το 2_22C_10d_B (το πρώτο από δεξιά στο κλαδόγραµµα) διαχωρίζεται από τα όµοιά του, καθώς οµαδοποιείται µε τα πρότυπα των 28 o C των 10 ηµερών. Εικόνα 3.11: Ιεραρχική οµαδοποίηση µε χρήση της συσχέτισης Pearson. 65

66 Στη συνέχεια, η ανάλυση των κύριων συνιστωσών (PCA, εικόνα 3.2) αποτυπώνει τη διάταξη των δειγµάτων στο τρισδιάστατο χώρο. Κάθε σφαίρα στην PCA αντιστοιχεί στο πρότυπο έκφρασης κάθε µικροσυστοιχίας. Πλέον τα πρότυπα βρίσκονται πιο κοντά στον πειραµατικό χώρο (αντίθετα µε τα αποτελέσµατα πριν την κανονικοποίηση των 28 ). Επίσης, είναι εµφανής η µεγάλη απόκλιση του προτύπου 2_28C_10d_A από τα υπόλοιπα της ίδιας συνθήκης (στο άκρο του άξονα 1). Το ίδιο παρατηρούµε και για το 2_32C_20d_C, όπου είναι αρκετά αποµακρυσµένο από τα όµοιά του. Η οπτικοποίηση και η κατανοµή των δειγµάτων στο χώρο είναι περισσότερο ευδιάκριτη στην PCA δύο διαστάσεων της εικόνας (βλ. εικόνα 3.12, Β και Γ). Εικόνα 3.11: Η PCA αποτυπώνει τα δείγµατα στο τρισδιάστατο χώρο. Με το κίτρινο βέλος υποδεικνύεται το 2_28C_10d_A και το 2_32C_10d_C που αποκλίνουν σηµαντικά. Τα δείγµατα που αποκλίνουν σηµαντικά από τα όµοιά τους εξαιρούνται από την ανάλυση, γιατί αυξάνουν τη διακύµανση µεταξύ των προτύπων. Πρόκειται για τα πρότυπα 2_28C_10d_A, 2_32C_20d_C και 1_32C_20d_A. 66

67 Α. Β. Γ. Εικόνα 3.12: PCA δυο διαστάσεων. Α: PC1vsPC2, B: PC2vsPC3, Γ: PC1vsPC3. Με βέλη υποδεικνύονται τα προς εξαίρεση δείγµατα. Τα ποσοστά για τις πρώτες κύριες συνιστώσες: PC1=30,4%, PC2=19,5% και PC3=10,5%. 67

68 Ανάλυση των 17 µεταγραφικών προτύπων µετά την Κανονικοποίηση των 28 Από τα κλαδογράµµατα της εικόνας 3.10, µε τη χρήση της ευκλείδειας απόστασης και της απόστασης Manhattan, προκύπτουν 4 σαφείς κλάδοι. Οι οµαδοποιήσεις στους κλάδους αφορούν στα πρότυπα των 22 o C θερµοκρασίας ανάπτυξης του 1 ου πειράµατος, στα πρότυπα των 28 o C των 10 ηµερών (10d), στα πρότυπα των 22 o C του 2 ου πειράµατος και τέλος σ ένα διευρυµένο κλάδο µε τα πρότυπα των 28 o C και 32 o C των δύο πειραµάτων. Πλέον, είναι εµφανές πως τα 4 από τα 5 συνολικά πρότυπα των 28 o C οµαδοποιούνται µαζί. Α. Β. Εικόνα 3.13: Ιεραρχική οµαδοποίηση των 17 προτύπων µε χρήση (A) της ευκλείδειας και (B) της απόστασης Manhattan. Ακολούθως, στο κλαδόγραµµα της εικόνας 3.14, µε χρήση της συσχέτισης Pearson, παρατηρούνται και εδώ- οι 4 κλάδοι που περιγράφηκαν παραπάνω. Όµως, το αξιοσηµείωτο είναι πως αυτό το κλαδόγραµµα αποτελείται από κύριους κλάδους, όπου στον πρώτο περιέχονται τα πρότυπα των 22 o C και τα πρότυπα των 10 ηµερών, ενώ στο δεύτερο κλάδο τα πρότυπα των 28 o C και 32 o C. Από την τελευταία παρατήρηση συνάγεται πως τα πρότυπα των 22 o C είναι πιο κοντά στα πρότυπα των 10 ηµερών, ίσως λοιπόν τα άτοµα των 22 o C να εµφανίζουν µεταγραφικό πρότυπο που δεν ταιριάζει στο προχωρηµένο οντογενετικό στάδιο των ατόµων των 28 o C και 32 o C (των 20d). 68

69 Εικόνα 3.14: Ιεραρχική οµαδοποίηση των 17 προτύπων µε χρήση της συσχέτισης Pearson. Στη συνέχεια, η PCA (εικόνα 3.15) οπτικοποιεί καλύτερα τα δείγµατα στον πειραµατικό χώρο και οι οµάδες που περιγράφηκαν στα αποτελέσµατα της ιεραρχικής οµαδοποίησης αποτυπώνονται µε πιο ευδιάκριτο τρόπο. Έτσι φαίνεται πως τα πρότυπα των 22 o C του 1 ου πειράµατος διατάσσονται στο άνω αριστερό τεταρτηµόριο της PCA (υποδεικνύονται µε ανοιχτό κίτρινο) και τα πρότυπα των 22 o C του 2 ου πειράµατος (έντονο κίτρινο) διατάσσονται στην πάνω πλευρά της PCA αλλά στο κέντρο αυτής. Τα πρότυπα των 22 o C των δύο πειραµάτων συνιστούν δύο διακριτές οµάδες. Επίσης, τα πρότυπα των 28 o C της ηλικίας των 10 ηµερών (10d) διαχωρίζονται από όλα τα υπόλοιπα πρότυπα και εντοπίζονται στο πάνω δεξί τεταρτηµόριο της PCA (υποδεικνύονται µε κόκκινο χρώµα). Σηµειώνεται πως στην τρισδιάστατη PCA της εικόνας 3.15, δε φαίνεται το πρότυπο 2_28C_10d_C κι αυτό γιατί είναι κατά πολύ αποµακρυσµένο, ώστε να ξεφεύγει από τα όρια που καλύπτει η δεδοµένη εικόνα, ενώ στην PCA των δύο διαστάσεων αποτυπώνεται ακριβώς (εικόνα 3.16). Τα πρότυπα των 28 o C και 32 o C των 20 ηµερών (20d) οµαδοποιούνται στην κάτω πλευρά της PCA, στο κέντρο αυτής (υποδεικνύονται µε λευκό χρώµα). Ως οµάδα παρουσιάζει ευρεία διακύµανση, όµως τα πρότυπα των 28 o C και 32 o C δεν είναι δυνατό να ξεχωρίσουν και στο εξής θεωρούνται ως µια µαθηµατικά ενιαία οµάδα 9 δειγµάτων. 69

70 Εικόνα 3.15: Η PCA αποτυπώνει τα δείγµατα στο τρισδιάστατο χώρο. Με ανοιχτό κίτρινο χρώµα τα δείγµατα των 22 o C του 1 ου πειράµατος και µε έντονο κίτρινο τα 22 o C του 2 ου, ενώ µε κόκκινο τα δείγµατα των προτύπων των 10d και µε λευκό όλα υπόλοιπα πρότυπα των 28 o C και 32 o C (20d). Συµπεραίνεται ότι ο σαφής διαχωρισµός των προτύπων των 28 o C και 32 o C από αυτά των 22 o C και των δύο πειραµάτων υποδηλώνει τη σηµασία της θερµοκρασιακής αγωγής, καθώς η χαµηλή θερµοκρασία των 22 o C επάγει διαφορικό µεταγραφικό πρότυπο. Όσον αφορά στις τρεις πρώτες κύριες συνιστώσες, παρατηρείται πως η PC1 διαχωρίζει τα δείγµατα βάσει του οντογενετικού σταδίου (συγκρίνοντας τα πρότυπα των 28 o C των 10d µε αυτά των 22 o C των 20d) και βάσει της διάρκειας της θερµοκρασιακής αγωγής (συγκρίνοντας τα πρότυπα των 22 o C των δύο πειραµάτων). Η PC2 διαχωρίζει τα δείγµατα βάσει της θερµοκρασίας ανάπτυξης, µε τη θερµοκρασία των 22 o C να έχει δράσει καθοριστικά ώστε να διαφοροποιεί το πρότυπο έκφρασής τους από τα αντίστοιχα των 28 o C και 32 o C. 70

71 Α. Β. Γ. Εικόνα 3.16: PCA δυο διαστάσεων. Α: PC1vsPC2, B: PC2vsPC3, Γ: PC1vsPC3. Με κίτρινο υποδεικνύονται τα πρότυπα των 22 o C, µε κόκκινο των 10d και µε µαύρο των 28 o C και 32 o C. Τα ποσοστά για τις πρώτες κύριες συνιστώσες: PC1=21,2%, PC2=18,2% και PC3=15,1%. 71

72 Ανάλυση Σηµαντικότητας (SAM) Από την ιεραρχική οµαδοποίηση και την ανάλυση κύριων συνιστωσών προέκυψε ότι τα πρότυπα από µια κοινή πειραµατική συνθήκη οµαδοποιούνται και διαχωρίζονται από τα πρότυπα άλλων συνθηκών. Συγκεκριµένα, ο διαχωρισµός των µεταγραφικών προτύπων αντανακλάται στο επίπεδο της θερµοκρασιακής αγωγής που έλαβε χώρα, τη διάρκεια αυτής και το οντογενετικό στάδιο. Έτσι, βάσει των διακριτών οµαδοποιήσεων που παρατηρήθηκαν στην PCA, πραγµατοποιήθηκαν οι εξής συγκρίσεις: Σύγκριση προτύπων (20d): 28 o C vs 22 o C 1 ου πειράµατος Η SAM ανέδειξε 268 αρνητικώς στατιστικώς σηµαντικά γονίδια για το κατώφλιο εύρος d=0,621 και για ρυθµό ανίχνευσης ψευδών γονιδίων ίσο µε µηδέν (FRD median =0). Αυτά τα 268 στατιστικώς σηµαντικά γονίδια υποεκφράζονται στα πρότυπα των πληθυσµών που έχουν αναπτυχθεί στους 28 o C και υποδεικνύονται µε τις πράσινες κουκίδες (εκτός του εύρους d) στην εικόνα 3.17α. Σύγκριση προτύπων (20d): 28 o C vs 22 o C 2 ου πειράµατος Η SAM ανέδειξε 118 συνολικά στατιστικώς σηµαντικά γονίδια για το κατώφλιο εύρος d=0,459 και για FRD median =0. Από τα 118 στατιστικώς σηµαντικά γονίδια, τα 56 υποεκφράζονται (υποδεικνύονται µε τις πράσινες κουκίδες εκτός του εύρους d στην εικόνα 3.17β) και τα 62 υπερεκφράζονται (υποδεικνύονται µε τις κόκκινες κουκίδες εκτός του εύρους d στην εικόνα 3.17β) στα πρότυπα των πληθυσµών που έχουν αναπτυχθεί στους 28 o C. Σηµειώνεται πως οι παραπάνω συγκρίσεις πραγµατοποιήθηκαν ως προς τα πρότυπα των 22 o C έναντι των 28 o C, αν και τα δεύτερα δεν ξεχωρίζουν µαθηµατικά από τα 32 o C, αλλά που διατηρούν ένα διακριτό βιολογικό υπόβαθρο. Τα πρότυπα των 28 o C θεωρούνται ως τα πρότυπα αναφοράς, καθώς η θερµοκρασία των 28 o C αποτελεί το βέλτιστο για το είδος. Σύγκριση προτύπων (20d): 28 o C & 32 o C vs 22 o C 1 ου πειράµατος Η SAM ανέδειξε 512 αρνητικώς στατιστικώς σηµαντικά γονίδια για το κατώφλιο εύρος d=0,843 και για FRD median =0. Αυτά τα 512 στατιστικώς σηµαντικά γονίδια υποεκφράζονται στα πρότυπα των πληθυσµών που έχουν αναπτυχθεί στους 28 o C και 32 o C και υποδεικνύονται µε τις πράσινες κουκίδες (εκτός του εύρους d) στην εικόνα 3.17γ. 72

73 Σύγκριση προτύπων (20d): 28 o C & 32 o C vs 22 o C 2 ου πειράµατος Η SAM ανέδειξε 133 συνολικά στατιστικώς σηµαντικά γονίδια για το κατώφλιο εύρος d=0,582 και για FRD median =0. Από τα 133 στατιστικώς σηµαντικά γονίδια, τα 86 υποεκφράζονται (υποδεικνύονται µε τις πράσινες κουκίδες εκτός του εύρους d στην εικόνα 3.17δ) και τα 47 υπερεκφράζονται (υποδεικνύονται µε τις κόκκινες κουκίδες εκτός του εύρους d στην εικόνα 3.17δ) στα πρότυπα των πληθυσµών που έχουν αναπτυχθεί στους 28 o C και 32 o C. Σύγκριση προτύπων (20d): 22 o C 1 ου vs 22 o C 2 ου πειράµατος Η SAM ανέδειξε 36 αρνητικώς στατιστικώς σηµαντικά γονίδια για το κατώφλιο εύρος d=0,396 και για FRD median =0. Αυτά τα 36 στατιστικώς σηµαντικά γονίδια υποεκφράζονται στα πρότυπα των πληθυσµών των 22 o C του 2 ου πειράµατος (δηλαδή υπερεκφράζονται στα πρότυπα των 22 o C 1 ου πειράµατος) και υποδεικνύονται µε τις πράσινες κουκίδες (εκτός του εύρους d) στην εικόνα 3.17ε. Σύγκριση προτύπων: 10d_28 o C vs 22 o C 1 ου πειράµατος Η SAM ανέδειξε 59 αρνητικώς στατιστικώς σηµαντικά γονίδια για το κατώφλιο εύρος d=0,450 και για FRD median =0. Αυτά τα 59 στατιστικώς σηµαντικά γονίδια υποεκφράζονται στα πρότυπα των πληθυσµών των 28 o C ηλικίας 10 ηµερών (10d) και υποδεικνύονται µε τις πράσινες κουκίδες (εκτός του εύρους d) στην εικόνα 3.17στ. Σύγκριση προτύπων: 20d_28 o C vs 10d_28 o C Η SAM ανέδειξε 827 συνολικά στατιστικώς σηµαντικά γονίδια για το κατώφλιο εύρος d=0,571 και για FRD median =0. Από τα 827 στατιστικώς σηµαντικά γονίδια, τα 724 υποεκφράζονται (υποδεικνύονται µε τις πράσινες κουκίδες εκτός του εύρους d στην εικόνα 3.17ζ) και τα 90 υπερεκφράζονται (υποδεικνύονται µε τις κόκκινες κουκίδες εκτός του εύρους d στην εικόνα 3.17ζ) στα πρότυπα των πληθυσµών 28 o C ηλικίας 20 ηµερών (10d). Σηµείωση 1: Οι λίστες των στατιστικώς σηµαντικών γονιδίων που προέκυψαν από τις παραπάνω συγκρίσεις παρατίθενται στο Παράρτηµα σε ηλεκτρονική µορφή (σε cd). Σηµείωση 2: Η SAM πραγµατοποιήθηκε επί των προτύπων έκφρασης που προέκυψαν από το PMonly µοντέλο, κι αυτό γιατί από τα αποτελέσµατα της πολυπαραµετρικής στατιστικής ανάλυσης παρατηρήθηκε πως τα δύο µοντέλα (PM-only & PM-MM) συµφωνούν. 73

74 α. 28 o C vs 1_22 o C β. 28 o C vs 2_22 o C γ. 28 o C,32 o C vs 1_22 o C δ. 28 o C,32 o C vs 2_22 o C ε. 2_22 o C vs 1_22 o C στ. 10d_28 o C vs 1_22 o C ζ. 20d_28 ο C vs 10d_28 o C Εικόνα 3.17: Το αποτέλεσµα της SAM για τις επιµέρους συγκρίσεις. Με πράσινο υποδεικνύονται τα στατιστικώς σηµαντικά γονίδια που υποεκφράζονται και µε κόκκινο αυτά που υπερεκφράζονται. Οι συγκρίσεις πραγµατοποιήθηκαν για FDR median =0. Το κατώφλιο εύρος delta υποδεικνύεται σε κάθε γράφηµα. 74

75 Συµπερασµατικά, από την αξιολόγηση των αποτελεσµάτων της πολυπαραµετρικής στατιστικής ανάλυσης τόσο πριν όσο και µετά την κανονικοποίηση των 28, παρατηρείται µια συµφωνία ως προς το διαχωρισµό και την οµαδοποίηση των προτύπων έκφρασης βάσει της θερµοκρασιακής αγωγής και του οντογενετικού σταδίου. Ωστόσο, η κανονικοποίηση των 28 αξιοποιεί αρκετά µεγαλύτερο όγκο της βιολογικής πληροφορίας, αφού εξαλείφθηκε ο πειραµατικός παράγοντας που διαφοροποιούσε τα δείγµατα και πλέον τα δείγµατα διαφοροποιούνται µόνο βιολογικά. Ως εκ τούτου, η διαφοροποίηση των προτύπων έκφρασης έδωσε επιπλέον αποτελέσµατα, ως προς την επίδραση του σταδίου εφαρµογής και της διάρκειας της θερµοκρασιακής αγωγής αυτό πριν την κανονικοποίηση των 28 ήταν αδύνατο- και µε σαφώς µεγαλύτερο αριθµό στατιστικώς σηµαντικών γονιδίων. Συνεπώς, προκρίνεται η ανάλυση των προτύπων µετά την κανονικοποίηση των 28 ως περισσότερο εµπιστεύσιµη και ικανή να δώσει πιο ασφαλή βιολογικά συµπεράσµατα. 75

76 3.4. Αποτελέσµατα Ανάλυσης Γονιδιακής Οντολογίας Οι λίστες των στατιστικώς σηµαντικών γονιδίων που προέκυψαν από τις συγκρίσεις των µεταγραφικών προτύπων των διαφορετικών πληθυσµών µε τη SAM ανάλυση εξετάσθηκαν από το λογισµικό πακέτο DAVID. Ο αριθµός των στατιστικώς σηµαντικών γονιδίων διαφοροποιεί τα µεταγραφικά πρότυπα των δυο συγκρινόµενων οµάδων (που ορίζουµε κάθε φορά). Η ανάλυση στο DAVID έδειξε πως τα εξεταζόµενα γονίδια παρουσιάζουν έντονη µεταγραφική δραστηριότητα σε συγκεκριµένες ανατοµικές δοµές και επιτελούν συγκεκριµένες βιολογικές διεργασίες. Τα γονίδια που εµφανίζουν κοινή ιστοειδική έκφραση και που επιτελούν την ίδια βιολογική διεργασία οµαδοποιούνται µαζί. Η οµάδα που σχηµατίζουν χαρακτηρίζεται από µια τιµή εµπλουτισµού (Enrichment Score), η οποία ορίζει τη συχνότητα παρουσίας των γονιδίων στην υπό µελέτη λίστα σε σχέση µε τη συχνότητα των γονιδίων στο σύνολο του γονιδιώµατος του οργανισµού και κρίνεται ως στατιστικώς σηµαντική όταν η τιµή της είναι 1,3 (ωστόσο και µικρότερης τιµής Enrichment Score παρέχουν ασφαλή εικόνα για τη βιολογική δράση των γονιδίων στην υπό µελέτη λίστα). Η λειτουργική ανάλυση και ταξινόµηση των γονιδίων βάσει της ιστοειδικής έκφρασής τους και την ανάλυση Γενετικής Οντολογίας πραγµατοποιήθηκε για τις λίστες γονιδίων από τη SAM για κάθε πείραµα (πριν την Κανονικοποίηση των 28 ) και για όλες τις οµαδοποιήσεις και διαχωρισµούς των προτύπων που παρατηρήθηκαν µετά την Κανονικοποίηση των 28. Σηµειώνεται πως όλα τα αποτελέσµατα της λειτουργικής και γονιδιωµατικής ανάλυσης παρατίθενται στο παράρτηµα, ενώ παρακάτω παρουσιάζονται τα πιο σηµαντικά αποτελέσµατα για την εξαγωγή βιολογικών συµπερασµάτων Σύγκριση των προτύπων 28 o C & 32 o C µε τα 22 o C του 1 ου πειράµατος Η SAM έδειξε πως τα πρότυπα διαφοροποιούνται ως προς τη διαφορική έκφραση 166 γονιδίων, που παρουσιάζουν αυξηµένη έκφραση στα πρότυπα των πληθυσµών των 22 o C θερµοκρασίας ανάπτυξης. 76

77 Η ανάλυση στο DAVID ως προς τις ανατοµικές δοµές από την κύρια βάση δεδοµένων για το zebrafish ZFIN έδειξε πως ένας αριθµός των στατιστικώς σηµαντικών γονιδίων της λίστας εκφράζεται ειδικά στην περιοχή του µατιού (18 γονίδια, εικόνα 3.18), του θωρακικού πτερυγίου (11, εικόνα 3.19) και του εγκεφάλου (10, εικόνα 3.20). Εικόνα 3.18: Τα 18 γονίδια που εκφράζονται στην περιοχή του µατιού, υπερεκφράζονται στα πρότυπα των 22 o C (κόκκινο χρώµα) και υποεκφράζονται στα πρότυπα των 28 o C και 32 o C (πράσινο). Τιµή εµπλουτισµού: 1,62. Εικόνα 3.19: Τα 11 γονίδια που εκφράζονται στην περιοχή του θωρακικού πτερυγίου, υπερεκφράζονται στα πρότυπα των 22 o C (κόκκινο χρώµα) και υποεκφράζονται στα πρότυπα των 28 o C και 32 o C (πράσινο). Τιµή εµπλουτισµού: 0,67. 77

78 Εικόνα 3.20: Τα 10 γονίδια που εκφράζονται στην περιοχή του εγκεφάλου, υπερεκφράζονται στα πρότυπα των 22 o C (κόκκινο χρώµα) και υποεκφράζονται στα πρότυπα των 28 o C και 32 o C (πράσινο). Τιµή εµπλουτισµού: 0,50. Η GO ανάλυση στο DAVID ως προς τους όρους βιολογικών διεργασιών (BP, εικόνα 3.21) έδειξε πως ένας αριθµός των στατιστικώς σηµαντικών γονιδίων της λίστας εµπλέκονται στη διεργασία της πρωτεόλυσης (15), στη ρύθµιση του κυτταρικού κύκλου (9, όπου 5 ειδικά της µίτωσης), στην οργάνωση της χρωµατίνης (10) και στη ρύθµιση µεταβολικών διεργασιών No of genes proteolysis cell cycle chromosome organization Εικόνα 3.21: Τα στατιστικώς σηµαντικά γονίδια ανέδειξαν τις βιολογικές διεργασίες της πρωτεόλυσης, της ρύθµισης του κυτταρικού κύκλου και της οργάνωσης της χρωµατίνης να βρίσκονται σε ενεργότητα στα πρότυπα των 22 o C. Τέλος, η GO ανάλυση ως προς τους όρους των υποκυτταρικών δοµών (CC) έδειξε πως ένας αριθµός γονιδίων (17) αφορά στη δοµή του πρωτεασώµατος (κάτι που συµφωνεί µε την αυξηµένη πρωτεόλυση, όπως προέκυψε από την ανάλυση ως προς τα BP). Αντίθετα, ως προς την ανάλυση των όρων µοριακής λειτουργίας (MF) δε βρέθηκαν οµάδες που να διακρίνουν κάποια µοριακή λειτουργία ως ιδιαίτερα αυξηµένη. 78

79 Σύγκριση των προτύπων 28 o C & 32 o C µε τα 22 o C του 2 ου πειράµατος Η SAM έδειξε πως τα πρότυπα της σύγκρισης διαφοροποιούνται ως προς τη διαφορική έκφραση 33 γονιδίων, όπου 25 παρουσιάζουν αυξηµένη έκφραση στα πρότυπα των πληθυσµών των 22 o C θερµοκρασίας ανάπτυξης και 8 παρουσιάζουν αυξηµένη έκφραση στους 28 o C και 32 o C. Η ανάλυση στο DAVID ως προς τις ανατοµικές δοµές ZFIN έδειξε πως ένας αριθµός των στατιστικώς σηµαντικών γονιδίων, που υπερεκφράζονται στους 22 o C, εκφράζεται ειδικά στην περιοχή του µατιού (3 γονίδια), του θωρακικού πτερυγίου (3) και του εγκεφάλου (4). Η ίδια ανάλυση για τα γονίδια που υπερεκφράζονται στα πρότυπα των 28 o C και 32 o C έδειξε πως 3 γονίδια (από τα 8) εκφράζονται στην περιοχή των σωµιτών, στο µυοτόµιο. Σε αυτό το σηµείο, πρέπει να τονιστεί πως ο µικρός αριθµός γονιδίων της λίστας από αυτή τη σύγκριση οδήγησε σε οµαδοποιήσεις µικρού Enrichment score. Η GO ανάλυση ως προς τους όρους BP, CC και MF δεν οδήγησε στην ανάδειξη συγκεκριµένων λειτουργιών. Για το αποτέλεσµα αυτό, οφείλεται ο µικρός αριθµός των γονιδίων της λίστας Σύγκριση των προτύπων 22 o C του 1 ου πειράµατος µε όλα τα 28 o C (µετά την Κανονικοποίηση των 28 ) Η SAM έδειξε πως τα πρότυπα διαφοροποιούνται µεταξύ τους ως προς την έκφραση 268 γονιδίων, που παρουσιάζουν αυξηµένη έκφραση στα πρότυπα των πληθυσµών των 22 o C θερµοκρασίας ανάπτυξης. Η ανάλυση στο DAVID ως προς τις ανατοµικές δοµές ZFIN έδειξε πως ένας αριθµός των στατιστικώς σηµαντικών γονιδίων της λίστας εκφράζεται ειδικά στην περιοχή του µατιού (23 γονίδια, εικόνα 3.22) και ειδικά για τον αµφιβληστροειδή (24 γονίδια, εικόνα 3.23), του σκελετού των φαρυγγικών τόξων 3-7 (18, εικόνα 3.24), του κεντρικού νευρικού συστήµατος/εγκεφάλου (16, εικόνα 3.25) και της σπονδυλικής στήλης (11, εικόνα 3.26). 79

80 Εικόνα 3.22: Τα 23 γονίδια που εκφράζονται στην περιοχή του µατιού, υπερεκφράζονται στα πρότυπα των 22 o C (κόκκινο χρώµα) και υποεκφράζονται στα πρότυπα των 28 o C (πράσινο). Τιµή εµπλουτισµού: 0,95. Εικόνα 3.23: Τα 24 γονίδια που εκφράζονται στην περιοχή του αµφιβληστροειδή στο µάτι, υπερεκφράζονται στα πρότυπα των 22 o C (κόκκινο χρώµα) και υποεκφράζονται στα πρότυπα των 28 o C (πράσινο). Τιµή εµπλουτισµού: 0,95. 80

81 Εικόνα 3.24: Τα 18 γονίδια που εκφράζονται στην περιοχή του σκελετού των φαρυγγικών τόξων 3-7, υπερεκφράζονται στα πρότυπα των 22 o C (κόκκινο χρώµα) και υποεκφράζονται στα πρότυπα των 28 o C (πράσινο). Τιµή εµπλουτισµού: 0,37. Εικόνα 3.25: Τα 16 γονίδια που εκφράζονται στο κεντρικό νευρικό σύστηµα/εγκέφαλο, υπερεκφράζονται στα πρότυπα των 22 o C (κόκκινο χρώµα) και υποεκφράζονται στα πρότυπα των 28 o C (πράσινο). Τιµή εµπλουτισµού: 0,37. 81

82 Εικόνα 3.26: Τα 11 γονίδια που εκφράζονται στην περιοχή της σπονδυλικής στήλης, υπερεκφράζονται στα πρότυπα των 22 o C (κόκκινο χρώµα) και υποεκφράζονται στα πρότυπα των 28 o C (πράσινο). Τιµή εµπλουτισµού: 0,06. Στη συνέχεια, η GO ανάλυση ως προς τους όρους ΒΡ (εικόνα 3.27) έδειξε πως ένας αριθµός των στατιστικώς σηµαντικών γονιδίων της λίστας εµπλέκονται στη διεργασία της πρωτεόλυσης (23) και στη καταβολική διαδικασία των µακροµορίων (17). Επίσης, παρατηρήθηκαν (µε µικρότερη τιµή εµπλουτισµού) γονίδια του κυτταρικού κύκλου (που εµπλέκονται ειδικά στη Μ φάση της µίτωσης, 4 γονίδια) και γονίδια που ρυθµίζουν µεταβολικές διεργασίες είτε θετικά (3) είτε αρνητικά (3) No of genes Macromolecule catabolic process Proteolysis Εικόνα 3.27: Τα στατιστικώς σηµαντικά γονίδια ανέδειξαν τις βιολογικές διεργασίες της πρωτεόλυσης και του καταβολισµού των µακροµορίων να βρίσκονται σε ενεργότητα στα πρότυπα των 22 o C. Τέλος, ως προς τους CC όρους παρατηρήθηκε ένας αριθµός γονιδίων (17), που αφορά στη δοµή του πρωτεασώµατος (κάτι που συµφωνεί µε την αυξηµένη πρωτεόλυση, όπως προέκυψε από την ανάλυση ως προς τα BP). Αντίθετα, ως προς όρους (MF) δε βρέθηκαν οµάδες που να διακρίνουν κάποια µοριακή λειτουργία ιδιαιτέρως αυξηµένη. 82

83 Σύγκριση των προτύπων 22 o C του 2 ου πειράµατος µε όλα τα 28 o C (µετά την Κανονικοποίηση των 28 ) Η SAM έδειξε πως τα πρότυπα της σύγκρισης διαφοροποιούνται ως προς την έκφραση 118 γονιδίων, όπου 56 παρουσιάζουν αυξηµένη έκφραση στα πρότυπα των πληθυσµών των 22 o C θερµοκρασίας ανάπτυξης και 62 παρουσιάζουν αυξηµένη έκφραση στους 28 o C. Η ανάλυση στο DAVID ως προς τις ανατοµικές δοµές ZFIN έδειξε πως ένας αριθµός των στατιστικώς σηµαντικών γονιδίων, που υπερεκφράζονται στους 22 o C, εκφράζεται ειδικά στην περιοχή του εγκεφάλου και της σπονδυλικής στήλης (4 γονίδια, εικόνα 3.28) και του θωρακικού πτερυγίου (3, εικόνα 3.29).Ως προς τους ΒΡ όρους παρατηρήθηκε ότι 6 γονίδια εµπλέκονται στην ενδοκυτταρική µεταγωγή σήµατος, ενώ ως προς τους CC και MF όρους δεν ξεχωρίζει κάποια συγκεκριµένη πληροφορία βιολογικής σηµασίας. Εικόνα 3.28: Τα 4 γονίδια που εκφράζονται στην περιοχή του εγκεφάλου και της σπονδυλικής στήλης, υπερεκφράζονται στα πρότυπα των 22 o C (κόκκινο χρώµα) και υποεκφράζονται στα πρότυπα των 28 o C (πράσινο). Τιµή εµπλουτισµού: 0,51. Εικόνα 3.29: Τα 3 γονίδια που εκφράζονται στην περιοχή του θωρακικού πτερυγίου, υπερεκφράζονται στα πρότυπα των 22 o C (κόκκινο χρώµα) και υποεκφράζονται στα πρότυπα των 28 o C (πράσινο). Τιµή εµπλουτισµού: 0,28. 83

84 Η ανάλυση ως προς τις ZFIN δοµές στα γονίδια που υπερεκφράζονται στα πρότυπα των 28 o C έδειξε πως 6 γονίδια εκφράζονται στην επιδερµίδα (εικόνα 3.30) και 3 γονίδια εκφράζονται στο µυοσκελετικό ιστό των θωρακικών πτερυγίων (εικόνα 3.31). Εικόνα 3.30: Τα 6 γονίδια που εκφράζονται στην επιδερµίδα, υποεκφράζονται στα πρότυπα των 22 o C (πράσινο χρώµα) και υπερεκφράζονται στα πρότυπα των 28 o C (κόκκινο). Τιµή εµπλουτισµού: 1,55. Εικόνα 3.31: Τα 4 γονίδια που εκφράζονται στο µυοσκελετικό ιστό των θωρακικών πτερυγίων, υποεκφράζονται στα πρότυπα των 22 o C (πράσινο χρώµα) και υπερεκφράζονται στα πρότυπα των 28 o C (κόκκινο). Τιµή εµπλουτισµού: 1,43. Ως προς τους ΒΡ όρους παρατηρήθηκε ότι 5 γονίδια εµπλέκονται σε µεταβολικές διεργασίες των πρωτεϊνών και ως προς τους CC όρους εντοπίστηκαν γονίδια που δρουν στη δοµή του µιτοχονδρίου. Τέλος, ως προς τους όρους MF δε διακρίνεται κάποια συγκεκριµένη πληροφορία βιολογικής σηµασίας. 84

85 Σύγκριση των προτύπων 22 o C του 1 ου πειράµατος µε όλα τα 28 o C και 32 o C (µετά την Κανονικοποίηση των 28 ) Η SAM έδειξε πως τα πρότυπα διαφοροποιούνται µεταξύ τους ως προς την έκφραση 512 γονιδίων, που παρουσιάζουν αυξηµένη έκφραση στα πρότυπα των πληθυσµών των 22 o C θερµοκρασίας ανάπτυξης. Η ανάλυση στο DAVID ως προς τις ανατοµικές δοµές ZFIN έδειξε πως ένας αριθµός των στατιστικώς σηµαντικών γονιδίων της λίστας εκφράζεται ειδικά στην περιοχή του µατιού (37 γονίδια, εικόνα 3.32) και επιπλέον γονίδια ειδικά για τη δοµή του ανώριµου µατιού (21, εικόνα 3.33). Βρέθηκαν ακόµη 5 γονίδια που εκφράζονται στην περιοχή του σπλαχνοκράνιου και στο χόνδρινο ιστό των θωρακικών πτερυγίων (εικόνα 3.34). Εικόνα 3.32: Τα 37 γονίδια που εκφράζονται στην περιοχή του µατιού, υπερεκφράζονται στα πρότυπα των 22 o C (κόκκινο χρώµα) και υποεκφράζονται στα πρότυπα των 28 o C και 32 o C (πράσινο). Τιµή εµπλουτισµού: 2,81. 85

86 Εικόνα 3.33: Τα 21 γονίδια που εκφράζονται ειδικά στη δοµή του ανώριµου µατιού (immature eye), υπερεκφράζονται στα πρότυπα των 22 o C (κόκκινο χρώµα) και υποεκφράζονται στα πρότυπα των 28 o C και 32 o C (πράσινο). Τιµή εµπλουτισµού: 2,81. Εικόνα 3.34: Τα 5 γονίδια που εκφράζονται στην περιοχή του σπλαχνοκράνιου και αφορούν στους χόνδρινους ιστούς των θωρακικών πτερυγίων, υπερεκφράζονται στα πρότυπα των 22 o C (κόκκινο χρώµα) και υποεκφράζονται στα πρότυπα των 28 o C και 32 o C (πράσινο). Τιµή εµπλουτισµού: 1,01. Στη συνέχεια, η GO ανάλυση ως προς τους όρους ΒΡ (εικόνα 3.35) έδειξε πως ένας αριθµός των στατιστικώς σηµαντικών γονιδίων της λίστας εµπλέκονται στη διεργασία της πρωτεόλυσης (32) και στην ανάπτυξη του µατιού (10). Επίσης, γονίδια που αφορούν σε καταβολικές διαδικασίες (5) και στη ρύθµιση αυτών (3). Άλλα γονίδια εµπλέκονται σε µεταβολικές διεργασίες του DNA (23), στην οργάνωση των χρωµοσωµάτων και στην διεργασία του RNA. Τέλος, βρέθηκαν τα γονίδια που σχετίζονται µε τον κυτταρικό κύκλο (12), την επεξεργασία πρωτεϊνών και τη µεταφορά αυτών στα µιτοχόνδρια (4) και τη ρύθµιση του προγραµµατισµένου κυτταρικού θανάτου (5). 86

87 Proteolysis Camera-type eye development Catabolic process Regulation of catabolic process DNA metabolic process Chromosome organization No of genes RNA processing Cell cycle Protein localization in mitochondrion Protein folding Εικόνα 3.35: Τα στατιστικώς σηµαντικά γονίδια, που υπερεκφράζονται στα πρότυπα των 22 o C, ανέδειξαν τις βιολογικές διεργασίες που περιγράφονται στο ραβδόγραµµα. Τέλος, η ανάλυση ως προς τους CC όρους αναδείχθηκαν δοµές που αφορούν κυρίως στο πρωτεάσωµα, αλλά και πλήθος ενδοκυτταρικών δοµών πχ. στο πυρήνα και τα µιτοχόνδρια. Ενώ ως προς τους MF παρατηρήθηκε αυξηµένη ενεργότητα που αφορά στη σύνδεση νουκλεοτιδίων, οξειδοαναγωγικών µορίων (NAD/NADH) και έντονη δράση κινασών Σύγκριση των προτύπων 22 o C του 2 ου πειράµατος µε όλα τα 28 o C και 32 o C (µετά την Κανονικοποίηση των 28 ) Η SAM έδειξε πως τα πρότυπα της σύγκρισης διαφοροποιούνται ως προς την έκφραση 133 γονιδίων, όπου 86 παρουσιάζουν αυξηµένη έκφραση στα πρότυπα των πληθυσµών των 22 o C θερµοκρασίας ανάπτυξης και 47 παρουσιάζουν αυξηµένη έκφραση στους 28 o C και 32 o C. Η ανάλυση στο DAVID ως προς τις ανατοµικές δοµές ZFIN έδειξε πως ένας αριθµός των στατιστικώς σηµαντικών γονιδίων, που υπερεκφράζονται στους 22 o C, εκφράζεται ειδικά στην περιοχή της κεφαλής (6) και σε εγκεφαλικές περιοχές (4 από τα 6). 87

88 Εικόνα 3.36: Τα 6 γονίδια εκφράζονται στην περιοχή της κεφαλής, υπερεκφράζονται στα πρότυπα των 22 o C (κόκκινο χρώµα) και υποεκφράζονται στα πρότυπα των 28 o C και 32 o C (πράσινο). Τιµή εµπλουτισµού: 1,05. Ως προς τους ΒΡ όρους (εικόνα 3.37) παρατηρήθηκε ότι τα γονίδια αφορούν στην κυτταρική (3) και εµβρυική µορφογένεση (4, ανάπτυξη ιστών και οργάνων) και στη διαδικασία της γαστριδίωσης (3). Επιπλέον, αναδείχθηκαν διεργασίες της µεταγραφής και ρύθµισης µεταβολικών διαδικασιών. Ενώ ως προς τους CC και MF όρους δεν ξεχωρίζει κάποια συγκεκριµένη πληροφορία βιολογικής σηµασίας. 5 4 No of genes cell part morphogenesis embryonic morphogenesis gastrulation Εικόνα 3.37: Τα στατιστικώς σηµαντικά γονίδια, που υπερεκφράζονται στα πρότυπα των 22 o C, ανέδειξαν βιολογικές διεργασίες που αφορούν στη γαστριδίωση, την κυτταρική και εµβρυική µορφογένεση. Η ανάλυση ως προς τις ZFIN δοµές στα γονίδια που υπερεκφράζονται στα πρότυπα των 28 o C και 32 o C έδειξε πως 7 γονίδια σχετίζονται µε την ανάπτυξη του σκελετικού ιστού των φαρυγγικών τόξων 3-7 και του µυοσκελετικού ιστού των θωρακικών πτερυγίων (4 από τα 7, εικόνα 3.38). 88

89 Εικόνα 3.38: Τα 4 γονίδια που εκφράζονται στο σκελετικό ιστό των φαρυγγικών τόξων 3-7 και στο µυοσκελετικό ιστό των θωρακικών πτερυγίων, υποεκφράζονται στα πρότυπα των 22 o C (πράσινο χρώµα) και υπερεκφράζονται στα πρότυπα των 28 o C (κόκκινο). Τιµή εµπλουτισµού: 1,27. Ως προς τους ΒΡ όρους αναδείχθηκαν οι βιολογικές διεργασίες της ανάπτυξης ιστών και οργάνων (2), µεταβολικές διεργασίες των πρωτεϊνών και του DNA. Τέλος, ως προς τους όρους CC και MF δε διακρίνεται κάποια συγκεκριµένη πληροφορία βιολογικής σηµασίας Σύγκριση των προτύπων 22 o C του 1 ου πειράµατος µε τα πρότυπα των22 o C του 2 ου πειράµατος (µετά την Κανονικοποίηση των 28 ) Η SAM έδειξε πως τα πρότυπα διαφοροποιούνται µεταξύ τους ως προς την έκφραση 36 γονιδίων, που παρουσιάζουν αυξηµένη έκφραση στα πρότυπα των πληθυσµών των 22 o C του 1 ου πειράµατος. Η ανάλυση στο DAVID ως προς τις ανατοµικές δοµές ZFIN έδειξε πως ένας αριθµός των στατιστικώς σηµαντικών γονιδίων της λίστας εκφράζεται ειδικά στην περιοχή του ανώριµου µατιού (7, εικόνα 3.39). Βρέθηκαν ακόµη 4 γονίδια που εκφράζονται στην περιοχή του ήπατος (εικόνα 3.40). Όσον αφορά στους όρους ΒΡ αναδείχθηκαν κυρίως µεταβολικές διεργασίες των αµινοξέων, στους MF όρους παρατηρήθηκε αυξηµένη ενεργότητα κινασών και στη σύνδεση νουκλεοτιδίων, ενώ για τους CC όρους δε διακρίνεται κάποια συγκεκριµένη πληροφορία βιολογικής σηµασίας. 89

90 Εικόνα 3.39: Τα 7 γονίδια εκφράζονται στο αναπτυσσόµενο µάτι, υπερεκφράζονται στα πρότυπα των 22 o C του 1 ου πειράµατος (κόκκινο χρώµα) και υποεκφράζονται στα πρότυπα των 22 o C του 2 ου πειράµατος (πράσινο). Τιµή εµπλουτισµού: 0,77. Εικόνα 3.40: Τα 4 γονίδια εκφράζονται στο ήπαρ, υπερεκφράζονται στα πρότυπα των 22 o C του 1 ου πειράµατος (κόκκινο χρώµα) και υποεκφράζονται στα πρότυπα των 22 o C του 2 ου πειράµατος (πράσινο). Τιµή εµπλουτισµού: 0, Σύγκριση των προτύπων 22 o C του 1 ου πειράµατος µε τα πρότυπα των10d_28 o C (µετά την Κανονικοποίηση των 28 ) Η SAM έδειξε πως τα πρότυπα διαφοροποιούνται µεταξύ τους ως προς την έκφραση 59 γονιδίων, που παρουσιάζουν αυξηµένη έκφραση στα πρότυπα των πληθυσµών των 22 o C του 1 ου πειράµατος. Η ανάλυση στο DAVID ως προς τις ανατοµικές δοµές ZFIN έδειξε πως ένας αριθµός των στατιστικώς σηµαντικών γονιδίων της λίστας εκφράζεται στο polster πρόδροµη δοµή του αδένα εκκόλαψης (10, εικόνα 3.41), στο ωτικό κυστίδιο (8, εικόνα 3.42) και στον αµφιβληστροειδή χιτώνα (6, εικόνα 3.43). Ενώ από τη GO ανάλυση αναδείχθηκε µόνο η µεταβολική διεργασία πρωτεϊνών ως προς τους BP όρους. 90

91 Εικόνα 3.41: Τα 10 γονίδια εκφράζονται στο polster, υπερεκφράζονται στα πρότυπα των 22 o C του 1 ου πειράµατος (κόκκινο χρώµα) και υποεκφράζονται στα πρότυπα των 28 o C ηλικίας 10d (πράσινο). Τιµή εµπλουτισµού: 3,58. Εικόνα 3.42: Τα 8 γονίδια εκφράζονται στο ωτικό κυστίδιο, υπερεκφράζονται στα πρότυπα των 22 o C του 1 ου πειράµατος (κόκκινο χρώµα) και υποεκφράζονται στα πρότυπα των 28 o C ηλικίας 10d (πράσινο). Τιµή εµπλουτισµού: 1,88. Εικόνα 3.43: Τα 6 γονίδια εκφράζονται στον αµφιβληστροειδή, υπερεκφράζονται στα πρότυπα των 22 o C του 1 ου πειράµατος (κόκκινο χρώµα) και υποεκφράζονται στα πρότυπα των 28 o C ηλικίας 10d (πράσινο). Τιµή εµπλουτισµού: 1,88. 91

92 Αναπτυξιακή σύγκριση των προτύπων 10d_28 o C µε τα πρότυπα των 20d_28 o C (µετά την Κανονικοποίηση των 28 ) Η SAM έδειξε πως τα πρότυπα της σύγκρισης διαφοροποιούνται ως προς την έκφραση 827 γονιδίων, όπου 724 παρουσιάζουν αυξηµένη έκφραση στα πρότυπα των πληθυσµών των 28 o C ηλικίας 10d και 90 αυξηµένη έκφραση στους 28 o C ηλικίας 20d. Η ανάλυση στο DAVID ως προς τις ανατοµικές δοµές ZFIN έδειξε πως ένας αριθµός των στατιστικώς σηµαντικών γονιδίων, που υπερεκφράζονται στους 28 o C των 10 ηµερών (10d), αφορά στο πάγκρεας (9, εικόνα 3.44) και την καρδιά (8, εικόνα 3.45), αλλά κυρίως στο νευρικό σύστηµα και τις εγκεφαλικές περιοχές (131 γονίδια, εικόνα 3.46). Η ανάλυση έδειξε, επίσης, έκφραση στην επιβλάστη (11, εικόνα 3.47) και τη σπονδυλική στήλη (14, εικόνα 3.48). Εικόνα 3.44: Τα 9 γονίδια εκφράζονται στο πάγκρεας, υπερεκφράζονται στα πρότυπα των 28 o C των 10d (κόκκινο χρώµα) και υποεκφράζονται στα πρότυπα των 28 o C ηλικίας 20d (πράσινο). Τιµή εµπλουτισµού: 1,27. Εικόνα 3.45: Τα 8 γονίδια εκφράζονται στην καρδιά, υπερεκφράζονται στα πρότυπα των 28 o C των 10d (κόκκινο χρώµα) και υποεκφράζονται στα πρότυπα των 28 o C ηλικίας 20d (πράσινο). Τιµή εµπλουτισµού: 1,34. 92

93 (συνέχεια) Εικόνα 3.46: Τα 131 γονίδια εκφράζονται στο κεντρικό νευρικό σύστηµα, υπερεκφράζονται στα πρότυπα των 28 o C των 10d (κόκκινο χρώµα) και υποεκφράζονται στα πρότυπα των 28 o C ηλικίας 20d (πράσινο). Τιµή εµπλουτισµού: 21,68. 93

94 Εικόνα 3.47: Τα 11 γονίδια εκφράζονται στην επιβλάστη, υπερεκφράζονται στα πρότυπα των 28 o C των 10d (κόκκινο χρώµα) και υποεκφράζονται στα πρότυπα των 28 o C ηλικίας 20d (πράσινο). Τιµή εµπλουτισµού: 3,51. Εικόνα 3.48: Τα 14 γονίδια εκφράζονται στην περιοχή της σπονδυλικής στήλης, υπερεκφράζονται στα πρότυπα των 28 o C των 10d (κόκκινο χρώµα) και υποεκφράζονται στα πρότυπα των 28 o C ηλικίας 20d (πράσινο). Τιµή εµπλουτισµού: 1,56. Ως προς τους ΒΡ όρους παρατηρήθηκε ότι τα γονίδια εµπλέκονται σε διεργασίες όπως η ανάπτυξη του νευρικού συστήµατος, η ρύθµιση µεταβολικών διαδικασιών, η εµβρυική ανάπτυξη και µορφογένεση οργάνων (πχ. µάτι και άλλα όργανα αίσθησης). Οι κύριες βιολογικές διεργασίες για τα γονίδια από αυτή τη σύγκριση παρουσιάζονται στο ραβδόγραµµα της εικόνας Ενώ ως προς τους CC και MF όρους αναδείχτηκε η ενεργότητα των πρωτεϊνικών ιοντοαντλιών (CC) και η δράση ATPασών (MF). 94

95 Regulation of transcription Eye development Sensory organ development Neurological system process ATP metabolic process Regulation of RNA metabolic process Purine nucleotide metabolic process No of genes Cell fate specification Εικόνα 3.49: Τα στατιστικώς σηµαντικά γονίδια, που υπερεκφράζονται στα πρότυπα των 28 o C των 10d, ανέδειξαν βιολογικές διεργασίες που αφορούν στη ρύθµιση της µεταγραφής, την ανάπτυξη του µατιού και άλλων αισθητήριων οργάνων, την ανάπτυξη του νευρικού συστήµατος, τη µεταβολική διαδικασία του ΑΤΡ, τη ρύθµιση της µεταβολικής διαδικασίας του RNA και των πουρινών και τον καθορισµό της κυτταρικής µοίρας. Ακολούθως, η ανάλυση ως προς τις ZFIN δοµές στα γονίδια που υπερεκφράζονται στα πρότυπα των 28 o C των 20 ηµερών (ηλικίας 20d) ανέδειξε δοµές που αφορούν κυρίως στο µυϊκό σύστηµα (8, εικόνα 3.50). Συγκεκριµένα, τα γονίδια εκφράζονται στο µυϊκό σύστηµα του κορµού (8, εικόνα 3.51) και της κεφαλής (5, εικόνα 3.52). Ακόµη 6 γονίδια εκφράζονται στον αρχέγονο καρδιακό σωλήνα (εικόνα 3.53). Σε µικρότερο βαθµό, σηµαντικό ωστόσο, παρατηρείται έκφραση στα βράγχια και στις γονάδες. Εικόνα 3.50: Τα 8 γονίδια αφορούν στο µυϊκό σύστηµα, υπερεκφράζονται στα πρότυπα των 28 o C των 20d (κόκκινο χρώµα) και υποεκφράζονται στα πρότυπα των 28 o C ηλικίας 10d (πράσινο). Τιµή εµπλουτισµού: 2,67. 95

96 Εικόνα 3.51: Τα 8 γονίδια αφορούν στο µυϊκό σύστηµα του κορµού, υπερεκφράζονται στα πρότυπα των 28 o C των 20d (κόκκινο χρώµα) και υποεκφράζονται στα πρότυπα των 28 o C ηλικίας 10d (πράσινο). Τιµή εµπλουτισµού: 2,67. Εικόνα 3.52: Τα 5 γονίδια αφορούν στο µυϊκό σύστηµα της κεφαλής, υπερεκφράζονται στα πρότυπα των 28 o C των 20d (κόκκινο χρώµα) και υποεκφράζονται στα πρότυπα των 28 o C ηλικίας 10d (πράσινο). Τιµή εµπλουτισµού: 1,74. Εικόνα 3.53: Τα 6 γονίδια αφορούν στον αρχέγονο καρδιακό σωλήνα, υπερεκφράζονται στα πρότυπα των 28 o C των 20d (κόκκινο χρώµα) και υποεκφράζονται στα πρότυπα των 28 o C ηλικίας 10d (πράσινο). Τιµή εµπλουτισµού: 2,67. 96

97 Ως προς τους ΒΡ όρους παρατηρήθηκε ότι τα γονίδια εµπλέκονται σε διεργασίες όπως η ρύθµιση της οξείδωσης, η µεταβολική διεργασία των υδατανθράκων, των πρωτεϊνών και των νουκλεοτιδίων, η ενεργοποίηση των αιµοπεταλίων και η απόκριση σε τραυµατισµούς (εικόνα 3.54).Ενώ ως προς τους CC και MF όρους αναδείχτηκε κυρίως η δράση κινασών (MF) No of genes oxidation reduction carbohydrate catabolic process platelet activation response to wounding Εικόνα 3.54: Τα στατιστικώς σηµαντικά γονίδια, που υπερεκφράζονται στα πρότυπα των 28 o C των 20d, ανέδειξαν βιολογικές διεργασίες που αφορούν στη ρύθµιση της οξείδωσης, τη καταβολική διεργασία των υδατανθράκων, την ενεργοποίηση των αιµοπεταλίων και την απόκριση σε τραυµατισµούς (πχ επούλωση πληγών). Συµπερασµατικά, οι συγκρίσεις των προτύπων έκφρασης και η λειτουργική γονιδιωµατική ανάλυση των στατιστικώς σηµαντικών γονιδίων που τα διαφοροποιούν ανέδειξε τις δοµές και τις βιολογικές διεργασίες που δέχονται την επίδραση είτε της θερµοκρασίας αγωγής (θερµοκρασία & διάρκεια αυτής) είτε του οντογενετικού σταδίου. Η επίδραση παρατηρήθηκε να είναι έντονη στην έκφραση γονιδίων που σχετίζονται µε την ανάπτυξη συγκεκριµένων δοµών (πχ µάτι, Κ.Ν.Σ.), χαρακτηριστικών ενδεχοµένως του οντογενετικού σταδίου όπου βρίσκονται τα άτοµα. 97

98 4. ΣΥΖΗΤΗΣΗ Στην παρούσα ερευνητική εργασία µελετήθηκε η επίδραση που µπορεί να έχει η θερµοκρασία ανάπτυξης στο ολικό µεταγράφωµα των νυµφών zebrafish. Η υψηλής απόδοση τεχνολογία των µικροσυστοιχιών και η ακριβής βιοπληροφορική ανάλυση, επέτρεψε την µελέτη των µεταγραφικών προτύπων των πληθυσµών που αναπτύχθηκαν στις τρεις διαφορετικές θερµοκρασίες ανάπτυξης στα δύο πειράµατα διαφορετικής διάρκειας της θερµοκρασιακής αγωγής. Η ανάλυση των αποτελεσµάτων στην παρούσα εργασία κατέδειξε την επίδραση της θερµοκρασίας ανάπτυξης στο µεταγραφικό πρότυπο των υπό σύγκριση πληθυσµών και της διάρκειας της θερµοκρασιακής αγωγής στο µεταγραφικό πρότυπο των πληθυσµών των δύο πειραµάτων. Τέλος, διαπιστώθηκαν οι διαφορές των δυο οντογενετικών σταδίων σε µεταγραφικό επίπεδο. Στη διεθνή βιβλιογραφία υπάρχουν πολλές αναφορές για τη σηµασία της θερµοκρασίας ανάπτυξης και την επίδραση που έχει σε διαφόρους µορφολογικούς και φυσιολογικούς χαρακτήρες (Koumoundouros et al. 2002a, 2009, Georgakopoulou et al. 2007, Johnston 2006, Johnston et al. 2009, Georga & Koumoundouros 2010). Ωστόσο, η παρούσα εργασία αποτελεί µια καινοτόµο προσπάθεια σε µοριακό επίπεδο, που συσχετίζει τη θερµοκρασία ανάπτυξης µε τις αλλαγές που αποτυπώνονται στο µεταγραφικό πρότυπο. Μέσα από τη συζήτηση που ακολουθεί, προσδιορίζεται η επίδραση της θερµοκρασίας ανάπτυξης στο πρότυπο έκφρασης γονιδίων, που εκφράζονται σε συγκεκριµένες ανατοµικές δοµές και που επιτελούν συγκεκριµένες βιολογικές διεργασίες. Θεωρούµε πως τα στατιστικώς σηµαντικά γονίδια που αναδείχθηκαν από τις θερµοκρασιακές συγκρίσεις των προτύπων παρουσιάζουν θερµοεξαρτώµενη έκφραση και υποθέτουµε ότι συµβάλλουν στο µηχανισµό της θερµοκρασιακής πλαστικότητας του φαινοτύπου του zebrafish. 98

99 4.1. Επίδραση της θερµοκρασίας ανάπτυξης στο µεταγραφικό πρότυπο Σύγκριση των προτύπων πριν την κανονικοποίηση των 28 Η στατιστική ανάλυση των προτύπων των δύο πειραµάτων, όπως οπτικοποιούνται στην PCA (εικόνα 3.4), αποτυπώνει τις διαφορές των µεταγραφικών προτύπων ως αποτέλεσµα της επίδρασης της θερµοκρασίας ανάπτυξης. Βέβαια, από τη σύγκριση των 20 µεταγραφικών προτύπων παρατηρήθηκαν πως 3 από αυτά ήταν αρκετά αποµακρυσµένα από τα όµοιά τους και αύξαναν τη συνολική διακύµανση. Πρόκειται για τα δείγµατα, 2_28C_10d_A, 2_32C_20d_C και 1_32C_20d_A, τα οποία στη συνέχεια εξαιρέθηκαν από τη µετέπειτα ανάλυση. Η απόκλιση αυτών των προτύπων από τα υπόλοιπα θα µπορούσε να αποδοθεί σε πειραµατικά σφάλµατα. Ειδικά για το 1_32C_20d_A, που προέρχεται από πληθυσµό του 1 ου πειράµατος, για το οποίο πραγµατοποιήθηκε εκτίµηση του ολικού µήκους σώµατος (πληθυσµός 32Α του πίνακα 3.1), δεν παρατηρείται µεγάλη διαφορά έναντι των άλλων πληθυσµών στους 32 o C, όµως αυτό µπορεί να οφείλεται στο ότι το δείγµα εκτίµησης του µήκους ήταν µικρό στον εν λόγω πληθυσµό. Είναι πιθανό, επίσης να έδρασε κάποιος -πειραµατικός ίσως- παράγοντας στις συνθήκες διατήρησης του πληθυσµού 32Α που να τον επηρέασε, και που να δικαιολογεί το µικρό αριθµό του πληθυσµού και να αντανακλάται στο µεταγραφικό επίπεδο. Μετά την αφαίρεση των 3 αποκλινόντων προτύπων, στην PCA των 17 µεταγραφικών προτύπων (πριν την κανονικοποίηση των 28, εικόνα 3.8), είναι πλέον ξεκάθαρος ο διαχωρισµός των δειγµάτων λόγω της θερµοκρασίας ανάπτυξης. Παρατηρείται, τόσο στο 1 ο όσο και στο 2 ο πείραµα, ότι τα πρότυπα των πληθυσµών 22 o C διαχωρίζονται από τα αντίστοιχα των 28 o C και 32 o C (ο διαχωρισµός των προτύπων βάσει θερµοκρασίας ανάπτυξης λαµβάνει χώρα ως προς τη δεύτερη κύρια συνιστώσα, PC2). Τα πρότυπα των 28 o C και 32 o C θεωρήθηκαν πια ως µια οµάδα, στο 1 ο πείραµα πιο συµπαγής και στο 2 ο πιο διευρυµένη, και συγκρίθηκαν µε τα πρότυπα των 22 o C. Από τη σύγκριση αυτών µε τη SAM ανάλυση, αναδείχθηκαν 166 και 33 στατιστικώς σηµαντικά γονίδια, που διαφοροποιούν τις δυο συγκρινόµενες οµάδες για κάθε πείραµα αντίστοιχα. Ο µικρός αριθµός των στατιστικώς σηµαντικών γονιδίων από το 2 ο πείραµα οφείλεται στη 99

100 µεγαλύτερη διακύµανση των δειγµάτων (σε σχέση µε τα δείγµατα του 1 ου πειράµατος που βρίσκονται πιο κοντά). Ωστόσο, µια ακόµη υπόθεση αφορά στη διάρκεια της θερµοκρασιακής αγωγής του 2 ου πειράµατος (ίση µε 280 o d, δηλαδή το µισό διάστηµα από ό,τι στο 1 ο πείραµα), που µπορεί να µην προκάλεσε τόσο µεγάλες διαφοροποιήσεις στους πληθυσµούς των 22 o C έναντι των 28 o C και 32 o C. Αντίθετα, στο 1 ο πείραµα µε τη διπλάσια σε διάρκεια θερµοκρασιακή αγωγή, ίσως η θερµοκρασία ανάπτυξης να δρα και να διαφοροποιεί πιο έντονα τα πρότυπα των 22 o C έναντι των 28 o C και 32 o C. Όµως το πλέον σηµαντικό που εξάγεται από τη λειτουργική γονιδιωµατική ανάλυση των παραπάνω συγκρίσεων, είναι ότι τα γονίδια που αναδείχθηκαν αφορούν σε κοινές περιοχές έκφρασης. Συγκεκριµένα, από τη σύγκριση των προτύπων των 22 o C έναντι των 28 o C και 32 o C (και στα 2 πειράµατα), παρατηρείται υπερέκφραση γονιδίων στα πρότυπα των 22 o C, και η έκφραση αυτών εντοπίζεται κυρίως στην περιοχή του µατιού, του θωρακικού πτερυγίου και του εγκεφάλου. Ειδικά για την περίπτωση της αυξηµένης µεταγραφικής δραστηριότητας στον εγκέφαλο, υπάρχει αντίστοιχο εύρηµα µε χρήση µικροσυστοιχιών, που επιβεβαιώνει ότι η περιοχή του εγκεφάλου χαρακτηρίζεται από αυξηµένη έκφραση γονιδίων κατά τον εγκλιµατισµό πληθυσµών κυπρίνων (common carp) σε χαµηλές θερµοκρασίες (Gracey 2007). Παρά το µικρότερο αριθµό γονιδίων που αναδείχθηκαν από το 2 ο πείραµα, παρατηρείται συµφωνία µε τα αποτελέσµατα του 1 ου πειράµατος. Εικάζεται πως τα πρότυπα των 22 o C, παρουσιάζουν αυξηµένη µεταγραφική δραστηριότητα των γονιδίων σε αυτές τις περιοχές, διότι οι πληθυσµοί ενδέχεται να έχουν καθυστερήσει αναπτυξιακά στην οντογένεση αυτών των δοµών και να είναι επιφορτισµένοι για την ολοκλήρωση αυτών των δοµών, όταν η διαδικασία αυτή έχει ολοκληρωθεί στους πληθυσµούς που έχουν αναπτυχθεί στους 28 o C και 32 o C. Ένα ακόµη ενδιαφέρον σηµείο που υποστηρίζει την τελευταία υπόθεση, είναι ότι εντοπίστηκαν 3 γονίδια που υπερεκφράζονται στα πρότυπα των 28 o Cκαι 32 o C (του 2 ου πειράµατος) και αφορούν στην ανάπτυξη των µυών, δηλαδή βρίσκονται σε µεταγενέστερο οντογενετικό στάδιο. Ειδικά, η υπερέκφραση των γονιδίων που αφορούν στην ανάπτυξη των µυών συµφωνεί και µε αναφορές που υποστηρίζουν πως οι υψηλές θερµοκρασίες επηρεάζουν τη µυογένεση είτε ως προς τη σύνθεση των µυϊκών ινών, είτε ως προς τη πυκνότητα αυτών στους µυς (Johnston 2006). 100

101 Από τα παραπάνω συνάγεται το συµπέρασµα, πως παρά την τήρηση του κανόνα των θερµοηµερών, η χαµηλή θερµοκρασία ανάπτυξης ήταν ικανή να καθυστερήσει την ανάπτυξη και το χρονοδιάγραµµα των οντογενετικών διαδικασιών. Άλλωστε έχει δειχθεί στη νύµφη του είδους Clupea harengus, πως πληθυσµοί που αναπτύσσονταν σε χαµηλή θερµοκρασία, εµφάνιζαν σχετικά καθυστερηµένη ανάπτυξη των πτερυγίων, των µυών και του νευρικού συστήµατος (µε σηµείο αναφοράς το ολικό µήκος, TL), δηλαδή τα ίδια αναπτυξιακά γεγονότα στις χαµηλές θερµοκρασίες επιτελούνται σε µεγαλύτερο µήκος σώµατος (Johnston et al. 2001). Επίσης, λαµβάνοντας υπ όψιν τη συσχέτιση θερµοκρασίας ανάπτυξης µε το ολικό µήκος σώµατος από τις µετρήσεις TL που πραγµατοποιήθηκαν στα άτοµα των πληθυσµών του 1 ου πειράµατος διαπιστώθηκε πως το TL των ατόµων κυµαίνεται µεταξύ 6 και 9mm (βλ. πίνακα 3.1). Ειδικά τα άτοµα των πληθυσµών 22 o C, εµφανίζουν ένα µέσο TL που κατανέµεται οµοιόµορφα γύρω στα 6,5mm. Ενώ τα πρότυπα των 28 o C και 32 o C ποικίλλουν στο TL από 6 µε 6,5mm, όµως παρατηρούνται και µεγαλύτερες τιµές TL γύρω στο 8 µε 9mm. Το µεγαλύτερο µήκος των 28 o C και 32 o C θα µπορούσε να είναι απόρροια της γρηγορότερης ανάπτυξης λόγω της υψηλότερης θερµοκρασίας (Schaefer & Ryan 2006). Βέβαια, για τους πληθυσµούς των 28 o C και 32 o C µε µικρότερο µέσο µήκος (και παρόµοιο µε αυτών των 22 o C), δε σηµαίνει ότι δεν είναι εξίσου ανεπτυγµένα µε τα υπόλοιπα των 28 o C και 32 o C. Εικάζεται πως και αυτοί οι πληθυσµοί θα είναι εξίσου ανεπτυγµένοι ή τουλάχιστον περισσότερο ανεπτυγµένοι από τους πληθυσµούς των 22 o C κι αυτό γιατί έρευνες έχουν δείξει πως η υψηλή θερµοκρασία δύναται να επιταχύνει περισσότερο την ανάπτυξη από την αύξηση του µήκους. Για παράδειγµα, η υψηλή θερµοκρασία ανάπτυξης προκαλεί την εµφάνιση των ακτίνων των πτερυγίων σε µικρότερα συνολικά µήκη σώµατος (Fuiman et al. 1998, Sfakianakis et al. 2004). Τέλος, από τα στατιστικώς σηµαντικά γονίδια που αναλύθηκαν, αξίζει να σταθούµε στην prothymosin alpha b (hypothetical LOC559194), που είναι τόσο µητρικής όσο και εµβρυικής προέλευσης, εκφράζεται στα πρώιµα αναπτυξιακά στάδια και εντοπίζεται η έκφραση του στα θωρακικά πτερύγια και στον αναπτυσσόµενο αµφιβληστροειδή. Η παρουσία έκφρασης στα πρότυπα των 22 o C, επιβεβαιώνει ότι τα άτοµα των 22 o C έχουν καθυστερήσει στην ανάπτυξή τους. Επιπλέον, στην ίδια αναγωγή µας οδηγεί η έκφραση 101

102 του BMPER (binding endothelial regulator), που δρα ως ρυθµιστής της αιµοποιητικής και αγγειακής ανάπτυξης του zebrafish (Moser et al. 2007) Σύγκριση των προτύπων µετά την κανονικοποίηση των 28 Η κανονικοποίηση των 28 κρίθηκε απαραίτητο να γίνει ώστε να υπερκεραστούν οι διαφορές που οφείλονταν σε πειραµατικές και όχι βιολογικές παραµέτρους µεταξύ των προτύπων των πληθυσµών 28 o C θερµοκρασίας ανάπτυξης. Οι πληθυσµοί των 28 o C και στα 2 πειράµατα δεν υπέστησαν διαφορετική θερµοκρασιακή αγωγή, ως εκ τούτου ήταν αναµενόµενο να εµφανίζουν παρόµοιο µεταγραφικό πρότυπο. Μετά την κανονικοποίηση των 28 τα πρότυπα των 28 o C από τα 2 πειράµατα οµαδοποιούνται πλέον µαζί (βλ. PCA εικόνα 3.15). Η κανονικοποίηση έλαβε χώρα για την άντληση περισσότερων πληροφοριών και για την πιο αξιόπιστη εξαγωγή βιολογικών συµπερασµάτων. Μετά την κανονικοποίηση, οι διαφορές µεταξύ των µεταγραφικών προτύπων αποτυπώνονται σύµφωνα µε την επίδραση της θερµοκρασίας ανάπτυξης και του οντογενετικού σταδίου (PCA µε τα 17 µεταγραφικά πρότυπα, βλ. εικόνα 3.15). Παρατηρείται ότι η χαµηλή θερµοκρασία ανάπτυξης στους 22 o C ήταν καθοριστική στο να διαχωρίσει τα πρότυπα των 22 o C από αυτά των 28 o C και 32 o C, ως προς την PC2. Μάλιστα παρατηρείται πως όχι µόνο η θερµοκρασία των 22 o C, αλλά και η διάρκεια εφαρµογής της ήταν καθοριστική στο διαχωρισµό των προτύπων των πληθυσµών των 22 o C των 2 πειραµάτων. Αντίθετα, τα πρότυπα των 28 o C και 32 o C σχηµατίζουν µια οµάδα (που περικλείει τα πρότυπα και από τα 2 πειράµατα). Έτσι συνάγεται πως η υψηλή θερµοκρασία ανάπτυξης των 32 o C δεν προκαλεί έντονες µεταβολές στα µεταγραφικά πρότυπα των πληθυσµών των 32 o C που να το διαφοροποιούν σηµαντικά από τα πρότυπα των πληθυσµών που αναπτύχθηκαν στη βέλτιστη θερµοκρασία για το είδος, στους 28 o C. Αυτή η µη διαφοροποίηση των προτύπων των 28 o C και 32 o C ίσως να οφείλεται είτε στη µικρή διαφορά των 4 o C (έναντι των 6 o C διαφορά µε τους 22 o C), είτε στην προσαρµοστική ικανότητα του zebrafish να είναι πιο άµεση στις υψηλότερες θερµοκρασίες. Για να διαπιστωθεί ο βαθµός επίδρασης της θερµοκρασίας ανάπτυξης, πραγµατοποιήθηκε τόσο η σύγκριση των προτύπων των 22 o C κάθε πειράµατος µε τα πρότυπα των 28 o C, για να αναδειχθούν οι διαφορές των 22 o C µε την πρότυπη θερµοκρασία 102

103 των 28 o C, όσο και η σύγκριση των προτύπων 22 o C κάθε πειράµατος µε τα πρότυπα των 28 o C και 32 o C, που αποτελούν µαθηµατικά µια ενοποιηµένη οµάδα. Από τη σύγκριση των προτύπων των 22 o C του 1 ου πειράµατος µε τα πρότυπα όλων των 28 o C αλλά και µε τα πρότυπα των 28 o C και 32 o C (ως µια οµάδα), αναδείχθηκαν 268 στατιστικώς σηµαντικά γονίδια και 512 αντίστοιχα, που υπερεκφράζονται στους 22 o C. Τα γονίδια, όπως προέκυψε από τα αποτελέσµατα της λειτουργικής και γονιδιωµατικής ανάλυσης και των δύο συγκρίσεων, εκφράζονται σε κοινές δοµές, στις περιοχές του µατιού, των σκελετικών στοιχείων του φαρυγγικού τόξου και άλλων σκελετικών στοιχείων (σπονδυλική στήλη και σπλαγχνοκράνιο). Από τα παραπάνω συνάγεται ότι η έντονη µεταγραφική δραστηριότητα αυτών των γονιδίων στις συγκεκριµένες δοµές στους πληθυσµούς των 22 o C, λαµβάνει χώρα για να ολοκληρωθεί η ανάπτυξή τους, ενώ στους άλλους πληθυσµούς εικάζεται ότι έχει ήδη ολοκληρωθεί και βρίσκονται σε πιο προχωρηµένο οντογενετικό στάδιο. Επιπλέον, όσον αφορά στα αποτελέσµατα ως προς τις βιολογικές διεργασίες που επιτελούνται, παρατηρήθηκε αυξηµένη δραστηριότητα της ρύθµισης των πρωτεϊνών και της πρωτεόλυσης. Αντίστοιχο αποτέλεσµα, που αφορά στην αυξηµένη δραστηριότητα της πρωτεόλυσης, εµφανίζεται στο πρότυπο κυπρίνων που έχουν υποστεί εγκλιµατισµό σε χαµηλή θερµοκρασία (Gracey 2007). Άλλες βιολογικές διεργασίες που αναδείχθηκαν αφορούν στη ρύθµιση του κυτταρικού κύκλου και διαφόρων µεταβολικών διεργασιών. Σηµειώνεται πως και οι 2 συγκρίσεις που πραγµατοποιήθηκαν (22vs28 και 22vs28&32 - µε τα πρότυπα των 28/32 ως µια οµάδα) αναδεικνύουν τις ίδιες βιολογικές διεργασίες. Η τελευταία παρατήρηση δρα ενισχυτικά στην υπόθεση ότι οι πληθυσµοί των 28 o Cκαι 32 o C αποτελούν ενιαία οµάδα σε σχέση µε τους 22 o C, όχι µόνο µαθηµατικά αλλά και βιολογικά. Ακολούθως, οι αντίστοιχες συγκρίσεις που πραγµατοποιήθηκαν µε τα πρότυπα των πληθυσµών των 22 o C του 2 ου πειράµατος, έδειξαν πως υπάρχει κοινό ιστοειδικό και βιολογικό πρότυπο έκφρασης για τα στατιστικώς σηµαντικά γονίδια (118 από τη σύγκριση των 22 o C µε τα 28 o C µόνο και 133 από τη σύγκρισή τους µε τα 28 o C και 32 o C). Μάλιστα, αυτό το κοινό πρότυπο έκφρασης παρατηρήθηκε τόσο στα γονίδια που υπερεκφράζονται στους 22 o C, µε την έκφρασή τους να εντοπίζεται στις εγκεφαλικές περιοχές, όσο και στα γονίδια που υπερεκφράζονται στους 28 o C και 32 o C, και που επιδεικνύουν αυξηµένη µεταγραφική δραστηριότητα για την ανάπτυξη του µυοσκελετικού ιστού των θωρακικών 103

104 πτερυγίων. Μάλιστα, οι Georga & Koumoundouros (2010) σε ανάλυση που πραγµατοποίησαν στο σχήµα σώµατος µετά από επίδραση στις τρεις θερµοκρασίες ανάπτυξης, διαπίστωσαν πως το σχήµα σώµατος των ατόµων των 22 o C διαφέρει από αυτό των 28 o C και 32 o C ως προς διάφορους χαρακτήρες, µεταξύ των οποίων ήταν και τα θωρακικά πτερύγια. Επιπρόσθετα, το γεγονός ότι στα πρότυπα των υψηλών θερµοκρασίων (28 o C και 32 o C) αναδείχθηκαν γονίδια που σχετίζονται µε το µυϊκό σύστηµα, έρχεται σε συµφωνία µε τους Johnston et al. (2009), που έχουν δείξει πως η µυϊκή ανάπτυξη επηρεάζεται σηµαντικά από τη θερµοκρασία ανάπτυξης και µάλιστα ευνοείται στις υψηλότερες θερµοκρασίες σε σχέση µε τις χαµηλές. Στο σηµείο αυτό κρίνεται απαραίτητο, να γίνει µια σύγκριση των αποτελέσµατων από την ανάλυση των µεταγραφικών προτύπων µε αποτελέσµατα προηγούµενων εργασιών στο εργαστηρίο ως προς τη µορφολογία των ατόµων που έχουν υποστεί την επίδραση της θερµοκρασίας κατά την πρώιµη οντογενετική περίοδο. Καταρχήν, αξίζει να σηµειωθεί πως η διαφοροποίηση των προτύπων των 22 o C από τα 28 o C και 32 o C έρχεται σε πλήρη συµφωνία µε την παρατηρούµενη διαφοροποίηση των εν λόγω πληθυσµών ως προς µορφολογικούς χαρακτήρες. Ως προς το χρόνο εµφάνισης των οντογενετικών χαρακτήρων, έχει δειχθεί πως τα άτοµα των 22 o C καθυστερούν σηµαντικά, ενώ στα άτοµα των 28 o C και 32 o C έχει παρατηρηθεί µείωση του χρόνου εµφάνισης των οντογενετικών χαρακτήρων που εµφανίζονται µετά την κάµψη της νωτοχορδής (Λοϊζίδης 2009). Επιπλέον, ως προς τις αλλαγές που παρατηρούνται στο σχήµα σώµατος των ατόµων διαφορετικής θερµοκρασιακής συνθήκης, είναι εµφανής ο διαχωρισµός των ατόµων των 22 o C από τα 28 o C και 32 o C (Πάτσιου 2011, Georga & Koumoundouros 2010). Ακόµη όταν εξετάστηκε η επίδραση της θερµοκρασίας ανάπτυξης στην αναλογία φύλου, διαπιστώθηκε πως η χαµηλή θερµοκρασιακή συνθήκη των 22 o C ήταν ικανή να επάγει ένα πρότυπο αρρενοποίησης στα άτοµα, ενώ στους 28 o C και 32 o C δεν παρατηρήθηκε καµιά επίδραση, αφού η κατανοµή των θηλυκών και αρσενικών ατόµων ήταν ισόποση (Πάτσιου 2011). Επίσης, όσον αφορά στην ευνοϊκή δράση των υψηλών θερµοκρασιών, διαπιστώθηκε πως υπάρχει µια γραµµική αύξηση του ειδικού ρυθµού αύξησης (SGR) ανάλογη µε την αύξηση της θερµοκρασίας (Λοϊζίδης 2009). Η συµβολή της υψηλής θερµοκρασίας ήταν σηµαντική και στην περίπτωση µελέτης της οντογένεσης και κάµψης της νωτοχορδής. Συγκεκριµένα, αποτελέσµατα έδειξαν πως η ολοκλήρωση της κάµψης της νωτοχορδής 104

105 πραγµατοποιείται σε µικρότερο µήκος στα άτοµα των 32 ο C από ότι στα άτοµα των άλλων δύο συνθηκών (Πάτσιου 2011). Στη συνέχεια, από τα στατιστικώς σηµαντικά γονίδια που εµφανίζουν ιστοειδικό πρότυπο έκφρασης στις υπό ανάπτυξη δοµές των πληθυσµών των 22 o C, επισηµαίνονται κάποια από αυτά µε ξεχωριστή βιολογική σηµασία. Το hsp70 (heat shock protein 70) παρουσιάζει θερµοεξαρτώµενη ρύθµιση και είναι απαραίτητο κατά την ανάπτυξη του µατιού (Evans et al. 2005). Το hsp70 έχει, επίσης διαπιστωθεί σε πρόσφατη εργασία µε χρήση cdna µικροσυστοιχιών, να υπερεκφράζεται στους πληθυσµούς γαλαζοπτέρυγου τόνου (Thunnus orientalis) που είχαν εγκλιµατιστεί σε χαµηλή θερµοκρασία (Castilho et al. 2009). Το pes (pescadillo) µε µεγαλύτερη έκφραση κατά τα πρώιµα στάδια της ανάπτυξης, εντοπίζεται να εκφράζεται κυρίως στην περιοχή του µατιού, του εγκεφάλου και στις εκφύσεις των πτερυγίων. Το taz (tafazzin), στα αποτελέσµατα της ανάλυσης φαίνεται ότι συµµετέχει την ανάπτυξη του µατιού, όµως ο κύριος ρόλος του γονιδίου αφορά στον καθορισµό και την ανάπτυξη της καρδιάς (Khuchua et al. 2006). Το p53 (tumor protein p53), φαίνεται να επάγει την ενεργοποίηση της απόπτωσης των αρχέγονων κυττάρων του µατιού και τη διαφοροποίηση των κυττάρων προς το σχηµατισµό του ώριµου µατιού (Fischer et al. 2007). Επίσης, ενδιαφέρον παρουσιάζουν τα γονίδια που εµπλέκονται στον κυτταρικό κύκλο (π.χ. cyclin-dependent kinase 2). Τέλος, µια γενική παρατήρηση από τη σύγκριση των προτύπων των 22 o C των 2 πειραµάτων µε τα πρότυπα των άλλων θερµοκρασιακών συνθηκών, αποτελεί ότι τα αποτελέσµατα των συγκρίσεων δεν καταλήγουν στην ανάδειξη των ίδιων δοµών. Βεβαίως, γίνεται αντιληπτό πως οι πληθυσµοί των 22 o C των 2 πειραµάτων καθυστερούν έναντι των 28 o C και 32 o C, όµως το αξιοσηµείωτο που συνάγεται από την παραπάνω παρατήρηση είναι ότι οι εν λόγω πληθυσµοί διαφοροποιούνται µεταξύ τους - όπως είναι εµφανές στην PCA της εικόνας Αυτό ενδεχοµένως οφείλεται στην εφαρµογή σε πρώιµο οντογενετικό στάδιο και στη διάρκεια της θερµοκρασιακής αγωγής. 105

106 4.2. Επίδραση της περιόδου και της διάρκειας της θερµοκρασιακής αγωγής στο µεταγραφικό πρότυπο Τα µεταγραφικά πρότυπα των πληθυσµών των 22 o C των 2 πειραµάτων διαφοροποιούνται µεταξύ τους, όπως φαίνεται στην PCA της εικόνας 3.15, ως αποτέλεσµα της διαφορετικής έναρξης εφαρµογής και της διάρκειας της θερµοκρασιακής αγωγής. Μάλιστα από τη σύγκριση των προτύπων διαπιστώθηκαν 36 στατιστικώς σηµαντικά γονίδια να υπερεκφράζονται στα πρότυπα των 22 o C του 1 ου πειράµατος. Εκτιµάται πως αφού η χαµηλή θερµοκρασία ανάπτυξης τείνει να καθυστερεί την ανάπτυξη, η επίδραση της περιόδου και της διάρκειας της θερµοκρασιακής αγωγής θα είναι εντονότερη. Η θερµοκρασιακή αγωγή των 22 o C στο 1 ο πείραµα εφαρµόστηκε στους πληθυσµούς από την πρώτη ηµέρα µετά τη γονιµοποίηση (1 dpf), δηλαδή σε πρώιµο οντογενετικό στάδιο, και µάλιστα για το διπλάσιο διάστηµα (σε σχέση µε το 2 ο πείραµα). Υποστηρίζεται, λοιπόν, ότι η έναρξη εφαρµογής της θερµοκρασιακής αγωγής από την πρώτη µέρα έδρασε καθοριστικά στην ανάπτυξη των ατόµων. Μάλιστα, η διάρκεια της θερµοκρασιακής αγωγής φαίνεται να δρα αθροιστικά, γι αυτό οι πληθυσµοί του πειράµατος που υπέστησαν τη µεγαλύτερη σε διάρκεια θερµοκρασιακή αγωγή είναι σε πιο πρώιµο/νεαρό οντογενετικό στάδιο σε σχέση µε τα άτοµα των πληθυσµών, που δέχτηκαν τη µισής διάρκειας θερµοκρασιακή αγωγή. Από τα αποτελέσµατα της λειτουργικής και γονιδιωµατικής ανάλυσης δεν απαντάται αυτή η υπόθεση σαφώς, αλλά υποστηρίζεται µερικώς από τα 7 γονίδια, που εκφράζονται ειδικά στον ανώριµο οφθαλµό. Ακολούθως, για να διαπιστωθεί πόσο έχει καθυστερήσει η ανάπτυξη των πληθυσµών των 22 o C (1 ου πειράµατος, υπενθυµίζεται ότι πρόκειται για άτοµα ηλικίας 20 ηµερών, 20d), επιχειρήθηκε η σύγκριση των προτύπων τους µε τα πρότυπα των 28 o C ηλικίας 10 ηµερών (10d). Η SAM ανάλυση ανέδειξε µόλις 59 γονίδια, παρόλο που πρόκειται για πληθυσµούς διαφορετικής ηλικίας, ενώ θα ήταν αναµενόµενο να βρεθούν πολλά περισσότερα γονίδια. Τα γονίδια αυτά υπερεκφράζονται στα άτοµα των 22 o C. Κάποια από αυτά τα γονίδια αφορούν σε δοµές αισθητήριων οργάνων, γεγονός που υποδηλώνει πως τα άτοµα των 22 o C είναι πιο ανεπτυγµένα σε σχέση µε τα άτοµα ηλικίας 10d, που δεν έχουν ξεκινήσει ακόµα την ανάπτυξη των αισθητηρίων οργάνων. Επιπλέον, κάποια γονίδια από τα στατιστικώς 106

107 σηµαντικά εκφράζονται στο polster, αποτελεί την πρόδροµη δοµή που εξελίσσεται στον αδένα εκκόλαψης και βρίσκεται στη βάση του πρόσθιου εγκέφαλου. Πρόκειται για έναν εµβρυικό χαρακτήρα, που ενδεχοµένως να µην παρατηρείται σε άτοµα ηλικίας 20 ηµερών. Έτσι, από τα παραπάνω υποστηρίζεται πως η επίδραση µιας θερµοκρασιακής συνθήκης είναι καθοριστική όταν αυτή εφαρµόζεται κατά το κρίσιµο πρώιµο οντογενετικό στάδιο και µάλιστα η διάρκεια της θερµοκρασιακής αγωγής τείνει να επιδρά αθροιστικά και να επιβραδύνει το ρυθµό της ανάπτυξης και το χρονοδιάγραµµα των οντογενετικών σταδίων. Η τελευταία παρατήρηση συµφωνεί και µε αποτελέσµατα πρόσφατης εργασίας στο εργαστήριό µας (Πάτσιου 2011). Τέλος, συµπεραίνεται πως το µεταγραφικό πρότυπο µπορεί να παρουσιάζει θερµοεξαρτώµενη πλαστικότητα ανάλογη τόσο της έντασης, πχ. στους 22 o C είναι πιο µεγάλη η διαφορά από τη βέλτιστη θερµοκρασία των 28 o C, σε σχέση µε τη διαφορά των 32 o C από τους 28 o C Η διαφοροποίηση των µεταγραφικών προτύπων στις 2 διαφορετικές ηλικίες (10d vs 20d) Η αναπτυξιακή σύγκριση των προτύπων στις δυο διαφορετικές ηλικίες των πληθυσµών που αναπτυχθήκαν στους 28 o C ήταν αναµενόµενο να αναδείξει πολυάριθµα στατιστικώς σηµαντικά γονίδια που εµπλέκονται σε διαφορετικές λειτουργίες. Η διαφοροποίηση των µεταγραφικών προτύπων των 28 o C ηλικίας 10d από τα αντίστοιχα των 28 o C ηλικίας 20d είναι εµφανής, όπως παρουσιάζεται στην PCA της εικόνας Καθώς, τα πρότυπα αφορούν σε άτοµα που βρίσκονται σε 2 διαφορετικά οντογενετικά στάδια, αναµένεται οι διαφορές στην έκφραση των γονιδίων να αντανακλώνται και σε διαφορετικές οντογενετικές και βιολογικές διεργασίες. Πράγµατι από τα αποτελέσµατα της λειτουργικής και γονιδιωµατικής ανάλυσης των στατιστικώς σηµαντικών γονιδίων, παρατηρήθηκε πως τα γονίδια που υπερεκφράζονται στα πρότυπα των 10d (724 γονίδια) αφορούν στην ανάπτυξη της καρδιάς, του παγκρέατος, του κεντρικού νευρικού συστήµατος, της επιβλάστης και της σπονδυλικής στήλης. Η ανάπτυξη αυτών των δοµών γίνεται νωρίτερα από την ανάπτυξη των δοµών που αναδείχθηκαν από 107

108 τα γονίδια που υπερεκφράζονται στα πρότυπα των 20d (90 γονίδια). Στα πρότυπα των 20d παρατηρήθηκε έντονη µεταγραφική δραστηριότητα των γονιδίων που αφορούν στην ανάπτυξη του µυϊκού συστήµατος (µυϊκός ιστός κεφαλής και κορµού), των βραγχίων και των γονάδων. Ήδη η αυξηµένη έκφραση γονιδίων που εµπλέκονται στην ανάπτυξη των γονάδων επιβεβαιώνει τη µεγάλη αναπτυξιακή διαφορά µεταξύ των 2 οντογενετικών ηλικιών. Επιπλέον, στο επίπεδο των βιολογικών διεργασιών, σύµφωνα µε τις οντολογίες BP, παρατηρήθηκε πως στα πρότυπα των 10d υπερεκφράζονται γονίδια που είναι επιφορτισµένα µε την εµβρυική ανάπτυξη, τη µορφογένεση οργάνων και την ανάπτυξη του νευρικού συστήµατος. Αντίθετα, στα πρότυπα των 20d υπερεκφράζονται τα γονίδια που εµπλέκονται σε µεταβολικές διεργασίες και στην αιµοποίηση (ενεργοποίηση αιµοπεταλίων και απόκριση σε τραυµατισµούς). ιαπιστώνεται πως το µεταγραφικό επίπεδο των νεότερων ατόµων, ηλικίας 10d, ανέδειξε βιολογικές διεργασίες που λαµβάνουν χώρα νωρίς στην ανάπτυξη, ενώ στα πρότυπα των ατόµων ηλικίας 20d αποτυπώθηκαν τα οντογενετικά γεγονότα που, όπως ήταν αναµενόµενο, συµβαίνουν αργότερα στην ανάπτυξη. Ωστόσο, τα ευρήµατα της παρούσας εργασίας ως προς τις αναπτυξιακές διαφορές των πληθυσµών διαφορετικής ηλικίας δε µπορούν να συσχετιστούν µε αποτελέσµατα της διεθνούς βιβλιογραφίας, καθώς οι περισσότερες µελέτες µε χρήση µικροσυστοιχιών στο zebrafish αφορούν στην πολύ πρώιµη ανάπτυξη - µέχρι τη δεύτερη ηµέρα µετά τη γονιµοποίηση (π.χ. στην εργασία των Mathavan et al. 2005), ή το πολύ µέχρι την πέµπτη ηµέρα µετά τη γονιµοποίηση (Ton et al. 2002) Η βιοπληροφορική µελέτη του µεταγραφικού προτύπου (transcriptomics) στο zebrafish και η σηµασία της κανονικοποίησης των 28 Η µελέτη του µεταγραφικού προτύπου του zebrafish µε χρήση µικροσυστοιχιών έχει µελετηθεί στα πρώιµα αναπτυξιακά στάδια (Ton et al. 2002, Mathavan et al. 2005) για τον εντοπισµό των γονιδίων που εµπλέκονται στην εµβρυική οργανογένεση και στη ρύθµιση των οντογενετικών γεγονότων. 108

109 Επιπλέον, το µεταγραφικό πρότυπο αποτελεί αντικείµενο µελέτης της απόκρισης σε περιβαλλοντικούς παράγοντες, όπως στην περίπτωση της επίδρασης της υποξίας στο zebrafish (van der Meer et al. 2005), της επίδρασης της νηστείας (Drew et al. 2008) και της επίδρασης τοξικών παραγόντων (Craig et al. 2010). Όσον αφορά στη χρήση µικροσυστοιχιών για τη µελέτη του µεταγραφικού προτύπου ιχθύων ως απόκριση στη θερµοκρασία εγκλιµατισµού, έχουν πραγµατοποιηθεί εργασίες στον τόνο (Thunnus orientalis, Castilho et al. 2009), στον κυπρίνο (Gracey 2007), το killifish (Fundulus heteroclitus, Whitehead et al. 2010). Όµως, για το zebrafish δεν υπάρχει προηγούµενο ολιστικής µελέτης της επίδρασης της θερµοκρασίας στο µεταγραφικό πρότυπο µε τη χρήση της τεχνολογίας των µικροσυστοιχιών. Αντίθετα, υπάρχουν αρκετές µελέτες της επίδρασης της θερµοκρασίας στο επίπεδο µορφολογικών και φυσιολογικών χαρακτήρων (Koumoundouros et al. 2009, Bagatto 2005, Johnston 2006, Georga & Koumoundouros 2010). Η δυνατότητα ολιστικής µελέτης του µεταγραφώµατος του zebrafish µετά από την εφαρµογή των διαφορετικών θερµοκρασιακών συνθηκών υπήρξε κοµβική. Ωστόσο, το γεγονός ότι τα δύο πειράµατα, που διαφοροποιούνταν ως προς τη διάρκεια της θερµοκρασιακής αγωγής, πραγµατοποιήθηκαν σε διαφορετικό χρόνο, δηµιούργησε την ανάγκη ενοποίησης των δεδοµένων και απαλοιφή του πειραµατικού σφάλµατος που υπεισερχόταν. Η κανονικοποίηση των προτύπων των 28 ήταν καθοριστικής σηµασίας για την επίτευξη αυτού του στόχου και για την πληρέστερη αξιοποίηση όλων των δεδοµένων, ώστε να εξαχθούν ασφαλή βιολογικά συµπεράσµατα. Η κανονικοποίηση και ενοποίηση των δεδοµένων παρείχε ακριβέστερη εικόνα των οµοιοτήτων και διαφορών µεταξύ των µεταγραφικών προτύπων. Πριν την κανονικοποίηση δεν ήταν δυνατό να φανεί η διαφοροποίηση που διαπιστώθηκε στα πρότυπα των 22 o C των δυο πειραµάτων, ενώ διαπιστώθηκε πως δεν ισχύει το ίδιο για τα πρότυπα των 32 o C, που συνιστούν µια οµάδα. Η κανονικοποίηση που πραγµατοποιήθηκε στο εργαστήριό µας απέδωσε εµπιστεύσιµα κανονικοποιηµένα δεδοµένα, καθώς οι θερµοκρασιακές συγκρίσεις, πριν και µετά την κανονικοποίηση, µεταξύ των 22 o C µε τα 28 o C και 32 o C οδήγησαν σε κοινά βιολογικά συµπεράσµατα. Ωστόσο, οι πληροφορίες που παρήγαγαν τα κανονικοποιηµένα 109

110 δεδοµένα ήταν περισσότερες και αξιοποιήθηκαν στο µέγιστο βαθµό για τη βιολογική ερµηνεία των προτύπων απόκρισης των γονιδίων. Τέλος, επειδή η υβριδοποίηση των δειγµάτων των δύο πειραµάτων έγινε στον ίδιο τύπο µικροσυστοιχίας, το zebrafish GeneChip array της εταιρείας Affymetrix, η κανονικοποίηση πραγµατοποιήθηκε µε την εφαρµογή ενός σχετικά απλού αλγόριθµου που δεν εισάγει σφάλµατα. Αντίθετα, σε άλλες περιπτώσεις, όπου απαιτείται ενοποίηση δεδοµένων έκφρασης από διαφορετικού τύπου µικροσυστοιχίες, εφαρµόζονται πολύπλοκοι αλγόριθµοι µε περισσότερες πιθανότητες εισαγωγής σφάλµατος (Shabalin et al. 2008). 110

111 5. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Η ολιστική ανάλυση της µοριακής φυσιολογίας σε µεταγραφικό επίπεδο κατέστησε δυνατό τον προσδιορισµό της θερµοκρασιακής πλαστικότητας σε µορφολογικά χαρακτηριστικά και δοµές. Η παρούσα εργασία έδειξε ότι όντως η θερµοκρασία ανάπτυξης επιδρά στο πρότυπο έκφρασης και απόκρισης των γονιδίων ανά θερµοκρασιακή συνθήκη. Η θερµοκρασιακή αγωγή κατά την πρώιµη ανάπτυξη ήταν καθοριστική στο να διαφοροποιήσει τα µεταγραφικά πρότυπα των πληθυσµών των 22 o C από τα αντίστοιχα των 28 o C και 32 o C. Η χαµηλή θερµοκρασία ανάπτυξης στους 22 o C προκάλεσε µια καθυστέρηση στα οντογενετικά γεγονότα έναντι των πληθυσµών των 28 o C και 32 o C, όπως αποτυπώνεται από τη διαφορική γονιδιακή έκφραση και τις βιολογικές διεργασίες που επιτελούν. Τα γονίδια που προσδιορίστηκαν να παρουσιάζουν θερµοεξαρτώµενη πλαστικότητα αφορούν στην ανάπτυξη του εγκεφάλου, του µατιού και των θωρακικών πτερυγίων. Η διάρκεια της θερµοκρασιακής αγωγής και η εφαρµογή της κατά την πρώιµη οντογενετική περίοδο (από την 1 η ηµέρα µετά τη γονιµοποίηση) επέδρασαν σηµαντικά, στην περίπτωση της χαµηλής θερµοκρασίας των 22 o C. Η περίοδος των πρώτων 10 ηµερών υπήρξε καθοριστική και περισσότερο θερµοευαίσθητη, ώστε να προκαλέσει µεγαλύτερη καθυστέρηση της ανάπτυξης στα άτοµα που υπέστησαν τη µεγαλύτερης διάρκειας θερµοκρασιακή αγωγή. Η εφαρµογή της υψηλότερης θερµοκρασίας ανάπτυξης και η διάρκεια της θερµοκρασιακής αγωγής στους 32 o C δε φάνηκε να επιδρά σηµαντικά στη διαφοροποίηση των µεταγραφικών προτύπων των πληθυσµών από την απόκριση που παρατηρήθηκε στη βέλτιστη θερµοκρασία των 28 o C. ιαπιστώθηκαν οι διαφορές στη γονιδιακή έκφραση ανά οντογενετικό στάδιο στη σύγκριση των προτύπων των ατόµων ηλικίας 10d από τα άτοµα ηλικίας 20d και δείχθηκε ότι τα πρότυπα έκφρασης αντανακλούν την προτεραιότητα στις οντογενετικές διαδικασίες, που διαφοροποιούνται από στάδιο σε στάδιο. 111

112 6. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ Ayala, M.D., Lopez-Albors, O., Gil, F., GarcıAa-Alcázar, A., Abellán, E., Alarcón, J.A., Álvarez, M.C., RamıArez-Zarzosa, G. and Moreno, F Temperature effects on muscle growth in two populations (Atlantic and Mediterranean) of sea bass, Dicentrarchus labrax L. Aquaculture 202(3-4): Bagatto, B Ontogeny of cardiovascular control in zebrafish (Danio rerio): Effects of developmental environment. Comparative Biochemistry and Physiology - A Molecular and Integrative Physiology 141(4): Borgatti, S. P How to explain hierarchical clustering. Connections 17(2): Brown, G.C., Hafner, R.P and Brand, M.D Molecular Interactions on Microarrays. Nature Genetics 21: 5-9. Castilho, P.C., Buckley, B.A., Somero, G., and Block, B.A Heterologous hybridization to a complementary DNA microarray reveals the effect of thermal acclimation in the endothermic bluefin tuna (Thunnus orientalis). Molecular Ecology 18(10): Chevin, L.M., Lande, R. and Mace G.M Adaptation, Plasticity, and Extinction in a Changing Environment: Towards a Predictive Theory. PLoS Biology 8(4): e doi: /journal.pbio Craig, P.M., M., Wood, C.M., and McClelland, G.B Water chemistry alters gene expression and physiological end points of chronic waterborne copper exposure in zebrafish (Danio rerio). Environmental Science & Technology 44: Darias, M.J., Zambonino-Infante, J.L., Hugot, K., Cahu, C.L. and Mazurais, D Gene expression patterns during the larval development of European sea bass (Dicentrarchus labrax) by microarray analysis. Marine Biotechnology (NY) 10(4): Dennis, G. Jr, Sherman, B.T., Hosack, D.A., Yang, J., Gao, W., Lane, H.C. and Lempicki, R.A DAVID: Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery. Genome Biology doi: /gb-p3 4:P3. Drew, R.E., Rodnick, K.J., Settles, M., Wacyk, J., Churchill, E., Powell, M.S., Hardy, R.W., Murdoch, G.K., Hill, R.A. and Robison, B.D Effect of starvation on transcriptomes of brain and liver in adult female zebrafish (Danio rerio). Physiological Genomics 35(3): Dutta, B., Snyder, R. and Klapa, M.I Significance Analysis of Time-Series Transcriptomic Data: A Methodology That Enables the Identification and Further Exploration of the Differentially Expressed Genes at Each Time-Point. Biotechnology and Bioengineering 98(3): Eisen, M.B., Spellman, P.T., Brown, P.O. and Botstein, D Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns. PNaS 95(25): Evans, T.G., Yamamoto, Y., Jeffery, W.R. and Krone, P.H Zebrafish Hsp70 is required for embryonic lens formation. Cell Stress Chaperones 10(1): Fischer, S., Prykhozhij, S., Rau, M.J. and Neumann, C.J Mutation of zebrafish caf-1b results in S phase arrest, defective differentiation, and p53-mediated apoptosis during organogenesis. Cell Cycle 6(23): Fuiman, L.A., Poling, K.R. and Higgs, D.M Quantifying developmental progress for comparative studies of larval fishes. Copeia (3): Georga, I. and Koumoundouros, G Thermally Induced Plasticity of Body Shape in Adult Zebrafish Danio rerio (Hamilton, 1822). Journal of Morphology 271: Georgakopoulou, E., Sfakianakis, D.G, Kouttouki, S., Divanach, P., Kentouri, M. and Koumounodouros, G The influence of temperature during early life on phenotypic expression at later ontogenetic stages in sea bass. Journal of Fish Biology 70(1):

113 Gilbert, S.F Ecological Developmental Biology: Developmental Biology Meets the Real World. Developmental Biology 233: Gracey, A.Y Interpreting physiological responses to environmental change through gene expression profiling. Journal of Experimental Biology 210(9): Hirayama, M., Ahsan, M.N., Mitani, H. and Watabe, S CYR61 is a novel gene associated with temperature-dependent changes in fish metabolism as revealed by cdna microarray analysis on a medaka Oryzias latipes cell line. Journal of Cellular Biochemistry 104(4): Huang, D.W., Sherman, B.T. and Lempicki, R.A Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nature Protocols 4 (1): Johnston, I.A., Cole, N.J, Vieira, V.L.A. and Davidson, I Temperature and developmental plasticity of muscle phenotype in herring larvae. Journal of Experimental Biology 200(5): Johnston, I.A Environment and plasticity of myogenesis in teleost fish. Journal of Experimental Biology 209(12): Johnston, I.A., Lee, H.T., Macqueen, D.J., Paranthaman, K., Kawashima, C., Anwar, A., Kinghorn, J.R. and Dalmay, T Embryonic temperature affects muscle fibre recruitment in adult zebrafish: genome-wide changes in gene and microrna expression associated with the transition from hyperplastic to hypertrophic growth phenotypes. Journal of Experimental Biology 212(12): Ju, Z., Wells, M.C. and Walter, R.B DNA microarray technology in toxicogenomics of aquatic models: methods and applications. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology 145(1): Kassahn, K.S., Caley, M.J., Ward, A.C., Connolly, A.R., Stone, G. and Crozier, R.H Heterologous microarray experiments used to identify the early gene response to heat stress in a coral reef fish. Molecular Ecology,16(8): Khuchua, Z., Yue, Z., Batts, L. and Strauss, A.W A zebrafish model of human Barth syndrome reveals the essential role of tafazzin in cardiac development and function. Circulation Research (2): Koumoundouros, G., Sfakianakis, D.G., Divanach, P., and Kentouri, M., Effect of temperature on swimming performance of sea bass juveniles. Journal of Fish Biology 60(4): Koumoundouros G., Ashton C., Sfakianakis D.G., Divanach P., Kentouri M., Anthwal N., Stickland N.C., Thermally induced phenotypic plasticity of swimming performance in European sea bass [Dicentrarchus labrax (Linnaeus 1758)] juveniles. Journal of Fish Biology 74: Li, C. and Wong, W.H. 2001a. Model-based analysis of oligonucleotide arrays: Expression index computation and outlier detection. PNaS 98: Li, C. and Wong, W.H. 2001b Model-based analysis of oligonucleotide arrays: model validation, design issues and standard error application. Genome Biology 2(8): research Lien, C.L., Schebesta, M., Makino, S., Weber, G.J. and Keating, M.T Gene expression analysis of zebrafish heart regeneration. PLoS Biology 4(8): e Linney, E., Dobbs-McAuliffe, B., Sajadi, H. and Malek, R.L Microarray gene expression profiling during the segmentation phase of zebrafish development. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology 138(3): Lipshutz, J., Gingeras, R. and Lockhart, J., High density synthetic oligonucleotide arrays. Nature Genetics Supplement 21: Lopez-Albors, O., Ayala, M.D., Gil, F., Garcıa-Alcazar, A., Abellan, E., Latorre, R., Ramırez- Zarzosa, G., Vazquez, J.M Early temperature effects on muscle growth dynamics and histochemical profile of muscle fibres of sea bass Dicentrarchus labrax L., during larval and juvenile stages. Aquaculture 62201:

114 Mathavan, S., Lee, S.G., Mak, A., Miller, L.D., Murthy, K.R., Govindarajan, K.R., Tong, Y., Wu, Y.L., Lam, S.H., Yang, H., Ruan, Y., Korzh, V., Gong, Z., Liu, E.T., and Lufkin, T Transcriptome analysis of zebrafish embryogenesis using microarrays. PLoS Genetics 1: Matschak, T. W. and Stickland, N.C The growth of Atlantic salmon (Salmo salar L.) myosatellite cells in culture at two different temperatures. Experientia 51(3): Mieczkowski, J., Tyburczy, M.E., Dabrowski, M. and Pokarowski, P Probe set filtering increases correlation between Affymetrix GeneChip and qrt-pcr expression measurements. BMC Bioinformatics 11: 104 (doi: / ). Moser, M., Yu, Q., Bode, C., Xiong, J.W. and Patterson, C BMPER is a conserved regulator of hematopoietic and vascular development in zebrafish. Journal of Molecular and Cellular Cardiology 43(3): Nishidate, M., Nakatani, Y., Kudo, A., and Kawakami, A Identification of novel markers expressed during fin regeneration by microarray analysis in medaka fish. Developmental Dynamics 236 (9): Okoniewski, M.J. and Miller, C.J Hybridization interactions between probesets in short oligo microarrays lead to spurious correlations. BMC Bioinformatics 7: 276 (doi: / ). Parichy, D.M., Elizondo, M.R., Mills, M.G. Gordon, T.N. and Engeszer, R.E Normal Table of Postembryonic Zebrafish Development: Staging by Externally Visible Anatomy of the Living Fish. Developmental Dynamics 238: Pelster, B Developmental plasticity in the cardiovascular system of fish, with special reference to the zebrafish. Comparative Biochemistry and Physiology - A Molecular and Integrative Physiology 133(3): Phillips, K Phenotypic Plasticity. doi: /jeb June 15, 2006 Journal of Experimental Biology (Inside JEB) 209: i-iii. Pigliucci, M., Murren, C. J., and Schlichting, C.D Phenotypic plasticity and evolution by genetic assimilation. Journal of Experimental Biology 209(12): Quackenbush, J Computational analysis of microarray data. Nature Reviews Genetics 2(6): Raychaudhuri, S., Stuart, J.M. and Altman, R.B Principal components analysis to summarize microarray experiments: application to sporulation time series. Pacific Symposium on Biocomputing (Honolulu, Hawaii) Rombough, P.J. and Moroz, B.M The scaling and potential importance of cutaneous and branchial surfaces in respiratory gas exchange in larval and juvenile walleye Stizostedion vitreum. Journal of Experimental Biology 200(18): Saeed AI, Sharov V, White J, Li J, Liang W, Bhagabati N, Braisted J, Klapa M, Currier T, Thiagarajan M, Sturn A, Snuffin M, Rezantsev A, Popov D, Ryltsov A, Kostukovich E, Borisovsky I, Liu Z, Vinsavich A, Trush V, Quackenbush J TM4: a free, open-source system for microarray data management and analysis. ( Biotechniques 34(2): Saviozzi, S. and Calogero R.A Microarray probe expression measures, data normalization and statistical validation. Comparative and Functional Genomics 4: Schaefer, J. and Ryan, A Developmental plasticity in the thermal tolerance of zebrafish Danio rerio. Journal of Fish Biology 69(3): Schena, M Genome analysis with gene expression microarrays. Bioessays 18(5): Schlichting, C.D. and Pigliucci, M Phenotypic Evolution: A Reaction Norm Perspective. Sunderland, MA: Sinauer Associates. Sfakianakis, D.G., Koumoundouros, G., Divanach, P., and Kentouri, M Osteological development of the vertebral column and of the fins in Pagellus erythrinus (L. 1758). 114

115 Temperature effect on the developmental plasticity and morpho-anatomical abnormalities. Aquaculture 232(1-4): Sfakianakis, D.G., Leris, I. and Kentouri, M Effect of developmental temperature on swimming performance of zebrafish (Danio rerio) juveniles. Environmental Biology of Fishes doi: /s Shabalin, A.A., Tjelmeland, H., Fan, C., Perou, C.M. and Nobel, A.B Merging two gene expression studies via cross platform normalization. Bioinformatics 24, Slonim, D.K. and Yanai, I Getting Started in Gene Expression Microarray Analysis PLoS Computational Biology 5(10): e doi: /journal.pcbi Spence, R., Gerlach, G., Lawrence, C. and Smith, C The behaviour and ecology of the zebrafish, Danio rerio. Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society 83: doi: /j x x. Sprague, J., Bayraktaroglu, L., Clements, D., Conlin, T., Fashena, D., Frazer, K., Haendel, M., Howe, D.G., Mani, P., Ramachandran, S., Schaper, K., Segerdell, E., Song, P., Sprunger, B., Taylor, S., Van Slyke, C.E., and Westerfield, M The Zebrafish Information Network: the zebrafish model organism database. Nucleic Acids Research 34: doi: /nar/gkj086. Stickland, N.C., White, R.N., Mescall, P.E., Crook, A.R., and Thorpe, J.E The effect of temperature on myogenesis in embryonic development of the Atlantic salmon (Salmo salar L.). Anatomy and Embryology 178(3): Ton, C., Stamatiou, D., Dzau, V.J. and Liew, C.C Construction of a zebrafish cdna microarray: gene expression profiling of the zebrafish during development. Biochemical and Biophysical Research Communications 296(5): Tusher, V.G., Tibshirani, R. and Chu G Significance analysis of microarrays applied to the ionizing radiation response. PNaS 98(9): van der Meer, D.L., van den Thillart, G.E., Witte, F., de Bakker, M.A., Besser, J., Richardson, M.K., Spaink, H.P., Leito, J.T., and Bagowski, C.P Gene expression profiling of the long-term adaptive response to hypoxia in the gills of adult zebrafish. American Journal of Physiology Regulatory, Integrative and Comparative Physiology 286(5): Via, S., Gomulkiewicz, R., De Jong, G., Scheiner, S.M., Schlichting, C.D. and Van Tienderen, P.H Adaptive phenotypic plasticity: consensus and controversy. Trends in Ecology & Evolution 10: Vulesevic, B. and Perry, S.F Developmental plasticity of ventilatory control in zebrafish, Danio rerio. Respiratory Physiology and Neurobiology 154(3): Waddington, C.H Genetic assimilation. Advanced Genetics 10: West-Eberhard, M.J Developmental Plasticity and Evolution. New York: Oxford University Press. Westerfield, M The Zebrafish Book, a Guide for the Laboratory use of Zebrafish (Danio rerio). 3rd edition, Eugene: University of Oregon Press. Whitehead, A., Triant, D.A., Champlin, D. and Nacci, D Comparative transcriptomics implicates mechanisms of evolved pollution tolerance in a killifish population. Molecular Ecology 19: Wilkes, D., Xie, S.Q., Stickland, N.C., Alami-Durante, H., Kentouri, M., Sterioti, A., Koumoundouros, G., Fauconneau, B. and Goldspink, G Temperature and myogenic factor transcript levels during early development determines muscle growth potential in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) and sea bass (Dicentrarchus labrax). Journal of Experimental Biology 204(16): Xie, S.Q., Mason, P.S., Stickland, N.C., Wilkes, D., Goldspink, G. and Fauconneau, B Lower environmental temperature delays and prolongs myogenic regulatory factor expression and muscle differentiation in rainbow trout (Onchrhynchus mykiss) embryos. Differentiation 68(2-3):

116 Zhang, J., Chu, W. and Fu, G DNA microarray technology and its application in fish biology and aquaculture. Frontiers of Biology in China 4(3): Γεώργα, Ι., Περιβαλλοντικά ελεγχόµενος προγραµµατισµός του φαινοτύπου στο zebrafish, Danio rerio (Hamilton, 1822). ιατριβή µεταπτυχιακού διπλώµατος ειδίκευσης. Τµήµα Βιολογίας. Πανεπιστήµιο Πατρών. Λοϊζίδης, Μ Συνεπίδραση της θερµοκρασίας και της φωτοπεριόδου στο ρυθµό αύξησης, την οντογένεση και το φυλοκαθορισµό του zebrafish, Danio rerio (Hamilton, 1822). ιπλωµατική εργασία. Τµήµα Βιολογίας. Πανεπιστήµιο Πατρών. Πάτσιου, Επίδραση της θερµοκρασίας κατά το εµβρυικό-νυµφικό στάδιο στην αναλογία του φύλου και στη µορφολογία του zebrafish, Danio rerio (Hamilton, 1822). ιπλωµατική εργασία. Τµήµα Βιολογίας. Πανεπιστήµιο Πατρών. Συµεωνίδη, Θερµοεξαρτώµενος οντογενετικός προγραµµατισµός της κολυµβητικής ικανότητας του zebrafish (Danio rerio, Hamilton 1822). ιπλωµατική εργασία. Τµήµα Βιολογίας. Πανεπιστήµιο Πατρών. Χρίστου, Μ Επίδραση της πυκνότητας του πληθυσµού κατά τα πρώιµα οντογενετικά στάδια στο φαινότυπο ενήλικων zebrafish, Danio rerio (Hamilton, 1822). ιπλωµατική εργασία. Τµήµα Βιολογίας. Πανεπιστήµιο Πατρών

117 7. ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ 7.1. Σύσταση και διατήρηση των πειραµατικών πληθυσµών Τα πειράµατα έλαβαν χώρα στο εργαστήριο Ιχθυολογίας του Tµήµατος Βιολογίας του Πανεπιστηµίου Πατρών. Οι πληθυσµοί των ψαριών που µελετήθηκαν προήλθαν από γεννήτορες άγριου τύπου (ZF WT2 F5, Wageningen Agricultural University, The Netherlands). Η διατήρηση και η εκτροφή των νυµφών και των ενήλικων ψαριών πραγµατοποιήθηκε βάσει µεθοδολογίας που περιγράφεται στο The Zebrafish Book (Westerfield, 1995). Τη διατήρηση των πειραµατικών πληθυσµών της παρούσας εργασίας επιµελήθηκε η Σοφία Νικούλη (1 ο πείραµα) και η Έλενα Μήτση (2 ο πείραµα). Οι γεννήτορες διατηρούνταν σε κλειστό σύστηµα κυκλοφορίας και ανανέωσης νερού σε ενυδρεία χωρητικότητας δέκα λίτρων. Το σύστηµα υποστηριζόταν από αντλία ανανέωσης νερού, µηχανικό και βιολογικό φίλτρο, παροχή οξυγόνου και λάµπα αποστείρωσης UV. Η θερµοκρασία διατηρούταν σταθερή στους 28 o C (± 1 o C). Η φωτοπερίοδος, που εφαρµόστηκε, ήταν 14h:10h φώς:σκοτάδι. Καθόλη τη διάρκεια της εκτροφής, ο κορεσµός του νερού σε Ο 2 ήταν >90%, ενώ το ph κυµαινόταν µεταξύ 7,0 και 7,5. Το νερό του συστήµατος παρείχετο από το αστικό δίκτυο επεξεργασµένο πρώτα από το σύστηµα ανάστροφης ώσµωσης (reverse osmosis), για τη ρύθµιση των επιπέδων αλάτων. Όσον αφορά στην εκτροφή των ψαριών, γινόταν ad libitum µε βιοµηχανική τροφή (color growth and health formula By Ocean Nutrition), δύο φορές την ηµέρα. Η διατροφή τους διαφοροποιούταν όταν επρόκειτο να πραγµατοποιηθεί η διαδικασία της αναπαραγωγής., έτσι το τάισµα γινόταν µε ναύπλιους Artemia sp. ή/και µε κατεψυγµένους κύβους σκουληκιών. Τα αυγά που παραλαµβάνονταν από τους γεννήτορες στις τοποθετηµένες γεννήστρες, καταµετρούνταν και εµβαπτίζονταν σε διάλυµα υπεροξειδίου του υδρογόνου (1 ml H 2 O 2 /L νερού) για περίπου δέκα λεπτά, για να εξουδετερωθεί ενδεχόµενη µόλυνση από µύκητες. Μετά το πρώτο 24ωρο µετά τη γονιµοποίησή τους, διαχωρίζονταν στους επιµέρους πειραµατικούς πληθυσµούς και τοποθετούνταν σε µικρότερης κλίµακας κλειστά συστήµατα ενυδρείων (αντίστοιχα αυτού των γεννητόρων). Εκεί βαθµιαία εγκλιµατίζονταν 117

118 στις θερµοκρασιακές συνθήκες ανάπτυξης του κάθε πειράµατος. Η θερµοκρασία διατηρούταν σταθερή µε τη συνδυασµένη χρήση ενός µηχανήµατος ψύξης (Sfilingoi) και ενός θερµοστάτη. Να σηµειωθεί πως οι ροές κυκλοφορίας του νερού ήταν µικρής/ήπιας έντασης. Οι νύµφες αρχικά τρέφονταν από τα αποθέµατα λεκίθου, ενώ κατά την 3 η µε 4 η ηµέρα, που άρχιζε η εκκόλαψη των νυµφών, ταΐζονταν 4 φορές την ηµέρα µε πρωτόζωα του γένους Paramecium. Επιπρόσθετα, κατά την 11 η 15 η ηµέρα, οι νύµφες ταΐζονταν και µε ναύπλιους του γένους Artemia µε την ίδια συχνότητα (4 φορές κατά τη διάρκεια της ηµέρας). Η χρονική στιγµή έναρξης χορήγησης Paramecium sp. ή Artemia sp., ποίκιλλε ανάλογα µε τη θερµοκρασία ανάπτυξης (Γεώργα 2007) Αποµόνωση ολικού RNA µε Nucleospin RNA II Κατά την αποµόνωση ολικού RNA, τα άτοµα θα πρέπει να είναι, όσο το δυνατό περισσότερο, απαλλαγµένα από υπολείµµατα τροφών και ακαθαρσίες. Για το λόγο αυτό, την προηγούµενη ηµέρα, πριν από την αποµόνωση RNA, πραγµατοποιείται νηστεία των νυµφών από τα δυο τελευταία γεύµατα της ηµέρας, ενώ παράλληλα καθαρίζεται το ενυδρείο. Η δειγµατοληψία απαιτεί περίπου 70 άτοµα, τα οποία ζυγίζονται και ακολούθως ψύχονται σε υγρό άζωτο, ούτως ώστε να αποφευχθεί η αποικοδόµηση του RNA από τα ένζυµα του οργανισµού. Στη συνέχεια, πραγµατοποιείται η αποµόνωση ολικού RNA σύµφωνα µε το πρωτόκολλο αποµόνωσης µε Nucleospin RNA II. Τα βήµατα που έλαβαν χώρα είναι τα εξής: 1. Οµογενοποίηση δείγµατος: σύνθλιψη του ιστού σε πορσελάνινο γουδί µε υγρό άζωτο µέχρι να σχηµατισθεί κονιορτοποίηµα 2. Λύση των κυττάρων: προσθήκη διαλύµατος RA1 και β-µερκαπτοαιθανόλης (σε αναλογία 1ml RA1 και 35µl β-µερκαπτοαιθανόλης ανά 100mgr ιστού) στον κονιορτοποιηµένο ιστό και οµογενοποίηση σε γυάλινο γουδί 3. Φιλτράρισµα του διαλύµατος: µεταφορά 350µl διαλυµένου ιστού σε Nucleospin Filter Unit τοποθετηµένο σε tube και φυγοκέντρηση για 1 λεπτό στα g 4. Αδιαλυτοποίηση νουκλεοτιδίων: απόρριψη του Nucleospin Filter Unit και 118

119 µεταφορά του διηθήµατος σε καινούργιο tube. Προσθήκη 350µl αιθανόλης 70% και καλή ανάµειξη 5. έσµευση νουκλεοτιδίων: µεταφορά του διαλύµατος σε κολώνα Nucleospin RNA II τοποθετηµένη σε νέο tube και φυγοκέντρηση για 1 λεπτό στα g. Απόρριψη του διηθήµατος και µεταφορά της κολώνας σε καθαρό tube 6. Αφαλάτωση της µεµβράνης: προσθήκη 350µl διαλύµατος MDB (Membrane Desalting Buffer) στην κολώνα και φυγοκέντρηση για 1 λεπτό στα g. Απόρριψη διηθήµατος και µεταφορά της κολώνας σε νέο tube Η αποµάκρυνση των αλάτων θα κάνει πιο αποτελεσµατική την πέψη της DNase I στο επόµενο βήµα. Εάν το διήθηµα έρθει σε επαφή µε την κολώνα τότε αυτό απορρίπτεται, η κολώνα µεταφέρεται σε καινούργιο tube και φυγοκεντρείται ξανά στα g για 30 δευτερόλεπτα. 7. Πέψη του DNA: προετοιµασία του διαλύµατος DNase I (ανάµειξη 90µl DNase reaction buffer και 10µl διαλύµατος DNase για κάθε κολώνα) και προσθήκη 95µl από το διάλυµα στο κέντρο της κολώνας. Επώαση για λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου 8. Ξέπλυµα και στέγνωµα της µεµβράνης: Προσθήκη 200µl διαλύµατος RA2 στην κολώνα και φυγοκέντρηση για 1 λεπτό στα g. Απόρριψη διηθήµατος και µεταφορά της κολώνας σε νέο tube (το διάλυµα RA2 απενεργοποιεί τη DNase) Προσθήκη 600µl διαλύµατος RA3 στην κολώνα και φυγοκέντρηση για 1 λεπτό στα g. Απόρριψη διηθήµατος και µεταφορά της κολώνας σε νέο tube Προσθήκη 250 µl διαλύµατος RA3 στην κολώνα και φυγοκέντρηση για 2 λεπτά στα g. Απόρριψη διηθήµατος και µεταφορά της κολώνας σε αποστειρωµένο eppendorf 9. Έκλουση RNA: προσθήκη 100ml αποστειρωµένου νερού (RNase-free) και φυγοκέντρηση για 1 λεπτό στα g. Απόρριψη κολώνας και φύλαξη του RNA στους -80 o C Σηµείωση: από κάθε πληθυσµό των τριών θερµοκρασιακών συνθηκών έγιναν τρεις αποµονώσεις ολικού RNA (τρία aliquots). 119

120 7.3. Υπολογισµός της συγκέντρωσης του RNA µε φωτοµέτρηση Για τον υπολογισµό της συγκέντρωσης του RNA λαµβάνουν χώρα τα εξής βήµατα: Αραίωση 5µl RNA σε 245µl RNase-free νερό (αραίωση 1:50) Μέτρηση της οπτικής απορρόφησης O.D. στα 260nm και 280nm Υπολογισµός του λόγου O.D. 260nm/280nm, που δείχνει την καθαρότητα του RNA και µε τιµή που πρέπει να κυµαίνεται µεταξύ 1,7-2 Υπολογισµός της συγκέντρωσης του RNA, λαµβάνοντας υπ όψιν ότι 1 O.D. αντιστοιχεί σε 40µg RNA/ml διαλύµατος. Ο τύπος που δίνει τη συγκέντρωση του RNA είναι : C RNA = O.D. 260nm x 40 x 50 * = mg RNA/ml διαλύµατος * όπου 50 είναι η αραίωση που έγινε στο αρχικό δείγµα RNA 7.4. Ηλεκτροφόρηση του RNA σε πήκτωµα αγαρόζης Για τον έλεγχο της ποιότητας του αποµονωµένου RNA πραγµατοποιήθηκε ηλεκτροφόρηση µικρού δείγµατος σε πήκτωµα αγαρόζης. Η ηλεκτροφόρηση παρέχει οπτικά την κατάσταση των δυο ριβοσωµικών RNA, 18S και 28S rrna, τα οποία εµφανίζονται ως δυο ζώνες στο πήκτωµα ηλεκτροφόρησης, µετά από έκθεσή του σε υπεριώδη ακτινοβολία. Σε κάθε δείγµα RNA (πριν φορτωθεί στο πήκτωµα ηλεκτροφόρησης) προστίθεται 1µl EtBr (αραίωση 1:100, 99µl DEP Η 2 Ο + 1µl πυκνό EtBr). Το EtBr προσδένεται στο RNA και έχει την ιδιότητα να φθορίζει στο υπεριώδες φως Παρασκευή του πηκτώµατος αγαρόζης 1. Σε κωνική φιάλη µεταφέρονται 0,75gr αγαρόζης και διαλύονται σε 60ml ddh 2 O 2. Το διάλυµα αγαρόζης θερµαίνεται µέχρι να σχηµατισθεί διαυγές διάλυµα, οπότε αφήνεται να κρυώσει µέχρι περίπου τους 50 o C 3. Προσθήκη 7,5ml διαλύµατος 10x MOPs 4. Προσθήκη 13,4ml διαλύµατος φορµαλδεΰδης 5. Μεταφορά του διαλύµατος σε ειδικό σκαφάκι µε χτενάκι και αφήνεται να πήξει, 120

121 οπότε το σκαφάκι µεταφέρεται στη συσκευή ηλεκτροφόρησης 6. Προσθήκη 350ml διαλύµατος 1x MOPs (αραίωση 40ml 10x MOPs σε 360ml νερό) στη συσκευή ηλεκτροφόρησης Προετοιµασία των δειγµάτων RNA για ηλεκτροφόρηση 1. Με βάση τη συγκέντρωση του RNA, που προσδιορίστηκε φωτοµετρικά, 1µgr RNA ανάγεται σε µl και προστίθεται RNase-free νερό µέχρι τελικό όγκο ίσο µε 7µl 2. Προσθήκη ίσου όγκου Sample Coctail, 7µl, στο δείγµα και ακολουθεί ήπια ανάδευση 3. Θέρµανση του δείγµατος στους 65 o C για 5 λεπτά 4. Προσθήκη 1µl Loading Buffer και ακολουθεί καλή ανάµειξη για 30 δευτερόλεπτα 5. Αποµακρύνεται το χτενάκι από το πήκτωµα ηλεκτροφόρησης και φορτώνεται το δείγµα 6. Εφαρµόζεται τάση 35 volt για 2 ώρες, µέχρι να αναπτυχθεί καλά η ηλεκτροφόρηση και να είναι ευδιάκριτες οι ζώνες 7. Έκθεση του πηκτώµατος σε συσκευή υπεριώδους ακτινοβολίας και παρατήρηση των ζωνών 121

122 7.5. Πολυπαραµετρική στατιστική ανάλυση των προτύπων από το PM-MM µοντέλο Ανάλυση των 20 µεταγραφικών προτύπων Α. Β. Εικόνα 7.1: Ιεραρχική οµαδοποίηση µε χρήση (A) της ευκλείδειας και (B) της απόστασης Manhattan. Α. Β. Εικόνα 7.2: Ιεραρχική οµαδοποίηση µε χρήση της συσχέτισης Pearson (Α). Στο (Β) κλαδόγραµµα έχουν επισηµανθεί µε διαφορετικά χρώµατα οι 3 κλάδοι, όπου οµαδοποιούνται τα πρότυπα. 122

123 Εικόνα 7.3: Η PCA αποτυπώνει τα δείγµατα στο τρισδιάστατο χώρο. Με γαλάζιο χρώµα τα δείγµατα του 1 ου πειράµατος και µε ροζ του 2 ου, ενώ µε πράσινο τα δείγµατα των προτύπων των 10d. Με το κίτρινο βέλος υποδεικνύεται το 2_28C_10d_A. 123

124 Α. Β. Γ. Εικόνα 7.4: PCA δυο διαστάσεων. Α: PC1vsPC2, B: PC2vsPC3, Γ: PC1vsPC3. Με βέλη υποδεικνύονται τα προς εξαίρεση δείγµατα. Τα ποσοστά για τις πρώτες κύριες συνιστώσες: PC1=31,5%, PC2=19,4% και PC3=12,1%. 124

125 Ανάλυση των 17 µεταγραφικών προτύπων Α. Β. Εικόνα 7.5: Ιεραρχική οµαδοποίηση µε χρήση (A) της ευκλείδειας και (B) της απόστασης Manhattan. ιακρίνεται ο κλάδος των προτύπων του 1 ου πειράµατος (γαλάζιο χρώµα µπάρας), ο κλάδος των προτύπων των 10d (πράσινο) και ο κλάδος των προτύπων του 2 ου πειράµατος (ροζ). Εικόνα 7.6: Ιεραρχική οµαδοποίηση µε χρήση της συσχέτισης Pearson. ιακρίνεται ο κλάδος των προτύπων του 1 ου πειράµατος (γαλάζιο χρώµα µπάρας), ο κλάδος των προτύπων των 10d (πράσινο) και ο κλάδος των προτύπων του 2 ου πειράµατος (ροζ). 125

126 Εικόνα 7.7: Η PCA αποτυπώνει τα δείγµατα στο τρισδιάστατο χώρο. Με γαλάζιο χρώµα τα δείγµατα του 1 ου πειράµατος και µε ροζ του 2 ου, ενώ µε πράσινο τα δείγµατα των προτύπων των 10d. Με το κίτρινο βέλος υποδεικνύεται το 2_28C_10d_A. 126

127 Ανάλυση των 20 µεταγραφικών προτύπων µετά την Κανονικοποίηση των 28 Α. Β. Εικόνα 7.8: Ιεραρχική οµαδοποίηση µε χρήση (A) της ευκλείδειας και (B) της απόστασης Manhattan. Εικόνα 7.9: Ιεραρχική οµαδοποίηση µε χρήση της συσχέτισης Pearson. 127

128 Εικόνα 7.10: Η PCA αποτυπώνει τα δείγµατα στο τρισδιάστατο χώρο. 128

129 Ανάλυση των 17 µεταγραφικών προτύπων µετά την Κανονικοποίηση των 28 Α. Β. Εικόνα 7.11: Ιεραρχική οµαδοποίηση µε χρήση (A) της ευκλείδειας και (B) της απόστασης Manhattan. Εικόνα 7.12: Ιεραρχική οµαδοποίηση µε χρήση της συσχέτισης Pearson. 129