Τεχνολογία πρωτεϊνικής μεταγωγής

Transcript

1 Τεχνολογία πρωτεϊνικής μεταγωγής Η τεχνολογία πρωτεϊνικής μεταγωγής αναφέρεται στη μεθοδολογία που χρησιμοποιεί μικρά πεπτίδια, τα οποία αποτελούνται από λιγότερα από 30 αμινοξέα και είναι ικανά να διαπεράσουν σχεδόν όλες τις βιολογικές μεμβράνες. Αυτά τα μικρά πεπτίδια αποκαλούνται PTDs ( Protein Transduction domains ) ή CPPs ( Cell Penetrating Peptides). Τα CPPs έχουν τη δυνατότητα να διαπερνούν σχεδόν όλες τις μεμβράνες. Τα πιο κοινά CPPs είναι θετικά φορτισμένα, αν και έχουν καταγραφεί και μερικά ανιονικά ή υδρόφοβα. Ανάλογα με την προέλευσή τους, μπορούμε να διακρίνουμε τρεις κύριες κατηγορίες : a) Πεπτίδια που προέρχονται από ενδογενείς πρωτεΐνες (ιών, δροσόφιλας κτλ) b) Χιμαιρικά πεπτίδια, που σχηματίζονται από τη σύντηξη δύο φυσικών ακολουθιών c) Συνθετικά CPPs, τα οποία σχεδιάζονται βασισμένα σε μελέτες δομήςδραστικότητας των φυσικών CPPs. Τα CPPs μπορούν να μεταφέρουν μέσα στα κύτταρα μία ποικιλία από ομοιοπολικά ή μη-ομοιοπολικά συνδεδεμένα φορτία, όπως μικρά μόρια (κυκλοσπορίνη, δοξορουβικίνη) αλλά και sirnas και μακρομόρια (πρωτεΐνες, πλασμίδια, λιποσώματα, δίκλωνο DNA). H μεταφορά των φορτίων (μικρού μεγέθους έως μεγάλες πρωτεΐνες ) έχει πραγματοποιηθεί με επιτυχία σε πειράματα in vitro και in vivo. Η πρώτη επίδειξη πρωτεϊνικής μεταγωγής με την τεχνολογία των CPPs σε πειραματόζωο καταγράφηκε από τον Dowdy και την ομάδα του(schwarze, Ho, Vocero-akbani, & Dowdy, 1999), όπου και έγινε ενδοπεριτοναϊκή έγχυση της β- γαλακτοσιδάσης, συντηγμένης με το ΤΑΤ σε ποντίκι και βρέθηκε σε αρκετούς ιστούς συμπεριλαμβανομένου και του εγκεφάλου (Bechara & Sagan, 2013; Carter, Lau, Tosh, Ward, & Mrsny, 2013). Στον παρακάτω πίνακα απεικονίζονται μερικά αντιπροσωπευτικά CPPs. 1

2 Πίνακας 1 : Χαρακτηριστικοί αντιπρόσωποι των CPPs, η προέλευση και η αλληλουχία τους (Papadopoulou & Tsiftsoglou, 2013) 2

3 Παραδείγματα κλινικών δοκιμών των CPPs Πρόσφατα έχουν χρησιμοποιηθεί CPPs in vivo για να στοχεύσουν καρκινικά κύτταρα που υπερεκφράζουν την μεταλλοπρωτεϊνάση-2. Η θεραπεία ποικίλλων μολυσματικών ασθενειών με αναστολή του NF-κΒ ήταν αποτελεσματική in vivo με τη σύζευξη των αναστολέων του ΝF-κΒ σε διάφορα CPPs. Τέλος έχει γίνει επιτυχής στόχευση όγκων in vivo για την (D) R8-δοξορουβικίνη (Bechara & Sagan, 2013). A.15 Μηχανισμοί μεταφοράς των CPPs Προκειμένου να ασκήσουν το θεραπευτικό τους ρόλο, τα CPPs πρέπει να διαπεράσουν την κυτταρική μεμβράνη και, αν χρειάζεται, να στοχεύσουν και συγκεκριμένο οργανίδιο. Η ενδοκυτταρική μεταγωγή εξαρτάται από το μέγεθος, τη δομή, τη φύση του φορτίου, την πολικότητα και την υδροφοβικότητα. Για παράδειγμα αναφορικά με τα κατιονικά CPPs (πλούσια σε αργινίνη και λυσίνη), η είσοδος στα κύτταρα ξεκινά με ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις και δεσμούς υδρογόνου ανάμεσα στην ομάδα της γουανιδίνης της αργινίνης και στα αρνητικά φορτισμένα στοιχεία της κυτταρικής μεμβράνης (όπως οι πρωτεογλυκάνες θειικής ηπαρίνης, τα φωσφορικά και οι καρβοξυλομάδες) (Papadopoulou & Tsiftsoglou, 2013). Αν και ο ακριβής μηχανισμός μεταφοράς δεν είναι ακόμα πλήρως γνωστός έχουν προταθεί αρκετά μοντέλα, όπως: 1) το σύστημα ανεστραμμένων μικκυλίων. 2) το σύστημα άμεσης διείσδυσης. και 3) το σύστημα της ενδοκυττάρωσης. Το τελευταίο φαίνεται να είναι και το πιο αποδεκτό. Η ενδοκυττάρωση των CPPs αποτελείται από δύο βήματα: ενδοκυτταρική είσοδος, ακολουθούμενη από ενδοσωμική διαφυγή. Αυτό είναι σημαντικό ώστε να αποφευχθεί η καταστροφή του φορτίου στα λυσοσώματα και το «φορτίο» να φτάσει στο στόχο του. Η ενδοκυττάρωση είναι μία φυσιολογική διαδικασία που συμβαίνει στα κύτταρα. Μπορεί να ενεργοποιηθεί από ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις με τις πρωτεογλυκάνες της επιφάνειας των κυττάρων ή με απευθείας αλληλεπίδραση με τη μεμβράνη. Όταν δεσμεύονται στα GAGs (γλυκοζαμινογλυκάνη = οικογένεια πολυσακχαριτών υψηλού μοριακού βάρους που περιέχουν αμινοσάκχαρο και σχηματίζουν προστατευτικά περιβλήματα γύρω από τα ζωικά κύτταρα), τα CPPs θα μπορούσαν α) να εισέλθουν ακολουθώντας τον κύκλο ανακύκλωσης των GAGs, τα οποία είναι συνεχώς εσωτερικευμένα ή β) πιο αποτελεσματικά τα CPPs μπορούν να προκαλέσουν ενδοκύττωση μέσω της ομαδοποίησης των GAGs, ενεργοποίησης ενδοκυτταρικών σημάτων και αναδιαμόρφωσης της ακτίνης. Όλοι οι γνωστοί τρόποι 3

4 πινοκυττάρωσης έχουν περιγραφεί για την είσοδο των συμπλεγμάτων CPPsφορτίο. Η μακροπινοκύττωση είναι ο πιο κοινός τρόπος ενδοκυττάρωσης των CPPs (Bechara & Sagan, 2013). Εικόνα 1 : Απεικόνιση μηχανισμών μεταφοράς των CPPs (Farkhani et al., 2014) Τοξικότητα των CPPs Η όλο και αυξανόμενη χρήση των CPPs σε κλινικές δοκιμές αλλά και ως εργαλείων έρευνας καθιστά απαραίτητη την εκτίμηση της τοξικότητάς τους. Ο έλεγχος της κυτταροτοξικότητας είναι απαραίτητος καθώς πλέον δεν χρησιμοποιούνται μόνο σε πειράματα in vitro αλλά και σε in vivo. Τα CPPS γενικά χαρακτηρίζονται από μεγάλη εξειδίκευση αν και φυσική αστάθεια, πρωτεόλυση, συνάθροιση, αιμολυτική δραστηριότητα (ως ένδειξη κυτταρικής διαταραχής) και ανοσογονικότητα μπορούν να εμφανιστούν κατά τη χρήση τους (Papadopoulou & Tsiftsoglou, 2011). 4

5 Έρευνες έχουν δείξει ότι η τοξικότητα ποικίλλει ανάλογα με το φορτίο, τον τύπο του κυττάρου, τη δόση καθώς και τη σειρά των πεπτιδίων, το μήκος, τη θέση σύζευξης και τα φυσικά και δομικά χαρακτηριστικά. Ως αποτέλεσμα της κατιονικής φύσης τους, αυτά τα μικρά πεπτίδια ασκούν αρκετές επιδράσεις στην κυτταρική μεμβράνη (διαρροή της μεμβράνης), στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και στη βιωσιμότητα (μειώνουν τη βιωσιμότητα σε υψηλές συγκεντρώσεις). Μερικές έρευνες έδειξαν ότι η συστηματική χορήγηση ορισμένων CPPs σε ανεκτές δόσεις δεν προκάλεσε μεγάλη καταστροφή των ιστών. Ωστόσο υπήρξαν και κάποιες που αφορούσαν εκτεταμένη τοξικότητα σε ήπαρ και νεφρούς, μετά από έγχυση μεγάλων ποσοτήτων. Η βελτίωση της εξειδίκευσης των CPPs για ένα κύτταρο ή ιστό θα μπορούσε να μειώσει τη χορηγούμενη δόση και να ελαχιστοποιηθεί έτσι και η συστηματική τοξικότητα (Lee, Castagner, & Leroux, 2013). Τελειώνοντας, η τεχνολογία πρωτεϊνικής μεταγωγής είναι περισσότερο ασφαλής συγκριτικά με τη γονιδιακή θεραπεία, διότι δεν επηρεάζει την ακεραιότητα του γονιδιώματος του ξενιστή. Γονιδιακή θεραπεία Φυσική ικανότητα των ιών να εισέρχονται στα κύτταρα με δυνατότητα έκφρασης των ένθετων γονιδίων στα κύτταρα στόχο Πρωτεϊνική θεραπεία ενδοκυττάρια μεταφορά εξωγενώς χορηγούμενων ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών, active Τεχνολογία ΠΡΩΤΕΪΝΙΚΗΣ ΜΕΤΑΓΩΓΗΣ Modified from Ogawa et al, Acta Med. Okayama, 2009, Vol. 63, No. 1, pp. 1-7 Ωστόσο υπάρχουν και αρκετά προβλήματα που πρέπει να επιλυθούν και παρουσιάζονται στον παρακάτω πίνακα. 5

6 Πίνακας 2 : «Εμπόδια-προβλήματα» και πιθανές λύσεις στη χρήση των CPPs στη «θεραπευτική» (Papadopoulou & Tsiftsoglou, 2013). Το πεπτίδιο TAT Το ΤΑΤ πεπτίδιο χρησιμοποιείται ευρέως στην τεχνολογία των PTDs και αποτελεί ένα ενδεκαπεπτίδιο (YGRKKRRQRRR) που είναι εμπλουτισμένο κατά κύριο λόγο με βασικά αμινοξέα (αργινίνη και λυσίνη ). Το ΤΑΤ αναγνωρίστηκε ως PTD όταν παρατηρήθηκε ότι η ΤΑΤ πρωτεΐνη του HIV-1 (Transactivator factor of Transcription) ήταν ικανή να διαπεράσει την κυτταρική μεμβράνη και να μεταδιεγείρει ετερόλογες πρωτεΐνες ενδοκυτταρικά (Papadopoulou & Tsiftsoglou, 2011). H ΤΑΤ πρωτεΐνη του ιού, αφού εκφραστεί σε κύτταρα μολυσμένα με τον ιό HIV-1 εκκρίνεται και εισχωρεί σε γειτονικά μολυσμένα κύτταρα, όπου και ενεργοποιεί τη μεταγραφή ιικών γονιδίων. Η ΤΑΤ πρωτεΐνη είναι ένα μικρό πολυπεπτίδιο που αποτελείται από 101 αμινοξέα και κωδικοποιείται από δύο εξώνια. Δεδομένα από μελέτες NMR δείχνουν ότι η δομή της είναι εύκαμπτη και δεν υπάρχουν εμφανή στοιχεία δευτεροταγούς δομής. Διακρίνονται 5 περιοχές στα δύο εξώνια της πρωτεΐνης. Στο πρώτο εξώνιο (1-72 αμινοξέα) υπάρχουν οι εξής θέσεις: 1) ένα αμινο-τελικό άκρο (1-21 αμινοξέα) 2) μια περιοχή που έχει 7 κυστεϊνες (22-37 αμινοξέα) 3)μια περιοχή 6

7 σηματοδότησης για μεταφορά στον πυρήνα (38-48 αμινοξέα) και 4) μια βασική περιοχή, εμπλουτισμένη με λυσίνη και αργινίνη. Το δεύτερο εξώνιο ξεκινά στη θέση 73 και έχει μια όχι τόσο συγκεκριμένη σειρά. Ύστερα από αρκετές απαλοιφές αμινοξέων από το πολυπεπτίδιο κατέληξαν στην αλληλουχία (YGRKKRRQRRR) η οποία αντιστοιχεί στα αμινοξέα της πλήρους πρωτεΐνης ΤΑΤ (Fittipaldi & Giacca, 2005). Domains of the HIV-1 TAT protein TAT peptide Adv Drug Deliv Rev Feb 28;57(4): Tο ΤΑΤ ως CPP, λόγω της ικανότητάς του να στοχεύει τον πυρήνα, έχει ήδη χρησιμοποιηθεί για τη μεταγωγή πλασμιδιακού DNA ή βιολογικών μορίων, όπως οι μεταγραφικοί καταστολείς p53 και p16. Επιπλέον το ΤΑΤ ως CPP προτείνεται να χρησιμοποιηθεί για τη λυσοσωμική μεταφορά θεραπευτικών πρωτεϊνών, στα πλαίσια της πρωτεϊνικής θεραπείας αντικατάστασης {ERT: (Enzyme Replacement Therapy)} σε μερικές λυσοσωμικές διαταραχές. 7

8 Αναφορικά με τον μηχανισμό εισόδου στα κύτταρα έρευνες έδειξαν ότι το ΤΑΤ μπορεί να διεγείρει την πρόσληψή του με μακροπινοκύττωση, όπου η εσωτερίκευση γίνεται με ένα μηχανισμό δημιουργίας πόρων και το ΤΑΤ αλληλεπιδρά με την ακτίνη. Κάποιες άλλες εργασίες αναφέρουν ότι μετά την πρόσδεση του και την ομαδοποίηση των πρωτεογλυκανών, το πεπτίδιο θα επάγει την ενεργοποίηση μια μικρής GTPase, της Rac1, η οποία θα ανασχηματίσει την ακτίνη και θα επάγει την μακροπινοκύττωση. Τέλος ο Dowdy και η ομάδα του επιβεβαίωσαν την μακροπινοκυττάρωση ως το κύριο μονοπάτι το οποίο απαιτεί την παρουσία δραστικών πρωτεϊνών της μεμβράνης αλλά όχι επιφανειακών GAGs ή σιαλικών οξέων (Bechara & Sagan, 2013)(Schwarze et al., 1999). Κατασκευή πρωτεϊνών για ενδοκυτταρική μεταφορά Τα στάδια για τη βακτηριακή παραγωγή της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης σύντηξης ΤΑΤ-Χ που θα χρησιμοποιηθεί για μεταγωγή είναι τα εξής: Ι. Ολικό RNA που έχει απομονωθεί (π.χ. από αίμα υγιούς) χρησιμεύει ως πρότυπο για RT-PCR για να ενισχυθεί η «CDS: coding sequence» αλληλουχία που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη Χ του ενδιαφέροντος, ΙΙ III)Το προϊόν της PCR θα κλωνοποιηθεί είτε στον φορέα έκφρασης ptat/ptat- HA σε πλαίσιο με την ακολουθία για την περιοχή του ΤΑΤ είτε σε έναν άλλο κατάλληλα τροποποιημένο φορέα έκφρασης που φέρει την αλληλουχία του ΤΑΤ πεπτιδίου, IV) Ακολουθεί ο μετασχηματισμός-μεταμόρφωση των βακτηρίων, V) και η επαγωγή έκφρασης της πρωτεΐνης, VI) Τα βακτηριακά κύτταρα συλλέγονται, λύονται και τελικά η συντηγμένη πρωτεΐνη (ΤΑΤ-Χ) καθαρίζεται. Η ανάκτηση της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης σε διαλυτή μορφή μπορεί να γίνει με τη χρήση διαφόρων ουσιών, όπως χαοτροπικοί παράγοντες ή διάλυμα L- Αργινίνης. Η διαλυματοποιημένη πρωτεΐνη μπορεί στη συνέχεια να εισαχθεί σε καλλιέργειες κυττάρων και να μελετηθεί η δράση της (Papadopoulou & Tsiftsoglou, 2011). 8

9 Εικόνα 2 : Στάδια παραγωγής ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών σε σύζευξη με το πεπτίδιο ΤΑΤ, σε βακτήρια (Papadopoulou & Tsiftsoglou, 2011) Βιβλιογραφία Ντάσκα Αγορίτσα, πτυχιούχος του τμήματος Φαρμακευτικής: Διπλωματική εργασία, υπό την επίβλεψη της κ. Παπαδοπούλου Λευκοθέας, Αναπληρώτριας Καθηγήτριας του τμήματος Φαρμακευτικής. Bechara C 1, Sagan S. Cell-penetrating peptides: 20 years later, where do we stand? FEBS Lett Jun 19;587(12): Carter E 1, Lau CY, Tosh D, Ward SG, Mrsny RJ. Cell penetrating peptides fail to induce an innate immune response in epithelial cells in vitro: implications for continued therapeutic use. Eur J Pharm Biopharm Sep;85(1): Farkhani SM 1, Valizadeh A 2, Karami H 3, Mohammadi S 4, Sohrabi N 5, Badrzadeh F 6. Cell penetrating peptides: efficient vectors for delivery of nanoparticles, nanocarriers, therapeutic and diagnostic molecules. Peptides Jul;57: Foltopoulou PF 1, Tsiftsoglou AS, Bonovolias ID, Ingendoh AT, Papadopoulou LC. Intracellular delivery of full length recombinant human mitochondrial L-Sco2 protein into the mitochondria of permanent cell lines and SCO2 deficient patient's primary cells. Biochim Biophys Acta Jun;1802(6):

10 Lee SH 1, Castagner B, Leroux JC.Is there a future for cell-penetrating peptides in oligonucleotide delivery? Eur J Pharm Biopharm Sep;85(1):5-11. Papadopoulou LC 1, Tsiftsoglou AS. Transduction of human recombinant proteins into mitochondria as a protein therapeutic approach for mitochondrial disorders. Pharm Res Nov;28(11): Papadopoulou LC 1, Tsiftsoglou AS The potential role of cell penetrating peptides in the intracellular delivery of proteins for therapy of erythroid related disorders. Pharmaceuticals (Basel) Jan 7;6(1): Schwarze SR 1, Ho A, Vocero-Akbani A, Dowdy SF. In vivo protein transduction: delivery of a biologically active protein into the mouse. Science Sep 3;285(5433):