ΣΗΜΕΙΩΣΕΙΣ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ

Transcript

1 ΤΜΗΜΑ ΓΕΩΠΟΝΙΚΗΣ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΓΕΩΠΟΝΙΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΣΗΜΕΙΩΣΕΙΣ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΖΩΩΝ ΕΛΕΝΗ ΝΤΟΥΝΗ ΒΙΟΛΟΓΟΣ, Ph.D. Ακαδηµαϊκό έτος

2 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Τεχνολογίες Λειτουργικής Γονιδιωµατικής Με την εκθετική αύξηση του αριθµού των γονιδίων που αποκαλύφθηκαν από τα προγράµµατα αποκωδικοποίησης του γονιδιώµατος διαφόρων οργανισµών κρίνεται απαραίτητη η ανάπτυξη αποτελεσµατικών µεθόδων για την εύρεση της λειτουργίας κάθε γονιδίου. Τα γενετικά τροποποιηµένα στελέχη ποντικών αποτελούν ένα ιδιαίτερα χρήσιµο εργαλείο στον τοµέα της Λειτουργικής Γονιδιωµατικής, το νέο κλάδο της Μοριακής Βιολογίας που έρχεται να αναδείξει την λειτουργία (ες) κάθε γονιδίου. Κατά τη διάρκεια των τελευταίων δέκα χρόνων, έγινε δυνατή η δηµιουργία σχεδόν κάθε είδους µετάλλαξης στο γονιδίωµα του ποντικού µε τη βοήθεια δύο προσεγγίσεων, της αντίστροφης γενετικής και της πρόσθιας γενετικής (εικόνα 1). ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΚΗ ΓΟΝΙ ΙΩΜΑΤΙΚΗ ΑΝΤΙΣΤΡΟΦΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ (γονίδιο φαινότυπος) Πρόσθεση εξωγενών γονιδίων (διαγονιδιακά) Τροποποίηση ενδογενών γονιδίων Αφαίρεση γονιδίων (knockout) Στοχευµένη µεταλλαξογένεση γονιδίων Ελεγχόµενη έκφραση γονιδίων (conditional) Εικόνα 1. Κλάδοι της Λειτουργικής Γονιδιωµατικής ΠΡΟΣΘΙΑ ΓΕΝΕΤΙΚΗ (φαινότυπος γονίδιο) Τυχαία µεταλλαξογένεση Στην αντίστροφη γενετική, ο ερευνητής έχοντας αποµονώσει το γονίδιο που µελετά, µπορεί να το τροποποιήσει σε επίπεδο οργανισµού και να µελετήσει το αποτέλεσµα της γενετικής επέµβασης µε την παρατήρηση ενός φαινοτύπου. Η προσέγγιση αυτή επιτρέπει την εισαγωγή νέων γονιδίων σε ολόκληρους οργανισµούς (διαγονιδιακά ποντίκια transgenic mice), την κατευθυνόµενη απενεργοποίηση ή µεταλλαξογένεση 2

3 ενδογενών γονιδίων σε όλα (knockout) ή σε επιλεγµένα κύτταρα του οργανισµού (conditional mutants) και προσφέρει ένα in vivo σύστηµα για την αναγνώριση γονιδίων που καθορίζουν τη οµαλή λειτουργία του οργανισµού ή που ευθύνονται για ασθένειές του (1). Η πρόσθια γενετική ακολουθεί την τακτική της κλασικής γενετικής, παρατηρώντας δηλαδή ένα φαινότυπο ακολουθεί η εύρεση του µεταλλαγµένου γονιδίου χρησιµοποιώντας ειδικές διασταυρώσεις και γενετικές αναλύσεις. Μιας και οι αυθόρµητες µεταλλάξεις είναι σπάνιες στη φύση, λόγω της ευεργετικής δράσης των επιδιορθωτικών ενζύµων, οι ερευνητές επάγουν τη δηµιουργία τυχαίων µεταλλάξεων και συνεπώς νέων φαινοτύπων µε τη χρήση χηµικών µεταλλαξογόνων, όπως η αιθυλνιτροσουρία. 3

4 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 ο Τεχνολογία ιαγονιδιακών ζώων ιαγονιδιακοί, ονοµάζονται οι οργανισµοί αυτοί στους οποίους έχει τροποποιηθεί το γενετικό τους υλικό µε την εισαγωγή «ξένου» DNA. Το ξένο γενετικό υλικό µεταβιβάζεται στη συνέχεια µέσω των γεννητικών κυττάρων στους απογόνους όπου όλα τα κύτταρα περιέχουν το ίδιο τροποποιηµένο γενετικό υλικό. Τα πρώτα διαγονιδιακά ποντίκια δηµοσιεύθηκαν το 1982, στα οποία είχε γίνει παρέµβαση στα γονίδια που καθορίζουν την ανάπτυξη. Λίγα χρόνια αργότερα δηµιουργήθηκε το πρώτο ποντίκι το οποίο είχε την ικανότητα να παράγει ένα φάρµακο για ανθρώπινη χρήση, τον ιστικό ενεργοποιητή πλασµινογόνου (tpa) - που δρα ενάντια στους θρόµβους. Σήµερα, σχεδόν όλα τα διαγονιδιακά ποντίκια δηµιουργούνται µε µικροένεση του ξένου DNA σ έναν από τους δύο προπυρήνες του γονιµοποιηµένου ωαρίου, έναν προερχόµενο από το σπερµατοζωάριο και έναν από το ωάριο, που µε τη σύντηξή τους θα προκύψει ο πυρήνας του εµβρύου στο στάδιο του ενός κυττάρου. Στην συνέχεια τα ζυγωτά µεταφέρονται στον ωαγωγό µιας θετής µητέρας όπου και αναπτύσσονται φυσιολογικά και οι απόγονοι που θα γεννηθούν ελέγχονται για την παρουσία του διαγονιδίου (εικόνα 2). Εικόνα 2. Τα στάδια της διαγένεσης 4

5 Ένα οποιοδήποτε κλωνοποιηµένο τµήµα DNA, είτε cdna είτε γονιδιωµατικό, µπορεί να εισαχθεί µε µικροένεση στον προπυρήνα αφού αποµακρυνθεί πρώτα απ αυτό η περιοχή του φορέα κλωνοποίησης. Η ενσωµάτωση γίνεται τυχαία σε µία ή περισσότερες θέσεις του γονιδιώµατος του ζυγωτού. Επίσης, µπορεί να ενσωµατωθεί ένα µόνο αντίγραφο ή περισσότερα που συνήθως είναι διευθετηµένα στη σειρά µε κοινό προσανατολισµό κεφαλής-ουράς (head to tail). Η επιλογή ενός ιστοειδικού υποκινητή εξασφαλίζει τη δυνατότητα έκφρασης του διαγονιδίου επιλεκτικά σε συγκεκριµένα κύτταρα του διαγονιδιακού ζώου. Παρόλα αυτά η έκφραση ενός διαγονιδίου επηρεάζεται αρκετά συχνά από την µεταγραφική κατάσταση της γειτονικής χρωµατίνης µε αποτέλεσµα είτε την εκτοπική έκφραση του διαγονιδίου δηλ. έκφραση και σε άλλους ιστούς είτε την αναστολή της έκφρασής του. Αν ένα γονίδιο ενσωµατωθεί σε ετεροχρωµατίνη, δηλαδή σε ανενεργό χρωµατίνη, τότε το γονίδιο δεν θα εκφραστεί. Επίσης, η ύπαρξη ενός ισχυρού ενισχυτή κοντά στη θέση ενσωµάτωσης του διαγονιδίου κατευθύνει την έκφραση του σε συγκεκριµένους κυτταρικούς τύπους. Υπάρχουν όµως θέσεις ελέγχου περιοχών (locus control regions), που όταν συµπεριληφθούν στη διαγονιδιακή κατασκευή, συµβάλουν στην υπερέκφραση του διαγονιδίου ανάλογα µε τον αριθµό των αντιγράφων και ανεξάρτητα από τη θέση ενσωµάτωσής του. H έκφραση ενός διαγονιδίου εξαρτάται από: 1. Τον υποκινητή, δηλ. αν είναι ισχυρος ή ιστοειδικός 2. Την θέση ενσωµάτωσης, που είναι πάντα τυχαία ευχρωµατίνη ετεροχρωµατίνη έκφραση έκφραση Αλληλουχίες «θέσης ελέγχου περιοχών» (Locus Control region, LCR) Επιτρέπουν έκφραση του διαγονιδίου: 1. ανεξάρτητη της θέσης ενσωµάτωσης 2. ανάλογη του αριθµού των αντιγράφων 5

6 Οι διαγονιδιακοί οργανισµοί συνήθως υπερεκφράζουν µια πρωτεΐνη οπότε αποτελούν ιδανικά συστήµατα µελέτης διαδικασιών και λειτουργιών που πιθανόν απορυθµίζονται και οδηγούν στην ασθένεια. Με τον τρόπο αυτό µπορούν να µελετηθούν και να κατανοηθούν οι µοριακοί και κυτταρικοί µηχανισµοί που εµπλέκονται στην παθογένεση των ασθενειών αυτών ενώ τα διαγονιδιακά µοντέλα µπορούν να χρησιµοποιηθούν για δοκιµές φαρµακευτικών ουσιών σε προκλινικό επίπεδο. Για παράδειγµα, διάφορες διαγονιδιακές σειρές ποντικών που υπερεκφράζουν τον Παράγοντα Νέκρωσης Όγκων (TNF, Tumor Necrosis Factor) και τους υποδοχείς του σε συγκεκριµένους κυτταρικούς τύπους εµφανίζουν παθολογίες που προσοµοιάζουν ασθένειες του ανθρώπου όπως τη Ρευµατοειδή Αρθρίτιδα, τη Σκλήρυνση κατά πλάκας και τη γενικευµένη φλεγµονή (2). Επίσης, τα διαγονιδιακά ζώα µπορούν να χρησιµοποιηθούν ως βιοαντιδραστήρες για την παραγωγή εξαιρετικά χρήσιµων ουσιών τόσο για την ιατρική, όσο και για τη γεωργία ή την κτηνοτροφία. Φαρµακευτική κτηνοτροφία Το περασµένο έτος η αρµόδια Υπηρεσία Φαρµάκων της Ευρωπαϊκής Ένωσης (European Medicines Agency, ΕΜΕΑ) έδωσε έγκριση για κυκλοφορία της ανθρώπινης πρωτεΐνης αντιθροµβίνης-α (που χορηγείται σε ασθενείς για να αποφευχθεί η πιθανότητα θρόµβωσης), την οποία παράγουν µε το γάλα τους γενετικώς τροποποιηµένες αίγες. Στο γενετικό υλικό των αιγών περιέχεται ένα ανθρώπινο γονίδιο το οποίο κωδικοποιεί την αντιθροµβίνη, υπό τον έλεγχο του υποκινητή της β-καζεΐνης µε σκοπό την παραγωγή της ανθρώπινης πρωτεΐνης αποκλειστικά στο γάλα (εικόνα 3). 6

7 Παραγωγή φαρµακευτικών πρωτεϊνών από κτηνοτροφικά ζώα 1. Επιλογή υποκινητών γονιδίων που εκφράζονται σε κύτταρα του µαστικού αδένα π.χ. καζεΐνη, β-γαλακτοσφαιρίνη 2. Προετοιµασία διαγονιδιακής κατασκευής 3. Εισαγωγή διαγονιδίου στον προπυρήνα γονιµοποιηµένου ωαρίου µε µικροένεση 4. Εµφύτευση σε θετή µητέρα 5. Ταυτοποίηση διαγονιδιακών απογόνων µε PCR 6. Συλλογή γάλακτος 7. Αποµόνωση και καθαρισµός φαρµακευτικής πρωτεΐνης από το γάλα Εικόνα 3. Στάδια παραγωγής φαρµακευτικών πρωτεϊνών από κτηνοτροφικά ζώα Κατά τη διάρκεια ενός έτους υπολογίζεται ότι ένα τέτοιο ζώο παράγει την αντίστοιχη ποσότητα πρωτεΐνης µε εκείνη που θα συλλεγόταν από δείγµατα αίµατος (η αντιθροµβίνη εξάγεται από το πλάσµα του αίµατος). Το κόστος παραγωγής µιας ουσίας για φαρµακευτική χρήση µέσω της καλλιέργειας βακτηρίων ή κυττάρων θηλαστικών (πρακτική που ακολουθείται ευρέως σήµερα) συνδέεται µε παραγωγή από 0,2γρ/λίτρο του µέσου καλλιέργειας. Στο γάλα διαγονιδιακών ζώων µπορούν να παραχθούν από 2-10γρ ανασυνδυασµένης πρωτεΐνης ανά λίτρο. Τα βιοτεχνολογικά φάρµακα, όπως οι πρωτεΐνες, τα αντισώµατα και τα ένζυµα, αποτελούν αυτή τη στιγµή το 20% όλων των φαρµάκων που κυκλοφορούν στην αγορά, καθώς και το 50% εκείνων που βρίσκονται σε κλινικές δοκιµές. Υπάρχουν ήδη αγελάδες που παράγουν την ανθρώπινη πρωτεΐνη λακτοφερρίνη, η οποία υπάρχει στο µητρικό γάλα και διαθέτει αντιβακτηριακές ιδιότητες, κουνέλια που παράγουν το ένζυµοαναστολέα της C1-εστεράσης, το οποίο αναστέλλει την εξέλιξη σχηµατισµού οιδηµάτων, αγελάδες-«παραγωγοί» µεγάλων ποσοτήτων ανθρωπίνων αντισωµάτων, 7

8 µε στόχο την ανάπτυξη θεραπειών που θα στοχεύουν τόσο τις µικροβιακές λοιµώξεις όσο και τις αυτοάνοσες διαταραχές, διαγονιδιακά πουλερικά, που θα παράγουν αυγά για τη θεραπεία µεταδοτικών και αυτοάνοσων ασθενειών ή διαφορετικές πρωτεΐνες για φαρµακευτική χρήση. Φαίνεται λοιπόν ότι υπάρχουν τεράστιες δυνατότητες ανάπτυξης της βιοτεχνολογίας στον τοµέα της παραγωγής φαρµακευτικών πρωτεϊνών στο µέλλον. Εφαρµογές τεχνολογίας διαγονιδιακών συστηµάτων Μελέτη της γονιδιακής έκφρασης in vivo ηµιουργία πειραµατικών µοντέλων ασθενειών του ανθρώπου Ανάλυση των µοριακών, κυτταρικών µηχανισµών που εµπλέκονται στην επαγωγή του φαινοτύπου οκιµές νέων φαρµακευτικών ουσιών στα µοντέλα ασθενειών ηµιουργία οργανισµών µε νέα βελτιωµένα χαρακτηριστικά χρήσιµα στην ιατρική (π.χ. παραγωγή ινσουλίνης), στην κτηνοτροφία και στην γεωργία Γονιδιακή θεραπεία 8

9 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 ο Τεχνολογία κατευθυνόµενης γονιδιακής στόχευσης- ηµιουργία knockout ποντικών Η τεχνολογία της κατευθυνόµενης γονιδιακής στόχευσης (gene targeting) έχει εφαρµοστεί µε µεγάλη επιτυχία τις τελευταίες δύο δεκαετίες στο ποντίκι και επιτρέπει την αντικατάσταση ενός ενδογενούς γονιδίου από ένα εξωγενές που φέρει την επιθυµητή µετάλλαξη και επιτυγχάνεται µε οµόλογο ανασυνδυασµό σε εµβρυονικά βλαστικά κύτταρα (Embryonic stem cells, ES) (3). Τα εµβρυονικά βλαστικά κύτταρα αποµονώνονται από την εσωτερική κυτταρική µάζα (inner cell mass) της βλαστοκύστης, δηλαδή του εµβρύου 3.5 ηµερών που δεν έχει ακόµα εµφυτευθεί (εικόνα 4). Η βλαστοκύστη αποτελείται από δύο διακριτά µέρη: την εξωτερική επιφάνεια (τροφοεξώδερµα) απ όπου προέρχονται µεµβράνες που περιβάλουν το έµβρυο και την εσωτερική κυτταρική µάζα από την οποία προέρχονται τα κύτταρα που συνιστούν το έµβρυο. Τα εµβρυονικά βλαστικά κύτταρα µπορούν να καλλιεργηθούν και υπό ειδικές συνθήκες παραµένουν αδιαφοροποίητα, και διπλοειδικά, έχοντας τη δυνατότητα όταν εισάγονται σε άλλες βλαστοκύστεις να συµβάλουν στη παραγωγή διαφοροποιηµένων κυττάρων ακόµα και κυττάρων της γαµετικής σειράς. Εικόνα 4. Βλαστοκύστη ποντικού. Το τροφοεξώδερµα (λευκό βέλος) και η εσωτερική κυτταρική µάζα. (µαύρο βέλος) περιβάλουν µια κοιλότητα, το βλαστόκοιλο, που αποτελεί το χαρακτηριστικό γνώρισµα της βλαστοκύστης. Η γονιδιακή κατασκευή στόχευσης πρέπει να περιέχει δύο περιοχές µε οµόλογες αλληλουχίες ως προς το γονίδιο στόχος, όπου θα γίνει οµόλογος ανασυνδυασµός µεταξύ αυτής και του ενδογενούς γονιδίου. Επειδή ο οµόλογος ανασυνδυασµός αποτελεί ένα σπάνιο φαινόµενο στα ευκαρυωτικά κύτταρα, η χρησιµοποίηση δεικτών θετικής και αρνητικής επιλογής είναι απαραίτητη για τον εµπλουτισµό των καλλιεργειών σε ανασυνδυασµένους ES κλώνους (Εικόνα 5). Για να επιτευχθεί η στόχευση ενός γονιδίου σε όλα τα κύτταρα του ποντικού, η γονιδιακή κατασκευή εισάγεται µε ηλεκτροπαλµό σε εµβρυονικά βλαστικά κύτταρα µε σκοπό να 9

10 αντικαταστήσει το ενδογενές γονίδιο µέσω του φαινόµενου του οµόλογου ανασυνδυασµού. Παρουσία κατάλληλων αντιβιοτικών (G418, gancyclovir) τα περισσότερα κύτταρα πεθαίνουν λόγω της µη πρόσληψης ξένου DNA, ενώ από κάθε ένα κύτταρο που επιβιώνει δηµιουργείται µία αποικία που αποµονώνεται και καλλιεργείται µε σκοπό την παραγωγή αρκετών κυττάρων της ίδιας γενετικής σύστασης για τον έλεγχο του ανασυνδυασµού. Τα ανασυνδυασµένα ES κύτταρα, δηλαδή τα κύτταρα όπου το ξένο DNA έχει αντικαταστήσει το ενδογενές γονίδιοστόχο εισάγονται στο βλαστόκοιλο της βλαστοκύστης συµβάλλοντας στον σχηµατισµό ενός χιµαιρικού οργανισµού. Η µεταφορά των βλαστοκύστεων αυτών σε θετές µητέρες θα οδηγήσει στη δηµιουργία χιµαιρικών απογόνων, που θα φέρουν δηλαδή κύτταρα τόσο από τη βλαστοκύστη όσο και από τα τροποποιηµένα ES κύτταρα. Εάν τα ES κύτταρα προέρχονται από λευκά ποντίκια και οι βλαστοκύστεις από µαύρα ποντίκια τότε οι λευκές περιοχές στο τρίχωµα του χιµαιρικού ποντικού θα προέρχονται από τα ES κύτταρα. Η µεταβίβαση των τροποποιηµένων γονιδίων στους απογόνους εξασφαλίζεται µε την παραγωγή γαµετών που προέρχονται από τα ES κύτταρα, ενώ µε διασταυρώσεις παράγονται οµόζυγα ζώα για τη µεταλλαγή που εισάχθηκε. Τα ποντίκια στα οποία έχει αδρανοποιηθεί ένα γονίδιο µε τη χρήση της τεχνολογίας της κατευθυνόµενης γονιδιακής στόχευσης ονοµάζονται knockout και συµβολίζονται ως -/-. Τα στάδια που ακολουθούνται κατά την γονιδιακή στόχευση απεικονίζονται στην εικόνα 6. 10

11 Εικόνα 5. Σχηµατική απεικόνιση του συστήµατος θετικής-αρνητικής επιλογής. (Α) Τυχαία ενσωµάτωση. (Β) Γονιδιακή στόχευση µε οµόλογο ανασυνδυασµό. Για τον εντοπισµό των κλώνων (αποικιών) που έχουν ενσωµατώσει την γονιδιακή κατασκευή στο γονιδίωµά τους, είτε τυχαία είτε µε οµόλογο ανασυνδυασµό, πρέπει κατά τον σχεδιασµό της γονιδιακής κατασκευής να συµπεριληφθεί µεταξύ των δύο οµόλογων περιοχών ένας δείκτης θετικής επιλογής (π.χ. γονίδιο αντοχής σε νεοµυκίνη, neo). Οι κλώνοι που φέρουν στο γονιδίωµά τους το neo γονίδιο θα επιβιώσουν παρουσία θετικής επιλογής (π.χ. ανάλογο νεοµυκίνης G418). Ο δείκτης αρνητικής επιλογής (π.χ. γονίδιο κινάσης της θυµιδίνης ερπητοϊού, tk) τοποθετείται στα άκρα της γονιδιακής κατασκευής για την εξάλειψη των ES κυττάρων στα οποία έχει γίνει τυχαία ενσωµάτωση. Όταν συµβεί λοιπόν οµόλογος ανασυνδυασµός τότε το tk γονίδιο δεν ενσωµατώνεται στο γονιδίωµα και έτσι θα επιβιώσουν µόνο τα ανασυνδυασµένα ES κύτταρα παρουσία αρνητικής επιλογής (π.χ. gancyclovir) (βλ. αναφορά 1). 11

12 Εικόνα 6. Σχηµατική απεικόνιση των σταδίων που ακολουθούνται στην κατευθυνόµενη γονιδιακή στόχευση. 12

13 Ο οµόλογος ανασυνδυασµός σε ES κύτταρα επιτρέπει την διακοπή της έκφρασης γονιδίων (knockout) όταν ο δείκτης θετικής επιλογής ενσωµατώνεται ή αντικαθιστά µια λειτουργική περιοχή ενός γονιδίου. Με την δηµιουργία και µελέτη knockout ποντικών για το γονίδιο του TNF αποκαλύφθηκε ο ρόλος αυτής της κυτταροκίνης, in vivo, σε ανοσολογικές αποκρίσεις όπως στην ενίσχυση της άµυνας του οργανισµού έναντι παθογόνων βακτηρίων (π.χ. Listeria monocytogenes), τον σχηµατισµό πρωτογενών θυλακίων Β κυττάρων και βλαστικών κέντρων (4). Με την τεχνολογία της γονιδιακής στόχευσης υπάρχει επίσης η δυνατότητα της εισαγωγής µεταλλάξεων σε ένα γονίδιο µε µεγάλη ακρίβεια. Για να επιτευχθεί αυτό πρέπει αφενός η µετάλλαξη να εισαχθεί σε µία από τις οµόλογες περιοχές της γονιδιακής κατασκευής και αφετέρου ο δείκτης θετικής επιλογής να µπορεί να αποµακρυνθεί µετά τον οµόλογο ανασυνδυασµό για να αποφευχθούν αλλοιώσεις στην έκφραση του γονιδίου. Το τελευταίο στάδιο επιτυγχάνεται µε τη δράση ειδικών τοποειδικών ανασυνδυασών, όπως το ένζυµο Cre (causes recombination) του βακτηριοφάγου P1 που έχει την ικανότητα να καταλύει ανασυνδιασµό ανάµεσα σε δύο ειδικές αλληλουχίες µήκους 34bp που ονοµάζονται loxp (locus of crossing over) αφαιρώντας το τµήµα του DNA που εµπεριέχεται σ αυτές (5). Επειδή οι loxp αλληλουχίες δεν συναντούνται στο γονιδίωµα των ευκαρυωτικών οργανισµών αποτελούν το καταλληλότερο σύστηµα εφαρµογής τοποειδικού ανασυνδιασµού. 13

14 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 ο Τροποποιήσεις του ευκαρυωτικού γονιδιώµατος µε το σύστηµα Cre/loxP Η δυνατότητα απενεργοποίησης ή τροποποίησης των γονιδίων µε µεταλλάξεις και η µελέτη των επιπτώσεων που έχουν αυτές οι αλλαγές σε ολόκληρο τον οργανισµό επιτρέπει την κατανόηση της λειτουργίας των γονιδίων και των προϊόντων τους in vivo (αντίστροφη γενετική). Με τη χρήση συγκεκριµένων εργαλείων γενετικής µηχανικής επιτυγχάνεται η τροποποίηση του DNA µε αυστηρά προκαθορισµένο τρόπο. Αρκετά ανασυνδυαστικά ένζυµα από προκαρυωτικά και ευκαρυωτικά συστήµατα, έχουν την ικανότητα να κόβουν το DNA σε ειδικές θέσεις-στόχους και να ενώνουν τα κοµµένα άκρα του DNA σε µια δεύτερη θέση. Οι πιο γνωστές τοποειδικές ανασυνδυάσες (site-specific recombinases) που έχουν έχουν χρησιµοποιηθεί σε ετερόλογα κυτταρικά συστήµατα, είναι η Cre (Causes recombination) του βακτηριοφάγου Ρ1 και η FLP (flippase) που προέρχεται από τη ζύµη Saccharomyces cerevisiae. Αυτές οι ανασυνδυάσες έχουν την ικανότητα να καταλύουν από µόνες τους ανασυνδυασµό ανάµεσα σε δύο ειδικές θέσεις του DNA µε µήκος 34bp, την αλληλουχία των οποίων αναγνωρίζουν. Η ανασυνδυάση Cre αναγνωρίζει µια αλληλουχία η οποία ονοµάζεται lοxρ (locus of crossing-over), ενώ η αντίστοιχη αλληλουχία αναγνώρισης της FLP είναι η FRT (FLIP recognition target). Οι συγκεκριµένες αλληλουχίες αυτού του µήκους είναι σχεδόν απίθανο να βρεθούν τυχαία στο γονιδίωµα των ανώτερων ευκαρυωτικών οργανισµών. εδοµένου ότι η µόνη προϋπόθεση για την αντίδραση του ανασυνδυασµού είναι η παρουσία της ανασυνδυάσης, τα ένζυµα αυτά αποτελούν τα καταλληλότερα συστήµατα τοποειδικού ανασυνδυασµού για εφαρµογή σε οποιοδήποτε ανώτερο ευκαρυωτικό είδος. Έµφαση θα δοθεί στην ανασυνδυάση Cre, η οποία έχει εφαρµοστεί περισσότερο ως εργαλείο τροποποίησης του ευκαρυωτικού γονιδιώµατος (5). Ο τοποειδικός ανασυνδυασµός του συστήµατος Cre/loxP Η Cre, όπως και όλα τα υπόλοιπα µέλη της οικογένειας των ιντεγκρασών (integrase family) στην οποία ανήκει, κόβει τo DNA σε συγκεκριµένες θέσεις της αλληλουχίας lοxρ και συνδέεται οµοιοπολικά µε αυτή, µέσω µιας τυροσίνης του καταλυτικού της κέντρου. Σε κάθε lοxρ αλληλουχία προσδένονται 2 µόρια Cre. Η αλληλουχία lοxρ έχει συνολικό µήκος 34 bp και αποτελείται από δύο ανεστραµµένες επαναλήψεις 13 bp η καθεµία, οι οποίες χωρίζονται από µια µοναδική κεντρική αλληλουχία 8 bp στην οποία γίνεται ο ανασυνδιασµός δηλαδή το κόψιµο και η ανταλλαγή των αλυσίδων 14

15 του DNA (εικόνα 7). Η κεντρική αυτή αλληλουχία δεν έχει συµµετρία και προσδίδει τον προσανατολισµό στην lοxρ αλληλουχία. Είναι πολύ σηµαντικό να γνωρίζουµε τον προσανατολισµό της κεντρικής περιοχής και κατ' επέκταση τον προσανατολισµό ολόκληρου του lοxρ, γιατί απ αυτόν θα εξαρτηθεί το προϊόν του ανασυνδυασµού. Για το λόγο αυτό, η αλληλουχία ΙοxΡ παριστάνεται γραφικά ως βέλος, η φορά του οποίου, αυθαίρετα συµπίπτει µε τη φορά 5'-GCA-3' των τριών πρώτων βάσεων της κεντρικής περιοχής (εικόνα 7). Η αλληλουχία και ο προσανατολισµός του loxp Cre Cre Εικόνα 7. Η αλληλουχία loxp. Τα βέλη δείχνουν τις θέσεις που κόβει η ανασυνδυάση Cre στην κεντρική περιοχή. Για να δράσει η Cre πρέπει να εντοπίσει τουλάχιστον δύο lοxρ αλληλουχίες είτε µε την ίδια είτε µε αντίθετη φορά. Ο ανασυνδυασµός επιτυγχάνεται όταν δύο lοxρ αλληλουχίες έρθουν κοντά παρουσία τεσσάρων µορίων Cre (δύο σε κάθε lοxρ) και πραγµατοποιείται µε ανταλλαγή δύο αλυσίδων DNA (µια αλυσίδα από κάθε µόριο DNA) ώστε να προκύψει ενδιάµεση δοµή Holliday, η οποία ακολουθείται από ανταλλαγή και των δύο άλλων αλυσίδων δίνοντας γένεση στα τελικά προϊόντα 15

16 (εικόνα 8). Η ακρίβεια του ανασυνδυασµού είναι τέτοια, ώστε να µη γίνεται προσθήκη, αφαίρεση ή αλλαγή βάσεων στην κεντρική περιοχή. Οι ανεστραµµένες επαναλήψεις από κάθε lοxρ ωστόσο, ανταλλάσσονται και το αποτέλεσµα είναι τα τελικά lοxρ να είναι απόλυτα όµοια µε τα αρχικά και πλήρως λειτουργικά. Όταν οι δύο lοxρ αλληλουχίες βρίσκονται στο ίδιο µόριο DNA και έχουν την ίδια φορά τότε το ενδιάµεσο τµήµα DNA αποκόπτεται µε τη µορφή κυκλικού µορίου, οπότε στο γραµµικό µόριο αποµένει ένα lοxρ. Η αντίθετη φορά της αντίδρασης δηλαδή η ενσωµάτωση ή η σύντηξη δύο τµηµάτων DNA είναι εφικτή όταν οι lοxρ αλληλουχίες βρίσκονται σε διαφορετικά µόρια DNA και µπορεί να δηµιουργήσει σε χρωµοσωµικές µετατοπίσεις όταν αρχικά βρίσκονται σε διαφορετικά χρωµοσώµατα. Όταν οι δύο lοxρ αλληλουχίες βρίσκονται στο ίδιο µόριο DNA αλλά έχουν αντίθετη φορά, τότε το ενδιάµεσο τµήµα DNA αναστρέφεται και σε αυτήν την περίπτωση η αντίδραση είναι εξίσου πιθανή και προς τις δύο κατευθύνσεις. Εικόνα 8. Μηχανισµός ανασυνδυασµού της Cre µεταξύ δύο lοxρ αλληλουχιών σε σειρά. 4 µόρια Cre απαιτούνται για τον ανασυνδυασµό µεταξύ της πρώτης αλληλουχίας lοxρ (µαύρο) µε τη δεύτερη (λευκό) µε αποτέλεσµα την ανταλλαγή DNA σε κάθε lοxρ (ασπρόµαυρο). 16

17 Εφαρµογές του συστήµατος Η ικανότητα αυτή της Cre να αποκόπτει, να ενσωµατώνει ή να αναστρέφει τµήµατα DNA έχει βρει µεγάλη εφαρµογή σε ευκαρυωτικά κύτταρα in vitro. Σε συνδυασµό µε την τεχνολογία της γονιδιακής στόχευσης σε εµβρυονικά βλαστικά κύτταρα, θεωρητικά, οποιαδήποτε γονιδιακή τροποποίηση που µπορεί να επιτευχθεί σε ES κύτταρα in vitro, είναι δυνατόν να µεταφερθεί και in vivo στο επίπεδο του οργανισµού. Οι γονιδιακές τροποποιήσεις στα ES κύτταρα µε το σύστηµα Cre/ lοxρ συνήθως περιλαµβάνουν δύο στάδια: µια συγκεκριµένη γενετική τροποποίηση που περιλαµβάνει και την εισαγωγή των lοxρ αλληλουχιών, επιτυγχάνεται στο πρώτο στάδιο µε οµόλογο ανασυνδυασµό στα ES κύτταρα και στη συνέχεια η τελική, επιθυµητή µορφή διαµορφώνεται µετά από ανασυνδυασµό ανάµεσα σε δύο ή περισσότερα lοxρ µε παροδική έκφραση της Cre στα κύτταρα αυτά. 1. Αποµάκρυνση του δείκτη θετικής επιλογής Μια σηµαντική εφαρµογή του συστήµατος Cre/ lοxρ είναι η αποµάκρυνση του δείκτη θετικής επιλογής όταν αυτός δεν είναι πια απαραίτητος, προς αποφυγή µιας πιθανής παρεµπόδισης από αυτόν της σωστής έκφρασης των γειτονικών, τροποποιηµένων γονιδίων. H αφαίρεση του δείκτη θετικής επιλογής µε τη βοήθεια των lοxρ, επιτρέπει την µελέτη της επίδρασης στην γονιδιακή έκφραση και λειτουργία, αλλαγών όπως µετάλλαξης σηµείου και µικρές αφαιρέσεις ή προσθήκες, εάν υποτεθεί ότι το lοxρ, το οποίο παραµένει στο τροποποιηµένο γονίδιο δεν έχει καµία επίδραση (εικόνα 9). Ακολουθώντας αυτή την µεθοδολογία ο δείκτης θετικής επιλογής πρέπει να εµπεριέχεται ανάµεσα σε δύο loxp αλληλουχίες µε τον ίδιο προσανατολισµό, ενώ η αποµάκρυνσή του γίνεται µε µικροένεση ενός πλασµιδίου που παράγει παροδικά το ένζυµο Cre σε προπυρήνες γονιµοποιηµένων ωαρίων που προέρχονται από τα γενετικά τροποποιηµένα ποντίκια. Με την τεχνολογία αυτή δηµιουργήθηκαν στο παρελθόν τα TNF ARE ποντίκια στα οποία αφαίρεση της 3 ARE αλληλουχίας από το γονιδίου του TNF οδήγησε σε υπερέκφραση TNF και εµφάνιση αρθρίτιδας και φλεγµονώδους εντεροπάθειας τύπου Crohn s (6). 17

18 Εικόνα 9. Εισαγωγή µετάλλαξης (αστερίσκος) σε γονίδιο µε αφαίρεση του δείκτη θετικής επιλογής (neo) έπειτα από παροδική έκφραση της Cre. Τα εξώνια απεικονίζονται µε γκρι παραλληλόγραµµα, η 3 αµετάφραστη περιοχή µε λευκό, ενώ τα lοxρ µε τρίγωνα. Η µέθοδος αυτή έχει εφαρµοστεί στην επίτευξη µικρών αφαιρέσεων, στην αντικατάσταση αµινοξέων, την µετάλλαξη ρυθµιστικών περιοχών ή την εισαγωγή καινούργιων τµηµάτων DNA σε γονίδια ποντικών. Ο ανασυνδυασµός από την Cre µπορεί ακόµα να χρησιµοποιηθεί για την αφαίρεση του δείκτη επιλογής µαζί µε ένα τµήµα DNA µεγέθους έως και αρκετών kb µε τοποθέτηση ενός loxp κοντά στο δείκτη επιλογής και ενός δεύτερου µε τον ίδιο προσανατολισµό σε κάποια απόσταση. 2. «Υπό όρους» γονιδιακές τροποποιήσεις Οι «υπό όρους» γονιδιακές τροποποιήσεις (conditional gene targeting), µπορούν να οριστούν ως οι γονιδιακές τροποποιήσεις, oι οποίες συµβαίνουν µόνο σε ορισµένους κυτταρικούς τύπους (κυτταροειδικές) ή επάγονται σε συγκεκριµένα αναπτυξιακά στάδια ενός οργανισµού (χρονοεπαγόµενες). Αντιθέτως, η αδρανοποίηση γονιδίων στους knockout οργανισµούς γίνεται σε όλα τα κύτταρα του οργανισµού (εικόνα 10). Η τεχνολογία αυτή είναι ιδιαίτερα χρήσιµη σε περιπτώσεις που α) τα αντίστοιχα knockout ποντίκια δεν επιβιώνουν και β) ένα γονίδιο εκφράζεται σε διάφορα 18

19 αναπτυξιακά στάδια και/ή σε διάφορους κυτταρικούς τύπους. Η προσέγγιση αυτή συνδυάζει την τεχνολογία της γονιδιακής στόχευσης µε το σύστηµα τοποειδικού ανασυνδυασµού Cre/loxP και αποσκοπεί συνήθως στην υπό όρους ενεργοποίηση, απενεργοποίηση ή αντικατάσταση ενός γονιδίου. κυτταροειδικές χρονοεπαγόµενες Εικόνα 10. Κυτταροειδικές και χρονοεπαγόµενες γονιδιακές τροποποιήσεις. Η εφαρµογή του συστήµατος Cre/loxP στις «υπό όρους» γονιδιακές τροποποιήσεις προαπαιτεί τη δηµιουργία δύο σειρών ποντικών: µιας σειράς ποντικών που έχει δηµιουργηθεί µε γονιδιακή στόχευση, η οποία φέρει δύο loxp σε προκαθορισµένες θέσεις ενός γονιδίου, και µιας δεύτερης σειράς ποντικών που συνήθως παράγεται µε διαγένεση, η οποία εκφράζει την Cre σε συγκεκριµένους κυτταρικούς τύπους ή 19

20 αναπτυξιακά στάδια. Η «υπό όρους» µεταλλαγµένη σειρά ποντικών (conditional) προκύπτει µε διασταύρωση των δύο αυτών σειρών ποντικών, έτσι ώστε η τροποποίηση του τµήµατος DNA που φέρει τα loxp, να περιορίζεται µόνο στους κυτταρικούς τύπους ή αναπτυξιακά στάδια όπου εκφράζεται η Cre (εικόνα 11). To είδος των «υπό όρους» γονιδιακών τροποποιήσεων µπορεί να περιλαµβάνει όλες τις τροποποιήσεις, οι οποίες είναι δυνατό να γίνουν µε την εφαρµογή του συστήµατος Cre/loxP, συνηθέστερα ωστόσο, αυτές αποσκοπούν στην «υπό όρους» ενεργοποίηση, απενεργοποίηση ή αντικατάσταση ενός γονιδίου. Εικόνα 11. Η τεχνολογία των «υπό όρους» γονιδιακών τροποποιήσεων προαπαιτεί τη δηµιουργία δύο σειρών ποντικών: µιας σειράς ποντικών όπου ένα τµήµα ή και ολόκληρο το γονίδιο εµπεριέχεται σε δύο loxp αλληλουχίες και µιας δεύτερης σειράς ποντικών όπου η Cre εκφράζεται είτε κυτταροειδικά είτε σε συγκεκριµένα αναπτυξιακά στάδια. Η διασταύρωση των δύο αυτών σειρών ποντικών οδηγεί στη δηµιουργία µιας υπό όρους µεταλλαγµένης σειράς ποντικών (conditional) όπου η αφαίρεση του τµήµατος DNA µεταξύ των δύο loxp αλληλουχιών περιορίζεται µόνο στα κύτταρα όπου εκφράζεται το ένζυµο ανασυνδιασµού Cre (βλ. αναφορά 1). Για παράδειγµα, εάν η Cre εκφράζεται σε νευρικά κύτταρα τότε µόνο στα κύτταρα αυτά θα επαχθεί γονιδιακή τροποποίηση. 20

21 Για την κυτταροειδική ενεργοποίηση ενός γονιδίου, το γονίδιο αυτό αρχικά απενεργοποιείται µε εισαγωγή σε ένα σηµαντικό για την έκφρασή του σηµείο, ανασταλτικών αλληλουχιών οι οποίες περιβάλλονται από loxp µε τον ίδιο προσανατολισµό και άρα µπορούν να αποµακρυνθούν µε τη δράση της Cre (εικόνα 12). Γονιδιακή κατασκευή Ενδογενές γονίδιο Απενεργοποίηση γονιδίου tk neo neo ΟΑ Tg-Cre Ενεργοποίηση γονιδίου Εικόνα 12. Κυτταροειδική ενεργοποίηση γονιδίου. Κατά τον σχεδιασµό της γονιδιακής κατασκευής, τοποθετείται κοντά στο σηµείο έναρξης της µεταγραφής ο δείκτης θετικής επιλογής και ακολουθούν ανασταλτικές αλληλουχίες για τη µεταγραφή του γονιδίου. Τα δύο αυτά στοιχεία περιβάλλονται από 2 loxp αλληλουχίες σε σειρά. Με οµόλογο ανασυνδυασµό (ΟΑ) η γονιδιακή κατασκευή αντικαθιστά το ενδογενές γονίδιο οπότε σταµατά η έκφραση του γονιδίου. Όταν η σειρά αυτή ποντικού διασταυρωθεί µε ένα διαγονιδιακό ποντίκι που εκφράζει την Cre σε ένα συγκεκριµένο κυτταρικό τύπο, τότε αφαιρείται ο δείκτης θετικής επιλογής µαζί µε τις αλληλουχίες που παρεµπόδιζαν την µεταγραφή του γονιδίου οπότε επαναενεργοποιείται η έκφραση του γονιδίου κυτταροειδικά. 21

22 Για την κυτταροειδική απενεργοποίηση ενός γονιδίου, αρχικά ένα σηµαντικό για τη λειτουργία τµήµα του ή και όλο το γονίδιο, περιβάλλονται από loxp αλληλουχίες µε τρόπο ώστε να µην επηρεάζουν την έκφρασή του. Αυτό γίνεται σε δύο στάδια: στο πρώτο, τρία loxp µε τον ίδιο προσανατολισµό τοποθετούνται στο γονίδιο που ενδιαφέρει (τα δύο για την αποµάκρυνση του δείκτη θετικής επιλογής) και στο δεύτερο, µετά από παροδική έκφραση της Cre προκύπτουν τρία πιθανά προϊόντα, από τα οποία επιλέγεται αυτό στο οποίο µόνο ο δείκτης θετικής επιλογής έχει αποµακρυνθεί (εικόνα 13). Εικόνα 13. Κυτταροειδική απενεργοποίηση ενός γονιδίου µε τη στρατηγική των 3 loxp. Η παροδική έκφραση της Cre στα κύτταρα της γαµετικής σειράς οδηγεί στην δηµιουργία 3 προϊόντων ανασυνδυασµού: 1) ενός κατεστραµµένου αλληλοµόρφου (null) που παράγεται µε ανασυνδυασµό µεταξύ του 1 ου και του 3 ου loxp, 2) του επιθυµητού «υπό όρους» αλληλοµόρφου (conditional) που παράγεται µε ανασυνδυασµό µεταξύ του 1 ου και του 2 ου loxp (αφαίρεση του δείκτη θετικής επιλογής), και 3) ενός κατεστραµµένου αλληλοµόρφου (null) που παράγεται µε ανασυνδυασµό µεταξύ του 2 ου και του 3 ου loxp. Για την κυτταροειδική απενεργοποίηση του γονιδίου επιλέγονται οι απόγονοι που φέρουν το 2 ο προϊόν ανασυνδυασµού (conditional allele) δηλαδή ένα λειτουργικό αλληλόµορφο που 22

23 εµπεριέχεται ανάµεσα από 2 loxp αλληλουχίες. Αυτά τα ποντίκια ζευγαρώνουν στη συνέχεια µε ποντίκια που εκφράζουν την Cre κυτταροειδικά, οπότε µε ανασυνδυασµό αδρανοποιείται το γονίδιο στους συγκεκριµένους κυτταρικούς τύπους. Χρονικά επαγόµενες γονιδιακές τροποποιήσεις Οι επαγόµενες γονιδιακές τροποποιήσεις είναι ιδιαίτερα χρήσιµες στην ανάλυση του ρόλου συγκεκριµένων γονιδίων σε ενήλικα πειραµατόζωα, λόγω του ότι προσφέρουν τη δυνατότητα της γονιδιακής τροποποίησης µετά τη φυσιολογική ανάπτυξη των προσαρµοστικών κυτταρικών συστηµάτων του οργανισµού, όπως το ανοσοποιητικό και το νευρικό σύστηµα. Έτσι, ενώ η συνεχής κυτταροειδική έκφραση της Cre µπορεί να επιτευχθεί µε συνδυασµό φυσικών ή κατασκευασµένων υποκινητών, η χρονικά ελεγχόµενη λειτουργία της Cre, επιτυγχάνεται µε ρύθµιση τόσο του µεταγραφικού όσο και του µετα-µεταφραστικού επιπέδου της έκφρασης της. 1. Σύστηµα τετρακυκλίνης-ρύθµιση σε µεταγραφικό επίπεδο Κυτταροειδικός έλεγχος της µεταγραφής µπορεί να επιτευχθεί σύµφωνα µε το σύστηµα της τετρακυκλίνης σε ευκαρυωτικά κύτταρα µε τη χρήση δύο διαγονιδιακών σειρών ποντικών: η πρώτη σειρά παράγει κυτταροειδικά ένα διαενεργοποιητή (transactivator) που έχει τη δυνατότητα να προσδένεται σε ειδικές ρυθµιστικές αλληλουχίες που καθορίζουν την έκφραση του διαγονιδίου (π.χ. Cre) της δεύτερης διαγονιδιακής σειράς. Επίσης, ο διαενεργοποιητής προσδένεται σε εξωγενώς χορηγούµενη τετρακυκλίνη οπότε διαφοροποιείται η προσδετική του ικανότητα στις ειδικές αλληλουχίες του DNA. Η χορήγηση τετρακυκλίνης µπορεί να επάγει είτε έναρξη της έκφρασης ενός γονιδίου (tet-on) είτε παύση της έκφρασης (tet-off). Στο σύστηµα tet-on, ο διαενεργοποιητής, που παράγεται υπό τον έλεγχο ενός κυτταροειδικού υποκινητή, για να προσδεθεί στις ειδικές ρυθµιστικές αλληλουχίες DNA και να επάγει έκφραση του δεύτερου διαγονιδίου πρέπει να δεσµευθεί σε µόρια τετρακυκλίνης. Οπότε η χορήγηση τετρακυκλίνης ξεκλειδώνει την µεταγραφή του διαγονιδίου-στόχου (εικόνα 14). Αντίθετα, στο σύστηµα tet-off, ο διαενεργοποιητής επάγει κανονικά την έκφραση του διαγονιδίου κάτι που σταµατά όταν χορηγείται τετρακυκλίνη (εικόνα 14). 23

24 Θέτοντας στη θέση του γονιδίου-στόχου την Cre υπό τον έλεγχο ενός τέτοιου υποκινητή και εκφράζοντας τον διαενεργοποιητή µε κυτταροειδικό τρόπο, η χρονική στιγµή του κυτταροειδικού ανασυνδυασµού µπορεί να ρυθµιστεί µε χορήγηση του µορίου επαγωγής (Εικ. 14). Το σύστηµα αυτό έχει βρει επιτυχή εφαρµογή σε διαγονιδιακά συστήµατα. tet-on + τετρακυκλίνη έκφραση TSP rtta TRE γονίδιο tet-off TSP tta TRE γονίδιο Εικόνα 14. Χρονικά ελεγχόµενη ενεργοποίηση (tet-on) ή καταστολή (tet-off) της µεταγραφής ενός γονιδίου µε το σύστηµα της τετρακυκλίνης. TSP=κυτταροειδικός υποκινητής, rtta ή tta=διαενεργοποιητής, TRE=αλληλουχίες πρόσδεσης διανεργοποιητή. 2. Ρύθµιση της έκφρασης σε µετα-µεταγραφικό επίπεδο Μέτα-µεταγραφικός έλεγχος της λειτουργίας της Cre µπορεί να επιτευχθεί µε την σύντηξη της Cre µε την περιοχή πρόσδεσης (ligand binding domain, LBD) των στεροειδών ορµονών. To χιµαιρικό αυτό µόριο παράγεται συνεχώς και απουσία της στεροειδούς ορµόνης παραµένει στο κυτταρόπλασµα σε σύµπλοκο µε τις πρωτεΐνες θερµικού σοκ. Μετά τη χορήγηση της στεροειδούς ορµόνης οι πρωτεΐνες θερµικού 24