Διαμόλυνση με μικροέγχυση

Transcript

1 Διαγονιδιακά ζώα

2 Διαμόλυνση με μικροέγχυση Ορισμοί: ΔΙΑΓΟΝΙΔΙΑΚΑ 2 pl σε ένα από τους δύο προπυρήνες 10-30% επιβίωση ΔΙΑΓΟΝΙΔΙΟ Ορμονική διέγερση 40% των απογόνων έχει το διαγονίδιο ΤΥΧΑΙΑ ΕΝΘΕΣΗ

3 ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΔΙΑΜΟΛΥΝΣΗΣ (Ηλεκτροδιάτρηση και λιποσώματα) Τα κύτταρα δεν παραλαμβάνουν ελεύθερο DNA, εξαιρούνται κάποια βακτήρια

4 ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΔΙΑΜΟΛΥΝΣΗΣ (ιικοί φορείς) Ρετροϊοί μολύνουν μόνο κύτταρα που διαιρούνται Λεντιιοί, αδενοϊοί και αδενοσχετιζόμενοι ιοί μολύνουν και κύτταρα που δεν διαιρούνται Απαιτούνται αλληλουχίες LTR για ενσωμάτωση και αλληλουχία Ψ για συσκευασία

5 ΙΣΤΟΕΙΔΙΚΗ ΕΚΦΡΑΣΗ ΔΙΑΓΟΝΙΔΙΩΝ Εκμετάλλευση των Υποκινητών- Ενισχυτών Παράδειγμα: ΙΣΤΟΕΙΔΙΚΗ ΕΚΦΡΑΣΗ ΤΟΞΙΝΩΝ ΓΙΑ ΕΞΟΥΔΕΤΕΡΩΣΗ ΣΥΓΚΕΚΡΙΜΕΝΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ Χρήση: ΤΟΞΙΝΗ ΔΙΦΘΕΡΙΤΙΔΑΣ (Α-ΑΛΥΣΙΔΑ) Κινάση της Θυμιδίνης (TK1) ΤΥΧΑΙΑ ΕΝΘΕΣΗ: ΑΠΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΣΗ ΕΝΔΟΓΕΝΩΝ ΓΟΝΙΔΙΩΝ (loss of function mutation), ΜΕΤΑΒΛΗΤΑ ΕΠΙΠΕΔΑ ΕΚΦΡΑΣΗΣ, ΑΛΛΑΓΗ ΙΣΤΟΕΙΔΙΚΟΤΗΤΑΣ

6 Mouse in Red: Red Fluorescent Protein Expression in Mouse ES Cells, Embryos, and Adult Animals Kristina Vintersten,1 Claudio Monetti,1 Marina Gertsenstein,1 Puzheng Zhang,1 Lajos Laszlo,2 Steffen Biechele,1 and Andras Nagy1,3* genesis 40: (2004)

7 Μπορεί να επιτευχθεί στοχευμένη ένθεση ES (embryonic stem) εμβρυικά βλαστικά κύτταρα τα οποία είναι ολοδύναμα ΧΡΗΣΗ ΤΩΝ ΕΜΒΡΥΪΚΩΝ ΒΛΑΣΤΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ (ΑΠΌ ΕΣΩΤΕΡΙΚΟ ΒΛΑΣΤΟΚΥΣΤΗΣ) ΔΕΝ ΠΡΕΠΕΙ ΝΑ ΔΙΑΦΟΡΟΠΟΙΗΘΟΥΝ (LIF) Αρχικό ποντίκι: ιδρύτης Απόγονοι: διαγονιδιακή σειρά ΕΙΣΑΓΩΓΗ DNA ΗΛΕΚΤΡΟΔΙΑΤΡΗΣΗ, ΡΕΤΡΟΪΟΙ, ΔΙΑΜΟΛΥΝΣΗ ΕΠΙΛΟΓΗ (G418) ΟΜΟΛΟΓΟΣ ΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΟΣ: Στόχευση αλλά μικρό ποσοστό επιτυχίας

8 KNOCKOUT ΠΟΝΤΙΚΙΑ ΓΙΑ ΜΟΝΤΕΛΑ ΟΜΟΛΟΓΟΣ ΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΟΣ ΕΧΕΙ ΠΙΘΑΝΟΤΗΤΑ 1:1000 ΜΠΟΡΕΙ ΝΑ ΑΥΞΗΘΕΙ Η ΠΙΘΑΝΟΤΗΤΑ ΜΕ ΧΡΗΣΗ ΜΕΓΑΛΩΝ ΑΚΡΩΝ ΠΟΥ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΥΝ ΤΗΝ ΠΕΡΙΟΧΗ ΠΟΥ ΜΑΣ ΕΝΔΙΑΦΕΡΕΙ Συνήθως τα άκρα προκύπτουν από BAC κλώνους BAC RECOMBINEERING τότε ως και 20% ΥΠΟΜΟΡΦΙΚΑ ΑΛΛΗΛΟΜΟΡΦΑ ΔΥΟ ΜΑΡΤΥΡΕΣ ΕΠΙΛΟΓΗΣ (NEO ΚΑΙ TK)

9

10 ΧΡΗΣΕΙΣ ΤΩΝ ΔΙΑΓΟΝΙΔΙΑΚΩΝ ΖΩΩΝ ΜΟΝΤΕΛΑ ΑΣΘΕΝΕΙΩΝ ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ Βακτήρια και ζύμες αλλά δεν τροποποιούν όπως οι ανώτεροι οργανισμοί NCBI» Bookshelf» An Introduction to Genetic Analysis» Applications of Recombinant DNA Technology» Recombinant DNA technology in eukaryotes

11 A central role of KLKs in Netherton Syndrome SPINK5 (LEKTI) NS: Mutations in Spink5 resulting in truncated protein LEKTI => lower number of protein inhibition domains than the wild-type K R K R R K R K R K R K R R K CPs K K wt Spink5 -/- Death < 24 h Newborn After few hours Time (t) Sales KU et al. Nature Genet 42: , 2010 Komatsu et al., J Invest Dermatol 118: , 2002 Yamasaki K et al. Nature Med 13: , 2007 Descargues P et al. Nature Genet 37: 56-65, 2005 Hewett DR et al. Hum Mol Genet 14: , 2005 Yang T et al. Genes Dev 18: , 2004

12 Δημιουργία του Klk5 -/- ποντικού 5 arm (4288 bp) FRT En2 SA 3 arm (4403 bp) loxp FRT loxp loxp IRES lacz pa hbactp neo pa Klk5 FLPase-mouse Cre-mouse wt Klk5 -/-

13 Διάσωση του φαινοτύπου του Netherton wt wt Spink5 -/- Klk5 -/- Spink5 -/- /Klk5 -/- wt Spink5 -/- Klk5 -/- Spink5 -/- /Klk5 -/-

14 TALEN (transcription activator-like effector nucleases) Τεχνητές νουκλεάσες που στηρίζονται στις πρωτεΐνες TAL effectors (Xanthomonas spp) 2011 METHOD OF THE YEAR TAL TALEN 7% 70%

15 TALEN (transcription activator-like effector nucleases) Αμινοξύ Βάση DNA HD NN NI NG C G A T Nucleic Acids Res Jul;39(12):e82. doi: /nar/gkr218. Epub 2011 Apr 14. Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting. Cermak T 1, Doyle EL, Christian M, Wang L, Zhang Y, Schmidt C, Baller JA, Somia NV, Bogdanove AJ, Voytas DF.

16 CONDITIONAL KNOCKOUT (Ιστοειδική απενεργοποίηση) Κάποια γονίδια είναι εμβρυικά θανατηφόρα ή θανατηφόρα αμέσως μετά τη γέννηση του ζώου Απαιτείται η ιστοειδική απενεργοποίησή τους loxp αλληλουχίες

17 ΧΡΩΜΟΣΩΜΙΚΕΣ ΑΝΑΔΙΑΤΑΞΕΙΣ ΔΙΠΛΟΣ ΟΜΟΛΟΓΟΣ ΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΟΣ Μοντέλο για χρωμοσωμικές αναδιατάξεις

18 ΕΠΑΓΩΜΕΝΑ KNOCKOUT

19 ΕΠΑΓΩΜΕΝΑ KNOCKOUT

20 Ευχαριστώ πολύ!!!!