ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΙΓΑΙΟΥ Τμήμα Περιβάλλοντος ΠΤΥΧΙΑΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΙΓΑΙΟΥ Τμήμα Περιβάλλοντος ΠΤΥΧΙΑΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ Εκτίμηση της τοξικής δράσης των φυτοπροστατευτικών προϊόντων Linuron και Monolinuron με την χρήση του φωτοσυνθετικού οργανισμού Lemna minor Θεοδωροπούλου Δανάη 141/ Σαρχάνη Βασιλική 141/ Επιβλέπων καθηγητής: κ. Αθ. Στασινάκης Μυτιλήνη 2010

2 Περιεχόμενα ΠΕΡΙΛΗΨΗ 1 1. ΦΥΤΟΠΡΟΣΤΑΤΕΥΤΙΚΑ ΠΡΟΪΟΝΤΑ & ΟΙ ΟΥΣΙΕΣ LINURON KAI MONOLINURON 1.1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΙΣΤΟΡΙΚΗ ΑΝΑΔΡΟΜΗ ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΚΑΙ ΤΥΧΗ ΦΥΤΟΠΡΟΣΤΑΤΕΥΤΙΚΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΣΤΟ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝ ΚΑΤΗΓΟΡΙΕΣ ΦΥΤΟΠΡΟΣΤΑΤΕΥΤΙΚΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ Εντομοκτόνα (Insecticides): Ζιζανιοκτόνα (Herbicides): Μυκητοκτόνα (Fungicides): LINURON Φυσικές και Χημικές Ιδιότητες του Linuron Τοξικότητα MONOLINURON Φυσικές και Χημικές Ιδιότητες ΝΟΜΟΘΕΣΙΑ ΠΕΙΡΑΜΑΤΑ ΤΟΞΙΚΟΤΗΤΑΣ ΚΑΙ LEMNA MINOR 2.1. ΤΟΞΙΚΟΛΟΓΙΑ Η ΕΝΝΟΙΑ ΤΗΣ ΤΟΞΙΚΟΤΗΤΑΣ ΑΝΑΓΚΑΙΟΤΗΤΑ ΟΙΚΟΤΟΞΙΚΟΛΟΓΙΚΩΝ ΑΝΑΛΥΣΕΩΝ ΠΕΙΡΑΜΑΤΑ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΥ ΤΟΞΙΚΟΤΗΤΑΣ ΠΕΙΡΑΜΑΤΑ ΟΞΕΙΑΣ ΤΟΞΙΚΟΤΗΤΑΣ ΠΕΙΡΑΜΑΤΑ ΧΡΟΝΙΑΣ ΤΟΞΙΚΟΤΗΤΑΣ ΣΥΝΔΥΑΣΜΕΝΗ ΤΟΞΙΚΟΤΗΤΑ ΚΑΤΗΓΟΡΙΕΣ ΤΟΞΙΚΟΤΗΤΑΣ ΚΑΙ ΤΟΞΙΚΟΛΟΓΙΚΟΙ ΟΡΟΙ (ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ) ΕΠΙΛΟΓΗ ΚΑΤΑΛΛΗΛΟΥ ΟΡΓΑΝΙΣΜΟΥ ΒΑΣΙΚΕΣ ΑΡΧΕΣ ΣΤΑ ΠΕΙΡΑΜΑΤΑ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΥ ΤΟΞΙΚΟΤΗΤΑΣ LEMNA MINOR ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ 3.1. ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΠΡΩΤΟΚΟΛΛΟΥ Οι αρχές του πειράματος Εξοπλισμός...30

3 Συλλογή και καλλιέργεια της Lemna minor Θρεπτικό μέσο (medium) Έλεγχος και Μετρήσεις Έκθεση ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΠΕΙΡΑΜΑΤΩΝ Παρασκευή θρεπτικού μέσου (medium) Αναλυτική περιγραφή πειράματος ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ 4.1. ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΗΣ ΤΟΞΙΚΟΤΗΤΑΣ ΤΟΥ LINURON ΣΤΗ LEMNA MINOR Προσδιορισμός του εύρους των αποτελεσμάτων συγκεντρώσεων επίδρασης του linuron στη Lemna minor Εκτίμηση τοξικότητας του linuron και προσδιορισμός της EC ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΗΣ ΤΟΞΙΚΟΤΗΤΑΣ ΤΟΥ MONOLINURON ΣΤΗ LEMNA MINOR Προσδιορισμός του εύρους των αποτελεσμάτων συγκεντρώσεων επίδρασης του monolinuron στη Lemna minor Εκτίμηση τοξικότητας του monolinuron και προσδιορισμός της EC ΣΥΓΚΡΙΣΗ ΤΙΜΩΝ ΤΗΣ EC 50 ΜΕ ΑΛΛΟΥΣ ΟΡΓΑΝΙΣΜΟΥΣ...49 ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ...51 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ..53

4 Στις οικογένειες μας...

5 Περίληψη Σκοπός της συγκεκριμένης πτυχιακής εργασίας είναι να εξεταστεί η τοξικότητα που παρουσιάζουν τα φυτοπροστατευτικά linuron και monolinuron. Για να πραγματοποιηθεί αυτός ο έλεγχος τοξικότητας χρησιμοποιήθηκε ο υδρόβιος οργανισμός lemna minor και υπολογίστηκε η τιμή της παραμέτρου EC 50. Η μέθοδος που ακολουθήθηκε για την εκπόνηση της εργασίας αυτής ήταν η διεξαγωγή μιας σειράς εβδομαδιαίων πειραμάτων όπως αυτή προτείνεται από το πρωτόκολλο OECD Guidelines for the testing of chemicals/ Lemna sp. Growth Inhibition Test. Τα αποτελέσματα που προέκυψαν έδειξαν ότι η τιμή της EC 50 για το linuron κυμαίνεται μεταξύ 20,44 ppb και 38,33 ppb και η αντίστοιχη τιμή για το monolinuron μεταξύ 296,5 ppb και 341,22 ppb. Σύμφωνα με τις παρατηρούμενες τιμές συμπεραίνουμε ότι το linuron έχει πιο ισχυρή τοξική δράση απ ότι το monolinuron. Ο οργανισμός lemna minor φαίνεται να παρουσιάζει ευαισθησία και στα δυο φυτοπροστατευτικά για τις συγκεντρώσεις που χρησιμοποιήθηκαν. Λέξεις κλειδιά: Linuron, monolinuron, lemna minor, EC 50, τοξικότητα, φυτοπροστατευτικά προϊόντα

6 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Ι- Φυτοπροστατευτικά προϊόντα και οι ουσίες Linuron, Monolinuron 1.1 Εισαγωγή Τα φυτοπροστατευτικά προϊόντα έχουν συμβάλλει σημαντικά στην αύξηση της παραγωγής στην γεωργία ελέγχοντας τα παράσιτα και τις ασθένειες των φυτών. Η ανάγκη να αυξηθεί η παραγωγή τροφής σε παγκόσμιο επίπεδο έτσι ώστε να ανταπεξέλθει σε επάρκεια στον ολοένα αυξανόμενο αριθμό του πληθυσμού, έχει πλέον αναγνωριστεί. Μια από τις στρατηγικές για την αύξηση της παραγωγικότητας των συγκομιδών είναι ο αποτελεσματικός παρασιτικός έλεγχος λόγω του ότι περισσότερο από το 45% της ετήσιας παραγωγής τροφής χάνεται επειδή προσβάλλεται από παράσιτα. Στις τροπικές χώρες, η απώλεια είναι ακόμα εντονότερη αφού η επικράτηση υψηλών θερμοκρασιών και υγρασίας συμβάλουν στον γρήγορο πολλαπλασιασμό των παρασίτων. (Abhilash et al., 2009) Σύμφωνα με την οδηγία 91/414 της ΕOK, ως φυτοπροστατευτικά προϊόντα (plant protection products) ορίζονται οι δραστικές ουσίες και τα σκευάσματα τα οποία περιέχουν μια ή περισσότερες δραστικές ουσίες, προσφέρονται με τη μορφή με την οποία παραδίδονται στο χρήστη και προορίζονται: α) να προστατεύουν τα φυτά ή τα φυτικά προϊόντα από κάθε είδους επιβλαβείς οργανισμούς ή να προλαμβάνουν τη δράση τους, εφόσον οι ουσίες ή τα σκευάσματα αυτά δεν ορίζονται διαφορετικά παρακάτω, β) να επηρεάζουν τις βιολογικές διεργασίες των φυτών, εκτός αν πρόκειται για θρεπτικές ουσίες (π.χ. ρυθμιστές αύξησης), γ) να διατηρούν τα φυτικά προϊόντα, εκτός αν πρόκειται για ουσίες ή προϊόντα που υπόκεινται σε ειδικές διατάξεις του Συμβουλίου ή της Επιτροπής σχετικά με τα συντηρητικά, δ) να καταστρέφουν τα ανεπιθύμητα φυτά, ή ε) να καταστρέφουν μέρη των φυτών, να επιβραδύνουν ή να παρεμποδίζουν την ανεπιθύμητη ανάπτυξη των φυτών. 1.2 Ιστορική αναδρομή Οι προσπάθειες να καταπολεμηθούν τα παράσιτα με χημικά είχαν ξεκινήσει πολλά εκατομμύρια χρόνια πριν. Στην Κίνα, γύρω στο 3000 π.χ. χρησιμοποιείτο ένα

7 μίγμα από ασβέστη, τέφρα ξύλου και κιμωλία για να θανατώνει έντομα τα οποία κατέστρεφαν την αγροτική παραγωγή. Τα πρώτα συνθετικά φυτοπροστατευτικά διατέθηκαν στην αγορά κατά την δεκαετία του 1940, προσφέροντας μεγάλα οφέλη στην ολοένα αυξανόμενη παραγωγή τροφίμων (van der Werf, 1996). Μέχρι τότε, οι αγρότες έλεγχαν τα παράσιτα των καλλιεργειών τους χρησιμοποιώντας παραδοσιακές μεθόδους -χωρίς τη χρήση χημικών- όπως η αμειψισπορά και η αγρανάπαυση. Άλλωστε πολύ λίγα χημικά προϊόντα, όπως το αρσενικό και η νικοτίνη, ήταν διαθέσιμα για χρήση στη γεωργία εκείνη την εποχή. Το 1945 με την εξέλιξη και παραγωγή DDT σύντομα ακολουθούμενη από το BHC και άλλα φυτοπροστατευτικά αρχίζει και η εποχή του χημικού παρασιτικού ελέγχου. Αρχικά, τα χημικά που παρασκευάστηκαν ανταποκρίθηκαν στις προσδοκίες των καλλιεργητών για παρασιτικό έλεγχο. Η χρήση τους ήταν εύκολη, δρούσαν γρήγορα και αποτελεσματικά όσον αφορά στην θανάτωση των παρασίτων που έπλητταν τις σοδειές. Ο ενθουσιασμός για τα νέα χημικά όπλα ήταν μεγάλος και έτσι η φήμη τους (και χρήση τους) δεν άργησε να διαδοθεί στις ΗΠΑ και στον υπόλοιπο κόσμο. Παρ όλα αυτά, τα προβλήματα δεν άργησαν να φανούν στην αποτελεσματικότητα κατά των παρασίτων αλλά και στις ανεξήγητες μεταβολές όσον αφορά σε ορισμένους πληθυσμούς πτηνών και ψαριών. Μέσα σε 2 χρόνια από την πρώτη χρήση του DDT παρατηρήθηκε ανθεκτικότητα σε φυτοφάρμακα από μύγες και άλλα παρασιτικά έντομα. Η χρήση των φυτοφαρμάκων δεν είχε μόνο σαν αποτέλεσμα την ανθεκτικότητα αλλά και την θανάτωση φυσικών εχθρών ορισμένων παρασίτων το οποίο είχε σαν συνέπεια την υπερβολική αύξηση του πληθυσμού αυτών καθιστώντας αυτά ως παράσιτα. Παράλληλα με τις άμεσες επιπτώσεις που είχε η χρήση εντομοκτόνων στα παράσιτα, οι επιπτώσεις που έφεραν στις καλλιέργειες αλλά και στο περιβάλλον δεν άργησαν να φανούν. Μεγάλος αριθμός θανάτων ψαριών και πουλιών που παρατηρήθηκαν στη φύση βρέθηκε να είναι απόρροια της χρήσης εντομοκτόνων και άλλων φυτοπροστατευτικών. Η ανησυχία μεγάλωσε όταν σε γάλα και άλλες τροφές εντοπίστηκαν υψηλές συγκεντρώσεις φυτοπροστατευτικών. Ο αυξανόμενος αριθμός των περιβαλλοντικών επιπτώσεων της εφαρμογής των φυτοπροστατευτικών που εντοπίστηκε χάρη στη βοήθεια ρυθμιστικών οργανισμών, οδήγησε στην μείωση και μερικές φορές ακόμα και στην απαγόρευση της χρήσης των φυτοπροστατευτικών προϊόντων (van der Werf, 1996).

8 Τελικά, το 1972, η χρήση του DDT και σχετικών χλωριωμένων εντομοκτόνων απαγορεύτηκε στις ΗΠΑ. Η παραγωγή και η χρήση φυτοπροστατευτικών συνεχίστηκε αλλά πολλά από τα νεότερα φυτοπροστατευτικά είχαν πολύ αυστηρή χρήση ως προς τη δοσολογία ανά εκτάριο. Παρότι μικρότερες ποσότητες φυτοπροστατευτικών χρησιμοποιούνταν ανά εκτάριο, η τοξικότητά τους ήταν πολύ μεγαλύτερη από εκείνη των προηγούμενων. Το πλεονέκτημά τους σε σχέση με προγενέστερα αυτών φυτοπροστατευτικά είναι ο μικρότερος χρόνος παραμονής τους στο περιβάλλον. Πουθενά, την παρούσα στιγμή, δεν υπάρχουν φυτοπροστατευτικά πιο πολύτιμα από αυτά των αναπτυσσόμενων χωρών και ειδικά εκείνων στις τροπικές περιοχές όπου επιδιώκουν να εισέλθουν στην παγκόσμια οικονομία παρέχοντας φρέσκα φρούτα και λαχανικά εκτός εποχής σε χώρες με πιο ήπια κλίμακα (Ecobichon, 2001). 1.3 Εφαρμογή και Τύχη φυτοπροστατευτικών προϊόντων στο περιβάλλον Τα φυτοπροστατευτικά συνήθως εφαρμόζονται με την μέθοδο του ψεκασμού στα φυτά ή/και στο έδαφος. Σε υγρή μορφή ενσωματώνονται ή εκχύνονται στα εδάφη ενώ σε στερεή μορφή εφαρμόζονται υπό την μορφή κόκκων ή επεξεργασίας σπόρου. Η χρήση των φυτοπροστατευτικών, που εξαρτάται από το στάδιο των καλλιεργειών, τον προοριζόμενο στόχο, την μέθοδο εφαρμογής και τις καιρικές συνθήκες, διανέμεται μεταξύ εδάφους, φυλλώματος ή υπολειμμάτων συγκομιδής και απωλειών λόγω κλίσης ( van der Werf, 1996). Μετά την εφαρμογή ενός φυτοπροστατευτικού αυτό μπορεί να απορροφηθεί από τα φυτά, να εξατμιστεί, να δεσμευτεί στο έδαφος (στα κολλοειδή της αργίλου ή στην οργανική ουσία) ή να περάσει στο υπέδαφος και στα υπόγεια νερά μέσω της έκπλυσης (αμμώδη εδάφη). Τέλος μπορεί να μετακινηθεί λόγω επιφανειακής απορροής σε λίμνες, ποτάμια και θάλασσα. Στο έδαφος μπορεί να υποστεί χημική ή μικροβιακή διάσπαση σε λιγότερο ή περισσότερο τοξικές ουσίες (μεταβολίτες). (Μαυρομανωλάκης, 2007) Αρχικά τα φυτοπροστατευτικά μεταφέρονται από τις γεωργικές εκτάσεις στα επιφανειακά νερά λόγω επιφανειακής απορροής. Το ποσό που χάνεται από τα πεδία και μεταφέρεται στα επιφανειακά νερά εξαρτάται από διάφορους παράγοντες συμπεριλαμβανομένων των χαρακτηριστικών του εδάφους, της τοπογραφίας, των καιρικών συνθηκών, των γεωργικών πρακτικών και των χημικών και περιβαλλοντικών ιδιοτήτων του κάθε φυτοπροστατευτικού. Οι χημικές αντιδράσεις και οι φυσικές μετατοπίσεις επηρεάζουν την παραμονή των χημικών στο έδαφος

9 αλλά με διαφορετικές περιβαλλοντικές επιπτώσεις. Τα χημικά τα οποία είναι αρκετά ανθεκτικά στην αποδόμηση και επαρκώς διαλυτά έτσι ώστε να μεταφέρονται στο νερό μπορεί να εντοπιστούν σε σημαντικές ποσότητες στους υδροφορείς (Konstantinou et al., 2006). Οι δρόμοι μεταφοράς μέσω των οποίων τα φυτοπροστατευτικά σκεδάζονται ή διαλύονται από την περιοχή εφαρμογής είναι ευρέως γνωστά. Αυτό που δεν είναι γνωστό είναι ο ρόλος που παίζει κάθε δρόμος μεταφοράς στην μεταφορά τους και στη μετέπειτα ρύπανση του περιβάλλοντος. Αυτό μπορεί να εξαρτάται από τις φυσικές και χημικές ιδιότητες του φυτοπροστατευτικού, αν και υπάρχει αβεβαιότητα σχετικά με αυτό. Οι απώλειες οφείλονται κυρίως στη χημική και βιολογική αποδόμηση του φυτοπροστατευτικού το οποίο φτάνει στην επιφάνεια της γης. Η πιθανή απώλεια λόγω της απορροής είναι μικρότερη από 5%. Το ποσό της απώλειας λόγω διύλισης είναι συνήθως μικρότερο από 1% και λόγω αεριοποίησης η απώλεια κυμαίνεται σε ποσοστό 40%-80% η οποία εξαρτάται από φυσικές ιδιότητες και από το περιβάλλον. Απώλειες προς την ατμόσφαιρα μπορεί να εμφανιστούν κατά τη διάρκεια της εφαρμογής. Στη σημασία τέτοιων απωλειών και στο που αυτές εναποτίθενται έχει δοθεί μεγάλη προσοχή. Με την εισαγωγή των συνθετικών φυτοπροστατευτικών στην ευρεία κατανάλωση κατά τη δεκαετία του 50, υπήρξε μια επαναστατική αλλαγή στους τύπους και τις κατηγορίες των χημικών. Αυτές οι αλλαγές είναι υπεύθυνες εν μέρει για τις αλλαγές στις γεωργικές πρακτικές και εν μέρει για τις περιβαλλοντικές ανησυχίες. Παρ όλα αυτά η έμφαση που δόθηκε στα οργανοχλωριωμένα εντομοκτόνα είχε θετικά αποτελέσματα λόγω της εύκολης ανάκτησης των ενώσεών τους από το περιβάλλον και λόγω της ευκολίας των μεθόδων ανάλυσης τους. Αυτό συγκεκριμένα μείωσε την δυσκολία των μετρήσεων των φυτοφαρμάκων στον αέρα και μας προειδοποίησε για το πραγματικό μέγεθος της κίνησης των φυτοπροστατευτικών στην ατμόσφαιρα παγκοσμίως. Στο περιβάλλον, όλα τα προϊόντα διασπώνται σε παράγωγα. Μόλις τελευταία η ανάλυση των παραγώγων των φυτοπροστατευτικών προϊόντων αποτέλεσε τρόπο ανίχνευσης των αρχικών προϊόντων. Γενικά τα παράγωγα είναι λιγότερο τοξικά αλλά αυτό δεν ισχύει πάντα. Για παράδειγμα ένα παράγωγο του παραθείου είναι πολύ περισσότερο τοξικό από την αρχική ουσία. Οι μηχανισμοί με τους οποίους τα φυτοπροστατευτικά εναποτίθενται στο έδαφος, συμπεριλαμβανομένης της υγρής εναπόθεσης, μπορεί να είναι με τη μορφή μορίων,

10 με τη μορφή ατμού, βροχής, χιονιού, πάγου ή ομίχλης. Η ομίχλη εμφανίζεται όταν οι υδρατμοί συμπυκνώνονται σε σταγονίδια των 2-60 μm. Αυτά τα σταγονίδια αντιπροσωπεύουν μόνο ένα μικρό μέρος της υγρασίας που παρουσιάζεται σε ένα σύννεφο ομίχλης και τα εναπομείναντα σταγονίδια παρουσιάζονται με τη μορφή ατμών. 1.4 Κατηγορίες φυτοπροστατευτικών προϊόντων Τα φυτοπροστατευτικά προϊόντα περιλαμβάνουν μια απέραντη σειρά φυσικών και συνθετικών ουσιών που ποικίλουν όσον αφορά στην χημική τους σύσταση. Το μόνο κοινό τους γνώρισμα είναι η ικανότητά τους να εξολοθρεύουν βιοτικά παράσιτα κάποιου είδους. Η οικολογία της ρύπανσης και η οικοτοξικολογία ασχολούνται κυρίως με τα συνθετικά οργανικά χημικά αν και άλλα μπορεί να έχουν σημαντικότερη επίδραση στο περιβάλλον σε ορισμένες περιπτώσεις. Σύμφωνα με την λειτουργία τους, τα φυτοπροστατευτικά μεγαλύτερης οικολογικής σημασίας χωρίζονται σε τρεις κατηγορίες, τα εντομοκτόνα, τα ζιζανιοκτόνα και τα μυκητοκτόνα (Connell & Miller, 1984) Εντομοκτόνα (Insecticides): Τα εντομοκτόνα που χρησιμοποιούνται συχνότερα είναι οι χλωριωμένοι υδρογονάνθρακες ή οι οργανοχλωριωμένες ενώσεις και οι οργανοφωσφορικές ενώσεις. Αυτή η ομάδα φυτοφαρμάκων περιλαμβάνει το DDT και σχετικές με αυτό ενώσεις οι οποίες έχουν χρησιμοποιηθεί εκτενώς στην γεωργία μέχρι πρόσφατα χάρη στη αποτελεσματικότητα και το χαμηλό τους κόστος. Η χρήση τους έφτασε τα μέγιστα στις αρχές της δεκαετίας του 70 αλλά λίγα χρόνια αργότερα περιορίστηκε λόγω της ανησυχίας που υπήρχε για τις επιπτώσεις τους στο περιβάλλον. Οι χλωριωμένοι υδρογονάνθρακες που ανήκουν στα εντομοκτόνα παρουσιάζουν κάποιες ομοιότητες ως προς τα χαρακτηριστικά τους. Διακρίνονται από χαμηλή διαλυτότητα, υψηλή λιποφιλία και η παραμονή τους στο φυσικό περιβάλλον είναι σχετικά μεγάλη. Επιπλέον, βιοσυσσωρεύονται σε ανεξάρτητους οργανισμούς και μπορεί να βιομεγεθυνθούν στις τροφικές αλυσίδες. Όσον αφορά στις οργανοφωσφορικές ενώσεις περίπου 40 από αυτές είναι διαθέσιμες εμπορικά σαν εντομοκτόνα. Τα γενικά χαρακτηριστικά τους διαφέρουν εμφανώς από αυτά των χλωριωμένων υδρογονανθράκων αφού έχουν περιορισμένη παραμονή στο φυσικό περιβάλλον, είναι διαλυτά στο νερό, δεν βιοσυσσωρεύονται και δεν βιομεγεθύνονται στις τροφικές αλυσίδες Ζιζανιοκτόνα (Herbicides):

11 Μεγάλη ποικιλία ουσιών έχουν χρησιμοποιηθεί ως ζιζανιοκτόνα. Η ανάπτυξη επιλεγμένων ζιζανιοκτόνων με ιδιότητες όμοιες με αυτές της αυξίνης και ιδιότητες αυξητικού ελέγχου των φυτών, οδήγησε σε εκτενή χρήση των ουσιών αυτών για έλεγχο των ζιζανίων στην γεωργία και τη δασονομία. Η πιο αποτελεσματική και ευρεία χρήση στην κατηγορία των ζιζανιοκτόνων είναι τα φαινοξικά οξέα συμπεριλαμβανομένων ουσιών όπως το 2,4-D και το 2,4,5-Τ. Ως γενικός κανόνας, τα φαινοξικά οξέα έχουν περιορισμένη παραμονή στο φυσικό περιβάλλον, είναι μετρίως διαλυτά στο νερό, μη βιοαποδομήσιμα και δεν βιομεγεθύνονται. Το 1992 ο παγκόσμιος αριθμός πωλήσεων για τα φυτοπροστατευτικά προϊόντα έδειξε ότι τα ζιζανιοκτόνα χρησιμοποιούνταν περισσότερο από οποιαδήποτε άλλη κατηγορία φυτοπροστατευτικών Μυκητοκτόνα (Fungicides): Τα μυκητοκτόνα χρησιμοποιούνται σε μικρότερες ποσότητες απ ότι τα εντομοκτόνα και τα ζιζανιοκτόνα. Εντούτοις, η χρήση τους ποικίλει περισσότερο από αυτή των δυο άλλων κατηγοριών φυτοπροστατευτικών με τα μυκητοκτόνα να χρησιμοποιούνται για την αναχαίτιση ανάπτυξης μυκήτων στην βιομηχανία χαρτιού, την ανθεκτικότητα υλικών στη μούχλα, τον έλεγχο αποσύνθεσης των φρούτων μετά την συγκομιδή και για πολλές άλλες περιπτώσεις. Οι επιπτώσεις που φέρουν στα φυσικά οικοσυστήματα είναι γενικά αμελητέες αν και μπορεί να θεωρηθούν σημαντικές σε ορισμένες περιπτώσεις. Από χημικής σκοπιάς, τα μυκητοκτόνα διαφέρουν πολύ το ένα με το άλλο με αποτέλεσμα να μην είναι εφικτό να μπορέσουμε να γενικεύσουμε τα χαρακτηριστικά τους. Σύμφωνα με επίσημα στοιχεία του Υπουργείου Αγροτικής Ανάπτυξης και Τροφίμων και συγκεκριμένα της Διεύθυνσης Προστασίας Φυτικής Παραγωγής τα σκευάσματα φυτοπροστατευτικών προϊόντων και βιοκτόνων που χρησιμοποιούνται αυτή την στιγμή στην Ελλάδα είναι 1781 (τελευταία ενημέρωση 19/5/2010).

12 Σχήμα 1: Κατανάλωση φυτοπροστατευτικών προϊόντων στην Ελλάδα για τα έτη (Πηγή: Konstantinou et al., 2006) Παρόλα αυτά υπολείμματα φυτοπροστατευτικών από άλλες χώρες μπορεί να εισέλθουν στην Ελλάδα μέσω των ποταμών που ξεκινούν από άλλες χώρες της Ευρωπαϊκής Ένωσης και καταλήγουν στην Ελλάδα. Η διαχείριση του νερού στα κράτη μέλη της Ευρωπαϊκής Ένωσης είναι συχνά περίπλοκη. Δέκα Ευρωπαϊκές χώρες λαμβάνουν περισσότερο από το μισό των συνολικών αποθεμάτων νερού τους από γειτονικές χώρες. Αυτή η κατανομή των λεκανών απορροής, σε διαφορετικές διοικητικές ή περιφερειακές μονάδες σημαίνει ότι μπορεί εύκολα να χαθεί ένα μέρος των μέτρων των επιπτώσεων που λαμβάνονται από μια χώρα ή μια άλλη. Η Ελλάδα μοιράζεται διασυνοριακά επιφανειακά νερά με ένα νέο κράτος μέλος της Ευρωπαϊκής Ένωσης (Βουλγαρία), με την Τουρκία και με άλλα υποψήφια κράτη μέλη της Ευρωπαϊκής Ένωσης (π.χ. Αλβανία, Σκόπια). Αν και η χρήση ορισμένων φυτοπροστατευτικών έχει απαγορευθεί στις χώρες της Ευρωπαϊκής Ένωσης, η παράνομη χρήση φυτοπροστατευτικών (παλιότερα φυτοπροστατευτικά που υπάρχουν ακόμα σε αποθήκες, παράνομες εισαγωγές κ. ά.) είναι ένα σοβαρό πρόβλημα σε κάποιες χώρες της ανατολικής Ευρώπης. Επιπλέον, στοιχεία όσον αφορά στην συγκέντρωση των φυτοπροστατευτικών στα διασυνοριακά ποτάμια της ανατολικής Ευρώπης δεν είναι διαθέσιμα και δεν έχουν παρθεί μέτρα γι αυτό (Vryzas et al., 2008). Στην παρούσα έρευνα, τα φυτοπροστατευτικά προϊόντα που εξετάζονται ανήκουν στην κατηγορία των ζιζανιοκτόνων και πιο συγκεκριμένα στις φαινυλουρίες. Οι

13 φαινυλουρίες είναι μια σημαντική κατηγορία τριάντα περίπου ζιζανιοκτόνων που ενεργούν στο έδαφος. Θεωρούνται επίμονα ζιζανιοκτόνα. για παράδειγμα μια εφαρμογή του diuron στο έδαφος μπορεί να αποτρέψει την ανάπτυξη ζιζανίων μέχρι και για ένα έτος. Σε υψηλή δοσολογία είναι χρήσιμα για ολοκληρωτική θανάτωση των ζιζανίων, ενώ η μικρή δοσολογία μπορεί να χρησιμοποιηθεί για επιλεκτικό έλεγχο των ζιζανίων σε ευρύ φάσμα συγκομιδών. Το 1984, οι εταιρείες παραγωγής ζιζανιοκτόνων που υπάγονται στην κατηγορία των φαινυλουριών υπολογίστηκε ότι είχαν κέρδη 550 εκατομμυρίων δολαρίων (Cremlyn,1991). 1.5 Linuron To Linuron ανήκει στην κατηγορία των υποκατεστημένων ουριών. Η ονομασία του κατά IUPAC είναι 3- (3,4 διχλωροφαινυλ) -1-μεθοξυ-1μεθυλουρία. Είναι ένα ζιζανιοκτόνο το οποίο παρασκευάστηκε από την εταιρεία E.I. Du Pont De Nemours and Co. και από την Hoechst AG (τωρινή AgrEvo GmbH). Στην αγορά μπορούμε να το συναντήσουμε με τις ονομασίες Afalon, Afalon Inuron, Linex, Linurex, DuPont 326, Linorox, Lorox, Hoe , Garnitan κ.ά. Εικόνα 2: Συντακτικός τύπος της ουσίας Linuron Αριθμός Ημ/νία Εγκρισης Εγκρισης Εμπορικό Ονομα Εγγυημένη Σύνθεση Ποσοστό % Λήξη Κάτοχος Παρασκευαστής Χώρα Έγκρισης Έγκρισης /12/2008 LINAGAN 50 SC linuron 50% β/ο 31/12/2013 AGAN CHEMICAL MANUFACTURERS ΙΣΡΑΗΛ LTD ΑΛΦΑ ΓΕΩΡΓΙΚΑ ΕΦΟΔΙΑ ΑΕBΕ

14 7922 3/6/2009 AFALON 47,5 WP linuron 47.5% β/β 31/12/2013 AGAN CHEMICAL MANUFACTURERS ΙΣΡΑΗΛ LTD MAGMA ΓΕΩΡΓΙΚΕΣ ΕΙΣΡΟΕΣ Ε.Π.Ε /9/2009 LINURON AGROLOGY 50 WP linuron 50% β/β 31/12/2013 AGAN CHEMICAL AGROLOGY MANUFACTURERS ΙΣΡΑΗΛ ΠΑΠΑΟΙΚΟΝΟΜΟΥ LTD Α.Β.Ε.Ε /9/2009 LINURON AGAN 50 WP linuron 50% β/β 31/12/2013 AGAN CHEMICAL MANUFACTURERS ΙΣΡΑΗΛ LTD ΑΛΦΑ ΓΕΩΡΓΙΚΑ ΕΦΟΔΙΑ ΑΕBΕ Στην Ελλάδα χρησιμοποιούνται 4 σκευάσματα που περιέχουν ως δραστική ουσία το Linuron. Στοιχεία των συγκεκριμένων σκευασμάτων εμφανίζονται στον παρακάτω πίνακα: Πίνακας 1: Πληροφορίες για τα 4 σκευάσματα της δραστικής ουσίας Linuron Πηγή: Υπουργείο Αγροτικής Ανάπτυξης και Τροφίμων Διεύθυνση Προστασίας Φυτικής Παραγωγής Δρα ως φωτοσυνθετικός ανασταλτικός παράγοντας ηλεκτρονίων, πράγμα που σημαίνει ότι μπορεί να ελέγχει τη βλάστηση και ανάπτυξη ετήσιων και πολυετών πλατύφυλλων και χλοωδών ζιζανίων. Συνήθως χρησιμοποιείται σε καλλιέργειες σόγιας, κρεμμυδιού, πατάτας, βαμβακιού, καλαμποκιού, καρότου, σπαραγγιού, φρούτων κ.ά. Είναι εκλεκτικό στον τρόπο διακίνησής του και απορροφάται κυρίως από τις ρίζες των φυτών αλλά και από το φύλλωμά τους με δυνατότητα μετακίνησης πρώτιστα από το ξύλωμα. Εμφανίζει χαμηλή κινητικότητα αλλά σε χονδροειδή εδάφη και σε εδάφη με χαμηλό οργανικό φορτίο μπορεί να εμφανιστεί αυξημένη κινητικότητα. Η μικροβιακή αποδόμηση είναι ο πρωταρχικός παράγοντας για την εξαφάνισή του από το έδαφος. Οι διαδικασίες απορρόφησης και μικροβιακής αποδόμηση περιορίζουν την εισχώρησή του στα υπόγεια νερά. Απορροές στα επιφανειακά νερά μπορεί να εμφανιστούν Φυσικές και Χημικές Ιδιότητες του Linuron Πίνακας 2: Φυσικοχημικές ιδιότητες του Linuron ΙΔΙΟΤΗΤΕΣ ΤΙΜΗ Μοριακός Τύπος C 9 H 10 Cl 2 N 2 O 2 Μοριακό Βάρος 249,1

15 CAS Registry No EEC No ph Φάση (25 ο C) Λευκοί κρύσταλλοι Σημείο τήξης ο C Τάση ατμών (50 ο C) 7,1 mpa logk ow (25 o C) 3 K oc 341 Διαλυτότητα στο νερό (25 ο C) 75 mg/l Διαλυτότητα στην ακετόνη (25 ο C) 500 g/l Χρόνος ημιζωής (μέρες) Σημείο βρασμού ο C Χρώμα Υπόλευκο Οσμή Αμυδρή Φυσική κατάσταση Σκόνη Φαινόμενη πυκνότητα 0,35-0,45 g/cc Σημείο ανάφλεξης Μη εύφλεκτο Εκρηκτικές ιδιότητες Μη εκρηκτικό Οξειδωτικές ικανότητες Μη οξειδωτικό Σταθερότητα Δεν υφίσταται πολυμερισμό Επικίνδυνες αντιδράσεις Καμία Υλικά προς αποφυγή Οξειδωτικά μέσα, οξέα, βάσεις Επικίνδυνα προϊόντα διασπάσεως Ενώσεις χλωρίου και οξείδια του αζώτου Εξάτμιση (20 ο C) 2.0 *10-4 Pa m 3 mol -1 CIPAC αρ. 76 Καθαρότητα 900g/kg Τοξικότητα Το Linuron είναι ταχέως απορροφούμενο από δια στόματος χρήση. Μεταβολίζεται αποτελεσματικά στα νεφρά των αρουραίων και δεν συσσωρεύεται στα θηλαστικά. Σε ανθρώπινους οργανισμούς μπορεί να προκαλέσει ερεθισμό στα μάτια, θεωρείται ύποπτο καρκινογένεσης και υπάρχει κίνδυνος σοβαρής βλάβης της υγείας ύστερα από παρατεταμένη έκθεση σε περίπτωση κατάποσης. Μπορεί να βλάψει το έμβρυο κατά την περίοδο της κύησης καθώς και να προκαλέσει πιθανούς

16 κινδύνους για εξασθένιση της γονιμότητας. Όσον αφορά στο περιβάλλον είναι πολύ τοξικό για τους υδρόβιους οργανισμούς καθώς επίσης μπορεί να προκαλέσει μακροχρόνιες δυσμενείς επιπτώσεις στο υδάτινο περιβάλλον. Στους παρακάτω πίνακες φαίνονται η τοξικότητα του linuron και οι επιπτώσεις της για ορισμένη δοσολογία σε συγκεκριμένους οργανισμούς. Πίνακας 3: Τοξικότητα του Linuron Οξεία Τοξικότητα Από στόματος Από δέρματος Από εισπνοή LD 50 (αρουραίους) >5000 mg/kg LD 50 (κουνέλια) >2000 mg/kg LC 50 (κουνέλια) >5 mg/l σε 4 ώρες Πίνακας 4: Επιδράσεις της τοξικότητας του Linuron Τοπικές επιδράσεις Ερεθισμός δέρματος Ερεθισμός οφθαλμού Ευαισθητοποίηση Ελάχιστα ερεθιστικό (κουνέλια) Μέτρια ερεθιστικό (κουνέλια) Δεν προκαλεί Πίνακας 5: Επιπτώσεις τοξικότητας του Linuron Χρόνια τοξικότητα NOAEL(αρουραίους)=25 ppm ή 1,3mg/kg/day (2 ώρες) NOEL(ποντίκια)=50ppm ή 6,5 mg/kg/day (2ώρες) Τοξικότητα στην αναπαραγωγή NOAEL(αρουραίους)=0,8-1,0mg/kg/day Καρκινογένεση EPA-Κατηγορία C EU-Κατηγορία καρκινογένεσης 3 IARC-Δεν κατατάσσεται

17 Μεταλλαξιγένεση Τερατογένεση Δεν προκαλεί NOAEL(αρουραίους)=20mg/kg/day (μητρικό και εμβρυικό) NOAEL-(κουνέλια)=10mg/kg/day (μητρικό) NOAEL-(κουνέλια)=25mg/kg/day (εμβρυικό) Όσον αφορά στα υπολείμματα του linuron, η καταστροφή τους θα πρέπει να γίνεται με θάψιμο σε ειδικό μέρος ή με αποτέφρωση σε ειδικές κάμινους φυτοφαρμάκων σύμφωνα με τοπικούς ή εθνικούς κανονισμούς. 1.6 Monolinuron Το monolinuron όπως και το linuron ανήκει στην κατηγορία των υποκατεστημένων ουριών. Η ονομασία του κατά IUPAC είναι 3-(4-χλωροφαινυλ)-1-μεθοξυ-1- μεθυλουρία. Είναι ζιζανιοκτόνο το οποίο παρασκευάστηκε από την εταιρεία Hoechst AG (τωρινή AgrEvo GmbH). Εικόνα 2: Συντακτικός τύπος της ουσίας monolinuron Η βιοχημική του δράση είναι όμοια με αυτή του linuron, αφού κι αυτό δρα ως φωτοσυνθετικός ανασταλτικός παράγοντας ηλεκτρονίων. Οι καλλιέργειες στις οποίες εφαρμόζεται είναι αυτές των σπαραγγιών, κρεμμυδιών, αμπελιών, καλαμποκιών, πράσων κ.ά., και ο τρόπος μετακίνησής του είναι όμοιος με αυτόν του linuron Φυσικές και Χημικές Ιδιότητες Στους πίνακες που ακολουθούν παρατίθενται οι φυσικοχημικές ιδιότητες του φυτοπροστατευτικού monolinuron και η τοξικότητα του για ορισμένη δοσολογία, σε συγκεκριμένους οργανισμούς.

18 Πίνακας 6: Φυσικοχημικές ιδιότητες του monolinuron ΙΔΙΟΤΗΤΕΣ ΤΙΜΗ Μοριακό Τύπος C 9 H 11 CIN 2 O 2 Μοριακό Βάρος 214,6 CAS Registry No EEC No Φάση Άχρωμοι Κρύσταλλοι Τάση ατμών (50 ο C) 100 mpa LogK ow 2.20 K oc Σημείο τήξης ο C Διαλυτότητα στο νερό (50 ο C) 735 mg/l Διαλυτότητα στην ακετόνη Εύκολα διαλυτό Χρόνος ημιζωής (μέρες) Σταθερότητα Αποσυντίθεται στους 220 ο C Εξάτμιση (25 ο C) 7.302*10-4 Pa m 3 mol -1 Πίνακας 7: Τοξικότητα του Monolinuron ΟΞΕΙΑ ΤΟΞΙΚΟΤΗΤΑ ΤΙΜΗ Από στόματος LD 50 (αρουραίους) > 2000 mg/kg Από δέρματος LD 50 (αρουραίους) Από εισπνοή LC 50 (αρουραίους) > 3,39 mg/l (4 ώρες) 1.7 Νομοθεσία Τα νέα μέτρα αυξάνουν τον αριθμό των διαθέσιμων φυτοφαρμάκων στα κράτη μέλη της Ε.Ε.. Απαγορεύουν όμως τη χρήση ορισμένων επικίνδυνων ουσιών και διασφαλίζουν την ασφαλέστερη χρήση των φυτοπροστατευτικών προϊόντων στην καθημερινότητα των πολιτών. Για την έγκριση, διάθεση στην αγορά και έλεγχο των φυτοπροστατευτικών προϊόντων ισχύει το παρακάτω Νομικό Πλαίσιο: Η Υπουργική Απόφαση 85418/ και ο νόμος 721/77 για εγκρίσεις σκευασμάτων μέσω ΑΣΥΓΕΦ ή μέσω συνοπτικής διαδικασίας που περιέχουν δραστικά συστατικά ήδη εγκεκριμένων στην Ελλάδα ή στην Ευρώπη.

19 Το Προεδρικό Διάταγμα 115/97 για εγκρίσεις σκευασμάτων τόσο νέες για την Ευρωπαϊκή Ένωση δραστικές ουσίες όσο και παλιές οι οποίες έχουν ήδη καταχωρηθεί στο Παράρτημα Ι. Το Προεδρικό Διάταγμα 205/2001 για εγκρίσεις βιοκτόνων τόσο για νέες για την Ευρωπαϊκή Ένωση δραστικές ουσίες όσο και για παλιές οι οποίες έχουν ήδη καταχωρηθεί στο Παράρτημα Ι, ΙΑ και ΙΒ. Ο νόμος 2538/97 και η τροποποίηση του νόμου 2538/97 (ΦΕΚ 242/ ) για προσωρινές εγκρίσεις σε σκευάσματα που περιέχουν δραστικά συστατικά μη εγκεκριμένα στη χώρα μας αλλά εγκεκριμένα σε 2 τουλάχιστον Ευρωπαϊκές χώρες (εκ των οποίων η μια Μεσογειακή). Πληροφορίες σχετικά με τα φυτοπροστατευτικά προϊόντα όπως η χορήγηση, αναθεώρηση και ανάκληση εγκρίσεων φυτοπροστατευτικών προϊόντων, η καταχώρηση των δραστικών ουσιών, τα μέτρα ελέγχου κ. ά. αναφέρονται εκτενώς στην Οδηγία 91/414/ΕΟΚ. Όσον αφορά στην έρευνα, η Οδηγία αναφέρει συγκεκριμένα ότι τα κράτη μέλη ορίζουν ότι τα πειράματα ή οι δοκιμές για σκοπούς έρευνας ή ανάπτυξης, που συνεπάγονται την ελευθέρωση στο περιβάλλον μη εγκεκριμένων φυτοπροστατευτικών προϊόντων, μπορούν να εκτελούνται μόνο εφόσον έχει χορηγηθεί έγκριση για διενέργεια δοκιμών υπό ελεγχόμενες συνθήκες, και για περιορισμένες ποσότητες και περιοχές. Σχετικά με τα φυτοπροστατευτικά που χρησιμοποιήσαμε στα πειράματα μας, οι σχετικές οδηγίες που τα αναφέρουν είναι η 91/414/ΕΟΚ αλλά και η απόφαση 2000/234/ΕΚ. Σύμφωνα με την Οδηγία 91/414/ΕΟΚ, το linuron ορίζεται ως εγκεκριμένο φυτοπροστατευτικό προϊόν με έναρξη ισχύος τον Ιανουάριο του 2004 και λήξη της καταχώρησης την 31/12/2013., Σύμφωνα με την Απόφαση 2000/234/ΕΚ 1) η ουσία monolinuron δεν καταχωρείται ως δραστική ουσία στο παράρτημα Ι της Οδηγίας 91/414/ΕΟΚ 2) τα κράτη μέλη εξασφαλίζουν: α. ότι οι εγκρίσεις φυτοπροστατευτικών προϊόντων τα οποία περιέχουν την ουσία monolinuron αποσύρονται εντός περιόδου έξι μηνών από την ημερομηνία της παρούσας απόφασης.

20 β. ότι, από την ημερομηνία κοινοποίησης της παρούσας απόφασης, καμία έγκριση φυτοπροστατευτικού προϊόντος το οποίο περιέχει την ουσία monolinuron δεν πρόκειται να χορηγηθεί ή να ανανεωθεί δυνάμει της παρέκκλισης η οποία προβλέπεται στο άρθρο 8 παράγραφος 2 της Οδηγίας 91/414/ΕΟΚ 3) τα κράτη μέλη χορηγούν περίοδο χάριτος για τη διάθεση, αποθήκευση, διάθεση στην αγορά και χρησιμοποίηση των υφιστάμενων αποθεμάτων σύμφωνα με τις διατάξεις του άρθρου 4 παράγραφος 6 της Οδηγίας 91/414/ΕΟΚ, η οποία είναι κατά το δυνατόν βραχεία και δεν υπερβαίνει τους 18 μήνες από την ημερομηνία κοινοποίησης της παρούσας απόφασης.

21 ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΙΙ Πειράματα τοξικότητας και Lemna minor 2.1 Τοξικολογία Η τοξικολογία στη γενική της περίπτωση, και πιο συγκεκριμένα η ανθρώπινη τοξικολογία, ήταν γνωστή από αρχαιοτάτων χρόνων. Από την εποχή των αρχαίων Αιγυπτίων και πιθανόν ακόμα νωρίτερα ο άνθρωπος χρησιμοποιούσε δηλητηριώδεις ουσίες για να σκοτώσει τους εχθρούς του, να αυτοκτονήσει, να απαλλαγεί από ανεπιθύμητα ζώα. Όμως η οικοτοξικολογία ως ανεξάρτητη επιστήμη αναπτύχθηκε κατά τις 3-4 τελευταίες δεκαετίες του εικοστού αιώνα. Η διαφορά της κλασσικής τοξικολογίας με την οικοτοξικολογία φανερώνεται από το πρόθεμα οικο- που είναι σύντμηση της λέξης οικοσύστημα. Έτσι η οικοτοξικολογία αναφέρεται στην επίδραση των τοξικών ουσιών γενικά στους οργανισμούς του οικοσυστήματος. Μπορούμε λοιπόν να τη θεωρήσουμε ως έναν από τους νεότερους κλάδους της Επιστήμης της Φύσης και περιλαμβάνει στοιχεία από πολλούς κλάδους όπως η Βιολογία, Οικολογία, Περιβαλλοντική Μηχανική, Ιατρική, Στατιστική κ.ά. (Κούγκολος, 2005). Υδατική τοξικολογία καλείται η ποιοτική και ποσοτική μελέτη των δυσμενών επιπτώσεων των χημικών ουσιών, αλλά και άλλων ανθρωπογενών υλικών, πάνω στους υδρόβιους οργανισμούς, ενώ παράλληλα προβλέπει και τις συγκεντρώσεις των ρύπων που αναμένονται στο υδατικό περιβάλλον (νερό, ίζημα, οργανισμοί). Επομένως περιλαμβάνει και τη μελέτη της τύχης και συμπεριφοράς των ουσιών στο περιβάλλον (Γατίδου, 2005). 2.2 Η έννοια της τοξικότητας Αν και η φράση ότι μια ουσία είναι τοξική χρησιμοποιείται συχνά και στην καθημερινή ζωή, είναι παραπλανητικό να θεωρούμε ότι κάποιες ουσίες είναι τοξικές, ενώ κάποιες άλλες όχι. Δεν υπάρχει σαφής γραμμή διαχωρισμού ανάμεσα στις «κακές» τοξικές ουσίες και στις «καλές» μη τοξικές. Ο Παράκελσος ( ), Ελβετός γιατρός, αλχημιστής, φιλόσοφος, που είναι από τους πρώτους που έβαλε την τοξικολογία σε επιστημονικές βάσεις έχει δηλώσει ότι όλες οι ουσίες είναι δηλητήριο. Δεν υπάρχει καμιά που να μην είναι δηλητήριο. Η σωστή δόση ξεχωρίζει το φάρμακο από το δηλητήριο. Μέχρι τον 19 ο αιώνα που η φαρμακολογία δεν είχε αναπτυχθεί ιδιαίτερα ήταν πολύ συνηθισμένο να παίρνει ο κόσμος μικρές δόσεις από δηλητήρια (π.χ. αρσενικό, διχρωμικό κάλιο) για φάρμακα. Από την άλλη είναι πολύ γνωστό ότι μεγάλες δόσεις από φάρμακα μπορεί να κάνει ζημιά στην υγεία.

22 Από την άλλη, βέβαια, είναι λογικό να θεωρούνται τοξικές οι ουσίες εκείνες που σε μικρή δόση ή σε μικρή συγκέντρωση μπορούν να προκαλέσουν θάνατο ή άλλη βλάβη στην υγεία. Για παράδειγμα το κυανιούχο κάλιο, οι διοξίνες, ο υδράργυρος θεωρούνται και δίκαια πολύ τοξικές ουσίες. Δεν πρέπει βέβαια να ξεχνάμε όμως ότι η δόση κάνει το δηλητήριο. Στις τοξικές ουσίες μιλάμε πάντα για δόση ή για συγκέντρωση τοξικής ουσίας. Προκειμένου για ουσίες που προσλαμβάνονται από τον οργανισμό της ξηράς (π.χ. ένα θηλαστικό) μετρούμε τη δόση ως mg τοξικής ουσίας/kg βάρους του οργανισμού. Θεωρείται δηλαδή, και αυτό είναι σε γενικές γραμμές σωστό, ότι ένα ποντίκι που ζυγίζει 2 kg μπορεί να αντέξει διπλάσια ποσότητα δηλητήριου από ένα ποντίκι που ζυγίζει 1 kg. Για έναν υδρόβιο όμως οργανισμό (ψάρια, ζωοπλαγκτόν, φυτοπλαγκτόν) το κριτήριο για την τοξικότητα είναι η συγκέντρωση της ουσίας στο νερό (mg/l ή μg/l της ουσίας). Είναι συνηθισμένο να ορίζουμε την τοξικότητα χρησιμοποιώντας το θάνατο κάποιων οργανισμών ως κριτήριο. Για παράδειγμα όταν κάποια σημαντική ποσότητα από ένα βαρύ μέταλλο πέσει σε μια λίμνη και αυξήσει τη συγκέντρωση του μετάλλου στο νερό, τότε θα παρατηρήσουμε θανάτους ψαριών και αυτό μας δίνει μια άμεση αίσθηση της τοξικότητας. Ένας οργανισμός όμως μπορεί να υποστεί βλάβες οι οποίες δεν θα τον οδηγήσουν στο θάνατο. Χαρακτηριστικό παράδειγμα είναι η αναπαραγωγή λειτουργία. Σε συγκέντρωση χαμηλότερη από αυτήν η οποία μπορεί να τον σκοτώσει, ο οργανισμός χάνει την ικανότητα του για αναπαραγωγή. Μπορούμε λοιπόν να ορίσουμε ότι τοξική είναι μία δόση ή συγκέντρωση ουσίας που προκαλεί αναστολή σε κάποια φυσιολογική λειτουργιά (Κούγκολος, 2005). 2.3 Αναγκαιότητα οικοτοξικολογικών αναλύσεων Οι οικοτοξικολογικές αναλύσεις είναι αναγκαίες και πρέπει να γίνονται συμπληρωματικά προς τις χημικές αναλύσεις για τους παρακάτω λόγους: 1. Είναι τεχνικά και οικονομικά αδύνατον σε ένα δείγμα νερών ή αποβλήτων να γίνει μεγάλος αριθμός αναλύσεων. Οι οικοτοξικολογικές αναλύσεις μπορούν να μας δείξουν ποια δείγματα είναι τοξικά ώστε να επιμείνουμε και να κάνουμε περισσότερες αναλύσεις στα δείγματα αυτά ώστε να ανακαλύψουμε την πηγή της τοξικότητας. 2. Μόνο οι τοξικολογικές αναλύσεις μας δίνουν το αποτέλεσμα της ύπαρξης τοξικών ουσιών σε ένα δείγμα. Μπορούμε να πούμε λοιπόν ότι οι χημικές αναλύσεις δίνουν την αιτία της ρύπανσης (ύπαρξης κάποιων τοξικών ουσιών σε συγκεκριμένες

23 συγκεντρώσεις), οι οικοτοξικολογικές δίνουν το αποτέλεσμα (επίδραση σε ζωντανούς οργανισμούς). 3. Με βάση το φαινόμενο του συνεργισμού πολλές φορές συμβαίνει να συνδυάζονται δύο τοξικές ουσίες σε σχετικά χαμηλές συγκεντρώσεις, αλλά η μία να επιτείνει το τοξικό αποτέλεσμα της άλλης και η συνολική επίδραση του δείγματος να είναι ιδιαίτερα τοξική. Κάτι τέτοιο είναι αδύνατο να προβλεφθεί με χημικές αναλύσεις. 4. Διαφορετικοί οργανισμοί (φύκη, ψάρια, μαλάκια, ζωοπλαγκτόν) έχουν διαφορετική ευαισθησία. Χρειάζεται λοιπόν μια σειρά πειραμάτων με διαφορετικούς οργανισμούς ώστε να διαπιστωθεί η τοξικότητα κάποιου δείγματος. 2.4 Πειράματα προσδιορισμού τοξικότητας Στα πειράματα της οικοτοξικολογίας το ζητούμενο είναι να προστατευθούν τα οικοσυστήματα. Βέβαια, διαταραχή σε ένα οικοσύστημα μπορεί πολλές φορές να έχει τραγικές συνέπειες και για τον άνθρωπο. Στην οικοτοξικολογία και στην υδατική τοξικολογία γίνονται πειράματα, όπου οι έμβιοι οργανισμοί χρησιμοποιούνται ως δείκτες για την μέτρηση της τοξικότητας χημικών ουσιών ή μειγμάτων στα οικοσυστήματα. Τα πειράματα αυτά λέγονται βιοδοκιμές ή βιολογικές δοκιμασίες (bioassays). Τα κριτήρια επιλογής ενός πειράματος είναι σε γενικές γραμμές τα ακόλουθα: Το πείραμα πρέπει να μην κρατά πολύ χρόνο και να μην κοστίζει πολύ Ο οργανισμός που χρησιμοποιείται ως δείκτης πρέπει να είναι κατά το δυνατόν ευαίσθητος. Τα αποτελέσματα πρέπει να είναι επαναλήψιμα. Πρέπει να υπάρχει η δυνατότητα να γίνονται πολλά πειράματα, ώστε να ελέγχονται οι πολλές νέες ουσίες που παράγονται κάθε χρόνο. Με τις βιοδοκιμές θέλουμε να διαπιστώσουμε ποιες είναι οι συγκεντρώσεις των τοξικών ουσιών που σκοτώνουν τους έμβιους οργανισμούς ή προκαλούν βλάβη σε κάποια ζωτική τους λειτουργία (π.χ. την ικανότητα αναπαραγωγής). Είναι σημαντικό να γίνονται πειράματα με περισσότερους από έναν οργανισμούς, οι οποίοι να είναι αντιπροσωπευτικοί των κρίκων της τροφικής αλυσίδας. Μερικά από τα πιο γνωστά πειράματα που χρησιμοποιούνται στην υδατική τοξικολογία είναι:

24 Τα πειράματα της ακινητοποίησης της Daphnia magna (24 hour acute immobilization test). Η Daphnia magna είναι καρκινοειδές, είδος ζωοπλαγκτού, πολυκύτταρος οργανισμός. Κατά την γέννηση έχει μήκος 0,5 mm και το ενήλικο περί τα 5mm. Ελέγχεται το ποσοστό των ζώων που έχουν ακινητοποιηθεί (συνήθως ακινησία σημαίνει θάνατος), 24 ώρες μετά την έκθεση τους σε τοξικές ουσίες (Κούγκολος, 2005). Για τα πειράματα χρησιμοποιούνται μόνο νεογνά και όχι ενήλικα ζώα. Επιπλέον, η Daphnia magna είναι ευαίσθητη στις πιο πολλές τοξικές ουσίες (η ευαισθησία ενός πειράματος προσδιορισμού τοξικότητας εξαρτάται και από τον οργανισμό δείκτη και από την τοξική ουσία). Το κυριότερο μειονέκτημα αυτής της βιοδοκιμής είναι ότι είναι δύσκολο σε ένα πείραμα να χρησιμοποιηθεί μεγάλος αριθμός ζώων και έτσι μερικές φορές η επαναληψιμότητα δεν είναι καλή. Το πείραμα της ανάπτυξης αλγών π.χ. της Chlorella ellipsoidea. Τα άλγη (ή μικροφύκη) είναι οργανισμοί, έτσι μπορεί να χρησιμοποιηθεί μεγάλος αριθμός οργανισμών ανά πείραμα. Το μειονέκτημα είναι ότι χρειάζεται όργανο για την μέτρηση της ανάπτυξης των αλγών, γιατί δεν μπορούν να μετρηθούν με γυμνό μάτι. Τα πειράματα κρατούν γύρω στις 3 μέρες. Τα πειράματα με τα ψάρια. Έχουν το πλεονέκτημα ότι χρησιμοποιούν οργανισμούς πολύ κοντά στους ανθρώπους (σπονδυλωτά). Μειονεκτήματα είναι ο μικρός αριθμός των οργανισμών ανά πείραμα και η μεγάλη διάρκεια των πειραμάτων. Τα πειράματα με καλλιεργημένα κύτταρα ψαριών. Αυτά είναι πιο ευαίσθητα από τα πειράματα με ολόκληρα ψάρια και διαρκούν λιγότερο. Τα πειράματα με μύκητες (π.χ. Sacharomyces Cerevisiae). Αυτά διαρκούν λιγότερο από τα πειράματα με την άλγη (έως μία μέρα). Πάντως η χρήση των μυκήτων ως οργανισμών δεικτών δεν είναι πολύ διαδεδομένη. Το Microtox test. Χρησιμοποιεί το βακτήριο Vibrio fischeri (παλαιότερη ονομασία Photobacterium phosphoreum) και είναι πολύ σύντομο (15-30 λεπτά). Οι μικροοργανισμοί αυτοί έχουν την ικανότητα να εκπέμπουν βιοφωταύγεια. Το τεστ μετρά την αναστολή στην ικανότητα αυτή που προκαλείται από τοξικές ουσίες. Πρέπει να σημειωθεί ότι ο μικροοργανισμός Vibrio fischeri ζει στη θάλασσα.

25 Τα τεστ με τους οργανισμούς Brachionus plicatilis και Artemia franciscana (παλαιότερη ονομασία Artemia salina) χρησιμοποιούνται για την μελέτη της τοξικότητας σε αλμυρά ή υφάλμυρα νερά. Το τεστ με την Artemia franciscana μπορεί να γίνει με γυμνό οφθαλμό, αλλά έχει το μειονέκτημα ότι η Artemia δεν είναι πολύ ευαίσθητος οργανισμός. Για να δούμε ευκρινώς τον οργανισμό Brachionus picatilis χρειαζόμαστε μια μεγέθυνση 10 φορές περίπου. Ο Brachionus picatilis είναι πιο ευαίσθητος στην ανίχνευση τοξικών ουσιών από την Artemia franciscana. 2.5 Πειράματα οξείας τοξικότητας Η οξεία τοξικότητα ορίζεται ως οι επιβλαβείς επιπτώσεις που εμφανίζονται μέσα σε μικρό διάστημα (24, 48 ή 96 ώρες) μετά την μεμονωμένη ή επαναλαμβανόμενη εφαρμογή της δοκιμαζόμενης ουσίας σε έναν οργανισμό. Τα πειράματα οξείας τοξικότητας έχουν ως αποτέλεσμα τον προσδιορισμό της αναχαιτιζόμενης (ΕC 50 ) ή θανατηφόρου (LC 50 ) συγκέντρωσης η οποία προκαλεί αναχαίτιση ή θανάτωση του 50% του δοκιμαζόμενου οργανισμού. 2.6 Πειράματα χρόνιας τοξικότητας Σύμφωνα με τους Suter et al.(1987) χρόνιες επιπτώσεις εμφανίζονται έπειτα από μακροχρόνια έκθεση σε δηλητήριο. Στην υδατική οικοτοξικολογία οργανισμοί όπως η daphnia είναι ιδιαίτερα ενδιαφέροντες εξ αιτίας της ευαισθησίας τους σε ευρύ φάσμα δηλητηρίων. Οι φυτικοί οργανισμοί είναι επίσης ενδιαφέροντες λόγω του ότι μπορούν να αξιολογήσουν τα αποτελέσματα της μόλυνσης στα οικοσυστήματα. 2.7 Συνδυασμένη τοξικότητα Έως πριν λίγα χρόνια τα πειράματα τοξικότητας γίνονταν με τη δοκιμής της τοξικότητας μιας μόνο ουσίας πάνω σε έναν οργανισμό. Στη φύση όμως οι τοξικές ουσίες ποτέ δεν βρίσκονται μεμονωμένες αλλά πολλές τοξικές ουσίες βρίσκονται στο ίδιο οικοσύστημα. Έτσι έχει μεγάλο θεωρητικό και πρακτικό ενδιαφέρον το να μπορεί να προβλεφθεί η συνδυασμένη τοξικότητα τοξικών που επιδρούν στον ίδιο οργανισμό. Για παράδειγμα η νομοθεσία που καθορίζει τη μέγιστη συγκέντρωση τοξικών που επιτρέπεται να χύνονται σε ένα οικοσύστημα (π.χ. μία λίμνη) βασίζεται σε πειράματα προσδιορισμού τοξικότητας μεμονωμένων ουσιών. Έχει βρεθεί όμως από ερευνητές ότι, σε ορισμένες περιπτώσεις, ο συνδυασμός πολλών τοξικών στις μέγιστες επιτρεπόμενες συγκεντρώσεις μπορεί να έχει τοξικότητα σε κάποιον

26 οργανισμό του οικοσυστήματος. Άρα είναι σημαντικό να εξετάζεται η συνδυασμένη τοξικότητα των ουσιών (interactive effect of chemicals). 2.8 Κατηγορίες τοξικότητας και τοξικολογικοί όροι (συντμήσεις) Με βάση την πολυετή εμπειρία των τοξικολόγων, οι τοξικές χημικές ουσίες χωρίζονται σε 4 κατηγορίες (Βαλαβανίδης, 2007) : 1. Πολύ τοξικές: <50mg/kg (LD 50 oral), <200 mg/kg (LD 50 dermal, δέρμα). 2. Μετρίως τοξικές: mg/kg (LD 50 oral), mg/kg (LD 50 dermal, για το δέρμα). 3. Ελαφρώς τοξικές: >500 mg/kg (LD 50 oral), >2000 mg/kg (LD 50 dermal). 4. Μη τοξικές: για υψηλότερες συγκεντρώσεις του ενός γραμμαρίου ανά μονάδα βάρους (συνήθως 1 κιλό). Τα τελευταία χρόνια έχουν επικρατήσει διάφοροι τοξικολογικοί όροι (Βαλαβανίδης, 2007): LD 50 (mean lethal dose for 50% mortality), θανατηφόρος δόση 50% LC 50 (mean lethal concentration for 50% mortality), θανατηφόρος συγκέντρωση 50% EC 50 (effect concentration 50%, concentration that causes an effect, not death, on 50% of tested organisms), συγκέντρωση πρόκλησης αποτελέσματος σε 50% του οργανισμού-πειραματόζωου LED 10 (effective dose corresponding to the lower 95% confidence limit on a dose associated with 10% response), αποτελεσματική δόση με 95% όρια αξιοπιστίας για δόση που ανταποκρίνεται σε 10% αποτέλεσμα (θνησιμότητα) IC 50 (inhibitory concentration that reduces the normal response, growth rates of algae, bacteria and other organisms by 50%), δόση αναστολής 50%, δοκιμασία για την ανάπτυξη βακτηρίων, φύκους και άλλων οργανισμών NOEC (No observed effects concentration, determined by graphical or statistical methods), συγκέντρωση μη παρατηρούμενου αποτελέσματος

27 NOEL (No observed effects level, parameter as a dose), επίπεδο (mg/kg) μη παρατηρούμενου αποτελέσματος (βλάβη στην υγεία οργανισμού) NOAEC (No observed adverse effects concentration, the effect is usually chosen for its impact upon the species tested), συγκέντρωση με μη παρατηρούμενη επίδραση σε συγκεκριμένο παράγοντα υγείας οργανισμού NOAEL (No observed adverse effect level), επίπεδο με μη παρατηρούμενες αρνητικές συνέπειες LOEC (Lowest observed effects concentration), χαμηλότερη συγκέντρωση όπου παρατηρείται αποτέλεσμα (βλάβη στον ζωντανό οργανισμό) LOEL (Lowest observed effects level), χαμηλότερο επίπεδο όπου παρατηρείται αποτέλεσμα MTC (Minimum Threshold conc.), ελάχιστη συγκέντρωση κατωφλίου (ουδός) MTD (Maximum tolerated dose), ανώτατη ανεκτή δόση (για τοξικολογικά πειράματα σε καρκινογόνες ουσίες) MATC (Minimum allowable toxicant concentration), ελάχιστη επιτρεπόμενη δόση τοξικής ουσίας TLV (Threshold Limit Value), Οριακή Τιμή Κατωφλίου, για το εργασιακό περιβάλλον (American Conference Govermental Industrial Hygienists) TLV-STEL (TLV-Short Team Exposure Limit), Μικρής Διάρκειας Έκθεση Οι συγκεντρώσεις για τους παραπάνω όρους μεταβάλλονται (συνήθως προς τα κάτω) μετά από νεότερα πειράματα περιβαλλοντικής τοξικολογίας και οικοτοξικολογίας που έχουν αυστηρότερα κριτήρια τελικών αποτελεσμάτων ή βλαβών στα πειραματόζωα. Επιπλέον, υπάρχουν και άλλοι όροι τοξικολογικών πειραμάτων που αφορούν εξειδικευμένα πειράματα οικοτοξικολογίας (Βαλαβανίδης, 2007). 2.9 Επιλογή κατάλληλου οργανισμού Μια από τις βασικότερες παραμέτρους για την σωστή διεξαγωγή πειραμάτων τοξικότητας είναι η επιλογή του κατάλληλου οργανισμού προς χρήση. Η επιλογή θα

28 πρέπει να γίνεται βάσει της οικολογικής σημασίας και της αφθονίας του οργανισμού αλλά και βάσει της ευκολίας και της ταχύτητας ανάπτυξής του υπό εργαστηριακές συνθήκες. Γενικότερα ένας οργανισμός για να χρησιμοποιηθεί σε πείραμα τοξικότητας θα πρέπει να πληρεί όσο το δυνατόν περισσότερα από τα παρακάτω κριτήρια (Γατίδου, 2005 ; Βαλαβανίδης, 2007) : Ευρεία γεωγραφική κατανομή και ευρύ φάσμα ευαισθησίας σε διάφορους ρύπους Να βρίσκεται σε αφθονία Να είναι εύκολο να βρεθεί στο συγκεκριμένο οικοσύστημα και να συλλεχθεί Να υπάρχει σε αρκετές ποσότητες ώστε να διευκολύνει τις αναλύσεις και τις τοξικολογικές παρατηρήσεις Οι θρεπτικές απαιτήσεις για τη σωστή ανάπτυξη του να είναι πλήρως γνωστές Να είναι γνωστή η ταξινομική του ταυτότητα και η γενετική του σύνθεση Να παρουσιάζει μικρή γενετική και φαινοτυπική ποικιλομορφία Να αναπτύσσεται γρήγορα αλλά και να γηράσκει εύκολα ώστε να γίνονται παρατηρήσεις και σε σχέση με την ηλικία του μέσα στα πλαίσια των τοξικολογικών ερευνών Να περιέχει τέτοιες συγκεντρώσεις του χημικού ρύπου ή ρύπων ώστε να διευκολύνεται η ανάλυση, αλλά και σε ποσότητες που να μην προκαλούν διαταραχές ή να σκοτώνουν τα άτομα του πληθυσμού Να είναι εύκολος στους χειρισμούς και κατάλληλος για εργαστηριακές μελέτες Αν είναι δυνατόν να είναι ενδογενής και να χαρακτηρίζει το οικοσύστημα της περιοχής που δέχεται την επίδραση της τοξικής ουσίας Είναι σημαντικός από οικολογική, οικονομική ή άλλη άποψη Σε διάφορα πειραματικά πρωτόκολλα προτείνονται διαφορετικά είδη οργανισμών είτε του γλυκού είτε του θαλασσινού νερού τα οποία μπορούν να χρησιμοποιηθούν σε πειράματα τοξικότητας (Γατίδου, 2005).

29 2.10 Βασικές αρχές στα πειράματα προσδιορισμού τοξικότητας Στα τεστ τοξικότητας δοκιμάζεται η επίδραση ενός δείγματος σε ζωντανούς οργανισμούς (βιοδοκιμές). Οι οργανισμοί που χρησιμοποιούνται στα τεστ τοξικότητας ανήκουν σε διάφορα στάδια της τροφικής αλυσίδας και συνήθως περιλαμβάνουν βακτήρια, πρωτόζωα, τροχόζωα, οστρακόδερμα και ψάρια καθώς επίσης και μικροφύκη και ανώτερους φυτικούς οργανισμούς. Στα τεστ τοξικότητας με τους παραπάνω οργανισμούς προσδιορίζεται η επίδραση ενός δείγματος στο ρυθμό ανάπτυξης, στη ζωτικότητα, στην αναπνοή ή σε άλλη φυσιολογική λειτουργία του οργανισμού που χρησιμοποιείται στο τεστ. Τα πειράματα οξείας τοξικότητας σύμφωνα με τον οδηγό του Αμερικανικού EPA περιλαμβάνουν έκθεση οποιουδήποτε οργανισμού από μια ομάδα είκοσι οργανισμών σε κάθε μια από τις πέντε συγκεντρώσεις της εκροής και στο νερό ρύθμισης (control water). Ανάμεσα στους δέκα πιο συχνά χρησιμοποιούμενους οργανισμούς είναι η Daphnia magna, και τα ψάρια fathead minnows (κοκκινόγαστρος, κυπρινοειδές ψάρι) και rainbow trout (ιριδίζουσα πέστροφα). Τα πειράματα χρησιμοποιούνται για τον ορισμό της συγκέντρωσης της εκροής, εκφρασμένη σε %, η οποία μέσα στον προκαθορισμένο χρόνο του τεστ προκαλεί θάνατο στο 50% των οργανισμών (EPA, 1993). Τα πειράματα μπορούν να διεξαχθούν ως μια απαίτηση από την ίδια τη βιομηχανία (selfmonitoring), από επιθεωρήσεις εκτίμησης συμμόρφωσης, από επιθεωρήσεις στη δειγματοληψία και από ειδικές επιτροπές. Τα πειράματα μπορεί να γίνουν σε ένα κεντρικό εργαστήριο ή στο περιβάλλον. Αυτά τα πειράματα προσδιορισμού τοξικότητας μπορεί να χρησιμοποιηθούν, εκτός των άλλων, και για τον έλεγχο της αποτελεσματικότητας πολλών τεχνολογιών επεξεργασίας αποβλήτων για έναν δεδομένο τύπο βιομηχανίας Lemna Minor Το υδρόβιο φυτό που συχνά αναφέρεται ως duckweed, Lemna spp., ανήκει στην οικογένεια Lemnaceae, το οποίο διαθέτει έναν μεγάλο αριθμό ειδών σε παγκόσμιο επίπεδο. Η διαφορετική τους εμφάνιση και ταξινόμηση έχει περιγραφεί εκτενώς. Η Lemna minor είναι ένα από τα αντιπροσωπευτικά είδη που εντοπίζεται σε ήπια κλίματα και συχνά χρησιμοποιείται σε πειράματα τοξικότητας (OECD, 2006).

30 Η Lemna minor είναι μονοκοτυλήδονο, αγγειόσπερμο φυτό (Böttcher et al., 2006) το οποίο αποτελείται από έναν δισκοειδή μίσχο και μία πολύ λεπτή ρίζα που προέρχεται από το κέντρο της χαμηλότερης επιφάνειας προς κάθε φύλλωμα (OECD, 2006). Το μέγεθος του φυτού είναι σχετικά μικρό αλλά παρ όλα αυτά το μέγεθος των φύλλων του είναι ικανοποιητικά μεγάλο ώστε να μετρούνται εύκολα με γυμνό μάτι (Drost et al., 2007). Είναι οργανισμός εύκολος στην καλλιέργεια και τον χειρισμό με υψηλά επίπεδα ανάπτυξης κάτω από εργαστηριακές συνθήκες και είναι πολύ ευαίσθητος σε μεγάλο αριθμό ρυπαντών (Drost et al., 2007). Σε σύγκριση με παλαιότερα φυτά, τα νεότερα τείνουν να είναι ωχρότερα, με χρώμα ελαφρύ πράσινο και να αποτελούνται από 2 με 3 φύλλα διαφορετικού μεγέθους. Συνήθως συναντώνται στα επιφανειακά νερά και υφάλμυρα οικοσυστήματα, σε ήπια κλίματα. Αποτελούν σημαντική πηγή τροφής για διάφορα πουλιά και ψάρια και παρέχουν κατοικία σε ασπόνδυλα (Drost et al., 2007). Εικόνα 3: Lemna minor Η συμβολή της οικογένειας των duckweeds (Lemnaceae) είναι παγκόσμια και είναι γνωστά για την ανεκτικότητα τους στους παράγοντες πίεσης που ασκούνται στο περιβάλλον και την συσσώρευση των ξενοβιοτικών οργανισμών. Αυτό καθιστά τα duckweeds κατάλληλα για οικοτοξικολογικές μελέτες και ειδικά την Lemna minor για την οποία τυποποιημένες διαδικασίες ελέγχου είναι διαθέσιμες.

31 ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΙΙΙ-Μεθοδολογία Το πειραματικό στάδιο της παρούσας μελέτης ολοκληρώθηκε κατά τη διάρκεια του εαρινού εξαμήνου του ακαδημαϊκού έτους Αφορούσε στις επιδράσεις της χρήσης των ζιζανιοκτόνων linuron και monolinuron στον οργανισμό Lemna minor. Η διαδικασία που ακολουθήθηκε για την εκπόνηση της συγκεκριμένης μελέτης έγινε βάσει του πρωτοκόλλου «221 Lemna sp. Growth Inhibition Test» του Οργανισμού για την Οικονομική Συνεργασία και Ανάπτυξη (OECD). Τα πειράματα έλαβαν χώρα στα εργαστήρια Ποιότητας Υδάτων και Αέρα, Διαχείρισης Υγρών Αποβλήτων και Βιολογίας τα οποία στεγάζονται στο κτήριο Ξενία Β του τμήματος Περιβάλλοντος του Πανεπιστημίου Αιγαίου. Παρακάτω παρατίθεται λεπτομερής ανάλυση των διαδικασιών που ακολουθήθηκαν κατά την διάρκεια των πειραμάτων. 3.1 ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΠΡΩΤΟΚΟΛΛΟΥ Το συγκεκριμένο πρωτόκολλο σχεδιάστηκε για να αξιολογήσει την τοξικότητα των ουσιών στα υδρόβια φυτά του γλυκού νερού του γένους Lemna. Περιγράφει τον έλεγχο τοξικότητας με την χρήση των οργανισμών Lemna gibba και Lemna minor, από τους οποίους και οι δύο έχουν μελετηθεί εκτενώς και είναι το αντικείμενο των προτύπων που αναφέρονται παρακάτω. Λεπτομέρειες για τον έλεγχο με ή χωρίς ανανέωση δοκιμαστικού διαλύματος περιγράφονται Οι αρχές του πειράματος Η διάρκεια του πειράματος είναι εφτά ημέρες. Το αντικείμενο του πειράματος είναι να ποσοτικοποιήσει τις σχετικές με την δοκιμαζόμενη ουσία επιδράσεις στη βλάστηση κατά την διάρκεια μιας περιόδου, βασισμένη σε εκτιμήσεις επιλεγμένων μεταβλητών μέτρησης. Ο αριθμός των φύλλων είναι βασική μεταβλητή μέτρησης. Τουλάχιστον μία ακόμα μεταβλητή (π.χ. ξηρό βάρος) μετριέται εφόσον μερικές ουσίες μπορεί να επηρεάσουν άλλες μεταβλητές περισσότερο από αυτή του αριθμού των φύλλων. Για να ποσοτικοποιήσουμε τις σχετικές με την δοκιμαζόμενη ουσία επιδράσεις η ανάπτυξη στο δοκιμαστικό διάλυμα συγκρίνεται με αυτή του διαλύματος ελέγχου και η συγκέντρωση είναι αυτή που καθορίζει την επί τις εκατό αναχαίτιση η οποία εντοπίζεται και εκφράζεται ως EC x (στην προκριμένη περίπτωση EC 50 ). Στατιστικά μπορούν επιπλέον να εντοπιστούν οι παράμετροι LOEC (κατώτατη συγκέντρωση στην οποία παρατηρούνται επιπτώσεις) και NOEC (συγκέντρωση στην οποία δεν παρατηρείται καμία επίπτωση).

32 3.1.2.Εξοπλισμός Ο εξοπλισμός που χρησιμοποιήθηκε βάσει πρωτοκόλλου αποτελούνταν από γυάλινα σκεύη. Τα γυαλικά που χρησιμοποιήθηκαν για την καλλιέργεια αλλά και καθ όλη την πειραματική διαδικασία πρέπει να είναι καθαρισμένα από χημικούς ρυπαντές, που ίσως επιμολύνουν το θρεπτικό μέσο (medium), και πρέπει να έχουν αποστειρωθεί. Τα τριβλία που χρησιμοποιούνται πρέπει να είναι αρκετά φαρδιά έτσι ώστε να αποφευχθεί η αλληλοκάλυψη στο τέλος του εκάστοτε πειράματος. Οι διαστάσεις των τριβλίων θα πρέπει να ξεπερνούν τα 20 mm σε ύψος και τα 100 ml σε όγκο και θα πρέπει να κλείνονται με καπάκι έτσι ώστε να επιτυγχάνεται η ελάχιστη επίδραση από εξωτερικούς παράγοντες Συλλογή και καλλιέργεια της Lemna minor Ο συγκεκριμένος φυτικός οργανισμός μπορεί να προμηθευτεί από καλλιέργειες, από κάποια άλλα εργαστήρια ή από το πεδίο. Αν το δείγμα συλλεχθεί από το πεδίο θα πρέπει να συντηρηθεί για τουλάχιστον 8 εβδομάδες στο θρεπτικό μέσο το οποίο χρησιμοποιείται και για τα πειράματα. Η ίδια διαδικασία θα ακολουθηθεί για δείγματα που συλλέγονται από άλλο εργαστήριο ή καλλιέργειες για διάστημα 3 τουλάχιστον εβδομάδων. Οι υγιείς καλλιέργειες της Lemna minor αποτελούνται από δύο έως πέντε φύλλα. Η ποιότητα και ομοιομορφία των φυτών που χρησιμοποιούνται για το πείραμα θα έχουν σημαντική επιρροή στο αποτέλεσμα οπότε θα πρέπει να διαλέγονται με προσοχή. Νεαροί, ταχέως αναπτυσσόμενοι οργανισμοί χωρίς ορατές κακώσεις ή χλωρώσεις θα πρέπει να χρησιμοποιούνται. Μεγάλος αριθμός μονών φύλλων είναι ένδειξη περιβαλλοντικής πίεσης (π.χ. μειωμένα θρεπτικά). Για να μειωθεί η συχνότητα των καλλιεργειών, οι οργανισμοί θα πρέπει να διατηρούνται κάτω από συνθήκες μειωμένου φωτισμού και θερμοκρασίας (4 10 o C). Η περίοδος προσαρμογής των καλλιεργειών στις συνθήκες του πειράματος είναι 7 10 ημέρες. Η θερμοκρασία του θαλάμου πρέπει να είναι 24 ± 2 o C. Κατά τη διάρκεια του πειράματος το ph δεν πρέπει να αυξηθεί περισσότερο από 1,5 μονάδες Θρεπτικό μέσο (medium) Για την καλλιέργεια της Lemna minor συστήνεται ένα τροποποιημένο μοντέλο του Σουηδικού Προτύπου (SIS). Για την παρασκευή του χρησιμοποιούνται έξι υδατικά διαλύματα. Στον πίνακα 8 (σελ. 33) αναφέρονται τα αντιδραστήρια που χρησιμοποιούνται για κάθε διάλυμα και οι αναλογίες τους. Τα διαλύματα I-V αποστειρώνονταν σε κλίβανο στους C για περίπου είκοσι λεπτά ενώ το διάλυμα VI αποστειρωνόταν με διήθηση με την χρήση φίλτρου