B ProbeTec ET Mycobacterium tuberculosis Complex (DTB) Direct Detection Reagent Pack

Transcript

1 B ProbeTec ET Mycobacterium tuberculosis Complex (DTB) Direct Detection Reagent Pack JAA(04) Ελληνικά ΧΡΗΣΗ ΓΙΑ ΤΗΝ ΟΠΟΙΑ ΠΡΟΟΡΙΖΕΤΑΙ Η Συσκευασία Αντιδραστηρίου Άμεσης Ανίχνευσης Συμπλέγματος Mycobacterium tuberculosis BD ProbeTec ET, για χρήση με το Σύστημα BD ProbeTec ET, χρησιμοποιεί τεχνολογία ενίσχυσης με εκτόπιση κλώνου (Strand Displacement Amplification ή SDA) για την άμεση, ποιοτική ανίχνευση DNA του συμπλέγματος Mycobacterium tuberculosis από κλινικά αναπνευστικά δείγματα, όπως πτύελα, επαγόμενα πτύελα, βρογχικές εκπλύσεις και άλλα αναπνευστικά δείγματα που έχουν υποστεί ρευστοποίηση και ελαχιστοποίηση της συνυπάρχουσας χλωρίδας. Η Ανάλυση Άμεσης Ανίχνευσης Συμπλέγματος Mycobacterium tuberculosis BD ProbeTec ET (DTB) προορίζεται για χρήση ως άμεση εξέταση για την αξιολόγηση δειγμάτων από ασθενείς που δεν έχουν αντιμετωπιστεί θεραπευτικά και για τους οποίους υπάρχει υποψία φυματίωσης. Ως ασθενείς που δεν έχουν αντιμετωπιστεί θεραπευτικά νοούνται εκείνοι που: (1) δεν έχουν λάβει αντιφυματική θεραπεία, (2) δεν έχουν λάβει τέτοια θεραπεία κατά τους τελευταίους 125μήνες, ή (3) έλαβαν θεραπεία διάρκειας μικρότερης από 7 ημέρες. ΠΕΡΙΛΗΨΗ ΚΑΙ ΕΠΕΞΗΓΗΣΗ Ένα τρίτο περίπου του πληθυσμού παγκοσμίως μολύνεται από Mycobacterium tuberculosis και τα άτομα αυτά διατρέχουν κίνδυνο 10% να αναπτύξουν την ασθένεια στη διάρκεια της ζωής τους. 1,2 Υπολογίζεται ότι η φυματίωση ευθύνεται για το θάνατο 3 εκατομμυρίων ατόμων στον κόσμο ετησίως, γεγονός που την καθιστά το κύριο αίτιο θανάτου από μολυσματική νόσο. 1,3 Η βραδεία ανάπτυξη του οργανισμού M. tuberculosis καθυστερεί την κλινική διάγνωση και θεραπεία, συμβάλλοντας, έτσι, στην εξάπλωση της ασθένειας. Τα Κέντρα Ελέγχου και Πρόληψης Νοσημάτων (CDC) των Η.Π.Α. συνιστούν να καταβάλλεται κάθε προσπάθεια από τα εργαστήρια ώστε να χρησιμοποιούνται οι ταχύτερες μέθοδοι που διατίθενται για διαγνωστικές εξετάσεις μυκοβακτηρίων. 3 Η χρήση των τεχνικών ενίσχυσης DNA, όπως η SDA, επιτρέπουν ταχεία ανίχνευση και ταυτοποίηση του DNA συμπλέγματος M. tuberculosis σε κλινικά δείγματα, προωθώντας έτσι ταχύτερη ιατρική παρέμβαση. Η συσκευασία αντιδραστηρίων συμπλέγματος Mycobacterium tuberculosis (DTB) χρησιμοποιείται με το Σύστημα BD ProbeTec ET. Το σύστημα εξέτασης χρησιμοποιεί την τεχνολογία ομοιογενούς SDA ως μέθοδο ενίσχυσης και μεταφοράς φθορίζουσας ενέργειας (ET) ως μέθοδο ανίχνευσης για την εξέταση της παρουσίας του συμπλέγματος Mycobacterium tuberculosis απευθείας από αναπνευστικά δείγματα που έχουν υποβληθεί σε ρευστοποίηση και ελαχιστοποίηση της συνυπάρχουσας χλωρίδας (ιζήματα NALC- NaOH). Το σύμπλεγμα Mycobacterium tuberculosis αποτελείται από τους οργανισμούς M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG, M. africanum, και M. microti. 4,5 ΑΡΧΕΣ ΤΗΣ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑΣ Η Ανάλυση για το σύμπλεγμα Mycobacterium tuberculosis BD ProbeTec ET (DTB) βασίζεται στην ταυτόχρονη ενίσχυση και ανίχνευση του DNA-στόχου χρησιμοποιώντας εκκινητές ενίσχυσης και μια αλληλουχία ανίχνευσης με σήμανση φθορισμού. 6-8 Τα αντιδραστήρια SDA αφυδατώνονται σε δύο διαφορετικές αναλώσιμες μικροϋποδοχές. Το επεξεργασμένο με NALC-NaOH ίζημα προστίθεται στην Μικροϋποδοχή Εκκίνησης που περιέχει τους εκκινητές ενίσχυσης, τις αλληλουχίες ανίχνευσης με σήμανση φθορισμού, και άλλα αντιδραστήρια. Μετά την επώαση, το μείγμα αντίδρασης μεταφέρεται στην Μικροϋποδοχή Ενίσχυσης, που περιέχει δύο ένζυμα (μια πολυμεράση DNA και μια περιοριστική ενδονουκλεάση) που είναι απαραίτητα για την SDA. Οι Μικροϋποδοχές Ενίσχυσης σφραγίζονται για την πρόληψη μόλυνσης και επωάζονται σε θερμικά ελεγχόμενη συσκευή ανάγνωσης φθορισμού, η οποία παρακολουθεί την αντίδραση για τη δημιουργία προϊόντων ενίσχυσης. Κάθε αντίδραση ενισχύει και ανιχνεύει από κοινού έναν Εσωτερικό Μάρτυρα Ενίσχυσης (IAC). Σκοπός αυτού του μάρτυρα είναι η επιβεβαίωση της εγκυρότητας της αντίδρασης ενίσχυσης και η αναγνώριση δυνητικής αναστολής από το επεξεργασμένο δείγμα. Τα αποτελέσματα αναφέρονται ως θετικά, αρνητικά ή μη προσδιορίσιμα μέσω ενός αλγόριθμου. ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ ΚΑΙ ΥΛΙΚΑ Κάθε Συσκευασία Αντιδραστηρίου Άμεσης Ανίχνευσης Συμπλέγματος Mycobacterium tuberculosis BD ProbeTec ET περιέχει: Μικροϋποδοχές Εκκίνησης DTB, 3 x 32: 4 Ολιγονουκλεοτίδια 7,6 pmol, dntp 37,6 nmol, αλληλουχίες ανίχνευσης 30 pmol, Συνθετικό ολιγονουκλεοτίδιο αντίγραφα Μικροϋποδοχές Ενίσχυσης DTB, 3 x 32: Περιοριστικό ένζυμο 25,5 μονάδες, Πολυμεράση DNA 8 μονάδες, dntps 10 nmol Παρελκόμενα: 10 Καλύμματα, 8 Σακούλες απόρριψης, 16 Στεγανωτικά Κάθε Κιτ Επεξεργασίας Δείγματος Άμεσης Ανίχνευσης Συμπλέγματος Mycobacterium tuberculosis BD ProbeTec ET περιέχει: Ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης DTB ml που περιέχει ουρία, ρυθμιστικό διάλυμα CAPS, διμεθυλοσουλφοξείδιο, γλυκερόλη και υδροξείδιο του νατρίου, Ρυθμιστικό διάλυμα Λύσης DTB 2 50 ml υδροξειδίου του καλίου, Ρυθμιστικό διάλυμα Εξουδετέρωσης DTB ml που περιέχει βικίνη, υδροξείδιο του καλίου, διμεθυλοσουλφοξείδιο, γλυκερόλη και 0,03% Proclin (συντηρητικό). Κάθε Σετ Ελέγχου Άμεσης Ανίχνευσης Συμπλέγματος Mycobacterium tuberculosis BD ProbeTec ET περιέχει: Θετικό Μάρτυρα DTB DNA αφυδατωμένων όρχεων σολομού 5 µg και 750 αντίγραφα συνθετικού ολιγονουκλεοτιδίου ανά αντίδραση, συνολικά 5250 αντίγραφα. Αρνητικό Μάρτυρα DTB - DNA αφυδατωμένων όρχεων σολομού 5 µg.

2 Όργανα, εξοπλισμός και προμήθειες: BD ProbeTec ET instrument and instrument plate (Όργανο και πλάκα οργάνου), BD ProbeTec ET Priming and Warming Heater (Θερμαντήρας Εκκίνησης και Θέρμανσης), BD ProbeTec ET Oven (Φούρνος) ή φούρνος εργαστηρίου γενικής χρήσης με δυνατότητα θέρμανσης δειγμάτων σε θερμοκρασία 101 C ± 1 C για ελάχιστη διάρκεια 30 λεπτών και μέγιστη διάρκεια 35 λεπτών, BD ProbeTec ET Sonic Bath (Υδατόλουτρο υπερήχων) και ένθεμα BD ProbeTec ET, BD ProbeTec ET Pipettor (Αυτόματη πιπέτα) και παροχή ισχύος, Στατώ σωληναρίων δείγματος 2 ml, Clear Pipetting Rack (Διαφανές στατώ αναρρόφησης/διανομής), Σωληνάρια δείγματος 2 ml, Caps and BD ProbeTec ET Accessories Kit (Καπάκια 2 ml και Κιτ παρελκόμενων), CultureSwab EZ Swabs (Στυλεοί CultureSwab EZ). Υλικά που απαιτούνται αλλά δεν παρέχονται: Μικροφυγόκεντρος με κεφαλή συγκράτησης αερολυμάτων και τυπική κεφαλή ικανότητας x g (όπως ο τύπος μικροφυγόκεντρου Eppendorf 5417C), αναμείκτης περιδίνησης (vortex), αναλώσιμα γάντια, πιπέτες με ρύγχη στεγανά στα αερολύματα ικανά να διανέμουν όγκους 100 ml, 500 ml, 600 ml και 1 ml, 1% (v/v) υποχλωριώδες νάτριο με Alconox*, στείρα δοχεία ικανά για διατήρηση κλασμάτων των 3 Ρυθμιστικών διαλυμάτων DTB, χρονόμετρο, φυματιοκτόνο απολυμαντικό, απορροφητικά ταμπόν/γάζες, βαθμονομημένο θερμόμετρο. *Προσθέστε 7,5 g Alconox σε 1 L 1% (v/v) υποχλωριώδους νατρίου και αναμείξτε. Προετοιμάζετε νέο διάλυμα καθημερινά. Απαιτήσεις Φύλαξης και Χειρισμού: Οι συσκευασίες αντιδραστηρίων DTB μπορούν να φυλάσσονται στους 2 33 C. Μη χρησιμοποιείτε κλειστές μη ανοιγμένες συσκευασίες αντιδραστηρίων μετά την ημερομηνία λήξης. Αφού ανοιχθεί ο σάκος, οι μικροϋποδοχές είναι σταθερές για 4 εβδομάδες εφόσον είναι σωστά σφραγισμένες ή μέχρι την ημερομηνία λήξης ανάλογα με ποιο από τα δύο θα προηγηθεί. Μην καταψύχετε. Τα αντιδραστήρια επεξεργασίας DTB μπορούν να φυλάσσονται στους 2 33 C. Μη χρησιμοποιείτε τα αντιδραστήρια μετά την ημερομηνία λήξης. Μην καταψύχετε. Οι μάρτυρες DTB μπορούν να φυλάσσονται στους 2 33 C. Μη χρησιμοποιείτε τους μάρτυρες μετά την ημερομηνία λήξης. Μην καταψύχετε. ΠΡΟΕΙΔΟΠΟΙΗΣΕΙΣ ΚΑΙ ΠΡΟΦΥΛΑΞΕΙΣ Για in vitro διαγνωστική χρήση. 1. Δεν έχει καταδειχθεί η απόδοση αυτής της εξέτασης για την ανίχνευση του συμπλέγματος M. tuberculosis σε μη αναπνευστικά δείγματα, συμπεριλαμβανομένου, αλλά χωρίς να περιορίζεται σε αίμα, εγκεφαλονωτιαίο υγρό, κόπρανα ή ούρα. Η απόδοση της Ανάλυσης DTB BD ProbeTec ET δεν έχει αξιολογηθεί με δείγματα που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με μεθόδους διαφορετικές από αυτές που περιγράφονται σε αυτό το εσώκλειστο οδηγιών. 2. Τα βήματα χειρισμού και επεξεργασίας δειγμάτων μέσω του βήματος θερμικής αδρανοποίησης θα πρέπει να εκτελούνται σε θάλαμο βιολογικής ασφάλειας τάξης ΙΙ (Class II BSC). Η φυγοκέντρηση δείγματος πριν από το βήμα θερμικής αδρανοποίησης θα πρέπει να εκτελείται χρησιμοποιώντας αποκλειστικά την κεφαλή συγκράτησης αερολυμάτων. Η κεφαλή συγκράτησης αερολυμάτων θα πρέπει να ανοίγεται μόνο σε θάλαμο βιολογικής ασφάλειας. Για φυγοκέντρηση δειγμάτων μετά τη θερμική αδρανοποίηση, χρησιμοποιείτε μόνο την τυπική κεφαλή εκτός θαλάμου βιολογικής ασφάλειας. 3. Θα πρέπει να υποβάλλετε όλα τα επεξεργασμένα δείγματα σε καλλιέργεια για να προσδιοριστεί εάν υφίστανται μυκοβακτήρια πλην αυτού της φυματίωσης (MOTT), καθώς και να εκτελείτε αντιμυκοβακτηριακές εξετάσεις ευαισθησίας, να προσδιορίζετε τα υποείδη του συμπλέγματος M. tuberculosis ή/και να αξιολογείτε τη βιωσιμότητά τους. 4. Στα δείγματα ενδέχεται να υπάρχουν παθογόνοι μικροοργανισμοί, συμπεριλαμβανομένης της ηπατίτιδας Β και του ιού της ανοσοανεπάρκειας του ανθρώπου (HIV). Επομένως, τα δείγματα αυτά θα πρέπει να αντιμετωπίζονται ως μολυσματικά τηρώντας τις καθιερωμένες εργαστηριακές διαδικασίες 9,10,11 ή/και κατευθυντήριες οδηγίες του εκάστοτε ιδρύματος. 5. Μην εναλλάσσετε και μην αναμειγνύετε τις μικροϋποδοχές, τους μάρτυρες ή τα ρυθμιστικά διαλύματα επεξεργασίας από κιτ με διαφορετικούς αριθμούς παρτίδας. 6. Κατά την απόρριψη χρησιμοποιημένων ρυγχών πιπέτας, σωληναρίων δειγμάτων, καλυμμάτων εκκίνησης και άλλων αναλώσιμων ειδών, χρησιμοποιείτε τις καθιερωμένες εργαστηριακές πρακτικές. 7. Χρησιμοποιείτε μόνο την Αυτόματη πιπέτα BD ProbeTec ET και τα ρύγχη πιπέτας BD ProbeTec ET για τη μεταφορά των επεξεργασμένων δειγμάτων στις Μικροϋποδοχές Εκκίνησης και τη μεταφορά δειγμάτων από τις Μικροϋποδοχές Εκκίνησης στις Μικροϋποδοχές Ενίσχυσης. 8. Οι φάκελοι αντιδραστηρίων που περιέχουν μη χρησιμοποιημένες Μικροϋποδοχές Εκκίνησης και Μικροϋποδοχές Ενίσχυσης ΠΡΕΠΕΙ να επανασφραγίζονται προσεκτικά μετά το άνοιγμα. Βεβαιωθείτε ότι οι φάκελοι αντιδραστηρίων περιέχουν αποξηραντικό υλικό πριν τους επανασφραγίσετε. 9. Πριν μετακινηθεί από το Θερμαντήρα Εκκίνησης και Θέρμανσης BD ProbeTec ET στο Όργανο BD ProbeTec ET, η πλάκα που περιέχει τις Μικροϋποδοχές Ενίσχυσης ΠΡΕΠΕΙ να σφραγίζεται καλά με το Στεγανωτικό Ενίσχυσης. Η σφράγιση είναι απαραίτητη για την αποφυγή μόλυνσης του οργάνου και του χώρου εργασίας με προϊόντα ενίσχυσης. Μην αφαιρείτε ποτέ το υλικό σφράγισης από τις μικροϋποδοχές. 10. Σε περίπτωση κατά την οποία μια πλάκα εξέτασης υπερβαίνει τις 6 στήλες (> 48 δείγματα και Μάρτυρες), πρέπει να χρησιμοποιηθεί ΟΛΟΚΛΗΡΟ φύλλο στεγανωτικού Ενίσχυσης για την πρόληψη πιθανής μόλυνσης. 11. Για την πρόληψη μόλυνσης στο περιβάλλον εργασίας με προϊόντα ενίσχυσης, χρησιμοποιήστε τις σακούλες απόρριψης που παρέχονται για να απορρίψετε τις σφραγισμένες μικροϋποδοχές ενίσχυσης μετά την ολοκλήρωση της εξέτασης. 12. ΑΛΛΑΖΕΤΕ ΓΑΝΤΙΑ σε συγκεκριμένα βήματα κατά την επεξεργασία δείγματος και τη διαδικασία ανάλυσης για την πρόληψη επιμόλυνσης των δειγμάτων. Εάν τα γάντια έρχονται σε επαφή με δείγματα, αλλάζετέ τα αμέσως ώστε να αποφεύγετε την επιμόλυνση άλλων δειγμάτων. 13. Σε περίπτωση μόλυνσης του χώρου εργασίας ή του εξοπλισμού από επεξεργασμένο δείγμα καθαρίστε καλά τη μολυσμένη περιοχή με 1% (v/v) υποχλωριώδες νάτριο με Alconox και εκπλύνετε καλά με απιονισμένο/ απεσταγμένο νερό. Αφήστε τις επιφάνειες να στεγνώσουν καλά πριν εξακολουθήσετε την εργασία σας. 2

3 14. Καθαρίζετε κάθε μέρα όλη την επιφάνεια εργασίας πάγκους και επιφάνειες οργάνων με 1% υποχλωριώδες νάτριο με Alconox. Εκπλύνετε καλά με απιονισμένο/απεσταγμένο νερό. Αφήστε τις επιφάνειες να στεγνώσουν καλά πριν εξακολουθήσετε με άλλες εξετάσεις. 15. Οι μικροϋποδοχές εκκίνησης με υπόλειμμα υγρού (μετά τη μεταφορά του υγρού από τις Μικροϋποδοχές Εκκίνησης στις Μικροϋποδοχές Ενίσχυσης) αποτελούν πηγή εστιασμένης μόλυνσης. Πριν την απόρριψη σφραγίστε προσεκτικά τις Μικροϋποδοχές Eκκίνησης με στεγανωτικό πλάκας. 16. Μην τοποθετείτε τα δάκτυλα ή τα χέρια σας στο υδατόλουτρο υπερήχων όταν είναι ενεργοποιημένοι οι υπέρηχοι. Κάτι τέτοιο μπορεί να προκαλέσει δυσφορία και πιθανό ερεθισμό στο δέρμα. Επίσης, ενδέχεται να προκύψει μακροχρόνια βλάβη στο μαλακό ιστό. 17. Μη χρησιμοποιείτε θερμόμετρο υδράργυρου για να ελέγχετε τη θερμοκρασία του υδατόλουτρου υπερήχων. Για το σκοπό αυτό παρέχεται ψηφιακό θερμόμετρο. 18. Σε περίπτωση κάποιου ασυνήθιστου περιστατικού όπως έκχυση μέσα στο όργανο BD ProbeTec ET ή μόλυνση DNA που δεν μπορεί να αφαιρεθεί με καθαρισμό, επικοινωνήστε με το Τμήμα Τεχνικής Εξυπηρέτησης. 19. Εάν χρησιμοποιείτε φούρνο εργαστηρίου γενικής χρήσης, ακολουθήστε τις οδηγίες του εγχειριδίου χρήσης του φούρνου για πληροφορίες σχετικά με τη λειτουργία και τις προφυλάξεις ασφαλείας. 20. Χρησιμοποιείτε καθιερωμένες εργαστηριακές μεθόδους χειρισμού των δειγμάτων κατά τη διάρκεια της θερμικής αδρανοποίησης ή/και κατόπιν αυτής. Αρ. Κατ. Περιγραφή BBL MycoPrep Specimen Digestion/Decontamination Kit, δέκα φιάλες 75 ml με διάλυμα NALC-NaOH και 5 συσκευασίες φωσφορικού ρυθμιστικού διαλύματος BBL MycoPrep Specimen Digestion/Decontamination Kit, δέκα φιάλες 150 ml με διάλυμα NALC-NaOH και 10 συσκευασίες φωσφορικού ρυθμιστικού διαλύματος. Κίνδυνος H314 Προκαλεί σοβαρά δερματικά εγκαύματα και οφθαλμικές βλάβες. P260 Μην αναπνέετε σκόνη/αναθυμιάσεις/αέρια/σταγονίδια/ατμούς/εκνεφώματα. P280 Να φοράτε προστατευτικά γάντια/ προστατευτικά ενδύματα/μέσα ατομικής προστασίας για τα μάτια/πρόσωπο. P264 Πλύνετε σχολαστικά μετά το χειρισμό. P303+P361+P353 ΣΕ ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ ΕΠΑΦΗΣ ΜΕ ΤΟ ΔΕΡΜΑ (ή με τα μαλλιά): Αφαιρέστε αμέσως όλα τα μολυσμένα ενδύματα. Ξεπλύνετε το δέρμα με νερό/στο ντους. P405 Φυλάσσεται κλειδωμένο. P501 Διάθεση του περιεχομένου/περιέκτη σύμφωνα με τους τοπικούς/περιφερειακούς/εθνικούς/διεθνείς κανονισμούς. Αρ. Κατ. Περιγραφή Κάθε Κιτ Επεξεργασίας Δείγματος Άμεσης Ανίχνευσης Συμπλέγματος Mycobacterium tuberculosis BD ProbeTec ET περιέχει: Προσοχή H315 Προκαλεί ερεθισμό του δέρματος. H319 Προκαλεί σοβαρό οφθαλμικό ερεθισμό. H335 Μπορεί να προκαλέσει ερεθισμό της αναπνευστικής οδού. P280 Να φοράτε προστατευτικά γάντια/προστατευτικά ενδύματα/μέσα ατομικής προστασίας για τα μάτια/πρόσωπο. P264 Πλύνετε σχολαστικά μετά το χειρισμό. P312 Καλέστε το ΚΕΝΤΡΟ ΔΗΛΗΤΗΡΙΑΣΕΩΝ ή ένα γιατρό εάν αισθανθείτε αδιαθεσία. P405 Φυλάσσεται κλειδωμένο. P403+P233 Αποθηκεύεται σε καλά αεριζόμενο χώρο. Ο περιέκτης διατηρείται ερμητικά κλειστός. P501 Διάθεση του περιεχομένου/περιέκτη σύμφωνα με τους τοπικούς/περιφερειακούς/εθνικούς/διεθνείς κανονισμούς. Κίνδυνος H302 Επιβλαβές σε περίπτωση κατάποσης. H314 Προκαλεί σοβαρά δερματικά εγκαύματα και οφθαλμικές βλάβες. P260 Μην αναπνέετε σκόνη/αναθυμιάσεις/αέρια/σταγονίδια/ατμούς/εκνεφώματα. P280 Να φοράτε προστατευτικά γάντια/ προστατευτικά ενδύματα/μέσα ατομικής προστασίας για τα μάτια/πρόσωπο. P264 Πλύνετε σχολαστικά μετά το χειρισμό. P303+P361+P353 ΣΕ ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ ΕΠΑΦΗΣ ΜΕ ΤΟ ΔΕΡΜΑ (ή με τα μαλλιά): Αφαιρέστε αμέσως όλα τα μολυσμένα ενδύματα. Ξεπλύνετε το δέρμα με νερό/στο ντους. P405 Φυλάσσεται κλειδωμένο. P501 Διάθεση του περιεχομένου/περιέκτη σύμφωνα με τους τοπικούς/περιφερειακούς/εθνικούς/διεθνείς κανονισμούς. 3

4 Προσοχή H302 Επιβλαβές σε περίπτωση κατάποσης. P264 Πλύνετε σχολαστικά μετά το χειρισμό. P301+P312 ΣΕ ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ ΚΑΤΑΠΟΣΗΣ: Καλέστε το ΚΕΝΤΡΟ ΔΗΛΗΤΗΡΙΑΣΕΩΝ ή ένα γιατρό εάν αισθανθείτε αδιαθεσία. P501 Διάθεση του περιεχομένου/περιέκτη σύμφωνα με τους τοπικούς/περιφερειακούς/ εθνικούς/διεθνείς κανονισμούς. ΣΥΛΛΟΓΗ ΚΑΙ ΧΕΙΡΙΣΜΟΣ ΤΩΝ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ Όλα τα δείγματα θα πρέπει να συλλέγονται και να μεταφέρονται σύμφωνα με τις συστάσεις της CDC, του εγχειριδίου διαδικασιών κλινικής μικροβιολογίας Clinical Microbiology Procedures Handbook ή το εγχειρίδιο διαδικασιών του εργαστηρίου σας. 1,8 ΕΛΑΧΙΣΤΟΠΟΙΗΣΗ, ΡΕΥΣΤΟΠΟΙΗΣΗ ΚΑΙ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗ Τα δείγματα θα πρέπει να υποβάλλονται σε επεξεργασία χρησιμοποιώντας τη μέθοδο NALC-NaOH σύμφωνα με τις συστάσεις της CDC σχετικά με τη μυκοβακτηριολογία δημόσιας υγείας Public Health Mycobacteriology: A Guide for the Level III Laboratory. 1 Εναλλακτικά, χρησιμοποιήστε το κιτ BBL MycoPrep για την επεξεργασία μυκοβακτηριακών δειγμάτων (δείτε την ενότητα Διαθεσιμότητα ). ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Εάν η εξέταση της Ανάλυσης BD ProbeTec ET δεν εκτελείται αμέσως, τα ιζήματα NALC/NaOH μπορούν να φυλάσσονται ως εξής: (α) Στους 2 8 C μέχρι 5 ημέρες. (β) Για διάστημα άνω των 5 ημερών, κατεψυγμένα στους -20 C ή σε χαμηλότερη θερμοκρασία (χωρίς κύκλους) μέχρι τρεις μήνες. Τα κατεψυγμένα ιζήματα πρέπει να αποψύχονται σε θερμοκρασία δωματίου πριν την επεξεργασία για εξέταση DTB BD ProbeTec ET. ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑΣ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ A. Προετοιμασία Επεξεργασίας Δείγματος DTB BD ProbeTec ET Εκτός BSC 1. Τα ρυθμιστικά διαλύματα επεξεργασίας δείγματος πρέπει να βρίσκονται σε θερμοκρασία δωματίου και να είναι καλά αναμεμειγμένα πριν τη χρήση. Για να αποφύγετε μόλυνση των μητρικών ρυθμιστικών διαλυμάτων, διαιρέστε επαρκείς ποσότητες των ρυθμιστικών διαλυμάτων σε κατάλληλα επισημασμένα δοχεία ως εξής: α. Ρυθμιστικό διάλυμα DTB 1 1 ml ανά ίζημα NALC-NaOH που πρόκειται να υποβληθεί σε επεξεργασία πλέον συμπληρώματος 1 2 ml για λόγους ευκολίας στην αναρρόφηση. β. Ρυθμιστικό διάλυμα λύσης DTB 2 0,1 ml ανά ίζημα NALC-NaOH και μάρτυρες που πρόκειται να υποβληθούν σε επεξεργασία πλέον συμπληρώματος 0,5 1 ml για λόγους ευκολίας στην αναρρόφηση. γ. Ρυθμιστικό διάλυμα εξουδετέρωσης DTB 3 0,6 ml ανά ίζημα NALC-NaOH και μάρτυρες που πρόκειται να υποβληθούν σε επεξεργασία πλέον συμπληρώματος 0,5 1 ml για λόγους ευκολίας στην αναρρόφηση. δ. Για την αποφυγή μόλυνσης των ρυθμιστικών διαλυμάτων μην εκχέετε το υπολειπόμενο ρυθμιστικό διάλυμα πάλι στις φιάλες. 2. Χρησιμοποιείτε τις ετικέτες που παρέχονται με τα σωληνάρια δείγματος και σημειώστε ένα Σωληνάριο Δείγματος 2 ml για κάθε ίζημα NALC-NaOH που πρόκειται να υποβληθεί σε επεξεργασία. 3. Αφαιρέστε τα καπάκια από τα σωληνάρια δείγματος και διανείμετε 1,0 ml ρυθμιστικού διαλύματος DTB 1 σε κάθε σωληνάριο. Πωματίστε πάλι τα σωληνάρια. 4. Μετακινήστε τα σωληνάρια δείγματος στο θάλαμο BSC. B. Επεξεργασία δειγμάτων ιζήματος NALC-NaOH για Εξέταση DTB BD ProbeTec ET Εντός θαλάμου BSC ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Στην προετοιμασία για τη αφαίρεση των δειγμάτων, ετοιμάστε ένα δοχείο απόρριψης βιολογικά επικίνδυνων αποβλήτων. 1. Υποβάλλετε σε περιδίνηση (vortex) το πρώτο ίζημα NALC-NaOH για 5 s. 2. Χρησιμοποιώντας την αυτόματη πιπέτα στην οποία έχει τοποθετηθεί νέο ρύγχος στεγανό στα αερολύματα, μεταφέρετε 500 µl του ιζήματος NALC-NaOH στο κατάλληλα επισημασμένο σωληνάριο δείγματος που περιέχει 1 ml ρυθμιστικού διαλύματος DTB Πωματίστε πάλι ερμητικά το σωληνάριο. 4. Επαναλάβετε τα βήματα 1 3 για κάθε ίζημα NALC-NaOH. 5. ΑΛΛΑΞΤΕ ΓΑΝΤΙΑ. 6. Υποβάλλετε σε περιδίνηση κάθε Σωληνάριο Δείγματος για 5 s. 7. Τοποθετήστε κάθε σωληνάριο στην κεφαλή συγκράτησης αερολυμάτων και ασφαλίστε σφικτά το κάλυμμα συγκράτησης αερολυμάτων. Σκουπίστε την εξωτερική επιφάνεια της κεφαλής με πετσέτες ή γάζα που έχουν εμποτιστεί με αντιμικροβιακό διάλυμα. 8. Μεταφέρετε την κεφαλή συγκράτησης αερολυμάτων στο φυγόκεντρο. Φυγοκεντρήστε τα σωληνάρια στα 12,200 x g για 3 min. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Πρέπει να τηρούνται οι οριζόμενες συνθήκες φυγοκέντρησης καθώς ανεπαρκής φυγοκέντρηση ενδέχεται να οδηγήσει σε ψευδώς αρνητικά αποτελέσματα. 9. Αμέσως μετά τη φυγοκέντρηση, αφαιρέστε προσεκτικά την κεφαλή από το μικροφυγόκεντρο (χωρίς να καταστρέψετε το στεγανωτικό αερολυμάτων) και επιστρέψτε την κεφαλή στο θάλαμο BSC. 10. Αφαιρέστε το κάλυμμα συγκράτησης αερολυμάτων και αφαιρέστε αμέσως τα δείγματα από την κεφαλή με προσοχή ώστε να ελαχιστοποιηθεί η εκ νέου ανάμειξη του υπερκείμενου και του ιζήματος. 4

5 11. Αφαιρέστε το καπάκι από το πρώτο σωληνάριο και μεταγγίστε το υπερκείμενο στο δοχείο απόρριψης υγρών αποβλήτων που βρίσκεται στο θάλαμο BSC. Χρησιμοποιήστε μια απαλή ανάστροφη κίνηση και τελειώστε με ένα τίναγμα του ανεστραμμένου σωληναρίου προς τα κάτω. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Το ίζημα ενδέχεται να αποσυνδεθεί με την πάροδο του χρόνου. Εκτελέστε τα βήματα 9, 10 και 11 χωρίς καθυστέρηση. 12. Επανατοποθετήστε το καπάκι σφικτά και τοποθετήστε το σωληνάριο στο Στατώ Σωληναρίων Δείγματος 2 ml. 13. Επαναλάβετε τα βήματα 11 και 12 για όλα τα δείγματα. 14. ΑΛΛΑΞΤΕ ΓΑΝΤΙΑ. Γ.1. Θέρμανση δείγματος Φούρνος BD ProbeTec ET. ΣΗΜΕΙΩΣΕΙΣ: Βεβαιωθείτε ότι τα σωληνάρια δείγματος έχουν πωματιστεί σφικτά. Πριν θερμάνετε τα δείγματα στο φούρνο, εξετάστε οπτικά τα καπάκια των σωληναρίων δείγματος για να βεβαιωθείτε ότι είναι τοποθετημένοι καλά οι δακτύλιοι στεγανοποίησης. Εάν ο ελαστικός δακτύλιος στεγανοποίησης φαίνεται παραμορφωμένος ή εάν λείπει, αντικαταστήστε το καπάκι με νέο. Ανατρέξτε στο Εγχειρίδιο Χρήσης του Συστήματος BD ProbeTec ET για πλήρεις οδηγίες λειτουργίας, συμπεριλαμβανομένων σχετικών προειδοποιήσεων και προφυλάξεων. 1. Τοποθετήστε το Στατώ Σωληναρίων Δείγματος 2 ml στο φούρνο και κλείστε τη θύρα. 2. Επιλέξτε RUN #01. Πατήστε OK. 3. Πατήστε START για να εκκινήσει η εκτέλεση. 4. Όταν εκκινήσει ο κύκλος θέρμανσης, εκτελέστε τα ακόλουθα βήματα: α. Προετοιμάστε το υδατόλουτρο υπερήχων BD ProbeTec ET Sonic Bath. Η προετοιμασία αυτή περιλαμβάνει: (1) Τοποθετήστε το ένθεμα του υδατόλουτρου υπερήχων μέσα στο υδατόλουτρο. (2) Πληρώστε το υδατόλουτρο υπερήχων μέχρι την ενδεικτική γραμμή Maximum με ζεστό νερό βρύσης. (ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Δεν πρέπει να χρησιμοποιηθεί απιονισμένο νερό.) (3) Ορίστε τη θερμοκρασία στους 65 C και ενεργοποιήστε το θερμαντήρα. (4) Εκτελέστε υπέρηχους για 60 min (προεπιλεγμένη ρύθμιση) με τοποθετημένο το κάλυμμα του υδατόλουτρου υπερήχων. β. Ασφαλίστε την τυπική κεφαλή στο μικροφυγόκεντρο. 5. Μετά από 15 min στον κύκλο θέρμανσης, ελέγξτε και καταγράψτε τη θερμοκρασία στο εξωτερικό θερμόμετρο του φούρνου και βεβαιωθείτε ότι δεν είναι μεγαλύτερη ή ίση από 95 C. 6. Στο τέλος του κύκλου θέρμανσης του φούρνου η συσκευή εκπέμπει ηχητικό σήμα και η οθόνη LCD υποδεικνύει την ολοκλήρωση της εκτέλεσης με την ένδειξη DONE. Απελευθερώστε το σύρτη πατώντας το πλήκτρο OPEN DOOR και αφαιρέστε το στατώ σωληναρίων δείγματος 2 ml. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Εάν υπάρχουν μυκοβακτήρια στα σωληνάρια δείγματος καθίστανται με αυτό τον τρόπο μη-βιώσιμα και είναι δυνατή η διενέργεια περαιτέρω χειρισμών εκτός του θαλάμου BSC. Τα δείγματα πρέπει να εξακολουθούν να αντιμετωπίζονται ως δυνητικά βιολογικώς επικίνδυνα. Γ.2. Θέρμανση δειγμάτων Φούρνος εργαστηρίου γενικής χρήσης ΣΗΜΕΙΩΣΕΙΣ: Βεβαιωθείτε ότι έχετε κλείσει καλά τα πώματα στα σωληνάρια δειγμάτων. Πριν να θερμάνετε τα δείγματα στο φούρνο, ελέγξτε οπτικά τα καπάκια των σωληναρίων δειγμάτων, για ναβεβαιωθείτε ότι είναι οι δακτύλιοι στεγανοποίησης είναι κατάλληλα τοποθετημένοι. Εάν ο δακτύλιος στεγανοποίησηςδείχνει αλλοιωμένος ή απουσιάζει, τοποθετήστε καινούριο πώμα. Ανατρέξτε στο εγχειρίδιο χρήσης του φούρνου για πλήρεις οδηγίες λειτουργίας και για σχετικές προειδοποιήσεις καιπροφυλάξεις. 1. Τοποθετήστε το δειγματοφορέα σωληναρίων 2 ml στο φούρνο και κλείστε τη θύρα. 2. Η θερμοκρασία των δειγμάτων θα πρέπει να φτάσει στους 101 C ± 1 C για ελάχιστη διάρκεια 30 λεπτών και μέγιστη διάρκεια 35 λεπτών. Τηρείτε τις σχετικές οδηγίες σχετικά με το χρόνο και τη θερμοκρασία επώασης. 3. Ενώ πραγματοποιείται η θέρμανση των δειγμάτων στο φούρνο, προβείτε στις ακόλουθες ενέργειες: a. Προετοιμάστε το λουτρό υπερήχων BD ProbeTec ET Sonic Bath. Η προετοιμασία αυτή περιλαμβάνει τα εξής βήματα: (1) Προσθέστε το λουτρό υπερήχων μέσα στο υδατόλουτρο. (2) Γεμίστε το λουτρό υπερήχων μέχρι την ενδεικτική γραμμή Maximum με ζεστό νερό βρύσης. (ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Μη χρησιμοποιείτε απιονισμένο νερό.) (3) Ρυθμίστε τη θερμοκρασία στους 65 ΊC και ενεργοποιήστε το θερμαντήρα. (4) Ενεργοποιήστε τους υπέρηχους για 60 λεπτά (προεπιλεγμένη ρύθμιση), αφού τοποθετήσετε το κάλυμμα του λουτρού υπερήχων στη θέση του. β. Ασφαλίστε τον τυπικό στροφέα στη μικροφυγόκεντρο. 4. Όταν ολοκληρωθεί ο κύκλος θέρμανσης του φούρνου, αφαιρέστε το δειγματοφορέα σωληναρίων 2 ml. ΠΡΟΕΙΔΟΠΟΙΗΣΗ: Μην αγγίζετε το θερμό δειγματοφορέα σωληναρίων 2 ml χωρίς εξοπλισμό ατομικής προστασίας. Διαφορετικά, ενδέχεται να προκληθούν εγκαύματα. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Εάν υπάρχουν μυκοβακτηρίδια στα σωληνάρια δείγματος, αυτά καθίστανται μη βιώσιμα και είναι δυνατή η διενέργεια περαιτέρω χειρισμών εκτός του θαλάμου βιολογικής ασφάλειας. Τα δείγματα πρέπει να αντιμετωπίζονται πάντα ως δυνάμει βιολογικώς επικίνδυνα. 5

6 Δ. Λύση δείγματος Υδατόλουτρο υπερήχων BD ProbeTec ET Sonic Bath ΠΡΟΕΙΔΟΠΟΙΗΣΗ: Μην τοποθετείτε τα δάκτυλα ή τα χέρια σας στο υδατόλουτρο υπερήχων όταν είναι ενεργοποιημένοι οι υπέρηχοι. Κάτι τέτοιο μπορεί να προκαλέσει δυσφορία και πιθανό ερεθισμό στο δέρμα. Επίσης, ενδέχεται να προκύψει μακροχρόνια βλάβη στον μαλακό ιστό. ΠΡΟΕΙΔΟΠΟΙΗΣΗ: Μη χρησιμοποιείτε θερμόμετρο υδράργυρου για να ελέγχετε τη θερμοκρασία του υδατόλουτρου υπερήχων. Για το σκοπό αυτό παρέχεται ψηφιακό θερμόμετρο. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Ανατρέξτε στο Εγχειρίδιο Χρήσης του Συστήματος BD ProbeTec ET για πλήρεις οδηγίες λειτουργίας, συμπεριλαμβανομένων σχετικών προειδοποιήσεων και προφυλάξεων. 1. Τοποθετήστε τα σωληνάρια δείγματος στη μικροφυγόκεντρο με την τυπική κεφαλή. 2. Κλείστε το κάλυμμα και υποβάλλετε σε παλμική φυγοκέντρηση για 10 s. 3. Αφαιρέστε τα σωληνάρια από το φυγόκεντρο και εξετάστε τα καπάκια των σωληναρίων για την ύπαρξη συμπυκνώματος. Εάν είναι ορατό συμπύκνωμα, επαναλάβετε τη φυγοκέντρηση. 4. Τοποθετήστε τα σωληνάρια ξανά στο στατώ σωληναρίων δείγματος 2 ml. 5. Αφαιρέστε το καπάκι από το πρώτο σωληνάριο. Χρησιμοποιώντας την αυτόματη πιπέτα με ρύγχος στεγανό στα αερολύματα, διανείμετε 100 µl από το ρυθμιστικό διάλυμα λύσης DTB 2 στο σωληνάριο. Επανατοποθετήστε το καπάκι σφιχτά στο σωληνάριο δείγματος. 6. Επαναλάβετε τη διαδικασία για όλα τα δείγματα χρησιμοποιώντας νέο ρύγχος για κάθε δείγμα. 7. ΑΛΛΑΞΤΕ ΓΑΝΤΙΑ. 8. Υποβάλλετε σε περιδίνηση κάθε σωληνάριο για 5 s. Καθώς τοποθετείτε πάλι τα σωληνάρια στο στατώ σωληναρίων δείγματος 2 ml, βεβαιωθείτε ότι τα σωληνάρια είναι σφικτά πωματισμένα και πιέστε τα με τρόπο ώστε η προεξοχή του σωληναρίου να εδράζει στην χαραγμένη εγκοπή του στατώ. Αυτή η ευθυγράμμιση δίνει τη σωστή κατεύθυνση στα σωληνάρια για μέγιστη έκθεση στην υπερηχητική ενέργεια. 9. Απενεργοποιήστε τους υπέρηχους και βεβαιωθείτε ότι το επίπεδο του νερού βρίσκεται μεταξύ των ενδεικτικών γραμμών Minimum και Maximum στο ένθεμα του υδατόλουτρου υπερήχων. Αφαιρέστε ή προσθέστε ζεστό νερό βρύσης αναλόγως. Ελέγξτε τη θερμοκρασία του υδατόλουτρου υπερήχων με το ψηφιακό θερμόμετρο και βεβαιωθείτε ότι κυμαίνεται στους 65 +/- 5 C. Αφαιρέστε το θερμόμετρο από το υδατόλουτρο. 10. Μεταφέρετε το στατώ σωληναρίων δείγματος 2 ml στο ένθεμα του υδατόλουτρου υπερήχων. Τοποθετήστε το κάλυμμα του υδατόλουτρου υπερήχων. 11. Ορίστε το χρονόμετρο του υδατόλουτρου υπερήχων στα 45 min και ενεργοποιήστε τους υπέρηχους. 12. Στο τέλος της διαδικασίας υπερήχησης, απενεργοποιήστε το υδατόλουτρο υπερήχων και αφαιρέστε το στατώ σωληναρίων δείγματος των 2 ml. Τοποθετήστε το στατώ σε απορροφητικό χαρτί για να στεγνώσει. E. Εξουδετέρωση δείγματος 1. Τοποθετήστε τα σωληνάρια δείγματος στο μικροφυγόκεντρο με την τυπική κεφαλή. 2. Κλείστε το κάλυμμα και υποβάλλετε σε παλμική φυγοκέντρηση για 10 s. 3. Αφαιρέστε τα σωληνάρια από το φυγόκεντρο και εξετάστε τα καπάκια των σωληναρίων για την ύπαρξη συμπυκνώματος. Εάν είναι ορατό συμπύκνωμα, επαναλάβετε τη φυγοκέντρηση. 4. Τοποθετήστε τα σωληνάρια στο διαφανές στατώ αναρρόφησης/διανομής. 5. Αφαιρέστε το καπάκι από το πρώτο σωληνάριο. Χρησιμοποιώντας την αυτόματη πιπέτα με ρύγχος στεγανό στα αερολύματα, διανείμετε 600 µl από το ρυθμιστικό διάλυμα εξουδετέρωσης DTB 3 στο σωληνάριο. Πωματίστε ξανά και σφίξτε το καπάκι στο σωληνάριο δείγματος. 6. Επαναλάβετε τη διαδικασία για όλα τα δείγματα χρησιμοποιώντας νέο ρύγχος για κάθε σωληνάριο. 7. ΑΛΛΑΞΤΕ ΓΑΝΤΙΑ. 8. Υποβάλλετε σε περιδίνηση κάθε σωληνάριο για 5 s. 9. Υποβάλλετε τα σωληνάρια σε παλμική φυγοκέντρηση ακολουθώντας τα παραπάνω βήματα Τοποθετήστε τα σωληνάρια πάλι στο διαφανές στατώ αναρρόφησης/διανομής. 11. Τα επεξεργασμένα δείγματα είναι τώρα έτοιμα για εξέταση στο σύστημα BD ProbeTec ET. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Εάν δεν εκτελεστεί αμέσως η εξέταση, τα επεξεργασμένα δείγματα μπορούν να φυλάσσονται ως εξής: α) Στους C μέχρι 12 h. β) Στους 2 8 C μέχρι 4 ημέρες. Τα δείγματα πρέπει να επαναθερμαίνονται στο Φούρνο BD ProbeTec ET ή φούρνο εργαστηρίου γενικής χρήσης με δυνατότητα θέρμανσης δειγμάτων σε θερμοκρασία 101 C ± 1 C για ελάχιστη διάρκεια 30 λεπτών και μέγιστη διάρκεια 35 λεπτών, πριν από την εξέταση. γ) Κατεψυγμένα στους -20 C ή σε χαμηλότερη θερμοκρασία (χωρίς κύκλους) μέχρι 3 μήνες. Τα κατεψυγμένα δείγματα πρέπει να αποψύχονται σε θερμοκρασία δωματίου και να επαναθερμαίνονται στο Φούρνο BD ProbeTec ET ή φούρνο εργαστηρίου γενικής χρήσης με δυνατότητα θέρμανσης δειγμάτων σε θερμοκρασία 101 C ± 1 C για ελάχιστη διάρκεια 30 λεπτών και μέγιστη διάρκεια 35 λεπτών, πριν από την εξέταση. δ) Αφού επαναθερμάνετε τα σωληνάρια (σύμφωνα με τα παραπάνω βήματα β και γ), τοποθετήστε τα στο μικροφυγόκεντρο χρησιμοποιώντας την τυπική κεφαλή. Κλείστε το κάλυμμα και υποβάλλετε σε παλμική φυγοκέντρηση για 10 s. Αφαιρέστε τα σωληνάρια από το φυγόκεντρο και εξετάστε τα καπάκια των σωληναρίων για συμπύκνωμα. Εάν είναι ορατό συμπύκνωμα, επαναλάβετε τη φυγοκέντρηση. Τοποθετήστε τα σωληνάρια στο διαφανές στατώ αναρρόφησης/διανομής. Τα δείγματα είναι τώρα έτοιμα για εξέταση στο σύστημα BD ProbeTec ET. 6

7 ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ ΤΗΣ ΕΞΕΤΑΣΗΣ A. Προετοιμασία οργάνου 1. Ενεργοποιήστε το όργανο και αφήστε το να προθερμανθεί πριν την έναρξη της ανάλυσης. α. Ο Θερμαντήρας εκκίνησης και θέρμανσης απαιτεί περίοδο προθέρμανσης και σταθεροποίησης διάρκειας 90 περίπου min. Το σημείο ετοιμότητας του εξαρτήματος εκκίνησης του Θερμαντήρα εκκίνησης και θέρμανσης είναι 72,5 C. Το σημείο ετοιμότητας του εξαρτήματος θέρμανσης του Θερμαντήρα εκκίνησης και θέρμανσης είναι 54 C. β. Το όργανο BD ProbeTec ET λειτουργεί με λογισμικό και απαιτεί ελάχιστο χρόνο προθέρμανσης διάρκειας 30 min. 2. Οι θερμοκρασίες του θερμαντήρα εκκίνησης και θέρμανσης πρέπει να ελέγχονται πριν την έναρξη της ανάλυσης. Το θερμόμετρο του Θερμαντήρα εκκίνησης θα πρέπει να κυμαίνεται μεταξύ C. Το θερμόμετρο της μονάδας θέρμανσης θα πρέπει να κυμαίνεται μεταξύ 53,5 54,5 C. 3. Ελέγξτε τη θερμοκρασία που εμφανίζεται στην οθόνη του BD ProbeTec ET. Η θερμοκρασία θα πρέπει να κυμαίνεται μεταξύ 47,5 55,0 C. B. Αυτόματη πιπέτα BD ProbeTec ET Ανατρέξτε στο Εγχειρίδιο Χρήσης του Συστήματος BD ProbeTec ET για λεπτομερείς επεξηγήσεις των λειτουργιών του πληκτρολογίου της αυτόματης πιπέτας BD ProbeTec ET. Για την εκτέλεση της ανάλυσης DTB απαιτούνται τα ακόλουθα προγράμματα. Το πρόγραμμα 1 μεταφέρει υγρό από τα επεξεργασμένα δείγματα στις μικροϋποδοχές εκκίνησης. Το πρόγραμμα 5 μεταφέρει υγρό από τις μικροϋποδοχές εκκίνησης στις μικροϋποδοχές ενίσχυσης. Προγραμματίστε την αυτόματη πιπέτα ως εξής: Πρόγραμμα 1: 1. Ενεργοποιήστε την αυτόματη πιπέτα. Η αυτόματη πιπέτα θα εκπέμψει ένα ηχητικό σήμα, θα αναβοσβήσει η ένδειξη ZERO και ο αριθμός έκδοσης του λογισμικού Software Version # και θα εκπέμψει ηχητικό σήμα άλλη μια φορά. 2. Πατήστε το μπλε πλήκτρο Prog (προγραμματισμός). Πατήστε το πλήκτρο Vol (όγκος) μέχρι να εμφανιστεί η ένδειξη 1 για να επιλέξετε το Πρόγραμμα 1. Πατήστε Enter. 3. Για να ορίσετε τον τρόπο προγραμματισμού, πατήστε και κρατήστε πατημένο το πλήκτρο Prog. Ενώ πατάτε το πλήκτρο Prog, πατήστε ταυτόχρονα το Πλήκτρο Ειδικής Λειτουργίας με ένα ρύγχος πιπέτας ή το άκρο ενός συνδετήρα. 4. Πατήστε Fill (πλήρωση). Πατήστε το άνω βέλος μέχρι να εμφανιστεί η ένδειξη 200. Πατήστε Enter. 5. Πατήστε Disp (διανομή). Πατήστε το πλήκτρο άνω βέλους μέχρι να εμφανιστεί η ένδειξη 150. Πατήστε Enter. 6. Πατήστε Purge (εκκένωση). Πατήστε Enter. 7. Πατήστε Enter για δεύτερη φορά για να αποθηκεύσετε το πρόγραμμα και για την έξοδό σας από το μενού. Θα ακουστεί ένα ηχητικό σήμα που υποδηλώνει ότι ο προγραμματισμός ολοκληρώθηκε. 8. Επαληθεύστε το πρόγραμμα που επιλέξατε πατώντας το διακόπτη για να προχωρήσετε σε όλα τα βήματα. Καθώς προχωράτε σε κάθε βήμα, ορίστε την ταχύτητα αναρρόφησης/ διανομής χρησιμοποιώντας το πλήκτρο Vol. Σε κάθε βήμα εμφανίζεται η ένδειξη της ταχύτητας. Χρησιμοποιήστε το πλήκτρο Vol για να ρυθμίσετε την ένδειξη της ταχύτητας ώστε να εμφανίζονται 2 τετράγωνα στα βήματα Fill και Disp και 3 τετράγωνα για την εκκένωση Purge. Πρόγραμμα 5: 1. Πατήστε το πλήκτρο Prog. Πατήστε το πλήκτρο Vol μέχρι να εμφανιστεί η ένδειξη 5 για να επιλέξετε το πρόγραμμα 5. Πατήστε Enter. 2. Για να ορίσετε τον τρόπο προγραμματισμού, πατήστε και κρατήστε πατημένο το πλήκτρο Prog. Ενώ πατάτε το πλήκτρο Prog, πατήστε ταυτόχρονα το πλήκτρο ειδικής λειτουργίας με ένα ρύγχος πιπέτας ή το άκρο ενός συνδετήρα. 3. Πατήστε Fill. Πατήστε το άνω βέλος μέχρι να εμφανιστεί η ένδειξη 100. Πατήστε Enter. 4. Πατήστε Disp. Πατήστε το πλήκτρο άνω βέλους μέχρι να εμφανιστεί η ένδειξη 100. Πατήστε Enter. 5. Πατήστε Mix. Πατήστε το πλήκτρο άνω βέλους μέχρι να εμφανιστεί η ένδειξη 50. Πατήστε Enter. 6. Πατήστε Enter για δεύτερη φορά για να αποθηκεύσετε το πρόγραμμα και για την έξοδό σας από το μενού. Θα ακουστεί ένα ηχητικό σήμα που υποδηλώνει ότι ο προγραμματισμός ολοκληρώθηκε. 7. Επαληθεύστε το πρόγραμμα που επιλέξατε πατώντας το διακόπτη για να προχωρήσετε σε όλα τα βήματα. Καθώς προχωράτε σε κάθε βήμα, ορίστε την ταχύτητα αναρρόφησης/διανομής/ανάμειξης χρησιμοποιώντας το πλήκτρο Vol. Σε κάθε βήμα εμφανίζεται η ένδειξη της ταχύτητας. Χρησιμοποιήστε το πλήκτρο Vol για να ρυθμίσετε την ένδειξη της ταχύτητας ώστε να εμφανίζονται 2 τετράγωνα για τις λειτουργίες αναρρόφησης και διανομής. Χρησιμοποιήστε το πλήκτρο Vol για να ρυθμίσετε την ταχύτητα της ανάμειξης ώστε να εμφανίζονται 3 τετράγωνα. Αναθεώρηση προγραμμάτων Τα προγράμματα θα πρέπει να αναθεωρούνται πριν από την έναρξη της διαδικασίας. Για να εκτελέσετε αναθεώρηση των προγραμμάτων, ενεργοποιήστε πρώτα την αυτόματη πιπέτα. Πατήστε το μπλε πλήκτρο Prog (προγραμματισμός). Πατήστε το πλήκτρο Vol (Όγκος) μέχρι να εμφανιστεί ο αριθμός που υποδηλώνει το πρόγραμμα που πρόκειται να αναθεωρήσετε. Πατήστε το πλήκτρο Enter. Χρησιμοποιήστε το διακόπτη της αυτόματης πιπέτας για να προχωρήσετε βήμα βήμα σε όλη την έκταση του προγράμματος. 7

8 Πρόγραμμα 1: Αυτό το πρόγραμμα αναρροφά 200 µl και διανέμει 150 µl. Στην οθόνη της αυτόματης πιπέτας θα πρέπει να εμφανίζονται τα ακόλουθα: Fill 200 µl SII (πλήρωση 200 µl) Dispense 150 µl SII (διανομή 150 µl) Purge S III (εκκένωση) Με τον ίδιο τρόπο αναθεωρήστε και το πρόγραμμα 5: Πρόγραμμα 5: Το πρόγραμμα αυτό αναρροφά 100 µl, διανέμει 100 µl, και αναμειγνύει 50 µl τρεις φορές. Στην οθόνη της αυτόματης πιπέτας θα πρέπει να εμφανίζονται τα ακόλουθα: Fill 100 µl SII (πλήρωση 100 µl) Dispense 100 µl SII (διανομή 100 µl) Mix 50 µl S III (ανάμειξη 50 µl) Zero (αναβοσβήνει διακεκομμένα) Γ. Διάταξη πλάκας Η Αναφορά Διάταξης Πλάκας δημιουργείται από το όργανο BD ProbeTec ET αφού συνδεθούν στο σύστημα ο τύπος (οι τύποι) ανάλυσης, η ανίχνευση δείγματος, οι αριθμοί ελέγχου παρτίδας και οι αριθμοί παρτίδας κιτ. Η Αναφορά Διάταξης Πλάκας παρουσιάζει τη φυσική διάταξη των δειγμάτων και μαρτύρων για κάθε πλάκα που πρόκειται να εξεταστεί. Αυτή η διάταξη χρησιμοποιείται τόσο για την πλάκα μικροϋποδοχών εκκίνησης όσο και για την πλάκα μικροϋποδοχών ενίσχυσης. Για την Ανάλυση DTB, οι μικροϋποδοχές εκκίνησης είναι οι πορτοκαλί μονόχρωμες ταινίες μικροϋποδοχών. Οι Μικροϋποδοχές ενίσχυσης είναι οι πορτοκαλί ραβδωτές ταινίες μικροϋποδοχών. Δ. Προετοιμασία Μαρτύρων Ανάλυσης ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Οι Μάρτυρες DTB BD ProbeTec ET, το ρυθμιστικό διάλυμα λύσης DTB 2 και το ρυθμιστικό διάλυμα εξουδετέρωσης DTB 3 θα πρέπει να βρίσκονται σε θερμοκρασία δωματίου πριν από τη χρήση. Χρησιμοποιείτε ρυθμιστικά διαλύματα που έχουν προηγουμένως διαιρεθεί σε κλάσματα για την επεξεργασία του δείγματος. Αναμείξτε καλά πριν τη χρήση. 1. Για κάθε σειρά (πλάκα) που πρόκειται να εξεταστεί, προετοιμάστε ένα Σωληνάριο Αρνητικού Μάρτυρα DTB και ένα Σωληνάριο Θετικού Μάρτυρα DTB. Εάν η πλάκα περιέχει περισσότερους από έναν αριθμούς παρτίδας συσκευασίας αντιδραστηρίων DTB, οι μάρτυρες πρέπει να εξετάζονται με κάθε παρτίδα. 2. Αφαιρέστε το καπάκι από το Σωληνάριο Αρνητικού Μάρτυρα: α. Χρησιμοποιώντας νέο ρύγχος πιπέτας, διανείμετε 100 µl από το ρυθμιστικό διάλυμα λύσης DTB 2. β. Χρησιμοποιώντας νέο ρύγχος πιπέτας, διανείμετε 600 µl από το ρυθμιστικό διάλυμα εξουδετέρωσης DTB Πωματίστε ξανά και σφικτά το σωληνάριο και υποβάλλετε σε περιδίνηση για 5 s. 4. Αφαιρέστε το καπάκι από το Σωληνάριο Θετικού Μάρτυρα. α. Χρησιμοποιώντας νέο ρύγχος πιπέτας, διανείμετε 100 µl από το ρυθμιστικό διάλυμα λύσης DTB 2. β. Χρησιμοποιώντας νέο ρύγχος πιπέτας, διανείμετε 600 µl από το ρυθμιστικό διάλυμα εξουδετέρωσης DTB Πωματίστε ξανά και σφικτά το σωληνάριο και υποβάλλετε σε περιδίνηση για 5 s. 6. Τοποθετήστε τα σωληνάρια μαρτύρων στη μικροφυγόκεντρο με την τυπική κεφαλή. Κλείστε το κάλυμμα και υποβάλλετε σε παλμική φυγοκέντρηση για 10 s. Αφαιρέστε τα σωληνάρια από το φυγόκεντρο και τοποθετήστε τα στο διαφανές στατώ αναρρόφησης/διανομής. E. Διαδικασία Εξέτασης 1. Αφαιρέστε και απορρίψτε τα καπάκια από τα σωληνάρια δείγματος και μαρτύρων για την πρώτη εκτέλεση. 2. ΑΛΛΑΞΤΕ ΓΑΝΤΙΑ. 3. Προετοιμάστε την πλάκα μικροϋποδοχών εκκίνησης, χρησιμοποιώντας την Αναφορά Διάταξης Πλάκας ως οδηγό. 4. Επανασφραγίστε τους σάκους μικροϋποδοχών εκκίνησης ως εξής. α. Τοποθετήστε τον σάκο σε επίπεδη επιφάνεια. Κρατήστε επίπεδο με το ένα χέρι το ανοιχτό άκρο του σάκου. β. Ενώ ασκείτε πίεση, σύρετε το δάχτυλο κατά μήκος του εξωτερικού μέρους της σφράγισης μετακινώντας το από το ένα άκρο του σάκου στο άλλο. γ. Ελέγξτε για να βεβαιωθείτε ότι ο σάκος σφραγίστηκε. 5. Επιλέξτε το Πρόγραμμα 1 στην αυτόματη πιπέτα BD ProbeTec ET. 6. Τοποθετήστε τα ρύγχη πιπέτας. Επεκτείνετε την αυτόματη πιπέτα τραβώντας εντελώς το μπουτόν ανάπτυξης. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Για την πρόληψη διαρροής βεβαιωθείτε ότι τα ρύγχη προσαρμόζονται καλά στην αυτόματη πιπέτα. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Όταν αναρροφάτε δείγματα, αποφεύγετε προσεκτικά την αναρρόφηση σφαιριδίων υπολειμμάτων που ενδέχεται να φράξουν τα ρύγχη πιπετών και να επηρεάσουν τα αποτελέσματα της εξέτασης. 7. Αναρροφήστε 200 µl από την 1η στήλη δειγμάτων. 8. Συμπτύξτε απαλά την αυτόματη πιπέτα, αγγίξτε τα ρύγχη πιπετών στις πλευρές των υποδοχών και διανείμετε 150 µl στην πρώτη στήλη των μικροϋποδοχών εκκίνησης (1A-H). ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Είναι σημαντικό να διανέμετε υγρά επάνω στο εσωτερικό τοίχωμα των μικροϋποδοχών ώστε να διασφαλίζεται ορθότητα και ακρίβεια και να αποφεύγεται η επιμόλυνση. 9. Απορρίψτε τα ρύγχη. Πατήστε το διακόπτη του συστήματος για την επαναφορά της αυτόματης πιπέτας. 10. Τοποθετήστε νέα ρύγχη, επεκτείνετε την αυτόματη πιπέτα και αναρροφήστε 200 µl από τη 2η στήλη δειγμάτων. 8

9 11. Συμπτύξτε απαλά την αυτόματη πιπέτα, αγγίξτε τα ρύγχη πιπετών στις πλευρές των υποδοχών και διανείμετε 150 µl στη δεύτερη στήλη των μικροϋποδοχών εκκίνησης (2 A-H). ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Μην συμπτύσσετε την αυτόματη πιπέτα επάνω από τα δείγματα ή τις μικροϋποδοχές γιατί κάτι τέτοιο ενδέχεται να προκαλέσει μόλυνση. Οι απότομες κινήσεις μπορεί να προκαλέσουν σταγονίδια ή αερολύματα. 12. Απορρίψτε τα ρύγχη. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Απορρίψτε τα ρύγχη με προσοχή ώστε να αποφεύγονται σταγονίδια ή αερολύματα που μπορεί να μολύνουν το χώρο εργασίας. 13. Εξακολουθήστε να μεταφέρετε τα υπόλοιπα δείγματα της εκτέλεσης. 14. Καλύψτε την πλάκα μικροϋποδοχών εκκίνησης με το κάλυμμα εκκίνησης και αφήστε να επωαστεί η πλάκα σε θερμοκρασία δωματίου για 20 min τουλάχιστον. (Μπορεί να επωαστεί μέχρι 6 h.) ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Πωματίστε πάλι τα επεξεργασμένα δείγματα με νέα καπάκια. ΑΛΛΑΞΤΕ ΓΑΝΤΙΑ. 15. Όταν ολοκληρωθεί η επώαση εκκίνησης προετοιμάστε την πλάκα μικροϋποδοχών ενίσχυσης. Διαμορφώστε τις μικροϋποδοχές ενίσχυσης σε μια πλάκα με τον ίδιο τρόπο που υποδεικνύεται στην Αναφορά Διάταξης Πλάκας (όπως και στην πλάκα εκκίνησης). Επανασφραγίστε το σάκο μικροϋποδοχών ενίσχυσης όπως περιγράφεται στο βήμα Αφαιρέστε το κάλυμμα από την πλάκα μικροϋποδοχών εκκίνησης και μεταφέρετε την πλάκα στο θερμαντήρα εκκίνησης. Τοποθετήστε ΑΜΕΣΩΣ την πλάκα μικροϋποδοχών ενίσχυσης στη μονάδα θέρμανσης για να προθερμανθεί. 17. Ρυθμίστε το χρονόμετρο στα 10 min. (ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Ο οριζόμενος χρόνος είναι κρίσιμης σημασίας σε αυτό το βήμα.) 18. Όταν ολοκληρωθεί η επώαση των 10 min (+/- 1 λεπτό), επιλέξτε το Πρόγραμμα 5 στην αυτόματη πιπέτα. 19. Τοποθετήστε αμέσως ρύγχη και μεταφέρετε 100 µl από τη στήλη 1 της πλάκας μικροϋποδοχών εκκίνησης στη στήλη 1 της πλάκας μικροϋποδοχών ενίσχυσης. Αφήστε τα ρύγχη των πιπετών να αγγίξουν τις πλευρές των υποδοχών και διανείμετε το υγρό. Μετά τη διανομή, αφήστε την αυτόματη πιπέτα να αναμείξει αυτόματα το υγρό στις υποδοχές. 20. Απορρίψτε τα ρύγχη. Τοποθετήστε νέα ρύγχη και εξακολουθήστε τη μεταφορά του μείγματος αντίδρασης από τις μικροϋποδοχές εκκίνησης στις μικροϋποδοχές ενίσχυσης, ανά στήλη, χρησιμοποιώντας νέα ρύγχη για κάθε στήλη. 21. Όταν μεταφερθεί και η τελευταία στήλη, αφαιρέστε την οπίσθια επένδυση από ένα στεγανωτικό ενίσχυσης. (Ένα στεγανωτικό ενίσχυσης [1/2] καλύπτει μέχρι 6 στήλες, εάν η πλάκα υπερβαίνει τις 6 στήλες ΠΡΕΠΕΙ να χρησιμοποιηθεί ολόκληρο στεγανωτικό.) Κρατήστε το στεγανωτικό από τα άκρα και εφαρμόστε το επάνω από τις μικροϋποδοχές. Χρησιμοποιήστε τους οδηγούς που βρίσκονται στη μονάδα θέρμανσης ως βοήθημα για την εφαρμογή του στεγανωτικού. Πιέστε το στεγανωτικό προς τα κάτω ώστε να βεβαιωθείτε ότι όλες οι μικροϋποδοχές έχουν σφραγιστεί πλήρως. 22. Στην οθόνη του BD ProbeTec ET, μετακινήστε το φορέα προς τα έξω και ανοίξτε τις θύρες και το κάλυμμα της πλάκας. Μεταφέρετε ΑΜΕΣΩΣ (εντός 30 s) τη σφραγισμένη πλάκα μικροϋποδοχών ενίσχυσης στο όργανο BD ProbeTec ET και εκκινήστε την εκτέλεση. (Για λεπτομερείς οδηγίες ανατρέξτε στο Εγχειρίδιο Χρήσης του Συστήματος BD ProbeTec ET.) 23. Αφού εκκινήσετε την ανάλυση, ολοκληρώστε το ακόλουθο τμήμα της διαδικασίας καθαρισμού: α. Σφραγίστε την πλάκα μικροϋποδοχών εκκίνησης με ένα στεγανωτικό ενίσχυσης και αφαιρέστε την πλάκα από το θερμαντήρα εκκίνησης και θέρμανσης. (Χρησιμοποιήστε το θερμοάντοχο γάντι για να αφαιρέσετε την πλάκα η θερμοκρασία της υπερβαίνει τους 70 C.) β. Αφήστε την πλάκα να κρυώσει στον πάγκο για 5 min. Απορρίψτε τις μικροϋποδοχές εκκίνησης σε δοχείο απόρριψης βιολογικά επικίνδυνων αποβλήτων. γ. Καθαρίστε τη μεταλλική πλάκα: Εκπλύνετε την πλάκα με διάλυμα 1% (v/v) υποχλωριώδους νατρίου με Alconox. Εκπλύνετε την πλάκα με απεσταγμένο ή απιονισμένο νερό. Τυλίξτε την πλάκα σε μια καθαρή πετσέτα και αφήστε να στεγνώσει πλήρως πριν την χρησιμοποιήσετε πάλι. 24. Όταν ολοκληρωθεί η εκτέλεση, δημιουργείται μια εκτύπωση των αποτελεσμάτων της εξέτασης. 25. Μετακινήστε το φορέα της πλάκας από την πλάκα, ανοίξτε τη θύρα και αφαιρέστε την πλάκα. Κλείστε τη θύρα και επιστρέψτε την πλάκα στο εσωτερικό του οργάνου. 26. Αφαιρέστε τις σφραγισμένες μικροϋποδοχές ενίσχυσης από την πλάκα. Προσοχή: Μην αφαιρείτε το υλικό σφράγισης από τις μικροϋποδοχές. Οι σφραγισμένες μικροϋποδοχές μπορούν να αφαιρεθούν εύκολα σαν ενιαία μονάδα κρατώντας το άνω και κάτω τμήμα του στεγανωτικού και τραβώντας τις από την πλάκα με μια κίνηση προς τα επάνω. Τοποθετήστε τις σφραγισμένες μικροϋποδοχές μέσα στη σακούλα απόρριψης. Σφραγίστε τη σακούλα. 27. Καθαρίστε τη μεταλλική πλάκα: Εκπλύνετε την πλάκα με διάλυμα 1% (v/v) υποχλωριώδους νατρίου με Alconox. Εκπλύνετε την πλάκα με απεσταγμένο ή απιονισμένο νερό. Τυλίξτε την πλάκα σε μια καθαρή πετσέτα και αφήστε να στεγνώσει πλήρως πριν την χρησιμοποιήσετε πάλι. 28. Μετά την τελευταία ανάλυση της ημέρας, εκτελέστε τις ακόλουθες διαδικασίες καθαρισμού: α. Καθαρίστε τις επιφάνειες των πάγκων με διάλυμα 1% (v/v) υποχλωριώδους νατρίου με Alconox. Αφήστε το διάλυμα να παραμείνει επάνω στις επιφάνειες εργασίας για 2 3 min, μετά σκουπίστε με απεσταγμένο ή απιονισμένο νερό. β. Καθαρίστε το στατώ σωληναρίων δείγματος και το διαφανές στατώ αναρρόφησης/διανομής βυθίζοντάς τα σε διάλυμα 1% (v/v) υποχλωριώδους νατρίου με Alconox για διάστημα μέχρι 60 s. Εκπλύνετε καλά με πεσταγμένο ή απιονισμένο νερό και αφήστε να στεγνώσει στον αέρα. γ. Καθαρίστε τις εξωτερικές επιφάνειες του θερμαντήρα εκκίνησης και θέρμανσης και του οργάνου BD ProbeTec ET με 1% (v/v) υποχλωριώδες νάτριο με Alconox. Σκουπίστε τις επιφάνειες με απεσταγμένο ή απιονισμένο νερό. 9

10 δ. Καθαρίστε τη λαβή της αυτόματης πιπέτας (ΜΟΝΟ ΤΗ ΛΑΒΗ) με 1% (v/v) υποχλωριώδες νάτριο με Alconox. Σκουπίστε τη λαβή με απεσταγμένο ή απιονισμένο νερό και στεγνώστε με καθαρή πετσέτα. ε. Επαναφορτίστε την αυτόματη πιπέτα. στ. Απορρίψτε τη σφραγισμένη σακούλα απόρριψης και τα βιολογικώς επικίνδυνα απόβλητα σύμφωνα με τις καθιερωμένες διαδικασίες για την απόρριψη μολυσμένων αποβλήτων. Ποιοτικός έλεγχος Το Σετ Ελέγχου DTB BD ProbeTec ET διατίθεται χωριστά. Σε κάθε εκτέλεση ανάλυσης και για κάθε νέο αριθμό παρτίδας κιτ αντιδραστηρίων πρέπει να περιλαμβάνεται ένας θετικός και ένας αρνητικός μάρτυρας. Οι μάρτυρες μπορούν να τοποθετούνται σε τυχαίες θέσεις. Ο θετικός μάρτυρας DTB παρακολουθεί τυχόν αποτυχία του αντιδραστηρίου, την ολοκλήρωση των απαραίτητων διαδικαστικών στοιχείων (αναρρόφηση/διανομή και επωάσεις), την ενίσχυση και την ανίχνευση. Ο αρνητικός μάρτυρας DTB παρακολουθεί τη μόλυνση του αντιδραστηρίου ή/και του περιβάλλοντος. Ο θετικός μάρτυρας DTB και ο αρνητικός μάρτυρας DTB πρέπει να εξετάζονται ως θετικός και αρνητικός, αντίστοιχα, προκειμένου να προκύψουν τα αποτελέσματα του δείγματος. Εάν οι μάρτυρες δεν αποδίδουν τα αναμενόμενα, η εκτέλεση της ανάλυσης θεωρείται άκυρη και το όργανο δεν αναφέρει τα αποτελέσματα του ασθενή. Εάν ο ποιοτικός έλεγχος δεν ανταποκρίνεται στα αναμενόμενα αποτελέσματα, επαναλάβετε ολόκληρη την ανάλυση χρησιμοποιώντας νέο σύνολο μαρτύρων, νέες μικροϋποδοχές και τα επεξεργασμένα δείγματα. Εάν η επανάληψη του ποιοτικού ελέγχου δεν παράσχει τα αναμενόμενα αποτελέσματα, επικοινωνήστε με το Τμήμα Τεχνικής Εξυπηρέτησης (δείτε την ενότητα Ερμηνεία των αποτελεσμάτων ). Ανατρέξτε στην Ενότητα Δ της ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑΣ ΕΞΕΤΑΣΗΣ για οδηγίες σχετικά με την προετοιμασία των μαρτύρων. Αφού ολοκληρωθεί η προετοιμασία των μαρτύρων, εξακολουθήστε την εξέταση όπως περιγράφεται στην Ενότητα Ε της ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑΣ ΕΞΕΤΑΣΗΣ. Στη μικροϋποδοχή εκκίνησης είναι ενσωματωμένος ένας Εσωτερικός Μάρτυρας Ενίσχυσης (IAC). Ο μάρτυρας IAC περιέχει στόχο νουκλεϊκού οξέως που ενισχύεται παρουσία της θεμέλιας ουσίας του δείγματος. Σκοπός του μάρτυρα IAC είναι η επιβεβαίωση της εγκυρότητας της αντίδρασης ενίσχυσης και η αναγνώριση δυνητικής αναστολής από το επεξεργασμένο δείγμα. Μάρτυρας Επεξεργασίας Δείγματος: Για να εξετάσετε την αποτελεσματικότητα της επεξεργασίας του δείγματος, θα πρέπει να εξετάζεται ένας διαδικαστικός μάρτυρας σε τακτική βάση, σύμφωνα με τους τοπικούς κανονισμούς. Ο μάρτυρας της διαδικασίας αποτελείται από ένα εναιώρημα M. tuberculosis (π.χ., American Type Culture Collection, H37Ra ATCC 25177). Το εναιώρημα θα πρέπει να προετοιμαστεί ως εξής: 1. Παρασκευάστε ένα εναιώρημα McFarland No. 1 του οργανισμού. 2. Αραιώστε το εναιώρημα McFarland 1:100 σε Βόεια Λευκωματίνη (Κλάσμα V), (π.χ., διανείμετε 0,1 ml του εναιωρήματος McFarland σε 9,9 ml Βόειας Λευκωματίνης και αναμείξτε καλά). 3. Κλάσματα 1,0 ml μπορούν να καταψυχθούν στους -20 C ή σε χαμηλότερη θερμοκρασία (χωρίς κύκλους). 4. Το κυτταρικό εναιώρημα θα πρέπει να παρασκευάζεται σαν δείγμα ρουτίνας για εξέταση με το σύστημα BD ProbeTec ET. Παρακολούθηση για την παρουσία μόλυνσης DNA: Πριν από την πρώτη εκτέλεση της ανάλυσης DTB BD ProbeTec ET και για ένα μήνα τουλάχιστον εφεξής, θα πρέπει να εκτελείται η ακόλουθη διαδικασία εξέτασης για να παρακολουθείται ο χώρος εργασίας και οι επιφάνειες του εξοπλισμού για την παρουσία μόλυνσης DNA. Η περιβαλλοντική παρακολούθηση είναι απαραίτητη για την ανίχνευση μόλυνσης πριν αυτή εξελιχθεί σε πρόβλημα. 1. Για κάθε χώρο* που πρόκειται να εξεταστεί χρησιμοποιήστε ένα στυλεό CultureSwab EZ. 2. Σημειώστε ένα σωληνάριο δείγματος για κάθε χώρο από τον οποίο θα ληφθεί επίχρισμα και διανείμετε 100 µl ρυθμιστικού διαλύματος λύσης DTB 2 και 600 µl ρυθμιστικού διαλύματος εξουδετέρωσης DTB 3 σε κάθε σωληνάριο. 3. Εμβαπτίστε τον πρώτο στυλεό στο μείγμα ρυθμιστικού διαλύματος του σωληναρίου δείγματος και σκουπίστε τον πρώτο χώρο με μια μεγάλη σαρωτική κίνηση. 4. Αναμείξτε το στυλεό στο μείγμα ρυθμιστικού διαλύματος, εκπιέστε το στυλεό, πωματίστε πάλι το σωληνάριο και υποβάλλετε σε περιδίνηση για 5 s. Απορρίψτε τους στυλεούς. 5. Επαναλάβετε για κάθε επιφάνεια από την οποία λαμβάνετε δείγμα. 6. Τοποθετήστε τα σωληνάρια στο στατώ σωληναρίων δείγματος και θερμάνετε στο φούρνο (εδάφιο Γ της ενότητας ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑΣ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ ). 7. Ενώ θερμαίνονται τα σωληνάρια, χρησιμοποιήστε καθαρές πετσέτες που έχουν εμποτιστεί με νερό για να αφαιρέσετε υπολείμματα του μείγματος ρυθμιστικού διαλύματος από τις επιφάνειες από τις οποίες λήφθηκε επίχρισμα. 8. Μετά τη θέρμανση, τοποθετήστε τα σωληνάρια στη μικροφυγόκεντρο με την τυπική κεφαλή, κλείστε το κάλυμμα και υποβάλλετε σε παλμική περιστροφή για 10 s. 9. Αφαιρέστε τα σωληνάρια από το φυγόκεντρο και εξετάστε τα καπάκια για την ύπαρξη συμπυκνώματος. Εάν είναι ορατό συμπύκνωμα, επαναλάβετε τη φυγοκέντρηση. 10. Τοποθετήστε τα σωληνάρια στο διαφανές στατώ αναρρόφησης/διανομής και προχωρήστε στην ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ ΕΞΕΤΑΣΗΣ. *Οι συνιστώμενες επιφάνειες προς εξέταση περιλαμβάνουν: επιφάνεια φούρνου, υδατόλουτρο υπερήχων, στατώ σωληναρίων δείγματος 2 ml, διαφανές στατώ αναρρόφησης/διανομής, θερμαντήρας εκκίνησης και θέρμανσης, μαύρες πλάκες μικροϋποδοχών, λαβή αυτόματης πιπέτας, πλήκτρα επαφής οργάνου, πληκτρολόγιο οργάνου και πάγκος εργασίας. Εάν κάποιος χώρος δώσει θετικό αποτέλεσμα, καθαρίστε την περιοχή με νέο διάλυμα 1% (v/v) υποχλωριώδους νατρίου με Alconox. Βεβαιωθείτε ότι έχει υγρανθεί ολόκληρη η περιοχή με το διάλυμα υποχλωριώδους νατρίου και αφήστε το να παραμείνει στην επιφάνεια για δύο λεπτά τουλάχιστον ή μέχρι να στεγνώσει. Εάν είναι απαραίτητο, αφαιρέστε τυχόν περίσσεια του διαλύματος υποχλωριώδους νατρίου με καθαρή πετσέτα. Σκουπίστε την επιφάνεια με καθαρή πετσέτα που έχει εμποτιστεί με απιονισμένο ή απεσταγμένο νερό και αφήστε την επιφάνεια να στεγνώσει. Επανεξετάστε την επιφάνεια. Επαναλάβετε μέχρι να προκύψουν αρνητικά αποτελέσματα. Εάν η μόλυνση δεν επιλυθεί, επικοινωνήστε με το Τμήμα Τεχνικής Εξυπηρέτησης για περισσότερες πληροφορίες. 10

11 ΕΡΜΗΝΕΙΑ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ ΤΗΣ ΕΞΕΤΑΣΗΣ Αποτέλεσμα Ανάλυσης DTB Θετικό Αρνητικό Μη προσδιορίσιμο Συνιστώμενη Αναφορά Ανάλυση ανίχνευσης θετική για την παρουσία DNA συμπλέγματος M. tuberculosis. Εκκρεμεί καλλιέργεια AFB. Ανάλυση ανίχνευσης αρνητική για την παρουσία DNA συμπλέγματος M. tuberculosis. Εκκρεμεί καλλιέργεια AFB. Να επαναληφθεί η ανάλυση ανίχνευσης από επεξεργασμένο δείγμα. Εάν αποδειχθεί θετική ή αρνητική να χρησιμοποιηθεί η κατάλληλη δήλωση που περιγράφεται παραπάνω. Εάν εξακολουθεί να δίδει μη προσδιορίσιμα αποτελέσματα αναφέρετε Το αποτέλεσμα της αρχικής και επαναληπτικής ανάλυσης ανίχνευσης είναι μη προσδιορίσιμο. Παρακαλείστε όπως υποβάλλετε νέο δείγμα για εξέταση. Εκκρεμεί καλλιέργεια AFB. ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΙ ΤΗΣ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑΣ 1. Η μέθοδος αυτή έχει εξεταστεί μόνο με αναπνευστικά δείγματα όπως πτύελα (επαγόμενα ή προϊόντα απόχρεμψης), βρογχοκυψελιδικές πλύσεις και βρογχικές και τραχειακές αναρροφήσεις. Η απόδοση με άλλα δείγματα δεν έχει αξιολογηθεί. 2. Ένα αρνητικό αποτέλεσμα δεν αποκλείει την πιθανότητα ύπαρξης του οργανισμού στόχου σε συγκέντρωση μικρότερη από την ευαισθησία της εξέτασης. 3. Όπως συμβαίνει και με άλλες διαγνωστικές εξετάσεις, τα αποτελέσματα της ανάλυσης DTB θα πρέπει να ερμηνεύονται σε συνδυασμό με άλλα εργαστηριακά και κλινικά δεδομένα που έχει στη διάθεσή του ο γιατρός. 4. Η ανάλυση DTB δεν διακρίνει μεταξύ μελών του συμπλέγματος M. tuberculosis M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG, M. africanum, και M. microti. 5. Για τη βέλτιστη απόδοση αυτής της ανάλυσης απαιτείται η κατάλληλη συλλογή και χειρισμός δειγμάτων. 6. Πρέπει να τηρούνται οι οριζόμενες συνθήκες φυγοκέντρησης καθώς η ανεπαρκής φυγοκέντρηση ενδέχεται να οδηγήσει σε ψευδώς αρνητικά αποτελέσματα. 7. Η ανάλυση DTB δεν ανιχνεύει παραλλαγές του συμπλέγματος M. tuberculosis που δεν διαθέτουν την ακολουθία παρεμβολής IS Η χρήση της ανάλυσης DTB περιορίζεται σε ειδικά εκπαιδευμένο προσωπικό στη διαδικασία της ανάλυσης και του συστήματος BD ProbeTec ET. 9. Η ανάλυση DTB δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την αξιολόγηση της θεραπευτικής επιτυχίας ή αποτυχίας γιατί ενδέχεται να εξακολουθήσει να υφίσταται παρουσία των νουκλεΐκών οξέων από οργανισμούς του συμπλέγματος Mycobacterium tuberculosis και μετά την αντιμικροβιακή θεραπεία. 10. Η ανάλυση DTB δεν προορίζεται για την αντικατάσταση της καλλιέργειας για σκοπούς εξέτασης αντιμικροβιακής ευαισθησίας. 11. Η ανάλυση DTB παρέχει ποιοτικά αποτελέσματα. Δεν είναι δυνατόν να σχηματιστεί συσχέτιση μεταξύ του μεγέθους της βαθμολογίας MOTA και του αριθμού κυττάρων σε ένα θετικό δείγμα. 12. Η ακολουθία ανίχνευσης του συμπλέγματος M. tuberculosis, IS6110, είναι ειδική για τους οργανισμούς M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG, M. africanum, και M. microti. 13. Η ανάλυση DTB ανιχνεύει παραλλαγές μη-φυματιωδών μυκοβακτηριακών ειδών που μπορεί να περιέχουν την ακολουθία IS Η προγνωστική αξία μιας ανάλυσης εξαρτάται από τον επιπολασμό του νοσήματος στον εκάστοτε πληθυσμό. 15. Δεν έχει προσδιοριστεί το αποτέλεσμα άλλων δυνητικών μεταβλητών όπως η αντιμικροβιακή θεραπεία ή συνυπάρχουσα λοίμωξη σε δείγματα. 16. Εάν χρησιμοποιείτε φούρνο εργαστηρίου γενικής χρήσης, βεβαιωθείτε ότι το υγρό στο εσωτερικό των σωληναρίων δειγμάτων έχει φτάσει σε θερμοκρασία 101 ± 1 C για τουλάχιστον 30 λεπτά, προκειμένου να καταστούν μη βιώσιμα τυχόν μυκοβακτηρίδια που υπάρχουν στα δείγματα. ΑΝΑΜΕΝΟΜΕΝΑ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Με την ανάλυση DTB BD ProbeTec ET εξετάστηκαν συνολικά 1157 δείγματα που συλλέχθηκαν από 986 ασθενείς σε δύο γεωγραφικά διαφορετικούς χώρους κλινικής μελέτης. Η κατανομή συχνότητας της αρχικής βαθμολογίας MOTA παρουσιάζεται στην Εικόνα 1. Τα αποτελέσματα της ανάλυσης DTB BD ProbeTec ET παρουσιάζονται σε σύγκριση με τα αποτελέσματα αναφοράς φυματίωσης και επιχρισμάτων από οξεάντοχους βάκιλους (AFB). Το αποτέλεσμα αναφοράς φυματίωσης βασίζεται σε αποτέλεσμα καλλιέργειας μυκοβακτηριδίων ή διάγνωσης ασθενή από ανασκόπηση διαγράμματος. Η παρουσία ή απουσία του συμπλέγματος Mycobacterium tuberculosis προσδιορίζεται με τη σύνδεση της βαθμολογίας DTB BD ProbeTec ET MOTA για τα δείγματα με προκαθορισμένες τιμές κατωφλίου. Η βαθμολογία MOTA είναι μια μέτρηση που χρησιμοποιείται για την αποτίμηση του μεγέθους του σήματος που δημιουργείται ως αποτέλεσμα της αντίδρασης. Το μέγεθος της βαθμολογίας MOTA δεν είναι ενδεικτικό του επιπέδου του οργανισμού στο δείγμα. Το σύνολο των υπολογισμών εκτελείται αυτόματα από το λογισμικό του οργάνου. Τα δείγματα που εξετάστηκαν στους δύο χώρους ταυτοποιήθηκαν από την ανάλυση BD ProbeTec ET ως θετικά, αρνητικά ή μη προσδιορίσιμα. Μόνο ένα δείγμα έδωσε μη προσδιορίσιμο αποτέλεσμα στην αρχική εξέταση. Το δείγμα αυτό επιλύθηκε ως αρνητικό κατά την επανεξέταση. 11