ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ Φαρμακοχημεία Φυσικά Προϊόντα: Σχεδιασμός, Σύνθεση και Ανάλυση Βιοδραστικών Ενώσεων Διατριβή Μεταπτυχιακού Διπλώματος Ειδίκευσης «Υπερέκφραση, απομόνωση και χαρακτηρισμός της εξωκυττάριας περιοχής ενός ιοντικού καναλιού ενεργοποιούμενου από τη δέσμευση ενός προσδέτη του βακτηρίου Gloeobacter violaceus της υπεροικογένειας των υποδοχέων Cys-θηλιάς» Αργυρίου Αικατερίνη Φαρμακοποιός Πάτρα 2011

2

3 Τριμελής Εξεταστική Επιτροπή 1. Αναπληρωτής Καθηγητής Γεώργιος Α. Σπυρούλιας (επιβλέπων) Τμήμα Φαρμακευτικής, Πανεπιστήμιο Πατρών 2. Επίκουρη Καθηγήτρια Φωτεινή Λάμαρη Τμήμα Φαρμακευτικής, Πανεπιστήμιο Πατρών 3. Επίκουρος Καθηγητής Κωνσταντίνος Πουλάς Τμήμα Φαρμακευτικής, Πανεπιστήμιο Πατρών

4

5 Ευχαριστίες Η παρούσα εργασία εκπονήθηκε στο Τμήμα Φαρμακευτικής του Πανεπιστημίου Πατρών από το Νοέμβριο του 2009 έως το Νοέμβριο του 2011, στα πλαίσια της απόκτησης του Μεταπτυχιακού Διπλώματος Ειδίκευσης στην κατεύθυνση «Φαρμακοχημεία-Φυσικά Προϊόντα: Σχεδιασμός, Σύνθεση και Ανάλυση Βιοδραστικών Ενώσεων». Θα ήθελα να εκφράσω τις πιο θερμές ευχαριστίες στον επιβλέποντά μου, τον Αναπληρωτή Καθηγητή κ. Γεώργιο Σπυρούλια, για την επιστημονική συμβουλή και τη συνεχή καθοδήγηση που μου προσέφερε όλο αυτό το χρονικό διάστημα. Τον ευχαριστώ ιδιαίτερα για την ευκαιρία και την εμπιστοσύνη που μου έδωσε να ασχοληθώ με ενδιαφέροντα επιστημονικά θέματα και να εκπαιδευτώ σε πολλές διαφορετικές τεχνικές στο ερευνητικό πεδίο μου. Επίσης, θα ήθελα να ευχαριστήσω τα μέλη της τριμελούς επιτροπής, την Επίκουρη Καθηγήτρια κ. Φωτεινή Λάμαρη και τον Επίκουρο Καθηγητή κ. Κωνσταντίνο Πουλά για τις πολύτιμες συμβουλές τους και την πολύ καλή συνεργασία μας σε εκπαιδευτικά και ερευνητικά θέματα. Επιπλέον, θα ήθελα να εκφράσω θερμές ευχαριστίες στον Dr. Detlef Betrop από το Τμήμα Φυσιολογίας ΙΙ του Τμήματος Ιατρικής του Πανεπιστημίου του Freiburg της Γερμανίας, ο οποίος συνέβαλλε στη διεξαγωγή του συνόλου των NMR πειραμάτων και παράλληλα στην άριστη συνεργασία και καθοδήγηση σε ερευνητικά θέματα. Δε θα μπορούσα να μην ευχαριστήσω το Μεταδιδάκτορα Χρήστο Χασάπη για τις γνώσεις και συμβουλές που μου προσέφερε. Παράλληλα θα ήθελα να ευχαριστήσω όλα τα μέλη του εργαστηρίου, Νίκο Δημητρόπουλο, Ζηνοβία Σπυράντη, Αριάδνη Λουτσίδου, Πέτρο Γκαζώνη, Γεώργιο Δάλκα, Μαριτίμη Βλάχου και Διονύση Βούρτση για το φιλικό κλίμα και τη συμπαράσταση του καθενός με τον τρόπο του όλο αυτό το διάστημα. Τέλος, ευχαριστώ θερμά τους γονείς και τον αδερφό μου για την αμέτρητη συμπαράσταση και ενθάρρυνση που μου προσέφεραν όλα αυτά τα χρόνια.

6

7 Περιεχόμενα Περιεχόμενα Α. Θεωρητικό Μέρος 1 Α.1. Υπεροικογένεια ιοντικών καναλιών που ενεργοποιούνται μετά από δέσμευση προσδέτη (LGIC) 3 Α.2. Πενταμερείς ιοντικοί δίαυλοι που ενεργοποιούνται με δέσμευση προσδέτη (plgics) 4 Α.3. Επαγόμενες δομικές αλλαγές κατά την πρόσδεση υποκαταστατών στα plgics 6 Α.4. Κρυσταλλική δομή ELIC 9 Α.5. Κρυσταλλική δομή της GLIC 12 Α.6. Διαμορφώσεις της GLIC 14 Α.7. X-ray δομές της GLIC προσδεδεμένης με γενικά αναισθητικά 17 Α.8. Σύγκριση των διαμορφώσεων GLIC και ELIC 20 A.Β. ΧΡΗΣΗ ΤΟΥ ΒΙΟΜΟΡΙΑΚΟΥ ΝΜR 22 A.Β.1. Χρήση του NMR για τον προσδιορισμό τριτοταγών δομών βιομορίων 22 A.Β.2. Χρήση του NMR για το χαρακτηρισμό της δυναμικής φύσης βιομορίων 23 A.Β.3. Μοριακό μέγεθος και NMR 23 A.Β.4. Έκφραση ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών για δομική μελέτη NMR 23 A.Β.5. Ισοτοπική επισήμανση πρωτεϊνών με ενεργούς πυρήνες στη φασματοσκοπία NMR 24 A.Β.6. Επιλεκτική Επισήμανση 25 A.Β.6.i). 15 Ν-επιλεκτικά επισημασμένα αμινοξέα σε μη-επισημασμένο ( 14 Ν) υπόβαθρο 26 A.B.6.i).α. 15 Ν-επισημασμενα αμινοξέα Lys, Arg, Met, Pro, Cys, His, Asn 28 A.B.6.i).β. 15 Ν-επισήμανση αμινοξέων που εμφανίζονται σε ενδιάμεσα στάδια του βιοσυνθετικού μονοπατιού στα βακτηριακά κύτταρα με την αποφυγή της μη-επιλεκτικής επισήμανσης 29 i

8 Περιεχόμενα A.B.6.i).α.a). Έκφραση της πρωτεΐνης σε πρωτοτροφικά κύτταρα με προσθήκη του 15 Ν-επισημασμένου αμινοξέος 29 A.B.6.i).α.b). Έκφραση της πρωτεΐνης σε αυξοτροφικά βακτηριακά κύτταρα με προσθήκη περίσσειας μη-επισημασμένων αμινοξέων 30 A.Β.6.ii). Επιλεκτική αντίστροφη επισήμανση αμινοξέων σε 15 Ν υπόβαθρο 30 Β. Σκοπός Εργασίας 33 Γ. Υλικά και Μέθοδοι 37 Γ.1. Υλικά 39 Γ.1.1. Εργαστηριακός Εξοπλισμός 39 Γ.1.2. Αναλώσιμα 40 Γ.1.3. Αντιδραστήρια 40 Γ.1.4. Επισημασμένα μέσα 41 Γ.1.5. Επισημασμένα αμινοξέα 42 Γ.1.6. Μη-επισημασμένα 14 Ν-αμινοξέα 42 Γ.1.7. Θρεπτικά Υλικά 43 Γ.1.8. Διαλύματα 43 Γ.1.9. Πλασμιδιακός φορέας κλωνοποίησης (cloning vector) και κυτταρικά στελέχη Escherichia coli που χρησιμοποιήθηκαν 45 Γ.2. Μέθοδοι 46 Γ.2.1. Υγρές και στερεές καλλιέργειες βακτηρίων 46 Γ.2.2. Εισαγωγή πλασμιδίου σε κύτταρα E.coli (μετασχηματισμός) 47 Γ.2.3. Πρωτεϊνική έκφραση 48 Γ.2.3.i). Διερεύνηση των συνθηκών έκφρασης μέσω μικρής κλίμακας καλλιέργειας 48 Γ.2.3.ii). Έκφραση της πρωτεΐνης μέσω των πρωτοτροφικών κυττάρων BL21(DE3) 49 Γ.2.3.iii). Έκφραση της πρωτεΐνης μέσω των αυξοτροφικών κυττάρων DL39(DE3) 50 Γ.2.3.iv). Το συστημα έκφρασης pet 51 ii

9 Περιεχόμενα Γ.2.4. Απομόνωση της πρωτεΐνης 53 Γ.2.4.i). Χρωματογραφία συγγένειας 53 Γ.2.4.ii). Χρωματογραφία μοριακού αποκλεισμού 53 Γ.2.4.iii). Χρωματογραφία ιοντοανταλλαγής 54 Γ.2.5. Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου σε αποδιατακτικές συνθήκες (SDS-PAGE electrophoresis) 55 Δ. Πειραματικό Μέρος 59 Δ.1. Μετασχηματισμός των βακτηριακών κυττάρων E.coli BL21(DE3) και των κυττάρων DL39(DE3) με το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο pet20b(+) 61 Δ.2. Εύρεση των βέλτιστων συνθηκών έκφρασης της πρωτεΐνης GLIC ΕΚΠ 61 Δ.2.1. Ανάπτυξη προκαλλιέργειας 61 Δ.2.2. Δημιουργία stock γλυκερόλης 62 Δ.2.3. Ανάπτυξη υγρής καλλιέργειας ελαχίστων μέσων για την εύρεση των βέλτιστων συνθηκών έκφρασης της πρωτεΐνης 62 Δ.3. Υγρή καλλιέργεια για την έκφραση της GLIC ΕΚΠ 63 Δ.3.1. Προκαλλιέργεια 63 Δ.3.2. Υγρή καλλιέργεια σε θρεπτικό υλικό ελαχίστων μέσων (minimal media, M95X) 63 Δ.3.3. Συλλογή των κυττάρων 64 Δ.3.4. Λύση των βακτηριακών κυττάρων μέσω υπερήχων 64 Δ.4. Απομόνωση της πρωτεΐνης GLIC ΕΚΠ 64 Δ.4.1. Απομόνωση της πρωτεΐνης GLIC ΕΚΠ με χρωματογραφία συγγένειας 64 Δ.4.2. Απομόνωση της πρωτεΐνης GLIC ΕΚΠ με χρωματογραφία μοριακού αποκλεισμού 66 Δ.4.3. Απομόνωση της πρωτεΐνης GLIC ΕΚΠ με χρωματογραφία ιοντοανταλλαγής 66 Δ.5. Ποσοτικός προσδιορισμός της GLIC ΕΚΠ Προετοιμασία NMR δείγματος 67 iii

10 Περιεχόμενα Δ.6. Έκφραση και απομόνωση της επισημασμένης 15 Ν ή/και 13 C ή/και 2 Η πρωτεΐνης GLIC ΕΚΠ 68 Δ.7. Επιλεκτική αντίστροφη επισήμανση της αργινίνης (Αrg) σε 15 Ν υπόβαθρο 69 Δ.8. Επιλεκτική αντίστροφη επισήμανση της λυσίνης (Lys) σε 15 Ν υπόβαθρο και επιλεκτική 15 Ν-επισήμανση λυσίνης 69 Δ.9. Επιλεκτική 15 Ν-επισήμανση ιστιδίνης (His) και ασπαραγίνης (Asn) 69 Δ.10. Εφαρμογή επιλεκτικής 15 Ν-επισήμανσης και αντίστροφης επισήμανσης της λευκίνης (Leu) 70 Δ Επιλεκτική αντίστροφη επισήμανση της λευκίνης (Leu) σε 15 Ν υπόβαθρο 70 Δ Επιλεκτική 15 Ν-επισήμανση της λευκίνης ( 15 Ν-Leu) 70 Δ Έκφραση της πρωτεΐνης σε κύτταρα BL21(DE3) με προσθήκη 15 Ν- Leu και 14 Ν-Val, 14 Ν-Ile 70 Δ Έκφραση της πρωτεΐνης-glic ΕΚΠ σε κύτταρα DL39(DE3) με προσθήκη 15 N-Leu 71 Δ.11. Εφαρμογή επιλεκτικής 15 Ν-επισήμανσης και αντίστροφης επισήμανσης της βαλίνης (Val) 72 Δ Επιλεκτική αντίστροφη επισήμανση της βαλίνης (Val) σε 15 Ν υπόβαθρο 72 Δ Έκφραση της πρωτεΐνης σε κύτταρα BL21(DE3) με προσθήκη 15 Ν- Val και 14 Ν-Leu, 14 Ν-Ile 72 Δ.12. Έκφραση της πρωτεΐνης σε κύτταρα BL21(DE3) με προσθήκη 15 Ν- Ile και 14 Ν-Leu, 14 Ν- Val 72 Δ.13. Εφαρμογή επιλεκτικής 15 Ν-επισήμανσης της φαινυλαλανίνης (Phe) / αλανίνης (Ala) 73 Δ.13.1 Επιλεκτική αντίστροφη επισήμανση της φαινυλαλανίνης (Phe)/αλανίνης (Ala) σε 15 Ν υπόβαθρο 73 Δ Έκφραση της πρωτεΐνης-glic ΕΚΠ σε κύτταρα DL39(DE3) με προσθήκη 15 N-Phe 73 Δ Έκφραση της πρωτεΐνης-glic ΕΚΠ σε κύτταρα DL39(DE3) με προσθήκη 15 N-Ala 73 iv

11 Περιεχόμενα Δ.14. Έκφραση της πρωτεΐνης-glic ΕΚΠ σε κύτταρα DL39(DE3) με προσθήκη 15 N-Tyr 74 Δ.15. Έκφραση της πρωτεΐνης-glic ΕΚΠ σε κύτταρα DL39(DE3) με προσθήκη 15 N-Glu 74 Δ.16. Έκφραση της πρωτεΐνης-glic ΕΚΠ σε κύτταρα DL39(DE3) με προσθήκη 15 N-Asp 74 Ε. Αποτελέσματα 77 Ε.1. Έκφραση και απομόνωση της πρωτεΐνης GLIC ΕΚΠ 79 Ε.2. Έκφραση της 15 Ν-πρωτεΐνης, της 15 Ν, 13 C-πρωτεΐνης και της 2 Η, 15 Ν, 13 C-πρωτεΐνης 80 Ε Ν-επιλεκτική επισήμανση αμινοξέων 84 Ε.3.1. Επιλεκτική αντίστροφη επισήμανση της αργινίνης (Arg) σε 15 Ν υπόβαθρο 85 Ε.3.2. Επιλεκτική αντίστροφη επισήμανση της λυσίνης (Lys) σε 15 Ν υπόβαθρο και επιλεκτική 15 Ν-επισήμανση λυσίνης 85 Ε.3.3. Επιλεκτική αντίστροφη επισήμανση ιστιδίνης (His) και ασπαραγίνης (Asn) 87 Ε.3.4. Επιλεκτική 15 Ν-επισήμανση και επιλεκτική αντίστροφη επισήμανση της λευκίνης (Leu) 89 Ε.3.5. Επιλεκτική 15 Ν-επισήμανση και αντίστροφη επισήμανση της βαλίνης 91 Ε.3.6. Επιλεκτική 15 Ν-επισήμανση της GLIC ΕΚΠ με 15 N-Ile 92 Ε.3.7. Επιλεκτική αντίστροφη επισήμανση και επιλεκτική 15 Ν-επισήμανση της φαινυλαλανίνης (Phe)/ αλανίνης (Ala) 93 Ε.3.8. Επιλεκτική 15 Ν-επισήμανση της τυροσίνης 95 Ε.3.9. Επιλεκτική 15 Ν-επισήμανση του γλουταμινικού οξέος και του ασπαραγινικού οξέος 96 Ε.4. Λήψη NMR φασμάτων μετά την αύξηση της θερμοκρασίας του πρωτεϊνικού δείγματος 98 Ε.5. Ανάλυση κυκλικού διχρωισμού της GLIC ΕΚΠ 100 ΣΤ. Συζήτηση 101 v

12 Περιεχόμενα Η. Βιβλιογραφία 117 Θ. Παράρτημα 125 Θ.1. Ταυτοποίηση των κορυφών του φάσματος 1 Η- 15 Ν HSQC στα 700MHz της GLIC ΕΚΠ 127 Θ.2. Συντμήσεις 143 Θ.3. Δημοσίευση 145 vi

13 Ενότητα Α Θεωρητικό Μέρος 1

14 Α. Θεωρητικό Μέρος 2

15 Α. Θεωρητικό Μέρος Α.1. Υπεροικογένεια ιοντικών καναλιών που ενεργοποιούνται μετά από δέσμευση προσδέτη (LGIC) Τα ιοντικά κανάλια [1, 2] που ενεργοποιούνται μετά από δέσμευση ενός προσδέτη (ligand-gated ion channels LGIC) [3] αποτελούν τη σημαντικότερη υπεροικογένεια υποδοχέων με λειτουργία διαύλων ιόντων. Πρόκειται για διαμεμβρανικές πρωτεΐνες που ενεργοποιούνται από εξωκυττάριους ή ενδοκυττάριους προσδέτες, κυρίως νευροδιαβιβαστές και είναι υπεύθυνοι για τη γρήγορη διέγερση και αναστολή στη νευροδιαβίβαση. Χαρακτηριστικές ιδιότητες αυτής της κατηγορίας ιοντικών καναλιών είναι η ενεργοποίησή τους μετά από δέσμευση ειδικών προσδετών, η μεταφορά ιόντων διαμέσου της κυτταρικής μεμβράνης [4] καθώς επίσης και η εκλεκτικότητα ως προς τα ιόντα που μεταφέρουν (θετικά ή αρνητικά, μονοσθενή ή δισθενή). Αποτελούνται από ένα ενδοκυττάριο (Cτελικό) τμήμα, τις διαμεμβρανικές έλικες και μια εξωκυττάρια περιοχή (ΕΚΠ, Ν-τελικό άκρο). Εμφανίζονται με τη μορφή ολιγομερών ορισμένων υπομονάδων και υφίστανται σε τρεις λειτουργικές καταστάσεις [5] : Ο υποδοχέας μπορεί να βρίσκεται σε κατάσταση ηρεμίας απουσία προσδέτη (κλειστός δίαυλος), να είναι ενεργοποιημένος μετά από δέσμευση προσδέτη (ανοιχτός δίαυλος) ή να είναι απευαισθητοποιημένος μετά από συνεχή διέγερση από αγωνιστή [6]. Εικόνα 1: Σχηματική απεικόνιση των αλλοστερικών καταστάσεων του nachr. [6] 3

16 Α. Θεωρητικό Μέρος Με βάση τη δομή των υπομονάδων και τα σύμπλοκα που δημιουργούν, μπορούν να διαχωριστούν σε τρεις μεγάλες υπομονάδες: Α. Υπομονάδες του τύπου Cys-θηλιάς (Cys-loop receptors) [7-10], οι οποίες είναι πενταμερή ιοντικά κανάλια (pentameric ligand-gated ion channel plgics) που ενεργοποιούνται από δέσμευση ενός προσδέτη. Υπομονάδες των μελών της οικογένειας αυτής αποτελούνται από τέσσερις διαμεμβρανικές (ΔΜ) έλικες και μια χαρακτηριστική Cys-θηλιά στην Ν-τελική εξωκυττάρια περιοχή (ΕΚΠ). Β. Υπομονάδες των υποδοχέων NMDA (N-methyl-D-asparate) [11], AMPA (α-amino-3- hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid receptor) [12]. Πρόκειται για τύπους υποδοχέων, οι οποίοι περιλαμβάνουν τρεις διαμεμβρανικές (ΔΜ) έλικες και σχηματίζουν ένα κανάλι κατιόντων. Γ. Υπομονάδες των υποδοχέων όπως οι υποδοχείς Ρ2Χ (ATP-gated ion channels) [13], οι οποίες περιλαμβάνουν δύο διαμεμβρανικές περιοχές (ΔΜ). Α.2. Πενταμερείς ιοντικοί δίαυλοι που ενεργοποιούνται με δέσμευση προσδέτη (plgics) Οι πενταμερείς ιοντικοί δίαυλοι Cys-θηλιάς, οι οποίοι ενεργοποιούνται με δέσμευση προσδέτη (pentameric ligand-gated ion channels plgics) [14-17] αποτελούν μια σημαντική κατηγορία υποδοχέων που μεσολαβούν στα αρχικά στάδια της κυτταρικής επικοινωνίας. Η οικογένεια αυτή των plgics περιλαμβάνει υποδοχείς των ευκαρυωτικών οργανισμών όπως οι νικοτινικοί υποδοχείς της ακετυλοχολίνης (nachrs) [8, 16, 18, 19], υποδοχείς του γ-αμινοβουτυρικού οξέος τύπου Α και C (GABA A και GABA C ) [20], της γλυκίνης [21] και της σεροτονίνης (5ΗΤ-3) [22]. Παρόμοιοι τύποι υποδοχέων εμφανίζονται και σε προκαρυωτικούς οργανισμούς [23], όπως o Erwinia ligand-gated ion channel [24] (ELIC), από το βακτήριο Erwinia chrysanthemi και o [25, 26] Gloeobacter ligand-gated ion channel (GLIC) από το βακτήριο Gloeobacter violaceus [27]. Οι υποδοχείς Cys-θηλιάς αποτελούν κύριους θεραπευτικούς στόχους [28], 4

17 Α. Θεωρητικό Μέρος συμπεριλαμβανομένης της αναισθησίας και της μυοχαλάρωσης, καθώς επίσης και στόχος της δράσης των εντομοκτόνων. Ταυτόχρονα αποτελούν στόχους μιας σειράς φαρμάκων που θεραπεύουν νευρολογικές διαταραχές όπως Alzheimer [29], άγχος, επιληψία, μάθηση, έλλειψη προσοχής και τον εθισμό στα φάρμακα [30]. Εικόνα 2: Σχηματική απεικόνιση του φυλογενετικού δέντρου της οικογένειας plgics. [23] Οι υποδοχείς plgics είναι διαμεμβρανικές γλυκοπρωτεΐνες που συγκροτούνται από πέντε όμοιες ή ομόλογες υπομονάδες [31, 32], οι οποίες διατάσσονται περιμετρικά ενός κεντρικού υδατο-πληρούμενου πόρου [10] στην κυτταρική μεμβράνη. Κάθε υπομονάδα αυτών των ιοντικών καναλιών αποτελείται από μια Ν-τελική εξωκυττάρια περιοχή, ΕΚΠ (μήκους περίπου 210 αμινοξικών καταλοίπων στην περίπτωση των υποδοχέων τύπου nachrs), από τέσσερις διαμεμβρανικές (ΔΜ) α-έλικες (Μ1-Μ4) και από μια κυτταροπλασματική περιοχή (ΚΠ) μεταξύ της Μ3 και Μ4 έλικας με ποικιλία σε αλληλουχία και μέγεθος [33, 34]. Στην Ν- τελική εξωκυττάρια περιοχή (ΕΚΠ) κάθε υπομονάδας βρίσκεται η χαρακτηριστική θηλιά 13 αμινοξέων μεταξύ δύο συντηρημένων καταλοίπων κυστεΐνης (Cys) συνδεδεμένων με δισουλφιδικό δεσμό, σχηματίζοντας μια κλειστή θηλιά που 5

18 Α. Θεωρητικό Μέρος βρίσκεται μεταξύ περιοχών δέσμευσης προσδέτη και τμημάτων του καναλιού. Για το λόγο αυτό, οι συγκεκριμένοι ιοντικοί δίαυλοι ονομάζονται επίσης υποδοχείς Cysθηλιάς (Cys-loop receptors). Συνδυασμός διαφορετικών τύπων υπομονάδων με σκοπό το σχηματισμό ετερο-πενταμερών, παρέχει ένα πλούτο λειτουργικής ποικιλομορφίας που καλύπτει ένα μεγάλο εύρος αναγκών [35]. Επειδή οι διαφορετικοί υποδοχείς-μέλη της υπεροικογένειας εμφανίζουν κοινά δομικά και λειτουργικά χαρακτηριστικά, υποστηρίζεται ότι τα γονίδια που κωδικοποιούν τις ομόλογες υπομονάδες προέρχονται εξελικτικά από το ίδιο αρχέγονο γονίδιο [14, 15]. Ανάλογα με την τοπολογία και τα φαρμακολογικά χαρακτηριστικά του κάθε υποδοχέα, οι υποδοχείς αυτοί χωρίζονται σε κατηγορίες. Κάθε οικογένεια των υποδοχέων είναι επιλεκτική είτε για κατιόντα είτε για ανιόντα και η ενεργοποίησή τους μπορεί να είναι διεγερτική ή ανασταλτική ανάλογα με τη κατανομή των ιόντων και στις δύο πλευρές της μεμβράνης και το δυναμικό της μεμβράνης των κυττάρων. Η μεταγωγή του σήματος στους υποδοχείς της οικογένειας Cys-θηλιάς πραγματοποιείται μέσω της δέσμευσης του νευροδιαβιβαστή και τη μεταφορά των ιόντων διαμέσου της κυτταρικής μεμβράνης, ενώ οι υποδοχείς αυτοί εμφανίζουν εκλεκτικότητα ως προς τα ιόντα που μεταφέρουν. Α.3. Επαγόμενες δομικές αλλαγές κατά την πρόσδεση υποκαταστατών στα plgics Τα πενταμερή ιοντικά κανάλια (plgics) αποτελούν μια οικογένεια μεμβρανικών πρωτεϊνών και εμφανίζουν μια «κλειστή» και μια «ανοιχτή» διαμόρφωση που σχετίζεται με την ιοντική αγωγιμότητα του καναλιού. Η μετατροπή αυτή προκαλείται ως απάντηση στην αύξηση ή τη μείωση της συγγένειας δέσμευσης για συγκεκριμένους προσδέτες. Αρκετά μέλη της οικογένειας, συμπεριλαμβανομένου του νικοτινικού υποδοχέα της ακετυλοχολίνης, διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στη μεταγωγή σήματος στις συνάψεις των νευρώνων. Ο μηχανισμός με τον οποίο το 6

19 Α. Θεωρητικό Μέρος κανάλι μεταβαίνει από τη μία διαμόρφωση στην άλλη δεν είναι πλήρως κατανοητός παρά τις προσπάθειες που έχουν πραγματοποιηθεί. Ωστόσο, έχει πραγματοποιηθεί σύγκριση των κρυσταλλογραφικών δομών των συμπλόκων AChBPs-αγωνιστές με την απο-μορφή (απουσία προσδέτη) της πρωτεΐνης AChBP [2, 36, 37], η οποία ανέδειξε σημαντικές ανακατατάξεις στην AChBP κατά την πρόσδεση των αγωνιστών. Η AChBP είναι μια πενταμερής υδατοδιαλυτή πρωτεΐνη που απομονώθηκε για πρώτη φορά από κύτταρα γλοίας του γαστερόποδου μαλακίου Lymnaea stagnalis. Το ώριμο μόριο της AChBP έχει μήκος 210 αμινοξέα και παρουσιάζει ικανοποιητική ομολογία με τις Ν-τελικές ΕΚΠ των υπομονάδων (μεγαλύτερη με τις α υπομονάδες) των πενταμερών υποδοχέων της LGIC υπερ-οικογένειας. Οι αλλαγές, οι οποίες προέκυψαν στην AChBP κατά την πρόσδεση των αγωνιστών, πιθανόν να προκαλούν τη διάνοιξη του ιοντικού καναλιού στην περίπτωση της AChBP. Οι περιοχές πρόσδεσης βρίσκονται στις διεπιφάνειες των γειτονικών ΕΚΠ των υπομονάδων [38]. Εικόνα 3: Τοπολογικό διάγραμμα του μονομερούς μορίου AChBP. Ν: αμινο-τελικό άκρο, α1: α-έλικα, β1-β10: πτυχωτά φύλλα, L1-10: θηλιές ακανόνιστης δομής, S-S: δισουλφιδικοί δεσμοί, C: καρβοξυτελικό άκρο. [2] Η πρόσδεση των αγωνιστών οδηγεί σε σημαντική μετακίνηση της θηλιάς C της κύριας πλευράς της θέσης πρόσδεσης, ώστε να «κλείνει» την είσοδο της υδρόφοβης κοιλότητας και να περιβάλλει τα μόρια των αγωνιστών. 7

20 Α. Θεωρητικό Μέρος Στην «ανοιχτή» διαμόρφωση, απουσία αγωνιστών, η συντηρημένη Tyr185 της θηλιάς C (αντιστοιχεί στην Tyr190 στην α1 υπομονάδα του μυϊκού τύπου nachr) βρίσκεται σε απόσταση 8 Å από τη συντηρημένη Lys139 (Lys145 στην α1 υπομονάδα) του β7-πτυχωτού φύλλου, η οποία σχηματίζει μια γέφυρα άλατος με το συντηρημένο Asp194 (Asp200 στην α1 υπομονάδα) του β10-πτυχωτού φύλλου. Στα σύμπλοκα AChBP-αγωνιστές, η θηλιά C μετατοπίζεται με αποτέλεσμα η Tyr185 να βρίσκεται σε απόσταση 2-3 Å με τη Lys139, ενώ η γέφυρα άλατος με το Asp194 εξαφανίζεται. Έχει βρεθεί ότι μεταλλάξεις σε οποιοδήποτε από αυτά τα τρία αμινοξικά κατάλοιπα εμποδίζουν το άνοιγμα του καναλιού [39]. Συμπερασματικά, κατά την πρόσδεση αγωνιστών, η θηλιά C, η οποία βρίσκεται στη θέση πρόσδεσης, μετακινείται με τέτοιο τρόπο, ώστε να ευνοεί την ανάπτυξη ενός δεσμού υδρογόνου μεταξύ δύο συντηρημένων καταλοίπων Tyr και Lys, σταθεροποιώντας τη θηλιά C στη νέα διαμόρφωση. Όλες οι διαθέσιμες μέχρι στιγμής κρυσταλλογραφικές δομές διαφόρων AChBPs μπορούν να χωριστούν σε δύο μεγάλες κατηγορίες, ανάλογα με τη διευθέτηση της θηλιάς C: «ανοιχτή» ή «κλειστή» (Εικόνα 3). Η πρώτη κατηγορία περιλαμβάνει τις δομές της απο-μορφής της Α-AChBP [2] (AChBP από Aplysia californica [40] ) καθώς και τις δομές των συμπλόκων των AChBP με ανταγωνιστές [41] (α- Cbtx [42], α-ctx-pnla-διπλό μετάλλαγμα [43], α-ctx ImI και MLA), αντιπροσωπεύοντας την κατάσταση ηρεμίας των nachrs. Η δεύτερη κατηγορία περιλαμβάνει τις δομές των συμπλόκων της Α-AChBP και της L-AChBP [44] (AChBP από Lymnaea stagnalis) με αγωνιστές (L-AChBP/νικοτίνη, L-AChBP/καρβαμυλοχολίνη [45], Α-AChBP/λομπελίνη και Α-AChBP/επιβατιδίνη) ή με μόρια που προσομοιάζουν κατιονικούς αγωνιστές (L-AChBP/HEPES, A-AChBP-HEPES) και αντιπροσωπεύει την ενεργή κατάσταση των nachrs. Μεταξύ των δομών των δύο αυτών κατηγοριών, η θηλιά C μετατοπίζεται μέχρι και 11Å, όπως παρατηρήθηκε μετά από σύγκριση των δύο ακραίων καταστάσεων (σύμπλοκα Α-AChBP/α-Ctx ImI και Α-AChBP/επιβατιδίνη) [46]. Εκτός από τη μετατατόπιση της θηλιάς C, παρατηρούνται επίσης σημαντικές μετακινήσεις των θηλιών β1-β2, β8-β9 και της Cys-θηλιάς κατά την πρόσδεση αγωνιστών [47]. 8

21 Α. Θεωρητικό Μέρος Εικόνα 4: «Ανοιχτή» και «κλειστή» διαμόρφωση της δομής της AChBP. Η θηλιά C σημειώνεται με κόκκινο ή μπλε χρώμα, αντίστοιχα. [2] Α.4. Κρυσταλλική δομή ELIC Έχει προσδιοριστεί η ύπαρξη νουκλεοτιδικών αλληλουχιών σε βακτηριακά γονιδιώματα, οι οποίες κωδικοποιούν 15 πιθανούς ομόλογους υποδοχείς της υπεροικογένειας των ευκαρυωτικών LGIC [48]. Η πρώτη δομή ενός plgic σε υψηλή ανάλυση που παρέχει ένα μοντέλο για τη μελέτη του μηχανισμού της μεταφοράς ιόντων μέσα από το δίαυλο των υποδοχέων αυτής της οικογένειας είναι η ELIC. Η επίλυση της δομής της ELIC, ενός προκαρυωτικού LGIC από το βακτήριο Erwinia chrysanthemi, με κρυσταλλογραφία ακτίνων Χ, σε ανάλυση 3,3 Å και με ph 6,5 [26] πραγματοποιήθηκε πρόσφατα. Η δομή της ELIC (εικόνες 5 και 6), η οποία αντιπροσωπεύει την κλειστή διαμόρφωση του καναλιού, δηλαδή τη μη-αγώγιμη μορφή του καναλιού, επιβεβαίωσε το προτεινόμενο μοντέλο για τη δομή των προκαρυωτικών plgics. 9

22 Α. Θεωρητικό Μέρος Εικόνα 5 : Τοπολογικό διάγραμμα της ELIC. [1] Η πρωτεΐνη αυτή είναι ένα πενταμερές ιοντικό κανάλι που θεωρείται πρόγονος των nachrs. Η επίλυση της δομής της αποκάλυψε τη μεγάλη ομοιότητα της δομής της εξωκυττάριας περιοχής της (ELIC ΕΚΠ ) με τη δομή της AChBP και με τις ΕΚΠ των υπομονάδων της Torpedo nachr, με εξαίρεση την έλλειψη της Ν-τελικής α-έλικας και της Cys-θηλιάς [26]. Επίσης, η διαμεμβρανική περιοχή της πρωτεΐνης αυτής βρέθηκε ότι είναι παρόμοια με την αντίστοιχη των υπομονάδων του Torpedo nachr, καθώς αποτελείται από τέσσερις α-έλικες (α1-α4) κατ αντιστοιχία με τις Μ1-Μ4 [49] διαμεμβρανικές περιοχές του nachr. Οι α2-έλικες των διαμεμβρανικών περιοχών και των πέντε υπομονάδων της ELIC [50] σχηματίζουν έναν εσωτερικό κύκλο, που ορίζει την περίμετρο του καναλιού και ο οποίος περιβάλλεται και προστατεύεται από το υδρόφοβο περιβάλλον, ενώ ο εξωτερικός κύκλος σχηματίζεται από τις έλικες α1 και α3. Συγκρίνοντας τη δομή της ELIC με των ευκαρυωτικών LGICs, η ύπαρξη υδρόφοβου περιβάλλοντος στο κέντρο της μεμβράνης είναι συντηρημένη καθώς και η ύπαρξη αρνητικά φορτισμένων αμινοξικών καταλοίπων στην περιφέρεια του καναλιού, τα οποία προσδίδουν ιοντική επιλεκτικότητα [51]. Όμως η διάμετρος του ιοντικού πόρου της ELIC είναι μικρότερη από αυτή του nachr, δημιουργώντας με αυτό τον τρόπο την κλειστή διαμόρφωση του καναλιού. 10

23 Α. Θεωρητικό Μέρος Εικόνα 6: Α Πλάγια όψη και Β κάτοψη της δομής της ELIC. Ε = εξωκυττάριος χώρος, Ι = ενδοκυττάριος χώρος. [24] Ιδιαίτερα σημαντική είναι η έλλειψη της α3-α4 θηλιάς [1, 26] στα προκαρυωτικά LGICs, η οποία εμφανίστηκε κατά τη διάρκεια της εξέλιξης στα ευκαρυωτικά LGICs ώστε να εξυπηρετήσει συγκεκριμένες διεργασίες [52]. Για παράδειγμα στην περίπτωση των nachr συνεισφέρει στη μεγαλύτερη επιλεκτικότητα σε διαπερατά ιόντα καθώς και στη σύνδεσή του υποδοχέα με την κυτταροπλασματική πρωτεΐνη Rapsyn, με την οποία επιτυγχάνεται η συνάθροιση του υποδοχέα σε διάφορα σημεία της κυτταρικής μεμβράνης [53, 54]. Cys θηλιά α3-α4 θηλιά Εικόνα 7: Σύκριση απλουστευμένων απεικονίσεων των δομών των προκαρυωτικών με τα ευκαρυωτικά LGICs. Στα προκαρυωτικά LGICs απουσιάζει η χαρακτηριστική Cys θηλιά (C-C), η N-τελική α-έλικα και η κυτταροπλασματική θηλιά. [24] 11

24 Α. Θεωρητικό Μέρος Α.5. Κρυσταλλική δομή της GLIC Η δομή της πρωτεΐνης GLIC, ενός προκαρυωτικού ομολόγου που εντοπίζεται στο κυανοβακτήριο Gloeobacter violaceus [55], έχει προσδιοριστεί με κρυσταλλογραφία ακτίνων Χ σε ανάλυση 2,9 Å [26] και 3.1 Å [25] σε ph 4,6. Ο ρόλος αυτού του υποδοχέα αν και παραμένει άγνωστος ακόμα και σήμερα, πιθανολογείται ότι είναι η προσαρμογή του βακτηρίου στις μεταβολές του ph στο περιβάλλον όπου αυτό βρίσκεται. Αποδείχθηκε ότι η GLIC σχηματίζει πενταμερή και λειτουργεί ως ένα κατιονικό κανάλι, το οποίο ενεργοποιείται από την πρόσδεση πρωτονίων σε αυτό. Επομένως, δεδομένης της σχετικά υψηλής ομολογίας της κυρίως με την α7 υπομονάδα του nachr [56] (20% αμινοξική ταύτιση), θεωρείται ως ένας πρόγονος της υπεροικογένειας των ευκαρυωτικών LGICs. Σύμφωνα με τη κρυσταλλική της δομή, η GLIC φαίνεται ότι σχηματίζει κατιονικά κανάλια που ενεργοποιούνται με μείωση του ph στην εξωκυττάρια περιοχή. Πρόκειται για μια φαινομενικά ανοιχτή διαμόρφωση. Οι πέντε υπομονάδες έχουν τη διευθέτηση βαρελιού γύρω από την οδό μεταφοράς των ιόντων (εικόνα 8). Α Β Εικόνα 8 : Α Πλάγι α όψη και Β κάτοψη της δομής της GLIC. [26] 12

25 Α. Θεωρητικό Μέρος Οι υπομονάδες αυτές αλληλεπιδρούν ισχυρά μέσω μιας διεπιφάνειας εμβαδού 2200Å 2, η οποία περιλαμβάνει φορτισμένα αμινοξικά κατάλοιπα και μόρια νερού. Κάθε υπομονάδα της ΕΚΠ αποτελείται από πέντε εσωτερικές και τρεις εξωτερικές β- πτυχωτές επιφάνειες που συνδέονται με θηλιές και σχηματίζει ένα υδρόφοβο πυρήνα β-πτυχώσεων. Η GLIC παρουσιάζει δομική ομοιότητα με την αντίστοιχη διεπιφάνεια των ΕΚΠ των ευκαρυωτικών plgics που καλύπτεται από μια κοιλότητα δέσμευσης νευροδιαβιβαστών. Αυτό ενισχύεται μετά τον καθορισμό της β9-β10 θηλιάς (θηλιά C). Η διαμεμβρανική περιοχή (ΔΜΠ) της κάθε υπομονάδας αποτελείται από τέσσερις έλικες (Μ1-Μ4). Οι Μ2 έλικες των πέντε υπομονάδων σχηματίζουν το τοίχωμα του πόρου (εικόνα 8Α) και συνορεύουν με τους εξής πυρήνες αμινοξικών καταλοίπων: ένα αρνητικά φορτισμένο γλουταμινικό οξύ στη θέση 2 (Glu2), δύο πολικά αμινοξέα Τhr2 και Ser6 και τα τέσσερα υδρόφοβα αμινοξέα Ιle9, Αla13 και Ile16/Leu17. Οι Μ1 έλικες στρέφονται στο κατάλοιπο Ρro205 και σχηματίζουν με τη Μ3 ένα δεύτερο κύκλο ελίκων που αλληλεπιδρούν με το Μ2 [57], ενώ οι Μ4 έλικες βρίσκονται περιμετρικά. A B Εικόνα 9: A Πλάγια όψη της διαμεμβρανικής περιοχής. Μόνο δύο υπομονάδες παρουσιάζονται.και Β τοπολογικό διάγραμμα της GLIC. [26] Η κεντρική οδός μεταφοράς ιόντων αποτελείται από έναν εξωκυττάριο υδρόφιλο προθάλαμο, του οποίου το εύρος ξεπερνά τα 12Å και από έναν διαμεμβρανικό πόρο σε σχήμα χωνιού (εικόνα 9A). Οι Μ2 άξονες των ελίκων είναι κεκλιμένοι σε σχέση με τον άξονα του πόρου, με εξωτερικές υδρόφοβες πλευρικές 13

26 Α. Θεωρητικό Μέρος αλυσίδες προσανατολισμένες προς τις έλικες της κοινής επιφάνειας ενώ το εσωτερικό καλύπτεται από πολικές πλευρικές αλυσίδες προσανατολισμένες προς τον πόρο. Ο πόρος της GLIC σχηματίζει κώνο διαμέτρου 12Å στο άνω μέρος (εξωτερικά) και 5Å στο κάτω μέρος (εσωτερικά). Αυτό το μεγάλο άνοιγμα του πόρου υποδηλώνει μια «ανοιχτή δομή» του ιοντικού καναλιού. Όσον αφορά στη στενή περιοχή του πόρου, αυτή καθορίζεται από ισχυρές αλληλεπιδράσεις μεταξύ πέντε πλευρικών αλυσίδων γλουταμίνης. Αυτή η στενή περιοχή είναι πιθανό να αποτελεί εμπόδιο στην ελεύθερη διάχυση των ιόντων, λειτουργώντας ως φίλτρο επιλεκτικότητας των ιόντων. Επειδή το ενδοκυττάριο τμήμα του ανοιχτού καναλιού αντιμετωπίζει το φυσιολογικό ph του κυτταρικού περιβάλλοντος, είναι πιθανό η πρωτονιωμένη κατάσταση αυτών των αμινοξικών καταλοίπων να αλλάζει σε χαμηλό ph, ως αποτέλεσμα των συνθηκών κρυστάλλωσης (ph 4,6). Οι μικρές αλλαγές στη διαμόρφωση των πλευρικών αλυσίδων είναι επαρκείς για την αύξηση της ακτίνας του πόρου των μερικώς πρωτονιωμένων καταλοίπων σε χαμηλό ph, ενώ η συνολική διαμόρφωση των ελίκων που μορφοποιούν τον πόρο δε διαταράσσονται. Η δομή του κωνικού υδατικού πόρου και η ικανότητα πρόσδεσης ιόντων στο στενό ενδοκυττάριο τμήμα του αποδεικνύουν ότι η δομή της GLIC απεικονίζει είτε μια αγώγιμη κατάσταση ενός plgic είτε μια διαμόρφωση η οποία πλησιάζει αρκετά στη διαμόρφωση η οποία υιοθετείται σε μια αγώγιμη κατάσταση. Α.6. Διαμορφώσεις της GLIC Ανάλογα με το τμήμα του γονιδίου της GLIC το οποίο εκφράζεται αλλά και την κατάσταση στην οποία βρίσκεται η πρωτεΐνη, η GLIC εμφανίζεται σε διαφορετικές διαμορφώσεις. Η GLIC ΕΚΠ είναι μονομερές σε διάλυμα [58] παρά την ικανότητά της να σχηματίζει πενταμερή [26] όταν συνδέεται με τη διαμεμβρανική περιοχή, ενώ όταν η GLIC ΕΚΠ κρυσταλλώνεται χωρίς τη διαμεμβρανική περιοχή σχηματίζει εξαμερή [58]. 14 Η δομή του μονομερούς, με την οποία εμφανίζεται η GLIC ΕΚΠ σε διάλυμα, πλησιάζει αρκετά την αναδίπλωση του αντίστοιχου τμήματος του πενταμερούς της

27 Α. Θεωρητικό Μέρος GLIC χωρίς όμως να επηρεάζεται η διαμόρφωση του υδρόφοβου πυρήνα, ο οποίος παραμένει ανεξάρτητος από τις δραστικές αλλαγές στο περιβάλλον όπου βρίσκεται η GLIC ΕΚΠ. Σε κατάσταση κρυστάλλου και απουσία της διαμεμβρανικής περιοχής, η οποία φαίνεται να σχετίζεται με τη σωστή συγκρότηση του πενταμερούς, παρουσιάζεται μετάβαση από το πενταμερές στο εξαμερές (εικόνα 10) καθώς οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ των υπομονάδων τροποποιούνται, οι αλληλεπιδράσεις με τη διαμεμβρανική περιοχή χάνονται και οι συνθήκες κρυστάλλωσης της πρωτεΐνης μεταβάλλονται. Συγκεκριμένα η GLIC κρυσταλλώθηκε σε ph 4,6, ενώ η GLIC ΕΚΠ κρυσταλλώθηκε σε ph 7. Εικόνα 10: Κάτοψη και πλάγια όψη (a)του εξαμερούς και (b)του πενταμερούς της GLIC ΕΚΠ. [58] Οι επιφάνειες αλληλεπίδρασης μεταξύ γειτονικών υπομονάδων είναι μεγαλύτερες στο εξαμερές σε σύγκριση με αυτές που σχηματίζονται στο πενταμερές (10.3% και 8.5% της συνολικής επιφάνειας αντίστοιχα). Οι διεπιφάνειες αλληλεπίδρασης μελετηθήκαν αναλυτικά χρησιμοποιώντας σαν σύστημα αναφοράς δύο υπομονάδες: την κεντρική και την γειτονική/συπμληρωματική της σε κατάσταση ολιγομερισμού. Ο πιο εύκολος τρόπος για την περιγραφή της αναδιοργάνωσης των υποομάδων που επέρχεται κατά την μετάβαση από την μορφή του πενταμερούς σε αυτή του 15

28 Α. Θεωρητικό Μέρος εξαμερούς, είναι η εξέταση της γειτονικής υπομονάδας (και στις δύο μορφές ολιγομερισμού) αφού γίνει η υπέρθεση της κεντρικής υπομονάδας (Εικόνα 11). Στην εξαμερή μορφή του υποδοχέα παρατηρείται μια κλίση της γειτονικής υπομονάδας που οδηγεί σε μια κίνηση προς τα έξω και μακριά από τον άξονα συμμετρίας της. Επιπλέον, το τμήμα του εσωτερικού β κλώνου της συμπληρωματικής υπομονάδας που αλληλεπιδρά με την κύρια υπομονάδα υποβάλλεται σε μια καθοδική μετακίνηση της τάξης των 5Å. Εικόνα 11: Ατομικές επαφές που συμμετέχουν στη τεταρτοταγή δομή της GLIC ΕΚΠ (a) κεντρική υπομονάδα (e) συμπληρωματική υπομονάδα : με βέργες κίτρινου χρώματος για τα αμινοξέα που συμμετέχουν στις αλληλεπιδράσεις της διεπιφάνειας στο πενταμερές και στο εξαμερές, πράσινο για τα αμινοξικά κατάλοιπα που αλληλεπιδρούν μόνο στο πενταμερές, μπλε για τα αμινοξικά κατάλοιπα που αλληλεπιδρούν μόνο στο εξαμερές. (b, d) κάτοψη των δύο γειτονικών υπομονάδων όπου γίνεται υπέρθεση των κεντρικών (b) και των συμπληρωματικών (d) υπομονάδων. Η άλλη υπομονάδα είναι πράσινη για το πενταμερές και μπλε για το εξαμερές. (c) πλάγια όψη των συμπληρωματικών υπομονάδων, όπου εμφανίζονται οι σχετικές κινήσεις κατά την αλλαγή στον ολιγομερισμό. [58] Αμινοξικά κατάλοιπα τα οποία συμβάλουν στις διεπειφάνειες αλληλεπίδρασης των γειτονικών υπομονάδων τόσο στον πενταμερή όσο και εξαμερή τύπο ανήκουν στους κλώνους β1, β2, β6 και β5. Κατάλοιπα της συμπληρωματικής υπομονάδας που συμμετέχουν στην διεπιφάνεια αλληλεπίδρασης στο πενταμερές βρίσκονται στην δεξιά πλευρά της και αλληλεπιδρούν με την C θηλιά της κύριας υπομονάδας η οποία παρατηρήθηκε ότι είναι ευκίνητη και μη σωστά δομημένη στον εξαμερή τύπο. Γι αυτό 16

29 Α. Θεωρητικό Μέρος η κλίση της συμπληρωματικής υπομονάδας στο εξαμερές συνδυάζεται με αποκλεισμό της C θηλιάς από την επιφάνεια ολιγομερισμού. Τέλος τα κατάλοιπα τα οποία συμμετέχουν στην επιφάνεια εξαμερισμού βρίσκονται στη πάνω πλευρά της συμπληρωματικής υπομοναδας. Α.7. X-ray δομές της GLIC προσδεδεμένης με γενικά αναισθητικά Τα γενικά αναισθητικά [59] χρησιμοποιούνται ευρέως, αλλά ο μοριακός μηχανισμός δράσης τους παραμένει ελάχιστα κατανοητός. Υπάρχουν ισχυρές ενδείξεις ότι κύριοι στόχοι τους αποτελούν οι πενταμερείς ιοντικοί δίαυλοι που ενεργοποιούνται ή αναστέλλονται από αυτά [60]. Το βακτηριακό ομόλογο του υποδοχέα από το Gleobacter violaceus (GLIC) είναι ευαίσθητο σε κλινικές συγκεντρώσεις των γενικών αναισθητικών [61]. Με σκοπό τη μελέτη των αλλαγών στη δομή της GLIC μετά από πρόσδεση σε αυτήν των αναισθητικών, έγινε κρυστάλλωση των συμπλόκων της GLIC με την προποφόλη [62, 63] και το ντεσφλουράνιο [64] και ακολούθησε προσδιορισμός της δομής των συμπλόκων αυτών σε κρυσταλλική κατάσταση μέσω κρυσταλλογραφίας ακτίνων Χ σε ανάλυση 3,3 Å και 3,2 Å αντίστοιχα [65]. Αυτές οι κρυσταλλικές δομές αποκαλύπτουν μια κοινή θέση δέσμευσης των γενικών αναισθητικών, η οποία προΰπάρχει στη δομή. Η περιοχή πρόσδεσης βρίσκεται στο πάνω μισό της διαμεμβρανικής περιοχής (εικόνα 12) στην κοιλότητα που υπάρχει μέσα σε κάθε υπομονάδα. Και τα δύο μόρια αναισθητικών συνδέονται με την πρωτεΐνη μέσω αλληλεπιδράσεων Van der Waals. Συγκεκριμένα, η προποφόλη συνδέεται στην είσοδο της κοιλότητας, ενώ το μικρότερο και πιο ευέλικτο ντεσφλουράνιο δεσμεύεται στο εσωτερικό της. 17

30 Α. Θεωρητικό Μέρος Εικόνα 12: Περιοχές πρόσδεσης προποφόλης και ντεσφλουράνιο. [65] Η κοιλότητα των γενικών αναισθητικών είναι προσβάσιμη από τη διπλοστοιβάδα λιπιδίων και σταδιακά στενεύει προς τα κάτω, προς το εσωτερικό της υπομονάδας. Μια άλλη κοιλότητα συγκρίσιμου όγκου βρίσκεται στην κοινή επιφάνεια των υπομονάδων, από την άλλη πλευρά της Μ1. Δεν είναι προσβάσιμη από το εξωτερικό, ενώ ένας στενός δίαυλος (διαμέτρου μικρότερης των 3 Å) συνδέει τις δύο κοιλότητες. Το ντεσφλουράνιο που είναι θαμμένο στην κοιλότητα συνδέεται με υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις με τη Μ1 (Ιle201, Ιle202), τη Μ3 (Τhr255, Ιle258) και τη Μ2 (Val242). Η προποφόλη που βρίσκεται κοντά στην είσοδο των κοιλοτήτων των γενικών αναισθητικών, κατά την πρόσδεσή της θα οδηγήσει σε σύγκρουση με τα λιπίδια, τα οποία βρίσκονται φυσιολογικά στην περιοχή. Κατά συνέπεια η παρουσία της προποφόλης σχετίζεται με την αναδιοργάνωση των τοπικών αλκυλομάδων. Η προποφόλη προσδένεται ανάμεσα στις Μ1 και Μ3 και αλληλεπιδρά κυρίως με τα αμινοξικά κατάλοιπα Τhr255 και Tyr255 μέσω αλληλεπιδράσεων Van der Waals (εικόνα 13). Η διαταραχή των αλληλεπιδράσεων της πρωτεΐνης με τα λιπίδια, η οποία προκαλείται από τη δέσμευση των γενικών αναισθητικών συμβάλλει στην αναστολή της λειτουργίας της πρωτεΐνης, γεγονός το οποίο υποδηλώνει ότι τα γενικά 18

31 Α. Θεωρητικό Μέρος αναισθητικά μπορούν να ανταγωνίζονται με ενδογενείς, αλλοστερικούς υποκαταστάτες, τα λιπίδια στην περίπτωση αυτή αλλά και ενδεχομένως λιπαρά οξέα και χοληστερόλη στην περίπτωση των ευκαρυωτικών plgics. Εικόνα 13: Αμινοξικά κατάλοιπα της GLIC που συμμετέχουν στην πρόσδεση του ντεσφλουράνιο και της προποφόλης. [65] Μεταλλάξεις συγκεκριμένων αμινοξέων της περιοχής πρόσδεσης μεταβάλλουν την ιοντική ευαισθησία της GLIC απέναντι στα πρωτόνια και επηρεάζουν τα αποτελέσματα της γενικής αναισθησίας. Επίσης, πραγματοποιήθηκαν μετρήσεις αναστολής των γενικών αναισθητικών σε διαφορετικό ph και τα αποτελέσματα των μετρήσεων αυτών ήταν ότι και για τα δύο αναισθητικά είναι περισσότερο αποτελεσματικά σε υψηλότερο ph. Αυτό αποδεικνύεται από πειράματα ηλεκτροφυσιολογίας. Η κρυσταλλική δομή της GLIC εμφανίζεται να έχει ανοιχτή διαμόρφωση. Τα γενικά αναισθητικά συμπεριφέρονται ως αναστολείς της ιοντικής ανταπόκρισης και ως εκ τούτου αναμένεται να σταθεροποιούν μια κλειστή διαμόρφωση. 19

32 Α. Θεωρητικό Μέρος Α.8. Σύγκριση των διαμορφώσεων GLIC και ELIC Η ELIC [24] εμφανίζει σχετικά χαμηλή ταύτιση αμινοξέων με την GLIC, [26] η οποία φτάνει περίπου το 18%, γεγονός που αντανακλάται στη φυλογενετική απόσταση των κυανοβακτηρίων και των πρωτεοβακτηρίων [23]. Μετά από υπέρθεση της X-ray δομής της ELIC με την αντίστοιχη της GLIC παρατηρούνται σημαντικές ομοιότητες μεταξύ των δύο δομών [25] (εικόνα 14). Η εντυπωσιακή διατήρηση τόσο της δευτεροταγούς όσο και στοιχείων της τριτοταγούς δομής επιτρέπει την οριοθέτηση μιας κύριας δομής που διατηρείται στην οικογένεια των plgics. Αυτή περιλαμβάνει το εσωτερικό του υδρόφοβου πυρήνα και τις τέσσερις διαμεμβρανικές α-έλικες. Επίσης, και οι δύο προκαρυωτικές πρωτεΐνες σχηματίζουν ιοντικά κανάλια που είναι εκλεκτικά για κατιόντα. Οι διαφορές που διακρίνονται ανάμεσα στις περιοχές της GLIC και της ELIC αφορούν στη διαμόρφωσή της περιοχής πρόσδεσης και της διαμεμβρανικής περιοχής και υποδηλώνουν ότι οι δύο πρωτεΐνες υιοθετούν δύο ευδιάκριτες διαμορφώσεις στον πόρο, τον οποίο διαπερνούν ιόντα. Επομένως, οι διαφορές στις διαμορφώσεις μεταξύ των δύο ιοντικών καναλιών εντοπίζονται στη γεωμετρία των πόρων τους. Α Β Εικόνα 14: Α Υπέρθεση της ανοιχτής διαμόρφωσης δύο γειτονικών υπομονάδων της GLIC με τις αντίστοιχες της κλειστής διαμόρ φωσης της ELIC, με πράσινο για την GLIC και με κόκκινο την ELIC, ενώ με γκρι οι υπόλοιπες υπομονάδες. Β Υπέρθεση της υπομονάδας της GLIC (πράσινο) και της ELIC (κίτρινο). [25, 26] 20

33 Α. Θεωρητικό Μέρος Συγκεκριμένα, αν και ο διαμεμβρανικός πόρος της ELIC συμπιέζεται στην εξωκυττάρια περιοχή, η αντίστοιχη περιοχή της GLIC δείχνει μια ανοιχτή διαμόρφωση χωνιού με μια γραμμική μείωση της διαμέτρου προς την ενδοκυττάρια είσοδο του καναλιού. Σε αυτό το στενό τμήμα της GLIC, ο πόρος της ELIC διευρύνεται λόγω της ύπαρξης μιας κοιλότητας γεμάτη με νερό διαμέτρου περίπου 6Å. Αυτή η διαφορά στη διαμόρφωση του πόρου είναι αποτέλεσμα της διαφοράς στον προσανατολισμό των α2 και α3 ελίκων, ενώ η θέση της α1 έλικας που συνδέει το διαμεμβρανικό πόρο με το εξωκυττάριο τμήμα παραμένει ουσιαστικά αμετάβλητη. Επομένως, η δομή της GLIC και της ELIC προσομοιώνει την ανοιχτή και την κλειστή κατάσταση του ιοντικού καναλιού, αντίστοιχα. Ο συνδυασμός των δύο αυτών δομών προτείνει ένα νέο μηχανισμό ελέγχου εισόδου των ιόντων για τα πενταμερή ιοντικά κανάλια, που το άνοιγμά τους προέρχεται από την αλλαγή στην κλίση των ελίκων οι οποίες διαμορφώνουν ανάλογα, τον πόρο. 21

34 Α. Θεωρητικό Μέρος A.Β. ΧΡΗΣΗ ΤΟΥ ΒΙΟΜΟΡΙΑΚΟΥ ΝΜR A.Β.1. Χρήση του NMR για τον προσδιορισμό τριτοταγών δομών βιομορίων Η πιο γνωστή χρήση της φασματοσκοπίας NMR [66] σε βιολογικά συστήματα είναι η επίλυση τριτοταγών δομών βιομορίων σε ατομική λεπτομέρεια στο διάλυμα. Γεγονός είναι πάντως ότι η μεγάλη πλειοψηφία των γνωστών σήμερα δομών έχει επιλυθεί χρησιμοποιώντας την τεχνική της κρυσταλλογραφίας ακτίνων X [67]. Η κρυσταλλογραφία ακτίνων X είναι προγενέστερη τεχνική και σχεδόν πλήρως αυτοματοποιημένη άλλα απαιτεί την, αβέβαιης έκβασης, διαδικασία της κρυστάλλωσης μιας πρωτεΐνης [68]. Τυπικά, για την επιτυχή έκβαση της διαδικασίας επίλυσης τριτοταγούς δομής με NMR [69, 70] απαιτείται η καταγραφή ποικίλων ετεροπυρηνικών και πολυδιάστατων φασμάτων βιομοριακών δειγμάτων υψηλών απαιτήσεων σε συγκέντρωση και καθαρότητα. Η σύνθεση των πληροφοριών που προκύπτουν από τον κάθε τύπο φάσματος οδηγεί στην κατάρτιση μίας λίστας περιορισμών διατομικών αποστάσεων και γωνιών, η ικανοποίηση των οποίων οδηγεί στην επίλυση της δομής. Η διαφοροποίηση των χημικών μετατοπίσεων λόγω τριτοταγούς δομής μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να πιστοποιηθεί η σωστή αναδίπλωση ενός πολυπεπτιδίου. Η ευρεία διασπορά των σημάτων NMR στους άξονες του φάσματος 1 Η- 15 Ν HSQC (Heteronuclear single-quantum correlation spectroscopy) [71], το οποίο συσχετίζει το άτομο του αζώτου (Ν) μιας ομάδας ΝΗχ με το άμεσα συνδεδεμένο πρωτόνιο, οφείλεται στην ύπαρξη ποικίλων χημικών μικροπεριβαλλόντων που επάγουν μαγνητικές διαφοροποιήσεις σε χημικά όμοιους πυρήνες και συνεπώς αποτελεί στοιχείο ενδεικτικό της ύπαρξης δομής και το αντίστροφο. 22

35 Α. Θεωρητικό Μέρος A.Β.2. Χρήση του NMR για το χαρακτηρισμό της δυναμικής φύσης βιομορίων Η φασματοσκοπία NMR είναι πολύτιμο και αναντικατάστατο εργαλείο για το χαρακτηρισμό της ευκινησίας σε μοριακό, ακόμα και σε υπομοριακό επίπεδο. Είναι δηλαδή δυνατό να μελετηθεί ο δυναμικός χαρακτήρας, [72] η κινητικότητα επιμέρους τμημάτων ενός βιομορίου σε επίπεδο ατόμων και να εξαχθούν συμπεράσματα για τη σημασία της ευελιξίας δραστικών ομάδων στη συνολική βιολογική δραστικότητα του μορίου. Στις περιπτώσεις πολυπεπτιδίων, τα πειράματα χαρακτηρισμού της δυναμικής συμπεριφοράς αποσκοπούν στον υπολογισμό παραμέτρων όπως οι χρονικές σταθερές αποδιέγερσης Τ1 και Τ2 για κάθε πυρήνα 1 Η αμιδικής ομάδας του πολυπεπτιδικού σκελετού, και συνεπώς σε έμμεση εκτίμηση της ευελιξίας τους. A.Β.3. Μοριακό μέγεθος και NMR Το μοριακό μέγεθος αποτελεί σημαντική παράμετρο στη βιομοριακή φασματοσκοπία NMR. Φάσματα NMR υψηλού μοριακού βάρους πρωτεϊνών, περιέχουν ευρείες και μικρότερης έντασης κορυφές και αυτό καθιστά δύσκολο τον δομικό χαρακτηρισμό τους, δικαιολογώντας την υπεραντιπροσώπευση μικρών πρωτεϊνών στην κατανομή μοριακών βαρών των επιλυμένων με NMR δομών. Με τα διαθέσιμα σήμερα μαγνητικά πεδία, το όριο μοριακού βάρους κάτω από το οποίο η επίλυση της δομής μιας πρωτεΐνης είναι εφικτή χρησιμοποιώντας πολύπλοκα σχήματα ισοτοπικής επισήμανσης (π.χ. ειδική επισήμανση αμινοξέων) και πρωτόκολλα πολυδιάστατης φασματοσκοπίας NMR είναι 30kDa. A.Β.4. Έκφραση ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών για δομική μελέτη NMR Με NMR δομική μελέτη είναι δυνατόν να χαρακτηριστούν μικρά οργανικά μόρια, πεπτίδια και πρωτεΐνες [73], μεγέθους από μερικά Da έως και 30kDa. Ωστόσο, απαιτείται επισήμανση των μορίων αυτών με τους ενεργούς NMR πυρήνες ( 15 N ή/και 23

36 Α. Θεωρητικό Μέρος 13 C) και αυξημένη συγκέντρωσή τους στο διάλυμα [74]. Η επισήμανση των ενεργών μορίων και των πεπτιδίων με ενεργούς πυρήνες αποτελεί μια αρκετά ακριβή και πολύπλοκη τεχνική. Η επισήμανση των πρωτεϊνών, οι οποίες εκφράζονται με βιοτεχνολογικές μεθόδους, με ενεργούς NMR πυρήνες αποτελεί μια εύχρηστη και σχετικά προσιτή τεχνική. Αυτό πραγματοποιείται καθώς τα κύτταρα που εκφράζουν την πρωτεΐνη-στόχο, αναπτύσσονται σε βακτηριακές καλλιέργειες, των οποίων το θρεπτικό μέσο φέρει τις απαραίτητες πηγές άνθρακα και αζώτου επισημασμένες (σε 13 C και 15 N, αντίστοιχα). Επίσης, τα κύτταρα, τα οποία επιλέγονται για την έκφραση των πρωτεϊνών είναι απαραίτητο να εξασφαλίζουν ελεγχόμενη και υψηλής απόδοσης έκφραση. Επομένως, οι πρωτεΐνες, οι οποίες εκφράζονται με τον τρόπο αυτό είναι επισημασμένες στο άζωτο ( 15 N) ή/και στον άνθρακα ( 13 C) και στις απαραίτητες συγκεντρώσεις. Ακολουθεί η απομόνωση των πρωτεϊνών, η λήψη και επεξεργασία των NMR φασμάτων και ο δομικός χαρακτηρισμός των μορίων. A.Β.5. Ισοτοπική επισήμανση πρωτεϊνών με ενεργούς πυρήνες στη φασματοσκοπία NMR Οι ενεργοί πυρήνες στη φασματοσκοπία NMR είναι οι 15 N και 13 C και αξιοποιούνται για τη συσχέτισή τους με τους πυρήνες του πρωτονίου ( 1 Η) [75, 76]. Τα συστήματα συντονισμού σε ένα ομο- ( 1 Η- 1 Η) ή ετερο- ( 1 Η- 13 C/ 15 Ν) πυρηνικό φάσμα NMR δύο, τριών [77, 78] ή τεσσάρων διαστάσεων [79] παρέχουν τη δυνατότητα αναγνώρισης των δομικών μονάδων του βιοπολυμερούς καθώς και την εξακρίβωση της θέσης των δομικών αυτών μονάδων στην αλυσίδα του βιοπολυμερούς. Ο συνδυασμός της ισοτοπικής επισήμανσης εξαρτάται εκτός από τον τύπο των πειραμάτων του NMR που πρόκειται να πραγματοποιηθούν και από το μέγεθος της προς μελέτη πρωτεΐνης [80]. Επομένως, για πρωτεΐνες μεγέθους μέχρι 20kDa η διπλή επισήμανση είναι επαρκής. Για μελέτη της δομής μεγάλων μακρομορίων, που το μέγεθός του ξεπερνά τα 20kDa δεν επαρκεί. Το γεγονός αυτό οφείλεται στη διεύρυνση των κορυφών που προκαλούνται από τη γρήγορη αποδιέγερση των πυρήνων, καθώς επίσης και στην επικάλυψη των κορυφών εξαιτίας του πλήθους 24

37 Α. Θεωρητικό Μέρος τους. Στις περιπτώσεις αυτές χρησιμοποιείται ευρέως η μέθοδος της δευτερίωσης [81], δηλαδή η χρήση υγρών θρεπτικών μέσων όπου οι πυρήνες των 1 Η (πρωτονίων) έχουν αντικατασταθεί από 2 Η (δευτέριο) και συνεπώς η παραγόμενη πρωτεΐνη φέρει 2 Η αντί των 1 Η. Με τη δευτερίωση μειώνεται ο ρυθμός αποδιέγερσης των NMRενεργών πυρήνων, ιδιαίτερα του 13 C, καθώς ο γυρομαγνητικός λόγος του 2 Η είναι 6,5 φορές μικρότερος από αυτόν του 1 [82, 83] Η. Επιπλέον, με τη χρήση της δευτερίωσης απλοποιούνται τα φάσματα, καθώς τα σήματα των πρωτονίων δεν εμφανίζονται εξαιτίας της ανταλλαγής τους με το δευτέριο [84]. Τέλος, βελτιώνεται η ανάλυση και η ευαισθησία των πειραμάτων NMR. Όσον αφορά στη δομική μελέτη μακρομορίων που το μέγεθός τους ξεπερνά τα 30kDa, τα φάσματα γίνονται όλο και περισσότερο πολύπλοκα εξαιτίας της επικάλυψης των κορυφών, καθιστώντας την επεξεργασία των φασμάτων αυτών εξαιρετικά δύσκολη. Ως μέσον απλοποίησής τους χρησιμοποιείται η επιλεκτική επισήμανση. Πολλές φορές μάλιστα η μέθοδος αυτή συνδυάζεται με αυτή της δευτερίωσης με σκοπό την απλοποίηση των NMR φασμάτων. A.Β.6. Επιλεκτική Επισήμανση Η στρατηγική της επιλεκτικής επισήμανσης [85] βασίζεται σε επιλεκτικά επισημασμένα ή μη αμινοξικά κατάλοιπα σε 13 C / 15 Ν επισημασμένες πρωτεΐνες. Με τον τρόπο αυτό απλοποιούνται τα πολυδιάστατα ετεροπυρηνικά NMR φάσματα και αυτό συντελεί στην ταυτοποίηση των πυρήνων της συγκεκριμένης αλληλουχίας για την κύρια αλυσίδα [86, 87] και για τους πυρήνες των πλευρικών ομάδων [88, 89]. Χρησιμοποιείται κυρίως για την ταυτοποίηση πυρήνων πρωτεϊνών μεγάλου μοριακού βάρους [90], τα φάσματα των οποίων είναι αρκετά πολύπλοκα. Η επιλεκτική επισήμανση αποτελεί μια σημαντική μεθοδολογία για να μειωθεί η αλληλοεπικάλυψη των σημάτων συντονισμού στο φάσμα και συντελεί στη διαδικασία ταυτοποίησης των κορυφών αλλά και στο χαρακτηρισμό της δυναμικής τμημάτων ή ολόκληρης της πρωτεΐνης. Ως μειονέκτημα της επιλεκτικής επισήμανσης μπορεί να αναφερθεί το υψηλό κόστος αρκετών επισημασμένων αμινοξέων. Επιπλέον, η παρεμβολή κορυφών στο φάσμα 1 Η- 15 Ν HSQC που αντιστοιχούν σε αμινοξέα τα οποία δεν έχουν επιλεχθεί 25

38 Α. Θεωρητικό Μέρος να είναι επισημασμένα, αποτελεί ένα από τα σημαντικότερα προβλήματα της επιλεκτικής επισήμανσης. Αυτό συμβαίνει διότι τα βακτηριακά κύτταρα που εκφράζουν τις προς μελέτη πρωτεΐνες μεταβολίζουν το επισημασμένο αμινοξύ παράγοντας και άλλα επισημασμένα αμινοξέα. Επομένως, στο 1 Η- 15 Ν HSQC φάσμα εμφανίζονται όχι μόνο κορυφές οι οποίες αντιστοιχούν στο συγκεκριμένο/επιθυμητό (αρχικά επισημασμένο) αμινοξύ αλλά εμφανίζονται σήματα/κορυφές αμινοξέων που έχουν προέλθει βιοσυνθετικά από αυτό. Το φαινόμενο αυτό ονομάζεται μη ειδική επισήμανση αμινοξέων (scrambling/cross- labeling) και γίνονται προσπάθειες εξάλειψής του. Ανάλογα με το είδος της επισήμανσης ( 13 C ή/και 15 N ή/και 2 Η) του αμινοξέος που επιλέγεται αλλά και της επισήμανσης του μέσου έκφρασης της προς μελέτη πρωτεΐνης, προκύπτουν διάφορες κατηγορίες επιλεκτικής επισήμανσης. Έτσι, διακρίνουμε τις κατηγορίες: o 15 Ν-επιλεκτικά επισημασμένα αμινοξέα σε μη-επισημασμένο ( 14 Ν) υπόβαθρο, [91] o Επιλεκτική αντίστροφη επισήμανση αμινοξέων σε 15 Ν-υπόβαθρο, [92] o 13 C-επιλεκτική επισήμανση αμινοξέων σε μη-επισημασμένο ( 12 C) υπόβαθρο, [90] o Επιλεκτική πρωτονίωση μεθυλομάδων σε 2 [93, 94] Η υπόβαθρο. A.Β.6.i). 15 Ν-επιλεκτικά επισημασμένα αμινοξέα σε μη-επισημασμένο ( 14 Ν) υπόβαθρο Η μέθοδος αυτή της επιλεκτικής επισήμανσης στηρίζεται στην ενσωμάτωση 15 Ν-επιλεκτικά επισημασμένων αμινοξέων σε μη-επισημασμένο ( 14 Ν) υπόβαθρο. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα στο φάσμα 1 Η- 15 Ν HSQC, το οποίο λαμβάνεται, να εμφανίζονται μόνο οι κορυφές που αντιστοιχούν στα αμινοξικά κατάλοιπα του 15 Ν-επισημασμένου αμινοξέος. Σε πολλούς τύπους αμινοξέων, οι οποίοι επισημάνθηκαν επιλεκτικά εμφανίζεται το φαινόμενο της μη-ειδικής επισήμανσης αμινοξέων [95]. Περαιτέρω μελέτη αυτού του προβλήματος οδήγησε στο συμπέρασμα ότι η μη-ειδική 26

39 Α. Θεωρητικό Μέρος [96, 97] επισήμανση οφείλεται στη βιοσύνθεση των αμινοξέων αυτών επισημασμένο αμινοξύ (Εικόνα 15). από το αρχικά Εικόνα 15: Απεικόνιση της βιοσύνθεσης των αμινοξέων σε βακτηριακά κύτταρα. Η βιοσύνθεση των αμινοξέων στα βακτήρια [98] είναι γνωστή εξαιτίας της μελέτης της ρύθμισης σε επίπεδο ενζυματικής δραστηριότητας και σε επίπεδο έκφρασης γονιδίων. Οι πορείες για τη βιοσύνθεση των αμινοξέων είναι ποικίλες. Ωστόσο, εμφανίζουν ένα σημαντικό κοινό χαρακτηριστικό: ο ανθρακικός σκελετός τους προέρχεται από ενδιάμεσα της γλυκόλυσης, [99] της πορείας των φωσφορικών πεντοζών ή του κύκλου του κιτρικού οξέος. [100] Με βάση τις πρώτες ύλες τα αμινοξέα μπορούν να ταξινομηθούν σε έξι βιοσυνθετικές οικογένειες. Η τρανσαμινάση [101] καταλύει την ανταλλαγή του αζώτου που οδηγεί στην ενσωμάτωση της επισήμανσης σε μη επιθυμητά παράγωγα. Επομένως, αυτή η μη-ειδική επισήμανση αμινοξέων μπορεί να αποφευχθεί με αναστολή του μεταβολισμού του επισημασμένου αμινοξέος σε παράγωγά του, δηλαδή άλλα αμινοξέα. Ασφαλώς, είναι ευκολότερη η επιλεκτική επισήμανση αμινοξέων που εμφανίζονται στα τελικά στάδια των μονοπατιών βιοσύνθεσης των αμινοξέων σε βακτηριακά κύτταρα. Έτσι, διακρίνουμε δυο κατηγορίες αμινοξέων για την 15 Ν-επιλεκτική επισήμανση αμινοξέων: 27

40 Α. Θεωρητικό Μέρος Αμινοξέα που βρίσκονται στο τελικό στάδιο βιοσύνθεσης στα βακτηριακά κύτταρα E.coli, Αμινοξέα που βρίσκονται στα ενδιάμεσα στάδια των βιοσυνθετικών μονοπατιών των αμινοξέων σε βακτηριακά κύτταρα E.coli. A.B.6.i).α. 15 Ν-επισημασμενα αμινοξέα Lys, Arg, Met, Pro, Cys, His, Asn Τα επιλεκτικά 15 Ν-επισημασμένα αμινοξέα [91] Lys, Arg, Met, Pro, Cys, His, Asn εμφανίζονται ως τελικά προϊόντα στα βιοσυνθετικά μονοπάτια των αμινοξέων στα βακτηριακά κύτταρα. Επομένως, μπορούν να χρησιμοποιηθούν κυτταρικές σειρές του βακτηρίου E.coli, τα οποία είναι πρωτοτροφικά κύτταρα [102]. Τα κύτταρα αυτά έχουν τη δυνατότητα σύνθεσης όλων των αμινοξέων που χρειάζονται, τόσο για να καλύψουν τις βιολογικές τους ανάγκες όσο και για τη έκφραση των προς μελέτη πρωτεϊνών, από μόνα τους χρησιμοποιώντας μια πηγή άνθρακα και μια πηγή αζώτου, η οποία τους δίνεται εξωγενώς. Έτσι, η έκφραση της προς μελέτη πρωτεΐνης γίνεται στις συγκεκριμένες κυτταρικές σειρές με την προσθήκη του 15 Ν- επισημασμένου αμινοξέος. Με τον τρόπο αυτό το κύτταρο λαμβάνει το 15 Ν- επισημασμένο αμινοξύ έτοιμο από την, κατά τα άλλα, μη επισημασμένη βακτηριακή καλλιέργεια και δε χρειάζεται να τo βιοσυνθέσει από μόνο του. Αυτό συμβαίνει καθώς το τελικό προϊόν της βιοσυνθετικής πορείας, που στην περίπτωση αυτή είναι το επιθυμητά 15 Ν-επισημασμένο αμινοξύ, αναστέλλει το ένζυμο το οποίο καταλύει την αντίδραση σύνθεσής του από κάποιο άλλο πρόδρομο αμινοξύ. Μετά την έκφραση και την απομόνωση της πρωτεΐνης ακολουθεί η λήψη φασμάτων NMR και συγκεκριμένα του φάσματος 1 Η- 15 Ν HSQC. Το 1 Η- 15 Ν HSQC φάσμα, το οποίο λαμβάνεται περιλαμβάνει τις κορυφές που αντιστοιχούν στο 15 Ν- επισημασμένο αμινοξύ. Με υπέρθεση του φάσματος αυτού με το φάσμα που περιλαμβάνει την πλήρως 15 Ν-επισημασμένη πρωτεΐνη, επιτρέπει τη ταυτοποίηση των σημάτων συντονισμού, τα οποία αντιστοιχούν στα αμινοξικά κατάλοιπα του επιλεκτικά 15 Ν-επισημασμένου αμινοξέος. Συνδυασμός των φασμάτων αυτών με τα τρισδιάστατα ετεροπυρηνικά φάσματα τα οποία συνδυάζουν το κάθε αμινοξύ με το προηγούμενό του έχει ως αποτέλεσμα τον προσδιορισμό της θέσης του κάθε αμινοξικού καταλοίπου στην αλληλουχία της πρωτεΐνης. Με τον τρόπο αυτό είναι 28

41 Α. Θεωρητικό Μέρος δυνατή η ταυτοποίηση όλων των αμινοξικών καταλοίπων μιας πρωτεΐνης που αντιστοιχούν στα αμινοξέα Lys, Arg, Met, Pro, Cys, His, Asn. A.B.6.i).β. 15 Ν-επισήμανση αμινοξέων που εμφανίζονται σε ενδιάμεσα στάδια του βιοσυνθετικού μονοπατιού στα βακτηριακά κύτταρα με την αποφυγή της μη-επιλεκτικής επισήμανσης Σε μια προσπάθεια να εξαλειφθεί η μη-ειδκή επισήμανση και να αυξηθεί ο αριθμός των αμινοξέων τα οποία μπορούν να επισημανθούν επιλεκτικά με επιτυχία, αναπτύχθηκαν διάφορες μέθοδοι επιλεκτικής επισήμανσης για τα αμινοξέα τα οποία εμφανίζονται σε ενδιάμεσα στάδια των βιοσυνθετικών μονοπατιών στα βακτηριακά κύτταρα E.coli. Σε αυτές τις μεθόδους χρησιμοποιούνται διαφορετικές E.coli κυτταρικές σειρές, οι οποίες χρησιμοποιούνται για την έκφραση της πρωτεΐνης, ή προστίθενται άλλα μη-επισημασμένα 14 Ν-αμινοξέα για να μειωθεί η μη-ειδική επισήμανση. Επομένως, διακρίνονται δύο μέθοδοι επιλεκτικής επισήμανσης των αμινοξέων αυτών: Έκφραση της πρωτεΐνης σε πρωτοτροφικά κύτταρα [103] με προσθήκη του 15 Ν- επισημασμένου αμινοξέος και περίσσειας μη-επισημασμένων 14 Ν-αμινοξέων, για να αποφευχθεί το φαινόμενο της μη-ειδικής επισήμανσης, [104] Έκφραση της πρωτεΐνης σε αυξοτροφικά βακτηριακά κύτταρα με προσθήκη του επιλεκτικά 15 Ν-επισημασμένου αμινοξέος μαζί με τα μη-επισημασμένα 14 Ν- αμινοξέα που δεν μπορούν να συνθέσουν από μόνα τους τα κύτταρα. [105] A.B.6.i).α.a). Έκφραση της πρωτεΐνης σε πρωτοτροφικά κύτταρα με προσθήκη του 15 Ν-επισημασμένου αμινοξέος Ένα κοινό πρόβλημα, το οποίο εμφανίζεται κατά την έκφραση της πρωτεΐνης σε πρωτοτροφικά κύτταρα, στα ελάχιστα θρεπτικά μέσα [106], με ένα επιλεκτικά 15 Ν- επισημασμένο αμινοξύ είναι η μη-ειδική επισήμανση αμινοξέων που εντοπίζεται στο 1 Η- 15 Ν HSQC φάσμα που λαμβάνεται. Αυτή η μη-ειδική επισήμανση μπορεί να αποφευχθεί με αναστολή της σύνθεσης άλλων 15 Ν-αμινοξέων από το επιλεκτικά επισημασμένο αμινοξύ. Επομένως, η μη-ειδική επισήμανση αμινοξέων μπορεί να αποφευχθεί με προσθήκη περίσσειας μη-επισημασμένων αμινοξέων, [104] τα οποία 29

42 Α. Θεωρητικό Μέρος προέρχονται βιοσυνθετικά από το επιθυμητά επισημασμένο αμινοξύ ή και όλων των υπολοίπων αμινοξέων με σκοπό να αποκλειστεί η μη-ειδική επισήμανση και άλλων αμινοξέων. Ωστόσο, η απαιτούμενη ποσότητα των μη επισημασμένων αμινοξέων, τα οποία πρέπει να προστεθούν ποικίλει και είναι δύσκολο να καθοριστεί με ακρίβεια αν η εσφαλμένη επισήμανση αμινοξέων έχει επαλειφθεί ή όχι, ιδιαίτερα σε περιπτώσεις όπου η ταυτοποίηση των κορυφών δεν είναι γνωστή. Γίνονται, επομένως, προσπάθειες για τον προσδιορισμό των ποσοτήτων των μη-επισημασμένων αμινοξέων που απαιτούνται για την αποτελεσματική διαδικασία της επιλεκτικής επισήμανσης της πρωτεΐνης με το επιθυμητό αμινοξύ. A.B.6.i).α.b). Έκφραση της πρωτεΐνης σε αυξοτροφικά βακτηριακά κύτταρα με προσθήκη περίσσειας μη-επισημασμένων αμινοξέων Ένας εναλλακτικός τρόπος εξάλειψης του φαινομένου της μη-ειδικής επισήμανσης αμινοξέων στην επιλεκτική επισήμανση είναι η χρήση αυξοτροφικών βακτηριακών κυττάρων [95]. Τα βακτήρια που ανήκουν σε τέτοιου είδους κυτταρικές σειρές δε μπορούν να συνθέσουν όλα τα είδη των αμινοξέων. Αυτό συμβαίνει λόγω έλλειψης των ειδικών ενζύμων, των τρανσαμινασών [101] που μετατρέπουν κάποιο αμινοξύ σε αμινοξύ διαφορετικού τύπου, καταλύοντας την αντίδραση ανάμεσα στο αμινοξύ και στο πρόδρομο μόριο, α-κετο οξύ. Επομένως, σε αυτές τις βακτηριακές κυτταρικές σειρές τα αμινοξέα που δε μπορούν να συνθέσουν τα βακτήρια προστίθενται εξωγενώς. Αυτά τα κύτταρα μπορούν να χρησιμοποιηθούν στην επιλεκτική επισήμανση των αμινοξέων που προστίθενται στο μέσο έκφρασής τους. Ένα μειονέκτημα της μεθόδου αυτής είναι η μειωμένη απόδοση στην έκφραση της πρωτεΐνης. Το 1 Η- 15 Ν-HSQC φάσμα που λαμβάνεται σε μια τέτοια περίπτωση περιλαμβάνει τις κορυφές του επισημασμένου αμινοξέος. 30

43 Α. Θεωρητικό Μέρος A.Β.6.ii). Επιλεκτική αντίστροφη επισήμανση αμινοξέων σε 15 Ν υπόβαθρο Μια παρόμοια μέθοδος με αυτή της επιλεκτικής 15 Ν-επισήμανσης, η οποία στηρίζεται στις ίδιες αρχές και προορίζεται για τον εντοπισμό των παραπάνω σημάτων συντονισμού αμινοξέων αλλά ταυτόχρονα με χαμηλότερο κόστος, είναι αυτή της αντίστροφης επιλεκτικής επισήμανσης [92]. Όπως αναφέρθηκε στην ενότητα B.6.i).α. ανάμεσα στα αμινοξέα, τα οποία μπορούν να επισημανθούν επιλεκτικά είναι η αργινίνη και η ασπαραγίνη. Ωστόσο, εξαιτίας του υψηλού κόστους αυτών των 15 Ν- επισημασμένων αμινοξέων, χρησιμοποιείται η τεχνική της αντίστροφης επισήμανσης. Η στρατηγική αυτή στηρίζεται στην επιλεκτική αντίστροφη επισήμανση αμινοξικών καταλοίπων σε μια πλήρως 15 Ν- επισημασμένη πρωτεΐνη και απλοποιεί το ετεροπυρηνικό φάσμα 1 Η- 15 Ν-HSQC. Στα φάσματα 1 Η- 15 Ν-HSQC που λαμβάνονται εμφανίζονται όλες οι κορυφές που αντιστοιχούν σε όλα τα αμινοξέα της πρωτεΐνης εκτός από αυτά του μη-επισημασμένου αμινοξέος. Με υπέρθεση των φασμάτων αυτών με το αντίστοιχο της πλήρους 15 Ν-επισημασμένης πρωτεΐνης καθώς και με την ανάλυση και άλλων ομο/ετερο-πυρηνικών NMR φασμάτων αναγνωρίζονται τα σήματα συντονισμού των αμινοξέων και τα αμινοξέα ταυτοποιούνται. 31

44 Α. Θεωρητικό Μέρος 32

45 Ενότητα Β Σκοπός Εργασίας 33

46 Β. Σκοπός Εργασίας 34

47 Β. Σκοπός Εργασίας Β. Σκοπός Εργασίας Η GLIC (Gloeobacter ligand-gated ion channel) είναι ένας ομοπενταμερής διαμεμβρανικός υποδοχέας του κυανοβακτηρίου Gloeobacter violaceus. Ο πιθανός ρόλος αυτού του υποδοχέα είναι η προσαρμογή του βακτηρίου στις αλλαγές του ph στο περιβάλλον, στο οποίο βρίσκεται. Ο υποδοχέας αυτός ανήκει στην υπεροικογένεια των plgics και εμφανίζει σχετικά υψηλή ομολογία κυρίως με την α7 υπομονάδα του nachr (20% αμινοξική ταύτιση). Τα τελευταία χρόνια οι γνώσεις γύρω από τη τριτοταγή δομή των plgics έχουν αυξηθεί, καθώς αρκετά μέλη της οικογένειας αυτής έχουν κρυσταλλωθεί και μελετηθεί με κρυσταλλογραφία ακτίνων Χ. Πρόκειται είτε για ολόκληρα μόρια, με περίπου αμινοξικά κατάλοιπα ανά υπομονάδα και τρεις διακριτές περιοχές, είτε για τα μόρια αυτά προσδεδεμένα με διάφορους προσδέτες, είτε ακόμα και για μεμονωμένες τις ΕΚΠ τους. Αυτό συμβαίνει για την εξαγωγή όσο το δυνατόν περισσοτέρων πληροφοριών σχετικών με τη δομή των υποδοχέων αυτών αλλά και των περιοχών δέσμευσής τους. Η οικογένεια αυτών των υποδοχέων παρουσιάζει μεγάλο φαρμακολογικό ενδιαφέρον, καθώς διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο σε νευρολογικές ασθένειες, αλλά αποτελούν ταυτόχρονα σημαντικούς στόχους διαφόρων φαρμάκων. Οι γνώσεις μας γύρω από τη δομή των plgics προέρχεται κυρίως από τη χρήση καρυσταλλογραφίας ακτίνων Χ. Σκοπός της παρούσας ερευνητικής εργασίας είναι η NMR μελέτη της ΕΚΠ της GLIC σε υδατικό διάλυμα. Έχοντας ως στόχο τη μέγιστη δυνατή απόδοση της παραγόμενης πρωτεΐνης πραγματοποιήθηκαν πειράματα έκφρασης της πρωτεΐνης σε διαφόρους τύπους θρεπτικών μέσων, έτσι ώστε να επιλεχθεί αυτό με τη μεγαλύτερη δυνατή απόδοση και το χαμηλότερο κόστος. Εξίσου σημαντική ήταν η διαδικασία επιτυχούς απομόνωσης της πρωτεΐνης GLIC ΕΚΠ από τις βακτηριακές πρωτεΐνες, έτσι ώστε να επιτευχθεί η δομική μελέτη μέσω της φασματοσκοπίας NMR. Ένας ακόμη στόχος είναι η επιτυχής, ολοκληρωτική ισοτοπική επισήμανση της πρωτεΐνης με ενεργούς πυρήνες 15 Ν, 13 C και 2 Η με σκοπό την καταγραφή NMR φασμάτων. Η πολυπλοκότητα των φασμάτων αυτών, η οποία οφείλεται στα φαινομένα αλληλεπικάλυψης των κορυφών, στο γρήγορο ρυθμό αποδιέγερσης των 35

48 Β. Σκοπός Εργασίας πυρήνων, καθώς και στο μέγεθος της πρωτεΐνης που μελετάται, το οποίο είναι αρκετά μεγάλο (201 αμινοξέα), αποτυπώνεται στα φάσματα της πρωτεΐνης. Σημαντική είναι η αναζήτηση μεθόδων για την αποτελεσματικότερη επεξεργασία των φασμάτων και την εξαγωγή ασφαλέστερων συμπερασμάτων. Τέτοιες μέθοδοι είναι η αντικατάσταση των ατόμων/πυρήνων πρωτονίου με δευτέρια, 2 Η και η επιλεκτική επισήμανση συγκεκριμένων αμινοξέων για την απλοποίηση των φασμάτων και τη μείωση του ρυθμού αποδιέγερσης, αντίστοιχα. Επόμενος στόχος της παρούσας εργασίας, εκτός από τη δομική μελέτη της GLIC ΕΚΠ σε διάλυμα μέσω της φασματοσκοπίας NMR, αποτέλεσε ο χαρακτηρισμός της δυναμικής της GLIC ΕΚΠ στο διάλυμα. Σημαντική είναι, επίσης, η ταυτοποίηση περιοχών που παρουσιάζουν σημαντική κινητικότητα και σύγκριση των NMR δεδομένων με τα δομικά δεδομένα που προέρχονται από τις διαθέσιμες κρυσταλλικές δομές της GLIC ΕΚΠ. 36

49 Ενότητα Γ Υλικά και Μέθοδοι 37

50 Γ. Υλικά και Μέθοδοι 38

51 Γ. Υλικά και Μέθοδοι Γ.1. Υλικά Γ.1.1. Εργαστηριακός Εξοπλισμός Επωαστήρας για καλλιέργειες βακτηρίων υπό ανάδευση, INFORS HT (Minitron) Ψυχόμενη φυγόκεντρος Beckman Coulter Επιτραπέζια ψυχόμενη φυγόκεντρος Heraeus Fresco 21 (Thermo Electron Corporation) Φυγόκεντρος KUBOTA Ηλεκτρονικός ζυγός Mettler Toledo Ηλεκτρονικός ζυγός ακριβείας Mettler Toledo Αυτόκαυστο της Raypa (για την αποστείρωση των θρεπτικών υλικών) Μηχάνημα υπερήχων για τη λύση των μεμβρανών των κυττάρων Misonix Sonicator Ultrasonic Processor-QSONICA, LLC Συσκευή παραγωγής ddh 2 O (διπλά αποσταγμένου νερού) Direct Q (Millipore) Συσκευή μέτρησης ph Sartorius Φασματοφωτόμετρο ορατού/υπεριώδους JENWAY 6305 UV/Vis Spectrophotometer Φασματοφωτόμετρο μονοχρωματικό για τη μέτρηση οπτικής πυκνότητα στα 600nm, Ultrospec 10, cell density meter, Amersham Biosciences Αναδευτήρας Vortex της Biorad Experion Automated Electrophorisis Station, Biorad Μαγνητικός αναδευτήρας Heidolph Mr Hei-Standard Περισταλτική αντλία Pharmacia Fine Chemicals Συσκευή αναρρόφησης Kif Lab Laboport Υδατόλουτρο Συσκευή υγρής χρωματογραφίας για την απομόνωση των πρωτεϊνών (FPLC- Fast Protein Liquid Chromatography) από την Amersham Biosciences Στήλη μοριακού αποκλεισμού Superose 12_10/300 Στήλη χρωματογραφίας συγγένειας His-Tag Συσκευή ηλεκτροφόρησης πρωτεϊνών της Biorad Πιπέτες Gilsson για τη μετάγγιση υγρών από 1μl έως 1ml 39

52 Γ. Υλικά και Μέθοδοι Γ.1.2. Αναλώσιμα Τρυβλία petri για στερεές καλλιέργειες Πλαστικά ακρορύγχια (tips) από Greiner bio-one Πλαστικοί σωλήνες προπυλενίου μιας χρήσης 15 και 50ml από Greiner bio-one Πλαστικοί σωλήνες φυγοκέντρησης 250ml Κωνικές φιάλες 250ml και 2L Πλαστικά σωληνάρια 1,5ml (eppendorf) από Greiner bio-one Πλαστικές κυψελίδες μιας χρήσης Κυψελίδα χαλαζία οπτικής διαδρομής για μέτρηση απορρόφησης διαλύματος 1cm NMR σωλήνες Φίλτρα με διάμετρο πόρου 0,2μm Whatman Φίλτρα συμπύκνωσης MWCO (Molecular Weight Cut-Off) από Amicon Πλαστικοί σωλήνες πολυπροπυλενίου μιας χρήσης 14ml από Greiner bio-one Φίλτρα διήθησης διαμέτρου πόρου 0,2μm από Millipore Σύριγγες μιας χρήσης Πλαστικά σιφώνια των 2, 5 και 10ml από Greiner bio-one Όλα τα γυάλινα και πλαστικά είδη που χρησιμοποιήθηκαν ήταν αποστειρωμένα ή αποστειρώνονταν με υγρή αποστείρωση στο αυτόκαυστο Raypa με το πρωτόκολλο: 20 λεπτά στους 121 ο C. Γ.1.3. Αντιδραστήρια Χρησιμοποιήθηκαν χημικά αντιδραστήρια καθαρότητας αναλυτικού βαθμού από Sigma, Applichem Biochemica, Fluca και Reidel de Hae. Bacto-tryptone, Bacto yeast extract και άγαρ από την Applichem Biochemica Αμπικιλλίνη, από Applichem Biochemica Βιοτίνη, θιαμίνη, IPTG (Isopropylo-1-thio-b-D-galactopyranozite), θειικό μαγνήσιο, από Applichem Biochemica Γλυκόζη, θειικό αμμώνιο, από Applichem Biochemica 40

53 Γ. Υλικά και Μέθοδοι Ιμιδαζόλιο από Applichem Biochemica Μίγμα αναστολέων προτεασών για χρήση τους κατά την πορεία της απομόνωσης πρωτεϊνών με His-Tag (Protease Inhibitor Coctail for use in purification of Histidine-tagged proteins) από Sigma Θειϊκός ψευδάργυρος και γλυκερόλη από Fluka Τετραμεθυλαιθυλενοδιαμίνη (temed) ακρυλαμίδιο 40%, SDS από Biorad, περοξυδιθειικό αμμώνιο (APS) από Applichem Biochemica και Trizma Base από Sigma Έγχρωμοι μάρτυρες διαφόρων μοριακών μεγεθών από Nippon Genetics Europe GmbH Αιθανόλη, μεθανόλη, οξικό οξύ από Applichem Biochemica Γουανιδίνη και DTT από Applichem Biochemica και υδροξείδιο του νατρίου από Reidel-de Haën Γ.1.4. Επισημασμένα μέσα Τα επισημασμένα μέσα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν από την CortecNet (FR) και από την Cambridge Isotope Laboratories (CIL, USA). 15 Ν-χλωριούχο αμμώνιο 15 Ν-isogro 13 C-γλυκόζη 15 Ν, 13 C- isogro 13 C-D7-γλυκόζη D 2 Ο (δευτεριωμένο νερό) 41

54 Γ. Υλικά και Μέθοδοι Γ.1.5. Επισημασμένα αμινοξέα Τα επισημασμένα αμινοξέα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν από την CortecNet (FR) και CIL (USA). 15 Ν-λυσίνη 15 Ν-λευκίνη 15 Ν-βαλίνη 15 Ν-ισολευκίνη 15 Ν-φαινυλαλανίνη 15 Ν-αλανίνη 15 Ν-τυροσίνη 15 Ν-ιστιδίνη 15 Ν-ασπαραγίνη 15 Ν-ασπαραγινικό οξύ 15 Ν-γλουταμινικό οξύ Γ.1.6. Μη-επισημασμένα 14 Ν-αμινοξέα Τα μη-επισημασμένα 14 Ν-αμινοξέα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν από την εταιρία CortecNet (FR) Ν-λευκίνη 14 Ν-αργινίνη 14 Ν-βαλίνη 14 Ν-φαινυλαλανίνη 14 Ν-λυσίνη 14 Ν-αλανίνη 14 Ν-ισολευκίνη 14 Ν-τυροσίνη 14 Ν-ασπαραγινικό οξύ 14 Ν-ασπαραγίνη

55 Γ. Υλικά και Μέθοδοι 14 Ν-γλυκίνη 14 Ν-μεθειονίνη Γ.1.7. Θρεπτικά Υλικά Τα θρεπτικά υλικά που χρησιμοποιήθηκαν για τις καλλιέργειες κυττάρων E.coli ύστερα από υγρή αποστείρωση (20 min, 121 ο C, 2Atm) ήταν της ακόλουθης σύστασης: LB (rich media) : 1% κ.β. Bacto-tryptone, 0,5% κ.β. Bacto-yeast extract, 1% κ.β. NaCl 5XM9 (minimal media) : 1,5% κ.β. KH 2 PO 4, 6,4% κ.β. Na 2 HPO 4.7H 2 O, 0,25% κ.β. NaCl LB-άγαρ-αμπικιλλίνη : LB που περιέχει 1,5% κ.β. άγαρ, 1mg/ml αμπικιλλίνη Γ.1.8. Διαλύματα Διαλύματα τα οποία χρησιμοποιούνται στην έκφραση της πρωτεΐνης με καλλιέργεια σε Μ9 Θιαμίνης : 0,5 mg/ml θιαμίνης σε ddh 2 O Βιοτίνης : 0,5 mg/ml βιοτίνης σε ddh 2 O I.P.T.G. : 1M I.P.T.G. (αποθήκευση στους -20 ο C) Αμπικιλλίνης : 0,1 g/ml σε 50% v/v αιθανόλης (αποθήκευση στους -20 ο C) Solution Q : για την παρασκευή 1l απαιτούνται: 8ml HCl (5M), 5g FeCl 2.4H 2 O, 184mg CaCl 2.2H 2 O, 64mg H 3 BO 3, 18mg CoCl 2.6H 2 O, 4mg CuCl 2.2H 2 O, 340mg ZnCl 2, 605mg Na 2 MoO 4.2H 2 O, 40mg MnCl 2.4H 2 O τους. Τα διαλύματα αυτά αποστειρώνονται (20 min, 121 ο C, 2Atm) πριν από τη χρήση 43

56 Γ. Υλικά και Μέθοδοι Διαλύματα τα οποία χρησιμοποιούνται στη χρωματογραφία συγγένειας ZnSO 4 : 1M ZnSO 4 Ιμιδαζολίου 10mM : 20mM Na 2 HPO 4, 0,5mM NaCl, 10mM ιμιδαζολίου Ιμιδαζολίου 20mM : 20mM Na 2 HPO 4, 0,5mM NaCl, 20mM ιμιδαζολίου Ιμιδαζολίου 40mM : 20mM Na 2 HPO 4, 0,5mM NaCl, 40mM ιμιδαζολίου Ιμιδαζολίου 100mM : 20mM Na 2 HPO 4, 0,5mM NaCl, 100mM ιμιδαζολίου Ιμιδαζολίου 400mM : 20mM Na 2 HPO 4, 0,5mM NaCl, 400mM ιμιδαζολίου EDTA : 0,1M EDTA Τα παραπάνω διαλύματα φιλτράρονται με φίλτρο της Millipore μεγέθους πόρων 0,2μm πριν από τη χρήση τους. Διαλύματα τα οποία χρησιμοποιούνται στη χρωματογραφία μοριακού αποκλεισμού Φωσφορικών : 50mM K 2 HPO 4, 50mM KH 2 PO 4 Γουανιδίνης : 6Μ γουανιδίνη Υδροξειδίου του νατρίου : 0,5Μ ΝaOH Τα παραπάνω διαλύματα φιλτράρονται με φίλτρο της Millipore μεγέθους πόρων 0,2μm πριν από τη χρήση τους. Διαλύματα τα οποία χρησιμοποιούνται στην ηλεκτροφόρηση σε πηκτή ακρυλαμιδίου Πήκτωμα διαχωρισμού 17% : 2,9ml ddh 2 O, 3,4ml ακρυλαμιδίου 40%, 2,2ml Tris-base 1,5M ph8,8, 10% w/v SDS, 50μl APS (ammonium per sulfate) 10%, 5μl TEMED (Ν,Ν,Ν,Ν,-τετραμεθυλεθυλενδιαμίνη) 44

57 Γ. Υλικά και Μέθοδοι Πήκτωμα φόρτωσης : 3ml ddh 2 O, 0,5ml ακρυλαμιδίου 40%, 1,25ml Tris-base 0,5M ph 6,8, 10% w/v SDS, 25μl APS 10%, 5μl TEMED Διάλυμα φόρτωσης δειγμάτων 3x πυκνό : 30% γλυκερόλης, 3%SDS, 60mM Tris-HCl ph 6,8-7, 0,09% μπλε της βρωμοφαινόλης, 150mM DTT Διάλυμα ηλεκτροφόρησης : 3 g/1l Tris-base, 14,4 g/1l γλυκίνη, 1gr SDS, ddh2o μέχρι το 1L Διάλυμα χρωματισμού της πηκτής πολυακρυλαμιδίου : 0,1%κ.β. Coomassie Blue R- 250, 40%v/v μεθανόλη,10% CH 3 COOH Διάλυμα χρωματισμού της πηκτής πολυακρυλαμιδίου : 5%v/v μεθανόλη, 7,5% CH 3 COOH Γ.1.9. Πλασμιδιακός φορέας κλωνοποίησης (cloning vector) και κυτταρικά στελέχη Escherichia coli που χρησιμοποιήθηκαν Τα στελέχη Escherichia coli που χρησιμοποιήθηκαν ήταν τα πρωτοτροφικά BL21(DE3) και τα αυξοτροφικά DL39(DE3). Τα κύτταρα BL21(DE3) είναι επιδεκτικά και παρέχουν την έκφραση των πρωτεϊνών σε υψηλά επίπεδα μετά από επαγωγή της έκφρασης με IPTG. Μετασχηματίζονται με πλασμίδια που φέρουν Τ7 προαγωγέα. Επίσης, όπως ήδη αναφέρθηκε, πρόκειται για πρωτοτροφικά κύτταρα δηλαδή συνθέτουν όλα τα αμινοξέα χρησιμοποιώντας μια πηγή άνθρακα και μια πηγή αζώτου που προστίθεται εξωγενώς. Όσον αφορά στα κύτταρα DL39(DE3) έχουν τη δυνατότητα έκφρασης των πρωτεϊνών μετά από επαγωγή της έκφρασης με IPTG και μετασχηματίζονται με πλασμίδια που φέρουν Τ7 προαγωγέα. Τα αυξοτροφικά κύτταρα DL39(DE3) δεν έχουν τη δυνατότητα σύνθεσης όλων των αμινοξέων, με αποτέλεσμα κάποια από αυτά να προστίθενται εξωγενώς. Επίσης, απαιτείται η προσθήκη πηγής αζώτου και άνθρακα για τη σύνθεση των υπολοίπων αμινοξέων. Ο πλασμιδιακός φορέας που χρησιμοποιείται είναι ο pet.20b(+). Το πλασμίδιο pet είναι βακτηριακό και έχει σχεδιαστεί για να επιτρέπει τη γρήγορη παραγωγή μεγάλης ποσότητας της πρωτεΐνης στόχου, όταν ενεργοποιείται. Το πλασμίδιο αυτό φέρει κάποιες σημαντικές περιοχές: ένα γονίδιο laci (λακτόζης Ι) που κωδικοποιεί την 45

58 Γ. Υλικά και Μέθοδοι πρωτεΐνη καταστολέα της λακτόζης (lac repressor), έναν Τ7-προαγωγέα, ειδικό μόνο για την Τ7 RNA-πολυμεράση, ένα χειριστή λακτόζης που μπορεί να εμποδίζει τη μεταγραφή, μια περιοχή πολλαπλής σύνδεσης, ένα γονίδιο αντίστασης στην αμπικιλλίνη. Επίσης, φέρει θέσεις αναγνώρισης για την πέψη περιοριστικών ενζύμων. Εικόνα 16: Χάρτης του φορέα κλωνοποίησης pet.20b(+) Γ.2. Μέθοδοι Γ.2.1. Υγρές και στερεές καλλιέργειες βακτηρίων Για την ανάπτυξη βακτηρίων χρησιμοποιούνται θρεπτικά υλικά, τα οποία πρέπει να περιέχουν πηγή άνθρακα, πηγή αζώτου, άλατα και ιόντα. Τα θρεπτικά υλικά που χρησιμοποιούνται είναι υγρά ή στερεά. Τα υγρά θρεπτικά υλικά περιέχουν όλα τα θρεπτικά συστατικά διαλυμένα σε νερό. Όσον αφορά στους τύπους της υγρής καλλιέργειας ως μέσο ανάπτυξης βακτηρίων που χρησιμοποιήθηκαν είναι η 46

59 Γ. Υλικά και Μέθοδοι καλλιέργεια ελαχίστων θρεπτικών μέσων (M9, minimal media) και η καλλιέργεια πλούσιων θρεπτικών μέσων (LB, rich media). Τα στερεά θρεπτικά υλικά παρασκευάζονται με ανάμιξη του υγρού θρεπτικού υλικού με έναν πολυσακχαρίτη που προέρχεται από φύκη, το άγαρ. Το άγαρ είναι ρευστό σε θερμοκρασίες πάνω από 45 ο C και στερεοποιείται σε χαμηλότερες θερμοκρασίες. Μια καλλιέργεια ξεκινά με προσθήκη μικρής ποσότητας κυττάρων στο θρεπτικό υλικό, μια διαδικασία η οποία ονομάζεται εμβολιασμός. Στη συνέχεια, η κωνική φιάλη που περιέχει την υγρή καλλιέργεια ή το τρυβλίο petri με τη στερεή καλλιέργεια τοποθετείται σε επωαστικό κλίβανο, όπου η θερμοκρασία της καλλιέργειας παραμένει σταθερή στους 37 ο C. Όσον αφορά στις υγρές καλλιέργειες απαιτείται ανάδευση έτσι ώστε η καλλιέργεια να εμπλουτίζεται με οξυγόνο. Με τον τρόπο αυτό ευνοείται ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων. Στις καλλιέργειες αυτού του τύπου οι φάσεις ανάπτυξης των βακτηριακών κυττάρων είναι: η λανθάνουσα, η εκθετική, η στατική και η φάση θανάτου. Κατά τη λανθάνουσα φάση τον πληθυσμό των κυττάρων αποτελούν τα κύτταρα του εμβολιασμού και ο πληθυσμός παραμένει σχεδόν σταθερός καθώς τα κύτταρα πρέπει να προσαρμοστούν στις καινούριες συνθήκες για να αρχίσουν να αναπτύσσονται. Ακολουθεί η εκθετική φάση ανάπτυξης κατά την οποία ο αριθμός των κυττάρων αυξάνεται εκθετικά, καθώς οι συνθήκες ανάπτυξης είναι οι βέλτιστες. Στη συνέχεια, τα κύτταρα περνούν στη στατική φάση, στην οποία ο πληθυσμός των βακτηρίων παραμένει περίπου σταθερός, λόγω εξάντλησης μεγάλου μέρους του θρεπτικού υλικού και της συσσώρευσης τοξικών προϊόντων του μεταβολισμού τους. Τέλος, κατά τη φάση θανάτου ο αριθμός των κυττάρων μειώνεται. Γ.2.2. Εισαγωγή πλασμιδίου σε κύτταρα E.coli (μετασχηματισμός) Τα επιδεκτικά κύτταρα, τα οποία περιγράφηκαν παραπάνω, μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την εισαγωγή σε αυτά πλασμιδιακού DNA που φέρει το γονίδιο της GLIC ΕΚΠ. Αυτές οι κυτταρικές σειρές του βακτηρίου E.coli επιδεκτικών κυττάρων χρησιμοποιούνται για την έκφραση την GLIC ΕΚΠ και είναι τα κύτταρα BL21(DE3) και τα 47

60 Γ. Υλικά και Μέθοδοι κύτταρα DL39(DE3). Και στις δύο περιπτώσεις κυττάρων χρησιμοποιείται το ίδιο πλασμίδιο και ακολουθούνται τα ίδια βήματα για το μετασχηματισμό τους. Σε 100μl εναιωρήματος επιδεκτικών κυττάρων, που φυλάσσονται στους -80 ο C, γίνεται ανάμιξη με 2μl πλασμιδιακού DNA (70ng/μl). Ακολουθεί τοποθέτηση του μίγματος σε πάγο (0 ο C) για 30min και στη συνέχεια θερμικό σοκ με επώαση στους 42 ο C (μέσα σε υδατόλουτρο) για 45sec. Το μίγμα τοποθετείται άμεσα σε πάγο και επωάζεται για 2min. Στη συνέχεια, γίνεται προσθήκη 500μl LB και επωάζεται υπό ανάδευση στους 37 ο C, για 1h, σε 200rpm. Κατόπιν, τα κύτταρα με το υγρό θρεπτικό υλικό επιστρώνονται σε στερεό θρεπτικό μέσο (LB με άγαρ) μέσα σε τρυβλίο petri, παρουσία του κατάλληλου αντιβιωτικού, δηλαδή παρουσία 100μl/ml αμπικιλλίνης. Το προϊόν/μίγμα επωάζεται για περίπου 12-16h στους 37 ο C. Τα πλασμίδια αυτού του τύπου φέρουν γονίδιο ανθεκτικότητας σε αμπικιλλίνη, με αποτέλεσμα οι αποικίες που εμφανίζονται στο τρυβλίο να αποτελούνται αποκλειστικά από κύτταρα που φέρουν τον πλασμιδιακό φορέα, δηλαδή έχουν μετασχηματιστεί επιτυχώς. Η διαδικασία αυτή διεξάγεται κάτω από στείρες συνθήκες και τα αναλώσιμα και τα αντιδραστήρια που χρησιμοποιούνται είναι αποστηρωμένα. Γ.2.3. Πρωτεϊνική έκφραση Γ.2.3.i). Διερεύνηση των συνθηκών έκφρασης μέσω μικρής κλίμακας καλλιέργειας Σε κάθε πρωτεΐνη που μπορεί να εκφραστεί οι συνθήκες έκφρασής της ποικίλουν ως προς το θρεπτικό υλικό, τη θερμοκρασία, το χρόνο επαγωγής και τη συγκέντρωση IPTG που προστίθεται. Για τη διερεύνηση των βέλτιστων συνθηκών έκφρασης της πρωτεΐνης, πραγματοποιούνται δοκιμές έκφρασης σε υγρή καλλιέργεια ελαχίστων μέσων (minimal media, M9), χρησιμοποιώντας θρεπτικά μέσα τα οποία όμως περιέχουν μη-επισημασμένα συστατικά. Η επαγωγή της έκφρασης για τα βακτηριακά κύτταρα επιλέγεται να γίνει κατά τη διάρκεια της εκθετικής φάσης, δηλαδή της απότομης αύξησης των κυττάρων. Αυτό ελέγχεται με τη μέτρηση της οπτικής πυκνότητας (optical density, OD) στα 600nm και θα πρέπει να κυμαίνεται μεταξύ 0,6 και 0,9. Η επαγωγή της έκφρασης γίνεται με προσθήκη του IPTG. Οι 48

61 Γ. Υλικά και Μέθοδοι παράγοντες που επηρεάζουν την έκφραση της πρωτεΐνης και που επιδέχονται βελτιστοποίηση είναι: o Η συγκέντρωση του IPTG: Γενικά η αποτελεσματικότερη απελευθέρωση του υποκινητή και η επαγόμενη έκφραση παρατηρούνται για συγκεντρώσεις IPTG 1mM. Σε περιπτώσεις που η ραγδαία αύξηση της συγκέντρωσης της πρωτεΐνης αποτελεί αιτία κατακρήμνισης της πρωτεΐνης ή εμφάνισης τοξικότητας για τα βακτηριακά κύτταρα, επιλέγονται συγκεντρώσεις 0,1-0,8mM. o Η θερμοκρασία: Οι υψηλές θερμοκρασίες επαγωγής (>32 ο C) ευνοούν τα ποσοστά έκφρασης της πρωτεΐνης. Σε περιπτώσεις εμφάνισης τοξικότητας στα κύτταρα ή κατακρήμνισης της πρωτεΐνης, η μείωση της θερμοκρασίας ευνοεί την επαγωγή της έκφρασης σε ορισμένες περιπτώσεις. o Ο χρόνος επαγωγής κατά τον οποίο υπερεκφράζεται η πρωτεΐνη-στόχος: Η υπερέκφραση των πρωτεϊνών συμβαίνει συνήθως κατά τις πρώτες ώρες της επαγωγής της έκφρασης και στη συνέχεια μειώνεται εκθετικά, καθώς τα κύτταρα περνούν στη φάση θανάτου. Ο βέλτιστος χρόνος επαγωγής της έκφρασης εξετάζεται μετά από λήψη δειγμάτων κυττάρων από την καλλιέργεια (1,5ml δείγματος, φυγοκέντρηση και απόρριψη του υπερκείμενου) και μετά από έλεγχο με SDS-page, για 0, 2, 4, 6, 8h και μετά από περίπου 16h. Γ.2.3.ii). Έκφραση της πρωτεΐνης μέσω των πρωτοτροφικών κυττάρων BL21(DE3) Μετά το μετασχηματισμό των κυττάρων με το φορέα κλωνοποίησης και την ανάπτυξη των αποικιών τους στο τρυβλίο petri παρουσία στερεού θρεπτικού υλικού (LB με άγαρ) και αμπικιλλίνης (100μg/ml), ακολουθεί η παρασκευή προκαλλιέργειας και στοκ γλυκερόλης. Κατά τη δημιουργία προκαλλιέργειας γίνεται εμβολιασμός του υγρού θρεπτικού υλικού LB με μια αποικία ή μέρους του στοκ γλυκερόλης παρουσία αμπικιλλίνης. Η προκαλλιέργεια αναπτύσσεται υπό ισχυρή ανάδευση στους 37 ο C, στους 180rpm, για περίπου 16h. Μέρος της προκαλλιέργειας αυτής χρησιμοποιείται για τον εμβολιασμό της καλλιέργειας των κυττάρων με σκοπό την έκφραση της πρωτεΐνης. Για την ανάπτυξη υγρής καλλιέργειας ελάχιστων θρεπτικών μέσων (Μ9) πρωτοτροφικών κυττάρων χωρίς επισήμανση απαιτούνται εκτός από τα 49

62 Γ. Υλικά και Μέθοδοι φωσφορικά άλατα, μια μη-επισημασμένη πηγή αζώτου, μια μη-επισημασμένη πηγή άνθρακα, βιταμίνες, ανιόντα, διάφορα μέταλλα και ιχνοστοιχεία, αντιβιοτικό και μέρος της προκαλλιέργειας. Η ανάπτυξη των κυττάρων γίνεται με επώαση στους 37 ο C, υπό ανάδευση στους 200rpm και ελέγχεται με τη μέτρηση της οπτικής πυκνότητας (OD ~0,6-0,9). Στη συνέχεια, γίνεται επαγωγή της έκφρασης με προσθήκη του IPTG και ακολουθούνται οι βέλτιστες συνθήκες θερμοκρασίας και χρόνου επαγωγής της έκφρασης που προσδιορίστηκαν μέσω δοκιμών έκφρασης που πραγματοποιήθηκαν. Κατόπιν, τα κύτταρα συλλέγονται και επεξεργάζονται για την απομόνωση της πρωτεΐνης. Όσον αφορά στην έκφραση επισημασμένης 15 Ν / 13 C πρωτεΐνης ακολουθείται η ίδια διαδικασία με τη διαφορά ότι οι πηγές αζώτου ή/και άνθρακα που χρησιμοποιούνται αντίστοιχα, είναι επισημασμένες, ενώ για την έκφραση της τριπλά επισημασμένης πρωτεΐνης ακολουθείται ένα ελαφρώς διαφοροποιημένο πρωτόκολλο. Συγκεκριμένα, επειδή η έκφραση της πρωτεΐνης παρουσία δευτεριωμένου νερού (D 2 O) δεν είναι ικανοποιητική, για να αυξηθεί η απόδοσή της, τα κύτταρα αναπτύσσονται σε υγρό, πλούσιο θρεπτικό μέσο, LB, παρουσία αντιβιοτικού, χωρίς να πραγματοποηθεί επαγωγή της έκφρασης. Ακολουθεί η συλλογή των κυττάρων αυτών. Η έκφραση της τριπλά επισημασμένης πρωτεΐνης σε υγρό θρεπτικό υλικό ελάχιστων μέσων (Μ9) απαιτεί τη χρήση δευτεριωμένου νερού (D 2 O) αντί του ddh 2 O. Σε αυτό το θρεπτικό μέσο προστίθεται η 15 Ν-επισημασμένη πηγή αζώτου, η 13 C-επισημασμένη πηγή άνθρακα, βιταμίνες, ιόντα, μέταλλα, ιχνοστοιχεία, το αντιβιοτικό (αμπικιλλίνη στη συγκεκριμένη περίπτωση) και κύτταρα που αναπτύχθηκαν σε υγρό θρεπτικό υλικό LB μέχρι το OD να αποκτήσει τιμή ~0,3. Η ανάπτυξη των κυττάρων αυτών γίνεται μέχρι το OD να αποκτήσει περίπου τις τιμές 0,6-0,9. Στη συνέχεια, ακολουθεί η επαγωγή της έκφρασης και η συλλογή των κυττάρων χωρίς αλλαγές στις συνθήκες έκφρασης της πρωτεΐνης. Γ.2.3.iii). Έκφραση της πρωτεΐνης μέσω των αυξοτροφικών κυττάρων DL39(DE3) 50 Η χρήση αυξοτροφικών κυττάρων DL39(DE3) για την έκφραση της πρωτεΐνης σε θρεπτικό υλικό ελαχίστων μέσων διαφοροποιείται από τα παραπάνω. Ως

63 Γ. Υλικά και Μέθοδοι μειονεκτήματα των κυττάρων αυτών αναφέρονται η μειωμένη έκφραση της πρωτεΐνης και το γεγονός ότι τα αυξοτροφικά κύτταρα δεν έχουν τη δυνατότητα σύνθεσης όλων των αμινοξέων. Επομένως, τα αμινοξέα που δεν συντίθενται ή συντίθενται σε ποσότητες που δεν είναι ικανές να καλύψουν τις ανάγκες των κυττάρων, πρέπει να προστεθούν εξωγενώς. Στην περίπτωση αυτή τα κύτταρα αναπτύσσονται σε υγρό θρεπτικό υλικό LB, παρουσία αντιβιοτικού σε μεγάλη κλίμακα και συλλέγονται χωρίς να πραγματοποιηθεί επαγωγή της έκφρασης. Μέρος των κυττάρων αυτών χρησιμοποιείται για εμβολιασμό του θρεπτικού υλικού ελαχίστων μέσων (Μ9) σε ποσότητα τέτοια ώστε το OD να φτάσει περίπου στο 0,3. Στο θρεπτικό μέσο προστίθεται πηγή αζώτου, πηγή άνθρακα σε μεγαλύτερη ποσότητα από την αντίστοιχη στα πρωκαρυωτικά και τα αμινοξέα που δεν συντίθενται από τα κύτταρα. Επίσης, προστίθενται βιταμίνες, ιόντα, μέταλλα και ιχνοστοιχεία σε διπλάσιες ποσότητες από τις αντίστοιχες στα πρωτοτροφικά κύτταρα, ενώ είναι απαραίτητη η προσθήκη αντιβιοτικού. Οι συνθήκες έκφρασης της πρωτεΐνης παραμένουν ίδιες με τις βέλτιστες, όπως αυτές διαπιστώθηκαν κατά τις δοκιμές έκφρασης. Ακολουθεί η συλλογή των κυττάρων και οι διαδικασίες για την απομόνωση της πρωτεΐνης. Γ.2.3.iv). Το συστημα έκφρασης pet Ο Τ7-προαγωγός και ο χειριστής της λακτόζης, τα οποία διαθέτει το πλασμίδιο pet και διαδραματίζουν ένα σημαντικό ρόλο στην έκφραση του γονιδίουστόχου, βρίσκονται στο 5 άκρο του γονιδίου στόχου. Επειδή ο Τ7-προαγωγός είναι ιογενής φορέας, μεταγράφει γρήγορα το γονίδιο και για όσο χρονικό διάστημα η Τ7- RNA-πολυμεράση είναι παρούσα. Η έκφραση της πρωτεΐνης αυξάνεται ραγδαία ανάλογα με το ποσό του mrna που μεταγράφεται από το γονίδιο. Ο έλεγχος έκφρασης της πρωτεΐνης επιτυγχάνεται μέσω του εκκινητή λακτόζης και του χειριστή. Για να μπορέσει να μεταγραφεί το γονίδιο της πρωτεΐνης-στόχου θα πρέπει να είναι παρούσα η Τ7-πολυμεράση. Το γονίδιο στο χρωμόσωμα του κυττάρου ξενιστή φέρει έναν επαγώγιμο εκκινητή που ενεργοποιείται από IPTG. Το IPTG εκτοπίζει τον καταστολέα από το χειριστή της λακτόζης, καθώς αποτελεί ανάλογο 51

64 Γ. Υλικά και Μέθοδοι της λακτόζης. Δεδομένου ότι υπάρχουν χειριστές λακτόζης και για τα δύο γονίδια που κωδικοποιούν την Τ7-πολυμεράση και το γονίδιο στόχο, αντίστοιχα, το IPTG ενεργοποιεί και τα δύο γονίδια. Επομένως, όταν προστίθεται στο κύτταρο, εκφράζεται η Τ7-πολυμεράση και γρήγορα αρχίζει να μεταγράφει το γονίδιο-στόχο, το οποίο στη συνέχεια μεταφράζεται σε πρωτεΐνη-στόχο. Εικόνα 17: Σύστημα έκφρασης του πλασμιδίου pet.20b(+) Ένα επιπλέον πλεονέκτημα των φορέων έκφρασης pet αποτελεί το γεγονός ότι περιλαμβάνουν διάφορες ακολουθίες που βρίσκονται δίπλα στις θέσεις κλωνοποίησης και κωδικοποιούνται ως πεπτίδια-επίτοποι, τα οποία συντελούν στην απομόνωση της πρωτεΐνης αυτής. Στην περίπτωση του pet.20b(+) πρόκειται μια ακολουθία 6 ιστιδίνων (6xHis-tag). 52

65 Γ. Υλικά και Μέθοδοι Γ.2.4. Απομόνωση της πρωτεΐνης Γ.2.4.i). Χρωματογραφία συγγένειας Η χρωματογραφία συγγένειας αποτελεί μια αποτελεσματική χρωματογραφική τεχνική διαχωρισμού και απομόνωσης πρωτεϊνών [ ]. Η αρχή της λειτουργίας της τεχνικής στηρίζεται στη χημική συγγένεια δέσμευσης. Συγκεκριμένα, η τεχνική αυτή εκμεταλλεύεται την υψηλή συγγένεια που εμφανίζουν πολλές πρωτεΐνες για ειδικές χημικές ομάδες. Στην περίπτωση αυτή η πρωτεΐνη GLIC ΕΚΠ εκφράστηκε συντηρημένη με επίτοπο 6 καταλοίπων ιστιδίνης (6His-tag). Ο επίτοπος των αμινοξέων αυτών έχει την ιδιότητα να προσδένεται ισχυρά σε ρητίνη που φέρει δισθενή ιόντα Zn 2+, τα οποία είναι ακινητοποιημένα επάνω στα σφαιρίδια νιτροτριακετικού οξέος (ΝΤΑ) της ρητίνης. Τα ιόντα ψευδαργύρου ακινητοποιούνται πάνω στα σφαιρίδια ριτίνης γιατί το ΝΤΑ των σφαιριδίων είναι ένας χηλικός παράγοντας με ικανότητα να δεσμεύει ιόντα Zn 2+ στις τέσσερις χηλικές περιοχές αλληλεπίδρασης που διαθέτει. Η έκλουση της 6His-πρωτεΐνης από τη στήλη επιτυγχάνεται με προσθήκη στη στήλη διαλυμάτων αυξημένης συγκέντρωσης ενός χηλικού παράγοντα, του ιμιδαζολίου. Η δομή του ιμιδαζολίου προσομοιάζει αυτή της ιστιδίνης (που διαθέτει ιμιδαζολικό δακτύλιο). Το ιμιδαζόλιο ανταγωνίζεται την ιστιδίνη ως προς τη δέσμευση των ιόντων Zn 2+ και τελικά αντικαθιστά την πρωτεΐνη στο δεσμό υψηλής συγγένειας με τα χηλικά σύμπλοκα των σφαιριδίων της ρητίνης της χρωματογραφικής στήλης, απελευθερώνοντάς την στο έκλουσμα. Με τον τρόπο αυτό γίνεται ο πρώτος διαχωρισμός της πρωτεΐνης GLIC ΕΚΠ από το μίγμα των βακτηριακών πρωτεϊνών που λαμβάνονται μετά τη λύση των μεμβρανών των κυττάρων. Γ.2.4.ii). Χρωματογραφία μοριακού αποκλεισμού Το δεύτερο στάδιο καθαρισμού και απομόνωσης της πρωτεΐνης GLIC ΕΚΠ περιλαμβάνει τη χρωματογραφία μοριακού αποκλεισμού [110] σε σύστημα υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης (FPLC, Fast Perfomance Liquid Chromatography). Η χρωματογραφία μοριακού αποκλεισμού (size exclusion chromatography), η οποία ονομάζεται και χρωματογραφία διήθησης με πηκτή (gel filtration chromatography,) 53

66 Γ. Υλικά και Μέθοδοι αποτελεί μια τεχνική ιδιαίτερα εφαρμόσιμη σε ενώσεις μεγάλου μοριακού βάρους. Η τεχνική αυτή δίνει τη δυνατότητα διαχωρισμού μορίων με διαφορετικά μοριακά βάρη, χρησιμοποιώντας μια στήλη μοριακού αποκλεισμού. Η αρχή λειτουργίας της στηρίζεται στο γεγονός ότι το υλικό πλήρωσης της στήλης αποτελείται από πορώδη ομοιόμορφα σφαιρίδια, μέσα από τους σπόρους των οποίων μπορούν να διαχέονται τα μόρια του διαλύτη και των διαλυμένων σωματιδίων. Όσο τα μόρια βρίσκονται μέσα στους πόρους παγιδεύονται σε αυτούς και απομακρύνονται με το ρεύμα ροής της κινητής φάσης. Ο μέσος χρόνος παραμονής στους πόρους εξαρτάται από το πραγματικό μέγεθος των μορίων. Μόρια μεγαλύτερα από το μέσο μέγεθος των πόρων αποβάλλονται χωρίς καμία κατακράτηση. Τα μόρια αυτά εκλούονται πρώτα από τη στήλη. Μόρια διαμέτρου σημαντικά μικρότερης από αυτή των πόρων μπορούν να διεισδύσουν και να διαπεράσουν μέσα από τους πόρους με αποτέλεσμα να παγιδεύονται για μεγαλύτερο χρόνο. Τα μόρια αυτά εκλούονται τελευταία από τη στήλη. Όσον αφορά στα μόρια ενδιάμεσου μεγέθους, ο μέσος όρος διείσδυσης στους πόρους του υλικού πλήρωσης της στήλης εξαρτάται από τη διάμετρό τους. Η ομάδα των μορίων αυτών υφίσταται διαχωρισμό, ο οποίος σχετίζεται άμεσα με το μέγεθος των μορίων και εν μέρει με το σχήμα τους. Με τον τρόπο αυτό γίνεται διαχωρισμός των μορίων με βάση το μοριακό τους βάρος. Η στήλη μοριακού αποκλεισμού προσαρμόζεται σε ένα σύστημα υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης, FPLC (Fast Perfomance Liquid Chromatography). Ένα τυπικό FPLC αποτελείται από τη στήλη, ένα σύστημα αντλιών, ένα σύστημα ανίχνευσης UV, ένα συλλέκτη κλασμάτων και μία μονάδα ελέγχου. Ο έλεγχος του συστήματος γίνεται μέσω λογισμικού σε ηλεκτρονικό υπολογιστή. Το δείγμα εφαρμόζεται μέσω ενός βρόγχου και φορτώνεται χειροκίνητα με ένεση στη βαλβίδα εισαγωγής δείγματος. Γ.2.4.iii). Χρωματογραφία ιοντοανταλλαγής Η απομόνωση των πρωτεϊνών με τη χρωματογραφία ιοντοανταλλαγής [111] στηρίζεται στην αντιστρεπτή προσρόφηση φορτισμένων μορίων στις καθηλωμένες ομάδες του ιοντικού ανταλλάκτη οι οποίες φέρουν αντίθετο φορτίο. Ο διαχωρισμός επιτυγχάνεται λόγω του ότι τα διαφορετικά μόρια έχουν διαφορετικούς βαθμούς 54

67 Γ. Υλικά και Μέθοδοι αλληλεπίδρασης με τον ιοντικό ανταλλάκτη εξαιτίας των διαφορών στα φορτία, στις πυκνότητες του φορτίου και το διαχωρισμό των φορτίων στις επιφάνειές τους. Οι αλληλεπιδράσεις αυτές μπορούν να ελεγχθούν με μεταβολή διαφόρων συνθηκών, όπως η ιοντική ισχύς και το ph. Υπάρχουν δύο είδη ιοντικών ανταλλακτών, οι θετικά και οι αρνητικά φορτισμένοι. Στην παρούσα εργασία χρησιμοποιήθηκε ο ανιοντικός ανταλλάκτης της στήλης Mono Q 5/50 GL που φέρει σαν λειτουργική ομάδα CH 2 -N + (CH 3 ) 3. Το πρώτο βήμα για τη χρήση της στήλης είναι η εξισορρόπηση της στατικής φάσης της στήλης στις επιθυμητές συνθήκες με τη χρήση του διαλύματος στο οποίο είναι διαλυμένες οι πρωτεΐνες. Ακολουθεί η χορήγηση του διαλύματος στο οποίο είναι διαλυμένες οι πρωτεΐνες μέσα στη στήλη. Με αυτή τη διαδικασία επιτυγχάνεται η προσρόφηση των πρωτεϊνών στις φορτισμένες ομάδες της στήλης με διαφορετικό βαθμό αλληλεπίδρασης και η απομάκρυνση των μη δεσμευμένων μορίων. Ακολουθεί η έκλουση, κατά την οποία τα βιομόρια απελευθερώνονται από τον ιοντοανταλλάκτη με τη χρήση ρυθμιστικού διαλύματος διαφορετικής σύστασης. Μόρια με μεγαλύτερη αλληλεπίδραση καθυστερούν περισσότερο από μόρια με μικρότερη τάση για αλληλεπίδραση. Η έκλουση των μορίων από τη στήλη πραγματοποιείται εκλούοντας διαλύματα με διαβαθμισμένη συγκέντρωση άλατος (συνήθως NaCl σε συγκεντρώσεις από 0,05Μ μέχρι και 2Μ). Γ.2.5. Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου σε αποδιατακτικές συνθήκες (SDS-PAGE electrophoresis) Ο διαχωρισμός και η ταυτοποίηση των πρωτεϊνών με βάση το μοριακό τους βάρος γίνεται με ηλεκτροφόρηση σε κάθετη πηκτή πολυακρυλαμιδίου, παρουσία δινατριούχου θειϊκού δωδεκαλικού νατρίου (SDS) [112, 113]. Η τεχνική αυτή στηρίζεται στο γεγονός ότι όταν ένα φορτισμένο μόριο βρεθεί σε ηλεκτροστατικό πεδίο, κινείται προς τον αντίθετα φορτισμένο πόλο. Διαφορετικά μόρια, με διαφορετική ένταση φορτίου, όταν βρεθούν σε ηλεκτρικό πεδίο κινούνται με ταχύτητα που εξαρτάται 55

68 Γ. Υλικά και Μέθοδοι από την ένταση του φορτίου που φέρουν και από το μέγεθος και το σχήμα τους. Συγκεκριμένα, οι πρωτεΐνες κατά την έκθεσή τους στο αρνητικά φορτισμένο απορρυπαντικό SDS αποκτούν αρνητικό φορτίο ανάλογο με τον αριθμό των αμινοξέων που διαθέτουν, οι πρωτεΐνες διατηρούνται αποδιαταγμένες και μετακινούνται προς το θετικό πόλο με ταχύτητα αντιστρόφως ανάλογη προς το μέγεθός τους. Με αυτό τον τρόπο η συμπεριφορά των πρωτεϊνών κατά την ηλεκτροφόρηση εξαρτάται μόνο από το μοριακό τους βάρος. Κατά τη μέθοδο της κάθετης ηλεκτροφόρησης, οι πρωτεΐνες τοποθετούνται αρχικά σε πηκτή χαμηλής περιεκτικότητας σε ακρυλαμίδιο (πηκτή φόρτωσης), η οποία χρησιμεύει στην προετοιμασία των πρωτεϊνών, ενώ ο διαχωρισμός πραγματοποιείται, αφού οι πρωτεΐνες περάσουν σε πηκτή υψηλής περιεκτικότητας σε ακρυλαμίδιο (πηκτή διαχωρισμού). Ανάλογα με το μέγεθος των πρωτεϊνών που αναμένονται να βρίσκονται στο δείγμα που ηλεκτροφορείται, κυμαίνεται και η πυκνότητα της πηκτής διαχωρισμού. Για το διαχωρισμό πρωτεϊνών μεγάλου μοριακού βάρους χρησιμοποιείται πηκτή μικρής πυκνότητας, ενώ για το διαχωρισμό πρωτεϊνών μικρού μοριακού βάρους χρησιμοποιείται πηκτή μεγάλης πυκνότητας. Α. Παρασκευή πηκτής πολυακρυλαμιδίου Η πηκτή φόρτωσης (stacking gel) περιέχει 3ml ddh 2 O, 0,5ml ακρυλαμιδίου 40%, 1,25ml Tris-base 0,5M ph 6,8, 10% w/v SDS, 25μl APS 10%, 5μl TEMED. Η πηκτή διαχωρισμού (running gel ή separating gel) 17% (σε ακρυλαμίδιο) περιέχει 2,9ml ddh 2 O, 3,4ml ακρυλαμιδίου 40%, 2,2ml Tris-base 1,5M ph8,8, 10% w/v SDS, 50μl APS 10%, 5μl TEMED. Το APS (Ammonium Per Sulfate) και το TEMED (Ν,Ν,Ν,Ν,- τετραμεθυλεθυλενδιαμίνη) χρησιμοποιούνται ως καταλύτες πολυμερισμού του ακρυλαμιδίου. Β. Προετοιμασία δειγμάτων για ηλεκτροφόρηση Τα δείγματα που προορίζονται για ηλεκτροφόρηση αναμειγνύονται με διάλυμα «φόρτωσης» πρωτεϊνών, το οποίο περιέχει SDS και β-μερκαπτοαιθανόλη και επωάζονται για 5min σε θερμοκρασία βρασμού (100 ο C). Οι συνθήκες αυτές είναι αποδιατακτικές για τις πρωτεΐνες, καθώς ο βρασμός παρουσία SDS έχει ως αποτέλεσμα τη διάσπαση δεσμών (υδρογόνου, ιοντικών, υδρόφοβων και Van der 56

69 Γ. Υλικά και Μέθοδοι Waals αλληλεπιδράσεων), ενώ η β-μερκαπτοαιθανόλη προκαλεί διάσπαση των δισουλφιδικών δεσμών. Παράλληλα με τα προς εξέταση δείγματα, γίνεται ανάλυση μείγματος πρωτεϊνών γνωστού μοριακού βάρους, που χρησιμοποιούνται ως μάρτυρες μοριακών μεγεθών. Γ. Ηλεκτροφόρηση και ανίχνευση των πρωτεϊνικών ζωνών Η ηλεκτροφόρηση πραγματοποιείται υπό σταθερή τάση 120V, σε ρυθμιστικό διάλυμα ηλεκτροφόρησης πρωτεϊνών. Οι ζώνες των πρωτεϊνών εμφανίζονται μετά από χρώση του πηκτώματος με ήπια ανάδευση σε διάλυμα χρωματισμού για 30 min στους 37 ο C και μετέπειτα αποχρωματισμό με συνεχείς πλύσεις σε διάλυμα αποχρωματισμού και σε θερμοκρασία δωματίου, μέχρι να απομακρυνθεί η περίσσεια χρωστικής. Οι πρωτεΐνες συνδέονται ισχυρά με τα μόρια των χρωστικών με αποτέλεσμα οι ζώνες οι οποίες αντιστοιχούν στις πρωτεΐνες να παραμένουν χρωματισμένες κατά την απομάκρυνση της χρωστικής. Η μελέτη του πρωτεϊνικού δείγματος γίνεται μετά από σύγκρισή του με τους μάρτυρες μοριακών μεγεθών. 57

70 Γ. Υλικά και Μέθοδοι 58

71 Ενότητα Δ Πειραματικό Μέρος 59

72 Δ. Πειραματικό Μέρος 60

73 Δ. Πειραματικό Μέρος Δ.1. Μετασχηματισμός των βακτηριακών κυττάρων E.coli BL21(DE3) και των κυττάρων DL39(DE3) με το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο pet20b(+) Ο μετασχηματισμός των επιδεκτικών κυττάρων E.coli BL21(DE3) με το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο pet20b(+) πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με την τεχνική που περιγράφηκε στην παράγραφο Γ.2.2. Μια θετική αποικία μετασχηματισμένων κυττάρων, η οποία αναπτύχθηκε στο τρυβλίο επιλέγεται για τον εμβολιασμό υγρού θρεπτικού υλικού, τη δημιουργία stock γλυκερόλης και την έκφραση της προς μελέτη πρωτεΐνης. Η ίδια διαδικασία επαναλαμβάνεται για το μετασχηματισμό των «επιδεκτικών», αυξοτροφικών κυττάρων DL39(DE3) από το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο pet20b(+). Δ.2. Εύρεση των βέλτιστων συνθηκών έκφρασης της πρωτεΐνης GLIC ΕΚΠ Δ.2.1. Ανάπτυξη προκαλλιέργειας Μετά το μετασχηματισμό, αναπτύσσεται υγρή καλλιέργεια LB, η οποία εμβολιάζεται με μία αποικία από το στερεό θρεπτικό υλικό. Συγκεκριμένα, σε πλαστικό σωλήνα των 50ml που περιέχει 10ml υγρού θρεπτικού υλικού LB και 10μl αμπικιλλίνης πραγματοποιείται εμβολιασμός του θρεπτικού υλικού με τα κύτταρα. Η προκαλλιέργεια αυτή επωάζεται σε επωαστικό κλίβανο στους 37 ο C, υπό ισχυρή ανάδευση στους 180rpm (rounds per minute) για περίπου ώρες. Με αυτή τη διαδικασία προκύπτει η ανάπτυξη προκαλλιέργειας, η οποία χρησιμοποιείται τόσο για τη δημιουργία stock γλυκερόλης, όσο και για την ανάπτυξη καλλιέργειας βακτηρίων σε μεγάλη κλίμακα. 61

74 Δ. Πειραματικό Μέρος Δ.2.2. Δημιουργία stock γλυκερόλης Σε αποστειρωμένο πλαστικό σωληνάριο (eppendorf) προστίθενται 500μl από την προκαλλιέργεια και 500μl γλυκερόλη, η οποία έχει αποστειρωθεί. Ακολουθεί η ομογενοποίηση του μείγματος με ανακίνηση του σωληναρίου και αποθήκευση του stock γλυκερόλης στους -80 ο C. Η διαδικασία αυτή πραγματοποιείται για τη μακροχρόνια διατήρηση και αποθήκευση των μετασχηματισμένων κυττάρων. Δ.2.3. Ανάπτυξη υγρής καλλιέργειας ελαχίστων μέσων για την εύρεση των βέλτιστων συνθηκών έκφρασης της πρωτεΐνης Χρησιμοποιείται κωνική φιάλη των 250ml, που περιέχει 80ml ddh 2 O (double distilled water) και 20ml M9X5, τα οποία έχουν υποστεί αποστείρωση. Σε αυτά προστίθενται 1ml από την προκαλλιέργεια, η οποία αναπτύχθηκε τις προηγούμενες ώρες, 200μl διαλύματος Q, 100μl διαλύματος MgSO 4 1Μ, 100μl βιοτίνης (0,5mg/ml), 100μl θειαμίνης (0,5mg/ml), 0,4g γλυκόζης, 0,1g (NH 4 ) 2 SO 4 και 100μl αμπικιλλίνης. Τα κύτταρα επωάζονται μέχρι η οπτική πυκνότητα της καλλιέργειας (Optical Density, OD) στα 600nm να φτάσει περίπου στις τιμές 0,6-0,9. Τότε γίνεται προσθήκη 100μl διαλύματος IPTG 1Μ. Μετά την προσθήκη του IPTG συλλέγονται δείγματα σε φιαλίδια από την καλλιέργεια κατά την προσθήκη του IPTG και ανά δύο ώρες. Τα δείγματα που συλλέγονται φυγοκεντρούνται στις rpm για 2 λεπτά και απορρίπτεται το υπερκείμενο. Τα κυτταρικά δείγματα προετοιμάστηκαν για ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου SDS με προσθήκη σε αυτά 100μl διαλύματος φόρτωσης δειγμάτων 1Χ πυκνό με 50mM DTT (Γ.1.8). Στη συνέχεια, τα κυτταρικά δείγματα επωάζονται σε νερό που βρίσκεται σε κατάσταση βρασμού (100 ο C) για 4 λεπτά, στη συνέχεια τοποθετούνται στους -80 ο C για 30 λεπτά και ξανά σε νερό που βρίσκεται σε κατάσταση βρασμού για 2 λεπτά. Ακολουθεί φυγοκέντρηση των δειγμάτων για 15 λεπτά και ηλεκτροφόρησή τους σε πηκτή περιεκτικότητας 17% σε ακρυλαμίδιο. Από την πηκτή ηλεκτροφόρησης σημειώθηκε ο χρόνος που απαιτείται για την εμφάνιση της μέγιστα υπερεκφρασμένης ζώνης (σε σύγκριση με αυτές που αντιστοιχούν στις λιγότερες ή περισσότερες ώρες έκφρασης), η οποία αντιστοιχεί στο μοριακό βάρος της πρωτεΐνης-στόχου μετά την προσθήκη IPTG. Από 62

75 Δ. Πειραματικό Μέρος την πηκτή (Εικόνα 18) διαπιστώνεται ότι η GLIC ΕΚΠ φτάνει στη μέγιστη έκφραση 4 ώρες μετά την προσθήκη IPTG στην καλλιέργεια μάρτυρας 0 h 2 h 4 h 6 h 8 h Ολονύχτια επώαση Εικόνα 18: SDS-PAGE που απεικονίζει τη δοκιμή έκφρασης για 0, 2, 4, 6, 8 ώρες και μετά από ολονύχτια επώαση μετά την προσθήκη IPTG. Δ.3. Υγρή καλλιέργεια για την έκφραση της GLIC ΕΚΠ Δ.3.1. Προκαλλιέργεια Σε πλαστικό σωλήνα των 50ml προστίθενται 20ml αποστειρωμένου LB, 20μl αμπικιλλίνης και μικρή ποσότητα από το stock γλυκερόλης. Στη συνέχεια, πραγματοποιείται επώαση υπό ανάδευση στους 37 ο C, σε 180rpm για ώρες. Δ.3.2. Υγρή καλλιέργεια σε θρεπτικό υλικό ελαχίστων μέσων (minimal media, M95X) Σε δύο κωνικές φιάλες των 2L, προστίθενται 800ml ddh 2 O και 200ml M95X, τα οποία έχουν υποστεί αποστείρωση. Σε αυτά προστίθενται 10ml προκαλλιέργειας, 2ml διαλύματος Q, 1ml διαλύματος MgSO 4 1M, 1ml βιοτίνης (0,5 mg/ml βιοτίνης σε ddh 2 O), 1ml θειαμίνης (0,5 mg/ml θειαμίνης σε ddh 2 O, 4g γλυκόζης, 1g (NH 4 ) 2 SO 4 και 1ml αμπικιλλίνης (0,1 g/ml). Τα κύτταρα επωάζονται σε 180rpm μέχρι η οπτική πυκνότητα (OD) να φτάσει περίπου στις τιμές 0,6-0,9. Τότε προστίθεται στην υγρή καλλιέργεια 1ml/L διαλύματος IPTG 1Μ και τα κύτταρα επωάζονται στις ίδιες συνθήκες για 4 ώρες. 63

76 Δ. Πειραματικό Μέρος Δ.3.3. Συλλογή των κυττάρων Μετά την έκφραση της πρωτεΐνης, ακολουθεί η συλλογή των κυττάρων από την υγρή καλλιέργεια. Η καλλιέργεια μοιράζεται σε ειδικούς πλαστικούς σωλήνες των 250ml και φυγοκεντρείται για 20 λεπτά, σε 8000rpm (4 ο C). Στη συνέχεια, απορρίπτεται το υπερκείμενο, τα κύτταρα εκπλένονται με διάλυμα ιμιδαζολίου 10mΜ, συλλέγονται σε πλαστικό σωλήνα των 50ml και αποθηκεύονται στους -20 ο C. Δ.3.4. Λύση των βακτηριακών κυττάρων μέσω υπερήχων Η λύση των βακτηριακών κυττάρων πραγματοποιείται με τη χρήση υπερήχων σε ειδικό μηχάνημα (μηχάνημα υπερήχων για τη λύση των μεμβρανών των κυττάρων Sonicator Ultrasonic Processor-QSONICA, LLC). Κατά τη διάρκεια της διαδικασίας αυτής ο πλαστικός σωλήνας που περιέχει τα κύτταρα βρίσκεται σε πάγο. Η εφαρμογή των υπερήχων διαρκεί 10 δευτερόλεπτα και ενδιάμεσα υπάρχει μια παύση της διαδικασίας για 5 λεπτά, έτσι ώστε να αποφεύγεται η αύξηση της θερμοκρασίας στο διάλυμα των κυττάρων. Η διαδικασία επαναλαμβάνεται 10 φορές. Πριν τη λύση τους τα κύτταρα ζυγίζονται και μετά προστίθεται σε αυτά μείγμα αναστολέων πρωτεολυτικών ενζύμων (πρωτεασών) σε αναλογία 1ml για κάθε 20g κυττάρων. Αμέσως μετά τα κύτταρα φυγοκεντρούνται στις rpm για 1 ώρα (4 ο C). Δείγματα από το υπερκείμενο και από το ίζημα ηλεκτροφορήθηκαν σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου SDS, με σκοπό να διαπιστωθεί εάν η πρωτεΐνη βρίσκεται στο διαλυτό μέρος των κυττάρων (υπερκείμενο) ή στο μη-διαλυτό μέρος τους (ίζημα). Παρατηρείται ότι η GLIC ΕΚΠ βρίσκεται στο διαλυτό μέρος, το οποίο υφίσταται και περαιτέρω επεξεργασία για την απομόνωσή της πρωτεΐνης. Δ.4. Απομόνωση της πρωτεΐνης GLIC ΕΚΠ Δ.4.1. Απομόνωση της πρωτεΐνης GLIC ΕΚΠ με χρωματογραφία συγγένειας 64 Η πρωτεΐνη GLIC ΕΚΠ εκφράστηκε με επίτοπο 6 καταλοίπων ιστιδίνης (6His-tag) στο C-τελικό της άκρο. Επομένως, η πρώτη απομόνωση της πρωτεΐνης

77 Δ. Πειραματικό Μέρος πραγματοποιείται με τη χρήση της στήλης His-tag. Αρχικά, στη ρητίνη της στήλης ακινητοποιούνται δισθενή ιόντα ψευδαργύρου (Zn 2+ ) και στη συνέχεια εκπλένεται με ddh 2 O, ώστε να απομακρυνθεί η περίσσεια ψευδαργύρου που δεν προσδέθηκε στη ρητίνη. Ακολουθεί η βαθμονόμηση της στήλης (calibration) με διάλυμα ιμιδαζολίου 10mΜ και εισαγωγή του δείγματος στη στήλη χρησιμοποιώντας χαμηλή ταχύτητα ροής. Κατόπιν, εισάγεται στη στήλη μια σειρά από διαλύματα σταδιακά αυξανόμενης συγκέντρωσης ιμιδαζολίου και συγκεκριμένα διαλύματα συγκεντρώσεων 10mM, 20mM, 40mM, 100mM και 400mM ιμιδαζολίου. Η έκλουση της GLIC ΕΚΠ -6His πραγματοποιείται κατά την εισαγωγή του διαλύματος 40mΜ ιμιδαζολίου στη στήλη. Το ιμιδαζόλιο αντικαθιστά την GLIC ΕΚΠ -6His στο δεσμό υψηλής συγγένειας με το μεταλλικό ιόν και έτσι απελευθερώνεται από τη ρητίνη. Τέλος, η στήλη εκπλένεται με EDTA για την απομάκρυνση του ψευδαργύρου και του ιμιδαζολίου και στη συνέχεια εκπλένεται με άφθονο ddh 2 O. Η στήλη αποθηκεύεται στους 4 ο C και είναι έτοιμη για επόμενη χρήση. Το κλάσμα που περιέχει την GLIC ΕΚΠ συγκεντρώνεται στα 2ml με τη χρήση ειδικών φίλτρων συγκέντρωσης (amicon) των ΜWCO (Molecular Weight Cut-Off). Το δείγμα φυγοκετρείται στις 4500 rpm μέχρι να φτάσει στην επιθυμητή ποσότητα (2ml) μάρτυρας Πρωτεϊνικό μίγμα 10Mm ιμιδαζολίου 20Mm ιμιδαζολίου 40Mm ιμιδαζολίου 100Mm ιμιδαζολίου 400Mm ιμιδαζολίου Εικόνα 19: SDS-PAGE που απεικονίζει την ποιότητα των κλασμάτων μετά τη χρωματογραφία συγγένειας. 65

78 Δ. Πειραματικό Μέρος Δ.4.2. Απομόνωση της πρωτεΐνης GLIC ΕΚΠ με χρωματογραφία μοριακού αποκλεισμού Η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη μετά την απομόνωσή της μέσω χρωματογραφίας συγγένειας, σε δεύτερο στάδιο εμπλουτίζεται μέσω χρωματογραφίας μοριακού αποκλεισμού. Για την απομόνωσή της επιλέχθηκε η στήλη μοριακής διήθησης Superose 12_10/300 και η συσκευή FPLC της Amersham Biosciences. Αρχικά, η στήλη βαθμονομείται με διάλυμα φωσφορικών (K 2 HPO 4 και KH 2 PO 4 ) 50Mm, ph 7 και στη συνέχεια εισάγεται το δείγμα στη στήλη και ακολουθεί η έκλουση των πρωτεϊνών ανάλογα με το μοριακό βάρος τους. Η περιοχή στην οποία εντοπίζεται η πρωτεΐνη-glic ΕΚΠ εμφανίζεται στην εικόνα του χρωματογραφήματος (Εικόνα 20). Εικόνα 20: Απομόνωση της πρωτεΐνης με χρωματογραφία μοριακού αποκλεισμού Η περιοχή αυτή εντοπίζεται μετά από ηλεκτροφόρηση δειγμάτων από τα κλάσματα που προέκυψαν σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου (Εικόνα 20). Ακολουθεί συμπύκνωση του δείγματος με τον ίδιο τρόπο που πραγματοποιήθηκε μετά τη χρωματογραφία συγγένειας. Επίσης, πραγματοποιείται αλλαγή του διαλύματος στο οποίο βρίσκεται η πρωτεΐνη με τη χρήση του amicon από διάλυμα φωσφορικών (K 2 HPO 4 και KH 2 PO 4 )σε Tris-HCl 20mM. Δ.4.3. Απομόνωση της πρωτεΐνης GLIC ΕΚΠ με χρωματογραφία ιοντοανταλλαγής Για να επιτευχθεί η πλήρης απομόνωση της πρωτεΐνης GLIC ΕΚΠ ακολούθησε η χρωματογραφία ιοντοανταλλαγής. Η στήλη ιοντοανταλλαγής που χρησιμοποιείται είναι η Mono Q της Amersham Biosciences. Ως διάλυμα εκκίνησης χρησιμοποιείται το διάλυμα 20mM Tris-HCl, ph 8 και ως διάλυμα έκλουσης το 20mM 66

79 Δ. Πειραματικό Μέρος Tris-HCl και 1Μ NaCl, ph 8. Μετά από τη βαθμονόμηση της στήλης με το διάλυμα εκκίνησης, ακολουθεί η εισαγωγή του δείγματος στη στήλη και η αποδέσμευση των πρωτεΐνών από τη στήλη με τη χρήση διαλύματος έκλουσης, το οποίο εισάγεται στη στήλη με αυξανόμενη συγκέντρωση. Με αυτό τον τρόπο πραγματοποιείται η πλήρης απομόνωση της πρωτεΐνης και αυτό αποτυπώνεται στην πηκτή ηλεκτροφόρησης πολυακρυλαμιδίου. Τέλος, τα κλάσματα στα οποία η πρωτεΐνη είναι πλήρως απομονωμένη συμπυκνώνονται στα 450μl. Δ.5. Ποσοτικός προσδιορισμός της GLIC ΕΚΠ Προετοιμασία NMR - δείγματος Ο ποσοτικός προσδιορισμός πραγματοποιήθηκε μετά από μέτρηση της οπτικής πυκνότητας στα 280nm με τη χρήση του φασματοφωτόμετρου ορατού/υπεριώδους JENWAY Μετά τη μέτρηση της οπτικής πυκνότητας ακολουθεί ο υπολογισμός της συγκέντρωσης της πρωτεΐνης με το νόμο Lambert-Beer που ορίζει ότι η οπτική πυκνότητα της πρωτεΐνης είναι ανάλογη με τη συγκέντρωση της πρωτεΐνης, (c), το μήκος της διαδρομής που διανύεται στο διάλυμα (δηλαδή το μήκος της κυψελίδας, α) και το συντελεστή απορροφητικότητας της πρωτεΐνης (ε). Δηλαδή: οπτική πυκνότητα =(α) x (ε) x (c) Μετά τον ποσοτικό προσδιορισμό της πρωτεΐνης, ακολουθεί η εισαγωγή του δείγματος σε σωλήνες NMR και η λήψη των NMR φασμάτων. 67

80 Δ. Πειραματικό Μέρος Δ.6. Έκφραση και απομόνωση της επισημασμένης 15 Ν ή/και 13 C ή/και 2 Η πρωτεΐνης GLIC ΕΚΠ Η έκφραση της 15 Ν-επισημασμένης και της 15 Ν, 13 C- επισημασμένης πρωτεΐνης πραγματοποιήθηκε με τη χρήση 15 Ν και 15 Ν, 13 C-επισημασμένων αντιδραστηρίων ( 15 NH 4 Cl ή/και 13 C-D-γλυκόζη) κατά την ανάπτυξη υγρής καλλιέργειας, αντίστοιχα. Οι συνθήκες έκφρασης και η πειραματική πορεία απομόνωσης της πρωτεΐνης είναι ίδιες με αυτές που εφαρμόζονται κατά την παραγωγή των μη-επισημασμένων πρωτεϊνών, με τη διαφορά ότι το 15 NH 4 Cl ή/και η 13 C-γλυκόζη αντικαθιστούν το (NH 4 ) 2 SO 4 και τη γλυκόζη, αντίστοιχα. Σε κάποια δείγματα 15 Ν-επισημασμένης και της 15 Ν, 13 C- επισημασμένης πρωτεΐνης χρησιμοποιήθηκε το ενισχυτικό μέσο 15 Ν-isogro και το 15 Ν, 13 C-isogro, αντίστοιχα. Πρόκειται για εκχύλισμα από φύκια, το οποίο περιέχει μίγμα αμινοξέων και επιταχύνει την ανάπτυξη των κυττάρων, ενώ ενισχύει την έκφραση της πρωτεΐνης. Όσον αφορά στην έκφραση της 15 Ν, 13 C, 2 Η-επισημασμένης πρωτεΐνης, ως πηγή αζώτου και άνθρακα χρησιμοποιούνται τα 15 NH 4 Cl και η 13 C-D-γλυκόζη, ενώ το ddh 2 O αντικαθιστάται από D 2 O. Επίσης, τα κύτταρα, αρχικά, αναπτύσσονται σε υγρή καλλιέργεια μεγάλης κλίμακας. Επομένως, 10ml προκαλλιέργειας μεταφέρονται σε 1L αποστειρωμένου LB στο οποίο προστίθεται 1ml αμπικιλλίνης. Τα κύτταρα αναπτύσσονται χωρίς να πραγματοποιηθεί επαγωγή της έκφρασης μέχρι η οπτική πυκνότητα στα 600nm να φτάσει περίπου 0,8-0,9. Στη συνέχεια, τα κύτταρα συλλέγονται και με αυτά πραγματοποιείται ο εμβολιασμός του θρεπτικού υλικού Μ9. Οι συνθήκες έκφρασης και η πειραματική πορεία απομόνωσης της πρωτεΐνης παραμένουν ίδιες. 68

81 Δ. Πειραματικό Μέρος Δ.7. Επιλεκτική αντίστροφη επισήμανση της αργινίνης (Αrg) σε 15 Ν υπόβαθρο Η ανάπτυξη της προκαλλιέργειας πραγματοποιείται χωρίς καμία αλλαγή, όπως περιγράφεται παραπάνω. Το ίδιο ισχύει και για την ανάπτυξη της καλλιέργειας της 15 Ν-επισημασμένης πρωτεΐνης, με τη διαφορά ότι όταν η οπτική πυκνότητα φτάσει περίπου 0,3-0,4 προστίθενται 0,15g/L 14 N-Arg (περίπου μία ώρα πριν την επαγωγή της έκφρασης). Στη συνέχεια, πραγματοποιείται επαγωγή της έκφρασης (ΟD 0,6-0,9) και συλλογή των κυττάρων, διατηρώντας τις ίδιες συνθήκες. Η πειραματική πορεία απομόνωσης της πρωτεΐνης παραμένει ίδια. Δ.8. Επιλεκτική αντίστροφη επισήμανση της λυσίνης (Lys) σε 15 Ν υπόβαθρο και επιλεκτική 15 Ν-επισήμανση λυσίνης Η διαδικασία της αντίστροφης επισήμανσης της λυσίνης είναι ίδια με την αντίστοιχη της αργινίνης με τη διαφορά ότι αντί της προσθήκης Arg γίνεται προσθήκη 0,15g/L 14 N-Lys. Όσον αφορά στην επιλεκτική 15 Ν-επισήμανση Lys ακολουθείται η διαδικασία έκφρασης της μη-επισημασμένης πρωτεΐνης σε ελάχιστα μέσα. Κατά την ανάπτυξη των κυττάρων στην υγρή καλλιέργεια ελαχίστων μέσων παρεμβάλλεται ένα επιπλέον στάδιο πριν τη προσθήκη IPTG. Όταν το ΟD φτάσει 0,3-0,4 (δηλαδή περίπου 1 ώρα πριν την επαγωγή της έκφρασης) προστίθενται στην καλλιέργεια 0,15g/L 15 N-Lys. Οι συνθήκες έκφρασης και η πειραματική πορεία απομόνωσης της πρωτεΐνης παραμένουν ίδιες. Δ.9. Επιλεκτική 15 Ν-επισήμανση ιστιδίνης (His) και ασπαραγίνης (Asn) Για την επιλεκτική 15 Ν-επισήμανση των καταλοίπων ιστιδίνης ( 15 N-His) απαιτείται η έκφραση της πρωτεΐνης με μη-επισημασμένες πηγές αζώτου και άνθρακα και την προσθήκη του 15 Ν-επισημασμένου αμινοξέος. Συγκεκριμένα, οι 69

82 Δ. Πειραματικό Μέρος διαδικασίες έκφρασης και απομόνωσης της πρωτεΐνης που χρησιμοποιούνται είναι αυτές που απαιτούνται για την έκφραση της μη-επισημασμένης πρωτεΐνης με τη διαφορά ότι κατά την ανάπτυξη των κυττάρων και περίπου όταν το OD φτάσει περίπου 0,3-0,4 (μια ώρα πριν την προσθήκη του IPTG), προστίθενται 0,15g/L 15 N-His. Με αυτό τον τρόπο πραγματοποιείται η επιλεκτική 15 Ν-επισήμανση των ιστιδίνων, ενώ όλα τα υπόλοιπα αμινοξικά κατάλοιπα παραμένουν μη-επισημασμένα. Με τον ίδιο τρόπο πραγματοποιείται και η επιλεκτική 15 Ν-επισήμανση των καταλοίπων ασπαραγίνης (Asn). Δ.10. Εφαρμογή επιλεκτικής 15 Ν-επισήμανσης και αντίστροφης επισήμανσης της λευκίνης (Leu) Δ Επιλεκτική αντίστροφη επισήμανση της λευκίνης (Leu) σε 15 Ν υπόβαθρο Η διαδικασία που ακολουθείται για την αντίστροφη επισήμανση της λευκίνης είναι ίδια με την αντίστοιχη διαδικασία, η οποία περιγράφεται παραπάνω, για την αντίστροφη επισήμανση της αργινίνης, με τη διαφορά ότι αντί για αργινίνη προστίθενται 0,15g/L 14 N-Leu. Δ Επιλεκτική 15 Ν-επισήμανση της λευκίνης ( 15 Ν-Leu) Για την επιλεκτική 15 Ν-επισήμανση της Leu δοκιμάστηκαν διαφορετικές διαδικασίες επιλεκτικής επισήμανσης, έτσι ώστε να επιτευχθεί το καλύτερο δυνατό αποτέλεσμα επιλεκτικής επισήμανσης. Αρχικά, χρησιμοποιήθηκε η ίδια διαδικασία με την επιλεκτική 15 Ν-επισήμανση της λυσίνης, με τη διαφορά ότι προστίθενται 0,15g/L 15 N-Leu αντί για 15 N-Lys. Δ Έκφραση της πρωτεΐνης σε κύτταρα BL21(DE3) με προσθήκη 15 Ν-Leu και 14 Ν-Val, 14 Ν-Ile Εξαιτίας της εμφάνισης του φαινομένου της μη-ειδικής επισήμανσης έγιναν προσπάθειες για την εξάλειψη του φαινομένου αυτού. Επομένως, η μη-ειδική επισήμανση της βαλίνης και της ισολευκίνης, που εμφανίζεται κατά την επιλεκτική 15 Ν-επισήμανση της λευκίνης έγιναν προσπάθειες να εξαληφθεί με την προσθήκη 14 Ν- 70

83 Δ. Πειραματικό Μέρος Val και 14 Ν-Ile. Συγκεκριμένα, ακολουθείται η ίδια διαδικασία έκφρασης της μηεπισημασμένης πρωτεΐνης σε ελάχιστα μέσα και η απομόνωσή της. Σε αυτή την περίπτωση όμως κατά την επαγωγή της έκφρασης, εκτός από την προσθήκη IPTG προστίθενται 0,085g/L 15 N-Leu, 0,51g/L 14 Ν-Val και 0,51g/L 14 Ν-Ile (δηλαδή οι ποσότητες των μη-επισημασμένων αμινοξέων που προστίθενται είναι εξαπλάσιες από την ποσότητα της 15 N-Leu). Οι διαδικασίες έκφρασης και απομόνωσης της πρωτεΐνης παραμένουν ίδιες. Δ Έκφραση της πρωτεΐνης-glic ΕΚΠ σε κύτταρα DL39(DE3) με προσθήκη 15 N- Leu Για την έκφραση της πρωτεΐνης GLIC ΕΚΠ σε κύτταρα DL39(DE3) απαιτείται η δημιουργία προκαλλιέργειας, όπως περιγράφεται παραπάνω. Στην περίπτωση αυτή όμως τα μετασχηματισμένα κύτταρα με τα οποία γίνεται εμβολιασμός είναι τα DL39(DE3). Την επόμενη μέρα 10ml προκαλλιέργειας μεταφέρονται σε 1L αποστειρωμένου LB, στο οποίο προστίθεται 1ml αμπικιλλίνης. Τα κύτταρα αναπτύσσονται χωρίς να πραγματοποιηθεί η επαγωγή της έκφρασης, μέχρι η οπτική πυκνότητα στα 600nm να φτάσει περίπου 0,8-0,9. Στη συνέχεια, τα κύτταρα συλλέγονται. Σε δύο κωνικές φιάλες των 2L, οι οποίες περιέχουν 800ml ddh 2 O και 200ml M95X, (τα οποία έχουν υποστεί αποστείρωση) πραγματοποιείται εμβολιασμός με τα παραπάνω κύτταρα μέχρι το OD να φτάσει περίπου στο 0,3. Σε καθεμιά από τις δύο κωνικές φιάλες προστίθενται επίσης 5g γλυκόζης, 1g (NH 4 ) 2 SO 4, 4ml διαλύματος Q, 2ml βιοτίνης, 2ml θειαμίνης, 1ml διαλύματος MgSO 4, 1ml αμπικιλλίνης και οι παρακάτω ποσότητες των αμινοξέων: 0,2g/L 15 N-Leu, 0,15g/L 14 Ν-Phe, 0,09g/L 14 Ν- Tyr, 0,4g/L 14 Ν-Asp, 0,2g/L 14 Ν-Ile, 0,2g/l 14 Ν-Val, 0,4g/L 14 Ν-Ala, 0,2g/L 14 Ν-Asn, 0,5g/L 14 Ν-Gly, 0,1g/L 14 Ν-Met, 0,21g/L 14 Ν-Lys και 0,1g/L 14 Ν-Met. Τα κύτταρα επωάζονται στους 37 ο C υπό ισχυρή ανάδευση στους 180rpm, μέχρι το OD να φτάσει 0,6-0,7. Τότε στην υγρή καλλιέργεια προστίθεται 1ml/L διαλύματος IPTG 1Μ και τα κύτταρα επωάζονται στις ίδιες συνθήκες για 4 ώρες. Η πειραματική πορεία απομόνωσης της πρωτεΐνης παραμένει ίδια. 71

84 Δ. Πειραματικό Μέρος Δ.11. Εφαρμογή επιλεκτικής 15 Ν-επισήμανσης και αντίστροφης επισήμανσης της βαλίνης (Val) Δ Επιλεκτική αντίστροφη επισήμανση της βαλίνης (Val) σε 15 Ν υπόβαθρο Η διαδικασία της επιλεκτικής αντίστροφης επισήμανσης της βαλίνης είναι ίδια με αυτή που ακολουθείται για την αντίστροφη επισήμανση της λυσίνης. Ασφαλώς, στη θέση της 14 Ν-Lys προστίθενται 0,15g/L 14 Ν-Val. Δ Έκφραση της πρωτεΐνης σε κύτταρα BL21(DE3) με προσθήκη 15 Ν-Val και 14 Ν-Leu, 14 Ν-Ile Οι συνθήκες έκφρασης και απομόνωσης της πρωτεΐνης είναι ίδιες με αυτές που απαιτούνται κατά την έκφραση της μη-επισημασμένης πρωτεΐνης με τη διαφορά ότι κατά την επαγωγή της έκφρασης προστίθενται 0,17g/L 15 Ν-Val, 1,02g/L 14 Ν-Leu και 1,02g/L 14 Ν-Ile (δηλαδή οι ποσότητες 14 Ν-Leu και 14 Ν-Ile είναι εξαπλάσιες από αυτή της 15 Ν-Val). Δ.12. Έκφραση της πρωτεΐνης σε κύτταρα BL21(DE3) με προσθήκη 15 Ν- Ile και 14 Ν-Leu, 14 Ν- Val Οι συνθήκες έκφρασης και απομόνωσης της πρωτεΐνης είναι ίδιες με αυτές που απαιτούνται κατά την έκφραση της μη-επισημασμένης πρωτεΐνης. Η διαφορά είναι ότι κατά την επαγωγή της έκφρασης προστίθενται 0,09g/L 15 Ν- Ile, 0,54g/L 14 Ν- Leu και 0,54g/L 14 Ν- Val (δηλαδή οι ποσότητες των 14 Ν-Leu και 14 Ν- Val είναι εξαπλάσιες από αυτή της 15 Ν- Ile). 72

85 Δ. Πειραματικό Μέρος Δ.13. Εφαρμογή επιλεκτικής 15 Ν-επισήμανσης της φαινυλαλανίνης (Phe) / αλανίνης (Ala) Δ.13.1 Επιλεκτική αντίστροφη επισήμανση της φαινυλαλανίνης (Phe)/αλανίνης (Ala) σε 15 Ν υπόβαθρο Η διαδικασία της επιλεκτικής αντίστροφης επισήμανσης τόσο για τη φαινυλαλανίνη όσο και για την αλανίνη είναι ίδια με αυτή που ακολουθείται για την αντίστροφη επισήμανση της λυσίνης. Στη θέση της 14 Ν-Lys προστίθεται 0,15g/L 14 Ν-Phe ή 0,15g/L 14 Ν-Ala ανάλογα με το αμινοξύ που επιλέγεται να μην είναι 15 Ν- επισημασμένο. Δ Έκφραση της πρωτεΐνης-glic ΕΚΠ σε κύτταρα DL39(DE3) με προσθήκη 15 N- Phe Η έκφραση της πρωτεΐνης GLIC ΕΚΠ με 15 Ν-επισημασμένη τη Phe σε αυξοτροφικά κύτταρα DL39(DE3) πραγματοποιείται με τον ίδιο τρόπο που περιγράφεται στο κεφάλαιο Δ Τα αμινοξέα και οι ποσότητες οι οποίες προστίθενται είναι: 0,15g/L 15 Ν-Phe, 0,09g/L 14 Ν-Tyr, 0,4g/L 14 Ν-Asp, 0,2g/L 14 N-Leu, 0,2g/L 14 Ν-Ile, 0,2g/l 14 Ν-Val, 0,4g/L 14 Ν-Ala, 0,2g/L 14 Ν-Asn, 0,5g/L 14 Ν-Gly, 0,1g/L 14 Ν- Met, 0,21g/L 14 Ν-Lys. Δ Έκφραση της πρωτεΐνης-glic ΕΚΠ σε κύτταρα DL39(DE3) με προσθήκη 15 N- Ala Η έκφραση της πρωτεΐνης GLIC ΕΚΠ με 15 Ν-επισημασμένη τη Ala σε αυξοτροφικά κύτταρα DL39(DE3) πραγματοποιείται με τον ίδιο τρόπο που περιγράφεται στο κεφάλαιο Δ Τα αμινοξέα και οι ποσότητες οι οποίες προστίθενται είναι: 0,3g/L 15 Ν-Ala, 0,15g/L 14 Ν-Phe, 0,09g/L 14 Ν-Tyr, 0,4g/L 14 Ν-Asp, 0,2g/L 14 N-Leu, 0,2g/L 14 Ν-Ile, 0,2g/l 14 Ν-Val, 0,2g/L 14 Ν-Asn, 0,5g/L 14 Ν-Gly, 0,1g/L 14 Ν-Met, 0,21g/L 14 Ν-Lys. 73

86 Δ. Πειραματικό Μέρος Δ.14. Έκφραση της πρωτεΐνης-glic ΕΚΠ σε κύτταρα DL39(DE3) με προσθήκη 15 N-Tyr Η έκφραση της πρωτεΐνης GLIC ΕΚΠ με 15 Ν-επισημασμένη τη Tyr σε αυξοτροφικά κύτταρα DL39(DE3) πραγματοποιείται με τον ίδιο τρόπο που περιγράφεται στο κεφάλαιο Δ Τα αμινοξέα και οι ποσότητες οι οποίες προστίθενται είναι: 0,07g/L 15 Ν-Tyr, 0,15g/L 14 Ν-Phe, 0,4g/L 14 Ν-Asp, 0,2g/L 14 N-Leu, 0,2g/L 14 Ν-Ile, 0,2g/l 14 Ν-Val, 0,4g/L 14 Ν-Ala, 0,2g/L 14 Ν-Asn, 0,5g/L 14 Ν-Gly, 0,1g/L 14 Ν-Met, 0,21g/L 14 Ν-Lys. Δ.15. Έκφραση της πρωτεΐνης-glic ΕΚΠ σε κύτταρα DL39(DE3) με προσθήκη 15 N-Glu Η έκφραση της πρωτεΐνης GLIC ΕΚΠ με 15 Ν-επισημασμένη το Glu σε αυξοτροφικά κύτταρα DL39(DE3) πραγματοποιείται με τον ίδιο τρόπο που περιγράφεται στο κεφάλαιο Δ Τα αμινοξέα και οι ποσότητες οι οποίες προστίθενται είναι: 0,18g/L 15 Ν-Glu, 0,15g/L 14 Ν-Phe, 0,09g/L 14 Ν-Tyr, 0,4g/L 14 Ν-Asp, 0,2g/L 14 N-Leu, 0,2g/L 14 Ν-Ile, 0,2g/l 14 Ν-Val, 0,4g/L 14 Ν-Ala, 0,2g/L 14 Ν-Asn, 0,5g/L 14 Ν-Gly, 0,1g/L 14 Ν-Met, 0,21g/L 14 Ν-Lys. Δ.16. Έκφραση της πρωτεΐνης-glic ΕΚΠ σε κύτταρα DL39(DE3) με προσθήκη 15 N-Asp Η έκφραση της πρωτεΐνης GLIC ΕΚΠ με 15 Ν-επισημασμένη το Asp σε αυξοτροφικά κύτταρα DL39(DE3) πραγματοποιείται με τον ίδιο τρόπο που περιγράφεται στο κεφάλαιο Δ Τα αμινοξέα και οι ποσότητες οι οποίες προστίθενται είναι: 0,31g/L 15 Ν-Asp, 0,15g/L 14 Ν-Phe, 0,09g/L 14 Ν-Tyr, 0,2g/L 14 N-Leu, 74

87 Δ. Πειραματικό Μέρος 0,2g/L 14 Ν-Ile, 0,2g/l 14 Ν-Val, 0,4g/L 14 Ν-Ala, 0,2g/L 14 Ν-Asn, 0,5g/L 14 Ν-Gly, 0,1g/L 14 Ν- Met, 0,21g/L 14 Ν-Lys. 75

88 Δ. Πειραματικό Μέρος 76

89 Ενότητα Ε Αποτελέσματα 77

90 ΣΤ. Συζήτηση 78

91 ΣΤ. Συζήτηση Ε.1. Έκφραση και απομόνωση της πρωτεΐνης GLIC ΕΚΠ Το isogro είναι ένα μίγμα ουσιών, το οποίο προέρχεται από εκχύλισμα φυκιών και αποτελείται από μίγμα αμινοξέων και άλλων χημικών συστατικών. Χρησιμοποιείται με σκοπό τη γρηγορότερη ανάπτυξη των κυττάρων και την ενίσχυση της απόδοσης της εκφραζόμενης πρωτεΐνης. Διατίθεται επισημασμένο σε 15 Ν, 15 Ν, 13 C και 2 Η, 15 Ν, 13 C και προστίθεται στο θρεπτικό υλικό Μ9 μαζί με την πηγή αζώτου και άνθρακα. Πραγματοποιήθηκαν δοκιμές σε μικρής κλίμακας καλλιέργειες με σκοπό τον προσδιορισμό της ποσότητας του isogro, το οποίο πρέπει να προστεθεί για τα βέλτιστα αποτελέσματα όσον αφορά στη γρήγορη ανάπτυξη των κυττάρων και στη μεγαλύτερη απόδοση της έκφρασης της πρωτεΐνης. Συγκεκριμένα, χρησιμοποιήθηκαν δύο καλλιέργειες ελαχίστων μέσων των 100ml (όπως περιγράφονται στο πειραματικό μέρος). Στην πρώτη δεν προστίθεται καθόλου isogro και στη δεύτερη προστίθεται 0,01g isogro. Στο διάγραμμα που παρατίθεται (Εικόνα 21) παρουσιάζεται η ανάπτυξη των βακτηριακών κυττάρων (η οποία αποτυπώνεται μέσω της αύξησης του OD) σε σχέση με το χρόνο και για τις δύο περιπτώσεις. Προκύπτει ότι η καλλιέργεια, στην οποία προστέθηκε isogro αναπτύσσεται γρηγορότερα από την άλλη. Το ίδιο συμβαίνει και με την απόδοση της κάθε καλλιέργειας σε πρωτεΐνη, όπως παρουσιάζεται στο διάγραμμα απεικόνισης της ποσότητας της πρωτεΐνης μέσω του αυτοματοποιημένου συστήματος ηλεκτροφόρησης του Experion ΤΜ της Biorad (Εικόνα 22). 0,6 0,5 0,4 ECD of GLIC+ 0,1g/L isogro ECD of GLIC OD 0,3 0,2 0, time (min) Εικόνα 21: Δι άγραμμα απεικόνισης της ανάπτυξης των βακτηριακών κυττάρων σε σχέση με το χρόνο ανάπτυξης. 79

92 ΣΤ. Συζήτηση Εικόνα 22: Απεικόνιση της απόδοσης της πρωτεΐνης GLIC ΕΚΠ χωρίς την προσθήκη isogro (4,6μg/μl) και μετά την προσθήκη 0,1g/l isogro (7,5μg/μl), με τη χρήση του Experion της Biorad. Ε.2. Έκφραση της 15 Ν-πρωτεΐνης, της 15 Ν, 13 C-πρωτεΐνης και της 2 Η, 15 Ν, 13 C-πρωτεΐνης Από την 15 Ν-επισημασμένη πρωτεΐνη προέκυψε το παρακάτω 1 Η- 15 Ν-HSQC φάσμα της GLIC ΕΚΠ σε ph 6,95, θερμοκρασία Τ=298 Κ, σε NMR μαγνήτη 700 MHz (Εικόνα 23) Στο παρακάτω 1 Η- 15 Ν-HSQC φάσμα διακρίνονται περίπου ΗΝ σήματα συντονισμού της κύριας αλυσίδας (αντί για περίπου 190, όπως αναμένονται από τα αμινοξικά κατάλοιπα της GLIC ΕΚΠ, χωρίς να υπολογίζονται οι 11 προλίνες τις οποίες διαθέτει και οι οποίες στερούνται αμιδικού ΝΗ). Υπολείπονται περίπου 50 σήματα ΗΝ, τα οποία δεν υπάρχουν ή επικαλύπτονται με άλλα. Το γεγονός αυτό οφείλεται στο μεγάλο μοριακό βάρος της πρωτεΐνης και στην ευκινησία του μορίου. 80

93 ΣΤ. Συζήτηση Εικόνα 23: 1 H- 15 N-HSQC φάσμα της GLIC ΕΚΠ, σε ph 6,95, θερμοκρασία Τ=298 Κ, σε NMR μαγνήτη 700MHz. Επιπλέον, ο αριθμός των σημάτων ΝΟΕs στα 1 H- 1 H- NOESY φάσματα, όπως φαίνεται και στο παρακάτω φάσμα (Εικόνα 24), είναι αρκετά μικρότερος από τον αναμενόμενο. Αυτό οφείλεται στο μεγάλο μοριακό βάρος της πρωτεΐνης και στο μεγάλο ρυθμό αποδιέγερσης των NMR-ενεργών πυρήνων, λόγω της αλληλεπίδρασης των πυρηνικών spin (Τ 2 μηχανισμός αποδιέγερσης). 81

94 ΣΤ. Συζήτηση Εικόνα 24: 1 H- 1 H-NO ESY φάσμα της GLIC ΕΚΠ. Το ίδιο πρόβλημα υπάρχει και στα φάσματα που λαμβάνονται με 13 C-επισήμανση της πρωτεΐνης (CACBNH). Η ένταση του προβλήματος αυτού μειώνεται με τη χρήση δευτεριωμένου νερού, D 2 O. Έτσι, η πρωτεΐνη που εκφράζεται στα δευτεριωμένα μέσα φέρει δευτέριο αντί για πρωτόνιο, ενώ όταν η δευτεριωμένη πρωτεΐνη βρεθεί σε υδατικό διαλύτη μόνο τα ανταλλάξιμα 2 Η (δηλαδή τα -ΝΗ, -ΟΗ και -SH) και όχι τα CH ανταλλάσσονται με τα πρωτόνια και έτσι εμφανίζονται τα σήματα συντονισμού ΗΝ. Η αντικατάσταση του 1 Η με 2 Η (δευτέριο) έχει ως αποτέλεσμα τη μείωση του ρυθμού αποδιέγερσης των ενεργών NMR-πυρήνων (αποδιέγερση spin-spin, Τ 2 ). 82

95 ΣΤ. Συζήτηση Συγκεκριμένα, η διακριτικότητα και η ευαισθησία των NMR πειραμάτων βελτιώνεται. Επομένως, πραγματοποιείται ο εμπλουτισμός των Μ9 ελαχίστων μέσων με 15 NH 4 Cl ( 15 Ν-χλωριούχο αμμώνιο) και 13 C-D 7 -γλυκόζη σε D 2 O. Με αυτό τον τρόπο το υδρογόνο αντικαθίσταται από δευτέριο και ο ρυθμός αποδιέγερσης του μορίου μειώνεται. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα την εμφάνιση σημάτων στα φάσματα, τα οποία δεν εμφανίζονταν προηγουμένως. ~95% δευτερίωση Η 2 Ο Ν-Η Ν-D Εικόνα 25: Διαφοροποίηση του φάσματος CBCANH μετά την ολική (~95%) δευτερίωση της πρωτεΐνης και την ανταλλαγή των αμιδικών ΝD σε ΝΗ μέσω διάλυσης της δευτεριωμένης πρωτεΐνης σε υδατικό (Η 2 Ο) ρυθμιστικό διάλυμα. Κατά τη φάση ανάπτυξης των κυττάρων σε δευτεριωμένα μέσα ο χρόνος, ο οποίος απαιτείται για την ανάπτυξή τους στα επιθυμητά επίπεδα είναι διπλάσιος από αυτόν στα μη-δευτεριωμένα μέσα. Αυτό οφείλεται στο διαφορετικό (δευτεριωμένο) περιβάλλον, στο οποίο αναπτύσσονται τα βακτηριακά κύτταρα. Για τον ίδιο λόγο η έκφραση της πρωτεΐνης είναι μειωμένη (Εικόνα 26). Ωστόσο, η συγκέντρωση της πρωτεΐνης επαρκεί για τη λήψη φασμάτων. Μειωμένη έκφραση της πρωτεΐνης Εικόνα 26: SDS-PAGE που απεικονίζει τη μειωμένη έκφραση της πρωτεΐνης σε δευτεριωμένα μέσα σε σύγκριση με αυτή σε πρωτονιωμένα μέσα. 83

96 ΣΤ. Συζήτηση Ε Ν-επιλεκτική επισήμανση αμινοξέων Για την 15 Ν-επιλεκτική επισήμανση αμινοξέων χρησιμοποιήθηκαν διαφορετικά πρωτόκολλα και διαφορετικές κυτταρικές σειρές του βακτηρίου E.coli, ανάλογα με το αμινοξύ που επισημαίνεται. Παρατηρείται ότι η έκφραση της πρωτεΐνης με τα αυξοτροφικά κύτταρα DL39(DE3) είναι χαμηλότερη σε σχέση με την αντίστοιχη στα πρωτοτοτροφικά BL21(DE3), όπως αναμενόταν (Εικόνα 27Β). Ωστόσο, η απομόνωση της πρωτεΐνης πραγματοποιείται με τον ίδιο τρόπο που περιγράφεται στο κεφάλαιο Δ.4 (Εικόνα 27Α). A μάρτυρας Πρωτεϊνικό μίγμα 10mM ιμιδαζολίου 20mM ιμιδαζολίου 40mM ιμιδαζολίου 100mM 400mM ιμιδαζολίου ιμιδαζολίου B Μειωμένη έκφραση της πρωτεΐνης Εικόνα 27: A SDS-PAGE που απεικονίζει την ποιότητα των κλασμάτων μετά τη χρωματογραφία συγγένειας μετά από έκφραση με επιλεκτική επισήμανση σε αυξοτροφικά κύτταρ α DL39(DE3) B SDS-PAGE που απεικονίζει τη μειωμένη έκφραση της πρωτεΐνης σε κύτταρα BL21(DE3) σε σύγκριση με αυτή σε κύτταρα DL39(DE3). 84

97 ΣΤ. Συζήτηση Ε.3.1. Επιλεκτική αντίστροφη επισήμανση της αργινίνης (Arg) σε 15 Ν υπόβαθρο Μετά την έκφραση της GLIC ΕΚΠ σε 15 Ν υπόβαθρο με επιλεκτική αντίστροφη επισήμανση της αργινίνης, πραγματοποιήθηκε η λήψη του αντίστοιχου 1 H- 15 N-HSQC φάσματος. Σε αυτό παρατηρείται (μετά από υπέρθεση του φάσματος αυτού με το 1 H- 15 N-HSQC της GLIC ΕΚΠ ) ότι τα σήματα συντονισμού, τα οποία αντιστοιχούν στην αργινίνη εξαφανίζονται. Με αυτό τον τρόπο ταυτοποιούνται και τα αμινοξικά κατάλοιπα αργινίνης. Η θέση της καθεμιάς από αυτές στην αλληλουχία της πρωτεΐνης εντοπίζεται με τα τρισδιάστατα ετεροπυρηνικά φάσματα, τα οποία συνδυάζουν το κάθε αμινοξύ με το προηγούμενό του. Με τον τρόπο αυτό ταυτοποιήθηκαν και επιβεβαιώθηκαν δεκαπέντε αμινοξικά κατάλοιπα αργινίνης. Επομένως, η διαδικασία της αντίστροφης επιλεκτικής επισήμανσης της αργινίνης στην GLIC ΕΚΠ είναι επιτυχημένη. Ε.3.2. Επιλεκτική αντίστροφη επισήμανση της λυσίνης (Lys) σε 15 Ν υπόβαθρο και επιλεκτική 15 Ν-επισήμανση λυσίνης Η διαδικασία έκφρασης της GLIC ΕΚΠ με επιλεκτική αντίστροφη επισήμανση της λυσίνης καθώς και αυτή της GLIC ΕΚΠ με επιλεκτική 15 Ν-Lys πραγματοποιείται όπως περιγράφεται στο κεφάλαιο Δ.8. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε η λήψη των αντίστοιχων 1 H- 15 N-HSQC φασμάτων. Παρατηρείται ότι στο φάσμα 1 H- 15 N-HSQC για την 14 N-Lys δεν εμφανίζονται οι κορυφές συντονισμού που αντιστοιχούν στη λυσίνη. 85

98 ΣΤ. Συζήτηση Α ) Β Εικόνα 28: Α 1 H- 15 N-HSQC φάσμα για την επιλεκτική 15 Ν-επισήμανση της λυσίνης. Β Υπέρθεση του φάσματος 1 H- 15 N-HSQC για την 15 Ν-Lys και του 1 H- 15 N-HSQC φάσματος της GLIC ΕΚΠ. (Σε κύκλο εμφανίζονται τα αμινοξικά κατάλοιπα λυσίνης.) 86

99 ΣΤ. Συζήτηση Αντίστοιχα, στο φάσμα παρατηρείται εμφάνιση των σημάτων συντονισμού που αντιστοιχούν μόνο στη λυσίνη (Εικόνα 28Α). Τα σήματα συντονισμού που εμφανίζονται στο 1 H- 15 N-HSQC για την 15 N-Lys είναι τα ίδια με αυτά που εξαφανίζονται στο 1 H- 15 N-HSQC για την 14 N-Lys. Μετά από υπέρθεση των φασμάτων αυτών με το φάσμα 1 H- 15 N-HSQC της 15 Ν-GLIC ΕΚΠ (Εικόνα 28Β) εντοπίζονται τα σήματα συντονισμού που αντιστοιχούν στα αμινοξικά κατάλοιπα λυσίνης. Η θέση της κάθε λυσίνης στην αλληλουχία της πρωτεΐνης εντοπίζεται σε συνδυασμό με τα τρισδιάστατα ετεροπυρηνικά φάσματα που συνδυάζουν το κάθε αμινοξύ με το προηγούμενό του. Με τη διαδικασία αυτή εντοπίζονται πέντε από τις οκτώ λυσίνες οι οποίες υπάρχουν στην αλληλουχία της GLIC ΕΚΠ και ταυτοποιείται η μία από αυτές (η οποία δεν είχε ταυτοποιηθεί ούτε μετά τη λήψη του φάσματος της δευτεριωμένης πρωτεΐνης) και επιβεβαιώνονται οι υπόλοιπες. Επομένως, η διαδικασία 15 Ν- επιλεκτικής επισήμανσης για την λυσίνη ήταν επιτυχημένη. Ε.3.3. Επιλεκτική αντίστροφη επισήμανση ιστιδίνης (His) και ασπαραγίνης (Asn) Το 1 H- 15 N-HSQC της GLIC ΕΚΠ με επιλεκτικά αντίστροφη επισήμανση της ιστιδίνης περιλαμβάνει τα σήματα συντονισμού που αντιστοιχούν σε όλα τα αμινοξέα εκτός από τις ιστιδίνες. Επομένως, η μέθοδος της επιλεκτικής αντίστροφης επισήμανσης η οποία χρησιμοποιήθηκε για την ιστιδίνη ήταν επιτυχημένη. Μετά από υπέρθεση του φάσματος αυτού με το 1 H- 15 N-HSQC φάσμα της GLIC ΕΚΠ εντοπίζονται τα ΗΝ σήματα των ιστιδινών. Η θέση της κάθε ιστιδίνης στην αλληλουχία της πρωτεΐνης εντοπίζεται σε συνδυασμό με τα τρισδιάστατα ετεροπυρηνικά φάσματα, τα οποία συσχετίζουν το κάθε αμινοξύ με το προηγούμενό του. Με αυτό τον τρόπο προσδιορίζονται και επιβεβαιώνονται οι ιστιδίνες (Εικόνα 29). Η ίδια διαδικασία πραγματοποιείται για τον προσδιορισμό των αμινοξικών καταλοίπων ασπαραγίνης (Εικόνα 30) στην αλληλουχία της GLIC ΕΚΠ. Έτσι, προσδιορίζονται και επιβεβαιώνονται τα αμινοξικά κατάλοιπα ασπαραγίνης. 87

100 ΣΤ. Συζήτηση Εικόνα 29: 1 H- 15 N-HSQC φάσμα για την επιλεκτικά αντίστροφη επισήμανση της ιστιδίνης 88 Εικόνα 30: Υπέρθεση του 1 H- 15 N-HSQC φάσματος γι α την επιλεκτικά αντίστροφη επισήμανση της ασπαραγίνης (με μπλε χρώμα) και του 1 H- 15 N-HSQC φάσματος της GLIC ΕΚΠ (με μαύρο χρώμα).

101 ΣΤ. Συζήτηση Ε.3.4. Επιλεκτική 15 Ν-επισήμανση και επιλεκτική αντίστροφη επισήμανση της λευκίνης (Leu) Στο 1 H- 15 N-HSQC φάσμα της 14 Ν-Leu της GLIC ΕΚΠ, το οποίο λαμβάνεται σε 15 Ν υπόβαθρο παρατηρείται ότι μετά από υπέρθεση του φάσματος αυτού οι κορυφές που εξαφανίζονται αντιστοιχούν σε σήματα συντονισμού των αμινοξικών καταλοίπων λευκίνης και άλλων αμινοξέων. Επομένως, η διαδικασία επιλεκτικής αντίστροφης επισήμανσης για την λευκίνη δεν ήταν επιτυχής. Στο 1 H- 15 N-HSQC φάσμα της GLIC ΕΚΠ που προέκυψε μετά από προσθήκη 15 Ν- Leu στην καλλιέργεια (Εικόνα 31) παρατηρούνται σήματα συντονισμού, τα οποία αντιστοιχούν σε περισσότερα και διαφορετικά αμινοξικά κατάλοιπα από τις λευκίνες. Επομένως, δεν ήταν δυνατή η αντιστοίχιση των κορυφών συντονισμού που ανήκουν στα αμινοξικά κατάλοιπα λευκίνης και κατά συνέπεια η αξιοποίηση του φάσματος αυτού. Η εμφάνιση σημάτων συντονισμού που αντιστοιχούν σε διαφορετικού τύπου αμινοξέα οφείλεται στην εμφάνιση της μη-ειδικής επισήμανσης, η οποία είναι αρκετά εκτεταμένη. Το γεγονός αυτό οδήγησε στην τροποποίηση της μεθόδου παρασκευής της επιλεκτικά επισημασμένης GLIC ΕΚΠ με 15 Ν-Leu. Μετά από υπέρθεση του προηγούμενου φάσματος με το 1 H- 15 N-HSQC φάσμα της GLIC ΕΚΠ, αλλά και μετά από περαιτέρω μελέτη της βιοσύνθεσης των αμινοξέων στα βακτηριακά κύτταρα, διαπιστώθηκε ότι αρκετές κορυφές του φάσματος αντιστοιχούν σε βαλίνη και ισολευκίνη. Με στόχο τη μείωση της μη-ειδικής επισήμανσης για τη βαλίνη και ισολευκίνη γίνεται προσθήκη αυτών των αμινοξέων μαζί με την 15 Ν-Leu. Με τον τρόπο αυτό μειώνεται το φαινόμενο της μη-ειδικής επισήμανσης για τα αμινοξέα αυτά και προκύπτει το παρακάτω 1 H- 15 N-HSQC φάσμα (Εικόνα 31B). Ωστόσο, μετά από υπέρθεση του φάσματος αυτού με το 1 H- 15 N-HSQC φάσμα της GLIC ΕΚΠ παρατηρείται ότι και σε αυτή την περίπτωση εμφανίζεται το φαινόμενο της μηειδικής επισήμανσης αλλά σε χαμηλότερη έκταση. Σε αυτό το φάσμα υπάρχουν σήματα συντονισμού, τα οποία αντιστοιχούν και σε άλλα αμινοξικά κατάλοιπα εκτός της λευκίνης. 89

102 ΣΤ. Συζήτηση A B Εικόνα 31: Α Υπέρθεση των φασμάτων 1 H- 15 N-HSQC φάσμα της 15 Ν-Val και της 15 Ν-Ile της GLIC ΕΚΠ. Β 1 H- 15 N- HSQC φάσμα για την 15 Ν-Leu Επομένως, ούτε και στην περίπτωση αυτή υπήρχε εξάλειψη του φαινόμενου της μηειδικής επισήμανσης. Έτσι, χρησιμοποιήθηκε διαφορετικός τύπος κυττάρων για την έκφραση της ειδικά επισημασμένης σε 15 Ν-Leu πρωτεΐνης, τα αυξοτροφικά κύτταρα και η διαδικασία περιγράφεται στο Δ Στο 1 H- 15 N-HSQC φάσμα, το οποίο προέκυψε από τη διαδικασία αυτή και παρουσιάζεται παρακάτω (Εικόνα 32), φαίνεται να επιτυγχάνεται η επιλεκτική 15 Ν-επισήμανση για τη λευκίνη. Α Β Εικόνα 32: Α 1 H- 15 N-HSQC φάσμα για την 15 Ν-Leu σε αυξοτροφικά κύτταρα. Β 1 H- 15 N-HSQC φάσμα για την 15 Ν-Leu σε πρωτοτροφικά κύτταρα. 90

103 ΣΤ. Συζήτηση Μετά από υπέρθεση του παραπάνω φάσματος με το 1 H- 15 N-HSQC φάσμα της GLIC ΕΚΠ εντοπίζονται τα σήματα συντονισμού για τα αμινοξικά κατάλοιπα λευκίνης και σε συνδυασμό με τα τρισδιάστατα ετεροπυρηνικά φάσματα, τα οποία συνδυάζουν το κάθε αμινοξύ με το προηγούμενό του εντοπίζεται η θέση της κάθε λευκίνης στην αλληλουχία της πρωτεΐνης. Επομένως, με αυτό τον τρόπο επιτυγχάνεται η σωστή ταυτοποίηση και επιβεβαίωση των αμινοξικών καταλοίπων λευκίνης. Ε.3.5. Επιλεκτική 15 Ν-επισήμανση και αντίστροφη επισήμανση της βαλίνης Στο φάσμα 1 H- 15 N-HSQC της GLIC ΕΚΠ με επιλεκτική αντίστροφη επισήμανση της βαλίνης φαίνεται να λείπουν κάποια σήματα συντονισμού, τα οποία αντιστοιχούν όχι μόνο στα αμινοξικά κατάλοιπα βαλίνης αλλά και σε άλλα αμινοξέα. Αυτό διαπιστώνεται μετά από υπέρθεση του φάσματος αυτού με το 1 H- 15 N-HSQC φάσμα της GLIC ΕΚΠ. Επομένως, από το φάσμα αυτό δεν ήταν δυνατόν να ληφθούν σαφή και ασφαλή συμπεράσματα και καθιστά τη συγκεκριμένη μέθοδο επιλεκτικής επισήμανσης της βαλίνης ανεπιτυχή. Τα περισσότερα από τα επιπλέον σήματα συντονισμού, τα οποία εξαφανίζονται, εκτός από αυτά που αντιστοιχούν στη βαλίνη, ανήκουν κυρίως σε αμινοξικά κατάλοιπα λευκίνης και ισολευκίνης. Τα ίδια σήματα, τα οποία εξαφανίζονται στο παραπάνω φάσμα, θα εμφανίζονταν αν πραγματοποιούνταν επιλεκτική 15 Ν-επισήμανση σε πρωτοτροφικά κύτταρα με προσθήκη 15 N-Val. Για να αποφευχθεί η μη-ειδική επισήμανση της λευκίνης και της ισολευκίνης, εκτός από την προσθήκη 15 N-Val στην καλλιέργεια προστίθεται 14 N-Leu και 14 N-Ile. Με αυτό τον τρόπο τα βακτήρια λαμβάνουν έτοιμα τα αμινοξέα λευκίνη και ισολευκίνη και δε χρειάζεται να τα βιοσυνθέσουν από την 15 N-Val. Επομένως, η μη-ειδική επισήμανση μειώνεται και το φάσμα 1 H- 15 N-HSQC της GLIC ΕΚΠ με επιλεκτική 15 N-επισήμανση της βαλίνης (Εικόνα 33) μπορεί να αξιοποιηθεί για την ταυτοποίηση και επιβεβαίωση των αμινοξικών καταλοίπων βαλίνης (μετά από υπέρθεση του φάσματος αυτού με το 1 H- 15 N-HSQC φάσμα της GLIC ΕΚΠ ). Η θέση της κάθε βαλίνης εντοπίζεται με τη χρήση των τρισδιάστατων ετεροπυρηνικών φασμάτων, τα οποία συσχετίζουν το κάθε αμινοξύ με το προηγούμενό του. 91

104 ΣΤ. Συζήτηση Α Β Εικόνα 33: Α Υπέρθεση του φάσματος 1 H- 15 N-HSQC για την 15 Ν- Val και του 1 H- 15 N-HSQC φάσματος της GLIC ΕΚΠ. (Σε κύκλο εμφανίζονται τα αμινοξικά κατάλοι πα βαλίνης.) Β 1 H- 15 N-HSQC φάσμα για την επιλεκτική 15 Ν- Val με προσθήκη 14 Ν- Leu και 14 Ν- Ile. Ε.3.6. Επιλεκτική 15 Ν-επισήμανση της GLIC ΕΚΠ με 15 N-Ile Τα αμινοξέα λευκίνη, βαλίνη και ισολευκίνη συνδέονται μέσω βιοσυνθετικών μονοπατιών, καθώς από το ένα αμινοξύ βιοσυντίθενται τα άλλα δύο. Για να είναι επιτυχής η επιλεκτική επισήμανση για την ισολευκίνη, μαζί με την 15 N-Ile προστίθεται 14 N-Leu και 14 N- Val. Στο 1 H- 15 N-HSQC φάσμα παρατηρούνται τα σήματα συντονισμού, τα οποία αντιστοιχούν στα αμινοξικά κατάλοιπα ισολευκίνης (Εικόνα 34). Μετά από υπέρθεση του φάσματος αυτού με το 1 H- 15 N-HSQC φάσμα της GLIC ΕΚΠ εντοπίζονται τα σήματα συντονισμού που αντιστοιχούν στα αμινοξικά κατάλοιπα ισολευκίνης. Στη συνέχεια, με τη βοήθεια τρισδιάστατων ετεροπυρηνικών φασμάτων, τα οποία συσχετίζουν το κάθε αμινοξύ με το προηγούμενό του. Έτσι, εντοπίζεται η θέση της κάθε ισολευκίνης στην αλληλουχία της GLIC ΕΚΠ. 92

105 ΣΤ. Συζήτηση Α Β Εικόνα 34: Α Υπέρθεση του φάσματος 1 H- 15 N-HSQC για την 15 Ν-Ile και του 1 H- 15 N-HSQC φάσματος της GLIC ΕΚΠ. (Σε κύκλο εμφανίζονται τα αμινοξικά κατάλοιπα ισολευκίνης.) Β 1 H- 15 N-HSQC φάσμα για την επιλεκτική 15 Ν- Ile με προσθήκη 14 Ν- Leu και 14 Ν- Val. Ε.3.7. Επιλεκτική αντίστροφη επισήμανση και επιλεκτική 15 Ν-επισήμανση της φαινυλαλανίνης (Phe)/ αλανίνης (Ala) Αρχικά, τόσο για τη φαινυλαλανίνη (Phe) όσο και για την αλανίνη (Ala), πραγματοποιήθηκε επιλεκτική αντίστροφη επισήμανση και λήφθησαν τα αντίστοιχα φάσματα. Σε αυτά τα 1 H- 15 N-HSQC φάσματα παρατηρείται το φαινόμενο της μηειδικής επισήμανσης εκτεταμένο σε αρκετούς τύπους αμινοξέων. Επομένως, πραγματοποιήθηκε προσπάθεια επιλεκτικής επισήμανσης με τη χρήση αυξοτροφικών κυττάρων, DL39(DE3), όπως περιγράφεται στο Δ.13.2 και Δ Στα 1 H- 15 N-HSQC φάσματα των δύο επιλεκτικά επισημασμένων αμινοξέων (Phe και Ala, Εικόνες 35 και 36, αντίστοιχα) παρατηρείται ότι το φαινόμενο της μη-ειδικής επισήμανσης εκλείπει και αυτή η μέθοδος επισήμανσης είναι επιτυχημένη. Μετά από υπέρθεση του κάθε φάσματος με το 1 H- 15 N-HSQC φάσμα της GLIC ΕΚΠ εντοπίζονται τα αμινοξικά κατάλοιπα φαινυλαλανίνης και αλανίνης. Η θέση του κάθε αμινοξέος στην αλληλουχία της πρωτεΐνης εντοπίζεται μέσω των τρισδιάστατων ετεροπυρηνικών φασμάτων, τα οποία συσχετίζουν το κάθε αμινοξύ με το προηγούμενό του. Με τη διαδικασία αυτή ταυτοποιήθηκαν τρία αμινοξικά κατάλοιπα φαινυλαλανίνης και 93

106 ΣΤ. Συζήτηση επιβεβαιώθηκαν άλλα τρία. Αντίστοιχα, με τη διαδικασία αυτή ταυτοποιήθηκαν και επιβεβαιώθηκαν κάποια αμινοξικά κατάλοιπα αλανίνης. Α Β Εικόνα 35: Α Υπέρθεση του φάσματος 1 H- 15 N-HSQC για την 15 Ν-Phe και του 1 H- 15 N-HSQC φάσματος της GLIC ΕΚΠ. (Σε κύκλο εμφανίζονται τα αμινοξικά κατάλοι πα φαινυλαλανίνης.) Β 1 H- 15 N-HSQC φάσμα γι α την επιλεκτικά επισημασμένη GLIC ΕΚΠ σε 15 Ν- Phe. Εικόνα 36: 1 H- 15 N-HSQC φάσμα για την 15 Ν-Ala. 94

107 ΣΤ. Συζήτηση Ε.3.8. Επιλεκτική 15 Ν-επισήμανση της τυροσίνης Η διαδικασία επιλεκτικής 15 Ν-επισήμανσης των αμινοξικών καταλοίπων τυροσίνης που επιλέχθηκε περιγράφεται στο Δ.15 και για την επιλογή της σημαντικό στοιχείο αποτέλεσε η θέση της τυροσίνης στο χάρτη βιοσύνθεσης των αμινοξέων. Το 1 H- 15 N-HSQC φάσμα, το οποίο προέκυψε (Εικόνα 37) περιελάμβανε μόνο τις κορυφές που αντιστοιχούν στα αμινοξικά κατάλοιπα τυροσίνης. Αυτά εντοπίζονται στο 1 H- 15 N-HSQC φάσμα της GLIC ΕΚΠ μετά από υπέρθεση των δύο φασμάτων. Εικόνα 37: 1 H- 15 N-HSQC φάσμα για την 15 Ν-Tyr της GLIC ΕΚΠ. Η θέση του κάθε αμινοξικού καταλοίπου στην αλληλουχία βρέθηκε με τη βοήθεια των τρισδιάστατων ετεροπυρηνικών φασμάτων. Με αυτό τον τρόπο ταυτοποιούνται και επιβεβαιώνονται ορισμένα αμινοξικά κατάλοιπα τυροσίνης. 95

108 ΣΤ. Συζήτηση Ε.3.9. Επιλεκτική 15 Ν-επισήμανση του γλουταμινικού οξέος και του ασπαραγινικού οξέος Επειδή, τόσο από το γλουταμινικό οξύ (Glu) όσο και από το ασπαραγινικό οξύ (Asp) συντίθενται αρκετά αμινοξέα, η επιλεκτική 15 Ν-επισήμανση τους είναι αρκετά δύσκολο να επιτευχθεί, εξαιτίας της μεγάλης έκτασης του φαινομένου της μη-ειδικής επισήμανσης. Για το λόγο αυτό πραγματοποιήθηκε επιλεκτική 15 Ν-επισήμανση για αυτά τα αμινοξέα με τη χρήση των αυξοτροφικών κυττάρων, DL39(DE3) (όπως περιγράφεται στα Δ.15, Δ.16). Στα 1 H- 15 N-HSQC φάσματα που αντιστοιχούν στην επιλεκτική επισήμανση του καθενός αμινοξέος (Εικόνες 38, 39) παρατηρείται το φαινόμενο της μη-ειδικής επισήμανσης εκτεταμένο σε ένα πλήθος διαφορετικών τύπων αμινοξέων. Εικόνα 38: 1 H- 15 N-HSQC φάσμα για την 15 Ν-Glu της GLIC ΕΚΠ. 96

109 ΣΤ. Συζήτηση Εικόνα 39: 1 H- 15 N-HSQC φάσμα για την 15 Ν-Asp της GLIC ΕΚΠ. Επομένως, από τα φάσματα αυτά δεν ήταν δυνατό να εξαχθούν σαφή συμπεράσματα, καθώς η μέθοδος επιλεκτικής 15 Ν-επισήμανσης δεν ήταν επιτυχημένη. 97

110 ΣΤ. Συζήτηση Ε.4. Λήψη NMR φασμάτων μετά την αύξηση της θερμοκρασίας του πρωτεϊνικού δείγματος Η λήψη των παραπάνω NMR φασμάτων της πρωτεΐνης GLIC ΕΚΠ πραγματοποιήθηκε σε θερμοκρασία περιβάλλοντος Τ=298 Κ (δηλαδή 25 ο C). Σε αυτή τη θερμοκρασία η πρωτεΐνη βρίσκεται ανάμεσα σε δύο διαφορετικές διαμορφωτικές καταστάσεις. Η διαμορφωτική ανταλλαγή μεταξύ των δύο καταστάσεων στη θερμοκρασία αυτή πραγματοποιείται σε μια ενδιάμεση συχνότητα στη χρονική κλίμακα του NMR. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα την εμφάνιση αδύναμων σημάτων συντονισμού στα NMR φάσματα, τα οποία οφείλονται στη διεύρυνση των κορυφών συντονισμού, ενώ κάποια ΗΝ σήματα δεν εμφανίζονται. Με την αύξηση της θερμοκρασίας η ανταλλαγή μεταξύ των δύο διαμορφώσεων πραγματοποιείται γρήγορα στη χρονική κλίμακα του NMR. Έτσι, πραγματοποιείται γρήγορη ανταλλαγή των πυρήνων μεταξύ δύο διαμορφωτικών καταστάσεων και κάποια από τα σήματα, τα οποία δεν εμφανιζόταν προηγουμένως εξαιτίας της μεγάλης διεύρυνσης των κορυφών, με αυτό τον τρόπο εμφανίζονται. Πραγματοποιήθηκε λήψη NMR φασμάτων, στα οποία είχαν επισημανθεί επιλεκτικά αμινοξέα, σε θερμοκρασίες Τ=298 Κ και Τ=308 Κ. Συγκρίνοντας τα φάσματα για το ίδιο επιλεκτικά επισημασμένο 15 Ν-αμινοξύ σε διαφορετικές θερμοκρασίες (Εικόνες 40-42) παρατηρείται ότι εμφανίζονται νέες κορυφές συντονισμού οι οποίες αντιστοιχούν στο αμινοξύ και οι οποίες δεν εμφανιζόταν στα φάσματα τα οποία λήφθησαν σε Τ=298 Κ. Α Β Εικόνα 40: 1 H- 15 N-HSQC φάσμα για την 15 N-Tyr σε θερμοκρασίες Α Τ=298 Κ και Β Τ=308 Κ. 98

111 Α Β ΣΤ. Συζήτηση Α Εικόνα 41: 1 H- 15 N-HSQC φάσμα για την 15 N-Ala σε θερμοκρασίες Α Τ=298 Κ και Β Τ=308 Κ Σε κύκλο παρουσιάζονται οι κορυφές, οι οποίες αυξάνουν την έντασή τους σημαντικά με την αύξηση της θερμοκρασίας. Β Εικόνα 42: 1 H- 15 N-HSQC φάσμα για την 15 N-Leu σε θερμοκρασίες Α Τ=298 Κ και Β Τ=308 Κ. Σε κύκλο παρουσιάζονται οι κορυφές, οι οποίες αυξάνουν την έντασή τους σημαντικά με την αύξηση της θερμοκρασίας. Με αυτό τον τρόπο, ταυτοποιούνται και επιβεβαιώνονται επιπλέον συχνότητες συντονισμού αμιδικών ΗΝ των αμινοξέων αυτών. Το πρόβλημα, το οποίο παρουσιάζεται στην περίπτωση αυτή είναι ότι η πρωτεΐνη καταβυθίζεται και πρωτεολύεται γρηγορότερα όταν αυξάνεται η θερμοκρασία. Aυτό αναμένεται να επιλυθεί με τη χρήση του αντιδραστηρίου «choline o-sulphate», το οποίο χρησιμοποιείται για την αύξηση της ανθεκτικότητας σε υψηλές θερμοκρασίες και δείχνει να σταθεροποιεί την πρωτεΐνη. Επομένως, μελλοντικά θα πραγματοποιηθούν προσπάθειες να ληφθούν φάσματα σε θερμοκρασία Τ=308 Κ, στα οποία να 99

112 ΣΤ. Συζήτηση εμφανίζονται περισσότερα σήματα συντονισμού και να εντοπίζονται περισσότερα αμινοξέα. Ε.5. Ανάλυση κυκλικού διχρωισμού της GLIC ΕΚΠ Η φασματοσκοπία κυκλικού διχρωισμού εκμεταλλεύεται τη διαφορά στην απορρόφηση μεταξύ των δύο φορών κυκλικά πολωμένου φωτός από μόρια που περιέχουν ασύμμετρα κέντρα. Η μεταβολή της διαφοράς απορρόφησης του αριστερόστροφα κυκλικά πολωμένου φωτός από το δεξιόστροφα (ΔΑ=ΑL-AR) σε σχέση με το μήκος κύματος είναι πλούσια σε πληροφορία σχετικά με τη δευτεροταγή δομή πρωτεϊνών στην περιοχή του απώτερου υπεριώδους (far-uv). Από φάσματα CD μπορεί να πιστοποιηθεί η αναδίπλωση μιας πρωτεΐνης, αλλά και να εκτιμηθεί το ποσοστό συμμετοχής κάθε επιμέρους τύπου δευτεροταγούς δομής στη συνολική δομή. Δείγματα πρωτεΐνης συγκέντρωσης 20-50μΜ χρησιμοποιήθηκαν για τη λήψη φασμάτων κυκλικού διχρωισμού (ΔΑ vs. λ) και θερμικής αποδιάταξης (ΔΑλ vs. Τ). Η περιοχή του φάσματος που σαρώθηκε αντιστοιχούσε στα nm. Χρησιμοποιήθηκαν κυψελίδες quartz-suprasil (HELLMA) οπτικών διαδρομών cm. Τα φάσματα καταγράφηκαν σε φασματοπολωσίμετρα Jasco J-810 (ΕΚΕΦΕ ΔΗΜΟΚΡΙΤΟΣ) συνδεδεμένα με συσκευή ελέγχου θερμοκρασίας τύπου Peltier. Η προτυποποίηση (standardization) και η συντήρηση των οργάνων έγινε με χρήση διαλυμάτων καμφοροσουλφονικού οξέος. Έτσι, χρησιμοποιώντας φασματοσκοπία κυκλικού διχρωϊσμού τεκμηριώθηκε η αναδίπλωση του μορίου σε επίπεδο δευτεροταγούς δομής, με συνεισφορά σε αυτή 48% της β- πτυχωτής επιφάνειας. 100 Εικόνα 43: Φάσμα κυκλικού διχρωισμού της GLIC ΕΚΠ σε ph 7, 298 K (20 mm TrisHCl).

113 ΣΤ. Συζήτηση Ενότητα ΣΤ Συζήτηση 101

114 ΣΤ. Συζήτηση 102

115 ΣΤ. Συζήτηση ΣΤ. Συζήτηση Τα πενταμερή ιοντικά κανάλια, τα οποία ενεργοποιούνται μετά από δέσμευση προσδέτη (plgics) της οικογένειας Cys-θηλιάς είναι διαμεμβρανικές γλυκοπρωτεΐνες, οι οποίες εμπλέκονται σε μεγάλη ποικιλία βιολογικών λειτουργιών. Οι νικοτινικοί υποδοχείς ακετυλοχολίνης (nachr) αποτελούν το κύριο μέλος των διαμεμβρανικών πρωτεΐνών αυτής της οικογένειας. Πολλά μέλη της οικογένειας αυτής χαρακτηρίζονται από μια συντηρημένη αλληλουχία 13 αμινοξικών καταλοίπων, τα οποία σχηματίζουν μια θηλιά και μεταξύ των δύο αμινοξικών καταλοίπων κυστεΐνης στο Ν-τελικό άκρο της κάθε υπομονάδας σχηματίζεται ένας δισουλφιδικός δεσμός. Οι εξωκυττάριες περιοχές (ΕΚΠ, ~210 αμινοξικά κατάλοιπα) περιλαμβάνουν περιοχές πρόσδεσης για αγωνιστές, συναγωνιστικούς αγωνιστές και ανταγωνιστές. Πρόσδεση ενός αγωνιστή προκαλεί γρήγορο άνοιγμα του διαμεμβρανικού ιοντικού καναλιού και οδηγεί σε μια αλλαγή στο δυναμικό της μεμβράνης. Πρόσφατα, έχουν προσδιοριστεί οι κρυσταλλικές δομές των εξωκυττάριων περιοχών σε χαμηλή και υψηλή διακριτικότητα παρέχοντας μια άποψη για τις δομές σε ατομικό επίπεδο και συγκεκριμένα για την αρχιτεκτονική αυτών των πενταμερών συστημάτων. Μέχρι πρόσφατα δεν υπήρχε αναφορά για τη δομή των συστημάτων αυτών σε διάλυμα καθώς και για τη δυναμική της πρωτεΐνης εξαιτίας της τάσης τους να σχηματίζουν ολιγομερή. Αυτός είναι ο κύριος λόγος για τον οποίο εμποδίζεται η μελέτη των plgics με φασματοσκοπία NMR, μέχρι σήμερα. Η εξωκυττάρια περιοχή του βακτηριακού ομολόγου του νικοτινικού υποδοχέα ακετυλοχολίνης (nachr) από το Gloeobacter violaceus (GLIC) έχει πρόσφατα κρυσταλλωθεί και εμφανίζει μια απροσδόκητη τεταρτοταγή δομή εξαμερούς, ενώ στο διάλυμα συμπεριφέρεται ως μονομερές. Στη μελέτη αυτή παρουσιάζεται η NMR διαμόρφωση σε διάλυμα καθώς και οι ιδιότητες δυναμικής του μορίου της GLIC ΕΚΠ (193 αμινοξικά κατάλοιπα με μια C-τελική Gly 2 His 6 επίτοπο) βασισμένη στην ταυτοποίηση των πυρήνων σε ποσοστό 80% της κύριας αλυσίδας (με εξαίρεση 11 αμινοξικά κατάλοιπα προλίνης, Εικόνα 51). Οι μη επιθυμητές ιδιότητες αποδιέγερσης εμποδίζουν μια ολοκληρωμένη ταυτοποίηση των σημάτων συντονισμού της GLIC ΕΚΠ. Ακόμη και σε μαγνητικό πεδίο 900MHz, το 1 Η- 15 Ν ετεροπυρηνικό φάσμα δύο διαστάσεων, HSQC/TROSY φάσμα της GLIC ΕΚΠ 103

116 ΣΤ. Συζήτηση περιλαμβάνει μόνο 145 από τα 190 σήματα συντονισμού των αμιδίων τα οποία αναμένονται στο φάσμα. Βασικά NMR πειράματα τριών διαστάσεων με 2 Η, 13 C, 15 N- επίσημανση των δειγμάτων της GLIC ΕΚΠ επιτρέπει την ταυτοποήση των πυρήνων του σκελετού 110 αμινοξικών καταλοίπων. Για να επιβεβαιωθεί και να επεκταθεί αυτή η ταυτοποίηση των πυρήνων, πραγματοποιήθηκαν πειράματα επιλεκτικής 15 Ν- επισήμανσης και / ή αντίστροφης επισήμανσης για 12 αμινοξέα (Ala, Leu, Ile, Val, Phe, Tyr, Asn, His, Lys, Arg, Asp και Glu) σύμφωνα με γνωστές στρατηγικές ή στρατηγικές οι οποίες έχουν τροποποιηθεί και περιγράφονται στα Δ.7-Δ.16 (Πίνακας 1 και 2). Πίνακας 1: Συνοπτική απεικόνιση της προσπάθειας για επιλεκτική επισήμανση της GLIC ΕΚΠ. σε πρωτοτροφικά κύτταρα BL21(DE3) 15 N επιλεκτική επισήμανση με τη χρήση πρωτοτροφικών βακτηριακών κυττάρων E. coli BL21(DE3): Αμινοξύ 14 N (αντίστροφη επισήμανση) 15 N επισήμανση Μη-ειδική επισήμανση Leu + Arg - Val + Phe + Lys - Ala + Lys - Leu + 15 N Leu+ 14 N (Val+Ile) + 15 N Val + 14 N (Leu+Val) - 15 N Ile + 14 N ( Leu+Val) - His - Asn - 104

117 ΣΤ. Συζήτηση Πίνακας 2: Συνοπτική απεικόνιση της προσπάθειας για επιλεκτική επισήμανση της GLIC ΕΚΠ. σε αυξοτροφικά κύτταρα DL39(DE3) 15 N επιλεκτική επισήμανση με τη χρήση αυξοτροφικών βακτηριακών κυττάρων E. coli DL39(DE3): Αμινοξύ 15 N επισήμανση Μη-ειδική επισήμανση Leu - Phe - Ala - Tyr - Asp + Glu + Αποτελεσματική αντίστροφη επισήμανση της 15 Ν-GLIC ΕΚΠ πραγματοποιήθηκε για τα αμινοξέα Arg, Lys, His και Asn στα βακτηριακά κύτταρα Escherichia coli, στην κυτταρική σειρά BL21(DE3). Επιτυχής επιλεκτική 15 Ν-επισήμανση στα κύτταρα Escherichia coli, στην κυτταρική σειρά πρωτοτροφικών κυττάρων BL21(DE3) επιτεύχθηκε για τα αμινοξέα Lys, Val και Ile (παρουσία 14 Ν-επισημασμένων αμινοξέων για να αποφευχθεί το φαινόμενο της μη-ειδικής επισήμανσης). Επιτυχής επιλεκτική 15 Ν-επισήμανση της GLIC ΕΚΠ για τα αμινοξέα Leu, Ala, Phe, Tyr, Asp και Glu επιτεύχθηκε στα αυξοτροφικά κύτταρα Escherichia coli, DL39(DE3). Συνολικά, η επιλεκτική επισήμανση παρείχε την ταυτοποίηση 34 νέων σημάτων συντονισμού των αμιδίων του σκελετού της GLIC ΕΚΠ. Τα 1 Η- 15 Ν-HSQC / TROSY φάσματα της επιλεκτικής 15 Ν-επισήμανσης των δειγμάτων της GLIC ΕΚΠ σε 298 και 308 Κ απέδειξε ότι η διαδικασία διαμορφωτικής ανταλλαγής σε αρκετά τμήματα της πρωτεΐνης αποτελεί μαζί με το χρόνο Τ 2 το λόγο της γρήγορης αποδιέγερσης. Με τον τρόπο αυτό, εμποδίζεται η ολοκληρωμένη ταυτοποίηση των πυρήνων, καθώς 36 ΗΝ σήματα συντονισμού δεν διακρίνονταν στα 298 Κ. Στα 308 Κ αρκετά ασθενή σήματα συντονισμού ενισχύονται σε ένταση και 105

118 ΣΤ. Συζήτηση νέα σήματα συντονισμού, τα οποία δεν εμφανίζονταν καθόλου στους 298 Κ εμφανίστηκαν (Εικόνα 44). Γ Εικόνα 44: Α Υπέρθεση των 1 Η- 15 Ν-HSQC φάσματα της GLIC ΕΚΠ με επιλεκτική 15 Ν-Ala και 15 Ν-Leu στους 298 Κ. Β 1 Η- 15 Ν-HSQC φάσμα της GLIC ΕΚΠ με επιλεκτική 15 Ν-Ala στους 308 Κ. Γ 1 Η- 15 Ν-HSQC φάσμα της GLIC ΕΚΠ με επιλεκτική 15 Ν-Leu στους 308 Κ. Το γεγονός αυτό ήταν αρκετά βοηθητικό για τη ταυτοποίηση των πυρήνων σε ορισμένες περιπτώσεις (π.χ. στην ταυτοποίηση της Tyr29). Παρά τις προσπάθειες επισήμανσης υπάρχουν 39 μη-ταυτοποιημένα σήματα συντονισμού αμινοξικών καταλοίπων εξαιρουμένων των προλινών, οι οποίες δε διαθέτουν αμιδικό ΗΝ (Εικόνα 45). Τα περισσότερα μη-ταυτοποιημένα αμινοξικά κατάλοιπα εντοπίζονται στην Ν-τελική περιοχή και κυρίως στη β1-β2 θηλιά, στο πρώτο μισό της β2-πτύχωσης, στον πυρήνα της β5-πτύχωσης, δύο αμινοξικά κατάλοιπα σε καθένα από τις β6 και β7-πτυχώσεις, ορισμένα τμήματα της β9- πτύχωσης, καθώς επίσης και της β9-β10 θηλιάς (θηλιά C) και το πρώτο τμήμα της β10 πτύχωσης. 106

119 ΣΤ. Συζήτηση Εικόνα 45: Τοπολογικό διάγραμμα της GLIC ΕΚΠ στο οποίο περιγράφονται σχηματικά τα ταυτοποιημένα τμήματα της GLIC ΕΚΠ. Με γκρι χρώμα εμφανίζονται οι περιοχές οι οποίες συνδέουν μεταξύ τους τις β- πτυχώσεις, με μπλε χρώμα εμφανίζεται το εσωτερικό β-φύλλο, με πορτοκαλί το εξωτερικό β-φύλλο και με ανοιχτό μπλε ή κίτρινο οι περιοχές οι οποίες δεν έχουν ταυτοποιυθεί. Στο κρυσταλλικό μοντέλο της GLIC, η β1-β2 θηλιά και η β5-β6 θηλιά ανήκουν στο εσωτερικό β-φύλλο (Εικόνα 45), το οποίο αλληλεπιδρά με τη διαμεμβρανική περιοχή, ενώ το C-τελικό άκρο καταλήγει στις β7 και β9 πτυχώσεις και στο πρώτο τμήμα της β10-πτύχωσης, τα οποία σχηματίζουν το άνω τμήμα του εξωτερικού β-φύλλου. Επιπλέον, μη-ταυτοποιημένα αμινοξικά κατάλοιπα βρίσκονται στη β4-β5 θηλιά και στο αρχικό τμήμα της Cys-θηλιάς (β6-β7 θηλιά). Η πρόβλεψη της δευτεροταγούς δομής της μονομερούς GLIC ΕΚΠ (η οποία πραγματοποιήθηκε μέσω του υπολογιστικού προγράμματος PECAN, Εικόνα 46) στηρίζεται στην ανάλυση των χημικών μετατοπίσεων και έρχεται σε συμφωνία με τα στοιχεία δευτεροταγούς δομής, τα οποία παρατηρούνται στην κρυσταλλική δομή του πενταμερούς της GLIC και του εξαμερούς της GLIC ΕΚΠ. Επομένως, η κυρίαρχη β- 107

120 ΣΤ. Συζήτηση δομή είναι ανεξάρτητη από την κατάσταση ολιγομερισμού. Αυτό επιβεβαιώνεται, επίσης, από τις μετρήσεις κυκλικού διχρωισμού σε ph 7,0 (εικόνα 43), οι οποίες τεκμηριώνουν την αναδίπλωμένη μορφή του μορίου σε επίπεδο δευτεροταγούς δομής με ποσοστό της β-πτυχωτής επιφάνειας 48%. Το ποσοστό είναι σχεδόν ταυτόσημο με το β-φύλλο το οποίο περιέχεται στην GLIC ΕΚΠ και στις δύο κρυσταλλικές δομές (48-50%). Η δυναμική του σκελετού της GLIC ΕΚΠ σε κλίμακα χρόνου από pico- σε nanosecond μελετήθηκε μέσω της ανάλυσης της αποδιέγερσης των πυρήνων και των σταθερών αποδιέγερσης R 1 (1/T 1, όπου Τ 1 ο χρόνος αποδιέγερσης μέσω του spinπλέγματος), R 2 (1/T 2, όπου Τ 2 ο χρόνος αποδιέγερσης μέσω του spin-spin) και του ετεροπυρηνικού 1 Η Ν 15 Ν NOEs (αλληλεπίδραση μεταξύ δύο πυρήνων ΗΝ). Ο λόγος των σταθερών αποδιέγερσης R 2 /R 1 για το μόριο της GLIC ΕΚΠ υπολογίστηκε 11,1±0,3ns και αποδεικνύει ότι η GLIC ΕΚΠ είναι σε κατάσταση μονομερούς. Αν και τα R 2 /R 1 δεδομένα (Εικόνα 46) δείχνουν υπολογίσιμη αστάθεια, ορισμένα ευκίνητα τμήματα (χαμηλότερες τιμές R 2 /R 1 ) ή σταθερά τμήματα (υψηλότερες τιμές R 2 /R 1 ) ήταν εφικτό να ταυτοποιηθούν. Για παράδειγμα, το Ν-τελικό τμήμα της GLIC ΕΚΠ είναι περισσότερο ευέλικτο από το C-τελικό. Χαμηλή ευκινησία (υψηλές R 2 /R 1 τιμές) μπορεί να αποδοθεί στις πτυχώσεις β1, β6, β7 και β9. Αντίθετα, τμήματα τα οποία συνδέουν τις β2-β3 πτυχώσεις, τμήματα του φύλου β4, της Cys-θηλιάς (β6-β7 θηλιά), της β7-β8 θηλιάς και τα γειτονικά τμήματα της C-θηλιάς (β9-β10 θηλιά) φαίνεται να είναι ευκίνητα. 108

121 ΣΤ. Συζήτηση Εικόνα 46: Τιμές 15 N R 1, R 2 και ετεροπυρηνικού 1 H N 15 N NOE 109

122 ΣΤ. Συζήτηση αλληλουχία Εικόνα 47: Α Δευτεροταγής δομή μέσω του PECAN σε σύγκριση με τη δευτεροταγή δομή του εξαμερούς της GLIC ΕΚΠ Β Τιμές R 2 /R 1 (η διακεκομμένη γραμμή αντιπροσωπεύει το μέσο όρο του R 2 /R 1 ) Αξιοσημείωτο είναι ότι σύμφωνα με τις 15 Ν σταθερές αποδιέγερσης, τα ευκίνητα τμήματα της GLIC ΕΚΠ συνορεύουν με τις περισσότερες μη-ταυτοποιημένες περιοχές, οι οποίες υφίστανται διαμορφωτική ανταλλαγή σε ενδιάμεση κλίμακα χρόνου NMR. Η δομή της μονομερούς GLIC ΕΚΠ (Εικόνα 48), η οποία είναι εκτεθειμένη σε νερό όπως παρατηρήθηκε σε πειράματα προσομοίωσης μοριακής δυναμικής 10ns (MD) έρχονται σε πλήρη συμφωνία με τις 15 Ν σταθερές αποδιέγερσης. Ο συντελεστής απόκλισης RMSD (Root-Mean Square Deviation) κυμαίνεται σε τιμές, οι οποίες εμπλέκουν υψηλή κινητικότητα του Ν-τελικού άκρου της GLIC ΕΚΠ, την άκρη της β1-β2 110

123 ΣΤ. Συζήτηση θηλιάς και τη β3-β4 θηλιά, τη Cys-θηλιά, το πρώτο τμήμα της β9-πτύχωσης και τη C-θηλιά ( Εικόνα 48). Εικόνα 48: Τιμές ατομικής RMS (Root Mean Square) διακύμανσης το οποίο προέρχεται από υπολογισμούς προσομοίωσης μοριακής δυναμικής (MD) σε 10ns της GLIC εκπ σε νερό. Μη ταυτοποιημένα τμήματα της GLIC ΕΚΠ παρατίθεται για σύγκριση. Πληροφορίες για την κινητικότητα της GLIC ΕΚΠ σε κλίμακα χρόνου από λεπτά μέχρι μέρες προέρχονται από ένα πείραμα H-D ανταλλαγής, στο οποίο το 1 H- 15 N-HSQC φάσμα σε 298 Κ καταγράφηκε από λυοφιλοποιημένο δείγμα πρωτεΐνης, το οποίο είχε διαλυθεί σε 100% D 2 O. Το πρώτο φάσμα μετά από ανταλλαγή πυρήνων για 90 λεπτά περιελάμβανε μόνο 19 ΗΝ σήματα συντονισμού του σκελετού, τα περισσότερα από τα οποία ανήκουν σε αμινοξικά κατάλοιπα στο άνω τμήμα του 111

124 ΣΤ. Συζήτηση εσωτερικού β-φύλλου και των συμπεριλαμβανομένων θηλιών (Εικόνα 49). Επομένως, μόνο οι ομάδες ΗΝ αυτού του τμήματος του σκελετού της GLIC ΕΚΠ εμπλέκονται στην κινητική σταθερότητα των δεσμών υδρογόνου. Το υπόλοιπο τμήμα της πρωτεΐνης είναι ευκίνητο σε κλίμακα χρόνου ωρών. Γ Δ Εικόνα 49: Ανταλλαγή H-D της GLIC ΕΚΠ η οποία παρ ακολουθείται μέσω 1 H- 15 N HSQC φάσματος Α 1 H- 15 N HSQC φάσμα της δευτεριωμένης GLIC ΕΚΠ (600 MHz; 50 mm KP i, ph 7.0, 298 K), B 1 H- 15 N HSQC φάσμα της GLIC ΕΚΠ μετά από 90min μετά από ΗD ανταλλαγή Γ 1 H- 15 N HSQC φάσμα της GLIC ΕΚΠ μετά από 23h μετά από ΗD ανταλλαγή Δ 1 H- 15 N HSQC φάσμα της GLIC ΕΚΠ μετά από 6d 20h μετά από ΗD ανταλλαγή. Η δομή του μονομερούς της GLIC ΕΚΠ παρουσιάζεται να είναι καλά αναδιπλωμένη στο διάλυμα, αν και τα πειράματα ανταλλαγής Η-D και τα φάσματα της επιλεκτικής επισήμανσης των δειγμάτων στους 308 Κ αποδεικνύουν ότι ορισμένα 112

125 ΣΤ. Συζήτηση τμήματα της πρωτεΐνης υπόκεινται σε εγγενή κινητικότητα σε διαφορετικές κλίμακες χρόνου NMR. Σύμφωνα με τα NMR δεδομένα, η GLIC ΕΚΠ παρουσιάζει μια δομή β- σάντουιτς, στην οποία το πάνω μέρος του εσωτερικού πυρήνα του β-φύλλου (β1, β2, β5 και β6-πτυχώσεις) και το κεντρικό τμήμα του εξωτερικού β-φύλλου (β4, β7, β9 και β10-πτυχώσεις) ανήκουν στο άκαμπτο τμήμα του μορίου (Εικόνα 50). Εικόνα 50: NMR δυναμική του σκελετού σύμφωνα με τις 15 Ν σταθερές αποδιέγερσης. Με μπλε σκούρο και κόκκινο εμπλέκονται οι τιμές R 2 /R 1 πάνω από το μέσο όρο στο εσωτερικό και εξωτερικό β-φύλλο, αντίστοιχα. Με άσπρο παρουσι άζονται τα ταυτοποιημένα τμήματα για τα οποία το R2/R1 δεν έχει προσδιοριστεί. Αντίθετα, τα ακόλουθα τμήματα παρουσιάζουν υψηλότερη ευκινησία κυρίως σε κλίμακα χρόνου από pico- σε nanosecond: το κατώτερο τμήμα του εσωτερικού β- φύλλου, η β1-β2 θηλιά και τα γειτονικά τμήματα των β-πτυχώσεων β1 και β2, η Cysθηλιά και τμήμα του συνδέτη β8-β9 και η C-θηλιά με τα γειτονικά τμήματα των πτυχώσεων β9 και β10. Τα περισσότερα από αυτά τα τμήματα βρέθηκαν να είναι ευέλικτα ή διαταραγμένα στα κρυσταλλωμένα ολιγομερή. Αυτά βρίσκονται είτε στην περίμετρο της δομής β-σάντουιτς είτε στα τμήματα, τα οποία βρίσκονται σε επαφή με τη διαμεμβρανική μεμβράνη στο πενταμερές της GLIC. Επιπλέον, η β1-β2 θηλιά, τμήματα των πτυχώσεων β5, β6 καθώς και η C-θηλιά υφίστανται διαμορφωτική ανταλλαγή σε κλίμακα χρόνου από microsecond σε millisecond, όπως αποδεικνύεται από την εμφάνιση των NMR σημάτων συγκεκριμένων αμινοξικών καταλοίπων μόνο 113

126 ΣΤ. Συζήτηση στους 308 Κ. Στα κρυσταλλικά μοντέλα, σημαντικά τμήματα των τελευταίων περιοχών ανήκουν στη διεπιφάνεια μεταξύ των υπομονάδων (Εικόνα 51A, 51B). Α Β Εικόνα 51: Τμήματα τα οποία συμμετέχουν στις αλληλεπιδράσεις μεταξύ των υπομονάδων στο εξαμερές (πορτοκαλί και κίτρινο για τη διεπιφάνεια μεταξύ της προηγούμενης και της επόμενης υπομονάδας, αντίστοιχα για το β και με μπλε ανοιχτό για τη διεπιφάνεια με την επόμενη ή την προηγούμενη υπομονάδα για τα α και γ, αντίστοιχα) Τα δεδομένα NMR σχετικά με την κινητικότητα του μονομερούς της GLIC ΕΚΠ στο διάλυμα και τα αντίστοιχα συμπεράσματα σχετικά με την ευελιξία των υπομονάδων του εξαμερούς της GLIC ΕΚΠ και του πενταμερούς της GLIC σε κατάσταση κρυστάλλωσης παρέχουν νέες γνώσεις σχετικά με την υπομονάδα και την οργάνωση του ολιγομερούς. Αρκετές ένδο- και διαμεμβρανικές αλληλεπιδράσεις οι οποίες υφίστανται στο πενταμερές αλλά όχι στο εξαμερές εντοπίζονται στα τμήματα τα οποία εμφανίζουν αργές ή γρήγορες κινήσεις. Για παράδειγμα η β1-β2 θηλιά έρχεται σε επαφή με τη διαμεμβρανική μεμβράνη στο πενταμερές αλλά εμφανίζει ευκινησία στο εξαμερές της GLIC ΕΚΠ, απουσία της διαμεμβρανικής περιοχής. Αυτό πιθανόν σχετίζεται με την απώλεια της γέφυρας άλατος μεταξύ Asp32-Arg192, η οποία υφίσταται στο πενταμερές αλλά στο εξαμερές έχει διασπαστεί. Στο διάλυμα, η β1-β2 θηλιά φαίνεται να υιοθετεί διαφορετική διαμορφωτική κατάσταση και η εξισορρόπηση μεταξύ των δύο καταστάσεων επιτεύχθηκε μετά την αύξηση της θερμοκρασίας. Η β1-β2 θηλιά εμφάνισε υψηλή κινητικότητα, η οποία μπορεί να επηρεάσει, επίσης, τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ των υπομονάδων. Αυτό συμβαίνει καθώς το τμήμα των καταλοίπων Tyr28-Ala41 εμπλέκεται στις αλληλεπιδράσεις μεταξύ των υπομονάδων στο πενταμερές και στο εξαμερές (Εικόνα 50B), ενώ στο μονομερές σε διάλυμα αποκτά ιδιαίτερη ευκινησία. Επιπλέον, τα NMR σήματα συντονισμού των αμινοξικών καταλοίπων Val89-Ile92 της β5-πτυχώσης, τα οποία 114

127 ΣΤ. Συζήτηση συμμετέχουν στη διεπιφάνεια των δύο υπομονάδων και των δύο ολιγομερών δεν ανιχνεύονται στους 298 Κ, γεγονός το οποίο υποδηλώνει έντονα μια διαδικασία ανάμεσα σε δύο καταστάσεις διαμορφωτικής ανταλλαγής στο μονομερές της GLIC ΕΚΠ στο διάλυμα. Επιπροσθέτως, τα σήματα συντονισμού, τα οποία αντιστοιχούν στο άκρο της β6-β7 θηλιάς (Ser112 και His127) παραμένουν μη ανιχνεύσιμα. Αυτά τα αμινοξέα έχει βρεθεί ότι συνδέονται με δεσμούς υδρογόνου στην κρυσταλλική δομή, σταθεροποιώντας έτσι την β6-β7 θηλιά στα βακτηριακά plgics, στα οποία απουσιάζει ο δισουλφιδικός (S-S) δεσμός της Cys-θηλιάς. Σύμφωνα με τις 15 Ν σταθερές αποδιέγερσης, η Cys-θηλιά παρουσιάζει σημαντική ευκινησία σε κλίμακα χρόνου από pico- σε nanosecond. Τελικά, το άκρο της β9-β10 C-θηλιάς (Ala175- Arg179), το οποίο παραμένει μη ταυτοποιημένο σε αρκετές υπομονάδες του εξαμερούς της GLIC ΕΚΠ, έχει ανιχνευθεί και ταυτοποιηθεί στο διάλυμα μέσων στο NMR και δείχνει αξιοσημείωτη κινητικότητα. Τα τμήματα, τα οποία συνδέουν τις πτυχώσεις β9 και β10 δεν είναι ορατά, γεγονός το οποίο υποδηλώνει και πάλι μια διαμορφωτική ανταλλαγή ανάμεσα σε δύο καταστάσεις σε κλίμακα χρόνου micro- σε millisecond. Τα αμινοξικά κατάλοιπα Ala175-Arg179 εμπλέκονται σε αλληλεπιδράσεις μεταξύ δύο υπομονάδων μόνο στο πενταμερές, αλλά εμφανίζονται αρκετά ευκίνητα στο εξαμερές. Το γεγονός αυτό ερμηνεύεται ως μια σημαντική κίνηση προς τα πάνω (όταν το πενταμερές συγκρίνεται με το εξαμερές) ή προς τα κάτω (όταν το εξαμερές συγκρίνεται με το πενταμερές), σύμφωνα με το διαφορετικό τρόπο ολιγομερισμού της GLIC ΕΚΠ. Από τα NMR δεδομένα συμπεραίνεται ότι το άκρο της C-θηλιάς, αν και είναι ευκίνητο, δεν είναι σημαντικό για αυτή τη μετατροπή, η οποία εμφανίζεται να είναι ζωτικής σημασίας για την κατάσταση ολιγομερισμού της GLIC ΕΚΠ. Τα δύο μηταυτοποιημένα τμήματα (Val168-Phe174 και Leu180-Asp185), τα οποία αποτελούν το πάνω μέρος του β9-β10 τμήματος με διαμόρφωση φουρκέτας, φέρει μια εγγενή πλαστικότητα, η οποία μπορεί να επηρεάσει την αλληλεπίδραση υπομονάδαςυπομονάδας (Εικόνα 51Β) και του ολιγομερισμού. Στα δεδομένα της κρυσταλλογραφίας ακτίνων Χ φαίνεται ότι η σύνδεση των γειτονικών υπομονάδων εξαρτάται από τον αποκλεισμό της C-θηλιάς από τη διεπιφάνεια. Μια υψηλή κινητικότητα της θηλιάς και μια κίνηση κάμψης έχει προβλεφθεί από την προσομοίωση μοριακής κινητικής και τη ab initio ανάλυση των κινήσεων/δονήσεων του μορίου (normal-mode analysis). 115

128 ΣΤ. Συζήτηση Συνοπτικά, έχουν εξεταστεί οι δομικές ιδιότητες και η δυναμική του μονομερούς της GLIC ΕΚΠ, στο διάλυμα, με μέγεθος 23kDa. Παρόλο που οι ιδιότητες αποδιέγερσης δεν είναι ευνοϊκές για μια ολοκληρωμένη NMR ανάλυση, τα NMR δεδομένα παρέχουν τη δυνατότητα μελέτης των κινήσεων του μορίου, τα οποία λαμβάνουν χώρα σε ευρύ φάσμα κλίμακας χρόνου, το οποίο κυμαίνεται από pico- σε millisecond. Η συγκεκριμένη μελέτη αποτελεί την πρώτη ταυτοποίηση μιας ΕΚΠ ενός μέλους της οικογένειας των Cys-θηλιάς υποδοχέων σε διάλυμα και την πρώτη λεπτομερή μελέτη της δυναμικής συμπεριφοράς μιας ΕΚΠ. Τα δεδομένα αυτά σε διάλυμα θεωρείται ότι σχετίζονται άμεσα με τη συναρμολόγηση των υπομονάδων της ΕΚΠ των LGIC και τις κινήσεις, οι οποίες είναι σχετικές με τη λειτουργία των υποδοχέων της οικογένειας Cys-θηλιάς. 116

129 Ενότητα Η Βιβλιογραφία 117

130 Η. Βιβλιογραφία 118

131 Η. Βιβλιογραφία Η. Βιβλιογραφία 1. Bocquet, N., et al., A prokaryotic proton-gated ion channel from the nicotinic acetylcholine receptor family. Nature, (7123): p Hansen, S.B., et al., Structures of Aplysia AChBP complexes with nicotinic agonists and antagonists reveal distinctive binding interfaces and conformations. EMBO J, (20): p Connolly, C.N. and K.A. Wafford, The Cys-loop superfamily of ligand-gated ion channels: the impact of receptor structure on function. Biochem Soc Trans, (Pt3): p Sine, S.M., et al., On the origin of ion selectivity in the Cys-loop receptor family. J Mol Neurosci, (1-2): p Hibbs, R.E. and E. Gouaux, Principles of activation and permeation in an anion-selective Cysloop receptor. Nature, (7349): p Changeux, J.P., Allosteric proteins: from regulatory enzymes to receptors--personal recollections. Bioessays, (9): p Changeux, J.P. and S.J. Edelstein, Allosteric mechanisms of signal transduction. Science, (5727): p Karlin, A. and M.H. Akabas, Toward a structural basis for the function of nicotinic acetylcholine receptors and their cousins. Neuron, (6): p Arias, H.R., P. Bhumireddy, and C. Bouzat, Molecular mechanisms and binding site locations for noncompetitive antagonists of nicotinic acetylcholine receptors. Int J Biochem Cell Biol, (8): p Paas, Y., et al., Pore conformations and gating mechanism of a Cys-loop receptor. Proc Natl Acad Sci U S A, (44): p Salussolia, C.L., et al., Arrangement of Subunits in Functional NMDA Receptors. J Neurosci, (31): p Rossmann, M., et al., Subunit-selective N-terminal domain associations organize the formation of AMPA receptor heteromers. EMBO J, (5): p Kawate, T., et al., Crystal structure of the ATP-gated P2X(4) ion channel in the closed state. Nature, (7255): p Betz, H., Ligand-gated ion channels in the brain: the amino acid receptor superfamily. Neuron, (4): p Ortells, M.O. and G.G. Lunt, Evolutionary history of the ligand-gated ion-channel superfamily of receptors. Trends Neurosci, (3): p Tsetlin, V., D. Kuzmin, and I. Kasheverov, Assembly of nicotinic and other Cys-loop receptors. J Neurochem, (5): p Maksay, G., Ligand-gated pentameric ion channels, from binding to gating. Curr Mol Pharmacol, (3): p Le Novere, N., T. Grutter, and J.P. Changeux, Models of the extracellular domain of the nicotinic receptors and of agonist- and Ca2+-binding sites. Proc Natl Acad Sci U S A, (5): p Unwin, N., et al., Nicotinic acetylcholine receptor at 4.6 angstrom resolution: Transverse tunnels in the channel wall. Journal of Molecular Biology, (4): p Schofield, P.R., et al., Sequence and Functional Expression of the Gaba-a Receptor Shows a Ligand-Gated Receptor Super-Family. Nature, (6127): p Grenningloh, G., et al., Glycine vs GABA receptors. Nature, (6143): p Maricq, A.V., et al., Primary structure and functional expression of the 5HT3 receptor, a serotonin-gated ion channel. Science, (5030): p Corringer, P.J., et al., Atomic structure and dynamics of pentameric ligand-gated ion channels: new insight from bacterial homologues. J Physiol, (Pt 4): p

132 Η. Βιβλιογραφία 24. Hilf, R.J. and R. Dutzler, X-ray structure of a prokaryotic pentameric ligand-gated ion channel. Nature, (7185): p Hilf, R.J. and R. Dutzler, Structure of a potentially open state of a proton-activated pentameric ligand-gated ion channel. Nature, (7225): p Bocquet, N., et al., X-ray structure of a pentameric ligand-gated ion channel in an apparently open conformation. Nature, (7225): p Nakamura, Y., et al., Complete genome structure of Gloeobacter violaceus PCC 7421, a cyanobacterium that lacks thylakoids. DNA Res, (4): p Gotti, C., D. Fornasari, and F. Clementi, Human neuronal nicotinic receptors. Prog Neurobiol, (2): p Pollard, H.B., N. Arispe, and E. Rojas, Ion channel hypothesis for Alzheimer amyloid peptide neurotoxicity. Cell Mol Neurobiol, (5): p Kalamida, D., et al., Muscle and neuronal nicotinic acetylcholine receptors. Structure, function and pathogenicity. FEBS J, (15): p McGehee, D.S. and L.W. Role, Physiological diversity of nicotinic acetylcholine receptors expressed by vertebrate neurons. Annu Rev Physiol, : p Role, L.W., Diversity in primary structure and function of neuronal nicotinic acetylcholine receptor channels. Curr Opin Neurobiol, (3): p Le Novere, N. and J.P. Changeux, The Ligand Gated Ion Channel Database. Nucleic Acids Res, (1): p Lo, W.Y., et al., A conserved Cys-loop receptor aspartate residue in the M3-M4 cytoplasmic loop is required for GABAA receptor assembly. J Biol Chem, (44): p Sine, S.M. and A.G. Engel, Recent advances in Cys-loop receptor structure and function. Nature, (7083): p Brejc, K., et al., The 2.7 A structure of AChBP, homologue of the ligand-binding domain of the nicotinic acetylcholine receptor. Novartis Found Symp, : p. 22-9; discussion 29-32, Sixma, T.K. and A.B. Smit, Acetylcholine binding protein (AChBP): a secreted glial protein that provides a high-resolution model for the extracellular domain of pentameric ligand-gated ion channels. Annu Rev Biophys Biomol Struct, : p Taly, A., et al., Discrimination of agonists versus antagonists of nicotinic ligands based on docking onto AChBP structures. J Mol Graph Model, : p Mukhtasimova, N., C. Free, and S.M. Sine, Initial coupling of binding to gating mediated by conserved residues in the muscle nicotinic receptor. J Gen Physiol, (1): p Church, P.J., Functional analyses of cotransmission in Aplysia californica. 1993, University of Chicago. p. viii, 93 leaves. 41. Bourne, Y., et al., Structural determinants in phycotoxins and AChBP conferring high affinity binding and nicotinic AChR antagonism. Proc Natl Acad Sci U S A, (13): p Bourne, Y., et al., Crystal structure of a Cbtx-AChBP complex reveals essential interactions between snake alpha-neurotoxins and nicotinic receptors. EMBO J, (8): p Celie, P.H., et al., Crystal structure of nicotinic acetylcholine receptor homolog AChBP in complex with an alpha-conotoxin PnIA variant. Nat Struct Mol Biol, (7): p Ihara, M., et al., Crystal structures of Lymnaea stagnalis AChBP in complex with neonicotinoid insecticides imidacloprid and clothianidin. Invert Neurosci, (2): p Celie, P.H., et al., Nicotine and carbamylcholine binding to nicotinic acetylcholine receptors as studied in AChBP crystal structures. Neuron, (6): p Lewis, R.J. and S. Dutertre, Toxin insights into nicotinic acetylcholine receptors. Biochemical Pharmacology, (6): p Ulens, C., et al., Structural determinants of selective alpha-conotoxin binding to a nicotinic acetylcholine receptor homolog AChBP. Proc Natl Acad Sci U S A, (10): p

133 Η. Βιβλιογραφία 48. Tasneem, A., et al., Identification of the prokaryotic ligand-gated ion channels and their implications for the mechanisms and origins of animal Cys-loop ion channels. Genome Biol, (1): p. R Jha, A., et al., Acetylcholine receptor gating at extracellular transmembrane domain interface: the cys-loop and M2-M3 linker. J Gen Physiol, (6): p Cheng, X., et al., Molecular-dynamics simulations of ELIC-a prokaryotic homologue of the nicotinic acetylcholine receptor. Biophys J, (11): p Zimmermann, I. and R. Dutzler, Ligand activation of the prokaryotic pentameric ligand-gated ion channel ELIC. PLoS Biol, (6): p. e Rendon, G., et al., Identifying bacterial and archaeal homologs of pentameric ligand-gated ion channel (plgic) family using domain-based and alignment-based approaches. Channels (Austin), (4): p Feng, G., J.H. Steinbach, and J.R. Sanes, Rapsyn clusters neuronal acetylcholine receptors but is inessential for formation of an interneuronal cholinergic synapse. J Neurosci, (11): p Bruneau, E. and M. Akaaboune, The dynamics of the rapsyn scaffolding protein at individual acetylcholine receptor clusters. J Biol Chem, (13): p Rexroth, S., et al., The Plasma Membrane of the Cyanobacterium Gloeobacter violaceus Contains Segregated Bioenergetic Domains. Plant Cell, (6): p Dey, R. and L. Chen, In search of allosteric modulators of a7-nachr by solvent density guided virtual screening. J Biomol Struct Dyn, (5): p Parikh, R.B., M. Bali, and M.H. Akabas, Structure of the M2 transmembrane segment of GLIC, a prokaryotic Cys loop receptor homologue from Gloeobacter violaceus, probed by substituted cysteine accessibility. J Biol Chem, (16): p Nury, H., et al., Crystal structure of the extracellular domain of a bacterial ligand-gated ion channel. J Mol Biol, (5): p Franks, N.P., General anaesthesia: from molecular targets to neuronal pathways of sleep and arousal. Nat Rev Neurosci, (5): p Li, G.D., et al., Numerous classes of general anesthetics inhibit etomidate binding to gammaaminobutyric acid type A (GABAA) receptors. J Biol Chem, (12): p Weng, Y., et al., Anesthetic sensitivity of the Gloeobacter violaceus proton-gated ion channel. Anesth Analg, (1): p Kotani, Y., et al., The experimental and clinical pharmacology of propofol, an anesthetic agent with neuroprotective properties. CNS Neurosci Ther, (2): p Bhattacharya, A.A., S. Curry, and N.P. Franks, Binding of the general anesthetics propofol and halothane to human serum albumin. High resolution crystal structures. J Biol Chem, (49): p Terrell, R.C., The invention and development of enflurane, isoflurane, sevoflurane, and desflurane. Anesthesiology, (3): p Nury, H., et al., X-ray structures of general anaesthetics bound to a pentameric ligand-gated ion channel. Nature, (7330): p Ernst, R.R., G. Bodenhausen, and A. Wokaun, Principles of nuclear magnetic resonance in one and two dimensions. The International series of monographs on chemistry. 1987, Oxford OxfordshireNew York: Clarendon Press ;Oxford University Press. xxiv, 610 p. 67. Drenth, J. and J. Mesters, Principles of protein x-ray crystallography. 3rd ed. 2007, New York: Springer. xiv, 332 p. 68. George, A. and W.W. Wilson, Predicting protein crystallization from a dilute solution property. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, (Pt 4): p Leopold, M.F., J.L. Urbauer, and A.J. Wand, Resonance assignment strategies for the analysis of NMR spectra of proteins. Mol Biotechnol, (1): p

134 Η. Βιβλιογραφία 70. Marion, D. and K. Wuthrich, Application of phase sensitive two-dimensional correlated spectroscopy (COSY) for measurements of 1H-1H spin-spin coupling constants in proteins. Biochem Biophys Res Commun, (3): p Muller, L., Sensitivity Enhanced Detection of Weak Nuclei Using Heteronuclear Multiple Quantum Coherence. Journal of the American Chemical Society, (16): p Kay, L.E., NMR studies of protein structure and dynamics. J Magn Reson, (2): p Huth, J.R., et al., Design of an expression system for detecting folded protein domains and mapping macromolecular interactions by NMR. Protein Sci, (11): p Ross, A., et al., Optimised fermentation strategy for 13C/15N recombinant protein labelling in Escherichia coli for NMR-structure analysis. J Biotechnol, (1): p Wüthrich, K., NMR of proteins and nucleic acids. The George Fisher Baker non-resident lectureship in chemistry at Cornell University. 1986, New York: Wiley. xv, Clubb, R.T. and G. Wagner, A triple-resonance pulse scheme for selectively correlating amide 1HN and 15N nuclei with the 1H alpha proton of the preceding residue. J Biomol NMR, (4): p Otting, G., et al., Protein hydration studied with homonuclear 3D 1H NMR experiments. J Biomol NMR, (2): p Logan, T.M., et al., Side chain and backbone assignments in isotopically labeled proteins from two heteronuclear triple resonance experiments. FEBS Lett, (3): p Snyder, D.A., et al., Resolution-enhanced 4D 15N/13C NOESY protein NMR spectroscopy by application of the covariance transform. J Am Chem Soc, (46): p Ikura, M., L.E. Kay, and A. Bax, A novel approach for sequential assignment of 1H, 13C, and 15N spectra of proteins: heteronuclear triple-resonance three-dimensional NMR spectroscopy. Application to calmodulin. Biochemistry, (19): p Eletsky, A., et al., A novel strategy for the assignment of side-chain resonances in completely deuterated large proteins using 13C spectroscopy. J Biomol NMR, (2): p Lohr, F., et al., A strategy to obtain backbone resonance assignments of deuterated proteins in the presence of incomplete amide 2H/1H back-exchange. J Biomol NMR, (4): p Leiting, B., F. Marsilio, and J.F. O'Connell, Predictable deuteration of recombinant proteins expressed in Escherichia coli. Anal Biochem, (2): p Hu, K., B. Vogeli, and K. Pervushin, Side-chain H and C resonance assignment in protonated/partially deuterated proteins using an improved 3D(13)C-detected HCC-TOCSY. J Magn Reson, (2): p Goto, N.K. and L.E. Kay, New developments in isotope labeling strategies for protein solution NMR spectroscopy. Curr Opin Struct Biol, (5): p Ono, A., et al., Selective multiple labeling strategy to obtain accurate NMR parameters for nucleic acids. Conformational analysis around the glycosidic bond. Nucleic Acids Symp Ser, 1997(37): p Parker, M.J., et al., A combinatorial selective labeling method for the assignment of backbone amide NMR resonances. J Am Chem Soc, (16): p Simplaceanu, V., et al., Chain-selective isotopic labeling for NMR studies of large multimeric proteins: application to hemoglobin. Biophys J, (2): p Weigelt, J., et al., Site-selective labeling strategies for screening by NMR. Comb Chem High Throughput Screen, (8): p Takeuchi, K., et al., 1-13C amino acid selective labeling in a 2H15N background for NMR studies of large proteins. J Biomol NMR, (1): p Fiaux, J., et al., Uniform and residue-specific 15N-labeling of proteins on a highly deuterated background. J Biomol NMR, (3): p

135 Η. Βιβλιογραφία 92. Chary, K.V.R. and H.S. Atreya, Amino acid selective 'unlabelling' for residue-specific NMR assignments in proteins. Current Science, (4): p Goto, N.K., et al., A robust and cost-effective method for the production of Val, Leu, Ile (delta 1) methyl-protonated 15N-, 13C-, 2H-labeled proteins. J Biomol NMR, (4): p Ayala, I., et al., An efficient protocol for the complete incorporation of methyl-protonated alanine in perdeuterated protein. J Biomol NMR, (2): p Ou, H.D., et al., Efficient identification of amino acid types for fast protein backbone assignments. J Biomol NMR, (3): p Kramer, R., Secretion of Amino-Acids by Bacteria - Physiology and Mechanism. Fems Microbiology Reviews, (1): p Kleerebezem, M. and J. Hugenholtz, Metabolic pathway engineering in lactic acid bacteria. Curr Opin Biotechnol, (2): p Epelbaum, S., D.M. Chipman, and Z. Barak, Analysis of intracellular metabolites as tool for studying branched-chain amino acid biosynthesis and its inhibition in bacteria. Methods Enzymol, : p Eanes, W.F., Molecular population genetics and selection in the glycolytic pathway. J Exp Biol, (Pt 2): p Barnes, S.J. and P.D. Weitzman, Organization of citric acid cycle enzymes into a multienzyme cluster. FEBS Lett, (2): p Feldman, L.I. and I.C. Gunsalus, The occurrence of a wide variety of transaminases in bacteria. J Biol Chem, (2): p Tatum, E.L. and J. Lederberg, Gene Recombination in the Bacterium Escherichia coli. J Bacteriol, (6): p Mehta, B.M., D.V. Rege, and A. Sreenivasan, Transformation to prototrophic condition in Escherichia coli induced by deoxyribonucleic acid. Nature, : p Truhlar, S.M., et al., Rapid mass spectrometric analysis of 15N-Leu incorporation fidelity during preparation of specifically labeled NMR samples. Protein Sci, (9): p Varshaver, N.B., et al., Detection of auxotrophic mutations in mammalian cell culture. Sov Genet, (3): p Pryor, K.D. and B. Leiting, High-level expression of soluble protein in Escherichia coli using a His(6)-tag and maltose-binding-protein double-affinity fusion system. Protein Expression and Purification, (3): p Muller, K.M., et al., Tandem immobilized metal-ion affinity chromatography/immunoaffinity purification of His-tagged proteins--evaluation of two anti-his-tag monoclonal antibodies. Anal Biochem, (1): p Grundy, J.E., L.Y. Wirtanen, and M. Beauregard, Addition of a poly-(6x) His tag to Milk Bundle-1 and purification using immobilized metal-affinity chromatography. Protein Expr Purif, (1): p Hochuli, E., H. Dobeli, and A. Schacher, New metal chelate adsorbent selective for proteins and peptides containing neighbouring histidine residues. J Chromatogr, : p Hagnauer, G.L., Size Exclusion Chromatography. Analytical Chemistry, (5): p. R265- R Kopaciewicz, W., et al., Retention Model for High-Performance Ion-Exchange Chromatography. Journal of Chromatography, (Aug): p Laemmli, U.K., Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, (5259): p Webb, K.S., et al., Correlation of apparent molecular weight and antigenicity of viral proteins: an SDS-page separation followed by acrylamide-agarose electrophoresis and immunoprecipitation. J Immunol Methods, (3-4): p

136 Η. Βιβλιογραφία 124

137 Ενότητα Θ Παράρτημα 125

138 Θ. Παράρτημα 126

139 Θ. Παράρτημα Θ.1. Ταυτοποίηση των κορυφών του φάσματος 1 Η- 15 Ν HSQC στα 700MHz της GLIC ΕΚΠ Εικόνα Π1: Ταυτοποίηση των κορυφών του 1 H- 15 N-HSQC φάσματος της GLIC ΕΚΠ, σε ph 6,95, θερμοκρασία Τ=298 Κ, σε NMR μαγνήτη 700MHz. 127

140 Θ. Παράρτημα Πίνακας Π1: Πίνακας χημικών μετατοπίσεων των πυρήνων όπως κατατέθηκε στη βάση δεδομένων ΒΜΡΒ. α/α αμινοξικό κατάλοιπο τύπος αμινοξέος τύπος πυρήνα χημική μετατόπιση 1 3 ASP C ASP H ASP N ASP CA ASP CB MET C MET H MET N MET CA MET CB VAL CA VAL C VAL CB VAL H VAL N SER C SER H SER N SER CA SER CB ILE CA ILE H ILE N ALA C ALA H ALA N ALA CA ALA CB ASP C ASP H ASP N ASP CA ASP CB GLU H GLU N GLU CA LEU C LEU H LEU N LEU CA LEU CB

141 Θ. Παράρτημα THR C THR H THR N THR CA THR CB VAL C VAL H VAL N VAL CA VAL CB ASN C ASN H ASN N ASN CA ASN CB THR H THR N THR CA GLY H GLY N GLY CA ILE H ILE N ILE CA TYR CB TYR H TYR N TYR CA LEU CB LEU H LEU N LEU CA ILE CA ILE H ILE N GLU CB GLU H GLU N GLU CA CYS H CYS N CYS CA CYS CB LYS C

142 Θ. Παράρτημα LYS H LYS N LYS CA LYS CB ALA CB ALA H ALA N ALA CA PHE CB PHE H PHE N PHE CA SER C SER H SER N SER CA SER CB LEU CA LEU H LEU N LEU CB SER C SER H SER N SER CA SER CB TRP C TRP H TRP N TRP CA TRP CB LYS C LYS H LYS N LYS CA LYS CB ASP C ASP H ASP N ASP CA ASP CB ARG C ARG H ARG N

143 Θ. Παράρτημα ARG CA ARG CB ARG C ARG H ARG N ARG CA ARG CB LEU C LEU H LEU N LEU CA LEU CB ALA C ALA H ALA N ALA CA ALA CB PHE C PHE H PHE N PHE CA PHE CB ASP C ASP H ASP N ASP CA ASP CB VAL C VAL H VAL N VAL CA VAL CB ARG C ARG H ARG N ARG CA ARG CB SER H SER N SER CA SER CB SER C GLY H GLY N

144 Θ. Παράρτημα GLY CA GLY C VAL C VAL CB VAL H VAL N VAL CA ARG C ARG H ARG N ARG CA ARG CB VAL C VAL CB VAL H VAL N VAL CA LYS C LYS H LYS N LYS CA LYS CB THR C THR CB THR H THR N THR CA TYR H TYR N TYR CA TYR CB GLU C GLU H GLU N GLU CA GLU CB GLU H GLU N GLU CA GLU CB GLU C ALA C ALA H ALA N

145 Θ. Παράρτημα ALA CA ALA CB ILE CA ILE CB ILE H ILE N TRP C TRP H TRP N TRP CA TRP CB ILE H ILE N ILE CA ILE CB GLU C GLU H GLU N GLU CA GLU CB ILE C ILE H ILE N ILE CA ILE CB ARG H ARG N ARG CA PHE H PHE N ASN CA ASN H ASN N VAL H VAL N VAL CA GLU C GLU CB GLU H GLU N GLU CA ALA C ALA H ALA N

146 Θ. Παράρτημα ALA CA ALA CB ARG C ARG H ARG N ARG CA ARG CB ASP H ASP N ASP CA ASP CB ALA C ALA CB ALA H ALA N ALA CA ASP CA ASP H ASP N SER C SER H SER N SER CA SER CB VAL C VAL H VAL N VAL CA VAL CB SER C SER H SER N SER CA SER CB ASP H ASP N ASP CA ASP CB ASP C GLY H GLY N GLY CA GLY C THR CB

147 Θ. Παράρτημα THR H THR N THR CA VAL C VAL H VAL N VAL CA VAL CB GLN C GLN H GLN N GLN CA GLN CB TYR H TYR N TYR CA TYR CB LEU H LEU N LEU CA ARG H ARG N PHE H PHE N PHE CA PHE CB SER C SER H SER N SER CA SER CB ALA H ALA N ARG C ARG H ARG N ARG CA ARG CB LEU CB LEU H LEU N LEU CA LEU H LEU N

148 Θ. Παράρτημα LEU CA LEU CB ASP C ASP H ASP N ASP CA ASP CB GLY H GLY N GLY CA GLY C ARG C ARG H ARG N ARG CA ARG CB ARG C ARG H ARG N ARG CA ARG CB THR C THR CB THR H THR N THR CA GLU C GLU H GLU N GLU CA GLU CB SER C SER CB SER H SER N SER CA ASP H ASP N ASP CA ASP CB SER C SER CB SER H SER N

149 Θ. Παράρτημα SER CA GLN C GLN CB GLN H GLN N GLN CA THR C THR H THR N THR CA THR CB LEU C LEU H LEU N LEU CA ILE CB ILE H ILE N ILE CA TYR CA TYR H TYR N LEU C LEU CB LEU H LEU N LEU CA ILE H ILE N ILE CA ARG C ARG H ARG N ARG CA ARG CB SER C SER H SER N SER CA SER CB VAL C VAL H VAL N VAL CA

150 Θ. Παράρτημα VAL CB ASP H ASP N ASP CA ASP CB THR H THR N THR CA THR CB THR C ARG C ARG H ARG N ARG CA ARG CB ASN C ASN H ASN N ASN CA ASN CB ILE C ILE H ILE N ILE CA ILE CB VAL C VAL H VAL N VAL CA VAL CB LEU C LEU H LEU N LEU CA LEU CB ALA C ALA H ALA N ALA CA ALA CB VAL C VAL H VAL N VAL CB

151 Θ. Παράρτημα VAL CA ASP H ASP N ASP CA ASP CB LEU H LEU N LEU CA LEU CB GLU C GLU H GLU N GLU CA GLU CB LYS C LYS H LYS N LYS CA LYS CB VAL C VAL H VAL N VAL CA VAL CB GLY C GLY H GLY N GLY CA LYS C LYS H LYS N LYS CA LYS CB ASN H ASN N ASN CA ASN CB ASP H ASP N ASP CA ASP H ASP N ASP CA ASP CB

152 Θ. Παράρτημα VAL H VAL N VAL CA GLY C GLY H GLY N GLY CA TRP C TRP H TRP N TRP CA TRP CB ASP C ASP H ASP N ASP CA ASP CB ILE C ILE H ILE N ILE CA ILE CB GLU CB GLU H GLU N GLU CA SER H SER N SER CB SER CA SER C PHE C PHE H PHE N PHE CA PHE CB THR C THR H THR N THR CA THR CB ALA C ALA H ALA N

153 Θ. Παράρτημα ALA CA ALA CB ALA C ALA H ALA N ALA CA ALA CB ALA H ALA N ALA CA LEU C LEU H LEU N LEU CA LEU CB GLU C GLU H GLU N GLU CA GLU CB ASP H ASP N ASP CA ARG CA ARG H ARG N ARG CB TYR C TYR H TYR N TYR CA TYR CB GLN C GLN CB GLN H GLN N GLN CA LEU CA LEU C LEU H LEU N ARG C ARG H ARG N

154 Θ. Παράρτημα ARG CA ARG CB ILE H ILE N ILE CA ILE CB SER C SER H SER N SER CA SER CB ARG C ARG H ARG N ARG CA ARG CB GLN C GLN H GLN N GLN CA GLN CB GLY C GLY H GLY N GLY CA GLY H GLY N GLY CA GLY C

155 Θ. Παράρτημα Θ.2. Συντμήσεις Αμινοξέα Ala Α Αλανίνη Arg R Αργινίνη Asn N Ασπαραγίνη Asp D Ασπαραγινικό οξύ Cys C Κυστεΐνη Gln Q Γλουταμίνη Glu E Γλουταμινικό οξύ Gly G Γλυκίνη His H Ιστιδίνη Ile I Ισολευκίνη Leu L Λευκίνη Lys K Λυσίνη Met M Μεθειονίνη Phe F Φαινυλαλανίνη Pro P Προλίνη Ser S Σερίνη Thr T Θρεονίνη Trp W Τρυπτοφάνη Tyr Y Τυροσίνη Val V Βαλίνη ACh: ακετυλοχολίνη nachr: νικοτινικός υποδοχέας της ακετυλοχολίνης LGICs: ιοντικά κανάλια που ενεργοποιούνται από την δέσμευση κάποιου προσδέτη ΕΚΠ: εξωκυττάρια περιοχή ΚΠ: κυτταροπλασματική περιοχή ΔΜ: διαμεμβρανική περιοχή AChBP: πρωτεΐνης δέσμευσης της ακετυλοχολίνης ELIC: προκαρυωτικό LGIC από Erwinia chrysanthemi GLIC: προκαρυωτικό LGIC από Gleobacter violaceus A AChBP: AChBP από Aplysia californica L AChBP: AChBP από Lymnaea stagnalis α Btx: α μπουγκαροτοξίνη α Cbtx: α κομπρατοξίνη α Ctx: α κωνοτοξίνη NMR: πυρηνικός μαγνητικός συντονισμός HSQC: Heteronuclear Single Quantum Correlation NOE: Nuclear Overhauser Enhancement or Nuclear Overhauser Effect NOESY: 2D Nuclear Overhauser Enhancement SpectroscopY HEPES: 4 (2 υδροξυαιθυλ) 1 πιπεραζινο αιθυλ σουλφονικό οξύ CD: κυκλικός διχρωϊσμός 143

156 Θ. Παράρτημα PDB: βάση δεδομένων Protein Data Bank RMSD: μέση απόκλιση της θέσης ενός ατόμου από ένα άτομο αναφοράς (root mean square deviation) Å: μονάδα μέτρησης (Amstrong) = m 144

157 Θ. Παράρτημα Θ.3. Δημοσίευση Από τα αποτελέσματα της παρούσας εργασίας συγγράφηκε η παρακάτω επιστημονική δημοσίευση, η οποία επισυνάπτεται αυτούσια στις επόμενες σελίδες. Christos T. Chasapis, Aikaterini I. Argyriou, Pierre-Jean Corringer, Detlef Bentrop, and Georgios A. Spyroulias. Unravelling the Conformational Plasticity of the Extracellular Domain of a Prokaryotic nachr Homologue in Solution by NMR. Biochemistry (2011). Nov 15;50(45): Abstract: Pentameric ligand-gated ion channels (plgics) of the Cys loop family are transmembrane glycoproteins implicated in a variety of biological functions. Here, we present a solution NMR study of the extracellular domain of a prokaryotic plgic homologue from the bacterium Gloeobacter violaceus that is found to be a monomer in solution. 145

158 Rapid Report pubs.acs.org/biochemistry Unravelling the Conformational Plasticity of the Extracellular Domain of a Prokaryotic nachr Homologue in Solution by NMR Christos T. Chasapis, Aikaterini I. Argyriou, Pierre-Jean Corringer, Detlef Bentrop, and Georgios A. Spyroulias*, Department of Pharmacy, University of Patras, GR Patras, Greece Institut Pasteur, Groupe Rećepteurs-Canaux, F Paris, France Institute of Physiology II, University of Freiburg, D Freiburg, Germany *S Supporting Information ABSTRACT: Pentameric ligand-gated ion channels (plgics) of the Cys loop family are transmembrane glycoproteins implicated in a variety of biological functions. Here, we present a solution NMR study of the extracellular domain of a prokaryotic plgic homologue from the bacterium Gloeobacter violaceus that is found to be a monomer in solution. nachr is the prototype of an important class of transmembrane proteins that form pentameric ion channels activated upon ligand binding (plgics). 1 Most members of this family are characterized by a conserved sequence of 13 residues flanked by disulfide-bridged cysteines in the N- terminal domain of each subunit. 1 The extracellular domains (ECDs; 210 residues) contain binding sites for agonists and competitive antagonists. Binding of an agonist induces rapid opening of the transmembrane ion channel, leading to a change in membrane potential. 2 Recently, both low- and highresolution ECD crystal structures 3,4 have been determined, providing new atomic-level insights into the structure and the pentameric architecture of these systems. However, there is not yet a report about their structure and dynamics in solution because their tendency to form oligomers has prevented the study of plgics by NMR spectroscopy until now. 5 The ECD of a bacterial nachr homologue from Gloeobacter violaceus (GLIC) was recently crystallized in two crystal forms and showed an unexpected hexameric quaternary structure while behaving as a monomer in solution. 6,7 Here, we present the solution NMR conformational and dynamical properties of the GLIC ECD monomer (193 residues with a C-terminal Gly 2 His 6 tag), based on the assignment of 80% of the backbone nuclei (excluding 11 Pro residues) (Figure S1 of the Supporting Information; BMRB accession number 17695). Unfavorable relaxation properties prevent a complete resonance assignment of GLIC ECD. Even at 900 MHz, the 1 H 15 N heteronuclear single-quantum coherence or transverse relaxation optimized spectroscopy (HSQC/ TROSY) spectra of GLIC ECD show only 145 of 182 expected backbone amide resonances. Standard triple-resonance NMR experiments with uniformly 2 H-, 13 C-, and 15 N-labeled GLIC samples allowed the backbone assignment of 110 residues. To corroborate and extend this assignment, we applied amino acid selective 15 N labeling and/or reverse labeling ( unlabeling of a 15 N protein) for 12 amino acids (Ala, Leu, Ile, Val, Phe, Tyr, Asn, His, Lys, Arg, Asp, and Glu) according to known or modified strategies (Supporting Information). Efficient unlabeling of [ 15 N]GLIC ECD was performed for Arg, Lys, His, and Asn in Escherichia coli BL21(DE3). Successful selective 15 N labeling in E. coli BL21(DE3) was achieved for Lys, Val, and Ile [in the presence of 14 N-labeled amino acids to prevent cross-labeling (Table S1 of the Supporting Information)]. Efficient selective 15 N labeling of GLIC ECD with Leu, Ala, Phe, Tyr, Asp, and Glu was achieved in the auxotrophic strain E. coli DL39 (Table S1). In total, the selective labeling efforts provided 34 new unambiguous assignments of backbone amides. 1 H 15 N HSQC/TROSY spectra of selectively 15 N-labeled GLIC ECD samples at 298 and 308 K clearly proved that conformational exchange processes in various regions of the protein are the reason for fast relaxation precluding a complete assignment (36 backbone HN resonances not detectable at 298 K). At 308 K, many weak HN resonances gain in intensity, and new resonances that do not appear at all at 298 K become observable. This is illustrated in Figure 1A C by the [ 15 N]Ala and [ 15 N]Leu GLIC ECD spectra at 298 and 308 K and was helpful for the assignment in some cases, e.g., for the detection of Tyr29. However, triple-resonance experiments at 308 K were not feasible because of the precipitation of GLIC ECD within a few hours. Figure 1D shows the assigned residues on the GLIC ECD topology diagram of the crystallized hexamer [Protein Data Bank (PDB) entry 3IGQ]. 7 Despite all labeling efforts, there are 39 unassigned nonproline residues (Figure 1D and Figure S2 of the Supporting Information) comprising the very N-terminus, most of the β1 β2 loop, the first half of strand β2, the core of strand β5, two residues each of strands β6 and β7, certain portions of strand β9 and of the β9 β10 loop (C-loop), and the first part of strand β10. In the GLIC crystal model, the β1 β2 and β5 β6 loops belong to the inner β-sheet (Figure 1D) interacting with the transmembrane domain (TMD), while the C-terminal ends of strands β7 and β9 and the first part of strand β10 form the upper region of the outer β-sheet (Figure Received: August 5, 2011 Revised: October 11, 2011 XXXX American Chemical Society A dx.doi.org/ /bi201223u Biochemistry XXXX, XXX, XXX XXX

159 Biochemistry Rapid Report Figure 1. (A) Overlay of the 1H 15N HSQC spectra (298 K) of GLICECD selectively labeled with [15N]Ala and [15N]Leu. (B and C) 1H 15N HSQC spectra of [15N]Ala and [15N]Leu GLICECD at 308 K indicating new HN resonances (arrows). (D F) Topology diagrams of GLIC ECD (PDB entry 3IGQ). (D) Assigned GLICECD regions gray for linkers, blue for the inner β-sheet, and orange for the outer β-sheet; unassigned residues light blue or yellow. (E) NMR backbone dynamics according to 15N relaxation data shown on top of the assignment status in panel D. Dark blue and red indicate R2/R1 values above average (14.28) in the inner and outer β-sheet, respectively. White illustrates assigned regions for which R2/R1 could not be determined (27 backbone HN resonances). (F) Regions participating in 6mer (PDB entry 3IGQ) subunit subunit interactions (light orange and yellow denote the interface with the preceding and following subunits, respectively). (G) Secondary structure through PECAN 8 compared to the secondary structure of the GLICECD 6mer (cartoon at the top of the diagram; light colors for unassigned residues). (H) R2/R1 values (the dotted line denotes the R2/R1 average). (I) Subunit subunit interactions in the GLIC ECD 3mer (PDB entry 3IGQ) are colored light blue for subunits α and γ and gold and light yellow for subunit β in the α β and β γ interfaces, respectively. Panel I was generated with MOLMOL. 9 1D). Additional unassigned residues are in the β4 β5 loop and at the beginning of the Cys loop (β6 β7 loop). Chemical shift-based prediction of the secondary structure of monomeric GLICECD through PECAN8 (Figure 1G) is fully consistent with the secondary structure elements observed in the crystal structures of pentameric GLIC and hexameric GLICECD (PDB entries 3EAM and 3IGQ, respectively);6,7 i.e., the predominant β-structure is independent of the oligomerization state. This is also confirmed by circular dichroism measurements at ph 7.0 (Figure S1) showing a β-sheet content of 48% that is almost identical to the β-sheet content of GLICECD in the two crystal structures (48 50%). The backbone dynamics of GLICECD on the pico- to nanosecond time scale was studied through the analysis of 15N R1 and R2 relaxation rates and heteronuclear {1HN} 15N NOEs (Figure S2). The correlation time for isotropic tumbling in solution as calculated from the R2/R1 ratio is 11.1 ± 0.3 ns, clearly indicating that GLICECD is in the monomeric state. Although the R2/R1 data (Figure 1E,H) show considerable variability, some flexible (lower R2/R1 values) or rigid (higher R2/R1 values) regions may be identified. For example, the Nterminus of GLICECD is clearly more flexible than the Cterminus. Low flexibility (high R2/R1 values) may be attributed to strands β1, β6, β7, and β9. In contrast, parts of the β2 β3 linker, strand β4, the Cys loop (β6 β7 loop), the β7 β8 loop, and the flanking portions of the C-loop (β9 β10) seem to be mobile. It is important to note that according to 15N relaxation data, mobile GLICECD regions are neighboring most of the unassigned segments undergoing conformational exchange on an intermediate time scale. The dynamics of monomeric GLICECD [PDB entry 3EAM, chain A (Figure S3 of the Supporting Information)] in explicit water as observed in a 10 ns molecular dynamics (MD) simulation is in good agreement with the 15N relaxation data. The root-mean-square fluctuation values indicate a high flexibility of the N-terminus of GLICECD, the tip of the β1 β2 loop and the β2 β3 loop, the Cys-loop, the first part of strand β9, and the C-loop (Figure S3). Information about the mobility of GLICECD on a time scale of minutes to days came from an H D exchange experiment in which 1H 15N HSQC spectra at 298 K were recorded after a lyophilized sample had been dissolved in 100% D 2O. Surprisingly, the first spectrum after exchange for 90 min contained only 19 backbone HN resonances, most of which belong to residues in the upper part of the inner β-sheet and its connecting loops (Figure S4 of the Supporting Information). Thus, only the backbone HN groups of this part of GLICECD are involved in kinetically stable hydrogen bonds. The rest of the protein is apparently mobile on the time scale of hours. Overall, the GLICECD monomer exhibits a well-folded structure in solution. However, the 15N relaxation data, the H D exchange experiment, and the spectra of selectively labeled samples at 308 K clearly show that some parts of the protein are subject to intrinsic mobility on different NMR time scales. According to the NMR data, GLICECD exhibits a βb dx.doi.org/ /bi201223u Biochemistry XXXX, XXX, XXX XXX