ΕΚΦΡΑΣΗ, ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΚΑΙ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΜΟΣ ΤΩΝ ΕΞΩΚΥΤΤΑΡΙΚΏΝ ΠΕΡΙΟΧΩΝ ΤΩΝ β ΚΑΙ δ ΥΠΟΜΟΝΑΔΩΝ ΤΟΥ ΥΠΟΔΟΧΕΑ ΤΗΣ ΑΚΕΤΥΛΟΧΟΛΙΝΗΣ

Transcript

1 Μ.Δ. ΕΚΦΡΑΣΗ, ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΚΑΙ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΜΟΣ ΤΩΝ ΕΞΩΚΥΤΤΑΡΙΚΏΝ ΠΕΡΙΟΧΩΝ ΤΩΝ β ΚΑΙ δ ΥΠΟΜΟΝΑΔΩΝ ΤΟΥ ΥΠΟΔΟΧΕΑ ΤΗΣ ΑΚΕΤΥΛΟΧΟΛΙΝΗΣ ΗΡΑ ΓΑΒΡΑ ΠΑΤΡΑ, 2007

2 ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ: ΣΩΚΡΑΤΗΣ ΤΖΑΡΤΟΣ ΑΝ.ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ: ΑΝ. ΠΑΠΑΠΕΤΡΟΠΟΥΛΟΣ ΛΕΚΤΟΡΑΣ: ΚΩΣΤΑΣ ΠΟΥΛΑΣ

3 Στον παππού μου και τον Γιάννη που δεν είναι πλέον μαζί μας...

4 Ευχαριστίες Η παρούσα μεταπτυχιακή διατριβή, πραγματοποιήθηκε στο εργαστήριο Μοριακής Νευροβιολογίας και Ανοσολογίας του Ελληνικού Ινστιτούτου Παστέρ. Θα ήθελα να ευχαριστήσω τον καθηγητή μου Κ. Σωκράτη Τζάρτο, για την ευκαιρία που μου έδωσε για την εκπόνηση αυτής της εργασίας και για τη στήριξή του. Στον καιρό της παραμονής μου, γνώρισα πολλά αξιόλογα άτομα και όχι μόνο για τις γνώσεις τους στον επιστημονικό τομέα. Καθώς η καθημερινή επαφή μαζί τους μου έδωσε και μου έμαθε πολλά, και με αυτόν τον τρόπο με έφερε πιο κοντά σε πολλά από αυτά, δε θα ήθελα να προβώ σε τυπικές ευχαριστίες. Για το λόγο αυτό, η παράληψη της επιστημονικής τους ιδιότητας δε συνεπάγεται ασέβεια προς το άτομό τους, αλλά πραγματική εκτίμηση του χαρακτήρα και της προσφοράς τους σε μένα. Συνεπώς, ιδιαίτερες ευχαριστίες οφείλω στην Πόπη για την συνεισφορά της στην όλη πορεία μου, στη Βούλα που μου απέδειξε ότι υπάρχουν άνθρωποι στους οποίους μπορείς να βασιστείς για βοήθεια και σωστή καθοδήγηση, στην Άννα και τον Νίκο που εκτός από τη συνεισφορά τους στο εργαστήριο, προσφέρουν και την «ανθρώπινη» ιδιότητά τους σε όλους μας, στον Αλέξανδρο που μου απέδειξε ότι μπορούν να υπάρχουν φίλοι μέσα σε ένα εργασιακό χώρο, στη Βέτα που με τον τρόπο της βοηθάει στη δημιουργία ενός «οικογενεικού» κλίματος συμβάλλοντας στη δημιουργία πιο ζεστών σχέσεων στο εργαστήριο και τέλος όλα τα παιδιά που πραγματικά η παρουσία τους έκανε πιο ευχάριστη την παραμονή μου. Στο σημείο αυτό, δε θα ήθελα να ξεχάσω τον Κώστα, ο οποίος προσέφερε εκτός των άλλων και μεγάλη βοήθεια στα γραφειοκρατικά θέματα που προέκυπταν από το Πανεπιστήμιο. Τέλος, δε θα ήθελα να παραλείψω ορισμένα άτομα εκτός της επιστημονικής κοινότητας που μου απέδειξαν ότι υπάρχουν πραγματικοί «άνθρωποι». (Και για όσους δεν γνωρίζουν, η Πόπη, η Βούλα και ο Αλέξανδρος είναι μεταδιδακτορικοί συνεργάτες, η Άννα και ο Νίκος ειδικοί τεχνικοί, ενώ ο Κώστας είναι Λέκτορας στο τμήμα Φαρμακευτικής του Πανεπιστημίου Πατρών)

5 ΠΕΡΙΛΗΨΗ ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1-28 Γενικά 1 Τύποι νικοτινικού υποδοχέα της ακετυλοχολίνη 2 α. Ο μυϊκού τύπου υποδοχέας της ακετυλοχολίνης 2 β. Ο νευρικού τύπου υποδοχέας της ακετυλοχολίνης Η ΔΟΜΗ ΤΟΥ ΥΠΟΔΟΧΕΑ ΤΗΣ ΑΚΕΤΥΛΟΧΟΛΙΝΗΣ 4 Η Πρωτοταγής δομή 4 Η δευτεροταγής και τριτοταγής δομή του νικοτινικού υποδοχέα της ακετυλοχολίνης 7 Η τεταρτοταγής δομή 10 Η πρωτεΐνη πρόσδεσης ακετυλοχολίνης από το σαλιγκάρι (AChBP) H ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΤΟΥ ΥΠΟΔΟΧΕΑ 15 Τύποι υποκαταστατών που προσδένονται στον υποδοχέα της ακετυλοχολίνης 16 Αγωνιστές του υποδοχέα της ακετυλοχολίνης 17 Ανταγωνιστές του υποδοχέα της ακετυλοχολίνης 18 Περιοχές πρόσδεσης υποκαταστατών στον υποδοχέα 17 Περιοχές πρόσδεσης ακετυλοχολίνης και άλλων υποκαταστατών 17 Θέση πρόσδεσης της α-μπουγκαροτοξίνης 21 Λειτουργικές καταστάσεις και αλλοστερικές τροποποιήσεις του AChR 22 Το ιοντικό κανάλι ΜΕΤΑΒΟΛΙΣΜΟΣ ΤΟΥ ΥΠΟΔΟΧΕΑ ΤΗΣ ΑΚΕΤΥΛΟΧΟΛΙΝΗΣ 27

6 1.2. ΠΑΘΟΛΟΓΙΚΕΣ ΚΑΤΑΣΤΑΣΕΙΣ ΣΧΕΤΙΖΟΜΕΝΕΣ ΜΕ ΤΟΝ ΥΠΟΔΟΧΕΑ ΤΙΣ ΑΚΕΤΥΛΟΛΙΝΗΣ Γενικά ΒΑΡΙΑ ΜΥΑΣΘΕΝΕΙΑ 29 Κλινικά χαρακτηριστικά 30 Παθοφυσιολογία της ασθένειας 32 Παθογένεση της βαριάς μυασθένειας 34 Ανοσοαπάντηση στη βαριά μυασθένεια 35 Μηχανισμοί δράσης αντισωμάτων έναντι του υποδοχέα της ακετυλοχολίνης 37 Διάγνωση της βαριάς μυασθένειας 38 Θεραπεία της βαριάς μυασθένειας ΣΥΓΓΕΝΗ ΜΥΑΣΘΕΝΙΚΑ ΣΥΝΔΡΟΜΑ ΧΡΗΣΗ ΤΩΝ ΕΞΩΚΥΤΤΑΡΙΚΩΝ ΠΕΡΙΟΧΩΝ ΤΩΝ ΥΠΟΜΟΝΑΔΩΝ ΤΟΥ AChR (ECDs) ΕΤΕΡΟΛΟΓΟ ΣΥΣΤΗΜΑ ΕΚΦΡΑΣΗΣ Pichia pastoris 43 ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ 46 ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΥΛΙΚΑ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ 47 ΕΞΟΠΛΙΣΜΟΣ 48 ΑΝΑΛΩΣΙΜΑ 49 ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΑ 49 ΝΙΚΟΤΙΝΙΚΟΣ AChR ΕΝΗΛΙΚΟΥ (ΜΙΓΜΑ Tγ ΚΑΙ Τε) 50

7 ΔΙΑΛΥΜΑΤΑ 50 Ρυθμιστικά διαλύματα 50 Διαλύματα ηλεκτροφόρησης πρωτεϊνών (SDS-PAGE) 52 Διαλύματα απομόνωσης πλασμιδιακού DNA σε μικρή και μεγάλη κλίμακα 53 Θρεπτικά Υλικά ΜΕΘΟΔΟΙ Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) 56 MΕΘΟΔΟΙ ΑΠΟΜΟΝΩΣΗΣ ΠΛΑΣΜΙΔΙΑΚΟΥ DNA ΑΠΟ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΕΣ ΒΑΚΤΗΡΙΩΝ 57 Απομόνωση μεγάλης ποσότητας DNA (maxi prep) 57 Απομόνωση μικρής ποσότητας DNA (mini prep) 58 Προσδιορισμός της νουκλεοτιδικής ακολουθίας του DNA (SEQUENCING) 59 Ποσοτική ανάλυση του DNA 59 Ηλεκτροφόρηση DNA σε πήκτωμα αγαρόζης 59 ΚΑΘΑΡΙΣΜOΣ ΤΟΥ DNA 60 Συστηματοποιημένη μέθοδο QIAquick Gel Extraction Kit Protocol (Qiagen) 60 ΚΑΤΑΚΡΗΜΝΙΣΗ ΤΟΥ DNA 61 Πέψη DNA με περιοριστικά ένζυμα 61 ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΕΣ ΚΥΤΤΑΡΩΝ 61 Καλλιέργειες βακτηρίων 61 ΥΠΟΚΛΩΝΟΠΟΙΗΣΗ ΜΟΡΙΩΝ DNA ΣΕ ΠΛΑΣΜΙΔΙΑ-ΦΟΡΕΙΣ 62 Προετοιμασία τμημάτων DNA για υποκλωνοποίηση 62 Σύνδεση του πλασμιδιακού φορέα και του προς κλωνοποίηση μορίου DNA με Τ4 DNA λιγάση 62 Mετασχηματισμός βακτηριακών καλλιεργειών με τη μέθοδο του θερμικού σοκ (Heat-shock) 63

8 Προετοιμασία των κυττάρων 63 Μετασχηματισμός με θερμικό σοκ 64 ΕΚΦΡΑΣΗ ΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΕΝΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ ΣΤΟ ΕΤΕΡΟΛΟΓΟ ΣΥΣΤΗΜΑ ΤΟΥ ΖΥΜΟΜΥΚΗΤΑ Pichia Pastoris 65 Μετασχηματισμός κυττάρων Pichia Pastoris με πλασμιδιακό DNA με την μέθοδο της ηλεκτροδιάτασης 65 Προετοιμασία των κυττάρων 65 Μετασχηματισμός με ηλεκτροδιάταση 65 Μικρής κλίμακας καλλιέργεια κυττάρων Pichia Pastoris 66 Ετερόλογη έκφραση πρωτεϊνών σε κύτταρα Pichia Pastoris σε μεγάλη κλίμακα 66 Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών σε πηκτώματα πολυακρυλαμιδίου SDS (SDS-PAGE) 66 Ανοσοαποτυπώματα πρωτεϊνών (Western blot) 67 Μεταφορά των πρωτεϊνών 68 Αντίδραση και ανίχνευση των πρωτεϊνών με τη χρήση κατάλληλου αντισώματος 69 Dot blot 69 ΚΑΘΑΡΙΣΜΟΣ ΑΝΑΣΥΝΥΑΣΜΕΝΩΝ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ 69 Καθαρισμός με χρωματογραφία συγγένειας από στήλη Ni-NTA-αγαρόζης 69 FPLC ανάλυση 70 Ανοσοενζυμική μέθοδος προσδιορισμού πρόσδεσης μονοκλωνικών αντισωμάτων στα ανασυνδυασμένα πολυπεπτίδια (ELISA) 70 Πρόσδεση της πρωτεΐνης σε σφαιρίδια CNBr-ενεργοποιημένης σεφαρόζης 4Β 71 Μέθοδος προσδιορισμού ανοσοπροσρόφησης 72 Πρόσδεση ραδιενεργού μπουγκαροτοξίνη στην ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη (Filter assay) 73 Μέθοδος ανοσοκατακρήμνισης με αντισώματα (RIA με αντισώματα) 73

9 ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΕΚΦΡΑΣΗ ΚΑΙ ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΕΞΩΚΥΤΤΑΡΙΚΗΣ ΠΕΡΙΟΧΗΣ ΤΗΣ β ΥΠΟΜΟΝΑΔΑΣ ΤΟΥ ΑΝΘΡΩΠΙΝΟΥ ΝΙΚΟΤΙΝΙΚΟΥ ΥΠΟΔΟΧΕΑ ΤΗΣ ΑΚΕΤΥΛΟΧΟΛΙΝΗΣ (βecd) Κατασκευή, έκφραση και μελέτη της εξωκυτταρικής περιοχής της βwt υπομονάδας του υποδοχέα της ακετυλοχολίνης Μετασχηματισμός και έκφραση του ανασυνδυασμένου βwt πολυπεπτιδίου στο ετερόλογο σύστημα του ζυμομύκητα Pichia pastoris Έκφραση σε καλλιέργειες μεγάλης κλίμακας, καθαρισμός και μελέτη της βwt πρωτεΐνης Σύγκριση της παραγωγικής ικανότητας με απ ευθείας επαγωγή σε BMMY Σύγκριση της παραγωγικής ικανότητας μεταξύ των ανασυνδυασμένων πολυπεπτιδίων β-ppic9 ΚΑΙ β-ppic9 Flag Έλεγχος της β-flag πρωτεΐνης σε διαφορετικές αποδιατακτικές συνθήκες Συνέκφραση της β-flag-his και της α1-his υπομονάδας και έλεγχος πιθανής δημιουργίας συμπλόκου Χαρακτηρισμός του ECD της β υπομονάδας με ELISA (με αντι-β) 100

10 3.1.9 Ικανότητα του ακινητοποιημένου β-πολυπεπτιδίου να ανοσοπροσροφά αντι-achr abs από ορούς μυασθενών (Έλεγχος ορών μυασθενικών για αντι-β Ααντισώματα με RIA) ΕΚΦΡΑΣΗ ΚΑΙ ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΕΞΩΚΥΤΤΑΡΙΚΗΣ ΠΕΡΙΟΧΗΣ ΤΗΣ δ ΥΠΟΜΟΝΑΔΑΣ ΤΟΥ ΑΝΘΡΩΠΙΝΟΥ ΝΙΚΟΤΙΝΙΚΟΥ ΥΠΟΔΟΧΕΑ ΤΗΣ ΑΚΕΤΥΛΟΧΟΛΙΝΗΣ ΚΑΤΑΣΚΕΥΗ ΤΟΥ ΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΕΝΟΥ ΕΞΩΚΥΤΤΑΡΙΚΟΥ ΤΜΗΜΑΤΟΣ ΤΗΣ δ ΥΠΟΜΟΝΑΔΑΣ ΤΟΥ ΥΠΟΔΟΧΕΑ ΤΗΣ ΑΚΕΤΥΛΟΧΟΛΙΝΗΣ (δecd) Κλωνοποίηση του εξωκυτταρικού τμήματος της δ υπομονάδας του υποδοχέα της ακετυλοχολίνης Μετασχηματισμός του ανασυνδυασμένου πλασμιδίου που φέρει το εξωκυτταρικό τμήμα της δ υπομονάδας (δecd) σε κύτταρα ζύμης Pichia pastoris Έκφραση των ανασυνδυασμένων πολυπεπτιδίων στο ετερόλογο σύστημα του ζυμομύκητα Pichia pastoris ΕΚΦΡΑΣΗ ΚΑΙ ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΕΞΩΚΥΤΤΑΡΙΚΗΣΠΕΡΙΟΧΗΣ ΤΗΣ δ ΥΠΟΜΟΝΑΔΑΣ ΤΟΥ ΑΝΘΡΩΠΙΝΟΥ ΝΙΚΟΤΙΝΙΚΟΥ ΥΠΟΔΟΧΕΑ ΤΗΣ ΑΚΕΤΥΛΟΧΟΛΙΝΗΣ, Η ΟΠΟΙΑ ΦΕΡΕΙ ΤΗΝ ΘΗΛΙΑ ΤΗΣ AChBP Κλωνοποίηση της εξωκυτταρικής περιοχής της δ υπομονάδας του υποδοχέα της ακετυλοχολίνης που φέρει την αλλαγμένη θηλιά της AChBP Μετασχηματισμός του ανασυνδυασμένου πλασμιδίου στο

11 ετερόλογο σύστημα έκφρασης του ζυμομύκητα Pichia pastoris Έκφραση των ανασυνδυασμένων πολυπεπτιδίων στο ετερόλογο σύστημα του ζυμομύκητα Pichia pastoris σε καλλιέργειες μεγάλης κλίμακας Έκφραση και μελέτη της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης σε καλλιέργεια μεγαλύτερης κλίμακας (3lt) Απογλυκοζυλιώσεις της δmut υπομονάδας Έλεγχος ορών μυασθενικών για αντι-δ αντισώματα με RIA 130 ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

12 ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΕΙΣΑΓΩΓΗ Γενικά Ο υποδοχέας της ακετυλοχολίνης (AChR) είναι μέλος της ευρύτερης υπεροικογένειας καναλιών που άγουν ιόντα μετά από πρόσδεση νευροδιαβιβαστικών ουσιών (LGICs) [1-3]. Στην ίδια υπερ-οικογένεια ανήκουν και οι υποδοχείς του γ- αμινοβουτυρικού οξέος (GABA) [4], της γλυκίνης (GlyR) [5], της 5- υδροξυτρυπταμίνης ή σεροτονίνης (5ΗΤ 3 ) [6] και οι γλουταμινικοί υποδοχείς. Όλοι οι υποδοχείς αυτής της υπερ-οικογένειας, αν και διαφέρουν σε μέγεθος, διαθέτουν παρόμοια λειτουργικά και δομικά χαρακτηριστικά και θεωρείται ότι τα γονίδια που κωδικοποιούν τις υπομονάδας τους, είναι εξελικτικά προϊόντα του ίδιου αρχέγονου γονιδίου (Εικόνα 1.1) [1, 3, 7, 8]. Οι νικοτινικοί υποδοχείς της ακετυλοχολίνης είναι διαμεμβρανικές γλυκοπρωτεΐνες, αποτελούνται από πέντε ομόλογες υπομονάδες, όπως και τα υπόλοιπα μέλη της υπεροικογένειας, οι οποίες σχηματίζουν το ιοντικό κανάλι [1, 9]. Στο εξωκυτταρικό τμήμα του καναλιού, διακρίνονται οι περιοχές πρόσδεσης της ακετυλοχολίνης, η οποία ενεργοποιεί την κίνηση του καναλιού διαβιβάζοντας το νευρικό μήνυμα στο κύτταροστόχο [1, 9]. Οι AChRs αποτελούν πρότυπο για την μελέτη των μελών της υπερ-οικογένειας, καθώς είναι το περισσότερο και το καλύτερα μελετημένο μόριο αυτής. Συναντώνται σε δύο ομόλογες μορφές, του μυϊκού και του νευρικού τύπου. AChR 5HT3R GABAR GlyR : C-C θηλιά (loop) Cloop : M1 M2 M3 και Μ4 διαμεμβρανικές : Μ1, Μ2, Μ3 και Μ4 διαμεμβρανικές περιοχές Εικόνα 1.1: Οι ομοιότητες στα δομικά χαρακτηριστικά των μελών της υπεροικογένειας διαύλων που ελέγχονται από προσδέτες.

13 Τύποι νικοτινικού υποδοχέα της ακετυλοχολίνης Α. Ο μυϊκού τύπου υποδοχέας της ακετυλοχολίνης Οι μυϊκού τύπου υποδοχείς εντοπίζονται στη περιοχή των μετασυναπτικών μεμβρανών των σκελετικών μυών. Ομόλογη πρωτοταγή δομή και παρόμοιες ιδιότητες, διαθέτουν και οι αντίστοιχου τύπου υποδοχείς, που συναντώνται στα ηλεκτρικά όργανα του ηλεκτρικού ψαριού Torpedo californica (θαλάσσιο ελασματοβράχιο, κοινώς γνωστό ως μουδιάστρα) και του Electrophorus (τελεόστερος γλυκού νερού, κοινώς γνωστό ως ηλεκτρικό χέλι) [10]. Ο AChR σχηματίζει ένα πενταμερές από τέσσερις διαφορετικές υπομονάδες, τις α1, β1, γ ή ε και δ, ονομασία κατά σειρά αυξανόμενου μοριακού βάρους [11], με σταθερή στοιχειομετρία (α1) 2 (β1)εδ στον ενήλικο και (α1) 2 (β1)γδ στον εμβρυϊκό οργανισμό και στους νικοτινικούς υποδοχείς των ηλεκτρικών οργάνων των ψαριών (α 2 βγδ) (Εικόνα 1.2) [12]. Εξαίρεση στον ενήλικο οργανισμό φαίνεται ότι αποτελούν τα κύτταρα των εξωτερικών οφθαλμικών μυών, τα οποία εκφράζουν τόσο την ε, όσο και την γ υπομονάδα [13]. Β. Ο νευρικού τύπου υποδοχέας της ακετυλοχολίνης Σε αντίθεση με το μυϊκού τύπου υποδοχέα, οι νευρικού τύπου υποδοχείς της ακετυλοχολίνης αποτελούνται από τις υπομονάδες α και β σχηματίζοντας ομο- ή ετεροπενταμερή. Απαντώνται ευρέως στο κεντρικό και περιφερικό νευρικό σύστημα των σπονδυλωτών και των εντόμων. Η ταξινόμηση των νευρικών υπομονάδων του υποδοχέα γίνεται με βάση την ομολογία αυτών με τις υπομονάδες του μυϊκού τύπου υποδοχέα ακετυλοχολίνης. Συνεπώς, νευρικές υπομονάδες τύπου α χαρακτηρίζονται αυτές που διαθέτουν δύο γειτονικά κατάλοιπα κυστεΐνης, ομόλογα με αυτά του μυϊκού τύπου υποδοχέα (θέσεις 192, 193 της αμινοξικής αλληλουχίας). Ομοίως, και για την β υπομονάδα, χρησιμοποιήθηκε η β1 του μυϊκού υποδοχέα ως πρότυπο, η οποία δεν διαθέτει το ζεύγος κυστεΐνων, όπως η α υπομονάδα.

14 Εικόνα 1.2: Οι μυϊκού τύπου ΑChRs είναι γλυκοπρωτεΐνες που αποτελούνται από πέντε ομόλογες υπομονάδες με την στοιχειομετρία α 2 βγδ (εμβρυϊκού τύπου). Οι νευρικού τύπου υποδοχείς της ακετυλοχολίνης είναι επίσης πενταμερείς που αποτελούνται από α ή β υπομονάδες (ετεροπενταμερή) ή μόνο από α υπομονάδες (ομοπενταμερή) (Lindstrom, 2000). Οι α και β υπομονάδες του μυϊκού AChR ονομάζονται κατά σύμβαση α1 και β1. Η αρίθμηση των νευρικών υπομονάδων γίνεται βάσει της χρονολογικής τους απομόνωσης και ανάλυσης της αμινοξικής τους αλληλουχίας. Έτσι αριθμούνται μέχρι σήμερα 9 νευρικές α υπομονάδες (α2-α10) και 3 β (β2-β4), που συμμετέχουν στο σχηματισμό του νευρικού τύπου υποδοχέα. Οι α2-α7 και β2-β4 έχουν εντοπιστεί σε πολλά είδη οργανισμών, συμπεριλαμβανομένου και του ανθρώπου, ενώ τις α8 και α9

15 τις εντοπίζουμε στο κοτόπουλο και στον αρουραίο αντίστοιχα [14, 15]. Υπομονάδες που αντιστοιχούν στις γ, δ και ε του μυϊκού τύπου υποδοχέα, δεν έχουν βρεθεί στους νευρικούς υποδοχείς. Η πληθώρα αυτή των υπομονάδων του νευρικού τύπου υποδοχέα, παρέχει τη δυνατότητα σχηματισμού ποικίλων υποτύπων υποδοχέα, από τον συνδυασμό των διαφόρων α και β νευρικών υπομονάδων, ως ομο- ή ετεροπενταμερή με αναλογία α/β 2/3 ή 3/2 (Εικόνα 1.2) [16]. Ο κάθε υπότυπος διακρίνεται από διαφορετικά ειδικά, φυσιολογικά και φαρμακολογικά χαρακτηριστικά και εντοπίζεται σε διαφορετική ανατομική περιοχή στον εγκέφαλο, στα γάγγλια και σε άλλους ιστούς. Εμπλέκονται έτσι σε διάφορες λειτουργίες του κεντρικού και περιφερικού νευρικού συστήματος, όπως έλεγχος της έκκρισης άλλων νευροδιαβιβαστικών ουσιών και των εκούσιων κινήσεων, στην αίσθηση του πόνου και της θερμοκρασίας του σώματος, καθώς και σε πολυπλοκότερες διαδικασίες, όπως η αντίληψη, η μάθηση, η συμπεριφορά [17]. Στην περιοχή των γάγγλιων εντοπίστηκαν AChRs που αποτελούνται από α3 και β4 υπομονάδες. Οι βασικοί υποδοχείς είναι ομοπενταμερή α7 ή ετεροπενταμερή (α4) 2 (β2) 3 (Εικόνα 1.2) και εντοπίζονται στον εγκέφαλο των θηλαστικών [18-20]. Αν και σε κάθε περιοχή επικρατεί ο ένας υποτύπος του υποδοχέα, εξακολουθούν δείγματα των υπολοίπων να είναι παρόντα, γεγονός που επιβεβαιώνεται και από την έκφραση περισσοτέρων του ενός υποτύπου από τον ίδιο μεμονωμένο νευρώνα. Το γεγονός αυτό, δικαιολογεί και την διαφορετική απόκριση στη νικοτίνη γειτονικών νευρώνων [21]. Ανάλογα με το είδος του οργανισμού και τον προς μελέτη ιστό, παρατηρούνται διαφορές στο πρότυπο έκφρασης κάθε υπομονάδας. Τέλος, AChRs εντοπίζονται και σε άλλους ιστούς των θηλαστικών, όπως αυτούς του ανοσολογικού συστήματος, με κύριο παράδειγμα τα μακροφάγα κύτταρα [22] Η ΔΟΜΗ ΤΟΥ ΥΠΟΔΟΧΕΑ ΤΗΣ ΑΚΕΤΥΛΟΧΟΛΙΝΗΣ Η Πρωτοταγής δομή Με τη βοήθεια της τεχνολογίας ανασυνδυασμένου DNA, προσδιορίστηκαν οι συμπληρωματικές αλληλουχίες DNA (cdna) των α [23], β [24], γ [25-26] και δ [24] υπομονάδων του Torpedo AChR. Η γνώση των αλληλουχιών αυτών έδωσε τη δυνατότητα χρήσης τους ως ιχνηθέτες για την απομόνωση cdna και γενωμικών

16 κλώνων, που κωδικοποιούν μυϊκές και νευρικές υπομονάδες του υποδοχέα διαφόρων ειδών, συμπεριλαμβανομένου και του ανθρώπου [27]. Η σύγκριση των αμινοξικών αλληλουχιών των τεσσάρων υπομονάδων (α, β, γ και δ) του Torpedo californica, αποκάλυψε τον υψηλό βαθμό ομολογίας μεταξύ των υπομονάδων (35-50%), υποδεικνύοντας την εξελικτική συγγένεια των πρωτεϊνών [28]. Σύγκριση αμινοξικών αλληλουχιών της ίδιας υπομονάδας σε διαφορετικά είδη, οδηγεί σε μεγαλύτερα ποσοστά ομολογίας. Χαρακτηριστικό παράδειγμα αποτελούν οι α1 υπομονάδες του Torpedo και ανθρώπινου μυϊκού AChR, με ποσοστό ομολογίας περίπου 80% [29]. Αντίστοιχα ποσοστά ομολογίας παρατηρούνται και στις νευρικές υπομονάδες τόσο του ίδιου, όσο και μεταξύ διαφορετικών ειδών. Σύγκριση αυτών με τις μυϊκού τύπου υπομονάδες οδηγούν σε παρόμοια ποσοστά [30]. Τόσο οι νευρικές, όσο και οι μυϊκού τύπου υπομονάδες, διαθέτουν δύο συντηρημένα κατάλοιπα κυστεΐνης που αντιστοιχούν σε αυτά των καταλοίπων 128 και 142 της α υπομονάδας του Torpedo υποδοχέα. Η ένωση αυτών των κυστεϊνών σχηματίζει μια θηλιά 15 αμινοξέων [2], εκ των οποίων τα 13 είναι αρκετά συντηρημένα και στους άλλους υποδοχείς ιοντικών καναλιών (Εικόνα 1.1) [8]. Στην παρουσία της θηλιάς αυτής οφείλεται και ο χαρακτηρισμός των μελών αυτής της υπερ-οικογένειας ως υποδοχείς Cys-θηλιάς (Cys-loop receptors) [1]. Ένα επιπλέον ζεύγος κυστεϊνών εντοπίζεται στις α υπομονάδες του AChR και αντιστοιχούν στα κατάλοιπα 192 και 193 του Torpedo υποδοχέα. Η σύνδεση αυτών είναι ιδιαίτερα ασυνήθιστη [31] και η παρουσία ή απουσία τους στις νευρικές υπομονάδες είναι υπεύθυνη για τον διαχωρισμό αυτών σε α και β αντίστοιχα. Σε ορισμένες υπομονάδες, και συγκεκριμένα στο αμινοτελικό τους άκρο, εντοπίζονται επιπλέον κατάλοιπα κυστεΐνης, συγκεκριμένα ένα επιπλέον κατάλοιπο στις α1, δ, ε και α7 και τρία στην γ υπομονάδα, των οποίων η δράση δεν έχει διευκρινιστεί. Όλες οι υπομονάδες στο αμινοτελικό τους άκρο, διαθέτουν θέσεις γλυκοζυλίωσης, ο αριθμός και η θέση των οποίων διαφέρει ανάλογα με την υπομονάδα. Στον ανθρώπινο υποδοχέα διακρίνεται μια θέση γλυκοζυλίωσης στις γ, δ, ε, α3 και β2, ενώ οι α2, α5, α7 και β3 διαθέτουν από δύο και η β4 τέσσερις θέσεις γλυκοζυλίωσης [32]. Ο ρόλος των θέσεων αυτών είναι σημαντικός πολλές φορές για τη σωστή ωρίμανση και δομή των υπομονάδων, με χαρακτηριστικό παράδειγμα τη θέση Ν141 της α υπομονάδας [33]. Το κύριο συστατικό των ολιγοσακχαριτικών αλυσίδων είναι η μανόζη και σε ορισμένες περιπτώσεις το σιαλικό οξύ [34-37].

17 Σε ορισμένα είδη και για μερικές υπομονάδες έχουν ταυτοποιηθεί περισσότερες από μια ισομορφές. Για τον άνθρωπο εντοπίστηκαν δύο ισομορφές για την α1 υπομονάδα, η μια εκ των δύο διαθέτει ένα επιπλέον εξώνιο (Ρ) μεταξύ Ρ3 και Ρ4, το Ρ3Α, το οποίο και κωδικοποιεί επιπλέον 25 αμινοξέα μεταξύ των καταλοίπων 58 και 59, και εντοπίζονται στην εξωκυτταρική πλευρά του μορίου. Η ισομορφή αυτή δεν είναι σπάνια, καθώς εκφράζεται σταθερά στους σκελετικούς μύες, στην καρδιά, στους πνεύμονες, στο θύμο αδένα και στους νεφρούς [38]. Σε αντίθεση, η ισομορφή που δεν διαθέτει το επιπλέον εξώνιο, συναντάται αποκλειστικά στους σκελετικούς μύες. Αντίστοιχο παράδειγμα αποτελεί και η α7, η οποία απαντάται σε περισσότερες από μια ισομορφές, ο ρόλος των οποίων όμως δεν έχει διευκρινιστεί ακόμα. Ένα από τα πρώτα δεδομένα σχετικά με τον AChR ήταν ότι διαθέτει τόσο εξωκυττάρικα, όσο και κυτταροπλασματικά τμήματα [39]. Με βάση τα στοιχεία υδροφοβικότητας της αμινοξικής αλληλουχίας της α υπομονάδας του Torpedo υποδοχέα [26, 40, 41], έγινε η πρώτη πρόβλεψη για τη δομή και την τοποθέτηση των διαφόρων τμημάτων του AChR σε σχέση με τη μεμβράνη [39]. Περαιτέρω πειραματικά δεδομένα επαλήθευσαν το παραπάνω μοντέλο, το οποίο και θεωρείται κοινό για όλες τις υπομονάδες, λόγω της αυξημένη ομολογίας μεταξύ των τελευταίων. Πλέον γνωρίζουμε ότι όλες οι υπομονάδες ακολουθούν το ίδιο πρότυπο υδροφιλικότηταςυδροφοβικότητας ανεξάρτητα από το είδος του ιστού προέλευσης (Εικόνα 1.3). Σύμφωνα με το μοντέλο αυτό, κάθε υπομονάδα αποτελείται από τέσσερις υδρόφοβες διαμεμβρανικές περιοχές Μ1-Μ4 (περίπου αμινοξέα η καθεμία) [41] και δύο υδρόφιλες περιοχές. Η μεγαλύτερη εκ των δύο υδρόφοβων περιοχών (περίπου 210 αμινοξέα) εντοπίζεται στο αμινοτελικό άκρο κάθε υπομονάδας, είναι συντηρημένη σε μεγάλο βαθμό και αντιστοιχεί περίπου στο μισό μέγεθος αυτής. Η δεύτερη και μικρότερη υδρόφιλη περιοχή, εντοπίζεται μεταξύ των Μ3 και Μ4, ποικίλει σε μέγεθος και σε αμινοξική σύσταση. Η περιοχή αυτή είναι σημαντική, καθώς σε αυτήν διακρίνονται οι θέσεις φωσφορυλίωσης [42]. Η πιο συντηρημένη περιοχή μεταξύ των υπομονάδων είναι η Μ2. Το αμινοτελικό, καθώς και το καρβοξυτελικό άκρο κάθε υπομονάδας βρίσκονται στον εξωκυττάριο χώρο και είναι υδρόφιλα (Εικόνα 1.3) [43].

18 MIR Περ ιοχή π ρ όσδεσης υποκαταστατών Εικόνα 1.3: Μοντέλο της διαμεμβρανικής τοπογραφίας και της δευτεροταγούς δομής μιας «τυπικής» υπομονάδας του μυϊκού τύπου υποδοχέα, όπως προβλέφθηκε αρχικά από την ανάλυση του διαγράμματος υδροφοβικότητας της αμινοξικής αλληλουχίας (Stroud, 1990) και επιβεβαιώθηκε αργότερα μέσω πολλών μελετών. Η δευτεροταγής και τριτοταγής δομή του νικοτινικού υποδοχέα της ακετυλοχολίνης Για να προσδιοριστεί η δευτεροταγής δομή των υπομονάδων του AChR, χρησιμοποιηθήκαν διάφορες τεχνικές, όπως αυτή του κυκλικού διχρωισμού (CD), υπέρυθρη φασματοσκοπία μετασχηματισμού Fourier (FTIR) και ο συντονισμός Raman [29]. Οι περισσότερες μελέτες έγιναν σε Torpedo υποδοχέα, ο οποίος αποτέλεσε και το κύριο μοντέλο. Τα ποσοστά για την δευτεροταγή δομή διέφεραν μεταξύ των διαφόρων τεχνικών, καθώς δεν είναι συγκρίσιμες. Στις διαφορές αυτές δεν πρέπει να αποκλειστεί και ο παράγοντας των διαφορετικών παρασκευασμάτων του Torpedo υποδοχέα. Από τις φασματοσκοπικές μελέτες προκύπτει ότι στο μεγαλύτερο μέρος του υποδοχέα απαντώνται α-έλικες και β-πτυχωτές επιφάνειες. Από την FTIR τεχνική λαμβάνονται ποσοστά 36-43% για τις β-πτυχωτές επιφάνειες, 32-33% για τις α-έλικες και 14-24% για β-στροφές. Το υπόλοιπο 0-18% αντιστοιχεί σε τυχαίες αναδιπλώσεις [44, 45]. Η αρχική εκτίμηση για τη δομή των διαμεμβρανικών τμημάτων ανταποκρινόταν αποκλειστικά σε α-έλικα (Εικόνα 1.3) [26, 40, 41]. Αργότερα η χρήση ηλεκτρονικής

19 μικροσκοπίας, αρχικά σε ανάλυση 9Ǻ [46] και στη συνέχεια σε 4Ǻ [47], έδειξε τη διαμεμβρανική περιοχή ως ένα δακτύλιο πέντε α-ελίκων (Εικόνα 1.4). Οι πέντε α- έλικες αποτελούν τον πόρο του ιοντικού καναλιού, οι οποίες σε συνδυασμό με τα προηγούμενα πειραματικά δεδομένα [29, 48, 49], οδήγησαν στο συμπέρασμα ότι αντιστοιχούν στις Μ2 περιοχές των υπομονάδων. ΘΕΣΗ ΠΡΟΣΔΕΣΗΣ ACh Μεγάλη υδρόφιλη περιοχή Εικόνα 1.4: Ο υποδοχέας της ακετυλοχολίνης: Σχηματική αναπαράσταση της δομής του υποδοχέα της ακετυλοχολίνης. Ο υποδοχέας έχει σχήμα περίπου κυλινδρικό. Οι πέντε υπομονάδες του, οι οποίες παρουσιάζονται με τη μορφή κυλίνδρων, είναι διευθετημένες κανονικά γύρω από ένα κεντρικό άξονα, σχηματίζοντας μια δομή με σχετική πενταγωνική συμμετρία. Κάθε υπομονάδα διαθέτει μια μεγάλη υδρόφιλη αμινοτελική εξωκυτταρική περιοχή και τέσσερις υδρόφοβες διαμεμβρανικές περιοχές (Μ1-Μ4), οι οποίες παρουσιάζονται επίσης με τη μορφή κυλίνδρων (Changeux et al, 1993). Τα αποτελέσματα αυτά συμφωνούν με αυτά των φασματοσκοπικών μεθόδων (FTIR). Στην τεχνική αυτή χρησιμοποιηθήκαν μεμβράνες με μεγάλη περιεκτικότητα σε AChRs, από τους οποίους είχαν προηγουμένως αφαιρεθεί τα εξωμεμβρανικά μέρη με τη βοήθεια πρωτεολυτικών ενζύμων [50]. Από τα πειραματικά αποτελέσματα, προκύπτει ότι το 50% των διαμεμβρανικών τμημάτων αντιστοιχεί σε α-έλικες, το 40% σε β-πτυχωτές επιφάνειες και β-στροφές, ενώ ένα 10% σε τυχαίες αναδιπλώσεις.

20 Στην κατανόηση της δευτεροταγούς δομής συνέβαλαν και τα αποτελέσματα πειραμάτων ομοιοπολικής τροποποίησης καταλοίπων, είτε μέσω πολικών αντιδραστηρίων στο κανάλι, είτε μέσω υδρόφοβων στην λιπιδική διπλοστοιβάδα. Τα κατάλοιπα που αντικαταστάθηκαν εντοπίζονται κατά μήκος όλης της διαμεμβρανικής επιφάνειας. Μεταλλάξεις προς κυστεΐνες καταλοίπων που εντοπίζονται στην εσωτερική επιφάνεια του καναλιού, έδειξαν ότι η δομή της Μ2 είναι α-έλικα, εάν εξαιρέσουν τρία αμινοξικά κατάλοιπα [51], καθώς και ότι η μισή περιοχή της Μ1, που εντοπίζεται προς την εξωκυτταρική περιοχή της μεμβράνης, δεν είναι ελικωμένη [52]. Με πειράματα με υδρόφοβους ιχνηθέτες, προέκυψε το συμπέρασμα ότι τουλάχιστον ένα μέρος των Μ3 και Μ4 είναι α-έλικα και ότι το μισό της Μ1 δεν είναι [53]. Συνοψίζοντας, καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι το ποσοστό α-έλικας δεν ανταποκρίνεται στο 100%, όπως αρχικά είχε προβλεφθεί [25, 26, 40], και ότι είναι σίγουρα μεγαλύτερο από 25%, που προκύπτει από ηλεκτρονική μικροσκοπία 9Ǻ [46]. Νεότερες μελέτες της ίδιας μεθόδου, και με καλύτερη ανάλυση (4Ǻ), έδειξαν ότι κάθε διαμεμβρανική περιοχή αποτελείται από τέσσερις α-έλικες και μικρές θηλιές που τις συνδέουν [47]. Οι α-έλικες έχουν συμμετρική διάταξη και σχηματίζουν δύο δακτυλίους (Εικόνα 1.5). Οι α-έλικες της Μ2 σχηματίζουν την περιοχή του εσωτερικού δακτυλίου και συνεπώς το στενότερο μέρος του καναλιού. Οι α-έλικες των υπολοίπων διαμεμβρανικών περιοχών (Μ1, Μ3 και Μ4) σχηματίζουν την εξωτερική περιοχή του πόρου (τον εξωτερικό δακτύλιο) προστατεύοντας τον εσωτερικό από τα λιπίδια της μεμβράνης. Όσον αφορά την αμινοτελική περιοχή των υπομονάδων που εντοπίζονται στον εξωκυτταρικό χώρο, όλες οι μέθοδοι οδηγούν σε συμπεράσματα που συγκλίνουν. Προκύπτει κατ αυτόν τον τρόπο το συμπέρασμα ότι πρόκειται κατά κύριο λόγο για β- πτυχωτές επιφάνειες και εντοπίζονται μόνο τρεις περιοχές με α-έλικα (Εικόνα 1.3). Τα δεδομένα αυτά συμφωνούν με αυτά της ηλεκτρονικής μικροσκοπίας [47]. Οι περιοχές αυτές περιελίσσονται μεταξύ τους και στην περίπτωση της α υπομονάδας σχηματίζουν μια κοιλότητα, πιθανότατα για την πρόσδεση της ακετυλοχολίνης (Ach). Πιο πρόσφατα δεδομένα ηλεκτρονικής μικροσκοπίας σε ανάλυση 4,6Ǻ [54-55], έδειξαν ξεκάθαρα την θέση πρόσδεσης της ακετυλοχολίνης και ότι αποτελείται από επτά περιελισσόμενες β-δομές. Μελέτες κυκλικού διχρωισμού συμφωνούν με τα αποτελέσματα αυτά, καθώς υποδεικνύουν β-φύλλα στις περιοχές πρόσδεσης της ακετυλοχολίνης [56-58].

21 Α. Β. Γ. Εικόνα 1.5: Η διαμεμβρανική περιοχή του AChR. (Α) Η Μ2 έλικα με τα αμινοξέα που βρίσκονται στην εσωτερική διαμεμβρανική περιοχή του πόρου. (Β) Η επιφάνεια του πόρου (οι μπροστινές υπομονάδες αφαιρέθηκαν με GRASP). Οι περιοχές με υψηλό αρνητικό φορτίο απεικονίζονται με κόκκινο, οι περιοχές με υψηλό θετικό με μπλε, ενώ η υδρόφοβη περιοχή του πόρου με κίτρινο. Σε αυτή την περιοχή, εντοπίζονται και τα αμινοξικά κατάλοιπα V255 και L251 που έχουν καθοριστικό ρόλο στη λειτουργία του καναλιού. (Γ) Συμμετρική τοποθέτηση των πλαγίων αλυσίδων που σχηματίζουν τον πόρο. Με γαλάζιο απεικονίζεται ένα μόριο σε μέγεθος ιόντος. Ενυδατωμένη μορφή μορίου ή ιόντος δεν διέρχεται του καναλιού. (Miyazawa et al, 2003). Η τεταρτοταγής δομή Η ακριβέστερη μέθοδος για καθορισμό τεταρτοταγούς δομής είναι η χρήση κρυσταλλογραφίας ακτινών Χ. Δυστυχώς μέχρι τώρα δεν έχει καταστεί δυνατή η λήψη και μελέτη καλής ποιότητας κρυστάλλων του AChR. Για το λόγο αυτό, οι μόνες, αλλά ικανοποιητικές πληροφορίες για την κατανόηση της τρισδιάστατης δομής του προκύπτουν από εφαρμογή της κρυο-ηλεκτρονικής κρυσταλλογραφίας σε δυσδιάστατους κρυστάλλους του Torpedo υποδοχέα [59]. Η δομή του AChR, προέκυψε αρχικά μετά από ποσοτική ανάλυση της αλληλουχίας του Torpedo υποδοχέα [28] και σύμφωνα με αποτελέσματα προσδιορισμού μοριακού βάρους [11, 60]. Μελέτες ηλεκτρονικής μικροσκοπίας όχι υψηλής ευκρίνεια (17Ǻ), ανίκανες να καθορίσουν σε επίπεδο ατόμου, ικανές όμως να προσδιορίσουν τη μορφή και τις διαστάσεις του υποδοχέα, καθώς και τη θέση πρόσδεσης υποκαταστατών και τον τρόπο οργάνωσης του ιοντικού καναλιού [44, 46, 61], έδειξαν τη συμμετρική τοποθέτηση των πέντε υπομονάδων γύρω από ένα άξονα συμμετρίας καθώς και τη σχετική πενταγωνική δομή του υποδοχέα. Υπολογίζεται κατ αυτόν τον τρόπο η διάμετρος του υποδοχέα περί τα 85Ǻ και αποδεικνύεται ότι στην κυτταροπλασματική

22 και εξωκυτταρική περιοχή ο πόρος παρουσιάζει μεγαλύτερο εύρος, το οποίο και μικραίνει σημαντικά στην περιοχή της διπλοστοιβάδας. Αξιοσημείωτο είναι ότι ο δίαυλος αυτός του υποδοχέα εκτείνεται αρκετά στο εξωκυττάριο περιβάλλον. Από μελέτες ηλεκτρονικής μικροσκοπίας ανάλυσης 9Ǻ σε Torpedo υποδοχείς [62], αποκάλυψαν το κυλινδρικό σχήμα του AChR και τις πέντε υπομονάδες που σχηματίζουν το κανάλι. Υπολογίστηκε η μέση διάμετρος στης εξωκυτταρικής και διαμεμβρανικής περιοχής στα 65Ǻ, διάσταση που μικραίνει στο εσωκυτταρικό τμήμα. Το συνολικό μήκος του AChR εντοπίζεται περί τα Ǻ, τα 60Ǻ εκ των οποίων εκτείνονται στην εξωκυτταρική πλευρά, ενώ 30Ǻ διαπερνούν την μεμβράνη (Εικόνα 1.6). Η διάμετρος στην επιφάνεια της μεμβράνης είναι 80Ǻ, ενώ η διάμετρος του πόρου είναι πολύ μικρότερη (περίπου 20Ǻ) [63]. Α. Β. Εικόνα 1.6: Πενταμερής δομή του υποδοχέα της ακετυλοχολίνης. (Α) Στην εικόνα απεικονίζονται διακρίνονται οι α-έλικες των υπομονάδων, καθώς και η δομή των β- πτυχώσεων που διαμορφώνουν την περιοχή πρόσδεσης της ακετυλοχολίνης. (Β) Κάτοψη του υποδοχέα στην οποία είναι εμφανής η εξωτερική και εσωτερική δομή του πόρου. (Miyazawa et al, 2003). Από την παραπάνω ανάλυση προέκυψαν και στοιχεία για την διαμόρφωση του AChR (κλειστός-ανοιχτός) σε τριτοταγή δομή. Αναλυτικότερα, διακρίνονται δύο διαφορετικής μορφής επιφάνειες, ανώμαλη και λεία, στην εξωκυτταρική και στο τοίχωμα του καναλιού αντίστοιχα. Το κανάλι μεταγωγής σήματος έχει διάμετρο 20-25Ǻ στην είσοδό του και στενεύει στην διαμεμβρανική περιοχή φτάνοντας τα 7-8Ǻ.

23 Πιο αναλυτικές και λεπτομερείς πληροφορίες λαμβάνουμε από την ανάλυση σε 4Ǻ [54]. Σε κάτοψη του AChR φαίνεται ο σχηματισμός του εξωτερικού δακτυλίου από τις διαμεμβρανικές περιοχές Μ1, Μ3 και Μ4, ο οποίος και καλύπτεται από τις περιοχές πρόσδεσης των υποκαταστατών. Σε αυτή την ανάλυση γίνονται διακριτές και οι α-έλικες των Μ2 περιοχών, εκτεθειμένες στα ιόντα που διαπερνούν το κανάλι (Εικόνα 1.7). Από μελέτες σε επίπεδα ανάλυσης 4Å, αποδεικνύεται ότι η πρόσδεση της ACh προκαλεί περιστροφή των β-πτυχωτών επιφανειών, η οποία μεταδίδεται και οδηγεί στο άνοιγμα του καναλιού. Οι δύο α υπομονάδες έχουν διαφορετική προτεταμένη δομή από τις υπόλοιπες τρεις υπομονάδες κατά την κλειστή διαμόρφωση του καναλιού, καθώς και διαφορετικές αλληλεπιδράσεις στις μεσεπιφάνειες μεταξύ των υπομονάδων. Η περιοχή πρόσδεσης της ACh, διαθέτει αρκετά χαρακτηριστικά που είναι εμφανή και στη δομή της AChBP (Εικόνα 1.8). Παρ όλα αυτά, η οργάνωση των Β και C θηλιών στην περιοχή πρόσδεσης του κλειστού καναλιού διαφέρει από αυτή της AChBP παρουσία προσδέτη, κάτι που μαρτυρά τις τοπικές μεταβολές στη δομή. Από σύγκριση των δύο δομών, αποδεικνύεται ότι οι τοπικές μεταβολές που πραγματοποιούνται παρουσία της ACh, οδηγούν στη σταθεροποίηση της δομής του ανοιχτού καναλιού. [47]. Η αυξημένη πυκνότητα της κυτταροπλασματικής περιοχής σε AChR οφείλεται στην ραψίνη, μια πρωτεΐνη που συναντάται στους Torpedo υποδοχείς σε αναλογία 1:1 [64, 65]. Η ραψίνη είναι προσκολλημένη στον υποδοχέα και απελευθερώνεται σε αλκαλικό περιβάλλον [66, 67]. Ο ρόλος της θεωρείται ότι είναι η συνάθροιση και σταθεροποίηση υποδοχέων στη μεμβράνη (clustering), καθώς και στη σύνδεσή τους στον κυτταροσκελετό [68-71]. Από τις μελέτες για τον ακριβή προσδιορισμό του τρόπου διευθέτησης των υπομονάδων, προκύπτει μια ποικιλία δομών ανάλογα με την προέλευση του AChR. Συγκεκριμένα, στον μυϊκού τύπου υποδοχέα διακρίνονται πέντε διαφορετικές διευθετήσεις (ααγδβ, ααγβδ, αγαβδ, αβαγδ, αδαβγ), καθώς και οι κατοπτρικές τους γύρω από το κανάλι. Οι δύο πρώτες, ααγδβ και ααγβδ, απορριφθήκαν βάσει πειραματικών δεδομένων [72, 73]. Από μελέτες ηλεκτρονικής μικροσκοπίας αποκλείστηκε και η πέμπτη πιθανή διαμόρφωση, δηλαδή αδαβγ [72]. Για τις δύο εναπομείναντες διαμορφώσεις, υπάρχουν πειραματικά δεδομένα που τις στηρίζουν.

24 Εικόνα 1.7: Κάτοψη και εγκάρσια τομή του υποδοχέα. Διακρίνονται οι 5 α-έλικες των Μ2 περιοχών (Unwin, 2005). Συγκεκριμένα, δεδομένα από κρυσταλλογραφικές μελέτες δυσδιάστατων κρυστάλλων σε Torpedo υποδοχείς [74], πειράματα διασύνδεσης των υπομονάδων με τη βοήθεια α-νευροτοξινών [75] και φωτοενεργοποιημένα παράγωγά τους υποστηρίζουν τη διαμεσολάβηση της β υπομονάδας [76], ενώ μελέτες από ηλεκτρονική μικροσκοπία υποστηρίζουν την παρεμβολή της γ υπομονάδας [72, 77, 78]. Το τελευταίο μοντέλο είναι και το επικρατέστερο, καθώς οι θέσεις πρόσδεσης της ακετυλοχολίνης εντοπίζονται μεταξύ των α/γ και α/δ υπομονάδων [79-82]. Μελέτες με χιμαιρικές υπομονάδες, υποστηρίζουν το μοντέλο αυτό [83]. Με χρήση φωτοενεργοποιημένων παραγώγων της α-νευροτοξίνης μπόρεσε να διευκρινιστεί και ποια από τις δύο κατοπτρικές μορφές είναι η ορθή [84]. Τα πειραματικά δεδομένα δικαιολογούν τη διάταξη α L γα Η βδ, με α L και α Η τις χαμηλής και υψηλής συγγένειας για την ακετυλοχολίνη α υπομονάδα (Εικόνα 1.4). Όσο αφορά τον νευρικό AChR, τα δεδομένα είναι πολύ περιορισμένα, καθώς είναι ιδιαίτερα δύσκολη η απομόνωση του [18]. Σίγουρο όμως είναι, ότι διαθέτει παραπλήσιο μοριακό βάρος με τον μυϊκού τύπου υποδοχέα. Αυτό, σε συνδυασμό με το γεγονός ότι και ο αριθμός των αμινοξικών καταλοίπων των νευρικών υπομονάδων είναι περίπου 600αμινοξέα (αα), αριθμός περίπου ίσος με τις μυϊκού τύπου

25 υπομονάδες, υποδεικνύει την πιθανότητα σχηματισμού πενταμερών νευρικών υποδοχέων. Η πρωτεΐνη πρόσδεσης ακετυλοχολίνης από το σαλιγκάρι (AChBP) Οι δομικές γνώσεις μας για τον υποδοχέα ακετυλοχολίνης διευρύνθηκαν πολύ μετά τη λύση της δομής της AChBP από το σαλιγκάρι Lymnaea stagnalis, με κρυσταλλογραφία ακτινών Χ και ανάλυση 2,7Ǻ [88]. Η παραπάνω δομή παρουσιάζει αυξημένη ομολογία με τα εξωκυτταρικά τμήματα τόσο του νευρικού α7 υποδοχέα (24%), όσο και με τις μυϊκού τύπου υπομονάδες (20-24%). Πολλά από τα συντηρημένα κατάλοιπα του AChR εντοπίζονται και στη AChBP, συμπεριλαμβανομένων και των απαραίτητων για την πρόσδεση των υποκαταστατών. Διαφορά αποτελούν τα κατάλοιπα της θηλιάς που σχηματίζεται μεταξύ των δύο κυστεϊνών, καθώς αυτά της AChBP, είναι πιο υδρόφιλα και κατά ένα λιγότερα. Η ικανότητα πρόσδεσης αγωνιστών και συναγωνιστών στην AChBP, είναι ίδια με αυτή του AChR και συνεπώς μπορεί να αποτελέσει μοντέλο για την αμινοξική διάταξη του υποδοχέα. Η τριτοταγής δομή ομοιάζει με αυτή του Torpedo υποδοχέα. Έχει μορφή κυλίνδρου ύψους 62Ǻ με εξωτερική διάμετρο 80Ǻ και εσωτερική περίπου18ǻ [55]. Σε κάτοψη το ομοπενταμερές μοιάζει με έλικα (Εικόνα 1.8), ενώ τα μόνα σημεία επαφής των υπομονάδων είναι οι μεσεπιφάνειες των διμερών που σχηματίζουν. Κάθε υπομονάδα διαθέτει δύο μεσεπιφάνειες, οι οποίες διακρίνονται συμβατικά σε θετική και αρνητική (Εικόνα 1.8). Η ομοιότητα επεκτείνεται και στη δευτεροταγή δομή των υπομονάδων, όσον αφορά τα προβλεπόμενα εξωκυτταρικά μέρη του υποδοχέα [86]. Οι διαστάσεις κάθε υπομονάδας είναι 62x47x34Ǻ και αποτελείται από μια α-έλικα στο αμινοξικό άκρο, δύο μικρές 3 10 έλικες και ένα κορμό β-πτυχωτών αλυσίδων που σχηματίζουν τη δομή β-σάντουιτς (Εικόνα 1.8). Η διάταξη αυτή μοιάζει με τροποποιημένη τοπολογία ανοσοσφαιρίνης (σε αυτή διακρίνονται επιπλέον μια β-φουρκέτα και μια β-πτυχωτή αλυσίδα). Όσον αφορά τους AChRs, αν και αυτή είναι η προβλεπόμενη δομή τους, δεν είναι εύκολο να επιβεβαιωθεί εξαιτίας αυτών των επιπλέον δομών. Οι β δομές στην AChBP, είναι τόσο πυκνά περιπλεγμένες μεταξύ τους που σχηματίζουν δύο διακριτούς υδρόφοβους κορμούς, κάτι που αποτελεί και τη βασική διαφοροποίηση αυτής της πρωτεΐνης με τις ανοσοσφαιρίνες.

26 Από τη λύση της τρισδιάστατης δομής της προκύπτουν δεδομένα για τις περιοχές αλληλεπίδρασης με τους διάφορους υποκαταστάτες, που συμφωνούν με τα ήδη υπάρχοντα δεδομένα για τον AChR. Α. Β. Εικόνα 1.8: Αναπαράσταση της τριτοταγούς δομής της AChBP. (Α) Κάθε μονομερές απεικονίζεται με διαφορετικό χρώμα και η αρίθμηση είναι αντίθετη με τη φορά της φοράς του ρολογιού με A-B, B-C, C-D, D-E και E-A να σχηματίζουν τις βασικές συμπληρωματικές περιοχές πρόσδεσης των υποκαταστατών αντιστοίχως (απεικόνιση ball-and stick). (Β) Κατακόρυφη απεικόνιση της AChBP. Η μεταξύ τους εγκάρσια περιοχή πρόσδεσης υποκαταστατών, τονίζεται μόνο για την Α (κίτρινη)-β (μπλε) μεσεπιφάνεια (Brejc et al, 2001) H ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΤΟΥ ΥΠΟΔΟΧΕΑ Ο ρόλος των υποδοχέων-καναλιών είναι να επιτρέπουν την γρήγορη μεταγωγή σήματος μεταξύ των κυττάρων και συνεπώς την καλύτερη επικοινωνία των τελευταίων. Η λειτουργία τους ελέγχεται από νευροδιαβιβαστικές ουσίες που εκκρίνονται από την μεμβράνη των προσυναπτικών κυττάρων, και με κατάλληλες διεργασίες μετατρέπονται σε νευρικό σήμα που ενισχύεται στη μεμβράνη των μετασυναπτικών κυττάρων. Η λειτουργία για όλα τα μέλη της υπερ-οικογένειας συμπεριλαμβάνει μερικά κοινά στάδια:

27 Α) Αναγνώριση της νευροδιαβιβαστικής ουσίας από τον υποδοχέα και πρόσδεση σε αυτόν Β) Ενεργοποίηση του υποδοχέα με μεταβολή της διαμόρφωσής του στο χώρο Γ) Άνοιγμα του καναλιού Δ) Επιλεκτική είσοδος ιόντων Ε) Απενεργοποίηση του καναλιού και επιστροφή στην αρχική του χωροδιάταξη. Στην περίπτωση του AChR, η πρόσδεση της ακετυλοχολίνης οδηγεί σε άνοιγμα του καναλιού και σε αλλαγές στην χωροδιάταξη του. Οι περιοχές που είναι απαραίτητες για τη λειτουργία του υποδοχέα είναι οι: Α) Θέσεις πρόσδεσης ακετυλοχολίνης, Β) Η είσοδος του καναλιού Γ) και στη συνέχεια ολόκληρο το κανάλι. H ταυτοποίηση των αμινοξέων της περιοχής πρόσδεσης της ακετυλοχολίνης, της εισόδου του καναλιού, με πειράματα τοποκατευθυνόμενης μεταλλαξηγένεσης και μελέτες ηλεκτρονικής μικροσκοπίας, βοήθησαν στην κατανόηση της λειτουργίας του υποδοχέα, καθώς και των υπολοίπων LGICs. Τύποι υποκαταστατών που προσδένονται στον υποδοχέα της ακετυλοχολίνης Ανάλογα με την περιοχή πρόσδεσης και την αλληλεπίδραση με τον υποδοχέα, με παράλληλη αλλαγή της λειτουργίας του καναλιού, οι υποκαταστάτες διακρίνονται σε τρεις βασικές κατηγορίες: Α) Αγωνιστές: Η θέση δέσμευσής τους στον υποδοχέα είναι η ίδια ή παραπλήσια με αυτή της ACh και διαθέτουν την ίδια δράση (Εικόνα 1.9) Β) Ανταγωνιστές: Η θέση δέσμευσής τους είναι η ίδια ή παραπλήσια με αυτή της ACh, διαθέτουν όμως αντίθετη δράση, αναστέλλοντας τη λειτουργία του ιοντικού καναλιού και Γ) Αλλοστερικοί τροποποιητές: Η θέση δέσμευσης είναι διαφορετική από αυτή της ACh. Είναι μια ετερογενής ομάδα, τα μέλη της οποίας έχουν την ικανότητα είτε να ενεργοποιούν, είτε να αναστέλλουν τη λειτουργία του καναλιού. Γενικότερα οι αντιστρεπτοί αγωνιστές είναι μόρια μικρά και ευκίνητα, σε αντίθεση με τους συναγωνιστικούς ανταγωνιστές, που συνήθως είναι ογκώδη μόρια και σχετικά δυσκίνητα. Υπάρχουν βέβαια και περιπτώσεις μορίων που διαθέτουν διπλή

28 δράση (άλλοτε δρουν ως αγωνιστές και άλλοτε ως ανταγωνιστές της ACh). Ένα τέτοιο μόριο είναι η κυτισίνη [87]. Εικόνα 1.9: Σχηματική αναπαράσταση της θέσης πρόσδεσης της ACh στον AChR. Οι θέσεις πρόσδεσης του νευροδιαβιβαστή σχηματίζονται κυρίως από αμινοξικά κατάλοιπα των α υπομονάδων. Κατάλοιπα από τις γ και δ υπομονάδες συμβάλλουν επίσης στην πρόσδεση της ακετυλοχολίνης. ( Αγωνιστές του υποδοχέα της ακετυλοχολίνης Ακετυλοχολίνη Αποτελεί τον ενδογενή αγωνιστή του AChR, με την ιδιότητα της μεμονωμένης ή και ταυτόχρονης διέγερσης ή αναστολής των μετασυναπτικών κυττάρων. Ο καθορισμός όμως μιας σύναψης ως διεγερτική ή ανασταλτική αποτελεί ρόλο του ίδιου του υποδοχέα της ακετυλοχολίνης. Ένας δεύτερος ρόλος του AChR είναι και ο καθορισμός της απευθείας ή της έμμεσης ενεργοποίησης του διαύλου από την νευροδιαβιβαστική ουσία ή μέσω ενός δεύτερου μεταβιβαστικού μορίου (πρώτη και δεύτερη περίπτωση αντίστοιχα). Στα σπονδυλωτά η ACh αλληλεπιδρά με τον

29 νικοτινικό υποδοχέα προκαλώντας τη διέγερση της νευρομυϊκής σύναψης. Σε περίπτωση αλληλεπίδρασης με τον μουσκαρινικό υποδοχέα προκαλεί επιβράδυνση του καρδιακού ρυθμού. Νικοτίνη Αποτελεί εξωγενή αγωνιστή του νικοτινικού υποδοχέα της ακετυλοχολίνης. Μεγαλύτερη συγγένεια σε αυτό το μόριο παρουσιάζουν οι νευρικού τύπου υποδοχείς της ακετυλοχολίνης και ειδικότερα οι ομοπενταμερείς [88]. Καρβαμυλοχολίνη Διαχωρισμός στη δράση της καρβαμυλοχολίνης δεν υπάρχει, καθώς αποτελεί αγωνιστή τόσο για νικοτινικούς όσο και για τους μουσκαρινικούς υποδοχείς της ακετυλοχολίνης, παρεμποδίζοντας της δράσης της ACh. Επιβατιδίνη Αποτελεί αγωνιστή μεγάλης συγγένειας για τον AChR που απομονώθηκε από το δέρμα του δηλητηριώδους βατράχου Epipedobates tricolor. Η συγγένεια πρόσδεσης στον νευρικού τύπου υποδοχέα είναι μεγάλη ανεξάρτητα από τον υπότυπο (όμο- ή ετεροπενταμερή). Ανάλογα της ουσίας αυτής ελέγχονται για τις φαρμακευτικές τους ιδιότητες. Ανταγωνιστές του υποδοχέα της ακετυλοχολίνης α-μπουγκαροτοξίνη Η α-μπουγκαροτοξίνη είναι το κύριο συστατικό του δηλητήριου του φιδιού Bungarus multicinctus. Αποτελείται από 74 αμινοξέα με μεγάλη συγγένεια για τον μυϊκού τύπου υποδοχέα της ακετυλοχολίνης. Η πρόσδεση είναι ειδική και ανταγωνίζεται αυτή της ακετυλοχολίνης, αναστέλλοντας τη λειτουργία του καναλιού [89, 90]. Η πρόσδεσή της δεν είναι αποκλειστική για το μυϊκού τύπου AChR, καθώς αλληλεπιδράει και με ορισμένους υποτύπους του νευρικού υποδοχέα. Ετερόλογη έκφραση των υπομονάδων του νευρικού τύπου υποδοχέα και μελέτη τους, απέδειξε την ικανότητα πρόσδεσης της α-μπουγκαροτοξίνης στα α7, α8 και α9

30 ομοπενταμερή, και παράλληλη απουσία αλληλεπίδρασης στα ετεροπενταμερή. Αν και η συγγένεια για τα ομοπενταμερή είναι αρκετά μεγάλη, συγκριτικά είναι μικρότερη από αυτή που παρουσιάζει με το μυϊκού τύπου υποδοχέα. Α- τουμποκουραρίνη Αναστέλλει τη δράση των μυϊκών AChRs, καθώς και ορισμένων υποτύπων νευρικών. Απομονώθηκε από το κουράριο, μείγμα τοξινών από φυτά, το οποίο πρωτοχρησημοποιήθηκε από τους Ινδιάνους της Νότιας Αμερικής για να παραλύουν τα θηράματά τους. Γκαλαμίνη Είναι αλλοστερικός τροποποιητής που μπλοκάρει τη δράση των μυϊκού τύπου υποδοχέων της ακετυλοχολίνης, όχι όμως και των νευρικού τύπου. Μεθυλυκακονιτίνη Είναι συναγωνιστικός ανταγωνιστής του νευρικού α7 AChR, στον οποίο και εντοπίζονται πέντε θέσεις πρόσδεσης αυτού του μορίου [91]. Περιοχές πρόσδεσης υποκαταστατών στον υποδοχέα Περιοχές πρόσδεσης ακετυλοχολίνης και άλλων υποκαταστατών Η αρχική υπόθεση για τις θέσεις πρόσδεσης της ακετυλοχολίνης στον υποδοχέα υπαγόρευε την παρουσία ορισμένων καταλοίπων των α υπομονάδων για τη δημιουργία της θέσης αυτής. Νεότερες μελέτες, αναιρώντας την υπόθεση αυτή, αποδεικνύουν την αναγκαιότητα και των γειτονικών υπομονάδων για το σχηματισμό των θέσεων πρόσδεσης, καθώς σχηματίζονται στις μεσεπιφάνειές τους με την α υπομονάδα (Εικόνα 1.9) [1, 79]. Αναγκαία είναι η παρουσία αρωματικών και υδρόφοβων καταλοίπων, καθώς και η παρουσία ενός δισουλφιδικού δεσμού μεταξύ των γειτονικών κυστεϊνών. Ο δισουλφιδικός δεσμός αποτελεί και θέση πρόσδεσης αγωνιστών και ανταγωνιστών στην α υπομονάδα [92]. Μετά από πειράματα σήμανσης με παράγωγα αγωνιστών και ανταγωνιστών και με μεταλλάξεις, διαπιστώθηκε η αναγκαιότητα της παρουσίας τεσσάρων καταλοίπων (Tyr93, Trp149,

31 Tyr190, Tyr198) για τον βαθμό αλληλεπίδρασης της ακετυλοχολίνης με τις θέσεις πρόσδεσής της στον AChR [93-97]. Οι δύο κυστεΐνες και τα τέσσερα αυτά κατάλοιπα διαπιστώθηκε ότι είναι συντηρημένα για όλων των ειδών τις α υπομονάδες, με μοναδική εξαίρεση της αντικατάστασης της Tyr 190 σε Asp στην α5 νευρική υπομονάδα. Σε τρισδιάστατη δομή, εντοπίζονται σε τρία επαρκώς διαχωρισμένα τμήματα της αμινοτελικής αλληλουχίας [98]. Αντίστοιχα κατάλοιπα έχουν εντοπιστεί και στις γ και δ υπομονάδες, τα οποία συμμετέχουν στην δημιουργία των θέσεων πρόσδεσης. Με πειράματα μεταλλάξεων, αποδείχθηκε η σημαντικότητα των Asp174 και των Asp180, Glu189 (στην γ και δ υπομονάδα αντίστοιχα) για τη αλληλεπίδραση της ακετυλοχολίνης με τον υποδοχέα. Επιπρόσθετα, πειράματα φωτοενεργοποίησης προσθέσανε δύο επιπλέον κατάλοιπα στα σημαντικά για τον σχηματισμό της θέσης πρόσδεσης (Trp55 και Trp57, στις γ και δ υπομονάδες αντίστοιχα). Τον κύριο ρόλο στη δημιουργία των θέσεων πρόσδεσης έχουν τα κατάλοιπα που εντοπίζονται στις τρεις διακριτές θηλιές (A, B, C) των α υπομονάδων, ενώ δευτερεύοντα διαδραματίζουν τα κατάλοιπα των γειτονικών υπομονάδων που συνεισφέρουν σε τρεις επιπλέον διακριτές θηλιές (D, E, F) (Εικόνα 1.9). Τα σημαντικά αυτά κατάλοιπα είναι αρωματικά, διαπίστωση που επιβεβαιώθηκε και πειραματικά μετά την ανάλυση της δομής της ακετυλοχολινεστεράσης [99] και με την βοήθεια ενός αντισώματος έναντι της φωσφοχολίνης [100, 101]. Τα κατάλοιπα που χαρακτηρίστηκαν ως σημαντικά για τη δημιουργία της θέσης πρόσδεσης έχουν ταυτοποιηθεί στη μυϊκή α1 και στις νευρικές α2, α3, α4 και α6 υπομονάδες. Κατάλοιπα που έχουν δευτερεύοντα ρόλο, έχουν ταυτοποιηθεί για τις μυϊκές γ, δ και ε και στις νευρικές β2 και β4 υπομονάδες. Υπάρχουν και υπομονάδες οι οποίες φαίνεται να μη συνεισφέρουν κατάλοιπα στην θέση πρόσδεσης, τέτοιες είναι η μυϊκή β1 και οι νευρικές α5 και β3 [102]. Στον μυϊκού τύπου υποδοχέα, οι θέσεις πρόσδεσης δημιουργούνται στις μεσεπιφάνειες α-γ και α-δ. Η διαφορά των δύο γειτονικών υπομονάδων, υπαγορεύει και διαφορετικό βαθμό πρόσδεσης στις αντίστοιχες θέσεις. Στους νευρικού τύπου ομοπενταμερείς AChRs (α7, α8 και α9), τόσο τα κύρια όσο και τα δευτερεύοντα κατάλοιπα, εντοπίζονται στην ίδια υπομονάδα. Κρυσταλλογραφικά δεδομένα από μελέτες υψηλής ανάλυσης [103] της AChBP με τους αγωνιστές νικοτίνη και καρβαμυλοχολίνη, απέδειξαν ότι τα κατάλοιπα των θηλιών A, B, C, D, E και F είναι απαραίτητα για την μεταξύ τους αλληλεπίδραση. Τόσο η νικοτίνη όσο και η καρβαμυλοχολίνη έχουν κοινή θέση πρόσδεσης και

32 προκαλούν τις ίδιες μεταβολές στο χώρο μετά την πρόσδεσή τους, καθώς τα κατάλοιπα που συμμετέχουν στην αλληλεπίδραση, μετακινούνται προς τον αγωνιστή περιβάλλοντας τον. Η μεγαλύτερη μεταβολή από την κίνηση των καταλοίπων εντοπίζεται στην θηλιά C. Η πρόσδεση του αγωνιστή προκαλεί μια σειρά από μεταβολές στην χωροδιάταξη του AChR, ξεκινώντας από την εξωκυτταρική περιοχή μέχρι και το εσωκυτταρικό μέρος του AChR. Οι μεταβολές στην διαμόρφωση του υποδοχέα συνεπάγεται και μεταβολές των λειτουργικών καταστάσεών του. Μια πρώτη εκτίμηση για την θέση πρόσδεσης της ακετυλοχολίνης με την μέθοδο μεταφοράς ενέργειας φθορισμού, καθορίζει μια περιοχή 25Å κάτω από το εξωκυτταρικό άκρο του υποδοχέα. Μεταγενέστερα δεδομένα από ηλεκτρονική μικροσκοπία, επιβεβαιώνουν την αρχική εκτίμηση, καθώς προσδιορίζει την θέση πρόσδεσης στα 30Å από το επίπεδο της κυτταροπλασματικής μεμβράνης. Θέση πρόσδεσης της α-μπουγκαροτοξίνης Η α-μπουγκαροτοξίνη μπορεί και προσδένεται τόσο στον ανέπαφο υποδοχέα όσο και στην αποδιαταγμένη α υπομονάδα του Torpedo californica. Ο βαθμός συγγένειας για τον ανέπαφο υποδοχέα παρουσιάζεται μεγαλύτερος από αυτόν της αποδιαταγμένης α υπομονάδας. Από τα παραπάνω δεδομένα συνάγεται το συμπέρασμα ότι για την ισχυρότερη πρόσδεση της α-μπουγκαροτοξίνης απαιτείται η ανέπαφη δομή της α υπομονάδας. Ο πλήρης προσδιορισμός της περιοχής πρόσδεσης εντοπίστηκε με χρήση πρωτεολυμένων πεπτιδίων [ ] και ανασυνδυασμένα τμήματα [ ] της α υπομονάδας, καθώς και συνθετικά πεπτίδια [ ]. Συνδυαστικά δεδομένα που προήλθαν από τις παραπάνω πειραματικές διεργασίες οδήγησαν στον εντοπισμό της κύριας περιοχής πρόσδεσης της α-μπουγκαροτοξίνης σε μια μικρή αμινοξική αλληλουχία στην α υπομονάδα, συμπεριλαμβανομένων και των κυστεϊνών στις θέσεις 192 και 193. Διεξοδικότερες μελέτες με συνθετικά πεπτίδια χαρτογράφησαν την περιοχή πρόσδεσης της α-μπουγκαροτοξίνης στο α επταπεπτίδιο, ως αναγκαία και επαρκή για την πρόσδεση της τοξίνης [115]. Για τον εντοπισμό των απαραίτητων αμινοξέων χρησιμοποιηθήκαν πεπτιδικά ανάλογα της α υπομονάδας [115, 116] και πειράματα σημειακών μεταλλάξεων [117], τα οποία χαρακτήρισαν τα Tyr189, Tyr190, Cys 192, Cys193 και Asp185 ως απαραίτητα, ενώ

33 το δυσουλφιδικό δεσμό Cys192-Cys193 ως μη αναγκαίο για την πρόσδεση της α- μπουγκαροτοξίνης. Λειτουργικές καταστάσεις και αλλοστερικές τροποποιήσεις του AChR Ο ακριβής αριθμός των διαφορετικών λειτουργιών του υποδοχέα δεν είναι ακόμα γνωστός, εντούτοις υπάρχουν τουλάχιστον τρεις εξακριβωμένες και τεκμηριωμένες λειτουργικές καταστάσεις (Εικόνα 1.10) [88, ]. Αναλύοντας τις καταστάσεις αυτές, εντοπίζονται οι: Εικόνα 1.10: Σχηματική αναπαράσταση των διαφορετικών διαμορφώσεων του AChR υπό την επίδραση του αλλοστερικού τροποποιητή (ακετυλοχολίνη) (Changeux et al, 1993). Α) Κατάσταση ηρεμίας: Χαρακτηρίζεται η κατάσταση απουσίας του υποκαταστάτη. Η κατάσταση αυτή είναι η πιο σταθερή και οι περισσότερες πιθανές διαμορφώσεις περιγράφονται από κλειστή μορφή του υποδοχέα. Β) Ενεργές καταστάσεις: Είναι σύντομες σε σχέση με τις καταστάσεις ηρεμίας, παροδικές και ασταθείς. Η διάρκειάς τους υπολογίζεται σε δέκατα του ms μετά από πρόσδεση της ACh. Οι περισσότερες πιθανότητες διαμόρφωσης του μορίου του υποδοχέα χαρακτηρίζονται από άνοιγμα του καναλιού.

34 Γ) Καταστάσεις απευαισθητοποίησης: Χαρακτηρίζεται το μεσοδιάστημα μεταξύ της πρόσδεσης του αγωνιστή (ACh) στον υποδοχέα και τη μετάβαση στην κατάσταση ηρεμίας. Η διάρκειά τους είναι μεγαλύτερη από αυτή των ενεργών καταστάσεων (υπολογίζεται σε δέκατα του s). Σε αυτή την κατάσταση, ο AChR παρουσιάζει αυξημένη συγγένεια για την ACh, με την μόνη διαφορά ότι το κανάλι είναι κλειστό. Η σταθερότητα της αργής έναρξης της κατάστασης απευαισθητοποίησης ενισχύεται παρουσία του αγωνιστή (ACh). Έχει βρεθεί ότι από την στιγμή πρόσδεσης της ACh στον AChR μεσολαβεί ένα διάστημα 20μs για το άνοιγμα του καναλιού. Σε αυτή την φάση υπάρχει μεγάλη πιθανότητα το κανάλι να εξακολουθεί να είναι ανοιχτό μέχρι την έναρξη της απευαισθητοποίησης ή μέχρι και την αποικοδόμηση της ACh [125]. Καθώς η υδρόλυση της ACh από την ακετυλοχολινεστεράση των μετασυναπτικών μεμβρανών γίνεται ταχύτατα, δεν είναι εύκολο να διευκρινιστεί ο ρόλος της απευαισθητοποίησης στην συνολική λειτουργία [2, 126]. Οι μόνες σίγουρες πληροφορίες για τον ρόλο της απευαισθητοποίησης περιορίζονται μόνο στη δράση της τόσο σε φυσιολογικές, όσο και σε παθολογικές καταστάσεις, καθώς και στη νευροδιαβίβαση υπό την παρουσία άλλων νευροδιαβιβαστών [127]. Η μετάβαση μεταξύ των διαφορετικών καταστάσεων του AChR γίνεται αλλοστερικά μετά από δέσμευση και αποδέσμευση των διαφόρων υποκαταστατών (τόσο αγωνιστών, όσο και συναγωνιστικών ανταγωνιστών). Η κατάσταση αυτή συνεπάγεται, αλλαγές στη διαμόρφωση του μορίου του υποδοχέα της ακετυλοχολίνης, τόσο στο εξωκυτταρικό, όσο και στο διαμεμβρανικό μέρος του υποδοχέα, κάτι που προέκυψε από πειράματα ηλεκτρονικής μικροσκοπίας, παρουσία και απουσία ACh [61]. Στις μελέτες του ετεροπενταμερών, η μετάβαση στην ενεργή κατάσταση, ευνοείται από την κατάληψη και των δύο θέσεων πρόσδεσης των αγωνιστών και με συνεργιστικό τρόπο [128]. Διαφορετικοί υποκαταστάτες, σταθεροποιούν τον υποδοχέα στην διαμόρφωση εκείνη στην οποία ευνοείται η πρόσδεση τους σε αυτόν. Οι αγωνιστές ακετυλοχολίνη και νικοτίνη, σταθεροποιούν το μόριο στην ενεργή και στην κατάσταση απευαισθητοποίησης, ενώ οι συναγωνιστικοί ανταγωνιστές, όπως η α- μπουγκαροτοξίνη, προτιμούν την κατάσταση ηρεμίας.

35 Το ιοντικό κανάλι Οι υποδοχείς που δρουν ως δίαυλοι, διακρίνονται για τις ακόλουθες δύο λειτουργίες τους: Α) Την αναγνώριση και τη δέσμευση νευροδιαβιβαστικών ουσιών που εκκρίνονται από την προσυναπτική μεμβράνη και Β) Τον έλεγχο των ιόντων που διέρχονται από το κανάλι. Βάσει των παραπάνω χαρακτηριστικών ιδιοτήτων μπορούν να διακριθούν και οι αντίστοιχες περιοχές του υποδοχέα που τις επιτελούν: Ι) Την περιοχή δέσμευσης των νευροδιαβιβαστικών ουσιών, που αποτελεί το εξωκυτταρικό μέρος του. Για την αλληλεπίδραση του υποδοχέα με την ακετυλοχολίνη, υπάρχουν αρκετές πληροφορίες σχετικά με την μοριακή δομή, σε επίπεδο ατόμου και για τα δύο μόρια. Οι πληροφορίες αυτές παρέχουν αρκετές γνώσεις σχετικά με τις αλλαγές στη χωροδίαταξη κατά την πρόσδεση της νευροδιαβιβαστικής ουσίας και την μεταβολή του υποδοχέα κατά το άνοιγμα του καναλιού [54]. ΙΙ) Την περιοχή όπου διέρχονται τα ιόντα, τον διαμεμβρανικό πόρο. Η διαμεμβρανική περιοχή διαθέτει ορισμένα ειδικά χαρακτηριστικά. Αρχικά αποτελεί την πιο περιορισμένη περιοχή του πόρου, γεγονός που οφείλεται στην ελάχιστη απόσταση μεταξύ των Μ2 και την παρουσία αμινοξέων μεγάλου όγκου (Εικόνα 1.11). Παράλληλα παρουσιάζει μια απόλυτη συμμετρία στην περιοχή αυτή η οποία οφείλεται στην κατανομή των αμινοξέων της Μ2 (Εικόνα 1.5). Τα αμινοξέα αυτά δημιουργούν επαφές μεταξύ των γειτονικών Μ2 περιοχών των υπομονάδων. Οι επαφές αυτές είναι δύο επιπέδων. α) Το πρώτο εμπλέκει μια λευκίνη (L251) με τη γειτονική της αλανίνη (ή σερίνη) και β) το δεύτερο χαρακτηρίζεται από την αλληλεπίδραση μιας βαλίνης (V255) (ή μιας ισολευκίνης) με την γειτονική φαινυλαλανίνη (F256). Οι πλευρικές ομάδες των αμινοξέων αυτών δημιουργούν ένα ισχυρό δεσμό μεταξύ των Μ2 περιοχών των υπομονάδων του AChR, σχηματίζοντας ένα στενό υδροφοβικό πέρασμα στο κέντρο του πόρου. Η σημαντικότητα αυτών των δύο αμινοξικών καταλοίπων αποδεικνύεται από την παρουσία τους σε όλες τις υπομονάδες του AChR [54]. Οι πλευρικές αλυσίδες των αμινοξικών καταλοίπων των Μ2 περιοχών καθορίζουν και την είσοδο του καναλιού, το εύρος του οποίου είναι τέτοιο, ώστε να επιτρέπει την