ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΧΗΜΕΙΑΣ & ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΤΡΟΦΙΜΩΝ ΜΑΡΙΑ Π.

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΧΗΜΕΙΑΣ & ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΤΡΟΦΙΜΩΝ ΜΑΡΙΑ Π. ΒΛΑΧΟΥ ΠΤΥΧΙΟΥΧΟΣ ΓΕΩΠΟΝΟΣ Α.Π.Θ. ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΜΔΕ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΚΕΣ ΕΠΕΜΒΑΣΕΙΣ ΚΑΤΑ ΤΗΝ ΟΙΝΟΠΟΙΗΣΗ ΤΗΣ ΠΟΙΚΙΛΙΑΣ OΨΙΜΟΣ ΕΔΕΣΣΗΣ ΜΕΡΟΣ Ι I ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΣΤΟ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΟ ΣΕ ΦΑΙΝΟΛΙΚΕΣ ΕΝΩΣΕΙΣ ΚΑΙ ΠΟΛΥΣΑΚΧΑΡΙΤΕΣ Επιβλέπουσα Ευφημία Χατζηδημητρίου Επίκουρη Καθηγήτρια ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2011

2 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΧΗΜΕΙΑΣ & ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΤΡΟΦΙΜΩΝ ΜΑΡΙΑ Π. ΒΛΑΧΟΥ ΠΤΥΧΙΟΥΧΟΣ ΓΕΩΠΟΝΟΣ Α.Π.Θ. ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΜΔΕ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΚΕΣ ΕΠΕΜΒΑΣΕΙΣ ΚΑΤΑ ΤΗΝ ΟΙΝΟΠΟΙΗΣΗ ΤΗΣ ΠΟΙΚΙΛΙΑΣ OΨΙΜΟΣ ΕΔΕΣΣΗΣ ΜΕΡΟΣ Ι I ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΣΤΟ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΟ ΣΕ ΦΑΙΝΟΛΙΚΕΣ ΕΝΩΣΕΙΣ ΚΑΙ ΠΟΛΥΣΑΚΧΑΡΙΤΕΣ Τριμελής Εξεταστική Επιτροπή: Μαρία Ζ. Τσιμίδου, Καθηγήτρια του Τμήματος Χημείας του Α.Π.Θ. Βασίλειος Κιοσέογλου, Καθηγητής του Τμήματος Χημείας του Α.Π.Θ. Ευφημία Χατζηδημητρίου, Επίκουρη Καθηγήτρια του Τμήματος Χημείας του Α.Π.Θ. ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ

3 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Αντικείμενο της παρούσας μεταπτυχιακής διπλωματικής εργασίας, ήταν η μελέτη της επίδρασης διαφόρων τεχνολογικών επεμβάσεων, κατά την οινοποίηση λευκής ποικιλίας η οποία στερείται ποικιλιακού αρώματος (Όψιμος Εδέσσης), στο περιεχόμενο σε φαινολικές ενώσεις και πολυσακχαρίτες. Το πρώτο μέρος των αποτελεσμάτων της πειραματικής διαδικασίας που αφορούσε την επίδραση των επεμβάσεων αυτών στο περιεχόμενο των οίνων σε πτητικές ενώσεις, αναφέρεται αναλυτικά στην μεταπτυχιακή διπλωματική εργασία της συμφοιτήτριάς μου κας Ζ. Βάρα, η οποία εκπονήθηκε παράλληλα. Η εργασία εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Χημείας και Τεχνολογίας Τροφίμων του Τμήματος Χημείας του Αριστοτέλειου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης, καθώς και στην οινοποιία Ευάγγελος Τσάνταλης Α.Ε., στα πλαίσια του Προγράμματος Μεταπτυχιακών Σπουδών για την απόκτηση του Μεταπτυχιακού Διπλώματος Ειδίκευσης στη Χημεία με έμφαση στη Χημεία & Τεχνολογία Τροφίμων, υπό την επίβλεψη της Επίκουρης Καθηγήτριας κας Ευφημίας Χατζηδημητρίου, την οποία και ευχαριστώ θερμά για την επιστημονική και ηθική της συμπαράσταση. Ευχαριστώ την Καθηγήτρια κα. Μαρία Ζ. Τσιμίδου και τον Καθηγητή κ. Βασίλειο Κιοσέογλου, για τις διορθώσεις και τις επισημάνσεις τους επί του παρόντος κειμένου, αλλά και για τις πολύτιμες υποδείξεις τους, ως μέλη της τριμελούς εξεταστικής επιτροπής. Ευχαριστώ επίσης θερμά την οινοποιία Ε. Τσάνταλης για τη διευκόλυνση στις οινολογικές επεμβάσεις της πειραματικής διαδικασίας, τα μέλη του panel που πραγματοποίησε την οργανοληπτική εξέταση των πειραματικών οίνων (κα. Άννα Γκουλιώτη, κα. Αγγελική Μπίμπα, κα Αθηνά Τσώλη, κ. Γιάννη Δημάκη, κ. Στέφανο Κουνδουρά, κ. Παναγιώτη Κυριακίδη και κ. Δημήτρη Μανιάτη), καθώς και την εταιρεία Αμπελοοινική Ε.Π.Ε. για την ευγενική παραχώρηση του χώρου στον οποίο πραγματοποιήθηκε η οργανοληπτική εξέταση. Τέλος, αφιερώνω το παρόν σύγγραμμα στους γονείς μου Περικλή και Αγγελική, για τον τρόπο με τον οποίο στηρίζουν πάντα τις επιλογές μου, καθώς και για την αγάπη με την οποία με περιβάλλουν. Στον Περικλή, τον Κωνσταντίνο, τη Γεωργία και τον Ηλία. Μαρία Βλάχου Θεσσαλονίκη, Νοέμβριος

4 Σε εκείνους που με στήριξαν και με ενθάρρυναν 4

5 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Η ποιότητα του οίνου καθορίζεται από ένα σύνολο παραμέτρων, μεταξύ των οποίων, το άρωμα και η γεύση θεωρούνται πρωταρχικές. Μετά την ολοκλήρωση της αλκοολικής ζύμωσης, ο φρέσκος οίνος είτε μεταγγίζεται, είτε μπορεί να παραμείνει και να «ωριμάσει» για κάποιο χρονικό διάστημα με τις οινολάσπες. Κατά τη διάρκεια της παραμονής του με τις οινολάσπες, ο οίνος εμπλουτίζεται με διάφορα συστατικά που απελευθερώνονται από τα νεκρά κύτταρα των ζυμών, χάρη στο αυθόρμητο φαινόμενο της αυτόλυσης. Τα συστατικά αυτά, μαζί με τις πτητικές ενώσεις, οι οποίες σχηματίζονται κατά την αλκοολική ζύμωση, συμβάλλουν στην πολυπλοκότητα και τη βελτίωση της ποιότητας του παραγόμενου οίνου. Στόχος της παρούσας εργασίας, ήταν η μελέτη σε βιομηχανική κλίμακα, της επίδρασης διαφόρων τεχνολογικών επεμβάσεων κατά την οινοποίηση λευκής ποικιλίας η οποία στερείται ποικιλιακού αρώματος, προκειμένου να αποκτηθεί ένα αναβαθμισμένο προϊόν με εμπορικό ενδιαφέρον, στο περιεχόμενο του σε φαινολικές ενώσεις και πολυσακχαρίτες. Για το σκοπό αυτό επιλέχθηκαν τρία εμπορικά στελέχη S. cerevisiae, τα οποία χρησιμοποιούνται ευρέως στη λευκή οινοποίηση και δύο εμπορικά ενζυμικά σκευάσματα με διαφορετικές δράσεις, τα οποία χρησιμοποιήθηκαν σε διαφορετικές δόσεις. Η λευκή ποικιλία αμπέλου που επιλέχθηκε, ήταν η γηγενής Vitis vinifera L. Όψιμος Εδέσσης. Διαπιστώθηκαν κάποιες διαφοροποιήσεις στα επίπεδα των φαινολικών συστατικών των οίνων και των πολυσακχαριτών, τόσο σε σχέση με το στέλεχος του ζυμομύκητα που χρησιμοποιήθηκε για την αλκοολική ζύμωση, όσο και σε σχέση με την προσθήκη ενζύμων κατά την ωρίμανση του φρέσκου οίνου σε επαφή με τις οινολάσπες. Από τα αποτελέσματα, διαφάνηκε ότι είναι δυνατό, με απλές τεχνολογικές παρεμβάσεις, να επιτευχθεί ποιοτική αναβάθμιση των οίνων που στερούνται ποικιλιακού αρώματος. Λέξεις κλειδιά: Φαινολικές ενώσεις, πολυσακχαρίτες, Vitis vinifera L. Όψιμος Εδέσσης, λευκή οινοποίηση, Saccharomyces cerevisiae, εμπορικά ενζυμικά σκευάσματα, ωρίμανση σε οινολάσπες. 5

6 ABSTRACT The quality of wine is determined by a set of parameters, among which the aroma and taste are considered primary. After completion of alcoholic fermentation, the fresh wine is either transferred or it can stay and "mature" for some time on the lees. During this stay on the lees, the wine is enriched with various ingredients that are released from dead yeast cells due to the phenomenon of spontaneous autolysis. These components, together with the volatile compounds formed during alcoholic fermentation, contribute to the complexity and quality amelioration of the wine produced. The aim of this work was to study on an industrial scale the effect of various technological treatments during vinification of a white grape variety lacking varietal aroma in order to get an upgraded product with a commercial interest, on the levels of phenolic components and polysaccharides of the latter. For this purpose, three commercial strains of Saccharomyces cerevisiae widely used in white wine vinification were selected and two commercial enzyme preparations of different action were employed at different dosages. The white grape variety that was selected was the native Vitis vinifera L. var Opsimos Edessis. Slight differences in the levels of the phenolic components and polysaccharides of wines with regard to the yeast strain used for fermentation as well as the addition of enzymes during contact with the lees were detected. These results indicate that is possible with simple technological interventions to achieve quality improvement of wines lacking varietal aroma. Key words: Phenolic compounds, polysaccharides, Vitis vinifera L. var Opsimos Edessis, white vinification, Saccharomyces cerevisiae, commercial enzyme preparations, lees maturation. 6

7 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΡΟΛΟΓΟΣ... 3 ΠΕΡΙΛΗΨΗ... 5 ABSTRACT... 6 Ευρετήριο Πινάκων Ευρετήριο Σχημάτων Ευρετήριο Εικόνων ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Ιστορική αναδρομή Η άμπελος και το σταφύλι Χαρακτηριστικά της αμπέλου Η σύσταση της σταφυλής Ο βόστρυχος ή κοτσάνι Η ράγα Παράγοντες που επηρεάζουν τη φαινολική σύσταση των ραγών Καλλιεργούμενη ποικιλία Εδαφικές συνθήκες Κλιματικές συνθήκες Καλλιεργητικές τεχνικές Καλλιεργητικές επεμβάσεις Η ποικιλία Όψιμος Εδέσσης Ο οίνος Η σύσταση του οίνου

8 Η οινοποίηση Λευκή οινοποίηση Η χρήση των ζυμομυκήτων στην οινοποίηση Η χρήση των ενζύμων στην οινοποίηση Ένζυμα του Saccharomyces cerevisiae Εμπορικά οινολογικά ένζυμα Ωρίμανση του λευκού οίνου με τις οινολάσπες Φαινολικές ενώσεις Η χημεία των φαινολικών ενώσεων Τα φαινολικά οξέα και τα παράγωγά τους Τα φλαβονοειδή Ανθοκυανίνες (Ανθοκυάνες) Η χημική δομή των ανθοκυανών Ταννίνες Η χημική δομή των ταννινών Υδρολυόμενες ταννίνες Συμπυκνωμένες ταννίνες Περιεκτικότητα ελληνικών οίνων σε φαινολικές ενώσεις Πολυσακχαρίτες Ταξινόμηση πολυσακχαριτών Ρόλος των πολυσακχαριτών στην οινοποίηση Μέθοδοι προσδιορισμού των φαινολικών συστατικών και των πολυσακχαριτών του οίνου Προσδιορισμός ολικών φαινολών με τη μέθοδο Folin-Ciocalteau

9 Προσδιορισμός ολικών φλαβανολών με τη μέθοδο της π- διμεθυλαμινοκινναμωμικής αλδεΰδης (DMACA) Προσδιορισμός ολικών πολυσακχαριτών με τη μέθοδο φαινόληςθειϊκού οξέος Σκοπός της εργασίας...53 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Δείγματα Πρότυπες ενώσεις Αντιδραστήρια-Διαλύτες Όργανα-Συσκευές Γυάλινα σκεύη Λοιπός εξοπλισμός Πειραματική λευκή οινοποίηση Βασικό πρωτόκολλο Ζυμομύκητες Ένζυμα Μέθοδοι Προσδιορισμός ολικών φαινολών με τη μέθοδο Folin-Ciocalteau Προσδιορισμός ολικών φλαβανολών με τη μέθοδο της π- διμεθυλαμινοκινναμωμικής αλδεΰδης (DMACA) Προσδιορισμός ολικών πολυσακχαριτών με τη μέθοδο φαινόληςθειϊκού οξέος Παραλαβή των πολυσακχαριτών του οίνου Κυρίως προσδιορισμός των πολυσακχαριτών Οργανοληπτική εξέταση

10 2.10. Στατιστική επεξεργασία...70 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ Ωρίμανση και χαρακτηριστικά της πρώτης ύλης Χαρακτηριστικά του οίνου μετά την ολοκλήρωση της αλκοολικής ζύμωσης Ανάλυση του οίνου Προσδιορισμός ολικών φαινολών με τη μέθοδο Folin-Ciocalteau Καμπύλη αναφοράς Αποτελέσματα ανάλυσης δειγμάτων Προσδιορισμός ολικών φλαβανολών με τη μέθοδο της π- διμεθυλαμινοκινναμωμικής αλδεΰδης (DMACA) Καμπύλη αναφοράς Αποτελέσματα ανάλυσης δειγμάτων Προσδιορισμός ολικών πολυσακχαριτών με τη μέθοδο φαινόληςθειικού οξέος Καμπύλη αναφοράς Αποτελέσματα ανάλυσης δειγμάτων Αξιολόγηση αποτελεσμάτων οργανοληπτικής εξέτασης του οίνου από την ποικιλία Όψιμος Εδέσσης Συμπεράσματα-Προτάσεις για μελλοντική έρευνα...99 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ I

11 Ευρετήριο Πινάκων Σελίδα Πίνακας 1.1. Συστηματική κατάταξη της αμπέλου 16 Πίνακας 1.2. Χαρακτηριστικά της ποικιλίας Όψιμος Εδέσσης 22 Πίνακας 1.3. Χημική σύσταση του οίνου 24 Πίνακας 1.4. Τα κυριότερα φαινολικά οξέα του σταφυλιού και του οίνου 35 Πίνακας 1.5. Τα κυριότερα φλαβονοειδή του σταφυλιού και του οίνου 37 Πίνακας 1.6. Περιεκτικότητα ελληνικών οίνων σε ολικές φαινόλες και ολικές 45 φλαβανόλες Πίνακας 2.1. Τεχνολογικές επεμβάσεις κατά την οινοποιητική διεργασία 59 Πίνακας 2.2. Χαρακτηριστικά των ζυμομυκήτων που χρησιμοποιήθηκαν στην 61 παρούσα εργασία Πίνακας 2.3. Χαρακτηριστικά των ενζυμικών σκευασμάτων που χρησιμοποιήθηκαν 62 στην παρούσα εργασία Πίνακας 3.1. Γλευκογραφικά στοιχεία σταφυλιών της ποικιλίας Όψιμος Εδέσσης 72 κατά τη συγκομιδή (έτη ) Πίνακας 3.2. Τρόπος δειγματοληψίας σταφυλιών της ποικιλίας Όψιμος Εδέσσης, 72 κατά μήκος μιας εκ των δύο διαγωνίων του αμπελώνα Πίνακας 3.3. Πορεία ωρίμανσης της ποικιλίας Όψιμος Εδέσσης, κατά την 74 οινοποιητική περίοδο 2009 Πίνακας 3.4. Αναλυτικά χαρακτηριστικά του οίνου μετά την ολοκλήρωση της 75 αλκοολικής ζύμωσης Πίνακας 3.5. Απορροφήσεις πρότυπων διαλυμάτων γαλλικού οξέος 76 Πίνακας 3.6. Μεταβολή της συγκέντρωσης (mg/l) των ολικών φαινολών, κατά τη 79 διάρκεια της ωρίμανσης παρουσία οινολασπών και ενζύμων σε οίνο από την ποικιλία Όψιμος Εδέσσης, ο οποίος προήλθε από αλκοολική ζύμωση με τη βοήθεια του στελέχους Α του ζυμομύκητα Saccharomyces cerevisiae Πίνακας 3.7. Μεταβολή της συγκέντρωσης (mg/l) των ολικών φαινολών, κατά τη διάρκεια της ωρίμανσης παρουσία οινολασπών και ενζύμων σε οίνο από την ποικιλία Όψιμος Εδέσσης, ο οποίος προήλθε από αλκοολική 80 ζύμωση με τη βοήθεια του στελέχους Β του ζυμομύκητα Saccharomyces cerevisiae Πίνακας 3.8. Μεταβολή της συγκέντρωσης (mg/l) των ολικών φαινολών, κατά τη διάρκεια της ωρίμανσης παρουσία οινολασπών και ενζύμων σε οίνο από την ποικιλία Όψιμος Εδέσσης, ο οποίος προήλθε από αλκοολική 81 ζύμωση με τη βοήθεια του στελέχους Γ του ζυμομύκητα Saccharomyces cerevisiae 11

12 Πίνακας 3.9. Απορροφήσεις πρότυπων διαλυμάτων κατεχίνης 83 Πίνακας Μεταβολή της συγκέντρωσης (mg/l) των ολικών φλαβανολών, κατά 86 τη διάρκεια της ωρίμανσης παρουσία οινολασπών και ενζύμων σε οίνο από την ποικιλία Όψιμος Εδέσσης, ο οποίος προήλθε από αλκοολική ζύμωση με τη βοήθεια του στελέχους Α του ζυμομύκητα Saccharomyces cerevisiae Πίνακας Μεταβολή της συγκέντρωσης (mg/l) των ολικών φλαβανολών, κατά τη διάρκεια της ωρίμανσης παρουσία οινολασπών και ενζύμων σε οίνο από την ποικιλία Όψιμος Εδέσσης, ο οποίος προήλθε από αλκοολική 87 ζύμωση με τη βοήθεια του στελέχους Β του ζυμομύκητα Saccharomyces cerevisiae Πίνακας Μεταβολή της συγκέντρωσης (mg/l) των ολικών φλαβανολών, κατά τη διάρκεια της ωρίμανσης παρουσία οινολασπών και ενζύμων σε οίνο από την ποικιλία Όψιμος Εδέσσης, ο οποίος προήλθε από αλκοολική 88 ζύμωση με τη βοήθεια του στελέχους Γ του ζυμομύκητα Saccharomyces cerevisiae Πίνακας Απορροφήσεις πρότυπων διαλυμάτων D-(+)-γαλακτόζης 90 Πίνακας Μεταβολή της συγκέντρωσης (mg/l) των ολικών πολυσακχαριτών, 93 κατά τη διάρκεια της ωρίμανσης παρουσία οινολασπών και ενζύμων σε οίνο από την ποικιλία Όψιμος Εδέσσης, ο οποίος προήλθε από αλκοολική ζύμωση με τη βοήθεια του στελέχους Α του ζυμομύκητα Saccharomyces cerevisiae Πίνακας Μεταβολή της συγκέντρωσης (mg/l) των ολικών πολυσακχαριτών, 94 κατά τη διάρκεια της ωρίμανσης παρουσία οινολασπών και ενζύμων σε οίνο από την ποικιλία Όψιμος Εδέσσης, ο οποίος προήλθε από αλκοολική ζύμωση με τη βοήθεια του στελέχους Β του ζυμομύκητα Saccharomyces cerevisiae Πίνακας Μεταβολή της συγκέντρωσης (mg/l) των ολικών πολυσακχαριτών, κατά τη διάρκεια της ωρίμανσης παρουσία οινολασπών και ενζύμων σε οίνο από την ποικιλία Όψιμος Εδέσσης, ο οποίος προήλθε από αλκοολική ζύμωση με τη βοήθεια του στελέχους Γ του ζυμομύκητα Saccharomyces cerevisiae 95 12

13 Ευρετήριο Σχημάτων Σελίδα Σχήμα 1.1. Αλκοολική ζύμωση 25 Σχήμα 1.2. Βασικά στάδια λευκής οινοποίησης 27 Σχήμα 1.3. Δομή φαινόλης 34 Σχήμα 1.4. Δομή ανθοκυανιδινών που απαντούν στο σταφύλι και τον οίνο 39 Σχήμα 1.5. Δομή μορίων ανθοκυανών: α) μονογλυκοζίτης-3, β) διγλυκοζίτης-3,5 39 Σχήμα 1.6. Συντακτικοί τύποι φαινολικών οξέων: α) γαλλικού οξέος, β) ελλαγικού 41 οξέος Σχήμα 1.7. Συντακτικοί τύποι των φλαβαν-3-ολών 42 Σχήμα 1.8. Σχηματική αναπαράσταση της μεταφοράς των ταννινών του σταφυλιού στον οίνο, κατά τη διάρκεια της οινοποίησης 43 Σχήμα 1.9. Σχηματική απεικόνιση τμήματος μορίου αραβινογαλακτάνης 47 (προερχόμενη από άγριο πεύκο) Σχήμα Σχηματική απεικόνιση τμήματος μορίου ραμνογαλακτουρονάνης τύπου 47 Ι Σχήμα Σχηματική απεικόνιση τμήματος μορίου ραμνογαλακτουρονάνης τύπου 48 ΙΙ Σχήμα Σχηματική απεικόνιση τμήματος μορίου ομογαλακτουρονάνης 48 Σχήμα Σχηματική παράσταση της αντίδρασης των φλαβανολών με τη π- 52 διμεθυλαμινοκινναμωμική αλδεΰδη Σχήμα 2.1. Πρωτόκολλο της λευκής οινοποίησης της οινοποιίας Ε. Τσάνταλης 57 Σχήμα 2.2. Πειραματική διαδικασία που ακολουθήθηκε μετά το τέλος της 60 αλκοολικής ζύμωσης στην παρούσα εργασία Σχήμα 2.3. Φύλλο αξιολόγησης που χρησιμοποιήθηκε στην οργανοληπτική 70 εξέταση Σχήμα 3.1. Καμπύλη αναφοράς για τον προσδιορισμό ολικών φαινολών με τη 77 μέθοδο Folin-Ciocalteau Σχήμα 3.2. Καμπύλη αναφοράς για τον προσδιορισμό ολικών φλαβανολών με τη 84 μέθοδο της π-διμεθυλαμινοκινναμωμικής αλδεΰδης Σχήμα 3.3. Καμπύλη αναφοράς για τον προσδιορισμό ολικών πολυσακχαριτών με 91 τη μέθοδο φαινόλης-θειικού οξέος Σχήμα 3.4. Επίδραση της ζύμωσης με διαφορετικά στελέχη S. cerevisiae, καθώς και 110 της ωρίμανσης με οινολάσπες και ένζυμα, στα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά οίνου από την ποικιλία Όψιμος Εδέσσης Σχήμα 3.5. Επίδραση της ζύμωσης με διαφορετικά στελέχη S. cerevisiae, καθώς και της ωρίμανσης με οινολάσπες και ένζυμα, στα αναλυτικά και οργανοληπτικά χαρακτηριστικά οίνου από την ποικιλία Όψιμος Εδέσσης

14 Ευρετήριο Εικόνων Σελίδα Εικόνα 1.1. Η κατανάλωση του οίνου στην αρχαιότητα 15 Εικόνα 1.2. Σταφυλή Vitis vinifera 17 Εικόνα 1.3. Κάθετη τομή ράγας 17 Εικόνα 1.4. Σταφυλή της ποικιλίας Όψιμος Εδέσσης 21 Εικόνα 1.5. Αμπελώνας της ποικιλίας Όψιμος Εδέσσης 21 Εικόνα 1.6. Κυτταρικό τοίχωμα Saccharomyces cerevisiae 29 Εικόνα 2.1. Διάλυμα έτοιμο προς ανάλυση, για τον προσδιορισμό των ολικών 64 φαινολών με τη μέθοδο Folin-Ciocalteau Εικόνα 2.2. Διαλύματα έτοιμα προς ανάλυση, για τον προσδιορισμό των ολικών 65 φλαβανολών με τη μέθοδο της π-διμεθυλαμινοκινναμωμικής αλδεΰδης Εικόνα 2.3. Διαλύματα έτοιμα προς ανάλυση, για τον προσδιορισμό των ολικών 68 πολυσακχαριτών με τη μέθοδο φαινόλης-θειικού οξέος Εικόνα 3.1. Σταφύλια της ποικιλίας Όψιμος Εδέσσης, οινοποιητικής περιόδου έτους Εικόνα 3.2. Σταφύλια της ποικιλίας Όψιμος Εδέσσης, οινοποιητικής περιόδου έτους

15 Κεφάλαιο 1 ο 1.1. Ιστορική αναδρομή ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Η καλλιέργεια της αμπέλου και η τέχνη της οινοποίησης, αποτελούν δύο από τα πιο χαρακτηριστικά στοιχεία των σπουδαιότερων αρχαίων πολιτισμών, οι οποίοι έδρασαν και αναπτύχθηκαν στο ανατολικό τμήμα της λεκάνης της Μεσογείου. Η μετανάστευση λαών της ανατολής προς τον ελλαδικό χώρο, συνέβαλλε στην ανάπτυξη της αμπελοκαλλιέργειας και κατ επέκταση και της οινοποίησης στη χώρα μας, γεγονός που χρονολογικά τοποθετείται γύρω στο π.χ. (Νικολάου, 2006). Ο οίνος κατείχε σημαντικότατη θέση σε πολλές από τις γιορτές των αρχαίων πολιτισμών, λόγω της θεϊκής καταγωγής την οποία πίστευαν ότι είχε (Ξαγοράρη, 1990). Με το πέρασμα των αιώνων, ο οίνος παρέμεινε άρρηκτα συνδεδεμένος με τον ελληνικό πολιτισμό, καθώς αποτέλεσε βασικό διατροφικό στοιχείο και λατρευτικό σύμβολο του χριστιανισμού (Montanari, 1997). Στη σημερινή εποχή, ο οίνος αποτελεί αναπόσπαστο τμήμα της ελληνικής ζωής, αλλά και της μεσογειακής διατροφής γενικότερα, καθώς η κατανάλωσή του είναι πλέον ευρεία και πολύ διαδεδομένη. Εικόνα 1.1. Η κατανάλωση του οίνου στην αρχαιότητα 15

16 1.2. Η άμπελος και το σταφύλι Χαρακτηριστικά της αμπέλου Η άμπελος ανήκει στην οικογένεια των Αμπελιδών (Ampelidae, Ampelidaceae, Vitaceae). Ο καρπός της αμπέλου, το σταφύλι, προορίζεται είτε για απευθείας κατανάλωση, είτε για μεταποίηση. Η συστηματική κατάταξη της αμπέλου, παρουσιάζεται στον Πίνακα 1.1. Πίνακας 1.1. Συστηματική κατάταξη της αμπέλου Βασίλειο (Regnum) Άθροισμα (Divisio) Κλάση (Classis) Υποκλάση (Subclassis) Τάξη (Ordo) Οικογένεια (Familia) Γένος (Genera) Είδος (Species) Plantae Magnoliophyta Rosidae Dicotyledones (Δικοτυλήδονα) Rhamnales (Θαμνώδη) Vitaceae (Αμπελίδες) Vitis (Άμπελος) vinifera L.(οινοφόρος) Ο αριθμός των ειδών του γένους Vitis είναι περίπου 60, με προέλευση τη Βόρεια Αμερική, την Ανατολική Ασία και την Ευρώπη (Galet, 2000). Στις αρχές της περιόδου των παγετώνων, το γένος Vitis διαχωρίστηκε σε δύο υπογένη, το Euvitis (κανονική άμπελος) και το Muscadinia. Το είδος Vitis vinifera ή Άμπελος η οινοφόρος ή Ευρωπαϊκή άμπελος, παρουσιάζει και το μεγαλύτερο ενδιαφέρον, καθώς σε αυτό ανήκουν όλες οι καλλιεργούμενες ποικιλίες αμπέλου, οι οποίες προορίζονται για οινοποίηση, για επιτραπέζια χρήση, καθώς και για σταφιδοποιία. Η άμπελος είναι ένα θαμνώδες και πολυετές φυτό, του οποίου ο κορμός χρειάζεται φυσική ή τεχνική υποστήριξη. Το φυτό της αμπέλου, αποτελείται από το υπόγειο (ριζικό σύστημα) και το υπέργειο (σταφυλή ή βότρυς ή τσαμπί) τμήμα. 16

17 Η σύσταση της σταφυλής Η σταφυλή ή βότρυς ή τσαμπί (Εικόνα 1.2.), αποτελείται από δύο κύρια μέρη (Σουφλερός, 2000): Το ξυλώδες μέρος (βόστρυχος ή κοτσάνι), σε αναλογία 30% κατ όγκο. Το εδώδιμο και οινοποιήσιμο τμήμα (ράγες), σε αναλογία 70% κατ όγκο. Ο τύπος του παραγόμενου οίνου, καθώς και η ποιότητά του, διαμορφώνονται σε μεγάλο βαθμό από τα χαρακτηριστικά του σταφυλιού, δηλαδή της πρώτης ύλης από την οποία παράγεται. Εικόνα 1.2. Σταφυλή Vitis vinifera ( Ο βόστρυχος ή κοτσάνι Ο βόστρυχος ή κοτσάνι (σκελετός της σταφυλής), είναι ένας κεντρικός άξονας, ο οποίος διακλαδίζεται σε άξονες δεύτερης και τρίτης τάξης. Από τους τελευταίους εκφύονται δύο έως πέντε ποδίσκοι, πάνω στους οποίους στηρίζονται οι ράγες. Το μέγεθος και το σχήμα των σταφυλιών, διαφέρει ανάλογα με την ποικιλία (Βλάχος, 1991). Το νερό είναι το συστατικό που απαντά σε μεγαλύτερη αναλογία στο βόστρυχο (90-70% κατά βάρος). Η ξηρή ουσία που απαντά στο βόστρυχο, αποτελείται κυρίως από ξυλώδεις ιστούς, ενώ σε μικρότερα ποσοστά απαντούν και άλλα επιμέρους συστατικά (φαινολικές ενώσεις, ανόργανα συστατικά, οργανικά οξέα, αζωτούχες ενώσεις, ρητίνες και σάκχαρα) (Σουφλερός, 2000) Η ράγα Η ράγα αποτελεί τον κύριο καρπό της αμπέλου, καθώς και τη βασική πρώτη ύλη για την παραγωγή του οίνου. Αποτελείται από το φλοιό (10-20%), τη σάρκα (74-87%) και τα γίγαρτα (3-6%), τα οποία μπορεί να απουσιάζουν από ορισμένες ποικιλίες. Ο φλοιός αποτελείται κυρίως από νερό (75-80% Εικόνα 1.3. Κάθετη τομή ράγας (Fregoni, 2005) 17

18 κατά βάρος), ενώ περιέχει και ορισμένα επιμέρους συστατικά (κυτταρίνη, πρωτεΐνες, ανόργανα συστατικά, αζωτούχες ενώσεις, φαινολικά συστατικά, οργανικά οξέα κ.ά.) (Σουφλερός, 2000). Η χημική σύσταση της σάρκας είναι κατά ένα μεγάλο μέρος ίδια με τη σύσταση του γλεύκους, καθώς εκείνη αποτελεί το κύριο συστατικό του. Αποτελείται κυρίως από νερό (65-80% κατά βάρος) και σάκχαρα (10-30% κατά βάρος), ενώ περιέχει και ορισμένα επιμέρους συστατικά (οργανικά οξέα, ανόργανα συστατικά, αζωτούχες ενώσεις, πηκτινικές ύλες και πτητικές ενώσεις) (Σουφλερός, 2000). Τα γίγαρτα (κουκούτσια), αποτελούν τα όργανα αναπαραγωγής της αμπέλου και αποτελούνται κυρίως από νερό (25-45% κατά βάρος) και υδατάνθρακες (34-36% κατά βάρος) ενώ περιέχουν και ορισμένα επιμέρους συστατικά (έλαιο, φαινολικά συστατικά, αζωτούχες ενώσεις και ανόργανα συστατικά ) (Σουφλερός, 2000) Παράγοντες που επηρεάζουν τη φαινολική σύσταση των ραγών Τα φαινολικά συστατικά αποτελούν δευτερογενείς μεταβολίτες των φυτών και συντίθενται από αυτά στη διάρκεια της φυσιολογικής τους ανάπτυξης. Σε καταστάσεις αυξημένης πίεσης, όπως είναι οι μολύνσεις και οι τραυματισμοί, τα φυτά χρησιμοποιούν τα φαινολικά συστατικά για την αντιμετώπιση των δύσκολων αυτών συνθηκών. Για το λόγο αυτό, τα βιοσυνθετικά μονοπάτια των φαινολικών συστατικών, καθίστανται ενεργά από την έναρξη της ανάπτυξης των ραγών (Naczk & Shahidi, 2004). Ορισμένοι περιβαλλοντικοί παράγοντες, οι οποίοι στο σύνολό τους χαρακτηρίζονται με τον γαλλικό όρο «terroir», επηρεάζουν άμεσα την ποιότητα των σταφυλιών και κατ επέκταση και του οίνου που παράγεται από αυτά (Koundouras et al., 2006). Συγκεκριμένα, οι παράγοντες αυτοί θεωρούνται υπεύθυνοι για το βαθμό στον οποίο πραγματοποιείται η βιοσύνθεση των φαινολικών συστατικών, επηρεάζοντας έτσι και τη γενικότερη σύσταση των σταφυλιών, η οποία σχετίζεται τόσο με την ποιότητα του οίνου, όσο και με τη δυνατότητά του για παλαίωση (Arozarena et al., 2000). Οι παράγοντες που καθορίζουν το φαινολικό δυναμικό των σταφυλιών, είναι: (α) η καλλιεργούμενη ποικιλία της αμπέλου, (β) οι εδαφικές συνθήκες, (γ) οι κλιματικές συνθήκες που επικρατούν, (δ) οι καλλιεργητικές τεχνικές που εφαρμόζονται, καθώς και (ε) οι καλλιεργητικές επεμβάσεις που πραγματοποιούνται, προκειμένου να επιτευχθεί η μέγιστη απόδοση σε συνδυασμό με την καλύτερη δυνατή ποιότητα προϊόντος. 18

19 Καλλιεργούμενη ποικιλία Κάθε ποικιλία σταφυλιών που δύναται να καλλιεργηθεί, χαρακτηρίζεται από ένα ξεχωριστό πολυφαινολικό δυναμικό. Ωστόσο, διαφορές στο πολυφαινολικό δυναμικό εμφανίζονται και ανάμεσα σε διαφορετικούς καλλιεργούμενους κλώνους κάθε ποικιλίας (Arozarena et al., 2000). Ο βαθμός ωριμότητας του σταφυλιού, διαμορφώνει κάθε χρονική στιγμή τη φαινολική του σύσταση. Συγκεκριμένα, τα φαινολικά συστατικά (ανθοκυάνες, ταννίνες) συσσωρεύονται κατά τη διάρκεια της ωρίμανσης των ραγών στο φλοιό. Έπειτα, η συγκέντρωση των ανθοκυανών ακολουθεί φθίνουσα πορεία, ενώ η συγκέντρωση των ταννινών του φλοιού συνεχίζει να αυξάνει. Την ίδια χρονική περίοδο, η συγκέντρωση των ταννινών των γιγάρτων ακολουθεί μία διαρκώς φθίνουσα πορεία (Ribéreau-Gayon et al., 2000). Τα φαινολικά συστατικά απαντούν στις ερυθρές ποικιλίες σε μεγαλύτερες συγκεντρώσεις σε σχέση με τις λευκές (Revilla et al., 2001, Revilla & González-SanJosé, 2001) Εδαφικές συνθήκες Οι ποικιλίες του είδους Vitis vinifera, έχουν την ικανότητα να προσαρμόζονται και να ευδοκιμούν σε ένα ευρύ φάσμα εδαφικών τύπων. Το μέγεθος της επίδρασης που ασκεί το έδαφος στην αύξηση και την ανάπτυξη της αμπέλου, εξαρτάται από τη δομή και τη σύστασή του, τη διαπερατότητά του, το ανάγλυφό του, την έκθεση του στην ηλιακή ακτινοβολία, την ικανότητά του προς θέρμανση και τη διαθέσιμη υγρασία του (Νικολάου, 2006). Αντίστοιχα, η επίδραση του υψομέτρου σχετίζεται τόσο με την επίδραση της θερμοκρασίας, όσο και με την επίδραση της υγρασίας, οι οποίες έχουν διαφορετικές τιμές σε διαφορετικά υψόμετρα (Mateus et al., 2001) Κλιματικές συνθήκες Η ηλιακή ακτινοβολία, η θερμοκρασία και η υγρασία, είναι οι κλιματικές παράμετροι που καθορίζουν κατά κύριο λόγο την ποιότητα της παραγόμενης πρώτης ύλης. Το έδαφος και το υψόμετρο στο οποίο βρίσκεται ο αμπελώνας, σε συνδυασμό με τις προαναφερθείσες παραμέτρους, καθορίζουν το μικροκλίμα του αμπελώνα και 19

20 διαδραματίζουν καθοριστικό ρόλο στην ωρίμανση των σταφυλιών και τη σύστασή τους σε φαινολικά συστατικά (Koundouras et al., 2006) Καλλιεργητικές τεχνικές Οι καλλιεργητικές τεχνικές σχετίζονται με τις διεργασίες που πραγματοποιούνται κατά την εγκατάσταση ενός αμπελώνα (π.χ. ρύθμιση της πυκνότητας φύτευσης του αμπελώνα, σωστή επιλογή του συστήματος μόρφωσης κ.ά) και επηρεάζουν σημαντικά, τόσο την παραγωγικότητα των πρέμνων, όσο και την ποιότητα των σταφυλιών και των προϊόντων που παράγονται από αυτά Καλλιεργητικές επεμβάσεις Οι καλλιεργητικές επεμβάσεις, πραγματοποιούνται με σκοπό την επίτευξη ιδανικότερης ισορροπίας ανάμεσα στη ζωηρότητα των πρέμνων και την ποιότητα των παραγόμενων προϊόντων. Οι χαμηλές στρεμματικές αποδόσεις οδηγούν σε καλύτερη ποιότητα προϊόντος, ενώ οι υψηλές στρεμματικές αποδόσεις οδηγούν σε μείωση των σακχάρων, των κατεχινών και των προκυανιδινών των σταφυλιών (Κουράκου-Δραγώνα, 1998). Συνεπώς, η αύξηση της ζωηρότητας και της απόδοσης των πρέμνων, έχει ως αποτέλεσμα τόσο την καθυστέρηση της ωρίμανσης, όσο και την παραγωγή σταφυλιών με χαμηλότερη περιεκτικότητα σε ανθοκυάνες και ταννίνες (Jackson & Lombard, 1993). Η σύνθεση των φαινολικών συστατικών στη ράγα του σταφυλιού, ευνοείται από την επάρκεια σε θρεπτικά συστατικά, ενώ η αύξηση της ζωηρότητας των πρέμνων, οδηγεί σε μείωση της συγκέντρωσης των φαινολικών συστατικών (Delgado et al., 2004). Η συνδυασμένη εφαρμογή λίπανσης και άρδευσης, ενισχύει την καρπόδεση και οδηγεί στο σχηματισμό ραγών με μεγαλύτερο μέγεθος και βάρος, καθώς και με μειωμένη περιεκτικότητα σε σάκχαρα (Paranychianakis et al., 2004, Des Gachons et al., 2005). Η εφαρμογή άρδευσης επηρεάζει, είτε άμεσα, είτε έμμεσα τη φυσιολογία του πρέμνου και ο βαθμός στον οποίο πραγματοποιείται, εξαρτάται από τη σχέση της φυλλικής επιφάνειας προς το βάρος των ραγών (Lakso, 1990). Το κλάδευμα αποτελεί μία από τις σπουδαιότερες καλλιεργητικές φροντίδες για τα φυτά, ενώ εφαρμόζεται τόσο στα πολυετή όσο και σε πολλά από τα μονοετή καλλιεργούμενα φυτικά είδη (Jackson & Lombard, 1993, Νικολάου, 2006). Επιπλέον, οι φυτικοί ρυθμιστές ή φυτορυθμιστικές ουσίες, ρυθμίζουν την αύξηση και την ανάπτυξη 20

21 των φυτών, επηρεάζοντας το χρόνο ωρίμανσης των σταφυλιών, αποτρέποντας προσβολές του μύκητα Botrytis cinerea και μεταβάλλοντας τη συγκέντρωση των ανθοκυανών στις ράγες των σταφυλιών ορισμένων ποικιλιών (Hiratsuka et al., 2001, Βακουφτσής, 2006, Νικολάου, 2006) Η ποικιλία Όψιμος Εδέσσης Η Όψιμος Εδέσσης είναι μια λευκή ποικιλία σταφυλιών (Εικόνα 1.4.), η οποία καλλιεργείται αποκλειστικά στη Βόρεια Ελλάδα, σε έκταση περίπου στρεμμάτων. Η χρήση της ποικιλίας μέχρι το 2007, αφορούσε κυρίως την παραγωγή σταφυλιών για επιτραπέζια κατανάλωση και λόγω της αντοχής της στις μεταφορές, η διάθεσή της γινόταν τόσο στις εσωτερικές αγορές, όσο και στις αγορές της Κεντρικής Ευρώπης. Εικόνα 1.4. Σταφυλή της ποικιλίας Εικόνα 1.5. Αμπελώνας της ποικιλίας Όψιμος Όψιμος Εδέσσης Εδέσσης Σύμφωνα με μαρτυρίες ντόπιων καλλιεργητών, η ποικιλία αυτή ήταν δυσεύρετη στην αγορά της Ελλάδας κατά την περίοδο , διότι ολόκληρη σχεδόν η ποσότητα της παραγωγής μεταφερόταν με φορτηγά στη Γερμανία και την Ιταλία. Ωστόσο, η εμφάνιση της ποικιλίας Ροζακί, που άρχισε να καλλιεργείται εκείνη την εποχή, προκάλεσε μεγάλο πλήγμα στο εμπόριο της ποικιλίας Όψιμος Εδέσσης, καθώς την αντικατέστησε πλήρως στον τομέα των εξαγωγών. Έτσι, ολόκληρη η παραγόμενη ποσότητα της ποικιλίας αυτής, παρέμενε αδιάθετη στον Ελλαδικό χώρο, χωρίς να υπάρχει κανένας τρόπος αξιοποίησης της. Προσωρινή λύση στο πρόβλημα, έδωσε η δυνατότητα απόσταξης για την παραγωγή τσίπουρου μέχρι το 2007, οπότε σύμφωνα με απόφαση του Υπουργείου Αγροτικής Ανάπτυξης και Τροφίμων (αριθμ / ), η Όψιμος Εδέσσης ταξινομήθηκε 21

22 στις «επιτρεπόμενες οινοποιήσιμες ποικιλίες αμπέλου» για το Αμπελουργικό Διαμέρισμα Μακεδονίας, Ν.Α. Πέλλας. Σήμερα, η συγκεκριμένη ποικιλία κατατάσσεται στις ποικιλίες διπλής χρήσης, μπορεί δηλαδή να χρησιμοποιηθεί τόσο ως επιτραπέζια, όσο και για την παραγωγή λευκού επιτραπέζιου οίνου (οίνου χωρίς γεωγραφική ένδειξη). Τα σημαντικότερα χαρακτηριστικά της ποικιλίας Όψιμος Εδέσσης, παρουσιάζονται στον Πίνακα 1.2. Πίνακας 1.2. Χαρακτηριστικά της ποικιλίας Όψιμος Εδέσσης Κωδικός Ποικιλίας Λατινική Ονομασία Opsimos Edessis Συνώνυμα Περιοχές Καλλιέργειας Χαρακτηριστικά Φυτού Τρύγος Παραγόμενος Οίνος Λευκή Εδέσσης, Ντόπιο, Αμάσσι, Καρατζόβας, Φουστάνη, Πασχαλινό, Χειμωνιάτικο, Πανδίρι. Βόρεια Ελλάδα (Έδεσσα, Αλμωπία, Νάουσα, Νέα Τρίγλια Χαλκιδικής και Νομός Θεσσαλονίκης). Φυτό ζωηρό, παραγωγικό, το οποίο διαμορφώνεται σε κρεβατίνες και σε κυπελλοειδή και γραμμωτά σχήματα (Εικόνα 1.5.). Ανάλογα με τη διαμόρφωση του, δέχεται κλάδεμα μακρύ σε αμολυτές ή βραχύτερο. Παράγει σταφύλια μέτριου έως μεγάλου μεγέθους, κυλινδροκωνικού σχήματος, με ράγες μέτριου μεγέθους και φλοιό παχύ, ανθεκτικό, κιτρινοπράσινου έως κιτρινόλευκου χρωματισμού (Εικόνα 1.4.). Τα σταφύλια είναι επιδεκτικά στη συντήρηση και τη μεταφορά και αντέχουν στους πάσης φύσεως εμπορικούς χειρισμούς. Παρουσιάζει ευαισθησία στο ωίδιο, το οποίο προσβάλλει τους βλαστούς και το βόστρυχο, ενώ έχει μεγάλη αντοχή στον περονόσπορο. Πραγματοποιείται από τα μέσα μέχρι τα τέλη Οκτωβρίου (όψιμη ποικιλία) και η διαδικασία αυτή γίνεται με το χέρι. Λευκός, χαμηλόβαθμος και με διακριτικό άρωμα. Το επίπεδο ωρίμανσης των σταφυλιών κατά την έναρξη του τρύγου, καθορίζεται σε μεγάλο βαθμό από τις κλιματολογικές συνθήκες (ύψος βροχής, θερμοκρασία και ηλιοφάνεια) που επικρατούν στην περιοχή κατά την κρίσιμη περίοδο της ωρίμανσής τους. 22

23 1.5. Ο οίνος Σύμφωνα με την ελληνική και την ευρωπαϊκή νομοθεσία, «οίνος είναι το προϊόν που παράγεται αποκλειστικά με πλήρη ή μερική αλκοολική ζύμωση νωπών σταφυλιών, είτε αυτά έχουν υποστεί έκθλιψη είτε όχι, ή γλεύκους σταφυλιών» (ΕΚ 479/2008, Επίσημη Εφημερίδα της Ευρωπαϊκής Ένωσης, L 148/1, ). Τα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά κάθε οίνου, όπως είναι το ιδιαίτερο άρωμα και η μοναδική γεύση του, σε συνδυασμό με την ποιότητά του, λειτουργούν ως κριτήρια για την αποδοχή του από τους καταναλωτές και διαφοροποιούνται σύμφωνα με τη σύσταση κάθε οίνου (Σουφλερός, 1997, 2000). Η σύσταση του οίνου εξαρτάται από ένα σύνολο παραγόντων, οι οποίοι είναι: (i) η ποικιλία της αμπέλου, (ii) ο βαθμός ωρίμανσης του σταφυλιού, (iii) η διαχείριση του γλεύκους, (iv) η τεχνική της οινοποίησης, (v) ο έλεγχος του μικροβιακού φορτίου και των σκευών με τα οποία ο οίνος έρχεται σε επαφή, (vi) η μέθοδος παλαίωσης του οίνου και (vii) οι συνθήκες αποθήκευσης του οίνου. Οι παράγοντες αυτοί, μέσω μιας σειράς αλληλεπιδράσεων, διαμορφώνουν την τελική σύσταση του οίνου (Boulton et al., 1996) Η σύσταση του οίνου Ο οίνος απαρτίζεται από ένα σύνολο χημικών ενώσεων, η πρωταρχική μορφή των οποίων απαντά στην υδατική φάση της ράγας του σταφυλιού. Στην πραγματικότητα, ο οίνος αποτελεί ένα υδατοαλκοολικό διάλυμα οργανικών οξέων, ορισμένα από τα οποία απαντούν με τη μορφή αλάτων. Ωστόσο, στο διάλυμα αυτό βρίσκονται και πολυάριθμα άλλα συστατικά, τα οποία αν και απαντούν σε μικρές ποσότητες, διαδραματίζουν καθοριστικό ρόλο στη σύσταση και τη διαφοροποίηση των οίνων (Σουφλερός, 2000). Τα παραπάνω συστατικά, με τη βοήθεια της αλματώδους προόδου των αναλυτικών μεθόδων, μπορούν σήμερα να ανιχνευθούν και να προσδιορισθούν. Στον πίνακα που ακολουθεί, γίνεται αναφορά στα κυριότερα συστατικά του οίνου (Πίνακας 1.3.) (Σουφλερός, 2000), τα οποία προέρχονται πρωτίστως από το σταφύλι και δευτερευόντως από τα σκεύη (βαρέλια, δεξαμενές, διάφορα δοχεία, σωληνώσεις, συσκευές επεξεργασίας, φίλτρα) με τα οποία έρχεται σε επαφή το γλεύκος και ο οίνος. 23

24 Πίνακας 1.3. Χημική σύσταση του οίνου Νερό (80-85%) Οργανικά συστατικά Ανόργανα συστατικά Οργανικά οξέα Αλκοόλες Οσμηρές πτητικές ενώσεις Σάκχαρα Πολυσακχαρίτες Φαινολικές ενώσεις Αζωτούχες ενώσεις Βιταμίνες Ένζυμα Ανιόντα Κατιόντα Σταθερά και πτητικά οξέα σταφυλιού, ζυμώσεων και προσβολών Μονοαλκοόλες και πολυαλκοόλες Αλκοόλες, εστέρες, καρβονυλικές ενώσεις και τερπενικές ενώσεις Ανάγοντα και μη ανάγοντα Πηκτίνες, κόμμεα και δεξτράνη Φαινολικά οξέα, φλαβόνες, ανθοκυανίνες και ταννίνες Πρωτεΐνες, αμινοξέα, πολυπεπτίδια Η οινοποίηση Ο όρος «οινοποίηση» περιλαμβάνει το σύνολο των διεργασιών που λαμβάνουν χώρα κατά τη μετατροπή των νωπών σταφυλιών και του γλεύκους σε οίνο. Κατά τη διάρκεια της οινοποίησης, το γλεύκος, το οποίο είναι πλούσιο σε σάκχαρα (γλυκόζη και φρουκτόζη), χρησιμοποιείται από επιλεγμένους ζυμομύκητες οι οποίοι καταναλώνουν τα σάκχαρα που αυτό περιέχει, προκειμένου να παράγουν ενέργεια (ΑΤΡ). Η μεταβολική διεργασία ονομάζεται αλκοολική ζύμωση και κυριότερα προϊόντα της είναι η αιθανόλη και το διοξείδιο του άνθρακα, ενώ υπό αναερόβιες συνθήκες απελευθερώνεται και ενέργεια, καθώς παράγονται δύο μόρια ΑΤΡ ανά μόριο γλυκόζης που διασπάται με παράλληλη απελευθέρωση 25,4 kcal με μορφή θερμότητας (Τσακίρης, 1988). Η μεταβολική διεργασία παρουσιάζεται στο Σχήμα 1.1. Η οινοποίηση διακρίνεται σε λευκή ή ερυθρή, ανάλογα με το αν πραγματοποιείται απομάκρυνση των στεμφύλων πριν από την έναρξη της αλκοολικής ζύμωσης ή όχι, αντίστοιχα. 24

25 Σχήμα 1.1. Αλκοολική ζύμωση ( Λευκή οινοποίηση Οι λευκοί οίνοι παράγονται κυρίως με τη ζύμωση του γλεύκους που προέρχεται από λευκά σταφύλια και συμβαίνει αποκλειστικά στο χυμό, χωρίς την παρουσία των στερεών συστατικών του σταφυλιού (Σουφλερός, 2000). Οι λευκοί οίνοι κατατάσσονται σε διάφορες κατηγορίες ανάλογα με: την αρωματική ένταση (ουδέτεροι και αρωματικοί) τον τρόπο οινοποίησης (αλκοολική ζύμωση ή/και ωρίμανση σε δεξαμενές ή δρύινα βαρέλια) τη σύσταση του τελικού προϊόντος (ξηροί, ημίξηροι, ημίγλυκοι και γλυκείς) Τα στάδια της λευκής οινοποίησης, είναι τα ακόλουθα (Ribereau-Gayon et al., 2006a): (α) Συλλογή και μεταφορά των σταφυλιών στο οινοποιείο Το πρώτο και πολύ βασικό στάδιο της λευκής οινοποίησης, περιλαμβάνει τη συλλογή των σταφυλιών, η οποία θα πρέπει να πραγματοποιηθεί στο κατάλληλο στάδιο της ωριμότητας τους, αλλά και την άμεση και με προσεκτικό τρόπο μεταφορά τους στο οινοποιείο. Η υγιεινή του σταφυλιού, επηρεάζει σε μεγάλο βαθμό την ποιότητα του παραγόμενου οίνου. 25

26 (β) Παραλαβή του γλεύκους Το δεύτερο στάδιο της λευκής οινοποίησης, περιλαμβάνει την παραλαβή του γλεύκους. Στο στάδιο αυτό, απαιτείται μηχανική επεξεργασία της πρώτης ύλης και περιλαμβάνει τον εκραγισμό, την έκθλιψη των ραγών, τη στράγγιση ή προ-πίεση του γλεύκους και την πίεση των στεμφύλων. Ο εκραγισμός των σταφυλιών πραγματοποιείται στο εκραγιστήριο, το οποίο είναι ένας διάτρητος περιστρεφόμενος κύλινδρος, στο εσωτερικό του οποίου βρίσκεται ένας επίσης περιστρεφόμενος, αντίθετης φοράς, άξονας με πτερύγια. Οι ράγες διαχωρίζονται και περνούν από τις τρύπες του κυλίνδρου, ενώ οι βόστρυχοι οδηγούνται προς το αντίθετο άκρο και απομακρύνονται. Στη συνέχεια, οι ράγες περνούν ανάμεσα από τους κυλίνδρους του θλιπτηρίου, οι οποίοι επίσης περιστρέφονται. Η ταχύτητα και η μεταξύ τους απόσταση, ρυθμίζονται ανάλογα με την ποικιλία των σταφυλιών και το βαθμό ωριμότητάς τους. Με τον τρόπο αυτό σπάζουν οι φλοιοί, ενώ αποφεύγεται το σπάσιμο των γιγάρτων, το οποίο θα προσέθετε στυφή γεύση στον οίνο. Με την έκθλιψη των ραγών απελευθερώνεται μεγάλο μέρος του χυμού τους. Η σταφυλομάζα που παραλαμβάνεται με τον τρόπο αυτό, οδηγείται για πίεση. Ένα σύγχρονο πνευματικό πιεστήριο παρέχει ήπια μεταχείριση στο σταφύλι. Η λειτουργία του βασίζεται στη διόγκωση μιας μεμβράνης, με τη βοήθεια αέρα, η οποία βρίσκεται στο εσωτερικό του. Η σταφυλομάζα πιέζεται με τον τρόπο αυτό στα εσωτερικά τοιχώματα του κυλίνδρου και έτσι εξάγεται και το υπόλοιπο μέρος του χυμού των σταφυλιών. (γ) Επεξεργασία του γλεύκους πριν από την αλκοολική ζύμωση Το τρίτο στάδιο της λευκής οινοποίησης, περιλαμβάνει την επεξεργασία του γλεύκους πριν από την αλκοολική ζύμωση, μέσω χημικών, φυσικών και φυσικοχημικών διεργασιών. Στις χημικές διεργασίες, περιλαμβάνεται η θείωση, ο εμπλουτισμός του γλεύκους σε σάκχαρα και η διόρθωση της οξύτητας. Βασικός στόχος είναι, τόσο η προστασία του γλεύκους από τις οξειδώσεις, όσο και η διόρθωση των αρνητικών χαρακτηριστικών του, σύμφωνα πάντα με τη νομοθεσία. Στις φυσικές διεργασίες, περιλαμβάνεται η επεξεργασία για τη διαύγαση του γλεύκους, η οποία επιτυγχάνεται με την κατακρήμνιση όλων των σωματιδίων που βρίσκονται σε αιώρηση, σε χαμηλή θερμοκρασία και με τη βοήθεια πηκτινολυτικών ενζύμων. Η διάρκεια της διαύγασης (απολάσπωσης) κυμαίνεται συνήθως από 12 έως 14 26

27 ώρες, ανάλογα με το ποσοστό των λασπών. Οι οίνοι που προέρχονται από απολασπωμένα γλεύκη έχουν καθαρότερο άρωμα, ενώ το χρώμα τους είναι σταθερότερο και λιγότερο ευαίσθητο στις οξειδώσεις. Στις φυσικοχημικές διεργασίες, περιλαμβάνεται η επεξεργασία του οίνου με μπεντονίτη, μία άργιλο κολλοειδούς μορφής (Al 2 O 5, 4SiO 2, xh 2 O). Το αρνητικό φορτίο του μπεντονίτη και η μεγάλη προσροφητική του ικανότητα, βοηθούν στην απομάκρυνση μέρους των πρωτεϊνών, στη μερική δέσμευση των οξειδωτικών ενζύμων, καθώς και στην οργανοληπτική βελτίωση των παραγόμενων οίνων. (δ) Αλκοολική ζύμωση Το τέταρτο και ίσως πιο κρίσιμο στάδιο της λευκής οινοποίησης, περιλαμβάνει την αλκοολική ζύμωση, η οποία απαιτεί ενδελεχή έλεγχο, καθώς στη φάση αυτή θα καθοριστούν τα χαρακτηριστικά του τελικού προϊόντος. Η αλκοολική ζύμωση θεωρείται ολοκληρωμένη όταν το σύνολο των σακχάρων έχει μετατραπεί σε αιθυλική αλκοόλη, όταν δηλαδή έχει γίνει η μετατροπή του γλεύκους σε οίνο. Ο φρέσκος λευκός οίνος υφίσταται στη συνέχεια μία σειρά από κατεργασίες, με τελικό σκοπό τη σταθεροποίηση και εμφιάλωση ενός προϊόντος με επιθυμητά οργανοληπτικά χαρακτηριστικά. Στο Σχήμα 1.2. παρουσιάζονται τα βασικά στάδια της λευκής οινοποίησης. Σχήμα 1.2. Βασικά στάδια λευκής οινοποίησης ( Η χρήση των ζυμομυκήτων στην οινοποίηση Στον αμπελώνα και το οινοποιείο, απαντούν ζύμες αυτόχθονες (μόνιμη παρουσία) και ζύμες αλλόχθονες (παροδική παρουσία). Η παρουσία των ειδών Saccharomyces είναι 27

28 πολύ περιορισμένη στο περιβάλλον του αμπελώνα, ενώ υποστηρίζεται ότι απαντώνται μόνο στο περιβάλλον του οινοποιείου (Canal-Llaubères, 1993). Η ζύμωση του γλεύκους και η μετατροπή του σε οίνο, μπορεί να πραγματοποιηθεί με τους εξής τρόπους: Αυθόρμητα, μέσω της φυσικής επιλογής των ζυμομυκήτων (φυσική ζύμωση). Στην περίπτωση αυτή, υπάρχει στο γλεύκος μικτός πληθυσμός αυτόχθονων ζυμών, με αποτέλεσμα να παράγονται οίνοι με μοναδικό χαρακτήρα και οργανοληπτικά χαρακτηριστικά, ανάλογα με την περιοχή καλλιέργειας, την ποικιλία, το μικροκλίμα και τη χρονιά (Mateo et al, 1991). Έπειτα από εμβολιασμό με επιλεγμένες ξηρές ενεργές ζύμες (ελεγχόμενη ζύμωση). Στην περίπτωση αυτή, γίνεται χρήση επιλεγμένων στελεχών S. cerevisiae για τον εμβολιασμό και την έναρξη της αλκοολικής ζύμωσης, με αποτέλεσμα να επιτυγχάνεται καλύτερος έλεγχος της πορείας της, μεγαλύτερη ασφάλεια μέσω της μείωσης των μικροβιολογικών κινδύνων και βέλτιστα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά (Holzapfel, 2002, Boulton et al., 1996). Ο εμβολιασμός του γλεύκους με τα εμπορικά διαθέσιμα στελέχη, πραγματοποιείται πριν από την έναρξη της αλκοολικής ζύμωσης, με σκοπό την αριθμητική υπεροχή τους έναντι των άλλων αυτόχθονων ζυμών. Στην Ευρωπαϊκή Νομοθεσία (ΕΚ 606/2009 της Επιτροπής, 10/7/2009, παράρτημα ΙΑ, που καθορίζει τις οινολογικές πρακτικές και τους διάφορους περιορισμούς στους οποίους αυτές υπόκεινται), αναφέρονται οι λεπτομέρειες χρήσης ζυμομυκήτων ξηρών ή σε εναιώρημα, για την παραγωγή οίνου, καθώς και οι πρακτικές της ευνοϊκής ανάπτυξής τους. Ο ζυμομύκητας Saccharomyces, είναι ένας ευκαρυωτικός μικροοργανισμός με χαρακτηριστικό ελλειψοειδές σχήμα, ο οποίος πολλαπλασιάζεται αγενώς με εκβλαστήσεις. Αναλόγως του είδους, το σχήμα του μικροοργανισμού μπορεί να ποικίλει από σφαιρικό, ωοειδές ή κυλινδρικό. Τα κύτταρά του είναι μεμονωμένα, σε ζεύγη και σπάνια σε μικρές αλυσίδες ή συσσωματώματα (Ribereau Gayon et al., 2006a), ενώ το μέγεθος τους δεν είναι σταθερό και εξαρτάται από το στάδιο του κύκλου ανάπτυξης, τις συνθήκες ανάπτυξης και την ηλικία του κυττάρου. Είναι ένας οξεόφιλος μικροοργανισμός, ο οποίος αναπτύσσεται κυρίως σε ελαφρώς ή μετρίως όξινο περιβάλλον (ph 4,5-6,5), με άριστη θερμοκρασία ανάπτυξης τους o C. 28

29 Τα κύτταρα του ζυμομύκητα Saccharomyces cerevisiae, περιβάλλονται από ένα άκαμπτο κυτταρικό τοίχωμα, το οποίο αποτελείται από γλυκάνες και μαννοπρωτεΐνες (Εικόνα 1.6.). Κάτω από το κυτταρικό τοίχωμα βρίσκεται ο περιπλασματικός χώρος, ο οποίος διαχωρίζει το κυτταρικό τοίχωμα και την κυτταρική μεμβράνη, ενώ εκεί εναποτίθενται οι πρωτεΐνες που εκκρίνονται από τα κύτταρα του ζυμομύκητα. Το κυτταρόπλασμα των κυττάρων περιβάλλεται από την κυτταρική μεμβράνη, η οποία είναι εύθραυστη, αλλά ανθεκτική σε χαμηλές τιμές ph και αποτελείται από πρωτεΐνες και λιπίδια. Η περιεκτικότητά της σε μονο- και πολυ- ακόρεστα λιπαρά οξέα, καθορίζει τη διαπερατότητά της και αποτελεί ίσως το σημαντικότερο τμήμα του κυττάρου, διότι ελέγχει την είσοδο και την έξοδο διάφορων ουσιών από το εσωτερικό του (Boulton et al., 1996). Όπως ισχύει για όλους τους ανώτερους ευκαρυωτικούς οργανισμούς, έτσι και ο ζυμομύκητας Saccharomyces spp., διαθέτει πυρήνα και υποκυττάρια οργανίδια, μιτοχόνδρια, ριβοσώματα,, καθώς και ένζυμα που είναι απαραίτητα για τη βιοσύνθεση μέρους των πρωτεϊνών του κυττάρου (Ζερβόπουλος, 2010). Μία απεικόνιση του κυττάρου του S. cerevisiae, δίνεται στην Εικόνα 1.6. Εικόνα 1.6. Κυτταρικό τοίχωμα Saccharomyces cerevisiae (Francois, 2006) Τα σημαντικότερα κριτήρια για την επιλογή του καταλληλότερου στελέχους S. cerevisiae, είναι: Η αποτελεσματικότητα της ζύμωσης, δηλαδή η μετατροπή των σακχάρων του γλεύκους σε αλκοόλη και διοξείδιο του άνθρακα, σε βαθμό πάνω από 98% (Henschke, 1997). Η διατήρηση συγκεκριμένου ρυθμού ζύμωσης. 29

30 Η αντοχή σε αντίξοες για τους ζυμομύκητες συνθήκες, π.χ. υψηλή συγκέντρωση αιθανόλης, η οποία ασκεί τοξικό ρόλο, προσβάλλοντας τη διαπερατότητα της κυτταρικής μεμβράνης (Walker, 1998). Η ικανότητα ζύμωσης σε συγκεκριμένες συνθήκες θερμοκρασίας, όπως στη λευκή οινοποίηση, όπου επιλέγονται χαμηλές θερμοκρασίες ζύμωσης προκειμένου να ελαχιστοποιηθεί η απώλεια πτητικών ενώσεων (Henschke, 1997). Η ικανότητα απελευθέρωσης οσμηρών πτητικών συστατικών από τις πρόδρομες μορφές τους, τα οποία είναι υπεύθυνα για το ποικιλιακό αρωματικό δυναμικό της σταφυλής (Günata et al., 1994). Η ικανότητα αυτόλυσης των κυττάρων των ζυμομυκήτων με το θάνατό τους (Martinez-Rodriguez and Polo, 2000) και η απελευθέρωση πολυσακχαριτών, νουκλεϊκών οξέων και λιπιδίων Η χρήση των ενζύμων στην οινοποίηση Τα ένζυμα είναι πρωτεΐνες που έχουν ισχυρή καταλυτική δράση και υψηλή εξειδίκευση, τόσο σε σχέση με την ένωση η οποία μετατρέπεται (εξειδίκευση υποστρώματος), όσο και με τον τύπο της αντίδρασης που καταλύεται (εξειδίκευση αντίδρασης), η οποία αποτελεί τη βάση για την ταξινόμηση και την ονοματολογία τους (Belitz et al., 2006). Στο γλεύκος απαντά μεγάλη ποικιλία ενζύμων, τα οποία προέρχονται είτε από το σταφύλι (οξειδάσες, υπεροξειδάσες, πηκτινάσες, πρωτεάσες, ιμβερτάση, γλυκοσιδάσες, λιποξυγενάσες), είτε από τους ζυμομύκητες (Belitz et al., 1987) Ένζυμα του Saccharomyces cerevisiae Τα ένζυμα του ζυμομύκητα Saccharomyces cerevisiae, ανήκουν κυρίως στην κατηγορία των υδρολασών και ανάλογα με τη φύση των χημικών αντιδράσεων που καταλύουν, διακρίνονται σε: (α) Πηκτινολυτικά ένζυμα, στα οποία υπάγονται τα περισσότερα οινολογικά ένζυμα. Τα ένζυμα αυτά παρέχουν τεχνικά οινολογικά πλεονεκτήματα, όπως η επιτάχυνση των σταδίων πριν την αλκοολική ζύμωση (διαύγαση, απολάσπωση) και η βελτίωση της ποιότητας και της ποσότητας του παραγόμενου γλεύκους κατά την πίεση της σταφυλομάζας, μέσω της υδρόλυσης των πηκτινών του τοιχώματος των κυττάρων της ράγας. 30

31 (β) Γλυκοσιδάσες, οι οποίες διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στις ποικιλίες σταφυλιών που περιέχουν πρόδρομες άοσμες μορφές πτητικών ενώσεων (Ribereau-Gayon et al., 2006a). (γ) Γλυκανάσες, οι οποίες είναι ένζυμα που διασπούν τη β-1,3-γλυκάνη (βασικό συστατικό του κυτταρικού τοιχώματος του Saccharomyces cerevisiae), με αποτέλεσμα την απελευθέρωσή της στον οίνο Εμπορικά οινολογικά ένζυμα Μετά την ολοκλήρωση της αλκοολικής ζύμωσης, ένας μεγάλος αριθμός διαφορετικών ειδών ενζύμων απαντά στον παραγόμενο οίνο. Κάποια από τα ένζυμα αυτά εξακολουθούν να είναι χρήσιμα, καθώς δύνανται να συμβάλουν θετικά σε πολλές από τις μετα-ζυμωτικές διεργασίες, με σκοπό τη βελτίωση του τελικού προϊόντος. Ωστόσο, η ενζυμική τους δράση συνήθως δεν επαρκεί, είτε γιατί οι συνθήκες του περιβάλλοντος (οίνος) δεν είναι ευνοϊκές (χαμηλό ph), είτε γιατί η συγκέντρωσή τους είναι χαμηλή (φυσιολογικές και τεχνολογικές παράμετροι) (Gunata et al., 1993). Έτσι, η χρήση βιομηχανικά παραγόμενων ενζύμων, κυρίως πηκτινολυτικών, β- γλυκοσιδασών και β-1,3 γλυκανασών, είναι ευρέως διαδεδομένη κατά την εφαρμογή των οινολογικών μεθόδων, καθώς διαδραματίζει βοηθητικό ρόλο κατά (Masino et al., 2008): τη διαύγαση του γλεύκους την πρωτεϊνική σταθεροποίηση του οίνου τη διήθηση του οίνου τη χρωματική σταθεροποίηση του οίνου τη βελτίωση του αρώματος του οίνου Η παραγωγή των βιομηχανικών ενζύμων, θα πρέπει να είναι σύμφωνη με τις προδιαγραφές που συστήνονται από το JECFA (FAO/WHO Ειδική Επιτροπή των Πρόσθετων Ουσιών Τροφίμων) και από την FCC (Kώδικας Χημικών Ουσιών Τροφίμων). Η Διεθνής Οργάνωση Αμπέλου και Οίνου (OIV) (1118/2004) παίρνει τις αποφάσεις σχετικά με τις μεθόδους ανάλυσης και τις οινολογικές εφαρμογές και επεξεργασίες. Η Κοινοτική Νομοθεσία (ΕΚ 606/2009 της επιτροπής 10/7/2009 (παράρτημα ΙΑ), που καθορίζει τις οινολογικές πρακτικές και τους διάφορους περιορισμούς στους οποίους υπόκεινται), αναφέρει τη δυνατότητα χρήσης ενζυμικών παρασκευασμάτων, ενώ θέτει 31

32 προδιαγραφές και όρια στη χρήση της β-γλυκανάσης (παράρτημα IV του Κανονισμού (ΕΚ) 1493/1999) Ωρίμανση του λευκού οίνου με τις οινολάσπες Μετά την ολοκλήρωση της αλκοολικής ζύμωσης, ο φρέσκος οίνος είναι θολός (θολερότητα > 200 NTU), ενώ στον πυθμένα της δεξαμενής που πραγματοποιήθηκε η ζύμωση, υπάρχει υποστάθμη σε μορφή «λάσπης» που αποκαλείται οινολάσπη. H οινολάσπη ορίζεται ως: (α) το υπόλειμμα που συσσωρεύεται στα δοχεία που περιέχουν οίνο, μετά τη ζύμωση, κατά την αποθήκευση ή μετά από επιτρεπόμενη επεξεργασία, (β) το υπόλειμμα της διήθησης ή της φυγοκέντρησης του προϊόντος που αναφέρεται στο στοιχείο (α), (γ) το υπόλειμμα που συσσωρεύεται στα δοχεία που περιέχουν γλεύκος σταφυλιών, κατά την αποθήκευση ή μετά από επιτρεπόμενη επεξεργασία, (δ) το υπόλειμμα της διήθησης ή της φυγοκέντρησης του προϊόντος που αναφέρεται στο στοιχείο (γ) (ΕΚ 479/2008). Η οινολάσπη αποτελείται κυρίως από νεκρά κύτταρα μικροοργανισμών (κυρίως ζυμομυκήτων), η βιωσιμότητα των οποίων μειώνεται δραματικά προς το τέλος της αλκοολικής ζύμωσης και αρχίζει η αυτόλυση Η αυτόλυση των κυττάρων των ζυμομυκήτων αποτελεί αυθόρμητη, πολύπλοκη και αργή διαδικασία, κατά τη διάρκεια της οποίας παρατηρείται αποδιοργάνωση της κυτταρικής μεμβράνης και απελευθέρωση υδρολυτικών ενζύμων (πρωτεάσες, λιπάσες, γλυκανάσες). Τα ένζυμα αυτά, έρχονται σε επαφή με τα ενδοκυτταρικά συστατικά (πρωτεΐνες), προκαλώντας τη διάσπασή τους σε απλούστερα μόρια (πεπτίδια, αμινοξέα, νουκλεοτίδια, λιπαρά οξέα), τα οποία στη συνέχεια διαχέονται στον οίνο. Επιπλέον, οι πρωτεάσες μαζί με τις γλυκανάσες, καταλύουν την αποικοδόμηση του κυτταρικού τοιχώματος και συμβάλλουν στην απελευθέρωση συστατικών στον οίνο (γλυκάνες και μαννοπρωτεΐνες) (Guilloux-Benatier and Chassagne, 2003, Perez-Serradilla et al., 2008). Οι οινολάσπες διακρίνονται στις ακόλουθες κατηγορίες (Delteil, 2002): (α) Χονδρές οινολάσπες, οι οποίες είναι τα σωματίδια (μεγέθους 1μm-2mm) που καθιζάνουν μέσα σε 24 ώρες μετά την προσθήκη πηκτινολυτικών ένζυμων στο γλεύκος. Περιλαμβάνουν σωματίδια από το σταφύλι, συσσωματώματα τρυγικών κρυστάλλων και ζυμών, καθώς και νιφάδες που προκύπτουν από αντιδράσεις μεταξύ πρωτεϊνών, πολυσακχαριτών και ταννινών, που λαμβάνουν χώρα κατά τη διάρκεια της ζύμωσης. 32

33 (β) Λεπτές οινολάσπες, οι οποίες είναι τα σωματίδια (μεγέθους 1μm-12μm) που παραμένουν σε διασπορά στον οίνο 24 ώρες μετά τη διαύγαση - απολάσπωση. Συνιστούν σημαντική πηγή πολυσακχαριτών, αμινοξέων, νουκλεϊκών οξέων και εστέρων και αντιστοιχούν σε g/l τελικού προϊόντος Φαινολικές ενώσεις Οι φαινολικές ενώσεις απαρτίζουν μια μεγάλη ομάδα χημικών ενώσεων, οι οποίες αποτελούνται από δευτερογενείς μεταβολίτες που κατέχουν σημαντικό ρόλο σε πολλές από τις λειτουργίες των φυτών. Ο λειτουργικός τους ρόλος έγκειται κυρίως στην προστασία των φυτικών ιστών από τους μικροοργανισμούς (μύκητες και βακτήρια), καθώς και από την υπεριώδη ακτινοβολία (Koes et al., 1994, Boss et al., 1996). Απαντούν στα στερεά μέρη του σταφυλιού, κυρίως στο φλοιό και τα γίγαρτα και σχετίζονται με τους μηχανισμούς άμυνας που αναπτύσσουν τα πρέμνα. Επιπλέον, προστατεύουν το φυτό της αμπέλου από τις προσβολές που πραγματοποιούνται από τα έντομα, καθώς και από τη βρώση από τα ζώα (Koes et al., 1994, Jackson et al., 2008). Η συγκέντρωση των φαινολικών ενώσεων στο σταφύλι εξαρτάται, τόσο από την ποικιλία (γενετικό δυναμικό), όσο και από τους περιβαλλοντικούς παράγοντες που επικρατούν και τις καλλιεργητικές τεχνικές που εφαρμόζονται. Κατά την οινοποίηση, η μεταφορά τους στον οίνο αποδίδεται στην εκχύλιση ή τη διάχυσή τους από τα στέμφυλα ή στην εκχύλισή τους από το ξύλο των βαρελιών. Ωστόσο, μικρές ποσότητες μπορούν να σχηματιστούν και από το μεταβολισμό των ζυμών (Jackson et al., 2008). Οι φαινολικές ενώσεις κατέχουν ουσιαστικό ρόλο στη διαμόρφωση της ποιότητας του οίνου, καθώς καθορίζουν τους χαρακτήρες που επηρεάζουν την οινική ποιότητα, ενώ παράλληλα θεωρούνται υπεύθυνες για τις διαφορές που εμφανίζονται ανάμεσα σε λευκούς και ερυθρούς οίνους (Κουράκου-Δραγώνα, 1998, Σουφλερός, 2000). Επιπρόσθετα, οι ενώσεις αυτές διαμορφώνοντας τον αρωματικό χαρακτήρα κάθε οίνου, συμμετέχουν στις μεταβολές στις οποίες υπόκειται ο οίνος αυτός, κατά την παραγωγή, τη συντήρηση και την παλαίωσή του (Κουράκου-Δραγώνα, 1998, Bautista-Ortin et al., 2007). 33

34 Η χημεία των φαινολικών ενώσεων Οι φαινολικές ενώσεις περιέχουν στο μόριό τους ένα ή περισσότερα φαινολικά υδροξύλια (Σχήμα 1.3.) (Ribereau-Gayon et al., 2000). Σχήμα 1.3. Δομή φαινόλης Οι ενώσεις αυτές, ταξινομούνται σε τέσσερις βασικές κατηγορίες (Ribereau-Gayon et al., 2000): τα φαινολικά οξέα και τα παράγωγα αυτών τα φλαβονοειδή τις ανθοκυανίνες τις ταννίνες Τα φαινολικά οξέα και τα παράγωγά τους Τα φαινολικά οξέα απαντούν κυρίως στα φυτικά προϊόντα και συγκεκριμένα στα χυμοτόπια των κυττάρων του φλοιού και της σάρκας των ραγών, είτε σε ελεύθερη μορφή, είτε δεσμευμένα, ως εστέρες ή γλυκοζίτες, (Dey and Harborne, 1989, Κουράκου- Δραγώνα, 1998, Ribereau-Gayon et al., 2000). Σχηματίζονται κατά τη διάρκεια της ωρίμανσης του σταφυλιού, μέσω αντιδράσεων οξείδωσης, αναγωγής, υδρόλυσης και μεθυλίωσης. Το σταφύλι και ο οίνος περιέχουν φαινολικά οξέα, τα οποία ταξινομούνται σε δύο βασικές κατηγορίες (Ribereau-Gayon et al., 2000): Τα βενζοϊκά οξέα (C 6 -C 1 ) (Πίνακας 1.4.) και τα παράγωγά τους. Τα παράγωγα των οξέων αυτών απαντούν στα σταφύλια, κυρίως ως σύνθετες χημικές ενώσεις. Σε ελεύθερη κατάσταση απαντούν κατά τη διάρκεια της παλαίωσης των οίνων, ενώ παράλληλα αποτελούν συστατικό των ταννινών, συμμετέχοντας στη δομή τους. Τα κινναμωμικά οξέα (C 6 -C 3 ) (Πίνακας 1.4.) και τα παράγωγά τους. 34

35 Τα παράγωγα των οξέων αυτών απαντούν στα σταφύλια και τον οίνο, όπως και τα βενζοϊκά οξέα, με τη μορφή ενώσεων με τις ανθοκυάνες και το τρυγικό οξύ. Τα βενζοϊκά και τα κινναμωμικά παράγωγα, διαφοροποιούνται ως προς τους υποκαταστάτες του βενζολικού δακτυλίου, οι οποίοι μπορεί να είναι υδροξυ-ομάδες (- ΟΗ) και μεθοξυ-ομάδες (-ΟCH 3 ), στη θέση του υδρογόνου (-H) (Πίνακας 1.4.) (Ribereau-Gayon et al., 2000). Πίνακας 1.4. Τα κυριότερα φαινολικά οξέα του σταφυλιού και του οίνου (Ribereau-Gayon et al., 2000) Βασικό Βασικός Ονομασία Θέση πρόσθετων ομάδων οξύ χημικός τύπος φαινολοξέων -H -OH -OCH 3 π-υδροξυβενζοϊκό οξύ 2, 3, Πρωτοκατεχικό οξύ 2, 5 3, Βενζοϊκό Βανιλλικό οξύ 2, Γαλλικό οξύ 2 3, 4, Συριγγικό οξύ 2 4 3, 5 Σαλυκιλικό οξύ 3, 4, Γεντισικό οξύ 3, 4 2,5 --- π-kουμαρικό οξύ 2, 3, Κινναμωμικό Καφεϊκό οξύ 2, 5 3,4 --- Φερουλικό οξύ 2, Σιναπικό οξύ 2 4 3, 5 Έχουν ταυτοποιηθεί επτά παράγωγα του βενζοϊκού οξέος, είτε δεσμευμένα (εστέρες ή γλυκοζίτες), είτε σε ελεύθερη κατάσταση, καθώς επίσης και τέσσερα παράγωγα του κινναμωμικού οξέος, κυρίως δεσμευμένα με τη μορφή εστέρων με τρυγικό οξύ, ενώ μικρές μόνο ποσότητες απαντούν σε ελεύθερη κατάσταση (Ribereau-Gayon et al., 2000). 35

36 Η παραμονή και η παλαίωση του οίνου σε ξύλινα βαρέλια, οδηγεί στον εμπλουτισμό του σε φαινολικά οξέα, σε ποσότητες που εξαρτώνται κάθε φορά από την προέλευση και το βαθμό ξήρανσης του ξύλου (Κουράκου-Δραγώνα, 1998). Οι συγκεντρώσεις των φαινολικών οξέων στους οίνους, κυμαίνονται από 100 έως 200 mg/l στους ερυθρούς και από 10 έως 20 mg/l στους λευκούς οίνους (Ribereau-Gayon et al., 2000). Επιπρόσθετα, αξίζει να σημειωθεί ότι τα φαινολικά οξέα δεν εμφανίζουν κάποια ιδιαίτερη οσμή και γεύση, ενώ παρουσιάζουν χαρακτηριστική ευκολία οξείδωσης, ιδιαίτερα εκείνα που έχουν δύο φαινολικά -ΟΗ σε θέση ορθο- (ο-θέση), όπως το γαλλικό και το καφεϊκό οξύ. Η οξείδωση αυτή οδηγεί στο σχηματισμό ενώσεων καστανού ή μαύρου χρώματος, με δομή κινόνης, με αποτέλεσμα να παρατηρείται το φαινόμενο της οξειδωτικής μετατροπής του χρώματος του γλεύκους και του οίνου, σε μη επιθυμητές αποχρώσεις, το λεγόμενο «καφέτιασμα του οίνου» (Κουράκου-Δραγώνα, 1998, Σουφλερός, 2000) Τα φλαβονοειδή Τα φλαβονοειδή αποτελούν τις κίτρινες χρωστικές των φυτών (Ribereau-Gayon et al., 2000). Εμφανίζουν ισχυρή αντιοξειδωτική δράση, καθώς είναι δότες υδρογόνου, γεγονός που συνδυάζεται αποτελεσματικά με την ικανότητα που έχουν να δεσμεύουν τα δισθενή κατιόντα, εμποδίζοντας τη μετατροπή τους σε τρισθενή (Rice-Evans et al., 1996, Ribereau-Gayon et al., 2000). Οι ενώσεις αυτές αποτελούνται από ένα βασικό σκελετό με 15 άτομα άνθρακα (τύπος φλαβόνης). Η δομή τους χαρακτηρίζεται από δύο βενζολικούς δακτυλίους, οι οποίοι βρίσκονται ενωμένοι με έναν πυρανικό δακτύλιο. Διαφοροποιούνται ως προς τους υποκαταστάτες των βενζολικών δακτυλίων, οι οποίοι μπορεί να είναι αποκλειστικά υδροξυ-ομάδες (-ΟΗ) στη θέση του υδρογόνου (-H) (Πίνακας 1.5.) (Ribereau-Gayon et al., 2000). Τα φλαβονοειδή ταξινομούνται σε δύο βασικές κατηγορίες: (α) Παράγωγα της 2-φαινυλο-χρωμόνης (φλαβόνες, φλαβονόλες) (Πίνακας 1.5.). Οι φλαβόνες διαφοροποιούνται από τις φλαβονόλες, κυρίως λόγω της απουσίας του δραστικού -OH στη θέση 3. Εμφανίζουν έντονο κιτρινωπό χρωματισμό και αποτελούν τις πιο διαδεδομένες φλαβονοειδείς ενώσεις στα σταφύλια. Τα παράγωγά τους βρίσκονται μόνο στους φλοιούς των ραγών, τόσο των λευκών όσο και των ερυθρών 36

37 ποικιλιών, με τη μορφή γλυκοζιτών και συγκεκριμένα μονογλυκοζιτών-3 ή μονογλυκουρονοζιτών-3 (κερκετίνη). Συγκεκριμένα, σχηματίζονται με την προσκόλληση στη θέση -3 του κεντρικού δακτυλίου (βενζοπυρόνη), ενός μορίου μονοσακχαρίτη (κυρίως γλυκόζης) ή ενός μορίου γλυκουρονικού οξέος (Ribereau-Gayon et al., 2000). (β) Παράγωγα της 2-φαινυλο-χρωμανόνης (φλαβανόνες, φλαβανονόλες) (Πίνακας 1.5.). Οι φλαβανόνες διαφοροποιούνται από τις φλαβανονόλες, κυρίως λόγω της απουσίας του δραστικού -OH στη θέση 3. Εμφανίζουν λιγότερο έντονο κιτρινωπό χρωματισμό και είναι ελάχιστα διαδεδομένες στη φύση. Τα παράγωγά τους σπάνια βρίσκονται στα σταφύλια (κυρίως σε φλοιούς λευκών σταφυλιών), ενώ συχνότερα βρίσκονται στο ξύλο της δρυός με τη μορφή γλυκοζιτών. Πίνακας 1.5. Τα κυριότερα φλαβονοειδή του σταφυλιού και του οίνου (Ribereau-Gayon et al., 2000) Βασική φαινόλη Βασικός χημικός τύπος Ονομασία φλαβονοειδών Ονομασία αγλυκόνης Θέση πρόσθετων ομάδων -H -OH Φλαβόνη ή Φλαβονόλη Φλαβόνη Καιμπφερόλη 3, 5 3 Φλαβονόλη Κερκετίνη 5 3, 3 Μυρικετίνη --- 3, 3,5 Φλαβανόνη ή Φλαβανονόλη Φλαβανόνη Φλαβανονόλη Ταξιφολίνη 5 3, 3 Η παρουσία τους έχει διαπιστωθεί κυρίως σε παλαιωμένους σε δρύινα βαρέλια οίνους (Κουράκου-Δραγώνα, 1998). Τα παραπάνω μόρια, βρίσκονται στους οίνους σε ελεύθερη κατάσταση και σε συγκεντρώσεις της τάξεως των 100 mg/l στους ερυθρούς οίνους και των 1-3 mg/l στους λευκούς οίνους (Ribereau-Gayon et al., 2000). 37

38 Ανθοκυανίνες (Ανθοκυάνες) Οι ανθοκυανίνες ή ανθοκυάνες είναι οι ερυθρές χρωστικές του σταφυλιού, οι οποίες συναντώνται κυρίως στο φλοιό των ραγών της ποικιλίας Vitis vinifera. Σπανιότερα συναντώνται και στη σάρκα των ραγών, σε ποικιλίες οι οποίες ονομάζονται «βαφικές» (Ribereau-Gayon et al., 2000). Μεγάλες ποσότητες των ενώσεων αυτών απαντούν επίσης στα φύλλα της αμπέλου, κυρίως προς το τέλος της παραγωγικής περιόδου (περίοδος ανάπτυξης), με αποτέλεσμα αυτά να αποκτούν ερυθρό χρωματισμό. Αποτελέσματα μελετών αποδίδουν το έντονο ερυθρό-βιολετί χρώμα των φρέσκων οίνων, στην παρουσία ελεύθερων ανθοκυανών, ενώ το ερυθρό-κεραμιδί χρώμα των παλαιωμένων οίνων, στην παρουσία ανθοκυανινών που είναι συζευγμένες με ταννίνες (Chris Somers & Evans, 1977, McCloskey & Yengoyan, 1981, Ribereau-Gayon et al., 2000, Vidal et al., 2002). Οι περισσότερες λευκές ποικιλίες π.χ. Chardonnay, Sauvignon blanc, δεν περιέχουν ανθοκυανίνες, ενώ η περιεκτικότητα των κυριότερων ελληνικών ερυθρών ποικιλιών σε ολικές ανθοκυανίνες, κυμαίνεται από 100 έως mg/kg ραγών (Κουράκου-Δραγώνα, 1998) Η χημική δομή των ανθοκυανών Στη φύση υπάρχουν ορισμένες ενώσεις (γλυκοζίτες), οι οποίες αποτελούνται από ένα σάκχαρο και από κάποιο άλλο συστατικό που δεν είναι σάκχαρο και ονομάζεται άγλυκο. Οι ανθοκυάνες εμφανίζονται στη φύση με τη μορφή ετεροζιτών, οι οποίοι υδρολύονται εύκολα και δίνουν ένα άγλυκο και ένα ή περισσότερα μόρια σακχάρων. Τα άγλυκα μέρη που προέρχονται από αυτή την υδρόλυση, ονομάζονται ανθοκυανιδίνες (Σχήμα 1.4.) (Σουφλερός, 2000). Το άγλυκο μέρος των ανθοκυανών είναι υδροξυλιωμένο και μεθυλιωμένο παράγωγο του φαινυλο-2-βενζοπυρυλίου (κατιόν φλαβυλίου), ενώ το μόριο του σακχάρου είναι πάντα αλδόζη και κυρίως γλυκόζη, ενώ σπανιότερα αραβινόζη, ραμνόζη, γαλακτόζη ή ξυλόζη (Κουράκου-Δραγώνα, 1998). Για παράδειγμα, όταν η γλυκόζη προσκολλάται στη θέση -3 του μορίου της ανθοκυανιδίνης, τότε σχηματίζεται ο μονογλυκοζίτης -3, ενώ όταν προσκολλάται ταυτόχρονα στις θέσεις -3 και -5 του μορίου της ανθοκυανιδίνης, τότε σχηματίζεται ο διγλυκοζίτης -3,5 (Σχήμα 1.5.) (Σουφλερός, 2000). 38

39 Σχήμα 1.4. Δομή ανθοκυανιδινών που απαντούν στο σταφύλι και τον οίνο Στο σταφύλι και τον οίνο, ανάλογα με την υποκατάσταση του πλευρικού δακτυλίου, συναντώνται πέντε είδη ανθοκυανών (Κουράκου-Δραγώνα, 1998). Τα μόρια αυτά εμφανίζονται να είναι σταθερότερα με τη μορφή γλυκοζιτών (ανθοκυάνες) από ότι με τη μορφή άγλυκου (ανθοκυανιδίνες), με αποτέλεσμα οι ανθοκυανιδίνες να μην βρίσκονται ελεύθερες στη φύση. Σχήμα 1.5. Δομή μορίων ανθοκυανών: α) μονογλυκοζίτης-3, β) διγλυκοζίτης-3,5 Οι ανθοκυανιδίνες διαφέρουν μεταξύ τους μόνο ως προς τον αριθμό των -OH και - ΟCH 3 που υπεισέρχονται στον πλευρικό δακτύλιο. Ο αριθμός αυτός επηρεάζει τόσο τη σταθερότητα της ανθοκυάνης, όσο και το χρώμα της (Κουράκου-Δραγώνα, 1998, Ribéreau-Gayon et al., 2000) Ταννίνες Οι ταννίνες βρίσκονται στα στερεά μέρη του σταφυλιού και συγκεκριμένα στα γίγαρτα (65%), τους βοστρύχους (22%), τους φλοιούς (12%) και τη σάρκα (1%), ενώ παραλαμβάνονται είτε με εκχύλιση είτε με συμπίεση (Σουφλερός, 2000). Προστατεύουν τα φυτά από πιθανή προσβολή τους από μικροοργανισμούς, καθώς συντίθενται με ταχύτερους ρυθμούς έπειτα από κάποιο τραυματισμό του φυτικού ιστού. Ένας τέτοιος τραυματισμός οδηγεί στην καταστροφή τόσο των κυττάρων, όσο και της 39

40 διάταξής τους στο φυτό, με αποτέλεσμα οι πολυφαινολικές οξειδάσες να έρχονται σε επαφή με τις φαινολικές ενώσεις που βρίσκονται σε κατώτερα υποστρώματα (γαλλικό οξύ, χλωρογενικό οξύ, καφεϊκό οξύ, φλαβονοειδή). Οι πολυφαινολικές οξειδάσες προκαλούν την οξείδωση των φαινολικών αυτών ενώσεων, με αποτέλεσμα να παράγονται κινόνες, οι οποίες έπειτα από τον πολυμερισμό τους, σχηματίζουν ταννίνες (Muchuweti et al., 2006, Cosme et al., 2009, Laghi et al., 2010). Οι ταννίνες που απαντούν στα σταφύλια, διακρίνονται σε εκείνες που βρίσκονται στα γίγαρτα και σε εκείνες που βρίσκονται στο φλοιό. Οι ταννίνες των γιγάρτων εντοπίζονται στην εφυμενίδα και τον κερατοειδή ιστό του κελύφους, ενώ απελευθερώνονται στο περιβάλλον μόνο όταν ο επιδερμικός ιστός καταστεί διαλυτός. Οι ταννίνες του φλοιού εντοπίζονται είτε στα χυμοτόπια, όπου δημιουργούν πυκνά συμπλέγματα στα κύτταρα που βρίσκονται κοντά στην επιδερμίδα, είτε στην πρωτεϊνοφωσφολιπιδική μεμβράνη, με την οποία είναι ισχυρά συνδεδεμένες, είτε βρίσκονται ενωμένες με το κυτταρικό τοίχωμα (Κουράκου-Δραγώνα, 1998, Ribéreau-Gayon et al., 2000, Castañeda-Ovando et al., 2009) Η χημική δομή των ταννινών Οι ταννίνες είναι φαινολικές ενώσεις, οι οποίες έχουν την ικανότητα να σχηματίζουν σταθερά σύμπλοκα τόσο με πρωτεΐνες, όσο και με άλλα πολυμερή, όπως είναι οι πολυσακχαρίτες. Είναι μεγάλου μεγέθους μόρια, τα οποία περιέχουν φαινολικό δακτύλιο και προέρχονται από τον πολυμερισμό απλών φαινολικών ενώσεων. Ο τρόπος πολυμερισμού, καθώς και ο βαθμός στον οποίο πολυμερίζονται οι ενώσεις αυτές, επηρεάζουν σημαντικά τη δραστικότητα των μεγαλομορίων που προκύπτουν (Sun et al., 1998, Vidal et al., 2002). Το μοριακό βάρος των δραστικών ταννινών, κυμαίνεται από 600 έως Da. Σε περίπτωση που τα μόρια των ταννινών είναι υπερβολικά μεγάλα, τότε παρεμποδίζεται ο σχηματισμός συμπλόκων με τις πρωτεΐνες, διότι αυτά δεν μπορούν να πλησιάσουν τις πρωτεΐνες στον επιθυμητό βαθμό. Αντίστοιχα, σε περίπτωση που τα μόρια των ταννινών είναι υπερβολικά μικρά, τότε σχηματίζονται ασταθή σύμπλοκα με τις πρωτεΐνες, διότι δεν υπάρχουν αρκετές ενεργές θέσεις (Σουφλερός, 1997). 40

41 Ανάλογα με τη δομή των μορίων τους, οι ταννίνες διακρίνονται στις υδρολυόμενες (ή ταννίνες του γαλλικού οξέος) και τις συμπυκνωμένες (ή ταννίνες της κατεχίνης) (Ribéreau-Gayon et al., 2000) Υδρολυόμενες ταννίνες Οι υδρολυόμενες ταννίνες δεν περιέχονται στο σταφύλι, ενώ είναι δυνατόν να βρεθούν σε οίνους, καθώς είναι οι κύριες εμπορικές τανίνες που νόμιμα αναγνωρίζονται και χρησιμοποιούνται για τις διάφορες κατεργασίες των οίνων (Σουφλερός, 2000). Αποτελούνται είτε από ένα μόριο σακχάρου (κυρίως γλυκόζη), είτε από ένα μόριο πολυσακχαρίτη, του οποίου πολλά [-ΟΗ] βρίσκονται εστεροποιημένα με διάφορα φαινολικά οξέα. Τα σημαντικότερα από αυτά είναι το γαλλικό και το ελλαγικό οξύ (διμερές του γαλλικού οξέος) (Σχήμα 1.6.), τα οποία απελευθερώνονται έπειτα από όξινη υδρόλυση των γαλλοταννινών και των ελαγιταννινών αντίστοιχα (Κουράκου-Δραγώνα, 1998, Ribéreau-Gayon et al., 2000). Σχήμα 1.6. Συντακτικοί τύποι φαινολικών οξέων: α) γαλλικού οξέος, β) ελλαγικού οξέος (Ribéreau-Gayon et al., 2000) Το γαλλικό οξύ που ανιχνεύεται στον οίνο, αποτελεί φυσικό συστατικό του, καθώς βρίσκεται στο φλοιό και τα γίγαρτα του σταφυλιού. Αντίθετα, το ελλαγικό οξύ προέρχεται, είτε από τα δρύινα βαρέλια στα οποία ωριμάζει ο οίνος, είτε από τη προσθήκη οινολογικών ταννινών σε αυτόν. Οι κυριότερες υδρολυόμενες ταννίνες που απαντούν στο ξύλο της δρυός και κατ επέκταση και στα δρύινα βαρέλια, είναι η βεσκαλαγίνη και η κασταλαγίνη, οι οποίες έπειτα από μερική υδρόλυσή τους απελευθερώνουν τη βεσκαλίνη και την κασταλίνη αντίστοιχα (Rib éreau -Gayon et al., 2000). 41

42 Συμπυκνωμένες ταννίνες Οι συμπυκνωμένες ταννίνες είναι περισσότερο διαδεδομένες στη φύση σε σχέση με τις υδρολυόμενες, καθώς αποτελούν τις φυσικές ταννίνες των σταφυλιών. συμπυκνωμένες ταννίνες προέρχονται, τόσο από τον πολυμερισμό της φλαβανόλης-3 (κατεχίνη), όσο και της φλαβανοδιόλης-3,4 (προκυανιδίνη). Τα μόριά τους μπορεί να είναι ακυλιωμένα ή γλυκοζιλιωμένα, ενώ αποτελούνται από δέκα ή περισσότερα μόρια φλαβανολών και έχουν μοριακό βάρος μεγαλύτερο του (Rib éreau -Gayon et al., 2000). Οι βασικές δομικές μονάδες των συμπυκνωμένων ταννινών είναι η (+)-κατεχίνη και η (-)-επικατεχίνη (Σχήμα 1.7.). Η θέρμανση του διαλύματος των πολυμερών αυτών, παρουσία όξινου μέσου, οδηγεί στην αποδέσμευση ιδιαίτερα ασταθών κατιόντων, τα οποία μετατρέπονται σε προϊόντα συμπύκνωσης σκουρόχρωμου χρωματισμού και κυρίως σε ερυθρή κυανιδίνη. Για το λόγο αυτό, ο όρος «λευκοκυανιδίνες» που χρησιμοποιούνταν παλαιότερα, έχει σήμερα αντικατασταθεί από τον όρο «προκυανιδίνες» (Ribéreau-Gayon et al., 2000). Οι Κατεχίνη Επικατεχίνη Σχήμα 1.7. Συντακτικοί τύποι των φλαβαν-3-ολών Οι ενώσεις αυτές θεωρούνται υπεύθυνες για τις οργανοληπτικές ιδιότητες του οίνου, συμμετέχουν στη δημιουργία θολώματος, συμμετέχουν σε αντιδράσεις οξείδωσης ή και συμπύκνωσης κατά τη διάρκεια της παλαίωσης του οίνου και αλληλεπιδρούν με τις πρωτεΐνες (Ribéreau-Gayon et al., 2000). Η σημαντικότερη ιδιότητά τους, είναι η ικανότητά που έχουν να δεσμεύουν και να καταβυθίζουν τις πρωτεΐνες, ικανότητα η οποία είναι όμως αντιστρόφως ανάλογη του μεγέθους του μορίου τους (Hagerman & Butler, 1981, Vande Casteele et al., 1983, Ricardo-da-Silva et al., 1991, Sarni-Manchado et al., 1999). Η καταβύθιση των 42

43 πρωτεϊνών από τις προκυανιδίνες, καθίσταται αποτελεσματικότερη κυρίως σε τιμές ph κοντά στο ισοηλεκτρικό τους σημείο. Επιπλέον, η αλληλεπίδρασή τους με πρωτεΐνες πλούσιες σε προλίνη, είναι ευκολότερη σε σύγκριση με την αλληλεπίδρασή τους με τις σφαιροπρωτεΐνες. Οι συμπυκνωμένες ταννίνες βρίσκονται σε όλα τα στερεά μέρη του σταφυλιού, κυρίως όμως στο φλοιό, τα γίγαρτα και τους βοστρύχους, ενώ κατά τη διάρκεια της οινοποίησης μεταφέρονται στον οίνο (Σχήμα 1.8.) (Ribéreau-Gayon et al., 2000). Οι ταννίνες που απαντούν στα γίγαρτα, είναι προκυανιδίνες που έχουν ως κυρίαρχο χαρακτηριστικό την έντονη στυπτικότητά τους. Κατά το στάδιο του περκασμού, εμφανίζουν μικρό βαθμό πολυμερισμού, ο οποίος όμως αυξάνεται κατά την πορεία ωρίμανσης του σταφυλιού (Ribéreau-Gayon et al., 2000). Οι ταννίνες που απαντούν στο φλοιό, έχουν πολυπλοκότερη δομή συγκριτικά με τις προηγούμενες και εμφανίζουν μικρή μεταβολή του βαθμού πολυμερισμού τους (Cheynier et al., 2006). Σχήμα 1.8. Σχηματική αναπαράσταση της μεταφοράς των ταννινών του σταφυλιού στον οίνο, κατά τη διάρκεια της οινοποίησης (Kennedy, 2008) Στην πλειοψηφία τους είναι διμερείς και τριμερείς προκυανιδίνες, οι οποίες αδρανοποιούνται βαθμιαία με πρωτεΐνες, κατά την πορεία της ωρίμανσης του σταφυλιού, χάνοντας με αυτόν τον τρόπο τη στυπτικότητα και την επιθετικότητά τους. Τέλος, οι ταννίνες που απαντούν στους βοστρύχους, αποτελούν πολυμερισμένες προκυανιδίνες, οι οποίες παρουσιάζουν παρόμοια συμπεριφορά με εκείνη των ταννινών που απαντούν στα γίγαρτα, καθώς και παρόμοια ένταση στη στυπτικότητά τους. Επιπρόσθετα, οι ταννίνες που βρίσκονται στο φλοιό μπορούν να ταξινομηθούν σε τρεις κατηγορίες (Ribereau-Gayon et al., 1998): 43

44 Ταννίνες που απαντούν στα χυμοτόπια, οι οποίες σχηματίζουν πυκνά συμπλέγματα μέσα στα κύτταρα που βρίσκονται κοντά στην επιδερμίδα. Ταννίνες που βρίσκονται ισχυρά ενωμένες με την πρωτεϊνοφωσφολιπιδική μεμβράνη και είναι ευαίσθητες στους υπέρηχους. Ταννίνες που βρίσκονται ενωμένες με το κυτταρικό τοίχωμα κυτταρίνης-πηκτίνης. Η περιεκτικότητα ενός λευκού οίνου σε ταννίνες, καθορίζεται από την έκταση της διαύγασης (απομάκρυνσης των οινολασπών), ενώ η συγκέντρωσή τους σε μη απολασπωμένα γλεύκη κυμαίνεται από 100 έως 300 mg/l. Αντίθετα, η περιεκτικότητα ενός ερυθρού οίνου σε ταννίνες, καθορίζεται τόσο από την ποικιλία, όσο και από την τεχνική της οινοποίησης, ενώ η συγκέντρωσή τους κυμαίνεται από 1 έως 4 g/l (Ribéreau-Gayon et al., 2000). Συμπερασματικά, θα μπορούσαμε να πούμε ότι οι συμπυκνωμένες ταννίνες αποτελούν το «σώμα» του οίνου, καθώς συμμετέχουν στα διάφορα στάδια της ωρίμανσης και της παλαίωσής του. Οι ενώσεις αυτές αποτελούν το 30-60% των ολικών φαινολικών παραγώγων του οίνου, ενώ το ποσοστό αυτό αυξάνεται με την αύξηση της ηλικίας του οίνου. Οι αλυσίδες των συμπυκνωμένων ταννινών, σχηματίζουν ένα είδος σκελετού, στον οποίο είναι δυνατόν να προστεθούν και άλλα μόρια, όπως πολυσακχαρίτες, πεπτίδια, ανόργανα στοιχεία ή μόρια νερού (Κουράκου-Δραγώνα, 1998, Σουφλερός, 2000). 44

45 Περιεκτικότητα ελληνικών οίνων σε φαινολικές ενώσεις Η περιεκτικότητα ορισμένων ελληνικών οίνων σε ολικές φαινόλες και ολικές φλαβανόλες, παρουσιάζεται στον Πίνακα 1.6. Πίνακας 1.6. Περιεκτικότητα ελληνικών οίνων σε ολικές φαινόλες και ολικές φλαβανόλες Ποικιλία οίνου Συγκέντρωση Συγκέντρωση Πηγή ολικών φαινολών ολικών φλαβανολών Αθήρι Ρόδου 264,0-303,1 13,47-16,46 Sioumis et al., 2005 Αθήρι Αττικής 213,0-230,0 77,3-83,5 Salacha et al., 2008 Σαββατιανό Αττικής 201,0-279,0 0,61-104,5 Sioumis et al., 2005 Salacha et al., 2008 Μοσχάτο Αλεξανδρείας 85,4-99,9 4,2-13,6 Psarra et al., 2002 Μοσχοφίλερο 121,0-137,1 5,3-7,7 Psarra et al., 2002 Μονεμβασιά 197,6-402,4 53,5-205,3 Psarra et al., 2002 Ρομπόλα 185,3-192,3 7,0-7,9 Psarra et al., 2002 Ασύρτικο 233,2-313,0 51,3-116,9 Psarra et al., 2002 Salacha et al., 2008 Ροδίτης Πάτρας 67,7-99,7 3,3-5,6 Psarra et al., 2002 Ροδίτης Μαγνησίας 242,5 4,76 Sioumis et al., 2005 Ροδίτης Αττικής 183,0 36,0 Salacha et al., 2008 Σκιαδόπουλο Ζακύνθου 262,2 21,22 Sioumis et al., 2005 Μαλαγουζιά 193,5 120,0 Salacha et al., 2008 Βιλανά 269,1 89,0 Salacha et al., 2008 Πετρουλιάνος 286,5 145,1 Salacha et al., 2008 Ροκανιάρης 243,1 70,3 Salacha et al.,

46 1.7. Πολυσακχαρίτες Οι πολυσακχαρίτες συνιστούν μία από τις κυριότερες ομάδες μακρομορίων του οίνου. Προερχόμενοι από το τοίχωμα των κυττάρων του φλοιού και της σάρκας της ράγας του σταφυλιού, καθώς και από το τοίχωμα των κυττάρων μικροοργανισμών, όπως είναι οι ζυμομύκητες και ο μύκητας Botrytis cinerea που προσβάλλει τα σταφύλια (φαιά σήψη) (Dufour & Bayonove, 1999a, Boulet et al., 2007), διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην εξέλιξη της διεργασίας της οινοποίησης. Η πληθώρα των πηγών προέλευσής τους, οδηγεί στη μεγάλη διαφοροποίηση του κλάσματος των πολυσακχαριτών του οίνου, ως προς τη σύσταση. Η συγκέντρωσή τους στον οίνο, κυμαίνεται από 0,2 έως 2 g/l Ταξινόμηση πολυσακχαριτών Οι πολυσακχαρίτες που απαντούν στον οίνο, διακρίνονται σε κατηγορίες, ανάλογα με τη δομή του μορίου τους ή με τον όξινο χαρακτήρα τους (Guadalupe & Ayestarán, 2007). Ανάλογα με τη δομή τους, δηλαδή ανάλογα με το αν είναι συζευγμένοι ή όχι με πρωτεΐνες, ταξινομούνται σε (Dufour & Bayonove, 1999b): Αραβινογαλακτάνες τύπου I. Ο βασικός σκελετός των αραβινογαλακτανών τύπου I, αποτελείται κυρίως από μόρια β-d-γαλακτόζης, τα οποία βρίσκονται συνδεδεμένα μεταξύ τους με 4 1 γλυκοζιτικό δεσμό και έχουν υποκαταστάτες μόρια αραβινοφουρανόζης στη θέση 6 (Dufour & Bayonove, 1999b, Ayestarán et al., 2004). Αραβινογαλακτάνες τύπου II (AGs). Ο βασικός σκελετός των αραβινογαλακτανών τύπου IΙ (AGs), αποτελείται κυρίως από μόρια β-d-γαλακτόζης, τα οποία βρίσκονται συνδεδεμένα μεταξύ τους με 1 3 γλυκοζιτικό δεσμό, ενώ φέρει και πλευρικές 1 6 αλυσίδες β-d-γαλακτόζης, οι οποίες είναι υποκατεστημένες κυρίως με μόρια αραβινοφουρανόζης. Αραβινογαλακτάνες συζευγμένες με πρωτεΐνες (AGPs). Ο βασικός σκελετός των αραβινογαλακτανών που είναι συζευγμένες με πρωτεΐνες (AGPs), είναι πανομοιότυπος με εκείνο των αραβινογαλακτανών τύπου IΙ (AGs), με μοναδική διαφοροποίηση την παρουσία πρωτεΐνης στο μόριό τους, σε ποσοστό μέχρι 10%. Οι AGPs αποτελούν το 40% του συνόλου των πολυσακχαριτών που απαντούν στον οίνο. 46

47 Στο Σχήμα 1.9. απεικονίζεται ένα τμήμα του μορίου μιας αραβινογαλακτάνης (Pellerin et al., 1996, Guadalupe & Ayestarán, 2007). Σχήμα 1.9. Σχηματική απεικόνιση τμήματος μορίου αραβινογαλακτάνης (προερχόμενη από άγριο πεύκο) Ραμνογαλακτουρονάνες τύπου I (RG-I). Ο βασικός σκελετός των ραμνογαλακτουρονανών τύπου I (RG-I), έχει αρκετά πολύπλοκη δομή και αποτελείται κυρίως από μόρια ραμνόζης και γαλακτουρονικού οξέος. Στο Σχήμα απεικονίζεται ένα τμήμα του μορίου μιας ραμνογαλακτουρονάνης τύπου Ι. Σχήμα Σχηματική απεικόνιση τμήματος μορίου ραμνογαλακτουρονάνης τύπου Ι Ραμνογαλακτουρονάνες τύπου II (RG-II). Ο βασικός σκελετός των ραμνογαλακτουρονανών τύπου II (RG-II), αποτελείται κυρίως από μόρια α-dγαλακτουρονικού οξέος, τα οποία βρίσκονται συνδεδεμένα μεταξύ τους με δεσμούς 1 4, καθώς και από τέσσερις πλευρικές αλυσίδες, οι οποίες περιέχουν μόρια ραμνοπυρανόζης, γαλακτοπυρανόζης και αραβινοφουρανόζης (Pellerin et al., 1996, 47

48 Dufour & Bayonove, 1999a, Guadalupe & Ayestarán, 2007). Στο Σχήμα απεικονίζεται ένα τμήμα του μορίου μιας ραμνογαλακτουρονάνης τύπου ΙI. Σχήμα Σχηματική απεικόνιση τμήματος μορίου ραμνογαλακτουρονάνης τύπου ΙΙ Οι RG-II απαντούν σε υψηλά επίπεδα στο γλεύκος, διατηρούνται κατά τη διεργασία της αλκοολικής ζύμωσης και έτσι αποτελούν το 20% των πολυσακχαριτών που ανιχνεύονται και ταυτοποιούνται στον οίνο, οι οποίοι καθιζάνουν με την προσθήκη αιθανόλης (Pellerin et al., 1993, 1995, 1996). Επιπλέον, ορισμένοι ερευνητές θεωρούν πως οι RG-II απαντούν στον οίνο με τη μορφή ενός διμερούς συμπλόκου με το βόριο, το οποίο εμφανίζεται να είναι σταθερό στις τιμές ph του οίνου. Έτσι, οι RG-II πιθανότατα συσχετίζονται με την παρουσία ιχνών βαρέων μετάλλων στον οίνο (O Neill et al., 1996, Guadalupe & Ayestarán, 2007). Ομογαλακτουρονάνες (HG). Ο βασικός σκελετός των ομογαλακτουρονανών, αποτελείται κυρίως από μόρια γαλακτουρονικού οξέος, όπως και εκείνος των RG-I και RG-II. Οι ομογαλακτουρονάνες, οι ραμνογαλακτουρονάνες τύπου Ι και οι ραμνογαλακτουρονάνες τύπου ΙΙ, συνιστούν μια ομάδα πολυσακχαριτών που ονομάζονται πηκτίνες (Willats et al., 2001). Στο παρακάτω σχήμα (Σχήμα 1.12.), απεικονίζεται ένα τμήμα του μορίου μίας ομογαλακτουρονάνης. Σχήμα Σχηματική απεικόνιση τμήματος μορίου ομογαλακτουρονάνης 48

49 Μαννάνες συζευγμένες με πρωτεΐνες (μαννοπρωτεΐνες). Οι μαννοπρωτεΐνες αποτελούν δομικά στοιχεία του κυτταρικού τοιχώματος των ζυμομυκήτων (25-50% στην περίπτωση του μύκητα Saccharomyces cerevisiae) και απελευθερώνονται στο γλεύκος κατά τη διάρκεια της αλκοολικής ζύμωσης ή, κυρίως, μετά το τέλος αυτής, εφόσον ο οίνος παραμείνει σε επαφή με τις οινολάσπες (Llaubères et al., 1987, Ribereau-Gayon et al., 2000, Guadalupe & Ayestarán, 2007). Το μόριο των μαννοπρωτεϊνών αποτελείται από μόρια σακχάρων (κατά μέσο όρο 70%), κυρίως μαννόζη (98%) και μικρό ποσοστό πρωτεΐνης (Μ.Ο. 30%). Ο τρόπος με τον οποίο βρίσκονται συνδεδεμένα τα μόρια της μαννόζης, αλλά και το ποσοστό της πρωτεΐνης που περιέχεται σε ένα μόριο μαννοπρωτεΐνης, εξαρτώνται και καθορίζονται από τα αντίστοιχα χαρακτηριστικά των μαννοπρωτεϊνών των κυτταρικών τοιχωμάτων των μικροοργανισμών, οι οποίοι συμβάλλουν στη διεργασία της αλκοολικής ζύμωσης (Caridi, 2006, Guadalupe & Ayestarán, 2007). Οι πολυσακχαρίτες, ανάλογα με τον όξινο χαρακτήρα τους, δηλαδή ανάλογα με το αν περιέχουν γαλακτουρονικό οξύ ή όχι, ταξινομούνται σε (Dufour & Bayonove, 1999a): Ουδέτερους πολυσακχαρίτες, στους οποίους ανήκουν κυρίως οι αραβινογαλακτάνες τύπου I και II, αλλά και οι αραβινογαλακτάνες που είναι συζευγμένες με πρωτεΐνες. Οι ουδέτεροι πολυσακχαρίτες δεν περιέχουν γαλακτουρονικό οξύ. Όξινους πολυσακχαρίτες, στους οποίους ανήκουν οι ομογαλακτουρονάνες, οι ραμνογαλακτουρονάνες τύπου I και II και οι μαννοπρωτεΐνες. Οι όξινοι πολυσακχαρίτες χαρακτηρίζονται από υψηλή περιεκτικότητα σε γαλακτουρονικό οξύ, το οποίο βρίσκεται ενωμένο με δεσμούς α-1,4, καθώς και σε πλευρικές αλυσίδες σακχάρων, όπως είναι η γαλακτόζη και η αραβινόζη Ρόλος των πολυσακχαριτών στην οινοποίηση Οι πολυσακχαρίτες που απελευθερώνονται στον οίνο κατά τη διάρκεια της οινοποίησης, παρουσιάζουν ιδιαίτερο τεχνολογικό ενδιαφέρον. Συγκεκριμένα, συμμετέχουν σε μεγάλο βαθμό στη διαμόρφωση των οργανοληπτικών χαρακτηριστικών του παραγόμενου προϊόντος (Vidal et al., 2004), δρουν ως προστατευτικά κολλοειδή, αλληλεπιδρούν με τις ταννίνες (Riou et al., 2002), αλλά και με ορισμένες πτητικές ενώσεις (Chalier et al., 2007) και συμβάλλουν στην πρωτεϊνική και τρυγική σταθεροποίηση του οίνου (Ferreira et al., 2001, Guadalupe & Ayestarán, 2007, 2008). 49

50 Η παρουσία τους στον οίνο παρεμποδίζει την αύξηση της διαμέτρου των αιωρούμενων συστατικών του (κρύσταλλοι τρυγικού καλίου) και τη συσσωμάτωσή τους, με αποτέλεσμα να αποφεύγεται ή τουλάχιστον να καθυστερεί η καθίζησή τους. Η δράση αυτή των πολυσακχαριτών είναι επιθυμητή στους διαυγείς οίνους, καθώς τους προστατεύουν και διατηρούν τη διαύγεια αυτών, ενώ είναι ανεπιθύμητη στους θολούς οίνους, διότι παρεμποδίζουν τη διαύγασή τους (Σουφλερός, 1997, Ferreira et al., 2001). Οι πολυσακχαρίτες και οι φαινολικές ενώσεις, αποτελούν τις δύο σημαντικότερες κατηγορίες μακρομορίων του οίνου, οι οποίες κατέχουν καθοριστικό ρόλο στη διαμόρφωση των ιδιαίτερων οργανοληπτικών χαρακτηριστικών του προϊόντος αυτού. Στους πολυσακχαρίτες αποδίδεται η αίσθηση του «όγκου» που παρουσιάζουν οι οίνοι στο στόμα του καταναλωτή-δοκιμαστή (Vidal et al., 2004), ενώ στις φαινολικές ενώσεις αποδίδεται η στυφή γεύση που εμφανίζουν οι οίνοι, δηλαδή η αίσθηση που προκύπτει κατά την αντίδραση τους με τις πρωτεΐνες του σάλιου (Vidal et al., 2004). Η στυφή γεύση αποτελεί χαρακτηριστικό γνώρισμα των φρέσκων ερυθρών οίνων, ενώ η μείωση της έντασής της είναι ευθέως ανάλογη της παλαίωσης του οίνου (Vidal et al., 2004). Η μείωση της στυφής γεύσης στους παλαιωμένους οίνους, αποδίδεται κυρίως στη μετατροπή των στυφών προκυανιδινών σε λιγότερο πικρές και στυφές ενώσεις, η οποία επέρχεται με την πάροδο του χρόνου και την παλαίωση του οίνου. Επιπλέον, η παρουσία των πολυσακχαριτών στον οίνο, περιορίζει τη συσσωμάτωση των ανθοκυανιδινών και οδηγεί σε μείωση της στυφής γεύσης, καθώς παρεμποδίζεται η αλληλεπίδρασή τους με τις πρωτεΐνες της σιέλου και στη συνέχεια η καθίζησή τους. Η πηκτίνη και ο όξινος πολυσακχαρίτης ραμνογαλακτουρονάνη τύπου ΙΙ, θεωρούνται ότι συμβάλλουν στη μείωση της στυφής γεύσης των οίνων, μέσω δέσμευσης των συσσωματωμάτων των προκυανιδινών του οίνου, ενώ οι μαννοπρωτεΐνες και οι αραβινογαλακτάνες (AGPs), μέσω παρεμπόδισης της δημιουργίας τους (Vidal et al., 2003, 2004) Μέθοδοι προσδιορισμού των φαινολικών συστατικών και των πολυσακχαριτών του οίνου Προσδιορισμός ολικών φαινολών με τη μέθοδο Folin-Ciocalteau Για τον χρωματομετρικό προσδιορισμό των ολικών φαινολών, ακολουθήθηκε η μέθοδος των Singleton & Rossi (Singleton & Rossi, 1965), η οποία αποτελεί την πλέον 50

51 αποδεκτή και συχνά χρησιμοποιούμενη μέθοδο (De Beer et al., 2004), καθώς είναι γρήγορη, αναπαραγώγιμη και χαμηλού κόστους (Vrhovsek et al., 2001). Η αρχή της μεθόδου στηρίζεται στην οξείδωση των φαινολικών συστατικών, σε αλκαλικό περιβάλλον, από το αντιδραστήριο Folin-Ciocalteau. Na 2 WO 4 / Na 2 MoO 4 (phenol - MoW 11 O 40 ) -4 Mo(VI) (yellow) + e - Mo(V) (blue) Πρόκειται για ένα μίγμα φωσφο-βολφραμικού οξέος (H 3 PW 12 O 40 ) και φωσφομολυβδαινικού οξέος (H 3 PMo 12 O 40 ), το οποίο κατά την οξείδωση των φαινολικών συστατικών, ανάγεται σε μίγμα κυανών οξειδίων του βολφραμίου και του μολυβδαινίου. Η αντίδραση λαμβάνει χώρα σε αλκαλικό περιβάλλον, το οποίο εξασφαλίζεται με την προσθήκη κορεσμένου διαλύματος ανθρακικού νατρίου. Το μείγμα των οξειδίων βολφραμίου (W 8 O 23 ) και μολυβδαινίου (Mo 8 O 23 ) που σχηματίζεται κατά την αναγωγή, έχει κυανό χρώμα και παρουσιάζει μέγιστο απορρόφησης στα 750 nm περίπου, ενώ η έντασή του είναι ανάλογη της περιεκτικότητας του οίνου σε φαινολικά συστατικά (Naczk & Shahidi, 2004). Το αποτέλεσμα εκφράζεται σε ισοδύναμα mg γαλλικού οξέος/l οίνου Προσδιορισμός ολικών φλαβανολών με τη μέθοδο της π- διμεθυλαμινοκινναμωμικής αλδεΰδης (DMACA) Για τον προσδιορισμό των φλαβανολών του οίνου, ακολουθήθηκε η μέθοδος της π- διμεθυλαμινοκινναμωμικής αλδεΰδης (DMACA), η οποία προτάθηκε από τους Nagel και Glories (Nagel & Glories, 1991). Οι κατεχίνες και οι προανθοκυανιδίνες, αντιδρούν με τις αρωματικές αλδεΰδες σε ισχυρά όξινο περιβάλλον, αποδίδοντας μέσω αυτής της αντίδρασης προϊόντα με χαρακτηριστικό χρωματισμό. Τα προϊόντα αυτά μπορούν να χρησιμοποιηθούν για ποιοτικούς και ποσοτικούς προσδιορισμούς, με τη χρήση χρωματομετρικών και φασματοφωτομετρικών δοκιμών (Glavnik et al., 2009). 51

52 Σχήμα Σχηματική παράσταση της αντίδρασης των φλαβανολών με τη π-διμεθυλαμινοκινναμωμική αλδεΰδη Συγκεκριμένα, οι φλαβανόλες αντιδρούν με τη π-διμεθυλαμινοκινναμωμική αλδεΰδη (Σχήμα 1.13.). Το προϊόν της αντίδρασης έχει ανοιχτό πράσινο χρώμα, το οποίο παρουσιάζει μέγιστο απορρόφησης στα 640 nm, ενώ η έντασή του είναι ανάλογη της περιεκτικότητας του οίνου σε φλαβανόλες. Το αποτέλεσμα εκφράζεται σε ισοδύναμα mg κατεχίνης/l οίνου (Naczk & Shahidi, 2004) Προσδιορισμός ολικών πολυσακχαριτών με τη μέθοδο φαινόληςθειϊκού οξέος Για τον προσδιορισμό των ολικών πολυσακχαριτών του οίνου, εφαρμόστηκε η μέθοδος φαινόλης-θειϊκού οξέος, η οποία προτάθηκε από τον Dubois και τροποποιήθηκε από τον Segarra και τους συνεργάτες του. Οι πολυσακχαρίτες αντιδρούν με τη φαινόλη και το θειϊκό οξύ και δίνουν κίτρινο χρώμα, το οποίο παρουσιάζει μέγιστο απορρόφησης στα 490 nm, ενώ η έντασή του είναι ανάλογη της περιεκτικότητας του οίνου σε πολυσακχαρίτες. Το αποτέλεσμα εκφράζεται σε ισοδύναμα mg D-(+)-γαλακτόζης/L οίνου. 52

53 1.9. Σκοπός της εργασίας Η ποιότητα του οίνου απαρτίζεται από ένα σύνολο παραμέτρων, μεταξύ των οποίων, το άρωμα και η γεύση θεωρούνται πρωταρχικές. Μετά την ολοκλήρωση της αλκοολικής ζύμωσης, ο φρέσκος οίνος μπορεί είτε να μεταγγιστεί, είτε να παραμείνει και να «ωριμάσει» για κάποιο διάστημα με τις οινολάσπες. Κατά τη διάρκεια της παραμονής του με τις οινολάσπες, ο οίνος εμπλουτίζεται με διάφορα συστατικά, τα οποία απελευθερώνονται από τα νεκρά κύτταρα των ζυμών, χάρη στο αυθόρμητο φαινόμενο της αυτόλυσης. Τα συστατικά αυτά, μαζί με τις πτητικές ενώσεις, οι οποίες σχηματίζονται κατά την αλκοολική ζύμωση, συμβάλλουν στην πολυπλοκότητα και τη βελτίωση της ποιότητας του παραγόμενου οίνου. Οι πολυσακχαρίτες, ειδικότερα οι μαννοπρωτεΐνες και οι γλυκάνες, οι οποίες σχετίζονται με άμεσα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά, όπως είναι η «στρογγυλάδα», η «λιπαρότητα» και ο «όγκος», απελευθερώνονται κατά κύριο λόγο κατά την αποικοδόμηση του κυτταρικού τοιχώματος, μαζί με ένζυμα (εστεράσες και λιπάσες), αμινοξέα και λιπαρά οξέα. Σκοπός της παρούσας εργασίας, ήταν η μελέτη σε βιομηχανική κλίμακα, της επίδρασης διαφορετικών εμπορικών στελεχών Saccharomyces cerevisiae, καθώς και εμπορικών ενζυμικών σκευασμάτων, τα οποία χρησιμοποιούνται προκειμένου να επιταχυνθεί η αυτόλυση των κυττάρων κατά τη διάρκεια της ωρίμανσης του οίνου παρουσία οινολασπών, στα επίπεδα των φαινολικών συστατικών και των πολυσακχαριτών λευκού οίνου, ο οποίος στερείται ποικιλιακού αρώματος, προκειμένου να αποκτηθεί ένα αναβαθμισμένο προϊόν με εμπορικό ενδιαφέρον. Για το σκοπό αυτό επιλέχθηκαν τρία εμπορικά στελέχη του ζυμομύκητα Saccharomyces cerevisiae, τα οποία χρησιμοποιούνται ευρέως στη λευκή οινοποίηση, καθώς και δύο εμπορικά ενζυμικά σκευάσματα με διαφορετικές δράσεις που χρησιμοποιήθηκαν σε διαφορετικές δόσεις. Η λευκή ποικιλία αμπέλου που επιλέχθηκε, ήταν η γηγενής Vitis vinifera L. var Όψιμος Εδέσσης, η οποία ενώ στερείται ερευνητικού ενδιαφέροντος, συγκεντρώνει έντονο βιομηχανικό ενδιαφέρον. Χαρακτηρίζεται ως παραγωγική (περίπου 4 κιλά/πρέμνο), με έλλειψη ποικιλιακού αρώματος, ενώ από το 2007 και μετά χρησιμοποιείται για την παραγωγή οίνου βάσης (ευρείας κατανάλωσης), με την οινοποιεία Ευάγγελος Τσάνταλης να διαχειρίζεται περίπου τόνους ετησίως. 53

54 Κεφάλαιο 2 ο ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 2.1. Δείγματα Τα δείγματα λευκού ξηρού οίνου τα οποία αναλύθηκαν, προήλθαν από την πειραματική οινοποίηση σταφυλιών της μη αρωματικής, γηγενούς, λευκής ποικιλίας Vitis vinifera L. cv. Όψιμος Εδέσσης, από την αμπελουργική περιοχή της Αριδαίας και συγκεκριμένα από την κοινότητα της Πιπεριάς του νομού Πέλλας. Η διαδικασία (το πρωτόκολλο της οποίας παρατίθεται αναλυτικά στην ενότητα 2.7.) πραγματοποιήθηκε στις εγκαταστάσεις της οινοποιίας Ευάγγελος Τσάνταλης, στον Αγ. Παύλο Χαλκιδικής, κατά την οινοποιητική περίοδο Πρότυπες ενώσεις Στα πλαίσια της πειραματικής διαδικασίας, χρησιμοποιήθηκαν οι ακόλουθες πρότυπες ενώσεις: γαλλικό οξύ (99,5%) (Sigma Chem. Co., Germany), D-(+)-γαλακτόζη (Merck, Darmstadt, Germany) και ενυδατωμένη (+) κατεχίνη, αναλυτικής καθαρότητας > 98% (Sigma Chem. Co, Germany) Αντιδραστήρια-Διαλύτες Στην παρούσα εργασία χρησιμοποιήθηκαν τα εξής αντιδραστήρια: άνυδρο ανθρακικό νάτριο (Panreac Quimica S.A., Spain), αντιδραστήριο Folin-Ciocalteau (Fluka Biochemica, Germany), κρυσταλλική φαινόλη (Merck, Germany), θειικό οξύ (95-97%, v/v) (Merck, Darmstadt, Germany), υδροχλωρικό οξύ (37%, w/v) (Fluka, Germany), L (+) τρυγικό οξύ ( 99,5%, Fluka, Germany), υδροξείδιο του νατρίου (Merck, Germany) και διμεθυλαμινοκινναμωμική αλδεΰδη (DMACA) (> 98%, Fluka, Germany). Οι διαλύτες που χρησιμοποιήθηκαν ήταν: αιθανόλη καθαρότητας 99,8% (Riedel-de Haën, Seelze, Germany), μεθανόλη (97%, Panreac Quimica S.A., Spain), νερό απιονισμένο και καθαρότητας ΜilliQ (18,2 ΜΩ.cm) από το Εργαστήριο Χημείας και Τεχνολογίας Τροφίμων. 54

55 2.4. Όργανα-Συσκευές Η ζύγιση των απαιτούμενων ποσοτήτων των αντιδραστηρίων, πραγματοποιήθηκε σε αναλυτικό ζυγό ακριβείας τεσσάρων δεκαδικών ψηφίων ΑΒ 204-S (Mettler-Toledo, Greifensee, Germany), τριών δεκαδικών και δύο δεκαδικών ψηφίων (Kern, Germany) ανάλογα με την απαιτούμενη ακρίβεια ζύγισης. Η διάλυση των αντιδραστηρίων πραγματοποιήθηκε, είτε με χρήση του λουτρού υπερήχων Transsonic 420 (Elma, Germany), είτε με χρήση θερμαινόμενων μαγνητικών αναδευτήρων (P-Selecta Agimatic, USA και MR 303 Control, Heidolph, Germany). Για την ανάμιξη των διαλυμάτων χρησιμοποιήθηκε κυκλομίκτης (Vortex, Mixi Matic, Jencons, Bedfordshire, UK), ενώ για τη φυγοκέντρηση των δειγμάτων χρησιμοποιήθηκε συσκευή φυγοκέντρησης SV 11 (Firlabo, France). Για τη μέτρηση της απορρόφησης των προς εξέταση δειγμάτων, αυτά τοποθετήθηκαν, ανάλογα με την περίπτωση, σε κυψελίδες από γυαλί ή χαλαζία πάχους 10 mm (Laseranalytik, Germany) και στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκε φασματοφωτόμετρο UV- Vis διπλής δέσμης U-2000 (Hitachi, Tokyo, Japan), καθώς και φασματοφωτόμετρο UV- Vis απλής δέσμης Helios Epsilon (USA), για τη μέτρηση και την καταγραφή των απορροφήσεων. Επιπλέον, χρησιμοποιήθηκε πεχάμετρο ph 211 (Microprocessor ph Meter, Romania), υδατόλουτρο WB3015 (Greece) και επαρκώς αεριζόμενος ηλεκτρικός φούρνος με διάταξη ρύθμισης και μέτρησης της θερμοκρασίας Γυάλινα σκεύη Για τις ανάγκες των πειραμάτων χρησιμοποιήθηκαν τα παρακάτω γυάλινα σκεύη: ογκομετρικές φιάλες των 5, 10, 20, 25, 50, 100 και 200 ml, κωνικές φιάλες των 50, 100, 200 και 250 ml, γυάλινοι σωλήνες φυγοκέντρησης, σιφώνια πληρώσεως των 5, 10, 20, 25, και 50 ml, σιφώνια μετρήσεως των 5, 10, 20 και 25 ml, απλοί δοκιμαστικοί σωλήνες, εσμυρισμένοι δοκιμαστικοί σωλήνες των 25 ml, γυάλινες κυψελίδες πάχους 10 mm (Laseranalytik, Germany), ποτήρια ζέσεως διαφόρων μεγεθών, ογκομετρικοί κύλινδροι διαφόρων μεγεθών, χωνί διήθησης, πιπέτες Pasteur, κάψα ζύγισης, αδιαφανή φιαλίδια των 5 και 10 ml και διαφανή φιαλίδια των 10 ml. 55

56 2.6. Λοιπός εξοπλισμός Επιπρόσθετα, χρησιμοποιήθηκαν: αυτόματη μικροπιπέτα με έμβολο μl (HTL Labmate, Poland), αυτόματη μικροπιπέτα με έμβολο μl (Corning Lambda, Germany), κυψελίδες χαλαζία πάχους 10 mm (Laseranalytik, Germany), πλαστικοί σωλήνες φυγοκέντρησης, διηθητικό χαρτί, πουάρ, χρονόμετρο, parafilm, μαγνητάκια, αλουμινόχαρτο, σπάτουλες διαφόρων ειδών, τιπς, στατώ διαφόρων ειδών, υδροβολείς, πώματα, γάντια μιας χρήσης, προστατευτικά γυαλιά και προστατευτική μάσκα προσώπου Πειραματική λευκή οινοποίηση Βασικό πρωτόκολλο Η συγκομιδή των σταφυλιών της ποικιλίας Όψιμο Εδέσσης, πραγματοποιήθηκε στις Προηγήθηκε έλεγχος της πορείας ωρίμανσης (Πίνακας 3.3.). Τα αναλυτικά στοιχεία του γλεύκους που χρησιμοποιήθηκε για την πειραματική οινοποίηση στην παρούσα εργασία (δείγμα πριν την έναρξη της αλκοολικής ζύμωσης), παρουσιάζονται στον Πίνακα 3.3 ( 3.1.). Πρώτο στάδιο: Αλκοολική ζύμωση με επιλεγμένα στελέχη Saccharomyces cerevisiae Για τις ανάγκες του πειραματισμού, σταφύλια που συγκομίστηκαν την ίδια μέρα, μεταφέρθηκαν στο οινοποιείο, όπου και εφαρμόστηκε σε βιομηχανική κλίμακα (δεξαμενές 50 T) το πρωτόκολλο της λευκής οινοποίησης, το οποίο διαγραμματικά δίνεται στο Σχήμα 2.1. Αναλυτικότερα, μετά την πραγματοποίηση των απαραίτητων ελέγχων κατά την παραλαβή των σταφυλιών και την ολοκλήρωση των προζυμωτικών κατεργασιών (έκθλιψη, αποβοστρύχωση, προσθήκη SO 2 (50 mg/l), πίεση σταφυλόμαζας και στατική απολάσπωση σε θερμοκρασία 4 o C για 12 h), το διαυγασμένο γλεύκος μεταφέρθηκε σε τρεις διαφορετικές δεξαμενές ζύμωσης. 56

57 ΣΥΓΚΟΜΙΔΗ ΣΤΑΦΥΛΙΩΝ Αμπελοκαλλιέργειες εταιρείας ή συνεργαζόμενες ΣΥΓΚΟΜΙΔΗ ΟΚ ΠΑΡΑΛΑΒΗ ΓΛΕΥΚΟΥΣ ΓΕΝΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΚΑΙ ΟΡΓΑΝΟΛΗΠΤΙΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ ΠΑΡΑΛΑΒΗΣ STOP ΠΑΡΑΛΑΒΗ ΟΙΝΩΝ ΑΠΟ ΑΛΛΑ ΟΙΝΟΠΟΙΕΙΑ εταιρείας ή συνεργαζόμενα ΑΠΟΡΡΙΨΗ ΦΟΡΤΙΟΥ STOP ΠΑΡΑΛΑΒΗ ΣΤΑΦΥΛΙΩΝ Άγιος Παύλος ΖΥΓΙΣΗ ΣΕ ΓΕΦΥΡΟΠΛΑΣΤΙΓΓΑ ΟΠΤΙΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ (Γεν. Εμφάνιση, Φυτοϋγιεινή, O.O.) ΠΑΡΑΛΑΒΗ ΟΙΝΟΛΟΓΙΚΩΝ ΟΥΣΙΩΝ (Αέρια, Θρεπτικές Ουσίες Διαυγαστικά, Ένζυμα) ΠΟΙΟΤΙΚΟΣ ΚΑΙ ΠΟΣΟΤΙΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ ΠΑΡΑΛΑΒΗΣ ΟΚ ΑΠΟΘΗΚΕΣ ΟΙΝΟΛΟΓΙΚΩΝ ΟΥΣΙΩΝ STOP ΕΠΙΣΤΡΟΦΗ ΠΑΡΤΙΔΑΣ ΠΑΡΑΛΑΒΗ ΕΙΣΕΡΧΟΜΕΝΩΝ ΕΠΙΣΤΡΟΦΗ ΠΑΡΤΙΔΑΣ ΟΚ ΑΔΕΙΑΣΜΑ ΣΤΗ ΣΤΑΦΥΛΛΟΔΟΧΟ ΑΠΟΡΡΙΨΗ ΒΟΣΤΡΥΧΩΝ ΟΛΙΚΗ ΑΠΟΒΟΣΤΡΥΧΩΣΗ ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΤΣΙΠΟΥΡΟΥ ΚΟΠΡΙΑ ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΛΙΠΑΣΜΑ Στέμφυλα / κουκούτσια Οινολάσπες ΕΚΘΛΙΨΗ ΣΕ ΑΠΟΡΡΑΓΙΣΤΗΡΙΟ - ΘΛΙΠΤΗΡΙΟ ΜΕΤΑΦΟΡΑ ΣΕ ΠΝΕΥΜΑΤΙΚΟ ΠΙΕΣΤΗΡΙΟ ΕΝΔΕΧΟΜΕΝΗ ΨΥΞΗ ΔΙΑ ΨΥΧΟΜΕΝΟΥ ΚΥΚΛΩΜΑΤΟΣ ΠΙΕΣΕΙΣ ΣΤΟ ΠΝΕΥΜΑΤΙΚΟ ΠΙΕΣΤΗΡΙΟ Πρόρογος - Α Πιεση - Β Πίεση Γλεύκος ΑΝΑΛΥΣΗ ΓΛΕΥΚΟΥΣ Θερμοκρασία, Θειώδες, Be, ph, O.O., ΔΦΟ. ΑΠΟΛΑΣΠΩΣΗ ΓΛΕΥΚΟΥΣ ΣΕ ΔΕΞΑΜΕΝΗ ΑΠΟΛΑΣΠΩΣΗΣ Γλεύκος ΑΝΑΛΥΣΗ ΓΛΕΥΚΟΥΣ Θερμοκρασία, Θειώδες, Be, ph, O.O., ΔΦΟ, Αφομοιώσιμο Ν, Θολερότητα ΜΕΤΑΦΟΡΑ ΓΛΕΥΚΟΥΣ ΣΕ ΔΕΞΑΜΕΝΗ ΖΥΜΩΣΗΣ ΔΙΠΛΩΝ ΤΟΙΧΩΜΑΤΩΝ (ή ΒΑΡΕΛΙ) ΑΛΚΟΟΛΙΚΗ ΖΥΜΩΣΗ ΓΛΕΥΚΟΥΣ. ΕΛΕΓΧΟΣ ΘΕΡΜΟΚΡΑΣΙΑΣ (18-22 C) ΠΑΡΑΚΟΛΟΥΘΗΣΗ ΖΥΜΩΣΗΣ - ΑΝΑΛΥΣΕΙΣ ΓΛΕΥΚΟΥΣ Θερμοκρασία, Σάκχαρα, ph, Αφομ Ν ΜΕΤΑΓΓΙΣΕΙΣ Σε άλλες Δεξαμενές ή Βαρέλια ΠΡΟΣΘΗΚΕΣ ΟΙΝΟΛΟΓΙΚΩΝ ΟΥΣΙΩΝ (SO2, CO2, Aσκορβικό Οξύ, Πηκτινολητικά Ένζυμα) ΔΙΟΡΘΩΤΙΚΕΣ ΠΡΟΣΘΗΚΕΣ ΟΙΝΟΛΟΓΙΚΩΝ ΟΥΣΙΩΝ (SO2, Τρυγικό Οξύ) ΠΡΟΣΘΗΚΕΣ ΟΙΝΟΛΟΓΙΚΩΝ ΟΥΣΙΩΝ (Πηκτινολητικά Ένζυμα, SO2) ΔΙΟΡΘΩΤΙΚΕΣ ΠΡΟΣΘΗΚΕΣ ΟΙΝΟΛΟΓΙΚΩΝ ΟΥΣΙΩΝ (SO2) ΕΜΒΟΛΙΑΣΜΟΣ ΜΕ ΣΤΕΛΕΧΟΣ ΖΥΜΟΜΥΚΗΤΑ ΠΡΟΣΘΗΚΕΣ ΟΙΝΟΛΟΓΙΚΩΝ ΟΥΣΙΩΝ (Θρεπτικές Ουσίες, Διαυγαστικά) ΔΙΟΡΘΩΤΙΚΕΣ ΠΡΟΣΘΗΚΕΣ (SO2) ΓΛΕΥΚΟΠΟΙΗΣΗ ΑΠΟΛΑΣΠΩΣΗ ΑΛΚΟΟΛΙΚΗ ΖΥΜΩΣΗ ΓΕΝΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΟΙΝΟΥ Θερμοκρασία, Α.Β.,O.O, Π.Ο, Fe, Σάκχαρα, ph, Ένταση Χρώματος, SO2 ΠΑΛΑΙΩΣΗ ΟΙΝΟΥ ΣΕ ΔΕΞΑΜΕΝΗ ή ΒΑΡΕΛΙ. ΑΕΡΙΣΜΟΣ. ΜΕΤΑΓΓΙΣΕΙΣ Όταν απαιτείται ΩΡΙΜΑΣΗ - ΠΑΛΑΙΩΣΗ Σχήμα 2.1. Πρωτόκολλο της λευκής οινοποίησης της οινοποιίας Ε. Τσάνταλης 57

58 Στη συνέχεια ακολούθησε διόρθωση της σύστασης του γλεύκους και εμβολιασμός με ζύμες. Συγκεκριμένα, κρίθηκε απαραίτητη η αύξηση της περιεκτικότητας του γλεύκους σε σάκχαρα, καθώς και η αύξηση της ολικής του οξύτητας με προσθήκη ανακαθαρισμένου συμπυκνωμένου γλεύκους και τρυγικού οξέος, αντίστοιχα, προκειμένου η σύσταση του γλεύκους και τελικά του παραγόμενου οίνου, να πληροί τις προδιαγραφές της ισχύουσας νομοθεσίας. Σύμφωνα με τον Κανονισμό 607/2009, κεφάλαιο IV, «για να θεωρείται οίνος το προϊόν που παράγεται αποκλειστικά με πλήρη ή μερική αλκοολική ζύμωση νωπών σταφυλιών ή γλεύκους σταφυλιών, θα πρέπει να έχει περιεκτικότητα σε αλκοόλη τουλάχιστον 9% vol (αποκτημένος αλκοολικός τίτλος) και ολική οξύτητα (εκφρασμένη σε τρυγικό οξύ) τουλάχιστον 3,5 g/l». Για την αλκοολική ζύμωση, η οποία πραγματοποιήθηκε σε ελεγχόμενες συνθήκες θερμοκρασίας (20 ± 2 o C), χρησιμοποιήθηκαν τρία διαφορετικά εμπορικά στελέχη Saccharomyces cerevisiae: Α, Β και Γ (βλέπε ). Η παρακολούθηση της ομαλής πορείας της αλκοολικής ζύμωσης γινόταν καθημερινά μέσω της μέτρησης της πυκνότητας και της θερμοκρασίας ζύμωσης του γλεύκους. Μετά την ολοκλήρωση της αλκοολικής ζύμωσης (συγκέντρωση αναγόντων σακχάρων μικρότερη από 2 g/l), ακολούθησε προσθήκη SO 2 (35 mg/l) και μετάγγιση του γλεύκους σε τρεις καθαρές ανοξείδωτες δεξαμενές. Στη συνέχεια, κατάλληλη ποσότητα από κάθε δεξαμενή (30 L), μεταφέρθηκε μετά από ανάδευση σε γυάλινους περιέκτες των 2 L και 1 L, προκειμένου να πραγματοποιηθεί το δεύτερο στάδιο της πειραματικής διαδικασίας. Δεύτερο στάδιο: Κατεργασία του φρέσκου οίνου με διαφορετικά ενζυμικά σκευάσματα, κατά την παραμονή του με τις οινολάσπες Για τις ανάγκες του δεύτερου σταδίου της πειραματικής λευκής οινοποίησης, το οποίο πραγματοποιήθηκε επίσης στις εγκαταστάσεις του οινοποιείου υπό την επίβλεψη της κας Βάρα, σε ποσότητα οίνου ίση με 3 L (3 x 3 L), προστέθηκε ενζυμικό σκεύασμα με κύρια δράση β-γλυκανάσης σε δοσολογία (α) 0,03 g/l (δείγμα ΙΙ) και (β) 0,05 g/l (δείγμα ΙΙΙ), καθώς και (γ) μίγματος ενζυμικών σκευασμάτων με κύρια δράση β-γλυκανάσης (0,05 g/l) και β-γλυκοσιδάσης (0,02 g/l) (δείγμα IV), ενώ δύο παρτίδες οίνου (2 x 3 L) (I και V) παρέμειναν ως είχαν χωρίς καμία προσθήκη να αποτελούν τον οίνο Μάρτυρα (I-Μ) και τον οίνο που θα αναφέρεται ως Οινολάσπες (V-ΟινΛ) (Πίνακας 2.1.). Οι δοσολογίες προσθήκης της β-γλυκανάσης, αποτελούν την ελάχιστη και τη μέγιστη, αντίστοιχα, δοσολογία χρήσης που προτείνεται από την εταιρεία παραγωγής. Η παραπάνω 58

59 διαδικασία πραγματοποιήθηκε εις διπλούν, σε όλους τους οίνους που προέκυψαν από την αλκοολική ζύμωση με τη βοήθεια των επιλεγμένων στελεχών (Α, Β και Γ) Saccharomyces cerevisiae. Τα δείγματα διατηρήθηκαν σε σταθερές συνθήκες θερμοκρασίας (15-18 ο C) και υγρασίας (70%), ώστε να επιτευχθεί η βέλτιστη δράση των ενζύμων, για 10 εβδομάδες, με εβδομαδιαία ανάδευση, η οποία εφαρμόστηκε σε όλα τα δείγματα, εκτός από το Μάρτυρα (Πίνακας 2.1.). Πίνακας 2.1. Τεχνολογικές επεμβάσεις κατά την οινοποιητική διεργασία Επέμβαση I II III IV V Προσθήκη ενζύμου Ένζυμο - β-γλυκανάση β-γλυκανάση β-γλυκανάση + β-γλυκοσιδάση - Δοσολογία (g/l) - 0,03 0,05 0,05 + 0,02 - Ανάδευση λεπτών οινολασπών (μία/εβδομάδα) Το δεύτερο στάδιο του πειραματισμού ολοκληρώθηκε μετά το τέλος της δέκατης εβδομάδας, με την προσθήκη μπεντονίτη (δοσολογία 0,1 g/l) σε όλα τα δείγματα, προκειμένου να σταματήσει η δράση των ενζύμων. Με αυτόν τον τρόπο επήλθε και η πρωτεϊνική και τρυγική σταθεροποίηση των δειγμάτων και εφαρμόσθηκε με ακρίβεια το πρωτόκολλο της λευκής οινοποίησης της οινοποιίας Ευάγγελος Τσάνταλης. Ακολούθησε μετάγγιση των δειγμάτων σε καθαρούς γυάλινους περιέκτες, οι οποίοι διατηρήθηκαν στις ίδιες σταθερές συνθήκες θερμοκρασίας και υγρασίας και κρατήθηκαν μακριά από το φως. Στο Σχήμα 2.2. δίνεται σχηματικά η πειραματική διαδικασία που ακολουθήθηκε μετά το τέλος της αλκοολικής ζύμωσης. 59

60 ΕΒΔΟΜΑΔΕΣ 1Η 2Η 3Η 4Η 5Η 6Η 7Η 8Η 9Η 10Η 11Η 12Η ΕΠΕΞΕΡΓΑ ΣΙΑ A I-M AII AIII Α IV AV BI-M BII BIII BIV AV Γ I-M Γ II Γ III Γ IV Γ V προσθήκη ενζύμων προσθήκη ενζύμων ανάδευση δειγμάτων προσθήκη ενζύμων ανάδευση δειγμάτων ανάδευση δειγμάτων ανάδευση δειγμάτων ανάδευση δειγμάτων γευστική δοκιμή - μέτρηση ανάδευση δειγμάτων γευστική δοκιμή - μέτρηση ανάδευση δειγμάτων γευστική δοκιμή - μέτρηση ανάδευση δειγμάτων γευστική δοκιμή - μέτρηση ανάδευση δειγμάτων γευστική δοκιμή - μέτρηση ανάδευση δειγμάτων γευστική δοκιμή - μέτρηση προσθήκη μπετονίτη ανάδευση δειγμάτων γευστική δοκιμή - μέτρηση προσθήκη μπετονίτη ανάδευση δειγμάτων γευστική δοκιμή - μέτρηση προσθήκη μπετονίτη 4 ΜΗΝΕΣ μετάγγιση μετάγγιση μετάγγιση Σχήμα 2.2. Πειραματική διαδικασία που ακολουθήθηκε μετά το τέλος της αλκοολικής ζύμωσης στην παρούσα εργασία Ζυμομύκητες Για τη μελέτη της επίδρασης του στελέχους του ζυμομύκητα στα χαρακτηριστικά - αναλυτικά και οργανοληπτικά - του οίνου, από τη μη αρωματική, γηγενή, λευκή ποικιλία Όψιμος Εδέσσης, χρησιμοποιήθηκαν τρία διαφορετικά στελέχη (Α, Β και Γ) Saccharomyces cerevisiae. Οι ζύμες αυτές διατίθενται σε λυοφιλιωμένη μορφή, ως εμπορικά σκευάσματα έτοιμα για οινολογική χρήση, μετά από κατάλληλη ενεργοποίηση. Τα ιδιαίτερα χαρακτηριστικά τους αναφέρονται στον Πίνακα

61 Πίνακας 2.2. Χαρακτηριστικά των ζυμομυκήτων που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα εργασία Εμπορική Στέλεχος Ιδιαίτερα Εφαρμογή ονομασία/εταιρεία S. cerevisiae χαρακτηριστικά παραγωγής Α Fermivin / DSM N o 7013, Οινοποίηση όλων των Food Specialties, επιλογή τύπων οίνου. Netherlands INRA, Narbonne, France Β Zymaflore VL1 / VL1, Υψηλή ενζυμική Οινοποίηση λευκών Laffort, Bordeaux, απομονώθηκε δραστηριότητα β- οίνων από France στη γλυκοσιδάσης αρωματικές ποικιλίες Βουργουνδία (Μοσχάτο, Reisling, Gewurztraminer). Οινοποίηση οίνων με ιδιαίτερο χαρακτήρα που επιδέχονται ωρίμανση παρουσία οινολασπών Γ Excellence FW / Β2006, Υψηλή παραγωγή (Chardonnay). Iδανική ζύμη για την Lallemand, επιλογή από εστέρων, 2- παραγωγή φρέσκων Bordeaux, France Sarco φαινυλοαιθανόλης, αρωματικών λευκών θειολών και ροζέ οίνων, στους οποίους προσδίδει εξωτικό αρωματικό χαρακτήρα. Όλα τα σκευάσματα χρησιμοποιήθηκαν στην ίδια, ενδεδειγμένη για την ομαλή εκκίνηση της αλκοολικής ζύμωσης, δοσολογία (20 g/hl), προκειμένου να είναι συγκρίσιμα τα αποτελέσματα Ένζυμα Για τη μελέτη της επίδρασης της τεχνικής της ωρίμανσης του οίνου παρουσία οινολασπών, στα χαρακτηριστικά - αναλυτικά και οργανοληπτικά - του οίνου, από τη μη αρωματική, γηγενή, λευκή ποικιλία Όψιμος Εδέσσης, χρησιμοποιήθηκαν δύο 61

62 διαφορετικά εμπορικά ενζυμικά σκευάσματα, έτοιμα για οινολογική χρήση μετά από κατάλληλη διάλυση σε νερό. Τα ιδιαίτερα χαρακτηριστικά τους αναφέρονται στον Πίνακα 2.3. Πίνακας 2.3. Χαρακτηριστικά των ενζυμικών σκευασμάτων που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα εργασία Εμπορική Προέλευση Ενζυμική Εφαρμογή Δοσολογία / ονομασία / (μικροοργανισμός) δράση διάρκεια Εταιρεία εφαρμογής παραγωγής Rapidase Καλλιέργεια Πηκτινολυτική Διήθηση οίνων που 2-5 g/hl Glucalees / επιλεγμένων και προέρχονται από (διήθηση) DSM Food στελεχών β-γλυκανάσης σταφύλια Specialties Aspergillus niger προσβεβλημένα από 3-5 g/hl και Trichoderma Botrytis cinerea. (ωρίμανση harzianum με Ωρίμανση οίνων οινολάσπες), παρουσία 6 έως 8 οινολασπών. εβδομάδες AR 2000 / DSM Καλλιέργεια β-γλυκοσιδάσης Ενίσχυση του 2-3 g/hl, Food Specialties επιλεγμένων αρωματικού 2 έως 10 στελεχών ποικιλιακού εβδομάδες Aspergillus niger χαρακτήρα του παραγόμενου οίνου, κυρίως από αρωματικές ποικιλίες (Gewürztraminer, Riesling, Μοσχάτο) Η προσθήκη στον οίνο, αμέσως μετά το τέλος της αλκοολικής ζύμωσης, ενζύμων με δράση β-γλυκανάσης, συμβάλλει καταλυτικά στη μείωση της απαιτούμενης διάρκειας παραμονής του με τις οινολάσπες. Η τεχνική αυτή εφαρμόζεται, προκειμένου ο οίνος να εμπλουτιστεί με συστατικά (πολυσακχαρίτες και κυρίως μαννοπρωτεΐνες), τα οποία προέρχονται από το τοίχωμα των κυττάρων των ζυμομυκήτων μετά το θάνατό τους και τη λύση των οργανωμένων δομών τους και προσδίδουν όγκο και λιπαρότητα στον οίνο. Τα οικονομικά οφέλη από μία τέτοια προσθήκη είναι πολύ σημαντικά, καθώς μέσα σε έξι έως οκτώ εβδομάδες, επιτυγχάνεται ένα αποτέλεσμα το οποίο με τον παραδοσιακό τρόπο απαιτεί έξι μήνες. 62

63 Το ένζυμο Glucalees χρησιμοποιήθηκε: (α) μόνο του σε δύο δοσολογίες (0,03 και 0,05 g/l) οι οποίες αντιπροσωπεύουν τη χαμηλότερη και την υψηλότερη συνιστώμενη δόση, η οποία εφαρμόζεται στην πράξη και (β) σε συνδυασμό με το ένζυμο AR 2000, σε δοσολογία 0,05 και 0,02 g/l αντίστοιχα Μέθοδοι Προσδιορισμός ολικών φαινολών με τη μέθοδο Folin-Ciocalteau Για το χρωματομετρικό προσδιορισμό των ολικών φαινολών, ακολουθήθηκε η μέθοδος των Singleton & Rossi (1965), η οποία εφαρμόζεται στον οίνο με ορισμένες τροποποιήσεις. Δείγμα στην παρούσα μέθοδο αποτελεί ο οίνος, όπως αυτός περιγράφεται στην παράγραφο 2.7. Παρασκευή κορεσμένου διαλύματος άνυδρου ανθρακικού νατρίου (Na 2 CO 3 ) 27% Σε ποτήρι ζέσεως παρασκευάστηκε διάλυμα άνυδρου Na 2 CO 3 27% w/v και αφέθηκε για μία νύχτα στο ψυγείο. Την επόμενη ημέρα, το διάλυμα βγήκε από το ψυγείο, αφέθηκε να αποκτήσει θερμοκρασία περιβάλλοντος και στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε διήθηση με απλό ηθμό. Το διήθημα που παραλήφθηκε, χρησιμοποιήθηκε στη διαδικασία που περιγράφεται παρακάτω. Προσδιορισμός ολικών φαινολών Σε ογκομετρική φιάλη των 10 ml, αρχικά μεταφέρθηκαν 6 ml απιονισμένου νερού. Ακολούθησε προσθήκη 0,1 ml δείγματος, ανακίνηση της ογκομετρικής φιάλης, προσθήκη 0,5 ml αντιδραστηρίου Folin-Ciocalteau και έντονη ανακίνηση της ογκομετρικής φιάλης. Μετά την πάροδο 3 min, πραγματοποιήθηκε προσθήκη 1,5 ml κορεσμένου διαλύματος Na 2 CO 3 27% και ανακίνηση του μίγματος σε κυκλομίκτη. Τέλος, η φιάλη συμπληρώθηκε με απιονισμένο νερό ως τα 10 ml και το μίγμα αφέθηκε σε ηρεμία για 2 h, σε σκοτάδι και σε θερμοκρασία δωματίου (Εικόνα 2.1.). Η απορρόφηση καταγράφηκε σε φασματοφωτόμετρο ορατού στα 750 nm σε κυψελίδες υάλου 10 mm. Παράλληλα με τα δείγματα παρασκευάστηκε και ένας μάρτυρας με απιονισμένο νερό στη θέση του δείγματος, ο οποίος χρησιμοποιήθηκε για το μηδενισμό του φασματοφωτομέτρου. 63

64 Εικόνα 2.1. Διάλυμα έτοιμο προς ανάλυση, για τον προσδιορισμό των ολικών φαινολών με τη μέθοδο Folin-Ciocalteau Η συγκέντρωση των ολικών φαινολών που περιέχονται στον οίνο, υπολογίστηκε με βάση καμπύλη αναφοράς, η οποία κατασκευάστηκε με τη βοήθεια πρότυπων διαλυμάτων γαλλικού οξέος γνωστής συγκέντρωσης (50 έως 450 mg/l). Τα αποτελέσματα εκφράζονται σε ισοδύναμα ppm γαλλικού οξέος. Παρασκευή πρότυπων διαλυμάτων γαλλικού οξέος Αρχικά παρασκευάστηκε πυκνό διάλυμα γαλλικού οξέος 5 g/l, ως εξής: σε ογκομετρική φιάλη των 100 ml έγινε προσθήκη 0,5 g γαλλικού οξέος, ακολούθησε προσθήκη αιθανόλης μέχρι τη χαραγή και τέλος το διάλυμα ανακινήθηκε μέχρι την πλήρη διάλυση του γαλλικού οξέος. Στη συνέχεια παρασκευάστηκαν πρότυπα διαλύματα γαλλικού οξέος, συγκεντρώσεων 50, 100, 150, 200, 250, 350 και 450 mg/l, με προσθήκη σε ογκομετρική φιάλη των 10 ml, αρχικά της επιθυμητής κάθε φορά ποσότητας πυκνού διαλύματος γαλλικού οξέος (5 g/l), στη συνέχεια απιονισμένου νερού μέχρι τη χαραγή και τέλος ανακίνηση της φιάλης Προσδιορισμός ολικών φλαβανολών με τη μέθοδο της π- διμεθυλαμινοκινναμωμικής αλδεΰδης (DMACA) Για τον φασματοφωτομετρικό προσδιορισμό των ολικών φλαβανολών του οίνου, ακολουθήθηκε η μέθοδος της π-διμεθυλαμινοκινναμωμικής αλδεΰδης (DMACA), η οποία προτάθηκε από τους Nagel και Glories (1991). Δείγμα στην παρούσα μέθοδο αποτελεί ο οίνος, όπως αυτός περιγράφεται στην παράγραφο

65 Παρασκευή συνθετικού διαλύματος οίνου Σε ογκομετρική φιάλη των 1000 ml τοποθετήθηκαν αρχικά 100 ml αιθανόλης και 3 g τρυγικού οξέος. Στη συνέχεια η φιάλη συμπληρώθηκε σχεδόν μέχρι τη χαραγή με απιονισμένο νερό, ακολούθησε ανάδευση του διαλύματος, ρύθμιση της ενεργού οξύτητας στην τιμή 3,5 με τη βοήθεια διαλύματος καυστικού νατρίου 2 Μ και συμπλήρωση του όγκου με απιονισμένο νερό. Παρασκευή μεθανολικού διαλύματος HCl 1 M Σε ογκομετρική φιάλη των 100 ml, τοποθετήθηκαν αρχικά 60 ml μεθανόλης, στη συνέχεια 8,3 ml πυκνού HCl (12 M), συμπληρώθηκε ο όγκος με μεθανόλη και ακολούθησε καλή ανακίνηση. Παρασκευή διαλύματος DMACA 0,1% (w/v) Σε ογκομετρική φιάλη των 100 ml, τοποθετήθηκε αρχικά 0,1 g DMACA, στη συνέχεια συμπληρώθηκε ο όγκος με μεθανολικό διάλυμα HCl 1 M και το διάλυμα αναδεύτηκε μέχρι την πλήρη διάλυση του αντιδραστηρίου. Προσδιορισμός ολικών φλαβανολών Σε αδιαφανή φιαλίδια των 5 ml τοποθετήθηκαν από 1 ml δείγματος οίνου και 4 ml μεθανόλης. Στη συνέχεια, σε δύο γυάλινους δοκιμαστικούς σωλήνες έγινε προσθήκη 4 ml διαλύματος DMACA 0,1 % και 0,8 ml αραιωμένου δείγματος οίνου. Το χρώμα στους δοκιμαστικούς σωλήνες έγινε ανοιχτό πράσινο (Εικόνα 2.2.). Ακολούθησε μηχανική ανάδευση των σωλήνων για 2-3 sec, τοποθέτησή τους σε ηρεμία για 10 min και μέτρηση της απορρόφησης σε φασματοφωτόμετρο, στα 640 nm. Παράλληλα με τα δείγματα παρασκευάστηκε και ένας μάρτυρας, ο οποίος περιείχε 4 ml μεθανολικού διαλύματος HCl 1 M και 0,8 ml συνθετικού διαλύματος οίνου και χρησιμοποιήθηκε για το μηδενισμό του φασματοφωτομέτρου. 65

66 Εικόνα 2.2. Διαλύματα έτοιμα προς ανάλυση, για τον προσδιορισμό των ολικών φλαβανολών με τη μέθοδο της π-διμεθυλαμινοκινναμωμικής αλδεΰδης Η συγκέντρωση των ολικών φλαβανολών που περιέχονται στον οίνο, υπολογίστηκε με βάση καμπύλη αναφοράς, η οποία κατασκευάστηκε με τη βοήθεια πρότυπων διαλυμάτων κατεχίνης γνωστής συγκέντρωσης (1-16 mg/l). Τα αποτελέσματα εκφράζονται σε ισοδύναμα ppm κατεχίνης. Παρασκευή πρότυπων διαλυμάτων κατεχίνης Αρχικά παρασκευάστηκε πυκνό διάλυμα κατεχίνης 0,1 g/l, ως εξής: σε ογκομετρική φιάλη των 100 ml έγινε προσθήκη 0,01 g κατεχίνης, στη συνέχεια μεθανόλης μέχρι τη χαραγή και το διάλυμα αναδεύτηκε μέχρι την πλήρη διάλυση της κατεχίνης. Στη συνέχεια παρασκευάστηκαν πρότυπα διαλύματα κατεχίνης, συγκεντρώσεων 1, 3, 6, 9, 12, 14 και 16 mg/l, με προσθήκη σε ογκομετρική φιάλη των 5 ml αρχικά της επιθυμητής κάθε φορά ποσότητας πυκνού διαλύματος κατεχίνης 0,1 g/l, στη συνέχεια συνθετικού διαλύματος οίνου μέχρι τη χαραγή και ανακίνηση της φιάλης Προσδιορισμός ολικών πολυσακχαριτών με τη μέθοδο φαινόληςθειϊκού οξέος Για τον προσδιορισμό των ολικών πολυσακχαριτών του οίνου, ακολουθήθηκε η μέθοδος φαινόλης-θειϊκού οξέος, η οποία προτάθηκε από τον Dubois και τροποποιήθηκε από τον Segarra και τους συνεργάτες του (1995). Δείγμα στην παρούσα μέθοδο αποτελεί ο οίνος, όπως αυτός περιγράφεται στην παράγραφο

67 Ο προσδιορισμός των πολυσακχαριτών του οίνου, περιλαμβάνει δύο στάδια: 1) την παραλαβή των πολυσακχαριτών και 2) τον κυρίως προσδιορισμό των πολυσακχαριτών Παραλαβή των πολυσακχαριτών του οίνου Η παραλαβή των πολυσακχαριτών του οίνου, περιλαμβάνει τα ακόλουθα στάδια. α) Καταβύθιση των πολυσακχαριτών Σε δύο γυάλινους σωλήνες φυγοκέντρησης, μεταφέρθηκαν από 1 ml δείγματος οίνου, 5 ml αιθανόλης 99,8% (v/v) και 50 μl διαλύματος HCl 1 Μ. Στη συνέχεια, οι σωλήνες αφού αναδεύτηκαν μηχανικά για 2-3 sec, αφέθηκαν σε θερμοκρασία περιβάλλοντος για h, προκειμένου να ολοκληρωθεί η καταβύθιση των πολυσακχαριτών. β) Πλύσιμο του ιζήματος Μετά την παρέλευση των h, κατά την οποία ολοκληρώθηκε η καταβύθιση των πολυσακχαριτών και σχηματίστηκε κίτρινο ίζημα, οι σωλήνες φυγοκεντρήθηκαν (3500 rpm για 20 min). Στη συνέχεια, αφαιρέθηκε το υπερκείμενο διάλυμα, προστέθηκαν σε κάθε σωλήνα από 5 ml αιθανόλης 99,8% (v/v) και έγινε ξανά φυγοκέντρηση στις ίδιες συνθήκες για 10 min. Η τελευταία διαδικασία επαναλήφθηκε ακόμη τρεις φορές. Μετά το τέλος των τεσσάρων συνολικά δεκάλεπτων φυγοκεντρήσεων, εφαρμόστηκε η δοκιμή φαινόλης-θειϊκού οξέος, για την εξακρίβωση της καθαρότητας ή μη, του ιζήματος. γ) Δοκιμή φαινόλης-θειϊκού οξέος Από κάθε σωλήνα αφαιρέθηκαν 0,5 ml υπερκείμενης αιθανόλης και τοποθετήθηκαν σε εσμυρισμένο δοκιμαστικό σωλήνα. Ακολούθησε προσθήκη 0,5 ml διαλύματος φαινόλης 5% (w/v) και 2,5 ml πυκνού θειϊκού οξέος (95-97%). Η εμφάνιση κίτρινου χρώματος αποτελεί ένδειξη μη καθαρής αιθανόλης, άρα και μη καθαρού ιζήματος, οπότε η φυγοκέντρηση επαναλαμβάνεται μέχρις ότου το παραπάνω μίγμα να παραμένει άχρωμο. δ) Ξήρανση του ιζήματος Αφού αφαιρέθηκε από κάθε σωλήνα η μέγιστη ποσότητα αιθανόλης, με προσοχή ώστε να μην αφαιρεθεί ποσότητα ιζήματος, ακολούθησε ξήρανση του ιζήματος σε πυραντήριο στους 50 ο C, για περίπου 30 min (επίτευξη σταθερού βάρους). 67

68 ε) Διάλυση του ιζήματος Σε υδατόλουτρο (100 ο C) θερμάνθηκε μια ποσότητα νερού καθαρότητας MilliQ (18,2 MΩ.cm) από το οποίο έγινε προσθήκη 7 ml σε κάθε δοκιμαστικό σωλήνα. Κατά τη στιγμή της προσθήκης, το νερό δεν πρέπει να βρίσκεται σε κατάσταση βρασμού. Οι σωλήνες αναδεύτηκαν μηχανικά, μέχρι να διαλυθεί όλο το ίζημα, πωματίστηκαν και τοποθετήθηκαν σε ψύξη ή κατάψυξη, μέχρι τη στιγμή της ανάλυσης Κυρίως προσδιορισμός των πολυσακχαριτών Για τον προσδιορισμό των ολικών πολυσακχαριτών του οίνου, όπως προαναφέρθηκε, εφαρμόστηκε η μέθοδος φαινόλης-θειϊκού οξέος, η οποία προτάθηκε από τον Dubois και τροποποιήθηκε από τον Segarra και τους συνεργάτες του. Οι πολυσακχαρίτες αντιδρούν με τη φαινόλη και το θειϊκό οξύ και το προϊόν της αντίδρασης έχει κίτρινο χρώμα, το οποίο παρουσιάζει μέγιστο απορρόφησης στα 490 nm και είναι απευθείας ανάλογο με την ποσότητα των πολυσακχαριτών που υπάρχουν στο δείγμα. Για κάθε ένα διάλυμα του τελευταίου σταδίου της παραλαβής των πολυσακχαριτών, χρησιμοποιήθηκαν δύο εσμυρισμένοι δοκιμαστικοί σωλήνες, στους οποίους προστέθηκαν από 0,5 ml διαλύματος. Στη συνέχεια έγινε προσθήκη σε όλους τους εσμυρισμένους σωλήνες 0,5 ml διαλύματος φαινόλης 5% (w/v) και 2,5 ml πυκνού θειϊκού οξέος (95-97%), με προσοχή ώστε αυτό να ρέει, κατά το δυνατό, με σταθερή ταχύτητα και να μην έρχεται σε επαφή με τα τοιχώματα του σωλήνα. Το χρώμα στους εσμυρισμένους δοκιμαστικούς σωλήνες γίνεται κίτρινο (Εικόνα 2.3.). Ακολούθησε μηχανική ανάδευση των σωλήνων για 2-3 sec, τοποθέτησή τους σε υδατόλουτρο στους 30 ο C για 20 min και μέτρηση της απορρόφησης σε φασματοφωτόμετρο, στα 490 nm. Παράλληλα με τα δείγματα παρασκευάστηκε και ένας μάρτυρας με απιονισμένο νερό στη θέση του δείγματος, ο οποίος χρησιμοποιήθηκε για το μηδενισμό του φασματοφωτομέτρου. Η συγκέντρωση των ολικών πολυσακχαριτών που περιέχονται στον οίνο, υπολογίστηκε με βάση καμπύλη αναφοράς, η οποία κατασκευάστηκε με τη βοήθεια πρότυπων διαλυμάτων D-(+)-γαλακτόζης γνωστής συγκέντρωσης (10 έως 120 mg/l). Τα αποτελέσματα εκφράζονται σε ισοδύναμα ppm D-(+)-γαλακτόζης. 68

69 Εικόνα 2.3. Διαλύματα έτοιμα προς ανάλυση, για τον προσδιορισμό των ολικών πολυσακχαριτών με τη μέθοδο φαινόληςθειικού οξέος Παρασκευή πρότυπων διαλυμάτων D-(+)-γαλακτόζης Αρχικά παρασκευάστηκε πυκνό διάλυμα D-(+)-γαλακτόζης 1 g/l, ως εξής: σε ογκομετρική φιάλη των 1000 ml έγινε προσθήκη 1 g D-(+)-γαλακτόζης, στη συνέχεια απιονισμένου νερού μέχρι τη χαραγή και το διάλυμα αναδεύτηκε μέχρι την πλήρη διάλυση της D-(+)-γαλακτόζης. Στη συνέχεια παρασκευάστηκαν πρότυπα διαλύματα D-(+)-γαλακτόζης συγκεντρώσεων 10, 20, 40, 70, 100 και 120 mg/l, με προσθήκη σε ογκομετρική φιάλη των 10 ml αρχικά της επιθυμητής κάθε φορά ποσότητας πυκνού διαλύματος D-(+)- γαλακτόζης 1 g/l, στη συνέχεια απιονισμένου νερού μέχρι τη χαραγή και τέλος ανακίνηση της φιάλης Οργανοληπτική εξέταση Στην οργανοληπτική εξέταση έλαβαν μέρος επτά επαγγελματίες δοκιμαστές (τρεις γυναίκες και τέσσερεις άνδρες). Οι γευστικές δοκιμές πραγματοποιήθηκαν σε ειδικά διαμορφωμένο χώρο, με κανονικό φωτισμό και θερμοκρασία 20 C. Επιλέχθηκαν εννέα παράμετροι για να περιγράψουν τις μεταβολές στα δείγματα του οίνου. Δύο από αυτές αφορούσαν στο άρωμα των δειγμάτων (ένταση και διάρκεια) και έξι στην αίσθηση μέσα στο στόμα (λιπαρότητα-γλυκύτητα, οξύτητα, στυφή γεύση, πικρή γεύση, ισορροπία-αρμονία και επίγευση). Τέλος, επιλέχθηκε και άλλη μία παράμετρος (αρμονία-γενική εντύπωση), για την αξιολόγηση της συνολικής εικόνας των δειγμάτων. 69

70 Στους δοκιμαστές δόθηκε πρώτα το δείγμα του μάρτυρα, ζητήθηκε από αυτούς να το αξιολογήσουν ως προς τα προαναφερθέντα χαρακτηριστικά και να καταγράψουν το αποτέλεσμα στο φύλλο αξιολόγησης που φαίνεται στο Σχήμα 2.3. Στη συνέχεια, αξιολογήθηκαν και τα υπόλοιπα δείγματα και βαθμολογήθηκαν σε σχέση με το μάρτυρα Στατιστική επεξεργασία Η σύγκριση των αποτελεσμάτων πραγματοποιήθηκε με εφαρμογή ανάλυσης διακύμανσης μονής κατεύθυνσης (One-way ANOVA), από το λογισμικό πακέτο SPSS 18.0 (SPSS, Inc., Chicago IL, USA), έτσι ώστε να καθοριστούν οι σημαντικές διαφορές μεταξύ των δειγμάτων. 70

71 Δείγμα: Δοκιμαστής: Ημερομηνία: Πολύ καλό Καλό Ικανοποιητικό Ανεπαρκές Φτωχό Ελαττωματικό Ένταση Διάρκεια Παρατηρήσεις Άρωμα Αρώματα που ξεχωρίζουν Περιγράψτε, εάν υπάρχει, κάποιο ελάττωμα Γεύση Πολύ έντονη Έντονη Μέτρια Ελαφριά Πολύ μικρή Ανύπαρκτη Λιπαρότητα-Γλυκύτητα Οξύτητα Στυφάδα Πικράδα Ισορροπία-Αρμονία Παρατηρήσεις Πολύ καλή Καλή Ικανοποιητική Ανεπαρκής Φτωχή Ελαττωματική Επίγευση Αρμονία- Γενική εντύπωση Παρατηρήσεις Σχήμα 2.3. Φύλλο αξιολόγησης που χρησιμοποιήθηκε στην οργανοληπτική εξέταση 71

72 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ 3.1. Ωρίμανση και χαρακτηριστικά της πρώτης ύλης Κεφάλαιο 3 ο Η οινοποιία Ευάγγελος Τσάνταλης Α.Ε., από το 2008 μέχρι και σήμερα, συνεργάζεται με συνεταιρισμούς της περιοχής της Αριδαίας, αγοράζοντας πάνω από τόνους σταφυλιών της ποικιλίας Όψιμος Εδέσσης, ετησίως. Η συγκομιδή των σταφυλιών πραγματοποιείται με το χέρι, καθώς οι αποστάσεις ανάμεσα στα πρέμνα και η διαμόρφωση τους σε κρεβατίνες γραμμωτού σχήματος, δεν ευνοούν την εφαρμογή μηχανικού τρύγου (Εικόνα 1.5.). Η μεταφορά τους στο οινοποιείο, σε αντίθεση με άλλες οινοποιήσιμες ποικιλίες, δεν απαιτεί τη χρήση τελάρων. Η ποικιλία είναι επιδεκτική στη συντήρηση και τη μεταφορά σε μεγάλους περιέκτες, χάρη στη μορφολογία της ράγας (φλοιός παχύς και ανθεκτικός), γεγονός που συμβάλλει στη μείωση του κόστους παραγωγής. Η οινοποίηση των σταφυλιών πραγματοποιείται στο κεντρικό οινοποιείο της εταιρείας, που εδρεύει στον Άγιο Παύλο του νομού Χαλκιδικής. Η Όψιμος Εδέσσης είναι ιδιαίτερα όψιμη ποικιλία (τρύγος το δεύτερο δεκαπενθήμερο του Οκτωβρίου ή και αργότερα) και το επίπεδο ωρίμανσης των σταφυλιών κατά την έναρξη του τρύγου, εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από τις κλιματολογικές συνθήκες (βροχοπτώσεις, θερμοκρασία, ηλιοφάνεια) που επικρατούν κατά την κρίσιμη περίοδο της ωρίμανσης. Από τα συγκεντρωτικά στοιχεία του ελέγχου της πορείας ωρίμανσης της ποικιλίας Όψιμος Εδέσσης, για τα έτη (Πίνακας 3.1.), καθώς και από τα δελτία τρύγου (στα οποία αναφέρονται οι κλιματολογικές συνθήκες) για τις αντίστοιχες χρονιές, προκύπτει ότι το έτος 2009, κατά το οποίο πραγματοποιήθηκε η πειραματική μας διαδικασία, αποτέλεσε μια μέτρια χρονιά για την ποικιλία αυτή. Οι κλιματολογικές συνθήκες που επικράτησαν κατά το έτος 2009 (άστατος καιρός με αρκετές βροχοπτώσεις), συνέβαλλαν στην υπερβολική αύξηση της παραγωγής (4 κιλά σταφυλιών/πρέμνο), σε βάρος της καλής ωρίμανσης των σταφυλιών (Εικόνα 3.1.). Αντίθετα, τα ακραία καιρικά φαινόμενα τα οποία παρατηρήθηκαν κατά το έτος

73 (χιονόπτωση και χαλαζόπτωση), συνέβαλαν καθοριστικά στη μείωση της παραγωγής της συγκεκριμένης ποικιλίας (2 κιλά σταφυλιών/πρέμνο), αλλά και στη βελτίωση της ωρίμανσης των σταφυλιών (Εικόνα 3.2.). Πίνακας 3.1. Γλευκογραφικά στοιχεία σταφυλιών της ποικιλίας Όψιμος Εδέσσης κατά τη συγκομιδή (έτη ) Χρονιά συγκομιδής Ημερομηνία τρύγου Σάκχαρα (g/l) ph Ολική οξύτητα (g τρυγικού οξέος/l) / ,5 5, / ,6 4, / ,6 4,9 Τα αποτελέσματα του ελέγχου της πορείας ωρίμανσης της ποικιλίας Όψιμος Εδέσσης, κατά την οινοποιητική περίοδο 2009 (6 Οκτωβρίου έως 3 Νοεμβρίου 2009), αναφέρονται αναλυτικότερα στον Πίνακα 3.3. Οι δειγματοληψίες πραγματοποιήθηκαν στην περιοχή της Πιπεριάς του νομού Πέλλας, σε αμπελώνα έκτασης 25 περίπου στρεμμάτων, ο οποίος είχε σχήμα παραλληλογράμμου, κατά μήκος των δύο διαγωνίων του. Η πρώτη δειγματοληψία πραγματοποιήθηκε ακολουθώντας αρχικά την πρώτη διαγώνιο του αμπελώνα και στη συνέχεια τη δεύτερη, συλλέγοντας δείγμα πάντα από σημείο που δεν ήταν εκτεθειμένο στον ήλιο, σύμφωνα με τον Πίνακα 3.2. Με τον ίδιο τρόπο πραγματοποιήθηκε και η δεύτερη δειγματοληψία, η οποία ακολούθησε μετά από μία περίπου εβδομάδα. Πίνακας 3.2. Τρόπος δειγματοληψίας σταφυλιών της ποικιλίας Όψιμος Εδέσσης, κατά μήκος μιας εκ των δύο διαγωνίων του αμπελώνα Πρέμνο δειγματοληψίας Σειρά πρέμνου δειγματοληψίας

74 Εικόνα 3.1. Σταφύλια της ποικιλίας Όψιμος Εδέσσης, οινοποιητικής περιόδου έτους 2009 Εικόνα 3.2. Σταφύλια της ποικιλίας Όψιμος Εδέσσης, οινοποιητικής περιόδου έτους

75 Οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν στο εργαστήριο της εταιρείας Ε. Τσάνταλη, σε δείγματα γλεύκους από σταφύλια στα οποία εφαρμόστηκε αρχικά ελαφριά πίεση με το χέρι και κατόπιν διήθηση με τη χρήση πτυχωτών χάρτινων ηθμών. Από τα δεδομένα του Πίνακα 3.3. προκύπτει μια στασιμότητα στην πορεία ωρίμανσης των σταφυλιών, καθώς παρατηρήθηκε ελάχιστη αύξηση στη συγκέντρωση των σακχάρων, ίση με 6 g/l. Η ολική οξύτητα μειώθηκε κατά 1,6 g/l, ενώ μηδενίστηκε η περιεκτικότητα σε μηλικό οξύ. Τα παραπάνω αποτελέσματα οφείλονται, τόσο στο ιδιαίτερα αυξημένο φορτίο των αμπελιών της ποικιλίας Όψιμος Εδέσσης (4 τόννοι/στρέμμα συγκριτικά με 1,2 τόννοι/στρέμμα άλλων λευκών ποικιλιών), με απόδοση που δεν επέτρεψε στα σταφύλια να ωριμάσουν κανονικά, όσο και στις αντίξοες κλιματολογικές συνθήκες που επικράτησαν τη συγκεκριμένη χρονιά. Πίνακας 3.3. Πορεία ωρίμανσης της ποικιλίας Όψιμος Εδέσσης, κατά την οινοποιητική περίοδο (τρύγος) Ανάγοντα σάκχαρα (g/l) ph 3,42 3,40 3,60 Ολική οξύτητα (g τρυγικού οξέος/l) 5,6 5,1 4,0 Μηλικό οξύ (g/l) 0,3 0,1 0,0 Ο τρυγητός πραγματοποιήθηκε στις με το χέρι, χωρίς τη χρήση τελάρων (όπως γίνεται σε όλες τις ποικιλίες), καθώς λόγω του σκληρού σαρκώματος και της χοντρής φλούδας των ραγών, αυτές δεν συμπιέζονται εύκολα. Την ημέρα που πραγματοποιήθηκε ο τρύγος, οι μετρήσεις των αναγόντων σακχάρων και της ολικής οξύτητας (Πίνακας 3.3.), βρίσκονταν σε τέτοια επίπεδα, στα οποία ο εμπλουτισμός του γλεύκους με σάκχαρα και η διόρθωση της οξύτητας του, αποτελούσαν αναγκαίες διαδικασίες, όπως αναφέρθηκε και στο πειραματικό μέρος Χαρακτηριστικά του οίνου μετά την ολοκλήρωση της αλκοολικής ζύμωσης Στον Πίνακα 3.4. δίνονται τα αναλυτικά χαρακτηριστικά του οίνου (μέσος όρος των τιμών των οίνων που προέκυψαν από τη ζύμωση με τα στελέχη Α, Β και Γ), ο οποίος προέκυψε από την πειραματική διαδικασία της παρούσας εργασίας. Όπως αναφέρθηκε και στο πειραματικό μέρος, για την αλκοολική ζύμωση, η οποία πραγματοποιήθηκε σε 75

76 ελεγχόμενες συνθήκες θερμοκρασίας (20 ± 2 o C), χρησιμοποιήθηκαν τρία διαφορετικά εμπορικά στελέχη Saccharomyces cerevisiae. Πίνακας 3.4. Αναλυτικά χαρακτηριστικά του οίνου μετά την ολοκλήρωση της αλκοολικής ζύμωσης Παράμετρος Μέσος όρος Αιθανόλη (% vol.) 11,8 ±0,2 Ειδικό βάρος (g/ml) 0,9923 Ολική οξύτητα (g τρυγικού οξέος/l) 5,6 ± 0,1 Πτητική οξύτητα (g οξικού οξέος/l) 0,30 ± 0,05 ph 3,9 ± 0,2 Ανάγοντα σάκχαρα (g/l) 1,6 Ελεύθερο SO 2 (mg/l) 40 ± 2 Ολικό SO 2 (mg/l) 140 ± 4 Α 420 0,046 ± 0, Ανάλυση του οίνου Προκειμένου να διερευνηθεί η επίδραση του στελέχους του ζυμομύκητα Saccharomyces cerevisiae και η προσθήκη ενζύμων κατά τη διάρκεια της ωρίμανσης παρουσία οινολασπών, στη σύσταση των οίνων που προκύπτουν, πραγματοποιήθηκε ανάλυση με φασματοφωτομετρικές μεθόδους, δειγμάτων οίνων οι οποίοι προήλθαν από αλκοολική ζύμωση με τρία διαφορετικά εμπορικά στελέχη Saccharomyces cerevisiae και στη συνέχεια παρέμειναν για ωρίμανση παρουσία οινολασπών, με / ή χωρίς προσθήκη ενζυμικών σκευασμάτων, τα οποία επιταχύνουν τη διαδικασία της αυτόλυσης των κυττάρων. Το φαινολικό κλάσμα των οίνων, μελετήθηκε με τη βοήθεια μεθόδων προσδιορισμού ολικών φαινολών και φλαβανολών, ενώ προσδιορίστηκαν και οι ολικοί πολυσακχαρίτες. Η παρακολούθηση των μεταβολών πραγματοποιήθηκε για χρονικό διάστημα έξι εβδομάδων, από την 5η έως τη 10η εβδομάδα, που ακολούθησαν την προσθήκη των ενζύμων. Η περίοδος αυτή συστήνεται από τον προμηθευτή ως απαραίτητη, προκειμένου να υπάρξουν τα αναμενόμενα αποτελέσματα από τη δράση των ενζύμων. Η βέλτιστη χρονική στιγμή της διακοπής, καθορίζεται με τη βοήθεια οργανοληπτικής εξέτασης και επιτυγχάνεται με την προσθήκη μπεντονίτη στον οίνο. 76

77 Προσδιορισμός ολικών φαινολών με τη μέθοδο Folin-Ciocalteau Καμπύλη αναφοράς Η καμπύλη αναφοράς για τον ποσοτικό προσδιορισμό των ολικών φαινολών των πειραματικών οίνων, κατασκευάστηκε ως προς το γαλλικό οξύ. Για την κατασκευή της καμπύλης αναφοράς, χρησιμοποιήθηκαν πρότυπα διαλύματα γαλλικού οξέος, περιεκτικότητας 0, 50, 100, 150, 200, 250, 350 και 450 mg/l. Η απορρόφηση μετρήθηκε στα 750 nm (Singleton & Rossi, 1965). Για κάθε συγκέντρωση πραγματοποιήθηκαν τρεις μετρήσεις και υπολογίστηκε ο μέσος όρος (ΜΟ), η τυπική απόκλιση (SD) και ο συντελεστής μεταβλητότητας (CV). Στον πίνακα που ακολουθεί, παρουσιάζονται οι τιμές απορρόφησης των διαλυμάτων για κάθε συγκέντρωση γαλλικού οξέος (Πίνακας 3.5.), ενώ στο Σχήμα 3.1., παρουσιάζεται η καμπύλη αναφοράς, η οποία κατασκευάστηκε με τις τιμές αυτές. Πίνακας 3.5. Γαλλικό οξύ (mg/l) Απορροφήσεις πρότυπων διαλυμάτων γαλλικού οξέος Απορροφήσεις στα 750 nm ΜΟ ± SD CV ,045 0,045 0,056 0,049±0,006 13, ,114 0,127 0,129 0,123±0,008 6, ,156 0,163 0,165 0,161±0,005 2, ,219 0,222 0,222 0,221±0,002 0, ,256 0,257 0,268 0,260±0,007 2, ,341 0,369 0,380 0,363±0,020 5, ,463 0,474 0,478 0,472±0,008 1,7 77

78 Σχήμα 3.1. Καμπύλη αναφοράς για τον προσδιορισμό ολικών φαινολών με τη μέθοδο Folin-Ciocalteau Αποτελέσματα ανάλυσης δειγμάτων Τα αποτελέσματα του προσδιορισμού της περιεκτικότητας σε ολικές φαινόλες (μέθοδος Folin-Ciocalteau), σε οίνους από την ποικιλία Όψιμος Εδέσσης που προήλθαν από την αλκοολική ζύμωση με τη βοήθεια των στελεχών Α, Β και Γ του S. cerevisiae, καθώς και η μεταβολή της συγκέντρωσής τους κατά τη διάρκεια της ωρίμανσης παρουσία οινολασπών και ενζύμων, δίνονται στους Πίνακες 3.6., 3.7. και 3.8. Η συγκέντρωση των ολικών φαινολών, εκφρασμένη σε ισοδύναμα mg γαλλικού οξέος/l οίνου, υπολογίστηκε με τη βοήθεια της καμπύλης αναφοράς. Από τα αποτελέσματα προκύπτει ότι η Όψιμος Εδέσσης είναι μια ποικιλία με σχετικά υψηλή περιεκτικότητα σε ολικές φαινόλες ( mg ολικών φαινολών/l οίνου), σε σχέση με άλλες ελληνικές λευκές ποικιλίες (Πίνακας 1.10.). Η ωρίμανση του οίνου παρουσία οινολασπών για τέσσερεις εβδομάδες, καθώς και η προσθήκη των ενζυμικών σκευασμάτων, είχε ως αποτέλεσμα την αύξηση της συγκέντρωσης των ολικών φαινολών, σε σχέση με τους οίνους μάρτυρες, στα δείγματα των στελεχών Β και Γ του S. cerevisiae (δείγματα II - V). Η αύξηση αυτή, λαμβάνοντας υπόψη τις τιμές κατά την 5 η εβδομάδα από την προσθήκη των ενζύμων, κυμάνθηκε από 78