ΚΥΤΤΑΡΟΓΕΝΕΤΙΚΗ ΚΑΙ ΜΟΡΙΑΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΟΥ ΕΙΔΟΥΣ BACTROCERA KANDIENSIS (DIPTERA: TEPHRITIDAE)

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΚΑΙ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΚΥΤΤΑΡΟΓΕΝΕΤΙΚΗ ΚΑΙ ΜΟΡΙΑΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΟΥ ΕΙΔΟΥΣ BACTROCERA KANDIENSIS (DIPTERA: TEPHRITIDAE) Χαρτοματσίδου Τατιάνα Βιολόγος Επιβλέποντες: Μαυραγάνη- Τσιπίδου Πηνελόπη Καθηγήτρια Δροσοπούλου Ελένη Επίκουρη καθηγήτρια Θεσσαλονίκη

2 ARISTOTLE UNIVERSITY OF THESSALONIKI FACULTY OF SCIENCES SCHOOL OF BIOLOGY Postgraduate Studies Applied Genetics and Biotechnology MASTER THESIS CYTOGENETIC AND MOLECULAR STUDY OF THE SPECIES BACTROCERA KANDIENSIS (DIPTERA: TEPHRITIDAE) Chartomatsidou Tatiana Biologist Supervisors: Mavragani- Tsipidou Penelope Professor Drosopoulou Elena Assistant Professor Thessaloniki

3 Τριμελής εξεταστική επιτροπή: Μαυραγάνη- Τσιπίδου Πηνελόπη Καθηγήτρια Δροσοπούλου Ελένη Επίκουρη καθηγήτρια Σκούρας Ζαχαρίας Kαθηγητής 3

4 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η διεξαγωγή της παρούσας μεταπτυχιακής διπλωματικής εργασίας πραγματοποιήθηκε στο εργαστήριο Γενετικής του τομέα Γενετικής, Ανάπτυξης και Μοριακής Βιολογίας του τμήματος Βιολογίας του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης κατά το ακαδημαϊκό έτος Αρχικά, θα ήθελα να ευχαριστήσω την επιβλέπουσα καθηγήτρια κ. Μαυραγάνη Τσιπίδου Πηνελόπη, καθηγήτρια Γενετικής, για τη συνεχή και αμέριστη βοήθειά της. Η στήριξη και η καθοδήγησή της από τα πρώτα ερευνητικά μου βήματα, από το προπτυχιακό μέχρι και το μεταπτυχιακό επίπεδο, ήταν καθοριστική. Η εμπειρία μου στο εργαστήριο, υπό την επίβλεψη και τις συμβουλές της ήταν ιδιαίτερα σημαντική για εμένα. Την ευχαριστώ θερμά για όλες τις γνώσεις που με προθυμία μοιράστηκε μαζί μου. Επίσης, θα ήθελα να την ευχαριστήσω για την καθοριστική συμβολή της στη συγγραφή του κειμένου της διπλωματικής μεταπτυχιακής μου εργασίας, αλλά πάνω απ όλα θέλω να την ευχαριστήσω για την εμπιστοσύνη που έδειξε προς το πρόσωπο μου όλο αυτό το διάστημα. Ακόμη, θα ήθελα να ευχαριστήσω ιδιαίτερα τη συνεπιβλέπουσα καθηγήτρια κ. Δροσοπούλου Ελένη, επίκουρη καθηγήτρια του τομέα Γενετικής. Η συνεχής βοήθεια, οι συμβουλές και η καθοδήγησή της κατά τη διεξαγωγή της πειραματικής διαδικασίας ήταν ιδιαίτερα σημαντική. Επίσης, θα ήθελα να την ευχαριστήσω για τις εύστοχες παρατηρήσεις της σε όλη την πορεία μου, αλλά και για τις συμβουλές κατά τη συγγραφή της παρούσας εργασίας. Ιδιαίτερα, θα ήθελα να ευχαριστήσω την κ. Ζαχαροπούλου Αντιγόνη, ομότιμη καθηγήτρια του τμήματος Βιολογίας του Πανεπιστημίου Πατρών. Η συμβολή της καθόλη τη διάρκεια της εκπόνησης της μεταπτυχιακής μου διπλωματικής εργασίας, καθώς και οι συμβουλές και οι επισημάνσεις ήταν καθοριστικές για την πορεία και την ολοκλήρωση της παρούσας κυτταρογενετικής μελέτης. Επιπλέον, θα ήθελα να ευχαριστήσω τον κ. Σκούρα Ζαχαρία, καθηγητή Γενετικής, καθώς δέχτηκε να είναι μέλος της τριμελούς εξεταστικής μου επιτροπής. Επιπλεόν, θα ήθελα να τον ευχαριστήσω για την παραχώρηση των χώρων του εργαστηρίου του για τη διεξαγωγή τμήματος των πειραμάτων μου. Επίσης, θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά την συνάδελφο και μετά από όλη αυτήν την πορεία- πολύ καλή μου φίλη, Παντελίδου Χριστίνα, για την άριστη συνεργασία που είχαμε όλο αυτό το χρονικό διάστημα, κατά την κοινή μας 4

5 διαδρομή. Θέλω να την ευχαριστήσω για τη στήριξη και όλες τις καλές και σημαντικές στιγμές που ζήσαμε, εντός και εκτός εργαστηριακού χώρου. Φυσικά, θα ήθελα να ευχαριστήσω όλους τους συμφοιτητές και φίλους, που απέκτησα κατά τη διάρκεια της διετούς φοίτησής μου μεταπτυχιακό πρόγραμμα, για την υποστήριξη, τη βοήθεια και τις όμορφες στιγμές που μου προσέφεραν. Τέλος, θα ήθελα να ευχαριστήσω την οικογένεια μου και όλους τους κοντινούς μου ανθρώπους για τη συνεχή υποστήριξη, τη συμπαράσταση και τη ενθάρρυνση τους σε κάθε μου βήμα. Θα ήθελα να τους αφιερώσω την παρούσα διπλωματική εργασία, καθώς χωρίς τη στήριξή τους, η διεξαγωγή της θα ήταν αδύνατη. 5

6 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η οικογένεια Tephritidae Bactrocera dorsalis complex Bactrocera kandiensis Μέθοδοι ελέγχου και περιορισμού των ειδών της οικογένειας Tephritidae Χρωμοσώματα Μιτοχονδριακό γονιδίωμα ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Πειραματικό υλικό B. kandiensis Παρασκευάσματα μεταφασικών χρωμοσωμάτων Παρασκευάσματα πολυταινικών χρωμοσωμάτων Υβριδισμός in situ Ανάλυση του μιτοχονδριακού DNA του είδους B. kandiensis ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Μιτωτικά χρωμοσώματα Πολυταινικά χρωμοσώματα Εντοπισμός γονιδίων πάνω στα πολυταινικά χρωμοσώματα Ανάλυση του μιτοχονδριακού γονιδιώματος του είδους Bactrocera kandiensis ΣΥΖΗΤΗΣΗ Σύγκριση του μιτωτικού καρυοτύπου Σύγκριση πολυταινικού πυρήνα In situ εντοπισμός γονιδίων Αλληλούχιση μιτοχονδριακού γονιδιώματος ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

7 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Η γενετική και η κυτταρολογική μελέτη, σε συνδυασμό με τη μοριακή ανάλυση ειδών εντόμων μεγάλης οικονομικής σημασίας, όπως τα είδη της οικογένειας Tephritidae, είναι ιδιαίτερα σημαντική. Στόχος των πληροφοριών που συλλέγονται από τέτοιου είδους μελέτες, είναι εκτός από τη βιολογική γνώση, η ανάπτυξη νέων μεθόδων ελέγχου και καταπολέμησής τους, φιλικών προς το περιβάλλον (π.χ. τεχνική απελευθέρωσης στείρων εντόμων, SIT). Στην παρούσα μελέτη πραγματοποιήθηκε κυτταρογενετική και μοριακή ανάλυση των ατόμων του είδους Bactrocera kandiensis. Το δίπτερο έντομο B. kandiensis ανήκει στο σύμπλεγμα ειδών B. dorsalis της οικογένειας Tephritidae, το οποίο εντοπίζεται κυρίως στη νοτιοανατολική Ασία και σε νησιά του Ειρηνικού. Τα είδη του συμπλέγματος αυτού είναι εξαιρετικής οικονομικής σημασίας, καθώς ευθύνονται για σημαντικές απώλειες πολλών καλλιεργούμενων φρούτων και λαχανικών. Στην παρούσα εργασία, η κυτταρογενετική μελέτη περιλαμβάνει την ανάλυση του μιτωτικού και του πολυταινικού πυρήνα του είδους. Τα μιτωτικά χρωμοσώματα δίνουν τη δυνατότητα μελέτης του αριθμού, του μεγέθους και της μορφολογίας των αυτοσωμικών και φυλετικών χρωμοσωμάτων ενός είδους. Παράλληλα, τα πολυταινικά χρωμοσώματα αποτελούν ένα ανεκτίμητο εργαλείο τόσο για τη μελέτη της δομής και λειτουργίας των χρωμοσωμάτων και της οργάνωσης γονιδιωμάτων, όσο και για τη μελέτη της γενετικής δομής των φυσικών πληθυσμών. Στους μιτωτικούς πυρήνες του B. kandiensis παρατηρήθηκαν πέντε ζεύγη αυτοσωμικών χρωμοσωμάτων και ένα ζεύγος φυλετικών, με ετερογαμετικό το αρσενικό άτομο. Η ανάλυση των πολυταινικών πυρήνων σιαλογόνων αδένων έδειξε την ύπαρξη πέντε πολυταινικών χρωμοσωμάτων (δέκα πολυταινικοί βραχίονες) που αντιστοιχούν στα πέντε ζεύγη των αυτοσωμικών χρωμοσωμάτων του μιτωτικού πυρήνα. Επιπλέον, σε όλα τα παρασκευάσματα παρατηρήθηκε μια ετεροχρωματινική δομή με ποικίλη μορφολογία μεγέθους και πυκνότητας, η οποία αντιστοιχεί στα φυλετικά χρωμοσώματα. Η σύγκριση του προτύπου ζωνώσεων των πολυταινικών χρωμοσωμάτων του B. kandiensis με το είδος Bactrocera dorsalis έδειξε εκτεταμένες ομοιότητες στους εννέα από τους δέκα χρωμοσωμικούς βραχίονες. Η μοναδική εξαίρεση παρατηρείται στον δεξιό βραχίονα του δεύτερου πολυταινικού 7

8 χρωμοσώματος (βραχίονας 2R), στον οποίο εντοπίζεται ομόζυγη αναστροφή που περιλαμβάνει τις περιοχές Η μοριακή ανάλυση του είδους B. kandiensis περιλαμβάνει την πλήρη αλληλούχιση του μιτοχονδριακού γονιδιώματος και τη σύγκρισή του με το είδος B. dorsalis. Στο μιτοχονδριακό γονιδίωμα εντοπίστηκαν οι θέσεις και οι αλληλουχίες των γονιδίων που κωδικοποιούν πρωτεΐνες, καθώς και των γονιδίων που κωδικοποιούν διάφορα RNA. 8

9 SUMMARY The genetic and the cytogenetic study, along with a molecular study of insects of great economic importance, such as the species of the Tephritidae family, is considered strongly important. The aim of the information, delivered by this kind of studies, is to acquire biology knowledge, as well as to develop new environmentally friendly methods of control and confront (e.g. Sterile Insect Technique, SIT). The present study refers to a cytogenetic and molecular analysis of the species Bactrocera kandiensis. B. kandiensis belongs to Tephritidae family and specifically to B. dorsalis complex, established mainly in southern- eastern Asia, as well as in some Pacific islands. Species belonging to this complex are considered as pests with great economic impact, as they are responsible for important losses of numerous crops. The cytogenetic study contains the analysis of the mitotic and the polytene nucleus of the species. The study of the mitotic chromosomes allows the analysis of the number, the size and the morphology of the autosomes and the sex chromosomes of a species. Furthermore, polytene chromosomes are considered a priceless tool in studying the structure and function of the chromosomes and the genome organization, as well as the genetic structure of a natural population. The mitotic karyotype of B. kandiensis consists of 5 pairs of autosomes and one pair of sex chromosomes, which are heteromorphic in males. In the polytene nuclei of the salivary glands, five polytene elements (10 arms) can be observed, corresponding to the five pairs of autosomes of the mitotic nuclei. The analysis of polytene and mitotic nuclei of male and female individuals of B. kandiensis, revealed that sex chromosomes are not represented by polytene nuclei. However, a heterochromatic mass is observed in every specimen, varying in morphology, size and density. The comparison of the banding pattern of B. kandiensis polytene chromosomes with that of the reference species, B. dorsalis, showed extensive similarities across the nine of the ten chromosome arms. Based on this observation, these arms could be characterized as homosequential. The only exception is related to the right arm of the second polytene chromosome (2R arm), where a fixed inversion covering regions has been observed. The molecular analysis of B. kandiensis consists of the complete sequencing of the mitochondrial genome. The mtdna is being compared to the one of B. dorsalis. 9

10 The position and the sequence of protein coding genes, as well as the RNA coding genes, are estimated. 10

11 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1.1 Η οικογένεια Tephritidae Η οικογένεια Tephritidae μαζί με την οικογένεια Drosophilidae, αποτελούν τις δύο οικογένειες που περιλαμβάνουν τις «μύγες των φρούτων» (fruit flies). Το όνομα της οικογένειας προέρχεται από την ελληνική λέξη «τέφρος», το οποίο παραπέμπει στο γκρι χρώμα της στάχτης και αναφέρεται στο χρώμα του σώματος της οικογένειας. Έχουν περιγραφεί περίπου 5000 είδη της οικογένειας αυτής, η οποία θεωρείται η πιο οικονομικά σημαντική οικογένεια εντόμων σχετικά με το χώρο της γεωργίας. Πολλά είδη είναι παράσιτα για διάφορα είδη καλλιεργούμενων φυτών, προκαλώντας οικονομικές απώλειες δισεκατομμυρίων δολαρίων ετησίως στον τομέα αυτό. Υπάρχουν όμως και κάποια είδη της οικογένειας που θεωρούνται ευεργετικά, καθώς χρησιμοποιούνται ως παράγοντες βιολογικού ελέγχου διαφόρων ειδών φυτών. Επιπλέον, τα έντομα της οικογένειας Tephritidae θεωρούνται από τα πιο όμορφα και βιολογικά ενδιαφέροντα δίπτερα, χάρη στα διάφορα σχηματικά και χρωματικά μοτίβα των φτερών και του σώματός τους, που συχνά συνοδεύονται με έντονα χρώματα. Η μορφολογία αυτή επιπλέον συμβάλλει στον μιμιτισμό που εμφανίζουν κάποια από αυτά τα είδη, καθώς φέρουν χρώματα και χαρακτηριστικά άλλων επικίνδυνων αρθροπόδων. Με τον τρόπο αυτό είναι σε θέση να αποφεύγουν τη θήρευση, παρόλο που στην πραγματικότητα δεν είναι επικίνδυνα.. Επίσης, τα έντονα μορφολογικά χαρακτηριστικά που εμφανίζουν συμβάλλουν και σε άλλες συμπεριφορές, όπως η αναπαραγωγή ( /tephriti.htm) Συστηματική κατάταξη Μέχρι το Δεκέμβριο του 2003, είχαν αναγνωριστεί 4448 είδη και υποείδη της οικογένειας Tephritidae παγκοσμίως, τα οποία διαιρούνται σε 484 γένη. Ο πραγματικός αριθμός των ειδών όμως είναι αρκετά μεγαλύτερος, καθώς πολλά δεν έχουν χαρακτηριστεί ακόμα. Η ποικιλομορφία των ειδών εμφανίζει το μεγαλύτερο εύρος της στις τροπικές περιοχές. Γενικά, η οικογένεια των Tephritidae θεωρείται ότι περιλαμβάνει πολλές υποοικογένειες, με αποτέλεσμα να υπάρχουν ακόμα αρκετές ασυμφωνίες σχετικά με την κατάταξη και τις σχέσεις αυτών μεταξύ τους ( 11

12 Συγκεκριμένα, ο Korneyev το 1999 διαίρεσε την οικογένεια Tephritidae σε 6 υποοικογένεις: Dacinae, Trypetinae, Tephritinae, Phytalmiinae, Tachiniscinae και Blepharoneurinae. Η υποοικογένεια Dacinae περιέχει την μεγάλη φυλή Dacini που αποτελείται από δύο γένη, το γένος Bactrocera και το γένος Dacus (Korneyev, 1999). Το γένος Bactrocera αποτελείται από 629 είδη, από τα συνολικά 880 που ανήκουν στην υποοικογένεια Dacini (Drew, 2004), και περιλαμβάνει κυρίως μύγες- παράσιτα των τροπικών και υποτροπικών χωρών. Ωστόσο, η πιο ευρέως αποδεκτή άποψη είναι αυτή των Norrborn et al. (1999), σύμφωνα με την οποία η φυλή Dacini διαιρείται στις υπο-φυλές Ceratitidina, Dacina και Gastrozonina. Συνεπώς, όπως γίνεται κατανοητό από τα παραπάνω, οι μελέτες στη διάρκεια των δεκαετιών δεν έχουν οδηγήσει σε ολοκληρωμένη ταξινόμηση, καθώς έχουν προταθεί πολλές νέες ομάδες, ενώ ταυτόχρονα άλλα γένη έχουν μεταφερθεί. Η σημερινή ταξινόμηση της οικογένειας Tephritidae φαίνεται στον πίνακα 1. Πίνακας 1: Συστηματική κατάταξη της οικογένειας Tephritidae Συστηματική κατάταξη οικογένειας Tephritidae Βασίλειο Animalia Φύλο Arthropoda Υποφύλο Hexapoda Κλάση Insecta Τάξη Diptera Υπεροικογένεια Tephritoidea Οικογένεια Tephritidae (Fruit Flies) Βιολογία των ειδών Τα είδη της οικογένειας Tephritidae είναι κοινώς γνωστά ως «μύγες των φρούτων». Στην πραγματικότητα παρασιτούν σε διάφορα τμήματα και ιστούς των ξενιστών, εκτός από τους καρπούς, όπως στα άνθη, τους στήμονες, τα φύλλα, τις ρίζες, κ.ά. Στα περισσότερα από τα είδη της οικογένειας, με λίγες μόνο εξαιρέσεις, τα θηλυκά γεννάνε μέσα στους καρπούς των φρούτων. Στα πολυφάγα είδη, τα θηλυκά εναποθέτουν τα αυγά τους στον υγιή φυτικό ιστό, συνήθως στον καρπό, όπου η προνύμφη τρέφεται, προκαλώντας καταστροφές (εικόνα 1). Οι καρποί και τα άνθη είναι τα φυτικά τμήματα που πλήττονται περισσότερο (εικόνα 2), ενώ άλλα τμήματα στα οποία παρασιτούν είναι οι σπόρου, τα φύλλα και οι στήμονες ή τα άνθη. Τα ενήλικα άτομα συνήθως τρέφονται με υγρά στοιχεία των φυτών όπως με χυμούς ή 12

13 μελιτώδεις εκκρίσεις, ή με μικροοργανισμούς ( /diptera/tephriti/tephriti. htm). α) β) γ) Εικόνα 1: α) Είδος του γένους Bactrocera που αποθέτει τα αυγά του σε καρπούς, β) προνύμφες εντόμου που αναπτύσσονται στο εσωτερικό των καρπών (6), γ) νύμφες του είδους Ceratitis capitata στο έδαφος (8) Εικόνα 2: Καρποί φρούτων που έχουν καταστραφεί λόγω της ωοαπόθεσης από είδη της οικογένειας Tephritidae (7, 8) Κύκλος ζωής Ο κύκλος ζωής των εντόμων της οικογένειας Tephritidae περιλαμβάνει τα ακόλουθα στάδια: αυγό, προνύμφη, νύμφη, ενήλικο άτομο (εικόνα 3). Το χρονικό διάστημα κατά το οποίο το άτομο διακρίνεται ως προνύμφη, διαιρείται σε τρία επί μέρους προνυμφικά στάδια (εικόνα 4). Μετά το τέλος του τρίτου σταδίου, στο εσωτερικό της προνύμφης, σχηματίζεται η νύμφη, καθώς η επιδερμίδα αρχίζει να σκληραίνει (puparium) ( 13

14 Εικόνα 3: Κύκλος ζωής των εντόμων της οικογένειας Tephritidae (8) Εικόνα 4: Προνυμφικά στάδια των εντόμων της οικογένειας Tephritidae (9) Τα είδη μπορεί να γεννούν παραπάνω από μία φορά σε μια αναπαραγωγική περίοδο. Σε μερικά είδη, η διάρκεια ζωής μπορεί να είναι ιδιαίτερα σύντομη, όπως για παράδειγμα μία ή δύο εβδομάδες, όμως σε κάποια άλλα είδη, τα θηλυκά μπορούν να επιβιώσουν για μεγαλύτερο χρονικό διάστημα [π.χ. έως και 12 μήνες στην περίπτωση του Anastrepha ludens (Shaw et al., 1967, Carey, 1989, Steck, 1991)]. Επίσης, χαρακτηριστικό των ειδών της οικογένειας είναι η διάπαυση, η κατάσταση δηλαδή κατά την οποία αναστέλλεται προσωρινά η ανάπτυξη και η αναπαραγωγή των ατόμων, με ταυτόχρονη πτώση του μεταβολισμού. Στόχος της κατάστασης αυτής είναι τα άτομα να ανταπεξέλθουν σε δυσμενείς θερμοκρασιακές ή περιβαλλοντικές 14

15 συνθήκες. Σε ορισμένες περιπτώσεις, όπως στο είδος Rhagoletis, η κατάσταση αυτή μπορεί να διαρκέσει έως και δύο ή περισσότερα χρόνια (Christenson and Foote, 1960) Μορφολογία Τα ενήλικα άτομα της οικογένειας Tephritidae έχουν μήκος 1-35 mm. Το μοτίβο των χρωμάτων του σώματος διαφοροποιείται ανάμεσα στα διάφορα είδη. Τα φτερά των ειδών έχουν κίτρινα, καφέ ή μαύρα στίγματα, και συχνά είναι σκουρόχρωμα με ανοιχτόχρωμα σημάδια (εικόνα 5). Σε λίγες περιπτώσεις τα φτερά εμφανίζονται διάφανα. Τα αυγά των ειδών έχουν μήκος 0,35-1,65 mm και το χρώμα τους κυμαίνεται από λευκό έως ανοιχτό καφέ, ενώ το σχήμα τους είναι ωοειδέςεπίμηκες. Οι νύμφες έχουν κυλινδρικό σχήμα και μπορεί να εμφανίζονται λείες ή με μεταμερή. Το χρώμα τους εμφανίζεται από λευκό έως κίτρινο, καφέ ή μαύρο και διαφοροποιείται από το εμπρόσθιο έως το οπίσθιο τμήμα τους (Plant Health Australia, 2011). Εικόνα 5: Μορφολογία διαφόρων ειδών της οικογένειας Tephritidae (10) Φυτά- ξενιστές Τα περισσότερα, αν και όχι όλα τα είδη της οικογένειας που έχουν μελετηθεί βιολογικά, είναι φυτοφάγα, με το φάσμα των ξενιστών να ποικίλει ιδιαίτερα, συχνά ακόμα και σε στενά συγγενικά είδη (Norrborn and Kim, 1988, Goeden 1992, 1993, 1994). Πολλά είδη θεωρούνται αυστηρώς μονοφαγικά, όπως πχ. το Bactrocera oleae που παρασιτεί μόνο στην ελιά, ενώ άλλα είδη είναι εξαιρετικά πολυφάγα, όπως π.χ. 15

16 το Ceratitis capitata με πάνω από 300 διαφορετικούς ξενιστές (Liquido et al., 1991). Τα φυτά στα οποία παρασιτούν τα Tephritidae ανήκουν σε ένα μεγάλο εύρος οικογενειών, παρόλο που κάθε είδος εμφανίζει προτίμηση σε συγκεκριμένες κατηγορίες ξενιστών, που διαφοροποιούνται από τα υπόλοιπα είδης της οικογένειας. Τα φυτικά είδη τα οποία προτιμά κάθε μέλος της οικογένειας Tephritidae είναι συνήθως συγγενικά ή μπορεί ακόμα να αποτελούν και μοναδικό ξενιστή για ένα είδος. Η πλειοψηφία των ειδών της οικογένειας όμως, είναι ολιγοφαφικά και αναπαράγονται σε λίγα φυτικά είδη που σχετίζονται μεταξύ τους οικολογικά ή χημικά. Ακόμα και σε πολλά από τα πολυφαγικά είδη, αν και είναι ικανά να αναπαράγονται σε πολλούς ξενιστές, έχουν προτίμηση σε συγκεκριμένες οικογένειες ή γένη φυτών ( Οικονομική σημασία Περίπου 70 είδη της οικογένειας Tephritidae θεωρούνται σημαντικά αγρονομικά παράσιτα, ενώ εκτός από αυτά υπάρχουν είδη μικρότερης σημασίας ή και είδη που θεωρούνται πιθανά ευκαιριακά παράσιτα. Τα φρούτα είναι οι βασικοί ξενιστές, ανάμεσα στις καλλιέργειες στις οποίες τα είδη αυτά παρασιτούν. Σε αυτά περιλαμβάνονται τα εσπεριδοειδή, τα μάνγκο, τα μήλα και πολλά άλλα (εικόνα 6), καθώς και καρποί όπως αυτοί των ηλίανθων ( /diptera/tephriti/tephriti.htm). Εικόνα 6: Μερικά είδη στα οποία παρασιτούν τα είδη του γένους Bactrocera (11) Η μεγάλη πλειοψηφία τους ανήκει στα γένη Anastrepha, Ceratitis, Bactrocera, Dacus and Rhagoletis. Οι ξενιστές των ειδών αυτών ανήκουν σε ένα ευρύ πλαίσιο οικογενειών φυτών και περιλαμβάνουν πολλά σημαντικά εμπορικά καλλιεργούμενα είδη. 16

17 Όπως προαναφέρθηκε, τα ενήλικα άτομα γεννούν τα αυγά τους στους καρπούς και αυτά στη συνέχεια εξελίσσονται σε προνύμφες που τρέφονται από το εσωτερικό αυτών. Εκτός από αυτήν την καταστρεπτική δράση, οι οπές που δημιουργούνται στην επιφάνεια των καρπών επιτρέπουν την ανάπτυξη βακτηρίων και μυκήτων, καθιστώντας το φρούτο ακατάλληλο προς βρώση. Συνεπώς οι οικονομικές συνέπειες της δράσης των ειδών αυτών, είναι ιδιαίτερα σημαντικές για την εμπορία των αντίστοιχων καρπών από τις χώρες που τα εξάγουν. Τα οικονομικά αποτελέσματα δεν περιλαμβάνουν μόνο άμεση απώλεια της απόδοσης και αυξημένο κόστος ελέγχου, αλλά και μείωση των εξαγωγών στις αγορές, καθώς και κόστος δημιουργίας και συντήρησης ειδικών εγκαταστάσεων με στόχο τη μείωση του προβλήματος. Σε πολλές χώρες, οι εξαγωγές των πιο εμπορικών φρούτων περιορίζεται δραματικά, λόγω καραντίνας που επιβάλλεται, με στόχο την αποτροπή της εξάπλωσης των ειδών αυτών σε άλλες περιοχές. Χαρακτηριστικό παράδειγμα η Καλιφόρνια, όπου έπειτα από τυχαία μόλυνση από πληθυσμό του Ceratitis capitata και άλλων παρασιτικών ειδών της οικογένειας, η ζημία ανήλθε σε εκατοντάδες εκατομμύρια δολάρια το χρόνο (Jackson and Lee, 1985, Dowell and Wange, 1986). Ωστόσο, εκτός από την βλαπτική τους επίδραση στις καλλιέργειες, τα είδη της οικογένειας Tephritidae εμφανίζονται και ως ωφέλιμα σε κάποιες περιπτώσεις. Συγκεκριμένα, 15 είδη χρησιμοποιούνται ως παράγοντες βιολογικού ελέγχου ειδών της οικογένειας φυτών Asteraceae, ενώ άλλα είναι βασικά εργαλεία βιολογικής έρευνας (π.χ. η μεσογειακή μύγα- Ceratitis capitata) σε μελέτες γενετικής και μοριακής βιολογίας. Άλλα είδη επίσης, θεωρούνται σημαντικά μοντέλα για τη μελέτη εξελικτικών και οικολογικών θεωριών. Τέτοια παραδείγματα είναι τα είδη Rhagoletis σχετικά με τη συμπάτρια ειδογένεση (Bush, 1992), η μεσογειακή μύγα για δημογραφική έρευνα (Carey and Liedo, 1999) και πολλά άλλα είδη για διάφορες οικολογικές μελέτες. 1.2 Bactrocera dorsalis complex Το γένος Bactrocera θεωρείται το πιο σημαντικό οικονομικά γένος της οικογένειας Tephritidae, με περίπου 40 είδη να θεωρούνται σημαντικά παράσιτα (White and Elson-Harris, 1992). Είδη του γένους αυτού ανήκουν σε μια μεγάλη ομάδα εντόμων, που είναι δύσκολο να διακριθούν μορφολογικά μεταξύ τους, το 17

18 σύμπλεγμα ειδών Bactrocera dorsalis (Bactrocera dorsalis complex). Το σύμπλεγμα ειδών Bactrocera dorsalis αναγνωρίστηκε πρώτη φορά από τον Hardy (1969) και στη συνέχεια μελετήθηκε περαιτέρω από τους Drew and Hancock (1994). Το σύμπλεγμα αρχικά θεωρήθηκε ότι περιλαμβάνει 16 είδη, συγγενικά στενά με το B. dorsalis. Από τις αρχές τις δεκαετίας του 1980 όμως, περιγράφηκαν και προστέθηκαν νέα είδη, με αποτέλεσμα το σύμπλεγμα να αναθεωρηθεί, να επεκταθεί και να καταλήξει να περιέχει τελικά μέχρι σήμερα 75 είδη. Σε αυτό το ταχέως εξελισσόμενο σύμπλεγμα έχουν αναγνωριστεί είδη μεγάλης αγρονομικής σημασίας, ταυτόχρονα όμως, πολλά είδη παραμένουν ακόμα απροσδιόριστα (Clarke et al., 2005). Στοιχεία που έχουν συλλεχθεί μέχρι σήμερα δείχνουν ότι το σύμπλεγμα αυτό αποτελεί ένα ταχέως εξελισσόμενο σύμπλεγμα ειδών, με την ποικιλία των ειδών που συναντάμε να έχουν εμφανιστεί σε σχετικά πρόσφατο εξελικτικά χρόνο (πριν από 1-2 εκατομμύρια χρόνια). Το σύμπλεγμα αποτελεί ένα καλό εξελικτικό παράδειγμα φυτοφάγων ειδών. Σε αντίθεση με άλλα φυτοφάγα αρθρόποδα όμως, δεν παρατηρείται σύστημα συνεξέλιξης με τα φυτά- ξενιστές. Αντίθετα, η ποικιλότροπη εξέλιξή τους πιθανόν να ήταν αποτέλεσμα ενός πολύπλοκου συστήματος αλλαγής και επέκτασης του εύρους των ξενιστών, που συνέβη στα πλαίσια ενός φυτικά ποικίλου τροπικού δάσους, καθώς και των εξελικτικά γρήγορων αλλαγών στο γεωλογικό μωσαϊκό της νοτιοανατολικής Ασίας και των προσαυξανόμενων εδαφών (Clarke et al., 2005). Τα είδη του γένους αυτού είναι ενδημικά στους τροπικούς του Παλαιού Κόσμου, που περιλαμβάνει περιοχές της Αφρικής, της Ασίας και της Αυστραλίας. Η πλειοψηφία των ειδών αυτών προέρχεται από περιοχές της Ανατολής και της Αυστραλασίας (Αυστραλία, Νέα Γουινέα, Νέα Ζηλανδία, Ινδονησία). Καθώς τα είδη του συμπλέγματος ευδοκιμούν κυρίως σε τροπικό και υποτροπικό κλίμα, η είσοδός του στην Ευρώπη, θεωρείται σχετικά απίθανη, άρα και οι άμεσες οικονομικές απώλειες από ένα τέτοιο γεγονός. Ωστόσο, δεν αποκλείεται η είσοδος και η αναπαραγωγή των ειδών αυτών κατά τους θερινούς μήνες (EPPO, 1997) Bactrocera dorsalis Ανάμεσα στα πιο σημαντικά είδη του συμπλέγματος περιλαμβάνεται το Bactrocera dorsalis (The Oriental fruit fly). Το είδος B. dorsalis καταστρέφει πολλά 18

19 φρούτα όπως τα γκουάβα, τα μάνγκο και τα αβοκάντο (εικόνα 7). Η παρουσία του και η καταστρεπτική του δράση επιβάλλουν μέτρα ελέγχου προτού τα αντίστοιχα προϊόντα εξαχθούν στις διεθνείς αγορές, με στόχο την αποφυγή εξάπλωσης του είδους σε νέες περιοχές, μέσω των λιμανιών και των αεροδρομίων (Stephens et al., 2007). Εικόνα 7: Απώλειες στην παραγωγή μάνγκο λόγω του παρασιτικού εντόμου Bactrocera dorsalis (13) Μορφολογία Τα ενήλικα άτομα του είδους έχουν σώμα μήκους 8mm και τα φτερά τους φτάνουν σε μήκος περίπου τα 7,3 mm και είναι κατά κύριο λόγο διάφανα. Το χρώμα του σώματος ποικίλει, κυριαρχεί όμως το κίτρινο και το σκούρο καφέ με μαύρα στίγματα στο θώρακα (εικόνα 8). Γενικά, στο κοιλιακό τμήμα υπάρχουν δύο οριζόντιες μαύρες γραμμές με μια διαμήκη ενδιάμεση γραμμή που εκτείνεται από την βάση του τρίτου μεταμερούς μέχρι την κορυφή της κοιλίας. Τα σημάδια αυτά σχηματίζουν ένα μοτίβο σε σχήμα Τ (εικόνα 9), το οποίο όμως μπορεί να ποικίλει σημαντικά (Drew and Hancock, 1994). α β Εικόνα 8: α) Θηλυκό και β) αρσενικό άτομο του είδους Bactrocera dorsalis (6) 19

20 Εικόνα 9: Χαρακτηριστική μορφολογία της ραχιαίας πλευράς του είδους Bactrocera dorsalis (12) Στα θηλυκά άτομα ο ωοαποθέτης εμφανίζεται λεπτός με οξύληκτο άκρο (εικόνα 10) (Drew and Hancock, 1994). Τα αυγά του είδους είναι λευκά, επιμήκη ή ελλειπτικά και φτάνουν σε μήκους 1,17 mm. Η προνύμφη τρίτου σταδίου έχει τυπική σκωληκοειδή μορφή, με μήκος περίπου 10mm και κρεμώδες λευκό χρώμα. Οι προνύμφες εμφανίζουν καφέ έως σκούρο καφέ χρώμα με μήκος περίπου 4,9mm (Drew and Hancock, 1994). Εικόνα 10: Ωοαποθέτης θηλυκού ατόμου του είδους Bactrocera dorsalis (6) Κύκλος ζωής Η ανάπτυξη του αυγού σε ενήλικο άτομο, κατά τους θερινούς μήνες απαιτεί περίπου 16 ημέρες. Η ώριμη προνύμφη εξέρχεται από τον καρπό, πέφτει στο έδαφος και σχηματίζει τη νύμφη. Ο σχηματισμός της νύμφης πραγματοποιείται στο χώμα. Μετά την εκκόλαψη του ενήλικου ατόμου απαιτούνται περίπου 9 ημέρες προκειμένου να ωριμάσει σεξουαλικά. Η χρονική διάρκεια της ανάπτυξης μπορεί να επιμηκυνθεί σε πιο ψυχρές κλιματολογικές συνθήκες. Στη βέλτιστη περίπτωση, ένα θηλυκό μπορεί να γεννήσει έως και 3000 αυγά κατά τη διάρκεια της ζωής τους. Στο φυσικό πεδίο ωστόσο, ο αριθμός αυτός περιορίζεται στα αυγά κατά μέσο όρο. Σε γενικές γραμμές, τα ώριμα φρούτα προτιμώνται για την ωοαπόθεση, ωστόσο για το σκοπό αυτό μπορεί να χρησιμοποιηθούν και οι ανώριμοι καρποί (Drew and Hancock, 1994). Τα φρούτα και τα λαχανικά στα οποία έχει καταγραφεί να επιτίθεται το B. dorsalis περιλαμβάνει πάνω από 150 είδη (πίνακας 2), συμπεριλαμβανομένων το 20

21 βερίκοκο, το αβοκάντο, η μπανάνα, τα εσπεριδοειδή, το μάνγκο, η ντόμάτα, ο καφές, κ.ά. Ωστόσο, από τα παραπάνω, το αβοκάντο, το μάνγκο και η παπάγια είναι αυτά στα οποία επιτίθεται κατά κύριο λόγο (Drew and Hancock, 1994). Πίνακας 2: Οι σημαντικότεροι ξενιστές του είδους Bactrocera dorsalis (Allwood et al., 1999) Γεωγραφική εξάπλωση Το είδος B. dorsalis εντοπίζεται σε πολλές χώρες της νοτιοανατολικής Ασίας και σε περιοχές του Ειρηνικού (White and Elson-Harris 1992, Drew and Hancock 1994). Δεδομένης της πολυφαγίας που χαρακτηρίζει το είδος, εμφανίζει μεγάλη ικανότητα διασποράς και προσαρμοστικότητας σε νέες περιοχές, όπως συμβαίνει γενικά με τα περισσότερα είδη του συμπλέγματος (εικόνα 11). Για το λόγο αυτό έχει χαρακτηριστεί ως βασικός ξενιστής στης περιοχές της Ασίας και του Ειρηνικού και έχει χαρακτηριστεί ως είδος υπό καραντίνα στις περισσότερες χώρες (White and Elson-Harris, 1992, Drew and Hancock 1994, Clarke et al., 2005). 21

22 Εικόνα 11: Ιστορικό γεωγραφικής εξάπλωσης των ειδών του συμπλέγματος Bactrocera dorsalis (Vargas et al., 2015) Εκτός από την Ασία, έχει εντοπιστεί και στη Χαβάη, όπου εισήχθη συμπτωματικά κατά τα έτη (Mau, 2007). Αντίστοιχες περιπτώσεις εισαγωγής του είδους B. dorsalis σε περιοχές όπου το είδος δεν θεωρούνταν ενδημικό, έχουν καταγραφεί πολλές φορές (εικόνα 12). Στην Καλιφόρνια προσπάθεια εξάλειψής του πραγματοποιήθηκε το χρονικό διάστημα , ενώ επιπλέον νέες εισβολές ανιχνεύτηκαν ξανά κατά τα έτη 2002 και 2004 και εξαλείφθηκαν αντίστοιχα το 2006 και Το 2010, άτομα του είδους εντοπίστηκαν σε παγίδες στην περιοχή του Σακραμέντο, οπότε και εφαρμόστηκε πρόγραμμα καραντίνας και εξάλειψης από το 2010 (Weems et al., 2012). Επιπλέον, το είδος έχει εντοπιστεί, χωρίς όμως να έχει εγκαθιδρυθεί και στην Φλόριντα. Στη Χαβάη, προνύμφες εντοπίστηκαν σε περισσότερα από 125 είδη ξενιστών. Στο δυτικό Πακιστάν, μολύνσεις έχουν καταγραφεί στο 50-80% των αχλαδιών, των ροδάκινων και άλλων ειδών, ενώ στις Φιλιππίνες, το B. dorsalis θεωρείται το κύριο παράσιτο στα μάνγκο. Στην Ιαπωνία, θεωρούνταν σημαντικό παράσιτο των εσπεριδοειδών, μέχρι το έτος 1985, όπου και εξαλείφθηκε έπειτα από πρόγραμμα 18 ετών που περιλάμβανε ειδικές παγίδες του εντόμου, καθώς και εξειδικευμένα προγράμματα περιορισμού, όπως η τεχνική SIT (Drew and Hancock, 1994). 22

23 Εικόνα 12: Η παγκόσμια γεωγραφική κατανομή του Bactrocera dorsalis (*, ειβολή; r, ενδημικά) (Weems et al., 2012) Οικονομική σημασία Η μύγα Batrocera dorsalis s.s. (Hendel) θεωρείται ένα από τα πιο καταστρεπτικά παράσιτα στο χώρο της αγρονομίας (Clarke et al., 2005). Χαρακτηριστικά, έχει καταγραφεί ότι στην περιοχή Nauru της Ιαπωνίας, μέλη του συμπλέγματος B. dorsalis έχει τύχει να μολύνουν έως και το 95% το εμπορεύσιμων μάνκγο και έως 90% των γκουάβα (PMP-FFM, 2004) προκαλώντας μεγάλες οικονομικές απώλειες. Λόγω της ιδιαίτερης οικονομικής σημασίας και της παρουσίας των ατόμων αυτών παγκοσμίως, υπάρχουν πολλά ερευνητικά δίκτυα, καθώς και διεθνή συμπόσια που προγραμματίζουν εντατικές δράσεις σε ποικίλα θέματα σχετικά με το είδος, από το θέμα της οικολογίας τους έως και στο πεδίο της μοριακής βιολογίας. Η εισβολή των ειδών του συμπλέγματος στην Αυστραλία, την Ωκεανία, την κεντρική Αμερική, την Αφρική και στις ΗΠΑ προκάλεσε την έναρξη μελετών εφαρμοσμένης έρευνας για τον περιορισμό τους, τις προηγούμενες δεκαετίες. Οι περισσότερες από αυτές τις μελέτες εστιάζουν στην ανάπτυξη διαγνωστικών εργαλείων για την αναγνώριση των ειδών μέσα στο σύμπλεγμα (Adsavakulchai et al., 1998, Muraji and Nakahara, 2002, Jamnongluk et al,. 2003, Lawson et al., 2003, Drew et al., 2008), τον περιορισμό τους (Follett and McQuate, 2001, Nakahara et al., 2008) και την εξάλειψή τους (Malavasi et al., 2000, Seewootuthum et al., 2000). 23

24 1.3 Bactrocera kandiensis Το είδος Bactrocera kandiensis ανήκει στο σύμπλεγμα Β. dorsalis (πίνακας 3) και είναι συγγενικό με το είδος Β. dorsalis. Το Β. kandiensis θεωρείται ενδημικό στη Σρι Λάνκα (εικόνα 13). Περαιτέρω μελέτες σε κυτταρογενετικό και μοριακό επίπεδο είναι απαραίτητες, προκειμένου να διευκρινιστεί η θέση του είδους στο σύμπλεγμα (Drew and Hancock, 1994). Όπως έχει σημειωθεί για πολλά από τα είδη της ομάδας αυτής, εμφανίζει οικονομική σημασία, καθώς έχει καταγραφεί ως παράσιτο σε φυτά από έξι διαφορετικές οικογένειες. Πίνακας 3: Συστηματική κατάταξη του είδους Bactrocera kandiensis Συστηματική κατάταξη Kingdom: Animalia Phylum: Arthropoda Class: Insecta Order: Diptera Family: Tephritidae Genus: Bactrocera Subgenus: Bactrocera Species: B. kandiensis Εικόνα 13: Γεωγραφική εξάπλωση του είδους Bactrocera kandiensis (Khamis et al., 2012) Ιδιαίτερα σοβαρό παράσιτο θεωρείται σε διάφορους εμπορεύσιμους καρπούς, όπως τα μάνγκο, η παπάγια και άλλα (πίνακας 4), ενώ πιθανώς ευθύνεται και για καταστροφές που αποδίδονταν αρχικά στη δράση του Β. dorsalis. Το είδος αυτό, 24

25 όπως και άλλα είδη του συμπλέγματος είναι γνωστό ότι έλκεται από τη μεθυλική ευγενόλη. Πίνακας 4: Βασικοί εμπορεύσιμοι ξενιστές του είδους Bactrocera kandiensis (Tsuruta et al., 1997, Allwood et al., 1999, Plant Health Australia, 2011) Μορφολογία Μορφολογικά το B. kandiensis μοιάζει με διάφορα είδη της οικογένειας Tephritidae, όπως παρατηρείται γενικά στο σύμπλεγμα B. dorsalis. Τα θηλυκά ενήλικα άτομα έχουν μήκος σώματος 1,6 mm και χρώμα μαύρο- καφέ (εικόνα 14), ενώ το μήκος του θώρακά του φτάνει τα 3,10 mm και το μήκος των φτερών τα 6,18 mm (Drew et al., 2008). Η άκρη του ωοαποθέτη έχει χρώμα πορτοκαλί και καφέ στην ραχιαία πλευρά του. Όπως περιγράφηκε παραπάνω για το είδος B. dorsalis, έτσι και το B. kandiensis εμφανίζει το μοτίβο «Τ» στο κοιλιακό τμήμα της ραχιαίας πλευράς (εικόνα 15) (Drew and Raghu, 2002). Το είδος αυτό μορφολογικά εμφανίζει ιδιαίτερες ομοιότητες τα είδη B. arecae και B. caryeae (Drew and Hancock, 1994). Ωστόσο, διαφοροποιήσεις εντοπίζονται στα πρότυπα της κοιλιακής χώρας. Εικόνα 14: Μορφολογικά χαρακτηριστικά του είδους Bactrocera kandiensis (13) 25

26 Εικόνα 15: Σχεδιάγραμμα της μορφολογίας του είδους Bactrocera kandiensis (Drew and Hancock, 1994) Κατάταξη του είδους Το είδος B. kandiensis είναι μέλος του συμπλέγματος B. dorsalis. είναι παρασιτικό και μορφολογικά εμφανίζει έντονες ομοιότητες με το B. dorsalis (Drew & Hancock, 1994, Clarke et al., 2005, Khamis et al., 2012). Το γεγονός αυτό έχει προκαλέσει σύγχυση σχετικά με τη βιολογική σχέση των δύο ειδών, καθώς και με άλλα είδη του συμπλέγματος, όπως τα B. papayae, B. philippinensis και B. invadens. Μελέτες σχετικά με την αναπαραγωγική συμβατότητα των B. dorsalis με το B. kandiensis έχουν δείξει ικανότητα αναπαραγωγής μεταξύ τους (Plant Health Australia, 2011). Η κατάσταση στην Ινδία- και ιδίως στη Σρι Λάνκα- απαιτεί περαιτέρω έρευνα λόγω της οικονομικής σημασίας του είδους, προκειμένου να διευκρινιστούν οι σχέσεις μεταξύ των πληθυσμών των B. kandiensis και B. dorsalis, όσων πληθυσμών είχαν καταγραφεί αρχικά ως B. invadens, καθώς και μεταξύ των άλλων ειδών του συμπλέγματος. Βιοπληροφορικές αναλύσεις στην έρευνα των Khamis et al. (2012) έδειξαν ότι τα είδη Bactrocera μπορούσαν να διακριθούν σε 4 κλάδους. Ο πρώτος κλάδος αποτελούνταν από είδη του συμπλέγματος B. dorsalis (B. invadens, B. kandiensis και B. dorsalis s.s.) (Khamis et al., 2012). Ωστόσο, η φυλογενετική μελέτη των Schutze et al. (2014), μεταξύ άλλων έδειξε ότι το B. kandiensis αποτελεί έναν διακριτό κλάδο σε σχέση με το B. dorsalis, ενώ ταυτόχρονα υπήρχαν ενδείξεις υβριδισμών με άτομα B. dorsalis. Σε φυλογενετικές αναλύσεις των Nakahara et al. (2008) 6 είδη του συμπλέγματος, τα B. dorsalis, B. papayae, B. carambolae, B. philippinensis, B. occipitalis, και B. kandiensis συμπεριλήφθησαν σε έναν φυλογενετικό κλάδο. Το είδος Bactrocera kandiensis εμφανίστηκε ξεχωριστά σε πιο απομακρυσμένο κλάδο 26

27 από άλλα είδη του συμπλέγματος, σε σχέση με άλλα είδη μεταξύ τους όπως π.χ. τα B. zonata με το B. frauenfeldi, το B. tau και το B. cucumis (Nakahara, 2008) Προσεγγίσεις για τον διαχωρισμό των ειδών του συμπλέγματος B. dorsalis Το σύμπλεγμα B. dorsalis είναι μια ευρεία ομάδα με περισσότερα από 50 αδελφά είδη (Drew and Hanckock, 1994), πολλά από τα οποία θεωρούνταν αρχικά ως ένα μοναδικό είδος, το B. dorsalis. Παρόλα αυτά, βασιζόμενοι στην αναπαραγωγική συμβατότητα μεταξύ των ειδών, πολλοί ερευνητές πρότειναν, κάποια είδη να επανεξεταστούν ως υπο-είδη ενός είδους (Wee et al., 2002). Στην πραγματικότητα όμως υπάρχουν έρευνες που δείχνουν ότι η ομάδα αυτή μπορεί να εμφανίζει ακόμα μεγαλύτερη ετερογένεια από ότι αρχικά θεωρούνταν. Η ακριβής ταυτοποίηση των ειδών είναι σημαντική προκειμένου να μελετηθεί σωστά η οικολογία τους, αλλά και για να αναπτυχθούν κατάλληλες τεχνικές και προγράμματα ελέγχου στις χώρες που πλήττονται από τα παράσιτα (Drew and Hancock, 1994). Η έκταση στην οποία τα είδη του συμπλέγματος επηρεάζουν την παραγωγή και την οικονομία στις νοτιοανατολικές περιοχές της Ασίας, καθορίζει την προτεραιότητα στις έρευνες που γίνονται πάνω σε αυτά. Όσον αφορά τη διάκριση των ειδών του συμπλέγματος χρησιμοποιούνται διάφορα διαγνωστικά στοιχεία. Ωστόσο, πολλά από αυτά βασίζονται κυρίως σε μορφολογικούς χαρακτήρες. Συνεπώς τα στοιχεία αυτά είναι κατάλληλα μόνο για δείγματα πολύ καλής ποιότητας και συγκεκριμένα μόνο για ενήλικα άτομα. Λόγω των προβλημάτων αυτών, έχουν γίνει προσπάθειες εστίασης της έρευνας στην εύρεση διαγνωστικών χαρακτηριστικών σε μοριακό επίπεδο (Clarke et al., 2005). Η χρήση γενετικών δεικτών, όπως π.χ. τα γονίδια COI και COII, αποδείχτηκε χρήσιμη στο διαχωρισμό των ειδών του συμπλέγματος B. dorsalis, B. carambolae, B. papayae και B. philippinensis, όπου τα μορφολογικά χαρακτηριστικά δεν μπορούσαν να δώσουν σαφείς απαντήσεις (Muraji and Nakahara, 2002, Nakahara and Muraji, 2008, Krosch et al., 2012a). Η γενετική προσέγγιση μπορεί να παρέχει επιπλέον σταθερούς χαρακτήρες για την ταυτοποίηση στα μη ώριμα στάδια του εντόμου. Ο μεταφασικός καρυότυπος και τα πολυταινικά χρωμοσώματα των προνυμφών χρησιμοποιούνται επιπλέον για το διαχωρισμό των ειδών του συμπλέγματος, συμπεριλαμβανομένου και του είδους B. dorsalis (Clarke et al., 2005). 27

28 Επιπλέον, άλλες μέθοδοι που στηρίζονται στο DNA και συγκεκριμένα στοχεύουν σε μιτοχονδριακές γονιδιακές περιοχές (π.χ. D- loop, 12S, 16S) έχουν συμβάλλει ουσιαστικά στο διαχωρισμό των ειδών B. dorsalis, B. papayae, B. philippinensis, B. carambolae, B. occipitalis και B. kandiensis (Clarke et al., 2005). Όπως είναι λοιπόν φανερό από τα παραπάνω, η διάκριση των ειδών του συμπλέγματος σε διακριτά ή μη είδη, δεν είναι μια εύκολη διαδικασία. Η μορφολογική προσέγγιση δεν είναι επαρκής, ενώ η κυτταρογενετική και η μοριακή ανάλυση θωρούνται απαραίτητες για τέτοιου είδους έρευνες. Μια κυτταρογενετική μελέτη των μιτωτικών και των πολυταινικών χρωμοσωμάτων ενός είδους και η σύγκρισή τους με τα αντίστοιχα ενός άλλου, γνωστού και μελετημένου είδους της οικογένειας, μπορεί να καταδείξει τη σχέση που υπάρχει μεταξύ των δύο. Επιπλέον, μια μοριακή ανάλυση σε επίπεδο DNA και ιδιαίτερα του μιτοχονδριακού DNA μπορεί να επιβεβαιώσει επιπλέον την φυλογενετική στενή ή μη σχέση των δύο ειδών. Φυσικά, απώτερος στόχος τέτοιων ερευνών είναι, εκτός από τις βιολογικές γνώσεις πάνω στα είδη, και η ανάπτυξη τεχνικών και μεθοδολογιών ελέγχου και περιορισμού των καταστρεπτικώνπαρασιτικών ειδών εντόμων. 1.4 Μέθοδοι ελέγχου και περιορισμού των ειδών της οικογένειας Tephritidae Κατά τη διάρκεια των προηγούμενων δεκαετιών υπήρξε αξιοσημείωτο ενδιαφέρον για την ανάπτυξη τεχνικών και μεθόδων σχετικά με το βιολογικό έλεγχο παρασιτικών εντόμων. Οικογένεια εντόμων που ανήκει σε αυτήν την κατηγορία είναι η Tephritidae που τοποθετούνται ανάμεσα στα πιο καταστρεπτικά παρασιτικά είδη του κόσμου (White and Elson-Harris, 1992). Τεχνικές βιολογικού ελέγχου των ειδών αυτών είναι η εισαγωγή φυσικών εχθρών, τα συστήματα μαζικής παγίδευσης και η τεχνική SIT (Sterile Insect Technique) (Kapatos, 1989). Έως και την προηγούμενη δεκαετία, αλλά ακόμα και μεταγενέστερα, η διαχείριση και ο έλεγχος των παρασιτικών εντόμων της οικογένειας Tephritidae πραγματοποιούνταν είτε με οργανοφωσφορικά εντομοκτόνα, τα οποία σκοτώνουν τα ενήλικα άτομα και τις προνύμφες, είτε με ειδικά σπρέι που προσελκύουν και σκοτώνουν τα ενήλικα άτομα (εικόνα 16). Η δράση τους στηρίζεται στο γεγονός ότι περιέχουν ουσίες που προσελκύουν τα θηλυκά ενήλικα άτομα, ενώ ταυτόχρονα 28

29 περιέχουν και κάποιο εντομοκτόνο. Ωστόσο, η εκτεταμένη χρήση ισχυρών χημικών εντομοκτόνων, σε συνδυασμό με την περιβαλλοντική ρύπανση, τα χημικά κατάλοιπα στα τρόφιμα και στο νερό, καθώς και οι πιθανές επιπτώσεις τους στη ζωή και στην υγεία του ανθρώπου επέβαλλαν την εύρεση τεχνικών και στρατηγικών που θεωρούνται περιβαλλοντικά φιλικές. Εικόνα 16: Ψεκασμός των φυτών με κατάλληλα χημικά σπρέι που προσελκύουν τα θηλυκά άτομα (2) Τεχνική SIT Η τεχνική SIT (Sterile Insect Technique) αποτελεί έναν σημαντικό παράγοντα των προγραμμάτων διαχείρισης παρασιτικών εντόμων (Area Wide Integrated Pest Management, AW-IPM- programmes). Πρόκειται για μια τεχνική που στόχο έχει την εισαγωγή γενετικά στείρων αρσενικών ατόμων στο φυσικό περιβάλλον. Η εφαρμογή της σε διάφορα προγράμματα και η χρήση της εναντίον νέων ειδών, συνεχίζει να αποκαλύπτει πεδία στα οποία η τεχνολογία μπορεί να την βελτιώσει. Με την ανάπτυξη των τεχνικών στο χώρο της Γενετικής και της Μοριακής Βιολογίας, αναπτύχθηκαν στρατηγικές που μπορούν να επιτρέψουν το χειρισμό συγκεκριμένων βιολογικών χαρακτηριστικών προκειμένου να παραχθούν στελέχη πληθυσμών κατάλληλα για την εφαρμογή της τεχνικής SIT. Ένα τέτοιο παράδειγμα βελτιωμένης τεχνολογίας είναι η περίπτωση των προγραμμάτων που εφαρμόστηκαν για τη Μεσογειακή μύγα Ceratitis capitata (Rendόn et al., 2000, 2004). Στο μέλλον αναμένεται ότι τέτοια προγράμματα θα πραγματοποιηθούν και για άλλα είδη εντόμων με αγρονομική ή υγειονομική σημασία (Frantz, 2005, p.427). Βασιζόμενοι στην αναπαραγωγική βιολογία των περισσότερων εντόμων, καθώς και στις βασικές αρχές της τεχνικής SIT, είναι φανερό ότι τα στείρα αρσενικά άτομα που απελευθερώνονται στο περιβάλλον είναι σημαντικά για την αποτελεσματικότητα της τεχνικής. Τα θηλυκά άγρια άτομα προσδιορίζουν το μέγεθος του πληθυσμού της 29

30 επόμενης γενιάς, ενώ τα αρσενικά άγρια άτομα, ή πιο συγκεκριμένα οι γαμέτες που παράγουν, είναι παρόντα σε τέτοια έκταση, που θα ήταν απαραίτητη η απομάκρυνση του 99% των γαμετικών κυττάρων που παράγουν, πριν επιτευχθεί μια σημαντική μείωση του μεγέθους της επόμενης γενιάς (Koyama et al., 1984). Η στειρότητα εισάγεται σε έναν άγριο πληθυσμό μόνο μέσω των αρσενικών ατόμων, ακόμα και όταν απελευθερώνονται και θηλυκά στείρα άτομα. Δεδομένης αυτής της αρχής, η μέθοδος ονομαζόταν αρχικά «μέθοδος στείρων αρσενικών» ( sterile-male method ) (Knipling, 1959). Ωστόσο, την εποχή της δεκαετίας του 1960 το μοναδικό πρόγραμμα AW-IPM που εισήγαγε την τεχνολογία SIT εναντίον του είδους Cochliomyia hominivorax χρησιμοποίησε στείρα άτομα και των δύο φύλων. Το όνομα της μεθόδου είχε ως στόχο να υπογραμμίσει το γεγονός ότι μόνο τα στείρα αρσενικά άτομα αποτελούν ενεργό παράγοντα στην τεχνική αυτή. Όπως έγινε ιδιαίτερα εμφανές από την περίπτωση της Μεσογειακής μύγας από τους McInnis et al. (1994) και Rendόn et al. (2000, 2004), η απελευθέρωση στείρων ατόμων και των δύο φύλων είναι λιγότερο αποτελεσματική σε σχέση με την απελευθέρωση αποκλειστικά αρσενικών στείρων ατόμων προκειμένου να εισαχθεί η στειρότητα σε έναν άγριο πληθυσμό και το γεγονός αυτό πιθανώς βρίσκει εφαρμογή για τα περισσότερα είδη. Ο προφανής λόγος είναι ότι τα στείρα αρσενικά και τα στείρα θηλυκά άτομα που απελευθερώνονται στο περιβάλλον τείνουν να αναπαράγονται μεταξύ τους. Συνεπώς, η αναλογία της αναπαραγωγής μεταξύ στείρων αρσενικών και φυσιολογικών θηλυκών ατόμων μειώνεται με αποτέλεσμα μικρότερο ποσοστό στειρότητας να εισάγεται στον άγριο πληθυσμό (Frantz, 2005, p.427). Η τεχνική SIT έχει εφαρμοστεί ευρέως ενάντια σε είδη της οικογένειας Tephritidae. Μεγάλη πρόοδος και εκτεταμένη έρευνα άρχισε να πραγματοποιείται από τα τέλη της δεκαετίας του 1950 (Klassen et al., 1994), ενώ το πρώτο πρόγραμμα μεγάλης κλίμακας που πραγματοποιήθηκε στη διάρκεια της δεκαετίας του 1970 κατόρθωσε να σταματήσει την εισβολή τους είδους Ceratitis capitata από την Κεντρική Αμερική στο νότιο Μεξικό (Hendrichs et al., 1982). Έρευνες σχετικά με την πιθανότητα χρήσης της τεχνικής SIT για την εξάλειψη πληθυσμών ειδών όπως το Ceratitis capitata, τo Bactrocera cucurbitae και το Bactrocera dorsalis ξεκίνησαν το 1955 στην Χαβάη (Steiner and Christenson, 1956). Επίσης, πριν το 1960 πρωτοπόρες έρευνες είχαν πραγματοποιηθεί και για το είδος Bactrocera tryoni στην Αυστραλία και για το είδος Anastrepha ludens στο Μεξικό και στις ΗΠΑ (Klassen and Curtis, 30

31 2005, p. 5). Στην Ιαπωνία, η τεχνική αυτή υιοθετήθηκε κατά τις δεκαετίες του 1980 και 1990 με στόχο την εξάλειψη του είδους Bactrocera cucurbitae, επιτρέποντας στα φρούτα και στα λαχανικά που παράγονταν στις επί μέρους περιοχές της χώρας που πλήττονταν, να εισαχθούν στην κυρίως αγορά της Ιαπωνίας (Kuba et al., 1996). Στην περίπτωση της Χιλής, η μέθοδος SIT κατόρθωσε να εξαλείψει ολοκληρωτικά τη Μεσογειακή μύγα, με αποτέλεσμα μέχρι το 1995 η χώρα να είναι σε θέση να παράγει τεράστιες ποσότητες φρούτων που μπόρεσαν να εξαχθούν στις αγορές των ΗΠΑ, χωρίς να εφαρμόζονται μέτρα καραντίνας, γεγονός που αποτέλεσε ισχυρό πλεονέκτημα για την οικονομία της χώρας. Αντίστοιχο παράδειγμα, αποτελεί και η Αργεντινή, που με προγράμματα εξάλειψης της Μεσογειακής μύγας, κατέστησαν ελεύθερες από αυτήν διάφορες περιοχές παραγωγής εμπορεύσιμων φρούτων (Klassen and Curtis, 2005, p. 5). Με την ανάπτυξη της τεχνολογίας SIT, στόχος είναι οι μειωμένες απώλειες παραγωγής, καθώς και η μειωμένη χρήση εντομοκτόνων και όχι η εξάλειψη των παρασιτικών ειδών εντόμων. Τέτοια προγράμματα έχουν εφαρμοστεί μεταξύ άλλων και στο Ισραήλ, τη Νότια Αφρική, την Ταϋλάνδη, τη Βραζιλία, την Πορτογαλία, την Ισπανία και την Τυνησία. Επιπλέον, για να προληφθεί η εξάπλωση της Μεσογειακής μύγας στις ΗΠΑ μέσω μολυσμένων φρούτων εισαγωγής, στείρα αρσενικά άτομα απελευθερώνονται στο περιβάλλον σε τακτά χρονικά διαστήματα σε διάφορες περιοχές, με αποτέλεσμα η χρήση σπρέι να μην είναι πλέον απαραίτητη στις περιοχές αυτές (Klassen and Curtis, 2005, p. 5) Οφέλη της μεθόδου SIT Ανεπαρκείς πρακτικές ελέγχου των παρασιτικών ειδών ή μη έλεγχος έχει ως αποτέλεσμα άμεσες και έμμεσες απώλειες από τα είδη της οικογένειας Tephritidae. Αντιθέτως, σημαντικά οφέλη σημειώνονται όταν χρησιμοποιούνται πιο αποτελεσματικές εναλλακτικές μέθοδοι ελέγχου όπως είναι η SIT. Ένα παράδειγμα έμμεσης απώλειας είναι οι δευτερογενείς εκρήξεις πληθυσμών των παρασιτικών εντόμων, που είναι αποτέλεσμα της εξάλειψης των φυσικών εχθρών τους λόγω της χρήσης εντομοκτόνων σπρέι. Με την χρήση μιας αποτελεσματικής και περιβαλλοντικά φιλικής τεχνολογίας ελέγχου, η χρήση των εντομοκτόνων μειώνεται και συνεπώς μεγαλύτερος αριθμός φυσικών εχθρών επιβιώνει για να καταστείλει τον 31

32 πληθυσμό- στόχο. Σε αυτήν την περίπτωση, μια έμμεση απώλεια της τάξης του 10% μπορεί να μετατραπεί σε 10% έμμεσο όφελος (Enkerlin, 2005, p. 653). Στα άμεσα οφέλη που χρησιμοποιούνται για να αξιολογήσουν την αποτελεσματικότητα προγραμμάτων που χρησιμοποιούν την SIT είναι (Enkerlin, 2005, p. 653) η αύξηση της παραγωγής και της ποιότητας των εμπορεύσιμων ειδών μέσω της μείωσης της καταστροφής από τα παράσιτα, η μείωση του κόστους παραγωγής μέσω μιας οικονομικότερης και αποτελεσματικότερης μεθόδου ελέγχου. Στα έμμεσα οφέλη (Enkerlin, 2005, p. 653) περιλαμβάνονται η αύξηση του όγκου των εξαγόμενων φρούτων και λαχανικών, ταυτόχρονα αύξηση των εξαγωγών, μέσω της μείωσης της απόρριψης των εμπορευμάτων που δεν συνάδουν με τα επιτρεπτά επίπεδα χρήσης εντομοκτόνων, κ.ά. Συνεπώς η γνώση της γενετικής και της κυτταρογενετικής των ειδών της οικογένειας Tephritidae να έχει αποσπάσει τόσο μεγάλη ερευνητική προσοχή, με στόχο την εισαγωγή νέων τεχνικών περιορισμού και ελέγχου (Kounatidis et al., 2008, Stratikopoulos et al., 2009, Drosopoulou et al., 2011, Zacharopoulou et al., 2011). Η ανάπτυξη τέτοιων μεθόδων στηρίζεται στη γενετική των ειδών προκειμένου να εμφανίζουν εξειδίκευση απέναντι στα διαφορετικά είδη. Συνεπώς απαραίτητη είναι η κατανόηση και η γνώσης της βιολογίας, της οικολογίας και της γενετικής των ειδώνστόχων (Mavragani et al., 2002). Σημαντικά εργαλεία στη γνώση αυτή αποτελούν τα χρωμοσώματα των ειδών των Διπτέρων, τα οποία έχουν καταγραφεί αναλυτικά για διάφορα είδη. Σε κυτταρολογικό επίπεδο, η μελέτη των πολυταινικών χρωμοσωμάτων, αλλά και του μιτωτικού καρυοτύπου ενός είδους μπορεί να συμβάλει στη σύγκριση συγγενικών ειδών και στον χαρακτηρισμό- προσδιορισμό του είδους (Hunwattanakul and Baimai, 1994, Baimai et al., 1995, Baimai, 1998, 1999a, b, 2000). 1.5 Χρωμοσώματα Μεταφασικά χρωμοσώματα Στα πρώτα στάδια της μίτωσης, η χρωματίνη συμπυκνώνεται διαρκώς, ενώ ταυτόχρονα παύει κάθε γενετική δραστηριότητα, καθώς μετατρέπεται σε μια δομή με μέγιστο βαθμό συμπύκνωσης και συσπείρωσης. Αυτός ο μέγιστος βαθμός συσπείρωσης καθιστά τα χρωμοσώματα ορατά με χαρακτηριστική μορφή. 32

33 Τα μεταφασικά χρωμοσώματα πρόκειται για διπλασιασμένα χρωμοσώματα, αποτελούνται δηλαδή από τις αδελφές χρωματίδες που συνδέονται μεταξύ τους στο κεντρομέρος. Το κεντρομέρος χωρίζει μια χρωματίδα σε δύο βραχίονες. Οι μικροί βραχίονες χαρακτηρίζονται με το γράμμα «p», από τη γαλλική λέξη petit, που σημαίνει μικρός. Οι μεγάλοι βραχίονες χαρακτηρίζονται με το γράμμα «q», καθώς το γράμμα αυτό έπεται από το γράμμα p στο λατινικό αλφάβητο. Ένα χαρακτηριστικό που παρατηρείται σε όλα τα δίπτερα, είναι ότι τα μιτωτικά αυτοσωμικά ομόλογα χρωμοσώματα εμφανίζονται συχνά κατά ζεύγη (εικόνα 17), τοποθετημένα το ένα δίπλα στο άλλο (Radu et al., 1975, Bedo, 1986, Zacharopoulou et al., 1987). Εικόνα 17: Μεταφασικά χρωμοσώματα του είδους Ceratitis capitata (Zacharopoulou et al., 1987) Με την παρατήρηση των παρασκευασμάτων των μεταφασικών χρωμοσωμάτων, μπορεί να μελετηθεί ο καρυότυπος του είδους. Ως καρυότυπος ορίζεται το σύνολο των μεταφασικών χρωμοσωμάτων ενός σωματικού κυττάρου ενός οργανισμού, όπου διακρίνονται τα ποσοτικά και ποιοτικά χαρακτηριστικά τους. Ο καρυότυπος της μεγάλης πλειοψηφίας των ειδών της οικογένειας Tephritidae που έχουν αναλυθεί μέχρι σήμερα, αποτελείται από 6 ζεύγη χρωμοσωμάτων, συμπεριλαμβανομένου και ενός ζεύγους φυλετικών χρωμοσωμάτων (ΧΧ/ΧΥ) (εικόνα 18). Ως ετερογαμετικά εμφανίζονται τα αρσενικά άτομα (Mavragani-Tsipidou et al., 1992, Hunwattanakul and Baimai, 1994, Baimai et al., 1995, 2000, Zhao et al., 1998, Kounatidis et al., 2008, Drosopoulou et al., 2010, 2011). 33

34 α) β) Εικόνα 18: Μεταφασικά χρωμοσωμάτα του είδους Bactrocera dorsalis, όπου επισημαίνονται τα φυλετικά χρωμοσώματα. α) Αρσενικό άτομο, β) Θηλυκό άτομο (Zacharopoulou et al., 2011) Παρόλο που έχει παρατηρηθεί ποικιλότητα στο μήκος των φυλετικών χρωμοσωμάτων, ο καρυότυπος των θηλυκών και των αρσενικών ατόμων στα περισσότερα είδη διαχωρίζεται εύκολα, λόγω του ετερομορφικού ζεύγους ΧΥ. Σε λίγα μόνο είδη το Χ και το Υ χρωμόσωμα είναι πολύ όμοια σε μήκος (εικόνα 19), κάνοντας την αναγνώριση του φύλου του ατόμου δύσκολη (Goeden, 1993, Kounatidis et al., 2008, Drosopoulou et al., 2010, 2011). α) β) Εικόνα 19: Μιτωτικά μεταφασικά χρωμοσώματα του είδους Rhagoletis cingulata όπου διακρίνεται η ομοιότητα στο μέγεθος των δύο φυλετικών χρωμοσωμάτων Χ και Υ. α) θηλυκό άτομο, β) αρσενικό άτομο (Drosopoulou et al., 2011) Πολυταινικά χρωμοσώματα Τα πολυταινικά χρωμοσώματα είναι μεσοφασικά χρωμοσώματα που αποτελούνται από χιλιάδες μόρια DNA. Για το λόγο αυτό είναι ιδιαίτερα μεγάλα και εμφανίζουν χαρακτηριστική μορφολογία ζωνώσεων (εικόνα 20). Η πολυταινία εμφανίζεται σε ιστούς, όργανα και αναπτυξιακά στάδια κατά τα οποία υπάρχει αυξημένη ανάγκη ταχείας ανάπτυξης ενός οργάνου με σταθερά υψηλό επίπεδο λειτουργίας. Όργανα που περιέχουν κύτταρα με πολυταινικά χρωμοσώματα, 34

35 εμπλέκονται κατά κανόνα σε έντονες εκκριτικές λειτουργίες που πραγματοποιούνται σε σύντομο χρονικό διάστημα στα πλαίσια ταχείας ανάπτυξης. Οι χρωμοσωμικές ανακατατάξεις και ο υβριδισμός in situ στα πολυταινικά χρωμοσώματα επιτρέπουν την χαρτογράφηση των γονιδίων σε ανάλυση των μερικών δεκάδων χιλιάδων βάσεων (Zhimulev and Koryakov, 2009). Εικόνα 20: Πολυταινικός πυρήνας του είδους Bactrocera dorsalis. Με την ένδειξη Ch επισημαίνεται η πυκνή ετεροχρωματινική μάζα (Zacharopoulou et al., 2011) Τα πολυταινικά χρωμοσώματα ανακαλύφθηκαν πρώτη φορά από τον Balbiani το 1881 σε ιστούς προνυμφών, όπως οι σιελογόνοι αδένες, τα Μαλπιγγειανά σωληνάρια, το έντερο, τον υποδόριο ιστό και τους μυς του είδους Chironomus plumosus, ως μια εκτεταμένη κυλινδρική δομή που καταλάμβανε το χώρο του πυρήνα. Ωστόσο, η κληρονομική φύση των δομών αυτών δεν επιβεβαιώθηκε μέχρι που μελετήθηκε στο είδος Drosophila melanogaster στις αρχές της δεκαετίας του 1930 από τους Heitz και Bauer. Κατά τα έτη , τρεις ερευνητικές ομάδες (Painter, 1933, Heitz and Bauer, 1933, King and Beams, 1934), χρησιμοποιώντας κατάλληλη προεργασία, έδειξαν ότι αυτή η δομή δεν είναι μια ενιαία δομή, αλλά αποτελείται από ξεχωριστά στοιχεία, ο αριθμός των οποίων είναι κοντά στον απλοειδή αριθμό των μιτωτικών χρωμοσωμάτων. Κάθε στοιχείο σχηματίζεται ως αποτέλεσμα στενής σύναψης των ομόλογων χρωμοσωμάτων και συντίθεται από τμήματα, που σχηματίζουν ένα συγκεκριμένο μοτίβο ζωνώσεων (εικόνα 21) (Zhimulev and Koryakov, 2009). 35

36 Εικόνα 21: Συσχέτιση ανάμεσα στα μεταφασικά και τα πολυταινικά χρωμοσώματα (18) Η σχέση ανάμεσα στα πολυταινικά χρωμοσώματα- που τότε ήταν γνωστά ως «γιγαντιαία χρωμοσώματα»- και των φυσιολογικών μιτωτικών χρωμοσωμάτων, προτάθηκε πρώτη φορά από τον Rambousek (1912) και στη συνέχεια από τους Kostoff (1930), Koltzoff (1934) και Bauer (1935). Αδιαμφισβήτητα στοιχεία για τη χρωμοσωμική φύση των δομών αυτών ήρθαν στο φως από τον Painter το Χρησιμοποιώντας μια σειρά χρωμοσωμικών ανακατατάξεων, που ήταν αποτέλεσμα θραύσεων σε γνωστές περιοχές στα χρωμοσώματα, κατάφερε να χαρτογραφήσει 22 γονίδια και να καταδείξει την πλήρη γραμμική αντιστοιχία της θέσης τους σε γενετικούς και χρωμοσωμικούς χάρτες, τόσο μιτωτικών όσο και πολυταινικών χρωμοσωμάτων (Zhimulev and Koryakov, 2009). Το γιγαντιαίο μέγεθος των χρωμοσωμάτων των σιελογόνων αδένων εξηγήθηκε από τον Koltzoff (1934) ως αποτέλεσμα της σύνδεσης πολλών κλώνων. Ο όρος «πολυταινικά» εισήχθη πρώτη φορά από τον Koller (1935) και υιοθετήθηκε από τον Darlington (1937). Τα πολυταινικά χρωμοσώματα θεωρούνται σήμερα πολύ σημαντικό εργαλείο για την ανάλυση πολυάριθμων χαρακτηριστικών της μεσοφασικής οργάνωσης των χρωμοσωμάτων και του γονιδιώματος στο σύνολό του. Ειδικά κύτταρα λοιπόν που εντοπίζονται σε διάφορα είδη εντόμων, αλλά ακόμα και σε πρώτιστα, φυτά και θηλαστικά, υφίστανται επαναλαμβανόμενους κύκλους αντιγραφής του DNA, χωρίς όμως να ακολουθεί κυτταροπλασματική διαίρεση. Συμβαίνουν ενδομιτωτικές διαιρέσεις που έχουν ως αποτέλεσμα να αυξάνεται ο όγκος του κυττάρου και να σχηματίζονται μεγάλα πολυταινικά χρωμοσώματα. Η δομή των χρωμοσωμάτων αυτών είναι αποτέλεσμα πολλών διαδοχικών αντιγραφών 36

37 που παράγουν αδελφές χρωματίδες οι οποίες παραμένουν συνδεδεμένες. Τα πολυταινικά χρωμοσώματα φτάνουν σε μήκος τα 200 μm, με τα νημάτια να διαιρούνται, αλλά να μην αποχωρίζονται, σχηματίζοντας τη γνωστή γιγαντιαία δομή (Zhimulev and Koryakov, 2009) Ιδιαιτερότητες των πολυταινικών χρωμοσωμάτων Κύτταρα με πολυταινικά χρωμοσώματα διαφέρουν με διάφορους τρόπους από τα μιτωτικά διαιρούμενα κύτταρα και από τα κύτταρα που υφίστανται ενδομίτωση. Πρώτον, ο σχηματισμός των πολυταινικών χρωμοσωμάτων σχετίζεται με την εξάλειψη ολόκληρου του μηχανισμού της μίτωσης, μετά από κάθε αυτοδιπλασιασμό του DNA. Ο κυτταρικός κύκλος που συμβαίνει στον πολυταινισμό πραγματοποιείται κατά το ενδιάμεσο στάδιο της εμβρυογένεσης, όπως έχει δειχθεί στο είδος Drosophila melanogaster. Επίσης, στο τέλος κάθε περιόδου αντιγραφής, τα δύο δίκλωνα μόρια του DNA δεν διαχωρίζονται, αλλά αντιθέτως παραμένουν ζευγαρωμένα μεταξύ τους, σε διάφορα επίπεδα. Είναι γνωστό ότι το γονίδιο esg (escargot gene) στο δίπτερο έντομο D. melanogaster είναι απαραίτητο για τη διατήρηση των εμβρυϊκών δίσκων στον κύκλο των διπλοειδών κυττάρων. Το γονίδιο αυτό φυσιολογικά δεν είναι ενεργό στους προνυμφικούς ιστούς που περιέχουν πολυταινικά χρωμοσώματα. Η τεχνητή έκφρασή του σε τέτοιους ιστούς, όπως για παράδειγμα στους σιελογόνους αδένες, έχει δείξει ότι αναστέλλει την πολυταινία. Επιπλέον, τα πολυταινικά χρωμοσώματα δεν μπορούν να πραγματοποιήσουν μίτωση, ενώ τέλος, στην πολυταινία η πυρηνική μεμβράνη και ο πυρηνίσκος παραμένουν άθικτοι κατά τους συνεχείς κύκλους αντιγραφής του DNA (Zhimulev and Koryakov, 2009). Η πολυταινία εμφανίζεται και επιτυγχάνεται σε υψηλά επίπεδα σε όργανα, ιστούς και κύτταρα με μεγάλες αναπτυξιακές, άρα και μεταγραφικές ανάγκες, όπως προαναφέρθηκε. Τα πολυταινικά χρωμοσώματα εμφανίζουν μεταβολικό πλεονέκτημα, καθώς τα πολλαπλά αντίγραφα των γονιδίων επιτρέπουν ένα υψηλό επίπεδο γονιδιακής έκφρασης (Zhimulev and Koryakov, 2009). Χαρακτηριστικό είναι το παράδειγμα στο είδος D. melanogaster, όπου τα κύτταρα των σιελογόνων αδένων της προνύμφης υφίστανται πολλές ενδομιτωτικές διαιρέσεις, με στόχο την παραγωγή μεγάλων ποσοτήτων μιας ουσίας απαραίτητης για τη μετατροπή της σε νύμφη. Τα χαρακτηριστικά της πολυταινίας παρέχουν τις απαραίτητες συνθήκες για την επίτευξη των λειτουργιών αυτών. Καθώς ο μηχανισμός πυρηνικής και κυτταρικής 37

38 διαίρεσης είναι ολοκληρωτικά μπλοκαρισμένος κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου, η διαδικασία του διπλασιασμού των χρωμοσωμάτων φτάνει σε υψηλά επίπεδα απλοποίησης και ταχύτητας. Η μείωση σε αυτά τα δύο πεδία, φυσικά προσφέρει σημαντικό πλεονέκτημα από άποψη ενέργειας και χρόνου. Συνεπώς, το μέγεθος ενός οργάνου αυξάνεται σε ένα αρκετά μεγαλύτερο ποσοστό ως αποτέλεσμα του πολυταινισμού, από ότι θα μπορούσε να επιτευχθεί με τη μιτωτική διαίρεση των διπλοειδών κυττάρων. Επίσης, είναι προφανές ότι ένας πολυταινικός κυτταρικός κύκλος εξασφαλίζει τη διατήρηση υψηλής λειτουργικής δραστηριότητας στο όργανο, αποφεύγοντας τις διακοπές της γονιδιακής δραστηριότητας που προκύπτουν από μια μιτωτική διαίρεση (Zhimulev and Koryakov, 2009) Μορφολογία των πολυταινικών χρωμοσωμάτων Η μορφολογία των πολυταινικών χρωμοσωμάτων μπορεί να ποικίλει ευρέως, χάρη στα διαφορετικά επίπεδα της σύναψης μορίων DNA. Κάθε κλώνος σε ένα πολυταινικό χρωμόσωμα μπορεί να οριστεί ως χρωματίδα. Τα πολυταινικά χρωμοσώματα αναπτύσσονται από χρωμοσώματα διπλοειδών πυρήνων, έπειτα από τον διπλασιασμό κάθε χρωμοσωμικού στοιχείου (χρωματίδα). Αν η σύναψη των ομόλογων χρωματίδων είναι μέγιστη, σχηματίζονται τα κλασσικά πολυταινικά χρωμοσώματα, όπως αυτά στο είδος D. melanogaster (εικόνα 22). Σύναψη δύο ομόλογων πολυταινικών χρωμοσωμάτων συμβαίνει όταν αυτά εμφανίζονται με τη μορφή ενός συγχωνευμένου. Η χρωμοσωμική σύναψη πραγματοποιείται με εξαιρετική ακρίβεια, ζώνη προς ζώνη, δίνοντας την εικόνα ενός μοναδικού χρωμοσώματος. Έτσι, το τελικό αποτέλεσμα είναι ο αριθμός των πολυταινικών χρωμοσωμάτων να αντιστοιχεί στον απλοειδή αριθμό των αυτοσωμικών χρωμοσωμάτων. 38

39 α) β) Εικόνα 22: α) Σχέδιαγραμματική απεικόνιση πολυταινικών χρωμοσωμάτων του είδους Drosophila melanogaster (Zhimulev and Koryakov, 2009). β) Εικόνα πολυταινικών χρωμοσωμάτων του ίδιου είδους από οπτικό μικροσκόπιο (1) Ωστόσο, το επίπεδο της σύνδεσης των χρωματίδων μπορεί να ποικίλει (εικόνα 23). Έντονες διαφορές στο επίπεδο της σύνδεσης αυτής μπορεί να σχετίζονται με ιστοειδικά χαρακτηριστικά του κυττάρου, με την περίπτωση που ένα άτομο αποτελεί υβρίδιο, ενώ επίσης έχουν καταγραφεί διαφορές στη μορφολογία των πολυταινικών χρωμοσωμάτων ακόμα και ανάλογα με τις περιβαλλοντικές συνθήκες (θερμοκρασία, διατροφή, κ.ά.) που βιώνει ο οργανισμός (Zhimulev and Koryakov, 2009) Εικόνα 23: Περιπτώσεις διαφορετικών επιπέδων σύναψης στον βραχίονα ΙΙΙR του είδους Rhagoletis cerasi (Kounatidis et al., 2008) Σε πολλούς πολυταινικούς πυρήνες, τα μη ομόλογα χρωμοσώματα συνδέονται σε κεντρομερικές περιοχές σχηματίζοντας ένα κοινό χρωμόκεντρο. Τα χρωμόκεντρα των πολυταινικών χρωμοσωμάτων αντιστοιχούν στην ετεροχρωματίνη των μιτωτικών χρωμοσωμάτων. Χρωμόκεντρα ωστόσο, δεν εμφανίζονται σε όλους τους πολυταινικούς πυρήνες, καθώς στα είδη της οικογένειας Tephritidae που έχουν μελετηθεί δεν έχει εντοπιστεί αντίστοιχη δομή. Κάθε πολυταινικό χρωμόσωμα διαθέτει έναν μεγάλο βραχίονα που χαρακτηρίζεται ως «L» (Left arm) και έναν μικρότερο βραχίονα που χαρακτηρίζεται 39

40 ως «R» (Right arm). Η άκρη (tip) που βρίσκετ-αι στην αρχή κάθε χρωμοσωμικού βραχίονα είναι χαρακτηριστική και επιτρέπει την αναγνώριση και ταυτοποίηση κάθε χρωμοσώματος (εικόνα 24). Εκτός από τα τμήματα αυτά, τα χρωμοσώματα διαθέτουν και άλλες χαρακτηριστικές περιοχές που αποτελούν σημαντικά διαγνωστικά στοιχεία (Zacharopoulou et al., 1987). Εικόνα 24: Χαρακτηριστική άκρη (tip) που αντιστοιχεί στον βραχίονα 1R (a,b) του είδους Bactrocera olea και άκρη που αντιστοιχεί στην αρχή του βραχίονα ΙΙR (c) (Mavragani- Tsipidou et al., 2002) Ζωνικό πρότυπο Κατά τον επιμήκη άξονα κάθε χρωματίδας, η ποικιλία στο βαθμό της συσπείρωσης του DNA και οι αντίστοιχες πρωτεΐνες οδηγούν σε ποικιλομορφία στη συγκέντρωση της χρωματίνης. Περιοχές υψηλής συγκέντρωσης είναι γνωστές ως «χρωμομερή». Για κάθε χρωματίδα το πρότυπο των χρωμομερών είναι εξαιρετικά ειδικό, έτσι που στα πολυταινικά ομόλογα χρωμοσώματα τα χρωμομερή ευθυγραμμίζονται με ακρίβεια κατά μήκος των βραχιόνων και συνήθως εμφανίζονται να διαχέονται σαν μια ενιαία ζώνη σε ένα πολυταινικό στοιχείο. Το πρότυπο των ζωνώσεων σε ένα πολυταινικό χρωμόσωμα είναι γενικά τόσο σταθερό και ειδικό χαρακτηριστικό της οργάνωσης του, που πολλές φορές η κάθε ζώνη μπορεί να αναγνωριστεί, να χαρτογραφηθεί και να χαρακτηριστεί (Zhimulev and Koryakov, 2009). Οι περιοχές των πολυταινικών χρωμοσωμάτων ανάμεσα σε δύο ζώνες ονομάζονται ενδοχρωμομερικές. Επειδή η χρωματίνη που εντοπίζεται στην περιοχή ανάμεσα σε δύο ζώνες είναι λιγότερο συμπυκνωμένη σε σχέση με τη χρωματίνη που αντιστοιχεί σε περιοχές ζωνώσεων, όταν τα χρωμοσώματα παρατηρούνται υπό το φως, φαίνονται σαν πιο ανοιχτόχρωμες ζώνες (εικόνα 25). 40

41 Εικόνα 25: Τμήμα του πολυταινικού βραχίονα ΙΙR του είδους Drosophila melanogaster από ηλεκτρονικό μικροσκόπιο, όπου διακρίνονται οι σκουρόχρωμες και οι ανοιχτόχρωμες ζωνώσεις (Zhimulev and Koryakov, 2009) Η ακριβής αναγνώριση αυτών των ενδιάμεσων τμημάτων στα πολυταινικά χρωμοσώματα είναι δύσκολη, εξαιτίας του μικρού τους μεγέθους. Σύμφωνα με στοιχεία που έχουν συλλεχθεί για πολλά είδη Διπτέρων, το μέγεθος των ενδιάμεσων τμημάτων κυμαίνεται από 0,05 έως 0,38 mm, με έναν μέσο όρο να φτάνει τα 0,1-0,2 mm. Το μοριακό μέγεθος ενός ενδιάμεσου τμήματος φτάνει τα 0,3-3,8 kb. Χρησιμοποιώντας κατάλληλα αντισώματα, πολλές μη ιστονικές πρωτεΐνες μπορούν να εντοπιστούν στις περιοχές αυτές. Ανάμεσα σε αυτές περιλαμβάνονται η RNA πολυμεράση ΙΙ, ριβονουκλεοπρωτεΐνες, κ.ά. Ανάλογα με την οργάνωση των ενδιάμεσων περιοχών, αυτές μπορούν να διακριθούν σε δύο κατηγορίες. Τις ενδιάμεσες περιοχές που αντιστοιχούν σε ρυθμιστικές περιοχές ανενεργών γονιδίων στον ιστό που εμφανίζονται τα πολυταινικά χρωμοσώματα και στις περιοχές που αντιστοιχούν σε γονίδια διαρκώς ενεργά στον ιστό (π.χ. housekeeping genes) (Zhimulev and Koryakov, 2009). Στις περιοχές ανάμεσα στις ζωνώσεις, η συγκέντρωση του DNA και των πρωτεϊνών είναι χαμηλότερη. Οι ζώνες αυτές υποδεικνύουν ότι το πρότυπο των χρωμομερών στα κύτταρα φυσιολογικά λειτουργικών οργάνων είναι σχετικά σταθερό, αλλά η δομή των χρωμομερών και γενικά το πρότυπο των ζωνώσεων μεταβάλλεται όταν οι ενδό- ή οι εξωκυτταρικές συνθήκες μεταβάλλονται (Zhimulev and Koryakov, 2009). Τα μοτίβα αυτά άρχισαν να μελετώνται και να περιγράφονται από πολύ νωρίς. Από τις πρώτες τέτοιες προσπάθειες ήταν και αυτή του Bridges το 1935, ο οποίος περιέγραψε το μοτίβο των πολυταινικών χρωμοσωμάτων της D. melanogaster. Η συγκεκριμένη περιγραφή μάλιστα ήταν τόσο λεπτομερής, που οι αντίστοιχοι χάρτες χρησιμοποιούνται ακόμα και σήμερα. 41

42 Επίπεδο πολυταινισμού Η ανάπτυξη που προκύπτει από την αύξηση του μεγέθους σχετικά λίγων κυττάρων, παρά από την αύξηση του αριθμού των κυττάρων μέσω κυτταρικής διαίρεσης, είναι ένα φαινόμενο γνωστό στα έντομα. Τέτοια ανάπτυξη, συνοδεύεται φυσικά με ταυτόχρονη αύξηση του μεγέθους του πυρήνα και της ποσότητας του γενετικού υλικού. Τα επίπεδα πολυταινίας διαφέρουν στα χρωμοσώματα ανάλογα με τον κυτταρικό τύπο σε ένα όργανο, ανάμεσα στα όργανα, τους οργανισμούς και τα είδη. Σε μια χρωματίδα, δεν πολυταινίζονται όλα τα τμήματα του DNA στο ίδιο επίπεδο. Περιοχές με χαμηλά επίπεδα αντιγραφής κατά τη διάρκεια του πολυταινισμού είναι περισσότερο εμφανή στην περικεντρική ετεροχρωματίνη (εικόνα 26), καθώς και στην ετεροχρωματίνη ενδιάμεσων τμημάτων και των τελομερικών άκρων. Εικόνα 26: Περικεντρική ετεροχρωματίνη στους βραχίονες ΙL, IR (a) και IIL, IIR (b) και στους βραχίονες IIIL και ΙΙΙR του είδους Rhagoletis cingulata (Drosopoulou et al., 2011) Η μεταγραφή που πραγματοποιείται σε υψηλά επίπεδα σε περιοχές των πολυταινικών χρωμοσωμάτων, έχει ως αποτέλεσμα την εμφάνιση ειδικών δομών που χαρακτηρίζονται ως «DNA puffs». Τα puffs αποτελούν μια χαρακτηριστική δομή των πολυταινικών χρωμοσωμάτων και πρόκειται για «διαχυμένες», μη περιελυγμένες περιοχές του χρωμοσώματος που αντιστοιχούν σε θέσεις μεταγραφής (εικόνα 27). Μια τέτοια μεγάλη δομή ονομάζεται δακτύλιος Balbiani. Η έκταση των puffs είναι αυστηρά ειδική σε κάθε ιστό σε διαφορετικό αναπτυξιακό διάστημα (Zhimulev and Koryakov, 2009). 42

43 Εικόνα 27: Εικόνα από ηλεκτρονικό μικροσκόπιο όπου παρατηρείται η δημιουργία puff στη θέση του γονιδίου της εκδυσόνης στο είδος Drosophila melanogaster. α) Η περιοχή του γονιδίου πριν την ενεργοποίησή του, β) το γονίδιο της εκδυσόνης σε ενεργή κατάσταση (Zhimulev and Koryakov, 2009) Ο πολυταινικός πυρήνας των ειδών της οικογένειας Tephritidae Ο πολυταινικός πυρήνας των ειδών Tephritidae που έχουν εξεταστεί αποτελείται από 5 μακριά χρωμοσώματα (εικόνα 28) (Childress, 1969, Bush and Taylor, 1969, Foster et al., 1980, Bedo, 1986, 1987, Zacharopoulou, 1987, 1990, Mavragani- Tsipidou et al., 1992, Zambetaki et al., 1995, Zhao et al. 1998, Gariou- Papalexiou et al., 2002, Shahjahan and Yesmin, 2002, Kounatidis et al. 2008, Giardini et al., 2009, Drosopoulou et al., 2010, 2011a, 2011b, Zacharopoulou et al., 2011a, 2011b, Yesmin and Clyde, 2012, Augoustinos et al., 2014). Εικόνα 28: Πολυταινικός πυρήνας του είδους Bactrocera cucurbitae όπου διακρίνονται 5 πολυταινικά χρωμοσώματα (2-6), που διαιρούνται στους δύο βραχίονες «L» και «R» (Zacharopoulou et al., 2011b) 43

44 Όπως προαναφέρθηκε ο μιτωτικός καρυότυπος αποτελείται από 6 χρωμοσωμικά ζεύγη, συμπεριλαμβανομένου και ενός ετερομορφικού ζεύγους φυλετικών χρωμοσωμάτων (ΧΧ/ΧΥ). Η ανάλυση των πολυταινικών πυρήνων φανερώνει ότι τα 5 πολυταινικά στοιχεία (10 χρωμοσωμικοί βραχίονες) αντιστοιχούν στα 5 ζεύγη των αυτοσωμικών χρωμοσωμάτων, ενώ τα φυλετικά χρωμοσώματα εμφανίζουν μικρό ποσοστό αντιγραφής και σχηματίζουν ένα πυκνό ετεροχρωματινικό δίκτυο που εντοπίζεται στους πολυταινικούς πυρήνες πολλών ειδών Tephritidae (εικόνα 29) (Childress 1969, Bedo, 1982, 1987, Bedo and Zacharopoulou, 1988, Mavragani- Tsipidou et al., 1992, Semeshin et al., 1995, Shahjahan and Yesmin, 2002, Kounatidis et al., 2008, Drosopoulou et al., 2010, 2011, Zacharopoulou et al., 2011, Drosopoulou et al., 2012). Εικόνα 29: Ετεροχρωματινική μάζα που αντιστοιχεί στα μη πολυταινισμένα φυλετικά χρωμοσώματα του είδους Rhagoletsi cingulata (Drosopoulou et al., 2011) Η πρώτη ένδειξη αντιστοιχίας των φυλετικών χρωμοσωμάτων με την κοκκιώδη μάζα των πολυταινικών πυρήνων παρατηρήθηκε στη μύγα της Μεσογείου, C. capitata, μέσω της τεχνικής FISH, χρησιμοποιώντας ανιχνευτή του γονιδίου των κερατοτοξινών, που εντοπίζεται στο Χ χρωμόσωμα (Rosetto et al., 2000). Σε πρόσφατες μελέτες, με τη χρήση της τεχνικής FISH στο είδος Bactrocera oleae, ανιχνεύθηκε άμεσα η θέση των χρωμοσωμάτων Χ και Υ αποκλειστικά στο ετεροχρωματινικό δίκτυο του πολυταινικού πυρήνα, με τη χρήση κατάλληλων ανιχνευτών των φυλετικών χρωμοσωμάτων. Φαίνεται ότι το χρωμόσωμα Χ αποτελεί το μεγαλύτερο τμήμα του δικτύου αυτού, ενώ το χρωμόσωμα Υ περιορίζεται σε ένα μικρό, συμπυκνωμένο σωμάτιο (εικόνα 30). Το γεγονός ότι τα φυλετικά χρωμοσώματα δεν σχηματίζουν πολυταινικά στοιχεία στους πυρήνες αυτούς φανερώνει αδιαμφισβήτητα το χαμηλό ρυθμό αυτοδιπλασιασμού τους. Ωστόσο, δεν 44

45 πρέπει να αγνοείται το γεγονός ότι το ετεροχρωματινικό δίκυτο που σχηματίζεται από τα χρωμοσώματα Χ καταλαμβάνει έναν αξιοσημείωτο χώρο στον πολυταινικό πυρήνα (Drosopoulou et al., 2012). Εικόνα 30: Με τη χρήση της τεχνικής FISH εντοπίζεται η θέση του Χ χρωμοσώματος στην ετεροχρωματίνη ενός πολυταινικού πυρήνα του είδους Bactrocera olea (βέλη- κόκκινο χρώμα), ενώ με το πράσινο χρώμα διακρίνεται το χρωμόσωμα Υ (Drosopoulou et al., 2012) Χρησιμότητα πολυταινικών χρωμοσωμάτων Η κυτταρογενετική ανάλυση των Διπτέρων έχει διευκολυνθεί ιδιαίτερα από την ύπαρξη των πολυταινικών χρωμοσωμάτων. Από την πρώτη δημοσίευση του Bridges, το 1935 (Bridges, 1935), τα πολυταινικά χρωμοσώματα έχουν αποδειχθεί εξαιρετικό πειραματικό εργαλείο σε κυτταρογενετικές και γενετικές μελέτες. Χρησιμοποιούνται για τη μελέτη της δομής και της λειτουργίας των χρωμοσωμάτων, για τη μελέτη της παροδικής γονιδιακής δράσης, για τη μελέτη της γονιδιωματικής οργάνωσης και των φυλογενετικών σχέσεων μεταξύ των ειδών (Carson and Yoon, 1982, Lacovaara and Saura, 1982, Lemeunier et al., 1986), καθώς και σε μελέτες διάκρισης των μελών ενός συμπλέγματος ειδών (Clayton and Guest, 1986, Krimbas and Powell, 1992, Zhimulev et al., 2004). Τα πολυταινικά χρωμοσώματα χρησιμοποιούνται ως εργαλείο για την κατάταξη ορισμένων ειδών και για τη μελέτη της γενετικής ποικιλότητας σε είδη που παρουσιάζουν μεγάλο εύρος. Μορφολογικά, τα πολυταινικά χρωμοσώματα εμφανίζουν χαρακτηριστικά πρότυπα ανοιχτόχρωμων και σκουρόχρωμων ζωνώσεων. 45

46 Οι ζωνώσεις αυτές επιτρέπουν την ταυτοποίηση χρωμοσωμικών ανακατατάξεων και ελλείψεων. Οι σκούρες ζώνες συχνά αντιστοιχούν στην ανενεργή χρωματίνη, ενώ οι ανοιχτές ζώνες συνήθως εντοπίζονται σε περιοχές με έντονη μεταγραφική δραστηριότητα, όπως ήδη αναφέρθηκε. Τα πρότυπα αυτά είναι ιδιαίτερα χρήσιμα, καθώς επιτρέπουν άμεσα τον εντοπισμό των μεταγραφικά ενεργών περιοχών και της γενικής δομής της χρωματίνης. Θεωρούνται κατάλληλα εργαλεία χάρη στο χαρακτηριστικό ειδο-ειδικό πρότυπο ζωνώσεων που εμφανίζουν. Το πρότυπο αυτό αποτελεί μέσο μελέτης της γονιδιωματικής οργάνωσης, αλλά και της δομής και της λειτουργίας των χρωμοσωμάτων, συμβάλλοντας με τον τρόπο αυτό στη μελέτη των φυλογενετικών σχέσεων μεταξύ στενά συγγενικών ειδών (εικόνα 31) (Drosopoulou et al., 2011, Zacharopoulou et al., 2011a). Εικόνα 31: Σύγκριση των πολυταινικών βραχιόνων 2L και 2R των ειδών Ceratitis capitata (Cc) και Bactrocera dorsalis (Bd) (Zacharopoulou et al., 2011) Επιπλέον, κατασκευή ενός λεπτομερούς και ολοκληρωμένου φυσικού και γενετικού χάρτη των πολυταινικών χρωμοσωμάτων ενός οικονομικά σημαντικού είδους, δίνει ουσιώδεις πληροφορίες για την κατανόηση της βιολογίας τους, συμβάλλει στη γενετική ανάλυση των φυσικών πληθυσμών, καθώς και στην ανάπτυξη ή στη βελτίωση των σύγχρονων στρατηγικών γενετικού ελέγχου. Χάρτες πολυταινικών χρωμοσωμάτων έχουν κατασκευαστεί μέχρι σήμερα για περισσότερα από 270 είδη της οικογένειας Drosophilidae και άλλα 250 Δίπτερα (Drosopoulou et 46

47 al., 2011). Συγκεκριμένα, στην περίπτωση της Μεσογειακής μύγας C. capitata, είδος το οποίο θεωρείται μοντέλο για τα έντομα οικονομικής σημασίας, η μελέτη των πολυταινικών χρωμοσωμάτων και η δημιουργία χάρτη αυτών, έχει βοηθήσει στην ανάπτυξη της τεχνικής SIT μέσω της δημιουργίας γενετικά κατάλληλων ατόμων με σκοπό τον περιορισμό του φυσικού πληθυσμού (Genetic Sexing Strain- GSS) (Robinson et al., 1999, Gariou-Papalexiou et al., 2002, Franz, 2005, Zacharopoulou et al., 2011). 1.6 Μιτοχονδριακό γονιδίωμα Το μιτοχονδριακό DNA (mtdna) ανακαλύφθηκε πρώτη φορά τη δεκαετία του 1960 από τους Margit M. K. Nass και Salyvan Nass (Nass M. M. K. And Nass S., 1963) μέσω ηλεκτρονικής μικροσκοπίας και από τους Ellen Haslbrunner, Hans Tuppy και Gottfried Schatz (Schatz et al., 1964) μέσω βιοχημικών δοκιμασιών σε κλάσματα απομονωμένων μιτοχονδρίων. Το γονιδίωμα αυτό εντοπίζεται στα μιτοχόνδρια (εικόνα 32), τα οργανίδια των ευκαρυωτικών κυττάρων που μετατρέπουν τη χημική ενέργεια των τροφών σε ΑΤΡ, δηλαδή σε ενέργεια αξιοποιήσιμη από τα κύτταρα. Στους περισσότερους πολυκύτταρους οργανισμούς το μιτοχονδριακό DNA είναι ένα δίκλωνο κυκλικό μόριο. Σπάνια εμφανίζεται γραμμικό, όπως σε κάποιους μονοκύτταρους οργανισμούς (π.χ. Tetrahymena και Chlamydomonas reinhardtii) ή εξαιρετικά σπάνια σε πολυκύτταρους όπως π.χ. σε κάποια είδη Cnidaria (Nosek et al., 1998). Το μιτοχονδριακό DNA των ζωικών οργανισμών είναι ένα μικρό, εξωχρωμοσωμικό γονιδίωμα του οποίου το μέγεθος κυμαίνεται από 14kb έως 20kb, ενώ κάθε μιτοχόνδριο περιέχει 2 έως 10 αντίγραφα μιτοχονδριακού DNA (Wiesner et al., 1992). Στα περισσότερα μετάζωα, κάθε κύτταρο περιλαμβάνει 100 έως αντίγραφα του mtdna, με εξαίρεση τα γαμετικά κύτταρα. 47

48 Εικόνα 32: Θέση του μιτοχονδριακού γονιδιώματος στο κύτταρο. Διακρίνονται τα πολλαπλά αντίγραφα σε κάθε μιτοχόνδριο και η κυκλική δίκλωνη δομή του (4) Προέλευση μιτοχονδριακού DNA Το πυρηνικό και το μιτοχονδριακό DNA θεωρείται ότι έχουν ξεχωριστή εξελικτική προέλευση. Η προέλευση του mtdna αποδίδεται στην ενδοσυμβιωτική θεωρία, σύμφωνα με την οποία βακτήρια εγκολπώθηκαν από τους πρώτους προγόνους των σύγχρονων ευκαρυωτικών κυττάρων. Το μιτοχονδριακό DNA αποτελεί ένα μικρό μόνο ποσοστό του DNA του ευκαρυωτικού κυττάρου, καθώς η μεγαλύτερη ποσότητα του γενετικού υλικού εντοπίζεται στον πυρήνα. Η πλειοψηφία των πρωτεϊνών που εντοπίζονται στα μιτοχόνδρια κωδικοποιούνται από το πυρηνικό DNA, όμως τα γονίδια που κωδικοποιούν κάποιες από αυτές τις πρωτεΐνες, αν όχι τις περισσότερες, θεωρείται ότι έχουν βακτηριακή προέλευση και μεταφέρθηκαν στον ευκαρυωτικό πυρήνα κατά τη διάρκεια της εξέλιξης. Στα περισσότερα είδη, το μιτοχονδριακό DNA κληρονομείται αποκλειστικά και μόνο μέσω της μητέρας (εικόνα 33). Ωστόσο, πατρική κληρονόμηση έχει καταγραφεί σε περιπτώσεις διαφόρων ειδών όπως το μύδι (Zouros et al., 1994). 48

49 Εικόνα 33: Μητρική κληρονόμηση του μιτοχονδριακού γονιδιώματος (5) Αλληλουχίες μιτοχονδριακού γονιδιώματος Με ελάχιστες εξαιρέσεις, το μιτοχονδριακό γονιδίωμα σε όλους τους ζωικούς οργανισμούς περιέχει τα ίδια 37 γονίδια. Αυτά είναι δύο γονίδια που κωδικοποιούν rrnas (σχετίζονται με τη μεγάλη και τη μικρή υπομονάδα του ριβοσώματος), 13 γονίδια για πρωτεΐνες και 22 γονίδια για trnas (εικόνα 34). Τα προϊόντα των γονιδίων αυτών αποτελούν συστατικά του μονοπατιού παραγωγής ενέργειας του μιτοχονδρίου, ενώ μαζί με τα RNAs και τις πρωτεΐνες που εισέρχονται από το κυτταρόπλασμα, επιτρέπουν στο μιτοχόνδριο να διαθέτει το δικό του μηχανισμό αντιγραφής, μεταγραφής, τροποποίησης του mrna και μετάφρασης (Boore, 1999). Επιπλέον, το μιτοχονδριακό DNA περιλαμβάνει και μια μεγάλη μη κωδικοποιούσα περιοχή μεγέθους περίπου 1kb, η οποία χαρακτηρίζεται ως D-loop (Displacement loop). Η περιοχή αυτή περιέχει σήματα που σχετίζονται με την αντιγραφή και τη μεταγραφή του μιτοχονδριακού γονιδιώματος. 49

50 Εικόνα 34: Γενική δομή του μιτοχονδριακού DNA (3) Οι δύο αλυσίδες του μιτοχονδριακού DNA διαφέρουν μεταξύ τους στη νουκλεοτιδική σύσταση. Η αλυσίδα, που είναι πλούσια σε νουκλεοτίδια γουανίνης, αναφέρεται ως «βαριά αλυσίδα» («Heavy strand» - Η strand) και η αλυσίδα που είναι πλούσια σε κυτοσίνες αναφέρεται ως «ελαφριά αλυσίδα» («Light strand» - L strand). Η Η- αλυσίδα κωδικοποιεί 28 γονίδια και η L- αλυσίδα κωδικοποιεί 9 από τα συνολικά 37 γονίδια. Το μοτίβο αυτό εντοπίζεται στα περισσότερα μετάζωα, παρόλο που σε κάποιες περιπτώσεις μπορεί να λείπουν ένα ή περισσότερα γονίδια, ή να ποικίλει το μέγεθος του mtdna. Γενικά, οι αλληλουχίες του μιτοχονδριακού γονιδιώματος περιέχουν γονίδια χωρίς ιντρόνια, λίγες -έως καθόλου- περιοχές ανάμεσα στα γονίδια και τη μη κωδικοποιούσα περιοχή D- loop (Clayton, 1982, 1991, Fernandez-Silva et al., 2003). Όλα τα πολυπεπτίδια που κωδικοποιούνται είναι λειτουργικά, καθώς παίρνουν μέρος στις βασικές λειτουργίες του μιτοχονδρίου, συμπεριλαμβανομένου της οξειδωτικής φωσφορυλίωσης (Pissios and Scouras, 1993, Nikolaidis and Scouras, 1996, Peng et al., 2006). Όσον αφορά τη μεταγραφή, τουλάχιστον στους ζωικούς οργανισμούς, κάθε αλυσίδα μεταγράφεται συνεχώς, παράγοντας ένα πολυκιστρονικό μόριο RNA. Τα μιτοχονδριακά γονίδια ΑΤΡ8 και ΑΤΡ6, καθώς και τα γονίδια ND4L και ND4 είναι γνωστό ότι αλληλεπικαλύπτονται. Ανάμεσα στις περισσότερες -αλλά όχι όλες- τις 50

51 περιοχές που κωδικοποιούν πρωτεΐνες, εντοπίζονται τα trnas (Taylor and Turnbull, 2015) Χρησιμότητα μιτοχονδριακού γονιδιώματος Το μιτοχονδριακό DNA είναι ένα εξαιρετικά συντηρημένο μόριο ως προς τη δομή, γεγονός που το καθιστά, μαζί με άλλες ιδιότητες, χρήσιμο εργαλείο για τη μελέτη των εξελικτικών σχέσεων των οργανισμών. Το συνολικό μιτοχονδριακό DNA ή τμήματα αυτού έχουν χρησιμοποιηθεί ευρέως ως μοριακοί δείκτες για εξελικτικές, φυλογενετικές και πληθυσμιακές γενετικές μελέτες, καθώς εμφανίζει κάποια ειδικά χαρακτηριστικά. Μια από τις ιδιότητες του μιτοχονδριακού DNA που το καθιστούν πολύτιμο εργαλείο είναι το μικρό μέγεθός του, που δεν απαιτεί κλωνοποίηση. Επιπλέον, τα πολλαπλά αντίγραφα ανά κύτταρο και η σχεδόν αποκλειστική μητρική κληρονόμηση αποτελούν χρήσιμες ιδιότητες. Ταυτόχρονα, σημαντικό είναι το γεγονός ότι δεν εμφανίζει φαινόμενα ανασυνδυασμού, εμφανίζει όμως υψηλό ρυθμό αντικατάστασης βάσης (Brown et al., 1982), έχοντας συνεπώς ταχύτερη εξέλιξή σε σχέση με το πυρηνικό γονιδίωμα. Όλες οι παραπάνω ιδιότητες, ιδίως όμως το γεγονός ότι είναι εξαιρετικά συντηρημένο ανάμεσα σε διαφορετικά φύλα (Boore 1999, Miya and Nishida, 1999, Lee et al., 2001, Hurst and Jiggins, 2005, Mueller and Boore, 2005, Parham et al., 2006a, Peng et al., 2006, Drosopoulou et al., 2012), το καθιστούν ένα εξαιρετικά χρήσιμο εργαλείο για τη μελέτη των γενετικών σχέσεων μεταξύ ατόμων ή ομάδων μέσα σε είδη, καθώς και για την αναγνώριση και ποσοτικοποίηση των εξελικτικών σχέσεων μεταξύ διαφορετικών ειδών, δεδομένου ότι αυτά δεν είναι πολύ στενά συγγενικά (Yu et al., 2007). Για να πραγματοποιηθεί αυτό είναι απαραίτητη η αλληλούχιση και η σύγκριση του μιτοχονδριακού γονιδιώματος από διαφορετικά άτομα ή είδη. Τα δεδομένα από μια τέτοια σύγκριση χρησιμοποιούνται για να κατασκευαστεί ένα δίκτυο σχέσεων μεταξύ των αλληλουχιών, δηλαδή ένα φυλογενετικό δέντρο, το οποίο μπορεί να παρέχει μια εκτίμηση των σχέσεων μεταξύ των ατόμων ή των ειδών αυτών. Στους ζωικούς οργανισμούς ο υψηλός ρυθμός μεταλλαξιγένεσης καθιστά το mtdna το πιο χρήσιμο εργαλείο σύγκρισης ατόμων ενός είδους και ειδών που εμφανίζουν στενή ή σχετικά στενή φυλογενετική σχέση, καθώς ο αριθμός των διαφορών στις αλληλουχίες μπορεί εύκολα να εκτιμηθεί. Όσο πιο μακρυά εξελικτικά όμως είναι τα είδη, ο αριθμός αυτός μεγαλώνει ιδιαίτερα, 51

52 καθώς οι μεταλλάξεις αρχίζουν να συσσωρεύονται με αποτέλεσμα, η ακριβής καταμέτρηση αυτών να είναι αδύνατη (Taylor and Turnbull, 2015). Συνεπώς, η μελέτη του μιτοχονδριακού γονιδιώματος, καθώς και της λειτουργίας του, χρησιμοποιείται ως μοντέλο για τη γονιδιωματική εξέλιξη (Boore, 1999). Τα γονίδια, αλλά και η οργάνωση του μιτοχονδριακού γονιδιώματος γενικά είναι συντηρημένα. Οι αλληλουχίες του μιτοχονδριακού γονιδιώματος έχουν χρησιμοποιηθεί ως μοριακοί δείκτες σε μελέτες που εστιάζουν σε επίπεδο ειδών. Επιπλέον, η σύγκριση της ανακατάταξης των μιτοχονδριακών γονιδίων έχει γίνει ένα πολύ ισχυρό μέσο διαλεύκανσης των εξελικτικών σχέσεων, καθώς αυτές αποτελούν μοναδικά, γενικά σπάνια γεγονότα, που είναι απίθανο να δημιουργούνται ανεξάρτητα και τυχαία μέσα στις εξελικτικές γραμμές (Boore, 1999). Η σύγκριση των μιτοχονδριακών αλληλουχιών αντιπροσωπεύει τη βάση των φυλογενετικών αναλύσεων, καθώς επιτρέπει τη διαφώτιση των εξελικτικών σχέσεων μεταξύ των ειδών. Επίσης, δίνει τη δυνατότητα συσχέτισης πληθυσμών, με αποτέλεσμα να αποτελεί ένα ιδιαίτερα χρήσιμο εργαλείο στο πεδίο της φυλογενετικής και της ανθρωπολογίας. Παρόλο που υφίστανται κάποιοι περιορισμοί, όπως η μητρική κληρονόμηση, επειδή το μιτοχονδριακό DNA κληρονομείται ανεξάρτητα από το πυρηνικό, η χρήση δεικτών και από τα δύο γονιδιώματα μπορεί να προσφέρει βαθύτερη κατανόηση των γενετικών σχέσεων μεταξύ των ειδών ενός συμπλέγματος (Muraji and Nakahara, 2001). Η αλληλουχία του mtdna έχει μελετηθεί σε έναν μεγάλο αριθμό ειδών, συμπεριλαμβανομένου και οργανισμών που έχουν εξαφανισθεί. Μια από τις πιο εκτεταμένες έρευνες που έχουν πραγματοποιηθεί και βασίζεται στο μιτοχονδριακό γονιδίωμα είναι αυτή του Hardman (2005), ο οποίος χρησιμοποίησε την αλληλουχία του γονιδίου του κυτοχρώματος b, με στόχο τη διερεύνηση των φυλογενετικών σχέσεων μεταξύ 170 ειδών σιλουροειδών (siluriformes) Το μιτοχονδριακό γονιδίωμα στην οικογένεια Tephritidae Γενικά, πολλοί εντομολόγοι έχουν χρησιμοποιήσει μοριακούς δείκτες για να διαφωτίσουν τις φυλογενετικές σχέσεις σε πολλές ομάδες εντόμων. Πολλές έρευνες φανερώνουν ότι οι αλληλουχίες του μιτοχονδριακού DNA μπορούν να είναι χρήσιμες για την εξαγωγή φυλογενετικών συμπερασμάτων στην περίπτωση αυτή. Όσον αφορά τα είδη της οικογένειας Tephritidae, σε πολλές έρευνες έχει πραγματοποιηθεί 52

53 ανάλυση των μιτοχονδριακών αλληλουχιών προκειμένου να διαλευκανθούν οι σχέσεις ανάμεσα στα ποικίλα τάξα των tephritid (Han and McPheron, 1997), αλλά και ανάμεσα σε είδη που ανήκουν σε διαφορετικά γένη. Ωστόσο, επειδή οι αλληλουχίες φαίνεται να είναι αρκετά μικρές, η έκταση της ανάλυσης της σχέσης των οργανισμών είναι σχετικά περιορισμένη. Ως προς τα είδη που ανήκουν στο γένος Bactrocera, στο παρελθόν δεν πραγματοποιούνταν μοριακές φυλογενετικές μελέτες με βάση νουκλεοτιδικές αλληλουχίες. Μόνο ένας μικρός αριθμός αλληλουχιών mtdna είχαν καταγραφεί για αυτήν την ομάδα εντόμων μέχρι το 1997 (Han and McPheron, 1997). Για το λόγο αυτό, η φυλογενετική χρησιμότητα των αλληλουχιών σε αυτήν την περίπτωση είναι σχετικά άγνωστη. Πρόσφατα, έρευνες που στηρίζονται στο μιτοχονδριακό γενετικό υλικό πραγματοποιήθηκαν και για την περίπτωση ειδών του συμπλέγματος Bactrocera dorsalis. Βασικές πληροφορίες για ολόκληρο το μιτοχονδριακό γονιδίωμα σε περιπτώσεις ειδών που ανήκουν σε κοντινά τάξα, μπορούν να χρησιμοποιηθούν ώστε να επιλεχθεί ένα ή περισσότερα γονίδια, ως τα ευμετάβλητα ή ως τα πιο πληροφοριακά για την επίλυση συγκεκριμένων προβλημάτων (Yu et al., 2007). Ένα τέτοιο παράδειγμα είναι η έρευνα των Nardi et al. (2003) όπου η σύγκριση δύο πλήρων μιτοχονδριακών αλληλουχιών οδήγησε στην επιλογή του γονιδίου nad1 για μια ευρύτερη φυλογεωγραφική ανάλυση του είδους Bactrocera oleae (Nardi et al., 2005). Αντίστοιχο παράδειγμα είναι και η χρήση του γονιδιου COI για την πραγματοποίηση γενετικής ανάλυσης (Harrison 1989, Zhang and Hewitt, 1997, Liu et al., 2007). Η αλληλουχία του γονιδίου αυτού που ανήκει στο μιτοχονδριακό DNA χρησιμοποιήθηκε για να απαντηθούν ερωτήματα όπως η προέλευση κάποιων πληθυσμών Bactrocera dorsaslis στην Κίνα, καθώς και η εγγενής σχέση των πληθυσμών αυτών μεταξύ τους. Στόχος της μελέτης αυτής, καθώς και των περισσότερων αντίστοιχων ερευνών, ήταν φυσικά η ανάπτυξη μιας στρατηγικής ελέγχου του είδους αυτού, καθώς και η απόκτηση νέων ουσιωδών πληροφοριών σχετικά με τις λειτουργίες και τη γενετική του είδους σε συγκεκριμένα οικολογικά περιβάλλοντα (Chena and Υe, 2008). Το 2001, οι Muraji και Nakahara προσπάθησαν να διαφωτίσουν τις φυλογενετικες σχέσεις μεταξύ των μυγών του συμπλέγματος Bactrocera χρησιμοποιώντας νουκλεοτιδικές αλληλουχίας ενός σχετικά μεγάλου τμήματος του mtdna (μεγέθους 1,6 kb). Βασιζόμενοι στις ιδιότητες του νουκλεοτιδικού 53

54 περιοχομένου και στις αντικαταστάσεις στο μιτοχονδριακό τμήμα, μελετήθηκαν 6 είδη του συμπλέγματος Bactrocera. Ανάμεσα σε αυτά, οι σχέσεις μεταξύ των τεσσάρων ειδών B. dorsalis, B. philippinensis, B. papayae και B. carambolae δεν μπόρεσαν να διευκρινιστούν από καμία φυλογενετική ανάλυση (Muraji and Nakahara, 2001). Το B. papayae και τα υπόλοιπα είδη θεωρήθηκαν ως ένα είδος, το B. dorsalis (Hendel). Η ταξονομική κατάταξη του είδους είχε επαναπροσδιοριστεί το 1994 από τους Drew και Hancock, οπότε και αναγνωρίστηκε το σύμπλεγμα ειδών Bactrocera με 52 αδελφά είδη, βασιζόμενοι στα μορφολογικά χαρακτηριστικά και τα ενδιάμεσα στάδια μεταξύ των αδελφών ειδών που εντοπίζονταν στη φύση, καθώς πραγματοποιείται διαειδική σύζευξη μεταξύ των ειδών του συμπλέγματος (Muraji and Nakahara, 2001). Άλλη έρευνα που βασίστηκε στο μιτοχονδριακό γονιδίωμα μελετούσε δείγματα του είδους Bactrocera philippinensis από την περιοχή κατανομής του στην Κίνα και των ειδών Bactrocera dorsalis και Bactrocera papayae από τις ενδιάμεσες μεταβατικές περιοχές του ενδιαιτήματός του, προκειμένου να προσδιοριστεί ο πραγματικός αριθμός των κρυπτικών ειδών και της κρυπτικής γενεολογίας του συμπλέγματος. Επιπλέον, με βάση το μιτοχονδριακό γονιδίωμα, στόχος ήταν η αξιολόγηση της μοριακής ποικιλότητας, η γενετική αρχιτεκτονική των ειδών και η επίλυση του αμφιλεγόμενου ζητήματος σχετικά με την καταγωγή και έκταση της εξάπλωσης των ειδών του συμπλέγματος στην Κίνα (Wu et al., 2014). Δεδομένου ότι στα είδη Tephritidae, τα προνυμφικά στάδια συχνά επιλέγονται για τον έλεγχο καραντίνας, μοριακοί δείκτες μπορούν να φανούν ιδιαίτερα χρήσιμοι για την αναγνώριση των εντόμων ακόμα σε ανώριμα στάδια, όπου τα άτομα δεν μπορούν να διακριθούν μορφολογικά. Επιπλέον, υπάρχουν πολλά είδη που μπορούν να αναγνωριστούν με ακρίβεια, μόνο από τα μορφολογικά χαρακτηριστικά των ενήλικων αρσενικών ατόμων. Συνεπώς, οι διαγνωστικές μέθοδοι που στηρίζονται σε μοριακά δεδομένα με τη χρήση τμημάτων mtdna μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την ακρίβεια της αναγνώρισης των ειδών Bactrocera (Muraji and Nakahara, 2001). Τα τελευταία χρόνια, καθώς η αλληλούχιση όλο και περισσότερων μιτοχονδριακών γονιδιωμάτων γίνεται βασική πρακτική, η ανάλυση σε επίπεδο γένους ή είδους πραγματοποιείται με τη χρήση ολόκληρων των μορίων και όχι μόνο με μια υπο-ομάδα γονιδίων. Μέχρι το 2006 ήταν διαθέσιμα περίπου 60 μιτοχονδριακά γονιδιώματα εντόμων (Feijao et al., 2006). Ανάμεσα σε αυτά, 11 ανήκουν στα ανώτερα Δίπτερα και 4 ανήκουν συγκεκριμένα στα είδη της οικογένειας 54

55 Tephritidae. Συνεπώς, η συγκριτική μελέτη των μιτοχονδριακών γονιδιωμάτων αποτελεί πλέον μια εφικτή προσέγγιση στη μελέτη συγκεκριμένων ομάδων εντόμων στο επίπεδο του είδους και μπορεί να βρει εφαρμογή στη διάκριση των ειδών σε καίρια τάξα, όπως στην περίπτωση των ειδών της οικογένειας Tephritidae. 55

56 2. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 2.1 Πειραματικό υλικό B. kandiensis Στην παρούσα μελέτη, τόσο η κυτταρογενετική, όσο και η μοριακή ανάλυση του είδους B.kandiensis, πραγματοποιήθηκε σε άτομα προερχόμενα από το Εργαστήριο Ελέγχου Παρασιτικών Εντόμων του Seibersdorf (Insect Pest Control Laboratory- IPCL, FAO/IAEA, Vienna). Ανάλογα με το σκοπό χρήσης του βιολογικού υλικού, χρησιμοποιήθηκαν προνύμφες, νύμφες ή ενήλικα άτομα του είδους B.kandiensis. 2.2 Παρασκευάσματα μεταφασικών χρωμοσωμάτων Η δημιουργία παρασκευασμάτων μεταφασικών χρωμοσωμάτων σε όλα τα είδη της οικογένειας Tephritidae απαιτεί την απομόνωση εγκεφαλικών γαγγλίων. Τα νευρικά γάγγλια απομονώνονται από προνύμφες (larvae) τρίτου σταδίου ή από νεαρές νύμφες (pupae) του υπό μελέτη είδους. Στην περίπτωση της μελέτης του είδους B. kandiensis εφαρμόστηκε πρωτόκολλο που δεν περιλαμβάνει τη χρήση κολχικίνης (Mavragani- Tsipidou et al., 2015, p.: 12-17). Ως υλικό χρησιμοποιήθηκαν νεαρές νύμφες, καθώς μετά από διαδοχικές επαναλήψεις του πρωτοκόλλου παρατηρήθηκε ότι προκύπτουν παρασκευάσματα καλύτερης ποιότητας σε σχέση με αυτά που προκύπτουν από τις προνύμφες του ίδιου είδους. α. Απομόνωση εγκεφαλικών γαγγλίων Πρώτο βήμα της τεχνικής αυτής είναι η μεταφορά της νύμφης σε μια σταγόνα διαλύματος Ringer πάνω σε μία αντικειμενοφόρο πλάκα. Στόχος είναι ο διαχωρισμός του εγκεφάλου- και πιο συγκεκριμένα των εγκεφαλικών γαγγλίων- από τους υπόλοιπους ιστούς, όπως για παράδειγμα τα στοματικά εξαρτήματα και οι σιελογόνοι αδένες. Η αφαίρεση των υπολοίπων δομών της νύμφης, από τον επιθυμητό ιστό γίνεται με τη βοήθεια δύο λεπτών βελόνων στο στερεοσκόπιο. Η αντικειμενοφόρος πλάκα συνίσταται να τοποθετείται σε σκούρα επιφάνεια, ώστε να διευκολύνεται η εύρεση και η απομόνωση του επιθυμητού ιστού. 56

57 β. Προετοιμασία εγκεφαλικών γαγγλίων Ακολουθεί η μεταφορά των εγκεφαλικών γαγγλίων σε υποτονικό διάλυμα KCl (0,075Μ) για χρονική διάρκεια 15 έως 20 λεπτών. Η επώαση στο παραπάνω διάλυμα πραγματοποιείται σε νέα αντικειμενοφόρο πλάκα, η οποία συνήθως καλύπτεται με πάραφιλμ (parafilm), ώστε να διατηρείται η ρευστότητα του υγρού. Επιπλέον, επιθυμητή είναι και πάλι η σκουρόχρωμη επιφάνεια κάτω από την αντικειμενοφόρο πλάκα. Η χρήση του υποτονικού διαλύματος KCl έχει ως σκοπό τη διόγκωση και το άπλωμα των χρωμοσωμάτων στο χώρο, ενώ ο ακριβής χρόνος παραμονής του ιστού στο διάλυμα προσδιορίζεται ανάλογα με την ποιότητα των παρασκευασμάτων που προκύπτουν έπειτα από συνεχείς επαναλήψεις του πρωτοκόλλου. Στην παρούσα περίπτωση ο χρόνος παραμονής του ιστού στο διάλυμα KCl είναι 20 λεπτά. γ. Στερέωση μεταφασικών χρωμοσωμάτων Στη συνέχεια, τα εγκεφαλικά γάγγλια μεταφέρονται σε μια σταγόνα φρέσκου διαλύματος Carnoy s (αιθανόλη : χλωροφόρμιο : οξικό οξύ, σε αναλογία 6:3:1). Γενικά, στα είδη της οικογένειας Tephritidae ο συνολικός χρόνος παραμονής των εγκεφαλικών γαγγλίων στο διάλυμα αυτό προσδιορίζεται από 15 έως 30 λεπτά. Ωστόσο, για κάθε είδος υπάρχει ακριβής συνολικός χρόνος παραμονής, ώστε να επιτευχθεί η λήψη μεταφασικών χρωμοσωμάτων της καλύτερης δυνατής ποιότητας. Συγκεκριμένα, για το είδος B. kandiensis ο συνολικός χρόνος παραμονής του ιστού στο διάλυμα Carnoy s είναι περίπου 20 λεπτά. Ο συνολικός χρόνος επώασης του ιστού στο διάλυμα προκύπτει από τρεις διαδοχικές μεταφορές- για 7 περίπου λεπτά- σε σταγόνες του διαλύματος, με απώτερο σκοπό την πλήρη απομάκρυνση του νερού από τα εγκεφαλικά γάγγλια. Στο βήμα αυτό κρίνεται και πάλι απαραίτητη η χρήση πάραφιλμ γύρω από την αντικειμενοφόρο πλάκα, καθώς και η τοποθέτηση σκουρόχρωμης επιφάνειας στη βάση. δ. Διάλυση ιστού σε διάλυμα 60% οξικού οξέος Έπειτα από την επεξεργασία με το διάλυμα Carnoy s, τα εγκεφαλικά γάγγλια μεταφέρονται σε μια μικρή σταγόνα (περίπου 10 μl) διαλύματος οξικού οξέος 60%, η οποία τοποθετείται πάνω σε νέα αντικειμενοφόρο πλάκα. Μέσα στο διάλυμα του οξικού οξέος, ο ιστός κόβεται σε μικρότερα τμήματα με τη βοήθεια βελόνων. Ακολουθεί ανάδευση του ιστού στο διάλυμα με μικροπιπέτα (2-20 μl), προκειμένου να επιτευχθεί επιπλέον διάσπαση των τμημάτων του. Μια ακόμα σταγόνα των 10 μl 57

58 του διαλύματος οξικού οξέος 60% προστίθεται με την πιπέτα στην πρώτη σταγόνα. Στόχος είναι η απομάκρυνση διαφόρων υπολειμμάτων του ιστού που έχουν απομείνει στο ρύγχος της πιπέτας. Η διάρκεια του συγκεκριμένου σταδίου δεν πρέπει να υπερβαίνει τα 2 λεπτά, καθώς μεγαλύτερη παραμονή του ιστού στο διάλυμα μπορεί να έχει ως αποτέλεσμα την καταστροφή των χρωμοσωμάτων. ε. Διάχυση μεταφασικών χρωμοσωμάτων στην αντικειμενοφόρο πλάκα Στο τελευταίο στάδιο, η αντικειμενοφόρος πλάκα- με το ομογενοποιημένο πλέον υλικό- τοποθετείται σε θερμαινόμενη πλάκα στους 45 ο C. Στόχος της θέρμανσης είναι η ξήρανση του υλικού, το οποίο παράλληλα απλώνεται με απαλές, κυκλικές κινήσεις, με τη βοήθεια μικροπιπέτας, σε μια περιοχή έκτασης 20 x 20 mm, μέχρι να επιτευχθεί η πλήρης εξάτμιση του διαλύματος του οξικού οξέος. στ. Διατήρηση των παρασκευασμάτων Τα παρασκευάσματα μπορούν να χρησιμοποιηθούν άμεσα ή να αποθηκευτούν σε θερμοκρασία δωματίου για μεγάλο χρονικό διάστημα, χωρίς να υπάρχει ιδιαίτερη αλλοίωση της ποιότητά τους. Πίνακας 5: Αναλώσιμα, χημικά και διαλύματα που είναι απαραίτητα για το πρωτόκολλο δημιουργίας παρασκευασμάτων μεταφασικών χρωμοσωμάτων. Παρασκευάσματα μεταφασικών χρωμοσωμάτων Εξοπλισμός Χημικά Διαλύματα Θερμαινόμενη πλάκα Οξικό οξύ (CH 3 COOH) 60% οξικό οξύ Οπτικό μικροσκόπιο συνδεδεμένο με κάμερα Αντικειμενοφόροι πλάκες Καλυπτρίδες Στερεοσκόπιο Μικροβελόνες Parafilm Μαύρο χαρτί Χλωροφόρμιο (CHCl 3 ) Αιθανόλη Ένυδρο χλωριούχο ασβέστιο (CaCl 2 *2H 2 O) Χλωριούχο κάλιο (KCl) Χλωριούχο νάτριο (ΝaCl) Ένυδρο φωσφορικό νάτριο (Na 2 HPO 4 *2H 2 O) Όξινο ανθρακικό νάτριο (NaHCO 3 ) Carnoy s fixative (αιθανόλη : χλωροφόρμιο : οξικό οξύ, 6:3:1) Υποτονικό διάλυμα KCl (0,075 Μ σε νερό), φύλαξη στους 4 ο C Ringer (6,5 gr ΝaCl, 0,14 gr KCl, 0,2 gr NaHCO 3, 0,12 gr CaCl 2 *2H 2 O, 0,01 gr Na 2 HPO 4 *2 H 2 O, 1000 ml H 2 O) 58

59 2.3 Παρασκευάσματα πολυταινικών χρωμοσωμάτων Παρασκευάσματα πολυταινικών χρωμοσωμάτων για κυτταρολογική μελέτη Η τεχνική δημιουργίας παρασκευασμάτων πολυταινικών χρωμοσωμάτων, που έχει ως στόχο την παρατήρησή τους σε μια κυτταρολογική μελέτη, απαιτεί την απομόνωση των σιελογόνων αδένων του ατόμου (Mavragani- Tsipidou et al., 2015, p: 17-21). Η επανάληψη του πρωτοκόλλου έδειξε ότι καλύτερα παρασκευάσματα προκύπτουν από τις νύμφες του είδους, ειδικά στο στάδιο από την πρώτη έως την τέταρτη ημέρα. Εναλλακτικά, χρησιμοποιούνται προνύμφες που βρίσκονται στο τρίτο προνυμφικό στάδιο. Στην παρούσα εργασία χρησιμοποιήθηκαν από νύμφες τρίτης ημέρας. α. Απομόνωση σιελογόνων αδένων Το άτομο τοποθετείται σε σταγόνα διαλύματος Ringer ή φυσιολογικού ορού σε αντικειμενοφόρο πλάκα, προκειμένου να διαχωριστούν οι αδένες με τη βοήθεια μικροβελόνων στο στερεοσκόπιο. Η αντικειμενοφόρος πλάκα τοποθετείται πάνω σε σκουρόχρωμη επιφάνεια, ώστε να είναι ευκολότερη η παρατήρηση του ιστού, που εντοπίζεται ως μια ελαφρώς λευκή ή ημιδιάφανης δομή. Κατά την απομόνωση του ιστού, αυτός εντοπίζεται συνδεδεμένος με τα στοματικά εξαρτήματα ή με άλλες δομές του ατόμου, από τις οποίες είναι απαραίτητο να διαχωριστεί. Επιπλέον, συνδεδεμένα εντοπίζονται και μεγάλα τμήματα λίπους, τα οποία στο στάδιο αυτό παραβλέπονται και δεν γίνεται προσπάθεια απομάκρυνσής τους. β. Στερέωση των χρωμοσωμάτων Οι σιελογόνοι αδένες μεταφέρονται σε νέα αντικειμενοφόρο πλάκα σε σταγόνα φρέσκου διαλύματος 45% οξικού οξέος. Η αντικειμενοφόρος πλάκα συνήθως καλύπτεται με πάραφιλμ, προκειμένου να επιτευχθεί η παραμονή του ιστού στη σωστή θέση, ενώ παράλληλα τοποθετείται πάνω σε σκούρα επιφάνεια, ώστε να διευκολύνεται η παρατήρηση του ιστού. Στο στάδιο αυτό, το λίπος αφαιρείται ολοκληρωτικά, με προσεκτικές κινήσεις με τη βοήθεια μικροβελόνων, χωρίς να διαρρηγνύεται ο ιστός. Η συνολική διάρκεια της παραμονής του ιστού στο διάλυμα του οξικού οξέος δεν πρέπει να ξεπερνάει τα 2-3 λεπτά, ώστε να αποφεύγεται η καταστροφή των χρωμοσωμάτων. 59

60 γ. Υδρόλυση Ακολουθεί μεταφορά του ιστού σε σταγόνα διαλύματος υδροχλωρίου (HCl) 1Μ για 2 λεπτά, στην ίδια αντικειμενοφόρο πλάκα που χρησιμοποιήθηκε στο προηγούμενο στάδιο. Στο βήμα αυτό, ο ιστός υδρολύεται και αρχίζει να γίνεται διάφανος. δ. Επιπλέον στερέωση των χρωμοσωμάτων Ο απομονωμένος ιστός μεταφέρεται στη συνέχεια σε σταγόνα διαλύματος 80% γαλακτικού οξέος- 60% οξικού οξέος (σε αναλογία 1:1), στην ίδια αντικειμενοφόρο πλάκα, για πολύ σύντομο χρονικό διάστημα, το οποίο δεν ξεπερνά τα 6 δευτερόλεπτα. Η σύντομη παραμονή του ιστού στο διάλυμα είναι απαραίτητη, καθώς η επώαση για διάστημα μεγαλύτερο των 30 δευτερολέπτων μπορεί να καταστρέψει τους σιελογόνους αδένες. Στο στάδιο αυτό, ο ιστός εμφανίζεται περισσότερο διάφανος. ε. Χρώση ιστού Έπειτα, οι σιελογόνοι αδένες, μεταφέρονται σε διάλυμα χρωστικής (80% γαλακτικό οξύ και 3% ορκεΐνη σε 60% οξικό οξύ, σε αναλογία 1:1), σε νέα αντικειμενοφόρο πλάκα- καλυμμένη με πάραφιλμ,. Ο ρόλος του πάραφιλμ είναι για να αποφεύγεται η ξήρανση της χρωστικής. Ο όγκος του διαλύματος της χρωστικής που χρησιμοποιείται είναι περίπου 10μl και η διάρκεια παραμονής του ιστού στο διάλυμα αυτό είναι από 10 έως 20 λεπτά. Στην ίδια αντικειμενοφόρο πλάκα μπορούν να τοποθετηθούν πολλές σταγόνες του διαλύματος της χρωστικής, ώστε το βήμα αυτό να πραγματοποιείται ταυτόχρονα για πολλούς μεμονωμένους σιελογόνους αδένες. Η κατάλληλη διάρκεια του σταδίου αυτού εξαρτάται από τις συνθήκες, την ποιότητα των χρωμοσωμάτων και το είδος που χρησιμοποιείται. Συνεπώς, η ακριβής διάρκεια επιλέγεται έπειτα από μερικές επαναλήψεις του πρωτοκόλλου, προκειμένου να προσαρμοστεί στα εκάστοτε δεδομένα. Στην παρούσα περίπτωση, ο χρόνος που τηρήθηκε ήταν τα 20 λεπτά. στ. Πλύσιμο ιστού Μετά την παραμονή του ιστού στο διάλυμα της χρωστικής, αυτός μεταφέρεται σε σταγόνα διαλύματος 80% γαλακτικού οξέος- 60% οξικού οξέος (σε αναλογία 1:1), ώστε να ξεπλυθεί από την περίσσεια ποσότητα χρωστικής. Κάθε σιελογόνος αδένας 60

61 μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη δημιουργία ενός παρασκευάσματος. Εναλλακτικά, στο στάδιο αυτό, ο ιστός μπορεί να κοπεί σε 2 ή 3 κομμάτια, ώστε από έναν σιελογόνο αδένα να προκύψουν περισσότερα παρασκευάσματα. Έχει φανεί ότι στη δεύτερη περίπτωση, η ποιότητα των παρασκευασμάτων εμφανίζεται βελτιωμένη. ζ. Διάλυση ιστού Σε μια νέα αντικειμενοφόρο πλάκα που περιέχει σταγόνα του διαλύματος γαλακτικού- οξικού οξέος, τοποθετείται ο απομονωμένος ιστός. Εφαρμόζεται καλυπτρίδα διαστάσεων 18 x 18 mm και με τη βοήθεια βελόνας η καλυπτρίδα μετακινείται με κυκλικές, απαλές κινήσεις με στόχο την πλήρη διάσπαση του σιελογόνου αδένα και την ευρύτερη εξάπλωση των πολυταινικών χρωμοσωμάτων στην αντικειμενοφόρο πλάκα. Επιπλέον, η αντικειμενοφόρος πλάκα μπορεί να τυλιχθεί κατάλληλα με απορροφητικό χαρτί, ώστε να ασκηθεί επιπλέον πίεση στην καλύπτρίδα, με το χέρι, χωρίς όμως αυτή να μετακινείται από τη θέση της. Με την ολοκλήρωση της παραπάνω διαδικασίας, τα παρασκευάσματα πολυταινικών χρωμοσωμάτων που έχουν δημιουργηθεί, μπορούν να παρατηρηθούν στο μικροσκόπιο, προκειμένου να ελεγχθεί η ποιότητά τους. Αν το αποτέλεσμα είναι ικανοποιητικό, ακολουθεί η μονιμοποίηση του παρασκευάσματος. η. Μονιμοποίηση παρασκευάσματος Τελευταίο βήμα του πρωτοκόλλου είναι η μονιμοποίηση του παρασκευάσματος με την εφαρμογή κατάλληλου μέσου (π.χ. βερνίκι νυχιών) γύρω από την καλυπτρίδα. Πρέπει να σημειωθεί ότι η μονιμοποίηση είναι ημιμόνιμη, καθώς τα παρασκευάσματα μπορούν να χρησιμοποιηθούν για παρατήρηση άμεσα ή σε διάστημα 2 έως 4 εβδομάδων, κατά το οποίο πρέπει να διατηρούνται στους 4 ο C. θ. Παρατήρηση παρασκευασμάτων Η παρατήρηση των παρασκευασμάτων πραγματοποίηθηκε σε μικροσκόπιο Nikon (ECLIPSE 80i) σε μεγέθυνση 40x και 60x. Το μικροσκόπιο ήταν συνδεδεμένο με κάμερα με ηλεκτρονικό υπολογιστή. Η λήψη των φωτογραφιών έγινε μέσω του υπολογιστή με το πρόγραμμα NIS- Elements F

62 στ. Επεξεργασία φωτογραφιών Η επεξεργασία των φωτογραφιών έγινε σε ηλεκτρονικό υπολογιστή μέσω του προγράμματος Adobe Photoshop CC Παρασκευάσματα πολυταινικών χρωμοσωμάτων για χρήση σε πρωτόκολλα in situ Η τεχνική που περιγράφεται ακολούθως έχει εφαρμοστεί στις περιπτώσεις μελέτης των ειδών C. capitata (Zacharopoulou et al., 1987, 1990), B. tryoni (Zhao et al., 1998), A. ludens (Garcia- Martinez et al., 2009), B. dorsalis (Zacharopoulou et al., 2011a) και B. cucurbitae (Zacharopoulou et al., 2011b). Με το παρόν πρωτόκολλο δημιουργούνται παρασκευάσματα πολυταινικών χρωμοσωμάτων (Mavragani- Tsipidou et al., 2015, p: 17-21), με στόχο τη χρήση τους σε πρωτόκολλα in situ, με τα οποία είναι δυνατός ο υβριδισμός κατάλληλων επισημασμένων ανιχνευτών. Στόχος είναι η εύρεση ή η επαλήθευση της θέσης κάποιας συγκεκριμένης αλληλουχίας γονιδίου πάνω στα πολυταινικά χρωμοσώματα. Οι σιελογόνοι αδένες μπορούν να απομονωθούν από νύμφες ή προνύμφες του εντόμου. Η επαναλαμβανόμενη εφαρμογή αυτού του πρωτοκόλλου έδειξε ότι παρασκευάσματα καλύτερης ποιότητας προκύπτουν από νύμφες, στο στάδιο της πρώτης έως την τέταρτη ημέρα. Εναλλακτικά, χρησιμοποιούνται προνύμφες που βρίσκονται στο τρίτο προνυμφικό στάδιο. Στην παρούσα διπλωματική εργασία τα παρασκευάσματα των πολυταινικών χρωμοσωμάτων για την χρήση τους σε in situ πρωτόκολλα, δημιουργήθηκαν από νύμφες τρίτης ημέρας. α. Απομόνωση σιελογόνων αδένων Το άτομο τοποθετείται σε σταγόνα διαλύματος Ringer ή φυσιολογικού ορού σε αντικειμενοφόρο πλάκα προκειμένου να διαχωριστούν οι αδένες με τη βοήθεια μικροβελόνων κάτω από στερεοσκόπιο. Στη συνέχεια, οι σιελογόνοι αδένες τοποθετούνται σε σταγόνα φρέσκου διαλύματος 45% οξικού οξέος σε νέα αντικειμενοφόρο πλάκα. Η αντικειμενοφόρος πλάκα τοποθετείται και πάλι και στις δύο περιπτώσεις πάνω σε σκουρόχρωμη επιφάνεια, ώστε να είναι ευκολότερη η παρατήρηση του ημιδιάφανου ιστού. Κατά την απομόνωση του ιστού, η οποία πρέπει να γίνεται με γρήγορες κινήσεις, πραγματοποιείται διαχωρισμός του από οποιαδήποτε άλλη δομή του ατόμου, με την οποία μπορεί να είναι συνδεδεμένος, καθώς και από τα 62

63 τμήματα λιπώδους ιστού. Η χρονική διάρκεια παραμονής του ιστού στο διάλυμα αυτό υπολογίζεται περίπου στα 2 λεπτά. β. Στερέωση ιστού Οι σιελογόνοι αδένες μεταφέρονται και στερεοποιούνται σε διάλυμα γαλακτικού- οξικού οξέος (γαλακτικό οξύ - απεσταγμένο νερό- οξικό οξύ σε αναλογία 2:3:4,5). Το μονιμοποιητικό τοποθετείται πάνω σε καλυπτρίδα, στην οποία μεταφέρονται οι σιελογόνοι αδένες. Η παραμονή του ιστού σε αυτό το διάλυμα υπολογίζεται από 3 έως 5 λεπτά, μέχρι ο ιστός να γίνει διάφανος. Στη συνέχεια η αντικειμενοφόρος πλάκα τοποθετείται πάνω στην καλυπτρίδα. γ. Διάλυση ιστού Προκειμένου να ανοίξει πλήρως ο πυρήνας και τα πολυταινικά χρωμοσώματα να απλωθούν στην αντικειμενοφόρο πλάκα, είναι απαραίτητη η άσκηση ελαφριάς πίεσης με το δάχτυλο πάνω στην επιφάνεια της καλυπτρίδας. Τα παρασκευάσματα ελέγχονται στο μικροσκόπιο σχετικά με την ποιότητά τους, καθώς υπάρχει περίπτωση να είναι απαραίτητη η άσκηση επιπλέον πίεσης, ώστε να εντοπίζεται ένας μόνο πυρήνας σε κάθε επίπεδο. δ. Διατήρηση παρασκευασμάτων Τα παρασκευάσματα τοποθετούνται οριζόντια στην κατάψυξη για διάστημα 2-3 ημερών. Την δεύτερη ημέρα συνήθως, απαιτείται η απομάκρυνση της καλυπτρίδας από τα παρασκευάσματα. Αυτό το βήμα πραγματοποιείται με τη βύθιση των παρασκευασμάτων σε υγρό άζωτο για λίγα δευτερόλεπτα και στη συνέχεια με αφαίρεση της καλυπτρίδας με προσεκτικές και γρήγορες κινήσεις με τη βοήθεια λεπίδας ξυραφιού. Τα παρασκευάσματα τοποθετούνται σε απόλυτη αλκοόλη για πέντε λεπτά, δύο διαδοχικές φορές και στη συνέχεια μπορούν να διατηρηθούν στο ψυγείο για χρονικό διάστημα 2 έως 3 μηνών, καθώς στη συνέχεια η ποιότητά τους μειώνεται κατά πολύ. 63

64 Πίνακας 6: Αναλώσιμα, υλικά και διαλύματα για τη δημιουργία παρασκευασμάτων πολυταινικών χρωμοσωμάτων. Με απλή γραμματοσειρά σημειώνονται τα χημικά και τα διαλύματα που απαιτούνται για τη δημιουργία παρασκευασμάτων πολυταινικών χρωμοσωμάτων, με πλάγια γραμματοσειρά αυτά που αναφέρονται στα παρασκευάσματα πολυταινικών χρωμοσωμάτων για τη χρήση σε in situ τεχνικές, ενώ με την έντονη γραμματοσειρά σημειώνονται αυτά που χρησιμοποιούνται και στις δύο περιπτώσεις. Παρασκευάσματα πολυταινικών χρωμοσωμάτων και πολυταινικών χρωμοσωμάτων in situ Eξοπλισμός Χημικά Διαλύματα Αντικειμενοφόροι πλάκες Οξικό οξύ HCl 1N (σε dh 2 O) Καλυπτρίδες (18x18 mm και 20x20mm) Βερνίκι νυχιών Πάραφιλμ Μικροσκόπιο Στερεοσκόπιο Βελόνες Λεπίδες ξυραφιού Θερμαινόμενη πλάκα 2.4 Υβριδισμός in situ (CH 3 COOH) Ένυδρο χλωριούχο ασβέστιο (CaCl 2 H 2 O) Υδροχλωρικό οξύ (HCl) 37% Γαλακτικό οξύ [CH 3 CH(OH)CO OH] Χλωριούχο κάλιο (KCl) Χλωριούχο νάτριο (NaCl) Όξινο ανθρακικό νάτριο (NaHCO 3 ) Αιθανόλη Υγρό άζωτο Διάλυμα γαλακτικού οξέοςοξικού οξέος: 80% γαλακτικό οξύ/60% οξικό οξύ σε αναλογία 1:1 Ringer (6,5 gr NaCl, 0,14 gr KCl, 0,2 gr NaHCO 3, 0,12 gr CaCl 2 *2 H 2 O, 0,01 gr NaH 2 PO 4 *2 H 2 O, 1000 ml dh 2 O) Διάλυμα χρωστικής 45% οξικό οξύ (σε dh 2 O) Διάλυμα γαλακτικού οξέοςοξικού οξέος: γαλακτικό οξύ/ dh 2 O/ οξικό οξύ σε αναλογία 2:3:4,5 Τα γονίδια που μελετήθηκαν στο συγκεκριμένο είδος είναι τα hsp70, sxl, white και scarlet. Για το λόγο αυτό ήταν απαραίτητο να χρησιμοποιηθούν οι κατάλληλοι ανιχνευτές, ώστε έπειτα από την επισήμανσή τους να χρησιμοποιηθούν για τον in situ υβριδισμό σε παρασκευάσματα πολυταινικών χρωμοσωμάτων του είδους Απομόνωση DNA ανιχνευτών Ως αρχικό δείγμα χρησιμοποιήθηκαν βακτηριακά στελέχη Escherichia coli μετασχηματισμένα με πλασμίδια που διέθεταν ενσωματωμένο το εκάστοτε επιθυμητό γονίδιο. Τα στελέχη αυτά ελήφθησαν έτοιμα από ήδη υπάρχον στοκ γλυκερόλης. 64

65 Σκοπός είναι οι αλληλουχίες αυτές να χρησιμοποιηθούν ως ανιχνευτές των επιθυμητών γονιδίων. Οι ανιχνευτές που χρησιμοποιήθηκαν ήταν ετερολόγοι για το είδος B. kandiensis και η προέλευσή τους φαίνεται στον πίνακα 7. Πίνακας 7: Οργανισμός προέλευσης κάθε ανιχνευτή γονιδίου και η αντίστοιχη βιβλιογραφία. Ανιχνευτής Οργανισμός Βιβλιογραφία προέλευσης hsp70 C. capitata Papadimitriou et al., 1998 sxl C. capitata Saccone et al., 1998 white B.tryoni Bennett C.L. and Frommer M., 1997 scarlet B.tryoni Zhao et al., 2003 Αρχικά, επιστρώθηκαν καλλιέργειες σε στερεό θρεπτικό μέσο. Κάτω από στείρες συνθήκες. Με τη βοήθεια μικροβιολογικού κρίκου λαμβάνεται μικρή ποσότητα από το στοκ της υγρής καλλιέργειας και επιστρώνεται σε τριβλία με άγαρ. Οι καλλιέργειες επωάζονται για 16 ώρες σε κλίβανο στους 37 ο C. Παρασκευή τριβλίων με στερεό θρεπτικό υλικό: Για την παρασκευή του στερεού θρεπτικού υλικού χρησιμοποιήθηκε LB medium (Lysogeny Broth medium) το οποίο είναι κατάλληλο μέσο για την ανάπτυξη βακτηρίων με την προσθήκη άγαρ (πίνακας 8). Το διάλυμα αποστειρώνεται, στη συνέχεια όταν το μέσο έχει κρυώσει στους ο C, προστίθεται κατάλληλο αντιβιοτικό- στην παρούσα περίπτωση αμπικιλλίνη- και τέλος απλώνεται στα τριβλία. Μετά τη στερέωση του θρεπτικού υλικού, τα τριβλία είναι έτοιμα για την επίστρωση της καλλιέργειας. Έλεγχος βακτηριακών στελεχών Προκειμένου να ελεγχθεί αν τα βακτηριακά στελέχη που πρόκειται να χρησιμοποιηθούν περιέχουν πράγματι τα επιθυμητά γονίδια, γίνεται απομόνωση του πλασμιδιακού DNA από τις καλλιέργειες και πέψη του με τα κατάλληλα ένζυμα περιορισμού. Προκειμένου να γίνει η απομόνωση, απαραίτητο αρχικό βήμα είναι η δημιουργία μιας υγρής καλλιέργειας του επιθυμητού βακτηριακού στελέχους. 65

66 Παρασκευή υγρής βακτηριακής καλλιέργειας Το υγρό μέσο που χρησιμοποιείται είναι και πάλι το LB medium, στο οποίο όμως δεν έχει προστεθεί άγαρ (πίνακας 8). Μετά τη δημιουργία του υγρού μέσου, μοιράζονται 5ml σε σωλήνα και αποστειρώνονται. Μετά την αποστείρωση και αφού το διάλυμα έχει ψυχθεί, προστίθεται ως αντιβιοτικό η αμπικιλλίνη και το υγρό μέσο είναι διαθέσιμο για χρήση. Για τη δημιουργία μιας υγρής καλλιέργειας χρησιμοποιείται μια αποικία από τις καλλιέργειες που έχουν επιστρωθεί στα τριβλία. Η αποικία λαμβάνεται κάτω από στείρες συνθήκες με τη βοήθεια μικροβιολογικού κρίκου και εμβαπτίζεται σε υγρό θρεπτικό μέσο. Έπειτα από την εμβάπτιση της αποικίας στο υγρό θρεπτικό μέσο, ακολουθεί επώαση για 16 ώρες στους 37 ο C με διαρκή ανάδευση. Πίνακας 8: Υλικά που απαιτούνται για τη δημιουργία στερεού και υγρού θρεπτικού υλικού για την καλλιέργεια βακτηρίων LB medium- στερεό θρεπτικό μέσο LB medium- υγρό θρεπτικό μέσο Υλικά Ποσότητες Ποσότητες Bacto- tryptone 10g 10g Bacto- Yeast extract 5g 5g NaCl 5g 5g Άγαρ 15g - Αμπικιλλίνη 100μg/ml 100μg/ml Τελικός όγκος 1 L 1 L Απομόνωση πλασμιδιακού DNA Η απομόνωση του πλασμιδιακού DNA πραγματοποιήθηκε από την υγρή καλλιέργεια του βακτηρίου με τη βοήθεια του κιτ. Το κιτ που χρησιμοποιήθηκε είναι το NucleoSpin Plasmid της εταιρείας Macherey-Nagel το οποίο περιέχει το αντίστοιχο πρωτόκολλο και τα απαραίτητα αντιδραστήρια. Πέψη πλασμιδιακού DNA Για τον έλεγχο του πλασμιδιακού DNA που απομονώθηκε από τα μετασχηματισμένα βακτήρια απαραίτητη είναι η πέψη του με κατάλληλα ένζυμα περιορισμού, προκειμένου να διαπιστωθεί αν προκύπτουν τα αναμενόμενα- με βάση την αλληλουχία του- τμήματα. Η πέψη πραγματοποιείται σε σωλήνες eppendorf (1,5 66

67 ml) όπου προστίθεται το DNA, το κατάλληλο ένζυμο περιορισμού μαζί με το αντίστοιχο ρυθμιστικό διάλυμα (buffer) σε τελικό όγκο 20μl. Τα αντιδραστήρια που χρησιμοποιήθηκαν είναι της εταιρείας Fermentas. Ακολουθεί επώαση για τρεις ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Τα είδη των ενζύμων περιορισμού που χρησιμοποιήθηκαν σε κάθε περίπτωση, καθώς και οι αντίστοιχες ποσότητες φαίνονται στους ακόλουθους πίνακες 9 και 10. Πίνακας 9: Τα ένζυμα και τα αντίστοιχα ρυθμιστικά διαλύματα (buffer) που χρησιμοποιήθηκαν για τον έλεγχο κάθε πλασμιδιακού DNA Ανιχνευτής Ένζυμο Buffer hsp70 EcoRI EcoRI sxl EcoRI- HindIII R white XhoI R scarlet EcoRI EcoRI Πίνακας 10: Τα αντιδραστήρια και οι αντίστοιχες ποσότητες που χρησιμοποιήθηκαν για να πραγματοποιηθεί η πέψη του πλασμιδιακού DNA από κατάλληλα ένζυμα περιορισμού Υλικά- αντιδραστήρια DNA Buffer Ένζυμο ddh 2 O Τελικός όγκος Ποσότητα 3 μl 2 μl 1 μl Διπλή πέψη: 1μl + 1μl 14μl Διπλή πέψη: 13μl 20μl Έλεγχος της πέψης Ο έλεγχος της πέψης πραγματοποιείται με ηλεκτροφόρηση όλης της ποσότητας της πέψης του πλασμιδιακού DNA. Η ηλεκτροφόρηση πρόκειται για μια εύκολη τεχνική η οποία χρησιμοποιείται για το διαχωρισμό τμημάτων DNA, μεγέθους έως και 1ng, ανάλογα με το ποσοστό της αγαρόζης που χρησιμοποιείται. Η τεχνική στηρίζεται στο γεγονός ότι τα νουκλεϊκά οξέα λόγω του αρνητικού τους φορτίου κινούνται προς την άνοδο μέσα σε ένα ηλεκτρικό πεδίο. Η ηλεκτροφόρηση πραγματοποιείται σε gel αγαρόζης περιεκτικότητας 0,8%. Για την παρασκευή του gel χρησιμοποιούνται 0,8g αγαρόζης, που διαλύονται σε 100ml διαλύματος 0,5 x ΤΒΕ. Η σύσταση του διαλύματος ΤΒΕ δίνεται στον πίνακα

68 Πίνακας 11: Σύσταση διαλύματος TBE σε συγκέντρωση 5Χ Διάλυμα ΤΒΕ Συστατικά Ποσότητα Tris- base 54 g Βορικό οξύ 27,5 g EDTA 20 ml ddh 2 O σε τελικό όγκο 1L Το διάλυμα θερμαίνεται σε φούρνο μικροκυμάτων, προκειμένου να διαλυθεί πλήρως η αγαρόζη και στη συνέχεια προστίθεται βρωμιούχο αιθίδιο (EtBr) σε συγκέντρωση 0,05μl/ml διαλύματος (εικόνα 35). Το βρωμιούχο αιθίδιο χρησιμοποιείται, καθώς συνδέεται με τα μόρια του DNA και φθορίζει κάτω από υπεριώδες φως, με αποτέλεσμα οι ζώνες του DNA να είναι ορατές. Εικόνα 35: Τρόπος παρασκευής gel αγαρόζης για την ηλεκτροφόρηση δειγμάτων DNA (15) Για την φόρτωση των δειγμάτων στο gel αγαρόζης προστίθεται σε κάθε eppendorf πέψης 1μl διαλύματος φόρτωσης. Το διάλυμα φόρτωσης περιέχει μπλε της βρωμοφαινόλης, κυανούν του ξυλενίου και γλυκερόλη. Οι χρωστικές είναι απαραίτητες ώστε να είναι ευδιάκριτη η πορεία της ηλεκτροφόρησης των δειγμάτων, ενώ η γλυκερόλη απαιτείται για να κατακαθίσουν τα δείγματα στις θέσεις φόρτωσης. Εκτός από τα δείγματα, σε ξεχωριστή θέση στο gel φορτώνεται και κατάλληλος DNA μάρτυρας μοριακών βαρών (ladder) για τον υπολογισμό του μοριακού βάρους και της ποσότητας του DNA των δειγμάτων (εικόνα 36). Ο μάρτυρας που χρησιμοποιήθηκε ήταν ο puc Mix (8) της εταιρείας Fermentas ή ο μάρτυρας Lambda DNA/HindII της 68

69 ίδιας εταιρείας. Η τάση που εφαρμόστηκε στην πηκτή ήταν 100 Volt, για χρονικό διάστημα 30 λεπτών. Εικόνα 36: Τρόπος φόρτωσης των δειγμάτων DNA σε gel αγαρόζης, με σκοπό την ηλεκτροφόρησή τους (16) Επισήμανση πλασμιδιακού DNA Έπειτα από τον έλεγχο του πλασμιδιακού DNA ως προς την ύπαρξη των επιθυμητών γονιδίων, αυτό μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως ανιχνευτής. Για την επισήμανση του ανιχνευτή χρησιμοποιήθηκε το κιτ Dig-High Prime της εταιρείας Roche. Το πρωτόκολλο της σήμανσης στηρίζεται στην τεχνική Random Primed Labeling. Το κιτ περιλαμβάνει διγοξυγενίνη-11-dutp, καθώς και το ένζυμο Klenow. Η μέθοδος στηρίζεται στην αποδιάταξη των δίκλωνων ανιχνευτών και τη σταδιακή αντιγραφή της κάθε αλυσίδας με τη βοήθεια τυχαίων εξαμερών εκκινητών και της πολυμεράσης Klenow. Το πρόδρομο μόριο που χρησιμοποιείται είναι το dutp, που είναι επισημασμένο με το στεροειδές απτένιο διγοξυγενίνη (Dig-11- dutp) α. Επισήμανση ανιχνευτή - Σε ένα σωλήνα τύπου eppendorf προστίθεται 1μg πλασμιδιακού DNA και συμπληρώνεται με απεσταγμένο νερό μέχρι ο τελικός όγκος να είναι 16 μl. - Αποδιάταξη του DNA μέσω βρασμού για 10 λεπτά και άμεση τοποθέτησή του σε πάγο 69

70 - Προσθήκη 4 μl Mix Dig High Prime- spin ώστε να αναδευθεί το διάλυμα - Επώαση δείγματος 1-24 ώρες στους 37 ο C. Στην παρούσα εργασία η επώαση ήταν εικοσιτετράωρη. - Η αντίδραση σταματά με την προσθήκη 2 μl 0,2 Μ EDTA ph Προσθήκη 100 μl διαλύματος υβριδισμού - Φύλαξη του ανιχνευτή στους -20 ο C μέχρι τη χρήση του σε in situ υβριδισμό β. Έλεγχος επισήμανσης ανιχνευτών Τα διαλύματα που είναι απαραίτητα για τα επόμενα στάδια του in situ υβριδισμού, καθώς και ο τρόπος παρασκευής τους δίνονται παρακάτω: Buffer 1: - 0,1 M Tris- HCl ph 7,5-0,15 M NaCl Buffer 2: - Συγκέντρωση 0,5% w/v - 1g Blocking reagent (παρέχεται από το κιτ) ml buffer 1 - Απαραίτητη είναι η ανάδευση και η θέρμανση σε μέγιστη θερμοκρασία 65 ο C Buffer 3: - 0,1 M Tris- HCl ph 9,5-0,05 M MgCl 2-0,1 M NaCl Tris- HCl 1M: - Tris 121,14 g ml ddh 2 O - Σταδιακή προσθήκη HCl έως το επιθυμητό ph - Συμπλήρωση με ddh 2 O μέχρι 1 lt Η διαδικασία που ακολουθήθηκε για τον έλεγχο της επισήμανσης των ανιχνευτών είναι η εξής: 70

71 - Σε ένα κομμάτι μεμβράνης νιτροκυτταρίνης προστίθεται 1 μl ανιχνευτή. Στη μεμβράνη μπορούν να προστεθούν περισσότεροι από έναν ανιχνευτή, οι θέσεις των οποίων διαχωρίζονται και επισημαίνονται. - Αναμονή μέχρι ο ανιχνευτής να στεγνώσει και να μην διακρίνεται στη μεμβράνη. - Η μεμβράνη εκτίθεται σε UV ακτινοβολία για 5 λεπτά. Ο χρόνος δεν θα πρέπει να ξεπεραστεί, καθώς υπάρχει πιθανότητα καταστροφής του DNA από την ακτινοβολία. - Εμβάπτιση της μεμβράνης σε buffer 1 για 5 λεπτά. - Εμβάπτιση της μεμβράνης σε buffer 2 για 20 λεπτά. - Εμβάπτιση της μεμβράνης σε buffer 1 για 20 λεπτά. - Φυγοκέντρηση αντισωμάτων για 5 λεπτά στις rpm. - Αραίωση των αντισωμάτων: σε 3 ml buffer 2 προστίθεται 1 μl αντισωμάτων Anti- Dig Fab fragments (Roche) και ακολουθεί η ανάδευσή τους. - Εμβάπτιση της μεμβράνης στο διάλυμα των αντισωμάτων για 30 λεπτά. - Ακολουθούν δύο διαδοχικές εμβαπτίσεις σε buffer 1 για 15 λεπτά. - Η μεμβράνη τοποθετείται και παραμένει σε buffer 3 μέχρι τη μεταφορά της στο διάλυμα χρώματος. - Σε ένα μικρό τριβλίο προστίθενται 3 ml buffer 3 και 60 μl διαλύματος χρώματος BCIP/NBT (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate/nitro blue tetrazolium) (Roche) τα οποία αναμιγνύονται με τη βοήθεια πιπέτας. Το διάλυμα χρώσης πριν τη χρήση του τοποθετείται στο υδατόλουτρο στους 37 ο C στην περίπτωση που έχει ίζημα με στόχο τη διάλυση του. Το διάλυμα χρώματος θα πρέπει να κατασκευάζεται και να παραμένει σε σκοτεινό χώρο, καθώς είναι φωτοευαίσθητο. - Η μεμβράνη μεταφέρεται σε διάλυμα χρώματος και επωάζεται για λεπτά σε σκοτεινό σημείο Προετοιμασία παρασκευασμάτων - Το υδατόλουτρο ρυθμίζεται στους 65 ο C. - Πραγματοποιείται ενυδάτωση των παρασκευασμάτων με διαδοχική εμβάπτιση σε διαλύματα αλκοόλης: 70%, 50% και 30% για 2 λεπτά στην κάθε περίπτωση. - Τα παρασκευάσματα εμβαπτίζονται σε 2 x SSC (γρήγορο ξέπλυμα). 71

72 - Τα παρασκευάσματα μεταφέρονται σε σκεύος με ζεστό 2 x SSC (65 ο C- ίδια θερμοκρασία με αυτή του υδατόλουτρου). Το σκεύος τοποθετείται στο υδατόλουτρο (65 ο C) για 30 λεπτά με σκοπό τη σταθεροποίηση των χρωμοσωμάτων. - Γρήγορο ξέπλυμα των παρασκευασμάτων σε κρύο 2 x SSC. - Μετουσίωση σε 0,07Μ NaOH για 2 λεπτά (το NaOH παρασκευάζεται εκείνη τη στιγμή σε τελικό όγκο 300 ml ddh 2 O). Λόγω της ευαισθησίας των πολυταινικών χρωμοσωμάτων κάποια παρασκευάσματα πιθανώς να απαιτείται να παραμείνουν για μικρότερο χρονικό διάστημα στο διάλυμα NaOH (1,25 1,5 λεπτό). - Πραγματοποιείται αφυδάτωση των παρασκευασμάτων με διαδοχική εμβάπτιση σε διαλύματα αλκοόλης: 30%, 50%, 70% και 96% για 2 λεπτά στην κάθε περίπτωση. - Τα παρασκευάσματα στεγνώνουν στον αέρα και πρέπει να χρησιμοποιηθούν εντός 4 ωρών. - Πραγματοποιείται κατάλληλη προετοιμασία υγρού θαλάμου (πλαστικά κουτιά) στα οποία θα τοποθετηθούν τα παρασκευάσματα ώστε να γίνει ο υβριδισμός. Μέσα στο σκεύος τοποθετείται κατάλληλου μεγέθους διηθητικό χαρτί εμποτισμένο με διάλυμα 4 x SSC. Τα κουτιά τοποθετούνται σε κλίβανο ανάλογης θερμοκρασίας με αυτή στην οποία θα πραγματοποιηθεί ο υβριδισμός Υβριδισμός - Πραγματοποιείται αποδιάταξη του ανιχνευτή μέσω βρασμού για 10 λεπτά και άμεση τοποθέτηση του σε πάγο. Ακολουθεί ανάδευση spin. - Τοποθέτηση 15 μl ανιχνευτή σε κάθε παρασκεύασμα (στην περιοχή στην οποία έχουν καθηλωθεί τα χρωμοσώματα) και τοποθέτηση καλυπτρίδας (18 x 18 mm) με προσοχή, αποφεύγοντας τον σχηματισμό φυσαλίδων. - Τα παρασκευάσματα τοποθετούνται στο ειδικό κουτί υβριδοποίησης, το οποίο σφραγίζεται με κολλητική ταινία και τοποθετείται σε επωαστικό κλίβανο στην κατάλληλη θερμοκρασία υβριδισμού για τουλάχιστον 16 ώρες. Οι θερμοκρασίες που χρησιμοποιήθηκαν για τον υβριδισμό των ανιχνευτών στα επιθυμητά γονίδια φαίνονται στον πίνακα

73 Πίνακας 12: Η κατάλληλη θερμοκρασία υβριδισμού για κάθε ανιχνευτή γονιδίου. Ανιχνευτής hsp70 sxl white scarlet Θερμοκρασία υβριδισμού 60 Ο C 60 Ο C 54 Ο C 60 Ο C Ανίχνευση σήματος - Η θερμοκρασία του υδατόλουτρου ρυθμίζεται περίπου 10 με 12 ο C κάτω από τη θερμοκρασία υβριδισμού (π.χ. αν η θερμοκρασία υβριδισμού είναι 60 ο C τότε το υδατόλουτρο ρυθμίζεται περίπου στους ο C). - Θέρμανση 2 x SSC σε κατάλληλο σκεύος στη θερμοκρασία του υδατόλουτρου. - Εμβάπτιση των παρασκευασμάτων σε κρύο 2 x SSC με σκοπό την απομάκρυνση των καλυπτρίδων και άμεση μεταφορά τους στο σκεύος με το ζεστό 2 x SSC. - Το σκεύος με τα παρασκευάσματα τοποθετείται στο υδατόλουτρο όπου παραμένει για 15 λεπτά. - Μεταφορά παρασκευασμάτων σε κρύο 2 x SSC για 15 λεπτά. - Μεταφορά παρασκευασμάτων σε buffer 1 για 5 λεπτά. - Μεταφορά παρασκευασμάτων σε buffer 2 για 30 λεπτά. - Φυγοκέντρηση αντισωμάτων για 5 λεπτά στις rpm - Σύντομη εμβάπτιση παρασκευασμάτων σε buffer 1. - Αραίωση αντισωμάτων 1:500 σε buffer 2. Σύντομο vortex στα αραιωμένα αντισώματα. Ο όγκος του αραιωμένου διαλύματος αντισωμάτων που πρέπει να παρασκευαστεί υπολογίζεται δεδομένου ότι σε κάθε παρασκεύασμα τοποθετούνται 200 μl διαλύματος. - Τα παρασκευάσματα μεταφέρονται και πάλι στο κουτί υβριδισμού. - Τοποθετούνται 200 μl διαλύματος αντισωμάτων σε κάθε παρασκεύασμα και εφαρμόζεται γρήγορα και προσεκτικά καλυπτρίδα (22 x 22 mm) ώστε να μη στεγνώσουν τα παρασκευάσματα. - Τα παρασκευάσματα επωάζονται για λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. - Απομάκρυνση καλυπτρίδων από τα παρασκευάσματα. - Ακολουθούν δύο διαδοχικές εμβαπτίσεις των παρασκευασμάτων σε buffer 1 για 15 λεπτά κάθε φορά. 73

74 - Ξέπλυμα παρασκευασμάτων σε buffer 3 και παραμονή σε αυτό έως την τοποθέτηση αυτών σε διάλυμα χρώματος. - Παρασκευή διαλύματος χρώματος με αραίωση 1:50 σε buffer 3. Ο υπολογισμός της ποσότητας του διαλύματος που πρέπει να παρασκευαστεί γίνεται δεδομένου ότι για κάθε παρασκεύασμα απαιτείται 1ml διαλύματος. Το διάλυμα χρώματος πρέπει να παρασκευάζεται και να παραμένει σε σκοτεινό χώρο. - Τα παρασκευάσματα μεταφέρονται ξανά στα κουτιά υβριδισμού όπου τοποθετείται 1 ml διαλύματος χρώματος στο καθένα και επωάζονται σε σκοτεινό χώρο για περίπου 40 λεπτά. - Τα παρασκευάσματα ξεπλένονται με ddh 2 O δύο διαδοχικές φορές και έπειτα μπορούν να παρατηρηθούν στο οπτικό μικροσκόπιο ώστε να ελεγχθεί το σήμα. 2.5 Ανάλυση μιτοχονδριακού DNA του είδους B. kandiensis Προκειμένου να πραγματοποιηθεί η ανάλυση του μιτοχονδριακού DNA του υπό μελέτη είδους, έγινε του mtdna από άτομα εργαστηριακής καλλιέργειας που διατηρούνταν σε σωλήνες eppendorf στην κατάψυξη. Αρχικά απομονώθηκε μιτοχονδριακό DNA από 10 άτομα, 5 εκ των οποίων ήταν θηλυκά και 5 αρσενικά. Στη συνέχεια ακολούθησε ηλεκτροφόρηση του απομονωμένου mtdna προκειμένου να ελεγχθεί η επιτυχία του πρωτοκόλλου απομόνωσης. Επιπλέον, με την ηλεκτροφόρηση επιλέχθηκε το άτομο με βάση το οποίο θα γινόταν η ανάλυση του μιτοχοδνριακού DNA, στηριζόμενοι στην ποιότητα και στην ποσότητα του γενετικού υλικού που απομονώθηκε Απομόνωση μιτοχονδριακού DNA με CTAB Η απομόνωση του μιτοχονδριακού DNA από τα ενήλικα θηλυκά και αρσενικά άτομα πραγματοποιήθηκε με το πρωτόκολλο CTAB (Cetyltrimethyl ammonium bromide). Το ρυθμιστικό διάλυμα CTAB (CTAB buffer) είναι έτοιμο προς χρήση. Η πρωτεϊνάση Κ- σε τελική συγκέντρωση 0,1 mg/ml- και η β- μερκαπτοαιθανόλη- σε τελική συγκέντρωση 0,2%- μπορούν να προστεθούν λίγο πριν τη χρήση του διαλύματος. Ωστόσο, στην παρούσα πειραματική πρακτική, η β-μερκαπτοαιθανόλη δεν χρησιμοποιήθηκε, ενώ η πρωτεϊνάση Κ προστέθηκε σε ξεχωριστό βήμα μέσα στο πρωτόκολλο. 74

75 1. Τα ενήλικα άτομα B. kandiensis που ήταν αποθηκευμένα σε αιθανόλη αφήνονται να στεγνώσουν σε απορροφητικό ή διηθητικό χαρτί για 15 λεπτά ή ξεπλένονται με νερό μέχρι να απομακρυνθεί η αιθανόλη. 2. Κάθε άτομο μεταφέρεται σε σωλήνα τύπου eppendorf όγκου1,5 ml. 3. Παράγεται διάλυμα CTAB- πρωτεϊνάσης Κ των 200μl για κάθε eppendorf, με την πρωτεϊνάση Κ να έχει τελική συγκέντρωση 0,1 mg/ml. 4. Προστίθενται 200μl διαλύματος CTAB- πρωτεϊνάσης Κ σε κάθε σωλήνα τύπου eppendorf και το άτομο συνθλίβεται με ένα πλαστικό αποστειρωμένο έμβολο μέχρι να διακρίνεται μόνο ένα ενιαίο διάλυμα και να μην είναι ορατά μεμονωμένα τμήματα ιστού. 5. Επώαση στους ο C για μία ώρα σε υδατόλουτρο. 6. Προσθήκη 200μl αποστειρωμένο ddh 2 O (πραγματοποιείται ώστε να αυξηθεί ο όγκος και να γίνει πιο εύκολη η απομόνωση με το χλωροφόρμιο). 7. Προστίθεται ίσος όγκος (συνολικά 400μl) χλωροφορμίου. 8. Οι φάσεις αναμιγνύονται ανακινώντας τα σωληνάρια αρκετές φορές για 1-2 λεπτά. 9. Φυγοκέντρηση στις rpm για 5 λεπτά. 10. Η άνω υδατική φάση μεταφέρεται σε ένα νέο σωληνάριο eppendorf των 1,5ml, αποφεύγοντας τα στερεά τμήματα και την οργανική φάση. 11. Προστίθεται ίσος όγκος ( μl) ισοπροπανόλης και ακολουθεί ανάδευση με ανακίνηση για αρκετές φορές. 12. Αποθήκευση των σωληναρίων στους -20 ο C για τουλάχιστον μισή ώρα. 13. Φυγοκέντρηση στις rpm για λεπτά. 14. Απομακρύνεται το υπερκείμενο. 15. Προστίθεται 70% αιθανόλη μέχρι τον τελικό όγκο 1ml και τα σωληνάρια ανακινούνται 5-6 φορές. 16. Φυγοκέντρηση στις rpm για 5 λεπτά. 17. Απομάκρυνση του υπερκειμένου. 18. Spin για 5-6 δευτερόλεπτα 19. Η εναπομένουσα αλκοόλη απομακρύνεται με τη βοήθεια της πιπέτας, αποφεύγοντας την επαφή και τη διατάραξη του ιζήματος. 20. Επώαση για 5-10 λεπτά στους 37 ο C για να απομακρυνθούν ίχνη αιθανόλης. 21. Διάλυση σε 100 μl διαλύματος ΤΕ (ΤΕ buffer) ή σε αποστειρωμένο ddh 2 O. 75

76 2.5.2 Ηλεκτροφόρηση απομονωμένου mtdna Ο έλεγχος των δειγμάτων mtdna που απομονώθηκαν με το πρωτόκολλο CTAB, πραγματοποιήθηκε με ηλεκτροφόρησή τους σε πηκτή αγαρόζης 0,8%. Από το απομονωμένο δείγμα χρησιμοποιήθηκαν 5μl DNA, ενώ επιπλέον σε κάθε δείγμα που φορτώνεται στο gel αγαρόζης, προστίθενται 4μl ddh 2 O και 1μl χρωστικής, ώστε ο τελικός όγκος που θα φορτωθεί να είναι 10 μl. Ο μάρτυρας μοριακών βαρών που χρησιμοποιήθηκε είναι ο ladder Lambda DNA/HindIII (5) της εταιρείας Fermentas, σε ποσότητα 5μl (100 ng/μl) Αλληλούχιση mtdna του είδους B. kandiensis Στόχος της μοριακής ανάλυσης είναι η πλήρης αλληλούχιση του μιτοχονδριακού DNA του υπό μελέτη είδους, B. kandiensis. Προκειμένου να επιτευχθεί αυτό έχουν σχεδιαστεί ειδικοί εκκινητές με βάση τον συγγενικό οργανισμό B. dorsalis. Οι εκκινητές «διαιρούν» το μιτοχονδριακό γονιδίωμα σε επί μέρους τμήματα, προκειμένου να ενισχυθούν με τη μέθοδο PCR (Polymerase Chain Reaction- μέθοδος Αλυσιδωτής Αντίδρασης Πολυμεράσης) διαδοχικά τμήματα του γονιδιώματος Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης (PCR) Η PCR πρόκειται για μια in vitro ενζυμική μέθοδο αναπαραγωγής DNA χωρίς τη μεσολάβηση ζωντανών κυττάρων ή οργανισμών. Με τη μέθοδο αυτή μια συγκεκριμένη περιοχή του γονιδιώματος μπορεί να πολλαπλασιαστεί έως και εκατομμύρια φορές (εικόνα 37). Το ένζυμο που χρησιμοποιείται στη μέθοδο της PCR είναι μια θερμοανθεκτική DNA πολυμεράση, η Taq πολυμεράση, η οποία προέρχεται από το βακτήριο Thermus aquaticus. Συγκεκριμένα χρησιμοποιήθηκε η πολυμεράση BioTaq της εταιρείας BIOLINE και η πολυμεράση OneTaq της εταιρείας New England Biolabs για την ενίσχυση με το ζεύγος

77 Εικόνα 37: Η διαδικασία της μεθόδου PCR (17) Η περιοχή που ενισχύεται κάθε φορά εξαρτάται από τους εκκινητές που χρησιμοποιούνται. Ως εκκινητές ορίζονται ολιγονουκλεοτιδικές αλληλουχίες, μήκους νουκλεοτιδίων συνήθως, που είναι συμπληρωματικές με το τμήμα που βρίσκεται μπροστά από την περιοχή που τίθεται προς ενίσχυση. Οι εκκινητές σχεδιάζονται ανά ζεύγη, έτσι ώστε ένας εκκινητής να συνδέεται στο εμπρόσθιο τμήμα της επιθυμητής αλληλουχίας και καλείται forward (F) εκκινητής. Ο δεύτερος εκκινητής του ζεύγους προσδένεται στη συμπληρωματική αλυσίδα του DNA εξωτερικά από το τέλος του επιθυμητού τμήματος και καλείται reverse (R) εκκινητής. Έτσι, οι δύο εκκινητές επιμηκύνονται ταυτόχρονα ενισχύοντας το ενδιάμεσο τμήμα του DNA, το οποίο ορίζεται συνήθως στις 800 βάσεις περίπου. Εκτός από το μέγεθος των εκκινητών, που βέλτιστα περιορίζεται στα bp, είναι απαραίτητο το ποσοστό των βάσρων G+C να είναι υψηλότερο από 45%. Με τον τρόπο αυτό η σύνδεση του εκκινητή με το αντίστοιχο τμήμα της αλληλουχίας είναι ισχυρότερη. Επιπλέον, οι εκκινητές κάθε ζεύγους δεν πρέπει να εμφανίζουν συμπληρωματικότητα μεταξύ τους, ώστε να μην σχηματίζουν δεσμούς που να αποτρέπουν τον υβριδισμό τους στην αλληλουχία του DNA. Επιπλέον, η βέλτιστη θερμοκρασία στην οποία λειτουργούν (Tm annealing) πρέπει να είναι υψηλή, ώστε η σύνδεση με το DNA να είναι πιο εξειδικευμένη και όχι γενική. 77

78 Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν σχεδιάστηκαν στα προγράμματα OligoExplorer και OligoAnalyzer με βάση τις αλληλουχίες του μιτοχονδριακού DNA του συγγενικού είδους B. dorsalis. Οι αλληλουχίες των εκκινητών, τα τμήματα που ενισχύουν, καθώς και οι θερμοκρασίες στις οποίες γίνεται η επιμήκυνση σε κάθε περίπτωση, φαίνονται στον παρακάτω πίνακα (πίνακας 13). Τα ζεύγη των εκκινητών κατασκευάστηκαν από την εταιρία Intergrated DNA Technologies (IDT). Δύο διαδοχικά ζεύγη εκκινητών περιέχουν αλληλοεπικαλυπτόμενες αλληλουχίες μήκους περίπου νουκλεοτιδίων, καθώς αυτό επιτρέπει τη σύνδεση των διαδοχικών αλληλουχιών σε μια ενιαία. Πίνακας 13: Τα ζεύγη των εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν για την ενίσχυση του μιτοχονδριακού DNA του είδους Bactrocera kandiensis, οι αντίστοιχες αλληλουχίες τους, καθώς και οι θερμοκρασίες που απαιτούν για να επιτευχθεί η επιμήκυνσή τους. Οι εκκινητές που σημειώνονται με κόκκινο χρώμα εκκρεμούν ως προς την επιτυχή πραγματοποίηση της PCR και της αλληλούχισης των αντίστοιχων τμημάτων. Ζεύγος Όνομα εκκινητή Θέση σύνδεσης εκκινητή (Β.d.) Αλληλουχία εκκινητή (5-3 ) 1 ο 1F 317F GAACCCTAATCACTGTATCCTC 1R 846R TTCACTTGCTTGTATGGCTGC 2 ο 2F 757F GACTTAATCAAACTTCTCTGCG 2R 1623R GATGTTCCTACTATTCCTGCTC 3 ο 3F 1507F GTCTATCGCCTAAACTTCAGC 3R 2293R CCAGGATTCGGGATAATTTCC 4 ο 4F 2161F AGACCGAAACTTAAATACTTCC 4R 3056R GAGGTAGTTCTGAATAACTGTG 5 ο 5F 2850F CAGACTATCCAGATGCTTACAC 5R 3656R CTACCTTTACACCTAAGGCTG 6 ο 6F 3518F GAATTAGCAACAGACGGATTCC 6R 4251R CGTGAGGGTATTAATCAGTAGG 7 ο 7F 3968F TTTGGTGCCTCAAATAGCCC 7R 4650R AGAGTAAGTAATAAATGTCCTGC 8 ο 8F 4508F GCTCACCTAGTACCTCAAGGAACC 8R 5137R CAATGGCTGGAGATAAACTTCTGTGG 9F 5014F 9 ο CTACACACCTTACCTGTAACATTAGG 9R 5814R GTGAAGAAGACTTGGGATCAAATCC 10 ο 10F 5623F ATTTGACTTCCAATCATAAGGTC 10R 6439R GCTTAAAATAGAGCATAACACTG 11 ο 11F 6220F CTCCAATTAAGGAAGTATGACG 11R 7014R GACTGTCTGTTATTCTTTTCGG 12 ο 12F 6906F TATACCTCGCAATATAACTCAACC 12R 7746R TAATCGGATTGGGGATGTGG 13 ο 13F 7555F ATAGCAGCAGGTAATCAAGAAG 13R 8350R TTAGAGGGGGTAAGATTCGTG 14 ο 14F 8198F AACCTCATTTCATTGACACCAC 14R 8978R CCTAAGGCTCATGTTGAAGC Μέγεθος τμήματος που ενισχύεται Tmannealing ο C o C o C ο C ο C ο C o C o C o C (gel extraction) ο C ο C ο C ο C ο C 78

79 15 ο 15F 8775F AGCCTTTAAATCAGTTTGACGC 15R 9681R GAGTATGTGAAGGTGCTTTGG 16 ο 16F 9388F ATTCAAAATCTCAGTAAAATAAGACC 16R 10336R TGTTGATAGTTTATCTATAAATACGAC 17 ο 17F 10073F ATAAATCACCCCTTAGCAATAGG 17R 10859R GATCCGTAGTAGATCCCACG 18 ο 18F 10711F GCAGACATCAACTTAGCATTC 18R 11431R AGAGGACTAGGGCAATTACC 19 ο 19F 11204F ACCCCTACTTCTCATACAAGG 19R 12077R GTGAATCGGAGTTAGTTTCTGG 20 ο 20F 11861F TAACGAAAACGAGGTAAAGTCCC 20R 12620R TTTTGGAACGGAAGGTTCTAGG 21 ο 21F 12529F CGCATCACAAAAAGGTTGAGG 21R 13213R AGACGAGAAGACCCTATAAATC 22 ο 22F 13004F TCTCCAAAAAAATTACGCTGTTATCCC 22R 13929R ATTGTACCTTGTGTATCAGGGTTTATC 23 ο 23F 13621F GCTAATTCTAAGCATACATTTTATATTACC 23R 14518R CTGTAATTGATAATCCACGATGAACC 24 ο 24F 14226F ACCTTAATAGCAAGAGCGACG 24R 14801R CTAAATTTGTGCCAGCAGCC 25 ο 25bF 14605F CATTTTAAATAATAGGGTATCTAATCCTAG 25R 15135R TTAATGAAAAACGGTATATTACTTAGGG 26 ο 25cF 14894F AGCAAAAATACACGCAAAAACTTAC 25bR 15850R TTTATACTTACATTTAAGTGGTGTATG 27 ο 26F 15706F AATTCTCGGAAATGTCTATATTGG 26R 473R ACTGCTGAGGCTATGGCTTG ο C o C o C o C ο C o C ο C ο C (One Taq) ο C o C ο C ο C Στην μέθοδο της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης, εκτός από την πολυμεράση και τους εκκινητές, είναι απαραίτητα και άλλα αντιδραστήρια. Απαραίτητα είναι τα dntps, δηλαδή τα διάφορα νουκλεοτίδια που χρησιμοποιούνται, προκειμένου να σχηματιστούν οι νέοι κλώνοι του επιθυμητού τμήματος κατά την επιμήκυνση, καθώς και κατάλληλο buffer αντίδρασης, αλλά και διάλυμα χλωριούχου μαγνήσιου (MgCl 2 ). Ο ρόλος του MgCl 2 είναι ιδιαίτερα σημαντικός, καθώς βοηθάει τη δράση της DNA πολυμεράσης κατά την επιμήκυνση. Αύξηση της ποσότητας του MgCl 2, αυξάνει τη δράση της πολυμεράσης, μειώνοντας όμως ταυτόχρονα την ειδικότητα της αντίδρασης, και το αντίστροφο. Τόσο η DNA πολυμεράση, όσο και τα διαλύματα buffer και MgCl 2 που χρησιμοποιήθηκαν προμηθεύτηκαν από το κιτ BIOTAQ DNA Polymerase της εταιρείας BIOLINE. Τα dntps προέρχονται από την εταιρεία Invitrogen (100mΜ dntp Set- PCR Grade). Στην περίπτωση που χρησιμοποιήθηκε η OneTaq πολυμεράση, δεν χρησιμοποιήθηκε buffer και MgCl 2, καθώς το συγκεκριμένο κιτ της New England 79

80 Biolabs, φέρει το αντίστοιχο OneTaq Standard Reaction Buffer 5Χ που αντικαθιστά τα παραπάνω διαλύματα. Οι συγκεντρώσεις και οι ποσότητες των αντιδραστηρίων που χρησιμοποιήθηκαν για την PCR φαίνονται στον πίνακα 14, όσον αφορά τις αντιδράσεις με την DNA πολυμεράση BioTaq και στον πίνακα 15, όσον αφορά τις αντιδράσεις με την OneTaq πολυμεράση. Το μηχάνημα PCR που χρησιμοποιήθηκε ήταν το Lab Cycler της εταιρείας SensoQuest. Πίνακας 14: Οι αρχικές και οι τελικές συγκεντρώσεις, καθώς και οι ποσότητες των αντιδραστηρίων που χρησιμοποιήθηκαν σε κάθε αντίδραση PCR για την ενίσχυση του mtdna του είδους B. kandiensis με την DNA πολυμεράση BioTaq. Αντιδραστήρια Αρχική συγκέντρωση Τελική συγκέντρωση μl/ αντίδραση PCR Buffer 10Χ 1X 2,5 MgCl 2 50 mm 1,5 mm 0,75 dntps 2,5 mm 200μM 2 Primer Forward 25 pmol/ μl 0,5 pmol/ μl 0,5 Primer Reverse 25 pmol/ μl 0,5 pmol/ μl 0,5 BIOTAQ (Bioline) H 2 O DNA 5 Unit/ μl 1 Unit/ 0,2 αντίδραση Μέχρι τον τελικό όγκο της αντίδρασης 1 μl Τελικός όγκος αντίδρασης: 25μl 80

81 Πίνακας 15: Οι αρχικές και οι τελικές συγκεντρώσεις, καθώς και οι ποσότητες των αντιδραστηρίων που χρησιμοποιήθηκαν σε κάθε αντίδραση PCR για την ενίσχυση του mtdna του είδους B. kandiensis με την DNA πολυμεράση OneTaq. Αντιδραστήρια OneTaq Standard Reaction Buffer Αρχική Τελική μl/ αντίδραση συγκέντρωση συγκέντρωση 5X 1X 5 dntps 2,5 mm 200μM 2 Primer Forward Primer Reverse OneTaq DNA Polymerase DNA H 2 O 25 pmol/ μl 0,5 pmol/ μl 0,2 25 pmol/ μl 0,5 pmol/ μl 0,2 0,625 units/ 25 μl PCR 0,125 1 μl Μέχρι τον τελικό όγκο της αντίδρασης Τελικός όγκος αντίδρασης: 25μl Με τη βοήθεια του ενζύμου της πολυμεράσης, οι εκκινητές επιμηκύνονται, αντιγράφοντας την επιθυμητή περιοχή. Η διαδικασία αυτή πραγματοποιείται σε πολλούς κύκλους (30-40), προκειμένου να παραχθούν εκατομμύρια αντίγραφα της αλληλουχίας (πίνακας 16). Πιο συγκεκριμένα, τα στάδια της PCR είναι τα εξής: 1. Αρχική αποδιάταξη του DNA. Οι δύο αλυσίδες του DNA αποχωρίζονται με εφαρμογή υψηλής θερμοκρασίας (94 ο C για 3 λεπτά) (denaturation). 2. Αποδιάταξη του DNA στους 94 ο C για 45 δευτερόλεπτα. 3. Σύνδεση των εκκινητών στο DNA εκμαγείο σε θερμοκρασία που εξαρτάται από τον εκκινητή που χρησιμοποιείται για διάστημα 30 δευτερολέπτων (Οι θερμοκρασίες για κάθε ζεύγος εκκινητών δίνονται στον πίνακα 13). 81

82 4. Επιμήκυνση των εκκινητών στους 72 ο C για 60 δευτερόλεπτα (extension). Τα στάδια 2-4 επαναλαμβάνονται όσες φορές έχει οριστεί για την ενίσχυση του επιθυμητού τμήματος. Τα στάδια αυτά αποτελούν τους «κύκλους» της PCR, δηλαδή το πόσες φορές θα πραγματοποιηθεί η σύνδεση των εκκινητών και στη συνέχεια η επιμήκυνσή τους. Καθώς η διαδικασία επαναλαμβάνεται, οι νεοσυντιθέμενοι κλώνοι χρησιμοποιούνται ως εκμαγεία για τη σύνθεση του DNA, με αποτέλεσμα έπειτα από κάθε κύκλο να παράγονται νέα μόρια της υπό ενίσχυση αλληλουχίας. Οι κύκλοι συνήθως ορίζονται σε Ακολουθεί ένα στάδιο των 7 λεπτών στους 72 ο C. 6. Τέλος, τα δείγματα μπορούν να παραμείνουν στους 8 ο C, συνήθως μέχρι να αποθηκευτούν στο ψυγείο ή στην κατάψυξη. Η διαδικασία αυτή πραγματοποιήθηκε για όλα τα τμήματα DNA που στο άθροισμά τους αντιστοιχούν στο συνολικό μιτοχονδριακό DNA του υπό μελέτη είδους, με τη βοήθεια 27 ζευγών εκκινητών. Εκτός από το δείγμα DNA που ενισχύονταν κάθε φορά με τη μέθοδο της PCR, χρησιμοποιούνταν και ένας αρνητικός μάρτυρας, δηλαδή ένα δείγμα που περιείχε όλα τα αντιδραστήρια, αλλά δεν περιείχε DNA. Στόχος του αρνητικού μάρτυρα είναι να καταδείξει ότι δεν υπάρχουν επιμολύνσεις στα αντιδραστήρια που χρησιμοποιούνται και επομένως δεν υπάρχουν ψευδώς θετικά αποτελέσματα. Πίνακας 16: Τα διάφορα στάδια της μεθόδου PCR Θερμοκρασία Χρονική διάρκεια Επαναλήψεις Στάδιο 94 ο C 3 min Αρχική αποδιάταξη 94 ο C 45sec Αποδιάταξη 53 ο 59 ο C 30sec 40 κύκλοι Σύνδεση εκκινητή (annealing) 72 ο C 60sec Επιμήκυνση 72 ο C 7min 8 ο C 5min Διατήρηση 82

83 2.5.5 Ηλεκτροφόρηση PCR Το τμήμα DNA που ενισχύεται έπειτα από κάθε PCR, ηλεκτροφορείται σε πηκτή αγαρόζης. Η περιεκτικότητα της αγαρόζης στο gel είναι 0,8% και παρασκευάζεται με τον τρόπο που περιγράφηκε παραπάνω. Σε κάθε πηγαδάκι της πηκτής φορτώνεται το προϊόν της PCR και σε ένα διαδοχικό πηγαδάκι ο αντίστοιχος αρνητικός μάρτυρας. Για την φόρτωση κάθε δείγματος χρησιμοποιούνται 2μl προϊόντος PCR, τα οποία τοποθετούνται σε μια σταγόνα που αποτελείται από 7μl ddh 2 O και 1μl διάλυμα φόρτωσης, όπως περιγράφηκε νωρίτερα. Το διάλυμα αυτό αναδεύεται με τη βοήθεια πιπέτας και τα συνολικά 10μl φορτώνονται στο πηγαδάκι της πηκτής. Επιπλέον, σε ένα πηγαδάκι φορτώνεται και ο ladder. Ο ladder πρόκειται για ένα διάλυμα μορίων DNA με διαφορετικό μήκος. Κάθε ένα από αυτά τα μόρια DNA έχει διαφορετικό μέγεθος και βοηθάει στον υπολογισμό του μεγέθους του άγνωστου τμήματος. Στην παρούσα περίπτωση ο ladder που χρησιμοποιήθηκε είναι ο puc Mix (8) της εταιρείας Fermentas. Οι ποσότητες του προϊόντος και του ladder που χρησιμοποιήθηκαν για να φορτωθούν στην πηκτή φαίνονται στον παρακάτω πίνακα (πίνακας 17). Πίνακας 17: Οι ποσότητες του προϊόντος της PCR και των αντίστοιχων διαλυμάτων που χρησιμοποιούνται για την ηλεκτροφόρησή τους σε πηκτή αγαρόζης. Ηλεκτροφόρηση PCR σε πηκτή αγαρόζης 0,8% Θέση φόρτωσης προϊόντος PCR Θέση φόρτωσης ladder DNA 2 μl - ddh 2 O 7 μl - Διάλυμα φόρτωσης (χρωστική) 1 μl - Ladder PUC - 2,5 μl (100 ng/μl) Συνολικός όγκος 10 μl 2,5 μl 83

84 2.5.6 Αλληλούχιση τμημάτων μιτοχονδριακού DNA Προκειμένου να πραγματοποιηθεί η αλληλούχιση του μιτοχονδριακού DNA, χρησιμοποιείται κάθε προϊόν της PCR, που αποτελεί ένα ενισχυμένο τμήμα της αλληλουχίας. Από την ηλεκτροφόρηση των PCR προϊόντων υπολογίζεται η συγκέντρωση DNA κάθε ενισχυμένου τμήματος με τη βοήθεια του μάρτυρα. Ανάλογα με την εκάστοτε συγκέντρωση χρησιμοποιούνται 2-8μl του προϊόντος της PCR, το οποίο αναμιγνύεται με 2μl εκκινητή. Στη συνέχεια προστίθεται απεσταγμένο νερό μέχρι τελικό όγκο 10μl. Τελικός στόχος είναι κάθε σωλήνας που ετοιμάζεται για αλληλούχιση να περιέχει PCR προϊόν συγκέντρωσης τουλάχιστον ng/μl. Η παραπάνω διαδικασία πρέπει να πραγματοποιηθεί για όλα τα ενισχυμένα τμήματα, τόσο με τον εκκινητή Forward όσο και με τον Reverse, για όλα τα ζεύγη των εκκινητών, ώστε να έχουμε διπλό «διάβασμα» της αλληλουχίας και συνεπώς, να είναι εφικτή η επιλογή του καλύτερου και πιο ασφαλούς αποτελέσματος. Η παραπάνω προετοιμασία των PCR products γίνεται σύμφωνα με τις οδηγίες της εταιρίας Macrogen Inc., που πραγματοποίησε την αλληλούχιση Το διάβασμα κάθε αλληλούχισης μελετάται με το πρόγραμμα Chromas, στο οποίο φαίνεται η νουκλεοτιδική αλληλουχία, καθώς και η ποιότητα διαβάσματος της κάθε βάσης. Το τμήμα που επιλέγεται ως καλά διαβασμένο, δεν περιλαμβάνει τα αρχικά τμήματα στο 5 άκρο και τα τελικά τμήματα στο 3 άκρο, καθώς εκεί η ποιότητα της ανάλυσης δεν είναι καλή. Προκειμένου να υπάρχει ασφαλές αποτέλεσμα για το διάβασμα μιας αλληλουχίας, συγκρίνεται η αλληλούχιση ενός τμήματος, τόσο με τον εκκινητή F, όσο και με τον εκκινητή R. Η αλληλουχία που δίνεται από το διάβασμα με τον εκκινητή R, μετατρέπεται σε Reverse και Compliment με το αντίστοιχο εργαλείο που παρέχεται στην ιστοσελίδα Στη συνέχεια τα δύο διαβάσματα συγκρίνονται προκειμένου να ελεγχθεί αν υπάρχει ταύτιση στο αποτέλεσμα. Η σύγκριση των δύο αλληλουχιών πραγματοποιείται από το εργαλείο «Merger» που παρέχεται στην ιστοσελίδα του EMBOSS (European Molecular Biology Open Software Suite) ( Στην περίπτωση που υπάρχει ασυμφωνία σε κάποια βάση, τότε επιλέγεται η βάση που εμφανίζει καλύτερη ποιότητα διαβάσματος. Δύο διαδοχικά τμήματα της αλληλουχίας του μιτοχονδριακού DNA αλληλεπικαλύπτονται σε μήκος περίπου βάσεις, αυτό γίνεται γιατί ο 84

85 εκκινητής Forward ενισχύει ένα τμήμα που ενισχύεται ήδη από τον εκκινητή Reverse της προηγούμενης αλληλουχίας. Στόχος της αλληλεπικάλυψης αυτής είναι σύνδεση των διαδοχικών αλληλουχιών σε μια ενιαία αλληλουχία μέσα από βιοπληροφορικά εργαλεία (εικόνα 38). Για την εύρεση της αλληλεπικαλυπτόμενης περιοχής χρησιμοποιείται και πάλι το εργαλείο «Merger». Με τον τρόπο αυτό «σχηματίζεται» ολόκληρη η αλληλουχία του μιτοχονδριακού DNA. Εικόνα 38: Σύνδεση διαδοχικών τμημάτων μιας αλληλουχίας DNA λόγω ύπαρξης κοινώναλληλεπικαλυπτόμενων περιοχών. Η σύγκριση της νεοαποκτηθείσας αλληλουχίας συγκρίνεται με την αλληλουχία του μιτοχονδριακού DNA του συγγενικού οργανισμού B. dorsalis Accession Number: DQ ) μέσω του βιοπληροφορικού εργαλείου Blastn που παρέχεται από την ιστοσελίδα NCBI (National Center for Biotechnology Inforomation) στο σύνδεσμο Με τη σύγκριση αυτή εντοπίζονται τυχόν διαφορές στις αλληλουχίες των δύο οργανισμών, ενώ ταυτόχρονα συμβάλλει στην εύρεση της θέσης των διαφόρων γονιδίων του μιτοχονδριακού DNA του είδους B. kandiensis Ανάλυση φυλογενετικών σχέσεων Έπειτα από την ανάλυση του μιτοχονδριακού γονιδιώματος του είδους B. kandiensis, χρησιμοποιήθηκε το γονίδιο cox1, προκειμένου να μελετηθούν οι φυλογενετικές σχέσεις με άλλα είδη. Πιο συγκεκριμένα χρησιμοποιήθηκε τμήμα (τα 85

86 πρώτα 1503 νουκλεοτίδια) της αλληλουχίας του γονιδίου cox1. Το cox1 πρόκειται για ένα γονίδιο, το οποίο συχνά χρησιμοποιείται ως δείκτης για την ταυτοποίηση ζωικών ειδών. Η αλληλουχία του γονιδίου, που εντοπίζεται στο mtdna, είναι κατάλληλη για αυτόν το ρόλο, καθώς ο ρυθμός εμφάνισης μετάλλαξης είναι συχνά, τόσο υψηλός, ώστε να επιτρέπει το διαχωρισμό στενά συγγενικών ειδών. Επιπλέον, σημαντικό είναι το γεγονός, ότι η αλληλουχία αυτή διατηρείται μεταξύ οργανισμών του ίδιου είδους. Αρχικά, θεωρούνταν ότι η συγκεκριμένη γονιδιακή αλληλουχία φέρει πολύ λίγες διαφοροποιήσεις για να συγκριθούν μεταξύ τους πολύ στενά συγγενικά είδη. Ωστόσο, φαίνεται πως συνήθως εμφανίζει απόκλιση της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας σε ποσοστό μεγαλύτερο του 2% μεταξύ τέτοιων οργανισμών, γεγονός που αποδεικνύει τη χρησιμότητά του ως δείκτης (Hebert et al., 2003). Τα είδη με τα οποία συγκρίθηκε η αλληλουχία του γονιδίου cox1 του υπό μελέτη είδους, είναι το B. invadens, B. carambolae και δύο αλληλουχίες του B. dorsalis. Η αλληλουχία του B. invadens προέρχεται από προπτυχιακή διπλωματική εργασία, που είναι υπό εξέλιξη, στο εργαστήριο της κ. Δροσοπούλου. Αντίστοιχα, οι αλληλουχίες για τα είδη B. carambolae (Παγγέα Δ., 2015) και η μια εκ των δύο αλληλουχιών του B. dorsalis (Γουτακόλη Π., 2015) αποκτήθηκαν από εκπόνηση προπτυχιακών διπλωματικών εργασίών στο εργαστήριο της κ. Δροσοπούλου. Η δεύτερη αλληλουχία του οργανισμού B. dorsalis που χρησιμοποιήθηκε είναι η κατατεθημένη αλληλουχία με Accession number DQ Επιπλέον, χρησιμοποιήθηκαν και οι αντίστοιχες αλληλουχίες των είδών B. oleae (NC_ ), B. tryoni (HQ ), B. zonata (NC_ ), B. correcta (NC_ )και B. arecae (NC_ ), που αν και ανήκουν στο ίδιο γένος δεν συγκαταλέγονται στο σύμπλεγμα B. dorsalis. Ως εξωομάδα επιλέχθηκε ο οργανισμός C. capitata (NC_ ), ο οποίος συμπεριλαμβάνεται στην οικογένεια Tephritidae, αλλά ανήκει σε άλλο γένος από τα είδη Bactrocera. Το φυλογενετικό δέντρο κατασκευάστηκε στο πρόγραμμα MEGA6 με τη στατιστική μέθοδο Neighbor joining (UPGMA, Bootstrap Method- rep 1000). 86

87 3. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 3.1 Μιτωτικά χρωμοσώματα Από την παρατήρηση των μεταφασικών χρωμοσωμάτων, προκύπτει ότι τα άτομα του είδους έχουν συνολικά 12 χρωμοσώματα, τα οποία οργανώνονται σε 6 ζεύγη (2n=12). Από αυτά, τα 5 ζεύγη αποτελούν τα αυτοσωμικά χρωμοσώματα και το ένα ζεύγος περιλαμβάνει τα φυλετικά χρωμοσώματα (Χ, Υ). Ακολουθώντας το σύστημα ονομασίας που χρησιμοποιήθηκε από τους Radu, Rossler και Koltin το 1975 για το είδος C. capitata, τα φυλετικά χρωμοσώματα θεωρούνται το πρώτο ζεύγος χρωμοσωμάτων στον μιτωτικό καρυότυπο, ενώ τα υπόλοιπα ζεύγη αριθμούνται από το 2 έως το 6 κατά φθίνουσα σειρά μεγέθους (Mavragani-Tsipidou et al., 1992, 2002). Τα δύο πιο μεγάλα και τα δύο πιο μικρά ζεύγη χρωμοσωμάτων (με αρίθμηση 2, 3 και 5, 6 αντίστοιχα) εμφανίζονται υπομετακεντρικά, ενώ τα χρωμοσώματα του ζεύγους 4 είναι υπομετακεντρικά (εικόνα 39). Χ 6 Χ Εικόνα 39: Η αρίθμηση των αυτοσωμικών χρωμοσωμάτων σε μιτωτικό πυρήνα του είδους B. kandiensis. Με βέλη διακρίνεται η θέση του κεντρομέρους στα χρωμοσώματα. Αναφορικά με τα φυλετικά χρωμοσώματα, το αρσενικό άτομο του είδους είναι ετερογαμετικό, καθώς φέρει ένα Χ και ένα Υ χρωμόσωμα, ενώ το θηλυκό άτομο φέρει δύο όμοια Χ χρωμοσώματα (εικόνα 40). Παρατηρείται ότι το Χ χρωμόσωμα είναι μεγαλύτερο σε μήκος από το Υ, αλλά και από όλα τα αυτοσωμικά χρωμοσώματα και φέρει μια δευτερογενή περίσφιξη στο μικρό βραχίονα. Επίσης, είναι ευδιάκριτο ότι το Υ χρωμόσωμα, είναι ιδιαίτερα μικρό, 87

88 τόσο σε σχέση με το χρωμόσωμα Χ, όσο και σε σχέση με όλα τα αυτοσωμικά χρωμοσώματα, χωρίς όμως να θεωρείται ότι εμφανίζει μορφολογία «dot like». α) β) Εικόνα 40: Φωτογραφία μιτωτικού μεταφασικού πυρήνα θηλυκού ατόμου (α) και (β) αρσενικού ατόμου του είδους Bactrocera kandiensis. Σημειώνονται τα φυλετικά χρωμοσώματα Χ και Υ του είδους, και με βέλη επισημαίνεται η δευτερογενής περίσφηξη του φυλετικού χρωμοσώματος Χ. Γενικά, τα είδη της οικογένειας Tephritidae, αν και φυλογενετικά είναι πολύ κοντά μεταξύ τους, εμφανίζουν αρκετές διαφορές στο μήκος και στην αναλογία των βραχιόνων των φυλετικών χρωμοσωμάτων όπως έχει φανεί σε διάφορα είδη (Foster et al., 1980, Singh and Gupta, 1984, Bedo, 1986, Bush and Taylor, 1969, Zhao et al., 1998, Goday et al., 2006, Garcia-Martinez et al., 2009, Giardini et al., 2009a, 2009b, 2015, Zacharopoulou, 1987, 2011a, 2011b, Mavragani- Tsipidou et al., 1992, 2002, Ibanez- Palacius et al., 2010, Drosopoulou et al., 2011, 2012, Augoustinos et al., 2015). 3.2 Πολυταινικά χρωμοσώματα Ένας χαρακτηριστικός πολυταινικός πυρήνας του είδους Bactrocera kandiensis φαίνεται στην εικόνα 41. Στην φωτογραφία- που δείχνει τα πολυταινικά χρωμοσώματα όπως φαίνονται στο οπτικό μικροσκόπιο- διακρίνονται διάφοροι χρωμοσωμικοί βραχίονες. Το κόκκινο πλαίσιο αναπαριστά την ετεροχρωματινική μάζα που εντοπίζεται σε όλους τους πολυταινικούς πυρήνες. Η μάζα αυτή, όπως προαναφέρθηκε, αντιστοιχεί στα φυλετικά χρωμοσώματα Χ και Υ, τα οποία δεν εμφανίζουν φαινόμενα πολυταινισμού. 88

89 Εικόνα 41: Χαρακτηριστικός πολυταινικός πυρήνας του είδους Bactrocera kandiensis. Το κόκκινο πλαίσιο επισημαίνει την ετεροχρωματινική δομή που αντιστοιχεί στα φυλετικά χρωμοσώματα. Χρησιμοποιώντας πολλές φωτογραφίες πολυταινικών πυρήνων, μελετήθηκαν οι χρωμοσωμικοί βραχίονες, κατά μήκος όλων των τμημάτων τους. Σε έναν πολυταινικό πυρήνα εντοπίζονται συνολικά 5 χρωμοσώματα. Κάθε πολυταινικό χρωμόσωμα διαιρείται σε δύο βραχίονες τον αριστερό και τον δεξιό, με βάση την κεντρομερική περιοχή. Η διαίρεση αυτή έχει ως αποτέλεσμα στον πυρήνα να εντοπίζονται συνολικά 10 διαφορετικοί βραχίονες. Τα πολυταινικά χρωμοσώματα αριθμούνται από το 2 έως το 6, σύμφωνα με την ομολογία με τους πολυταινικούς βραχίονες του B. dorsalis. (Zacharopoulou et al., 2011) Οι διάφοροι βραχίονες διακρίνονται και ξεχωρίζουν μεταξύ τους χάρη στα ειδικά πρότυπα που εμφανίζουν ως προς τις ζώνες που φέρουν. Ιδιαίτερα χαρακτηριστικά είναι τα tip των βραχιόνων, δηλαδή τα τμήματα που βρίσκονται στην αρχική άκρη τους. Η μορφολογία των τμημάτων είναι χαρακτηριστική και επιτρέπει την αναγνώριση των επί μέρους βραχιόνων (εικόνα 42). 89

90 * * * * * * * * α) β) Εικόνα 42: Χαρακτηριστική μορφολογία του tip του βραχίονα 2L (α) και 2R (β) του είδους B. kandiensis Με κόκκινο αστερίσκο σημειώνεται η θέση του tip. Με κατάλληλη κατεργασία στο πρόγραμμα επεξεργασίας εικόνων Adobe Photoshop CC 2014, δημιουργήθηκε ο χάρτης των βραχιόνων των πολυταινικών χρωμοσωμάτων του είδους B. kandiensis (εικόνα 43), χρησιμοποιώντας ως πρότυπο το φωτογραφικό χάρτη του συγγενικού οργανισμού B. dorsalis. Επιπλέον, με βάση το ίδιο είδος οι περιοχές του κάθε βραχίονα διαιρέθηκαν σε επί μέρους τμήματα. Στόχος αυτής της «διαίρεσης» είναι η διευκόλυνση της μελέτης των χρωμοσωμάτων του είδους. Συνολικά, όλοι οι βραχίονες, από τον 2L έως τον 6R, αποτελούνται από 100 τμήματα που διακρίνονται με βάση ειδικά σημεία του προτύπου ζωνώσεων. 90

91 2L C C 2R 3L C C 3R L C C R 93

92 Εικόνα 43: Χάρτης πολυταινικών χρωμοσωμάτων του είδους Bactrocera kandiensis 92

93 Τα πολυταινικά χρωμοσώματα του είδους B. kandiensis αποτελούν γενικά ένα δύσκολο υλικό προς μελέτη. Η ποιότητα των χρωμωσωμικών παρασκευασμάτων που προκύπτουν δεν είναι ιδιαίτερα καλή, με αποτέλεσμα να δυσχεραίνει αρκετά την διάκριση των βραχιόνων και των επί μέρους περιοχών. Επιπλέον, συχνά εμφανίζονται και φαινόμενα χρωμοσωμικών θραύσεων, αναδίπλωσης και ζευγαρώματος των χρωμοσωμάτων. Όπως διακρίνεται από τον χάρτη των πολυταινικών χρωμοσωμάτων του είδους B. kandiensis, στο κεντρομέρος κάθε χρωμοσώματος εντοπίζεται ευδιάκριτη ετεροχρωματίνη (C). Χρωμόσωμα 2 Το χρωμόσωμα 2 αποτελεί ένα μεγάλο χρωμόσωμα, όπου ο αριστερός βραχίονας εμφανίζεται μεγαλύτερος από τον δεξιό. Στο χρωμόσωμα 2 συχνά παρατηρείται χαρακτηριστική ασύναψη στο tip του 2L που εκτείνεται κυρίως στην περιοχή 1. Τέτοια φαινόμενα ασύναψης εντοπίζονται και σε τμήματα άλλων βραχιόνων και σε αντίστοιχες περιπτώσεις έχει βρεθεί ότι εντοπίζονται μικρές ελλείψεις ή διαφορές στο μοτίβο των puffs ανάμεσα στα δύο ομόλογα χρωμοσώματα (Zacharopoulou et al., 2011). Χαρακτηριστική είναι και η περιέλιξη που εντοπίζεται στην περιοχή 3-4, η οποία θεωρείται ότι είναι αποτέλεσμα διπλασιασμού (εικόνα 44), ενώ χαρακτηριστικό μοτίβο αποτελούν και οι ζωνώσεις των περιοχών 7-8. Επίσης, ιδιαίτερο χαρακτηριστικό του βραχίονα 2R είναι οι ζώνες που εντοπίζονται στο τμήμα 17, οι οποίες είναι ιδιαίτερα έντονες και ευδιάκριτες και συμβάλλουν στην εύκολη αναγνώριση του βραχίονα. α β γ Εικόνα 44: α) Χαρακτηριστική ασύναψη που παρατηρείται στον βραχίονα 2L. β-γ) Χαρακτηριστική περιέλιξη στα τμηήματα 3-4 του βραχίονα 2L του είδους B. kandiensis. 93

94 Χρωμόσωμα 3 Το χρωμόσωμα 3 εμφανίζεται μικρότερο σε μήκος από το χρωμόσωμα 2. Ο 3R βραχίονας είναι αρκετά μικρότερος από τον αριστερό, ενώ επίσης είναι αρκετά δύσκολο να διακριθεί μορφολογικά σε έναν πολυταινικό πυρήνα. Γενικά, σε πολύ λίγες φωτογραφίες ήταν εφικτό να εντοπιστεί ο συγκεκριμένος βραχίονας, ενώ ακόμα και σε αυτές τις περιπτώσεις η εικόνα του δεν ήταν καθαρή, είτε επειδή εμφανιζόταν σπασμένος, είτε επειδή εμφανιζόταν με μια ιδιαίτερα «διαχυμένη», χαλαρή μορφή. Αντίθετα, ο βραχίονας 3L διακρίνεται εύκολα σε έναν πολυταινικό πυρήνα, με χαρακτηριστική την περιοχή 23. Χρωμόσωμα 4 Το χρωμόσωμα 4 επίσης εμφανίζει διαφορά στο μήκος μεταξύ του αριστερού και του δεξιού βραχίονα, με τον αριστερό να είναι μεγαλύτερος. Το κεντρομέρος είναι ιδιαίτερα ευδιάκριτο, ενώ ταυτόχρονα οι περικεντρικές περιοχές εμφανίζουν ένα χαρακτηριστικό μοτίβο που βοηθάει στη διάκρισή του. Ιδιαίτερα χαρακτηριστική περιοχή του βραχίονα 4R θεωρείται το puff που εντοπίζεται στην περιοχή 59 (εικόνα 45). Εικόνα 45: Ο πολυταινικός βραχίονας 4R του είδους B. kandiensis, όπου με κόκκινο βέλος επισημαίνεται το χαρακτηριστικό puff στην περιοχή 59. Χρωμόσωμα 5 Το χρωμόσωμα 5 αποτελεί το μεγαλύτερο από τα πολυταινικά στοιχεία που εντοπίζονται σε έναν πολυταινικό πυρήνα του είδους B. kandiensis. Ο βραχίονας 5L εμφανίζεται ιδιαίτερα μεγάλος, τόσο σε σχέση με τους υπόλοιπους πολυταινικούς βραχίονες, όσο και σε σχέση με τον βραχίονα 5R. Χαρακτηριστικό επίσης είναι ότι στη συγκεκριμένη περίπτωση εμφανίζεται λίγη έως καθόλου ετεροχρωματινική μάζα στην περιοχή του κεντρομέρους. Ο βραχίονας 5R εμφανίζεται αρκετά μικρότερος σε μήκος, ωστόσο είναι σχεδόν πάντα ιδιαίτερα ευδιάκριτος σε όλους τους πολυταινικούς πυρήνες. Χαρακτηριστική είναι η ασύναψη που παρατηρείται στην περιοχή 73-74, που όπως προαναφέρθηκε μπορεί να είναι αποτέλεσμα ελλείψεων ανάμεσα στα δύο ομόλογα χρωμοσώματα (εικόνα 46). 94

95 Εικόνα 46: Ο πολυταινικός βραχίονας 5R του είδους B. kandiensis, όπου με κόκκινο βέλος επισημαίνεται η ασύναψη που εντοπίζεται στην περιοχή Χρωμόσωμα 6 Το χρωμόσωμα 6μ μαζί με το χρωμόσωμα 5, είναι από τα μεγαλύτερα του πολυταινικού πυρήνα του υπό μελέτη είδους. Και σε αυτήν την περίπτωση ο βραχίονας 6L εμφανίζεται μεγαλύτερος από τον βραχίονα 6R. Γενικά όμως και οι δύο βραχίονες είναι αρκετά ευδιάκριτοι στους πολυταινικούς πυρήνες και εμφανίζουν χαρακτηριστικό πρότυπο ζωνώσεων. Στον βραχίονα 6L ιδιαίτερα χαρακτηριστικές είναι οι ζώνες των περιοχών 81 και 82, ενώ στον βραχίονα 6R, συχνά εντοπίζεται ασύναψη στο tip (εικόνα 47). tip 6L tip 6R α) β) Εικόνα 47: Χαρακτηριστικό tip ου βραχίονα 6L (α) και (β) χαρακτηριστική ασύναψη στο tip του βραχίονα 6R. 3.3 Εντοπισμός γονιδίων πάνω στα πολυταινικά χρωμοσώματα Στο πλαίσιο της κυτταρογενετικής μελέτης εντοπίστηκε με in situ υβριδισμό η θέση ορισμένων γονιδίων στους πολυταινικούς βραχίονες του είδους Bactrocera kandiensis. Τα γονίδια που εντοπίστηκαν είναι τα hsp70, white, sxl και scarlet. Η εικόνα που λαμβάνεται από οπτικό μικροσκόπιο φαίνεται στις εικόνες 47-50, όπου το σήμα του υβριδισμένου ανιχνευτή πάνω στο επιθυμητό γονίδιο διακρίνεται ως μια αρκετά έντονη ζώνη. Έπειτα από σύγκριση του βραχίονα στον οποίο διακρίνεται το σήμα με το χάρτη των πολυταινικών χρωμοσωμάτων του είδους B. kandiensis, ταυτοποιήθηκε η ακριβής θέση των γονιδίων. Συγκεκριμένα το γονίδιο hsp70 εντοπίζεται στον βραχίονα 3L, στη θέση 26 (εικόνα 48), και το γονίδιο white βρέθηκε στο βραχίονα 5L στην περιοχή 65 (εικόνα 49). Τα άλλα δύο γονίδια που μελετήθηκαν και συγκεκριμένα το γονίδιο sxl βρέθηκε στο βραχίονα 5R στην περιοχή 78 (εικόνα 50) και το scarlet στο βραχίονα 6L, στο τμήμα 82 (εικόνα 51). 95

96 Εικόνα 48: Θέση του γονιδίου hsp70 στον βραχίονα 3L του είδους Bactrocera kandiensis. Εικόνα 49: Θέση του γονιδίου white στον βραχίονα 5L του είδους Bactrocera kandiensis. 96

97 Εικόνα 50: Η θέση του γονιδίου sxl στον βραχίονα 5R του είδους Bactrocera kandiensis. Εικόνα 51: Θέση του γονιδίου scarlet στον βραχίονα 6L του είδους Bactrocera kandiensis. 3.4 Ανάλυση του μιτοχονδριακού γονιδιώματος του είδους Bactrocera kandiensis Για την ανάλυση του μιτοχονδριακού γονιδιώματος ενισχύθηκαν 27 αλληλοεπικαλυπτόμενα τμήματα με PCR. Τα αποτελέσματα της PCR γίνονται ορατά έπειτα από την ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της σε πηκτή αγαρόζης. Η απεικόνιση της 97

98 ηλεκτροφόρησης γίνεται με τη χρήση ακτινοβολίας UV, η οποία επιτρέπει τη διάκριση των ζωνών που αντιστοιχούν στα ενισχυμένα τμήματα. Στην περίπτωση που η PCR πραγματοποιείται με επιτυχία, διακρίνεται μία μεμονωμένη ζώνη που αντιπροσωπεύει το ενισχυμένο τμήμα (εικόνα 52). Το μέγεθος του τμήματος αυτού, καθώς και η συγκέντρωση του προϊόντος μπορεί εύκολα να υπολογιστεί από τις ζώνες του ladder που χρησιμοποιείται. 24F- 24R 57 Ο C. C Ladder puc (100 bp) 500 bp Εικόνα 52: Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης 0,8% (w/v). Προϊόντα πολυμερισμού μέσω PCR τμημάτων του μιτοχονδριακού γονιδιώματος του είδους B. kandiensis. H ενίσχυση έγινε με το ζεύγος εκκινητών 24F- 24R. Η ένδειξη C. αντιστοιχεί στον αρνητικό μάρτυρα (control) που χρησιμοποιηθηκε. Στην τελευταία θέση διακρίνεται ο μάρτυρας puc MIX (100 bp). Σε πολλές περιπτώσεις τα αποτελέσματα της PCR δεν ήταν ιδανικά. Γι αυτό το λόγο πραγματοποιήθηκαν αλλαγές στις αρχικές συνθήκες, προκειμένου η αντίδραση να πραγματοποιηθεί με επιτυχία. Αν κατά την ηλεκτροφόρηση, είναι ορατές περισσότερες από μια ζώνες, τότε η αντίδραση απαιτεί μεγαλύτερη εξειδίκευση, καθώς οι ζώνες αυτές δείχνουν ότι ενισχύονται περισσότερα από ένα τμήματα της αλληλουχίας (εικόνα 53). Προκειμένου η αντίδραση να γίνει πιο ειδική, πρέπει να αυξηθεί η θερμοκρασία του σταδίου του annealing. Επίσης, λύση μπορεί να δοθεί με τη μείωση της συγκέντρωσης του MgCl 2. Σε ορισμένες περιπτώσεις, μπορεί να είναι απαραίτητο να γίνουν και οι δύο τροποποιήσεις ταυτόχρονα. 98

99 α β Εικόνα 53: α) Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης 0,8% (w/v) ενισχυμένων τμημάτων της αλληλουχίας του mtdna του είδους B. kandiensis. α) Ενίσχυση με το ζεύγος εκκινητών 11 σε θερμοκρασία annealing 54 ο C και συγκέντρωση MgCl 2 1,5 mm έχει ως αποτέλεσμα την εμφάνιση παραπροϊόντων. β) Ενίσχυση με το ζεύγος εκκινητών 11 σε θερμοκρασία annealing 58 ο C και συγκέντρωση MgCl 2 1,25 mm έχεις ως αποτέλεσμα την εμφάνιση μιας μόνο ζώνης. Αντιθέτως, αν μετά την PCR δεν διακρίνεται καμία ζώνη, αυτό σημαίνει ότι οι συνθήκες που εφαρμόζονται είναι πολύ αυστηρές και δεν μπορεί να πραγματοποιηθεί ο πολυμερισμός (εικόνα 54). Η βελτίωση των συνθηκών σε αυτήν τη περίπτωση επιτυγχάνεται με μείωση της θερμοκρασίας annealing, με αύξηση της συγκέντρωσης MgCl 2 ή και με τους δύο τρόπους ταυτόχρονα. α β Εικόνα 54: α) Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης 0,8% (w/v) ενισχυμένων τμημάτων της αλληλουχίας του mtdna του είδους B. kandiensis. α) Ενίσχυση με το ζεύγος εκκινητών 23 σε θερμοκρασία annealing 56 ο C και συγκέντρωση MgCl 2 1,5 mm έχει ως αποτέλεσμα να μην εμφανίζεται καμία ζώνη. β) Ενίσχυση με το ζεύγος εκκινητών 23 σε χαμηλότερη θερμοκρασία annealing 54 ο C και συγκέντρωση MgCl 2 1,5 mm έχεις ως αποτέλεσμα την εμφάνιση μιας μόνο ζώνης. Τέλος, στην περίπτωση που εντοπίζεται ζώνη στις θέσεις των αρνητικών μαρτύρων σημαίνει ότι υπάρχει επιμόλυνση με DNA στα αντιδραστήρια. Σε ένα τέτοιο ενδεχόμενο πρέπει να χρησιμοποιηθούν νέα αντιδραστήρια, ώστε να μην λαμβάνονται ψευδώς θετικά αποτελέσματα. Μετά την επιτυχημένη ενίσχυση κάθε τμήματος με τη μέθοδο της PCR, τα προϊόντα ετοιμάζονται και αποστέλλονται για αλληλούχιση με τους εκκινητές F και R. Το «διάβασμα» κάθε τμήματος και η ποιότητά του για κάθε βάση δίνονται σε μορφή χρωματογραφήματος, όπως φαίνεται στην εικόνα

100 Εικόνα 55: Τμήμα από χρωματογράφημα αλληλούχισης τμήματος του μιτοχονδριακού γονιδιώματος του οργανισμού Bactrocera kandiensis. Στην συνέχεια, για κάθε ενισχυμένο τμήμα συγκρίθηκαν τα διαβάσματα με τον Forward και τον Reverse εκκινητή στο πρόγραμμα Merger. Στις περισσότερες περιπτώσεις υπήρχε πλήρης συμφωνία (εικόνα 56). Εικόνα 56: Η ευθυγράμμιση των Forward και Reverse διαβασμάτων του ζεύγους εκκινητών 1F-1R με το πρόγραμμα MERGER. Με τις κάθετες γραμμές συμβολίζεται η ομολογία των βάσεων στις δύο αλληλουχίες. Σε λίγες περιπτώσεις ωστόσο υπήρχαν διαφορές μεταξύ των αλληλουχιών (εικόνα 57). Σε αυτήν την περίπτωση γινόταν έλεγχος των χρωματογραφημάτων για κάθε αλληλουχία, προκειμένου να προσδιοριστεί η θέση όπου εντοπίζεται η διαφορά. Στόχος ήταν να συγκριθεί η ποιότητα της αλληλούχισης στη συγκεκριμένη θέση, ώστε να επιλεχθεί η σωστή βάση. 100

101 Εικόνα 57: Η ευθυγράμμιση των Forward και Reverse διαβασμάτων του ζεύγους εκκινητών 15F-15R με το πρόγραμμα MERGER. Με τις κάθετες γραμμές συμβολίζεται η ομολογία των βάσεων, ενώ με τελεία επισημαίνεται η διαφορετική βάση. Η βάση που διαφέρει στις δύο αλληλουχίες επισημαίνεται στο τέλος της στοίχισης. Έπειτα από την παραπάνω διεργασία για όλα τα ενισχυμένα τμήματα της αλληλουχίας του μιτοχονδριακού γονιδιώματος του B. kandiensis προκύπτουν οι επί μέρους αλληλουχίες που συνδέονται μεταξύ τους. Οι διαδοχικές αλληλουχίες συνδέονται μέσω των αλληλοεπικαλυτπόμενων περιοχών που φέρουν, μέσα από το πρόγραμμα Merger (εικόνα 58). Η αλληλουχία του μιτοχονδριακού γονιδιώματος του B. kandiensis που αποκτήθηκε παρατίθεται στο παράρτημα. Εικόνα 58: Σύνδεση των διαδοχικών αλληλουχιών των τμημάτων 1 και 2 με το πρόγραμμα MERGER, με βάση το αλληλοεπικαλυπτόμενο τμήμα που φέρουν δύο διαδοχικές αλληλουχίες. 101

102 3.4.1 Οργάνωση του μιτοχονδριακού γονιδιώματος Οι αλληλουχίες που αποκτήθηκαν έπειτα από την παραπάνω διαδικασία είναι αυτές που αντιστοιχούν στα τμήματα που ενισχύονται από τα ζεύγη εκκινητών 26-4 και 6-25b. Τα τμήματα αυτά έχουν μήκος 3194 ζεύγη βάσεων και ζεύγη βάσεων αντίστοιχα. Συνολικά, το άθροισμά τους (14751 ζεύγη βάσεων) αποτελεί περίπου το 94% του συνολικού μιτοχονδριακού γονιδιώματος. Τα τμήματα της αλληλουχίας που λείπουν είναι αυτά που αντιστοιχούν στις αλληλουχίες που τίθενται υπό ενίσχυση από τα ζεύγη εκκινητών 5 και 25c. Τα τμήματα αυτά παρουσίασαν ιδιαίτερες δυσκολίες στη φάση της ενίσχυσης τους με την διαδικασία της PCR διότι εμφάνιζαν έντονα παραπροϊόντα. Στην περίπτωση της αλληλουχίας που ενισχύεται από το ζεύγος εκκινητών 25c, η επιτυχία της PCR είναι ιδιαίτερα μειωμένη, καθώς δίνει προϊόντα πολύ χαμηλής συγκέντρωσης. Αυτό οφείλετα στο γεγονός ότι το τμήμα αυτό περιλαμβάνει την περιοχή D-Loop, η οποία είναι πλούσια σε Α και Τ. Μια τέτοια αλληλουχία δυσχεραίνει την εύρεση κατάλληλων και αποτελεσματικών εκκινητών, ενώ ταυτόχρονα κάνει και την αλληλούχιση του συγκεκριμένου τμήματος ιδιαίτερα δύσκολη και αναξιόπιστη. Έπειτα από την σύγκριση των αλληλουχιών του οργανισμού B. kandiensis με τον οργανισμό B. dorsalis προκύπτει ότι στην αλληλουχία που δίνεται από την ενίσχυση με τα ζεύγη εκκινητών 26 έως και 4 στο υπό μελέτη είδος αντιστοιχεί στην αρχή του μιτοχονδριακού γονιδιώματος του B. dorsalis. Πιο συγκεκριμένα το 142 ο νουκλεοτίδιο του τμήματος 26 του B. kandiensis, αντιστοιχεί στο 1 ο νουκλεοτίδιο της αλληλουχίας του mtdna του B. dorsalis (ΑΝ: DQ ) και το τελευταίο νουκλεοτίδιο αντιστοιχεί στο νουκλεοτίδιο με αρίθμηση Συνεπώς, με βάση την αρίθμηση που ακολουθείται για τον οργανισμό B. dorsalis, γίνεται και η αρίθμηση της αλληλουχίας του υπό μελέτη οργανισμού, ώστε να ξεκινάει από το ίδιο σημείο. Συνεπώς νουκλεοτίδιο που αντιστοιχεί στο πρώτο νουκλεοτίδιο της αλληλουχίας του B. kandiensis, καταγράφεται και στον υπό μελέτη οργανισμό ως το πρώτο νουκλεοτίδιο της αλληλουχίας. Με βάση την αρίθμηση αυτή, μπορούν να δοθούν οι θέσεις των γονιδίων που αντιστοιχούν σε όλο το μήκος αυτής της αλληλουχίας. Στην πρώτη αλληλουχία που προέκυψε έπειτα από βιοπληροφορική ανάλυση εντοπίστηκαν 6 πλήρη γονίδια που κωδικοποιούν trna και ένα γονίδιο που κωδικοποιεί πρωτεΐνη. Αυτά είναι κατά σειρά τα trna Ile, trna Gln, trna Met, nad2, trna Trp, trna Cys και trna Tyr. Επιπλέον, στην αλληλουχία εντοπίστηκε και η αρχή του γονιδίου cox1, 102

103 το οποίο όμως δεν εντοπίζεται πλήρες, καθώς η υπόλοιπη αλληλουχία αναμένεται να βρίσκεται στο τμήμα που ενισχύεται από το ζεύγος εκκινητών 5. Αντίστοιχα, η αλληλουχία που ενισχύθηκε από τα ζεύγη εκκινητών 6-25b αντιστοιχεί στην αλληλουχία στον οργανισμό B. dorsalis. Τα πλήρη γονίδια που βρέθηκαν σε αυτήν την αλληλουχία είναι 26, εκ των οποίων 15 κωδικοποιούν trna, 2 κωδικοποιούν rrna και 9 κωδικοποιούν πρωτεΐνες. Τα γονίδια αυτά κατά σειρά είναι: trna Lys, trna Asp, Atp8, Atp6, Cox3, trna Gly, nad3, trna Ala, trna Arg, trna Asn, trna Ser, trna Glu, trna Phe, nad5, trna His, nad4, nad4l, trna Thr, trna Pro, nad6, trna Ser, nad1, trna Leu (UCN), 16S rrna, trna Val και 12S rrna. Είναι φανερό λοιπόν ότι συνολικά έχουν εντοπιστεί 33 πλήρη γονίδια: 21 γονίδια που κωδικοποιούν trna, 2 γονδία που κωδικοποιούν rrna και 10 γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες. Δεδομένου ότι η αλληλουχία του μιτοχονδριακού γονιδιώματος είναι αρκετά συντηρημένη, ειδικά μεταξύ συγγενικών οργανισμών, όπως στην περίπτωση του B. kandiensis και B. dorsalis, αναμένεται ότι στην πλήρη αλληλουχία του υπό μελέτη είδους εντοπίζονται και τα υπόλοιπα γονίδια. Συνεπώς, στις αλληλουχίες που δεν έχουν μελετηθεί και χαρακτηριστεί ακόμα αναμένεται να εντοπίζονται 1 γονίδιο που κωδικοποιεί trna (Leu) και 3 γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες (cox1, cox2, cob). Αναλυτικά τα παραπάνω στοιχεία φαίνονται στον πίνακα 18. Πίνακας 18: Η οργάνωση του μιτοχονδριακού γονιδιώματος Bactrocera kandiensis rrna, trna γονίδια και μη κωδικοποιούσα περιοχή D- loop. Τα γονίδια που σημειώνονται με γκρίζο χρώμα δεν εχουν αλληλουχηθεί ακόμα. Οργάνωση μιτοχονδριακού γονιδιώματος Bactrocera kandiensis Γονίδιο Θέση Θέση Κωδικόνιο Κωδικόνιο Αριθμός κλώνος μέγεθος (B.d.) (B.k.) έναρξης λήξης αμινοξέων ΑΤ% trna-ile 1-66 H ,7 trna-gln L ,43 trna-met H ,5 nad H ATT TAA ,39 trna-trp H trna-cys L ,26 trna-tyr L ,63 Cox H trna Leu Cox

104 trna-lys trna-asp atp8 atp6 cox3 trna-gly nad3 trna-ala trna-arg trna-asn trna-ser trna-glu trna-phe nad5 trna-his nad4 nad4l trna Thr trna Pro nad6 cob trna-ser (UCN) nad1 trna-leu (CUN) 16S trna trna-val 12S ribosomal RNA D- Loop H 70 66,2 H 65 88,41 H 162 GTG TAA 53 72,84 H 677 ATG TA ,99 H 789 ATG TAA ,29 H 65 76,93 H 352 ATT T ,02 H 65 75,39 H 64 65,63 H 65 64,62 H 68 70,15 H 67 89,56 L 65 70,77 L 1720 ATT T ,44 L 66 80,31 L 1341 ATG TAG ,8 L 297 ATG TAA 98 78,79 H L 66 75,76 L 524 ATT TAA ,68 H 67 70,15 Η 940 ΤΑΤ Τ ,9 L L ,77 L 72 77,78 L ,94 104

105 Όλα τα παραπάνω γονίδια ταυτοποιήθηκαν έπειτα από σύγκριση με τις γνωστές αλληλουχίες του συγγενικού οργανισμού B. dorsalis (Accession number: DQ ). Η σύγκριση των δύο αλληλουχιών έγινε με το εργαλείο BLASTN από την ιστοσελίδα του NCBI ( Οι δύο μιτοχονδριακές αλληλουχίες του οργανισμού B. kandiensis που αποκτήθηκαν συγκρίθηκαν με τις αλληλουχίες του συγγενικού οργανισμού, προκειμένου να εντοπιστούν με ακρίβεια οι θέσεις των γονιδίων (εικόνα 59). α1) α2) β1) 105

106 β2) Εικόνα 59: α1) Γραφική αναπαράσταση των αποτελεσμάτων έπειτα από Blastn της αλληλουχίας του mtdna του οργανισμού B. kandiensis, που ενισχύεται από τα ζεύγη εκκινητών Η αλληλουχία συγκρίνεται με την αλληλουχία 1-66 του mtdna του οργανισμού B. dorsalis, προκειμένου να βρεθεί η θέση του γονιδίου trna Ile, στον υπό μελέτη οργανισμό. α2) Η απεικόνιση της ευθυγράμμισης των δύο αλληλουχιών, με βάση την οποία εντοπίζεται η θέση του αντίστοιχου γονιδίου στην αλληλουχία του υπό μελέτη οργανισμού. Με κάθετες γραμμές παρουσιάζεται η ομολογία μεταξύ των αντίστοιχων βάσεων των συγκρινόμενων αλληλουχιών. β1) Γραφική αναπαράσταση των αποτελεσμάτων έπειτα από Blastn της αλληλουχίας του mtdna του οργανισμού B. kandiensis, που ενισχύεται από τα ζεύγη εκκινητών Η αλληλουχία συγκρίνεται με την αλληλουχία του mtdna του οργανισμού B. dorsalis, προκειμένου να βρεθεί η θέση του γονιδίου nad2. β2ι) Η απεικόνιση της ευθυγράμμισης των δύο αλληλουχιών, με βάση την οποία εντοπίζεται η θέση του αντίστοιχου γονιδίου στην αλληλουχία του υπό μελέτη οργανισμού. Με κάθετες γραμμές παρουσιάζεται η ομολογία, ενώ στις θέσεις που δεν εμφανίζονται οι γραμμές, δεν υπάρχει ομολογία μεταξύ των αντίστοιχων βάσεων των συγκρινόμενων αλληλουχιών. Ειδικότερα, τα γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες αναγνωρίστηκαν επιπλέον από την ύπαρξη κωδικονίων έναρξης και λήξης (πίνακας 17). Κατά τη μελέτη των αλληλουχιών του μιτοχονδριακού DNA ως προς τα κωδικόνια έναρξης, καθώς και ως προς κάποια άλλα κωδικόνια, δεν πρέπει να παραλείπεται το γεγονός ότι ο γενετικός κώδικας του μιτοχονδριακού γονιδιώματος διαφέρει σε κάποια σημεία σε σχέση με τον γενετικό κώδικα που αφορά το πυρηνικό DNA (19). Πιο αναλυτικά, τα κωδικόνια AGA, AGG που κωδικοποιούν το αμινοξύ αργινίνη, στην περίπτωση του γενετικού κώδικα του μιτοχνδριακού DNA των ασπονδύλων, κωδικοποιούν το αμινοξύ σερίνη. Επιπλέον, διαφορά εντοπίζεται και στο κωδικόνιο AUA, που στην περίπτωση του mtdna κωδικοποιεί το αμινοξύ μεθιονίνη, αντί για ισολευκίνη. Επιπλέον, διαφοροποιήσεις εντοπίζονται και στα κωδικόνια έναρξης και λήξης. Όσον αφορά τα κωδικόνια έναρξης, επιπλέον εντοπίζονται τα AUA και AUU (καθώς και άλλα, σε συγκεκριμένους οργανισμούς), ενώ ως προς τα κωδικόνια λήξης, το κωδικόνιο UGA σε αυτήν την περίπτωση κωδικοποιεί το αμινοξύ τρυπτοφάνη. 106

107 Πιο συγκεκριμένα, στα γονίδια που εντοπίστηκαν στην αλληλουχία, μελετήθηκαν τα κωδικόνια έναρξης και λήξης αυτών που κωδικοποιούν πρωτεΐνες. Κωδικόνιο έναρξης ATG, φέρουν τα γονίδια atp6, cox3, nad4, nad4l και cob. Ως προς το γονίδιο cob, αν και έχει βρεθεί το αρχικό τμήμα του, δεν έχει βρεθεί η πλήρης αλληλουχία του. Το εναλλακτικό κωδικόνιο έναρξης ΑΤΤ εμφανίζεται στα γονίδια nad2, nad3, nad5 και nad6, ενώ το εναλλακτικό κωδικόνιο έναρξης ΑΤΑ εντοπίζεται στο γονίδιο nad1. Επιπλέον, εναλλακτικό κωδικόνιο έναρξης υπάρχει και στο γονίδιο atp8, όπου εμφανίζεται το κωδικόνιο GTG. Στην περίπτωση του γονιδίου cox1, στο οποίο επίσης εντοπίζεται η αρχική, αλλά όχι η πλήρης αλληλουχία του, δεν μπορεί να διευκρινιστεί κωδικόνιο έναρξης, καθώς η πρώτη τριπλέτα φέρεται ως η TCG. Ως προς τα κωδικόνια λήξης, αυτά είναι το TAG στο γονίδιο nad4, ενώ το ΤΑΑ εντοπίζεται στην περίπτωση των γονιδίων nad2, atp8, cox3, nad4l. Στην περίπτωση όλων των υπολοίπων πλήρων γονιδίων που έχουν σημειωθεί στην υπό μελέτη αλληλουχία, εντοπίζεται στη θέση της λήξης είτε το νουκλεοτίδιο Τ, είτε τα ΤΑ. Αυτά τα νουκλεοτίδια μετατρέπονται σε κωδικόνια λήξης, με την προσθήκη καταλοίπων αδενίνης στο 3 άκρο του mrna. Επιπλέον, μελετήθηκε το μέγεθος όλων των γονιδίων που εντοπίστηκαν πλήρως, καθώς και η ποσοστιαία περιεκτικότητά τους σε βάσεις αδενίνης- θυμίνης. Επιπρόσθετα, καταγράφεται ο κλώνος στον οποίο εντοπίζονται τα γονίδια. Πιο αναλυτικά στον κλώνο L εντοπίστηκαν 4 γονίδια γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες (nad5, nad4, nad4l, nad1), 8 γονίδια trna (trna Gln, Cys, Tyr, Phe, His, Pro, Leu UCN, Val), καθώς και τα δύο γονίδια rrna (12S και 16S rrna). Όσον αφορά τις αλληλουχίες που αντιστοιχούν σε γονίδια, αναλύθηκαν στο πρόγραμμα EMBOSS Transeq που παρέχεται από την ιστοσελίδα του EMBL-EBI ( Στο πρόγραμμα αυτό εισάγεται η αλληλουχία και στη συνέχεια μεταφράζεται στα έξι πιθανά αναγνωστικά πλαίσια. Με τον τρόπο αυτό ελέγχθηκαν οι αλληλουχίες των γονιδίων που εντοπίστηκαν, προκειμένου να διευκρινιστεί αν όντως κωδικοποιούν την ίδια, αναμενόμενη πρωτεΐνη, σύμφωνα με τον οργανισμό B. dorsalis, με βάση την αμινοξική ακολουθία που προκύπτει. Η σύγκριση των αμινοξικών αλληλουχιών στους δύο οργανισμούς έγινε με την ευθυγράμμιση τους στο πρόγραμμα MEGA6, καθώς και στο πρόγραμμα Clustal Omega ( (εικόνα 60). 107

108 α) β) Εικόνα 60: α) Σύγκριση της αμινοξικής αλληλουχίας του γονιδίου cox3 στην αλληλουχία του mtdna του είδους B. dorsalis και B. kandiensis. Οι αστερίσκοι υποδηλώνουν ομολογία στην αμινοξική αλληλουχία. β) Σύγκριση της αμινοξικής αλληλουχίας του γονιδίου nad2 στην αλληλουχία του mtdna του είδους B. dorsalis και B. kandiensis. Οι αστερίσκοι υποδηλώνουν ομολογία στην αμινοξική αλληλουχία. Το σύμβολο «.» υποδηλώνει διατήρηση μεταξύ ομάδων με ελάχιστα κοινές ιδιότητες, ενώ αντίστοιχα το σύμβολο «:» φανερώση διατήρηση της αλληλουχίας μεταξύ ομάδων με κοινές ιδιότητες. Σχετικά με τα trna γονίδια που εντοπίστηκαν, ελέγχθηκε αν σχηματίζουν αντίστοιχη δευτεροταγή δομή, με το πρόγραμμα RNAscan- SE που παρέχεται στο σύνδεσμο Η δευτεροταγής δομή του trna- Arg προέκυψε από το πρόγραμμα MITOS που παρέχεται στο σύνδεσμο Οι δευτεροταγείς δομές των trna φαίνονται στην εικόνα

109 trna- Ile trna- Gln trna- Met trna- Trp trna- Cys trna- Tyr trna- Lys trna- Asp trna- Gly trna- Ala trna- Arg trna- Asn trna- Ser (AGY) trna- Glu trna- Phe trna- His trna- Pro trna- Thr trna- Ser (UCN) trna- Leu (CUN) trna- Val Εικόνα 61: Η δευτεροταγής δομή των 21 trnas γονιδίων του μιτοχονδριακού γονιδιώματος B. kandiensis, όπως σχηματίστηκε με το πρόγραμμα RNAscan-SE και ΜΙΤΟS. 109

110 4. ΣΥΖΗΤΗΣΗ Η κυτταρογενετική, αλλά και η μοριακή μελέτη του είδους Bactrocera kandiensis παρέχουν πληροφορίες σχετικά με τη βιολογία του οργανισμού. Ωστόσο, τα στοιχεία που προέκυψαν μπορούν να χρησιμοποιηθούν και για τη σύγκρισή του με το συγγενικό είδος Bactrocera dorsalis, το οποίο έχει ήδη μελετηθεί σε κυτταρογενετικό (Zacharopoulou et al., 2011) και μοριακό επίπεδο (αλληλούχιση του μιτοχονδριακού DNA από τους Yu et al., 2007). Στόχος της σύγκρισης αυτής είναι να διευκρινιστεί αν πράγματι αποτελούν δύο διακριτά είδη, καθώς όπως έχει προαναφερθεί πολλά είδη του συμπλέγματος B. dorsalis είναι δύσκολο να διακριθούν μόνο με βάση τα μορφολογικά χαρακτηριστικά τους. 4.1 Σύγκριση του μιτωτικού καρυοτύπου Ο μιτωτικός καρυότυπος του είδους B. kandiensis δεν επέδειξε διαφορές σε σχέση με τα άλλα είδη της οικογένειας Tephritidae που έχουν μελετηθεί μέχρι τώρα, ως προς τον αριθμό των χρωμοσωμάτων του. Συγκεκριμένα ο μιτωτικός καρυότυπος περιέχει στο σύνολο 12 χρωμοσώματα (2n=12), από τα οποία τα 5 ζεύγη αποτελούν τα αυτοσωμικά και 1 ζεύγος αποτελεί τα φυλετικά χρωμοσώματα. Το αρσενικό άτομο εμφανίζεται ως το ετερογαμετικό και στους δύο οργανισμούς. Ως προς το μέγεθος των χρωμοσωμάτων δεν εντοπίζονται διαφορές ανάμεσα στα αυτοσωμικά χρωμοσώματα. Ωστόσο, διαφορά εμφανίζεται στο μέγεθος των φυλετικών χρωμοσωμάτων σε σχέση με το μέγεθος των αυτοσωμικών, αλλά και ανάμεσα στο Χ και το Υ χρωμόσωμα. Όπως είναι φανερό από την εικόνα 62 το φυλετικό χρωμόσωμα Χ είναι μεγαλύτερο από τα αυτοσωμικά χρωμοσώματα στο B. kandiensis, σε αντίθεση με το είδος B. dorsalis, όπου το Χ χρωμόσωμα είναι μικρότερο από όλα τα αυτοσωμικά χρωμοσώματα. Επίσης, διαφορά παρατηρείται και στο φυλετικό χρωμόσωμα Υ μεταξύ των δύο ειδών. Στο υπό μελέτη είδος, το Υ χρωμόσωμα, εμφανίζεται αρκετά μικρότερο από το Χ, ωστόσο δεν εμφανίζει μορφολογία «dot like» όπως στο είδος B. dorsalis, στο οποίο διακρίνεται μόνο ως ένα μικρό στίγμα. Συμπερασματικά, τα φυλετικά χρωμοσώματα του B. kandiensis εμφανίζονται διπλάσια σχεδόν σε μέγεθος από τα αντίστοιχα του B. dorsalis. 110

111 Bactrocera kandiensis Bactrocera dorsalis (Zacharopoulou et al., 2011) Εικόνα 62: Σύγκριση μεταφασικών χρωμοσωμάτων θηλυκού και αρσενικού ατόμου B. kandiensis με αρσενικό και θηλυκό άτομο του είδους B. dorsalis. Τα φυλετικά χρωμοσώματα παίζουν ένα δυσανάλογο ρόλο και πολλά διαφορετικά μοτίβα που παρουσιάζουν σχετίζονται με την ειδογένεση. Τα φυλετικά χρωμοσώματα Χ και Υ δεν ανασυδνυάζονται μεταξύ τους και τα γονίδια που είναι ωφέλιμα για τα αρσενικά συσσωρεύονται στην περιοχή κοντά στα φυλοκαθοριστικά γονίδια (Kaiser and Bachtrog, 2010, Giardini et al., 2015). Εξελικτικά, αυτό οδήγησε στη διατήρηση μις περιοχής που σχετίζεται ειδικά με τα αρσενικά άτομα, ενώ παράλληλα το Υ άλλαξε μορφολογικά, με αποτέλεσμα να αναστέλλεται η ικανότητα ανασυνδυασμού μεταξύ του Χ και Υ χρωμοσώματος, ως προς το τμήμα που περιλαμβάνει τα φυλοκαθοριστικά γονίδια (Giardini et al., 2015). Σε πολλά είδη εντόμων παρουσιάζεται υψηλή μορφολογική ποικιλία στα φυλετικά χρωμοσώματα, ως προς το μήκος, το μέγεθος, αλλά και τις ετεροχρωματινικές περιοχές (Traut, 1999, Kaiser and Bachtrog, 2010, Palacios-Gimenez et al., 2013). Συγκεκριμένα στο γένος Anastrepha έχουν συγκριθεί διαφορετικά είδη και έχουν καταγραφεί ειδικά ζωνικά πρότυπα στα φυλετικά χρωμοσώματα (Solferini and Morgante, 1987, Selivon et al., 2005a, Goday et al., 2006, Garcia-Martinez et al., 2009). Χαρακτηριστικό παράδειγμα αποτελεί το είδος Anastrepha fraterculus της οικογένειας Tephritidae. Τόσο το Χ, όσο και το Υ χρωμόσωμα του είδους εμφανίζουν έντονους δομικούς πολυμορφισμούς ανάμεσα σε διαφορετικούς πληθυσμούς, οι οποίοι ωστόσο δεν περιορίζουν την αναπαραγωγική συμβατότητα. Αντίθετα, αποτελούν παραδείγματα 111

112 ενδοειδικών χρωμοσωμικών πολυμορφισμών (Giardini et al., 2015). Κυτταρολογικές μελέτες που έχουν διεξαχθεί σε άγριους πληθυσμούς του είδους έχουν καταγράψει 4 διαφορετικές παραλλαγές του Χ χρωμοσώματος και 6 παραλλαγές του Υ (Lifschitz et al., 1999, Basso and Manso, 1998, Basso et al., 2003). 4.2 Σύγκριση πολυταινικού πυρήνα Η σύγκριση των πολυταινικών πυρήνων του είδους B. kandiensis με το είδος B. dorsalis επέδειξε ομολογία σε 9 από τους 10 χρωμοσωμικούς βραχίονες. Η σύγκριση αυτή είναι εφικτή μέσω του χάρτη των πολυταινικών χρωμοσωμάτων του υπό μελέτη είδους με τον αντίστοιχο του είδους B. dorsalis (Zacharopoulou et al., 2011). Η ομολογία αυτή φαίνεται χαρακτηριστικά στην εικόνα 63, όπου συγκρίνονται οι βραχίονες 4L και 5R, των δύο ειδών, με βάση το ζωνικό πρότυπο. 4L C B. dorsalis 4L B. kandiensis C R B. kandiensis 5R B. dorsalis Εικόνα 63: Ομολογία μεταξύ των βραχιόνων 4L και 5R μεταξύ των ειδών B. kandiensis και B. dorsalis. Ωστόσο, διαφορά παρατηρήθηκε στον βραχίονα 2R (εικόνα 64). Όπως προαναφέρθηκε, στον βραχίονα αυτό εντοπίζεται μια αναστροφή που περιλαμβάνει τις θέσεις Εικόνα 64: Ο βραχίονας 2R του B. kandiensis και η αρίθμησή των επί μέρους περιοχών του, έπειτα από τη μελέτη της αναστροφής που εμφανίζει σε σχέση με το είδος B. dorsalis. 112

113 Συγκεκριμένα, εντοπίζονται δύο σημεία στα οποία θεωρείται ότι συνέβη θραύση και είχε σαν αποτέλεσμα την αναστροφή του περιεχόμενου τμήματος. Το πρώτο σημείο είναι στην αρχή της περιοχής 15 και το δεύτερο περίπου στη μέση της περιοχής 19. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα το τμήμα που περιλαμβάνεται σε αυτά τα δύο σημεία να αναστρέφεται, γεγονός που φανερώνεται από τη διαφορά στη σειρά των ζωνώσεων (εικόνα 65). Εικόνα 65: Θέσεις θραύσης στον βραχίονα 2R του είδους B. kandiensis και η αναστροφή του αντίστοιχου τμήματος όπως προκύπτει έπειτα από σύγκριση με τον βραχίονα του είδους B. dorsalis. Η αρίθμηση των περιοχών από το 11 έως και το 14 παραμένει σταθερή. Στη συνέχεια εισάγεται το τμήμα που στο B. dorsalis αντιστοιχεί στην περιοχή 19. Το κομμάτι αυτό αντιστοιχίζεται στην περιοχή 15 στο B. kandiensis, προκειμένου να συνεχιστεί η ομαλή αρίθμηση του βραχίονα. Ανάλογα, τα τμήματα που αριθμούνται ως 16, 17, 18 και 19 στο είδος B. kandiensis αντιστοιχούν στα τμήματα 18, 17, 16 και 15 του είδους B. dorsalis. Γενικά, οι χρωμοσωμικές αναστροφές είναι κοινές σε πολλά τάξα, συμπεριλαμβανομένου και των Διπτέρων. Ειδικότερα, έχει διεξαχθεί ένας αξιοσημείωτος αριθμός μελετών που εστιάζουν στον τρόπο δημιουργίας των αναστροφών, καθώς και στο ρόλο που παίζουν στην ειδογένεση. Τα μέχρι στιγμής στοιχεία φανερώνουν μια σημαντική συσχέτιση μεταξύ μεταθετών στοιχείων και του τρόπου δημιουργίας των χρωμοσωμικών θραύσεων, συνεπώς και των αναστροφών, τόσο σε εργαστηριακά στελέχη, όσο και σε φυσικούς πληθυσμούς (Krimbas and Powell, 1992), αν και έχουν προταθεί και άλλα εναλλακτικλα μοντέλα. Ο in situ υβριδισμός και η ανάλυση της συντενίας μπορούν να συμβάλουν στον εντοπισμό της ομολογίας, αλλά και να υποδείξουν της χρωμοσωμικές ανακατατάξεις που διαφοροποιούν δύο είδη. Ο εντοπισμός χρωμοσωμικών αναστροφών στα είδη του γένους Bactrocera εμφανίζει ιδιαίτερο ενδιαφέρον. Τέτοιου είδους ανακατατάξεις παρατηρούνται τόσο σε φυσικούς πληθυσμούς όσο και σε εργαστηριακά στελέχη. Αναστροφές που 113