Κυτταρογενετική και μοριακή ανάλυση του είδους Ceratitis fasciventris (Diptera: Tephritidae)

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΤΡΙΩΝ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΕΩΝ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗ ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΚΑΙ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ Κυτταρογενετική και μοριακή ανάλυση του είδους Ceratitis fasciventris (Diptera: Tephritidae) Παντελίδου Χριστίνα ΑΕΜ: 477 Επιβλέποντες καθηγητές: Μαυραγάνη Τσιπίδου Πηνελόπη, Καθηγήτρια Δροσοπούλου Ελένη, Επίκουρη καθηγήτρια ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ

2 ARISTOTLE UNIVERSITY OF THESSALONIKI FACULTY OF SCIENCE SCHOOL OF BIOLOGY POSTGRADUATE STUDIES APPLIED GENETICS AND BIOTECHNOLOGY MASTER THESIS Cytogenetic and molecular analysis of Ceratitis fasciventris (Diptera: Tephritidae) Pantelidou Christina Biologist THESSALONIKI

3 Τριμελής εξεταστική επιτροπή Μαυραγάνη-Τσιπίδου Πηνελόπη Καθηγήτρια Τμήμα Βιολογίας, Α.Π.Θ. Δροσοπούλου Ελένη Επίκουρη καθηγήτρια Τμήμα Βιολογίας, Α.Π.Θ Σκούρας Ζαχαρίας Καθηγητής Τμήμα Βιολογίας, Α.Π.Θ. 3

4 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η παρούσα μεταπτυχιακή διπλωματική εργασία πραγματοποιήθηκε στο εργαστήριο Γενετικής του τομέα Γενετικής, Ανάπτυξης και Μοριακής Βιολογίας του τμήματος Βιολογίας του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης κατά το ακαδημαϊκό έτος Θα ήθελα να ευχαριστήσω την επιβλέπουσα καθηγήτρια κ. Πηνελόπη Μαυραγάνη Τσιπίδου, Καθηγήτρια Γενετικής για την αμέριστη βοήθεια και στήριξη της από τα πρώτα μου ερευνητικά βήματα κατά την προπτυχιακή μου εκπαίδευση έως την ανάθεση της παρούσας εργασίας. Η εμπειρία του να εργαστώ τόσα χρόνια υπό την επίβλεψη της και τις συμβουλές της στο εργαστήριο της ήταν ιδιαίτερα σημαντική για μένα. Πραγματικά την ευχαριστώ θερμά για όλα όσα μου δίδαξε και για την προθυμία της να μοιραστεί μαζί μου τις γνώσεις της, αλλά και για τη συμβολή της στη συγγραφή του κειμένου. Πάνω απ όλα την ευχαριστώ για την εμπιστοσύνη που έδειξε προς το πρόσωπο μου αλλά και για την συνεχή ενθάρρυνση της. Ακόμη, θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά να συνεπιβλέπουσα καθηγήτρια κ. Ελένη Δροσοπούλου, επίκουρη καθηγήτρια του τομέα Γενετικής, για την συνεχή βοήθεια της κατά τη διάρκεια διεξαγωγής της πειραματικής διαδικασίας και ιδιαίτερα για τηνκαθοδήγηση της σχετικά με την υλοποίηση των μοιακών τεχνικών. Η συμβολή της ήταν ουσιαστική και πολύτιμη στη διεξαγωγή των πειραμάτων και την ερμηνεία των αποτελεσμάτων. Επίσης, θα ήθελα να την ευχαριστήσω για τις εύστοχες παρατηρήσεις κατά τη συγγραφή της παρούσας εργασίας. Επιπλέον, θα ήθελα να ευχαριστήσω τον κ. Ζαχαρία Σκούρα, Καθηγητή Γενετικής, για το ότι δέχτηκε να είναι μέλος της τριμελούς εξεταστικής μου επιτροπής, αλλά και για την παραχώρηση του εργαστηρίου του για τη διεξαγωγή τμήματος των πειραμάτων μου. Επίσης, θα ήθελα να ευχαριστήσω την συνάδελφο και πολύ καλή μου φίλη Τατιάνα Χαρτοματσίδου για την άριστη συνεργασία που είχαμε όλο αυτό το χρονικό διάστημα, από τα προπτυχιακά μας χρόνια μέχρι και σήμερα, αλλά και για τις αξέχαστε και ευχάριστες στιγμές που περάσαμε μαζί εντός και εκτός του εργαστηριακού χώρου. Αξίζει να ευχαριστήσω και όλους τους συμφοιτητές και φίλους μου που απέκτησα κατά τη διάρκεια της διετούς φοίτητσης μου στο συγκεκριμένο μεταπτυχιακό πρόγραμμα, για την υποστήριξη, τη βοήθεια και τη φιλία που μου προσέφεραν. Τέλος, θα ήθελα να ευχαριστήσω την οικογένεια μου και όλους τους δικούς μου ανθρώπους για την υποστήριξη, τη συμπαράσταση και τη ενθάρρυνση τους σε κάθε μου βήμα και να τους αφιερώσω την παρούσα διπλωματική εργασία. 4

5 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Τα έντομα της οικογένειας Tephritidae αποτελούν παράσιτα μεγάλης οικονομικής σημασίας, τα οποία απειλούν τις καλλιέργειες πολλών εμπορεύσιμων φρούτων και λαχανικών. Η γενετική και κυτταρολογική μελέτη, σε συνδυασμό με τη μοριακή ανάλυση αυτών των ειδών αποτελούν τη βάση για την ανάπτυξη νέων μεθόδων ελέγχου και καταπολέμησής τους, φιλικών προς το περιβάλλον (π.χ. τεχνική απελευθέρωσης στείρων εντόμων, SIT). Στην παρούσα μελέτη πραγματοποιήθηκε κυτταρογενετική και μοριακή ανάλυση του είδους Ceratitis fasciventris. Το βιολογικό υλικό που χρησιμοποιήθηκε προέρχεται από άτομα του υπό μελέτη είδους από το Εργαστήριο Ελέγχου Παρασιτικών Εντόμων του Seibersdorf (IAEA, Βιέννη), με σκοπό τη κυτταρογενετική και μοριακή σύγκρισή του με το ήδη καλά μελετημένο συγγενικό είδος C. capitata. Το έντομο C. fasciventris ανήκει στην οικογένεια Tephritidae και ειδικότερα στο σύμπλεγμα FAR, που εντοπίζεται κυρίως στην ανατολική και δυτική Αφρική. Στο σύμπλεγμα αυτό συμπεριλαμβάνονται άλλα δύο είδη, τα C. rosa και C. anonae, που εμφανίζονται μορφολογικά όμοια τόσο μεταξύ τους όσο και με το C. fasciventris. Τα είδη του συμπλέγματος αυτού ευθύνονται για σημαντικές απώλειες στον τομέα των καλλιεργούμενων φρούτων και λαχανικών, γι αυτό χαρακτηρίζονται ως εξαιρετικής οικονομικής σημασίας. Η κυτταρογενετική μελέτη περιλαμβάνει την ανάλυση των μιτωτικών και των πολυταινικών πυρήνων του υπο μελέτη είδους. Η μελέτη των μιτωτικών χρωμοσωμάτων επιτρέπει την ανάλυση του αριθμού, του μεγέθους και της μορφολογίας των αυτοσωμικών και φυλετικών χρωμοσωμάτων ενός είδους. Tα πολυταινικά χρωμοσώματα αποτελούν ένα ανεκτίμητο εργαλείο τόσο για τη μελέτη της δομής και λειτουργίας των χρωμοσωμάτων και της οργάνωσης γονιδιωμάτων, όσο και για τη μελέτη της γενετικής δομής των φυσικών πληθυσμών. Από την παρατήρηση των μιτωτικών πυρήνων του C. fasciventris εντοπίζονται πέντε ζεύγη αυτοσωμικών χρωμοσωμάτων και ένα ζεύγος φυλετικών, με ετερογαμετικό το αρσενικό άτομο. Στους πολυταινικούς πυρήνες των σιελογόνων αδένων παρατηρούνται πέντε πολυταινικά χρωμοσώματα (δέκα πολυταινικοί βραχίονες) που αντιστοιχούν στα πέντε ζεύγη των αυτοσωμικών χρωμοσωμάτων του μιτωτικού πυρήνα. Η ανάλυση πολυταινικών και μιτωτικών πυρήνων, αρσενικών και θηλυκών ατόμων C. fasciventris, έδειξε ότι τα φυλετικά χρωμοσώματα δεν αντιπροσωπεύονται από πολυταινικά 5

6 χρωμοσώματα. Ωστόσο, σε όλα τα παρασκευάσματα παρατηρήθηκε μια ετεροχρωματινική δομή περιορισμένου μεγέθους και πυκνότητας. Από τη σύγκριση του προτύπου ζωνώσεως των πολυταινικών χρωμοσωμάτων του C. fasciventris με το είδος C. capitata παρατηρήθηκαν ομοιότητες στους οχτώ από τους δέκα χρωμοσωμικούς βραχίονες, γεγονός που τους χαρακτηρίζει ομόλογους. Παρ όλα αυτά εντοπίστηκαν ανακατατάξεις στους πολυταινικούς βραχίονες 3L και 5L. Πιο συγκεκριμένα, σε κάθε έναν από τους παραπάνω βραχίονες παρατηρήθηκαν πέντε και τέσσερεις θέσεις θραύσης αντίστοιχα, που οδηγούν στην εμφάνιση αναστροφών, αλλά και μεταθέσεων, γεγονός που αποδεικνύει την εμφάνιση πολλαπλών μεταλλάξων σε κάθε βραχίονα. Η ανακατάξεις αυτές, επιβεβαιώθηκαν και μέσω της τεχνικής του in situ υβριδισμού. Τέλος, η μοριακή ανάλυση του είδους C. fasciventris περιλαμβάνει την αλληλούχισης του μιτοχονδριακού του γονιδιώματος και τη σύγκρισή του με το είδος C. capitata, του οποίου η πλήρης μιτοχονδριακή αλληλουχία είναι ήδη κατατεθειμένη. Στο τμήμα του μιτοχονδριακού γονιδιώματος που αλληλουχίθηκε εντοπίστηκαν οι θέσεις και οι αλληλουχίες των γονιδίων που κωδικοποιούν πρωτεΐνες, καθώς και των γονιδίων που κωδικοποιούν διάφορα RNA. Παρατηρήθηκε ότι η οργάνωση του μιτοχονδριακού γονιδιώματος είναι σταθερή, καθώς υπάρχουν υψηλά επίπεδα συντήρησης ανάμεσα στα είδη της οικογένειας Tephritidae, ενώ εντοπίστηκε ομολογία και με το συγγενικό είδος C. capitata της τάξεως του 94%. 6

7 SUMMARY The species of the Tephritidae family are insects of great economic importance, which are responsible for important losses of numerous crops. The genetic and the cytogenetic study, along with a molecular study of these insects, is faindemental to develop new environmentally friendly methods of control and confront (e.g. Sterile Insect Technique, SIT). The present study refers to a cytogenetic and molecular analysis of the species Ceratitis fasciventris. The strains used are maintained in the Insect Pest Control Laboratory in Seibersdorf (IAEA, Vienna). The aim of the study is the comparison of the cytogenetic and molecular data with the reference data of Ceratitis capitata. Ceratitis fasciventris belongs to the Tephritidae family and specifically to the FAR complex, established mainly in eastern and western Africa. Species that belong to this complex are considered as pests with great economic impact, as they are responsible for important losses of numerous crops. The cytogenetic study contains the analysis of the mitotic and the polytene nucleus of the species. The study of the mitotic chromosomes allows the analysis of the number, the size, as well as the morphology of the autosomes and the sex chromosomes of a species. Polytene chromosomes are considered as a priceless tool in studying the structure and the function of the chromosomes and the genome organization, as well as the study of the genetic structure of the natural population The mitotic karyotype of C. fasciventris consists of 5 pairs of submetacentric autosomes and a pair of heteromorphic sex chromosomes. The analysis of the polytene complement revealed the existence of five polytene elements (10 polytene arms) which correspond to the five autosomes. These results are in full agreement with all Tephritid species analyzed so far. The analysis of polytene and mitotic nuclei of male and female individuals of C. fasciventris, revealed that sex chromosomes are not polytenized. However, a heterochromatic mass is observed in every specimen, varying in morphology, size and density. The comparison of the banding pattern of C. fasciventris chromosomes with that of C. capitata showed extensive similarities in eight chromosome arms. However, fixed rearrangements have been observed in two polytene arms, 3L and 5L. These rearrangements include inversions as well as transpositions an indicsting that more than one 7

8 mutation event has occured in each arm. It is evident that four breaks in each of the above elements are implicated. Finally, molecular analysis of C. fasciventris comprices sequencing effort of of the mitochondrial genome and comparison with C. capitata. The position and the sequence of protein coding genes, as well as the RNA coding genes, is estimated. It was observed that the organization of the mitochondrial genome is stable, as there are high maintenance among species of the family Tephritidae while localized homology with related species C. capitata the order of 94%. 8

9 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Οικογένεια Tephritidae Το γένος Cerartitis - Ceratitis capitata Μορφολογία του είδους C. capitata Κύκλος ζωής του είδους C. capitata Γεωγραφική εξάπλωση του είδους C. capitata Ξενιστές του είδους C. capitata Οικονομική σημασία και έλεγχος του είδους C. capitata Σύμπλεγμα FAR Το έντομο Ceratitis fasciventris Μορφολογία του είδους C. fasciventris Γεωγραφική εξάπλωση Κύκλος ζωής του είδους C. fasciventris Ξενιστές του είδους C. fasciventris Οικονομική σημασία και έλεγχος του είδους C. fasciventris Μεταφασικά χρωμοσώματα Πολυταινικά χρωμοσώματα Ιδιαιτερότητες της πολυταινίας Μορφολογία πολυταινικών χρωμοσωμάτων Διάφορες μορφές των πολυταινικών χρωμοσωμάτων Πρότυπο ζωνώσεων Σύναψη ομόλογων χρωμοσωμάτων Μοριακή οργάνωση των ζωνών Puffs Χρωμοσωμικές αναστροφές Χρήση των πολυταινικών χρωμοσωμάτων στη γενετική ανάλυση Μιτοχονδριακό γονιδίωμα Δομή των μιτοχονδρίων Δομή του μιτοχονδριακού DNA Το μιτοχονδριακό DNA ως μοριακό εργαλείο ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Πειραματικό υλικό C. fasciventris 47 9

10 2.2 Παρασκευάσματα μεταφασικών χρωμοσωμάτων Παρασκευάσματα πολυταινικών χρωμοσωμάτων Παρασκευάσματα πολυταινικών χρωμοσωμάτων για κυτταρολογική μελέτη Παρασκευάσματα πολυταινικών χρωμοσωμάτων για χρήση σε πρωτόκολλα in situ Υβριδισμός in situ Δημιουργία ανιχνευτών Υβριδισμός ανιχνευτών in situ σε παρασκευάσματα πολυταινικών χρωμοσωμάτων Σήμανση ανιχνευτή Έλεγχος σήματος ανιχνευτών Προετοιμασία παρασκευασμάτων Υβριδοποίηση Ανίχνευση σήματος υβριδοποίησης Ανάλυση μιτοχονδριακού DNA του είδους C. fasciventris Απομόνωση μιτοχονδριακού DNA με CTAB Ηλεκτροφόρηση απομονωμένου mtdna Αλληλούχιση mtdna του είδους C. fasciventris Βιοπληροφορική ανάλυση της αλληλουχίας ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Ανάλυση μιτωτικού καρυοτύπου Ανάλυση πολυταινικών χρωμοσωμάτων και κατασκευή χαρτών Υβριδισμοί in situ σε πολυταινικά χρωμοσώματα του είδους C. fasciventris Μιτοχονδριακό Γονιδίωμα του C. fasciventris Εύρεση της αλληλουχίας του mtdna του C. fasciventris Οργάνωση του τμήματος του mtdna του C. fasciventris που αλληλουχήθηκε Τα γονίδια της περιοχής του mtdna του C. fasciventris που αλληλουχήθηκε ΣΥΖΗΤΗΣΗ Σύγκριση μιτωτικών καρυοτύπων C. fasciventris C. capitata Σύγκριση πολυταινικών χρωμοσωμάτων C. fasciventris C. capitata

11 4.3 To mtdna του είδους C. fasciventris Η οργάνωση του μιτοχονδριακού γονιδιώματος του C. fasciventris ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ

12 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1.1 Οικογένεια Tephritidae H οικογένεια Tephritidae περιλαμβάνει έντομα που ανήκουν στην τάξη των Διπτέρων. Η κλάση των εντόμων (Insecta) αποτελεί τη μεγαλύτερη κλάση του φύλου των αρθροπόδων και έχει λάβει την ονομασία από το λατινικό insectum, το οποίο σημαίνει εν + τομή, καθώς το σώμα των εντόμων φαίνεται να έχει τομές και διαιρείται σε 3 τμήματα, την κεφαλή, τον θώρακα και την κοιλία. Έχει παρατηρηθεί ότι υπάρχουν περισσότερα είδη εντόμων απ ότι το σύνολο όλων των υπόλοιπων ειδών. Τα έντομα έχουν αναπτύξει πολλές προσαρμογές και έχουν καταφέρει να εκμεταλλευτούν ένα μεγάλο εύρος ενδιαιτημάτων. Η κλάση αυτή περιλαμβάνει 30 τάξεις και η τάξη των Διπτέρων είναι μια από τις 4 μεγαλύτερες (Curtis, 1983). Τα Δίπτερα διακρίνονται από τις άλλες τάξεις εντόμων με δύο βασικά χαρακτηριστικά. Πρώτον, φέρουν ένα ζεύγος μεμβρανωδών πτερύγων, ενώ το δεύτερο ζεύγος έχει τροποποιηθεί κατά την πορεία της εξέλιξης σε δύο μικρά όργανα ισορροπίας, τους αλτήρες. Δεύτερον, τα στοματικά μόρια είναι πάντα μυζητικού τύπου και συχνά έχουν τροποποιηθεί για νύξη (Λαζαρίδου-Δημητριάδου, 1991). Η οικογένεια των Tephritidae αποτελεί τη μία εκ των δύο οικογενειών στις οποίες ανήκουν όλες οι μύγες των φρούτων και το όνομα της προέρχεται από την ελληνική λέξη «τέφρος» που σημαίνει «γκρίζα στάχτη». Η δεύτερη οικογένεια είναι αυτή των Drosophilidae, στην οποία συμπεριλαμβάνεται το γένος Drosophila, τα είδη του οποίου αποτελούν ευρύτερα γνωστούς οργανισμούς μοντέλα και συχνά αποκαλούνται ως οι «κοινές μύγες των φρούτων». Στην οικογένεια Tephritidae έχουν περιγραφεί έως σήμερα σχεδόν είδη μυγών των φρούτων που κατηγοριοποιούνται σε περίπου 500 γένη. Η οικογένεια αυτή εμφανίστηκε πριν από περίπου 50 εκατομμύρια χρόνια, στα μέσα του Τεταρτοταγούς αιώνα αλλά αναγνωρίστηκε το Ο διαχωρισμός αυτής της οικογένειας από τη δεύτερη οικογένεια των μυγών των φρούτων πραγματοποιήθηκε πριν από περίπου εκατομμύρια χρόνια (Kwiatowski et al., 1994). Τα ενήλικα άτομα αυτής της οικογένειας έχουν συνήθως πτέρυγες ανοιχτού χρώματος με σκούρες κηλίδες, ενώ τα θηλυκά άτομα διαθέτουν μεγάλου μήκους ωοαποθέτη με σκοπό την απόθεση των αυγών σε φυτικούς ιστούς. Συνήθως τα είδη της οικογένειας αυτής τρέφονται με φυτικούς ιστούς όπως φύλλα, άνθη, καρπούς ρίζες και βλαστούς (Cristenson and Foote, 1960). Πολλά από τα έντομα της οικογένειας Tephritidae είναι γεωργικά παράσιτα που επιτίθενται σε μια ποικιλία φρούτων και λαχανικών παγκοσμίως και επομένως 12

13 παρουσιάζουν μεγάλη οικονομική σημασία (Foote et al., 1993, Aluja and Norrbom, 2000). Οι καταστροφές που προκαλούν σχετίζονται άμεσα με τον κύκλο ζωής τους, ο οποίος περιλαμβάνει τέσσερα στάδια, το αυγό, τη προνύμφη, η οποία υπόκειται σε τρεις εκδύσεις, τη νύμφη και το ενήλικο άτομο. Πιο συγκεκριμένα, το θηλυκό άτομο προσεγγίζει τον καρπό ή το φρούτο του φυτού και από τη στιγμή που θα εναποθέσει τα αυγά του μέσα σε αυτόν, καταστρέφεται η εμπορευσιμότητα και γευστικότητα του από τη δραστηριότητα των προνυμφών (εικόνα 1 και 2). Πιο συγκεκριμένα, οι αναπτυσσόμενες προνύμφες μετακινούνται μέσα στο μεσοκάρπιο και τρέφονται από αυτό (εικόνα 3). Επιπλέον, η μικροβιακή μόλυνση και η ανάπτυξη διαφόρων μυκήτων μέσω της οπής της ωοτοκίας αποτελεί συχνό φαινόμενο. Όλα αυτά τα γεγονότα έχουν ως αποτέλεσμα την πρόωρη πτώση των καρπών, οι οποίοι δεν είναι βρώσιμοι, και επομένως την ποιοτική και ποσοτική υποβάθμιση της παραγωγής (Foote et al., 1993). Εικόνα 1: Κύκλος ζωής των εντόμων της οικογένειας Tephritidae και καταστροφή των καρπών. ( 13

14 Εικόνα 2: Απόθεση αυγών από θηλυκό άτομο στον καρπό ( Εικόνα 3: Οι προνύμφες μετακινούνται μέσα στο μεσοκάρπιο και τρέφονται από αυτό καταστρέφοντας τον καρπό. ( Τα περισσότερα παρασιτικά είδη της οικογένειας Tephritidae που χρησιμοποιούν σαν ξενιστές φρούτα, στην πλειοψηφία τους ανήκουν στα γένη Anastrepha, Ceratitis, Bactrocera, Dacus και Rhagoletis (Παυλόπουλος, 2006). Οι πιο σημαντικές φρουτόμυγες της συγκεκριμένης οικογένειας που εντοπίζονται στην περιοχή της Μεσογείου είναι ο δάκος της ελιάς, Bactrocera oleae που προσβάλλει τον καρπό των άγριων ή καλλιεργούμενων ελιών (Olea europaea), η Μεσογειακή μύγα, Ceratitis capitata και η ευρωπαϊκή μύγα των κερασιών, Rhagoletis cerasi (Fimiani, 1989). Στους ξενιστές αυτών των παραστικών ειδών συμπεριλαμβάνεται μια ευρεία ποικιλία φυτικών ειδών και ένας μεγάλος αριθμός ανήκει σε φυτά με μεγάλη εμπορική σημασία. Συνολικά περίπου 150 είδη της οικογένειας Tephritidae έχουν ταυτοποιηθεί σαν παράσιτα φυτών με οικονομική και εμπορική σημασία. Έχει παρατηρηθεί ότι κάποια είδη της οικογένειας αυτής παρασιτούν σ ένα μόνο φυτικό είδος (π.χ. B. oleae) και θεωρούνται μονοφάγα, ενώ σε άλλα ο αριθμός των ξενιστών τους ποικίλει ανάλογα με τη 14

15 διαθεσιμότητα τους στις διάφορες γεωγραφικές περιοχές και τις κλιματολογικές συνθήκες, αυτά ονομάζονται πολυφάγα (Παυλόπουλος, 2006). Συνήθως, για την καταπολέμηση των αγροτικών εντόμων-παρασίτων χρησιμοποιούνται διάφορα χημικά εντομοκτόνα. Ωστόσο, οι τεχνικές αυτές έχουν βλαβερές συνέπειες τόσο στο περιβάλλον, όσο και στην υγεία του ανθρώπου. Για το λόγο αυτό σήμερα υπάρχει έντονο ενδιαφέρον για την ανάπτυξη νέων ή τη βελτίωση υπαρχόντων μεθόδων ελέγχου των παρασίτων-εντόμων, οι οποίες είναι φιλικότερες προς το περιβάλλον. Οι μόνες μέθοδοι που εκπληρώνουν αυτές τις προϋποθέσεις είναι εκείνες που στηρίζονται στη γενετική, τη βιολογία και την οικολογία των εντόμων-παρασίτων και θεωρούνται ειδικές για κάθε είδος, γεγονός που σχετίζεται άμεσα με την ισορροπία των οικοσυστημάτων (Robinson, 2002). Η μελέτη των ειδών αυτών στο επίπεδο της γενετικής και της μοριακής βιολογίας θα μπορούσε να συμβάλλει σημαντικά στην ανάπτυξη μεθόδων βιολογικού ελέγχου των πληθυσμών τους. Με εξαίρεση τη Μεσογειακή μύγα, Ceratitis capitata, που θεωρείται το καλύτερα μελετημένο είδος της οικογένειας, οι πληροφορίες για άλλα είδη είναι πολύ περιορισμένες. Η ανάπτυξη χρήσιμων γενετικών εργαλείων και σε άλλα είδη της οικογένειας κρίνεται αναγκαία για την αναγνώριση και τον έλεγχο τους (Παυλόπουλος, 2006). 1.2 Το γένος Ceratitis - Ceratitis capitata Η Μεσογειακή μύγα Ceratitis capitata (Wiedemann) (εικόνα 4) είναι το καλύτερα μέχρι σήμερα μελετημένο είδος της οικογένειας Tephritidae από γενετική και μοριακή άποψη (Robinson and Zacharopoulou, 1996). Επιπλέον, θεωρείται ως ένα από τα πιο πολυφάγα και σημαντικά παράσιτα των εμπορεύσιμων φρούτων παγκοσμίως και γι αυτό εντοπίζεται σε περισσότερες βιβλιογραφικές αναφορές από οποιοδήποτε άλλο είδος παρασίτων αυτού του γένους (Wharton et al., 2000, De Meyer, 2001). Μέχρι σήμερα υπάρχει ένα πλήθος πληροφοριών σχετικά με το είδος C. capitata, αλλά το μεγαλύτερο τμήμα των γνώσεων μας σχετικά με αυτό το παράσιτο προέρχεται από τις προσπάθειες ελέγχου του στις περιοχές στις οποίες έχει εισαχθεί κατά καιρούς (Wharton et al., 2000). 15

16 Εικόνα 4: Ενήλικο άτομο του είδους C. capitata. ( Η συστηματική του κατάταξη δίνεται στον πίνακα 1. Πίνακας 1: Συστηματική κατάταξη του είδους C. capitata. Βασίλειο Animalia Φύλο Arthropoda Κλάση Insecta Τάξη Diptera Οικογένεια Tephritidae Γένος Ceratitis Είδος C. capitata Μορφολογία του είδους C. capitata Τα ενήλικα άτομα του είδους C. capitata έχουν γενικά κίτρινο σώμα και μήκος 3,5-5 mm. Όπως και όλα τα άλλα είδη του γένους Ceratitis έτσι και αυτό, έχει φτερά που φέρουν χρωματιστούς σχηματισμούς οι οποίοι μοιάζουν με ρίγες και ένα διογκωμένο ραχιαίο τμήμα με κίτρινους και μαύρους σχηματισμούς (εικόνα 4). Ακόμη, το χαρακτηριστικό μοτίβο των γκρι κηλίδων στα κύτταρα των φτερών αποτελεί στοιχείο διάκρισης των Ceratitis spp. από τα περισσότερα άλλα γένη της οικογένειας Tephritidae (Haymer et al., 1994) (εικόνα 5). Εικόνα 5: Φτερό εντόμου του είδους C. capitata (OEPP/EPPO, 2011) 16

17 1.2.2 Κύκλος ζωής του είδους C. capitata Όπως όλα τα είδη της οικογένειας Tephritidae έτσι και στην περίπτωση της C. capitata το θηλυκό άτομο τρυπά με τον ωοαποθέτη του την επιφάνεια των φρούτων και γεννά μικροσκοπικά αυγά σε ομάδες των Κάθε θηλυκό άτομο υπό φυσιολογικές συνθήκες μπορεί να γεννήσει κατά μέσο όρο 250 αυγά (Katsoyannos, 1996), τα οποία μετά από 2-4 ημέρες εκκολάπτονται σε προνύμφες πρώτου σταδίου (εικόνα 1) υπό φυσιολογική θερμοκρασία, ενώ παρουσία κρύου η εκκόλαψη μπορεί να γίνει μετά από μέρες (EPPO quarantine pest). Η προνύμφη (larva) ζει μέσα στο φρούτο, κινείται στο μεσοκάρπιο δημιουργώντας ακανόνιστες, επιμήκεις στοές σε βάθος και τρέφεται από αυτό για 6-11 ημέρες κατά τη διάρκεια των οποίων υφίσταται δυο εκδύσεις (εικόνα 3). Όταν η προνύμφη είναι έτοιμη να βομβυκιωθεί ανέρχεται στην επιφάνεια του καρπού και με χαρακτηριστικό τρόπο εκτινάσσεται στο έδαφος. Αμέσως εισέρχεται στο χώμα και εκεί μεταπίπτει στο στάδιο της νύμφης (pupa) μέσα σε χρονικό διάστημα λίγων ωρών (εικόνα 6β). Το βομβύκιο που σχηματίζεται έχει αρχικά υποκίτρινο έως ανοιχτό καφέ χρώμα, ενώ στη συνέχεια μεταβάλλεται σε σκούρο καφέ. Κατά το στάδιο αυτό, το έντομο δεν τρώει, είναι τελείως απροστάτευτο και περιβάλλεται από κουκούλι. Έπειτα από διάστημα 7 με 11 ημερών εκκολάπτεται από αυτό το ενήλικο άτομο (εικόνα 1). Τα ενήλικα άτομα είναι αναπαραγωγικά ώριμα μετά από 2-4 ημέρες και συνήθως ζουν μέχρι 2 μήνες. Γενικά, στο φυσικό περιβάλλον ο κύκλος ζωής της Μεσογειακής μύγας ποικίλει ανάλογα με τις εξωτερικές συνθήκες και μπορεί να διαρκέσει έως και 3 μήνες. Αντιθέτως, σε εργαστηριακές συνθήκες (25 ο C και 75% υγρασία) ο κύκλος ζωής του εντόμου διαρκεί περίπου 25 ημέρες (Παυλόπουλος, 2006) Γεωγραφική εξάπλωση του είδους C. capitata Η Μεσογειακή μύγα C. capitata είναι ένα γηγενές είδος της Αφρικής με πιθανό σημείο προέλευσης την περιοχή νοτιοανατολικά της ερήμου Σαχάρα (Hancock, 1989). Τα τελευταία 200 χρόνια έχει παρατηρηθεί μια ευρεία εξάπλωση της σε πολλές τροπικές, υποτροπικές και εύκρατες περιοχές της γης, όπως στη λεκάνη της Μεσογείου, τις νότιες περιοχές των Η.Π.Α., την κεντρική και νότια Αμερική και την Αυστραλία (Fletcher, 1989, Hooper and Drew, 1989) (εικόνα 6). Η ραγδαία αυτή εξάπλωσή είναι αποτέλεσμα κυρίως ανθρώπινης δραστηριότητας (εμπόριο και τουρισμός) και οφείλεται λιγότερο σε φυσική μετανάστευση ή μεταφορά με τη βοήθεια του ανέμου (Back and Pemberton, 1918). Αξίζει να σημειωθεί πως υπάρχουν ενδείξεις ότι το είδος αυτό μπορεί να πετάξει για απόσταση τουλάχιστον είκοσι χιλιομέτρων (Fletcher, 1989). 17

18 Η πρώτη καταγραφή του συγκεκριμένου παρασίτου σε χώρες της Μεσογείου όπως η Ισπανία και η Ιταλία έγινε στα μέσα του 18 ου αιώνα (Malacrida et al., 1992), ενώ στις αρχές του περασμένου αιώνα εντοπίστηκε για πρώτη φορά στην Αμερικανική ήπειρο και συγκεκριμένα στη Βραζιλία το 1905 (Malacrida et al., 1992). Μέχρι το 1930 είχε φτάσει τις Ηνωμένες Πολιτείες, όπου και ανιχνεύτηκε σε Φλόριντα, Τέξας και Καλιφόρνια (Παυλόπουλος, 2006). Εικόνα 6: Παγκόσμια κατανομή του παρασιτικού είδους C. capitata Ξενιστές του είδους C. capitata Λόγω της πολυφαγίας που διακρίνει το συγκεκριμένο είδος, έχει παρατηρηθεί ότι οι προνύμφες του (larvae) μπορούν να αναπτυχθούν σε μία μεγάλη ποικιλία μη συγγενικών ειδών φρούτων. Για παράδειγμα, στη Χαβάη (USA), στα 60 από τα 196 είδη φρούτων που εξετάστηκαν κατά τη χρονική περίοδο , εντοπίστηκε τουλάχιστον μία φορά το είδος αυτό. Οι δύο πιο σημαντικοί ξενιστές θεωρούνται ο καφές (Coffea arabica) και το Solanum pseudocapsicum. Σύμφωνα με τον EPPO (European and Mediterranean Plant production Organization) ως σημαντική ξενιστές του συγκεκριμένου είδους θεωρούνται το μήλο (Malus pumila), το αβοκάντο (Persea americana), το ακτινίδιο (Actinidia deliciosa), το αχλάδι (Pyrus communis), το ροδάκινο (Prunus spp.και ειδικότερα το Prunus persica) και ουσιαστικά όλα τα καλλιεργούμενα φρούτα δέντρων. Επιπλέον, ως ξενιστές της C. capitata έχουν καταγραφεί άγρια φρούτα τα οποία ανήκουν σε ένα μεγάλο αριθμό οικογενειών (EPPO quarantine pest). 18

19 1.2.5 Οικονομική σημασία και έλεγχος του είδους C. capitata Έχει παρατηρηθεί ότι το είδος C. capitata έχει τη δυνατότητα να προσβάλλει περισσότερα από 350 είδη φρούτων, προκαλώντας κάθε χρόνο τεράστιες καταστροφές σε τροπικέςυποτροπικές και εύκρατες περιοχές του πλανήτη. Όπως προαναφέρθηκε αιτία αυτής της καταστροφής αποτελεί τόσο η εναπόθεση των αυγών στους καρπούς όσο και το γεγονός ότι οι περιοχές ωοαπόθεσης αποτελούν εστίες μόλυνσης από μικροοργανισμούς όπως βακτήρια και μύκητες. Η παρασιτική αυτή δράση της Μεσογειακής μύγας σε συνδυασμό με τη μεγάλη και γρήγορη γεωγραφική της εξάπλωση, δικαίως την κατατάσσουν στα έντομα μεγάλης οικονομικής σημασίας και καθιστούν αναγκαίο τον έλεγχο των φυσικών πληθυσμών της ή και την καταπολέμησή της (Παυλόπουλος, 2006). Αρχικά, για τον έλεγχο των φυσικών πληθυσμών του συγκεκριμένου εντόμου χρησιμοποιούνται διάφορες μέθοδοι όπως η μαζική παγίδευση (Haniotakis et al., 1991), η εφαρμογή δολωματικών ψεκασμών, η απολύμανση των εξαγώγιμων φρούτων (Mansour and Franz, 1996) και κυρίως η χρήση εντομοκτόνων. Οι δυσμενείς όμως επιπτώσεις από τη χρήση εντομοκτόνων επιβάλλουν την ανάπτυξη και εφαρμογή εναλλακτικών μεθόδων, φιλικών προς το περιβάλλον. Η εφαρμογή μεθόδων βιολογικού ελέγχου των φυσικών πληθυσμών επιβλαβών εντόμων βρίσκεται σήμερα σε προτεραιότητα τόσο στον Ευρωπαϊκό χώρο αλλά και σε διεθνές επίπεδο, με κυρίαρχη μέθοδο την απελευθέρωση στείρων ατόμων (SIT, Sterile Insect Technique) (Παυλόπουλος, 2006). Η τεχνική SIT απαιτεί την απελευθέρωση εκατομμυρίων στείρων αρσενικών ατόμων στο φυσικό πληθυσμό, έτσι ώστε να υπάρχει μεγάλη πιθανότητα άγρια θηλυκά άτομα να ζευγαρώσουν με στείρα αρσενικά (Gilmore, 1989). Η τεχνική SIT έχει χρησιμοποιηθεί κατά ορισμένων πληθυσμών του είδους C. capitata στην Κόστα Ρίκα, την Ιταλία, το Μεξικό, τη Νικαράγουα, το Περού, την Ισπανία, την Τυνησία και τις ΗΠΑ (Καλιφόρνια, Χαβάη) (Gilmore, 1989). Το μεγαλύτερο από αυτά τα προγράμματα (Programa Moscamed) διεξάγεται στο νότιο Μεξικό και έχει σχεδιαστεί για να σταματήσει την εξάπλωση του συγκεκριμένου είδους στη Βόρεια Αμερική, αλλά και για να επιτύχει την εξάλειψη του στην Κεντρική Αμερική (Schwarz et al., 1989). 1.3 Σύμπλεγμα FAR Οι μύγες των φρούτων της οικογένειας Tephritidae περιλαμβάνουν οικονομικά σημαντικά συμπλέγματα ειδών (Clarke et al., 2005, Virgilio et al., 2008), όπως είναι το σύμπλεγμα της Anastrepha fraterculus (Μεξικό, Κεντρική και Νότια Αμερική), το σύμπλεγμα Bactrocera dorsalis (Ασία, Αφρική και Νότια Αμερική) και το σύμπλεγμα Ceratitis FAR (Αφρική). Αυτά τα συμπλέγματα ειδών εγείρουν σοβαρές ανησυχίες διότι 19

20 περιπλέκουν την τελειοποίηση συγκεκριμένων στρατηγικών για τον έλεγχο των ειδών, τα οποία είναι μορφολογικά όμοια, αλλά έχουν ως ξενιστή διαφορετικό φάσμα φυτών και διαφορετικές οικολογικές απαιτήσεις (Virgilio et al., 2013). Το σύμπλεγμα Ceratitis FAR (De Meyer, 2005, Barr et al., 2006), το οποίο είναι ευρύτερα γνωστό ως «σύμπλεγμα FAR», είναι μια ομάδα από αφρικάνικες μύγες των φρούτων συμπεριλαμβανομένου του σημαντικού παρασίτου Ceratitis rosa και των μορφολογικά παρόμοιων, αλλά λιγότερο επιθετικών, Ceratitis fasciventris και Ceratitis anonae (Virgilio et al., 2013) (εικόνα 7). Όλα τα μέλη του συμπλέγματος FAR διακρίνονται από πολυφαγία και προκαλούν σημαντικές καταστροφές σε μια μεγάλη ποικιλία άγριων και καλλιεργούμενων φυτών συμπεριλαμβανομένων των Annonaceae, Myrtaceae, Rosaceae και Rubiaceae (Baliraine et al., 2004). Στην αφρικανική ήπειρο τα παράσιτα αυτά δεν προκαλούν μόνο σοβαρές οικονομικές απώλειες, αλλά επίσης μπορούν να απειλήσουν τη δημόσια υγεία εξαιτίας της σημαντικής μείωσης των αποδόσεων των καλλιεργειών (Virgilio et al., 2013). Επιπλέον, λόγω του ότι πολλές μύγες των φρούτων μπορούν να τραφούν από πολλές διαφορετικές διατροφικές πηγές, στο εγγύς μέλλον ορισμένα είδη μπορεί δυνητικά να αποτελέσουν παγκόσμια παράσιτα (Yuval and Hendrichs, 2001). α. β. γ. Εικόνα 7: Είδη συμπλέγματος FAR. α. C. fasciventris, β. C. rosa και γ. C. anonae (

21 Τα φάσματα κατανομής των ειδών που ανήκουν στο σύμπλεγμα FAR εμφανίζουν σημαντική επικάλυψη, ακόμα και αν κάθε είδος προσβάλλει έναν αριθμό μοναδικών ξενιστών (Copeland και Wharton, 2006, Copeland et al., 2006, Virgilio et al., 2008). Τα τρία είδη του συμπλέγματος ανήκουν στο υπογένος Pterandrus και είναι ευρέως διαδεδομένα σε μεγάλο αριθμό αφρικανικών χωρών. Πιο συγκεκριμένα, τα είδη C. fasciventris και C. anonae είναι συμπάτρια τόσο στην ανατολική όσο και στη δυτική Αφρική, ενώ η C. rosa εντοπίζεται στη νότια και ανατολική Αφρική, όπου η κατανομή της ταυτίζεται εν μέρει με αυτή του C. fasciventris αλλά όχι με του C. anonae (εικόνα 8) (Copeland et al., 2006, Virgilio et al., 2008). Εικόνα 8: Κατανομή 27 πληθυσμών των ειδών C. rosa, C. fasciventris και C. anonae στην αφρικανική ήπειρο (Virgilio et al., 2008). Σε αντίθεση με το καλά μελετημένο είδος C. capitata, το οποίο έχει εξαπλωθεί από την ανατολική Αφρική και έχει επιτύχει μια σχεδόν παγκόσμια κατανομή του κατά τον τελευταίο αιώνα, τα είδη του συμπλέγματος FAR (C. fasciventris, C. anonae και C. rosa) μέχρι στιγμής δεν έχουν εντοπιστεί εκτός της αφρικανικής ηπείρου σε μεγάλη εμβέλεια 21

22 (Vanickova et al., 2014). Εξαίρεση μπορεί να αποτελέσει το είδος C. rosa του συμπλέγματος, το οποίο προκαλεί ιδιαίτερη ανησυχία λόγω του κινδύνου της επέκτασης του εκτός της φυσικής του κατανομής (De Meyer et al., 2008, Li et al., 2009, de Villiers et αl., 2012), και λόγω της ικανότητάς του να επιτίθεται σε φρούτα που συνήθως καλλιεργούνται σε υποτροπικά ή εύκρατα κλίματα (π.χ. ροδάκινα και μήλα). Το είδος αυτό έχει ήδη εισαχθεί εκτός της αφρικανικής ηπειρωτικής χώρας στον Ινδικό Ωκεανό στα νησιά της La Reunion και του Μαυρικίου (White et al., 2001, Virgilio et al., 2013). Λόγω των κινδύνων ακούσιας εισαγωγής των παρασίτων του γένους Ceratitis (Hancock, 1989, Duyck et al., 2004, Copeland et al., 2006, Malacrida et al, 2007, De Meyer et al., 2008) υπάρχει μια αυξανόμενη ανάγκη να προσδιοριστούν αξιόπιστα τα διαφορετικά είδη που ανήκουν στις μύγες των φρούτων πριν αυτά εγκατασταθούν σε νέες περιοχές (Barr et al., 2006). Αρχικά, η ταυτοποίηση των ειδών του συμπλέγματος FAR βασίστηκε στα μορφολογικά χαρακτηριστικά των ενηλίκων (De Meyer, 2001, 2005, De Meyer and Freidberg, 2006). Πιο συγκεκριμένα, η διάκριση των αρσενικών από τα τρία είδη βασίζεται στις διαφορές που εμφανίζουν στα σχηματικά και χρωματικά μοτίβα του ποδιού (De Meyer and Freidberg, 2006). Οι διαφορές αυτές είναι διακριτές και σταθερές, αν και κάποια μεταβλητότητα παρατηρείται μεταξύ των πληθυσμών της δυτικής και της ανατολικής Αφρικής του είδους C. fasciventris (De Meyer, 2001). Τα αρσενικά άτομα των ειδών C. fasciventris και C. rosa μοιάζουν μορφολογικά περισσότερο μεταξύ τους από τα αρσενικά του C. anonae (Virgilio et al., 2013). Αξίζει να αναφερθεί ότι, αρχικά το είδος C. fasciventris θεωρήθηκε ως μια ποικιλία του C. rosa (Bezzi, 1920), αλλά πρόσφατα έχει αναγνωριστεί ως ξεχωριστό είδος (De Meyer, 2001). Από την άλλη πλευρά, μόνο τα θηλυκά άτομα του είδους C. anonae μπορούν να διακριθούν από τα άλλα δύο είδη, με ελάχιστες διαφορές στο χρώμα του χνουδωτού μοτίβου στο πόδι τους, ενώ η διάκριση μεταξύ θηλυκών των ειδών C. rosa και C. fasciventris βασίζεται σε ακόμη πιο λεπτομερειακά μορφολογικά χαρακτηριστικά, καθώς παρουσιάζουν πολύ μικρές διαφορές σε φολιδωτά χρωματιστά μοτίβα των ποδιών (De Meyer, 2001). Παρ όλα αυτά οι προνύμφες ή οι νύμφες (εικόνα 9), τα στάδια που συνήθως τίθενται σε καραντίνα, είναι επί του παρόντος αδύνατο να διακριθούν ανάμεσα στα είδη. Ως εκ τούτου, οι μοριακοί δείκτες μπορούν να αποτελέσουν επιπλέον και, ενδεχομένως, πιο απλά εργαλεία για τον εντοπισμό αυτών των παρασίτων και για τη διερεύνηση των φυλογενετικών τους σχέσεων (Virgilio et al., 2008). 22

23 α. β. Εικόνα 9: α. προνύμφη (larva) και β. νύμφη (pupa) του γένους Ceratitis. ( ) Επειδή είναι ιδιαίτερα δύσκολο να διακριθούν μορφολογικά ορισμένα μέλη του συμπλέγματος FAR (De Meyer & Freidberg, 2006), ειδικά τα θηλυκά άτομα, αναπτύχθηκε στο παρελθόν ένας αριθμός μοριακών προσεγγίσεων με σκοπό την αναγνώριση των ειδών (Baliraine et al., 2004, Barr & Mc Pheron, 2006, Virgilio et al., 2008, Steinke et al., 2012., Virgilio et al., 2012). Για παράδειγμα, οι Virgilio et al. το 2013 διευκρίνησαν πέντε γενοτυπικές ομάδες εντός του συμπλέγματος FAR χρησιμοποιώντας τη σύγκριση των αλληλομορφικών παραλλαγών σε 16 μικροδορυφορικούς τόπους. Αυτές οι γενοτυπικές ομάδες επισημάνθηκαν ως R1 και R2 (που αντιπροσωπεύουν το είδος C. rosa), F1 και F2 (που αντιπροσωπεύουν το είδος C. fasciventris) και Α (που αντιπροσωπεύει το είδος C. anonae). Σκοπός της μελέτης τους ήταν η διευκρίνιση των γενετικών σχέσεων και της γονιδιακής ροής τόσο ανάμεσα στα διαφορετικά είδη του συμπλέγματος όσο και ανάμεσα σε πληθυσμούς του ίδιου είδους. Διαπιστώθηκε, λοιπόν, ότι η γενετική διαφοροποίηση μεταξύ των ενδοειδικών πληθυσμών (F1 F2 και R1 R2) ήταν μεγαλύτερη ή και συγκρίσιμη με τη γενετική διαφοροποίηση μεταξύ πληθυσμών που ανήκαν σε διαφορετικά είδη του συμπλέγματος (π.χ. F1 A, R2 - A). Πιο συγκεκριμένα, διαπιστώθηκε ότι i) τα τρία αυτά είδη μπορεί να υποδιαιρούνται σε (τουλάχιστον) πέντε γενετικά καλά διαφοροποιημένες ομάδες, ii) το C. anonae είναι γενετικά παρόμοιο με το C. fasciventris, σύμπλεγμα F1 και iii) υπάρχει σημαντική ενδοειδική διαφοροποίηση μέσα στο είδος C. rosa. Τα αποτελέσματα αυτής της μελέτης τονίζουν τη σημασία αντιμετώπισης της προβληματικής ταξινόμησης των κρυπτικών εντόμων μέσω μιας ολοκληρωμένης προσέγγισης και προτείνουν ότι η διάκριση μεταξύ των ειδών σε συμπλέγματα ειδών θα πρέπει να υποστηρίζεται κατάλληλα από διαφορετικά σύνολα μορφολογικών και μοριακών δεδομένων (Virgilio et al., 2013). Επιπλέον, η χρήση της μικροδορυφορικής μεταβλητότητας για τη διάκριση κρυπτικών ειδών θεωρείται μάλλον επίπονη και ακριβή διαδικασία (Vanickova et al., 2014). 23

24 Επιπρόσθετα, δεν έχουν αναφερθεί ποτέ στο πεδίο περιπτώσεις διαειδικού ζευγαρώματος ή εντοπισμός υβριδικών φαινοτύπων μεταξύ των ειδών του συμπλέγματος FAR (Virgilio et al., 2013). Ωστόσο, σε εργαστηριακές συνθήκες έχει παρατηρηθεί ότι τα είδη C. rosa και C. fasciventris μπορούν να διασταυρωθούν και να παράγουν γόνιμα υβρίδια με ενδιάμεσους φαινοτύπους (Erbout et al., 2008). Μέχρι σήμερα, δεν υπάρχουν στοιχεία σχετικά με τη συμβατότητα ζευγαρώματος του είδους C. anonae με τα άλλα δύο είδη του συμπλέγματος. Ακόμη, αναλύσεις αλληλουχιών του μιτοχονδριακού και του πυρηνικού DNA δεν μπόρεσαν να τεκμηριώσουν τη μονοφυλετικότητα των τριών ειδών στο σύμπλεγμα FAR (Virgilio et al., 2008). Όμως, υπάρχουν κάποιες ενδείξεις γενετικής διαφοροποίησης μεταξύ των πληθυσμών του C. fasciventris ανατολικής και της δυτικής Αφρικής (Virgilio et al., 2008), καθώς και μεταξύ των νησιωτικών και ηπειρωτικών πληθυσμών του είδους C. rosa (Baliraine et al., 2004). Σε γενικές γραμμές, μέχρι στιγμής τα τρία είδη του συμπλέγματος δεν συμμορφώνονται πλήρως με τις καθοριστικές ιδιότητες των πιο συχνών εννοιών που χρησιμοποιούνται στα είδη (De Queiroz, 2007), και ιδίως i) με τη φαινοτυπική ιδέα του είδους, διότι τα θηλυκά άτομα των ειδών C. anonae και C. rosa είναι σχεδόν αδιάκριτα (De Meyer & Freidberg 2006), ii) τη βιολογική έννοια του είδους, διότι τα είδη C. rosa και C. fasciventris παράγουν γόνιμους υβριδικούς απογόνους κάτω από εργαστηριακές συνθήκες (Erbout et αl., 2008), iii) τη φυλογενετική ιδέα του είδους, επειδή η μονοφυλετικότητα των τριών αυτών ειδών δεν μπορούσε να επιβεβαιωθεί με αναλύσεις της αλληλουχίας του DNA (Virgilio et αl., 2008), και iv) την οικολογική ιδέα του είδους, επειδή υπάρχει μεγάλη αλληλοεπικάλυψη μεταξύ των θέσεων των τριών αυτών ειδών (Copeland et al., 2006). Η αβέβαιη ταξινομική κατάσταση συγκεκριμένων πληθυσμών έχει σημαντικές πρακτικές συνέπειες στην αποτελεσματική ανάπτυξη και χρήση των τεχνικών στειρότητας εντόμων (SIT), για την εκτροφή στείρων αρσενικών του σωστού είδους, και επηρεάζει τη διεθνής διακίνηση των φρούτων και λαχανικών λόγω των εμπορικών φραγμών σε σημαντικά γεωργικά προϊόντα τα οποία είναι ξενιστές των παρασίτων της οικογένειας Tephritidae (Dyck et al., 2005). Επιπλέον, ο προσδιορισμός των κρυπτικών ειδών θεωρείται ζωτικής σημασίας για την ακριβή εκτίμηση της βιοποικιλότητας, για τη διευκόλυνση του ελέγχου πιθανής προσβολής των φυτικών καλλιεργειών από παθογόνους οργανισμούς και για την κατεύθυνση των προσπαθειών περιορισμού τους σε συγκεκριμένες γεωγραφικές περιοχές (Paterson, 1991, Besansky, 1999, Copren et al., 2005, Garros et al., 2006, Bickford et al., 2007). Για παράδειγμα, πραγματοποιήθηκε ένας αριθμός από μελέτες που χρησιμοποίησαν περιβαλλοντικά δεδομένα και δεδομένα 24

25 διανομής για να δημιουργήσουν ένα μοντέλο των οικολογικών απαιτήσεων του είδους C. rosa και για τον εντοπισμό νέων περιοχών που μπορούν να θεωρηθούν ευαίσθητες προς εισβολή από το συγκεκριμένο είδος (De Meyer et αl., 2008, Li et αl., 2009, de Villiers et αl., 2012). Αυτές οι μελέτες προβλέπουν ότι το είδος C. rosa μπορεί να επεκταθεί όχι μόνο στο εσωτερικό της Αφρικής, αλλά και σε ολόκληρη την Ευρώπη, την Ασία, την Αυστραλία και τη Βόρεια και Νότιας Αμερική (De Meyer et al., 2008, Li et αl., 2009). Όλοι αυτοί, λοιπόν, οι λόγοι ωθούν την αναζήτηση εναλλακτικών εργαλείων για την ταυτοποίηση των κρυπτικών ειδών στις μύγες των φρούτων (Vanickova et al., 2014). Μια τέτοια εναλλακτική μέθοδος θεωρείται η κυτταρογενετική προσέγγιση για την ταυτοποίηση και τη διάκριση των διαφόρων ειδών μέσα σε συμπλέγματα ειδών. 1.4 Το έντομο Ceratitis fasciventris Το έντομο Ceratitis fasciventris (Bezzi) (εικόνα 10) αρχικά είχε θεωρηθεί ως υπό-είδος της Ceratitis rosa και σχετικά πρόσφατα αναγνωρίστηκε ως ξεχωριστό είδος (De Meyer, 2001). Εικόνα 10: Θηλυκό άτομο του είδους C. fasciventris ( Η συστηματική κατάταξη του είδους φαίνεται στον πίνακα 2. Πίνακας 2: Συστηματική κατάταξη του είδους C. fasciventris Βασίλειο Φύλο Κλάση Τάξη Οικογένεια Γένος Είδος Animalia Arthropoda Insecta Diptera Tephritidae Ceratitis C. fasciventris 25

26 1.4.1 Μορφολογία του είδους C. fasciventris Τα ενήλικα άτομα του είδους C. fasciventris έχουν σώμα με έντονες ρίγες. Όπως προαναφέρθηκε, ομοίως με τα άλλα είδη του γένους Ceratitis και αυτό, έχει φτερά που φέρουν χρωματιστούς σχηματισμούς οι οποίοι μοιάζουν με ρίγες και ένα διογκωμένο ραχιαίο τμήμα με κίτρινους και μαύρους σχηματισμούς (εικόνα 10). Ακόμη, το χαρακτηριστικό μοτίβο των γκρι κηλίδων στα φτερά εντοπίζεται και σε αυτό το είδος του γένους Ceratitis. Αξίζει να σημειωθεί ότι τα αρσενικά ενήλικα άτομα του συγκεκριμένου είδους μπορούν να διαφοροποιηθούν μέσω κάποιων μορφολογικών χαρακτηριστικών που παρουσιάζουν στο μέσον της κνήμης του ποδιού τους από τα υπόλοιπα δύο είδη του συμπλέγματος. Επίσης, κάποια χαρακτηριστικά σημεία που εντοπίζονται στα φτερά μπορεί να αποτελέσουν ενδείξεις διαχωρισμού των δύο φύλων αλλά χωρίς συνήθως μεγάλη επιτυχία (Virgilio et al., 2008) Γεωγραφική εξάπλωση Η γεωγραφική εξάπλωση του συγκεκριμένου είδους αφορά την Αφρικανική Ήπειρο. Πιο συγκεκριμένα, έπειτα από εκτεταμένες μελέτες υπάρχουν στοιχεία που δείχνουν δύο σε μεγάλο βαθμό αποκομμένους γεωγραφικά πληθυσμούς του C. fasciventris, τον έναν στην ανατολική Αφρική και τον άλλο στη δυτική και κεντρική Αφρική (Virgilio et al., 2013) (εικόνα 8). Ωστόσο, ο τελευταίος τύπος του είδους συναντάται και σε ορισμένες απομονωμένες περιοχές όπως στην Αγκόλα, στην Τανζανία, στη Ζάμπια, στο Μαλάουι, στην Ουγκάντα έως και το Μάλι Κύκλος ζωής του είδους C. fasciventris Ο κύκλος ζωής του C. fasciventris είναι όμοιος με όλα τα είδη της οικογένειας Tephritidae και περιγράφηκε αναλυτικά στο είδος C. capitata (εικόνα 1) Ξενιστές του είδους C. fasciventris Όπως όλα τα είδη που ανήκουν στο σύμπλεγμα FAR έτσι και αυτό το είδος είναι πολυφάγο και μπορεί να προκαλέσει καταστροφές σε ένα ευρύ φάσμα φρούτων αλλά και λαχανικών. Κάποια από τους κύριους ξενιστές του θεωρούνται το μάνγκο (Mangifera indica), ο καφές (Coffea arabica) και ο ανανάς (Ananas comosus) (Παυλόπουλος, 2006) Οικονομική σημασία και έλεγχος του είδους C. fasciventris Το είδος C. fasciventris έχει παρατηρηθεί ότι προσβάλλει έναν αρκετά μεγάλο αριθμό εμπορεύσιμων φρούτων, προκαλώντας τεράστιες οικονομικές απώλειες. Για το λόγο αυτό 26

27 αυξάνεται όλο και συνεχώς η ανάγκη ελέγχου της εξάπλωσης του η οποία μέχρι στιγμής είναι περιορισμένη στην Αφρική. Η χρήση καραντίνας καθώς και o έλεγχος των εξαγωγών σε χώρες που απουσιάζει το συγκεκριμένο είδος, είναι μέθοδοι για να αποφευχθεί η εξάπλωση του. 1.5 Μεταφασικά χρωμοσώματα Η ανάλυση των μεταφασικών χρωμοσωμάτων αποτελεί ένα αναπόσπαστο κομμάτι της κυτταρογενετικής μελέτης των ειδών της οικογένειας Tephritidae. Στη συντριπτική τους πλειοψηφία οι καρυότυποι των ειδών της συγκεκριμένης οικογένειας που έχουν αναλυθεί μέχρι σήμερα αποτελούνται από έξι ζεύγη χρωμοσωμάτων συμπεριλαμβανομένου ενός ζεύγους στο οποίο υπάρχουν υψηλά επίπεδα ετεροχρωματίνης και αντιπροσωπεύει τα φυλετικά χρωμοσώματα. Αξίζει να σημειωθεί ότι, το αρσενικό άτομο εμφανίζεται πάντα ετερογαμετικό με καρυότυπο 2n=12,XY (Singh and Gupta 1984, Bedo, 1986, Mavragani- Tsipidou et al., 1992, Hunwattanakul and Baimai 1994, Baimai et al., 2000, Zhao et al., 1998, Frias 2002, Cevallos and Nation, 2004, Selivon et al., 2005, Kounatidis et al., 2008, Garcia-Martinez et al., 2009, Drosopoulou et al., 2010, 2011, 2012a). Ακόμα κι αν έχει παρατηρηθεί μια μεγάλη μεταβλητότητα στο μήκος των φυλετικών χρωμοσωμάτων, μπορεί να πραγματοποιηθεί διάκριση των θηλυκών και αρσενικών ατόμων στα περισσότερα είδη με ευκολία εξαιτίας της διαφορετικής μορφής των Χ και Υ χρωμοσωμάτων. Μόνο σε μερικά είδη τα χρωμοσώματα Χ και Υ είναι παρόμοια σε μήκος καθιστώντας τη διάκριση των θηλυκών και των αρσενικών καρυοτύπων ιδιαίτερα δύσκολη (Kounatidis et al., 2008, Drosopoulou et al., 2010, 2011, 2012a). Γενικά, το μέγεθος των φυλετικών χρωμοσωμάτων μπορεί να διαφέρει από είδος σε είδος. Σε κάποια είδη όπως στο B. oleae το χρωμόσωμα Υ εμφανίζεται στον καρυότυπο ως μικρό ετεροχρωματινικό χρωμόσωμα με σχήμα τελείας (χρωμόσωμα dot), ενώ το Χ είναι μικρότερο από τα αυτοσωμικά χρωμοσώματα και πολύ μεγαλύτερο από το Υ (εικόνα 11). Σε κάποια άλλα είδη όπως στο R. cerasi τα φυλετικά χρωμοσώματα είναι πολύ ετεροχρωματινικά και παρόμοια σε μέγεθος, γεγονός που καθιστά δύσκολη τη διάκριση του φύλου. Ωστόσο, το χρωμόσωμα Υ εμφανίζεται λίγο μεγαλύτερο από το Χ (εικόνα 12). Για την αρίθμηση των χρωμοσωμάτων χρησιμοποιείται το σύστημα αρίθμησης που υποδείχθηκε από τους Radu et al. (1975), σύμφωνα με το οποίο, το ζεύγος των φυλετικών χρωμοσωμάτων είναι το πρώτο ζεύγος, ενώ τα υπόλοιπα αριθμούνται από 2 ως 6, ανάλογα με το μέγεθός τους, με το δεύτερο ζεύγος να έχει το μεγαλύτερο μέγεθος. 27

28 Εικόνα 11: Μεταφασικoί πυρήνες εγκεφαλικών γαγγλίων προνυμφών B. oleae. α) Θηλυκό, β) Αρσενικό άτομο. α. β. α. β. Εικόνα 12: Μεταφασικοί πυρήνες εγκεφαλικών γαγγλίων προνυμφών R. cerasi. α) Θηλυκό, β) Αρσενικό άτομο. Στους πολυταινικούς πυρήνες όλων των ειδών της οικογένειας Tephritidae που εξετάστηκαν, εντοπίζονται πέντε χρωμοσώματα (Bedo 1986, 1987, Zacharopoulou, 1987, 1990, Mavragani-Tsipidou et al., 1992, Zambetaki et al., 1995, Zhao et al., 1998, Shahjahan and Yesmin 2002, Kounatidis et al., 2008, Drosopoulou et al., 2010, 2011, Zacharopoulou et al., 2011). Έχει προταθεί, λοιπόν, ότι τα πέντε αυτά πολυταινικά χρωμοσώματα αντιστοιχούν στα πέντε ζευγάρια αυτοσωμικών μεταφασικών χρωμοσωμάτων, ενώ τα φυλετικά χρωμοσώματα αντιστοιχούν στην ετεροχρωματινική μάζα του πολυταινικόυ πυρήνα, οπότε δεν πολυταινίζονται (Drosopoulou et al., 2012a). Τα πρώτα αποδεικτικά στοιχεία για την αντιστοιχία μεταξύ των φυλετικών χρωμοσωμάτων και της ετεροχρωματινικής μάζας των πολυταινικών πυρήνων ελήφθησαν από την εφαρμογή της μεθόδου FISH στη Μεσογειακή μύγα, Ceratitis capitata. Οι ανιχνευτές που χρησιμοποιήθηκαν ήταν ειδικοί προς κάποια Χ-συνδεδεμένα γονίδια (Rosetto et al., 2000). 28

29 1.6 Πολυταινικά χρωμοσώματα Τα πολυταινικά χρωμοσώματα είναι γιγαντιαία χρωμοσώματα τα οποία εντοπίζονται σε πολλά δίπτερα και ιδιαίτερα στις μύγες. Αρχικά έχουν μορφή φυσιολογικών χρωμοσωμάτων, αλλά μέσα από επανειλημμένους κύκλους αντιγραφής του DNA χωρίς όμως να ακολουθεί κυτταρική διαίρεση (ενδοδιπλασιασμός), γίνονται μεγάλα χρωμοσώματα με έντονο πρότυπο ζωνώσεων (Zhimulev and Koryakov, 2009). Τα χρωμοσώματα αυτά ανακαλύφθηκαν από τον Balbiani το 1881 στους σιελογόνους αδένες προνυμφών, χωρίς όμως αυτός να μπορεί διακρίνει ξεκάθαρα την ύπαρξη των ξεχωριστών δομών τους καθώς είχαν τη μορφή μιας ενιαίας μάζας. Κατά τη διάρκεια της χρονικής περιόδου , τρεις ομάδες ερευνητών (Painter, 1933, Heitz and Bauer 1933, King and Beams, 1934), χρησιμοποιώντας παρασκευάσματα χρωμοσωμάτων, παρατήρησαν ότι ο πυρήνας των κυττάρων αποτελείται από ξεχωριστές δομές - χρωμοσώματα των οποίων ο αριθμός προσεγγίζει τον απλοειδή αριθμό των μιτωτικών χρωμοσωμάτων. Κάθε χρωμόσωμα εμφανίζει μια σαφή και σταθερή μορφολογία και αποτελείται από πολλά τμήματα, εμφανίζοντας ένα συγκεκριμένο πρότυπο ζωνώσεων (Zhimulev and Koryakov, 2009). Η σχέση μεταξύ των πολυταινικών χρωμοσωμάτων, γνωστά εκείνη την εποχή και ως «γιγάντια χρωμοσώματα», και των ήδη γνωστών μιτωτικών χρωμοσωμάτων προτάθηκε για πρώτη φορά από τον Rambousek (1912) και στη συνέχεια από τον Kostoff (1930), τον Koltzoff (1934), και τον Bauer (1935). Ο όρος «πολυταινικά» προτάθηκε από τον Koller (1935) και εγκρίθηκε από τον Darlington (1937). Γενικά, η πολυταινία εντοπίζεται σε ένα ευρύ φάσμα οργανισμών και εμφανίζεται σε πολλά στάδια της εξέλιξης. Για παράδειγμα, εντοπίστηκε σε πολλά είδη που ανήκουν στα Protista, τα οποία εμφανίστηκαν ήδη από την εποχή του Προκάμβιου (περισσότερα από 600 εκατομμύρια χρόνια πριν), στα Collembola, τα οποία εμφανίστηκαν στη μέση της Μεσοζωικής εποχή (πάνω από 400 εκατομμύρια χρόνια πριν), στα δίπτερα και στα θηλαστικά (100 εκατομμύρια χρόνια πριν) και επίσης σε πολλά κύτταρα των αγγειόσπερμων φυτών (Πίνακας 3) (Zhimulev and Koryakov, 2009). 29

30 Πίνακας 3: Οργανισμοί και όργανα στα οποία έχουν εντοπιστεί πολυταινικά χρωμοσώματα (Zhimulev and Koryakov, 2009) Τα πολυταινικά χρωμοσώματα θεωρούνται πλέον πολύ σημαντικά εργαλεία για την ανάλυση πολλών χαρακτηριστικών της οργάνωσης των χρωμοσομάτων στη μεσόφαση του κυτταρικού κύκλου αλλά και για την οργάνωση του συνολικού γονιδιώματος (Zhimulev and Koryakov, 2009) Ιδιαιτερότητες της πολυταινίας Τα κύτταρα στα οποία εντοπίζονται τα πολυταινικά χρωμοσώματα διαφέρουν από τα μιτωτικά διαιρούμενα κύτταρα και από όσα υποβάλλονται σε ενδομίτωση, σε κάποια βασικά σημεία. Πρώτον, ο σχηματισμός των πολυταινικών χρωμοσωμάτων συνδέεται με την εξάλειψη ολόκληρου του μηχανισμού της μίτωσης μετά από κάθε διπλασιασμό του DNA, ως αποτέλεσμα της οποίας ο κυτταρικός κύκλος αποτελείται από δύο φάσεις, την S και τη G (G1 G2). Δεύτερον, στο τέλος κάθε περιόδου αντιγραφής, τα δύο νέα μόρια του DNA δεν διαχωρίζονται, αλλά παραμένουν συνδεδεμένα μεταξύ τους σε διαφορετικό βαθμό. Τρίτον, τα πολυταινικά χρωμοσώματα που σχηματίζονται δεν έχουν τη δυνατότητα να συμμετέχουν σε μίτωση. Τέταρτον, η πυρηνική μεμβράνη και ο πυρηνίσκος παραμένουν ανέπαφα κατά τη διάρκεια διαδοχικών κύκλων της αντιγραφής του DNA (Zhimulev and Koryakov, 2009). Το γονίδιο escargot στη D. melanogaster που είναι απαραίτητο για να διατηρούνται τα κύτταρα των εμβρυικών δίσκων σε διπλοειδή κυτταρικό κύκλο, δεν λειτουργεί σε ιστούς προνυμφών που έχουν πολυταινικά χρωμοσώματα. Όμως, έχει παρατηρηθεί ότι η τεχνητή έκφραση του σε τέτοιους ιστούς, όπως στους σιελογόνους αδένες, αναστέλλει τον πολυταινισμό (Zhimulev and Koryakov, 2009). 30

31 Γενικά, η πολυταινία προκύπτει και επιτυγχάνεται σε υψηλά επίπεδα σε ιστούς, όργανα και αναπτυξιακά στάδια, όταν υπάρχει ανάγκη για ταχεία ανάπτυξη ενός οργάνου σε ένα υψηλό επίπεδο λειτουργίας. Όργανα που περιέχουν κύτταρα με πολυταινικά χρωμοσώματα, κατά κανόνα, συμμετέχουν σε έντονες εκκριτικές λειτουργίες που πρέπει να επιτευχθούν σε σύντομο χρονικό διάστημα μέσα σε ένα πλαίσιο ταχείας ανάπτυξης. Τα χαρακτηριστικά της πολυταινίας παρέχουν τις αναγκαίες προϋποθέσεις για την εκπλήρωση αυτών των λειτουργιών (Zhimulev and Koryakov, 2009). Καθώς όμως ολόκληρος ο μηχανισμός της πυρηνικής και κυτταρικής διαίρεσης καταστέλλεται εντελώς κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου, η διαδικασία της αντιγραφής των χρωμοσωμάτων πραγματοποιείται πολύ γρήγορα και απλουστευμένα. Βέβαια, η διαδικασία αυτή παρέχει ασφαλώς σημαντικά πλεονεκτήματα όσον αφορά την ενέργεια και το χρόνο που απαιτείται. Κατά συνέπεια, η μάζα ενός οργάνου αυξάνεται με μεγαλύτερο ρυθμό, ως αποτέλεσμα πολυταινισμού, από ό,τι θα αυξανόταν μέσω μιτωτικών διαιρέσεων των διπλοειδών κυττάρων. Είναι επίσης προφανές ότι ο κυτταρικός κύκλος στα πολυταινικά κύτταρα εξασφαλίζει τη διατήρηση των υψηλών λειτουργικών δραστηριοτήτων του οργάνου, αποφεύγοντας τις ασυνέχειες που μπορεί να προκύψουν λόγω της μίτωσης (Zhimulev and Koryakov, 2009) Μορφολογία πολυταινικών χρωμοσωμάτων Η μορφολογία των πολυταινικών χρωμοσωμάτων μπορεί να ποικίλει ευρέως λόγω των διαφορετικών επιπέδων σύναψης μεταξύ των δύω μορίων του DNA. Τα πολυταινικά χρωμοσώματα εμφανίζονται με τη μορφή κυλινδρικών δομών που φέρουν διακριτό πρότυπο ζωνώσεων. Σε ορισμένες περιπτώσεις, η σύζευξη των χρωματίδων διαταράσσεται σε ένα μόνο από τα χρωμοσώματα του συνόλου. Τότε αυτό το πολυταινικό χρωμόσωμα χάνει τελείως τη μορφή ζωνών και η εμφάνισή του είναι διάχυτη. Ακόμη, οι διαφορές στο βαθμό σύζευξης των χρωματίδων μπορεί να σχετίζονται με το είδος του ιστού από τον οποίο προέρχονται τα κύτταρα που περιέχουν πολυταινικά χρωμοσώματα. Σε πολλά είδη, τα πολυταινικά χρωμοσώματα με την κλασική τους μορφή, ανιχνεύονται στα κύτταρα των σιελογόνων αδένων (Zhimulev and Koryakov, 2009). Ωστόσο, έχουν ταυτοποιηθεί και στα κύτταρα των ωοθηκών, όμως, μόνο σε μερικά είδη όπως στο Calliphora erythrocephala (Ribbert, 1979). Συνήθως, στους πολυταινικούς πυρήνες, μη ομόλογα χρωμοσώματα ενώνονται με τις κεντρομερικές τους περιοχές (Zhimulev and Koryakov, 2009). Ακόμη, έχει παρατηρηθεί με τη βοήθεια του in situ υβριδισμού FISH ότι σε πολλά έντομα της οικογένειας Tephritidae 31

32 στην ετεροχρωματινική μάζα των πολυταινικών χρωμοσωμάτων αντιστοιχούν και τα φυλετικά χρωμοσώματα, όταν αυτά δεν πολυταινίζονται (Drosopoulou et al., 2012a). Μέχρι σήμερα σε όλα τα δίπτερα έντομα της οικογένειας Tephritidae που έχουν μελετηθεί ως σήμερα έχει διαπιστωθεί ότι κάθε πολυταινικός πυρήνας αποτελείται από πέντε μεγάλα πολυταινικά χωμοσώματα κάθε ένα από τα οποία αποτελείται από δύο μεγάλους πολυταινικούς βραχίονες (αριστερός και δεξιός βραχίονας). Όλοι αυτοί οι βραχίονες πολλές φορές μπορεί να συνδέονται σε μία ετεροχρωματινική περιοχή που ποικίλει σε μορφή και μέγεθος από είδος σε είδος. Οι παρατηρούμενες αυτές διαφορές στην ετεροχρωματινική μάζα πιθανόν αντιπροσωπεύουν κεντρομερικές ή περικεντρομερικές περιοχές στις οποίες εξελίσσεται η διαδικασία της αντιγραφής (Zacharopoulou et al., 2011). Οι κεντρομερικές και περικεντρικές περιοχές παράλληλα με τις τελομερικές και υποτελομερικές έχουν αναγνωριστεί ως ιδιαίτερα «δυναμικές» περιοχές στην εξέλιξη των χρωμοσωμάτων λόγω των συνεχών επαναλήψεων που παρουσιάζουν. Επιπλέον, θεωρούνται περιοχές με πολλές πιθανότητες εισαγωγής ή διατήρησης επαναλαμβανόμενων περιοχών (Eichler and Sankoff, 2003). Ακόμη, παρατηρήθηκαν διαφορές στην ποσότητα και τη διασπορά της ετεροχρωματίνης ανάμεσα σε διαφορετικά γένη δίπτερων εντόμων όπως στα Drosophila, Anopheles και Bactrocera (Zacharopoulou et al., 2011) Διάφορες μορφές των πολυταινικών χρωμοσωμάτων Το φαινόμενο κατά το οποίο η ανάπτυξη προκύπτει από την αύξηση του μεγέθους των σχετικά λίγων κυττάρων, και όχι από την αύξηση του αριθμού τους μέσω κυτταρικών διαιρέσεων, είναι ιδιαίτερα γνωστό στην κλάση των εντόμων. Βέβαια, τέτοια ανάπτυξη συνοδεύεται από μια παράλληλη αύξηση του μεγέθους του πυρήνα και του περιεχομένου του DNA. Αξίζει να σημειωθεί ότι τα επίπεδα πολυταινισμού διαφέρουν σημαντικά μεταξύ διαφορετικών κυττάρων μέσα σε ένα όργανο, μεταξύ διαφορετικών οργάνων αλλά και μεταξύ οργανισμών και ειδών. Επιπροσθέτως, όλα τα τμήματα του DNA σε μία αδελφή χρωματίδα δεν πολυταινίζονται στον ίδιο βαθμό. Κάποια τμήματα μπορεί να αντιγράφονται με ταχύτερο και άλλα με βραδύτερο ρυθμό. Οι περιοχές των χρωμοσωμάτων στις οποίες υπάρχει έντονη μεταγραφική δραστηριότητα έχουν τη μορφή «φουσκώματος» το οποίο ονομάζεται «DNA puff» και περιγράφηκαν πρώτη φορά στα πολυταινικά χρωμοσώματα των Sciaridae (Zhimulev and Koryakov, 2009). 32

33 1.6.4 Πρότυπο ζωνώσεων Κατά μήκος κάθε χρωματίδας, η διακύμανση στην έκταση της περιέλιξης του DNA και των σχετικών πρωτεϊνών του οδηγεί σε μεταβολή της συγκέντρωση της χρωματίνης. Όπως προαναφέρθηκε, οι περιοχές υψηλής συγκέντρωσης είναι γνωστές ως χρωμομερή (Εικόνα 13). Για κάθε χρωματίδα το ζωνικό πρότυπο είναι συγκεκριμένο έτσι ώστε στο ομόλογο πολυταινικό χρωμόσωμα τα ομόλογα χρωμομερή να ευθυγραμμίζονται ακριβώς το ένα δίπλα στο άλλο και συνήθως εμφανίζονται με τη μορφή ζώνης στο χρωμόσωμα. Το πρότυπο ζωνώσεων στα πολυταινικά χρωμοσώματα είναι γενικά σταθερό και ιδιαίτερα χαρακτηριστικό της οργάνωσής τους, έτσι ώστε οι επιμέρους περιοχές μπορούν να αναγνωριστούν, να χαρτογραφηθούν και να αποτελέσουν σημεία αναφοράς. Επίσης, έχει παρατηρηθεί ότι, στις περιοχές ενδιάμεσα των ζωνών, η συγκέντρωση του DNA και των πρωτεϊνών είναι χαμηλότερη από αυτή που εντοπίζεται στις ζώνες (Zhimulev and Koryakov, 2009). Εικόνα 13: Τμήμα του 3R πολυταινικού χρωμοσώματος του είδους D. melanogaster όπως απεικονίζεται στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο. Διακρίνεται το πρότυπο ζωνώσεων του χρωμοσώματος (Zhimulev and Koryakov, 2009). Το πρότυπο των ζωνώσεων και των περιοχών ανάμεσα τους σε κάθε πολυταινικό χρωμόσωμα είναι χαρακτηριστικό και ειδικό για το κάθε είδος, και σε γενικές γραμμές είναι χαρακτηριστικό του συγκεκριμένου χρωμοσώματος σε διαφορετικούς ιστούς ή σε διαφορετικά αναπτυξιακά στάδια. Μια εμπεριστατωμένη ανάλυση του σχηματισμού ζωνώσεων στα χρωμοσώματα από κύτταρα τεσσάρων ιστών του είδους C. tentans οδήγησε τον Beermann το στο συμπέρασμα ότι ένα συγκεκριμένο πρότυπο ζωνώσεων είναι το ίδιο σε μεγάλο βαθμό και ότι όλες οι ορατές διαφορές οφείλονται σε τεχνικές δυσκολίες, όπως η φαινομενική ή πραγματική συγχώνευση γειτονικών ζωνών (Beermann, 1950, 1952, 1961, 1972). Μελέτες οι οποίες σχετίζονται με τα πρότυπα των ζωνώσεων σε διάφορα είδη και όργανα υποστηρίζουν την άποψη ότι οι πιο σημαντικές ζώνες εμφανίζονται σταθερές. Ωστόσο, όπως προαναφέρθηκε, έχουν 33

34 εντοπιστεί διακυμάνσεις στο πρότυπο ζωνώσεων και υπάρχουν ενδείξεις ότι οι διαφορές αυτές αντιστοιχούν στην σύντηξη γειτονικών ζωνών και στην επιμήκυνση των ενδιάμεσων περιοχών τους (Beermann, 1962). Μερικές μελέτες έχουν καταγράψει σημαντικές διαφορές στα πρότυπα ζωνώσεων των πολυταινικών χρωμοσωμάτων ανάμεσα σε κύτταρα οργάνων που λειτουργούν φυσιολογικά. Επίσης, μια σύγκριση μεταξύ των προτύπων ζωνώσεων των πολυταινικών χρωμοσωμάτων που προέρχονται από τριχογόνα κύτταρα και αυτών που απομονώθηκαν από κύτταρα των ωοθηκών δεν έδειξε σαφή ομολογία μεταξύ των δύο προτύπων, παρά τη σταθερότητα που εμφανίζουν εντός κάθε ιστού (Ribbert, 1979). Το φαινόμενο των εποχιακών αλλαγών στο μήκος των πολυταινικών χρωμοσωμάτων που περιγράφηκε από τον Ilyinskaya το για ορισμένα είδη του γένους Chironomus είναι ένα άλλο καλό παράδειγμα της μεταβολής των προτύπων των ζωνώσεων στα πολυταινικά χρωμοσώματα (Ilyinskaya, 1977, 1980). Πριν από την περίοδο κρύου, τα χρωμοσώματα γίνονται πολύ μικρότερα, ο αριθμός των puffs είναι ελάχιστος και πολλές από τις εύκολα αναγνωρίσιμες γειτονικές ζώνες συγχωνεύονται για να σχηματίσουν συστάδες χρωματίνης. Τα χρωμοσώματα αρχίζουν να επιμηκύνονται κατά τους μήνες Ιανουάριο με Φεβρουάριο, ενώ εντοπίζονται και 3 με 4 φορές περισσότερες ζώνες τον Μάρτιο από ότι τον Σεπτέμβριο. Αυτές οι μεταβολές δείχνουν ότι το πρότυπο ζωνώσεων στα κύτταρα των οργάνων που λειτουργούν φυσιολογικά είναι σχετικά σταθερό, αλλά ότι η δομή τους είναι εύκαμπτη και η γενική μορφή των ζωνών είναι εξαιρετικά μεταβλητή, όταν οι ενδοκυττάριες ή οι εξωκυττάριες συνθήκες μεταβάλλονται (Zhimulev and Koryakov, 2009) Σύναψη ομόλογων χρωμοσωμάτων Η σωματική σύναψη πραγματοποιείται όταν δύο ομόλογα χρωμοσώματα ενώνονται. Πιο συγκεκριμένα η σύναψη των χρωμοσωμάτων ζώνη προς ζώνη με μεγάλη ακρίβεια, δίνει την εντύπωση ότι σχηματίζεται ένα μόνο χρωμόσωμα. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα, ο αριθμός των πολυταινικών χρωμοσωμάτων σε διάφορα έντομα όπως στη Drosophila και στο Chironomus να μειώνεται σε απλοειδή στον πυρήνα των κυττάρων τους (Zhimulev and Koryakov, 2009). Η σωματική σύναψη δεν παρατηρείται πάντα στα πολυταινικά χρωμοσώματα όλων των ειδών. Για παράδειγμα, τα ομόλογα χρωμοσώματα των δίπτερων εντόμων συνήθως συνάπτονται σε διαφορετικό βαθμό στα διάφορα έντομα, αλλά στα φυτά ή στα έντομα που ανήκουν στα Collembola σε φυσιολογικές συνθήκες δεν παρατηρείται σύναψη. Όμως, δεν 34

35 υπάρχουν ξεκάθαρα αποτελέσματα σχετικά με το φαινόμενο της σύναψης στα θηλαστικά και στα Protista, επειδή τα έως σήμερα δεδομένα είναι αντικρουόμενα. Επιπλέον, η σύναψη μπορεί να είναι ημιτελής, για παράδειγμα στα είδη της οικογένειας Simuliidae τα ομόλογα χρωμοσώματα βρίσκονται φυσιολογικά σε επαφή το ένα με το άλλο, αλλά αυτή η επαφή διασπάται σε μερικές περιοχές και τα ομόλογα χρωμοσώματα διαχωρίζονται μεταξύ τους σε μερικά σημεία (Zhimulev and Koryakov, 2009). Αξίζει να σημειωθεί ότι η συχνότητα των πυρήνων των σιελογόνων αδένων στους οποίους παρατηρούνται ασυνάψεις σε οποιοδήποτε από τα πολυταινικά τους χρωμοσώματα κατά τη διάρκεια της φυσιολογικής ανάπτυξης του εντόμου D. melanogaster, κυμαίνεται μεταξύ 6,5% με 45% σύμφωνα με τις διάφορες μελέτες που έχουν πραγματοποιηθεί. Ιδιαίτερου ενδιαφέροντος θεωρούνται οι ανακαλύψεις των Balbiani το 1881 και Bauer το 1945 σύμφωνα με τις οποίες παρατηρήθηκε ειδικές ασυνάψεις μόνο στο ένα χρωμόσωμα από το σύνολο των πολυταινικών χρωμοσωμάτων στον πυρήνα των κυττάρων του είδους C. plumosus, και πιο συγκεκριμένα στο τέταρτο χρωμόσωμα. Όπως, ανακαλύφθηκε στη συνέχεια, η σύναψη διαταράσσεται σε διαφορετικό βαθμό στο τέταρτο χρωμόσωμα των στενά συγγενικών μελών της ομάδας των ειδών plumosus (Zhimulev and Koryakov, 2009). Συνήθως, το φαινόμενο της ασύναψης παρατηρείται στα πολυταινικά χρωμοσώματα των υβριδίων που προέρχονται από τις διασταυρώσεις διαφορετικών ειδών. Παρ όλα αυτά έχει παρατηρηθεί ότι σε κάποια υβρίδια η ένωση των χρωμοσωμάτων είναι όμοια με αυτή των ατόμων από τα οποία προήλθαν. Ο βαθμός της ασύναψης των πολυταινικών χρωμοσωμάτων μπορεί να επηρεαστεί από διάφορους παράγοντες όπως η θερμοκρασία ή η ποσότητα ετεροχρωματίνης του χρωμοσώματος Υ (Zhimulev and Koryakov, 2009) Μοριακή οργάνωση των ζωνών Μοριακές και γενετικές αναλύσεις δείχνουν ότι υπάρχουν ζώνες με πολλά γονίδια, όπως για παράδειγμα ένα σύνολο πανομοιότυπων αλληλουχιών που καταλαμβάνουν μήκος 385 bp στο γονιδίωμα της D. melanogaster και το σύνολο των γονιδίων του 5S ριβοσωμικού RNA (rrna) που καταλαμβάνουν μια ομάδα τεσσάρων ζωνών στο γονιδίωμα του ίδιου εντόμου. Επίσης, εκατοντάδες αντίγραφα των γονιδίων 18S, 5.8S και 28S rrna τα οποία βρίσκονται στον πυρηνίσκο, σε πολλά είδη διπτέρων σχηματίζουν μια απλή ζώνη. Ακόμη, οι ζώνες που περιέχουν επαναλαμβανόμενα γονίδια ιστόνης εμφανίζονται με παρόμοιο τρόπο. Αντίθετα, οι «τεχνητές ζώνες», δηλαδή εκείνες που 35

36 εμφανίζονται στις θέσεις όπου πραγματοποιούνται ενθέσεις μεταθετών στοιχείων στα πολυταινικά χρωμοσώματα, είναι ακόμη πιο περίπλοκες. Γενικά, τα μεταθετά στοιχεία περιέχουν DNA από διαφορετικά είδη, όπως τα γονίδια σήμανσης που προέρχονται από το είδος D. melanogaster, τμήματα του είδους Escherichia coli, πλασμίδια και το γονίδιο β- gal (Zhimulev and Koryakov, 2009). Όπως παρατηρήθηκε σε μελέτες στις οποίες έγινε χρήση ηλεκτρονικού μικροσκοπίου, όλα αυτά τα θραύσματα ενώνονται σε μία ενιαία ζώνη (Semeshin et al., 1986). Στις περιοχές του πολυταινικού χρωμοσώματος που βρίσκονται μεταξύ δύο ζωνών η χρωματίνη εμφανίζεται πιο αποσυμπυκνωμένη από αυτή που βρίσκεται στην περιοχή της ζώνης. Γι αυτό, όταν τα χρωμοσώματα που έχουν βαφτεί και παρατηρούνται στο φως σε μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης ή ηλεκτρονικό μικροσκόπιο τα ενδιάμεσα αυτά τμήματα φαίνονται πιο ανοιχτόχρωμα από τις ζώνες. Ο ακριβής προσδιορισμός των ενδιάμεσων αυτών τμημάτων στα πολυταινικά χρωμοσώματα είναι δύσκολος εξαιτίας του μικρού μεγέθους τους. Σύμφωνα με τα στοιχεία που λαμβάνονται από πολλά είδη διπτέρων, το μέγεθος των ενδιάμεσων τμημάτων μεταξύ των ζωνών κυμαίνεται μεταξύ 0,05 και 0,38 μm, πιο συχνά είναι 0,1-0,2 μm, ενώ το μοριακό μέγεθος τους είναι bp (Zhimulev and Koryakov, 2009). Με τη χρήση πολλών αντισωμάτων έχει παρατηρηθεί ότι πολλές πρωτεΐνες μη ιστόνες, όπως η RNA πολυμεράση II, εντοπίζονται ειδικά σε αυτές τις ενδιάμεσες περιοχές. Η κλωνοποίηση και η αλληλούχιση του DNA των διαφόρων περιοχών του χρωμοσώματος που εντοπίζονται ανάμεσα σε δύο ζώνες από τον Demakov και τους συνεργάτες του έχουν δείξει ότι οι περιοχές αυτές: 1) είναι μοναδικές, 2) αποτελούνται από μεγάλο αριθμό πουρίνων, πουριμιδίνων, 3) είναι πλούσιες σε ακολουθίες Α-Τ (>80%) και 4) ότι περιέχουν αρκετά σύντομα ανοικτά πλαίσια ανάγνωσης (5550 bp) (Demakov et al., 1993). Όσον αφορά τη γενετική οργάνωσή των ενδιάμεσων αυτών τμημάτων αξίζει να αναφερθεί ότι θα μπορούσαν πιθανώς να διαιρεθούν σε δύο κατηγορίες. Τα ενδιάμεσα τμήματα πρώτου τύπου (Ι) που αντιστοιχούν στις ρυθμιστικές περιοχές γονιδίων τα οποία είναι ανενεργά στους σιελογόνους αδένες και στα ενδιάμεσα τμήματα δεύτερου τύπου (ΙΙ) που αντιστοιχούν σε συνεχώς ενεργά γονίδια σε αυτόν τον ιστό (Demakov et al., 2004). Γενικά, έχουν διατυπωθεί απόψεις που υποστηρίζουν ότι τα υπεύθυνα για το βασικό μεταβολισμό γονίδια (housekeeping genes) είναι αυτά που εδράζονται στις ενδιάμεσες ζώνες. Αντίθετα, στις ζώνες, και ειδικότερα στις θέσεις των βρόχων (puffs), εδράζονται γονίδια που εξυπηρετούν συγκεκριμένες αναπτυξιακές λειτουργίες (για ανασκόπηση Zhimulev et al., 2004). 36

37 1.6.7 Puffs Ο Painter το 1935 περιέγραψε μια σειρά σχετικά άχρωμων και διογκωμένων περιοχών ως βασικά χαρακτηριστικά του τρίτου χρωμοσώματος της D. melanogaster, ενώ ο Bridges το 1935 αποκάλεσε μερικές από αυτές τις διογκωμένες περιοχές με τον όρο «puffs» (εικόνα 14). Αλλά είδη βρόγχων (puffs) ήταν γνωστά από καιρό, όπως ο μεγαλύτερος βρόγχος (puff) που ανιχνεύθηκε από τον Balbiani (1881) στο είδος C. plumosus ως πάχυνση των περιοχών των χρωμοσωμάτων, η οποία ονομάστηκε με τον όρο Balbiani rings από τους Erhard (1910) και Alverdes (1912). Εικόνα 14: Βρόγχοι (puffs) σε πολυταινικά χρωμοσώματα του είδους C. fasciventris. Οι λεπτομερείς μελέτες των Beermann, Pavan και Breuer, και Mechelke στις αρχές του 1950 πρότειναν ότι οι βρόγχοι (puffs) και οι δακτύλιοι Balbiani (Balbiani rings) είναι περιοχές του χρωμοσώματος στις οποίες τα γονίδια βρίσκονται σε ενεργή κατάσταση (Beermann, 1952, Pavan and Breuer, 1952, Mechelke, 1953). Το σύνολο των puffs και των Balbiani rings είναι αυστηρά ειδικό για κάθε ιστό σε ένα δεδομένο στάδιο της ανάπτυξης του. Σε πολλές έρευνες έχει παρατηρηθεί ότι αυτοί οι βρόγχοι (puffs) αποτελούν τόπους με πολύ έντονη μεταγραφική δραστηριότητα (Zhimulev and Koryakov, 2009). Το 1961 ο Beermann παρατήρησε μια συσχέτιση μεταξύ της εμφάνισης μιας συγκεκριμένης έκκρισης σε ένα συγκεκριμένο λοβό των σιελογόνων αδένων του είδους C. pallidivittatus και της δραστηριότητας ενός επιπλέον δακτυλίου Balbiani στα κύτταρα του λοβού. Έτσι, παρατηρήθηκε για πρώτη φορά μια σχέση μεταξύ της δραστηριότητας ενός βρόγχου (puff) και ενός από τα προϊόντα του κυττάρου. Στη συνέχεια, πολλοί συγγραφείς απέδειξαν ότι τα Balbiani rings του κύριου λοβού κωδικοποιούν πρωτεΐνες που σχετίζονται με την έκκριση στους σιελογόνους αδένες. Στη Drosophila, η σχέση μεταξύ της λειτουργίας των διαφόρων βρόγχων (puffs) και της έκκρισης των σιελογόνων αδένων έχει αποδειχθεί χρησιμοποιώντας κυτταρογενετικές μεθόδους (Zhimulev and Koryakov, 2009). 37

38 Μελέτες οι οποίες πραγματοποιήθηκαν από τους Clever και Karlson (1960) στο Chironomus και του Becker (1962) στη Drosophila έχουν αποδείξει ότι η δραστηριότητα πολλών βρόγχων (puffs) που προκύπτουν στο τελικό προνυμφικό στάδιο ανάπτυξης επάγονται από την εκδυσόνη, η οποία ελέγχει τη μεταμόρφωση στα έντομα. Ακόμη, οι Ashburner και Richards απέδειξαν την ύπαρξη πολλών συνεχόμενων αλληλένδετων βρόγχων (puffs) που προκαλούνται από την ορμόνη κατά τη διάρκεια της προνύμφης και στις περιόδους πριν τη δημιουργία της νύμφης (pupa). Όταν έγινε αντιληπτό ότι αυτές οι διογκώσεις «puffs» είναι μορφολογικές εκδηλώσεις της γονιδιακής δραστηριότητας, πραγματοποιήθηκαν πολυάριθμα πειράματα με σκοπό την τροποποίηση των διαφόρων δραστηριοτήτων τους με διάφορους παράγοντες και χημικά συστατικά. Για παράδειγμα ο Ritossa (1962) εκθέτοντας τις προνύμφες των Drosophila busckii σε υψηλή θερμοκρασία, παρατήρησε την επαγωγή πολλών νέων βρόγχων (puffs), οι οποίοι προέκυψαν επίσης ως απόκριση σε θεραπεία των σιελογόνων αδένων με δηλητήρια που μπλοκάρουν την οξειδωτική φωσφορυλίωση. Τα δεδομένα αυτά οδήγησαν σε μια νέα ανακάλυψη ότι το κυτταρικό-φυσιολογικό σύστημα μπορεί να ανταποκρίνεται σε διάφορους τύπους στρες σε κυτταρικό επίπεδο - το λεγόμενο σύνδρομο του θερμικού σοκ (Heat Shock Syndrome) (Zhimulev and Koryakov, 2009). Στα είδη των Sciarids, ορισμένοι βρόγχοι (puffs) εμπλέκονται στην ενίσχυση του DNA (Breuer and Pavan, 1954). Θεωρείται άξιο αναφοράς το γεγονός ότι τα «RNA puffs» εξαιτίας της μείωση της συγκέντρωσης του DNA σε αυτά εμφανίζονται συνήθως πιο ανοιχτόχρωμα στο μικροσκόπιο, ενώ αντίθετα τα «DNA puffs» παραμένουν πιο σκουρόχρωμα έπειτα από το χρωματισμό των πολυταινικών χρωμοσωμάτων λόγω της συσσώρευσης μεγαλύτερης ποσότητας DNA σε αυτά. Τέτοια «DNA puffs» προκύπτουν μόνο σε πολυταινικά χρωμοσώματα των σιελογόνων αδένων στα τελευταία στάδια ανάπτυξης των προνυμφών και εμπλέκονται στην κωδικοποίηση πρωτεϊνών έκκρισης των σιελογόνων αδένων. Εκτός από την ενίσχυση του DNA, οι βρόγχοι (puffs) αυτοί εμφανίζουν έντονη δραστηριότητα και κατά τη μεταγραφή όπως αναφέρθηκε και παραπάνω (Zhimulev and Koryakov, 2009). Καθώς η δημιουργία και η θέση των puffs είναι εξειδικευμένη για τον ιστό και το αναπτυξιακό στάδιο, η μελέτη του βροχικού προτύπου μπορεί να δώσει σημαντικές πληροφορίες για την ενεργοποίηση και απενεργοποίηση γονιδίων κατά την ανάπτυξη και επομένως και για τη λειτουργία των γονιδίων αυτών. 38

39 1.6.8 Χρωμοσωμικές αναστροφές Χρωμοσωμικές αναστροφές έχουν περιγραφεί σε μια μεγάλη ποικιλία ειδών, συμπεριλαμβανομένων των θηλαστικών, όμως οι περισσότερες είναι γνωστές από τα δίπτερα όπως οι μύγες των φρούτων και τα κουνούπια. Σε πολλές ομάδες ζώων και φυτών οι χρωμοσωμικές αναστροφές έχουν εντοπιστεί ως διατηρημένες διαφορές μεταξύ των ειδών και ως πολυμορφισμοί μέσα στα είδη (Zacharopoulou et al., 2011). Αυτές οι διαφορές έχουν εγείρει το ενδιαφέρον για το πώς συμβάλλουν οι χρωμοσωμικές ανακατατάξεις στην ειδογένεση (Krimbas and Powell, 1992, Coyne and Orr, 2004, Hoffman and Rieseberg, 2008). Στα πολυταινικά χρωμοσώματα των διπτέρων έχουν εντοπιστεί πολλές διαφορετικές ανακατατάξεις τμημάτων, τα οποία εντοπίζονται σε νέες θέσεις με τον ίδιο ή αντίθετο προσανατολισμό. Η συμβολή αυτών των ανακατατάξεων στην ειδογένεση σχετίζεται κυρίως με στις παρατηρήσεις ότι πολλές αναδιατάξεις έχουν επίδραση στη γονιμότητα των ειδών, ότι εμφανίζονται πολλά προσυζευτικά ή οικολογικά εμπόδια, ότι οι χρωμοσωμικές διαφορές μπορούν να αποτελέσουν εμπόδια στη ροή της γενετικής πληροφορίας. Σήμερα, τα υπάρχοντα δεδομένα δηλώνουν ότι οι αναστροφές μπορούν να συμβάλουν στη διαφοροποίηση των ειδών μέσω της διατήρησης του συνδυασμού των αλληλομόρφων δρώντας ως καταστολείς του ανασυνδυασμού. Αυτός ο μηχανισμός μπορεί να διευκολύνει την απόκλιση μεταξύ των πληθυσμών και τελικά να οδηγήσει σε διαφοροποίηση των ειδών (Noor et al., 2001, 2007, Machado et al., 2002, Feder et al., 2003, Ayala and Coluzzi, 2005, Machado et al. 2007, Kulathinal et al., 2008, Costantini et al., 2009). Επιπλέον, η διευκρίνιση των αιτιών που οδηγούν σε αυτές τις χρωμοσωμικές αναστροφές σε άγριους πληθυσμούς θα συμβάλει στην καλύτερη κατανόηση του ρόλου τους σε διαδικασίες ειδογένεσης (Runcie and Noor, 2009). Μελέτες οι οποίες έχουν διεξαχθεί έως σήμερα υποστηρίζουν ότι τα μεταθετά στοιχεία πιθανότατα συνδέονται με τη δημιουργία των χρωμοσωμικών αναδιατάξεων (Lyttle and Haymer, 1992, Ca'ceres et al., 1999, 2001, Mathiopoulos et al., 1999, Evgen'ev et al., 2000, Richards et al., 2005). Γενικά, τα μεταθετά στοιχεία μπορεί να θεωρηθεί ότι διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην εξέλιξη του γονιδιώματος δεδομένου ότι μπορούν να επάγουν μια μεγάλη ποικιλία γενετικών αλλαγών, οδηγώντας έτσι σε πολυμορφία (Zacharopoulou et al., 2011) Χρήση των πολυταινικών χρωμοσωμάτων στη γενετική ανάλυση Ένα από τα σημαντικότερα εργαλεία της κυτταρογενετικής μελέτης θεωρούνται τα πολυταινικά χρωμοσώματα, καθώς χρησιμοποιούνται για την ανάλυση της γενετικής 39

40 οργάνωσης των χρωμοσωμάτων αλλά και του συνολικού γονιδιώματος (Zhimulev et al., 2004). Γενικά, τα πολυταινικά χρωμοσώματα έχουν χρησιμοποιηθεί σε πολλές μελέτες οι οποίες ασχολούνται με τη διερεύνηση των εξελικτικών μηχανισμών και με την ειδογένεση. Πιο συγκεκριμένα, τα πολυταινικά χρωμοσώματα έχουν χρησιμοποιηθεί σε μελέτες που σχετίζονται με τη διάκριση των φυλογενετικών σχέσεων ανάμεσα στα είδη (Carson and Yoon 1982, Lacovaara and Saura 1982, Lemeunier et al., 1986), σαν εργαλεία για να επιτευχθεί διάκριση των ειδών μέσα σε συμπλέγματα ειδών (Coluzzi et al., 1979) αλλά και σε μελέτες χαρτογράφησης γονιδιωμάτων (Adams et al., 2000, Holt et al., 2002). Επιπλέον, τα πολυταινικά χρωμοσώματα του είδους C. capitata, το οποίο αποτελεί οργανισμό μοντέλο για τα έντομα οικονομικής σημασίας, έχουν συμβάλει σημαντικά στη βελτίωση της τεχνικής στείρωσης των εντόμων (SIT), στόχος της οποίας είναι η δημιουργία στείρων αρσενικών ατόμων (Robinson et al., 1999, Gariou-Papalexiou et al., 2002, Franz 2005, Zacharopoulou et al., 2011). Όπως αποδείχθηκε από τους Patterson (1932) και Mackensen (1934), μικρές διαγραφές μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την ακριβή χαρτογράφηση γονιδίων. Με τη χρήση αυτής της μεθόδου στη δεκαετία του 1930 χαρτογραφήθηκαν τα πρώτα γονίδια στα πολυταινικά χρωμοσώματα του είδους D. melanogaster με ιδιαίτερα μεγάλη ακρίβεια σε διάφορες ζώνες ή ακόμα και τμήματα ζωνών. Σήμερα, πολλές εκατοντάδες γονίδια είναι χαρτογραφημένα με ακρίβεια πάνω σε χάρτες πολυταινικών χρωμοσωμάτων. Αυτή η κυτταρογενετική μέθοδος της γονιδιακής χαρτογράφησης συμπληρώνεται τώρα με τη μέθοδο της in situ υβριδοποίησης, η οποία επιτρέπει την αντιστοίχιση των γονιδίων σε συγκεκριμένες θέσεις πάνω στα χρωμοσώματα (Zhimulev and Koryakov, 2009). Ακόμη, η χρήση των πολυταινικών χρωμοσωμάτων της Drosophila αποδείχθηκε ιδιαίτερα κρίσιμη για την ταχεία ανάπτυξη των μεθόδων κλωνοποίησης και την ανάλυση της δομής και της έκφραση των γονιδίων. Επιπλέον, οι ετερόζυγες αναστροφές μπορούν να διακριθούν ξεκάθαρα στα πολυταινικά χρωμοσώματα και αυτό θεωρείται ιδιαίτερα σημαντικό για την γενετική ανάλυση των πληθυσμών (Zhimulev and Koryakov, 2009). Μέχρι σήμερα έχουν χρησιμοποιηθεί σε πολλές κυτταρογενετικές μελέτες στα δίπτερα έντομα και ιδιαίτερα σε αυτά της οικογένειας Tephritidae. 1.7 Μιτοχονδριακό γονιδίωμα Δομή των μιτοχονδρίων 40

41 Τα μιτοχόνδρια αποτελούν ευδιάκριτα οργανίδια, τα οποία εντοπίζονται στο κυτταρόπλασμα των ευκαρυωτικών κυττάρων, ενώ απουσιάζουν από τα προκαρυωτικά κύτταρα. Θεωρούνται ως τα κύρια οργανίδια παραγωγής ενέργειας καθώς είναι υπεύθυνα για την αερόβια κυτταρική αναπνοή (Brdiczka et al., 1994). Στην εσωτερική τους μεμβράνη φέρουν κάποια ενζυμικά σύμπλοκα, τα οποία ευθύνονται για την μεταφορά των ηλεκτρονίων στον τελικό αποδέκτη, το οξυγόνο, παρέχοντας μεγάλα ποσά τριφωσφορικής αδενοσίνης (ΑΤΡ) στο κύτταρο. Το μιτοχόνδριο αποτελείται από δύο μεμβράνες διαφορετικής βιοχημικής σύστασης, όπου η εσωτερική σχηματίζει πολλές αναδιπλώσεις, τις πτυχές (εικόνα 14). Η εξωτερική μεμβράνη περιέχει πολλά μόρια πορίνης, η οποία αποτελεί μια πρωτεΐνη μεταφοράς και σχηματίζουν διαύλους διαμέσου της διπλοστιβάδας των λιπιδίων. Αντιθέτως, η εσωτερική μεμβράνη είναι αδιαπέραστη από ιόντα αλλά και από τα περισσότερα μικρά μόρια σε όλη την έκταση της. Εξαίρεση αποτελούν οι θέσεις που φέρουν τις πρωτεΐνες μεταφοράς ηλεκτρονίων (Berg et al., 2009). Η προέλευση των μιτοχονδρίων κατά την εξέλιξη των ευκαρυωτικών κυττάρων εξηγείται από την ενδοσυμβιωτική θεωρία. Σύμφωνα με αυτήν ένα αρχικό προκαρυωτικό κύτταρο έχασε το κυτταρικό του τοίχωμα, γεγονός που του επέτρεψε την πρόσληψη μεγάλων τεμαχίων τροφής από το περιβάλλον με αποτέλεσμα την αύξηση του μεγέθους του. Κατά την πορεία της εξέλιξης, το DNA διαμορφώθηκε καλύτερα σχηματίζοντας έναν αρχέγονο πυρήνα και μετατρέποντας το σε ένα πρωτοευκαρυωτικό κύτταρο. Στο εσωτερικό των αρχέγονων αυτών ευκαρυωτικών κυττάρων εγκλωβίστηκαν βακτήρια, τα οποία θεωρούνται πρόδρομοι των μιτοχονδρίων, και η συμβίωση εξελίχθηκε σε υποχρεωτική με τη μεταφορά μέρος του DNA των ενδοσυμβιωτών, δηλαδή των βακτηρίων, και των σχετικών λειτουργιών στον πυρήνα του ξενιστή, δηλαδή στο αρχέγονο κύτταρο. Παρ όλα αυτά, τα μιτοχόνδρια χαρακτηρίζονται ως ημιαυτόνομα οργανίδια διότι διαθέτουν γενετικό υλικό που τους επιτρέπει τη βιοσύνθεση μερικών πρωτεϊνών καθώς και τους δίνει τη δυνατότητα αυτοδιπλασιασμού. Ο τρόπος κληρονόμησης του μιτοχονδριακού DNA στα περισσότερα ζωικά είδη είναι αποκλειστικά μητρικής προέλευσης. Εξαίρεση αποτελούν το μύδι (Zouros et al., 1992) και το ποντίκι (Gyllensten et al., 1991). Η μητρική κληρονόμηση των μιτοχονδρίων οφείλεται στο γεγονός ότι, τα ωάρια είναι πλούσια σε μιτοχόνδρια στο κυτταρόπλασμα τους, σε αντίθεση με τα σπερματοζωάρια που διαθέτουν ελάχιστα στην κεφαλή τους, τα οποία αποικοδομούνται με την είσοδο τους στο ωάριο (Sutovsky et al., 1999). 41

42 1.7.2 Δομή του μιτοχονδριακού DNA Το μιτοχονδριακό DNA σε όλα τα είδη του ζωικού βασιλείου έχει εντοπιστεί ως ένα δίκλωνο κυκλικό μόριο DNA,το μήκος του οποίου μπορεί να κυμαίνεται μεταξύ 15 και 20 kb (εικόνα 15). Σε γενικές γραμμές, αποτελείται από γονίδια χωρίς ιντρόνια και μια μη κωδική περιοχή μήκους περίπου 1 kb, την περιοχή ελέγχου όπως ονομάζεται (Displacement loop: D-loop), πλούσια σε βάσεις αδενίνη (Α) και θυμίνη (Τ), η οποία περιλαμβάνει έναν αριθμό παραγόντων που ρυθμίζουν την αντιγραφή και τη μεταγραφή του μιτοχονδριακού γονιδιώματος (Vittas et al., 2011). Επιπλέον, στα περισσότερα κυκλικά μιτοχονδριακά DNA ζώων που έχουν μελετηθεί έως τώρα έχουν εντοπιστεί 22 γονίδια τα οποία κωδικοποιούν trnas, 2 γονίδια που κωδικοποιούν rrnas και 13 γονίδια που κωδικοποιούν υπομονάδες ενζύμων τα οποία εμπλέκονται στη διαδικασία της οξειδωτικής φωσφορυλίωσης (εικόνα 16) (Spanos et al., 2000). Παρόμοια ήταν τα ευρήματα και στην ανάλυση του μιτοχονδριακού γονιδιώματος του είδους C. capitata (Spanos et al., 2000), το οποίο χρησιμοποιήθηκε ως αλληλουχία αναφοράς στην παρούσα εργασία για την ανάλυση του μιτοχονδριακού DNA του είδους C. fasciventris.το είδος αυτό θα είναι και το πρώτο είδος του συμπλέγματος FAR στο οποίο θα πραγματοποιηθεί τέτοιου είδους ανάλυση. Εικόνα 15: Το μιτοχονδριακό DNA είναι ένα δίκλωνο κυκλικό μόριο που εντοπίζεται στη μήτρα του μιτοχονδρίου των κυττάρων ( 42

43 Εικόνα 16: Γενική δομή μιτοχονδριακού DNA στα είδη του ζωικού Βασιλείου ( Το μιτοχονδριακό DNA ως μοριακό εργαλείο Το μιτοχονδριακό DNA (mtdna) έχει αποδειχθεί ένα πολύ χρήσιμο εργαλείο στα χέρια των ερευνητών σε πληθυσμιακές, φυλογενετικές και εξελικτικές μελέτες που αφορούν πολλά διαφορετικά είδη οργανισμών. Αυτό οφείλεται κυρίως: στο μικρό μέγεθος του στο μητρικό τρόπο κληρονόμησης, στο μεγάλο αριθμό αντιγράφων που μπορεί να έχει στην έλλειψη ανασυνδυασμών στη μεγάλη συχνότητα εμφάνισης πολυμορφισμών (Nikolaidis and Scouras, 1996, Spanos et al., 2000, Drosopoulou et al., 2012b). Η ιδιαίτερα διαδεδομένη χρήση του μιτοχονδριακού DNA σε μοριακές μελέτες παγκοσμίως φαίνεται από το γεγονός ότι μέχρι το 2000 καταγράφηκαν περίπου είσοδοι στις βάσεις δεδομένων του EMBL οι οποίες αφορούσαν αλληλουχίες μιτοχονδριακού DNA (mtdna). Αξίζει να αναφερθεί, ότι από αυτές οι είσοδοι αναφέρονταν σε μιτοχονδριακές αλληλουχίες διαφόρων εντόμων, καθώς έως τότε υπήρχαν 43

44 καταγεγραμμένες ελάχιστες αλληλουχίες ολόκληρων γονιδιωμάτων εντόμων, όπως των D. melanogaster (Clary et al., 1982), D. yakuba (Clary and Wolstenholme, 1985), Anopheles gambiae (Beard et al., 1994), Anopheles quadrimaculatus (Mitchell et al., 1993), Locusta migratoria (Flook et al., 1995), Apis melifera (Crozier and Crozier, 1993), C. capitata (Spanos et al., 2000). Πιο συγκεκριμένα στα έντομα, το μιτοχονδριακό DNA αποδείχθηκε ιδιαίτερα χρήσιμο τόσο σε γενετικές όσο και σε πληθυσμιακές μελέτες, καθώς έχουν χρησιμοποιηθεί σε παγκόσμιο επίπεδο γενετικοί δείκτες οι οποίοι βασίζονται σε αυτό (Kourti, 1992, Sheppard et al., 1992, McPheron et al., 1994). Για παράδειγμα, όταν εντοπίστηκαν έντομα του είδους C. capitata στις ΗΠΑ, χρησιμοποιήθηκαν ως μοριακοί δείκτες οι πολυμορφισμοί RFLPs (Restriction Fragment Length Polymorphisms) έτσι ώστε να ταυτοποιηθεί από ποιο πληθυσμό και από ποια περιοχή προήλθαν (Spanos et al., 2000). Όσον αφορά τα είδη της οικογένειας Tephritidae, δύο από τις περιοχές στην αλληλουχία του μιτοχονδριακού τους γονιδιώματος οι οποίες έχουν χρησιμοποιηθεί σε αρκετές μελέτες με σκοπό την επίλυση των φυλογενετικών σχέσεων ανάμεσα σε αυτά τα μεγάλης οικονομικής σημασίας γεωργικά παράσιτα, είναι το γονίδιο που κωδικοποιεί τη υπομονάδα ΙΙ της οξειδάσης του κυτοχρώματος και ένα τμήμα της αλληλουχίας που κωδικοποιεί τη μεγάλη υπομονάδα του ριβοσώματος (Han and McPheron, 1997, Smith and Bush, 1997, Spanos et al., 2000). Γενικά, η ανάλυση του μιτοχονδριακού γονιδιώματος των εντόμων της συγκεκριμένης οικογένειας έχει ως στόχο τη δημιουργία ενός γρήγορου και αξιόπιστου μοριακού εργαλείου, το οποίο θα μπορεί να χρησιμοποιηθεί στη διάκριση των ατόμων που προέρχονται από τους άγριους πληθυσμούς από εκείνα που απελευθερώθηκαν στα πλαίσια της τεχνικής SIT (Spanos et al., 2000). Επιπλέον, μέσο αυτού θα είναι δυνατόν να εντοπιστεί ο πληθυσμός από τον οποίων προήλθαν τα έντομα που εγκαθίστανται σε νέες περιοχές, στις οποίες δεν υπήρχαν παλαιότερα. 44

45 Σκοπός της εργασίας Το δίπτερο έντομο C. fasciventris ανήκει στην οικογένεια Tephritidae και πιο συγκεκριμένα στο σύμπλεγμα FAR μαζί με άλλα δύο είδη, το C. rosa και C. anonae. Τα είδη αυτού του συμπλέγματος εντοπίζονται στην Αφρική και είναι ιδιαίτερα δυσδιάκριτα μεταξύ τους. Επιπλέον, αποτελούν έντομα μεγάλης οικονομικής σημασίας, καθώς προκαλούν ποιοτική και ποσοτική υποβάθμιση της παραγωγής πολλών εμπορεύσιμων φρούτων. Παρά τις προσπάθειες ανεύρεσης μεθόδων βιολογικού ελέγχου, η καταπολέμησή τους περιορίζεται στη χρήση χημικών εντομοκτόνων. Η ανάπτυξη μεθόδων καταπολέμησης φιλικότερων προς το περιβάλλον προϋποθέτει τη βαθιά γνώση της γενετικής και της βιολογίας των εντόμων αυτών. Η μελέτη των χρωμοσωμάτων των διαφόρων οργανισμών είναι πρωταρχικής σημασίας για την κατανόηση της δομής και της λειτουργίας του γονιδιώματος τους. Στην οικογένεια Tephritidae των εντόμων η χρήση των πολυταινικών χρωμοσωμάτων και η δημιουργία χαρτών αποτελούν ένα ισχυρό εργαλείο στα χέρια των ερευνητών. Επιπλέον, ο in situ υβριδισμός αποτελεί μια ιδιαίτερα σημαντική μέθοδο που επιτρέπει τη σύνδεση της γενετικής και της μοριακής πληροφορίας. Η μέθοδος αυτή, προσδιορίζοντας την ακριβή θέση απομονωμένων ακολουθιών νουκλεϊκών οξέων στο γονιδίωμα, αποκαλύπτει ομολογίες χρωμοσωμάτων ή τμημάτων τους ανάμεσα σε διαφορετικά είδη και συμβάλει στην αποσαφήνιση των φυλογενετικών σχέσεων μεταξύ διαφορετικών ειδών. Ακόμη, η απουσία σαφών διαγνωστικών μορφολογικών χαρακτηριστικών ώστε να επιτευχθεί η οριοθέτηση των ειδών σε συμπλέγματα ειδών, τονίζει την ανάγκη για τη χρήση μοριακών εργαλείων. Το μιτοχονδριακό DNA αποτελεί ένα τέτοιου είδους πολύτιμο εργαλείο διότι αποδείχθηκε ιδιαίτερα χρήσιμο τόσο σε γενετικές όσο και σε πληθυσμιακές μελέτες. Γενικά, σε πλήθος μελετών που έχουν διεξαχθεί παγκοσμίως έχουν χρησιμοποιηθεί πολλοί γενετικοί δείκτες οι οποίοι βασίζονται σε αυτό. Στην παρούσα διπλωματική εργασία χρησιμοποιήθηκε ένα από τα τρία είδη του γένους Ceratitis που αποτελούν το σύμπλεγμα FAR, το C. fasciventris, με σκοπό την πλήρη κυτταρογενετική και μοριακή ανάλυση, η οποία περιλαμβάνει: Ανάλυση μιτωτικού καρυοτύπου Ανάλυση πολυταινικών χρωμοσωμάτων και κατασκευή χαρτών Εντοπισμός ειδικών γονιδίων στα πολυταινικά χρωμοσώματα μέσω in situ υβριδισμού 45

46 Σύγκριση κυτταρογενετικών αποτελεσμάτων του είδους Ceratitis fasciventris με τους υπάρχοντες χάρτες πολυταινικών χρωμοσωμάτων του είδους Ceratitis capitata Ανάλυση μιτοχονδριακού γονιδιώματος 46

47 2. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 2.1 Πειραματικό υλικό C. fasciventris Στην παρούσα μελέτη η κυτταρογενετική και μοριακή ανάλυση του είδους C. fasciventris, πραγματοποιήθηκε σε άτομα μιας αποικίας της ανατολικής Αφρικής, τα οποία προέρχονται από το Εργαστήριο Ελέγχου Παρασιτικών Εντόμων του Seibersdorf. Ανάλογα με το σκοπό χρήσης του βιολογικού υλικού, χρησιμοποιήθηκαν προνύμφες, νύμφες ή ενήλικα άτομα του συγκεκριμένου είδους. 2.2 Παρασκευάσματα μεταφασικών χρωμοσωμάτων Σύμφωνα με τα πρωτόκολλα για κυτταρογενετική χαρτογράφηση του γονιδιώματος των αρθρόποδων που συμπεριλαμβάνονται στο βιβλίο Tephritid fruit flies (Mavragani- Tsipidou P. et al., 2015), σε όλα τα είδη εντόμων της οικογένειας Tephritidae για την κατασκευή των παρασκευασμάτων μεταφασικών χρωμοσωμάτων απομονώνονται τα εγκεφαλικά γάγγλια από προνύμφες τρίτου σταδίου ή από νεαρές νύμφες, ενώ τα υλικά που χρησιμοποιήθηκαν για τη δημιουργία τους παρατίθενται στον πίνακα 4. Πίνακας 4: Υλικά για τη δημιουργία παρασκευασμάτων μεταφασικών χρωμοσωμάτων Εξοπλισμός Χημικά Διαλύματα Θερμαινόμενη πλάκα Οξικό οξύ (CH 3 COOH) 60% οξικό οξύ Οπτικό μικροσκόπιο συνδεδεμένο με κάμερα Χλωροφόρμιο (CHCl 3 ) Carnoy s fixative (αιθανόλη : χλωροφόρμιο : οξικό Αντικειμενοφόροι πλάκες Καλυπτρίδες Στερεοσκόπιο Μικροβελόνες Parafilm Μαύρο χαρτί Αιθανόλη Ένυδρο χλωριούχο ασβέστιο (CaCl 2 *2H 2 O) Χλωριούχο κάλιο (KCl) Χλωριούχο νάτριο (ΝaCl) Ένυδρο φωσφορικό νάτριο (Na 2 HPO 4 *2H 2 O) Όξινο ανθρακικό νάτριο (NaHCO 3 ) οξύ, 6:3:1) Υποτονικό διάλυμα KCl (0,075 Μ σε νερό), φύλαξη στους 4 ο C Ringer (6,5 gr ΝaCl, 0,14 gr KCl, 0,2 gr NaHCO 3, 0,12 gr CaCl 2 *2H 2 O, 0,01 gr Na 2 HPO 4 *2 H 2 O, 1000 ml H 2 O) 47

48 Η τεχνική με ή χωρίς τη χρήση κολχικίνης σύμφωνα με την οποία επιτυγχάνεται το άπλωμα των χρωμοσωμάτων χρησιμοποιώντας θερμαινόμενη πλάκα, ανακαλύφθηκε για τη χαρτογράφηση των χρωμοσωμάτων στο στάδιο της παχυταινίας της μείωσης στα Lepidoptera (Traut, 1976) και στη συνέχεια υιοθετήθηκε για την παρασκευή μιτωτικών και μειωτικών παρασκευασμάτων χρωμοσωμάτων άλλων εντόμων και αρθρόποδων (Sahara et al,. 1999). Για την κατασκευή των μεταφασικών παρασκευασμάτων του είδους C. fasciventris χρησιμοποιήθηκαν νεαρές νύμφες (pupae) καθώς παρατηρήθηκε ότι δίνουν καλύτερης ποιότητας παρασκευάσματα από αυτά που προκύπτουν από τις προνύμφες του ίδιου είδους. i. Απομόνωση εγκεφαλικών γαγγλίων Αρχικά, κάθε νύμφη μεταφέρεται σε μια σταγόνα διαλύματος Ringer ή φυσιολογικού ορού πάνω σε μία αντικειμενοφόρο πλάκα και έπειτα πραγματοποιείται διαχωρισμός του εγκεφάλου και πιο συγκεκριμένα των εγκεφαλικών γαγγλίων από τους υπόλοιπους ιστούς με τη βοήθεια δύο λεπτών βελόνων. Αξίζει να σημειωθεί ότι η αντικειμενοφόρος πλάκα θα πρέπει να τοποθετείται πάνω σε μία σκουρόχρωμη επιφάνεια, ώστε να διευκολύνεται ο εντοπισμός και η απομόνωση του επιθυμητού ιστού (λευκή- ημιδιάφανης δομή). Σε περίπτωση που η σκουρόχρωμη επιφάνεια δεν παρέχεται από το στερεοσκόπιο, μπορεί να τοποθετηθεί κάτω από την αντικειμενοφόρο πλάκα κομμάτι μαύρου χαρτιού. Συνήθως, τα εγκεφαλικά γάγγλια είναι συνδεδεμένα με τα στοματικά εξαρτήματα και με τους σιελογόνους αδένες του εντόμου. Γι αυτό κρίνεται απαραίτητο να πραγματοποιηθεί καλός διαχωρισμός των εγκεφαλικών γαγγλίων από τους υπόλοιπους ιστούς με τη χρήση των μικροβελόνων. ii. Προετοιμασία εγκεφαλικών γαγγλίων σε υποτονικό διάλυμα Στη συνέχεια, τα γάγγλια μεταφέρονται σε υποτονικό διάλυμα KCl (0,075Μ) όπου και παραμένουν για χρονικό διάστημα λεπτών. Η σταγόνα υποτονικού διαλύματος KCl τοποθετείται σε νέα αντικειμενοφόρο πλάκα, η οποία συνήθως καλύπτεται με parafilm με σκοπό να περιοριστεί η ρευστότητα του υγρού και τοποθετείται σε σκουρόχρωμο φόντο ώστε να είναι ευδιάκριτα τα εγκεφαλικά γάγγλια. Το υποτονικό διάλυμα KCl έχει ως σκοπό τη διόγκωση και το άνοιγμα των χρωμοσωμάτων, ενώ ο ακριβής χρόνος στον οποίο θα παραμείνουν τα εγκεφαλικά γάγγλια κρίνεται ανάλογα με την ποιότητα τους έπειτα από συνεχή επανάληψη του πρωτοκόλλου. iii. Στερέωση μεταφασικών χρωμοσωμάτων 48

49 Έπειτα, τα εγκεφαλικά γάγγλια μεταφέρονται σε μια σταγόνα φρέσκου διαλύματος Carnoy s, το οποίο περιέχει αιθανόλη : χλωροφόρμιο : οξικό οξύ σε αναλογία 6:3:1. Γενικά, ο συνολικός χρόνος παραμονής των γαγγλίων στο διάλυμα Carnoy s είναι λεπτά στα είδη της οικογένειας Tephritidae. Για κάθε είδος υπάρχει ακριβής συνολικός χρόνος παραμονής, ώστε να επιτευχθεί η λήψη μεταφασικών χρωμοσωμάτων καλύτερης ποιότητας. Πιο συγκεκριμένα, για το είδος C. fasciventris ο συνολικός χρόνος παραμονής του στο διάλυμα Carnoy s είναι περίπου 20 λεπτά. Για να επιβεβαιωθεί η πλήρης αφαίρεση όλου του νερού από τα εγκεφαλικά γάγγλια, αυτά θα πρέπει να τοποθετηθούν τουλάχιστον τρεις φορές σε διάλυμα Carnoy s. Σε κάθε σταγόνα εκ των τριών τα γάγγλια παραμένουν για περίπου 7 λεπτά. Και σε αυτή την περίπτωση η αντικειμενοφόρος πλάκα καλύπτεται από parafilm και τοποθετείται σε σκουρόχρωμη επιφάνεια. iv. Διάλυση υλικού σε διάλυμα 60% οξικού οξέος. Πιο συγκεκριμένα, τα γάγγλια μεταφέρονται σε μια μικρή σταγόνα (περίπου 10 μl) διαλύματος 60% οξικού οξέος, η οποία τοποθετείται πάνω σε νέα αντικειμενοφόρο πλάκα και τα τεμαχίζονται με τη βοήθεια των βελόνων. Στη συνέχεια, ακολουθεί ανάδευση τους με μικροπιπέτα (2 20 μl). Έπειτα, μια επιπλέον σταγόνα 10 μl διαλύματος 60% οξικού οξέος τοποθετείται δίπλα στην ίδια αντικειμενοφό πλάκα η οποία και παραλαμβάνεται με την πιπέτα και προστίθεται στην πρώτη σταγόνα με απώτερο σκοπό την απομάκρυνση διαφόρων υπολειμμάτων ιστών που έχουν απομείνει στο tip. Η διάρκεια του συγκεκριμένου σταδίου δεν πρέπει να υπερβαίνει τα 2 λεπτά. v. Διάχυση μεταφασικών χρωμοσωμάτων στην αντικειμενοφόρο πλάκα Τέλος, η αντικειμενοφόρος πλάκα με το ομογενοποιημένο πλέον υλικό τοποθετείται σε θερμαινόμενη πλάκα στους 45 ο C με στόχο την ξήρανση του υλικού. Με τη βοήθεια μιας μικροπιπέτας πραγματοποιείται άπλωμα του υλικού με απαλές κινήσεις σε μια περιοχή έκτασης 20 x 20 mm έως να επιτευχθεί η πλήρης εξάτμιση του διαλύματος του οξικού οξέος και η διάχυση των χρωμοσωμάτων. Η θερμαινόμενη πλάκα προθερμαίνεται στην αρχή της διαδικασίας στους 45 ο C. Τα παρασκευάσματα μπορούν να χρησιμοποιηθούν απευθείας ή να αποθηκευτούν σε κατάλληλες θήκες παρασκευασμάτων σε θερμοκρασία δωματίου για μεγάλο χρονικό διάστημα. 49

50 2.3 Παρασκευάσματα πολυταινικών χρωμοσωμάτων Για τη δημιουργία παρασκευασμάτων πολυταινικών χρωμοσωμάτων, απαιτείται απομόνωση των σιελογόνων αδένων του εντόμου από προνύμφες (larvae) τρίτου προνυμφικού σταδίου ή νύμφες (pupae) (Mavragani- Tsipidou P. et al., 2015). Τα υλικά για τη δημιουργία τους παρατίθενται στον πίνακα 5. Πίνακας 5: Υλικά για τη δημιουργία παρασκευασμάτων πολυταινικών χρωμοσωμάτων Παρασκευάσματα πολυταινικών χρωμοσωμάτων Παρασκευάσματα πολυταινικών χρωμοσωμάτων (in situ) Εξοπλισμός Χημικά Διαλύματα Χημικά Διαλύματα Αντικειμενοφ Οξικό οξύ HCl 1N (σε dh 2 O) Οξικό οξύ 45% οξικό οξύ (σε όροι πλάκες (CH 3 COOH) (CH 3 COOH) dh 2 O) Καλυπτρίδες (18x18 και 20x20) Βερνίκι νυχιών Πάραφιλμ Ένυδρο χλωριούχο ασβέστιο (CaCl 2 H 2 O) Υδροχλωρικό οξύ (HCl) 37% Γαλακτικό οξύ [CH 3 CH(OH)CO OH] Διάλυμα γαλακτικού οξέοςοξικού οξέος: 80% γαλακτικό οξύ/60% οξικό οξύ σε αναλογία 1:1 Ringer (6,5 gr NaCl, 0,14 gr KCl, 0,2 gr NaHCO 3, 0,12 gr CaCl 2 *2 H 2 O, 0,01 gr NaH 2 PO 4 *2 H 2 O, 1000 ml dh 2 O) Χρωστική Ένυδρο χλωριούχο ασβέστιο (CaCl 2 H 2 O) Αιθανόλη Γαλακτικό οξύ [CH 3 CH(OH)CO OH] Διάλυμα γαλακτικού οξέοςοξικού οξέος: γαλακτικό οξύ/ dh 2 O/ οξικό οξύ σε αναλογία 2:3:4,5 Ringer (6,5 gr NaCl, 0,14 gr KCl, 0,2 gr NaHCO 3, 0,12 gr CaCl 2 *2 H 2 O, 0,01 gr NaH 2 PO 4 *2 H 2 O, 1000 ml dh 2 O) Μικροσκόπιο Στερεοσκόπιο Βελόνες Λεπίδες ξυραφιού Θερμαινόμεν η πλάκα Χλωριούχο κάλιο (KCl) Χλωριούχο νάτριο (NaCl) Όξινο ανθρακικό νάτριο (NaHCO 3 ) Σκόνη ορκεΐνη Χλωριούχο νάτριο (NaCl) Χλωριούχο κάλιο (KCl) Όξινο ανθρακικό νάτριο (NaHCO 3 ) Υγρό άζωτο Παρασκευάσματα πολυταινικών χρωμοσωμάτων για κυτταρολογική μελέτη Οι σιελογόνοι αδένες μπορούν να απομονωθούν από προνύμφες (larvae) τρίτου προνυμφικού σταδίου ή νύμφες (pupae). Η συνεχής επανάληψη της συγκεκριμένης 50

51 τεχνικής είχε ως αποτέλεσμα τη διαπίστωση ότι οι σιελογόνοι αδένες που απομονώνονται από νύμφες (pupae) του εντόμου δίνουν καλύτερης ποιότητας παρασκευάσματα, ειδικά στο στάδιο της πρώτης έως την τέταρτη ημέρα. Στην παρούσα διπλωματική εργασία για τη δημιουργία παρασκευασμάτων πολυταινικών χρωμοσωμάτων του είδους C. fasciventris χρησιμοποιήθηκαν νύμφες, συνήθως τριών ημερών. i. Απομόνωση σιελογόνων αδένων Αρχικά, κάθε νύμφη τοποθετείται σε μια σταγόνα διαλύματος Ringer ή φυσιολογικού ορού σε αντικειμενοφόρο πλάκα με σκοπό να διαχωριστούν οι αδένες με τη βοήθεια μικροβελόνων κάτω από στερεοσκόπιο. H αντικειμενοφόρος πλάκα τοποθετείται πάνω σε σκουρόχρωμη επιφάνεια, ώστε να διευκολύνεται η παρατήρηση και η απομόνωση του ιστού, που εντοπίζεται ως ελαφρώς λευκή- ημιδιάφανη δομή. Σε περίπτωση που η σκουρόχρωμη επιφάνεια δεν παρέχεται από το στερεοσκόπιο, μπορεί να τοποθετηθεί κάτω από την αντικειμενοφόρο πλάκα κομμάτι μαύρου χαρτιού. Συνήθως, ο ιστός που πρέπει να απομονωθεί εντοπίζεται συνδεδεμένος με τα στοματικά εξαρτήματα ή με άλλες δομές του ατόμου, από τις οποίες είναι απαραίτητο να διαχωριστεί. Επίσης, συνδεδεμένα με τους σιελογόνους αδένες εντοπίζονται και μεγάλα τμήματα λίπους από τα οποία θα διαχωριστούν σε επόμενο στάδιο. ii. Στερέωση πολυταινικών χρωμοσωμάτων Στη συνέχεια οι σιελογόνοι αδένες μεταφέρονται σε μία σταγόνα φρέσκου διαλύματος οξικού οξέος 45%, η οποία έχει τοποθετηθεί σε νέα αντικειμενοφόρο πλάκα. Επιπλέον, η αντικειμενοφόρος καλύπτεται με parafilm, με στόχο την παραμονή του ιστού σε αυτή τη θέση, ενώ παράλληλα τοποθετείται πάνω σε σκουρόχρωμη επιφάνεια, ώστε να επιτυγχάνεται εύκολα η παρατήρηση του ιστού. Σε αυτό το στάδιο πραγματοποιείται η ολική αφαίρεση του λίπους με τη βοήθεια των μικροβελόνων πολύ προσεκτικά, ώστε να αποφευχθεί η πιθανή διάρρηξη του ιστού. Αξίζει να σημειωθεί ότι η συνολική διάρκεια παραμονής του ιστού στο διάλυμα του οξικού οξέος δεν θα πρέπει να υπερβαίνει τα 2-3 λεπτά. iii. Υδρόλυση Έπειτα ο ιστός μεταφέρεται σε μια σταγόνα διαλύματος υδροχλωρίου (HCl) 1Μ, η οποία τοποθετείται σε διπλανή θέση στην ίδια αντικειμενοφόρο πλάκα για 2 λεπτά. Στο στάδιο αυτό, ο ιστός αρχίζει να γίνεται διάφανος. iv. Επιπλέον στερέωση πολυταινικών χρωμοσωμάτων 51

52 Στο επόμενο στάδιο ο απομονωμένος ιστός μεταφέρεται σε μια σταγόνα διαλύματος 80% γαλακτικού οξέος - 60% οξικού οξέος (1:1), η οποία τοποθετείται στην ίδια αντικειμενοφόρο πλάκα, για ένα πολύ σύντομο χρονικό διάστημα, το οποίο δεν πρέπει να υπερβαίνει τα 6 δευτερόλεπτα. Αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι η παραμονή του ιστού στο διάλυμα HCl για διάστημα μεγαλύτερο των 30 δευτερολέπτων μπορεί να καταστρέψει τους σιελογόνους αδένες. Στο στάδιο αυτό, ο ιστός εμφανίζεται περισσότερο διάφανος. v. Χρώση Οι σιελογόνοι αδένες, μεταφέρονται σε νέα αντικειμενοφόρο πλάκα που επίσης είναι καλυμμένη με parafilm, σε μια σταγόνα διαλύματος χρωστικής (γαλακτικό οξύ και 3% ορκεΐνη σε 60% οξικό οξύ, 1:1). Η σταγόνα του διαλύματος χρωστικής θα πρέπει να έχει όγκο περίπου 10μl, ενώ ο ιστός πρέπει να παραμείνει σε αυτό το διάλυμα για λεπτά. Η παρουσία του parafilm στο στάδιο αυτό βοηθά στο να αποφευχθεί το στέγνωμα της χρωστικής. Επιπλέον, αξιοσημείωτο θεωρείται το γεγονός ότι στην ίδια αντικειμενοφόρο μπορούν να τοποθετηθούν πολλές σταγόνες του διαλύματος της χρωστικής με απώτερο σκοπό το στάδιο αυτό να πραγματοποιείται ταυτόχρονα για πολλούς μεμονωμένους σιελογόνους αδένες. Ακόμη, η ακριβής διάρκεια αυτού του σταδίου εξαρτάται από το είδος του εντόμου που χρησιμοποιείται, τις συνθήκες και την ποιότητα των χρωμοσωμάτων, οπότε επιλέγεται έπειτα από επαναλήψεις του πρωτοκόλλου. Στη συγκριμένη εργασία ο ακριβής χρόνος παραμονής στο διάλυμα χρώσης ήταν 20 λεπτά. vi. Ξέπλυμα σιελογόνων αδένων Μετά τέλος του απαραίτητου χρονικού διαστήματος παραμονής του ιστού στο διάλυμα της χρωστικής, πραγματοποιείται η μεταφορά του σε μία σταγόνα διαλύματος 80% γαλακτικού οξέος - 60% οξικού οξέος με αναλογία 1:1, ώστε να ξεπλυθεί από την περίσσεια ποσότητα χρωστικής. Γενικά, κάθε σιελογόνος αδένας μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη δημιουργία ενός παρασκευάσματος, αλλά υπάρχει δυνατότητα, ο ιστός να κοπεί σε 2 ή 3 κομμάτια με τη βοήθεια των μικροβελόνων, ώστε καθένα από τα αυτά να μπορεί να χρησιμοποιηθεί για αντίστοιχο αριθμό παρασκευασμάτων. Έχει παρατηρηθεί ότι στη δεύτερη περίπτωση, τα χρωμοσωματικά παρασκευάσματα είναι καλύτερης ποιότητας. vii. Διάλυση ιστού Στη συνέχεια, ο ιστός διαλύεται σε διάλυμα γαλακτικού - οξικού οξέος. Πιο συγκεκριμένα, ο απομονωμένος ιστός τοποθετείται σε μια νέα αντικειμενοφόρο πλάκα που 52

53 περιέχει σταγόνα του διαλύματος γαλακτικού - οξικού οξέος. Έπειτα, στην περιοχή της σταγόνας που περιέχει τον ιστό τοποθετείται καλυπτρίδα διαστάσεων 18x18 και με τη βοήθεια βελόνας, η καλυπτρίδα μετακινείται με κυκλικές απαλές κινήσεις έχοντας ως στόχο την πλήρη διάσπαση του σιελογόνου αδένα και την ευρύτερη κατανομή των πολυταινικών χρωμοσωμάτων στην αντικειμενοφόρο πλάκα. Επιπρόσθετα, υπάρχει δυνατότητα χρήσης απορροφητικού χαρτιού με το οποίο μπορεί να τυλιχθεί κατάλληλα η αντικειμενοφόρος πλάκα, ώστε να ασκηθεί επιπλέον πίεση στην καλύπτρίδα μέσω του δαχτύλου, χωρίς να υπάρξει κάποια μετακίνηση την αρχική της θέση. Μετά την ολοκλήρωση της διαδικασίας που περιγράφηκε παραπάνω, μπορεί να γίνει η παρατήρηση των παρασκευασμάτων πολυταινικών χρωμοσωμάτων στο μικροσκόπιο έτσι ώστε να ελεγχθεί η ποιότητά τους. Η μονιμοποίηση των παρασκευασμάτων πραγματοποιείται μόνο αν η εικόνα που λαμβάνεται από το οπτικό μικροσκόπιο είναι ικανοποιητική. viii. Μονιμοποίηση παρασκευασμάτων πολυταινικών χρωμοσωμάτων Τέλος, πραγματοποιείται μονιμοποίηση του παρασκευάσματος με κατάλληλο μέσο (π.χ. βερνίκι νυχιών) γύρω από την καλυπτρίδα. Αξίζει να σημειωθεί ότι η μονιμοποίηση είναι ημιμόνιμη, καθώς τα παρασκευάσματα μπορούν να χρησιμοποιηθούν προς παρατήρηση άμεσα ή σε διάστημα 2 έως 4 εβδομάδων, κατά το οποίο θα πρέπει να διατηρούνται στους 4 ο C Παρασκευάσματα πολυταινικών χρωμοσωμάτων για χρήση σε πρωτόκολλα in situ Η τεχνική η οποία περιγράφεται στη συνέχεια έχει εφαρμοστεί σε περιπτώσεις μελέτης των ειδών C. capitata (Zacharopoulou et al., 1987, 1990), B. tryoni (Zhao et al., 1998), A. ludens (Garcia- Martinez et al., 2009), B. dorsalis (Zacharopoulou et al., 2011a) και B. cucurbitae (Zacharopoulou et al., 2011b). Το συγκεκριμένο πρωτόκολλο χρησιμοποιείται και αυτό με στόχο τη δημιουργία παρασκευασμάτων πολυταινικών χρωμοσωμάτων, αλλά σε αυτή την περίπτωση τα παρασκευάσματα δημιουργούνται για να χρησιμοποιηθούν σε in situ υβριδισμούς. Στα παρασκευάσματα αυτά, δηλαδή, θα υπάρχει δυνατότητα υβριδισμού κατάλληλων επισημασμένων ανιχνευτών. Στόχος είναι η εύρεση ή η επαλήθευση της θέσης κάποιας συγκεκριμένης αλληλουχίας γονιδίου πάνω στο πολυταινικό χρωμόσωμα. Και σε αυτή την περίπτωση χρησιμοποιούνται προνύμφες (larvae) τρίτου προνυμφικού σταδίου ή νεαρές νύμφες (pupae). Στην παρούσα εργασία για τη δημιουργία παρασκευασμάτων πολυταινικών χρωμοσωμάτων του είδους C. fasciventris, τα οποία θα 53

54 χρησιμοποιηθούν σε in situ υβριδισμούς χρησιμοποιήθηκαν νεαρές νύμφες, συνήθως τριών ημερών. i. Απομόνωση σιελογόνων αδένων Κάθε νύμφη τοποθετείται σε μία σταγόνα διαλύματος 45% οξικού οξέος σε αντικειμενοφόρο πλάκα με σκοπό το διαχωρισμό των σιελογόνων αδένων με τη βοήθεια μικροβελόνων στο στερεοσκόπιο. Συνήθως ο ιστός εντοπίζεται συνδεδεμένος με τα στοματικά εξαρτήματα ή με άλλες δομές του εντόμου, γι αυτό κρίνεται απαραίτητος ο διαχωρισμός του από αυτές. Όμως, συνδεδεμένα με αυτόν εντοπίζονται και μεγάλα τμήματα λίπους από τα οποία θα διαχωριστεί σε επόμενο στάδιο. ii. Στερέωση σιελογόνων αδένων Οι σιελογόνοι αδένες μεταφέρονται και στερεοποιούνται μέσω διαλύματος γαλακτικού - οξικού οξέος (γαλακτικό - απεσταγμένο νερό - οξικό οξύ με αναλογία 2:3:4,5). Μια σταγόνα μονιμοποιητικού τοποθετείται πάνω σε καλυπτρίδα, στην οποία μεταφέρονται οι σιελογόνοι αδένες, εκεί παραμένουν για διάστημα 3-5 λεπτών, μέχρι ο ιστός να γίνει διάφανος. Έπειτα η αντικειμενοφόρος πλάκα τοποθετείται από πάνω. iii. Διάλυση ιστού Στο στάδιο αυτό τα πολυταινικά χρωμοσώματα θα πρέπει να απλωθούν στην αντικειμενοφόρο πλάκα, οπότε ο πυρήνας θα πρέπει να ανοίξει πλήρως. Για να πραγματοποιηθεί αυτό θεωρείται απαραίτητη η άσκηση ελαφριάς πίεσης με το δάχτυλο πάνω στην επιφάνεια της καλυπτρίδας. Ακολουθεί έλεγχος της ποιότητας των παρασκευασμάτων στο μικροσκόπιο, καθώς υπάρχει περίπτωση να απαιτείται άσκηση επιπλέον πίεσης, ώστε να εντοπίζεται ένας πυρήνας σε κάθε επίπεδο. iv. Διατήρηση παρασκευασμάτων πολυταινικών χρωμοσωμάτων Τα παρασκευάσματα πολυταινικών χρωμοσωμάτων που δημιουργήθηκαν μπορούν να διατηρηθούν στην κατάψυξη για διάστημα 2-3 ημερών. Κατά τη διάρκεια της δεύτερης μέρας συνήθως, απαιτείται η απομάκρυνση της καλυπτρίδας από τα παρασκευάσματα. Αυτό επιτυγχάνεται με τη βοήθεια υγρού αζώτου στο οποίο βυθίζονται τα παρασκευάσματα για λίγα δευτερόλεπτα και στην συνέχεια με γρήγορες αλλά πολύ προσεκτικές κινήσεις αφαιρείται η καλυπτρίδα με τη βοήθεια λεπίδας ξυραφιού. Τα παρασκευάσματα τοποθετούνται σε απόλυτη αλκοόλη για πέντε λεπτά, δύο διαδοχικές φορές. Τέλος, μπορούν να διατηρηθούν στο ψυγείο για χρονικό διάστημα 2 έως 3 μηνών, καθώς μετά το πέρας του χρονικού αυτού διαστήματος παρατηρείται αλλοίωση της 54

55 ποιότητας. Το γεγονός αυτό επηρεάζει τα αποτελέσματα των υβριδισμών in situ στους οποίους θα χρησιμοποιηθούν. 2.4 Υβριδισμός in situ Η κυτταρογενετική μελέτη του είδους C. fasciventris περιλαμβάνει τον εντοπισμό της θέσης κάποιων χαρακτηριστικών γονιδίων στα χρωμοσώματα του είδους. Γενικά, οι θέσεις των συγκεκριμένων γονιδίων έχουν μελετηθεί και σε άλλα είδη της οικογένειας Tephritidae, οπότε ο υβριδισμός in situ μπορεί να χρησιμοποιηθεί με σκοπό να επιβεβαιώσει τη διατήρηση της θέσης αυτών των γονιδίων ή να οδηγήσει στη διαπίστωση κάποιας πιθανής αναδιάταξης στα χρωμοσώματα. Τα γονίδια που μελετήθηκαν στην παρούσα μελέτη για το είδος C. fasciventris είναι τα hsp70, scarlet, white και sxl. Κρίνεται, λοιπόν, απαραίτητο να δημιουργηθούν οι κατάλληλοι ανιχνευτές, με σκοπό έπειτα από τη σήμανσή τους να χρησιμοποιηθούν για τον in situ υβριδισμό σε παρασκευάσματα πολυταινικών χρωμοσωμάτων του συγκεκριμένου είδους Δημιουργία ανιχνευτών Για τη δημιουργία των ανιχνευτών χρησιμοποιήθηκαν ως αρχικό δείγμα βακτηριακά στελέχη Escherichia coli μετασχηματισμένα με πλασμίδια που διέθεταν ενσωματωμένο το εκάστοτε επιθυμητό γονίδιο. Αυτά τα στελέχη χρησιμοποιήθηκαν έτοιμα από ήδη υπάρχον στοκ του εργαστηρίου. Αρχικά, πραγματοποιήθηκε επίστρωση καλλιεργειών σε στερεό θρεπτικό μέσο με τα συγκεκριμένα μετασχηματισμένα στελέχη. Πιο συγκεκριμένα, με τη βοήθεια μικροβιολογικού κρίκου λαμβάνεται μικρή ποσότητα από το στοκ της υγρής καλλιέργειας και επιστρώνεται σε τριβλία με άγαρ. Η διαδικασία αυτή επιτελείται κάτω από αυστηρά στείρες συνθήκες. Στη συνέχεια, οι καλλιέργειες επωάζονται για 24 ώρες σε κλίβανο στους 37 ο C. Παρασκευή τριβλίων με στερεό θρεπτικό υλικό: Για την παρασκευή του στερεού θρεπτικού υλικού χρησιμοποιήθηκε LB medium (Lysogeny Broth medium) που αποτελεί κατάλληλο μέσο ανάπτυξης βακτηρίων ως στερεό θρεπτικό υλικό με την προσθήκη άγαρ (Πίνακας 6). Αρχικά, το διάλυμα αποστειρώνεται και έπειτα προστίθεται κατάλληλο αντιβιοτικό αφού το θρεπτικό μέσο έχει ψυχθεί αρκετά. Αξίζει να σημειωθεί ότι στην παρούσα περίπτωση το αντιβιοτικό που χρησιμοποιείται είναι η αμπικιλλίνη. Τέλος, το θρεπτικό μέσο απλώνεται στα τριβλία, όπου μετά την ψύξη και τη στερέωση του σε αυτά, μπορεί να πραγματοποιηθεί η επίστρωση της καλλιέργειας. 55

56 Πίνακας 6: Υλικά παρασκευής στερεού και υγρού θρεπτικού μέσου. LB medium- στερεό θρεπτικό μέσο LB medium- υγρό θρεπτικό μέσο Υλικά Ποσότητες Ποσότητες Bacto- tryptone 10g 10g Bacto- Yeast extract 5g 5g Άγαρ 15g - NaCl 5g 5g Αμπικιλλίνη 100μg/ml 100μg/ml Τελικός όγκος 1 L 1 L Έλεγχος βακτηριακών στελεχών: Στη συνέχεια θα πρέπει να πραγματοποιηθεί έλεγχος των βακτηριακών στελεχών που πρόκειται να χρησιμοποιηθούν ώστε να διαπιστωθεί εάν περιέχουν πράγματι τα επιθυμητά γονίδια. Γι αυτό το σκοπό γίνεται απομόνωση του πλασμιδιακού DNA από τις καλλιέργειες και πέψη αυτού με τα κατάλληλα ένζυμα περιορισμού. Όμως, για να επιτευχθεί η απομόνωση του πλασμιδιακού DNA θα πρέπει να προηγηθεί η δημιουργία μιας υγρής καλλιέργειας του επιθυμητού βακτηριακού στελέχους. i. Παρασκευή υγρής βακτηριακής καλλιέργειας Για την παρασκευή της υγρής καλλιέργειας χρησιμοποιείται μια αποικία από τις καλλιέργειες που έχουν επιστρωθεί στα τριβλία. Η λήψη της συγκεκριμένης αποικίας γίνεται με τη βοήθεια του μικροβιολογικού κρίκου κάτω από στείρες συνθήκες. Στη συνέχεια αυτός εμβαπτίζεται σε υγρό θρεπτικό μέσο, το οποίο είναι και πάλι το LB medium όμως χωρίς προσθήκη άγαρ. Μετά τη δημιουργία του υγρού μέσου, μοιράζονται 5ml σε κάθε σωλήνα falcon και αποστειρώνονται. Μετά την ολοκλήρωση της αποστείρωσης και αφού το διάλυμα έχει ψυχθεί ακολουθεί η προσθήκη αντιβιοτικού και πιο συγκεκριμένα της αμπικιλλίνης. Από αυτή τη χρονική στιγμή και έπειτα το υγρό μέσο θεωρείται διαθέσιμο προς χρήση. Την εμβάπτιση της αποικίας στο υγρό θρεπτικό μέσο ακολουθεί η επώαση των υγρών καλλιεργειών για 24 ώρες στους 37 ο C με διαρκή ανάδευση. ii. Απομόνωση πλασμιδιακού DNA: Η απομόνωση του πλασμιδιακού DNA πραγματοποιήθηκε από την υγρή καλλιέργεια του βακτηρίου με τη βοήθεια ειδικού κιτ. Το κιτ που χρησιμοποιήθηκε είναι το 56

57 NucleoSpin Plasmid της εταιρείας Macherey-Nagel στο οποίο περιέχονται το αντίστοιχο πρωτόκολλο και τα απαραίτητα αντιδραστήρια. iii. Πέψη πλασμιδιακού DNA Το πλασμιδιακό DNA, το οποίο απομονώθηκε από τα μετασχηματισμένα βακτήρια θα πρέπει να ελεγχθεί ώστε να διαπιστωθεί εάν αυτά περιέχουν πράγματι τα επιθυμητά γονίδια. Για τον έλεγχο, λοιπόν, του πλασμιδιακού DNA που απομονώθηκε κρίνεται απαραίτητη η πέψη του με κατάλληλα ένζυμα περιορισμού, προκειμένου να διαπιστωθεί αν προκύπτουν τα αναμενόμενα - με βάση την αλληλουχία του - τμήματα. Η διαδικασία της πέψης υλοποιείται σε σωλήνες eppendorf (1,5 ml) στους οποίους προστίθεται το DNA, το κατάλληλου ένζυμο περιορισμού με το αντίστοιχο ρυθμιστικό διάλυμα (buffer) σε τελικό όγκο 20μl και ακολουθεί επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για χρονικό διάστημα τριών ωρών. Στους πίνακες που ακολουθούν καταγράφονται τα είδη των ενζύμων περιορισμού που χρησιμοποιήθηκαν σε κάθε περίπτωση και οι αντίστοιχες ποσότητες. Πίνακας 7: Τα ένζυμα περιορισμού που χρησιμοποιήθηκαν στην πέψη των ανιχνευτών. Ανιχνευτής Ένζυμο (Fermentas) Buffer (Fermentas) hsp70 EcoRI EcoRI scarlet EcoRI EcoRI white XhoI R sxl EcoRI- HindIII R Πίνακας 8: Υλικά-αντιδραστήρια και ποσότητες σε κάθε σωλήνα πέψης. Υλικάαντιδραστήρια DNA Buffer Ένζυμο ddh 2 O Τελικός όγκος Ποσότητα 150ng/μl 2 μl 10 Units Διπλή πέψη: 10U + 10U 14μl Διπλή πέψη: 13μl 20μl iv. Έλεγχος πέψης Για τον έλεγχο της πέψης πραγματοποιείται ηλεκτροφόρηση όλης της ποσότητας της πέψης του πλασμιδιακού DNA σε gel αγαρόζης περιεκτικότητας 0,8%. Η παρασκευή του gel πραγματοποιείται με τη διάλυση 0,8g αγαρόζης σε 100ml ρυθμιστικού διαλύματος ηλεκτροφόρησης 0,5Χ ΤΒΕ (Tris base, βορικό οξύ, EDTA) (πίνακας 9) 57

58 εντός της κωνικής φιάλης. Στη συνέχεια, το διάλυμα θερμαίνεται σε φούρνο μικροκυμάτων με σκοπό την πλήρη διάλυση της αγαρόζης, έτσι ώστε να δημιουργηθεί ένα διαυγές προϊόν και ψύχεται έως ένα σημείο. Τέλος, στο διάλυμα προστίθενται 5μl από τη χρωστική βρωμιούχο αιθίδιο (EtBr) σε συγκέντρωση 100 mg/ml της εταιρίας Applichem. Το βρωμιούχο αιθίδιο χρησιμοποιείται καθώς έχει τη δυνατότητα να συνδέεται με τα μόρια του DNA και να φθορίζει κάτω από υπεριώδες φως, με αποτέλεσμα οι ζώνες του DNA να καθίστανται ορατές. Στη μία πλευρά της φόρμας τοποθετήθηκαν χτενάκια για να δημιουργήσουν πηγαδάκια όπου θα φορτωθεί το διάλυμα της πέψης, τα οποία και αφαιρέθηκαν μετά τη στερεοποίηση της πηκτής. Για να πραγματοποιηθεί η φόρτωση των δειγμάτων στο gel αγαρόζης θα πρέπει να προηγηθεί προσθήκη 1μl διαλύματος φόρτωσης σε κάθε eppendorf πέψης. Το διάλυμα φόρτωσης περιέχει μπλε της βρωμοφαινόλης, κυανούν του ξυλενίου και γλυκερόλη. Οι χρωστικές θεωρούνται απαραίτητες ώστε να είναι ευδιάκριτη η πορεία της ηλεκτροφόρησης των δειγμάτων, ενώ η γλυκερόλη απαιτείται για να κατακαθίσουν τα δείγματα στις θέσεις φόρτωση. Επιπλέον, στο δείγμα που φορτώνεται προστίθεται ddh 2 O, ώστε ο τελικός όγκος που θα φορτωθεί να είναι 10 μl. Εκτός από τα δείγματα, στο gel φορτώνεται και κατάλληλος DNA μάρτυρας μοριακών βαρών (ladder) για τον υπολογισμό του μοριακού βάρους και της ποσότητας του DNA των δειγμάτων. Ο μάρτυρας που χρησιμοποιήθηκε ήταν ο puc Mix (8) της εταιρείας Fermentas. Η τάση που εφαρμόστηκε στην πηκτή ήταν 100 Volt για χρονικό διάστημα περίπου 25 λεπτών. Πίνακας 9: Τα συστατικά και οι ποσότητες τους για την παρασκευής διαλύματος TBE Διάλυμα ΤΒΕ συστατικά ποσότητα Tris- base 54 g Βορικό οξύ 27,5 g EDTA 20 ml ddh 2 O σε τελικό όγκο 1000ml v. Επισήμανση πλασμιδιακού DNA Αφού ολοκληρωθεί ο έλεγχος του πλασμιδιακού DNA ως προς την ύπαρξη των επιθυμητών γονιδίων, αυτό μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως ανιχνευτής. Για τη χρήση κάθε ανιχνευτή σε in situ υβριδισμούς απαραίτητη είναι η σήμανση του, για την οποία χρησιμοποιήθηκε το κιτ Dig-High Prime της εταιρείας Roche. Το πρωτόκολλο 58

59 της σήμανσης στηρίζεται στην τεχνική random primed labeling και το κιτ περιλαμβάνει διγοξυγενίνη-11-dutp, καθώς και το ένζυμο Klenow. Η μέθοδος βασίζεται στην αποδιάταξη των δίκλωνων ανιχνευτών και τη σταδιακή αντιγραφή της κάθε αλυσίδας με τη βοήθεια τυχαίων εξαμερών εκκινητών και της πολυμεράσης Klenow. Το πρόδρομο μόριο που χρησιμοποιείται είναι το dutp, που είναι επισημασμένο με το στεροειδές απτένιο διγοξυγενίνη (Dig-11-dUTP) Υβριδισμός ανιχνευτών in situ σε παρασκευάσματα πολυταινικών Buffer 1: χρωμοσωμάτων 10-1 M Tris- HCl ph 7,5 150x10-3 M NaCl Buffer 2: Συγκέντρωση 0,5% w/v Διαλύματα για υβριδισμό in situ 1g Blocking reagent (παρέχεται από το κιτ) 200 ml buffer 1 Απαραίτητη είναι η ανάδευση και η θέρμανση σε μέγιστη θερμοκρασία 65 ο C. Buffer 3: 10-1 M Tris- HCl ph 9,5 5x10-2 M MgCl M NaCl Tris- HCl 1M: Tris 121,14 g/mol 800 ml ddh 2 O 25 ml HCl Σταδιακή προσθήκη HCl έως το ph 7,5 0,07 M NaOH: Παρασκευάζεται πριν από τη χρήση από pellets NaOH 0,84 g NaOH 300 ml ddh 2 O 20xSSC (ph 7): NaCl 175,3 g Tris-Sodium Citrate 88,2 g 59

60 ddh 2 O τελικός όγκος 1L Διάλυμα Υβριδισμού dig: 5x SSC 1% blocking reagent 0,1% Sarcosyl 0,02% SDS 30% 50% 70% 96% Αλκοόλες Χρησιμοποιείται καθαρή αλκοόλη που αραιώνεται κατά περίπτωση με ddh 2 O Σήμανση ανιχνευτή Σε ένα σωληνάκι τύπου eppendorf προστίθεται 1μg πλασμιδιακού DNA και συμπληρώνεται με απεσταγμένο νερό μέχρι ο τελικός όγκος να είναι 16 μl. Αποδιάταξη του DNA μέσω βρασμού για 10 λεπτά και άμεση τοποθέτηση του eppendof σε πάγο. Πρόσθεση 4 μl Mix Dig High Prime και ακολουθεί spin. Το μίγμα επωάζεται από 1 έως 24 ώρες στους 37 ο C. Στην παρούσα διπλωματική εργασία η επώαση ήταν εικοσιτετράωρη. Η αντίδραση σταματά με την προσθήκη 2 μl 0,2 Μ EDTA ph 8.0 που έχει τη δυνατότητα να δεσμεύει τα Mg 2+. Πρόσθεση 100 μl διαλύματος υβριδισμού και φύλαξη ανιχνευτή στους - 20 ο C μέχρι τη χρήση του σε in situ υβριδισμό Έλεγχος σήματος ανιχνευτών Σε ένα κομμάτι μεμβράνης νιτροκιταρίνης προστίθενται 1 μl από τον κάθε ανιχνευτή. Στη μεμβράνη μπορούν να προστεθούν περισσότεροι από έναν ανιχνευτή, οι θέσεις των οποίων διαχωρίζονται. Αναμονή μέχρι τη στιγμή που οι κουκίδες δεν θα διακρίνονται στη μεμβράνη. Έκθεση μεμβράνης σε UV ακτινοβολία για 5 λεπτά. Ο χρόνος αυτός έκθεσης δεν θα πρέπει να ξεπεραστεί καθώς υπάρχει πιθανότητα καταστροφής του DNA. Εμβάπτιση της μεμβράνης σε buffer 1 για 5 λεπτά. Εμβάπτιση της μεμβράνης σε buffer 2 για 20 λεπτά. 60

61 Εμβάπτιση της μεμβράνης σε buffer 1 για 20 λεπτά. Φυγοκέντρηση αντισωμάτων για 5 λεπτά στις rpm. Αραίωση των αντισωμάτων: σε 3 ml buffer 2 προστίθεται 1 μl αντισωμάτων και ακολουθεί η ανάμειξη τους. Εμβάπτιση της μεμβράνης σε διάλυμα αντισωμάτων για 30 λεπτά. Ακολουθούν δύο διαδοχικές εμβαπτίσεις με buffer 1 για 15 λεπτά. Τοποθέτηση μεμβράνης σε buffer 3 και παραμονή της μέχρι τη μεταφορά της στο διάλυμα χρώματος. Σε ένα μικρό τριβλίο προστίθενται 3 ml buffer 3 και 60 μl διαλύματος χρώματος τα οποία αναμιγνύονται με τη βοήθεια πιπέτας. Το διάλυμα χρώσης πριν τη χρήση του τοποθετείται στο υδατόλουτρο στους 37 ο C στην περίπτωση που έχει κάποιο ίζημα με στόχο τη διάλυση του. Το διάλυμα χρώματος θα πρέπει να κατασκευάζεται και να παραμένει σε σκοτεινό χώρο. Μεταφορά μεμβράνης σε διάλυμα χρώματος και επώαση για λεπτά σε σκοτεινό σημείο Προετοιμασία παρασκευασμάτων Ρυθμίζουμε το υδατόλουτρο στους 65 ο C. Ενυδάτωση παρασκευασμάτων πολυταινικών χρωμοσωμάτων που έχουν δημιουργηθεί για τη χρήση τους σε υβριδισμούς in situ, με διαδοχική εμβάπτιση τους σε διαλύματα αλκοόλης: 70%, 50% και 30% για 2 λεπτά. Εμβάπτιση παρασκευασμάτων σε 2 x SSC (γρήγορο ξέπλυμα) Μεταφορά παρασκευασμάτων σε σκεύος με ζεστό 2 x SSC, το οποίο έχει προθερμανθεί στους 65 ο C (ίδια θερμοκρασία με αυτή του υδατόλουτρου) και το οποίο τοποθετείται στο υδατόλουτρο (65 ο C) για 30 λεπτά με σκοπό τη σταθεροποίηση των χρωμοσωμάτων. Γρήγορο ξέπλυμα σε κρύο 2 x SSC. Μετουσίωση σε 0,07 NaOH για 2 λεπτά (το NaOH παρασκευάζεται εκείνη τη στιγμή με τη διάλυση 0,84 gr ΝaOH σε 300 ml ddh 2 O). Λόγω της ευαισθησίας των πολυταινικών χρωμοσωμάτων κάποια παρασκευάσματα παρέμειναν για μικρότερο χρονικό διάστημα στο διάλυμα NaOH (1,25 1,5 λεπτό). Αφυδάτωση των παρασκευασμάτων με διαδοχική εμβάπτιση τους σε διαλύματα αλκοόλης: 30%, 50%, 70% και 96% για 2 λεπτά. 61

62 Στέγνωμα παρασκευασμάτων στον αέρα, τα οποία θα πρέπει να χρησιμοποιηθούν εντός 4 ωρών. Προετοιμασία κουτιών στα οποία θα τοποθετηθούν τα παρασκευάσματα ώστε να γίνει ο υβριδισμός με την τοποθέτηση κατάλληλου μεγέθους διπλού διηθητικού χαρτιού και προσθήκη διαλύματος 4 x SSC. Τα κουτιά τοποθετούνται σε κλίβανο ανάλογης θερμοκρασίας με αυτή στην οποία θα πραγματοποιηθεί ο υβριδισμός Υβριδοποίηση Αποδιάταξη του ανιχνευτή μέσω βρασμού για 10 λεπτά και άμεση τοποθέτηση του σε πάγο και spin. Τοποθέτηση 15 μl ανιχνευτή σε κάθε παρασκεύασμα πολυταινικών χρωμοσωμάτων (στην περιοχή στην οποία έχουν καθηλωθεί τα χρωμοσώματα) και η περιοχή καλύπτεται με καλυπτρίδα (18 x 18 cm) με μεγάλη προσοχή αποφεύγοντας τον σχηματισμό φυσαλίδων. Τα παρασκευάσματα τοποθετούνται στο ειδικό κουτί υβριδοποίησης, το οποίο σφραγίζεται με κολλητική ταινία και τοποθετούνται σε επωαστικό θάλαμο με θερμοκρασία ο C για τουλάχιστον 16 ώρες Ανίχνευση σήματος υβριδοποίησης Πριν το τέλος του υβριδισμού πρέπει να παρασκευαστεί το διάλυμα buffer 2 (1g Blocking Reagent ml buffer 1 αναδεύονται και η θερμοκρασία κατά την ανάδευση δεν θα πρέπει να υπερβαίνει τους 65 ο C). Ρύθμιση της θερμοκρασίας του υδατόλουτρου περίπου 10 με 12 ο C κάτω από τη θερμοκρασία υβριδισμού (π.χ. αν η θερμοκρασία υβριδισμού ήταν 60 ο C τότε το υδατόλουτρο ρυθμίζεται περίπου στους 48 ο C). Θέρμανση 2 x SSC σε κατάλληλο σκεύος στη θερμοκρασία του υδατόλουτρου. Εμβάπτιση των παρασκευασμάτων σε κρύο 2 x SSC με σκοπό την απομάκρυνση των καλυπτρίδων και άμεση μεταφορά τους σε σκεύος με ζεστό 2 x SSC. Το σκεύος με τα παρασκευάσματα τοποθετείται στο υδατόλουτρο όπου παραμένει για 15 λεπτά. Μεταφορά παρασκευασμάτων σε κρύο 2 x SSC για 15 λεπτά. Μεταφορά παρασκευασμάτων σε buffer 1 για 5 λεπτά. Μεταφορά παρασκευασμάτων σε buffer 2 για 30 λεπτά. Φυγοκέντρηση αντισωμάτων για 5 λεπτά στις rpm 62

63 Σύντομη εμβάπτιση παρασκευασμάτων σε buffer 1. Αραίωση αντισωμάτων 1:500. Γενικά, τοποθετούνται 200 μl διαλύματος αντισωμάτων σε κάθε παρασκεύασμα. Για παράδειγμα, για 14 παρασκευάσματα απαιτούνται 6 μl αντίσωμα και 3 ml buffer 2. Σύντομο vortex στα αραιωμένα αντισώματα. Τα παρασκευάσματα μεταφέρονται και πάλι στο κουτί υβριδισμού. Τοποθετούμε 200 μl διαλύματος αντισωμάτων σε κάθε παρασκεύασμα και τοποθετούμε γρήγορα και προσεκτικά την καλυπτρίδα (22 x 22 cm) για να μη στεγνώσουν. Επώαση παρασκευασμάτων για λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Απομάκρυνση καλυπτρίδων από τα παρασκευάσματα και ακολοθούν δύο διαδοχικές εμβαπτίσεις σε buffer 1 για 15 λεπτά. Ξέπλυμα παρασκευασμάτων σε buffer 3 και παραμονή σε αυτό έως την τοποθέτηση αυτών σε διάλυμα χρώματος. Παρασκευή διαλύματος χρώματος (αραίωση 1:50). Γενικά, χρειάζεται 1 ml διαλύματος χρώματος σε κάθε παρασκεύασμα. Για παράδειγμα για 14 παρασκευάσματα απαιτούνται 15 ml buffer 3 και 300 μl χρωμογόνο. Το διάλυμα χρώματος πρέπει να παρασκευάζεται και να παραμένει σε σκοτεινό χώρο. Τα παρασκευάσματα μεταφέρονται ξανά στα κουτιά υβριδισμού όπου τοποθετείται 1 ml διαλύματος χρώματος στο καθένα και επωάζονται σε σκοτεινό χώρο για περίπου 40 λεπτά. Τα παρασκευάσματα ξεπλένονται με ddh 2 O και μπορούν να παρατηρηθούν στο οπτικό μικροσκόπιο ώστε να πραγματοποιηθεί εντοπισμός του σήματος. Η παρατήρηση όλων των παρασκευασμάτων πραγματοποίηθηκε σε μικροσκόπιο Nikon (ECLIPSE 80i) σε μεγέθυνση 40x και 60x. Το μικροσκόπιο ήταν συνδεδεμένο με κάμερα με ηλεκτρονικό υπολογιστή. Η λήψη των φωτογραφιών έγινε μέσω του υπολογιστή με το πρόγραμμα NIS- Elements F Ανάλυση μιτοχονδριακού DNA του είδους C. fasciventris Για να πραγματοποιηθεί η ανάλυση του μιτοχονδριακού γονιδιώματος θα πρέπει να προηγηθεί η απομόνωση του από άτομα εργαστηριακής καλλιέργειας, τα οποία διατηρούνταν σε σωλήνες eppendorf στην κατάψυξη. Γενικά, υλοποιήθηκε απομόνωση μιτοχονδριακού DNA συνολικά από δέκα άτομα, πέντε αρσενικά και πέντε θηλυκά. Έπειτα, το απομονωμένο mtdna ηλεκτροφορήθηκε με 63

64 σκοπό να ελεγχθεί η επιτυχία της απομόνωσης. Με βάση τα αποτελέσματα της ηλεκτροφόρηση, δηλαδή την ποιότητα και την ποσότητα του γενετικού υλικού που έχει απομονωθεί, επιλέχθηκε το άτομο που θα χρησιμοποιηθεί για να γίνει η ανάλυση του μιτοχοδνριακού DNA Απομόνωση μιτοχονδριακού DNA με CTAB Για την απομόνωση του μιτοχονδριακού DNA από τα ενήλικα αρσενικά και θηλυκά άτομα πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του πρωτοκόλλου CTAB (Cetyltrimethyl ammonium bromide). Γενικά, το ρυθμιστικό διάλυμα CTAB (CTAB buffer) είναι έτοιμο προς χρήση, ενώ η πρωτεϊνάση Κ με τελική συγκέντρωση 0,1 mg/ml και η β- μερκαπτοαιθανόλη με τελική συγκέντρωση 0,2%, μπορούν να προστεθούν λίγο πριν τη χρήση του διαλύματος. Στην παρούσα μελέτη η πρωτεϊνάση Κ προστέθηκε σε ξεχωριστό βήμα μέσα στο πρωτόκολλο και η β-μερκαπτοαιθανόλη δεν χρησιμοποιήθηκε. Αρχικά, τα ενήλικα άτομα C. fasciventris που είναι αποθηκευμένα σε αιθανόλη τοποθετούνται σε απορροφητικό ή διηθητικό χαρτί για 15 λεπτά με σκοπό να στεγνώσουν. Εναλλακτικά μπορούν να ξεπλυθούν με νερό μέχρι να απομακρυνθεί η αιθανόλη. Κάθε άτομο μεταφέρεται σε σωλήνα τύπου eppendorf του 1,5 ml. Παρασκευάζεται διάλυμα CTAB - πρωτεϊνάσης Κ των 200μl για κάθε eppendorf, η πρωτεϊνάση Κ θα πρέπει να έχει τελική συγκέντρωση 0,1 mg/ml. Γίνεται προσθήκη 200μl διαλύματος CTAB - πρωτεϊνάσης Κ σε κάθε eppendorf μέσα στο οποίο υπάρχει ένα έντομο και στη συνέχεια αυτό συνθλίβεται με τη χρήση ενός πλαστικού αποστειρωμένου εμβόλου με συνεχείς πιέσεις έως ότου να δημιουργηθεί ένα ομοιογενές διάλυμα και να μην είναι ορατά μεμονωμένα τμήματα του εντόμου. Ακολουθεί επώαση για χρονικό διάστημα μίας περίπου ώρας σε υδατόλουτρο στους ο C. Προστίθενται 200μl αποστειρωμένο ddh 2 O με σκοπό να αυξηθεί ο όγκος ώστε να γίνει πιο εύκολη η απομόνωση με το χλωροφόρμιο. Προστίθεται ίσος όγκος (συνολικά 400μl) χλωροφορμίου Ανακίνηση σωληναρίων για 1-2 λεπτά αρκετές φορές με στόχο την ανάμιξη των φάσεων. Φυγοκέντρηση για 5 λεπτά στις 8000rpm. 64

65 Μεταφορά της άνω υδάτινης φάσης σε νέο σωληνάριο τύπου eppendorf των 1,5ml, αποφεύγοντας τα στερεά τμήματα και την οργανική φάση. Προσθήκη ίσου όγκου ( μl) ισοπροπανόλης και ανάδευση με ανακίνηση για αρκετές φορές. Τοποθέτηση των σωληναρίων για τουλάχιστον μισή ώρα στους -20 ο C. Φυγοκέντρηση για λεπτά στις rpm. Απομακρύνεται το υπερκείμενο. Προστίθεται 70% αιθανόλη μέχρι τον τελικό όγκο του 1ml και τα σωληνάρια ανακινούνται 5-6 φορές. Φυγοκέντρηση στις rpm για 5 λεπτά. Απομάκρυνση υπερκειμένου. Spin για 5-6 δευτερόλεπτα Απομάκρυνση της αλκοόλης που πιθανόν έχει απομείνει με τη βοήθεια πιπέτας, αποφεύγοντας το ίζημα. Επώαση για 5-10 λεπτά στους 37 ο C με σκοπό να απομακρυνθούν τα ίχνη της αιθανόλης. Διάλυση σε 100 μl διαλύματος ΤΕ (ΤΕ buffer) ή σε αποστειρωμένο ddh 2 O Ηλεκτροφόρηση απομονωμένου mtdna Στη συνέχεια πρέπει να πραγματοποιηθεί έλεγχος των δειγμάτων του mtdna που απομονώθηκαν με το πρωτόκολλο CTAB. Αυτό υλοποιείται μέσω της ηλεκτροφόρησή τους σε πηκτή αγαρόζης 0,8%. Από το απομονωμένο δείγμα χρησιμοποιήθηκαν 5μl DNA, ενώ ως μάρτυρας μοριακών βαρών χρησιμοποιήθηκε ο ladder Lambda DNA/HindIII (5) (λ DNA/HindIII) της εταιρείας Fermentas, σε ποσότητα 250ng Αλληλούχιση mtdna του είδους C. fasciventris Σχεδιασμός εκκινητών Οι εκκινητές αποτελούν ολιγονουκλεοτιδικές αλληλουχίες (18-30 νουκλεοτιδίων συνήθως), συμπληρωματικές ως προς την νουκλεοτιδική περιοχή που βρίσκεται μπροστά από το τμήμα του γονιδιώματος που τίθεται προς ενίσχυση. Επιπλέον, οι εκκινητές σχεδιάζονται ανά ζεύγη με απώτερο σκοπό ο ένας εκκινητής του ζεύγους να συνδέεται στο εμπρόσθιο τμήμα της επιθυμητής αλληλουχίας, ενώ ο άλλος να προσδένεται στη συμπληρωματική αλυσίδα του DNA εξωτερικά στο το τέλος του επιθυμητού τμήματος. Ο 65

66 πρώτος εκκινητής ονομάζεται Forward, ενώ ο δεύτερος Reverse. Μετά την πρόσδεση τους στο επιθυμητό τμήμα της αλληλουχίας του μιτοχονδριακού DNA οι δύο εκκινητές επιμηκύνονται ταυτόχρονα ενισχύοντας το ενδιάμεσο τμήμα του. Στόχος ήταν η σχεδίαση ζευγών εκκινητών που να ενισχύουν επικαλυπτόμενα τμήματα mtdna, μήκους περίπου 800 bp. Αξίζει να σημειωθεί ότι δύο διαδοχικά ζεύγη εκκινητών περιέχουν αλληλοεπικαλυπτόμενες αλληλουχίες μήκους περίπου 200 νουκλεοτιδίων, καθώς αυτό επιτρέπει τη σύνδεση των διαδοχικών αλληλουχιών σε μια ενιαία. Η αναζήτηση των εκκινητών περιορίζονταν από τις εξής παραμέτρους, το μήκος των εκκινητών να κυμαίνονταν στις bp, το ποσοστό των βάσεων G-C να ήταν υψηλότερο από 45% και ιδιαίτερα το 3 άκρο με σκοπό η σύνδεση με το τμήμα της αλληλουχίας που θα ενίσχυαν να ήταν ισχυρή. Παράλληλα, κάθε ζεύγος εκκινητών έπρεπε να μην ήταν συμπληρωματικό, έτσι ώστε να περιορίζονταν οι δεσμοί μεταξύ τους αλλά και η θερμοκρασία που λειτουργούσαν άριστα στο στάδιο του υβριδισμού (Tm annealing) να ήταν υψηλή, καθιστώντας έτσι την σύνδεση πιο εξειδικευμένη, καθώς και να μην προσδένονται σε άλλες περιοχές, είτε στο πυρηνικό είτε στο μιτοχονδριακό DNA. Τα ζεύγη εκκινητών σχεδιάστηκαν με τη βοήθεια των προγραμμάτων OligoExplorer και OligoAnalyzer (εικόνα 17) και κατασκευάστηκαν από την εταιρίας IDT (Intergrated DNA Technologies) α. 66

67 β. Εικόνα 17: Αναζήτηση ζευγών εκκινητών με τα προγράμματα OligoExplorer (α) και OligoAnalyzer (β). α. Στο πάνω τμήμα παρουσιάζονται η αλληλουχία και η θέση των ζευγών εκκινητών σε αυτή, ενώ στο κάτω τμήμα, στη δεξιά πλευρά φαίνονται το μήκος τους, η θερμοκρασία τους, το ποσοστό GC%, το μέγεθος του τμήματος που ενισχύουν, οι διαφορές μεταξύ των εκκινητών του ζεύγους (θερμοκρασία ποσοστό GC%), ενώ στην αριστερή πλευρά φαίνονται οι δεσμοί που σχηματίζουν οι εκκινητές με τον εαυτό τους αλλά και με τον άλλο εκκινητή του ζεύγους. β. Στο περιβάλλον του OligoAnalyzer στη δεξιά πλευρά φαίνονται οι αλληλουχίες κάθε ζεύγους εκκινητών, ενώ στην αριστερή φαίνονται τα χαρακτηριστικά του καθενός (θερμοκρασία, ποσοστό GC%), οι μεταξύ τους διαφορές, οι δεσμοί που σχηματίζουν οι εκκινητές με τον εαυτό τους αλλά και με τον άλλο εκκινητή του ζεύγους. Ενίσχυση του μιτοχονδριακού DNA του C. fasciventris Αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης (PCR, Polymerase Chain Reaction) Η μέθοδος αυτή είναι μια in vitro ενζυμική μέθοδο αναπαραγωγής DNA χωρίς τη μεσολάβηση ζωντανών κυττάρων ή οργανισμών μέσω της οποίας μια συγκεκριμένη περιοχή του γονιδιώματος μπορεί να πολλαπλασιαστεί έως και εκατομμύρια φορές. Σε γενικές γραμμές, η PCR βασίζεται στην επανάληψη βημάτων σε κατάλληλα μηχανήματα (θερμικούς κυκλοποιητές), όπου το υπόστρωμα της αντίδρασης (DNA) αποδιατάσσεται και επαναδιατάσσεται, ενώ στο ενδιάμεσο αυτών των δύο βημάτων πραγματοποιείται υβριδισμός των εκκινητών δίνοντας έτσι το έναυσμα για να προχωρήσει η αντίδραση στη φάση της επιμήκυνσης με τη βοήθεια ενός θερμοανθεκτικού ενζύμου, της Taq πολυμεράσης. Η διαδικασία αυτή πραγματοποιείται σε πολλούς κύκλους (30-40) 67

68 προκειμένου να παραχθούν εκατομμύρια αντίγραφα της επιθυμητής αλληλουχίας (εικόνα 18). Τα αντιδραστήρια που χρησιμοποιήθηκαν για κάθε αντίδραση αναγράφονται στον πίνακα 10. Η DNA πολυμεράση που χρησιμοποιήθηκε ήταν το ένζυμο BIOTAQ από την εταιρία Bioline. Επιπλέον, στην PCR απαραίτητα είναι τα dntps, τα οποία ευθύνονται για το σχηματισμό των νέων κλώνων του επιθυμητού τμήματος κατά την επιμήκυνση, καθώς και κατάλληλο buffer αντίδρασης, αλλά και διάλυμα χλωριούχου μαγνήσιου (MgCl 2 ). Το MgCl 2 κατέχει έναν ιδιαίτερα σημαντικό ρόλο στη διαδικασία της PCR καθώς βοηθάει τη δράση της DNA πολυμεράσης κατά την επιμήκυνση. Η αύξηση της ποσότητας του MgCl 2 αυξάνει τη δράση της πολυμεράσης, μειώνοντας όμως ταυτόχρονα την ειδικότητα της αντίδρασης και το αντίστροφο. Τόσο η DNA πολυμεράση, όσο και τα διαλύματα buffer και MgCl 2 που χρησιμοποιήθηκαν προέρχονται από το BIOTAQ DNA Polymerase της εταιρείας Bioline. Τα dntps προέρχονται από την εταιρεία Invitrogen (100mΜ dntp Set- PCR Grade). 68

69 Εικόνα 18: Σχηματική απεικόνιση του κύκλου της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR) κα η εκθετική αύξηση του τμήματος μέσω αυτής της μεθόδου ( 69

70 Πίνακας 10: Αντιδραστήρια PCR, με τη χρήση του ενζύμου BIOTAQ (Bioline) για την ενίσχυση του DNA του εντόμου C. fasciventris, με τις αρχικές και τελικές τους συγκεντρώσεις. Αντιδραστήρια Αρχική Συγκέντρωση Τελική συγκέντρωση Ποσότητες για μια αντίδραση Buffer solution 10x 1X 2,5μl MgCl 2 50 mm 1,5 mm 0,75 μl dntps 2,5 mm 200 μμ 2 μl F primer 25 pmol/ml 0,5 pmol/ml 0,5 μl R primer 25 pmol/ml 0,5 pmol/ml 0,5 μl DNA Polymerase ddh 2 O DNA Τελικός όγκος 5 Unit/ μl 1 Unit/ αντίδραση 0,2 μl 17,55 μl 1 μl 25 μl Τα στάδια της PCR είναι τα εξής: Αρχική αποδιάταξη του DNA στους 94 ο C για 3 λεπτά (Initialization step). Προετοιμάζει την αντίδραση, θέτοντας τη θερμοκρασία στο μηχάνημα υψηλή. Αποδιάταξη του DNA στους 94 ο C για 45 δευτερόλεπτα (Denaturation step) Οι δύο αλυσίδες του DNA αποχωρίζονται με υψηλή θερμοκρασία εξαιτίας της διάσπασης των δεσμών υδρογόνου μεταξύ των αζωτούχων βάσεων που τις συγκρατούν (εικόνα 18). Υβριδισμός εκκινητών (Annealing step). Σύνδεση των εκκινητών στα συπληρωματικά τους τμήματα πάνω στο DNA σε θερμοκρασία που εξαρτάται από τον εκκινητή και χρησιμοποιείται για διάστημα 30 δευτερολέπτων. Πιο αναλυτικά, η θερμοκρασία μειώνεται και είναι τόσο χαμηλή ώστε να επιτραπεί η υβριδοποίηση των εκκινητών με τον κλώνο, αλλά αρκετά υψηλή ώστε η σύνδεση να είναι ειδική (εικόνα 18). Επιμήκυνση των εκκινητών στους 72 ο C για 60 δευτερόλεπτα (Elongation step). Η DNA πολυμεράση χρησιμοποιεί τα dntps, προσθέτοντας συμπληρωματικές βάσεις στις μονόκλωνες αλυσίδες DNA, με σκοπό την επέκταση των ολιγονουκλεοτιδικών ακολουθιών και τη σύνθεση νέων κλώνων. Η θερμοκρασία αυτού του σταδίου καθορίζεται από τη βέλτιστη δραστικότητα της DNA πολυμεράσης (εικόνα 18). Τα στάδια 2 έως 4 επαναλαμβάνονται όσες φορές έχει οριστεί για την ενίσχυση του επιθυμητού τμήματος. Αποτελούν τους «κύκλους» της PCR, δηλαδή το πόσες φορές θα πραγματοποιηθεί η σύνδεση των εκκινητών και στη συνέχεια η επιμήκυνσή τους. Καθώς η διαδικασία επαναλαμβάνεται, οι νεοσυντιθέμενοι κλώνοι χρησιμοποιούνται ως εκμαγεία για τη σύνθεση του DNA, με αποτέλεσμα έπειτα από κάθε κύκλο να 70

71 παράγονται νέα μόρια της υπό ενίσχυση αλληλουχίας. Οι κύκλοι συνήθως ορίζονται σε και στην παρούσα διπλωματική εργασία ορίστηκαν στους 40. Ακολουθεί ένα στάδιο των 7 λεπτών στους 72 ο C, δηλαδή το στάδιο της τελικής επιμήκυνσης (Final elongation) που εξασφαλίζει ότι κάθε μονόκλωνο μόριο DNA έχει επεκταθεί σε όλο το μήκος του (Εικόνα 18). Τέλος, τα δείγματα μπορούν να παραμείνουν στους 8 ο αποθηκευτούν στο ψυγείο ή στην κατάψυξη. C συνήθως μέχρι να Στην παρούσα μελέτη για την αντίδραση της PCR χρησιμοποιήθηκε ο θερμικός κυκλοποιητήςτο Lab Cycler της εταιρείας SensoQuest. Σε κάθε αντίδραση χρησιμοποιήθηκαν διαφορετικές συνθήκες στο θερμικό κυκλοποιητή, όπως ορίζουν τα πρωτόκολλα κάθε εταιρίας. Στον πίνακα 11 παρουσιάζονται οι συνθήκες PCR, οι οποίες εφαρμόστηκαν με τη χρήση του ενζύμου BIOTAQ (Bioline). Πίνακας 11: Συνθήκες ενίσχυσης των τμημάτων του μιτοχονδριακού DNA του C. fasciventris με τη χρήση του ενζύμου BIOTAQ (Bioline) Θερμοκρασία Χρονική διάρκεια Στάδιο 94 ο C 3 min Αρχική αποδιάταξη 94 ο C 45sec Αποδιάταξη 50 ο 59 ο C 30sec 40 κύκλοι Σύνδεση εκκινητή 72 ο C 60sec Επιμήκυνση 72 ο C 7min 8 ο C 5min Διατήρηση Η διαδικασία ενίσχυσης μέσω της μεθόδου της PCR πραγματοποιήθηκε για όλα τα τμήματα του DNA, τα οποία συνολικά συνθέτουν ολόκληρο το μιτοχονδριακό DNA του είδους C. fasciventris, με τη βοήθεια 27 ζευγών εκκινητών. Εκτός από το δείγμα DNA που ενισχύονταν κάθε φορά με τη μέθοδο της PCR, χρησιμοποιούνταν και ένας αρνητικός μάρτυρας, ένα δείγμα δηλαδή που περιείχε όλα τα αντιδραστήρια, αλλά δεν περιείχε DNA. Στόχος του αρνητικού μάρτυρα είναι να καταδείξει ότι δεν υπάρχουν επιμολύνσεις στα αντιδραστήρια που χρησιμοποιούνται και επομένως δεν υπάρχουν ψευδώς θετικά αποτελέσματα. Ανάλυση ενισχυμένων τμημάτων σε πηκτή αγαρόζης Πριν τη χρήση του PCR product σε περαιτέρω εφαρμογές, πρέπει να ελεγχθεί ως προς κάποιες παραμέτρους, ώστε να πιστοποιηθεί η ποιότητα του. Αρχικά, θα πρέπει να εξακριβωθεί ότι έχει σχηματιστεί προϊόν καθώς όλες οι αντιδράσεις PCR δεν είναι 71

72 επιτυχείς και οι κύριες αιτίες μπορεί να είναι η ποιότητα του DNA ή οι εκκινητές να μην είναι συμπληρωματικοί με το DNAστόχο. Ακόμη, μπορεί να οφείλεται σε κάποιο λανθασμένο χειρισμό κατά τη διάρκεια προετοιμασίας της αντίδρασης (μη αποστειρωμένο περιβάλλον) που μπορεί να οδηγήσει στην είσοδο DNA που θα προέρχεται από το περιβάλλον, γνωστό και ως παράγοντας επιμόλυνσης. Έτσι, στην αντίδραση εκτός από το επιθυμητό προϊόν θα υπάρχει και το άγνωστο DNA, στο οποίο θα είναι συμπληρωματικοί οι εκκινητές, οπότε με τη μέθοδο της PCR θα ενισχυθεί και τμήμα από αυτό. Στη συνέχεια, θα πρέπει το προϊόν να έχει το σωστό μέγεθος, καθώς υπάρχει πιθανότητα ένας ή και δύο εκκινητές να ταιριάζουν σε επιπλέον ακολουθίες του DNA που ενισχύεται, με αποτέλεσμα το προϊόν που θα προκύψει να έχει διαφορετικό μέγεθος από το αναμενόμενο. Τέλος, θα πρέπει να ελεγχθεί ότι από κάθε αντίδραση παράγεται ένα μοναδικό προϊόν. Στην περίπτωση που οι εκκινητές προσδεθούν και σε άλλες περιοχές του DNA, τότε θα ενισχυθούν περισσότερες από μια ακολουθίες. Ο έλεγχος των αλληλουχιών που ενισχύθηκαν από τις PCR, όπου χρησιμοποιήθηκαν τα ζεύγη εκκινητών για να πολλαπλασιαστούν τα γονίδια του μιτοχονδριακού γονιδιώματος του C. fasciventris, έγινε με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης περιεκτικότητας 0,8% (w/v), η οποία παρασκευάζεται με τον ίδιο τρόπο που περιγράφηκε στην ηλεκτροφόρηση της πέψης. Σε κάθε πηγαδάκι της πηκτής φορτώνεται μικρή ποσότητα από το προϊόν της PCR αναμειγμένη με 1μl χρωστικής και ddh 2 O, ώστε ο τελικός όγκος που θα φορτωθεί να είναι 10 μl, και σε ένα διαδοχικό πηγαδάκι ο αντίστοιχος αρνητικός μάρτυρας (εικόνα 19). Εκτός από τα δείγματα, στο gel φορτώνεται και κατάλληλος DNA μάρτυρας μοριακών βαρών (ladder) για τον υπολογισμό του μοριακού βάρους και της ποσότητας του DNA των δειγμάτων. Ο μάρτυρας που χρησιμοποιήθηκε ήταν ο puc Mix (8) της εταιρείας Fermentas. Εικόνα 19: «Φόρτωση» δειγμάτων σε με πηκτή αγαρόζης ( 72

73 Η ηλεκτροφόρηση πραγματοποιήθηκε στα 100 volt, 50 Watt για χρονικό διάστημα περίπου 25 λεπτών. Έπειτα η πηκτή τοποθετείται σε κατάλληλο μηχάνημα για τη λήψη της φωτογραφίας. Η χρωστική, άρα και τα νουκλεϊκά οξέα στα οποία είναι συνδεδεμένη, είναι ορατά στο μπλε φως του μηχανήματος. Με αυτό τον τρόπο έγιναν ορατές οι ζώνες του DNA που ενισχύθηκαν μέσω των PCR (εικόνα 20). Εικόνα 20: Εξέταση της πηκτής αγαρόζης σε υπεριώδες φως και φωτογράφηση της από ειδικό φωτογραφικό μηχάνημα.( Πίνακας 12: Ποσότητες του προϊόντος της PCR, της χρωστικής, του νερού και του ladder που χρησιμοποιήθηκαν για να φορτωθούν στην πηκτή αγαρόζης. Ηλεκτροφόρηση PCR σε πηκτή αγαρόζης 0,8% Θέση φόρτωσης προϊόντος PCR Θέση φόρτωσης ladder DNA 2 μl - ddh 2 O 7 μl - Διάλυμα φόρτωσης (χρωστική) 1 μl - Ladder PUC ng Προετοιμασία αλληλούχισης Τα PCR προϊόντα που προέκυψαν με τη χρήση των 27 ζευγών εκκινητών, στάλθηκαν για αλληλούχιση. Η προετοιμασία των δειγμάτων έγινε με βάση τις οδηγίες της εταιρείας Macrogen Inc, που πραγματοποίησε την αλληλούχιση. Σύμφωνα με αυτές κάθε σωλήνας έπρεπε να περιέχει 5 μl PCR product συγκέντρωσης 50 ng/μl και 5 μl εκκινητή, ο οποίος έχει ενισχύσει το συγκεκριμένο προϊόν συγκέντρωσης 10 pmole/μl. Σε κάθε περίπτωση η συγκέντρωση των PCR products υπολογίστηκε συγκριτικά με βάση τις γνωστές συγκεντρώσεις των ζωνών του μάρτυρα που χρησιμοποιήθηκε και σε κάθε ηλεκτροφόρηση 73

74 (εικόνα 21). Κάθε ένα από τα PCR product αλληλουχήθηκε με τον εκκινητή Forward (F) και με τον Reverse (R). Εικόνα 21: Μάρτυρας puc Mix (8) της εταιρείας Fermentas, που χρησιμοποιήθηκε για τη σύγκριση των προιόντων που προέκυψαν από την PCR. Απεικονίζεται το μέγεθος τους (bp) και η συγκέντρωση της κάθε βάσης (ng/μg) για την ποσοτικοποίηση των PCR products. ( 2.6 Βιοπληροφορική ανάλυση της αλληλουχίας Τα αποτελέσματα από την αλληλούχιση των προϊόντων πολυμερισμού αναλύθηκαν μέσω του πακέτου BLAST/NCBI tool ( με απώτερο σκοπό να βρεθεί η πιθανή ομολογία τους με άλλες αλληλουχίες, οι οποίες είναι ήδη κατατεθειμένες σε βάσεις δεδομένων. Για τα διαβάσματα της αλληλούχισης χρησιμοποιήθηκε το πρόγραμμα Chromas, το οποίο και φανέρωσε την νουκλεοτιδική αλληλουχία κάθε τμήματος αλλά και την ποιότητα του διαβάσματος κάθε βάσης. Σε κάθε τμήμα αποκόπηκαν οι 3 και 5 άκρες των διαβασμάτων, των οποίων το διάβασμα δεν ήταν καλό. Τα διαβάσματα του Forward (F) και του Reverse (R) εκκινητή στοιχήθηκαν και συγκρίθηκαν μέσω του προγράμματος Merger EMBOSS ( με στόχο να προκύψει μια κοινή, διπλά διαβασμένη αλληλουχία. Παρ όλα αυτά σε κάποιες θέσεις παρατηρήθηκε ασυμφωνία βάσεων, σε αυτές τις περιπτώσεις ελέγχθηκε η ποιότητα των βάσεων από το πρόγραμμα Chromas και στην κάθε θέση επιλέχθηκε η βάση με την πιο υψηλή ποιότητα διαβάσματος. Τέλος, ακολούθησε σύνδεση των διαδοχικών διαβασμάτων μεταξύ τους στη θέση των επικαλυπτόμενων αλληλουχιών. 74

75 Η βιοπληροφορική μελέτη της αλληλουχίας του μιτοχονδριακού γονιδιώματος πραγματοποιήθηκε μέσω του προγράμματος Standard Nucleotide BLAST/ NCBI tool ( για τη σύγκριση με τις υπόλοιπες γνωστές αλληλουχίες του C. capitata. Επίσης, έγινε χρήση και του προγράμματος Clustal Omega ( για την ευθυγράμμιση των αλληλουχιών και τον εντοπισμό των πρωτεϊνικών γονιδίων, των rrnas και των trnas. Τα πρωτεϊνικά γονίδια μεταφράστηκαν με το πρόγραμμα Transeq-EMBOSS ( transeq/) και συγκρίθηκαν με τις υπόλοιπες γνωστές πρωτεϊνες μέσω του Standard Protein BLAST / NCBI tool ( Τέλος, για την πρόβλεψη της δευτεροταγούς δομής των trnas γονιδίων χρησιμοποιήθηκαν τα προγράμματα RNAscan- Se ( και MITOS ( 75

76 3. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 3.1 Ανάλυση μιτωτικού καρυοτύπου Η ανάλυση του μιτωτικού καρυοτύπου των μεταφασικών χρωμοσωμάτων του είδους C. fasciventris έδειξε ότι σε αυτό εντοπίζονται συνολικά έξι ζεύγη χρωμοσωμάτων εκ των οποίων τα πέντε ζεύγη ανήκουν σε αυτοσωμικά χρωμοσώματα και το ένα ζεύγος σε φυλετικά. Τα φυλετικά χρωμοσώματα έχουν και σε αυτό το είδος υψηλά επίπεδα ετεροχρωματίνης και είναι ΧΧ για τα θηλυκά άτομα και ΧΥ για τα αρσενικά (εικόνα 22α, 22β). Αξίζει να σημειωθεί ότι, το αρσενικό άτομο εμφανίζεται και σε αυτό το είδος όπως και στα υπόλοιπα είδη της συγκεκριμένης οικογένειας ως ετερογαμετικό με καρυότυπο 2n=12,XY. Τα αποτελέσματα αυτά συμφωνούν πλήρως με την εικόνα του μιτωτικού καρυοτύπου του ήδη μελετημένου είδους C. capitata. α. β. Εικόνα 22: α. μιτωτικός καρυοτύπος θηλυκού ατόμου C. fasciventris, β. μιτωτικός καρυοτύπος αρσενικού ατόμου C. fasciventris. Τα αυτοσωμικά χρωμοσώματα μπορεί να διαφέρουν στο μέγεθος τους αλλά και στη θέση του κεντρομέρους τους. Ακλουθώντας το σύστημα αρίθμησης που χρησιμοποιήθηκε από τους Radu, Rossler και Koltin το 1975 για τα μεταφασικά χρωμοσώματα του είδους C. capitata, τα φυλετικά χρωμοσώματα σημειώνονται ως το πρώτο ζεύγος χρωμοσωμάτων του μιτωτικού καρυοτύπου, ενώ τα πέντε ζεύγη αυτοσωμικών χρωμοσωμάτων σημειώνονται με τους αριθμούς 2 έως το 6 κατά σειρά ελατούμενου μεγέθους (Mavragani-Tsipidou et al., 1992). Στο συγκεκριμένο είδος όλα τα αυτοσωμικά χρωμοσώματα εμφανίζονται υπομετακεντρικά (εικόνα 23). Το χρωμόσωμα Χ είναι μικρότερο σε μέγεθος από τα αυτοσωμικά χρωμοσώματα και πολύ μεγαλύτερο από το Υ που εμφανίζεται με τη μορφή δύο μικρών τελείων. Το χρωμόσωμα Χ εμφανίζεται υπομετακεντρικό (εικόνα 22α). Επιπλέον, όπως και σε όλα τα άλλα είδη της οικογένειας Tephritidae που έχουν μελετηθεί 76

77 έως σήμερα έτσι και στο είδος C. fasciventris τo X και το Υ χρωμόσωμα αποτελούντται κατά κύριο λόγο από ετεροχρωματίνη. Εικόνα 23: Αρίθμηση μεταφασικών χρωμοσωμάτων και εντοπισμός κεντρομερών σε μιτωτικό καρυότυπο θηλυκού ατόμου. Τα βέλη δείχνουν τη θέση του κεντρομέρους σε κάθε ένα από τα αυτοσωμικά χρωμοσώματα. 3.2 Ανάλυση πολυταινικών χρωμοσωμάτων και κατασκευή χαρτών Για να πραγματοποιηθεί η ανάλυση των πολυταινικών χρωμοσωμάτων μελετήθηκαν πολλοί διαφορετικοί πολυταινικοί πυρήνες από ένα μεγάλο αριθμό χρωμοσωμικών παρασκευασμάτων, στους οποίους έγινε αναγνώριση των χρωμοσωμάτων. Σύμφωνα με την παρούσα κυτταρογενετική μελέτη του είδους C. fasciventris παρατηρήθηκε ότι στα κύτταρα των σιελογόνων αδένων του εντοπίστηκαν πέντε μεγάλα πολυταινικά χρωμοσώματα, τα οποία αντιστοιχούν στα πέντε αυτοσωμικά χρωμοσώματα του μιτωτικού καρυοτύπου. Η αρίθμηση τους ξεκινά από το 2 έως το 6 κατά αντιστοιχία με τα μεταφασικά αυτοσωμικά χρωμοσώματα. Κάθε ένα από αυτά περιλαμβάνει δύο πολυταινικούς βραχίονες, οπότε σε κάθε πολυταινικό πυρήνα εντοπίζονται συνολικά δέκα πολυταινικοί βραχίονες. Οι δύο πoλυταινικοί βραχίονες κάθε χρωμοσώματος δεν έχουν ίδιο μέγεθος, γεγονός το οποίο συμφωνεί με την εικόνα του μιτωτικού καρυοτύπου. Γενικά, τον πιο μεγάλο σε μέγεθος βραχίονα κάθε πολυταινικού χρωμοσώματος τον ονομάζουμε αριστερό βραχίονα (L), ενώ τον πιο μικρό τον χαρακτηρίζουμε ως δεξιό (R). Κάθε πολυταινικός βραχίονας χωρίζεται σε 20 αριθμημένες περιοχές με σκοπό την καλύτερη μελέτη του. Από το συνδυασμό των πολλών διαφορετικών εικόνων των πολυταινικών χρωμοσωμάτων των πολυταινικών πυρήνων δημιουργήσαμε τους χάρτες των πέντε πολυταινικών χρωμοσωμάτων του υπό μελέτη είδους που παρατίθενται στην εικόνα 26. Αυτά χωρίζονται σε 100 αριθμημένες περιοχές σύμφωνα με τον χάρτη των πολυταινικών χρωμοσωμάτων του είδους C. capitata. Επιπροσθέτως, ούτε σε αυτό το είδος της οικογένειας Tephritidae δεν 77

78 παρατηρήθηκε πολυταινισμός των φυλετικών χρωμοσωμάτων. Τα φυλετικά χρωμοσώματα εμφανίστηκαν με τη μορφή ετεροχρωματινικού δικτύου γεγονός το οποίο ενισχύει την ετεροχρωματινική τους φύση (εικόνα 24). Στο συγκεκριμένο είδος το μέγεθος και η ποσότητα της κεντρομερικής ετεροχρωματινικής μάζας εμφανίζεται περιορισμένη, οπότε και το κεντρομέρος (C) κάθε βραχίονα δεν είναι ιδιαίτερα ευδιάκριτο (εικόνα 24 και 25). Οι παρατηρήσεις αυτές σχετικά με το μέγεθος και τη μορφή των κεντρομερών συμφωνούν απόλυτα με τα αποτελέσματα που διεξήχθηκαν από την ανάλυση των πολυταινικών χρωμοσωμάτων του είδους C. capitata (Zacharopoulou et al., 1989). Εικόνα 24: Πολυταινικός πυρήνας από κύτταρα σιελογόνου αδένα του είδους C. fasciventris με περιορισμένη ετεροχρωματινική περιοχή. Σε μεγέθυνση εμφανίζεται η ετεροχρωματινική μάζα που αντιστοιχεί στα φυλετικά χρωμοσώματα. 78

79 Εικόνα 25: Κεντρομερικές περιοχές σύνδεσης βραχιόνων σε πολυταινικούς πυρήνες του είδους C. fasciventris: α. σύνδεση κεντρομερών των βραχιόνων 5R, 5L και 3R, β. σύνδεση κεντρομερών των δύο βραχιόνων (4R και 4L) του τέταρτου πολυταινικού χρωμοσώματος 79

80 Εικόνα 26: Χάρτης πολυταινικών χρωμοσωμάτων του είδους C. fasciventris. Χρωμόσωμα 2 (περιοχές 1-20) Πιο αναλυτικά, το χρωμόσωμα 2 μπορεί να αναγνωρισθεί εύκολα λόγω της χαρακτηριστικής μορφολογίας των άκρων (tips) τόσο του δεξιού (2R) όσο και του αριστερού βραχίονα (2L). Αξίζει να αναφερθεί ότι, το άκρο του βραχίονα 2L εντοπίζεται διογκωμένο (puffs) στην πλειοψηφία των πολυταινικών πυρήνων που παρατηρήθηκαν στο οπτικό μικροσκόπιο. Επιπλέον, ο αριστερός βραχίονας, 2L (περιοχές 1-11) είναι μεγαλύτερος από τον δεξί βραχίονα, 2R (περιοχές 12-20), ενώ χαρακτηριστική θεωρείται η ασύναψη που εντοπίζεται με μεγάλη συχνότητα στις περιοχές 4 5 του 2L βραχίονα (εικόνα 27). 2L Εικόνα 27: Ασύναψη στον πολυταινικό βραχίονα 2L του είδους C. fasciventris. 80

81 Χρωμόσωμα 3 (περιοχές 21-40) Στο τρίτο πολυταινικό χρωμόσωμα του είδους C. fasciventris ο αριστερός βραχίονας, 3L (περιοχές 21-35) είναι κατά πολύ μεγαλύτερος από τον δεξί βραχίονα, 3R (περιοχές 36-40). Η ανάλυση του αριστερού βραχίονα (3L) είναι ιδιαίτερα δύσκολη κυρίως εξαιτίας των θραύσεων που παρατηρήθηκαν σε πολλά σημεία. Ιδιαίτερο χαρακτηριστικό του βραχίονα 3L θεωρούνται οι δύο διογκώσεις (puffs) που εντοπίζονται στις περιοχές 27 και 28 αλλά και η μικρής έκτασης ασύναψη που παρατηρείται στην περιοχή 29 (εικόνα 26). Αντιθέτως, ο δεξιός βραχίονας 3R αναγνωρίζεται εύκολα εξαιτίας του χαρακτηριστικού του tip, του καλού ζωνικού προτύπου που εμφανίζει καθώς δεν υπάρχουν θραύσεις κατά μήκος του, αλλα και εξαιτίας του μικρού του μεγέθους. Χρωμόσωμα 4 (περιοχές 41-60) Στο χρωμόσωμα αυτό ο αριστερός βραχίονας, 4L (περιοχές 41-51) είναι μεγαλύτερος από το δεξί βραχίονα, 4R (περιοχές 52-60), ενώ τα άκρα (tips) και των δύο χρωμοσωμάτων θεωρούνται ιδιαίτερα χαρακτηριστικά και συντηρημένα ανάμεσα στα είδη της αυτής της οικογένειας. Πιο συγκεκριμένα, η αναγνώριση του βραχίονα 4R θεωρείται ιδιαίτερα εύκολη εξαιτίας του χαρακτηριστικού tip του, αλλά και λόγω των δύο χαρακτηριστικών διογκώσεων (puffs) που εμφανίζονται στις περιοχές 55 και 57 (εικόνα 26). Αλλά και ο βραχίονας 4L ταυτοποιείται με ευκολία λόγω του χαρακτηριστικού προτύπου ζωνώσεων του και ιδιαίτερα της περιοχής 48 (εικόνα 26). Χρωμόσωμα 5 (περιοχές 61-80) Το χρωμόσωμα αυτό αποτελείται επίσης από δύο άνισους σε μέγεθος βραχίονες, με τον αριστερό βραχίονα, 5L (περιοχές 61-72) να εμφανίζεται αρκετά μεγαλύτερος από τον δεξιό, 5R (περιοχές 73-80). Γενικά, η αναγνώριση και η χαρτογράφηση του αριστερού βραχίονα θεωρείται δύσκολή εξαιτίας του μεγάλου μεγέθους του και των πολλών θραύσεων που παρατηρήθηκαν κατά μήκος του. Ιδιαίτερα χαρακτηριστικό θεωρείται το πρότυπο ζωνώσεων στην περιοχή 72, αλλά και στην περιοχή 71 (εικόνα 26), στοιχεία που οδήγησαν στην αναγνώριση του συγκεκριμένου βραχίονα. Ο δεξιός βραχίονας του πέμπτου χρωμοσώματος (5R) εμφανίζεται ιδιαίτερα συντηρημένος ανάμεσα στα ήδη μελετημένα είδη αυτής της οικογένειας με χαρακτηριστικό αρχικό άκρο (tip) αλλά και πρότυπο ζωνώσεων. Επιπλέον, ιδιαίτερα χαρακτηριστική είναι η θραύση του χρωμοσώματος αυτού στο μέσο της περιοχής 74 (εικόνα 28), εικόνα η οποία εντοπίζεται σε όλους τους πολυταινικούς πυρήνες του είδους C. fasciventris. 81

82 Εικόνα 28: Θραύση (βέλος) στην περιοχή 74 του πολυταινικού βραχίονα 5R της C. fasciventris. Χρωμόσωμα 6 (περιοχές ) Το χρωμόσωμα 6 αποτελεί επίσης ένα καλά συντηρημένο χρωμόσωμα ανάμεσα στα είδη της υπό μελέτης οικογένειας, γι αυτό και στο είδος C. fasciventris εμφανίζεται με χαρακτηριστικό πρότυπο ζωνώσεων τόσο στα άκρα του χρωμοσώματος, όσο και σε όλο το μήκος του. Ο αριστερός βραχίονας, 6L (περιοχές 81-92) είναι μεγαλύτερος από τον δεξιό, 6R (περιοχές ), ενώ χαρακτηριστική είναι η διόγκωση (puff) που παρατηρείται στην περιοχή 99 του βραχίονα 6R (εικόνα 26). Επιπλέον, όπως προαναφέρθηκε κάθε ένας από τους δέκα πολυταινικούς βραχίονες διαθέτει χαρακτηριστική μορφολογία τόσο στο αρχικό του άκρο (tip) όσο και στο τελικό, δηλαδή στο κεντρομέρος του (C). Αξίζει να σημειωθεί ότι το αρχικό άκρο του κάθε βραχίονα μπορεί να εμφανίζεται με κάποιες διαφοροποιήσεις, οι οποίες εξαρτώνται από το αναπτυξιακό στάδιο του εντόμου (προνύμφη ή νύμφη) που απομονώθηκαν οι πολυταινικοί πυρήνες (εικόνα 29). α. 82

83 β. Εικόνα 29: Διαφορετικές μορφές των tips των βραχιόνων α. 2R, και β. 4L της C. fasciventris. Ακόμη, σε πολλούς πολυταινικούς πυρήνες παρατηρήθκε ότι τα tips των πολυταινικών βραχιόνων 3R και 5R εντοπίζονταν πάντα το ένα ενωμένο με το άλλο (εικόνα 30). Εικόνα 30: Ένωση tips (βέλος) των πολυταινικών βραχιόνων 3R 5R σε δύο διαφορετικούς πολυταινικούς πυρήνες της C. fasciventris. 3.3 Εντοπισμός γονιδίων με in situ σε πολυταινικά χρωμοσώματα του είδους C. fasciventris. Στην παρούσα εργασία έγινε προσπάθεια χαρτογράφησης 4 ανιχνευτών, οι οποίοι αντιστοιχούν σε γονιδιακούς τόπους (Πίνακας 13) στα πολυταινικά χρωμοσώματα σιαλογόνων αδένων του εντόμου C. fasciventris, με τη μέθοδο του υβριδισμού in situ. Οι απομονωμένες ακολουθίες DNA που χρησιμοποιήθηκαν ως ανιχνευτές προέρχονται από τα είδη B. oleae, B. tryoni και C. capitatα. Για τον εντοπισμό της θέσης των τριών εκ των τεσσάρων ανιχνευτών στα πολυταινικά χρωμοσώματα σιαλογόνων αδένων του C. fasciventris ορίστηκε θερμοκρασία υβριδισμού 60 C, ενώ για τον εντοπισμό της θέσης του ανιχνευτή για το γονίδιο white, η θερμοκρασία υβριδισμού ορίστηκε στους 52 ο C (Πίνακας 13). Παράλληλα, σε όλα τα πειράματα έγινε υβριδισμός σε παρασκευάσματα πολυταινικών χρωμοσωμάτων του B. oleae με τον ανιχνευτή του γονιδίου hsp70 ή του sxl, η θέση υβριδισμού των οποίων είναι γνωστή στο δάκο, ώστε να γίνει έλεγχος των συνθηκών υβριδισμού. Το σήμα της υβριδοποίησης εμφανίζεται με τη μορφή μιας έντονης διακριτής ζώνης πάνω σε συγκεκριμένες ζώνες των πολυταινικών χρωμοσωμάτων. Η αναγνώριση 83

84 των θετικών σημάτων πραγματοποιήθηκε έπειτα από παρατήρηση στο μικροσκόπιο και φωτογράφηση τουλάχιστον 10 πολυταινικών πυρήνων που φέρουν το σήμα. Ως θετικά χαρακτηρίστηκαν τα σήματα που εντοπίστηκαν στο μεγαλύτερο ποσοστό των πυρήνων του παρασκευάσματος. Πίνακας 13: Θέσεις υβριδισμού αλληλουχιών στα πολυταινικά χρωμοσώματα σιαλογόνων αδένων του C. fasciventris. Γονίδια hsp 70 sex lethal scarlet white Οργανισμός προέλευσης Θέση υβριδισμού C. fasciventris Θερμοκρασία υβριδισμού C. capitata 26, 3L arm 60 ο C B. oleae 79, 5R arm 60 ο C B. tryoni 83, 6L arm 60 ο C B. tryoni 67, 5L arm 52 ο C Πιο αναλυτικά, ο ανιχνευτής του γονιδίου hsp70 που προέρχεται από το είδος C. capitata υβριδίστηκε στην περιοχή 26C του βραχίονα 3L του τρίτου χρωμοσώματος του είδους C. fasciventris (εικόνα 31). Εικόνα 31: Υβριδισμός του γονιδίου hsp70 στα πολυταινικά χρωμοσώματα σιαλογόνων αδένων του C. fasciventris. Με βέλη σημειώνονται τα σήματα υβριδισμού όπως παρατηρούνται στο οπτικό μικροσκόπιο. 84

85 Ο ανιχνευτής του γονιδίου sxl, ο οποίος προέρχεται από το είδος B. oleae υβριδίστηκε στην περιοχή 79B του βραχίονα 5R του πέμπτου χρωμοσώματος του είδους C. fasciventris (εικόνα 32). Εικόνα 32: Υβριδισμός του γονιδίου sxl στα πολυταινικά χρωμοσώματα σιαλογόνων αδένων του C. fasciventris. Με βέλη σημειώνονται τα σήματα υβριδισμού όπως παρατηρούνται στο οπτικό μικροσκόπιο. Ο ανιχνευτής του γονιδίου scarlet, ο οποίος προέρχεται από το είδος B. tryoni υβριδίστηκε στην περιοχή 83A του βραχίονα 6L του έκτου χρωμοσώματος του είδους C. fasciventris (εικόνα 33). 85

86 Εικόνα 33: Υβριδισμός του γονιδίου scarlet στα πολυταινικά χρωμοσώματα σιαλογόνων αδένων του C. fasciventris. Με βέλη σημειώνονται τα σήματα υβριδισμού όπως παρατηρούνται στο οπτικό μικροσκόπιο Ο ανιχνευτής του γονιδίου white, ο οποίο προέρχεται επίσης από το είδος B. tryoni υβριδίστηκε στην περιοχή 67B του βραχίονα 5L του πέμπτου χρωμοσώματος του είδους C. fasciventris (εικόνα 34). Εικόνα 34: Υβριδισμός του γονιδίου white στα πολυταινικά χρωμοσώματα σιαλογόνων αδένων του C. fasciventris. Με βέλη σημειώνονται τα σήματα υβριδισμού όπως παρατηρούνται στο οπτικό μικροσκόπιο 3.4 Μιτοχονδριακό Γονιδίωμα του C. fasciventris Εύρεση της αλληλουχίας του mtdna του C. fasciventris Για την εύρεση της αλληλουχίας του μιτοχονδριακού γονιδιώματος του C. fasciventris έγινε ενίσχυση επικαλυπτόμενων τμημάτων με τη χρήση ολικού γονιδιωματικού DNA του είδους με τη μέθοδο της αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης (PCR). Το μιτοχονδριακό γονιδίωμα διαιρέθηκε σε 27 τμήματα, τα οποία ενισχύθηκαν με τη χρήση εκκινητών που σχεδιάστηκαν στο εργαστήριο βάση της ήδη γνωστής κατατεθειμένης αλληλουχίας του μιτοχονδριακού γονιδιώματος του είδους C. capitata (Accession number: AJ ). Οι αλληλουχίες τους καθώς και οι θερμοκρασίες δράσης των εκκινητών για το υπό μελέτη είδος σε κάθε περίπτωση, φαίνονται στον πίνακα

87 Πίνακας 14: Ακολουθίες των εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα μελέτη. Ζεύγος Όνομα εκκινητή Θέση σύνδεσης εκκινητή Εκκινητές (FORWARD - REVERSE) Αλληλουχία εκκινητή 1 ο 1F Cc 354F 5 -CAATCTCTTCTAATTCCTGATTAGG-3 1R Cc1056R 5 -AATCCAATAAATGGGGGTAATCC-3 2 ο 2F Cf819F 5 -TTCTCTTCTATCAATCATTTAGG-3 2R Cf1662R 5 -TTAGTGCTCCTGGGTGAC-3 3 ο 3F Cc1508F 5 -CTAAACTTCAGCCATTTAATCGC-3 3R Cc2214R 5 -GGTATAAAATAGGGTCTCCTCC-3 4 ο 4F Cc2020F 5 -CAGTAATTAATATACGATCTACCG-3 4R Cc2849R 5 -ATAGTCTGAATATCGCCGAGG-3 5 ο 5F Cc2660F 5 -TTTATCAATAGGAGCAGTATTTGC-3 5R Cc3387R 5 -ATAACCGAAGAGAAGGAAAAGC-3 6 ο 6F Cf3162F 5 -CTCCAAGATAGAGCTTCACC-3 6R Cf4082R 5 -TAGGGGATTGAGGAATTACTG-3 7 ο 7F Cc3826F 5 -TTTTAATCATTAGATGACTGAAAGC-3 7R Cc4651R 5 -AAGTAAGAAGAAGATGTCCTGC-3 8 ο 8F Cc4451F 5 -TACCTCTTTGATTATGTTTTATGC-3 8R Cc5047R 5 -CGTAAACCTAATGTGACTGG-3 9 ο 9F Cf4876F 5 -GTGCTATAACATCCGTTTCAGG-3 9R Cf5820R 5 -GATCAAAACCGCATTCAAATGG-3 10 ο 10F Bd5623F 5 -ATTTGACTTCCAATCATAAGGTC -3 10R Bd6439R 5 -GCTTAAAATAGAGCATAACACTG-3 11 ο 11F Cf6260F 5 -TTTATCTTTTAATGGTTAAACTCC-3 11R Cf7015R 5 -TAACGGTTTGTTATTCTTTTCG-3 12 ο 12F Cc6909F 5 -TCCCCGTAATATAATTCAACCC-3 12R Cc7736R 5 -GGAGATGTCGCTTTTTTATTAGC-3 13 ο 13F Cc7520F 5 -AATGAACCAAAGCAGAAACTGG-3 13R Cc8363R 5 -CATTTAGTGGGGGAAATATTCG-3 14 ο 14F Cf8197F 5 -GAATAATTCATATCATTGACACCAC-3 14R Cc9131R 5 -TTAGTTTCTTTACCTTTATTAGTAGG-3 15 ο 15F Cc8948F 5 -TTATTGACCCAGATACAGGAGC-3 15R Cc9691R 5 -GAGTATGTGAAGGTGCTTTAGG-3 16F Cc9543F 5 -AACCTTGTATAAAACAAATAGGAC-3 16 ο 16R Cc10251R 5 -CATTAGATGCCAAAGATGTAAC-3 Μέγεθος τμήματος που ενισχύεται Θερμοκρ ασία -Tm annealing (BIOTAQ) 702 bp 53 o C 843 bp 50 o C 706 bp 56 o C 829 bp 54 ο C 727 bp 54 ο C 920 bp 51 ο C 825 bp 54 o C 596 bp 53 o C 944 bp 52 o C 817 bp 53 ο C 755 bp 50 ο C 827 bp 54 ο C 843 bp 55 ο C 934 bp 52 ο C 743 bp 53 ο C 708 bp 53 o C 17 ο 17F Cf10075F 5 -TTATTCAAATAAATCATCCTCTAGC-3 17R Cf10808R 5 -CCGTTAGCGTGTATAGTTCG bp 52 o C 18 ο 18F Cc10702F 5 -CCTTGCTATACATTACACAGC-3 18R Cc11427R 5 -ATTACTCCTCCTAGTTTATTAGG bp 54 o C 19 ο 19F Cf11289F 5 -ATCCTTATTTACTAGGTGATCCAG-3 19R Cf12090R 5 -AAGGTGAATCTGAATTAGTATCAGG3 801 bp 53 ο C 20 ο 20F Cc11861F 5 -TAACGAAAACGAGGTAAAGTCCC-3 20R Bd12620R 5 -TTTTGGAACGGAAGGTTCTAGG bp 55 o C 21 ο 21F Bd12529F 5 -CGCATCACAAAAAGGTTGAGG-3 21R Bd13213R 5 -AGACGAGAAGACCCTATAAATC bp 55 ο C 22 ο 22F Bd13004F 5 -TCTCCAAAAAAATTACGCTGTTATCCC bp 55 ο C 87

88 22R Bd13929R 5 -ATTGTACCTTGTGTATCAGGGTTTATC-3 23 ο 23F Cf13500F 5 -ATACTTTAACATTACAAAACTTTAGAC-3 23R Cf14399R 5 -GCTTATGTTTAAGAAGAGATGG-3 24 ο 24F Cc14238F 5 -ACCTTAATAGTAAGAGTGACGG-3 24R Cc14814R 5 -GTTAAATTTGTGCCAGCATCC-3 25 ο 25F Cf14576F 5 -GTTTCAAGAACATAACTAATACTACC-3 25R Cf15658R 5 -CAAATTGTTATTTATTTCAGAATTTTAGG-3 26 ο 26F Cc15083F 5 -AAAATTTAGGTATCTCCTTCCC-3 26R Cc15798R 5 -AATGCCAATATAGACATTTCCG-3 27 ο 27F Cc15773F 5 -CTCTCGGAAATGTCTATATTGG-3 27R Cc509R 5 -CAAACAATAAAACAGCAGATGC bp 50 ο C 576 bp 54 o C 1082 bp 49 o C 715 bp 56 ο C 56 ο C Στη συνέχεια, τα προϊόντα ηλεκτροφορήθηκαν σε πηκτή αγαρόζης 0,8 % (w/v), για να προσδιοριστεί το μέγεθος της ζώνης (bp) που δίνουν, η ποσότητα της ζώνης (ng/μg) αλλά και η ποιότητα της. Κάποια από τα τμήματα που προέκυψαν από την ενίσχυση του μιτοχονδριακού γονιδιώματος αντιπροσωπεύονταν από μια ισχυρή ζώνη και είχαν το αναμενόμενο μέγεθος (εικόνα 35). Αξίζει να σημειωθεί το γεγονός ότι δεν ήταν πολλά τα τμήματα που ενισχύθηκαν και έδωσαν καθαρά προϊόντα με τη χρήση των θερμοκρασιών για τον υβριδισμό των εκκινητών που ορίστηκε από την εταιρία παρασκευής τους (IDT) καθώς και με τη χρήση των καθορισμένων συγκεντρώσεων των αντιδραστηρίων. Αντιθέτως, αρκετές ήταν οι περιπτώσεις προβληματικών ηλεκτροφoρήσεων, οι οποίες έδιναν είτε καμία ζώνη (εικόνα 36-3) είτε περισσότερες από μία ζώνες (εικόνα 36-1) είτε αχνές ζώνες (εικόνα 35-5). Εικόνα 35: Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης 0,8% (w/v). Προϊόντα πολυμερισμού τμημάτων του μιτοχονδριακού DNA του είδους C. fasciventris. 1: με το ζεύγος εκκινητών 8F 8R, 3: με το ζεύγος 16F - 16R, 5: με το ζεύγος 17F 17R, 2,4,6 αντιδράσεις αρνητικού ελέγχου για την ενίσχυση των τμημάτων που απεικονίζονται στη φωτογραφία ηλεκτροφόρησης. Ladder, puc Mix Marker 8: μάρτυρας μοριακών βαρών 100bp της εταιρίας Fermentas. 88

89 Εικόνα 36: Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης 0,8% (w/v). Προϊόντα πολυμερισμού τμημάτων του μιτοχονδριακού DNA του είδους C. fasciventris. 1: με το ζεύγος εκκινητών 9F 9R παρουσιάζει παραπροϊόντα, 3: με το ζεύγος 13F - 13R το οποίο στις συγκεκριμένες συνθήκες δεν ενίσχυσε κάποιο τμήμα, 2,4, αντιδράσεις αρνητικού ελέγχου για την ενίσχυση των τμημάτων που απεικονίζονται στη φωτογραφία ηλεκτροφόρησης. Ladder, puc Mix Marker 8: μάρτυρας μοριακών βαρών 100bp της εταιρίας Fermentas. Στα περισσότερα τμήματα πραγματοποιήθηκαν πολλές δοκιμές όσον αφορά τη θερμοκρασία υβριδισμού ή τη συγκέντρωση του MgCl 2. Όταν η ζώνη του τμήματος ήταν αχνή η αντίδραση πραγματοποιούνταν με τις ίδιες συγκεντρώσεις των αντιδραστηρίων, αλλά η θερμοκρασία υβριδισμού των εκκινητών ελαττωνόταν ώστε να διευκολυνθεί η πρόσδεση των εκκινητών στα συμπληρωματικά τμήματα του μιτοχονδριακού DNA. Αντίθετα, όταν η ηλεκτροφόρηση απεικόνιζε την ενίσχυση επιπλέον τμημάτων, πραγματοποιούνταν αύξηση της θερμοκρασίας υβριδισμού των εκκινητών καθιστώντας πιο αυστηρές τις συνθήκες PCR. Στην περίπτωση που και σε αυτή την περίπτωση δεν υπήρχε το επιθυμητό αποτέλεσμα, ακολούθησε συνδυασμός αυξημένης θερμοκρασίας υβριδισμού με μείωση ή αύξηση της συγκέντρωσης του MgCl 2 τελικής συγκέντρωσης 1, 25 ή 2 mm. Όλα τα δείγματα αλληλουχήθηκαν σε αυτόματο αναλυτή της εταιρίας. Το αποτέλεσμα της αλληλούχισης ενός από τα τμήματα που προέκυψαν απεικονίζονται στην εικόνα 37. Εικόνα 37: Χρωματογράφημα αλληλούχισης τμήματος του μιτοχονδριακού DNA του είδους C. fasciventris. 89

90 Για κάθε τμήμα στοιχήθηκαν τα δύο διαβάσματα, το ένα με τον εκκινητή Forward και άλλο με τον Reverse, με τη χρήση του προγράμματος Merger-EMBOSS έτσι ώστε να προκύψει μια κοινή αλληλουχία. Στην εικόνα 38 παρατίθεται το αποτέλεσμα της ευθυγράμμισης των δύο διαβασμάτων ενός τμήματος του μιτοχονδριακού DNA του είδους C. fasciventris. 8Forward Reverse 1 tgttttatgctttacggatgaattaatcatactcaacatatatttgctca 50 8Forward 1 -ttagtacctcaaggtacacctgcagttttaataccttttatagtatgta 49 8Reverse 51 tttagtacctcaaggtacacctgcagttttaataccttttatagtatgta 100 8Forward 50 ttgaaactattagaaatattatccgaccaggaacattagcagttcgatta 99 8Reverse 101 ttgaaactattagaaatattatccgaccaggaacattagcagttcgatta 150 8Forward 100 gctgctaatataattgcaggacaccttcttcttacccttctaggtaatac 149 8Reverse 151 gctgctaatataattgcaggacaccttcttcttacccttctaggtaatac 200 8Forward 150 tggcccttcactttcaataataattgtttctttattattaattggtcaaa 199 8Reverse 201 tggcccttcactttcaataataattgtttctttattattaattggtcaaa 250 8Forward 200 ttgctttattagttcttgaatcagctgtagctattattcaatcatatgta 249 8Reverse 251 ttgctttattagttcttgaatcagctgtagctattattcaatcatatgta 300 8Forward 250 tttgccgtcttaagaactttatactctagagaagtaaattaatgtcaaca 299 8Reverse 301 tttgccgtcttaagaactttatactctagagaagtaaattaatgtcaaca 350 8Forward 300 cactcaaatcacccatttcatttagttgattatagcccatgacctttaac 349 8Reverse 351 cactcaaatcacccatttcatttagttgattatagcccatgacctttaac 400 8Forward 350 aggagcaattggtgctataacatccgtttcaggtttagtaaaatgatttc 399 8Reverse 401 aggagcaattggtgctataacatccgtttcaggtttagtaaaatgatttc 450 8Forward 400 atcaatatgatatttctttatttcttttaggaaatgttattactatttta 449 8Reverse 451 atcaatatgatatttctttatttcttttaggaaatgttattactatttta 500 8Forward 450 acagtttatcaatgatgacgagatgtatctcgtgaaggaacatttcaagg 499 8Reverse 501 acagtttatcaatgatgacgaga Forward 500 tttacacacccttcc 514 8Reverse Εικόνα 38: Ευθυγράμμιση των Forward και Reverse διαβασμάτων του ζεύγους εκκινητών 8F 8R μέσω του προγράμματος Merger ( Οι κάθετες γραμμές δείχνουν την ομοιότητα των βάσεων μεταξύ των δύο διαβασμάτων. Σε πολλές περιπτώσεις τα δύο διαβάσματα ενός τμήματος είχαν μία ή περισσότερες θέσεις στις οποίες υπήρχε ασυμφωνία βάσεων (εικόνα 39). Σε κάθε τέτοια περίπτωση ήταν αναγκαία η αναζήτηση αυτών των βάσεων στα αντίστοιχα χρωματογραφήματα τους με σκοπό να ελεγχθεί η ποιότητα διαβάσματος κάθε βάσης. Στο τέλος, επιλέγεται η βάση που εμφανίζει την υψηλότερη τιμή για το σχηματισμό της κοινής αλληλουχίας. 90

91 10Forward 1 ataatatttatcttaatttattattacaagagttgtaataatattagctt 50 10Reverse Forward 51 ctattttatcaaaaaaatctttaacagatcgagaaaaatgttcaccattc Reverse Forward 101 gaatgtggatttgaccccaaatcatcttcacggttacctttttctctacg Reverse Forward 151 atttttcttaattacaattatttttttaatttttgatgtagaaattgctt Reverse Forward 201 taattttaccaataattttaattattacaatttcaaatatttttatatga Reverse Forward 251 acttttacttctattatttttattattattttaattattggattatatca Reverse attggataaatca 13 10Forward 301 tgaatgaaatcaaggaatactaaattgatcaaattaaatagggttgtagt Reverse 14 tgaatg-agtcaaggaat--ttaaattttcaaattaaatagggttgtagt 60 10Forward 351 taattataacatttgatttgcattcaaaaagtattgaaattcaatctacc Reverse 61 taattataaca-tccctttgcattcaaaaagtattgaaattcaatctacc Forward 401 ttatcattaattttactataaagaatatgaagcgatttattgcaattagt Reverse 110 tcatcattaattttactctaaagaatatgaagcgatttattgcaattagt Forward 451 ttcgacctaatcttaggtttttaaaacccttattctttattaattgaagc Reverse 160 ttcgacctaatcttaggtttttaaaacccttattctttattaattgaagc Forward 501 caaaaagaggcttatcactgttaatgatagaactgaaaaaattttccaat Reverse 210 caaaaagaggcttatcactgttaatgatagaactgaaaaaattttccaat Forward 551 taaagaagtatgacgttcaagaaaaagctgctaacttttatcttttaatg Reverse 260 taaagaagtatgacgttcaagaaaaagctgctaacttttatcttttaatg Forward 601 gttaaactccatttatacttctatttatatagtttattaaaaacattaca Reverse 310 gttaaactccatttatacttctatttatatagtttattaaaaacattaca Forward 651 ttttcattgtaaaaataaaattttcatatttttataaattacttaaacta Reverse 360 ttttcattgtaaaaataaaattttcatatttttataaattacttaaa Forward 701 attcactatacctaagaattataacaattaccctaacatcttcagt Reverse Εικόνα 39: Ευθυγράμμιση των Forward και Reverse διαβασμάτων του ζεύγους εκκινητών 10F 10R μέσω του προγράμματος Merger ( Οι κάθετες γραμμές δείχνουν την ομοιότητα των βάσεων μεταξύ των δύο διαβασμάτων, ενώ με τελείες έχουν σημειωθεί οι διαφορές των βάσεων μεταξύ των δύο διαβασμάτων. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε σύνδεση των συνεχόμενων τμημάτων, των οποίων η ποιότητα αλληλούχισης θεωρήθηκε καλή σύμφωνα με τα χρωμογραφήματα, μέσω του προγράμματος Merger ( Στην εικόνα 91

92 40 παρουσιάζεται η αλληλεπικάλυψη δύο συνεχόμενων τμημάτων του μιτοχονδριακού DNA του C. fasciventris. Σε ορισμένες περιπτώσεις, κατά την προσπάθεια σύνδεσης δύο τμημάτων παρατηρήθηκε και εδώ το πρόβλημα των διαφορετικών βάσεων κατά την στοίχιση. Προς επίλυση αυτού του είδους προβλημάτων έπρεπε να πραγματοποιηθεί έλεγχος της ποιότητας διαβάσματος από τα χρωματογραφήματα ccctcatctcttaatatattcaaagacccacaatttaattcaccagttat tgaataataaattaaacgaaaagaataacaaaccgttaaaccagtagaaa aaaaatatagaaaaaaagaaaatatattaatgtatctcaaagaaacaact tctaaaattaaatcctttgaataaaatccagctaaaaaaggcattccaca taaagctaaatttgcaacattaaaacaacctgaagttaaaggcatatata cacctaaacctcctattaaacgaatatcttgagaattatttatattatga ataatagctccagcgcatataaataataaagctttaaataaagcatgagt taataaatgaaaaaaagccaatttataaaatcctattgatagaattctta ttattaaacctaattgtcttaaagtagataaagcaataattttttttaga tcaaattcaaaattagcccccaacccagctataaatattgttaaaccaga aattaataataaaaattgtcctataaaactttctcttaataaaatattaa atcgaattaataaatataccccagcagttaccaaagtagaagaatgaact aaagcagaaactggagtaggtgcagccatagccgcaggtaatcaagatga aaaaggaatctgtgctctttttgttatagctgctaatataattaataccc caataatttgtatttcaattatattttttattgattctaaataaaaaata tttcaattatattttttattgattctaaataaaaaata taatttcatctaccataatttaatattcaagcaatagcta taatttcatctaccataatttaatattcaagcaatagctaataaaaaagc 88 92

93 aacatctccaattcgatttgataaaacagttaatattccagcattataag atttcacattttgaaaataaattactaaacaataagaaactaatcctaat ccatctcatcctaataaaattctaattaaattaggactaataattaataa cattatagataaaacaaatataagaactaatataataaaacggttaatgt ttacatcccctcttatatactcctttctataataaattactaaagaagaa attaataaaacaaatgatataaataataaacttattcaatcaaataaaaa agttataacaattcttgaagaatttaatgtaactacttcccattctaaaa aaacagaatattcatttattaaaaaaactaaactaaataaaaatatagaa attctaattctaattagaactaaaaatctaattctacaaattgataaata atttttcacgatctaagatgaataattcatatcattgacaccacaaatca atatttttaataaactacttaaatttaaaatttaattttaaagtcaaaat aaacaaatttctctctttaaaattaataaatttaaaggaaatcaatgaaa aaataataaaaaatattcacgaat 712 Εικόνα 40: Η ευθυγράμμιση των τμημάτων που ενισχύθηκαν από τους εκκινητές 12 και 13 φανερώνει την αλληλεπικάληψη των δύο αυτών τμημάτων, άρα και τη δυνατότητα ένωσης τους για να προκύψει η αλληλουχία του mtdna. Συνολικά, πραγματοποιήθηκε επιτυχής αλληλούχιση των 25 εκ των 27 τμημάτων στα οποία είχε χωριστεί το mtdna του υπό μελέτη είδους, δηλαδή αλληλουχίθηκε το 93% του μιτοχονδριακού του γονιδιώματος. Όσο αφορά τα υπόλοιπα 2 τμήματα, σε κάποια δεν υπήρξε επιτυχημένη ενίσχυση τους, ενώ σε κάποια άλλα παρατηρήθηκαν παραπροϊόντα. Αλληλουχίθηκαν λοιπόν, βάσεις, οι οποίες ανήκουν σε δύο μεγάλα τμήματα του μιτοχονδριακού DNA, η συνολική περιεκτικότητα των οποίων είναι Α+Τ = 76,79% και G+C= 23,21%. 93

94 3.4.2 Οργάνωση του τμήματος του mtdna του C. fasciventris που αλληλουχήθηκε Η βιοπληροφορική μελέτη της αλληλούχιση του 93% του mtdna του είδους C. fasciventris και σύγκριση του με τη μιτοχονδριακή αλληλουχία του C. capitata μέσω του προγράμματος Standard Nucleotide BLAST / NCBI tool ( (εικόνα 41). Επίσης, μέσω του προγράμματος Clustal Omega ( έγινε ευθυγράμμιση των αλληλουχιών και εντοπίστηκαν 18 γονίδια trnas, 10 γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες και τμήματα άλλων 3 γονιδίων (ΝΑD2, NAD5, COI), το ένα (16S) εκ των δύο γονιδίων που κωδικοποιούν rrnas (large subunit rrna, small subunit rrna) και μία περιοχή ελέγχου Control Region ή D-loop (πίνακας 15). Τα γονίδια που κωδικοποιούν πρωτείνες τόσο αυτά που εντοπίστηκαν ολόκληρα όσο και αυτά στα οποία προσδιορίστηκαν τμήματα τους, τα trnas γονίδια, τo 16S rrna γονίδιο αλλά και το τμήμα του 12S rrna γονιδίου, αναγνωρίστηκαν μέσω σύγκρισης με την ήδη γνωστή και κατατεθειμένη αλληλουχία του στενά συγγενικού είδους C. capitata. (Accession number: AJ ). Ακόμη, τα 10 γονίδια που κωδικοποιούν πρωτείνες και εντοπίστηκε η ολοκληρωμένη αλληλουχία τους αναγνωρίστηκαν περαιτέρω από την παρουσία των κωδικονίων έναρξης και λήξης. Εικόνα 41: Ευθυγράμμιση αλληλουχιμένου τμήματος C. fasciventris με γνωστές κατατεθιμένες νουκλεοτιδικές αλληλουχίες μέσω του προγράμματος Standard Nucleotide BLAST / NCBI tool ( 94

95 Πίνακας 15: Γονίδια που εντοπίστηκαν στο 93% του αλληλουχιμένου mtdna του C. fasciventris. Γονίδια Σ Θέση στο mtdna Μέγεθος Κ του C. capitata (bp) K.E. K.Λ. Α.Α. ΑΤ% trna-trp W H 68 77,95 trna- Cys C L 66 72,73 trna-tyr Y L 70 75,72 trna Leu (UUA) L (UUR) H 66 72,73 Gene cox2 COII H 687 ATG TAA ,06 trna-lys K H 71 67,61 trna Asp D H 67 89,56 Gene ATP8 ATP H 162 ΑΤΤ ΤΑΑ 53 78,88 Gene ATP6 ATP H 677 ΑΤG TA ,94 Gene cox3 COIII H 789 ATG TAA ,71 trna-gly G H 65 77,28 Gene nad3 NAD H 354 ATA TAA ,23 trna Ala A H trna-arg R H 64 70,32 trna-asn N H 65 73,85 trna-ser S H 68 70,59 trna-glu E H 68 91,1 trna-his H L ,62 Gene nad4 NAD L 1341 ATG T 77,93 Gene nad4l NAD4L L 290 ΑΤG TAA 96 81,1 trna-thr T H 65 83,08 trna-pro P L 66 75,76 Gene nad6 NAD H 525 ATT TAA ,72 Gene cob COB H 1137 ATG TAG ,39 trna-ser S (UCN) H Gene nad1 NAD L 1032 AΤΤ T ,46 trna-leu (CUA) L (CUA) L 66 80,31 16S rrna 16S L ,63 trna-val V L 72 79,17 95

96 Σ: Συντομογραφία, Κ: Κλώνος, Κ.Ε.: Κωδικόνιο Έναρξης, Κ.Λ.: Κωδικόνιο Λήξης, Α.Α.: Αριθμός Αμινοξέων Τα γονίδια της περιοχής του mtdna του C. fasciventris που αλληλουχήθηκε Η αλληλούχιση που πραγματοποιήθηκε στο 93% του mtdna του υπό μελέτη είδους, αντιστοιχόυσε σε 10 ολοκληρωμένα γονίδια, τα COII, COIII, NAD3 ATP8, ATP6, NAD4L, NAD4, NAD6, COB, NAD1, ένα γονίδιο rrna, το 16S, της μεγάλης ριβοσωμικής υπομονάδας και 18 ολοκληρωμένα γονίδια trna, τα οποία βρίσκονται διάσπαρτα μέσα στο γονιδίωμα και ποικίλουν σε μέγεθος από 64 έως 72 νουκλεοτίδια. Η δευτεροταγής δομή των trnas γονιδίων κατασκευάστηκε με τη βοήθεια του προγραμμάτος RNAscan-Se ( ή με το πρόγραμμα MITOS ( (εικόνα 42). 96

97 97

98 Εικόνα 42: Δευτεροταγής δομή των 18 trnas γονιδίων που εντοπίστηκαν στο αλληλουχιμένο τμήμα του μιτοχονδριακού γονιδιώματος του C. fasciventris, με το πρόγραμμα RNAscan-Se ( Η δευτεροταγής δομή των trna Ser και Arg κατασκευάστηκαν με το πρόγραμμα MITOS ( Τα γονίδια NAD1, NAD3, NAD4, ΝΑD4L και NAD6 που κωδικοποιούν την πρώτη, την τρίτη, την τέταρτη, την πέμπτη και την έβδομη υπομονάδα αντίστοιχα από τις επτά υπομονάδες της NADH δεϋδρογονάσης. Τα γονίδια ΑΤΡ6 και ΑΤΡ8 κωδικοποιούν τις δύο υπομονάδες της ΑΤΡ συνθάσης F0. Ακόμη, εντοπίστηκε το γονίδιο COII που κωδικοποιεί τη δεύτερη υπομονάδα της οξειδάσης του κυτοχρώματος c και το COIII που κωδικοποιεί την τρίτη υπομονάδα αυτού του ενζύμου, καθώς επίσης και το γονίδιο του κυτοχρώματος b (COB). Τα γονίδια COII, COIII, ATP6, NAD4, NAD4L και COB χρησιμοποιούν ως κωδικόνιο έναρξης το ATG, ενώ τα υπόλοιπα γονίδια των οποίων η αλληλουχία εντοπίστηκε ολόκληρη χρησιμοποιούν εναλλακτικά κωδικόνια, γεγονός που παρατηρείται συχνά σε μιτοχονδριακά γονίδια ασπόνδυλων οργανισμών ( s#sg5). Tα γονίδια ΑΤΡ8, NAD1 και NAD6 χρησιμοποιούν ως κωδικόνιο έναρξης το ΑΤΤ, ενώ το γονίδιο NAD3 το ΑΤΑ. Όσον αφορά τα κωδικόνια λήξης τα γονίδια COII, ΑΤΡ8, COIII, NAD3 NAD4L και NAD6 χρησιμοποιούν το ΤΑΑ και το γονίδιο COB το TAG. Στα υπόλοιπα δεν υπάρχει κωδικόνιο λήξης στο DNA αλλά εμφανίζεται ένα δινουκλεοτίδιο ΤΑ στο γονίδιο ΑΤΡ6 και ένα τελικό νουκλεοτίδιο θυμίνης Τ στα γονίδια NAD1 και NAD4, από τα οποία θα προκύψοει κωδικόνιο λήξης μετά από μεταμεταγραφική πολυαδενυλίωση (Ojala et al., 1981) Στα υπόλοιπα τμήματα του DNA που αλληλουχίθηκαν αναγνωρίστηκαν τμήματα άλλων γονιδίων που συνήθως εντοπίζονται στις αλληλουχίες μιτοχονδριακού γονιδιώματος των ειδών της οικογένειας Tephritidae, τα οποία ταυτοποιήθηκαν έπειτα από σύγκριση τους με την ήδη κατατεθειμένη αλληλουχία του συγγενικού είδους C. fasciventris μέσω του Blastn. Πιο αναλυτικά εντοπίστηκαν, τμήματα των γονιδίων ΝΑD2 και NAD5 που κωδικοποιούν την δεύτερη και την έκτη από τις επτά υπομονάδες της NADH δεϋδρογονάσης, στην αλληλουχία του πρώτου και ενδέκατου τμήματος αντίστοιχα, του γονιδίου COI που κωδικοποεί την πρώτη από τις τρείς υπομονάδες της οξειδάσης του κυτοχρώματος c, στην αλληλουχία του τρίτου κομματιού DNA και τμήμα του 12S rrna γονιδίου που κωδικοποιεί τη μικρή υπομονάδα του ριβοσώματος, στο εικοστό τέταρτο τμήμα του mtdna. 98

99 Επίσης, από την αλληλούχιση του εικοστού έκτου κομματιού του μιτοχονδριακού γονιδιώματος διαπιστώθηκε ότι αυτό αποτελεί τμήμα της περιοχής ελέγχου (D-loop) η οποία είναι πλούσια σε αδενίνες (Α) και θυμίνες (Τ). Η περιοχή ελέγχου αποτελεί τη μη κωδικοποιούσα περιοχή του μιτοχονδριακού γονιδιώματος του C. fasciventris. Πιο συγκεκριμένα, το τμήμα του mtdna που ενισχύθηκε με το 26 ο ζεύγος εκκινητών αλληλουχίθηκε και διαπιστώθηκε ότι αποτελείται από 590 βάσεις εκ των οποίων το 91% αντιστοιχόυν σε αδενίνες (Α) και θυμίνες (Τ), σημαντικά μεγαλύτερο ποσοστό από αυτό των γουανίνων (G) και των κυτοσινών (C). Τα πρωτεϊνικά γονίδια μεταφράστηκαν με το πρόγραμμα Transeq-EMBOSS ( (εικόνα 43) και η αμινοξική αλληλουχία κάποιων από αυτά παρατίθεται ενδεικτικά στον πίνακα 16. Έπειτα, ακολούθησε η σύγκριση τους με τις αντίστοιχες πρωτεϊνες του C. capitata μέσω του Standard Protein BLAST / NCBI tool ( μεταξύ των οποίων παρατηρήθηκαν υψηλά ποσοστά ομολογίας (πίνακας 17). Εικόνα 43: Μετάφραση πρωτεϊνικών γονιδίων μέσω του προγράμματος Transeq-EMBOSS ( 99

100 Πίνακας 16: Αμινοξική αλληλουχία των 8 εκ των 10 πρωτεϊνικών γονιδίων ΓΟΝΙΔΙΟ COII ATP8 ATP6 COIII NAD3 NAD4 NAD4L NAD6 ΑΜΙΝΟΞΙΚΗ ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΑ MTTWASLGLQDSASPLMEQLTFFHDHALMILVMITTLVGYLMFMLF FNSYTNRNLLHGQTIEMIWTILPAIVLLFIAFPSLRLLYLLDEINEPSITL KAIGHQWYWSYEYSDFMNVEFDSYMIPTNELSNDGFRLLDVDNRIV LPMNSQVRILVTAADVIHSWTIPALGVKVDGTPGRLNQTNFLMNRPG LFYGQCSEICGANHSFMPIVIESIPTNYFIKWITNSIN* IPQMAPIGWLSLFIIFSLTFILFSMMNYYSVIPQSPKSQILKKSQSNSMN WKW* MMTNLFSVFDPSSSIFNLSLNWLSTFLGLLLIPSAYWLMPSRWHIFWN SILITLHKEFKTLLGPSGHSGSTFIFVSLFSLILFNNFMGLFPYIFTSTSH LTLTLTLALPLWLCFMLYGWINHTQHMFAHLVPQGTPAVLMPFMVC IETISNIIRPGTLAVRLAANMIAGHLLLTLLGNTGPSLSMMIVSLLLIGQ IALLVLESAVAIIQSYVFAVLSTLYSSEVNX* MSTHSNHPFHLVDYSPWPLTGAIGAMTSVSGLVKWFHQYDISLFLLG NVITILTVYQWWRDVSREGTFQGLHTLPVTLGLRWGMILFILSEVLFF MSFFWAFFHSSLSPAIELGASWPPAGIKPFNPFQIPLLNTAILLSSGVTV TWAHHSLMEGNHSQATQSLFFTVLLGVYFTILQAYEYIEAPFTIADSV YGSTFFMATGFHGIHVLIGTTFLLICLIRHLNNHFSKNHHFGFEAAAW YWHFVDIVWLFLYISIYWWGG* MFSISIMMFILIIITSVVMMLASILSKKSLTDREKCSPFECGFDPKSSSR LPFSLRFFLITIIFLIFDVEIALILPMILIITISNIFMWTFTSIIFIIILIIGLYHE WNQGMLNWSN* MLKLIFMMIFISPICFMQGLFWMVHNLLFVVTFVLILMNFCTNYFVNI SYFMGFDVLSYGLILLSFWICSLMIVASESVYKYNNYKNLFLFNVLA LLIFLVLTFSSMNLFMFYLFFESSLIPTLFLILGWGYQPERLQAGVYLL FYTLLVSLPLLVGIFLLYVNCNTMNFYLLSNYMFNYDLLYLSMILAF LVKMPMFLVHLWLPKAHVEAPVSGSMILAGIMLKLGGYGLLRVFSF LQLIGLKYNYIWVSISLIGGVLISLVCLRQTDLKALIAYSSVAHMGIVL GGLMTLSYWGLSGSYTLMIGHGLCSSGLFWLNFMPSMTLWWFLLS VCNMALANITYERLGSRSLLINKGLAPPSLNLLGEISLLNSIVSWSWL TMISLSLLSFFSAAYTLYLYAYSQHGKLFSGVYSFSGGNIREYFLLFFH WFPLNLLILKSEICLFWL* MLMMFYWSLPCFLFLMGVFVFVSNRKHLLSMLLSLEYIVLNLFFLLY IYLSLMEYMSFFSMMFLTFSVCEGALGLSILVSMIRTHGNDYFQSFNV L* IIQLILYASTLITRFIFIQINHPLAIGLILLIQTIQICLLTGLIAKRF*FSYILF LIFLGGILVLFIYVTSLASNEIFSLSIKLTTISLIIFSIIIIVYILLDKTRSSFFI HNNEIQPIHYLNIIVKENSLNLQKLYNYPTNFLTILLINYLLITLIAVVKI TKLFYGPLRPIN* 100

101 Πίνακας 17: Ομολογία (%) των πρωτεϊνικών γονιδίων COII, ATP8, ATP6, COIII, NAD3, NAD4, NAD4L και NAD6 του C. fasciventris, σε αμινοξικό επίπεδο, με τα αντίστοιχα κατατεθειμένα γονίδια του είδους C. capitata. Γονίδιο C. capitata COII 99 ATP8 98 ATP6 99 COIII 99 NAD3 99 NAD4 99 NAD4L 98 NAD

102 4. ΣΥΖΗΤΗΣΗ Γενικά, οι μύγες των φρούτων της οικογένειας Tephritidae περιλαμβάνουν σχεδόν 4500 είδη, πολλά από τα οποία αποτελούν γεωργικά παράσιτα που επιτίθενται σε μια μεγάλη ποικιλία φρούτων και λαχανικών σε παγκόσμιο επίπεδο (Aluja and Norrbom, 2000). Στην αφρικανική ήπειρο τα παράσιτα της συγκεκριμένης οικογένειας προκαλούν σοβαρές οικονομικές απώλειες και μπορούν να απειλήσουν ακόμη και τη δημόσια υγεία μέσω των σημαντικών μειώσεων που προκαλούν στις αποδόσεις των καλλιεργειών (Mwatawala et al., 2009). Η αντιμετώπιση τους στηρίζεται κατά κύριο λόγο στη χρήση εντομοκτόνων φαρμάκων, γεγονός που μπορεί να οδηγήσει σε σημαντική επιβάρυνση του περιβάλλοντος έχοντας καταστρεπτικές συνέπειες σε αυτό. Το γεγονός ότι τα είδη αυτά επηρεάζουν άμεσα τη ζωή του ανθρώπου καθιστά αναγκαία τη κατανόηση της βιολογίας και της γενετικής τους, έτσι ώστε μελλοντικά να αναπτυχθούν τεχνικές καταπολέμησής τους φιλικές προς το περιβάλλον (Virgilio et al., 2013). Επιπλέον, όπως προαναφέρθηκε οι μύγες των φρούτων της οικογένειας Tephritidae περιλαμβάνουν οικονομικά σημαντικά συμπλέγματα ειδών. Ένα τέτοιο σύμπλεγμα στην Αφρική είναι το σύμπλεγμα FAR που περιλαμβάνει τρία είδη δυσδιάκριτα μεταξύ τους, ανάμεσα στα οποία ανήκει και το είδος C. fasciventris που μελετάτε στη συγκεκριμένη εργασία. Αυτά τα συμπλέγματα ειδών εγείρουν σοβαρές ανησυχίες διότι περιπλέκουν την τελειοποίηση των στρατηγικών ελέγχου των ειδών, τα οποία εμφανίζονται μορφολογικά όμοια μεταξύ τους, αλλά έχουν ως ξενιστή διαφορετικό φάσμα φυτών και διαφορετικές οικολογικές απαιτήσεις (Clarke et al., 2001, Copeland et al., 2005, Aluja and Mangan, 2008). Η μελέτη των χρωμοσωμάτων, τόσο των μεταφασικών όσο και των πολυταινικών παρουσιάζει εξαιρετικό ενδιαφέρον και από εξελικτική σκοπιά, καθιστώντας τα πολύτιμα εργαλεία ώστε να επιτευχθεί η διάκριση των ειδών μέσα σε συμπλέγματα ειδών. Στην παρούσα μελέτη έγινε προσπάθεια ανάλυσης των μεταφασικών χρωμοσωμάτων του είδους C. fasciventris αλλά και σύγκριση τους με αυτά του είδους C. capitata, κατασκευή του χάρτη των πολυταινικών χρωμοσωμάτων του συγκεκριμένου είδους και άμεση σύγκριση τους με τα αντίστοιχα χρωμοσώματα της C. capitata, εντοπισμός των θέσεων συγκεκριμένων γονιδίων στα πολυταινικά χρωμοσώματα του είδους C. fasciventris με τη μέθοδο του υβριδισμού in situ, με στόχο τη δημιουργία μοριακών δεικτών για τα χρωμοσώματα και τον εντοπισμό τυχόν δομικών ανακατατάξεων σε σύγκριση με τα αντίστοιχα πολυταινικά χρωμοσώματα του ήδη μελετημένου είδους C. capitata. Όμως, 102

103 εκτός της κυτταρογενετικής μελέτης πραγματοποιήθηκε και μοριακή μελέτη του C. fasciventris μέσω της προσπάθειας ανάλυσης του μιτοχονδριακού του γονιδιώματος. 4.1 Σύγκριση μιτωτικών καρυοτύπων C. fasciventris C. capitata Οι περισσότεροι καρυότυποι των ειδών της οικογένειας Tephritidae που έχουν αναλυθεί μέχρι σήμερα περιλαμβάνουν έξι ζεύγη χρωμοσωμάτων από τα οποία τα πέντε είναι ζεύγη αυτοσωμικών χρωμοσωμάτων και το ένα φυλετικών. Στα φυλετικά χρωμοσώματα έχει παρατηρηθεί ότι υπάρχουν υψηλά επίπεδα ετεροχρωματίνης. Παρ όλα αυτά το μήκος όλων των χρωμοσωμάτων αλλά και των βραχιόνων τους παρουσιάζουν διαφορές ανάμεσα στα είδη της συγκεκριμένης οικογένειας, ακόμη ανάμεσα και σε αυτά που είναι πολύ κοντά φυλογενετικά (Mavragani-Tsipidou et al., 1992). Η ανάλυση του μιτωτικού καρυοτύπου των μεταφασικών χρωμοσωμάτων του είδους C. fasciventris συμφωνεί με την εικόνα των μιτωτικών καρυοτύπων των άλλων εντόμων της συγκεκριμένης οικογένειας που έχουν ήδη μελετηθεί, καθώς και σε αυτό το είδος εντοπίζονται συνολικά έξι ζεύγη χρωμοσωμάτων από τα οποία τα πέντε ζεύγη αντιστοιχούν σε αυτοσωμικά χρωμοσώματα και το ένα ζεύγος σε φυλετικά. Επιπλέον, τα φυλετικά χρωμοσώματα του είδους C. fasciventris εμφανίζουν υψηλά επίπεδα ετεροχρωματίνης και θα είναι ΧΧ για τα θηλυκά άτομα και ΧΥ για τα αρσενικά (εικόνα 44α, 44γ). Τα αποτελέσματα αυτά συμφωνούν και με την εικόνα του μιτωτικού καρυοτύπου του ήδη μελετημένου είδους C. capitata, το οποίο ανήκει στην ίδια οικογένεια και στο ίδιο γένος με το υπό μελέτη είδος (εικόνα 44β, 44δ). α. β. 103

104 γ. δ. Εικόνα 44: α. μιτωτικός καρυοτύπος θηλυκού ατόμου C. fasciventris, β. μιτωτικός καρυοτύπος θηλυκού ατόμου C. capitata (Zacharopoulou, 1986), γ. μιτωτικός καρυοτύπος αρσενικού ατόμου C. fasciventris, δ.. μιτωτικός καρυοτύπος αρσενικού ατόμου C. capitata (Radu et al., 1975), Γενικά, εντοπίζεται μια ομοιότητα ανάμεσα στα αυτοσωμικά χρωμοσώματα των δύο ειδών, καθώς τόσο στο υπό μελέτη είδος όσο και στη C. capitata όλα τα αυτοσωμικά χρωμοσώματα εμφανίζονται υπομετακεντρικά (εικόνα 44) (Zacharopoulou, 1986). Ακόμη, στη C. fasciventris το χρωμόσωμα Χ είναι μικρότερο σε μέγεθος από τα αυτοσωμικά χρωμοσώματα και πολύ μεγαλύτερο από το Υ, ομοιίως στο χρωμόσωμα Χ στη C. capitata εμφανίζεται μεγαλύτερο από το Υ (εικόνα 44). Επιπλέον, στο είδος C. fasciventris το χρωμόσωμα Χ εμφανίζεται υπομετακεντρικό όπως και στο μιτωτικό καρυότυπο του είδους C. capitata (εικόνα 44α, 44β), ενώ το Υ χρωμόσωμα εντοπίζεται με τη μορφή δύο μικρών τελείων σε αντίθεση με το αντίστοιχο χρωμόσωμα του είδους C. capitata το οποίο εμφανίζεται μεγαλύτερο από αυτό του είδους C. fasciventris (εικόνα 44γ, 44δ). 4.2 Σύγκριση πολυταινικών χρωμοσωμάτων C. fasciventris C. capitata Όπως περιγράφηκε στα αποτελέσματα, οι πολυταινικοί πυρήνες του είδους C. fasciventris αποτελούνται από πέντε πολυταινικά χρωμοσώματα με συγκεκριμένο πρότυπο ζωνώσεων, τα οποία αντιστοιχούν στα πέντε αυτοσωμικά χρωμοσώματα του μιτωτικού πυρήνα. Συνολικά, παρατηρούνται δέκα πολυταινικοί βραχίονες, καθώς κάθε χρωμόσωμα αποτελείται από δύο άνισους σε μέγεθος βραχίονες (αριστερός και δεξιός βραχίονας). Επίσης, ταυτοποιήθηκαν οι κεντρομερικές περιοχές των πολυταινικών χρωμοσωμάτων, οι οποίες δεν παρουσιάζονταν πλούσιες σε ετεροχρωματίνη και αποτέλεσαν ιδιαίτερα χαρακτηριστικά για την αναγνώριση κάθε χρωμοσώματος. Η ίδια εικόνα περιορισμένης κεντρομερικής ετεροχρωματινικής μάζας έχει παρατηρηθεί και στους πολυταινικούς πυρήνες του στενά συγγενικού είδους C. capitata (Zacharopoulou, 1987, 1990) εν αντιθέση με άλλα είδη της οικογένειας αυτής όπως των B. dorsalis (Zacharopoulou et al., 2011), B. tryoni (Zhao et al., 1998), B. curcubitae (Zacharopoulou et al., 2011), αλλά και υβριδίων 104

105 του γένους Bactrocera, όπως στο Β. dorsalis B. carambolae (Augoustinos et al., 2014) (εικόνα 45). α. β. Εικόνα 45: Κεντρομερικές περιοχές στους πολυταινικούς πυρήνες α. του υβριδίου Β. dorsalis- B. carambolae (Augoustinos et al., 2014) και β. C. fasciventris.οι κύκλοι και τα βέλη δείχνουν τις κεντρομερικές περιοχές σε κάθε περίπτωση. Η ανάλυση των πολυταινικών πυρήνων από αρσενικά και θηλυκά άτομα του υπό μελέτη είδους δεν παρουσίασε καμία διαφορά τόσο στον αριθμό των χρωμοσωμάτων όσο και στην μορφολογία τους ανάμεσα στα δύο φύλα. Επιπροσθέτως, ούτε σε αυτό το είδος της οικογένειας Tephritidae δεν παρατηρήθηκαν πολυταινικά χρωμοσώματα που να αντιστοιχούν στα φυλετικά χρωμοσώματα, γεγονός το οποίο ενισχύει την ήδη υπάρχουσα διαπίστωση ότι τα φυλετικά χρωμοσώματα δεν πολυταινίζονται. Σε γενικές γραμμές οι παρατηρήσεις αυτές συμφωνούν με προηγούμενες μελέτες που πραγματοποιήθηκαν στο στενά συγγενικό είδος C. capitata (Bedo, 1986, 1987, Zacharopoulou 1987, 1990, Bedo and Zacharopoulou, 1988), αλλά και σε άλλα είδη όπως στα L. cuprina (Childress, 1969, Foster et al., 1980, Bedo, 1982), C. bezziana (Bedo, 1992), B. oleae (Mavragani-Tsipidou et al., 1992a, Zambetaki et al., 1995), B. tryoni (Zhao et al., 1998) και B. curcubitae (Shahjahan and Yesmin, 2002). Το ετεροχρωματινικό δίκτυο, το οποίο εντοπίστηκε στους πυρήνες των πολυταινικών χρωμοσωμάτων του C. fasciventris (εικόνα 24) είναι πιθανό να αντιπροσωπεύει και εδώ τα φυλετικά χρωμοσώματα ΧΧ και ΧΥ όπως διαπιστώθηκε και σε άλλα δίπτερα έντομα (Kounatidis et al., 2008, Garcia-Martinez et al., 2009, Drosopoulou et al., 2012a). 105

106 Στη συγκεκριμένη εργασία χρησιμοποιήθηκε το συγγενικό είδος C. capitata, του οποίου τα πολυταινικά χρωμοσώματα έχουν ήδη χαρτογραφηθεί, με σκοπό τον εντοπισμό πιθανών ανακατατάξεων στα χρωμοσώματα του C. fasciventris. Η μελέτη των πολυταινικών χρωμοσωμάτων του C. fasciventris αποκάλυψε ομολογία του ζωνικού προτύπου σε τρία από τα πέντε πολυταινικά χρωμοσώματα με τα αντίστοιχα του είδους C. capitata και δομικές ανακατατάξεις σε αρκετά σημεία κυρίως του τρίτου και του πέμπτου χρωμοσώματος. Πιο αναλυτικά, και οι δύο βραχίονες (L, R) των χρωμοσωμάτων 2, 4, και 6 εμφανίζουν απόλυτη ομολογία με τους αντίστοιχους του είδους C. capitata (εικόνα 46). Επιπλέον, οι βραχίονες 3R και 5R του τρίτου και πέμπτου χρωμοσώματος αντίστοιχα είναι ομόλογοι με τους αντίστοιχους βραχίονες του είδους C. capitata, γεγονός το οποίο δεν ισχύει για τους βραχίονες 3L και 5L των ίδιων χρωμοσωμάτων, καθώς σε αυτούς έχουν παρατηρηθεί αρκετές ανακατατάξεις (εικόνα 47 και 48). Αυτές οι ανακατατάξεις περιλαμβάνουν τόσο αναστροφές όσο και μεταθέσεις, γεγονός το οποίο αποδεικνύει ότι πραγματοποιήθηκαν περισσότερες από μία μεταλλάξεις σε κάθε ένα από αυτούς τους δύο βραχίονες. 106

107 Εικόνα 46: Σύγκριση πολυταινικών χρωμοσωμικών βραχιόνων 2R, 4L και 4R των ειδών C. fasciventris και C. capitata (χάρτες C. capitata από Gariou-Papalexiou et al.,2002). Στο βραχίονα 3L τα ακραία τμήματα του βραχίονα παραμένουν ίδια και στα δύο είδη (περιοχές 21-24Α και 31D - 35 ), ενώ παρατηρούνται πέντε σημεία θραύσης κατά μήκος του βραχίονα. Τα τμήματα που προκύπτουν τοποθετούνται σε άλλα σημεία με ίδιο ή αντίθετο προσανατολισμό (εικόνα 47). Ομοίως, στο βραχίονα 5L τα ακραία τμήματα του χρωμοσωμικού βραχίονα παραμένουν ίδια στα δύο είδη (περιοχές και 70C - 72), ενώ διαπιστώθηκαν τέσσερα σημεία θραύσης κατά μήκος του συγκεκριμένου βραχίονα. Και σε αυτή την περίπτωση παρατηρούνται ανακατατάξεις τμημάτων, τα οποία εντοπίζονται σε νέες θέσεις με τον ίδιο ή αντίθετο προσανατολισμό (εικόνα 48). Εικόνα 47: Σύγκριση των πολυταινικών χρωμοσωμικών βραχιόνων 3L των ειδών Ceratitis capitata και Ceratitis fasciventris. Τα βέλη με τα διαφορετικά χρώματα δείχνουν τη θέση και τον προσανατολισμό των αντίστοιχων χρωμοσωμικών τμημάτων των ομόλογων χρωμοσωμάτων. C: κεντρομέρος (χάρτες C. capitata από Gariou-Papalexiou et al., 2002). 107

108 C C. capitata C C. fasciventris Εικόνα 48: Σύγκριση των πολυταινικών χρωμοσωμικών βραχιόνων 5L των ειδών Ceratitis capitata και Ceratitis fasciventris. Τα βέλη με τα διαφορετικά χρώματα δείχνουν τη θέση και τον προσανατολισμό των αντίστοιχων χρωμοσωμικών τμημάτων των ομόλογων χρωμοσωμάτων. C: κεντρομέρος (χάρτες C. capitata από Gariou-Papalexiou et al., 2002). Στην παρούσα μελέτη, η κατανομή συγκεκριμένων γονιδίων στα πολυταινικά χρωμοσώματα σιαλογόνων αδένων του C. fasciventris, η οποία μελετήθηκε με τη μέθοδο του υβριδισμού in situ βοήθησε στην εύρεση και ταυτοποίηση αυτών των ανακατατάξεων. Έτσι, λοιπόν, ο in situ υβριδισμός των ανιχνευτών για τα γονιδία sxl και scarlet υποστηρίζει ότι οι πολυταινικοί χρωμοσωμικοί βραχίονες 5R και 6L των ειδών C. fasciventris και C. capitata είναι ομόλογοι, ενώ ο υβριδισμός των ανιχνευτών hsp70 και white επιβεβαιώνει την ύπαρξη ανακατατάξεων στους πολυταινικούς χρωμοσωμικούς βραχίονες 3L και 5L ανάμεσα στα δύο αυτά είδη. Θεωρείται ότι οι ανακατατάξεις αποτελούν σημαντικό μηχανισμό στην εξέλιξη του γονιδιώματος των ειδών (Rieseberg 2001, Noor 2001, Feder and Nosil 2009, Stevison 2011, McGaugh and Noor, 2012). 4.3 To mtdna του είδους C. fasciventris Η οργάνωση του μιτοχονδριακού γονιδιώματος του C. fasciventris Στην παρούσα εργασία αλληλουχίθηκε και αναλύθηκε το 93% του συνολικού μιτοχονδριακού γονιδιώματος του είδους C. fasciventris (εικόνα Π1 Παραρτήματος) με απώτερο σκοπό τη σύγκριση του με ήδη κατατεθειμένες αλληλουχίες κυρίως του στενά συγγενικού είδους C. capitata αλλά και άλλων ειδών της οικογένειας Tephritidae. Αλληλουχίθηκαν λοιπόν, βάσεις, η περιεκτικότητα των οποίων είναι Α+Τ = 76,79% και G+C= 23,21%. Τα ποσοστά αυτά είναι παρόμοια με αυτά που προκύπτουν από τις κατατεθειμένες αλληλουχίες των ειδών της οικογένειας Tephritidae και ειδικότερα 108