ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΙΑΣ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ & ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΙΑΣ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ & ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΕΠΑΓΩΓΗΣ ΤΟΥ «ΕΠΑΓΟΜΕΝΟΥ ΑΠΟ ΤΗΝ ΥΠΟΞΙΑ ΜΕΤΑΓΡΑΦΙΚΟΥ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑ-1» (HIF- 1) ΣΕ ΑΝΘΡΩΠΙΝΑ ΛΕΙΑ ΜΥΪΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ ΒΡΟΓΧΩΝ (A) Normoxic Conditions Degradation of HIF-lcx CYTOPLASM HIF-lcx '- -Λ;. ;,--' Unstable Transcription Factor VHL Ub Signal Addition Recogr Ub Signal Rro teo lytic Degrada tion (J3) Hypoxic Conditions ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΜΠΟΥΤΟΥΡΕΛΗ ΧΡΙΣΤΙΝΑ ΛΑΡΙΣΑ 2006

2 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΙΑΣ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ & ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΕΠΑΓΩΓΗΣ ΤΟΥ «ΕΠΑΓΟΜΕΝΟΥ ΑΠΟ ΤΗΝ ΥΠΟΞΙΑ ΜΕΤΑΓΡΑΦΙΚΟΥ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑ-1» (HIF- 1) ΣΕ ΑΝΘΡΩΠΙΝΑ ΛΕΙΑ ΜΥΪΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ ΒΡΟΓΧΩΝ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΜΠΟΥΤΟΥΡΕΛΗ ΧΡΙΣΤΙΝΑ ΛΑΡΙΣΑ 2006

3 Πανεπιστήμιο Θεσσαλίας ΥΠΗΡΕΣΙΑ ΒΙΒΛΙΟΘΗΚΗΣ & ΠΛΗΡΟΦΟΡΗΣΗΣ Ειαικη Συλλογή «Γκρίζα Βιβλιογραφία» Αριθ. Εισ.: Ημερ. Εισ.: Δωρεά: Ταξιθετικός Κωδικός: 4986/1 14/11/2006 Π.Θ. ΠΤ- ΒΒ 2006 ΜΠΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΙΑΣ

4 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΙΑΣ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ & ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΕΠΑΓΩΓΗΣ ΤΟΥ «ΕΠΑΓΟΜΕΝΟΥ ΑΠΟ ΤΗΝ ΥΠΟΞΙΑ ΜΕΤΑΓΡΑΦΙΚΟΥ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑ-1» (HIF- 1) ΣΕ ΑΝΘΡΩΠΙΝΑ ΛΕΙΑ ΜΥΪΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ ΒΡΟΓΧΩΝ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ Επιβλέπουσα Καθηγήτρια Παρασκευά Ευφροσύνη Λέκτορας Κυτταρικής Φυσιολογίας, Ιατρικής Σχολής, Πανεπιστημίου Θεσσαλίας Μέλη Τριμελούς Επιτροπής Παρασκευά Ευφροσύνη, Λέκτορας Κυτταρικής Φυσιολογίας, Τμήμα Ιατρικής Πανεπιστημίου Θεσσαλίας Σταθόπουλος Κωνσταντίνος, Επίκουρος Καθηγητής Βιοχημείας, Τμήμα Βιοχημείας & Βιοτεχνολογίας Πανεπιστημίου Θεσσαλίας Κοντού Μαρία, Λέκτορας Κλινικής Χημείας, Τμήμα Βιοχημείας & Βιοτεχνολογίας Πανεπιστημίου Θεσσαλίας 2

5 Η παρούσα διπλωματική εργασία εκπονήθηκε στο εργαστήριο Φυσιολογίας του τμήματος Ιατρικής του Πανεπιστημίου Θεσσαλίας. Θα ήθελα να ευχαριστήσω ιδιαίτερα τον Καθηγητή κ. Γουργουλιάνη, ο οποίος με παρέπεμψε στο συγκεκριμένο τμήμα για την πραγματοποίηση της διπλωματικής μου εργασίας. Θα ήθελα επίσης να ευχαριστήσω το διευθυντή του εργαστηρίου Φυσιολογίας, Καθηγητή κ. Μολυβδά που μου έδωσε την ευκαιρία να πραγματοποιήσω τη διπλωματική μου στο εργαστήριο Φυσιολογίας. Ιδιαίτερα θα ήθελα να ευχαριστήσω την επιβλέπουσα καθηγήτρια Παρασκευά Ευφροσύνη, η οποία με τη βοήθεια της, το ενδιαφέρον και την άψογη συνεργασία της, συνέβαλε καθοριστικά στην αποτελεσματική διεκπεραίωση της εργασίας μου. Με χαρά θα ήθελα να ευχαριστήσω την υποψήφια διδάκτορα Σταματίου Ροδόπη για την πολύτιμη βοήθειά της, καθώς και τα υπόλοιπα μέλη του εργαστηρίου Φυσιολογίας του τμήματος Ιατρικής για το ευχάριστο και δημιουργικό περιβάλλον εργασίας. Τέλος θα ήθελα να ευχαριστήσω τα μέλη της τριμελούς επιτροπής, κ. Σταθόπουλο Κωνσταντίνο και Κοντού Μαρία για την ανάγνωση της διπλωματικής μου εργασίας. 3

6 Αφιερωμένο στην αδερφή μου Γιάννα, 4

7 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΕΡΙΛΗΨΗ... 7 ABSTRACT ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑΣ HIF HIF-Ιβ HIF-Ια ΡΥΘΜΙΣΗ TOYHIF-Ια ΑΠΟ ΤΑ ΕΠΙΠΕΔΑ ΟΞΥΓΟΝΟΥ ΡΥΘΜΙΣΗ ΣΕ ΕΠΙΠΕΔΟ ΜΕΤΑΓΡΑΦΙΚΗΣ ΕΝΕΡΓΟΤΗΤΑΣ ΕΠΑΓΩΓΗ TOY HIF-1 ΣΕ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΚΕΣ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΕΙΣ ΟΞΥΓΟΝΟΥ ΑΝΑΠΝΕΥΣΤΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ ΚΑΙ ΥΠΟΞΙΑ ΛΕΙΑ ΜΥΪΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ ΒΡΟΓΧΩΝ ΣΚΟΠΟΣ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗΣ ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Πρωτογενείς καλλιέργειες λείων μυϊκών κυττάρων βρόγχων ΠΑΓΩΜΑ ΚΥΤΤΑΡΩΝ Ξεπαγωμα ΚΥΤΤΑΡΩΝ Ταυτοποίηση λείων μυϊκών κυττάρων Έμμεσος Ανοσοφθορισμός Κατεργασία κυττάρων - Μελετη της επαγωγής toy HIF-1 a Παρασκευή εκχυλισμάτων ολικής πρωτεΐνης λείων μυϊκών κυττάρων Προσδιορισμός πρωτεϊνικής συγκέντρωσης των δειγμάτων (Μέθοδος Bradford) ΑΝΑΛΥΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΜΕ ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΚΑΙ ΑΝΟΣΟΑΠΟΤΥΠΩΣΗ Προετοιμασία Δειγμάτων Προετοιμασία πηκτής πολυακριλαμιδίου Ηλεκτροφόρηση δειγμάτων

8 2.7 ΑΝΟΣΟΑΠΟΤΥΠΩΣΗ ΚΑΤΑ WESTERN (Western Blotting) Μεταφορά των πρωτεϊνών σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης Αντίδραση πρωτεϊνών με το εξειδικευμένο ΧΗΜΕΙΟΦΩΤΑ ΥΓΕΙΑ (Chemiluminesence) ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΟΥ ΚΟΒΑΛΤΙΟΥ ΣΤΗΝ ΕΠΑΓΩΓΗ TOY HIF-Ia ΣΕ ΑΝΘΡΩΠΙΝΑ ΛΕΙΑ ΜΥΪΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ ΒΡΟΓΧΩΝ ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΗΣ ΔΕΣΦΕΡΙΟΞΑΜΙΝΗΣ (DFO) ΣΤΗΝ ΕΠΑΓΩΓΗ TOY HIF- 1Α ΣΕ ΑΝΘΡΩΠΙΝΑ ΛΕΙΑ ΜΥΪΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ ΒΡΟΓΧΩΝ ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΩΝ ΔΙΑΦΟΡΕΤΙΚΩΝ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΕΩΝ ΥΠΟΞΙΑΣ ΣΤΗΝ ΕΠΑΓΩΓΗ TOY HIF-Ia ΣΕ ΑΝΘΡΩΠΙΝΑ ΛΕΙΑ ΜΥΪΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ ΒΡΟΓΧΩΝ ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΗΣ ΚΑΡΒΑΧΟΛΗΣ (CCH) ΣΤΗΝ ΕΠΑΓΩΓΗ TOY HIF-Ia ΣΕ ΑΝΘΡΩΠΙΝΑ ΛΕΙΑ ΜΥΪΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ ΒΡΟΓΧΩΝ ΕΠΑΓΩΓΗ ΚΑΙ ΕΝΔΟΚΥΤΤΤΑΡΙΟΣ ΕΝΤΟΠΙΣΜΟΣ TOY HIF-Ia ΣΕ ΑΝΘΡΩΠΙΝΑ ΛΕΙΑ ΜΥΪΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ ΒΡΟΓΧΩΝ...46 ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΩΝ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 54 6

9 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Ο επαγόμενος από την υποξία μεταγραφικός παράγοντας 1 (HIF-1), αποτελεί τον κύριο ρυθμιστή της ομοιόστασης του οξυγόνου στους ιστούς. Ο HIF-1 αποτελείται από δύο υπομονάδες: την υπομονάδα α (HIF-la), η οποία υπόκειται σε ρύθμιση και την υπομονάδα β (HIF-1 β ή ARNT), η οποία εκφράζεται συνεχώς. Ο HIF-la έχει βρεθεί ότι παράγεται σε υψηλά επίπεδα σε κύτταρα, τα οποία βρίσκονται κάτω από συνθήκες υποξίας. Στις συγκεκριμένες συνθήκες ο HIF-la ενεργοποιεί τη μεταγραφή μια σειράς γονιδίων, τα οποία σχετίζονται με διεργασίες, όπως η ερυθροποίηση, η αγγειογένεση, η αγγειοδιαστολή, η αύξηση του ρυθμού της αναπνοής, καθώς και η γλυκόλυση. Πρόσφατα έχει δειχθεί ότι πέραν της υποξίας, ο HIF-la, επάγεται και σε φυσιολογικές συγκεντρώσεις οξυγόνου από αυξητικούς παράγοντες. Επιπλέον σε συνθήκες νορμοξίας ο HIF-la επάγεται και από παράγοντες οι οποίοι έχει βρεθεί ότι μιμούνται τις συνθήκες υποξίας, όπως το κοβάλτιο (Co2+) και η δεσφεριοξαμίνη (DFO). Στο αναπνευστικό σύστημα, τα λεία μυϊκά κύτταρα καλύπτουν το εσωτερικό των αεραγωγών. Τα λεία μυϊκά κύτταρα των βρόγχων του αναπνευστικού συστήματος ρυθμίζουν τη διάμετρο των αεραγωγών και κατά συνέπεια το οξυγόνο που φτάνει στους πνεύμονες. Έχει βρεθεί ότι σε πρωτογενείς καλλιέργειες λείων μυϊκών κυττάρων τραχείας κουνελιού, ο HIF-la επάγεται σε συνθήκες μειωμένης συγκέντρωσης οξυγόνου καθώς και σε φυσιολογικές συγκεντρώσεις οξυγόνου παρουσία κοβαλτίου. Στη συγκεκριμένη εργασία διερευνήθηκε η επαγωγή η του HIF-la σε πρωτογενείς καλλιέργειες ανθρώπινων λείων μυϊκών κυττάρων βρόγχων (ΛΜΚΒ), τόσο σε συνθήκες υποξίας, όσο και από διάφορους επαγωγείς σε φυσιολογικές συνθήκες οξυγόνου, με τη χρήση των μεθόδων της ηλεκτροφόρησης σε πηκτή πολυακριλαμιδίου παρουσία αποδιατακτικών συνθηκών (SDS-PAGE) και της ανοσοαποτύπωσης (Western Blotting). Αρχικά επιχειρήθηκε η μελέτη της επίδρασης των παραγόντων που δρουν ως μιμητές της υποξίας στην επαγωγή του HIF-la. Τέτοιοι επαγωγείς έχει βρεθεί ότι είναι το κοβάλτιο (Co2+) (Chachami et al., 2004) και η δεσφεριοξαμίνη (DFO). Τόσο το κοβάλτιο, όσο και η δεσφεριοξαμίνη προκάλεσαν επαγωγή του HIF-la. στα ανθρώπινα ΛΜΚΒ. Επιπλέον διερευνήθηκε η επίδραση των διαφορετικών 7

10 συγκεντρώσεων οξυγόνου (συγκέντρωση οξυγόνου 1% καν 6%) στην επαγωγή του HIF-la, στα ανθρώπινα ΛΜΚΒ. Η υποξία (συγκέντρωση οξυγόνου 1% και 6%) οδήγησε όπως ήταν αναμενόμενο στην επαγωγή του HIF-la στα ανθρώπινα ΛΜΚΒ. Συγκεκριμένα βρέθηκε ότι η επαγωγή αυτή ήταν πιο έντονη στα κύτταρα που καλλιεργήθηκαν σε συγκέντρωση οξυγόνου 1% από ότι σε συγκέντρωση οξυγόνου 6%. Επίσης μελετήθηκε η επίδραση της καρβαχόλης (CCH), ενός χολινεργικού αγωνιστή της ακετυλοχολίνης στην επαγωγή του HIF-la. Η καρβαχόλη φαίνεται να μην προκαλεί επαγωγή του HIF-la στα ανθρώπινα ΛΜΚΒ σε επίπεδα ανιχνεύσιμα με τη μέθοδο που χρησιμοποιήθηκε. Επιπλέον μελετήθηκε και ο ενδοκυττάριος εντοπισμός της έκφρασης του HIF-la στα ανθρώπινα ΛΜΚΒ, ύστερα από επεξεργασία με τους παραπάνω επαγωγείς με τη μέθοδο του έμμεσου ανοσοφθορισμού. Από τα παραπάνω αποτελέσματα προκύπτει ότι οι πρωτογενείς καλλιέργειες ΛΜΚΒ ανθρώπου, αποτελούν ένα κυτταρικό μοντέλο, το οποίο είναι κατάλληλο για τη μελέτη της επαγωγής του HIF-la. 8

11 ABSTRACT The Hypoxia-inducible factor-l(hif-l), is a major regulator of oxygen homeostasis. HIF-1 is a heterodimer composed of two subunits HIF-Ια and HIF-Ιβ. HIF-Ιβ is constitutively expressed. In contrast, the expression of HIF-1 a is regulated. Under hypoxic conditions HIF-1 a levels increase and HIF-1 activates the transcription of more than 60 genes. HIF-1 target genes participate in the control of oxygen homeostasis by regulating processes like erythropoiesis, angiogenesis and glycolysis. It has been shown that HIF-1 a is also induced under normoxic conditions by factors that can mimic hypoxia, like cobalt and DFO. Moreover, HIF-la expression is upregulated by various growth factors. Airway smooth muscle cells regulate the lumen diameter of hollow organs and in this way, regulate the amount of oxygen that reaches the lungs. It has been previously shown, that in primary cultured airway smooth muscle cells from rabbit trachea HIFla is induced by hypoxia and by the exposure of cells to cobalt. The aim of the present study was to investigate the induction of HIF-la in human bronchial smooth muscle cells (BSMC). For this purpose primary cultures of human BSMC were exposed both to hypoxia and to various inducers under normoxic conditions. HIF-la expression was analyzed by SDS-PAGE and Western blotting using a monoclonal antibody against human HIF-la. Initially, human BSMC were exposed to cobalt and desferioxamin, both of which can mimic hypoxia. Under these conditions HIF-la protein levels were significantly induced. Exposure of human BSMC to different oxygen concentrations (1% [O2] and 6% [O2] also resulted to the induction of HIF-la. This induction was more intense after the exposure to 1% [O2] than to 6% [O2]. Finally, human BSMC were exposed to carbachol, a cholinergic agonist of acetylcholine, which was previously shown to induce HIF-la expression in cardiomyocytes. However, no induction of HIF-la was observed in human BSMC. The expression and intracellular localization of HIF-la after exposure to the above inducers was also analyzed by indirect immunofluorescence with similar results. 9

12 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Οι περισσότεροι οργανισμοί απαιτούν οξυγόνο για την επιβίωση τους. Στην πλειοψηφία τους, οι πολυκύτταροι οργανισμοί έχουν αναπτύξει ειδικά όργανα για την πρόσληψη, μεταφορά και διανομή του οξυγόνου στους ιστούς. Η μείωση των φυσιολογικών επιπέδων οξυγόνου στους ιστούς, αντιπροσωπεύει το φαινόμενο της υποξίας. Η ρύθμιση της ομοιόστασης του οξυγόνου συμβαίνει τόσο σε επίπεδο οργανισμού, όσο και σε επίπεδο κυττάρου και περιλαμβάνει διάφορους μηχανισμούς ρύθμισης και προσαρμογής στις αλλαγές της πίεσης του οξυγόνου (A. Zarkoska and Dulak, 2004). Σε επίπεδο συστήματος, η προσαρμογή στην υποξία περιλαμβάνει την αύξηση του ρυθμού της αναπνοής και την αύξηση της διανομής του οξυγόνου στους ιστούς, μέσω της αυξημένης παραγωγής ερυθροκυττάρων (ερυθροποιήση), της αύξησης του σχηματισμού νέων αγγείων (αγγειογένεση), και της αγγειοδιαστολής (A. Zarkoska and Dulak, 2004). Σε κυτταρικό επίπεδο, η υποξία οδηγεί στην ενεργοποίηση εναλλακτικών μονοπατιών, τα οποία δεν απαιτούν μοριακό οξυγόνο. Σε αυτά περιλαμβάνονται η αλλαγή του ενεργειακού μεταβολισμού από την οξειδωτική φωσφορυλίωση σε αναερόβια γλυκόλυση,καθώς επίσης και η αύξηση της πρόσληψης γλυκόζης (Bunn H.F. et al.,1996; A. Zarkoska and Dulak, 2004). Όλες οι παραπάνω διαδικασίες, ρυθμίζονται σε μεγάλο βαθμό από τη δράση του επαγόμενου από την υποξία μεταγραφικού παράγοντα 1 (Hypoxia Inducible Factor-1, HIF-1) (Wenger R.H. et al., 2002) O HIF-1 είναι ένας μεταγραφικός παράγοντας που εξαρτάται από το οξυγόνο και μπορεί να επάγει την έκφραση πάνω από 60 γονιδίων. Στα γονίδια στόχους του HIF- 1, περιλαμβάνονται γονίδια, τα οποία κωδικοποιούν πρωτεΐνες που συμβάλουν τόσο στη διατήρηση της ομοιόστασης του οξυγόνου, όσο και στην προσαρμογή του οργανισμού στις διάφορες μεταβολές της πίεσης του οξυγόνου. Τα γονίδια αυτά μπορούν να χωριστούν σε τέσσερις κατηγορίες. Η πρώτη κατηγορία περιλαμβάνει γονίδια, τα οποία εμπλέκονται στην ανάπτυξη και λειτουργικότητα του αγγειακού συστήματος και τα οποία προωθούν την αγγειογένεση, όπως είναι ο αγγειακός ενδοθηλιακός αυξητικός παράγοντας (VEGF, Vascular Endothelium Growth Factor). Στη δεύτερη κατηγορία συγκαταλέγονται γονίδια, των οποίων τα προϊόντα επάγουν την ερυθροποίηση, όπως είναι η ερυθροποιητίνη (ΕΡΟ, erythropoietin). Η τρίτη κατηγορία αντιπροσωπεύεται από γονίδια, των οποίων τα προϊόντα συμμετέχουν 10

13 στον ενεργειακό μεταβολισμό. Η συνεργασία των προϊόντων των γονιδίων αυτής της κατηγορίας οδηγεί στην αυξημένη πρόσληψη γλυκόζης, καθώς επίσης και στην ενεργοποίηση της γλυκόλυσης ως κύρια πηγή ενέργειας. Η τέταρτη κατηγορία περιλαμβάνει γονίδια, των οποίων τα προϊόντα είναι υπεύθυνα για τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό καθώς και για τη βιωσιμότητα του κυττάρου. Πέραν των τεσσάρων αυτών κατηγοριών γονιδίων, υπάρχουν και άλλα γονίδια τα οποία επάγονται από τον HIF-1 και τα οποία είναι σημαντικά για την απόκριση του κυττάρου σε ακραία ερεθίσματα (stresses). (A. Zarkoska and Dulak, 2004). Στον πίνακα 1 παρατίθενται οι τέσσερις κατηγορίες των γονιδίων, η έκφραση των οποίων ρυθμίζεται από τον HIF-1. Το αρχικό βήμα για την ανακάλυψη του HIF-1, προήλθε από μελέτες που αφορούσαν την αλληλεπίδραση μιας πρωτεΐνης που προσδένεται στο DNA στην 3 περιοχή του γονιδίου της ερυθροποιητίνης, σε μία αλληλουχία που ονομάζεται στοιχείο απόκρισης στην υποξία (HRE, Hypoxia Response Element). Οι μελέτες αυτές αποκάλυψαν, ότι ένας από τους παράγοντες που αλληλεπιδρούν με την 3 HRE περιοχή του γονιδίου της ερυθροποιητίνης, προσδενόταν αποκλειστικά μετά από έκθεση σε υποξία. Οι Semenza και Wang ονόμασαν στη συνέχεια αυτό τον παράγοντα ως «Παράγοντα επαγόμενο από την υποξία-1» ή HIF-1( Wenger R.H et al., 2002). Η περιοχή HRE, είναι μια ειδική περιοχή, με αλληλουχία 5 - (A/G)CGTG-3 (Semenza G.L.et al., 2005), η οποία έχει βρεθεί στους υποκινητές όλων των γονιδίων στόχων του HIF Ο ΠΑΡΑΓΟΝΤΑΣ HIF-1 Ο HIF-1 είναι μία ετεροδιμερής πρωτεΐνη που αποτελείται από δύο υπομονάδες, τον HIF-la και τον HIF-Ιβ (Εικόνα 1). Το ανθρώπινο γονίδιο για τον HIF-la έχει χαρτογραφηθεί στο χρωμόσωμα 14 (14q21-q24), ενώ το γονίδιο για τον HIF-1 β στο χρωμόσωμα 1 (lq21). Οι δύο υπομονάδες του HIF-1 παρουσιάζουν υψηλή ομολογία και φαίνεται να είναι αρκετά συντηρημένες καθώς έχει βρεθεί ότι υπάρχει περίπου 90% ομοιότητα για αυτές ανάμεσα στον άνθρωπο, το ποντίκι και τον αρουραίο (Wenger R.H. et al.,1996). 11

14 Process Gene product References Control of Angiogenesis Vascular endothelial growth factor Forsythee/ al vascular VEGF receptor 1 Gerber et al system Plasminogen activator inhibitor 1 Kietzmann et al, 1999 Transforming growth factor /?3 Caniggia etal, 2000 Vasomotor control Nitric oxide synthase 2 Melillo et al, 1995 (inducible nitric oxide synthase) Palmer et al, 1998 Endothelin-1 Hue? a/.,1998 a 1 B-adrenergic receptor Eckhart et al,1997 Adrenomedullin Cormier-Regard efa/., 1998 Heme oxvaenase 1 Lee etal Maturation of Erythropoiesis Erythropoietin Jiang et al, 1996 red blood Iron transport Transferrin Rolfs etal., 1997 cells Transferrin receptor Lok & Ponka, 1999 Tacchinirfa/, Ceruloplasmin Mukhopadhvav et al Energy metabolism Glycolysis Lactate dehydrogenase A Phosphoglycerate kinase 1 Aldolase A and C Firth elm al Semenzaefa/, 1994,1996 Iyer etal Phosphofructokinase L Glucose transport Multifunctional enzyme Pyruvate kinase M Enolase 1 Hexokinase 1 and 2 Glucose transporter 1 Glucose transporters Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Gleadle & Ratcliffe, 1997 O'Rourke et al [yer et al, 1998 Lu et al Iver et al Cell Arrest of cell cycle p21 Carmeliete/a/., 1998 proliferation Apoptosis Bcl2/EIB 19kDa-interacting Bruick, 2000 and viability protein 3 (BNIP3) Nip3-like protein X Sowteretal., 2001 Growth factors Insulin-like growth factor 2 Feldsereta/., 1999 Insulin-like growth factor binding protein 1.2 and 3 Other ph regulation Carbonic anhydrase 9 Wykoff et al, 2000 Nucleotide metabolism Adenylate kinase 3 O'Rourke et al, 1996 Matrix metabolism Collagen prolyl-4-hydroxylase a 1 Takahashi et al, 2000 Catecholamine synthesis Tyrosine hydroxylase Norris & Millhom Feedback regulation D35sri Bhattacharva el al Πίνακας 1. Γονίδια που υπάγονται από τον HIF-1. (A. Zargoska and J. Dulak, 2004, HIF-1: The knows and unknowns of hypoxia sensing. Acta Biochmemica Polonica 51(3): , 2004) 12

15 Η κάθε υπομονάδα του HIF-1 περιλαμβάνει δύο χαρακτηριστικές δομές: τη δομή bhlh (basic helix-loop-helix) και την δομή PAS ( per-ahr-arnt-sim) (Wang G.L. et ah, 1995). Η δομή PAS περιλαμβάνει δύο επαναλήψεις A και B και είναι υπεύθυνη για την αλληλεπίδραση του HIF-1 με άλλες πρωτεΐνες. Η δομή bhlh είναι υπεύθυνη τόσο για την πρόσδεση του HIF-1 στο DNA, όσο και για το διμερισμό των α και β υπομονάδων του(α. Zarkoska and Dulak, 2004 Wenger R.H. et al., 2002)). Για να καταστεί ο μεταγραφικός παράγοντας HIF-1 ενεργός και να μπορέσει να δράσει, θα πρέπει πρώτα η υπομονάδα HIF-la να διμεριστεί με την υπομονάδα HIF-1 β και ο HIF-1 να συνδεθεί στην HRE περιοχή του υποκινητή του γονιδίου στόχου. Ο HIF-la και ο HIF-1 β παρουσιάζουν διαφορετικά επίπεδα έκφρασης ανάλογα με τη διαθεσιμότητα του οξυγόνου. Πιο συγκεκριμένα σε συνθήκες νορμοξίας (φυσιολογικής συγκέντρωση οξυγόνου), η έκφραση του HIF-la κυμαίνεται σε πολύ χαμηλά επίπεδα, ενώ αντίθετα όταν η συγκέντρωση του οξυγόνου μειώνεται, η έκφραση της α υπομονάδας του HIF-1 αυξάνεται ραγδαία. Από την άλλη πλευρά η έκφραση του HIF-1 β στα κύτταρα είναι συνεχής και ανεξάρτητη από τη συγκέντρωση του οξυγόνου (Li H.et ah, 1996). HIF-1 α CHj 532 OH OH ,o o f- r- in't T ο CO r- <- CM PO 736 OH 803 l«n- NLS bhlh PAS ODD TAD-N LS: TAD-C JN: D.NA binding Dimerisation CBP. SRC-1, Ref-1 P3GCVCBP SRC-1, Ref-1 HlF-ip xt V- O to <3> SO «Γ> ί> N-j NLS bhlh PAS j TAO DNA binding Dimensstion Εικόνα 1. Σχηματική απεικόνιση της πρωτεϊνικής δομής των δύο υπομονάδων του HIF-1. Αναπαριστώνται οι βασικές λειτουργικές περιοχές των δύο υπομονάδων του H1F-1, καθώς και οι περιοχές πρόσδεσης των διάφορων συμπαραγόντων (Dery, M.-A.C, Michaud, M.D., Richard, D.E. Hypoxia-inducible factor 1: regulation by hypoxic and non-hypoxic activators. Int. J. Biochem. & CellBiol. 37: , 2005). 13

16 1.1.1 HIF-Ιβ Ο HIF-Ιβ είναι επίσης γνωστός και ως πυρηνικός μεταφορέας του υποδοχέα των αρυλ-υδρογονανθράκων ( Aryl Hydrocarbon Receptor Nuclear Translocator- ARNT). O ARNT πήρε το όνομά του, εξαιτίας της ικανότητάς του να διμερίζεται με τον υποδοχέα των αρυλ-υδρογονανθράκων με τον οποίο δημιουργούν το λειτουργικό υποδοχέα διοξίνης. Η β υπομονάδα του HIF-1 είναι μία πρωτεΐνη 91-94kD και αποτελείται από 789 αμινοξέα. Έχουν βρεθεί δύο επιπλέον ισομορφές για τον HIF- Ιβ, η πρωτεΐνη ARNT2 και η πρωτεΐνη ARNT 3 (BMAIL/MOP3), οι οποίες διαφέρουν από τον HIF-Ιβ στο ότι η έκφρασή τους είναι ιστο-ειδική (Semenza G.L. et al., 2000b) HIF-Ια Η υπομονάδα HIF-Ια είναι μία πρωτεΐνη 120kD και αποτελείται από 826 αμινοξέα. Εκτός από τις χαρακτηριστικές δομές bhlh και PAS στο αμινοτελικό του άκρο, ο HIF-la περιέχει και δύο περιοχές trans ενεργοποίησης, γνωστές ως TAD (Transactivation Domain) περιοχές, οι οποίες είναι υπεύθυνες για τη μεταγραφική ρύθμιση των γονιδίων-στόχων του HIF-1 (Pugh C.W. et al., 1997). Στο καρβοξυτελικό άκρο του ο HIF-Ια περιέχει μια περιοχή που είναι γνωστή ως περιοχή αποικοδόμησης που εξαρτάται από το οξυγόνο ODD (Oxygen Dependent Degradation Domain) και η οποία είναι υπεύθυνη για την αποικοδόμηση του HIF-la σε συνθήκες νορμοξίας (Huang L.E. et al., 1998). Η περιοχή ODD περιλαμβάνει με τη σειρά της δύο μοτίβα PEST-like, τα οποία είναι αλληλουχίες πλούσιες σε κατάλοιπα προλίνης (Ρ), γλουταμινικού οξέως (Ε), σερίνης (S) και θρεονίνης (Τ) (Rechsteiner & Rogers, 1996), των οποίων ο ρόλος θα περιγράφει στη συνέχεια. Τέλος ο HIF-la περιλαμβάνει και δύο αλληλουχίες, οι οποίες λειτουργούν ως σήματα πυρηνικού εντοπισμού NLS (Nuclear Localization Signals), που είναι σημαντικές για την αποτελεσματική είσοδο του HIF-la στον πυρήνα (Kalio P.J. et al., 1998) (Εικόνα 2). 14

17 Έχουν βρεθεί δύο επιπλέον ισομορφές για τον HIF-la, ο HIF-2a, γνωστός και ως Ενδοθηλιακή περιοχή PAS (EPAS, Endothelial PAS domain protein 1) και o HIF-3a (Tian H. et al ). 0 FIIF-2a παρουσιάζει αρκετές ομοιότητες με τον HIF-la τόσο ως προς την πρωτεϊνική του δομή, όσο και ως προς τον τρόπο ρύθμισης της έκφρασής του με βάση τη συγκέντρωση του οξυγόνου. Ο HIF-3a παρουσιάζει επίσης ομολογία με τον HIF-1 α αλλά δεν περιέχει τις περιοχές TAD και πιθανολογείται ότι λειτουργεί ως αρνητικός ρυθμιστής της επαγόμενης από την υποξία έκφρασης των γονιδίων. Η αρνητική αυτή ρύθμιση φαίνεται να οφείλεται στη δράση της πρωτεΐνης αναστολής της PAS περιοχής (IPAS, Inhibitory PAS protein), η οποία αποτελεί ένα προϊόν εναλλακτικού ματίσματος του HIF-3a. Η IPAS έχει βρεθεί ότι λειτουργεί ως ανταγωνιστής του HIF-la, καθώς έχει την ικανότητα να αλληλεπιδρά με τον ARNT, παρεμποδίζοντας έτσι το διμερισμό του με τον HIF-la και επιπλέον παρεμποδίζει την πρόσδεση του HIF-la στις περιοχές HREs (Makino Υ. et al., 2002) ΡΥΘΜΙΣΗ TOY HIF-la ΑΠΟ ΤΑ ΕΠΙΠΕΔΑ ΟΞΥΓΟΝΟΥ Κατά τη νορμοξία, ο HIF-la υπόκειται σε ουβικουιτινίωση και αποικοδόμηση μέσω πρωτεόλυσης, η οποία πραγματοποιείται από το 26S πρωτεόσωμα (Kalio P.J. et al., 1999). Στην διαδικασία της ουβικουιτινίωσης του HIF-la κύριο ρόλο παίζει η ογκοκατασταλτική πρωτεΐνη von Hippel-Lindau (pvhl, von Hippel-Lindau tumor suppressor ptrotein). H pvhl, αλληλεπιδρά απευθείας με την περιοχή αποικοδόμησης που εξαρτάται από το οξυγόνο ODD του HIF-la (Bonicalzi Μ.Ε. at al., 2001). Η pvhl δρα σαν υπόστρωμα, το οποίο αναγνωρίζεται από την Ε3 λιγάση της ουβικουιτίνης. Η λιγάση αυτή μετά την πρόσδεση του HIF-la οδηγεί στην στρατολόγηση ενός συμπλέγματος πρωτεϊνών του μηχανισμού της ουβικουιτινίωσης, οι οποίες με τη σειρά τους οδηγούν τον HIF-la στο πρωτεόσωμα για αποικοδόμηση (Semanza G.L., 2001). Η pvhl συνδέεται με την περιοχή ODD του HIF-la σε συνθήκες νορμοξίας, ενώ υπό συνθήκες υποξίας, η pvhl δεν συνδέεται με τον HIF-la, με αποτέλεσμα τη σταθεροποίηση και τη συσσώρευση του τελευταίου(μ3χ\νε11 Ρ.Η. et al., 1999). Η αλληλεπίδραση αυτή ανάμεσα στην pvhl και τον HIF-la ρυθμίζεται από την υδροξυλίωση του HIF-la, η οποία εξαρτάται από τα επίπεδα του οξυγόνου και του 15

18 σιδήρου. Ο ανθρώπινος HIF-la, υδροξυλιώνεται στα κατάλοιπα προλίνης 402 (Pro402) και 564 (Pro 564), τα οποία βρίσκονται στην περιοχή ODD. Η υδροξυλίωση του HIF-la προηγείται και είναι απαραίτητη για τη σύνδεσή του με την pvhl και για την περαιτέρω επεξεργασία και τελική αποικοδόμηση του HIF-1 (Ivan Μ. et al., 2001) (Εικόνα 3). NORM ΟΧΙΑ degradation Prote as ome 26S Εικόνα 3. Ρύθμιση της σταθερότητας του HIF-la. Σε συνθήκες νορμοξίας οι προλύλυδροξυλάσες (PHDs), υδροξυλιώνουν τα κατάλοιπα προλίνης 402 και 564 ( Pro 402, Pro 564), τα οποία βρίσκονται στην περιοχή αποικοδόμησης που εξαρτάται από το οξυγόνο (ODD) του HIF-la. Στη συνέχεια, η ογκοκατασταλτική πρωτεΐνη von Hippel-Lindau (pvhl), προσδένεται στην περιοχή ODD και οδηγεί στη στρατολόγηση του συμπλέγματος της λιγάσης της ουβικουιτίνης Ε3. Με αυτόν τον τρόπο ο HIF-la, ουβικουτινιώνεται και ακολούθως αποικοδομείται από το πρωτεόσωμα S26. Σε συνθήκες υποξίας οι προλύλυδροξυλάσες καθίστανται ανενεργός και με αυτόν τον τρόπο εμποδίζεται η πρόσδεση της pvhl στην περιοχή ODD. Έτσι ο HIF-la αποφεύγει την ουβικουιτινίωση και την πρωτεοσωμική αποικοδόμηση και μπορεί στη συνέχεια να μεταφερθεί στον πυρήνα, όπου μετά από διμερισμό με τον HIF-Ιβ, ενεργοποιεί τη μεταγραφή των γονιδίων στόχων του. (Α. Zargoska and J. Dulak, HIF-1: The knows and unknowns of hypoxia sensing. Acta Biochmemica Polonica 51 (3): ,2004) 16

19 Η υδροξυλίωση των καταλοίπων προλίνης της περιοχής ODD του HIF-la καταλύεται από ειδικά ένζυμα που καλούνται προλυλ-υδροξυλάσες (PHD, prolylhydroxylases). Οι PHDs, είναι διοξυγενάσες που απαιτούν οξυγόνο και 2- κετογλουταρικό και εξαρτώνται και από το σίδηρο. Τα ένζυμα αυτά μεταφέρουν ένα άτομο οξυγόνου στο κατάλοιπο προλίνης της περιοχής ODD, το οποίο και υδροξυλιώνουν, ενώ ένα δεύτερο άτομο οξυγόνου αντιδρά με το 2-κετογλουταρικό, παράγοντας ηλεκτρικό οξύ (Semenza G.L., 2001). Έχουν βρεθεί τρεις παρόμοιες προλυλ-υδροξυλάσες, οι PHD1, PHD2 και PHD3, οι οποίες έχουν την ικανότητα να υδροξυλιώνουν τον HIF-la. Τόσο η PHD1, όσο και η PHD2 και η PHD3, εξαρτώνται από το 2- κετογλουταρικό και απαιτούν μοριακό οξυγόνο ως συν-υπόστρωμα και με αυτόν τον τρόπο συνδέουν τη διαθεσιμότητα οξυγόνου με τη ρύθμιση του HIF-la, δρώντας σαν αισθητήρες οξυγόνου (Epstein A. et al., 2001) Εκτός από την υδροξυλίωση των καταλοίπων προλίνης της περιοχής ODD του HIF-la, σημαντικό ρόλο για την αποικοδόμηση του HIF-la σε φυσιολογικές συγκεντρώσεις οξυγόνου παίζει και η ακετυλίωση ενός καταλοίπου λυσίνης (lys532) από την ARD-1 ακετυλοτρανσφεράση. Η ακετυλίωση αυτή του καταλοίπου λυσίνης έχει ως αποτέλεσμα την πιο αποτελεσματική πρόσδεση της ογκοκατασταλτικής πρωτεΐνης pvhl στον HIF-la και κατ επέκταση της αποικοδόμησή του από το πρωτεόσωμα ( Jeong J.W. et al., 2002) ΡΥΘΜΙΣΗ ΣΕ ΕΠΙΠΕΔΟ ΜΕΤΑΓΡΑΦΙΚΗΣ ΕΝΕΡΓΟΤΗΤΑΣ Για να αποκτήσει ο HIF-1 πλήρη μεταγραφική ενεργότητα, θα πρέπει να προσδεθεί στην ειδική αλληλουχία στόχο του DNA, γνωστή και ως αλληλουχία HRE και να στρατολογήσει σε αυτή διάφορους μεταγραφικούς συμπαράγοντες. Η διαδικασία αυτή υπόκειται σε οξυγονο-εξαρτώμενη ρύθμιση. Όπως έχει ήδη αναφερθεί για τις περιοχές trans ενεργοποίησης του HIF-1 (TADs), κύριος ρόλος τους είναι να επιτελούν αυτή τη διαδικασία στρατολόγησης των συμπαραγόντων στους υποκινητές των γονιδίων στόχων του HIF-1. Ο κυριότερος συμπαράγοντας, ο οποίος έχει βρεθεί ότι αλληλεπιδρά με τις TAD-C περιοχές του HIF-1, είναι ο παράγοντας p300/cbp (Gu J. et al., 2001). 17

20 JN ormoxi a H ypoxia l No Tran sac tivation i HRE promoter An giog ai esis, Gly co lysis, Erytlvrop aiesis Tr ansferrin Εικόνα 5. Ρύθμιση της μεταγραφχκής ενεργότητας του HIF-la. Σε συνθήκες νομοξίας ο HIF-la, υφίσταται επιπλέον υδροξυλίωση στο κατάλοιπο ασπαραγίνης 803 (Asn 803), το οποίο βρίσκεται στην TAD-C περιοχή του. Η υδροξυλίωση αυτή εμποδίζει την αλληλεπίδρασή του HIF-la με τους διάφορους συμπαράγοντες, όπως είναι ο p300/cbp, και κατ επέκταση την ενεργοποίησή της μεταγραφής του. Σε συνθήκες υποξίας, και απουσία της πρωτεΐνης IPAS ( πρωτεΐνη αναστολής της PAS περιοχής) και του ενζύμου FIH (παράγοντας αναστολής του HIF-la), που έχουν την ικανότητα να προσδένονται στον HIF-la, εμποδίζοντας το διμερισμό του με τον ARNT, πραγματοποιείται κανονικά η μεταγραφή, των γονιδίων στόχων του HIF-la.( Daniel J. Brat, Balveen Kaur, Erwin G. Van Meir, Genetic modulation of hypoxia induced gene expression and angiogenesis: relevance to brain tumors, Bioscience 8, d , 2003) Έχει βρεθεί ότι σε συνθήκες νορμοξίας, το υψηλά συντηρημένο κατάλοιπο ασπαραγίνης στη θέση 803 (Asn803) της περιοχής TAD-C υφίσταται υδροξυλίωση (Lando D. et al., 2002a). Η υδροξυλίωση αυτή καταλύεται από τον παράγοντα αναστολής του HIF-1 (FIH, factor inhibiting HIF-la) (Lando D. et al., 2002b). O FIH-1 είναι μία δεοξυγενάση, η οποία όπως και οι προλυλ-υδροξυλάσες χρησιμοποιεί ως υπόστρωμα τον Fe2+ και το 2-οξυγλουταρικό (Lando D. et al., 2002a). Η υδροξυλίωση της Asn803, έχει ως αποτέλεσμα την αποσιώπηση των περιοχών TADs, επειδή εμποδίζει την αλληλεπίδραση του HIF-1 με τον συμπαράγοντα p300/cbp και επομένως αναστέλλει την έκφραση των γονιδίων στόχων του HIF-1 (Lando D. et al., 2002a). 18

21 1.1.5 ΕΠΑΓΩΓΗ TOY HIF-1 ΣΕ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΚΕΣ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΕΙΣ ΟΞΥΓΟΝΟΥ Με ενδιαφέρον όλο και περισσότερες μελέτες υποδεικνύουν ότι η επαγωγή του HIF-1 μπορεί να συμβεί και κάτω από φυσιολογικές συγκεντρώσεις οξυγόνου, από διάφορους παράγοντες. Στους παράγοντες αυτούς ανήκουν οι «μιμητές της υποξίας», οι οποίοι δρουν σαν αναστολείς των προλυλ- υδροξυλασών καθώς και των ασπαραγινυλ-υδροξυλασών. «Μιμητές της υποξίας», θεωρούνται μόρια που αντικαθιστούν το σίδηρο, όπως είναι τα δισθενή μέταλλα (Co, Νϊ ) και μόρια τα οποία είναι ανάλογα του 2- οξυγλουταρικού. Το κοβάλτιο, πιθανόν δρα σαν μιμητής της υποξίας, που σταθεροποιεί τον HIF-la σε συνθήκες νορμοξίας (Salnikow Κ. et al., 2000). Ο μηχανισμός δράσης του κοβαλτίου για τη σταθεροποίηση του HIF-la σε φυσιολογικές συγκεντρώσεις οξυγόνου, έχει προταθεί πρόσφατα και αφορά την αναστολή της δράσης των προλυλ-υδροξυλασων μέσω της αντικατάστασης του σιδήρου τους (Epstein A. et al., 2001; Wang G. et al.,1995). Ωστόσο για το Co έχει προταθεί ότι μπορεί να δρα και μέσω άλλων μηχανισμών. Ένας τέτοιος μηχανισμός, προτείνει ότι το κοβάλτιο αλληλεπιδρά απ ευθείας με τον HIF-la, και με αυτόν τον τρόπο εμποδίζει την αλληλεπίδρασή του με την pvhl (Yuan Υ. et al., 2003). Ένας τρίτος μηχανισμός δράσης για την επαγωγή του HIF-la από το κοβάλτιο σε συνθήκες νορμοξίας στα λεία μυϊκά κύτταρα, προτείνει τη μεταφραστική ρύθμιση της σύνθεσης του HIF-la μέσω του σηματοδοτικού μονοπατιού της ΡΙ3Κ (Chachami G. et al., 2004). Ένας άλλος παράγοντας που δρα σαν «μιμητής της υποξίας» σε συνθήκες νορμοξίας όπως το κοβάλτιο είναι η δεσφεριοξαμίνη (DFO) (Salnikow Κ. et al., 2000; Chachami G. et al., 2004). Η δεσφεριοξαμίνη είναι ένας χηλικός παράγοντας σιδήρου, ο οποίος εμποδίζει τη δράση των προλυλ-υδροξυλασών, αντικαθιστώντας το σίδηρο που περιέχεται στις καταλυτικές τους περιοχές (Wang G.L. et ah, 1993). Στους παράγοντες που έχουν την ικανότητα να επάγουν τον HIF-la σε συνθήκες νορμοξίας, περιλαμβάνονται επίσης διάφορες ορμόνες και αυξητικοί παράγοντες. Τέτοιοι είναι κυτοκίνες, όπως η ιντερλευκίνη 1β καθώς επίσης και διάφοροι αυξητικοί παράγοντες, όπως είναι η ινσουλίνη, ο ινσουλοεξαρτώμενος αυξητικός παράγοντας τύπου 1 (IGF-1, insulin-like growth factor-1), ο επιδερμικός αυξητικός 19

22 παράγοντας (EGF, epidermal growth factor), ο αυξητικός παράγοντας μετασχηματισμού- βι ( TGF-βι transforming growth factor- βι) και ο αυξητικός παράγοντας των ινοβλαστών 2 (FGF-2, fibroblast growth factor) ( Hellwing-Burgel et al., 1999; Richard D.E. et ah, 2000; Gorlach A.et al., 2001; Stiehl D.P. et ah, 2002; Jiwon Lee et al., 2004). Όλοι οι παραπάνω παράγοντες πιθανολογείται ότι επάγουν την έκφραση του HIF-la σε συνθήκες νορμοξίας, είτε μέσω της ενεργοποίησης του μονοπατιού της κινάσης της 3 φωσφατιδιλοϊνοσιτόλης (PI3K/Akt), προκαλώντας αύξηση της σύνθεσης του HIF-la, είτε/ και μέσω της ενεργοποίησης του μονοπατιού των ΜΑΡΚ, προκαλώντας την αύξηση της ενεργότητάς ( Zhong Η. et al., 2000; Zundel W. et al., 2000; Laugher E. et al., 2001) (Εικόνα 6). growth factors PI3K Ras Εικόνα 6. Αυξητικοί παράγοντες επάγουν τη σύνθεση του HIF-la ανεξάρτητα από τα επίπεδα οξυγόνου μέσω της ενεργοποίησης σηματοδοτικών μονοπατιών. Αυξητικοί παράγοντες προσδένονται σε γειτονικούς υποδοχείς κινάσης τυροσίνης και οδηγούν στην ενεργοποίηση σηματοδοτικών μονοπατιών, όπως αυτό της κινάσης της 3 φωσφατιδιλοϊνοσιτόλης (PI3K/Akt) και των ΜΑΡΚ και κατ επέκταση στην επαγωγή της μετάφρασης διαφόρων mrna, μεταξύ των οποίων, το mrna του HIF-la. (Ji-Won Lee, Seong-Hui Bae, Joo-Won Jeong, Se-Hee Kim and Kyu-Won Kim. Hypoxia-inducible factor (HIF-l)a: its protein stability and biological functions. Exp. Moi Med. 36(1), 1-12, 2004) 20

23 1.2 ΑΝΑΠΝΕΥΣΤΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ ΚΑΙ ΥΠΟΞΙΑ Το αναπνευστικό σύστημα, για να μπορέσει να ανταποκριθεί σε συνθήκες μειωμένης συγκέντρωσης οξυγόνου, έχει αναπτύξει εξελικτικές ομοιοστατικές αποκρίσεις, οι οποίες οδηγούν στην επαναφορά της ισορροπίας μεταξύ αερισμού και διανομής του οξυγόνου στους ιστούς. Έτσι εξασφαλίζεται η παροχή του οξυγόνου στον οργανισμό. Κατά την οξεία υποξία, παρατηρείται συστολή των πνευμονικών αρτηριών, αυξημένη αρτηριακή πίεση καθώς και ανακατανομή της αιματικής ροής από το κατώτερο προς το ανώτερο μέρος του πνεύμονα (Yu F.et al., 1998). Κατά τη χρόνια υποξία παρατηρείται αγγειακή αναδιαμόρφωση των πνευμονικών αρτηριών, η οποία μπορεί να οδηγήσει σε αρτηριακή υπέρταση. Η χρόνια υποξία παρατηρείται κυρίως σε άτομα που πάσχουν από προχωρημένες ασθένειες του αναπνευστικού συστήματος, καθώς και από άτομα που ζουν σε υψηλά υψόμετρα, όπου η συγκέντρωση του ατμοσφαιρικού οξυγόνου είναι αρκετά χαμηλή (Leach R.M. and Treacher D.F., 1995;Leach R.M., et al.,2002). Τα αποτελέσματα τη έκθεσης σε χαμηλές συγκεντρώσεις οξυγόνου είναι επίσης εμφανή και στο ανώτερο αναπνευστικό σύστημα. Συγκεκριμένα, έχει βρεθεί ότι in vivo, η χρόνια υποξία οδηγεί σε υπερπλασία των λείων βρογχικών μυών (Flulsmann A.R. et al., 1997)και αύξηση των συσπάσεων σε απομονωμένη τραχεία κουνελιού((21αγίοη R.A., et al., 1999). In vitro, προτείνεται ότι τα επίπεδα του οξυγόνου διαμορφώνουν την ανάπτυξη των λείων μυϊκών κυττάρων του αναπνευστικού συστήματος, με την οξεία υποξία να επάγει των πολλαπλασιασμό των λείων μυϊκών κυττάρων του αναπνευστικού συστήματος και τη χρόνια υποξία να τον εμποδίζει (Cogo A. et al., 2003). In vivo, τα επίπεδα του οξυγόνου έχει αποδειχθεί ότι συνδέονται άμεσα με την έκφραση του HIF-la σε πολλούς κυτταρικούς τύπους, οι οποίοι απαντώνται στο αναπνευστικό σύστημα. Με αυτόν τον τρόπο επιβεβαιώνεται η συμμετοχή του HIF- 1α στις φυσιολογικές και παθοφυσιολογικές αποκρίσεις του αναπνευστικού συστήματος στην υποξία. 21

24 1.2.1 ΛΕΙΑ ΜΥΪΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ ΒΡΟΓΧΩΝ Στο αναπνευστικό σύστημα, τα λεία μυϊκά κύτταρα καλύπτουν το εσωτερικό των αεραγωγών. Τα λεία μυϊκά κύτταρα δε διαφοροποιούνται πλήρως και διατηρούν την ικανότητά τους για συστολή, μετανάστευση, πολλαπλασιασμό, έκκριση αυξητικών παραγόντων και κυτοκινών. Τα λεία μυϊκά κύτταρα των βρόγχων συστέλλονται προκειμένου να ρυθμίζουν τη διάμετρό των αεραγωγών (Owens, 1995; Thyberg, 1996). Η κύρια λειτουργία των κυττάρων αυτών είναι η σύσπαση, η οποία εξαρτάται από την έκφραση μιας σειράς συσταλτών και ρυθμιστικών πρωτεϊνών, οι οποίες βρίσκονται στα κύτταρα σε αυστηρά ελεγχόμενες συγκεντρώσεις (Horowitz et al., 1996). Πρόσφατα έχει δειχθεί, ότι η μείωση των επιπέδων οξυγόνου σε μη φυσιολογικά επίπεδα στο περιβάλλον καλλιέργειας λείων μυϊκών κυττάρων που προέρχονται από τραχεία κουνελιού, οδηγεί σε επαγωγή του HIF-la.. Προσθήκη κοβαλτίου στο θρεπτικό μέσο καλλιέργειας των λείων μυϊκών κυττάρων τραχείας κουνελιού, σε φυσιολογικές συνθήκες οξυγόνου είχε επίσης ως αποτέλεσμα την επαγωγή του HIFla (Chachami G. et al., 2004). 22

25 1.3 ΣΚΟΠΟΣ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗΣ Ο μεταγραφικός παράγοντας HIF-1 ρυθμίζει την έκφραση γονιδίων που μεσολαβούν στην κυτταρική απόκριση στην υποξία. Η ρυθμιζόμενη υπομονάδα του, HIF-la επάγεται σε συνθήκες μειωμένης συγκέντρωσης οξυγόνου. Η επαγωγή του HIF-la μπορεί να συμβεί και σε φυσιολογικές συγκεντρώσεις οξυγόνου από παράγοντες που πιστεύεται ότι δρουν μιμούμενοι τις συνθήκες υποξίας και από αυξητικούς παράγοντες. Τα λεία μυϊκά κύτταρα του αναπνευστικού συστήματος ρυθμίζουν τη διάμετρο των αεραγωγών και κατά συνέπεια την ποσότητα του οξυγόνου που φτάνει στους πνεύμονες. Σε προηγούμενη μελέτη έχει δειχθεί ότι σε πρωτογενείς καλλιέργειες λείων μυϊκών κυττάρων τραχείας κουνελιού, τα οποία εκτέθηκαν σε υποξία και επεξεργάστηκαν με C0CI2, παρουσία ορού, προκλήθηκε επαγωγή της έκφρασης του HIF-la (Chachami et al., 2004). Σκοπός της συγκεκριμένης εργασίας, είναι η διερεύνηση της επαγωγής του HIF-la σε πρωτογενείς καλλιέργειες ανθρώπινων λείων μυϊκών κυττάρων βρόγχων, με σκοπό να εξακριβωθεί αν το παραπάνω κυτταρικό μοντέλο είναι κατάλληλο για τη μελέτη της επαγωγής του HIF-1 και των γονιδίων στόχων του. Υγκεκριμένα μελετάται η επίδραση της υποξίας και παραγόντων που φαίνεται ότι λειτουργούν ως μιμητές της υποξίας στην επαγωγή του HIF-la στα ανθρώπινα ΑΜΚΒ. Σε αυτούς τους παράγοντες, περιλαμβάνονται το κοβάλτιο και η δεσφεριοξαμίνη. Επιπλέον μελετάται η επίδραση της επεξεργασίας των ανθρώπινων ΛΜΚΒ σε διαφορετικές συγκεντρώσεις υποξίας, και συγκεκριμένα σε συγκεντρώσεις οξυγόνου 1% και 6%, στην επαγωγή του HIF-la. Επίσης διερευνάται και η επίδραση της καρβαχόλης, ενός χολινεργικού αγωνιστή της ακετυλοχολίνης στην επαγωγή του HIF-la στα ανθρώπινα ΛΜΚΒ. 23

26 2. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 2.1 Πρωτογενείς καλλιέργειες λείων μυϊκών κυττάρων βρόγχων Χρησιμοποιήθηκαν φυσιολογικά ανθρώπινα λεία μυϊκά κύτταρα βρόγχων (ΛΜΚΒ) (Bronchial Smooth Muscle Celles, BSMC) από την εταιρεία Clonetics (BSMC, Clonetics). Τα ανθρώπινα ΛΜΚΒ καλλιεργούνται σε θρεπτικό μέσο DMEM-F12, το οποίο περιέχει αντιβιοτικά πενικιλίνη/στρεπτομυκίνη (PS) και 10% ορό εμβρύου βοός (FBS) και αφήνονται να επωαστούν σε κλίβανο, στους 37 C παρουσία ατμόσφαιρας 5% σε CO2. Ο χρόνος διπλασιασμού των κυττάρων ήταν κατά μέσο όρο 30 ώρες. Κάθε 48 ώρες γίνεται αλλαγή του θρεπτικού μέσου της φλάσκας. Όταν η φλάσκα είναι σχεδόν πλήρης, αφαιρείται το θρεπτικό μέσο και τα κύτταρα ξεπλένονται με ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών αλάτων (phosphate buffer saline - PBS). Εν συνεχεία προστίθεται στα κύτταρα 0,25% τρυψίνη σε PBS και η φλάσκα μεταφέρεται για επώαση στον κλίβανο στους 37 C παρουσία 5% CO2 για 5 min. Η τρυψίνη προκαλεί την αποκόλληση των κυττάρων από την επιφάνεια της φλάσκας. Ακολούθως προστίθεται στα ανθρώπινα ΛΜΚΒ θρεπτικό διάλυμα DMEM-F12 που περιέχει 10% FBS και PS και τα κύτταρα μεταφέρονται σε τρυβλία Petri, όπου θα λάβουν χώρα οι περαιτέρω πειραματικές διαδικασίες. 2.2 Πάγωμα κυττάρων Τα κύτταρα πλένονται με PBS και στη συνέχεια προστίθεται σε αυτά 0,25% τρυψίνη σε PBS (2ml σε κάθε φλάσκα επιφάνειας 75 cm2). Ακολουθεί επώαση των κυττάρων στον κλίβανο στους 37 C παρουσία ατμόσφαιρας 5% σε CO2 για 5 min. Σε κάθε φλάσκα επιφάνειας 75cm2, προστίθενται 10ml θρεπτικού μέσου DMEM-F12, το οποίο περιέχει PS και 10% FBS. Το περιεχόμενο της φλάσκας μεταφέρεται σε ένα πλαστικό σωλήνα και ακολουθεί φυγοκέντρηση για 5min στα 200g. Το υπερκείμενο αποχύνεται και το ίζημα που προέκυψε από τη φυγοκέντρηση και στο οποίο 24

27 περιέχονται τα κύτταρα, επαναιωρείται σε θρεπτικό μέσο DMEM-F12, το οποίο περιέχει PS και 10% FBS, το οποίο περιέχει διμέθυλο-σουλφοξείδιο (dimethylsulfoxide - DMSO) σε τελική συγκέντρωση 10%. Στη συνέχεια τα κύτταρα μεταφέρονται σε ειδικά σωληνάρια κατάψυξης (cryotube), τα οποία αφήνονται για 15min σε θερμοκρασία δωματίου και ακολούθως τοποθετούνται στους -80 C. Τα κύτταρα μπορούν να αποθηκευτούν στους -80 C για διάστημα μερικών μηνών. Στην περίπτωση που επιθυμούμε τη διατήρηση των κυττάρων για μεγαλύτερο χρονικό διάστημα, αυτά τοποθετούνται σε υγρό άζωτο. 2.3 Ξεπάγωμα κυττάρων Για να ξεπαγώσουν τα κύτταρα, τα ειδικά σωληνάρια κατάψυξης στα οποία περιέχονται, τοποθετούνται γρήγορα κάτω από το τρεχούμενο νερό της βρύσης. Στη συνέχεια τα κύτταρα μεταφέρονται σε καθαρό πλαστικό σωλήνα, όπου τους προστίθεται σταγόνα σταγόνα 10 ml θρεπτικού μέσου DMEM-F12, το οποίο περιέχει PS και 10% FBS. Εν συνεχεία πραγματοποιείται φυγοκέντρηση των κυττάρων για 3min στα 200g. Το υπερκείμενο αποχύνεται, ενώ το ίζημα, στο οποίο περιέχονται τα κύτταρα επαναιωρείται σε 10ml θρεπτικού μέσου DMEM-F12, το οποίο περιέχει PS και 10% FBS. Τέλος τα κύτταρα μεταφέρονται σε φλάσκα για επώαση στους 37 C παρουσία ατμόσφαιρας 5% σε CO Ταυτοποίηση λείων μυϊκών κυττάρων Η ταυτοποίηση των λείων μυϊκών κυττάρων έγινε με τη μέθοδο του έμμεσου ανοσοφθορισμού και με τη χρήση αντισώματος κατά της α-ακτίνης των λείων μυών του ανθρώπου ( μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού Sigma) (Skali Ο. et al., 1986). 25

28 2.4.1 Έμμεσος Ανοσοφθορισμός Αρχικά τα κύτταρα μεταφέρονται σε τρυβλία Petri, στα οποία προηγουμένως έχουν τοποθετηθεί γυάλινες καλυπτρίδες. Τα κύτταρα προσκολλώνται στις καλυπτρίδες και με τον τρόπο αυτό μπορούν να χρησιμοποιηθούν στα επόμενα βήματα της πειραματικής διαδικασίας. Μετά την κατεργασία των κυττάρων όπως αναφέρεται παρακάτω (2.5 Κατεργασία Κυττάρων), οι καλυπτρίδες μεταφέρονται σε πιάτο 24 θέσεων και τα κύτταρα ξεπλένονται με ρυθμιστικό διάλυμα PBS. Στη συνέχεια πραγματοποιείται μονιμοποιήση των κυττάρων, με προσθήκη διαλύματος 3% φορμαλδεΰδης σε PBS, για 5min σε θερμοκρασία δωματίου. Τα κύτταρα ξεπλένονται με ρυθμιστικό διάλυμα PBS δύο φορές για 5min κάθε φορά, έτσι ώστε να απομακρυνθεί τελείως η φορμαλδεΰδη. Εν συνεχεία τα κύτταρα επωάζονται σε διάλυμα PBS-l%Triton Χ-100 για 15min στους 4 C, έτσι ώστε να κατασταθεί η μεμβράνη των κυττάρων διαπερατή. Ακολουθεί ξέπλυμα των κυττάρων με ρυθμιστικό διάλυμα PBS για 5min σε θερμοκρασία δωματίου. Ακολούθως τα κύτταρα μπλοκάρονται με τη χρήση διαλύματος PBS-0,1% Tween 20-3% αλβουμίνη ορού βοός (BSA) και αφήνονται για 1-18 ώρες στους 4 C. Η αλβουμίνη από ορό βοός συμβάλει στην αποφυγή της μη ειδικής σύνδεσης του αντισώματος που χρησιμοποιείται στη συνέχεια της πειραματικής διαδικασίας. Ακολουθεί μεταφορά των καλυπτρίδων σε ένα καθαρό πιάτο 24 θέσεων και επώαση των κυττάρων είτε με το πρώτο μονοκλωνικό αντίσωμα κατά της α-ακτίνης των λείων μυών του ανθρώπου (anti-sm-a-actin) (αραίωση 1:400 σε διάλυμα PBS-0,1% Tween 20-1% BSA) είτε με το πρώτο μονοκλωνικό αντίσωμα anti-hif-ι (αραίωση 1:200 σε διάλυμα PBS-0,1% Tween 20-1% BSA), για Ιώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Τα κύτταρα ξεπλένονται με διάλυμα PBS-0,1% Tween 20-1% BSA τρεις φορές, για 10min την κάθε φορά. Ακολούθως τα κύτταρα επωάζονται με το δεύτερο αντίσωμα κατά της IgG του ποντικού συζευγμένο με τη φθορίζουσα ομάδα FITC (goat anti-mouse), αραιωμένο 1:50 σε διάλυμα PBS-0,1% Tween 20-1% BSA, για 30min σε θερμοκρασία δωματίου. Ξέπλυμα των κυττάρων με διάλυμα PBS-0,1% Tween 20-1% BSA τρεις φορές για 5min την κάθε φορά. Στη συνέχεια, οι καλυπτρίδες εμβαπτίζονται σε απεσταγμένο νερό, στεγνώνονται και τοποθετούνται ανάποδα σε αντικειμενοφόρο πλάκα στη οποία προηγουμένως έχει 26

29 τοποθετηθεί μία σταγόνα Vectashield, το οποίο περιέχει 4,6διαμιδο-2φαινυλ-ινδόλη (DAPI) για χρώση του DNA. Τέλος, παρατηρούμε τις καλυπτρίδες σε μικροσκόπιο φθορισμού Optiphot-2. Γίνεται λήψη φωτογραφιών με το σύστημα κάμερας UFX- DX (Nikon). 2.5 Κατεργασία κυττάρων - Μελέτη της επαγωγής του HIF-la Πριν την κατεργασία των κυττάρων για τη μελέτη της επαγωγής του HIF-la, πραγματοποιείται αλλαγή του θρεπτικού μέσου (DMEM-F12) στο οποίο βρίσκονται τα κύτταρα και επώαση των κυττάρων με το νέο θρεπτικό για 1 ώρα στον κλίβανο στους 37 C παρουσία 5% CO2. Η επίδραση των επαγωγέων του HIF-la στα ανθρώπινα ΛΜΚΒ έγινε ως εξής: 1. Υποψία (1% και 6%): Τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε θάλαμο υποξίας όπου η συγκέντρωση του οξυγόνου ρυθμίστηκε κατάλληλα. 2. Κοβάλτιο (Co2+)\ Στο θρεπτικό μέσο προστέθηκε κοβάλτιο σε τελική συγκέντρωση ΙΟΟμΜ. 3. Δεσφεριοζαμ,ίνη (DFO)\ Στο θρεπτικό μέσο προστέθηκε δεσφεριοξαμίνη σε τελική συγκέντρωση 130μΜ. 4. Καρβαγόλη (CCH): Στο θρεπτικό μέσο προστέθηκε καρβαχόλη σε τελική συγκέντρωση ΙΟΟμΜ. Τα κύτταρα επωάστηκαν με τους παραπάνω επαγωγείς, για 4 ώρες Παρασκευή εκχυλισμάτων ολικής πρωτεΐνης λείων μυϊκών κυττάρων ΔΙΑΛΥΜΑ ΛΥΣΗΣ ΚΥΤΤΑΡΩΝ (Xvsis Buffer) 20mM Tris-Cl ph 8,0 150mM NaCl 1% Triton X pg/ml φθορο-φαινυλ-μεθυλ-σουλφίδιο (PMSF) ImM διθειοθρειτόλη (DTT) ImM Na3VC>4 lomm β-glycerolphosphate 27

30 Μετά το πέρας του χρόνου επώασης με τους επαγωγείς, αφαιρείται το θρεπτικό μέσο (DMEM-F12) και τα κύτταρα ξεπλένονται με διάλυμα 1 x PBS, το οποίο περιέχει 100pg/ml φθορο-φαινυλ-μεθυλ-σουλφίδιο (PMSF). Στη συνέχεια 50μ1 διαλύματος λύσης προστίθεται και τα κύτταρα αποκολλώνται από τα τρυβλία Petri (scrape). Τα κύτταρα μεταφέρονται σε σωλήνα τύπου eppendorf και επωάζονται στον πάγο για lomin. Ακολουθεί φυγοκέντρηση των κυττάρων για 30 min στις rpm και στους 4 C. Το υπερκείμενο που προέκυψε από τη φυγοκέντρηση, μεταφέρεται σε καθαρό σωληνάριο, όπου και διατηρείται για να χρησιμοποιηθεί αργότερα κατά την πειραματική διαδικασία Προσδιορισμός πρωτεϊνικής συγκέντρωσης των δειγμάτων (Μέθοδος Bradford) Ο προσδιορισμός της συγκέντρωσης των πρωτεϊνών του δείγματος, έγινε με τη φωτομετρική μέθοδο Bradford. Ποσότητα από το υπερκείμενο της παραπάνω φυγοκέντρησης, μεταφέρεται σε καθαρό σωληνάριο τύπου eppendorf και χρησιμοποιείται για την πραγματοποίηση της μεθόδου Bradford. Σύμφωνα με το πρωτόκολλο της συγκεκριμένης μεθόδου, προστίθενται στο σωληνάριο με το υπερκείμενο 795 μΐ Η20 και 200μ1 διαλύματος χρωστικής Biorad και ακολουθεί επώαση για 5min σε θερμοκρασία δωματίου για σταθεροποίηση του χρώματος. Ακολούθως το παραπάνω δείγμα φωτομετρείται στα 595nm. Η συγκέντρωση των πρωτεϊνών στο δείγμα που φωτομετρήθηκε υπολογίζεται βάση μιας πρότυπης καμπύλης, η οποία προκύπτει από τη φωτομέτρηση πρότυπων διαλυμάτων αλβουμίνης ορού βοός (BSA) (Εικόνα 8) 28

31 BSA (pg/ml) O.D. (595nm) 1 0, , , ,33 8 0, , , , , ,249 Εικόνα 8. Πρότυπη καμπύλη πρωτεϊνικής συγκέντρωσης κατά Bradford 2.6 ΑΝΑΛΥΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΜΕ ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΚΑΙ ΑΝΟΣΟΑΠΟΤΥΠΩΣΗ Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου παρουσία αποδιατακτικού μέσου (SDS PAGE) Προετοιμασία Δειγμάτων Για την υλοποίηση του συγκεκριμένου πειράματος, χρησιμοποιούνται 75 μΐ (ή 3 όγκοι) από το υπερκείμενο που προέκυψε μετά τη λύση των κυττάρων, στα οποία προστίθενται 25 μΐ (ή 1 όγκος) από το 4 x sample loading buffer (4 χ διάλυμα φόρτωσης του δείγματος), το οποίο έχει ως εξής: 29

32 4 x SAMPLE LOADING BUFFER 250mM Tris-HCl ph 6,8 9,2% δωδεκυλοθειικό νάτριο (SDS) 40% γλυκερόλη 0,2% (w/v) κυανό της βρωμοφαινόλης 100mM διθειοθρειτόλη (DTT) Εν συνεχεία θερμαίνουμε το δείγμα μας για 3 min στους 95 C και όλα είναι έτοιμα για να προχωρήσουμε στην ηλεκτροφόρηση Προετοιμασία πηκτής πολυακριλαμιδίου ΔΙΑΛΥΜΑΤΑ ΔΟΧΕΙΩΝ ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗΣ ΠΗΚΤΗ ΔΙΑΧΩΡΙΣΜΟΥ (Separating Gel) 0,375 Μ Tris-HCl ph 8,8 2mM EDTA 0,1% SDS 8% ΑκρυλαμίδιοΤίε 0,04% Υπερθειικό Αμμώνιο (APS) 0,04% Ν,Ν,Ν,Ν - τετραμεθυλ-αιθυλ- διαμίνη (TEMED) ΠΗΚΤΗ ΕΠΙΣΤΟΙΒΑΞΗΣ (Stacking Gel) 0,125 Μ Tris-HCl ph 6,8 2 mm EDTA 0,1% SDS 4,5% ΑκρυλαμίδιοιόΗ 0,08% APS 0,04% TEMED 30

33 Για την ηλεκτροφόρηση δειγμάτων σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου παρουσία SDS, είναι απαραίτητη η χρήση δύο ειδών πηκτών, της πηκτής διαχωρισμού και της πηκτής επιστοίβαξης. Η πηκτή επιστοίβαξης τοποθετείται πάνω από την πηκτή διαχωρισμού ώστε να συσσωρευτούν οι πρωτεΐνες σε μικρό όγκο, ενώ η πηκτή διαχωρισμού, χρησιμοποιείται ώστε να γίνει διαχωρισμός των πρωτεϊνών με βάση το μοριακό τους βάρος ( οι πρωτεΐνες με μικρό μοριακό βάρος κινούνται πιο γρήγορα από εκείνες μεγαλύτερου μοριακού βάρους). Το διάλυμα της πηκτής διαχωρισμού μεταφέρεται μεταξύ δύο γυάλινων πλακών διαστάσεων 10,1cm πλάτος και 7,3cm ύψος η μία και 10,1cm πλάτος και 8,3 cm ύψος η άλλη, κατάλληλα τοποθετημένων. Ο χώρος ανάμεσα στις δύο γυάλινες πλάκες καλύπτεται με την πηκτή διαχωρισμού σε ύψος 5,3cm, δηλ. αφήνονται περίπου 2cm από την κορυφή. Ο επιπλέον αυτός χώρος των 2cm καλύπτεται με νερό με προσοχή χωρίς να διαταραχθεί η επιφάνεια της πηκτής. Στη συνέχεια η πηκτή αφήνεται να πολυμεριστεί. Μετά την πραγματοποίηση του πολυμερισμού, το νερό αποχύνεται και απομακρύνεται το υπόλοιπο με διηθητικό χαρτί με προσοχή ώστε να μην έρθει σε επαφή με την επιφάνεια της πηκτής Ηλεκτροφόρηση δειγμάτων 1 χρυθμιστικο ΔΙΑΛΥΜΑ ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗΣ ( Running (electrode) Buffer) 50 mm Tris 0,38 Μ Γλυκίνη 2 mm EDTA 0,1% SDS Ακολούθως η πηκτή επιστοίβαξης μεταφέρεται πάνω από την πηκτή διαχωρισμού, καλύπτοντας τον ελεύθερο χώρο ανάμεσα στις γυάλινες πλάκες και τοποθετείται η ειδική μήτρα («χτενάκι»), έτσι ώστε να δημιουργηθούν οι χώροι στους οποίους θα γίνει η φόρτωση των δειγμάτων. Η πηκτή αφήνεται να πολυμεριστεί. Στη συνέχεια απομακρύνεται με προσοχή η ειδική μήτρα και ο χώρος φόρτωσης των δειγμάτων που δημιουργήθηκε, ξεπλένεται με νερό. Ακολούθως οι πηκτές μεταφέρονται στη 31

34 συσκευή ηλεκτροφόρησης (Mini-PROTEAN 3 Cell της εταιρίας Biorad). To εσωτερικό διαμέρισμα της συσκευής καλύπτεται μέχρι την κορυφή με το 1 x Ρυθμιστικό Διάλυμα Ηλεκτροφόρησης. Εν συνεχεία φορτώνονται τα δείγματα, και οι πηκτές τοποθετούνται στο ρεύμα και σε σταθερή τάση 100V και 400mA για περίπου 1 ώρα. Η ηλεκτροφόρηση τερματίζεται όταν η χρωστική κυανό της βρωμοφαινόλης, έχει φτάσει στο τέλος της πηκτής. 2.7 ΑΝΟΣΟΑΠΟΤΥΠΩΣΗ ΚΑΤΑ WESTERN (Western Blotting) Μεταφορά των πρωτεϊνών σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης ΔΙΑΛΥΜΑ ΜΕΤΑΦΟΡΑΣ 48 mm Tris 39 mm Γλυκίνη 1,3 ml SDS 20% Μεθανόλη Μετά το τέλος της ηλεκτροφόρησης, οι πρωτεΐνες μεταφέρονται σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης. Για το λόγο αυτό οι πηκτές που έχουν δημιουργηθεί μεταφέρονται για εξισορρόπηση σε διάλυμα μεταφοράς. Στη συνέχεια η πηκτή τοποθετείται σε ειδική διάταξη, όπως φαίνεται στην εικόνα 9, και η οποία έχει ήδη προετοιμαστεί ως εξής: Αρχικά στην ειδική αυτή διάταξη μεταφέρεται ένα σφουγγαράκι το οποίο έχει προηγουμένως εμβαπτιστεί στο διάλυμα μεταφοράς. Πάνω από το σφουγγαράκι τοποθετούνται διαδοχικά τρία κομμάτια διηθητικού χαρτιού, τα οποία επίσης έχουν περαστεί αρχικά από το διάλυμα μεταφοράς. Ακολούθως η πηκτή μεταφέρεται και αυτή στην ειδική διάταξη. Πάνω από την πηκτή τοποθετείται η μεμβράνη νιτροκυτταρίνης, η οποία και αυτή έχει προηγουμένως εμβαπτιστεί στο διάλυμα μεταφοράς. Πάνω από τη μεμβράνη νιτροκυτταρίνης τοποθετούνται όπως και προηγουμένως αρχικά τρία κομμάτια διηθητικό χαρτί και στη συνέχεια ένα δεύτερο σφουγγαράκι. Ακολούθως η παραπάνω διάταξη, τοποθετείται σε ειδική συσκευή μεταφοράς, με τη μεμβράνη νιτροκυτταρίνης να βρίσκεται πιο κοντά στον θετικό πόλο και την πηκτή 32

35 πολυακριλαμιδίου να βρίσκεται πιο κοντά στον αρνητικό πόλο. Η συσκευή τοποθετείται στο ρεύμα και συγκεκριμένα στα 100V, 350mA για 1 ώρα. Η διάταξη τοποθετείται με το συγκεκριμένο τρόπο στη συσκευή μεταφοράς, έτσι ώστε οι πρωτεΐνες που είναι αρνητικά φορτισμένες, να μπορέσουν να μεταφερθούν από την πηκτή στη μεμβράνη νιτροκυτταρίνης, η οποία θα χρησιμοποιηθεί στην περαιτέρω πειραματική διαδικασία (Εικόνα 9). Electrode module Εικόνα 9. Σχηματική απεικόνιση της ειδικής διάταξης που χρησιμοποιείται για τη μεταφορά των πρωτεϊνών από την πηκτή ηλεκτροφόρησης στη μεμβράνη νιτροκυτταρίνης. 33

36 Ακολουθεί χρώση τη μεμβράνης νιτροκυτταρίνης με χρωστική PonceauS 0,2% (Serva) για lmin, για να ελεγχθεί αν έχει γίνει με επιτυχία η μεταφορά των πρωτεϊνών. Στη συνέχεια η μεμβράνη νιτροκυτταρίνης ξεπλένεται με απεσταγμένο νερό και παρατηρούνται οι ζώνες, οι οποίες εμφανίζονται στη μεμβράνη και οι οποίες αντιστοιχούν στις διάφορες πρωτεΐνες που περιέχονται στο δείγμα που ηλεκτροφορήθηκε. Για τον αποχρωματισμό της μεμβράνης, και τη χρήση της στην περαιτέρω πειραματική διαδικασία, αυτή ξεπλένεται με διάλυμα PBS- 0,1% Tween Αντίδραση πρωτεϊνών με το εξειδικευμένο αντίσωμα Η μεμβράνη νιτροκυτταρίνης επωάζεται αρχικά με διάλυμα κορεσμού (blocking buffer), το οποίο έχει ως εξής: 5% άπαχο γάλα σε PBS-0,1% Tween 20, για 30 min σε θερμοκρασία δωματίου, με ανάδευση. Ακολουθεί πλύση της μεμβράνης νιτροκυτταρίνης με διάλυμα PBS-0,1% Tween 20, έως ότου απομακρυνθεί τελείως το γάλα και προσθήκη του πρώτου αντισώματος. Χρησιμοποιήθηκαν τα μονοκλωνικά αντισώματα anti-hif-la (αραίωση 1:500) (BD Biosciences) και anti-sm-a-actin (αραίωση 1:1000) (Sigma) αραιωμένα με PBS-0,1% Tween 20. Η μεμβράνη επωάζεται με το αντίσωμα για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου ή όλο το βράδυ στους 4 C με ανάδευση. Μετά το τέλος του προαναφερθέντος χρόνου, γίνεται ξέπλυμα της μεμβράνης νιτροκυτταρίνης με διάλυμα PBS-0,1% Tween 20, 3 φορές για 1 Omin την κάθε φορά. Στη συνέχεια προστίθεται το δεύτερο αντίσωμα, το οποίο είναι αντίσωμα κατά της IgG, ανοσοσφαιρίνης του ποντικού (goat anti-mouse) σε αραίωση 1:3000 σε διάλυμα PBS-0,1% Tween 20. Η μεμβράνη επωάζεται με το δεύτερο αντίσωμα για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου και σε ανάδευση. Το δεύτερο αντίσωμα που χρησιμοποιείται (goat anti-mouse), είναι συζευγμένο με το ένζυμο HRP (horse-raddish peroxidase) και έχει παραχθεί ειδικά κατά του πρώτου αντισώματος (anti-hif ή anti-sm-a-actin). Ακολουθεί ξέπλυμα της μεμβράνης με διάλυμα PBS-0,1% Tween 20, 3 φορές για 10min την κάθε φορά (Εικόνα 10). 34

37 5a) ELECTROTRANSFER 5b) ANTIBODY DETECTION Irtcutwie with Ab; iy) end than wash excess At>, Εικόνα 10. Σχηματική απεικόνιση της διαδικασίας της ανοσοαποτύπωσης. a) Μεταφορά πρωτεϊνών από την πηκτή ηλεκτροφόρησης στη μεμβράνη νιτροκυτταρίνης b) Αντίδραση πρωτεϊνών που μεταφέρθηκαν στη μεμβράνη νιτροκυτταρίνης με το εξειδικευμένο αντίσωμα 2.8 ΧΗΜΕΙΟΦΩΤΑ ΥΓΕΙΑ (Chemiluminesence) Μετά το τέλος της ανοσοαποτύπωσης (Western Blotting), ακολουθεί η μέθοδος της χημειοφωτάυγειας (chemiluminesence). Για την πραγματοποίηση της συγκεκριμένης μεθόδου, η μεμβράνη νιτροκυτταρίνης επωάζεται με διάλυμα, το οποίο αποτελείται από λουμινόλη 1.25mM σε διάλυμα Tris ph 8.5, κουμαρικό οξύ 6.8 mm διαλυμένο σε διμεθυλο-σουλφοξείδιο (DMSO) και PECT και ακολούθως εκτίθεται σε φιλμ χημειοφωταύγειας (Εικόνα 11). Στη συνέχεια το φιλμ χημειοφωταύγειας, μεταφέρεται αρχικά σε υγρό εμφάνισης (developer) και ακολούθως σε υγρό σταθεροποίησης (fixer) της (AGFA). Όλη η διαδικασία της μεθόδου της χημειοφωταύγειας, λαμβάνει χώρα σε σκοτεινό θάλαμο. 35

38 Εικόνα 11. Σχηματική απεικόνιση της μεθόδου της χημειοφωταύγειας. Το πρώτο αντίσωμα ειδικό για την πρωτεΐνη που μας ενδιαφέρει, συνδέεται με αυτή, ενώ το δεύτερο αντίσωμα, το οποίο είναι συζευγμένο με το ένζυμο HRP, είναι ειδικό ως προς το πρώτο αντίσωμα και συνδέεται με αυτό. Το Η202 προκαλεί οξείδωση του ενζύμου HRP, το οποίο παρουσία λουμινόλης και κουμαρικού οξέος (ενισχυτή) δίνει ένα οξειδωμένο προϊόν, το οποίο εκπέμπει φως. Η ένταση του φωτός αποτυπώνεται στο φίλμ. 36

39 3. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Χρησιμοποιήθηκαν ανθρώπινα λεία μυϊκά κύτταρα (ΛΜΚΒ), της εταιρίας Clonetics (BSMC, Clonetics), τα οποία καλλιεργήσαμε. Για να επιβεβαιώσουμε, ότι τα κύτταρα ήταν λεία μυϊκά, προχωρήσαμε στην ταυτοποίησή τους, με τη βοήθεια της μεθόδου του έμμεσου ανοσοφθορισμού. Κατά τη διαδικασία του ανοσοφθορισμού, χρησιμοποιήσαμε μονοκλωνικό αντίσωμα κατά της ισομορφής της ανθρώπινης α-ακτίνης, η οποία συναντάται στους λείους μυς. Για την υλοποίηση του συγκεκριμένου πειράματος, αρχικά καλλιεργήσαμε τα κύτταρα σε τρυβλία Petri, τα οποία περιείχαν γυάλινες καλυπτρίδες. Τα κύτταρα επωάστηκαν με το πρώτο αντίσωμα, το οποίο ήταν μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού κατά της ανθρώπινης α-ακτίνης των λείων μυϊκών κυττάρων. Εν συνεχεία, τα κύτταρα επωάστηκαν με ένα δεύτερο αντίσωμα, το οποίο ήταν αντίσωμα κατά της ανοσοσφαιρίνης G του ποντικού, το οποίο ήταν συζευγμένο με μια φθορίζουσα ομάδα (φλουορεσκείνη -FITC). Anti- SM-a-actin Εικόνα 12. Ανοσοφθορισμός λείων μυϊκών κυττάρων με μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού κατά της SM-a-actin A104 (Sigma). Πάνω από το 95% των κυττάρων χρωματίστηκαν θετικά για την συσταλτή πρωτεΐνη των λείων μυϊκών κυττάρων α-ακτίνη. Δεξιά: φωτογραφία από μικροσκόπιο φθορισμού με χρήση φακού μεγένθυσης 40χ. Αριστερά: φωτογραφία από μικροσκόπιο φθορισμού με χρήση φακού μεγένθυσης 1 Οχ. Ακολούθως παρατηρήσαμε τα δείγματά μας σε μικροσκόπιο φθορισμού (Εικόνα 12), όπου και διαπιστώσαμε ότι πάνω από το 95%των κυττάρων είχαν αντιδράσει με 37

40 τα αντισώματα. Το γεγονός αυτό αποδεικνύει ότι τα κύτταρα εκφράζουν την α- ακτίνη των λείων μυϊκών κυττάρων και άρα είναι λεία μυϊκά. 3.1 ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΟΥ ΚΟΒΑΛΤΙΟΥ ΣΤΗΝ ΕΠΑΓΩΓΗ TOY HIF- 1α ΣΕ ΑΝΘΡΩΠΙΝΑ ΛΕΙΑ ΜΥΪΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ ΒΡΟΓΧΩΝ Το κοβάλτιο είναι απαραίτητο για το σχηματισμό της βιταμίνης Βΐ2. Ο γενικός πληθυσμός εκτίθεται σε χαμηλές συγκεντρώσεις κοβαλτίου, το οποίο βρίσκεται κυρίως στο φαγητό και σε μικρότερο ποσοστό στον αέρα και το νερό. Ωστόσο έκθεση σε υψηλές συγκεντρώσεις κοβαλτίου στο εργασιακό περιβάλλον, μπορεί να βλάψει μεταξύ άλλων και τους πνεύμονες. Ειδικότερα, το κοβάλτιο έχει υποδειχθεί ως κύρια αιτία πρόκλησης του εργασιακού άσθματος. Επιπλέον, το κοβάλτιο όπως έχει αναφερθεί επάγει την έκφραση του HIF-la σε λεία μυϊκά κύτταρα τραχείας κουνελιού (Chachami G. et al., 2004). Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε η επίδραση του κοβαλτίου στην επαγωγή του HIF-la σε ανθρώπινα ΛΜΚΒ. Για την πραγματοποίηση του συγκεκριμένου πειράματος, καλλιεργήσαμε τα ανθρώπινα ΛΜΚΒ σε τρυβλία Petri. Στη συνέχεια και αφού τα κύτταρα είχαν καλύψει σχεδόν το 85% της επιφάνειας του τρυβλίου, προσθέσαμε σε ένα από τα τρυβλία ΙΟΟμΜ κοβάλτιο, στη μορφή C0CI2 και τα αφήσαμε για 4 ώρες στους 37 C παρουσία 5% CO2. Ταυτόχρονα στις ίδιες συνθήκες τοποθετήσαμε και ένα τρυβλίο στο οποίο τα κύτταρα είχαν καλλιεργηθεί μόνο παρουσία θρεπτικού μέσου, χωρίς την προσθήκη κοβαλτίου. Στη συνέχεια προκαλέσαμε τη λύση των κυττάρων με χρήση κατάλληλων διαλυμάτων και προχωρήσαμε στην ανάλυση των εκχυλισμάτων που πήραμε με τη μέθοδο Bradford για τον προσδιορισμό της ολικής ποσότητας πρωτεΐνης. Στη συνέχεια 35μμ από κάθε δείγμα, αναλύθηκαν με τη βοήθεια της μεθόδου της ηλεκτροφόρησης σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου κάτω από αποδιατακτικές συνθήκες (SDS-PAGE). Ακολούθως προσδιορίσαμε τα επίπεδα του HIF-la με τη βοήθεια της μεθόδου της ανοσοαποτύπωσης κατά Western. Χρωματίσαμε τη μεμβράνη νιτροκυτταρίνης με χρωστική PonceauS, ώστε να γίνουν ορατές οι μπάντες οι οποίες αντιπροσωπεύουν πρωτεΐνες διαφορετικού μοριακού βάρους (Εικόνα 13). Ταυτόχρονα πραγματοποιήσαμε Western Blotting, χρησιμοποιώντας αντίσωμα κατά 38

41 της α-ακτίνης των λείων μυϊκών κυττάρων ως μάρτυρα για τον έλεγχο της ποσότητας των πρωτεϊνών των δειγμάτων που φορτώθηκαν σε κάθε διαδρομή (Εικόνα 13). A) Western Blottig Β) Χρώση Ponceau Μάρτυρας C0CI2 Μάρτυρας C0CI2 HIF-Ια Actin-> Εικόνα 13. Μελέτη του κοβαλτίου στην επαγωγή του HIF-Ια. Α) Στα κύτταρα που επεξεργαστήκαμε με κοβάλτιο, παρατηρείται επαγωγή του HIF-la Β) Χρώση της μεμβράνης με PonceauS. Από τα παραπάνω αποτελέσματα συμπεράναμε ότι το κοβάλτιο επάγει τον HIF-la και κάτω από φυσιολογικές συγκεντρώσεις οξυγόνου. 3.2 ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΗΣ ΔΕΣΦΕΡΙΟΞΑΜΙΝΗΣ (DFO) ΣΤΗΝ ΕΠΑΓΩΓΗ TOY HIF-la ΣΕ ΑΝΘΡΩΠΙΝΑ ΛΕΙΑ ΜΥΪΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ ΒΡΟΓΧΩΝ Η δεσφεριοξαμίνη (DFO) είναι ένας χηλικός παράγοντας. Η δεσφεριοξαμίνη, όπως και το κοβάλτιο θεωρείται ότι δρα σαν μιμητής της υποξίας, σταθεροποιώντας τον 39

42 HIF-la σε συνθήκες νορμοξίας. Συγκεκριμένα έχει βρεθεί ότι η DFO, κάτω από φυσιολογικές συγκεντρώσεις οξυγόνου, δεσμεύει το σίδηρο, ο οποίος βρίσκεται στις καταλυτικές περιοχές των προλυλ- υδροξυλασών (PFtDs). Με αυτόν τον τρόπο εμποδίζει την υδροξυλίωση των καταλοίπων προλίνης στις θέσεις 402 και 564 του HIF-1 α και κατ επέκταση εμποδίζει την ουβικουιτινίωση και τελική αποικοδόμηση του από το πρωτεόσωμα. Βάσει των παραπάνω δεδομένων, αναζητήσαμε την επίδραση της δεσφεριοξαμίνης σε ανθρώπινα ΛΜΚΒ. Καλλιεργήσαμε ανθρώπινα ΛΜΚΒ σε τρυβλία Petri. Όταν τα κύτταρα έφτασαν έναν ικανοποιητικό αριθμό, τα επεξεργαστήκαμε ως εξής: Στο ένα από τα τρυβλία με τα κύτταρα, προσθέσαμε 130μΜ δεσφεριοξαμίνης και το τοποθετήσαμε στους 37 C παρουσία 5% CO2, για 4 ώρες. Στις ίδιες συνθήκες τοποθετήσαμε και ένα δεύτερο τρυβλίο με κύτταρα, τα οποία όμως καλλιεργήθηκαν μόνο παρουσία θρεπτικού μέσου. Μετά το πέρας του προαναφερθέντος χρόνου, προχωρήσαμε στη λύση των κυττάρων. Στη συνέχεια αναλύσαμε τα δείγματά μας με τη μέθοδο Bradford, ώστε να γίνει προσδιορισμός της ολικής ποσότητας πρωτεΐνης. Ακολούθησε ηλεκτροφόρηση 35μμ από κάθε δείγμα σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου κάτω από αποδιατακτικές συνθήκες (SDS-PAGE). Μετά την ολοκλήρωση της ηλεκτροφόρησης, μεταφέραμε τις πρωτεΐνες από την πηκτή ηλεκτροφόρησης, σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης. Ακολούθως χρωματίσαμε τις πρωτεΐνες, με τη βοήθεια της χρωστικής PonceauS (Εικόνα 14). Στη συνέχεια η μεμβράνη επωάστηκε με μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού anti-hif-la και με ένα δεύτερο αντίσωμα goat anti-mouse, συζευγμένο με το ένζυμο HRP (Εικόνα 14). Ταυτόχρονα πραγματοποιήσαμε Western Blotting, χρησιμοποιώντας αντίσωμα κατά της α-ακτίνης των λείων μυϊκών κυττάρων ως μάρτυρα για τον έλεγχο της ποσότητας των πρωτεϊνών των δειγμάτων που φορτώθηκαν σε κάθε διαδρομή (Εικόνα 14). 40

43 A) Western Blotting B) Χρώση Ponceau Μάρτυρας DFO Μάρτυρας DFO HIF-la-» Acting* 1 2 Εικόνα 14. Μελέτη της δεσφεριοξαμίνης στην επαγωγή του επαγόμενου από την υποξία μεταγραφικού παράγοντα-ια στα λεία μυϊκά ανθρώπινα κύτταρα. Α)Σε κύτταρα, τα οποία καλλιεργήθηκαν απουσία DFO, δεν παρατηρήθηκε επαγωγή του HIF-la (διαδρομή 1). Αντίθετα στα κύτταρα που υπέστησαν επεξεργασία με δεσφεριοξαμίνη, υπήρξε επαγωγή του HIF-la σε μεγάλο βαθμό (διαδρομή 2). Επιπλέον πραγματοποιείται επεξεργασία των κυττάρων με αντίσωμα κατά της α-ακτίνης των λείων μυϊκών κυττάρων για τον έλεγχο της ποσότητας των πρωτεϊνών των δειγμάτων της κάθε διαδρομής. Β) Χρώση της μεμβράνης νιτροκυτταρίνης με PonceauS. Η δεσφεριοξαμίνη τελικά επάγει τον HIF-la κάτω από φυσιολογικές συγκεντρώσεις οξυγόνου στα ανθρώπινα ΛΜΚΒ. Το γεγονός αυτό αποδεικνύεται από τα αποτελέσματα της εικόνας 14, στην οποία φαίνεται καθαρά, ότι στα κύτταρα που καλλιεργήθηκαν με DFO παρατηρήθηκε έκφραση του HIF-la, σε αντίθεση με το μάρτυρα, όπου δεν παρατηρείται επαγωγή. 41

44 3.3 ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΩΝ ΔΙΑΦΟΡΕΤΙΚΩΝ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΕΩΝ ΥΠΟΞΙΑΣ ΣΤΗΝ ΕΠΑΓΩΓΗ TOY HIF-la ΣΕ ΑΝΘΡΩΠΙΝΑ ΛΕΙΑ ΜΥΪΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ ΒΡΟΓΧΩΝ Ο όρος υποξία αναφέρεται στη μείωση της συγκέντρωση του οξυγόνου, κάτω των φυσιολογικών επιπέδων. Σε κυτταρικό επίπεδο ως φυσιολογική συγκέντρωση οξυγόνου, θεωρείται η συγκέντρωση μεταξύ 20-22%. Επομένως ακόμη και μία συγκέντρωση οξυγόνου γύρω στο 8%, πιθανόν να θεωρείται ως υποξία. Ο HIF-la, είναι γνωστό ότι επάγεται σε συνθήκες υποξίας. Η επαγωγή αυτή, οφείλεται στο γεγονός, ότι οι προλυλ- υδροξυλάσες, οι οποίες υδροξυλιώνουν τον HIF-la και τον οδηγούν με αυτόν τον τρόπο στην αποικοδόμησή του, καθίστανται ανενεργός κατά την υποξία. Βάσει αυτού του γεγονότος, θελήσαμε να αναζητήσουμε τη βέλτιστη συγκέντρωση οξυγόνου, στην οποία τα λεία μυϊκά ανθρώπινα κύτταρα επάγουν τον HIF-la. Για το λόγο αυτό επεξεργαστήκαμε τα κύτταρα σε δύο διαφορετικές συγκεντρώσεις υποξίας, υποξία 1% και υποξία 6%. Στο συγκεκριμένο πείραμα, αφού καλλιεργήσαμε τα ανθρώπινα ΛΜΚΒ σε τρυβλία Petri, τα μεταφέραμε σε θάλαμο υποξίας, όπου ρυθμίσαμε τη συγκέντρωση του οξυγόνου. Το ένα τρυβλίο το τοποθετήσαμε σε θάλαμο υποξίας με συγκέντρωση οξυγόνου 1%, ενώ το δεύτερο τρυβλίο, το μεταφέραμε σε θάλαμο υποξίας, όπου ρυθμίσαμε τη συγκέντρωση του οξυγόνου στο 6%. Τα κύτταρα τα αφήσαμε στους θαλάμους υποξίας για 4 ώρες. Στη συνέχεια προκαλέσαμε τη λύση των κυττάρων και ακολούθησε ανάλυση της ολικής ποσότητας πρωτεΐνης των δειγμάτων μας με Bradford. Ηλεκτροφορήσαμε 35μμ από κάθε δείγμα σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου κάτω από αποδιατακτικές συνθήκες (SDS-PAGE) και ανάλυση με ανοσοαποτύπωση κατά Western με μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού anti-hif-la και στη συνέχεια με αντίσωμα goat anti-mouse, συζευγμένο με το ένζυμο HRP (Εικόνα 15). 42

45 A) Western Blotting Μάρυτρας Υποξία 1% 6% B) Χρώση Ponceau Μάρτυρας Υποξία 1% 6% HIF-Ια-» 12 3 Εικόνα15. Μελέτη της συγκέντρωσης της υποξίας στη επαγωγή του HIF-la. Α)Και στις δύο συγκεντρώσεις οξυγόνου που αντιπροσωπεύουν την υποξία πραγματοποιείται επαγωγή του HIF-la σε σχέση με το μάρτυρα. Η επαγωγή φαίνεται να είναι πιο έντονη σε συγκέντρωση οξυγόνου 1%. Β) Χρώση της μεμβράνης νιτροκυτταρίνης με PonceauS. Από τα αποτελέσματα της εικόνας 15, συμπεραίνουμε ότι τελικά σε οποιαδήποτε συγκέντρωση οξυγόνου κάτω των φυσιολογικών επιπέδων, πραγματοποιείται επαγωγή του HIF-la. Η επαγωγή όμως αυτή φαίνεται να είναι πιο έντονη στα κύτταρα, τα οποία εκτέθηκαν στην πιο χαμηλή συγκέντρωση οξυγόνου, που στο πείραμά μας ήταν 1%. 3.4 ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΗΣ ΚΑΡΒΑΧΟΛΗΣ (CCH) ΣΤΗΝ ΕΠΑΓΩΓΗ TOY HIF-la ΣΕ ΑΝΘΡΩΠΙΝΑ ΛΕΙΑ ΜΥΪΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ ΒΡΟΓΧΩΝ Από πειράματα που έχουν γίνει σε καρδιακά μυοκύτταρα, έχει βρεθεί ότι η ακετυλοχολίνη (Ach), επάγει τον HIF-la μέσω ενός μη οξυγονο-εξαρώμενου μηχανισμού (Yoshihiko Κ. et al. 2005; Kiichi Η., et al., 2004). Η καρβαχόλη (CCH), είναι ένας χολινεργικός αγωνιστής της ακετυλοχολίνης, ο οποίος προσδένεται στους ειδικούς μουσκαρινικούς υποδοχείς ακετυλοχολίνης. 43

46 Επομένως καν η καρβαχόλη πιθανολογείται ότι προκαλεί επαγωγή του HIF-la, μέσω του ίδιου μηχανισμού, που χρησιμοποιεί η ακετυλοχολίνη. Βάσει αυτού του συλλογισμού, θελήσαμε να αναζητήσουμε την επίδραση της καρβαχόλης στην επαγωγή του HIF-la σε ανθρώπινα ΛΜΚΒ. Αρχικά καλλιεργήσαμε τα κύτταρα μας σε τρυβλία Petri. Στη συνέχεια προσθέσαμε σε ένα τρυβλίο με κύτταρα καρβαχόλη (CCH) σε τελική συγκέντρωση ΙΟΟμΜ. Σε ένα δεύτερο τρυβλίο προσθέσαμε κοβάλτιο (C0CI2) σε τελική συγκέντρωση ΙΟΟμΜ, το οποίο αποτελεί το θετικό μας μάρτυρα, καθώς έχουμε ήδη δείξει ότι ο HIF-la, επάγεται παρουσία κοβαλτίου σε συνθήκες νορμοξίας και σε ένα τρίτο τρυβλίο επεξεργαστήκαμε τα κύτταρα μόνο με θρεπτικό μέσο, χωρίς την προσθήκη κάποιου επαγωγέα (αρνητικός μάρτυρας). Τα τρυβλία επωάστηκαν στους 37 C παρουσία 5% CCE, για 4 ώρες. Στη συνέχεια έγινε λύση των κυττάρων και μέτρηση της ολικής ποσότητας πρωτεΐνης με τη μέθοδο Bradford. Ακολούθησε ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου κάτω από αποδιατακτικές συνθήκες (SDS-PAGE) και ανάλυση με ανοσοαποτύπωση κατά Western, ώστε να προσδιοριστούν τα επίπεδα έκφρασης του HIF-la. Η ανοσοαποτύπωση, έλαβε χώρα με τη χρήση μονοκλωνικού αντισώματος ποντικού κατά του HIF-la. (Εικόνα 16). Συγχρόνως πραγματοποιήσαμε Western Blotting, χρησιμοποιώντας αντίσωμα κατά της α-ακτίνης των λείων μυϊκών κυττάρων ως μάρτυρας για τον έλεγχο της ποσότητας των πρωτεϊνών των δειγμάτων που φορτώθηκαν σε κάθε διαδρομή (Εικόνα 16). Από τα αποτελέσματα του πειράματος, παρατηρήσαμε ότι τα κύτταρα που επεξεργάστηκαν με κοβάλτιο, έδειξαν όπως αναμενόταν επαγωγή του HIF-la στα ανθρώπινα ΛΜΚΒ. Τα κύτταρα τα οποία καλλιεργήθηκαν σε θρεπτικό μέσο χωρίς άλλη προσθήκη, δεν έδειξαν επαγωγή του HIF-la (αρνητικός μάρτυρας). Στα κύτταρα, στα οποία προσθέσαμε καρβαχόλη, δε φαίνεται βάσει των αποτελεσμάτων της ανοσοαποτύπωσης κατά Western, να πραγματοποιήθηκε επαγωγή του HIF-la. Το γεγονός αυτό μπορεί να οφείλεται στο ότι χρησιμοποιήθηκε μικρή συγκέντρωση καρβαχόλης, μη ικανής να προκαλέσει επαγωγή. 44

47 A) Western Blotting B) Χρώση Ponceau Μάρτυρας(ϋοθ2 CCH Μάρτυρας CoCl2 CCH HIF-la-» Acting Εικόνα 16. Μελέτη της επαγωγής του HIF-la από την καρβαχόλη (CCH), σε ανθρώπινα ΛΜΚΒ. Α)Το κοβάλτιο χρησιμοποιείται ως θετικός μάρτυρας για την επαγωγή του HIF-la στα ανθρώπινα ΛΜΚΒ (διαδρομή 2). Τα κύτταρα, τα οποία επεξεργάστηκαν με καρβαχόλη δίνουν ίδια αποτελέσματα με τον αρνητικό μάρτυρα. Επιπλέον πραγματοποιείται επεξεργασία των κυττάρων με αντίσωμα κατά της α-ακτίνης των λείων μυϊκών κυττάρων για τον έλεγχο της ποσότητας των πρωτεϊνών των δειγμάτων της κάθε διαδρομής. Β) Χρώση της μεμβράνης νιτροκυτταρίνης με PonceauS. 45

48 3.5 ΕΠΑΓΩΓΗ ΚΑΙ ΕΝΔΟΚΥΤΤΤΑΡΙΟΣ ΕΝΤΟΠΙΣΜΟΣ ΤΟΥ HIF-la ΣΕ ΑΝΘΡΩΠΙΝΑ ΑΕΙΑ ΜΥΪΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ ΒΡΟΓΧΩΝ Ταυτόχρονα με τα παραπάνω πειράματα, μελετήσαμε και την επαγωγή και τον ενδοκυττάριο εντοπισμό του HIF-la στα ΛΜΚΒ, με τη μέθοδο του έμμεσου ανοσοφθορισμού παρουσία των διαφόρων επαγωγέων. Καλλιεργήσαμε τα κύτταρα σε τρυβλία Petri, στα οποία περιεχόταν γυάλινες καλυπτρίδες. Όταν τα κύτταρα κάλυψαν περίπου το 85% της επιφάνειας του τρυβλίου, τους προσθέσαμε ΙΟΟμΜ κοβάλτιο (C0CI2), 130μΜ δεσφεριοξαμίνη (DFO) και ΙΟΟμΜ ακετυλοχολίνης (Ach) και τα αφήσαμε για 4 ώρες στους 37 C παρουσία 5% CO2. Συγχρόνως, ένα τρυβλίο με κύτταρα το τοποθετήσαμε σε θάλαμο υποξίας, όπου προσαρμόσαμε τη συγκέντρωση του οξυγόνου στο 1%, επίσης για 4 ώρες. Μετά το πέρας του απαιτούμενου χρόνου προχωρήσαμε στη μέθοδο του έμμεσου ανοσοφθορισμού, όπου ως πρώτο αντίσωμα, χρησιμοποιήσαμε μονοκλωνικό αντίσωμα anti-hif-la, ενώ το δεύτερο αντίσωμα ήταν αντίσωμα κατά της IgG του ποντικού, το οποίο ήταν συζευγμένο με μια φθορίζουσα ομάδα (φλουορεσκε'ΐνη -FITC). Η φθορίζουσα ομάδα του δεύτερου αντισώματος χρησιμοποιήθηκε για τον εντοπισμό του HIF-la. (Εικόνα 16) Παρατηρήσαμε ότι τα κύτταρα, τα οποία δεν εκτέθηκαν σε κάποιον επαγωγέα, δεν έδειξαν επαγωγή του HIF-la. Αντιθέτως στα κύτταρα, τα οποία εκτέθηκαν σε κοβάλτιο (C0CI2), δεσφεριοξαμίνη (DFO) και υποξία 1% (hypoxia 1%) αντίστοιχα, παρατηρήθηκε επαγωγή του HIF-la, ο οποίος είναι συγκεντρωμένος στον πυρήνα των κυττάρων. Τέλος στα κύτταρα, στα οποία προσθέσαμε ακετυλοχολίνη (Ach), παρατηρήσαμε ότι πραγματοποιήθηκε επαγωγή του HIF-la, αλλά σε μικρότερο βαθμό σε σύγκριση με τους προηγούμενους επαγωγείς. 46

49 anti-hif-ια DAPI Μάρτυρας CoCl2 Hypoxia 1% DFO Ach Εικόνα 16. Ανοσοφθορισμός λείων μυϊκών κυττάρων με μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού κατά του HIF-la. Απουσία επαγωγέα (μάρτυρας), ο HIF-la δεν εκφράζεται. Παρουσία επαγωγέων, όπως το κοβάλτιο (C0CI2), η δεσφεριοξαμίνη (DFO) και η υποξία 1% (hypoxia 1%), ο HIF-1 α επάγεται σε μεγάλο ποσοστό και τα κύτταρα φθορίζουν, ενώ παρουσία ακετυλοχολίνης, (Ach), ο HIF-la επάγεται και τα κύτταρα φθορίζουν, αλλά σε μικρότερο βαθμό. Η θέση των πυρήνων των κυττάρων γίνεται εμφανής με χρώση με 4,6διαμιδο-2φαινυλ-ινδόλη (DAPI). 47

50 4. ΣΥΖΗΤΗΣΗ Ο HIF-la είναι ένας από τους πιο σημαντικούς μεταγραφικούς παράγοντες που έχουν ανακαλυφθεί τα τελευταία χρόνια και αυτό γιατί αποτελεί τον κύριο ρυθμιστή της ομοιόστασης του οξυγόνου στους ιστούς (Iyer et al., 1998; Semenza, 2000). Διάφορες διεργασίες, όπως είναι η αγγειογένεση, η ερυθροποίηση, η αύξηση του ρυθμού αναπνοής και η αλλαγή του ενεργειακού μεταβολισμού από την οξειδωτική φωσφορυλίωση στην αναερόβια γλυκόλυση ρυθμίζονται σε μεγάλο βαθμό από τον HIF-la. Η ρύθμιση των παραπάνω διεργασιών πραγματοποιείται μέσω της επαγωγής από τον HIF-la της μεταγραφής μιας σειράς γονιδίων -μέχρι στιγμής είναι γνωστά περίπου 60 γονίδια-στόχοι του HIF-la-, τα οποία κωδικοποιούν πρωτεΐνες,που εμπλέκονται στις διεργασίες αυτές και οι οποίες συμβάλουν στη διατήρηση της ομοιόστασης του οξυγόνου και στην προσαρμογή του οργανισμού στις διάφορες μεταβολές της πίεσης του οξυγόνου. Για να μπορέσει ο HIF-1, να επάγει την έκφραση των παραπάνω γονιδίων-στόχων του, θα πρέπει αρχικά να γίνει διμερισμός των δύο υπομονάδων του: HIF-la και HIF-1 β και στη συνέχεια ο διμερισμένος πλέον HIF-1 να εισαχθεί στον πυρήνα. Εκεί ο ενεργός HIF-1 θα πρέπει να προσδεθεί στην ειδική αλληλουχία HRE, η οποία έχει βρεθεί ότι βρίσκεται στους υποκινητές όλων των γονιδίων στόχων του HIF-1, για να μπορέσει να επάγει τη μεταγραφή τους (Wenger R.H.,2002; Harris A.L., 2002). Η επαγωγή του HIF-1 έχει βρεθεί ότι ρυθμίζεται τόσο από τα επίπεδα του οξυγόνου όσο και σε φυσιολογικές συγκεντρώσεις οξυγόνου από διάφορους παράγοντες. Συγκεκριμένα ο HIF-la, επάγεται σε περιπτώσεις επεξεργασίας των κυττάρων σε συνθήκες μειωμένης συγκέντρωσης οξυγόνου. Επιπλέον ο HIF-la, μπορεί να επαχθεί και σε φυσιολογικές συνθήκες από αυξητικούς παράγοντες, καθώς και από παράγοντες, οι οποίοι δρουν σαν μιμητές της υποξίας. Ένας τέτοιος «μιμητής» της υποξίας, το κοβάλτιο έχει αποδειχθεί ότι επάγει τον HIF-la σε πρωτογενείς καλλιέργειες λείων μυϊκών κυττάρων κουνελιού, παρουσία ορού (Chachami et al., 2004). Το αναπνευστικό σύστημα, για να μπορέσει να ανταποκριθεί σε συνθήκες μειωμένης συγκέντρωσης οξυγόνου, έχει αναπτύξει εξελικτικές ομοιοστατικές αποκρίσεις, οι οποίες οδηγούν στην επαναφορά της ισορροπίας μεταξύ αερισμού και διανομής του οξυγόνου στους ιστούς. Τα λεία μυϊκά κύτταρα των βρόγχων 48

51 του αναπνευστικού συστήματος ρυθμίζουν τη διάμετρο των αεραγωγών και κατά συνέπεια το οξυγόνο που φτάνει στους πνεύμονες. Σκοπός της συγκεκριμένης εργασίας ήταν η μελέτη της επαγωγής του HIF-la, σε πρωτογενείς καλλιέργειες ανθρώπινων λείων μυϊκών κυττάρων βρόγχων, τόσο σε συνθήκες υποξίας, όσο και από διάφορους επαγωγείς σε φυσιολογικές συνθήκες οξυγόνου με τη χρήση των μεθόδων της ηλεκτροφόρησης σε πηκτή πολυακριλαμιδίου παρουσία αποδιατακτικών συνθηκών (SDS-PAGE) και της ανοσοαποτύπωσης (Western Blotting). Τα κύτταρα σε όλες τις παραπάνω περιπτώσεις, καλλιεργήθηκαν σε θρεπτικό μέσο DMEM-FT2, το οποίο περιείχε 10% FBS και P/S. Αρχικά μελετήθηκε η επίδραση του κοβαλτίου στην επαγωγή του HIF-la στα ανθρώπινα ΛΜΚΒ. Επιλέχθηκε η μελέτη της επίδρασης του κοβαλτίου στη επαγωγή του HIF-la, καθώς το Co αποτελεί έναν μη οξυγονο-εξαρτώμενο επαγωγέα του HIF-la, οποίος έχει βρεθεί ότι μιμείται τα αποτελέσματα της υποξίας στα λεία μυϊκά κύτταρα κουνελιού, παρουσία οξυγόνου, μέσω διαφορετικών μηχανισμών. Ένας πρώτος μηχανισμός δράσης του κοβαλτίου για την επαγωγή του HIF-la σε φυσιολογικές συγκεντρώσεις οξυγόνου, προτείνει την αναστολή της δράσης των προλυλ-υδροξυλασων μέσω της αντικατάστασης του σιδήρου τους (Epstein et al., 2001; Wang G. et al., 1995). Εναλλακτικά, το κοβάλτιο μπορεί να αλληλεπιδρά απ ευθείας με τον HIF-la, και με αυτόν τον τρόπο να εμποδίζει την αλληλεπίδρασή του με την pvhl και κατ επέκταση την ουβικουιτινίωση και την πρωτεοσωμική αποικοδόμησή του (Yuan Υ. et al., 2003). Ένας τρίτος μηχανισμός δράσης για την επαγωγή του HIF-la από το κοβάλτιο σε συνθήκες νορμοξίας στα λεία μυϊκά κύτταρα, προτείνει τη μεταφραστική ρύθμιση της σύνθεσης του HIF-la μέσω του σηματοδοτικού μονοπατιού της ΡΙ3Κ (Chachami et al., 2004). Τα αποτελέσματα έδειξαν επαγωγή του HIF-la στα κύτταρα, τα οποία είχαν επεξεργαστεί με κοβάλτιο. Στη συνέχεια μελετήθηκε η επίδραση της δεσφεριοξαμίνης στην επαγωγή του HIF-la στα ανθρώπινα ΛΜΚΒ. Η δεσφεριοξαμίνη είναι ένας χηλικός παράγοντας, ο οποίος βρέθηκε ότι επάγει την έκφραση του HIF-la, μέσω της δέσμευσης του σιδήρου οποίος βρίσκεται στις καταλυτικές περιοχές των προλυλ-υδροξυλασών κι έτσι εμποδίζεται η ουβιουιτινίωση και τελική αποικοδόμηση του HIF-la (Wang et al., 1993). Στα κύτταρα που επεξεργάστηκαν με δεσφεριοξαμίνη, παρατηρείται επαγωγή του HIF-la. Συγκεκριμένα η επαγωγή του HIF-la μετά 49

52 την επίδραση με δεσφεριοξαμίνη βρέθηκε να είναι πιο έντονη σε σύγκριση με την επαγωγή του HIF-la που προκλήθηκε από την επίδραση του κοβαλτίου. Το γεγονός αυτό υποδεικνύει ότι η δεσφεριοξαμίνη είναι πιο ισχυρός επαγωγέας του HIF-la από ότι το κοβάλτιο στα ανθρώπινα ΛΜΚΒ. Ακολούθως μελετήθηκε η επίδραση των διαφορετικών συγκεντρώσεων υποξίας (συγκέντρωση οξυγόνου 1% και 6%) στην επαγωγή του HIF-la στα ανθρώπινα ΛΜΚΒ. Είναι γνωστό ότι ο HIF-la επάγεται σε κύτταρα, τα οποία εκτίθενται σε χαμηλές συγκεντρώσεις οξυγόνου. Σε συνθήκες υποξίας οι προλύλυδροξυλάσες, οι οποίες φυσιολογικά υδροξυλιώνουν τον HIF-la σε συγκεκριμένα κατάλοιπα, καθίστανται ανενεργές και με αυτόν τον τρόπο εμποδίζεται η πρόσδεση της pvhl στην περιοχή ODD του HIF-la. Έτσι ο HIF-la αποφεύγει την ουβικουιτινίωση και την πρωτεοσωμική αποικοδόμηση και μπορεί στη συνέχεια να μεταφερθεί στον πυρήνα, όπου μετά από διμερισμό με τον HIF-1 β, ενεργοποιεί τη μεταγραφή γονιδίων στόχων. (A. Zargoska and J. Dulak, 2004). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι σε συνθήκες οξυγόνου 1% και 6% προκαλείται επαγωγή του HIF-la. Συγκεκριμένα βρέθηκε ότι η επαγωγή που προκαλείται σε συγκέντρωση οξυγόνου 1 % είναι πολύ πιο έντονη σε σχέση με την επαγωγή που προκαλείται σε συγκέντρωση 6%. Από τα αποτελέσματα αυτά, βγαίνει το συμπέρασμα, ότι όσο πιο χαμηλή είναι η συγκέντρωση οξυγόνου στην οποία εκτίθενται τα ανθρώπινα ΛΜΚΒ, τόσο πιο έντονη είναι η επαγωγή του HIF-la σε αυτά. Εν συνεχεία, μελετήθηκε η επίδραση της καρβαχόλης στην επαγωγή του HIFla στα ανθρώπινα ΛΜΚΒ. Η καρβαχόλη αποτελεί έναν χολινεργικό αγωνιστή της ακετυλοχολίνης, ο οποίος προσδένεται στους ειδικούς μουσκαρινικούς υποδοχείς της. Έχει δειχθεί, ότι η ακετυλοχολίνη μπορεί να προκαλέσει επαγωγή του HIF-la μέσω ενός μηχανισμού που περιλαμβάνει τη δράση των NO. Πιο συγκεκριμένα η ακετυλοχολίνη, μέσω της πρόσδεσής της σε ειδικούς υποδοχείς, οδηγεί στην παραγωγή μονοξειδίου του αζώτου (NO), το οποίο μειώνει την αλληλεπίδραση, μεταξύ της pvhl και του HIF-la, εμποδίζοντας με αυτόν τον τρόπο την ουβικουιτινίωσή και τελικά την αποικοδόμηση του τελευταίου από το πρωτεόσωμα (Kiichi Η., et al., 2004). Η επεξεργασία των κυττάρων με καρβαχόλη, δεν οδήγησε σε επαγωγή του HIF-la σε επίπεδα ανιχνεύσιμα με τη μέθοδο που χρησιμοποιήθηκε. Το γεγονός αυτό μπορεί να οφείλεται στο ότι 50

53 χρησιμοποιήθηκε μικρή συγκέντρωση καρβαχόλης, μη ικανής να προκαλέσει επαγωγή. Από τη χρήση της δεσφεριοξαμίνης ως επαγωγέα του HIF-la, φαίνεται, ότι ο HIF-1 συνδέεται με τα ενδοκυττάρια επίπεδα του σιδήρου. Ο ρόλος ωστόσο του HIF-1, στο μεταβολισμό του σιδήρου παραμένει αδιευκρίνιστος και αποτελεί ένα ενδιαφέρον ερώτημα. Το ερώτημα αυτό είναι δυνατόν να διερευνηθεί με τη μελέτη της έκφρασης γονιδίων που συμμετέχουν στο μεταβολισμό του σιδήρου κάτω από συνθήκες ενεργοποίησης του HIF-la, όπως η υποξία. Η μελέτη της έκφρασης των γονιδίων αυτών μπορεί να γίνει με την χρήση ειδικών μικροσυστοιχιών cdna (IronChip), 300 περίπου γονιδίων του ανθρώπου και του ποντικού που ενέχονται στο μεταβολισμό του σιδήρου καθώς και σε συμπληρωματικά μονοπάτια όπως το οξειδωτικό στρες και ο μεταβολισμός του μονοξειδίου του αζώτου (NO), του χαλκού και του σεληνίου. Με τη χρήση του IronChip θα γίνει δυνατή η διερεύνηση πολύπλοκων ρυθμιστικών δικτύων, καθώς μπορεί να αναγνωρίσει ποσοτικές διαφορές στην έκφραση γονιδίων με ακρίβεια και επαναληψιμότητα και από την μέχρι τώρα χρήση του έχουν καθοριστεί ρυθμιστικά πρότυπα για κάθε μονοπάτι, με αποτέλεσμα να έχει ποσοτικοποιηθεί ο βαθμός συγγένειας τους (Muckenthaler et al., 2003a; Muckenthaler et al., 2003b). To IronChip θα χρησιμοποιηθεί προκειμένου να συγκριθούν τα πρότυπα γονιδιακής έκφρασης ανάμεσα σε κύτταρα που έχουν υποστεί υποξία και σε κύτταρα που έχουν κατεργαστεί με δότες ή συμπλοκοποιητές του σιδήρου, καθώς όλες αυτές οι συνθήκες, όπως φαίνεται από τα αποτελέσματα της εργασίας αυτής επηρεάζουν την έκφραση του HIF-la, ώστε να καθοριστούν οι ομοιότητες και οι διαφορές τους. Τα λεία μυϊκά κύτταρα τραχείας προέρχονται από έναν ιστό που φυσιολογικά εκτίθεται και αποκρίνεται σε διακυμάνσεις συγκεντρώσεως οξυγόνου. Ο αρχικός χαρακτηρισμός των ΛΜΚΒ ανθρώπου ως προς την επαγωγή του HIF-la ήταν απαραίτητος προκειμένου τα κύτταρα αυτά να χρησιμοποιηθούν ως μοντέλο για τη διευκρίνιση του ρόλου του HIF-la στον μεταβολισμό του σιδήρου. Για την υλοποίηση των παραπάνω, αρχικά έγινε απομόνωση του mrna από τα κύτταρα αυτά, και μελέτη για τη σύγκριση με ανάλυση κατά Northern ή RT-PCR της έκφρασης συγκεκριμένων γονιδίων που συμμετέχουν στον μεταβολισμό του σιδήρου κάτω από συνθήκες ενεργοποίησης του HIF-la 51

54 5. ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΩΝ APS = Υπερθειικό αμμώνιο ARNT (Aryl Hydrocarbon Receptor Nuclear Translocator) = Πυρηνικός υποδοχέας των αρυλ-υδρογονανθράκων bhlh (basic helix-loop-helix) = χαρακτηριστική δομή έλικας-στροφής-έλικας BSA = Αλβουμίνη ορού βοός CCH = Καρβαχόλη DAPI= 4,6 διαμιδο-2φαινυλ-ινδόλη DFO = Δεσφεριοξαμίνη DMEM-F12 = Θρεπτικό DMSO (dimethyl-sulfoxide) = Διμεθυλοσουλφοξίδιο DTT = Διθειοτριόλη EGF(Epidermal growth factor) = Επιδερμικός αυξητικός παράγοντας EPAS (Endothelial PAS domain protein 1) = Ενδοθηλιακή περιοχή PAS EPO (erythropoietin) = Ερυθροποιητίνη FBS = Ορός εμβρύου βοός FIH (factor inhibiting HIF-la) = Παράγοντας αναστολής του HIF-la FGF (Fibroblast growth factor) = Αυξητικός παράγοντας των ινοβλαστών HIF-1 = Επαγώμενος από την υποξία μεταγραφικός παράγοντας 1 HRE (Hypoxia Response Element) = Στοιχείο Απόκρισης στην υποξία IGF (insulin-like growth factor-1) = ινσουλοεξαρτώμενος αυξητικός παράγοντας IPAS(Inhibitory PAS protein) = Πρωτεΐνη αναστολής της PAS περιοχής NLS(Nuclear Localization Signals) = Σήμα πυρηνικού εντοπισμού ODD(Oxygen Dependent Degradation Domain) = Περιοχή αποικοδόμησης που εξαρτάται από το οξυγόνο P/S = Αντιβιοτικά Πενικιλίνη/ Στρεπτομυκίνη PAS = per-ahr-arnt-sim PBS = Διάλυμα φωσφορικών αλάτων PHD (prolyl-hydroxylases) = Προλυλ-υδροξυλάσες ΡΙ3Κ = Κινάση της 3-φωσφατιδιλοινοσιτόλης PMSF = Φθορο-φαινυλ- μεθυλ-σουλφίδιο 52

55 * pvhl (von Hippel-Lindau tumor suppressor ptrotein) = Ογκοκατασταλτική πρωτεΐνη Von Hippel-Lindau SDS = Δωδεκυλοθειικό νάτριο TAD(Transactivation Domain) = Περιοχή trans ενεργοποίησης του HIF-Ια TEMED =N,N,N\N - τετραμεθυλ-αιθυλ- διαμίνη TGF-βι (transforming growth factor-βι) = Αυξητικός παράγοντας μετασχηματισμού VEGF(Vascular Endothelium Growth Factor) = Αγγειακός ενδοθηλιακός αυξητικός παράγοντας ΛΜΚΒ (Bronchial Smooth Muscle Celles, BSMC) = Λεία μυϊκά κύτταρα βρόγχων 53

56 6. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 1. Bunn HF, Arany Z, Huang LE, Eckner R, Bhattacharya S, Jiang C, Goldberg MA, Livingston DM., An essential role for p300/cbp in the cellular response to hypoxia. Proc Natl Acad Sci USA 93: , Bonicalzi M.E., Groulx I., DE Paulsen N., Lee S., Role of exon-2-encoded β- domain of the Von Hippel Lindau tumour suppressor protein, J. Biol. Chem., 276(2), , Chachami G., Simos G., Hatziefthimiou A., Bonanoy S., Molyvdas P.A., Paraskeva E., Cobalt induces hyoxia-inducible factor-la expression in airway smooth muscle cells by a reactive oxygen species - and PI3K-dependent mechanism, Am J Respir Cell Mol Biol., 31(5):544-51, Clayton R.A., Nally J.E., MavLean M.R., Thomson N.C., McGrath, Chronic exposure to hypoxia attenuates contractile responses in rat airways in vitro: a possible role for nitric oxide. Eur. J. Pharmacol. 385:29-37, Cogo A., Napolitano G., Michoud M.C., Barbon D.R., Ward M., Martin J.G., Effects of hypoxia on rat airway smooth muscle cells proliferation. J. Appl. Physiol. 94: , Daniel J. Brat, Balveen Kaur, Erwin G. Van Meir, Genetic modulation of hypoxia induced gene expression and angiogenesis: relevance to brain tumors. Bioscience 8, dl , Dery, M.-A.C, Michaud, M.D., Richard, D.E. Hypoxia-inducible factor 1: regulation by hypoxic and non-hypoxic activators. Int. J. Biochem. & CellBiol. 37: , Ema M., Hirota K., Mimura J., Abe H., Yodoi J., Sogawa K., Poellinger L., Fujii-Kuriyama Y., Molecular mechanisms of transcription activation by HLF and HIF-Ια in response to hypoxia: their stabilization and redox signalinduced interaction with CBP/p3 00, EMBOJ., 18, , Epstein A., Gleadle J., McNeil L., Hewitson K., O Rourke J., Mole D., Mukherji M., Metzen E., Wilson M., Dhanda A., et ah, C. elegana EGL-9 and mammalian homologs define hydroxylation, Cell 107:43-54, Gorlach, A., Diebold, I., Schini-Kerth, V.B., Berchner-Pfannschmidt, U., Roth, U., Brandes, R.P., Kietzmann, T., and Busse, R., Thrombin activates 54

57 the hypoxia-inducible factor-1 signaling pathway in vascular smooth muscle cells: role of the p22(phox)-containing NADPH oxidase. Circ. Res. 89, 47-54, Gu J, Milligan J, Huang LE (2001) Molecular mechanism of hypoxiainducible factor lalpha-p300 interaction. A leucine-rich interface regulated by a single cysteine. J Biol Chem 276: Haris A.L., Hypoxia:a key regulatory factor in tumor growth, Nat Rev Cancer, 2(1):38247, Hellwing-Burgel T, Rutkowskik Metzen E, et ah. Interleukin-1 beta and tumor necrosis factor-alpha stimulate DNA binding of hypoxia-inducible facorl.bolld, 94(5): , Horowitz A.,. Menice C. B, Laporte R., Morgan K. G., Mechanisms of smooth muscle contraction. Physiol. Rev. 76: , Huang L.E, Gu J., Schau M., Bunn H.F., Regulation of hypoxia-inducible factor la is mediated by an 02-dependent degradation domain via the ubiquitin-proteasome pathway, Proc Natl Acad Sci USA, 95, , Hulsmann A.R., J. V.van den Anker, Evolution and natural history of chronic lung disease of prematurity. Monaldi Arch. Chest Dis. 52: , Ivan M., Kondo K., Yang H. F., Kim W., Valiando J., Ohh M., Salic A., Asara J. M., Lane W. S., Kaelin W. G., HIFa targeted for VHL-mediated destruction by proline hydroxylation: Implications for O2 sensing, Science 292, , Jeong J.W., Bae M.K., Ahn M.Y., et ah, Regulation and destabilization of HIF-Ια by ARD-1 mediated acetylation, Celll 11: , Ji-Won Lee, Seong-Hui Bae, Joo-Won Jeong, Se-Hee Kim and Kyu-Won Kim. Hypoxia-inducible factor (HIF-l)a: its protein stability and biological functions. Exp. Moi Med. 36(1), 1-12, Kallio P.J, Okamoto K., Obrien S., Carrers P., Makins Y., Tanaka H, Poellinger L, Signal transduction in hypoxic cells: inducible nuclear translocation and recruitment of the CBP/p300 coactivator by the hypoxiainducible factor-la, EMBO J, 17, ,

58 21. Kallio P.J., Wilson W.J., O'Brien S., et al., Regulation of the hypoxiainducible transcription factor laby the ubiquitin-proteasome pathway, J Biol Chem, 274(10): , Kiichi Hirota, Ryo Fukuda, Satoshi Takabuchi, Shinae Kizaka-Kondoh, Takehiko Adachi, Kazuhiko Fukuda, Semenza G L., Induction of Hypoxiainducible Factor 1 Activity by Muscarinic Acetylcholine Receptor Signaling. J. Biol. Chem, 279, 40: , Lando D.,Peet D.J.,Whelan D.A.,et ah, Asparagine hydroxylation of the HIF transactivation domain:a hypoxic switch. Science,295(5556): , Laughner E., Taghavi P., Chiles K., Mahon P.C., Semenza G.L., HER2 (neu) signaling increases the rate of hypoxiainducible factor 1 alpha (HIF- 1 alpha) synthesis: novel mechanism for HIF-1-mediated vascular endothelial growth factor expression. Mol. Cell. Biol. 21, , Li Η., Ko H.P., Whitlock J.P., Induction of phosphoglycerate kinase 1 gene expression by hypoxia, Roles of ARNT and HIF-1, J. Biol. Chem. 271: , Makino Y., Kanopka A., William J.W., et al., Inhibitory PAS Domain Protein (IPAS) Is a Hypoxia-inducible Splicing Variant of the Hypoxia-inducible Factor-3aLocus.J Biol Chem, 277(36): , Maxwell P.H., Wiesener M.S., Chang G.W., et al., The tumour suppressor protein VHL targets hypoxia-inducible factors for oxygen-dependent proteolysis, Nature,399(6733): Owens G.K., Regulation of differentiation of vascular smooth muscle cells. Physiol Rev 75: , Pugh C.W., O'Rourke J.F., Nagao M, Gleadle J.M., Ratcliffe P.J., Activation of hypoxia-inducible factor-1: definition of regulatory domains within the a. subunit.j Biol Chem 272: , Rechsteiner M., Rogers S.W., PEST sequences and regulation by proteolysis, Trends Biochem Sci, 7, , Richard, D.E., Berra, E. and Pouyssegur, J., Nonhypoxic pathway mediates the induction of hypoxia-inducible factor 1 a in vascular smooth muscle cells. J. Biol. Chem., 275, ,

59 32. Salnikow K., Su W., Blagosklonny Μ. V., Costa M., Carcinogenic metals induce hypoxia-inducible factor-stimulated transcription by reactive oxygen species-independent mechanism, Cancer Res. 60, , Skalli O., Ropraz P., Trzeciak A., Benzonana G., Gillesen D., Gabbiani G., A monoclonal antibody against alpha-smooth muscle actin: a new probe for smooth muscle differentiation. J. Cell Biol. 103: , Schofield C.J., Ratcliffe P.J., Oxygen sensing by HIF hydroxylases, Nat Rev Mol Cell Biol., 5: , Semenza G.L., Chest; 128; , Semenza G., Hypoxia, clonal selection and the role of HIF-1 in tumor progression, Crt Rev. Biochem, Mol. Biol. 35:71-103, 200b 37. Semenza G. L., HIF-1, O2, and the 3 PHDs: how animal cells signal hypoxia to the nucleus, Cell 107, 1-3, Stiehl D.P., Jelkmann W., Wenger R.H., and Hellwig-Burgel T., Normoxic induction of the hypoxia-inducible factor 1 alpha by insulin and interleukinlbeta involves the phosphatidylinositol 3-kinase pathway. FEBS Lett. 512, , Tian H., McKnight S.L., Russel D.W., Endothelial PAS protein 1 (EPAS1), a transcriptional factor selectively expressed in endothelial cells. Genes Dev, 11,72-82, Thyberg J., Differentiated properties and proliferation of arterial smooth muscle cells in culture. Int Rev Cytol 169: , Wang G.L., Semenza, G.L., Desferrioxamine induces erythropoietin gene expression and hypoxia-inducible factor 1 DNA-binding activity: Implications for models of hypoxia signal transduction, Blood 82, , Wang G.L., Jiang B.H,. Rue E.A, Semenza GL, Hypoxia-inducible factor 1 is a basic-helix-loop-helix-pas heterodimer regulated by cellular O2 tension. Proc Natl Acad Sci USA 92: , Wenger R.H., Cellular adaptation to hypoxia: 02-sensing protein hydroxylases, hypoxia-inducible transcription factors, and 02-regulated gene expression. FASEB J16: , Wenger R. H., Rolfs A., Spielmann P., Zimmermann D. R., Gassman M., Mouse hypoxia-inducible factor-1-alpha is encoded by two different mrna 57

60 isoforms: expression from a tissue-specific and a housekeeping-type promoter. Blood 91: , Yu F., White S.B., Zhao Q., Lee F.S., HIF-lalpha binding to VHL is regulated by stimulus-sensitive proline hydroxylation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, , Yuan Y., Hilliard G., Ferguson T., Millhorn D.E., Cobalt inhibits the interaction between hypoxia-inducible factor-alpha and von Hippel-Lindau protein by direct binding to hypoxia-inducible factor-alpha. J. Biol. Chem 278, , Zagorska A., Dulak J., HIF-1: the knowns and unknowns of hypoxia sensing. Acta Biochim Pol, 51: , Zohng H., Chiles K., Feldser D., Laugher E., Hanrahan C., Georgesku M.M., Simons J.W., Semenza G.L., Modulation of HIF-Ια expression by the epidermal growth factor/pi3k/pten/akt/frap pathway in human prostate cancer cells, Implications for tumour angiogenesis and therapeutics, Cancer Res , Zundel W., Schindler C., Haas-Kogan D., Koong A., Kaper F., Chen E., Gottschalk A.R., Ryan H.E., Johnson A.B., et al., Loss of PTEN facilitates HIF-1 mediated gene expression, Genes Dev ,