Δοµή και ιδιότητες του DNA σε επίπεδο χρωµατίνηςνουκλεοσώµατος. 09/04/ Μοριακή Βιολογία Κεφ. 1 Καθηγητής Δρ. Κ. Ε. Βοργιάς

Transcript

1 Δοµή και ιδιότητες του DNA σε επίπεδο χρωµατίνηςνουκλεοσώµατος 09/04/2014 1

2 09/04/2014 2

3 Η καθαρά δοµική εικόνα της χρωµατίνης µας παρέχει µόνο µια στατική περιγραφή της. Δυναµική εικόνα της χρωµατίνης µπορούµε να αποκτήσουµε έµµεσα. Δυναµική εικόνα της χρωµατίνης είναι η διευθέτηση των νουκλεοσωµάτων σε τυχαίες ή ειδικές θέσεις στην αλληλουχία του DNA. Ο όρος: νουκλεόσωµα σε φάση (phased nucleosomes) περιγράφει συγκεκριµένη διευθέτηση των νουκλεοσωµάτων στο DNA. 09/04/2014 3

4 Η οργάνωση της χρωµατίνης είναι ελαστική για να καλύψει τις δοµικές και λειτουργικές της ανάγκες. Η χρωµατίνη από φωτογραφίες ΗΜ είναι γνωστό οτι εµφανίζεται ως ευχρωµατίνη (ενεργός χρωµατίνη) και ετεροχρωµατίνη (ανενεργός χρωµατίνη) 09/04/2014 4

5 Το µικροχρωµόσωµα του SV40, απλό παράδειγµα, περιέχει µια περιοχή χωρίς νουκλεοσώµατα. 09/04/2014 5

6 Πριν τη µεταγραφή, το γονίδιο URA3 διαθέτει κατά µήκος διατεταγµένα νουκλεοσώµατα. Όταν επάγεται η µεταγραφή, τα νουκλεοσώµατα βρίσκονται σε τυχαίες θέσεις. Όταν καταστέλλεται η µεταγραφή, τα νουκλεοσώµατα επανέρχονται στις ειδικές θέσεις τους. 09/04/2014 6

7 Η µηχανισµοί αποδόµησης (και όχι αποικοδόµησης) της χρωµατίνης, των νουκλεοσωµάτων, στόχο έχουν να αυξήσουν τη διαθεσιµότητα του DNA στις πρωτείνες που θα αναλάβουν την µεταγραφή και άρα τη γονιδιακή έκφραση. Αυτό επιτυγχάνεται: µέσω συµπλόκων αναδόµησης της χρωµατίνης χρησιµοποιώντας ATP (chromatin remodeling complexes) µέσω ενζυµικής (χηµικής) τροποποίησης των νουκλεοσωµάτων, µέσω τροποποίησης των ιστονών, µε στόχο την προγραµµατισµένη έκφραση/ αδρανοποίση γονιδίων ανταποκρινόµενη σε αναπτυξιακά και περιβαλλοντικά ερεθίσµατα-σήµατα. 09/04/2014 7

8 Τα συµπλόκα αναδόµησης της χρωµατίνη είναι σύµπλοκα πρωτεϊνικών υποµονάδων που χρησιµοποιούν ενέργεια (ATP) για να σπάσουν τη δοµή των νουκλεοσωµάτων ώστε να αυξηθεί η προσπελασιµότητα του DNA από µεταγραφικούς παράγοντες. Υπάρχουν πολλές οικογένειες τέτοιων συµπλόκων που η κάθε µια σχετίζεται µε οµάδες γονιδίων (άρα εξειδίκευση). 09/04/2014 8

9 Σύµπλοκο αναδόµησης ή αναδιαµόρφωσης της χρωµατίνης Το δυναµικό µοντέλο για τη µεταγραφή της χρωµατίνης προβλέπει τη δράση παραγόντων οι οποίοι χρησιµοποιούν την ενέργεια που παράγεται από την υδρόλυση του ATP για να εκτοπίσουν τα νουκλεοσώµατα από συγκεκριµένες περιοχές του DNA. 09/04/2014 9

10 Τα σύµπλοκα αναδιαµόρφωσης µπορούν να: προωθήσουν την ολίσθηση των νουκλεοσωµάτων κατά µήκος του DNA να εκτοπίσουν ολοκληρωτικά τα νουκλεοσώµατα από το DNA να αλλάξουν την απόσταση διαδοχικών νουκλεοσωµάτων. 09/04/

11 Ενζυµική (χηµική) τροποποίηση των νουκλεοσωµάτων µέσω τροποποίησης των ιστονών µε στόχο την προγραµµατισµένη έκφραση/αδρανοποίση γονιδίων ανταποκρινόµενη σε εξωτερικά σήµατα. Η ακετυλίωση των ιστονών ενεργοποιεί τη χρωµατίνη Η µεθυλίωση των ιστονών απενεργοποιεί τη χρωµατίνη. Η µεθυλίωση του DNA απενεργοποιεί τη χρωµατίνη. 09/04/

12 Τα σύµπλοκα που τροποποιούν τη δοµή της χρωµατίνης (ή την ενεργότητά της) φέρουν υποµονάδες στόχευσης που καθορίζουν τις θέσεις δράσης τους πάνω στο DNA, ενζυµικές υποµονάδες HAT ή HDAC που ακετυλιώνουν ή απακετυλιώνουν τις ιστόνες, καθώς και άλλες υποµονάδες που ασκούν επιπλέον επιδράσεις στη χρωµατίνη ή στο DNA. 09/04/

13 Οι περιοχές της περιοχές της χρωµατίνης που είναι ελεύθερες από νουκλεοσώµατα είναι γνωστές ως υπερευαίσθητες περιοχή στη δράση του ενζύµου DNase I και µε τον τρόπο αυτό µπορούµε να τις χαρτογραφήσουµε. Ποιές είναι οι περιοχές αυτές; Είναι οι περιοχές που αλληλεπιδρούν οι ιστόνες και οι παράγοντες µεταγραφής και σχετίζονται µε τη ρύθµιση της γονιδιακής ρύθµισης. 09/04/

14 Οι θέσεις εγκοπών βρίσκονται σε περιοδικά διαστήµατα κατά µήκος του πυρηνικού DNA, όπως φαίνεται από την πέψη αποµονωµένων κυτταρικών πυρήνων µε DNAάση Ι. Οι περισσότερο εκτεθειµένες θέσεις στο DNA εµφανίζονται µε µια περιοδικότητα που αντικατοπτρίζει τη δοµή της διπλής έλικας. Για απλότητα παρουσιάζονται οι εκτεθειµένες θέσεις µόνο της κόκκινης αλυσίδας. 09/04/

15 Η ανάλυση υψηλής διακριτικότητας δείχνει ότι κάθε θέση πέψης από την DNΑάση Ι αποτελείται από αρκετούς παρακείµενους φωσφοδιεστερικούς δεσµούς, όπως φαίνεται σε αυτό το παράδειγµα ανάλυσης των θέσεων S4 και S5, µε σήµανση των άκρων πυρηνικών σωµατίων. 09/04/

16 Κατά τη νουκλεοσωµική διάταξη, οι θέσεις περιορισµού εντοπίζονται σε σταθερή απόσταση από το συνδετικό DNA, το οποίο κόβεται από τη µικροκοκκική νουκλεάση. Με κόκκινο χρώµα φαίνεται η περιοχή όπου υβριδίζεται ο σηµασµένος ιχνηθέτης που χρησιµοποιείται για την ανάλυση κατά Southern, η οποία ακολουθεί την ηλεκτροφορητική ανάλυση των τµηµάτων. Μόνο όσα τµήµατα φέρουν την «κόκκινη» περιοχή µπορούν να παρατηρηθούν κατά την ανάλυση. Η εµφάνιση µόνο µίας ζώνης φανερώνει ότι σε όλα τα µόρια DNA τα νουκλεοσώµατα διατάσσονται µε τον ίδιο τρόπο (µη τυχαία διάταξη). 09/04/

17 Οι εγκοπές του δίκλωνου DNA αποκαλύπτονται από τα µονόκλωνα τµήµατα που προκύπτουν όταν µετουσιώνεται το DNA. Εάν το DNA σηµανθεί (λόγου χάρη) στα 5 άκρα του, µόνο τα 5 τµήµατα θα ανιχνεύονται µε αυτοραδιογραφία. Το µέγεθος των τµηµάτων προσδιορίζει την απόσταση της εγκοπής από το σηµασµένο άκρο. 09/04/

18 Με έµµεση επάκρια σήµανση προσδιορίζεται η απόσταση µιας υπερευαίσθητης σε DNΑάση-Ι θέσης από µια δεδοµένη θέση περιορισµού. Η ύπαρξη µίας συγκεκριµένης θέσης-στόχου για την DNΑάση-Ι παράγει ένα διακριτό τµήµα DNA, το µέγεθος του οποίου αντιστοιχεί στην απόσταση της υπερευαίσθητης σε DNΑάση-Ι θέσης από τη θέση περιορισµού. 09/04/

19 Η περιοχή χωρίς νουκλεοσώµατα του χρωµοσώµατος του SV40 περιλαµβάνει υπερευαίσθητες θέσεις, ευαίσθητες περιοχές και µια προστατευµένη περιοχή. Η υπερευαίσθητη θέση ενός γονιδίου β-σφαιρίνης στην κότα συνιστά µια περιοχή που είναι ευαίσθητη σε αρκετές νουκλεάσες. 09/04/

20 Η ευαισθησία στην DNΑάση Ι µπορεί να εκτιµηθεί προσδιορίζοντας το ρυθµό µε τον οποίο εξαφανίζεται υβριδοποιήσιµο υλικό. 09/04/

21 Στα ερυθροκύτταρα των ενηλίκων, το γονίδιο της β- σφαιρίνης είναι εξαιρετικά ευαίσθητο στην πέψη µε DNΑάση-Ι. Το ίδιο γονίδιο στα ερυθροκύτταρα των εµβρύων είναι µετρίως ευαίσθητο. Το γονίδιο της ωαλβουµίνης (το οποίο δεν είναι ενεργό) δεν είναι ευαίσθητο. 09/04/

22 Η επικράτεια των γονιδίων των σφαιρινών έχει υπερευαίσθητες θέσεις και στα δύο άκρα. Η οµάδα των θέσεων στο 5 άκρο αποτελεί την Locus Control Region και είναι θεµελιώδους σηµασίας για τη λειτουργία όλων των γονιδίων που βρίσκονται στην επικράτεια αυτή. 09/04/

23 09/04/

24 09/04/

25 09/04/

26 Η χαλάρωση της δοµής της χρωµατίνης είναι απαραίτητη για: Έκφραση γονιδίων Επιδιόρθωση βλαβών Συµπύκνωση χρωµοσωµάτων κατά την κυτταρική διαίρεση Πως επιτυγχάνεται η αναδιάπλαση της χρωµατίνης? 09/04/

27 Πως επιτυγχάνεται η αναδιάπλαση της χρωµατίνης? Η χρωµατίνη αναδιαπλάσεται µέσω επιγενετικών τροποποιήσεων 09/04/

28 Τι σηµαίνει επιγενετικές τροποποιήσεις της χρωµατίνης 09/04/

29 Ποιές είναι οι επιγενετικές τροποποιήσεις της χρωµατίνης 09/04/

30 Που γίνονται οι επιγενετικές τροποποιήσεις της χρωµατίνης 09/04/

31 Οι επιγενετικές τροποποιήσεις των ιστονών επιφέρουν αλλαγές στη δοµή της χρωµατίνης 09/04/

32 Ποιές είναι επιγενετικές τροποποιήσεις των ιστονών του πυρήνα του νουκλεοσώµατος που επιφέρουν αλλαγές στη δοµή της χρωµατίνης 09/04/

33 09/04/

34 09/04/

35 Η ακετυλίωση που σχετίζεται µε την ενεργοποίηση της γονιδιακής έκφρασης πραγµατοποιείται µε άµεση τροποποίηση των ιστονών που συγκροτούν τα νουκλεοσώµατα. Η ακετυλίωση των ιστονών H3 και H4 σχετίζεται µε την ενεργή κατάσταση της χρωµατίνης. 09/04/

36 Πότε ακετυλιώνονται οι ιστόνες; Στη φάση της αντιγραφής, οι ιστόνες υφίστανται ακετυλίωση και πριν ενσωµατωθούν σε νουκλεοσώµατα. Μετά αποµακρύνονται οι ακετυλοµάδες 09/04/

37 Ακετυλίωση ιστονών 09/04/

38 Ακετυλίωση ιστονών 09/04/

39 Ακετυλίωση ιστονών 09/04/

40 Ακετυλίωση ιστονών 09/04/

41 Ο ρόλος της ακετυλίωση ιστονών 09/04/

42 Μεθυλίωση ιστονών 09/04/

43 Μεθυλίωση ιστονών 09/04/

44 Μεθυλίωση vs Αποµεθυλίωση ιστονών 09/04/

45 Πρωτείνες Μεταφορείς Μεθυλίων σε Ιστόνες 09/04/

46 Πρωτείνες Μεταφορείς Μεθυλίων σε Ιστόνες 09/04/

47 Σχηµατισµός ετεροχρωµατίνης 09/04/

48 Ο Ρόλος της Μεθυλίωση ιστονών 09/04/

49 Η ακετυλίωση λυσίνης και η φωσφορυλίωση σερίνης µειώνουν το συνολικό θετικό φορτίο µιας πρωτεΐνης. Αντίθετα, η µεθυλίωση ενισχύει την ηλεκτροθετικότητα της λυσίνης. 09/04/

50 09/04/

51 Μεθυλίωση του DNA 09/04/

52 Η τροποποίηση µεθυλίωση - των κυτιδινών είναι ένας παράγοντας που επηρεάζει-ρυθµίζει την µεταγραφική ενεργότητα. Πώς: Η µεθυλίωση της C σε ειδικές θέσεις του γονιδίου εµποδίζει την πρόσδεση παραγόντων µεταγραφής (transcription factors) Tα ήδη ενεργά γονίδια δεν µεθυλιώνονται: Στα ενεργά γονίδια δουλεύουν µια σειρά από πρωτείνες. Είναι πιθανόν αυτές οι πρωτείνες να εµποδίζουν να δράσουν τα ένζυµα µεθυλίωσης (DNA methylases). 09/04/

53 Μεθυλίωση του DNA 09/04/

54 Μεθυλίωση του DNA 09/04/

55 Μεθυλίωση του DNA 09/04/

56 O ρόλος της Μεθυλίωση του DNA 09/04/

57 Σύγκριση ευχρωµατίνης µε ετεροχρωµατίνη 09/04/

58 09/04/

59 09/04/

60 09/04/

61 09/04/