Ανάλυση και χαρακτηρισμός του πλασμιδίου psma198 του βακτηρίου Streptococcus

Transcript

1 ΕΘΝΙΚΟ ΚΑΙ ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΣΠΟΥΔΩΝ «ΒΙΟΠΛΗΡΟΦΟΡΙΚΗ» ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ Ανάλυση και χαρακτηρισμός του πλασμιδίου psma198 του βακτηρίου Streptococcus macedonicus ACA-DC 198. Θωμάς Δ. Πλάκας Αθήνα 2013

2 NATIONAL AND KAPODISTRIAN UNIVERSITY OF ATHENS SCHOOL OF SCIENCES FACULTY OF BIOLOGY MSc «BIOINFORMATICS» MSc THESIS Analysis and characterization of the plasmid psma198 of the bacterium Streptococcus macedonicus ACA-DC 198. Thomas D. Plakas Athens 2013 ii

3 Τριμελής εξεταστική επιτροπή 1. Καθηγητής Σταύρος Ι. Χαμόδρακας (Επιβλέπων) Τμήμα Βιολογίας, Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών 2. Καθηγητής Κωνσταντίνος Ε. Βοργιάς Τμήμα Βιολογίας, Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών 3. Λέκτορας Βασιλική Α. Οικονομίδου Τμήμα Βιολογίας, Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών iii

4 Αφιερωμένο σε όλους όσους μου προσφέρουν την αγάπη τους, τη φιλία τους και την υποστήριξή τους. iv

5 Περιεχόμενα Ευχαριστίες 3 Περίληψη 5 Abstract 7 1. Εισαγωγή Οξυγαλακτικά βακτήρια Φυσιολογία των οξυγαλακτικών βακτηρίων Ταξινόμηση των οξυγαλακτικών βακτηρίων Στρεπτόκοκκοι Streptococcus macedonicus Πλασμιδιακό DNA στα βακτήρια Μηχανισμοί αντιγραφής στα πλασμίδια με έμφαση στα πλασμίδια των οξυγαλακτικών βακτηρίων Μηχανισμός αντιγραφής θήτα Μηχανισμός κυλιόμενης αντιγραφής Οριζόντια μεταφορά γονιδίων. Ανάλυση της βακτηριακής σύζευξης Σκοπός της διπλωματικής εργασίας Υλικά και Μέθοδοι Βακτηριακά στελέχη και συνθήκες καλλιέργειας Πρόβλεψη των γονιδίων και σχολιασμός του πλασμιδίου psma Νουκλεοτιδική, πρωτεϊνική και φυλογενετική ανάλυση του πλασμιδίου psma Προσδιορισμός του σχετικού αριθμού αντιγράφων του πλασμιδίου psma Αποτελέσματα και συζήτηση Το πλασμίδιο psma198 ανήκει στην οικογένεια ρεπλικονίων με περιορισμένο εύρος ξενιστών pci305/pwvo2 του γένους Lactococcus Ο Streptococcus macedonicus απέκτησε το πλασμίδιο psma198 από τον Lactococcus lactis και η μεταφορά αυτή φαίνεται να έγινε στο περιβάλλον του γάλακτος 41-1-

6 4.3 Η απόκτηση του πλασμιδίου psma198 από τον Streptococcus macedonicus φαίνεται να μην αποτελεί πρόσφατο γεγονός Συμπεράσματα Βιβλιογραφία Συνέδρια Ερευνητικά άρθρα 75-2-

7 Ευχαριστίες Η παρούσα Διατμηματική Διπλωματική Εργασία εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Γαλακτοκομίας του Τμήματος Επιστήμης και Τεχνολογίας Τροφίμων του Γεωπονικού Πανεπιστημίου Αθηνών, στα πλαίσια του Μεταπτυχιακού Διπλώματος Ειδίκευσης «Βιοπληροφορική», του τμήματος Βιολογίας του Εθνικού και Καποδιστριακού Δρ. Πανεπιστημίου Αθηνών, υπό την καθοδήγηση του Κωνσταντίνου Παπαδημητρίου και την επίβλεψη του Καθηγητή κ. Σταύρου Χαμόδρακα. Σε αυτό το σημείο αισθάνομαι την ανάγκη να ευχαριστήσω ορισμένους ανθρώπους, των οποίων η συμβολή, η βοήθεια και η καθοδήγηση ήταν πολύτιμη κατά τη διάρκεια εκπόνησης, αλλά και συγγραφής της παρούσας Διπλωματικής Εργασίας. Οφείλω ένα μεγάλο ευχαριστώ στον Δρ. Κωνσταντίνο Παπαδημητρίου για την εμπιστοσύνη που μου έδειξε ώστε να με επιλέξει για να μελετήσω το θέμα αυτό. Μέσα από τη διδασκαλία και την προσωπική επαφή μαζί του με δίδαξε τον τρόπο με τον οποίο πρέπει να γίνεται η έρευνα δίνοντάς μου σημαντικά εφόδια για να αντιλαμβάνομαι και να επεξεργάζομαι τα διάφορα ερωτήματα που προκύπτουν κατά τη διάρκεια μίας επιστημονικής μελέτης. Θα ήθελα να τον ευχαριστήσω γιατί σε κάθε στάδιο αυτής της εργασίας, από την αρχή μέχρι το τέλος, ήταν δίπλα μου με πολύτιμες συμβουλές κάθε φορά, αφιερώνοντας για εμένα πολύτιμο προσωπικό του χρόνο. Τέλος, τον ευχαριστώ για τη δυνατότητα που μου έδωσε να συνεργαστώ και με τα υπόλοιπα μέλη της ερευνητικής ομάδας στην οποία ανήκει, επιτρέποντάς μου να γνωρίσω και άλλους αξιόλογους ανθρώπους. Ένα μεγάλο ευχαριστώ οφείλω και στον Καθηγητή κ. Σταύρο Χαμόδρακα, ο οποίος ήταν και ο επιβλέπων της παρούσας Διπλωματικής Εργασίας. Οι εύστοχες συμβουλές και η διάθεση που έδειχνε κάθε φορά που είχα μία απορία ήταν σημαντικές για την ολοκλήρωση της συγκεκριμένης εργασίας. Θα ήθελα να τον ευχαριστήσω για το γεγονός ότι με συμπεριέλαβε ως φοιτητή στο Μεταπτυχιακό Δίπλωμα Ειδίκευσης «Βιοπληροφορική», επιτρέποντάς μου να διευρύνω τις γνώσεις μου τόσο στο πεδίο της Βιοπληροφορικής, όσο και στο πεδίο της Δομικής Βιολογίας. Θα πρέπει επίσης να ευχαριστήσω τόσο τον Καθηγητή κ. Κωνσταντίνο Βοργιά, όσο και τη Λέκτορα κα. Βασιλική Οικονομίδου για την τιμή που μου έκαναν να αποτελέσουν μέλη της τριμελούς εξεταστικής μου επιτροπής. Τους ευχαριστώ και -3-

8 για το γεγονός ότι μέσα από τις διαλέξεις τους στο πρώτο έτος του μεταπτυχιακού, μας παρείχαν πολλές και σημαντικές πληροφορίες γύρω από το χώρο της Δομικής Βιολογίας και της Βιοχημείας. Ευχαριστίες οφείλω στην Καθηγήτρια κα. Έφη Τσακαλίδου και στην Δρ. Ράνια Αναστασίου, οι οποίες ήταν πάντα πρόθυμες να με βοηθήσουν σε οτιδήποτε χρειάστηκα. Η συνεργασία μου τόσο μαζί τους, όσο και με τα υπόλοιπα μέλη του Εργαστηρίου Γαλακτοκομίας στο Γεωπονικό Πανεπιστήμιο Αθηνών ήταν άψογη. Ακόμα θέλω να ευχαριστήσω την Δρ. Ζωή Λίτου και τον Δρ. Νικόλαο Παπανδρέου, από τον Τομέα Βιολογίας Κυττάρου και Βιοφυσικής του Τμήματος Βιολογίας, που μου προσέφεραν τη βοήθειά τους τόσο σε επιστημονικά θέματα, όσο και σε κάθε είδους πρόβλημα που με απασχόλησε. Θα πρέπει επίσης να ευχαριστήσω και τη συμφοιτήτριά μου Αθανασία Σαραφιανού, με την οποία δουλέψαμε μαζί για περίπου ένα χρόνο κάτω από την καθοδήγηση του Δρ. Κωνσταντίνου Παπαδημητρίου. Η συνεργασία μας υπήρξε άριστη. Θα ήθελα να ευχαριστήσω και όλα τα υπόλοιπα μέλη του Τομέα Βιολογίας Κυττάρου και Βιοφυσικής, καθώς και του Εργαστηρίου Γαλακτοκομίας για τις ώρες που περάσαμε μαζί και για την εποικοδομητική ανταλλαγή απόψεων που συνέβαλαν και στην υλοποίηση αυτής της εργασίας. Η παρούσα εργασία δεν θα μπορούσε να πραγματοποιηθεί χωρίς τη συμβολή της συντρόφου μου Παναγιώτας, της οποίας η υποστήριξη και η κατανόηση κατά τη διάρκεια αυτής της εργασίας ήταν μεγάλη. Την ευχαριστώ πολύ και αυτήν. Τέλος, δεν γίνεται να μην ευχαριστήσω τον πατέρα μου, την μητέρα μου, τη γιαγιά μου και τον παππού μου για τη στήριξη και όλα τα εφόδια που μου παρείχαν κατά την διάρκεια των μαθητικών, αλλά και φοιτητικών μου χρόνων. Χωρίς αυτούς δεν θα τα είχα καταφέρει. -4-

9 Περίληψη Ο Streptococcus macedonicus είναι ένα ενδιαφέρον είδος στρεπτόκοκκου αφού η πιο συχνή πηγή απομόνωσής του είναι τα τρόφιμα ζύμωσης, γεγονός το οποίο ισχύει και για τον Streptococcus thermophilus. Παρόλα αυτά, ο S. macedonicus είναι συγγενικός με συμβιωτικά ευκαιριακά παθογόνα του συμπλέγματος Streptococcus bovis/streptococcus equinus. Αναλύσαμε το πλασμίδιο psma198 που απομονώθηκε από το γαλακτοκομικό στέλεχος Streptococcus macedonicus ACA-DC 198 με σκοπό να εντοπίσουμε νέα στοιχεία που αφορούν τον κύριο οικολογικό θώκο αυτού του βακτηρίου. Με βάση την ομοιότητα της αλληλουχίας της πρωτεΐνης που είναι υπεύθυνη για την έναρξη αντιγραφής του πλασμιδίου (Rep) και του σημείου έναρξης της αντιγραφής (ori), το psma198 ανήκει στην οικογένεια pci305/pwv02, η οποία αποτελείται από πλασμίδια με περιορισμένο εύρος ξενιστών που βρίσκονται πρωτίστως στο γένος Lactococcus. Είναι το πρώτο πλασμίδιο αυτής της οικογένειας που εντοπίζεται στους στρεπτόκοκκους. Η συγκριτική ανάλυση της αλληλουχίας του psma198 και συγκεκριμένα του σημείου έναρξης της αντιγραφής του, του σημείου έναρξης της μεταφοράς του αλλά και ολόκληρου του μήκους του αποκάλυψε έναν υψηλό βαθμό ομοιότητας με τα πλασμίδια psk11b, pvf22 και pil5, αντίστοιχα, τα οποία έχουν απομονωθεί από στελέχη του Lactococcus lactis που προέρχονται από το γάλα ή τα προϊόντα του. Η φυλογενετική ανάλυση της πρωτεΐνης Rep του psma198 έδειξε ότι η συντριπτική πλειοψηφία των στενά σχετιζόμενων με την παραπάνω πρωτεϊνών προέρχονται από γαλακτοκομικά απομονωμένα στελέχη των λακτόκοκκων. Τόσο το psma198 όσο και το χρωμόσωμα του S. macedonicus εμφανίζουν ένα μεγάλο ποσοστό πιθανών ψευδογονιδίων, υποστηρίζοντας την κοινή τους εξέλιξη μέσω παρόμοιων διαδικασιών αποσύνθεσης γονιδίων. Επιπλέον, εντοπίσαμε χρωμοσωμικές περιοχές στον S. macedonicus που μπορεί να έχουν προέλθει από το psma198, ενισχύοντας την πιθανότητα μιας μακράς συνύπαρξης των δύο ρεπλικονίων. Επιπρόσθετα, το psma198 βρέθηκε σε διαφορετικούς βιότυπους του S. macedonicus και σε στελέχη απομονωμένα από διάσπαρτες γεωγραφικές περιοχές (π.χ. Ελλάδα ή Ελβετία) δείχνοντας ότι η απόκτηση του psma198 δεν είναι πρόσφατη. -5-

10 Τα ευρήματά μας υποδεικνύουν ότι ο S. macedonicus ACA-DC 198 απέκτησε το πλασμίδιο psma198 από τον L. lactis στο παρελθόν μέσω γενετικής ανταλλαγής που πραγματοποιήθηκε στο γάλα ή γενικότερα στα γαλακτοκομικά προϊόντα. Παρέχουμε τα πρώτα μοριακά και εξελικτικά στοιχεία για την προσαρμογή του S. macedonicus στο περιβάλλον των γαλακτοκομικών προϊόντων. -6-

11 Abstract Streptococcus macedonicus is an intriguing streptococcal species whose most frequent source of isolation is fermented foods similarly to Streptococcus thermophilus. However, S. macedonicus is closely related to commensal opportunistic pathogens of the Streptococcus bovis/streptococcus equinus complex. We analyzed the psma198 plasmid isolated from the dairy strain Streptococcus macedonicus ACA-DC 198 in order to provide novel clues about the main ecological niche of this bacterium. Based on the sequence similarity profiles of the plasmid's replication initiation protein (Rep) and origin of replication (ori), psma198 belongs to the narrow host range pci305/pwv02 family found primarily in lactococci and it is the first such plasmid to be reported in streptococci. Comparative analysis of the psma198 sequence over its ori, origin of transfer (orit) or entire length revealed a high degree of similarity with plasmids psk11b, pvf22 and pil5, respectively isolated from Lactococcus lactis strains deriving from milk or its products. Phylogenetic analysis of the psma198 Rep showed that the vast majority of closely related proteins derive from lactococcal dairy isolates. Both psma198 and the chromosome of S. macedonicus exhibit a high percentage of potential pseudogenes, indicating that they have co-evolved under the same gene decay processes. Furthermore, we identified chromosomal regions in S. macedonicus that may have originated from psma198, also supporting a long co-existence of the two replicons. In addition, psma198 was found in divergent biotypes of S. macedonicus and in strains isolated from dispersed geographic locations (e.g. Greece or Switzerland) showing that psma198's acquisition is not a recent event. Our findings support that S. macedonicus ACA-DC 198 acquired plasmid psma198 from L. lactis via an ancestral genetic exchange event that took place most probably in milk or dairy products. We provide the first molecular and evolutionary evidence for the habituation of S. macedonicus to the dairy environment. -7-

12 Παρουσιάσεις Poster σε Ελληνικά συνέδρια που πραγματοποιήθηκαν κατά τη διάρκεια της παρούσας Μεταπτυχιακής εργασίας: Konstantinos Papadimitriou, Thomas Plakas, Rania Anastasiou, Nikos C. Papandreou, Stavros J. Hamodrakas, Stéphanie Ferreira, Philip Supply, Pierre Renault, Bruno Pot and Effie Tsakalidou (2013) Characterization of plasmid psma198 found in Streptococcus macedonicus ACA-DC 198 supports the relation of the species to the milk environment. FEMS th Congress of European Microbiologists. Leipzig, Germany Thomas Plakas, Rania Anastasiou, Marina Georgalaki, Ioanna-Areti Asteri, Stéphanie Ferreira, Philip Supply, Nikos C. Papandreou, Bruno Pot, Effie Tsakalidou and Konstantinos Papadimitriou (2012) Comparative analysis of psma198 found in Streptococcus macedonicus ACA-DC 198, the first streptococcal plasmid of the pci305/pwv02 family of theta-replicating replicons. 5th conference of the Hellenic Initiative Mikrobiokosmos. Athens, Greece Thomas Plakas, Rania Anastasiou, Stéphanie Ferreira, Philip Supply, Nikos C. Papandreou, Bruno Pot, Effie Tsakalidou and Konstantinos Papadimitriou (2012) Analysis of the lactococcal plasmid psma198 found in Streptococcus macedonicus ACA-DC 198 points towards the habituation of the strain to the dairy environment. 7th conference of the Hellenic Society for Computational Biology and Bioinformatics. Heraklion, Greece -8-

13 Άρθρα που έχουν υποβληθεί σε Επιστημονικά περιοδικά με σύστημα κριτών και πραγματοποιήθηκαν κατά τη διάρκεια της παρούσας Μεταπτυχιακής εργασίας: Konstantinos Papadimitriou, Thomas Plakas, Rania Anastasiou, Nikos C. Papandreou, Stavros J. Hamodrakas, Stéphanie Ferreira, Philip Supply, Pierre Renault, Bruno Pot and Effie Tsakalidou (2013) Analysis of the lactococcal plasmid psma198 found in Streptococcus macedonicus ACA-DC 198 points towards the habituation of the strain to the dairy environment. PLOS ONE, submitted -9-

14 1. Εισαγωγή 1.1 Οξυγαλακτικά βακτήρια Καθ όλη τη διάρκεια της ιστορίας του ανθρώπου πάνω στον πλανήτη, τα οξυγαλακτικά βακτήρια είχαν ένα σημαντικό αντίκτυπο στον τρόπο ζωής του, στον πολιτισμό που ανέπτυξε και στις παραδόσεις που τον χαρακτήριζαν και τον χαρακτηρίζουν. Στις πιο σύγχρονες εποχές, με δεδομένη τη διεύρυνση των γνώσεών μας γύρω από το χώρο των τροφίμων, η οικονομική σημασία που απέκτησαν ήταν μεγάλη. Τα οξυγαλακτικά βακτήρια παίζουν σημαντικό ρόλο στην παραγωγή των τροφίμων που υπόκεινται στη διαδικασία της ζύμωσης. Από άποψη ποιότητας εξασφαλίζουν τη σωστή υφή και το κατάλληλο άρωμα για τα παραπάνω τρόφιμα, ενώ αποτελούν βιολογικά συντηρητικά, καθώς προκαλούν γρήγορη μείωση του ph των προϊόντων παράγοντας γαλακτικό οξύ [1]. Επιπλέον, τα βακτήρια αυτά παράγουν διάφορες αντιμικροβιακές ενώσεις, όπως, το οξικό οξύ, το διοξείδιο του άνθρακα, το υπεροξείδιο του υδρογόνου, η αιθανόλη και οι βακτηριοσίνες [2]. Τα οξυγαλακτικά βακτήρια διαθέτουν ένα μακροχρόνιο και ασφαλές ιστορικό εφαρμογής στα τρόφιμα. Είναι τα πιο σημαντικά βακτήρια των ζυμώσεων των τροφίμων που περιλαμβάνουν γαλακτοκομικά προϊόντα, ζυμούμενα λαχανικά, ζυμούμενα δημητριακά, ζυμούμενα προϊόντα κρέατος και το κρασί. Οι μικροοργανισμοί που χρησιμοποιούνται στις παραπάνω ζυμώσεις πρέπει να χαρακτηρίζονται από κάποιες προϋποθέσεις, είτε αυτές αφορούν στην ασφάλεια της διαδικασίας, είτε στην απόδοση που τη χαρακτηρίζει. Τα κριτήρια επιλογής των κατάλληλων μικροοργανισμών εξαρτώνται τόσο από τα χαρακτηριστικά της πρώτης ύλης, όσο και από τον τύπο και τις επιθυμητές ιδιότητες που θέλουμε να έχει το τελικό προϊόν [3]. Κάποια από τα οξυγαλακτικά βακτήρια έχουν χαρακτηριστεί και ως προβιοτικοί μικροοργανισμοί [4]. Είναι γνωστό ότι οι προβιοτικοί μικροοργανισμοί όταν καταναλωθούν ζωντανοί σε ικανές ποσότητες μπορούν να δράσουν ευεργετικά στην υγεία του ανθρώπου. Τα οφέλη που έχουν προταθεί να προκύπτουν από την κατανάλωσή τους είναι πολλά και μπορεί να είναι γενικά (π.χ. δραστηριότητας του εντέρου) ή στοχευμένα (π.χ. ρύθμιση της ανταγωνιστική δράση έναντι παθογόνων μικροοργανισμών της γαστρεντερικής οδού, όπως τα Clostridium difficile, Campylobacter jejuni και Helicobacter pylori) Η μεγάλη πλειοψηφία των

15 προβιοτικών μικροοργανισμών ανήκει στα οξυγαλακτικά βακτήρια και κυρίως στα είδη του γένους Lactobacillus και του γένους Bifidobacterium. Το αποτέλεσμα της συσχέτισης των οξυγαλακτικών βακτηρίων τόσο με τα τρόφιμα που έχουν υποστεί ζύμωση, όσο και με τους προβιοτικούς μικροοργανισμούς που δρουν ευεργετικά στην ανθρώπινη υγεία, προκαλεί όλο και μεγαλύτερο ενδιαφέρον στην επιστημονική κοινότητα, στις βιομηχανίες και στους καταναλωτές γενικότερα για αυτά τα στελέχη. Η δράση τους στις ζυμώσεις των τροφίμων είναι γνωστή εδώ και χιλιάδες χρόνια, ενώ η απόδειξη της ύπαρξής τους αρκετά πιο πρόσφατη (Ο Joseph Lister το 1878 κατάφερε να απομονώσει το πρώτο βακτήριο που ήταν υπεύθυνο για την οξίνιση του γάλακτος). Αντιθέτως, η ανάπτυξη των «λειτουργικών» τροφίμων και συγκεκριμένα των προβιοτικών οξυγαλακτικών βακτηρίων παρατηρείται μόνο τα τελευταία χρόνια, με τη ζήτησή τους να είναι αρκετά μεγάλη [5] Φυσιολογία των οξυγαλακτικών βακτηρίων Το 1942 ο Orla-Jensen περιέγραψε τα οξυγαλακτικά βακτήρια ως Gram θετικούς, μη σποριογόνους οργανισμούς (παίρνουν σχηματισμούς ραβδίων ή κόκκων) που ζυμώνουν τους υδατάνθρακες και τις ανώτερες αλκοόλες για να παράγουν κυρίως γαλακτικό οξύ [6]. Στις μέρες μας γνωρίζουμε ότι τα οξυγαλακτικά βακτήρια δεν διαθέτουν κυτόχρωμα και είναι μη αερόβιοι, αλλά αεροανθεκτικοί μικροοργανισμοί. Στην πλειοψηφία τους δεν είναι ικανοί για κίνηση, ενώ η αναλογία G + C (γουανίνη + κυτοσίνη) στο μόριο του DNA τους δεν ξεπερνάει το 55%. Έχουν βέλτιστη θερμοκρασία ανάπτυξης μεταξύ C και είναι ανθεκτικοί στα οξέα [7]. Χρησιμοποιούν τη γλυκόζη και τη λακτόζη ως πηγές άνθρακα για την παραγωγή είτε ενός και μόνου προϊόντος ζύμωσης (γαλακτικό οξύ Ομοζυμωτικά Βακτήρια), είτε περισσότερων προϊόντων ζύμωσης (γαλακτικό οξύ, CO2, αιθανόλη Ετεροζυμωτικά Βακτήρια)

16 1.1.2 Ταξινόμηση των οξυγαλακτικών βακτηρίων Τα οξυγαλακτικά βακτήρια ανήκουν στην τάξη Lactobacillales της κλάσης Bacilli του φύλλου Firmicutes. Για πολλές δεκαετίες, η ταξινόμησή τους βασιζόταν στα μορφολογικά και φαινοτυπικά τους χαρακτηριστικά. Παρόλα αυτά, η συνεχής ανακάλυψη νέων γονιδίων 16s rrna και ο ταυτόχρονος εμπλουτισμός των βάσεων δεδομένων προκάλεσε μεγάλες αλλαγές στην ταξινόμηση των οξυγαλακτικών βακτηρίων. Με τα δεδομένα που έχουμε μέχρι σήμερα, τα οξυγαλακτικά βακτήρια χωρίζονται σε έξι οικογένειες και 40 γένη συνολικά. Στον Πίνακα 1.1 καταγράφονται οι έξι οικογένειες των οξυγαλακτικών βακτηρίων καθώς και ο αριθμός των γενών που περιλαμβάνει η κάθε οικογένεια. Πίνακας 1.1 Οι έξι οικογένειες των οξυγαλακτικών βακτηρίων και ο αριθμός των γενών που αντιστοιχεί σε κάθε οικογένεια. Οικογένεια Αριθμός Γενών Aerococcaceae 7 Carnobacteriaceae 16 Enterococcaceae 7 Lactobacillaceae 3 Leuconostoccaceae 4 Streptococcaceae 3 Τα οξυγαλακτικά βακτήρια που σχετίζονται με τα τρόφιμα ανήκουν κυρίως στα γένη Streptococcus, Lactococcus, Enterococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, Weissella, Oenococcus, Carnobacterium και Tetragenococcus [8]. Τα γένη Streptococcus, Lactococcus και Enterococcus αρχικά περιλαμβάνονταν σε ένα γένος, το οποίο είχε το όνομα Streptococcus. Η ομαδοποίηση αυτή είχε γίνει με κριτήρια που βασίζονταν στη φυσιολογία, στη μορφολογία και στα βιοχημικά χαρακτηριστικά αυτών των μικροοργανισμών [9]. Παρόλα αυτά, το 1984 προτάθηκε, με βάση μοριακά κριτήρια πλέον, πως τα είδη Streptococcus faecalis και Streptococcus faecium θα ήταν πιο σωστό να μεταφερθούν στο γένος Enterococcus και να ονομάζονται Enterococcus faecalis και Enterococcus

17 faecium [10]. Το όνομα Enterococcus είχε αναφερθεί για πρώτη φορά το 1899 από τον Thiercelin για να περιγράψει τα βακτήρια αυτά τα οποία έχουν εντερική προέλευση. Από το 1984 και μετά, το συγκεκριμένο όνομα χαρακτηρίζει ένα γένος βακτηρίων [9]. Ένα χρόνο αργότερα, το 1985, επίσης με μοριακά κριτήρια, βρέθηκε ότι τόσο ο Streptococcus lactis όσο και οι Streptococcus garvieae, Streptococcus plantarum και Streptococcus raffinolactis, λόγω του γεγονότος ότι σχετίζονταν περισσότερο μεταξύ τους σε σχέση με τους άλλους στρεπτόκοκκους, έπρεπε να μεταφερθούν σε ένα νέο γένος με το όνομα «Lactococcus» και να ονομάζονται πλέον Lactococcus lactis, Lactococcus garvieae, Lactococcus plantarum και Lactococcus raffinolactis [11]. Η κατάταξη των οξυγαλακτικών βακτηρίων είναι υπό συνεχή εξέλιξη. Τα είδη που έχουν περιγραφεί είναι πάρα πολλά, ενώ η απομόνωση νέων στελεχών παγκοσμίως με διαφορετικά χαρακτηριστικά είναι μια συνεχής διαδικασία. Η εφαρμογή πολλών και διαφορετικών ταξινομικών προσεγγίσεων κάθε φορά θα πρέπει να θεωρείται δεδομένη. 1.2 Στρεπτόκοκκοι Οι στρεπτόκοκκοι είναι από τα πρώτα γένη βακτηρίων που αναγνωρίστηκαν από τους μικροβιολόγους, καθώς εμπλέκονται σε ένα μεγάλο αριθμό ασθενειών στους ανθρώπους και τα ζώα. Το όνομα «Streptococcus» χρησιμοποιήθηκε για πρώτη φορά το 1884 από τον Rosenbach [12], για να περιγράψει τους σχηματισμούς κόκκων που παίρνουν οι αλυσίδες του γένους αυτού. Η περιγραφή του αρχικά βασιζόταν σε χαρακτηριστικά φυσιολογίας, μορφολογίας και βιοχημείας, ενώ περιλάμβανε και ένα μεγάλο εύρος οργανισμών, μεταξύ αυτών και τα βακτήρια Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes και Streptococcus agalactiae [9]. Η αιμόλυση του άγαρ αίματος έχει ξεχωριστή σημασία όσον αφορά στη διάκριση αυτού του γένους. Οι β-αιμολυτικοί στρεπτόκοκκοι προκαλούν την πλήρη αιμόλυση των ερυθροκυττάρων. Με βάση τα δεδομένα που γνωρίζουμε σήμερα, στα μέλη αυτής της ομάδας περιλαμβάνονται τα εξής είδη στρεπτόκοκκων: 1) S. pyogenes (Group A Streptococcus, GAS), 2) S. agalactiae (Group B Streptococcus, GBS), 3) Streptococcus dysgalactiae, 4) Streptococcus equi, 5) Streptococcus canis,

18 6) Streptococcus anginosus, 7) Streptococcus constellatus, 8) Streptococcus intermedius, 9) Streptococcus porcinus, 10) Streptococcus iniae, 11) Streptococcus phocae και 12) Streptococcus didelphis. Οι μη β-αιμολυτικοί στρεπτόκοκκοι προκαλούν τον σχηματισμό μίας πρασινωπής ή καφετιάς ζώνης γύρω από αποικίες σε άγαρ αίματος, κάτι που δεν οφείλεται σε πραγματική αιμόλυση, αλλά σε αποχρωματισμό και απώλεια καλίου από τα ερυθροκύτταρα. Περιλαμβάνουν τα εξής είδη στρεπτόκοκκων: 1) S. pneumoniae, 2) Τα μέλη του συμπλέγματος Streptococcus bovis/streptococcus equinus (S. bovis, S. equinus, Streptococcus gallolyticus, Streptococcus infantarius, Streptococcus pasteurianus και Streptococcus lutetiensis), 3) Streptococcus suis και 4) Τους πρασινίζοντες στρεπτόκοκκους (Viridans Streptococci) [13]. Εικόνα 1.1 O Streptococcus pneumoniae στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο (Public Health Image Library-ID:262). Οι περισσότεροι στρεπτόκοκκοι είναι συμβιωτικοί των ανθρώπων και των ζώων, ενώ πολλοί από αυτούς είναι ευκαιριακά παθογόνα (opportunistic pathogens) και σχετίζονται με μια πληθώρα ασθενειών που μπορεί να περιλαμβάνει από ήπιας

19 μορφής ασθένειες (π.χ. φαρυγγίτιδα) μέχρι και πολύ σοβαρές λοιμώξεις, όπως η νεκρωτική φλεγμονή (necrotizing fasciitis). Ο Streptococcus thermophilus αποτελεί μέχρι στιγμής μία εξαίρεση σε αυτό το γένος, καθώς είναι μία από τις πιο σημαντικές εναρκτήριες καλλιέργειες βακτηρίων που χρησιμοποιούνται στη βιομηχανία του τυριού και του γιαουρτιού [14]. Εκτός από τον S. thermophilus, στενά σχετιζόμενοι με τα τρόφιμα είναι και οι Streptococcus macedonicus και S. infantarius [15, 16]. Ο S. macedonicus έχει ταυτοποιηθεί και αυτός σε ένα μεγάλο εύρος γαλακτοκομικών προϊόντων ανά τον κόσμο [15], ενώ αρκετά στελέχη και του S. infantarius έχουν απομονωθεί από το περιβάλλον των τροφίμων [17]. Η αλληλούχιση των γονιδιωμάτων του Streptococcus macedonicus ACA-DC 198 και του Streptococcus infantarius CJ18, που πραγματοποιήθηκε μέσα στο 2012 [18, 19], αναμένεται να απαντήσει στα ερωτήματα που αφορούν την προσαρμογή ή όχι των ειδών αυτών στο περιβάλλον του γάλακτος Streptococcus macedonicus Ο S. macedonicus είναι ένα είδος της οικογένειας Streptococcaceae, της τάξης Lactobacillales, της κλάσης Bacilli, του φύλου Firmicutes. Απομονώθηκε για πρώτη φορά από ελληνικό κασέρι, το οποίο είχε υποστεί ζύμωση και πήρε το όνομα «macedonicus» από το γεγονός ότι η παραπάνω διαδικασία έλαβε χώρα στη Μακεδονία [20]. Φυλογενετικά, με βάση την ανάλυση του 16s rrna, ανήκει στο σύμπλεγμα του S. bovis/s. equinus, στο οποίο ανήκουν και τα συμβιωτικά βακτήρια S. gallolyticus και S. pasteurianus [21]. Στην εικόνα 1.2 [15] φαίνονται οι φυλογενετικές σχέσεις μεταξύ των διαφόρων ειδών του γένους των στρεπτόκοκκων

20 Εικόνα 1.2 Φυλογενετικό δέντρο που δείχνει την σχέση του Streptococcus macedonicus με τα άλλα βακτήρια του γένους των στρεπτόκοκκων [15]. Ο S. macedonicus έχει μία εμφανή φυλογενετική απόσταση από τον S. thermophilus, με τον δεύτερο να φαίνεται ότι σχετίζεται περισσότερο με τον Streptococcus salivarius και τον Streptococcus vestibularis. Στη συγκεκριμένη εικόνα, αλλά και σε άλλα βιβλιογραφικά δεδομένα, ο S. macedonicus αναφέρεται σαν ένα υποείδος του S. gallolyticus. Κάτι τέτοιο είχε προταθεί από μία δημοσίευση το 2003 [21], αλλά δεν θεωρείται καθολικά αποδεκτό [22]. Το γονιδίωμα του S. macedonicus ACA-DC 198 έχει μέγεθος ζεύγη βάσεων [18], που είναι μικρότερο κατά περίπου βάσεις από το γονιδίωμα του S. gallolyticus [23]. Στο χρωμόσωμα του S. macedonicus ACA-DC 198 περιλαμβάνονται γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες. Tα 192 από αυτά τα γονίδια χαρακτηρίζονται ως πιθανά ψευδογονίδια, γεγονός που υποδηλώνει ότι το βακτήριο βρίσκεται σε διαδικασία αποσύνθεσης γονιδίων [18]. Μία τέτοια εξελικτική πορεία αποσύνθεσης του γονιδιώματος είναι σύμφωνη με αυτή που έχει περιγραφεί και για άλλα οξυγαλακτικά βακτήρια και προκύπτει κατά τη διάρκεια της προσαρμογής τους σε περιβάλλοντα πλούσια σε θρεπτικά συστατικά, όπως αυτά των τροφίμων [24]. Στην περίπτωση του S. thermophilus θεωρείται ότι η εκφυλιστική

21 εξέλιξη του γονιδιώματος συνοδεύτηκε και από απώλεια παθογόνων στοιχείων [25]. Το συγκεκριμένο είδος, το οποίο αποτελεί μία από τις πιο συχνές εναρκτήριες καλλιέργειες οξυγαλακτικών βακτηρίων, καταναλώνεται από τον άνθρωπο στο γάλα και στο γιαούρτι. Έχει προταθεί πως είναι το μοναδικό είδος στους στρεπτόκοκκους, που κατά την διάρκεια της προσαρμογής του στο περιβάλλον του γάλακτος, μέσα από μία διαδικασία αποσύνθεσης γονιδίων, απώλεσε όλα αυτά τα παθογόνα στοιχεία που χαρακτηρίζουν το συγκεκριμένο γένος [25]. Οι στρεπτόκοκκοι του συμπλέγματος S. bovis/s. equinus, μεταξύ αυτών και οι S. gallolyticus και S. pasteurianus, εμπλέκονται στην ενδοκαρδίτιδα, στη βακτηριαιμία και στον καρκίνο του παχέος εντέρου [26]. Παρόλη τη συγγένεια του S. macedonicus με τα παθογόνα βακτήρια S. gallolyticus και S. pasteurianus, το βακτήριο έχει απομονωθεί κυρίως από μεγάλο εύρος γαλακτοκομικών προϊόντων και οι υπάρχουσες μελέτες υποστηρίζουν ότι το γάλα και γενικότερα τα γαλακτοκομικά προϊόντα αποτελούν τον πρωταρχικό οικολογικό του θώκο [15]. Αναμένουμε για μελέτες οι οποίες θα διερευνήσουν την πιθανότητα ο S. macedonicus να ακολούθησε παρόμοια εξελικτική πορεία με αυτή του S. thermophilus και να απώλεσε κατά τη διάρκεια προσαρμογής του στο περιβάλλον του γάλακτος τα στοιχεία παθογένειας που μπορεί να περιελάμβανε. Σε αντίθετη περίπτωση και ειδικά αν βρεθούν στοιχεία παθογένειας, η παρουσία του βακτηρίου θα πρέπει πλέον να αποφεύγεται στις ζυμώσεις των τροφίμων για την ασφάλεια του καταναλωτή. Στην παρούσα εργασία, αναλύουμε το πρώτο πλασμίδιο που απομονώθηκε από τον S. macedonicus ACA-DC 198. Η αποσαφήνιση της πορείας της αρχικής απόκτησης του psma198 αναμένεται να μας δώσει επιπλέον στοιχεία για την προσαρμογή ή όχι του βακτηρίου στο περιβάλλον του γάλακτος. 1.3 Πλασμιδιακό DNA στα βακτήρια Τα πλασμίδια αποτελούν εξωχρωμοσωμικά μόρια DNA με συγκεκριμένο αριθμό αντιγράφων μέσα σε κάθε κύτταρο-ξενιστή και εντοπίζονται σε είδη που αντιπροσωπεύουν και τις τρεις επικράτειες έμβιων οργανισμών [Αρχαία, Βακτήρια, Ευκαρυώτες (Ζύμες και Μύκητες)]. Ο όρος «πλασμίδιο» εισήχθη για πρώτη φορά στην επιστημονική κοινότητα το 1952, από το Joshua Lederberg, για να περιγράψει

22 γενικά κάθε εξωχρωμοσωμικό γενετικό υλικό για το βακτήριο Escherichia coli [27]. Τα πλασμίδια εντοπίζονται σχεδόν σε όλα τα βακτηριακά είδη (Gram θετικά και Gram αρνητικά), ενώ ο αριθμός των αντιγράφων τους μπορεί να κυμαίνεται από ένα ή δύο μέχρι και μερικές εκατοντάδες αντίγραφα. Μπορούν και αντιγράφονται ανεξάρτητα από το βακτηριακό χρωμόσωμα, παρόλο που χρησιμοποιούν ένζυμα του ξενιστή τους, ενώ το μέγεθός τους μπορεί να είναι από περίπου ζεύγη βάσεων μέχρι και ζεύγη βάσεων [28, 29]. Από το 1952 και μετά, τα πλασμίδια μελετώνται εντατικά για τις γενετικές και φαινοτυπικές ιδιότητες που τα χαρακτηρίζουν. Οι ιδιότητές τους μπορούν να περιλαμβάνουν την ανθεκτικότητα σε αντιβιοτικά καθώς και σε τοξικά βαρέα μέταλλα, την αποικοδόμηση ξενοβιοτικών ουσιών, την ανθεκτικότητα στην ακτινοβολία, την παραγωγή βακτηριοσινών, την αυξημένη συχνότητα εμφάνισης μεταλλάξεων και τη βακτηριακή σύζευξη [29]. Τα περισσότερα πλασμίδια είναι δίκλωνα κυκλικά μόρια DNA, αν και από διάφορα βακτήρια έχουν απομονωθεί και γραμμικά πλασμίδια [30]. Παρόλο που τα πλασμίδια δεν θεωρούνται απαραίτητα για την επιβίωση των βακτηρίων, μερικά από αυτά κωδικοποιούν πρωτεΐνες που επιτρέπουν στους ξενιστές τους είτε να επιβιώσουν πιο ικανοποιητικά σε ένα αντίξοο περιβάλλον, είτε να ανταγωνιστούν με άλλους μικροοργανισμούς που βρίσκονται στην ίδια οικολογική περιοχή για τα διαθέσιμα θρεπτικά υποστρώματα [31]. Όσον αφορά στην οργάνωση της δομής του DNA τους, τα πλασμίδια, πέρα από τα γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες με διάφορες βιολογικές λειτουργίες, περιλαμβάνουν και μία βασική περιοχή με γονίδια και αλληλουχίες που συμμετέχουν στην αντιγραφή τους και στον έλεγχο αυτής. Αυτή η περιοχή περιλαμβάνει τα σημεία έναρξης της αντιγραφής (origin of replication, ori) των πλασμιδίων που είναι χαρακτηριστικά για κάθε ρεπλικόνιο, τα γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες (π.χ. πρωτεΐνη Rep) που συμμετέχουν στην έναρξη της αντιγραφής και τα γονίδια που εμπλέκονται στον έλεγχο του αναδιπλασιασμού των πλασμιδίων. Η εμφάνιση περιοχών DNA στα σημεία έναρξης της αντιγραφής των πλασμιδίων, όπου μπορούν να λάβουν χώρα αλληλεπιδράσεις πρωτεϊνών-dna, μαρτυρά στην ουσία και την ανάγκη ύπαρξης μίας πλασμιδιακής πρωτεΐνης (Rep) που ρυθμίζει την έναρξη της αντιγραφής

23 Έχει βρεθεί ότι υπάρχουν και πλασμίδια τα οποία δεν κωδικοποιούν άλλες πρωτεΐνες εκτός από αυτές που είναι υπεύθυνες για την αντιγραφή τους και συνεπώς δεν μπορούν να παρέχουν κάποια συγκεκριμένη ιδιότητα στο βακτήριο στο οποίο εντοπίζονται. Τα συγκεκριμένα πλασμίδια ονομάζονται κρυπτικά (cryptic) [31] Μηχανισμοί αντιγραφής στα πλασμίδια με έμφαση στα πλασμίδια των οξυγαλακτικών βακτηρίων Οι μηχανισμοί αντιγραφής των πλασμιδίων είναι τρεις και περιλαμβάνουν το μηχανισμό θήτα, την εκτόπιση κλώνου και το μηχανισμό κυλιόμενης αντιγραφής. Η άποψη η οποία είχε επικρατήσει υποστήριζε πως η αντιγραφή θήτα είναι πιο συχνή στα ρεπλικόνια των Gram αρνητικών βακτηρίων, με το μηχανισμό της κυλιομένης αντιγραφής να συναντάται περισσότερο στα Gram θετικά βακτήρια. Ωστόσο, ο συγκεκριμένος ισχυρισμός φαίνεται να είναι πιθανότατα λανθασμένος [28]. Οι γνώσεις οι οποίες έχουμε σήμερα για το μηχανισμό θήτα προέρχονται κυρίως από πλασμίδια των Gram αρνητικών βακτηρίων, ενώ αυτές που έχουμε για το μηχανισμό κυλιόμενης αντιγραφής απορρέουν από πλασμίδια των Gram θετικών βακτηρίων. Στην παρούσα εργασία, δεν θα αναφερθούμε στο μηχανισμό αντιγραφής εκτόπισης κλώνου, καθώς δεν αφορά ούτε στα πλασμίδια των στρεπτόκοκκων, ούτε σε αυτά των οξυγαλακτικών βακτηρίων που έχουν βρεθεί μέχρι σήμερα. Οι μηχανισμοί αντιγραφής των γραμμικών πλασμιδίων επίσης δεν αφορούν στην συγκεκριμένη εργασία, οπότε ούτε αυτοί θα περιγραφούν. Αξίζει όμως να σημειωθεί, ότι από όλα τα οξυγαλακτικά βακτήρια μόνο σε ένα είδος του γένους Lactobacillus έχει εντοπιστεί πλασμίδιο το οποίο είναι γραμμικό [30] Μηχανισμός αντιγραφής θήτα Ο μηχανισμός αντιγραφής θήτα εντοπίζεται κυρίως σε κυκλικά πλασμίδια Gram αρνητικών βακτηρίων, ενώ όσον αφορά στα οξυγαλακτικά βακτήρια έχει

24 περιγραφεί σε πλασμίδια βακτηρίων των γενών Streptococcus, Enterococcus, Lactococcus, Lactobacillus και Pediococcus. Η έναρξη της αντιγραφής του DNA στο συγκεκριμένο μηχανισμό περιλαμβάνει την τήξη των δύο κλώνων, τη σύνθεση ενός εκκινητή RNA, καθώς και την επιμήκυνση του τελευταίου μέσω σύνθεσης νέου DNA [32]. Η αντιγραφή προχωράει με συνεχή σύνθεση του προπορευόμενου κλώνου και ασυνεχή σύνθεση του δευτερεύοντος κλώνου, με τη σύνθεση των δύο κλώνων να πραγματοποιείται ταυτόχρονα και να είναι συνδεδεμένη. Ο μηχανισμός αντιγραφής θήτα μπορεί να ξεκινήσει είτε από ένα είτε από περισσότερα σημεία έναρξης της αντιγραφής (ori) και να κινείται σε μία ή δύο κατευθύνσεις [33]. Στις περισσότερες των περιπτώσεων, τα πλασμίδια που αναπαράγονται με το συγκεκριμένο μηχανισμό χρησιμοποιούν την πρωτεΐνη έναρξης της αντιγραφής Rep, ενώ μόνο ορισμένα από αυτά φαίνεται να χρησιμοποιούν την DNA-πολυμεράση Ι του κυττάρου στο οποίο βρίσκονται. Το ori των πλασμιδίων μπορεί να οριστεί ως η περιοχή όπου συμβαίνει η τήξη του δίκλωνου DNA για να ξεκινήσει η αντιγραφή, ως η ακολουθία όπου αρχίζει η σύνθεση του προπορευόμενου κλώνου και ως η ελάχιστη περιοχή του πλασμιδίου που υποστηρίζει την ανεξάρτητη αντιγραφή του. Τα ori φέρουν αλληλουχίες με τις οποίες μπορεί να αλληλεπιδράσει τόσο η πρωτεΐνη Rep, όσο και οι πρωτεΐνες που κωδικοποιούνται από το κύτταρο-ξενιστή [28]. Οι οικογένειες ρεπλικονίων θήτα των οξυγαλακτικών βακτηρίων είναι τέσσερις, με τα πλασμίδια των λακτόκοκκων να τοποθετούνται κατά βάση στην οικογένεια pci305/pwv02, που αντιγράφεται με το μηχανισμό θήτα, περιλαμβάνοντας ένα περιορισμένο εύρος ξενιστών. Το πρότυπο πλασμίδιο αυτής της οικογένειας ρεπλικονίων είναι το pci305. Έχει μήκος ζεύγη βάσεων και βρίσκεται στον L. lactis, ενώ το ρεπλικόνιό του αποτελείται από μία περιοχή πλούσια σε αδενίνη και θυμίνη, μία περιοχή που περιλαμβάνει επαναλήψεις 22 ζευγών βάσεων για τρεισήμισι φορές και ένα γονίδιο που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη έναρξης της αντιγραφής Rep [34]. Με τα μέχρι τώρα δεδομένα κανένα πλασμίδιο από αυτά που εντοπίζονταν στους στρεπτόκοκκους δεν περιλαμβανόταν στην παραπάνω οικογένεια ρεπλικονίων. Ένα άλλο ενδιαφέρον στοιχείο των πλασμιδίων των οξυγαλακτικών βακτηρίων που αντιγράφονται με το μηχανισμό θήτα είναι και η παρουσία ενός γονιδίου καταρροϊκά του γονιδίου της πρωτεΐνης Rep, το οποίο έχει το όνομα «orfx» και εμφανίζει μικρότερη συντήρηση σε σχέση με το γονίδιο της πρωτεΐνης Rep. Με βάση το γεγονός ότι το γονίδιο orfx απουσιάζει από μερικά πλασμίδια που

25 αντιγράφονται με το μηχανισμό θήτα, δεν μπορεί να χαρακτηριστεί ως ένα απαραίτητο συστατικό της αντιγραφής [35]. Παρόλα αυτά, υπάρχουν δημοσιεύσεις που προτείνουν ότι το συγκεκριμένο γονίδιο σε μερικά πλασμίδια έχει λειτουργική σημασία, ελέγχοντας τόσο τον αριθμό των πλασμιδιακών αντιγράφων στο κύτταρο, όσο και την σταθερότητα που εμφανίζει το πλασμίδιο [36]. Εικόνα 1.3 Σχηματική απεικόνιση του μηχανισμού θήτα αντιγραφής (Molecular Biology of the Cell, 4th edition) Μηχανισμός κυλιόμενης αντιγραφής Ο μηχανισμός της κυλιόμενης αντιγραφής, ενώ αρχικά θεωρούνταν ότι περιορίζεται μόνο σε μικρά πλασμίδια πολλαπλών αντιγράφων Gram θετικών βακτηρίων, πλέον είναι γνωστό ότι απαντάται και σε άλλους τύπους πλασμιδίων Gram θετικών βακτηρίων, αλλά και Αρχαίων. Σε αντίθεση με το μηχανισμό αντιγραφής θήτα, εδώ η σύνθεση του προπορευόμενου και του δευτερεύοντος κλώνου δεν συνδέονται

26 Η εκκίνηση του μηχανισμού πραγματοποιείται όταν η πλασμιδιακή πρωτεΐνη έναρξης της αντιγραφής Rep εισάγει μία εγκοπή στον προπορευόμενο κλώνο και συγκεκριμένα στην περιοχή που ονομάζεται σημείο έναρξης του αναδιπλασιασμού της διπλής αλυσίδας (double-strand origin, dso). Αυτή η εγκοπή δημιουργεί ένα ελεύθερο 3-υδροξυλικό άκρο που χρησιμοποιείται ως εκκινητής για τη σύνθεση του προπορευόμενου κλώνου, στην οποία εμπλέκονται οι πρωτεΐνες αντιγραφής του κυττάρου-ξενιστή (DNA πολυμεράση ΙΙΙ, ελικάση). Η επιμήκυνση από το 3-άκρο σε συνδυασμό με τη μετατόπιση του μητρικού προπορευόμενου κλώνου συνεχίζεται μέχρι το αντιγραφόσωμα (replisome) να φτάσει στο ανασυσταθέν σημείο έναρξης του αναδιπλασιασμού της διπλής αλυσίδας και να τερματιστεί η αντιγραφή του προπορευόμενου κλώνου. Τα τελικά προϊόντα της αντιγραφής του προπορευόμενου κλώνου είναι δύο. Το πρώτο περιλαμβάνει ένα μητρικό δευτερεύοντα κλώνο και ένα νεοσυντιθέμενο προπορευόμενο κλώνο, ενώ το δεύτερο περιλαμβάνει ένα μονόκλωνο DNA που αντιστοιχεί στο μητρικό προπορευόμενο κλώνο. Η διαδικασία τελειώνει με το μητρικό προπορευόμενο κλώνο να μετατρέπεται σε δίκλωνο μόριο DNA από τις πρωτεΐνες του ξενιστή, κάτι το οποίο ξεκινά από το σημείο έναρξης της αντιγραφής της μονής αλυσίδας [37]. Ανάλογα με τα χαρακτηριστικά που φέρουν οι πρωτεΐνες έναρξης της αντιγραφής Rep και οι αλληλουχίες στο σημείο έναρξης του αναδιπλασιασμού της διπλής αλυσίδας, τα πλασμίδια που αντιγράφονται με το μηχανισμό της κυλιόμενης αντιγραφής κατηγοριοποιούνται σε τουλάχιστον 4 οικογένειες (π.χ. pc194, pe194, pt181 και psn2). Η αλληλουχία στη θέση εγκοπής είναι συντηρημένη για κάθε οικογένεια ξεχωριστά. Τα πλασμίδια των οξυγαλακτικών βακτηρίων και πιο συγκεκριμένα αυτά των λακτόκοκκων, που αντιγράφονται με τον παραπάνω μηχανισμό, έχουν σαν πρότυπο πλασμίδιο το psh71 του L. lactis και ανήκουν στην οικογένεια pe194 [38]

27 Εικόνα 1.4 Σχηματική απεικόνιση του μηχανισμού κυλιόμενης αντιγραφής [37]. 1.4 Οριζόντια μεταφορά γονιδίων. Ανάλυση της βακτηριακής σύζευξης Αν εξαιρέσει κανείς τη γονιδιακή ροή μεταξύ στενά συγγενικών ειδών, οι γενετικές αλλαγές που συμβαίνουν σε ένα είδος σπάνια μεταφέρονται σε άλλα είδη. Παρόλα αυτά, υπάρχουν μοριακά δεδομένα που υποδεικνύουν ότι στην πορεία της εξέλιξης έχει συμβεί περιστασιακά μεταφορά γενετικής πληροφορίας μεταξύ πολλών διαφορετικών ταξινομικών βαθμίδων (taxa). Σε αυτή τη διαδικασία, η οποία ονομάζεται οριζόντια μεταφορά γονιδίων, ενεργή συμμετοχή έχουν και τα πλασμίδια, ενώ μέσω αυτής τα βακτήρια μπορούν και αποκτούν ιδιότητες προσαρμογής, βελτιώνοντας έτσι την επιβίωσή τους κάτω από επιλεκτικές πιέσεις [39]. Παρόλο που υπάρχουν αρκετοί μηχανισμοί οριζόντιας μεταφοράς, στην παρούσα μελέτη θα επικεντρωθούμε στην οριζόντια μεταφορά μέσω βακτηριακής σύζευξης. Για κάθε γονίδιο το οποίο μεταφέρεται οριζόντια από ένα γονιδίωμα σε ένα άλλο, απαιτούνται κάθε φορά 4 ή 5 διακριτά βήματα, για να πραγματοποιηθεί αυτή η διαδικασία (εικόνα 1.5) [40]. Το πρώτο βήμα περιλαμβάνει την προετοιμασία του DNA που πρόκειται να μεταφερθεί από το κύτταρο-δότη στο κύτταρο-δέκτη. Κατά τη βακτηριακή σύζευξη που γίνεται μέσω κάποιου πλασμιδίου, η προετοιμασία του DNA που πρόκειται να μεταφερθεί θα περιλαμβάνει την αναγνώριση και το κόψιμο ενός φωσφοδιεστερικού δεσμού ενός συγκεκριμένου δινουκλεοτιδίου που

28 εντοπίζεται σε μία θέση εγκοπής στην περιοχή έναρξης της μεταφοράς (orit) του πλασμιδίου από μία πρωτεΐνη κινητοποίησης (mobilization protein) [41]. Ο κλώνος ο οποίος έχει κοπεί, εφόσον λάβει χώρα η φυσική επαφή μεταξύ του κυττάρου-δότη και του κυττάρου-δέκτη (δεύτερο βήμα της διαδικασίας), μπορεί πλέον να μεταβιβαστεί από το ένα βακτήριο στο άλλο (τρίτο βήμα της διαδικασίας). Στο τέταρτο βήμα, με βάση το μονόκλωνο πλασμιδιακό DNA που πλέον έχει μεταφερθεί στο κύτταρο-δέκτη, συντίθεται η συμπληρωματική του αλυσίδα, με το δίκλωνο πλασμιδιακό DNA που προκύπτει να μπορεί να αντιγράφεται ανεξάρτητα από το βακτηριακό χρωμόσωμα [40]. Πολλές φορές, πλασμίδια τα οποία μέσω της παραπάνω διαδικασίας (συζευκτική μεταφορά) μεταφέρθηκαν από ένα βακτηριακό είδος σε ένα άλλο, μπορούν να φέρουν συγκεκριμένες αλληλουχίες (π.χ. αλληλουχίες ένθεσης, insertion sequences) στο DNA τους, που έχουν την ικανότητα να μεταπηδούν από αυτά στο βακτηριακό χρωμόσωμα και αντίθετα. Οι αλληλουχίες ένθεσης τέτοιων πλασμιδίων, όταν αυτά έχουν πλέον μεταφερθεί στο κύτταρο-δέκτη, μπορούν να μεταπηδήσουν στο χρωμόσωμα του τελευταίου, να ενσωματωθούν σε αυτό και εν τέλει να αποτελέσουν και ένα τμήμα του γονιδιώματός του που θα μεταφερθεί στους απογόνους του (πέμπτο βήμα της διαδικασίας) [40]. Επειδή όλα τα πλασμίδια τα οποία μεταφέρονται από ένα κύτταρο σε ένα άλλο δεν φέρουν τέτοιες αλληλουχίες ένθεσης, το πέμπτο βήμα της διαδικασίας, που μόλις περιγράφηκε, αποτελεί ένα προαιρετικό βήμα. Εικόνα 1.5 Οι 5 διαδικασίες της οριζόντιας μεταφοράς γονιδίων σε μία αναπαράσταση πάνω στο φυλογενετικό δέντρο όλων των έμβιων οργανισμών [40]

29 Οι αλληλουχίες ένθεσης μπορούν να έχουν μήκος από 600 ζεύγη βάσεων μέχρι και ζεύγη βάσεων. Περιβάλλονται από ανάστροφες επαναλήψεις μήκους 10 έως 40 ζευγών βάσεων, ενώ ανάμεσα σε αυτές βρίσκονται ένα ή περισσότερα ανοικτά πλαίσια ανάγνωσης που κωδικοποιούν πρωτεΐνες απαραίτητες για τη μετάθεση του στοιχείου. Στις απλούστερες και πιο μικρές αλληλουχίες ένα ανοικτό πλαίσιο ανάγνωσης κωδικοποιεί ένα ένζυμο που ονομάζεται μεταθετάση, το οποίο αναγνωρίζει τις ανάστροφες επαναλήψεις και καταλύει την εκτομή του στοιχείου από εκεί που βρίσκεται (είτε στο βακτηριακό χρωμόσωμα, είτε στο πλασμιδιακό DNA). Άλλες αλληλουχίες ένθεσης, περισσότερο πολύπλοκες, σχηματίζονται από δύο ή περισσότερα διαδοχικά διευθετημένα τρανσποζόνια, σε μικρή απόσταση το ένα από το άλλο. Τέτοιου τύπου τρανσποζόνια έχουν τη δυνατότητα να μετατίθενται ως μία μονάδα, μεταφέροντας συγχρόνως και το DNA που βρίσκεται ανάμεσά τους. Αυτά τα σύνθετα τρανσποζόνια μπορούν να μεταπηδήσουν από ένα βακτηριακό χρωμόσωμα σε ένα πλασμίδιο, να μεταφερθούν μέσω αυτών σε ένα άλλο βακτηριακό κύτταρο με τη διαδικασία της σύζευξης, να ενσωματωθούν στο χρωμόσωμα του κυττάρου-δέκτη και εάν μεταφέρουν ένα τμήμα DNA με σημαντική βιολογική πληροφορία (π.χ. γονίδια που προσδίδουν ανθεκτικότητα σε αντιβιοτικά), να δημιουργήσουν ένα εξελικτικό πλεονέκτημα στα βακτήρια που τα φέρουν [42]. Αναλύοντας περισσότερο το δεύτερο βήμα της διαδικασίας, ενδιαφέρον αποτελεί και ο τρόπος με τον οποίον επιτυγχάνεται η επαφή μεταξύ του κυττάρουδότη και του κυττάρου-δέκτη. Αυτός ο τρόπος είναι διαφορετικός όταν συγκρίνουμε τα Gram-θετικά βακτήρια με τα Gram-αρνητικά βακτήρια [41]. Στους εντερόκοκκους, για παράδειγμα, η ενεργοποίηση του πρωτεϊνικού συμπλέγματος σύζευξης, που κωδικοποιείται από πλασμίδια, γίνεται μέσω εμφάνισης κατάλληλων φερορμονών. Αυτό έχει σαν αποτέλεσμα την παραγωγή μίας μεμβρανικής πρωτεΐνης που επάγει και την κυτταρική επαφή μεταξύ του βακτηρίου-δότη και του βακτηρίουδέκτη [43]. Αξίζει να σημειωθεί πως υπάρχουν πλασμίδια τα οποία δεν περιλαμβάνουν γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες που συμμετέχουν στη συζευκτική μεταφορά. Ακόμα και τέτοια πλασμίδια μπορούν να μεταφερθούν παρουσία ενός συζευκτικού πλασμιδίου από ένα βακτήριο στο άλλο με την προϋπόθεση ότι φέρουν μία περιοχή έναρξης της μεταφοράς τους (orit) [41]. Η συζευκτική μεταφορά των βακτηριακών πλασμιδίων, που αποτελεί και τον πιο αποτελεσματικό τρόπο οριζόντιας μεταφοράς γονιδίων, θεωρείται εν τέλει ένας από τους κύριους λόγους για την αύξηση του αριθμού των βακτηρίων που

30 εμφανίζουν αντίσταση σε πολλά αντιβιοτικά [41]. Πέρα από την αντίσταση στα αντιβιοτικά, πολλά είναι τα συζευκτικά πλασμίδια που έχουν αναγνωριστεί και σχετίζονται και με άλλα χαρακτηριστικά, τα οποία μεταφέρουν στα νέα κύτταραδέκτες, όπως είναι η παραγωγή βακτηριοσινών, η αντίσταση στους βακτηριοφάγους [44], η παραγωγή πρωτεϊνασών [45] καθώς και ο καταβολισμός της λακτόζης [46]

31 2. Σκοπός της διπλωματικής εργασίας Στην παρούσα διπλωματική εργασία αναλύουμε το πλασμίδιο psma198, το πρώτο πλασμίδιο που απομονώθηκε από τον S. macedonicus ACA-DC 198 [18]. Προσπαθούμε να αποσαφηνίσουμε την πορεία της αρχικής του απόκτησης, θέλοντας να αντλήσουμε νέα στοιχεία για τον κύριο οικολογικό θώκο του βακτηρίου-ξενιστή στο οποίο εντοπίζεται. Το πλασμίδιο psma198 βρίσκεται σε ένα πολύ ενδιαφέρον είδος στρεπτόκοκκων που το συνοδεύουν κάποια αντιφατικά χαρακτηριστικά. Ο S. macedonicus φυλογενετικά ανήκει στο σύμπλεγμα του S. bovis/s. equinus όντας συγγενικός με μέλη του συμπλέγματος, όπως τα ευκαιριακά παθογόνα βακτήρια S. gallolyticus και S. pasteurianus που σχετίζονται με ασθένειες όπως η ενδοκαρδίτιδα, η βακτηριαιμία και ο καρκίνος του παχέως εντέρου [21, 26]. Από την άλλη πλευρά, παρόλο που μέχρι στιγμής μόνο ο S. thermophilus, μέσα από το γένος των στρεπτόκοκκων, θεωρείται ασφαλής και χρησιμοποιείται ευρέως στις ζυμώσεις των τροφίμων, ο S. macedonicus έχει και αυτός ταυτοποιηθεί σε ένα μεγάλο εύρος γαλακτοκομικών προϊόντων ανά τον κόσμο, με τις τωρινές μελέτες να υποστηρίζουν ότι το γάλα και γενικότερα τα γαλακτοκομικά προϊόντα αποτελούν τον πρωταρχικό οικολογικό του θώκο [15]. Στην συγκεκριμένη εργασία αναλύουμε όλα τα χαρακτηριστικά εκείνα του πλασμιδίου, τα οποία θα μας δώσουν μια εικόνα για την προέλευσή του και την τυχόν συσχέτισή του με πλασμίδια άλλων βακτηριακών γενών πέρα από τους στρεπτόκοκκους. Σύμφωνα με τις μελέτες μας, προτείνουμε πως ο S. macedonicus ACA-DC 198 απέκτησε το συγκεκριμένο πλασμίδιο από τον L. lactis μέσω ενός γεγονότος οριζόντιας μεταφοράς. Θέλουμε να διευκρινίσουμε εάν η παραπάνω ανταλλαγή έγινε στο γάλα ή στο περιβάλλον του γάλακτος γενικότερα, στην προσπάθεια αποσαφήνισης της προσαρμογής ή μη του S. macedonicus στο συγκεκριμένο περιβάλλον. Τα αποτελέσματα αυτής της μελέτης σε συνδυασμό με αυτά που περιμένουμε να μας δώσει και η ανάλυση του γονιδιώματος του S. macedonicus ACA-DC 198 [18] αναμένεται να αποσαφηνίσουν αν το βακτήριο πρέπει να θεωρείται ασφαλές ή αν θα πρέπει πλέον να αποφεύγεται η παρουσία του στις ζυμώσεις των τροφίμων

32 3. Υλικά και Μέθοδοι 3.1 Βακτηριακά στελέχη και συνθήκες καλλιέργειας Ο S. macedonicus ACA-DC 198 απομονώθηκε για πρώτη φορά από ένα παραδοσιακό ελληνικό τυρί, το κασέρι [20]. Το στέλεχος αναπτύχθηκε σε θρεπτικό υπόστρωμα M17 μαζί με 1 % (w/v) γλυκόζη (GM17). Αποθέματα του βακτηρίου αποθηκεύτηκαν σε κρυοφιαλίδια μαζί με 1 ml GM17 και 20 % (v/v) γλυκερόλη. 3.2 Πρόβλεψη των γονιδίων και σχολιασμός του πλασμιδίου psma198 Η πρόβλεψη των γονιδίων και ο σχολιασμός του πλασμιδίου psma198 πραγματοποιήθηκε μέσω 2 εργαλείων σχολιασμού ab initio για βακτηριακές και πλασμιδιακές αλληλουχίες, του RAST [47] και του BaSys [48]. Ο λειτουργικός σχολιασμός των πρωτεϊνών που προέβλεψαν τα δύο παραπάνω εργαλεία στο πλασμίδιο psma198 επιβεβαιώθηκε και με το πρόγραμμα WU-BLAST [49], το οποίο εκτελεί αναζητήσεις ομοιότητας για νουκλεοτιδικές ή αμινοξικές αλληλουχίες σε βιολογικές βάσεις δεδομένων. Η ταυτοποίηση των πιθανών ψευδογονιδίων μέσα από το σύνολο των 17 γονιδίων που περιλαμβάνει το πλασμίδιο βασίστηκε σε τρία χαρακτηριστικά: 1) Στην παρουσία ή απουσία της αλληλουχίας σύνδεσης στο ριβόσωμα (ribosome binding site, RBS) που εντοπίζεται μπροστά από κάθε λειτουργικό γονίδιο που πρόκειται να μεταφραστεί, 2) Στο μήκος της κάθε κωδικοποιούσας αλληλουχίας και 3) Στην εμφάνιση φαινομένων, όπως η αλλαγή του πλαισίου ανάγνωσης σε ένα γονίδιο, που μπορούν να οδηγήσουν είτε στην παραγωγή τροποποιημένων πρωτεϊνικών προϊόντων, είτε στην παραγωγή προϊόντων με μικρότερο μήκος στην ακολουθία. Η ταυτοποίηση τέλος του ori και του oriτ πραγματοποιήθηκε με βάση τις αλληλουχίες που είχαν καθοριστεί σε προηγούμενες δημοσιεύσεις βασισμένες σε πλασμίδια τα οποία βρέθηκαν συγγενικά με το psma

33 3.3 Νουκλεοτιδική, πρωτεϊνική και φυλογενετική ανάλυση του πλασμιδίου psma198 Πέρα από τις αναζητήσεις σε επίπεδο DNA ή σε πρωτεϊνικό επίπεδο που πραγματοποιήθηκαν στο WU-BLAST, έγιναν στοιχίσεις των διαφόρων νουκλεοτιδικών και πρωτεϊνικών αλληλουχιών στο ClustalW [50]. Για την καλύτερη ανάλυση των πολλαπλών στοιχίσεων χρησιμοποιήθηκε το πρόγραμμα Jalview [51]. Τα διάφορα χαρακτηριστικά που περιλαμβάνουν οι στοιχίσεις (π.χ. επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες, ανάστροφες επαναλήψεις κ.α.) καθορίστηκαν με βάση την αναζήτηση σε βιβλιογραφικά δεδομένα που αφορούν πλασμίδια συγγενικά του psma198. Το εργαλείο InterProScan χρησιμοποιήθηκε για την εύρεση αυτοτελών δομικών στοιχείων μέσα στις πρωτεΐνες [52]. Η αυτοματοποιημένη επιδιόρθωση των πολλαπλών στοιχίσεων των αλληλουχιών έγινε με το πρόγραμμα Gblocks [53], ενώ τα φυλογενετικά δέντρα μέγιστης πιθανότητας κατασκευάστηκαν με τη βοήθεια του αλγόριθμου PhyML[54], έτσι όπως εκτελείται στη διαδικτυακή πλατφόρμα phylogeny.fr [55]. Η πιθανότητα εμπιστοσύνης του κάθε κλάδου στο φυλογενετικό δέντρο υπολογίστηκε με το τεστ alrt (approximate likelihood-ratio test) [56]. Η γραφική αναπαράσταση του φυλογενετικού δέντρου έγινε με τη συμβολή του εργαλείου TreeDyn [57]. Τέλος, η συγκριτική ανάλυση του πλασμιδίου psma198 σε σχέση με άλλα πλασμίδια πραγματοποιήθηκε με τη βοήθεια του εργαλείου Circoletto [58] και του λογισμικού Kodon (Applied Maths N.V., SintMartens-Latem, Belgium). 3.4 Προσδιορισμός του σχετικού αριθμού αντιγράφων του πλασμιδίου psma198 Ο σχετικός αριθμός αντιγράφων του πλασμιδίου psma198 προσδιορίστηκε με ποσοτική PCR (Q-PCR) [59]. Ως γονίδιο αναφοράς χρησιμοποιείται ένα γονίδιο το οποίο υπάρχει μόνο σε ένα αντίγραφο στο γονιδίωμα του Streptococcus macedonicus ACA-CD 198. Για το συγκεκριμένο στέλεχος πολλαπλασιάστηκε ένα τμήμα 104 ζευγών βάσεων του γονιδίου mcdm με τους εκκινητές 5- CGG AAT TCA GTT CTT TCT ACG G -3 (mcdmf) και 5- GCT TCA CCA ATA AGC GTT CC

34 (mcdmr). Για το πλασμίδιο επιλέχθηκε ένα τμήμα 109 ζευγών βάσεων του γονιδίου rep που πολλαπλασιάστηκε με τους εκκινητές 5- GAA ATC AAC GCC CAT ACG TC -3 (repf) και 5- TAT CGT CTG CAC ACC GTT TC-3 (repr). Οι αντιδράσεις έγιναν στη συσκευή ΜΧ3005P (Stratagene, La Jolla, CA) χρησιμοποιώντας το KAPA SYBR FAST qpcr Kit (Kapa Biosystems, Inc. Woburn, MA), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Ο σχετικός αριθμός των πλασμιδιακών αντιγράφων προσδιορίστηκε με βάση την εξίσωση PCN= (Ec) Ctc/(Ep) Ctp που λαμβάνει υπόψη της τις διαφορετικές αποδόσεις της αντίδρασης (efficiency, E) αλλά και τη διαφορά των ορίων κύκλου (Cycle Threshold, CT) μεταξύ των δύο αμπλικονίων (χρωμοσωμικού-c και πλασμιδιακού-p)

35 4. Αποτελέσματα και συζήτηση 4.1 Το πλασμίδιο psma198 ανήκει στην οικογένεια ρεπλικονίων με περιορισμένο εύρος ξενιστών pci305/pwvo2 του γένους Lactococcus Ο S. macedonicus ACA-DC 198 περιλαμβάνει ένα πλασμίδιο ζευγών βάσεων, που ονομάζεται psma198 [18]. Η αναλογία G + C (γουανίνης + κυτοσίνης) στο DNA του πλασμιδίου αυτού είναι 35,0 %, ποσοστό το οποίο είναι χαμηλότερο από αυτό του χρωμοσώματος του S. macedonicus ACA-DC 198 (37,6 %), υποδηλώνοντας ότι το συγκεκριμένο βακτήριο πιθανόν να απέκτησε το πλασμίδιο psma198 από έναν άλλο οργανισμό. Συνολικά στο πλασμίδιο ταυτοποιήθηκαν 17 πιθανά γονίδια, τα οποία αναπαριστώνται σχηματικά πάνω στο χάρτη του πλασμιδίου στην εικόνα 4.1, ενώ τα χαρακτηριστικά τους καταγράφονται στον πίνακα 4.1. Εικόνα 4.1 Ο χάρτης του πλασμιδίου psma198. Με μαύρο χρώμα τονίζονται οι αλληλουχίες ori και orit. Με σκούρο γκρι αναπαριστώνται τα 12 λειτουργικά γονίδια του psma198, ενώ με ανοικτό γκρι τα υπόλοιπα 5 ψευδογονίδια που περιλαμβάνει

36 Πίνακας 4.1 Σχολιασμένα χαρακτηριστικά για τα 17 πιθανά γονίδια του psma198. Locus_tag Γονίδιο Μήκος σε Καλύτερο αποτέλεσμα νουκλεοτίδια του προγράμματος Πρωτεϊνική λειτουργία WU-Blastn (locus or locus_tag / οργανισμός / ταυτότητα / e-value) SMA_p0001 rep LACR_A06 / Πρωτεΐνη έναρξης της Lactococcus lactis subsp. αντιγραφής RepB cremoris SK11 plasmid 1 / 87% / 1.8e-196 SMA_p0002 orfx 585 BN193_11490 / Πρωτεΐνη που σχετίζεται Lactococcus raffinolactis με την αντιγραφή 4877 / 91% / 2.3e-101 SMA_p0003 SMA_p0004 ydee orf ENT_30280 / Πρωτεΐνη ρύθμισης της Enterococcus sp. 7L76 / μεταγραφής της 99% / 2.3e-184 οικογένειας AraC EfmE1039_1841 / Μεμβρανική πρωτεΐνη Enterococcus faecium E1039 / 99% / 4.7e-121 SMA_p0005 yoec 591 AF / Πρωτεΐνη με ενεργότητα Lactococcus lactis subsp. ιντεγκράσης/ρεκομπινάσης lactis UC317 pci305 / 88% / 1.4e-97 SMA_p0006 orf2 459 CAC42047 / Listeria innocua Clip11262 pli / 99% / 3.7e Πιθανό ψευδογονίδιο

37 SMA_p0007 orf3 438 LACR_D31 / Πρωτεΐνη ανθεκτικότητας Lactococcus lactis subsp. στο stress cremoris SK11 plasmid 4 / 99% / 4.9e-90 SMA_p0008 mnth HMPREF0848_00725 / Πρωτεΐνη μεταφοράς του Streptococcus sp. C150 / μαγγανίου 99% / 0.0 SMA_p0009 orf4 480 llmg_pseudo_13 / Πιθανό ψευδογονίδιο Lactococcus lactis subsp. cremoris MG1363 pseudogene / 97% / 3.3e-214 SMA_p0010 orf5 195 llmg_pseudo_13 / Πιθανό ψευδογονίδιο Lactococcus lactis subsp. cremoris MG1363 pseudogene / 97% / 3.3e-214 SMA_p0011 orf6 276 llmg_pseudo_13 / Πιθανό ψευδογονίδιο Lactococcus lactis subsp. cremoris MG1363 pseudogene / 97% / 3.3e-214 SMA_p0012 yoec 465 GMD1E_00300 / Πρωτεΐνη με ενεργότητα Enterococcus sp. ιντεγκράσης/ρεκομπινάσης GMD1E / 98% / 2.2e-93 SMA_p0013 orf7 132 pil7_28 / Lactococcus lactis subsp. lactis IL594 plasmid pil7 / 84% / 1.3e Πιθανό ψευδογονίδιο

38 SMA_p0014 mobc 366 HMPREF9519_01999 / Πρωτεΐνη μεταφοράς του Enterococcus faecalis πλασμιδίου TX1346 / 89% / 5.9e-61 SMA_p0015 rlx CI5MOBPRO / Πρωτεΐνη μεταφοράς του Lactococcus lactis subsp. πλασμιδίου cremoris UC503 pci528 / 99% / 3.4e-268 SMA_p0016 orf8 627 ENT_30400 / Συντηρημένη υποθετική Enterococcus sp. 7L76 / πρωτεΐνη 96% / 6.3e-124 SMA_p0017 orf9 603 BN193_11500 / Πρωτεΐνη της οικογένειας Lactococcus raffinolactis Fic 4877 / 99% / 3.5e-125 Το πρώτο γονίδιο είναι υπεύθυνο για την κωδικοποίηση της πρωτεΐνης έναρξης της αντιγραφής του πλασμιδίου Rep. Το γονίδιο rep εμφανίζει 87 % ταυτότητα σε επίπεδο DNA (e-value 1.8e-196) με το αντίστοιχο γονίδιο του πλασμιδίου 1 του Lactococcus lactis subsp. cremoris SK11 [60]. Ανάμεσα στα καλύτερα αποτελέσματα που έβγαλε το πρόγραμμα WU-BLASTp για την πρωτεΐνη Rep του πλασμιδίου psma198 ήταν και οι πρωτεΐνες RepB των πλασμιδίων pci305 (78% ταυτότητα, e-value 8.3e-162) και pwvo2 (75 % ταυτότητα, e-value 2.9e-152).Τα πλασμίδια αυτά είναι τα πρότυπα πλασμίδια της οικογένειας ρεπλικονίων pci305/pwvo2, η οποία περιλαμβάνει ένα περιορισμένο εύρος ξενιστών, ενώ αποτελείται κατά κύριο λόγο από πλασμίδια λακτόκοκκων που αντιγράφονται με το μηχανισμό θήτα [34, 35]. Η πολλαπλή στοίχιση των καλύτερων αποτελεσμάτων του προγράμματος WU-BLASTp για την πρωτεΐνη Rep του πλασμιδίου που μελετάμε, συμπεριλαμβανομένων και των RepB πρωτεϊνών των πλασμιδίων pci305 και pwvo2, έδειξε έναν υψηλό βαθμό συντήρησης που μοιράζονται αυτές οι πρωτεΐνες (εικόνα 4.2). Η ανάλυση της πρωτεΐνης Rep με το εργαλείο InterProScan έδειξε πως περιλαμβάνει 4 αυτοτελή δομικά στοιχεία που είναι καταγεγραμμένα στην Pfam και

39 είναι τα εξής: 1) Αυτοτελής δομική περιοχή που αντιστοιχεί στην πρωτεΐνη έναρξης της αντιγραφής Rep (Rep_3, PF01051), 2) Αυτοτελής δομική περιοχή που περιλαμβάνει το καρβοξυτελικό άκρο της πρωτεΐνης RepB του L. lactis (L_lactis_RepB_C, PF06430), 3) Δύο διαδοχικά αυτοτελή δομικά μοτίβα έλικαςστροφής-έλικας που έχουν την ιδιότητα αλληλεπίδρασης με το μόριο του DNA (Wing_hlx_DNA_bd, GEDSA: ). Η πρώτη δομική περιοχή εντοπίζεται στις πρωτεΐνες έναρξης της αντιγραφής Rep που συμμετέχουν στη διαδικασία όταν αυτή πραγματοποιείται μέσω του μηχανισμού θήτα [28], ενώ ο συνδυασμός της Rep_3 με τη δεύτερη δομική περιοχή L_lactis_RepB_C αποτελεί χαρακτηριστικό των πρωτεϊνών RepB της οικογένειας των ρεπλικονίων pci305/pwvo2. Παρόλο που ένας αριθμός καταλοίπων λευκίνης ταυτοποιήθηκαν στο αμινοτελικό άκρο των πρωτεϊνών που μελετάμε, οι δομικές προβλέψεις που πραγματοποιήσαμε έδειξαν ότι δεν είναι δυνατόν να σχηματιστεί ένα φερμουάρ λευκίνης, όπως αυτό έχει περιγραφεί στην πρωτεΐνη RepA του πλασμιδιακού ρεπλικονίου pps10 του βακτηρίου Pseudomonas syringae [61], καθώς και στην πρωτεΐνη RepB του πλασμιδίου pcd4 του L. lactis [62]. Εντούτοις, η ιδιότητα αλληλεπίδρασης των πρωτεϊνών RepB που μας απασχολούν με το μόριο του DNA μπορεί να εξασφαλιστεί από την παρουσία των μοτίβων έλικας-στροφής-έλικας, τα οποία εντοπίζονται στο μεγαλύτερό τους ποσοστό μέσα στη δομική περιοχή που αντιστοιχεί στην περιοχή Rep_3 της πρωτεΐνης Rep

40 Εικόνα 4.2 Πολλαπλή στοίχιση των πρωτεϊνών RepB που εμφανίζουν τη μεγαλύτερη ταυτότητα με την αντίστοιχη πρωτεΐνη του psma198, συμπεριλαμβανομένων και αυτών των πλασμιδίων pci305 και pwvo2. Τα συνεχόμενα βέλη με τις διπλές άκρες αναπαριστούν τις 2 περιοχές όπου εμφανίζονται τα δομικά μοτίβα έλικαςστροφής-έλικας. Το διακεκομμένο βέλος με τις παύλες και τις διπλές άκρες περιλαμβάνει την περιοχή εκείνη που αντιστοιχεί στην πρωτεΐνη έναρξης της αντιγραφής Rep. Το διακεκομμένο βέλος με τις τελείες και τις διπλές άκρες περιλαμβάνει το καρβοξυτελικό άκρο της πρωτεΐνης RepB του Lactococcus lactis. Η πολλαπλή στοίχιση πραγματοποιήθηκε με το ClustalW, ενώ η εύρεση των αυτοτελών δομικών στοιχείων μέσα στις πρωτεΐνες επετεύχθη με τη βοήθεια του εργαλείου InterProScan. Το γονίδιο orfx, το οποίο εντοπίζεται αμέσως μετά από το γονίδιο rep, είναι υπεύθυνο για την παραγωγή μίας πρωτεΐνης η οποία έχει προταθεί πως συμμετέχει στον έλεγχο του αριθμού των πλασμιδιακών αντιγράφων. Σε μερικά πλασμίδια το

41 συγκεκριμένο γονίδιο απουσιάζει, δείχνοντας ότι ίσως δεν πρέπει να θεωρείται ως ένα απαραίτητο στοιχείο στη διαδικασία της αντιγραφής των πλασμιδίων που το περιέχουν [63]. Άλλες ενδιαφέρουσες πρωτεΐνες που κωδικοποιούνται από τα γονίδια του psma198 είναι ένας ρυθμιστικός παράγοντας της μεταγραφής (YdeE) της οικογένειας AraC που είναι ευρέως διαδεδομένη στα βακτήρια, μία πρωτεΐνη ανθεκτικότητας στο στρες (Orf3) της οικογένειας Usp (Universal stress protein family) και μία πρωτεΐνη μεταφοράς του μαγγανίου (MntH). Το τέταρτο κατά σειρά γονίδιο (orf1) του πλασμιδίου psma198 κωδικοποιεί μία μεμβρανική πρωτεΐνη άγνωστης λειτουργίας, ενώ το πέμπτο και το δωδέκατο μία πρωτεΐνη (YoeC) με ενεργότητα ιντεγκράσης/ρεκομπινάσης. Σύμφωνα με τα ευρήματα μας, μπορούμε να πούμε πως το πλασμίδιο psma198 έχει υποβληθεί σε διαδικασίες αποσύνθεσης γονιδίων, αφού πέντε από τα 17 γονίδια που περιέχει χαρακτηρίστηκαν ως πιθανά ψευδογονίδια. Τα τέσσερα πρώτα κατά σειρά ψευδογονίδια (orf2, orf4, orf5, orf6) αποτελούν τμήματα τρανσποζασών. Το πέμπτο και τελευταίο ψευδογονίδιο (orf7) αξίζει να σημειωθεί πως κωδικοποιεί μία αμινοξική ακολουθία που έδειξε 63 % ταυτότητα (e-value 4.4e05 ) με ένα τμήμα της ακολουθίας του κυτοχρώματος Β που κωδικοποιείται από ένα γονίδιο του L. lactis. Και τα 5 ψευδογονίδια που σύμφωνα με την ανάλυσή μας περιλαμβάνει το πλασμίδιο, εντοπίζονται σε μία πιθανή λειτουργική μορφή σε άλλα πλασμίδια, τα οποία είναι συγγενικά με το psma198 (τα ψευδογονίδια orf4, orf5 και orf6 στο πλασμίδιο pgdh442, το ψευδογονίδιο orf2 στο πλασμίδιο pil5 και το ψευδογονίδιο orf7 στο πλασμίδιο pci605). Και τα τρία πλασμίδια αυτά, αξίζει να σημειωθεί, πως έχουν απομονωθεί από διάφορα στελέχη του L. lactis. Τα τέσσερα τελευταία γονίδια του πλασμιδίου είναι πολύ πιθανό πως σχετίζονται με διαδικασίες όπως η μεταφορά του από ένα κύτταρο-ξενιστή σε ένα άλλο, παρουσία πάντα ενός συζευκτικού πλασμιδίου. Εκτός από τα γονίδια mobc και rlx που κωδικοποιούν δύο πρωτεΐνες μεταφοράς του, δύο επιπλέον γονίδια, το orf8 και το orf9, είναι υπεύθυνα για την παραγωγή μίας συντηρημένης υποθετικής πρωτεΐνης και μίας πρωτεΐνης της οικογένειας Fic. Το γονίδιο orf9, που κωδικοποιεί και την πρωτεΐνη της οικογένειας Fic, εντοπίζεται συχνά στην ίδια περιοχή με τα γονίδια mobc και rlx, ενώ φαίνεται πως συμμετέχει και στις διαδικασίες ρύθμισης του κυτταρικού κύκλου [64]

42 Επιπλέον, μελετώντας την περιοχή του DNA που βρίσκεται αναρροϊκά του γονιδίου rep, εντοπίσαμε την αλληλουχία που αποτελεί το ori του πλασμιδίου psma198. Η πολλαπλή στοίχιση που παρουσιάζεται στην εικόνα 4.3 περιλαμβάνει τα καλύτερα αποτελέσματα του προγράμματος WU-BLAST για το σημείο έναρξης της αντιγραφής του πλασμιδίου psma198 και τις αντίστοιχες αλληλουχίες στα πλασμίδια pci305 και pwvo2. Το ori του πλασμιδίου που μελετάμε αποτελείται από 242 νουκλεοτιδία όμοια με αυτό των ρεπλικονίων της οικογένειας pci305/pwvo2. Στο ori του psma198 περιλαμβάνεται μία περιοχή πλούσια σε αδενίνη και θυμίνη, τρεισήμισι επαναλήψεις μίας αλληλουχίας 22 ζευγών βάσεων και δύο ανάστροφες επαναλήψεις [65]. Το πρότυπο, με βάση τα παραπάνω χαρακτηριστικά, που ακολουθεί η αλληλουχία του σημείου έναρξης της αντιγραφής του πλασμιδίου psma198, σε συνδυασμό με την υψηλή ταυτότητα που εμφανίζει η πρωτεΐνη έναρξης της αντιγραφής του Rep με αντίστοιχες πρωτεΐνες σε πλασμίδια των λακτόκοκκων, μας δείχνουν πως το πλασμίδιο που αναλύουμε είναι το πρώτο πλασμίδιο των στρεπτόκοκκων που ανήκει στην οικογένεια ρεπλικονίων pci305/pwvo2 [34, 35]. Επιπλέον, το πλασμίδιο psma198 βρέθηκε σε χαμηλό αριθμό αντιγράφων ανά βακτηριακό κύτταρο (2-3 αντίγραφα), όπως άλλωστε συμβαίνει και με τα πλασμίδια της οικογένειας ρεπλικονίων pci305/pwvo2 [66]

43 Εικόνα 4.3 Πολλαπλή στοίχιση της αλληλουχίας του σημείου έναρξης της αντιγραφής (ori) του πλασμιδίου psma198 με τις αντίστοιχες αλληλουχίες σε συγγενικά του πλασμίδια, συμπεριλαμβανομένων και των ori των πλασμιδίων pci305 και pwv02. Οι περιοχές που οριοθετούνται με βέλη είναι οι εξής: 1) Μια περιοχή πλούσια σε αδενίνη και θυμίνη (ΑΤ-rich region), 2) Τρεισήμισι επαναλήψεις μίας αλληλουχίας 22 ζευγών βάσεων (22bp-DR) και 3) Δύο ανάστροφες επαναλήψεις (IRa και IRb). Οι περιοχές που φαίνονται υπογραμμισμένες είναι οι εξής: 1) Οι υποκινητές στην θέση «-35» και στην θέση «-10», 2) Η αλληλουχία σύνδεσης με το ριβόσωμα (Ribosome binding site, RBS) και 3) Το κωδικόνιο έναρξης της μετάφρασης της πρωτεΐνης Rep. Η πολλαπλή στοίχιση πραγματοποιήθηκε με το εργαλείο ClustalW. Παρόλο που το πλασμίδιο psma198 δεν είναι από μόνο του ικανό να μεταφερθεί από ένα κύτταρο-ξενιστή σε ένα άλλο, βρέθηκε πως στο DNA του περιλαμβάνει μία αλληλουχία η οποία, υπό την παρουσία ενός συζευκτικού πλασμιδίου, μπορεί να επιτρέψει τη μεταφορά του σε ένα νέο κύτταρο-δέκτη. Αυτή η αλληλουχία, η οποία εντοπίζεται αναρροϊκά του γονιδίου mobc, ονομάζεται σημείο έναρξης της μεταφοράς του πλασμιδίου (orit) και περιλαμβάνει μια περιοχή 6 διαδοχικών ανάστροφων επαναλήψεων καθώς και 2 επαναλήψεις μιας αλληλουχίας 14 νουκλεοτιδίων. Οκτώ νουκλεοτίδια μετά από το τέλος της ανάστροφης

44 επανάληψης IR3 εντοπίσαμε και μία θέση εγκοπής, βασιζόμενοι σε προηγούμενες μελέτες των πλασμιδίων ps7a και ps7b του βακτηρίου Lactococcus lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis S50 που είναι απομονωμένος από το βούτυρο [65]. Όπως φαίνεται και στην εικόνα 4.4, μετά από την πολλαπλή στοίχιση που πραγματοποιήσαμε, για άλλη μία φορά αλληλουχίες σαν και αυτές του σημείου έναρξης της αντιγραφής εμφανίζουν υψηλή συντήρηση ανάμεσα στο πλασμίδιο psma198 και σε πολλά πλασμίδια των λακτόκοκκων, συμπεριλαμβανομένου και αυτού του pci305 [65, 67]. Εικόνα 4.4 Πολλαπλή στοίχιση μεταξύ του σημείου έναρξης της μεταφοράς (orit) του πλασμιδίου psma198 και των αντίστοιχων αλληλουχιών σε συγγενικά του πλασμίδια, συμπεριλαμβανομένου και του πλασμιδίου pci305. Τα διακεκομμένα βέλη αντιστοιχούν στις 6 ανάστροφες επαναλήψεις και τα συνεχόμενα βέλη στις 2 επαναλήψεις μίας αλληλουχίας 14 νουκλεοτιδίων. πραγματοποιήθηκε με το εργαλείο ClustalW Η πολλαπλή στοίχιση

45 4.2 Ο Streptococcus macedonicus απέκτησε το πλασμίδιο psma198 από τον Lactococcus lactis και η μεταφορά αυτή φαίνεται να έγινε στο περιβάλλον του γάλακτος Η συσχέτιση του πλασμιδίου psma198 με άλλα πλασμίδια διερευνήθηκε πιο εντατικά. Με βάση τις αναζητήσεις που πραγματοποιήσαμε στο πρόγραμμα WUBLAST, είδαμε πως τα πλασμίδια που είναι πιο κοντά σε επίπεδο DNA με το psma198 προέρχονται από λακτόκοκκους. Μελετώντας το ori του, είδαμε πως παρουσίαζε μέγιστη ταυτότητα στην περιοχή αυτή με το πλασμίδιο psk11b (92 % ταυτότητα, e-value 7.5e-37). Αντίστοιχα για το orit, ταυτοποιήσαμε το πλασμίδίο pvf22 (94 % ταυτότητα, e-value 4.3e-84). Το μεν πλασμίδιο psk11b έχει απομονωθεί από τον L. lactis subsp. cremoris SK11, που αποτελεί μία ευρέως διαδεδομένη εναρκτήρια καλλιέργεια για την παρασκευή τυριού [68], το δε πλασμίδιο pvf22 έχει απομονωθεί από τον Lactococcus lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis DPC3901, που αποτελεί ένα στέλεχος λακτόκοκκων που εντοπίστηκε στο ακατέργαστο τυρόγαλο [69]. Παρόλα αυτά, η ταυτότητα που εμφάνιζε το psma198 με καθένα από τα δύο παραπάνω πλασμίδια, ήταν περιορισμένη. Με το πλασμίδιο psk11b η ομοιότητα εντοπίστηκε μόνο στην περιοχή του σκελετού της αντιγραφής των πλασμιδίων (ori-rep-orfx), ενώ με το πλασμίδιο pvf22 μόνο στην περιοχή του σκελετού της κινητοποίησης των πλασμιδίων (orit-mobc-rlx-orf8-orf9) (εικόνα 4.5). Αυτό το γεγονός μας οδήγησε στην αναζήτηση του πλασμιδίου εκείνου που θα εμφάνιζε τη μεγαλύτερη ταυτότητα με ολόκληρη την αλληλουχία του psma198. Το πλασμίδιο αυτό ήταν το pil5, το οποίο έχει απομονωθεί και αυτό από μία εναρκτήρια καλλιέργεια τυριού, τον Lactococcus lactis subsp. lactis IL594 [67]. Το pil5 εμφανίζει ταυτότητα σε ποσοστό πάνω από 90 % (e-value 0.0) με περίπου το 62 % της αλληλουχίας του psma198. Σε αυτή την αλληλουχία εκτός των άλλων, περιλαμβάνεται και ο σκελετός κινητοποίησης του πλασμιδίου που αναλύουμε (εικόνα 4.5)

46 Εικόνα 4.5 Ολική στοίχιση της αλληλουχίας του πλασμιδίου psma198 έναντι των πλασμιδίων psk11b (Α), pvf22 (Β) και pil5 (C) σε μία κυκλική απεικόνιση. Τα επίπεδα ομοιότητας των τοπικών στοιχίσεων και στις τρεις περιπτώσεις, ανάλογα με το χρώμα με το οποίο αναπαριστώνται, χωρίζονται σε 4 ομάδες: 1) Κόκκινες γραμμές: Επίπεδα στοίχισης: 75 % έως %, 2) Πορτοκαλί γραμμές: Επίπεδα στοίχισης: 50 % έως 75 %, 3) Πράσινες γραμμές: Επίπεδα στοίχισης: 25 % έως 50 % και 4) Μπλε γραμμές: Επίπεδα στοίχισης: Μικρότερα από 25 %. Η θέση είτε της αλληλουχίας έναρξης της αντιγραφής (ori) του πλασμιδίου psma198, είτε της αλληλουχίας έναρξης της μεταφοράς του (orit) είναι σημειωμένη πάνω σε καθένα από τα τρία γραφήματα, έτσι ώστε να είναι σαφής η κατεύθυνση της αλληλουχίας του DNA του psma198 σε κάθε περίπτωση. Η εικόνα υλοποιήθηκε με τη βοήθεια του εργαλείου Circoletto. Τόσο οι παραπάνω αναζητήσεις για την εύρεση ταυτότητας των διαφόρων χαρακτηριστικών του psma198 σε άλλα πλασμίδια, όσο και όλες οι υπόλοιπες που πραγματοποιήσαμε (σε πρωτεϊνικό και νουκλεοτιδικό επίπεδο), τις περισσότερες φορές οδήγησαν σε στελέχη του L. lactis που έχουν απομονωθεί από το γάλα ή τα γαλακτοκομικά προϊόντα γενικότερα. Για παράδειγμα, η αναζήτηση ταυτότητας για το σκελετό αντιγραφής του psma198, στα δέκα πρώτα καλύτερα αποτελέσματα περιελάμβανε 9 περιπτώσεις γαλακτοκομικών στελεχών. Για αυτό το λόγο, θεωρούμε πολύ πιθανό ότι ο αρχικός δότης του πλασμιδίου psma198 προς τον S. macedonicus ήταν πράγματι ένα στέλεχος του L. lactis που είχε ταυτόχρονα και γαλακτοκομική προέλευση. Για να παρέχουμε πιο πολλές αποδείξεις για αυτήν την υπόθεση, πραγματοποιήσαμε και φυλογενετικές αναλύσεις για την πρωτεΐνη έναρξης της

47 αντιγραφής Rep του psma198. Η ακολουθία της πρωτεΐνης αυτής, στο φυλογενετικό δέντρο 144 παρόμοιων πρωτεϊνών (εικόνα 4.6), εντοπίζεται σε μια ομάδα 19 πρωτεϊνών εκ των οποίων οι 17 βρίσκονται σε γαλακτοκομικά στελέχη του L. lactis. Το συνολικό φυλογενετικό δέντρο χωρίζεται σε δύο κυρίους κλάδους. Ο πρώτος από αυτούς περιλαμβάνει 134 πρωτεΐνες. Οι από αυτές ανήκουν στους λακτόκοκκους, ενώ οι 91 συγκεκριμένα στον L. lactis. Η κατανομή του πρώτου κλάδου μας οδηγεί στο συμπέρασμα πως οι πρωτεΐνες Rep άλλων βακτηρίων πέρα από τους λακτόκοκκους, πρέπει να έχουν μεταφερθεί σε αυτά από τον L. lactis. Στελέχη βακτηρίων άλλων από τους λακτόκοκκους, των οποίων οι πρωτεΐνες Rep βρίσκονται διάσπαρτες στον πρώτο κλάδο του φυλογενετικού δέντρου που αναλύουμε, περιλαμβάνουν μεταξύ άλλων τα Listeria monocytogenes DRDC8, Listeria inocua serovar 6a CLIP 11262, Pediococcus pentosaceus ATCC43200, Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis W9, Lactobacillus salivarius SMXD51, Tetragenococcus halophilus H, Weissella koreensis KACC 15510, καθώς και διάφορα είδη του γένους Leuconostoc. Ο δεύτερος κλάδος αποτελείται από 11 πρωτεΐνες Rep των εντερόκοκκων και είναι εμφανώς διαχωρισμένος από τον πρώτο κλάδο. Εάν αθροίσουμε τις 11 αυτές πρωτεΐνες με τις 34 του πρώτου κλάδου που δεν εντοπίζονται στους λακτόκοκκους, καταλαβαίνουμε πως από τις 145 πρωτεΐνες που περιλαμβάνει το φυλογενετικό δέντρο που κατασκευάσαμε, μόνο οι 45 βρίσκονται σε βακτήρια άλλα από τους λακτόκοκκους. Αυτό το ποσοστό δεν μπορεί να θεωρηθεί σημαντικό, και είναι σε συμφωνία με το γεγονός ότι η οικογένεια ρεπλικονίων pci305/pwvo2 περιλαμβάνει πλασμίδια με ένα περιορισμένο εύρος ξενιστών που εντοπίζονται κατά κύριο λόγο σε στελέχη των λακτόκοκκων [35, 36]

48 Εικόνα 4.6 Φυλογενετικό δέντρο μέγιστης πιθανότητας της πρωτεΐνης έναρξης της αντιγραφής (Rep) του πλασμιδίου psma198 και 144 ακόμα πρωτεϊνών με παρόμοια λειτουργία. Για κάθε κλάδο του δέντρου καταγράφεται η πιθανότητα εμπιστοσύνης του εκφρασμένη σε ποσοστό %. Το βέλος δείχνει τη θέση που έχει πάρει η ακολουθία της πρωτεΐνης Rep του πλασμιδίου psma198 μέσα στο φυλογενετικό δέντρο. Το άγκιστρο περιλαμβάνει όλες τις πρωτεΐνες οι οποίες βρίσκονται στην ίδια ομάδα του φυλογενετικού δέντρου μαζί με την πρωτεΐνη Rep του πλασμιδίου που αναλύουμε. Η περιοχή αυτή εμφανίζεται και σε μεγέθυνση στα δεξιά του φυλογενετικού δέντρου, με τη θέση της πρωτεΐνης Rep του πλασμιδίου psma198 επίσης να προσδιορίζεται με ένα βέλος. Το φυλογενετικό δέντρο κατασκευάστηκε στη διαδικτυακή πλατφόρμα phylogeny.fr

49 4.3 Η απόκτηση του πλασμιδίου psma198 από τον Streptococcus macedonicus φαίνεται να μην αποτελεί πρόσφατο γεγονός Όπως αναφέρθηκε στην ενότητα 4.1, το χρωμόσωμα του S. macedonicus ACA-DC 198 [18] και το πλασμίδιο psma198 περιέχουν ένα υψηλό ποσοστό ψευδογονιδίων, προτείνοντας ότι τα δύο αυτά μόρια έχουν κοινή εξελικτική διαδρομή στα πλαίσια μίας διαδικασίας αποσύνθεσης γονιδίων. Η ιδέα μιας κοινής διαδρομής ανάμεσα στον S. macedonicus ACA-DC 198 και το πλασμίδιο psma198, μας οδήγησε στην εξέταση και πιθανών γενετικών ανταλλαγών που μπορεί να έχουν συμβεί μεταξύ του βακτηριακού χρωμοσώματος και του πλασμιδιακού DNA που μελετάμε. Άλλωστε, η υπόθεση της μεταφοράς γενετικού υλικού από το DNA του psma198 στο χρωμόσωμα του S. macedonicus ACA-DC 198 μπορεί να υποστηριχτεί και από άλλα στοιχεία. Σύμφωνα με αυτά, το πλασμίδιο που αναλύουμε, επειδή έχει μικρότερο μέγεθος από μερικά συγγενικά του πλασμίδια, όπως για παράδειγμα το pvf22 (22 kb) ή το pil5 (24 kb), μπορεί να θεωρηθεί πως έχει απωλέσει κάποια τμήματα του γενετικού του υλικού, μερικά από τα οποία ίσως να έχουν μεταφερθεί στο χρωμόσωμα. Για να ταυτοποιήσουμε τέτοιες γενετικές περιοχές, αρχικά πραγματοποιήσαμε αναζητήσεις για την τυχόν εύρεση γονιδίων του χρωμοσώματος του S. macedonicus ACA-DC 198 που παρουσίαζαν υψηλή ταυτότητα με γονίδια είτε του psma198, είτε άλλων συγγενικών του πλασμιδίων (εικόνα 4.7). Τα αποτελέσματα αυτών των αναζητήσεων έδωσαν έναν αριθμό χρωμοσωμικών γονιδίων που κωδικοποιούν τρανσποζάσες (π.χ. SMA_0311, SMA_0486 και SMA_2043) και εμφανίζουν υψηλή ταυτότητα με το ψευδογονίδιο orf2 (στην λειτουργική του μορφή επίσης κωδικοποιεί μία τρανσποζάση) του psma198. Γονίδια που κωδικοποιούν παρόμοιες τρανσποζάσες είναι παρόντα και σε άλλα συγγενικά πλασμίδια του psma198, όπως το pvf22 ή το pil5. Επιπλέον, βρήκαμε και μία περιοχή βάσεων στο χρωμόσωμα του Streptococcus macedonicus ACA-DC 198, που περιελάμβανε τα γονίδια SMA_0309 και SMA_0310 και έδειξε ταυτότητα σε ποσοστό 96 % με τα γονίδια cadc (cadmium resistance regulator, ρυθμιστής ανθεκτικότητας στο κάδμιο) και cada (cadmium efflux ATPase, πρωτεΐνη εκροής του καδμίου εξαρτώμενη από το ATP) επίσης του pil5. Είναι αξιοσημείωτο, πως για τα ίδια ακριβώς γονίδια έχει προταθεί σε προηγούμενες δημοσιεύσεις, πως έχουν μεταφερθεί οριζόντια από τον L. lactis στον S. thermophilus

50 [70]. Ένα ακόμη γονίδιο του χρωμοσώματος του S. macedonicus ACA-DC 198, το SMA_2044, έδειξε 93 % ταυτότητα με το γονίδιο cora1 του pvf22, το οποίο κωδικοποιεί μία πρωτεΐνη μεταφοράς του μαγνησίου και του κοβαλτίου [69]. Στην συνέχεια εξετάσαμε το γονιδίωμα του S. macedonicus ACA-DC 198, για την ύπαρξη γονιδίων που πιθανόν να έχουν προέλευση από πλασμίδια της οικογένειας ρεπλικονίων pci305/pwvo2. Εντοπίστηκε μια επιπρόσθετη χρωμοσωμική περιοχή, όπου 5 από τα 6 γονίδια (SMA_0488 έως SMA_0493 που εμπλέκονται στη βιοσύνθεση νουκλεοτιδίων και στην ρύθμιση αυτής) εμφανίζουν 93 % ταυτότητα με τα αντίστοιχα γονίδια στο πλασμίδιο pgdh442, το οποίο εντοπίζεται σε ένα στέλεχος του L. lactis με φυτική προέλευση [71]. Είναι άκρως εντυπωσιακό πως και οι τρεις χρωμοσωμικές περιοχές του S. macedonicus ACA-DC 198 (SMA_0309 και SMA_0310, SMA_2044, SMA_0488 έως SMA_0493), οι οποίες εμφάνισαν μεγάλη ταυτότητα με αντίστοιχες περιοχές στα πλασμίδια pil5, pvf22 και pgdh442, συνοδεύονταν πάντα, σε τουλάχιστον μία πλευρά τους, από μία τρανσποζάση που είχε επίσης υψηλή ταυτότητα με το ψευδογονίδιο orf2 του psma198, όπως αναφέρθηκε και παραπάνω. Αυτές οι τρανσποζάσες ήταν αντίστοιχες με τις εξής χρωμοσωμικές περιοχές του S. macedonicus ACA-DC 198: 1) SMA_0311, 2) SMA_2043 και 3) SMA_0486. Όλα αυτά τα στοιχεία που βρήκαμε (εικόνα 4.7), ενισχύουν την ιδέα της κοινής διαδρομής ανάμεσα στο πλασμίδιο psma198 και στο χρωμόσωμα του S. macedonicus ACA-DC 198. Η συνύπαρξη τους φαίνεται να είναι μακρά, ενώ η μεταφορά γενετικού υλικού από το πλασμίδιο στο χρωμόσωμα είναι πολύ πιθανή

51 Εικόνα 4.7 Στοίχιση χρωμοσωμικών περιοχών του Streptococcus macedonicus ACADC 198 με τμήματα DNA των πλασμιδίων pil5 (A), pvf22 (B) και pgdh442 (C). Και στις τρεις περιπτώσεις, η τρανσποζάση (υπογραμμισμένο γονίδιο) η οποία συνορεύει με τις παραπάνω χρωμοσωμικές περιοχές εμφανίζει υψηλή ταυτότητα με το ψευδογονίδιο orf2 του πλασμιδίου psma198. Όσο πιο σκούρο είναι το χρώμα με το οποίο αναπαριστάται μία στοίχιση, τόσο πιο μεγάλο είναι και το σκορ που τη χαρακτηρίζει. Η συγκεκριμένη εικόνα κατασκευάστηκε με τη βοήθεια του λογισμικού Kodon (Applied Maths N.V., Sint-Martens-Latem, Belgium)

52 Μελετώντας την κατανομή του πλασμιδίου psma198 σε 10 τυχαία επιλεγμένα στελέχη του S. macedonicus της συλλογής ACA-DC και σε δύο στελέχη της συλλογής Nestlé που έχουν απομονωθεί στην Ελβετία, με βάση την ηλεκτροφόρηση που πραγματοποιήσαμε, παρατηρήσαμε ότι ήταν πάντα παρόν (εικόνα 4.8). Εικόνα 4.8 Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης τμήματος του πλασμιδιακού DNA 12 στελεχών του Streptococcus macedonicus. Τα 10 πρώτα στελέχη ανήκουν στη συλλογή ACA-DC και έχουν απομονωθεί από παραδοσιακά ελληνικά γαλακτοκομικά προϊόντα, ενώ τα 2 τελευταία ανήκουν στη συλλογή Nestlé και έχουν απομονωθεί στην Ελβετία. Το πλασμίδιο psma198 είναι παρόν και στα 12 αυτά στελέχη. Τα 10 παραπάνω στελέχη της συλλογής ACA-DC, στα οποία εντοπίσαμε το πλασμίδιο psma198, έχουν όλα απομονωθεί από παραδοσιακά ελληνικά γαλακτοκομικά προϊόντα, ενώ αξίζει να σημειωθεί πως σύμφωνα με μία ανάλυση ηλεκτροφόρησης παλλόμενου πεδίου (Pulsed Field Gel Electrophoresis, PFGE) ανήκουν σε 5 διαφορετικούς βιότυπους (Εικόνα 4.9, μη δημοσιευμένα δεδομένα). Τα στοιχεία αυτά δείχνουν για μια ακόμα φορά πως η απόκτηση του psma198 από τον S. macedonicus δεν μπορεί να χαρακτηριστεί ως ένα πρόσφατο γεγονός

53 Εικόνα 4.9 Τα αποτελέσματα της ηλεκτροφόρησης παλλόμενου πεδίου (PFGE) για διάφορα στελέχη της συλλογής ACA-DC του Streptococcus macedonicus. Με κόκκινο χρώμα επισημαίνονται τα 10 στελέχη για τα οποία στην εικόνα 4.8, με βάση την ηλεκτροφόρηση που πραγματοποιήσαμε, βρήκαμε πως περιλαμβάνουν το πλασμίδιο psma198. Η ανάλυση ηλεκτροφόρησης παλλόμενου πεδίου μας δείχνει πως αυτά τα 10 στελέχη κατανέμονται σε 5 διαφορετικούς βιότυπους. συγκεκριμένη ανάλυση αποτελεί ένα τμήμα μη δημοσιευμένων δεδομένων Η

54 5. Συμπεράσματα Τα ευρήματά μας, μας παρέχουν σοβαρές ενδείξεις πως το πλασμίδιο psma198 είναι ένα νέο μέλος της οικογένειας ρεπλικονίων pci305/pwvo2, η οποία αποτελείται από πλασμίδια που αντιγράφονται με το μηχανισμό θήτα και εντοπίζονται σε ένα περιορισμένο εύρος κυττάρων-ξενιστών που περιλαμβάνουν κατά κύριο λόγο τους λακτόκοκκους [35, 36]. Το psma198 αποτελεί το πρώτο πλασμίδιο των στρεπτόκοκκων που είναι μέλος της παραπάνω οικογένειας. Τα επίπεδα ταυτότητας της ακολουθίας της πρωτεΐνης έναρξης της αντιγραφής του Rep αναδεικνύουν τη στενή εξελικτική σχέση που έχει με τα πλασμίδια των λακτόκοκκων, υποστηρίζοντας ότι ο S. macedonicus απέκτησε το συγκεκριμένο πλασμίδιο από τον L. lactis και ότι η μεταφορά αυτή πραγματοποιήθηκε στο γάλα ή στο περιβάλλον του γάλακτος γενικότερα. Αυτή η υπόθεση υποστηρίζεται και από άλλες δύο παρατηρήσεις: 1) Τα πιο συγγενικά πλασμίδια του psma198 (το psk11b, το pvf22 και το pil5) έχουν απομονωθεί από στελέχη του L. lactis που έχουν γαλακτοκομική προέλευση, 2) Η φυλογενετική ανάλυση της πρωτεΐνης έναρξης της αντιγραφής του Rep έδειξε ότι υπάρχει στενή σχέση μεταξύ αυτής και άλλων πρωτεϊνών RepB που εντοπίζονται σε γαλακτοκομικά στελέχη του L. lactis. Η απόκτηση του psma198 από τον S. macedonicus φαίνεται πως δεν αποτελεί ένα πρόσφατο γεγονός. Αυτή η πρόταση μπορεί να στηριχτεί πάνω σε τρεις διαφορετικές παρατηρήσεις: 1) Στο υψηλό ποσοστό ψευδογονιδίων που υπάρχει στο χρωμόσωμα του S. macedonicus ACA-DC 198 και στο DNA του psma198 αποτελώντας μία σοβαρή ένδειξη για τη μακρά συνύπαρξη των δύο αυτών μορίων στο πλαίσιο μίας διαδικασίας αποσύνθεσης γονιδίων, 2) Στην εμφάνιση πιθανών γενετικών περιοχών που έχουν μεταφερθεί από το psma198 στο χρωμόσωμα του S. macedonicus ACA-DC 198 και 3) Στην παρουσία του psma198 σε διάφορα στελέχη του S. macedonicus, πέρα από αυτό του ACA-DC 198. Με βάση την ανάλυση που πραγματοποιήσαμε, μπορούμε μεταξύ άλλων να συμπεράνουμε πως η παρουσία του S. macedonicus στο περιβάλλον του γάλακτος μπορεί να θεωρηθεί μακρά. Τα περισσότερα άλλωστε στελέχη του S.macedonicus έχουν απομονωθεί από γαλακτοκομικά προϊόντα, ενώ η υπάρχουσα βιβλιογραφία τονίζει πως το συγκεκριμένο περιβάλλον αποτελεί και τον πρωταρχικό οικολογικό του θώκο [15]. Αξίζει να σημειωθεί πως πέρα από το psma198, υπάρχει και ένα

55 άλλο πλασμίδιο στους στρεπτόκοκκους, αυτό του S. infantarius CJ18, που εμφανίζεται να έχει σχέση με τα πλασμίδια των λακτόκοκκων. Ο S. infantarius CJ18 και ο S. macedonicus ACA-DC 198 εμφανίζουν δύο κοινά χαρακτηριστικά: 1) Με βάση τις φυλογενετικές αναλύσεις του 16s rrna και τα δύο βακτήρια ανήκουν στο σύμπλεγμα του S. bovis/s. equinus και 2) Είναι τα μόνα μέλη του παραπάνω συμπλέγματος που έχουν απομονωθεί από γαλακτοκομικά προϊόντα [19, 20] και περιέχουν πλασμίδια που σχετίζονται με αυτά των λακτόκοκκων. Ούτε ο S. gallolyticus, ούτε ο S. pasteurianus, που έχουν απομονωθεί από διάφορα κλινικά δείγματα, περιλαμβάνουν πλασμίδια σαν τα παραπάνω. Προτείνουμε πως ο S. macedonicus ACA-DC 198 έχει προσαρμοστεί στο περιβάλλον του γάλακτος. Αν αυτή η προσαρμογή, όπως έγινε και στην περίπτωση του S. thermophilus [25], έχει σαν αποτέλεσμα την απώλεια των παθογόνων στοιχείων που χαρακτηρίζουν το γένος των στρεπτόκοκκων [72, 73], από το γονιδίωμα του S. macedonicus ACA-DC 198 αναμένεται να διευκρινιστεί πλήρως κατά την ανάλυση του γονιδιώματος του βακτηρίου αυτού [18]

56 6. Βιβλιογραφία 1. van de Guchte M, Serror P, Chervaux C, Smokvina T, Ehrlich SD, Maguin E: Stress responses in lactic acid bacteria. Antonie van Leeuwenhoek 2002, 82(14): Lucke FK: Utilization of microbes to process and preserve meat. Meat science 2000, 56(2): Caplice E, Fitzgerald GF: Food fermentations: role of microorganisms in food production and preservation. International journal of food microbiology 1999, 50(1-2): Ljungh A, Wadstrom T: Lactic acid bacteria as probiotics. Current issues in intestinal microbiology 2006, 7(2): Tsakalidou E, Papadimitriou K: Stress responses of lactic acid bacteria. New York: Springer; Orla-Jensen S: The Lactic Acid Bacteria. Die echten Milchsa\0308urebakterien. Erga\0308nzungsband. Ger: København; Klein G, Pack A, Bonaparte C, Reuter G: Taxonomy and physiology of probiotic lactic acid bacteria. International journal of food microbiology 1998, 41(2): Vandamme P, Pot B, Gillis M, de Vos P, Kersters K, Swings J: Polyphasic taxonomy, a consensus approach to bacterial systematics. Microbiological reviews 1996, 60(2): Stiles ME, Holzapfel WH: Lactic acid bacteria of foods and their current taxonomy. International journal of food microbiology 1997, 36(1):

57 10. Morrison DA, Guedon E, Renault P: Competence for natural genetic transformation in the Streptococcus bovis group streptococci S. infantarius and S. macedonicus. Journal of bacteriology 2013, 195(11): K.H. Schleifer JK, C. Dvorak, R. Kilpper-Bälz, M.D. Collins, W. Fischer: Transfer of Streptococcus lactis and Related Streptococci to the Genus Lactococcus gen. nov. Systematic and applied microbiology 1985, 6(2): Rosenbach FJ: Micro-organismen bei den Wund-Infektions - Krankheiten des Menschen. Wiesbaden, Germany: JF Bergmann Facklam R: What happened to the streptococci: overview of taxonomic and nomenclature changes. Clinical microbiology reviews 2002, 15(4): Bolotin A, Quinquis B, Renault P, Sorokin A, Ehrlich SD, Kulakauskas S, Lapidus A, Goltsman E, Mazur M, Pusch GD et al: Complete sequence and comparative genome analysis of the dairy bacterium Streptococcus thermophilus. Nature biotechnology 2004, 22(12): De Vuyst L TE: Streptococcus macedonicus, a multi-functional and promising species for dairy fermentations. International Dairy Journal 2008, 18: Schlegel L, Grimont F, Collins MD, Regnault B, Grimont PA, Bouvet A: Streptococcus infantarius sp. nov., Streptococcus infantarius subsp. infantarius subsp. nov. and Streptococcus infantarius subsp. coli subsp. nov., isolated from humans and food. International journal of systematic and evolutionary microbiology 2000, 50 Pt 4: Abdelgadir W, Nielsen DS, Hamad S, Jakobsen M: A traditional Sudanese fermented camel's milk product, Gariss, as a habitat of Streptococcus infantarius subsp. infantarius. International journal of food microbiology 2008, 127(3):

58 18. Papadimitriou K, Ferreira S, Papandreou NC, Mavrogonatou E, Supply P, Pot B, Tsakalidou E: Complete genome sequence of the dairy isolate Streptococcus macedonicus ACA-DC 198. Journal of bacteriology 2012, 194(7): Jans C, Follador R, Lacroix C, Meile L, Stevens MJ: Complete genome sequence of the African dairy isolate Streptococcus infantarius subsp. infantarius strain CJ18. Journal of bacteriology 2012, 194(8): Tsakalidou E, Zoidou E, Pot B, Wassill L, Ludwig W, Devriese LA, Kalantzopoulos G, Schleifer KH, Kersters K: Identification of streptococci from Greek Kasseri cheese and description of Streptococcus macedonicus sp. nov. International journal of systematic bacteriology 1998, 48 Pt 2: Schlegel L, Grimont F, Ageron E, Grimont PA, Bouvet A: Reappraisal of the taxonomy of the Streptococcus bovis/streptococcus equinus complex and related species: description of Streptococcus gallolyticus subsp. gallolyticus subsp. nov., S. gallolyticus subsp. macedonicus subsp. nov. and S. gallolyticus subsp. pasteurianus subsp. nov. International journal of systematic and evolutionary microbiology 2003, 53(Pt 3): Whiley RA KM: International Committee on Systematics of Prokaryotes Subcommittee on the taxonomy of staphylococci and streptococci. Int J Syst Evol Microbiol 2003, 53: Hinse D, Vollmer T, Ruckert C, Blom J, Kalinowski J, Knabbe C, Dreier J: Complete genome and comparative analysis of Streptococcus gallolyticus subsp. gallolyticus, an emerging pathogen of infective endocarditis. BMC genomics 2011, 12: Makarova KS, Koonin EV: Evolutionary genomics of lactic acid bacteria. Journal of bacteriology 2007, 189(4):

59 25. Hols P, Hancy F, Fontaine L, Grossiord B, Prozzi D, Leblond-Bourget N, Decaris B, Bolotin A, Delorme C, Dusko Ehrlich S et al: New insights in the molecular biology and physiology of Streptococcus thermophilus revealed by comparative genomics. FEMS microbiology reviews 2005, 29(3): Gupta A, Madani R, Mukhtar H: Streptococcus bovis endocarditis, a silent sign for colonic tumour. Colorectal disease : the official journal of the Association of Coloproctology of Great Britain and Ireland 2010, 12(3): Lederberg J: Cell genetics and hereditary symbiosis. Physiol Rev 1952, 32: del Solar G, Giraldo R, Ruiz-Echevarria MJ, Espinosa M, Diaz-Orejas R: Replication and control of circular bacterial plasmids. Microbiology and molecular biology reviews : MMBR 1998, 62(2): Molbak L, Tett A, Ussery DW, Wall K, Turner S, Bailey M, Field D: The plasmid genome database. Microbiology 2003, 149(Pt 11): Hinnebusch J, Tilly K: Linear plasmids and chromosomes in bacteria. Molecular microbiology 1993, 10(5): Actis LA, Tolmasky ME, Crosa JH: Bacterial plasmids: replication of extrachromosomal genetic elements encoding resistance to antimicrobial compounds. Frontiers in bioscience : a journal and virtual library 1999, 4:D Kornberg A, T. Baker: DNA replication. W H Freeman & Co New York, NY Kelman Z, O'Donnell M: DNA polymerase III holoenzyme: structure and function of a chromosomal replicating machine. Annual review of biochemistry 1995, 64:

60 34. Hayes F, Daly C, Fitzgerald GF: Identification of the Minimal Replicon of Lactococcus lactis subsp. lactis UC317 Plasmid pci305. Applied and environmental microbiology 1990, 56(1): Kiewiet R, Bron S, de Jonge K, Venema G, Seegers JF: Theta replication of the lactococcal plasmid pwvo2. Molecular microbiology 1993, 10(2): Hayes F, Vos P, Fitzgerald GF, de Vos WM, Daly C: Molecular organization of the minimal replicon of novel, narrow-host-range, lactococcal plasmid pci305. Plasmid 1991, 25(1): Khan SA: Plasmid rolling-circle replication: highlights of two decades of research. Plasmid 2005, 53(2): Khan SA: Rolling-circle replication of bacterial plasmids. Microbiology and molecular biology reviews : MMBR 1997, 61(4): Sorensen SJ, Bailey M, Hansen LH, Kroer N, Wuertz S: Studying plasmid horizontal transfer in situ: a critical review. Nature reviews Microbiology 2005, 3(9): Smets BF, Barkay T: Horizontal gene transfer: perspectives at a crossroads of scientific disciplines. Nature reviews Microbiology 2005, 3(9): Grohmann E, Muth G, Espinosa M: Conjugative plasmid transfer in grampositive bacteria. Microbiology and molecular biology reviews : MMBR 2003, 67(2): , table of contents. 42. Thomas CM, Nielsen KM: Mechanisms of, and barriers to, horizontal gene transfer between bacteria. Nature reviews Microbiology 2005, 3(9):

61 43. Waters CM, Dunny GM: Analysis of functional domains of the Enterococcus faecalis pheromone-induced surface protein aggregation substance. Journal of bacteriology 2001, 183(19): Mills S, Coffey A, O'Sullivan L, Stokes D, Hill C, Fitzgerald GF, Ross RP: Use of lacticin 481 to facilitate delivery of the bacteriophage resistance plasmid, pcbg104 to cheese starters. Journal of applied microbiology 2002, 92(2): van Kranenburg R KMdVW: Nucleotide sequence analysis of the lactococcal EPS plasmid pnz4000. Plasmid 2000, 43: Gasson MJ: In vivo genetic systems in lactic acid bacteria. FEMS microbiology reviews 1990, 7(1-2): Aziz RK, Bartels D, Best AA, DeJongh M, Disz T, Edwards RA, Formsma K, Gerdes S, Glass EM, Kubal M et al: The RAST Server: rapid annotations using subsystems technology. BMC genomics 2008, 9: Van Domselaar GH, Stothard P, Shrivastava S, Cruz JA, Guo A, Dong X, Lu P, Szafron D, Greiner R, Wishart DS: BASys: a web server for automated bacterial genome annotation. Nucleic acids research 2005, 33(Web Server issue):w Lopez R, Silventoinen V, Robinson S, Kibria A, Gish W: WU-Blast2 server at the European Bioinformatics Institute. Nucleic acids research 2003, 31(13): Thompson JD, Higgins DG, Gibson TJ: CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic acids research 1994, 22(22):

62 51. Waterhouse AM, Procter JB, Martin DM, Clamp M, Barton GJ: Jalview Version 2--a multiple sequence alignment editor and analysis workbench. Bioinformatics 2009, 25(9): Mulder N, Apweiler R: InterPro and InterProScan: tools for protein sequence classification and comparison. Methods Mol Biol 2007, 396: Castresana J: Selection of conserved blocks from multiple alignments for their use in phylogenetic analysis. Molecular biology and evolution 2000, 17(4): Guindon S, Gascuel O: A simple, fast, and accurate algorithm to estimate large phylogenies by maximum likelihood. Systematic biology 2003, 52(5): Dereeper A, Guignon V, Blanc G, Audic S, Buffet S, Chevenet F, Dufayard JF, Guindon S, Lefort V, Lescot M et al: Phylogeny.fr: robust phylogenetic analysis for the non-specialist. Nucleic acids research 2008, 36(Web Server issue):w Anisimova M, Gascuel O: Approximate likelihood-ratio test for branches: A fast, accurate, and powerful alternative. Systematic biology 2006, 55(4): Chevenet F, Brun C, Banuls AL, Jacq B, Christen R: TreeDyn: towards dynamic graphics and annotations for analyses of trees. BMC bioinformatics 2006, 7: N D: Circoletto: visualizing 383 sequence similarity with Circos. Bioinformatics 2010, 26: Skulj M, Okrslar V, Jalen S, Jevsevar S, Slanc P, Strukelj B, Menart V: Improved determination of plasmid copy number using quantitative real-time PCR for monitoring fermentation processes. Microbial cell factories 2008, 7:

63 60. Makarova K, Slesarev A, Wolf Y, Sorokin A, Mirkin B, Koonin E, Pavlov A, Pavlova N, Karamychev V, Polouchine N et al: Comparative genomics of the lactic acid bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2006, 103(42): Giraldo R, Fernandez-Tresguerres ME: Twenty years of the pps10 replicon: insights on the molecular mechanism for the activation of DNA replication in iteron-containing bacterial plasmids. Plasmid 2004, 52(2): Emond E, Lavallee R, Drolet G, Moineau S, LaPointe G: Molecular characterization of a theta replication plasmid and its use for development of a two-component food-grade cloning system for Lactococcus lactis. Applied and environmental microbiology 2001, 67(4): Mills S, McAuliffe OE, Coffey A, Fitzgerald GF, Ross RP: Plasmids of lactococci - genetic accessories or genetic necessities? FEMS microbiology reviews 2006, 30(2): Das D, Krishna SS, McMullan D, Miller MD, Xu Q, Abdubek P, Acosta C, Astakhova T, Axelrod HL, Burra P et al: Crystal structure of the Fic (Filamentation induced by camp) family protein SO4266 (gi ) from Shewanella oneidensis MR-1 at 1.6 A resolution. Proteins 2009, 75(1): Strahinic I, Kojic M, Tolinacki M, Fira D, Topisirovic L: Molecular characterization of plasmids ps7a and ps7b from Lactococcus lactis subsp. lactis bv. diacetylactis S50 as a base for the construction of mobilizable cloning vectors. Journal of applied microbiology 2009, 106(1): Shareck J, Choi Y, Lee B, Miguez CB: Cloning vectors based on cryptic plasmids isolated from lactic acid bacteria: their characteristics and potential applications in biotechnology. Critical reviews in biotechnology 2004, 24(4):

64 67. Gorecki RK, Koryszewska-Baginska A, Golebiewski M, Zylinska J, Grynberg M, Bardowski JK: Adaptative potential of the Lactococcus lactis IL594 strain encoded in its 7 plasmids. PloS one 2011, 6(7):e Siezen RJ, Renckens B, van Swam I, Peters S, van Kranenburg R, Kleerebezem M, de Vos WM: Complete sequences of four plasmids of Lactococcus lactis subsp. cremoris SK11 reveal extensive adaptation to the dairy environment. Applied and environmental microbiology 2005, 71(12): Fallico V, McAuliffe O, Fitzgerald GF, Ross RP: Plasmids of raw milk cheese isolate Lactococcus lactis subsp. lactis biovar diacetylactis DPC3901 suggest a plant-based origin for the strain. Applied and environmental microbiology 2011, 77(18): Schirawski J, Hagens W, Fitzgerald GF, Van Sinderen D: Molecular characterization of cadmium resistance in Streptococcus thermophilus strain 4134: an example of lateral gene transfer. Applied and environmental microbiology 2002, 68(11): Tanous C, Chambellon E, Yvon M: Sequence analysis of the mobilizable lactococcal plasmid pgdh442 encoding glutamate dehydrogenase activity. Microbiology 2007, 153(Pt 5): Boleij A, Muytjens CM, Bukhari SI, Cayet N, Glaser P, Hermans PW, Swinkels DW, Bolhuis A, Tjalsma H: Novel clues on the specific association of Streptococcus gallolyticus subsp gallolyticus with colorectal cancer. The Journal of infectious diseases 2011, 203(8): Danne C, Entenza JM, Mallet A, Briandet R, Debarbouille M, Nato F, Glaser P, Jouvion G, Moreillon P, Trieu-Cuot P et al: Molecular characterization of a Streptococcus gallolyticus genomic island encoding a pilus involved in endocarditis. The Journal of infectious diseases 2011, 204(12):

65 7. Συνέδρια Παρακάτω ακολουθούν οι περιλήψεις των poster στα συνέδρια καθώς και τα poster που αναρτήθηκαν σε αυτά, κατά τη διάρκεια της παρούσας Μεταπτυχιακής εργασίας

66 Konstantinos Papadimitriou, Thomas Plakas, Rania Anastasiou, Nikos C. Papandreou, Stavros J. Hamodrakas, Stéphanie Ferreira, Philip Supply, Pierre Renault, Bruno Pot and Effie Tsakalidou (2013) Characterization of plasmid psma198 found in Streptococcus macedonicus ACA-DC 198 supports the relation of the species to the milk environment. FEMS th Congress of European Microbiologists. Leipzig, Germany

67 - 63 -

68 - 64 -

69 Thomas Plakas, Rania Anastasiou, Marina Georgalaki, Ioanna-Areti Asteri, Stéphanie Ferreira, Philip Supply, Nikos C. Papandreou, Bruno Pot, Effie Tsakalidou and Konstantinos Papadimitriou (2012) Comparative analysis of psma198 found in Streptococcus macedonicus ACA-DC 198, the first streptococcal plasmid of the pci305/pwv02 family of theta-replicating replicons. 5th conference of the Hellenic Initiative Mikrobiokosmos. Athens, Greece

70 Συγκριτική ανάλυση του psma198 του Streptococcus macedonicus ACA-DC 198, του πρώτου πλασμιδίου που βρέθηκε στους στρεπτόκοκκους και ανήκει στην οικογένεια των ρεπλικονίων pci305/pwv02 που αντιγράφονται μέσω του μηχανισμού θ Πλάκας Θ.1,2, Αναστασίου Ρ.1, Γεωργαλάκη Μ.1, Αστερή Ι.Α.1, Ferreira S.3, Supply P.3,4, Παπανδρέου N.2, Pot Β.4, Τσακαλίδου Ε.1 και Παπαδημητρίου Κ.1 1Γεωπονικό Πανεπιστήμιο Αθηνών, Τμήμα Επιστήμης και Τεχνολογίας Τροφίμων, Εργαστήριο Γαλακτοκομίας, Αθήνα, Ελλάδα 2Πανεπιστήμιο Αθηνών, Τμήμα Βιολογίας, Τομέας Κυτταρικής Βιολογίας και Βιοφυσικής, Αθήνα, Ελλάδα 3Genoscreen, Genomic Platform and R&D, Campus de l'institut Pasteur, Lille, France, 4Institut Pasteur de Lille, Center for Infection and Immunity of Lille (CIIL), Lille, France Στην παρούσα εργασία αναλύουμε το psma198, το πρώτο πλασμίδιο που απομονώθηκε από το Streptococcus macedonicus ACA-DC 198, και διερευνούμε την πιθανή προέλευσή του. Με βάση το προφίλ της ομοιότητας της πρωτεΐνης που είναι υπεύθυνη για την έναρξη αντιγραφής του πλασμιδίου (Rep) και του σημείου έναρξης της αντιγραφής (ori), το psma198 βρέθηκε να είναι ένα νέο μέλος της οικογένειας των πλασμιδίων pci305/pwv02. Η οικογένεια pci305/pwv02 αποτελείται από πλασμίδια με περιορισμένο εύρος ξενιστών που βρίσκονται κυρίως σε είδη του γένους Lactococcus. Η συγκριτική ανάλυση του psma198 αποκάλυψε υψηλό βαθμό ομοιότητας με το πλασμίδιο psk11b ως προς το σκελετό αντιγραφής, το pvf22 ως προς το σκελετό κινητοποίησης και το pil5 ως προς το μεγαλύτερο μήκος του. Τα τρία αυτά πλασμίδια έχουν απομονωθεί από στελέχη του Lactococcus lactis που προέρχονται από το γάλα ή προϊόντα του. Το γεγονός αυτό υποδεικνύει ότι ο S. macedonicus απέκτησε το psma198 από τον L. lactis στο περιβάλλον των γαλακτοκομικών προϊόντων. Τόσο το psma198 όσο και το χρωμόσωμα του S. macedonicus εμφανίζουν ένα μεγάλο ποσοστό ψευδογονιδίων, υποστηρίζοντας την κοινή τους εξέλιξη μέσω διαδικασιών αποσύνθεσης γονιδίων. Επιπλέον, βρέθηκαν περιοχές στο χρωμόσωμα που μπορεί να έχουν προέλθει από το psma198,

71 ενισχύοντας την πιθανότητα μιας μακράς συνύπαρξης των δύο ρεπλικονίων. Τέλος, το psma198 βρέθηκε σε στελέχη του S. macedonicus που με την ηλεκτροφόρηση παλλόμενου πεδίου διαχωρίζονται σε πέντε διαφορετικούς γονότυπους, δείχνοντας ότι η απόκτηση του psma198 δεν είναι πρόσφατη. Τα ευρήματα της ανάλυσης του psma198 υποδηλώνουν την εξοικείωση του S. macedonicus ACA-DC 198 στο περιβάλλον των γαλακτοκομικών προϊόντων. Λέξεις κλειδιά: Πλασμίδιο, psma198, Streptococcus macedonicus

72 Comparative analysis of psma198 found in Streptococcus macedonicus ACA-DC 198, the first streptococcal plasmid of the pci305/pwv02 family of thetareplicating replicons Plakas T.1,2, Anastasiou R.1, Georgalaki M.1, Asteri I.A.1, Ferreira S.3, Supply P.3,4, Papandreou N.C.2, Pot B.4, Tsakalidou E.1 and Papadimitriou K.1 1Agricultural University of Athens, Department of Food Science and Technology, Laboratory of Dairy Research, Athens, Greece 2University of Athens, Faculty of Biology, Department of Cell Biology and Biophysics,Athens, Greece 3Genoscreen, Genomic Platform and R&D, Campus de l'institut Pasteur, Lille, France, 4Institut Pasteur de Lille, Center for Infection and Immunity of Lille (CIIL), Lille, France Here we analyze psma198, the first plasmid isolated from Streptococcus macedonicus ACA-DC 198, and we attempt to clarify the route of its original acquisition. Based on the similarity profiles of the plasmid s replication initiation protein (Rep) and its origin of replication (ori), psma198 was found to be a novel member of the pci305/pwv02 family of theta-replicating plasmids. The pci305/pwv02 family consists of plasmids of narrow host range that are mainly found in lactococcal species. Comparative analysis of the psma198 revealed a high degree of similarity with plasmids psk11b, pvf22 and pil5 over its replication backbone, its mobilization backbone and most of its length, respectively. All these three plasmids have been isolated from Lactococcus lactis strains deriving from milk or its products supporting that S. macedonicus acquired psma198 from the latter species and that this acquisition took place in the dairy environment. Both psma198 and the chromosome of S. macedonicus exhibit a high degree of pseudogenes, indicating that they must have evolved under the same gene decay processes. Furthermore, we were able to determine chromosomal regions that may have originated from psma198, also supporting a long co-existence of the two replicons. In addition, psma198 is carried by S. macedonicus strains segregated in five different genotypes by pulsed-field gel electrophoresis (PFGE), showing that psma198 s

73 acquisition is not a recent event. We propose that our overall analysis of psma198 points towards the habituation of S. macedonicus ACA-DC 198 to the dairy environment

74 - 70 -

75 Thomas Plakas, Rania Anastasiou, Stéphanie Ferreira, Philip Supply, Nikos C. Papandreou, Bruno Pot, Effie Tsakalidou and Konstantinos Papadimitriou (2012) Analysis of the lactococcal plasmid psma198 found in Streptococcus macedonicus ACA-DC 198 points towards the habituation of the strain to the dairy environment. 7th conference of the Hellenic Society for Computational Biology and Bioinformatics. Heraklion, Greece

76 - 72 -

77 - 73 -

78 - 74 -

79 8. Ερευνητικά άρθρα Παρακάτω ακολουθεί το ερευνητικό άρθρο που έχει υποβληθεί σε ένα επιστημονικό περιοδικό με σύστημα κριτών και υλοποιήθηκε κατά τη διάρκεια της παρούσας Μεταπτυχιακής εργασίας

80 Analysis of the lactococcal plasmid psma198 found in Streptococcus macedonicus ACA- DC 198 points towards the habituation of the strain to the dairy environment Konstantinos Papadimitriou 1, *, Thomas Plakas 1,2, Rania Anastasiou 1, Nikos C. Papandreou 2, Stavros J. Hamodrakas 2, Stéphanie Ferreira 3, Philip Supply 3, 4, 5, 6, 7, Pierre Renault 8, Bruno Pot 4, 5, 6, 7 and Effie Tsakalidou 1 1 Laboratory of Dairy Research, Department of Food Science and Technology, Agricultural University of Athens, Iera Odos 75, Athens, Greece 2 Department of Cell Biology and Biophysics, Faculty of Biology, University of Athens, Panepistimiopolis, Athens, Greece 3 Genoscreen, Genomic Platform and R&D, Campus de l'institut Pasteur, 1 rue du Professeur Calmette, Lille, France 4 Institut Pasteur de Lille, Center for Infection and Immunity of Lille (CIIL), F Lille, France 5 Inserm U1019, F Lille, France 6 CNRS UMR8204, F Lille, France 7 Univ Lille de Nord France, F Lille, France 8 Institut National de la Recherche Agronomique, UMR1319 Micalis, Domaine de Vilvert, Jouy-en-Josas, France * kpapadimitriou@aua.gr

81 Abstract Background: Streptococcus macedonicus is an intriguing streptococcal species whose most frequent source of isolation is fermented foods similarly to Streptococcus thermophilus. However, S. macedonicus is closely related to commensal opportunistic pathogens of the Streptococcus bovis/streptococcus equinus complex. Methodology/Principal Findings: We analyzed the psma198 plasmid isolated from the dairy strain Streptococcus macedonicus ACA-DC 198 in order to provide novel clues about the main ecological niche of this bacterium. Based on the sequence similarity profiles of the plasmid s replication initiation protein (Rep) and origin of replication ( ori), psma198 belongs to the narrow host range pci305/pwv02 family found primarily in lactococci and it is the first such plasmid to be reported in streptococci. Comparative analysis of the psma198 sequence over its ori, origin of transfer ( orit) or entire length revealed a high degree of similarity with plasmids psk11b, pvf22 and pil5, respectively isolated from Lactococcus lactis strains deriving from milk or its products. Phylogenetic analysis of the psma198 Rep showed that the vast majority of closely related proteins derive from lactococcal dairy isolates. Both psma198 and the chromosome of S. macedonicus exhibit a high percentage of potential pseudogenes, indicating that they have co-evolved under the same gene decay processes. Furthermore, we identified chromosomal regions in S. macedonicus that may have originated from psma198, also supporting a long co-existence of the two replicons. In addition, psma198 was found in divergent biotypes of S. macedonicus and in strains isolated from dispersed geographic locations (e.g. Greece or Switzerland) showing that psma198 s acquisition is not a recent event. Conclusions/Significance: Our findings demonstrate that S. macedonicus ACA-DC 198 acquired plasmid psma198 from L. lactis via an ancestral genetic exchange event that took place most probably in milk or dairy products. We provide the first molecular and evolutionary evidence for the habituation of S. macedonicus to the dairy environment

82 Introduction Lactic acid bacteria (LAB) form the most important group of microorganisms used in food fermentations. Several LAB species have a long history of unproblematic use as starters and they are thus considered as safe including a number of probiotic strains that may provide the consumers with health benefits [1]. However, food-related LAB are often phylogenetically related to commensal LAB that may be opportunistic or even invasive pathogens. The most striking example of this situation is probably the genus Streptococcus, in which only one species, Streptococcus thermophilus is considered safe. Since centuries, S. thermophilus is a dairy starter frequently consumed by humans world-wide. We now know that this species is phylogenetically related to notorious streptococcal pathogens such as Group A and Group B streptococci, as well as to Streptococcus pneumoniae. Studies of the S. thermophilus genome, however, have revealed extensive gene decay, leading to the loss of streptococcal pathogenic determinants during its adaptation to milk [2,3]. In addition, the species was shown to have acquired genes from species like Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus with whom it often shares a symbiotic relationship in the dairy environment [4]. These attributes along with the long empiric experience of its safe use support the benign nature of S. thermophilus [5]. Apart from S. thermophilus, certain members of the Streptococcus bovis/streptococcus equinus complex ( SBSEC), i.e. Streptococcus macedonicus and Streptococcus infantarius, have also been associated with fermented foods [6,7]. After its original description S. macedonicus has been identified in a wide range of dairies around the world and current studies indicate that milk and its products represent its primary ecological niche [6]. Similarly to S. macedonicus, certain strains of S. infantarius have been isolated from the food environment [8]. Both species are clearly related to the other members of the SBSEC, such as the commensals Streptococcus gallolyticus and Streptococcus pasteurianus that are associated with endocarditis, bacteremia and colon cancer [9,10]. Only recently reports appeared that suggested a possible link between the presence of S. macedonicus and some cases of endocarditis [11,12]. The recently completed sequencing of the genomes of S. macedonicus ACA-DC 198 (isolated from traditional Greek Kasseri cheese) and of S. infantarius CJ18 (isolated from suusac, a type of traditionally Kenyan fermented camel milk) are expected to facilitate the assessment of the adaptation of these species to the milk environment [13,14]. Here we analyzed the first plasmid isolated from S. macedonicus ACA-DC 198 and we attempted to clarify the route of its original acquisition

83 Materials and methods Bacterial strains and culture conditions Streptococcus macedonicus ACA-DC 198 was originally isolated from traditional Greek Kasseri cheese [15]. The strain was routinely cultured in M17 supplemented with 1% (w/v) glucose (GM17). Stocks of the bacterium were stored in cryovials filled with 1 ml of GM17 supplemented with 20% (v/v) glycerol. Sequencing and annotation of psma198 The sequence of psma198 was identified during the genome sequencing of S. macedonicus ACA-DC 198 as described previously [13]. In brief, total DNA of S. macedonicus was subjected to pyrosequencing according to the manufacturer s instructions on a 454 GS-FLX Titanium sequencer (Roche Diagnostics, Basel, Switzerl and) (Genoscreen, Lille, France). A round of shotgun pyrosequencing was followed by a 3-kb paired-end pyrosequencing. The acquired sequences were assembled using Newbler into 7 scaffolds, 5 of which could be subsequently aligned against a NheI genomic optical map of S. macedonicus (OpGen Technologies, Inc., Madison, WI). Further analysis supported that one of the two unaligned scaffolds was a plasmid. The complete sequence of psma198 was finally acquired at a >X coverage through hybrid assembly of the pyrosequencing reads with reads obtained after an additional round of Hiseq2000 (Illumina, San Diego, CA) sequencing (Fidelity Systems, Inc., Gaithersburg, MD). Gene prediction and annotation of the plasmid was performed using two ab initio predictor pipelines, RAST [16] and BaSys [17]. We also employed manual WU-Blast similarity searches for the detailed functional annotation of deduced proteins [18]. Pseudogenes were considered on the basis of presence or absence of ribosome-binding sequences (RBS), of the coding sequence length and of frame shifts resulting in split genes. The origin of replication (ori) and the origin of mobilization ( orit) were identified based on previously determined sequences in plasmids related to psma198. Nucleotide and protein analysis and phylogenetic analysis

84 In addition to WU-BlastN and WU-BlastP searches, nucleotide and protein sequences were aligned using ClustalW [19]. Miscellaneous features within the alignments (i.e. direct repeats, inverted repeats and other crucial sequences) were determined manually based on the available literature. We used InterProScan [20] to detect motifs within protein sequences. For phylogenetic analysis multiple sequence alignments were curated with Gblocks [21] and maximum likelihood trees were generated with the PhyML algorithm [22] as implemented in the Phylogeny.fr pipeline [23]. Branch support values were calculated with the χ 2 parametric approximate likelihood-ratio test (alrt) [24]. Graphical representation of the phylogenetic tree was carried out with TreeDyn [25]. Comparative analysis of psma198 to other plasmids was performed using Circoletto [26] and Kodon software (Applied Maths N.V., Sint- Martens-Latem, Belgium). Quantification of the psma198 plasmid copy number (PCN) The PCN of psma198 was determined based on the qpcr method described by Skulj et al. (2008) [27] and as performed previously [28]. In brief, total DNA was extracted as described by Leenhouts et al. [29]. As a reference an internal segment (104 bp) of the single copy chromosomal gene mcdm was amplified with the primers 5 - CGGAATTCAGTTCTTTCTACGG-3 (mcdm F ) and 5 -GCTTCACCAATAAGCGTTCC-3 (mcdm R ). For PCN determination an internal segment (109 bp) of the single copy plasmid gene rep was amplified with the primers 5 -GAAATCAACGCCCATACGTC-3 (rep F ) and 5 -TATCGTCTGCACACCGTTTC-3 (rep R ). qpcr was performed on a MX3005P (Stratagene, La Jolla, CA) using the KAPA SYBR FAST qpcr Kit (Kapa Biosystems, Inc. Woburn, MA) according to the manufacturer's instructions. Results and Discussion psma198 belongs to the narrow host range pci305/pwv02 family of lactococcal plasmids Streptococcus macedonicus ACA-DC 198 carries a novel plasmid of 12,728 bp assigned as psma198 [13]. The plasmid has a 35.0% G+C content, which is lower than that of the S. macedonicus chromosome (37.6%), suggesting that it may have been acquired from another organism. Overall, 17 CDSs were identified on psma198 (Fig.1 and Table 1). The first gene

85 codes for a replication initiation protein (Rep). The rep gene showed 87% of DNA sequence identity (e -value 1.8e -196 ) with the respective gene found on plasmid 1 of L. lactis subsp. cremoris SK11 [30]. Among the best WU-Blast hits of Rep we identified the RepB proteins of the pci305 and the pwv02 plasmids (78% identity, e-value 8.3e -162 and 75% identity, e- value 2.9e -152, respectively) that are the prototypes of the pci305/pwv02 family of the lactococcal theta-replicating plasmids [31-33]. Multiple sequence alignment of the top Rep WU-Blast hits, including the pci305 and pwv02 RepB proteins, revealed a high degree of conservation among them (Fig. 2). Analysis of these proteins with InterProScan determined four Pfam sequence signatures corresponding to the initiator Rep protein (Rep_3, PF01051), the L. lactis RepB C-terminal protein (L_lactis_RepB_C, PF06430) and two consecutive winged helix-turn-helix transcription DNA-binding repressors (Wing_hlx_DNA_bd, G3DSA: ). The first signature is typically shared by the theta replicon-type Rep proteins [34], while according to our analysis its combination with the second signature seems to be specific and characteristic of the RepB proteins of the pci305/pwv02 family. Although a number of leucine residues were identified at the N-terminal of the proteins, structural predictions suggested that these residues could not form a leucine zipper (data not shown) in contrast to what has been described for the RepA model of the Pseudomonas replicon ps10 [35] and the lactococcal RepB of plasmid pcd4 [36]. Nevertheless, the DNAbinding property of RepB proteins may depend on the winged helix-turn-helix motif found in the Rep_3 or the Wing_hlx_DNA_bd overlapping signatures [35]. The product of the gene orfx, found immediately downstream of rep, has been suggested to participate in the control of the PCN [33]. OrfX is significantly less conserved than Rep (data not shown). This is not completely unexpected, as in some plasmids orfx is absent, indicating that it may not be necessary for the replication of the plasmids carrying it [33]. Other potentially interesting proteins encoded by psma198 are a transcriptional regulator of the AraC family (YdeE), a universal stress protein (Orf3) and a manganese transport protein (MntH). The fourth gene codes for an integral membrane protein of unknown function, while the fifth and the twelfth genes are both coding for an integrase/recombinase plasmidassociated YoeC protein. Five ORFs are putative pseudogenes. Four ( orf2, orf4, orf5 and orf6) consist of fragments of genes coding for transposase elements. Interestingly, the remaining pseudogene ( orf7) encodes an amino acid sequence that shows 63% identity (e - value 4.4e- 05 ) to a truncated version of cytochrome B encoded by a L. lactis gene. It is also noteworthy that, according to current annotations, analogs of all these pseudogenes could be

86 identified in a potentially functional form in different lactococcal plasmids related to psma198 (e.g. orf2 in pil5, orf4, orf5 and orf6 in pgdh442 and orf7 in pci605, data not shown). These findings indicate that psma198 has been subjected to gene decay processes. The last four genes of the plasmid are probably dedicated to the mobilization of the plasmid. Apart from mobc and rlx coding for mobilization proteins, two additional genes ( orf8 and orf9) encode a conserved hypothetical protein and a Fic family protein, respectively. Genes like orf9 are often found in the same context with mobilization-associated genes and are probably implicated in cell cycle regulation [37]. Subsequently, we looked upstream of the rep gene in an attempt to identify the origin of replication ( ori) of psma198. WU-Blastn similarity searches and multiple sequence alignment directed us towards a pci305/pwv02 type of ori (Fig. 3). Indeed, we determined a segment spanning 242 nucleotides that contains an AT-rich region, three and a half direct repeats (DRs) of 22-bp iterons and two inverted repeats (IRs). The pattern of the psma198 ori along with the similarity of its Rep with the lactococcal RepB shows that psma198 is certainly a member of the pci305/pwv02 family of replicons, which are normally found in Lactococcus species [31-33]. Similarly to what has been reported for constructs based on the pci305/pwv02 replicon [38], psma198 was found to have a low PCN of 2-3 plasmids per cell. In addition, even though psma198 is not a self-transmissible plasmid, a cis-acting origin for transfer (orit) that would allow its mobilization in the presence of a true conjugative plasmid was also predicted upstream of mobc (Fig. 4). The orit exhibited a region of six consecutive IRs and two DRs. Eight bases after the end of IR3 we determined an identical nick site to those previously proposed for plasmids ps7a and ps7b found in L. lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis S50 isolated from butter [39]. Once more, these structures are highly conserved among several lactococcal plasmids including pci305 [39,40]. psma198 was acquired by S. macedonicus from L. lactis in the dairy environment The relation of psma198 to other plasmids was further investigated (Fig. 5). WU -Blastn searches supported that the closest plasmids were of lactococcal origin. Top hits were aligned against psma198 in a circular manner using Circoletto. We initiated our search with the psma198 ori and orit that showed highest identity to the corresponding features of plasmids psk11b (92% identity, e -value 7.5e -37 ) and pvf22 (94% identity, e -value 4.3e -84 ),

87 respectively. Plasmid psk11b has been isolated from L. lactis subsp. cremoris SK11, which is a widely used industrial starter in cheese making [41], and plasmid pvf22 has been isolated from the raw milk cheese strain L. lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis DPC3901 [42]. However, the sequence similarity between psma198 and each of the two plasmids mentioned above was essentially restricted to the replication ( ori-rep-orfx) or the mobilization (orit-mobc-rlx-orf8-orf9) backbone (Fig. 5). This led us to look for the plasmid that would have the highest identity with the complete sequence of psma198. The plasmid identified was pil5 that has been isolated from the cheese starter L. lactis subsp. lactis IL594 [40]. pil5 exhibited more than 90% identity (e -value 0.0) with a query coverage of approximately 62% of the psma198 sequence containing the entire mobilization backbone (Fig. 5). It should be emphasized that apart from the close similarity hits mentioned above, the overriding majority of top hits in all similarity searches for the different features annotated on psma198 at the protein and nucleotide level, originated from L. lactis dairy strains. For example, nine out of ten top hits for the replication backbone, originated from strains isolated from milk or its products. Therefore, it is most likely that the original donor of psma198 was indeed a dairy L. lactis strain. To provide further evidence for this assumption we performed phylogenetic analysis of the RepB protein (Fig. 6). The psma198 Rep sequence was placed within a branch where 17 out of 19 lactococcal RepB proteins originated from dairy L. lactis strains. The overall tree consisted of two main clades. In the first one, RepB proteins from L. lactis were the most frequently represented (91 out of lactococcal sequences in a total of 134) suggesting that the RepB proteins found sporadically in non-lactococcal species and interspersed in different branches within this clade (e.g. Listeria monocytogenes DRDC8, Listeria inocua serovar 6a CLIP 11262, Pediococcus pentosaceus ATCC43200, Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis W9, Lactobacillus salivarius SMXD51, Tetragenococcus halophilus H, Weissella koreensis KACC and Leuconostoc spp.) must have originated from L. lactis. The second clade was made up entirely of Enterococcus RepB proteins that have diverged from the rest. The fact that only 45 out of 145 RepB proteins included in the phylogenetic analysis were nonlactococcal is in line with the limited dispersion of pci305/pwv02 plasmids to species other than lactococci, as seen from early experimental data describing the narrow host range nature of these plasmids [31,43]. The acquisition of psma198 by S. macedonicus is not a recent event

88 As mentioned above, psma198 exhibits a high percentage of pseudogenes similarly to the chromosome of S. macedonicus ACA-DC 198 [13], suggesting that the two molecules must have co-evolved under the same gene decay processes. Given this inference on such a long co-existence, we examined possible genetic exchanges between psma198 and the chromosome of S. macedonicus ACA-DC 198. This hypothesis was also supported by the reduced size of psma198 as compared to some of its related plasmids, e.g. pvf22 and pil5 (12 kb vs. 22 and 23 kb, respectively) indicative of loss of genetic material, some of which could have moved to the chromosome. To identify such regions, we initially searched for the presence of chromosomal genes showing high identity to the genes found on psma198 or its related plasmids (Fig. 7). Using this strategy, a number of transposase-encoding genes were found on the chromosome that exhibited high sequence identity to the psma198 orf2 transposase pseudogene (e.g. SMA_0311, SMA_0486 and SMA_2043, data not shown). Genes coding for similar transposases are also present in different lactococcal plasmids related to psma198 (e.g. pil5, pvf22, etc., data not shown). Furthermore, we found a 2.5 kb region within a large genomic island of S. macedonicus ACA-DC 198 containing genes SMA_0309 and SMA_0310 that showed 96% identity with cadc and cada of pil5. Noteworthy, the cassette of the cadmium resistance regulator (cadc) and the cadmium efflux ATPase ( cada) was previously suggested to have been transferred horizontally from L. lactis to S. thermophilus [44]. An additional chromosomal gene, SMA_2044, exhibited 93% identity to the cora1 gene of pvf22, encoding a Mg 2+ and Co 2+ transport protein [42]. We then examined the genome of S. macedonicus for the existence of genes that could probably have derived from plasmids of the pci305/pwv02 family in general. An additional chromosomal region was found where five out of six genes (namely SMA_0488 to SMA_0493, involved in nucleotide biosynthesis and its regulation) showed 93% identity to the respective genes of plasmid pgdh442, which belongs to a plant isolate of L. lactis [45]. Strikingly, the three chromosomal regions (cadc -cada, SMA_2044, and SMA_0488 to SMA_0493) are all flanked at at least one side by one of the transposases showing high identity to psma198 orf2 mentioned above (i.e. SMA_0311, SMA_0486 and SMA_2043). All these observations, without any doubt, suggest a long co-existence with obvious genetic exchanges between the chromosome and the plasmid of S. macedonicus. When looking at the distribution of psma198 in more than 10 randomly selected S. macedonicus strains of the ACA-DC collection, the plasmid was always present (data not shown). It should be emphasized that the strains belonged to different biotypes according to

89 PFGE analysis and were all isolated from traditional Greek dairy products. The widespread distribution of psma198 among S. macedonicus strains was also supported by its detection in strains from the Nestlé culture collection isolated in Switzerland (data not shown). Again, these findings suggest that the acquisition of psma198 from S. macedonicus is not a recent event. Conclusion Our findings demonstrate that psma198 is a novel member of the pci305/pwv02 family of theta-replicating plasmids. The pci305/pwv02 replicon has been shown to be of narrow host range, mainly replicating in Lactococcus species [31,43]. psma198 is the first streptococcal plasmid to be described within this family. The levels of sequence identity of the psma198 replication/mobilization backbone reflect an evolutionary history linked with different lactococcal plasmids supporting that S. macedonicus acquired psma198 from L. lactis and that this exchange took place most probably in milk or milk products. Indeed, the closest related plasmids to psma198 (i.e. psk11b, pvf22 and pil5) have been isolated from L. latis of dairy origin, while the psma198 Rep showed high phylogenetic relatedness to RepB proteins of L. lactis dairy isolates. Finally, the acquisition of psma198 by S. macedonicus ACA-DC 198 seems not to be a recent event. This conclusion is based on: i) the high proportion of pseudogenes found in both psma198 and the chromosome of S. macedonicus ACA-DC 198, suggesting co-evolution of the two molecules, ii) the detection of different putative genetic exchange events between the two replicons and iii) the high prevalence of psma198 in divergent strains of S. macedonicus. Our analyses thus point to the long presence of S. macedonicus in the milk environment. This is in full agreement with the fact that most S. macedonicus strains (including S. macedonicus ACA-DC 198) have been isolated from dairy products that according to the current literature seem to be their primary ecological niche [6]. It should be noted that a plasmid related to lactoccocal plasmids has been also found in S. infantarius CJ18, the only other member of the SBSEC that was isolated from a dairy product [14]. Similar plasmids were absent from the S. gallolyticus and S. pasteurianus genomes sequenced today that were all clinical isolates. To the best of our knowledge, neither S. gallolyticus nor S. pasteurianus have been met in milk or milk products up to now. Whether the habituation of S. macedonicus ACA-DC 198 to the dairy environment has resulted in a diminished pathogenic potential compared to other

90 streptococci, as has been suggested in some relevant studies [13,46-48], remains to be elucidated. Acknowledgements This work was financially supported by the THALES Program (Funded by the Greek General Secretariat for Research and Technology)

91 References 1. Ljungh A, Wadstrom T (2006) Lactic acid bacteria as probiotics. Curr Issues Intest Microbiol 7: Bolotin A, Quinquis B, Renault P, Sorokin A, Ehrlich SD, et al. (2004) Complete sequence and comparative genome analysis of the dairy bacterium Streptococcus thermophilus. Nat Biotechnol 22: Hols P, Hancy F, Fontaine L, Grossiord B, Prozzi D, et al. (2005) New insights in the molecular biology and physiology of Streptococcus thermophilus revealed by comparative genomics. FEMS Microbiol Rev 29: Liu M, Siezen RJ, Nauta A (2009) In silico prediction of horizontal gene transfer events in Lactobacillus bulgaricus and Streptococcus thermophilus reveals protocooperation in yogurt manufacturing. Appl Environ Microbiol 75: Delorme C (2008) Safety assessment of dairy microorganisms: Streptococcus thermophilus. Int J Food Microbiol 126: De Vuyst L, Tsakalidou E (2008) Streptococcus macedonicus, a multi-functional and promising species for dairy fermentations. International Dairy Journal 18: Schlegel L, Grimont F, Collins MD, Regnault B, Grimont PA, et al. (2000) Streptococcus infantarius sp. nov., Streptococcus infantarius subsp. infantarius subsp. nov. and Streptococcus infantarius subsp. coli subsp. nov., isolated from humans and food. Int J Syst Evol Microbiol 50 Pt 4: Abdelgadir W, Nielsen DS, Hamad S, Jakobsen M (2008) A traditional Sudanese fermented camel's milk product, Gariss, as a habitat of Streptococcus infantarius subsp. infantarius. Int J Food Microbiol 127: Gupta A, Madani R, Mukhtar H (2010) Streptococcus bovis endocarditis, a silent sign for colonic tumour. Colorectal Dis 12: Lazarovitch T, Shango M, Levine M, Brusovansky R, Akins R, et al. (2012) The relationship between the new taxonomy of Streptococcus bovis and its clonality to colon cancer, endocarditis, and biliary disease. Infection. 11. Malkin J, Kimmitt PT, Ou HY, Bhasker PS, Khare M, et al. (2008) Identification of Streptococcus gallolyticus subsp. macedonicus as the etiological agent in a case of culture-negative multivalve infective endocarditis by 16S rdna PCR analysis of resected valvular tissue. J Heart Valve Dis 17:

92 12. Herrero IA, Rouse MS, Piper KE, Alyaseen SA, Steckelberg JM, et al. (2002) Reevaluation of Streptococcus bovis endocarditis cases from 1975 to 1985 by 16S ribosomal DNA sequence analysis. J Clin Microbiol 40: Papadimitriou K, Ferreira S, Papandreou NC, Mavrogonatou E, Supply P, et al. (2012) Complete genome sequence of the dairy isolate Streptococcus macedonicus ACA-DC 198. J Bacteriol 194: Jans C, Follador R, Lacroix C, Meile L, Stevens MJ (2012) Complete genome sequence of the African dairy isolate Streptococcus infantarius subsp. infantarius strain CJ18. J Bacteriol 194: Tsakalidou E, Zoidou E, Pot B, Wassill L, Ludwig W, et al. (1998) Identification of streptococci from Greek Kasseri cheese and description of Streptococcus macedonicus sp. nov. Int J Syst Bacteriol 48 Pt 2: Aziz RK, Bartels D, Best AA, DeJongh M, Disz T, et al. (2008) The RAST Server: rapid annotations using subsystems technology. BMC Genomics 9: Van Domselaar GH, Stothard P, Shrivastava S, Cruz JA, Guo A, et al. (2005) BASys: a web server for automated bacterial genome annotation. Nucleic Acids Res 33: W Lopez R, Silventoinen V, Robinson S, Kibria A, Gish W (2003) WU-Blast2 server at the European Bioinformatics Institute. Nucleic Acids Res 31: Thompson JD, Higgins DG, Gibson TJ (1994) CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, positionspecific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Res 22: Mulder N, Apweiler R (2007) InterPro and InterProScan: tools for protein sequence classification and comparison. Methods Mol Biol 396: Castresana J (2000) Selection of conserved blocks from multiple alignments for their use in phylogenetic analysis. Mol Biol Evol 17: Guindon S, Gascuel O (2003) A simple, fast, and accurate algorithm to estimate large phylogenies by maximum likelihood. Syst Biol 52: Dereeper A, Guignon V, Blanc G, Audic S, Buffet S, et al. (2008) Phylogeny.fr: robust phylogenetic analysis for the non-specialist. Nucleic Acids Res 36: W Anisimova M, Gascuel O (2006) Approximate likelihood-ratio test for branches: A fast, accurate, and powerful alternative. Syst Biol 55: Chevenet F, Brun C, Banuls AL, Jacq B, Christen R (2006) TreeDyn: towards dynamic graphics and annotations for analyses of trees. BMC Bioinformatics 7:

93 26. Darzentas N (2010) Circoletto: visualizing sequence similarity with Circos. Bioinformatics 26: Skulj M, Okrslar V, Jalen S, Jevsevar S, Slanc P, et al. (2008) Improved determination of plasmid copy number using quantitative real-time PCR for monitoring fermentation processes. Microb Cell Fact 7: Asteri IA, Papadimitriou K, Boutou E, Anastasiou R, Pot B, et al. (2010) Characterization of plac1, a cryptic plasmid isolated from Lactobacillus acidipiscis and comparative analysis with its related plasmids. Int J Food Microbiol 141: Leenhouts KJ, Tolner B, Bron S, Kok J, Venema G, et al. (1991) Nucleotide sequence and characterization of the broad-host-range lactococcal plasmid pwvo1. Plasmid 26: Makarova K, Slesarev A, Wolf Y, Sorokin A, Mirkin B, et al. (2006) Comparative genomics of the lactic acid bacteria. Proc Natl Acad Sci U S A 103: Kiewiet R, Bron S, de Jonge K, Venema G, Seegers JF (1993) Theta rep lication of the lactococcal plasmid pwvo2. Mol Microbiol 10: Hayes F, Daly C, Fitzgerald GF (1990) Identification of the Minimal Replicon of Lactococcus lactis subsp. lactis UC317 Plasmid pci305. Appl Environ Microbiol 56: Mills S, McAuliffe OE, Coffey A, Fitzgerald GF, Ross RP (2006) Plasmids of lactococci - genetic accessories or genetic necessities? FEMS Microbiol Rev 30: del Solar G, Giraldo R, Ruiz-Echevarria MJ, Espinosa M, Diaz-Orejas R (1998) Replication and control of circular bacterial plasmids. Microbiol Mol Biol Rev 62: Giraldo R, Fernandez-Tresguerres ME (2004) Twenty years of the pps10 replicon: insights on the molecular mechanism for the activation of DNA replication in iteroncontaining bacterial plasmids. Plasmid 52: Emond E, Lavallee R, Drolet G, Moineau S, LaPointe G (2001) Molecular characterization of a theta replication plasmid and its use for development of a twocomponent food-grade cloning system for Lactococcus lactis. Appl Environ Microbiol 67: Das D, Krishna SS, McMullan D, Miller MD, Xu Q, et al. (2009) Crystal structure of the Fic (Filamentation induced by camp) family protein SO4266 (gi ) from Shewanella oneidensis MR-1 at 1.6 A resolution. Proteins 75:

94 38. Shareck J, Choi Y, Lee B, Miguez CB (2004) Cloning vectors based on cryptic plasmids isolated from lactic acid bacteria: their characteristics and potential applications in biotechnology. Crit Rev Biotechnol 24: Strahinic I, Kojic M, Tolinacki M, Fira D, Topisirovic L (2009) Molecular characterization of plasmids ps7a and ps7b from Lactococcus lactis subsp. lactis bv. diacetylactis S50 as a base for the construction of mobilizable cloning vectors. J Appl Microbiol 106: Gorecki RK, Koryszewska-Baginska A, Golebiewski M, Zylinska J, Grynberg M, et al. (2011) Adaptative potential of the Lactococcus lactis IL594 strain encoded in its 7 plasmids. PLoS One 6: e Siezen RJ, Renckens B, van Swam I, Peters S, van Kranenburg R, et al. (2005) Complete sequences of four plasmids of Lactococcus lactis subsp. cremoris SK11 reveal extensive adaptation to the dairy environment. Appl Environ Microbiol 71: Fallico V, McAuliffe O, Fitzgerald GF, Ross RP (2011) Plasmids of raw milk cheese isolate Lactococcus lactis subsp. lactis biovar diacetylactis DPC3901 suggest a plantbased origin for the strain. Appl Environ Microbiol 77: Hayes F, Vos P, Fitzgerald GF, de Vos WM, Daly C (1991) Molecular organization of the minimal replicon of novel, narrow-host-range, lactococcal plasmid pci305. Plasmid 25: Schirawski J, Hagens W, Fitzgerald GF, Van Sinderen D (2002) Molecular characterization of cadmium resistance in Streptococcus thermophilus strain 4134: an example of lateral gene transfer. Appl Environ Microbiol 68: Tanous C, Chambellon E, Yvon M (2007) Sequence analysis of the mobilizable lactococcal plasmid pgdh442 encoding glutamate dehydrogenase activity. Microbiology 153: Boleij A, Muytjens CM, Bukhari SI, Cayet N, Glaser P, et al. (2011) Novel clues on the specific association of Streptococcus gallolyticus subsp gallolyticus with colorectal cancer. J Infect Dis 203: Maragkoudakis PA, Papadelli M, Georgalaki M, Panayotopoulou EG, Martinez-Gonzalez B, et al. (2009) In vitro and in vivo safety evaluation of the bacteriocin producer Streptococcus macedonicus ACA-DC 198. Int J Food Microbiol 133:

95 48. Danne C, Entenza JM, Mallet A, Briandet R, Debarbouille M, et al. (2011) Molecular characterization of a Streptococcus gallolyticus genomic island encoding a pilus involved in endocarditis. J Infect Dis 204:

96 Legends to Figures Figure 1 Annotated map of psma198. Black boxes indicate the position of ori and orit. Solid grey arrows indicate positions of functional genes. Remaining light grey arrows indicate positions of predicted pseudogenes. Figure 2 Multiple sequence alignment of RepB sequences relevant to the respective protein of psma198. The alignment was performed with ClustalW [19]. Double-headed arrows indicate positions of protein sequence signatures as determined by InterProScan [20], as follows: initiator Rep protein (dashed line), L. lactis RepB C-terminal (dotted line) and two consecutive winged helix-turn-helix transcription DNA-binding repressor (solid line). Figure 3 Multiple sequence alignment of ori of psma198 and its related plasmids. The alignment was performed using ClustalW [19]. Arrows indicate the position of the AT-rich region, the 22-bp direct repeat (DR) iterons and two inverted repeats (IR). The predicted leader region (-35, -10 and the RBS) and the start codon of the rep gene are underlined. Figure 4 Multiple sequence alignment of orit of psma198 and its related plasmids. The alignment was performed using ClustalW [19]. Arrows indicate positions of the six inverted repeats (IR) and the two directed repeats (DR). Figure 5 Sequence alignment of psma198 against psk11b (A), pvf22 (B) and pil5 (C) represented in a circular fashion using Circoletto [26]. Local alignments produced by BLAST are presented using ribbons whose color corresponds to four quartiles of the alignment s bitscore (red: top 25%, orange: second 25%, green: third 25% and blue: worst 25%). The positions of psma198 ori or orit were added in order to aid orientation

97 Figure 6 Maximum likelihood tree of the psma198 Rep generated using the Phylogeny.fr pipeline [23]. The arrow indicates the position of the psma198 Rep and the bracket denotes the branch with its closest related proteins. Branch support values are presented in the tree. Figure 7 Sequence alignment of chromosomal regions of S. macedonicus ACA-DC 198 against pil5 (A), pvf22 (B) and pgdh442 (C). The alignment was performed using Kodon software (Applied Maths, Belgium). In each case, the flanking transposase gene showing high sequence similarity to orf2 (SMA_p0006) of psma198 plasmid is underlined. Colored areas between the sequences correspond to different levels of identity that are specified within the areas

98 Table 1. Annotated features of psma198 locus_tag gene size nt Best WU-Blastn hit (locus or locus_tag/ organism/ identity/ e-value) Protein function SMA_p0001 rep 1194 LACR_A06/ Lactococcus lactis subsp. cremoris SK11 plasmid 1/ 87%/ 1.8e -196 Initiator RepB protein SMA_p0002 orfx 585 BN193_11490/ Lactococcus raffinolactis 4877/ 91%/ 2.3e -101 Replication associated protein SMA_p0003 ydee 858 ENT_30280 / Enterococcus sp. 7L76 / 99%/ 2.3e -184 AraC family transcriptional regulator SMA_p0004 orf1 582 EfmE1039_1841/ Enterococcus faecium E1039/ 99%/ 4.7e -121 Integral membrane protein SMA_p0005 yoec 591 AF179848/ Lactococcus lactis subsp. lactis UC317 pci305/ 88%/ 1.4e -97 Integrase/recombinase plasmid associated SMA_p0006 orf2 459 CAC42047/ Listeria innocua Clip11262 pli/ 99%/ 3.7e -94 Putative pseudo SMA_p0007 orf3 438 LACR_D31/ Lactococcus lactis subsp. cremoris SK11 plasmid 4/ 99%/ 4.9e -90 Universal stress protein family SMA_p0008 mnth 1578 HMPREF0848_00725 / Streptococcus sp. C150/ 99%/ 0.0 Manganese transport protein MntH SMA_p0009 orf4 480 llmg_pseudo_13/ Lactococcus lactis subsp. cremoris MG1363 pseudogene/ 97%/ 3.3e -214 Putative pseudo SMA_p0010 orf5 195 llmg_pseudo_13/ Lactococcus lactis subsp. cremoris MG1363 pseudogene/ 97%/ 3.3e -214 Putative pseudo SMA_p0011 orf6 276 llmg_pseudo_13/ Lactococcus lactis subsp. cremoris MG1363 pseudogene/ 97%/ 3.3e -214 Putative pseudo SMA_p0012 yoec 465 GMD1E_00300 / Enterococcus sp. GMD1E / 98%/ 2.2e -93 Integrase/recombinase plasmid associated SMA_p0013 orf7 132 pil7_28/ Lactococcus lactis subsp. lactis IL594 plasmid pil7/ 84%/ 1.3e -13 Putative pseudo SMA_p0014 mobc 366 HMPREF9519_01999/ Enterococcus faecalis TX1346/ 89%/ 5.9e -61 Mobilization protein SMA_p0015 rlx 1233 CI5MOBPRO/ Lactococcus lactis subsp. cremoris UC503 pci528/ 99%/ 3.4e -268 Mobilization protein SMA_p0016 orf8 627 ENT_30400 / Enterococcus sp. 7L76/ 96%/ 6.3e -124 Conserved hypothetical protein SMA_p0017 orf9 603 BN193_11500/ Lactococcus raffinolactis 4877/ 99%/ 3.5e -125 Fic family protein 94

99 Figure 1 orf8 orf9 ori rep orfx rlx ydee mobc orit orf7 yoec psma198 orf1 yoec orf6 orf5 orf4 mnth orf3 orf2-95-

100 Figure 2-96-

101 Figure 3 * * * AT -rich * * * * * * 22bp-DR 22bp-DR 22bp-DR IRa IRb RBS Start -97-

102 Figure 4 IR4 IR5 IR6 IR1 IR2 IR3 DR1a DR1b -98-

103 Figure 5 A. B. orit C. orit psma198 psk11b psma198 pvf22 psma198 pil5 ori -99-