ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ TOMEAΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΖΩΩΝ ΠΑΤΡΑ

Transcript

1 ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ TOMEAΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΖΩΩΝ ΠΑΤΡΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΔΙΠΛΩΜΑ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ: ΟΙΚΟΛΟΓΙΑ-ΔΙΑΧΕΙΡΙΣΗ ΚΑΙ ΠΡΟΣΤΑΣΙΑ ΦΥΣΙΚΟΥ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΟΣ Διερεύνηση των τοξικών επιπτώσεων της φαρμακευτικής ουσίας Δικλοφενάκη (Diclofenac), μετά τη χρήση υπερήχων ΤΟΥΦΕΞΗ ΕΙΡΗΝΗ A.M. 545 Επιβλέπων Καθηγητής: Νταϊλιάνης Στέφανος ΠΑΤΡΑ 2016

2 Τριμελής Επιτροπή Επιβλέπων Καθηγητής Νταϊλιάνης Στέφανος (Επίκουρος Καθηγητής, Τμήμα Βιολογίας, Τομέας Βιολογίας Ζώων, Πανεπιστήμιο Πατρών, τηλ./φαξ: , Μέλη επιτροπής Μαναριώτης Ιωάννης (Επίκουρος Καθηγητής, Τμήμα Πολιτικών Μηχανικών, Πανεπιστήμιο Πατρών, τηλ.: /6534, φαξ: , Βλαστός Δημήτρης (Επίκουρος Καθηγητής, Τμήμα Διαχείρισης Περιβάλλοντος και Φυσικών Πόρων, Πανεπιστήμιο Πατρών, τηλ.: , 2

3 ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Η παρούσα διπλωματική εργασία εκπονήθηκε στο πλαίσιο των μεταπτυχιακών μου σπουδών στον τομέα Βιολογίας Ζώων του Τμήματος Βιολογίας του Πανεπιστήμιου Πατρών υπό την επίβλεψη του Επίκουρου Καθηγητή Νταϊλιάνη Στέφανου, στον οποίο θα ήθελα να εκφράσω τις θερμές μου ευχαριστίες για τη βοήθεια που μου παρείχε σε όλα τα στάδια πραγματοποίησής της. Τον ευχαριστώ για την εμπιστοσύνη που μου έδειξε, την πολύτιμη επιστημονική καθοδήγησή του και για την απεριόριστη κατανόησή του, καθώς και την στήριξή του πρακτική και ηθική. Παράλληλα, θα ήθελα να ευχαριστήσω για την άψογη συνεργασία μας τον Επίκουρο Καθηγητή Μαναριώτη Ιωάννη, του Τμήματος Πολιτικών Μηχανικών του Πανεπιστήμιου Πατρών. Τον ευχαριστώ για την απόλυτη εμπιστοσύνη που μου έδειξε στο χώρο του εργαστηρίου του, αλλά και για την αρωγή του στην εκπόνηση των πειραμάτων μου. Τις ευχαριστίες μου θα ήθελα να εκφράσω και στον κ. Βλαστό Δημήτρη, Επίκουρο Καθηγητή του Τμήματος Διαχείρισης Περιβάλλοντος και Φυσικών Πόρων του Πανεπιστήμιου Πατρών για την συμμετοχή του στην τριμελή επιτροπή και τη συμβολή του στην ολοκλήρωση της μελέτης. Θα ήταν παράλειψη να μην ευχαριστήσω τα μέλη του εργαστηρίου, με τα οποία μοιραστήκαμε την καθημερινότητα μας τα δύο χρόνια των μεταπτυχιακών σπουδών μου, ιδιαίτερα την Τσαρπαλή Βασιλική, Υποψήφια Διδάκτορα του Τμήματος Βιολογίας του Πανεπιστημίου Πατρών που μου παρείχε τη βοήθειά της απλόχερα. 3

4 Περιεχόμενα ΠΡΟΛΟΓΟΣ... 6 ΠΕΡΙΛΗΨΗ... 7 ABSTRACT ΕΙΣΑΓΩΓΗ Φαρμακευτικές ουσίες Diclofenac (Diclofenac ή DCF) Είσοδος στο περιβάλλον και Οικολογικές επιπτώσεις Σύστημα υψηλής συχνότητας υπερήχων Επεξεργασία του DCF με υπερήχους (US) Δίθυρα μαλάκια μύδια- Το είδος Mytilus galloprovincialis Το είδος Mytilus galloprovincialis και η χρήση του σε οικοτοξικολογικές μελέτες Κυκλοφορικό σύστημα μυδιών Επαγωγή οξειδωτικής καταπόνησης (οξειδωτικό stress) και μηχανισμοί άμυνας στα Δίθυρα μαλάκια Παραγωγή σουπεροξειδικών ανιόντων ( Ο 2 - ) Παραγωγή οξειδίων του αζώτου ( ΝΟ) Πρόκληση λιπιδικής υπεροξείδωσης στα αιμοκύτταρα Εκτίμηση του βαθμού βλάβης του DNA στα αιμοκύτταρα ΣΚΟΠΟΣ ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Αντιδραστήρια και ουσίες Συλλογή μυδιών και διατήρηση τους Συλλογή αιμολέμφου μυδιών Προετοιμασία κυτταροκαλλιεργειών Προετοιμασία διαλυμάτων DCF και πειραματική διαδικασία υπερήχησης Ιn vitro έκθεση αιμοκυττάρων σε διαφορετικές συγκεντρώσεις DCF Εκτίμηση βιωσιμότητας κυττάρων Προσδιορισμός σουπεροξειδικών ανιόντων ( Ο 2 - ) Προσδιορισμός παραγωγής οξειδίων του αζώτου (ΝΟ, με τη μορφή NO 2 - ) Προσδιορισμός επιπέδων λιπιδικής υπεροξείδωσης Εκτίμηση του βαθμού βλάβης του DNA στα αιμοκύτταρα των μυδιών (Comet Assay/Alkaline Single Cell Electrophoresis) Προσδιορισμός ποσότητας πρωτεΐνης Ανάλυση δεδομένων Στατιστική ανάλυση ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

5 3.1 Αποδόμηση της DCF μετά από επεξεργασία με υπερήχους υψηλής συχνότητας Εκτίμηση τοξικότητας της DCF πριν και μετά την επεξεργασία με υπερήχους υψηλής συχνότητας Έλεγχος βιωσιμότητας των αιμοκυττάρων με τη μέθοδο Neutral Red uptake Προσδιορισμός σουπεροξειδικών ανιόντων ( Ο 2 - ) και οξειδίων του αζώτου Προσδιορισμός προϊόντων λιπιδικής υπεροξείδωσης (MDA) Εκτίμηση του βαθμού βλάβης του DNA στα αιμοκύτταρα ΣΥΖΗΤΗΣΗ Κυτταροτοξικές, οξειδωτικές και γενοτοξικές επιπτώσεις της DFC στα αιμοκύτταρα των μυδιών- Προτεινόμενοι μηχανισμοί δράσης Κυτταροτοξικές, οξειδωτικές και γενοτοξικές επιπτώσεις της DFC στα αιμοκύτταρα των μυδιών- Πρόκληση φαινομένων μέσω της ενεργοποίησης της NADPH οξειδάσης και ΝΟ συνθετάσης Η αποτελεσματικότητα της υπερήχησης στη διάσπαση της DFC Η υπερήχηση της DFC ως μέθοδος απαλειφής των επαγόμενων κυτταροτοξικών επιπτώσεων στα αιμοκύτταρα μυδιών ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

6 ΠΡΟΛΟΓΟΣ ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η Δικλοφενάκη (DCF) αποτελεί στις μέρες μας ένα από τα ευρέως χρησιμοποιούμενα φάρμακα παγκοσμίως. Όμως, ο μη ελεγχόμενος τρόπος διαχείρισης του ως απόβλητο επιφέρει περιβαλλοντικά προβλήματα. Οι συγκεντρώσεις της DCF που καταλήγουν στα υδάτινα οικοσυστήματα είναι τοξικές για τους υδρόβιους οργανισμούς. Προτεραιότητα αποτελεί η μείωση του περιβαλλοντικού κινδύνου και των αρνητικών συνεπειών για τους έμβιους οργανισμούς μέσα από τη σωστή διαχείριση και διεξαγωγή του τρόπου αποκατάστασης του προβλήματος. Λαμβάνοντας υπόψη το γεγονός ότι η ανίχνευση του φαρμάκου στα υδάτινα οικοσυστήματα είναι ένα περιβαλλοντικό πρόβλημα η μελέτη τοξικότητας σε οργανισμούς και ο βέλτιστος τρόπος μείωσης της συγκέντρωσής του στα οικοσυστήματα παρουσιάζεται ως επιτακτική ανάγκη. 6

7 ΠΕΡΙΛΗΨΗ ΠΕΡΙΛΗΨΗ Η παρούσα μελέτη διερευνά την ικανότητα της Δικλοφενάκης (Diclofenac ή DCF, µη στεροειδή αντιφλεγμονώδης φαρμακευτική ουσία) να επάγει κυτταροτοξικές, οξειδωτικές και γενοτοξικές επιπτώσεις σε αιμοκύτταρα του µυδιού Mytilus galloprovincialis, πριν και μετά την έκθεση του φαρμάκου σε υπερήχους (US). Συγκεκριμένα, διαλύματα του DCF (αρχικού όγκου 350 και 500 ml) με συγκεντρώσεις των 2, 2,5, 5 και 10 mg L -1, υποβλήθηκαν σε διαφορετικές συνθήκες λειτουργίας υπερήχων (σε συχνότητες 582, 862 kηz και σε πυκνότητα ισχύος 133, 167W), ώστε να αξιολογηθεί η αποτελεσματικότητα της μεθόδου. Στη συνέχεια, διαλύματα της DCF, πριν και μετά από επεξεργασία με υπερήχους (σε περιβαλλοντικά ανιχνεύσιμες συγκεντρώσεις 5, 10, 100 ng L -1 και σε υψηλότερες συγκεντρώσεις 1, 10 και 20 µg L -1 ), χρησιμοποιήθηκαν για την εκτίμηση της βιωσιμότητας των αιμοκυττάρων του μυδιού με τη μέθοδο του ουδέτερου ερυθρού (Neutral Red uptake). Έπειτα προσδιορίστηκαν τα επίπεδα των σουπεροξειδικών ανιόντων ( O 2 - ), των οξειδίων του αζώτου (NO), µε την µορφή των νιτρωδών ιόντων ( ΝΟ 2 - ), καθώς και τα επίπεδα υπεροξείδωσης των µεµβρανικών λιπιδίων (µε τη µορφή της µηλονικής διαλδεϋδης ή MDA) στα εκτιθέμενα αιμοκύτταρα. Τέλος, πραγματοποιήθηκε η εφαρμογή της τεχνικής των κομητών προκειμένου να εκτιμηθούν οι γενοτοξικές επιπτώσεις της DCF. Παράλληλα, αιμοκύτταρα εκτέθηκαν σε συγκεντρώσεις της ουσίας, μετά από προ-έκθεσή τους σε ειδικούς αναστολείς της δράσης των α) NADPH οξειδάσης (DPI) και β) NO συνθετάσης (L-NAME). Τα αποτελέσματα της μελέτης έδειξαν ότι το διάλυμα του DCF με αρχικό όγκο 350 ml, αρχικής συγκέντρωσης 2 mg L -1, υπό πυκνότητα ισχύος 167 W και συχνότητα 862 kηz για 120 min είχαν την υψηλότερη αποδόμηση (>50%) σε σύγκριση με τις άλλους συνδυασμούς που δοκιμάστηκαν. Αυτό πιστοποιείται και στα πειράματα που έγινα με τα διαλύματα μετά την επεξεργασία με υπερήχους, καθότι παρουσίασαν σημαντική εξασθένηση των κυτταροτοξικών, οξειδωτικών και γενοτοξικών βλαβών. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα, η δράση της DCF μπορεί να συνδεθεί με την επαγωγή των NADPH οξειδάσης και NO συνθετάσης, ενώ καταδεικνύεται η εξασθένηση της τοξικής δράσης στα αιμοκύτταρα των μυδιών μετά από την επεξεργασία με υπερήχους. 7

8 ΠΕΡΙΛΗΨΗ ABSTRACT The present study investigates the toxic behavior of diclofenac (DCF) before and after its ultrasound (US) treatment, as well as the involvement of intracellular target molecules, such as NADPH oxidase and NO synthase, in the DCF-induced adverse effects on hemocytes of mussel Mytilus galloprovincialis. In this context, appropriate volumes (350 and 500 ml) of DCF solutions (at concentrations of 2, 2.5, 5 and 10 mg L 1 ) were treated under different ultrasound operating conditions (frequency at 582 and 862 khz, electric power density at 133 and 167 W) for assessing US method efficiency. In parallel, DCF and US DCF-mediated cytotoxic (in terms of cell viability measured with the use of neutral red uptake/nru method), oxidative (in terms of superoxide anions/ O 2, nitric oxides such as NO 2 and lipid peroxidation products, such as malondialdehyde/mda content) and genotoxic (DNA damage measured by the use of Comet assay method) effects were investigated in hemocytes exposed for 1 h to 5, 10 and 100 ng L 1 and 1, 10 and 20 g L 1 of DCF. The involvement of NADPH oxidase and NO synthase to the DCF-induced toxicity was further investigated by the use of 10 μμ M L-NAME, a NO synthase inhibitor and 10 μm DPI, a NADPH oxidase inhibitor. According to the results, 350 ml of 2 mg L 1 DCF showed higher degradation ( > 50%) under 167 W electric power density and frequency at 862 khz for 120 min, compared to degradation in all other cases, followed by a significant elimination of its toxicity. Specifically, US DCF-treated hemocytes showed a significant attenuation of DCF-mediated cytotoxic, oxidative and genotoxic effects, which appeared to be caused by NADPH oxidase and NO synthase activation, since their inhibition was followed by a significant elimination of O 2 and NO 2 generation and the concomitant oxidative damage within cells. The results of the present study showed for the first time that unspecific mode of action of DCF, associated with the induction of NADPH oxidase and NO synthase in mussel hemocytes could be significantly diminished after partial US degradation of DCF, at least under optimized operating conditions currently tested. 8

9 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1.1 Φαρμακευτικές ουσίες Ως φαρμακευτική ουσία, ορίζεται η ένωση η οποία χρησιμοποιείται με σκοπό να διαγνώσει, να αποτρέψει ή να θεραπεύσει κάποια ασθένεια, ή να εξαλείψει τον πόνο, το άγχος ή οποιαδήποτε δυσφορία, καθώς και να συμβάλλει στην καλή σωματική και νοητική λειτουργία του οργανισμού. Οι φαρμακευτικές ουσίες μπορούν να κατηγοριοποιηθούν κατά ποικίλους τρόπους, ανάλογα με την κατηγορία της ουσίας, τη θεραπευτική δράση, τον τρόπο λήψης κ.λπ. Η πιο κοινή και αποδεκτή ταξινόμηση είναι η ταξινόμηση κατά ATC (Anatomical Therapeutic Chemical classification system). Κάποιες από τις πιο κοινά χρησιμοποιούμενες κατηγορίες είναι οι εξής: Αντιπυρετικά (Antipyretics) Αναλγητικά (Analgesics) Αντιβιοτικά (Antibiotics) Αντισηπτικά (Antiseptics) Αντιπαροξυσμικά (Anticonvulsants) Στην κατηγορία των αναλγητικών φαρμακευτικών ουσιών, ανήκουν τα μη στεροειδή (NSAIDs, Non Steroids Anti-Inflammatory Drugs), όπως η Δικλοφενάκη (Diclofenac ή DCF). Γενικά τα μη στεροειδή αντιφλεγμονώδη στην καθορισμένη δοσολογία τους επιδρούν στη φλεγμονώδη επεξεργασία και, ανεξάρτητα από τον παθογενετικό μηχανισμό της τελευταίας, επιτυγχάνουν τη μείωση ή και την υποχώρηση των φλεγμονωδών φαινομένων. Ο τρόπος δράσης σχετίζεται με την αναστολή της σύνθεσης των προσταγλαδινών (δράση στο ένζυμο κυκλοοξυγενάση-cox), καθώς και δευτερευόντως την παραγωγή ελεύθερων ριζών οξυγόνου, την αναστολή μετανάστευσης των λευκών αιμοσφαιρίων, τη σταθερότητα των μεμβρανών των λυσοσωμάτων και την αναστολή των λευκοτριενίων μέσω αδρανοποίησης του κύκλου της λιπο-οξυγενάσης (Εθνικός Οργανισμός Φαρμάκων Εθνικό Συνταγολόγιο, 2007). Υπάρχουν διαφορές μεταξύ των μη στεροειδών αντιφλεγμονωδών φαρμάκων ανάλογα με τις σχετικές δράσεις τους στην COX-1 και την COX-2. Ταξινομούνται στα κλασικά NSAIDs και στους εκλεκτικούς αναστολείς της COX-2 (COX-2i). Τα 9

10 ΕΙΣΑΓΩΓΗ πρώτα αναστέλλουν την COX-1 και την COX-2, ενώ η αντιφλεγμονώδης δράση τους θεωρείται ότι οφείλεται σε αναστολή της COX Diclofenac (Diclofenac ή DCF) Το Diclofenac (δικλωφενακικό νάτριο, DCF) (Εικόνα 1) είναι ένα μη στεροειδές αντιφλεγμονώδες φάρμακο (NSAIDs), το οποίο χορηγείται για τη θεραπεία των φλεγμονών και του πόνου, κυρίως σε αρθρίτιδες και μυοσκελετικούς πόνους, σε εμπύρετες καταστάσεις, για την καταπολέμηση της ημικρανίας, μετατραυματικές φλεγμονώδεις καταστάσεις και για χρόνιους πόνους που σχετίζονται με τον καρκίνο (Bhala et al., 2013). Μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί για να μειώσει τον εμμηνορροϊκό πόνο και τη δυσμηνόρροια. Στο Ηνωμένο Βασίλειο, στην Ινδία και στις Η.Π.Α., χρησιμοποιείται ως άλας νατρίου ή καλίου, ενώ σε ορισμένες χώρες μόνο ως άλας καλίου. H DCF είναι διαθέσιμο ως ένα γενικής χρήσεως φάρμακο με διαφορετικά ονόματα. Η ποσότητα που χρησιμοποιείται σε παγκόσμιο επίπεδο είναι 940 τόνοι ετησίως (Zhang et al., 2011). Η DCF συντέθηκε για πρώτη φορά από τον Alfred Sallmann και Rudolf Pfister από την εταιρεία Ciba-Geigy (τώρα έχει μετονομαστεί σε Novartis) στο σκεύασμα Voltaren, το 1973 (Altman et al., 2015). Εμφανίζεται σε σκευάσματα gel για την καταπολέμηση εγκαυμάτων από τον ήλιο, σε ενέσιμο προϊόν, οφθαλμικές σταγόνες και δισκίων (Dutta et al., 2007). Υπάρχουν και άλλες εμπορικές ονομασίες εκτός της Voltaren, όπως Aclonac και Cataflam. Εικόνα 1. Συντακτικός τύπος του μορίου της Δικλοφενάκης (πηγή: Τα τελευταία χρόνια ένας τεράστιος αριθμός φαρμακευτικών ενώσεων υπάρχει στα υδάτινα οικοσυστήματα (Besse και Garric, 2008; Boxall et al., 2012; Gavrilescu 10

11 ΕΙΣΑΓΩΓΗ et al., 2015). Συγκεκριμένα, οι Gaw και συν. (2014) ανέφεραν πρόσφατα την παρουσία περίπου 100 φαρμακευτικών ενώσεων στα παρυδάτια οικοσυστήματα σε όλο τον κόσμο και μεταξύ αυτών αναφέρθηκε η DCF ως μία από της πλέον ανθεκτικές φαρμακευτικές ουσίες, σε συγκεντρώσεις μεταξύ ng L -1 και μg L -1, στα γλυκά και παράκτια ύδατα (Bendz et al., 2005; Fent et al., 2006; Ankley et al., 2007; Ericson et al., 2010), γεγονός που εξηγεί την ταξινόμηση της ουσίας στον κατάλογο των ουσιών προτεραιότητας της Ευρωπαϊκής Ένωσης (ουσία τάξης IIA) και χαρακτηρίζεται ως «δυνητικά επικίνδυνη ένωση, με σχετικές ανεπιθύμητες ενέργειες». Λόγω της πολικής φύσης της DCF και ιονικής μορφής του, όταν το ph=5-9 (PubChem, 2014), είναι ουσία η οποία βιοσυσσωρεύεται στους ιστούς και πρόσφατα προστέθηκε στη λίστα με ουσίες προτεραιότητας για παρακολούθηση (Οδηγία 2013/39 / ΕΕ). Η DCF αποτελεί μια ασταθή και φωτοευαίσθητη ουσία καθότι μεταβολίζεται σε παραπροϊόντα (Drillia et al., 2005; Tixier et al., 2003). Μάλιστα, σε επιφανειακά νερά φωτοδιασπάται σε μεγάλο ποσοστό δίνοντας πολλά μεταβολικά προϊόντα (Andreozzi et al, 2003). Τέτοια παραπροϊόντα αποτελούν τα 5-OH-DCF (6%), 4'-OH-DCF(16%), 3'-OH-DCF (2%), 4'-5'-diOH-DCF (10%) κ.ά. (Zang et al. 2008). 1.3 Είσοδος στο περιβάλλον και Οικολογικές επιπτώσεις Οι πηγές εισόδου διακρίνονται σε σημειακές και μη σημειακές (Jorgensen & Halling-Sorensen, 2000). Η DCF εισέρχεται στο υδάτινο οικοσύστημα λόγω της μη σωστής διαχείρισης των νοσοκομειακών αποβλήτων, αλλά και την αμεθόδευτης απόθεσης φαρμακευτικών σκευασμάτων (Plant et al., 2012) (Εικόνα 2). Η DCF και τα παραπροϊόντα που δημιουργούνται, αφαιρούνται από την επεξεργασία λυμάτων (WWTP) μόνο σε ποσοστό 17-23%, ενώ μεγάλες συγκεντρώσεις καταλήγουν σε υδάτινους πόρους (Heberer, 2002; Michael et al., 2014; Quintana et al., 2005). Επίσης, η απορρόφηση του φαρμάκου είναι μικρή σε σχέση με τη δοσολογία, με αποτέλεσμα την υψηλή περιεκτικότητα του φαρμάκου στα ούρα (35-65% με τη μορφή γλυκουρονιδών) και στα περιττώματα των ανθρώπων ή ζώων (Baranauskaitė & Dvarionienė, 2014; Plant et al., 2012). Οι συγκεντρώσεις των φαρμακευτικών σκευασμάτων/ουσιών στα λύματα κυμαίνονται από 0,001 28,4 μg L 1 (Ziylan & Ince, 2011), ενώ η παρουσία της DCF στις μονάδες βιολογικής επεξεργασίας αστικών λυμάτων και σε επιφανειακά νερά 11

12 ΕΙΣΑΓΩΓΗ έχει αναφερθεί σε διάφορες μελέτες που διενεργήθηκαν σε διάφορες χώρες (Ελβετία, Βραζιλία, Ελλάδα, Ισπανία, Γαλλία και Ιταλία) (Andreozzi et al, 2003; Buser et al, 1998; Farre et al, 2001; Stumpf et al, 1999). Ο Ternes (1998) αναφέρει ότι η μέση συγκέντρωση της ουσίας είναι περίπου 0.81 μg L -1 σε απορροές και 0.15 μg L -1 σε ποτάμια της Γερμανίας. Μετά από μακροχρόνια έρευνα σε δείγματα αστικών λυμάτων και επιφανειακών νερών στο Βερολίνο, αναγνωρίστηκε ως ένα από τα πιο σημαντικά υπάρχοντα φάρμακα στο κύκλο του νερού (Heberer et al., 2003), με συγκεντρώσεις που κυμαίνονται από 3 μg L -1 έως 2.5 μg L -1 στην είσοδο και την έξοδο των βιολογικών καθαρισμών αντίστοιχα. Εκτός της Γερμανίας, στην Ισπανία η μέση συγκέντρωση στα εισρέοντα λύματα είναι 0,4-1,5 μg L -1, ενώ στις εκροές η συγκέντρωση κυμαίνεται από 0,4 έως 1 μg L -1 (Martin et al., 2012; Santos, 2005). Αντίστοιχες μελέτες στην Αυστρία έχουν δείξει συγκεντρώσεις μεταξύ 0,905-4,114 μg L -1 και 0,780-3,434 μg L -1 αντίστοιχα (Clara et al., 2005). Η ουσία σποραδικά έχει ανιχνευθεί ακόμα και σε πόσιμο νερό σε συγκεντρώσεις ιχνοστοιχείων (Braunch et al, 2000). Τέλος αξίζει να αναφερθεί ότι παρουσιάζονται εποχιακές μεταβολές στην μετρούμενη συγκέντρωση του φαρμάκου λόγω της αύξησης της κατανάλωσής του κατά την περίοδο του χειμώνα επειδή το κρύο και η υγρασία αυξάνουν τις ρευματικές παθήσεις. 12

13 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Εικόνα 2. Κύριες ροές φαρμακευτικών ουσιών στο περιβάλλον (πηγή: Gao L. et al., 2012). Αν και οι επιπτώσεις στον άνθρωπο είναι ελάχιστες, η παρουσία της DCF στο περιβάλλον έχει αρνητικές συνέπειες για τους υδρόβιους οργανισμούς, μιας και αρκετές μελέτες έδειξαν την πρόκληση τοξικότητας σε ψάρια, οστρακόδερμα και φύκη. Λόγω της πολικής φύσης της η ουσία DCF παρουσιάζει βιοσυσσωρευτικά φαινόμενα στους ιστούς των υδρόβιων οργανισμών (Meredith-Williamset al., 2012; McEneff et al., 2014), όπως στους νεφρούς και στο ήπαρ ψαριών, αλλά και στους ιστούς των δίθυρων μαλακίων, όπως τα μύδια (Bueno et al., 2013; Ericson et al., 2010; Klosterhaus et al., 2013; Li et al., 2012; McEneff et al., 2014; Schwaiger et al., 2004). Συγκεκριμένα, έχει αναφερθεί ότι 5 μg L -1 της ουσίας μπορεί να προκαλέσουν σοβαρές νεφρικές βλάβες σε ψάρια και αλλοιώσεις των βραγχιακών δομών, καθώς και καθυστέρηση της εκκόλαψης των αυγών (Parolini et al., 2011) ή ακόμα μη φυσιολογικό σχηματισμό εμβρύου (Chen et al., 2014). Πειράματα έκθεσης 21 ημερών του είδους Oncorhynchus mykiss σε DCF (συγκέντρωση DCF 0,5 έως 50 μg L -1 ) έδειξαν σημαντική μείωση του αιματοκρίτη (Schwaiger et al., 2004; Triebskorn et al., 2004; Triebskorn et al., 2007), καθώς και συμπτώματα φλεγμονής στα βράγχια, 13

14 ΕΙΣΑΓΩΓΗ τους νεφρούς και το ήπαρ, χωρίς ωστόσο να υποδεικνύεται κάποια δοσο-εξαρτώμενη σχέση (Parolini et al. 2010; Parolini et al. 2011). Παρόμοια αποτελέσματα έχουν προκύψει και σε μελέτες ασπόνδυλων (Fent et al., 2006; McEneff et al., 2014). Το παράδειγμα της Ινδίας Ένα πρόσφατο γεγονός καταγράφεται στη Ινδία, όπου της DCF χορηγούνταν ως κτηνοτροφική θεραπεία στις αγελάδες. Όμως λόγω δηλητηρίασης πέθαναν, και τα εκτεθειμένα πτώματα καταναλώθηκαν από γύπες. Αποτέλεσμα αυτού ήταν ο πληθυσμός των γυπών της Ινδίας να μειωθεί 95% έως το 2003 (Oaks et al., 2004) και 99,9% έως το 2008 (Naidoo & Swan et al., 2008) είτε λόγω νεφρικής ανεπάρκειας είτε άμεσης αναστολής της έκκρισης ουρικού οξέος των γυπών. Η έντονη μείωση γυπών παρουσίασε έντονη αύξηση πληθυσμού σκύλων (Canis familiaris) οι οποίοι εμφάνισαν ασθένειες (Swan et al., 2006). Παρατηρείται δηλαδή το φαινόμενο της βιοσυσσώρευσης εντός τροφικών αλυσίδων, η κατάρρευση και αστάθεια αυτών, τα οποία δείχνουν σοβαρά περιβαλλοντικά θέματα. Παρόμοιο συμβάν καταγράφηκε και με αετούς της στέπας (Aquila nipalensis) το 2014 με την DCF να βιοσυσσωρεύεται στους ιστούς των αετών μετά από κατάποση πτωμάτων άλλων ζώων και μείωση του πληθυσμού τους. 1.4 Σύστημα υψηλής συχνότητας υπερήχων Η αύξηση των περιβαλλοντικά ανιχνεύσιμων φαρμακευτικών ουσιών, σε συνδυασμό με τον περιβαλλοντικό κίνδυνο που εγκυμονούν, ανέδειξε την ανάγκη ανάπτυξης και εφαρμογής κατάλληλων μεθόδων επεξεργασίας των αποβλήτων. Συγκεκριμένα, τις τελευταίες δεκαετίες έχουν αναπτυχθεί και εφαρμόζονται σταδιακά εξειδικευμένες/προηγμένες οξειδωτικές διαδικασίες (advanced oxidation process - ΑΟΡ) διαφόρων ρυπογόνων ουσιών, προκειμένου να μειωθεί η συγκέντρωση και οι περιβαλλοντικές επιπτώσεις τους (Adewuyi, 2005; David, 2009; Matouq et al., 2008; Virkutyte & Rokhina, 2010). Παρόλα αυτά, οι συγκεκριμένες διαδικασίες παρουσιάζουν κάποια μειονεκτήματα, όπως η ανασταλτική δράση ορισμένων τοξικών ουσιών που μπορεί να οδηγήσει σε μείωση της αποτελεσματικότητάς τους, το υψηλό κόστος, η αργή απόδοση κτλ. (Adewuyi, 2005; Jones et al., 2005; Stackelberg et al., 2004; Ternes et al., 2002). 14

15 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Μια από τις προηγμένες διαδικασίες οξείδωσης (AOPs) είναι η επεξεργασία με υπερήχους υψηλής συχνότητας (ultrasound-us) (Mahamuni και Adewuyi, 2010), σε συνδυασμό με επιπρόσθετες ουσίες κατάλυσης (Mendez-Arriaga et al., 2008; Naddeo et al., 2009a, 2009b, 2010) ή με άλλες διαδικασίες AOPs (Hartmann et al, 2008; Manariotis et al, 2011; Mendez-Arriaga et al, 2008; Naddeo et al, 2009a, 2009b, 2010; Perez-Estrada et al., 2005). Οι υπέρηχοι έχουν χρησιμοποιηθεί για τη διάσπαση πολλών οργανικών κι ανόργανων ενώσεων συμπεριλαμβανόμενων των μετάλλων, των PAHs (Dailianis et al., 2014; Manariotis et al., 2011) και των PhCs (Aguirre- Martínezet al., 2013), διαδικασία που στηρίζεται στη δημιουργία κοιλώματος στο υδατικό διάλυμα όπου και σχηματίζονται φυσαλίδες υψηλής ενέργειας, μέσω των οποίων πραγματοποιείται η διάσπαση χημικών δεσμών (Suslick, 1990). 1.5 Επεξεργασία του DCF με υπερήχους (US) H εφαρμογή υπερήχων ως διαδικασία διάσπασης της DCF, μπορεί να οδηγήσει στη μερική διάσπαση της ουσίας και την εμφάνιση ενδιάμεσων μεταβολιτών/παραπροϊόντων (Madhavan et al., 2010; Naddeo et al., 2010). Τα ενδιάμεσα προϊόντα που έχουν καταγραφεί και επιβεβαιωθεί κατά την επεξεργασία με υπερήχους είναι το 4-OH DCF και το 5-OH DCF (Hartmann et al., 2008; Madhavan et al., 2010; Sein et al., 2008; Ziylan et al., 2014). Επίσης υπάρχουν και χλωριωμένα όπως το 2,6-διχλωροανιλίνης (2,6-dichloroaniline) (Calza et al., 2006). Oι Michael και συν. (2014) τα ονόμασαν και τα ομαδοποίησαν σε πολλαπλούς τύπους (ΤΡ 1-7) και οι Zylian και συν. (2014) τα κατηγοριοποίησαν με βάση την σειρά εμφάνισής τους σε σχέση με τον χρόνο επεξεργασίας με υπερήχους (D1-10). Αντίστοιχα οι Nie et al., 2014 έδειξαν ότι υπάρχουν δύο πιθανά μονοπάτια δημιουργίας μεταβολιτών της DCF και τελική μείωσης της συγκέντρωσής του μετά από υπερήχηση 80 min. 1.6 Δίθυρα μαλάκια μύδια- Το είδος Mytilus galloprovincialis Το γένος Mytilus, το οποίο ανήκει στην ομοταξία των δίθυρων μαλακίων, θεωρείται πως εμφανίστηκε για πρώτη φορά πριν από 1-2 εκατομμύρια χρόνια (Seed, 1976) και περιλαμβάνει τα είδη M. galloprovincialis, M. edulis, M. trossulus και M. californianus (Gosling, 1992) (Πίνακας 1). To Mytilus galloprovincialis, ή αλλιώς μεσογειακό μύδι (Mediterranean Mussel), αποτελεί γηγενές είδος μυδιού της 15

16 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Μεσογείου και της Μαύρης Θάλασσας (Chintiroglοu et al., 1999; Gosling, 1992), το οποίο όμως πλέον έχει σχεδόν παγκόσμια εξάπλωση. Έχει εξαπλωθεί με επιτυχία σε διάφορες περιοχές στο βόρειο και νότιο ημισφαίριο, κυρίως σε περιοχές με εύκρατο κλίμα (Branch και Stephanni, 2004) (Εικόνα 3). Πίνακας 1. Επιστημονική ταξινόμηση του είδους Mytilus galloprovincialis. Επιστημονική Ταξινόμηση Επικράτεια Eykaryota Βασίλειο Animalia Φύλο Mollusca Κλάση Bivalvia Τάξη Mytiloida Οικογένεια Mytilidae Γένος Mytilus Είδος M. galloprovinciallis Διωνυμικό Όνομα Mytilus galloprovincialis (Lamarck, 1819) Εικόνα 3. Γεωγραφική εξάπλωση του Mytilus galloprovincialis (πηγή: Mytilus_galloprovincialis.jpg). 16

17 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Τα μύδια έχουν περιορισμένη ικανότητα μετακίνησης και ζουν προσκολλημένα στο υπόστρωμα βραχωδών ακτών (μέση και κατώτερη παλιρροιακή ζώνη), σχηματίζοντας μεγάλους πληθυσμούς. Πρόκειται για ευρύαλους οργανισμούς, ανθεκτικούς στην επίδραση της παλίρροιας και του υψηλής ενέργειας κυματισμού. Είναι αμφιπλευροσυμμετρικοί οργανισμοί, των οποίων οι θυρίδες είναι πλευρικά συμπιεσμένες. Οι θυρίδες ενώνονται στο άνω μέρος μέσω ενός ελαστικού συνδέσμου που αποτελείται από κερατίνη και ανοιγοκλείνουν με τη βοήθεια δύο προσαγωγών μυών. Το όστρακο που τους περιβάλλει είναι μαύρο με λεπτομέρειες ανοιχτού υποκυανού, ενώ πάνω τους υπάρχουν παράλληλες εγκάρσιες γραμμές, οι οποίες υποδηλώνουν τη διαδοχική εποχική αύξηση του οστράκου (Εικόνα 4, 5). Εικόνα 4. Τυπική μορφή του είδους Mytilus galloprovincialis. 17

18 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Εικόνα 5. Το είδος Mytilus galloprovincialis με ανοιχτές θυρίδες (πηγή: και εσωτερική οργάνωση των μυδιών (πηγή: Τσαρπαλή Β.). Εσωτερικά του οστράκου βρίσκεται το μαλακό σώμα του μυδιού, το οποίο στερείται κεφαλής και αποτελείται από τη σπλαχνική μάζα και το πόδι. Η σπλαχνική μάζα αποτελείται από μια τρίχωρη καρδιά, δύο ζεύγη βραγχίων, τους γεννητικούς αδένες και το πεπτικό σύστημα (πεπτικός αδένας ή ηπατοπάγκρεας). Το πόδι συμβάλλει στην κίνηση του οργανισμού, ενώ παράλληλα περιλαμβάνει τον βυσσογόνο αδένα, ο οποίος εκκρίνει τα βυσσογόνα νημάτια με τη βοήθεια των οποίων το μύδι παραμένει προσκολλημένο στα βράχια. Το μέγεθος του μυδιού ποικίλλει ανάλογα με την ηλικία και την περιοχή διαβίωσης, και παρότι μπορεί να φτάσει μέχρι και τα 15 cm, συνήθως στα ενήλικα άτομα δεν ξεπερνά τα 8 cm (Εικόνα 5). Ως διηθηματοφάγοι οργανισμοί προσλαμβάνουν την τροφή μέσω ενός προσαγωγού σιφωνίου (Bayne et al., 1986), ενώ στη συνέχεια μεταφέρουν την τροφή στον γαστρεντερικό σωλήνα με συνδυασμένες κινήσεις των βλεφαρίδων των βραγχίων και των χειλικών προσακτρίδων της μανδυακής κοιλότητας. Στον πεπτικό αδένα, πραγματοποιείται η απορρόφηση θρεπτικών μορίων που εισέρχονται με ενδοκύττωση στα πεπτικά κύτταρα, καθώς και η απέκκριση των άχρηστων προϊόντων 18

19 ΕΙΣΑΓΩΓΗ της ενδοκυτταρικής πέψης, η σύνθεση ενζύμων για την εξωκυτταρική πέψη και η διαδικασία αποτοξικοποίησης διαφόρων ρύπων. Παράλληλα, εκτός από την πρόσληψη της τροφής, χρησιμοποιούν τα βράγχιά τους για την ανταλλαγή των αερίων. Το γεγονός ότι διηθούν το νερό, τα καθιστά ευάλωτα σε ξενοβιοτικές ουσίες που βρίσκονται στο νερό, και οι οποίες εύκολα συσσωρεύονται στα βράγχια και τον πεπτικό αδένα τους Το είδος Mytilus galloprovincialis και η χρήση του σε οικοτοξικολογικές μελέτες Τα είδη του γένους Mytilus χρησιμοποιούνται ευρέως τόσο σε εργαστηριακό επίπεδο, όσο και στο πεδίο για την μελέτη των εν δυνάμει τοξικών επιπτώσεων διαφόρων ρύπων (Cevik et al., 2008; Danellakis et al., 2011; De Lafontaine et al., 2000; Giannapas et al., 2012; Krishnakumar et al., 1994; Regoli and Orlando, 1994; Viarengo et al., 1997), λόγω μιας πλειάδας πλεονεκτημάτων και ιδιαίτερων χαρακτηριστικών, όπως περιληπτικά αναφέρονται παρακάτω (Philips, 1980; Surenda et al., 2011; Widdows, 1985): Τα μύδια διηθούν καθημερινά μεγάλες ποσότητες νερού για να καλύψουν τις διατροφικές τους ανάγκες. Μέσω της διήθησης λαμβάνει χώρα η πρόσληψη των ρυπογόνων ουσιών που βρίσκονται διαλυμένες στο νερό, και η αποθήκευση των ουσιών αυτών στους ιστούς τους. Τα μύδια, συγκριτικά με άλλους οργανισμούς, εμφανίζουν χαμηλό επίπεδο ενζυμικής δραστικότητας των συστημάτων που μπορούν να μεταβολίζουν ρύπους. Οι συγκεντρώσεις των ρύπων στους ιστούς απεικονίζουν τον βαθμό επιβάρυνσης των υδάτων, ενώ παράλληλα προσφέρουν χρήσιμες πληροφορίες για την βιολογική διαθεσιμότητα των ρυπογόνων ουσιών. Χαρακτηρίζονται από μεγάλη εξάπλωση. Ο σχηματισμός μεγάλων και σταθερών πληθυσμών παρέχει τη δυνατότητα επαναλαμβανόμενων δειγματοληψιών και μακροχρόνιας παρακολούθησης του υδάτινου περιβάλλοντος. Η περιορισμένη ικανότητα μετακίνησής τους καθ όλη τη διάρκεια της ζωής τους καθιστά αντιπροσωπευτικούς οργανισμούς των φυσικοχημικών και των περιβαλλοντικών παραμέτρων της κάθε περιοχής. Χαρακτηρίζονται από μεγάλη ανοχή σε πολλά είδη ρύπων. 19

20 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Συλλέγονται εύκολα. Η συντήρησής τους σε εργαστηριακές συνθήκες είναι ευκολότερη και με χαμηλότερο κόστος, σε σχέση με την συντήρηση άλλων οργανισμών βιοενδεικτών, όπως τα ψάρια. Προσφέρουν ικανοποιητικές ποσότητες ιστών για ανάλυση. Υπάρχει η δυνατότητα μεταφοράς και διατήρησης πληθυσμών σε άλλες περιοχές, προκειμένου να πραγματοποιηθεί έλεγχος της θαλάσσιας ρύπανσης. Αποτελούν μέρος της ανθρώπινης διατροφής, και συνεπώς έκθεση των οργανισμών αυτών σε ρυπογόνες ουσίες θέτει σε κίνδυνο την ανθρώπινη υγεία Κυκλοφορικό σύστημα μυδιών Η πρόσληψη τροφής μέσω διήθησης των δίθυρων μαλακίων, τα καθιστά εκτεθειμένα σε πολλούς μικροβιακούς παράγοντες και ρύπους και γι αυτό έχουν αναπτύξει τόσο χυμικούς όσο και κυτταρικούς μηχανισμούς άμυνας με εξαιρετική αποτελεσματικότητα. Συγκεκριμένα, τα δίθυρα μαλάκια έχουν ένα «ανοιχτό» κυκλοφορικό σύστημα στο οποίο η αιμόλεμφος, και τα έμμορφα συστατικά της, τα αιμοκύτταρα, περνώντας έξω από τα ανοικτά άκρα των αρτηριών, λούζει όλα τα όργανα και επιστρέφει στην καρδιά μέσω των κόλπων και των αναπνευστικών δομών (βράγχια). Το υγρό μέρος αναφέρεται ως πλάσμα ή ορός της αιμολέμφου και αποτελεί τη χυμική άμυνα του ανοσοποιητικού συστήματος των μαλακίων, περιλαμβάνοντας λυσοσωμικά ένζυμα (όπως β-γλυκουρονιδάση, όξινη και αλκαλική φωσφατάση, λιπάση, αμινοπεπτιδάση και λυσοζύμη), διαλυτές λεκτίνες και αντιμικροβιακά πεπτίδια, που βοηθούν στην αναγνώριση των παθογόνων μικροοργανισμών και σωματιδίων μέσω σήμανσης για την καταστροφή τους ή την άμεση θανάτωση τους (Anderson, 1996; Canesi et al., 2002; Leclerc, 1996; Paul, 2003; Prieur et al., 1990; Tiscar & Mosca, 2004; Vasta & Ahmed, 2008). Τα κύτταρα της αιμολέμφου, που ονομάζονται αιμοκύτταρα, διαδραματίζουν κεντρικό ρόλο στην ανοσολογική απόκριση των δίθυρων μαλακίων. Τα αιμοκύτταρα εμπλέκονται σε διάφορες φυσιολογικές λειτουργίες. Συγκεκριμένα, το πλάσμα φέρει βιομόρια, τα οποία έχουν την ικανότητα να εντοπίζουν τις ξενοβιοτικές ουσίες και τους παθογόνους μικροοργανισμούς και να ενεργοποιούν τους μηχανισμούς εξουδετέρωσής τους (Canesi et al., 2002; Leclerc, 1996; Prieur et al., 1990; Renwrantz, 1990; Schneeweib & Renwrantz, 1993). Παράλληλα, τα αιμοκύτταρα 20

21 ΕΙΣΑΓΩΓΗ έχουν την ικανότητα να συμβάλλουν στην επούλωση των πληγών, τον σχηματισμό και επισκευή του οστράκου, την πέψη και μεταφορά των θρεπτικών συστατικών, την απέκκριση, την εσωτερική άμυνα, καθώς και σε διαδικασίες αποτοξικοποίησης (Beninger et al., 2003; Canesi et al., 2002; Cheng, 1981; Fisher et al., 2004; Mount et al., 2004). Τα αιμοκύτταρα αποτελούν το σημαντικότερο μηχανισμό άμυνας των μαλακίων και χρησιμοποιούνται ευρύτατα σε περιβαλλοντικές και εργαστηριακές μελέτες εκτίμησης των βλαβερών επιπτώσεων διάφορων ξενοβιοτικών ουσιών του περιβάλλοντος. Κυρίως είναι υπεύθυνα για την κυτταροφαγία των παρασίτων, των παθογόνων ουσιών και ξένων σωματιδίων, η οποία περιλαμβάνει μια σύνθετη διαδικασία, όπως η αναγνώριση, η πρόσφυση, η εγκόλπωση και η καταστροφή των ξένων κυττάρων ή υλικών (Sokolova et al., 2009). Τα αιμοκύτταρα συμμετέχουν επίσης στην απευθείας εξουδετέρωση εξωγενών παραγόντων μέσω της αντίδρασης της αναπνευστικής έκρηξης, δηλαδή της άμεσης παραγωγής δραστικών ριζών οξυγόνου (ROS), όπως το σουπεροξειδικό ανιόν (. Ο - 2 ), μέσω του ενζύμου της NADPH οξειδάσης, και νιτρικών οξειδίων (NO), μέσω ενεργοποίησης της ΝΟ συνθετάσης. Οι ROS μπορούν να μετατραπούν περαιτέρω, από τη μυελοϋπεροξειδάση των αιμοκυττάρων, σε υποχλωριώδες οξύ (HOCl), που έχει ισχυρές αντιβακτηριδιακές και αντιικές ιδιότητες (Tiscar & Mosca, 2004). Έχουν βρεθεί δύο τύποι κυττάρων αιμολέμφου, τα υαλινοκύτταρα και τα κοκκιοκύτταρα (Garcia-Garcia et al., 2008; Parisi et al., 2008). Τα υαλινοκύτταρα είναι μη-κοκκώδη κύτταρα που φέρουν έναν μεγάλο κεντρικό πυρήνα που περιβάλλεται από σχετικά μικρή ποσότητα κυτταροπλάσματος και εμφανίζουν χαρακτηριστικά αδιαφοροποίητων κυττάρων. Τα κοκκιοκύτταρα είναι διαφοροποιημένα, μεγαλύτερα κύτταρα με μικρότερο πυρήνα και κυτταροπλασματικά κοκκία. Επιπλέον, έχουν μεγαλύτερη ικανότητα εξάπλωσης και δημιουργίας ψευδοποδίων. Όπως έχει αναφερθεί σε πολλά είδη διθύρων μαλακίων, η ικανότητα φαγοκυττάρωσης των υαλινοκυττάρων είναι μικρότερη από αυτή των κοκκιοκυττάρων (Goedken et al., 2004; Le Foll et al., 2010), με τα υαλινοκύτταρα να μην έχουν συνδεθεί με κάποια συγκριμένη λειτουργία, πέραν της συμμετοχής τους στην αιμόσταση και στην παραγωγή εξωκυττάριου στρώματος κατά τη διάρκεια της επούλωσης τραυμάτων (Suzuki et al., 1991; Suzuki & Funakoshi, 1992). Τα κοκκιοκύτταρα αποτελούν τον κύριο τύπο αιμοκυττάρων που εμπλέκονται στην κυτταρική ανοσολογική άμυνα των διθύρων μαλακίων (Donaghy et al., 2011; Terahara et al., 2006). Τα κοκκιοκύτταρα είναι πλούσια σε λυσοσώματα, που 21

22 ΕΙΣΑΓΩΓΗ αποτελούν πολύ-λειτουργικά κυτταρικά οργανίδια που περιέχουν υδρολάσες. Αυτές οι υδρολάσες εκκρίνονται στον ορό, ως μέρος του αμυντικού μηχανισμού έναντι ξένων παθογόνων σωμάτων (Cajaraville et al., 1995), εμπλέκονται στην ενδοκυττάρια πέψη των τροφών και των μακρομορίων, καθώς και στη συσσώρευση και στη δέσμευση ξενοβιοτικών ουσιών και μετάλλων (Moore et al., 1988). Επομένως, τα κοκκιοκύτταρα είναι ο κύριος τύπος κυττάρων που εμπλέκονται στην παραγωγή ελεύθερων ριζών οξυγόνου (ROS) ενάντια σε εξωγενή σωματίδια και διαλυτούς παράγοντες (Cajaraville et al., 1994; Pipe, 1992; Takahashi et al., 1993) Επαγωγή οξειδωτικής καταπόνησης (οξειδωτικό stress) και μηχανισμοί άμυνας στα Δίθυρα μαλάκια Έχουν περιγραφεί δύο μηχανισμοί άμυνας στα αιμοκύτταρα των δίθυρων μαλακίων κατά την εισαγωγή ξένων σωμάτων στον οργανισμό (Carballal et al., 1997; Renwrantz, 1990). Ο πρώτος μηχανισμός περιλαμβάνει την παραγωγή λυσοσωμικών ενζύμων και λυσινών (Cheng, 1981), και ο δεύτερος τη διαδικασία της αναπνευστικής έκρηξης, που περιλαμβάνει την απελευθέρωση δραστικών μορφών οξυγόνου (ROS), όπως τα σουπεροξειδικά ανιόντα (. Ο 2 - ) (Noel et al., 1993; Winston et al., 1996), καθώς και οξείδια του αζώτου (ΝΟ) (Arumugam et al., 2000; Conte et al., 1995; Franchini et al., 1995; Gourdon et al., 2001; Padgett et al., 1992). Σε ότι αφορά στον δεύτερο μηχανισμό γνωρίζουμε ότι κάθε άτομο ή μόριο που φέρει τουλάχιστον ένα ασύζευκτο ηλεκτρόνιο στην εξωτερική ηλεκτρονική στιβάδα ονομάζεται ελεύθερη ρίζα (Halliwell & Gutteridge, 1990). Οι ελεύθερες ρίζες είναι ιδιαίτερα δραστικές μορφές, καθώς τα ασύζευκτα ηλεκτρόνια της εξωτερικής στιβάδας έχουν την τάση να συζευχθούν με άλλα ασύζευκτα ηλεκτρόνια. Μία κατηγορία των ελεύθερων ριζών, η οποία παρουσιάζει μεγάλο ενδιαφέρον είναι οι ελεύθερες ρίζες οξυγόνου και συγκεκριμένα οι δραστικές μορφές του (Δραστικές μορφές οξυγόνου/reactive Οxygen Species, ROS). Οι ROS περιλαμβάνουν ελεύθερες ρίζες, όπως η ρίζα υδροξυλίου ( ΟΗ), και ιόντα όπως τα OCl -, ONO 2 -, OH -, συνδυασμό ελεύθερων ριζών και ιόντων, όπως το σουπεροξειδικό ανιόν ( Ο 2 - ) και μόρια, όπως το Η 2 Ο 2 (Εικόνα 6). 22

23 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Εικόνα 6. Ηλεκτρονική δομή συνηθισμένων δραστικών μορφών οξυγόνου (πηγή: Η ενδοκυτταρική παραγωγή ROS είναι φυσιολογική, καθώς σε μικρές συγκεντρώσεις συμβάλλουν στην ορθή λειτουργία του κυττάρου. Τα επίπεδά τους ρυθμίζονται μέσω κατάλληλων αντιοξειδωτικών μηχανισμών, ενώ αδυναμία των τελευταίων να τις εξουδετερώσουν μπορεί να οδηγήσει σε ανεξέλεγκτη αύξηση των ROS στον οργανισμό και στην πρόκληση οξειδωτικής καταπόνησης ή stress (Davies, 1995). Το οξειδωτικό stress έχει συσχετιστεί με την επαγωγή σοβαρών βλαβών στον οργανισμό, όπως η λιπιδική υπεροξείδωση, η βλάβη στο γενετικό υλικό και η διαταραχή στη φυσιολογική λειτουργία των πρωτεϊνών. Έχει βρεθεί ότι πολλές κατηγορίες περιβαλλοντικών ρύπων μπορούν να προκαλέσουν ενδοκυτταρική παραγωγή ROS και να προκαλέσουν την επαγωγή αυτού του φαινομένου (Winston & Di Giulio, 1991). Η βιοχημική βάση της αναπνευστικής έκρηξης έγκειται στην ενεργοποίηση των διαμεμβρανικών ενζύμων NADPH οξειδάση και ΝΟ συνθετάση (Εικόνα 7). Η NADPH οξειδάση καταλύει την οξείδωση του μοριακού οξυγόνου σε σουπεροξειδικό ανιόν ( Ο 2 - ), το οποίο μπορεί έπειτα να μετατραπεί σε υπεροξείδιο του υδρογόνου (Η 2 Ο 2 ) από το ένζυμο σουπεροξειδική δισμουτάση (SOD). Όμως, το H 2 O 2 μπορεί να αντιδράσει με δισθενή σίδηρο και να παραχθεί μια εξαιρετικά δραστική ρίζα, η ρίζα υδροξυλίου (ΟΗ - ), η οποία έχει την ικανότητα να αποσπά ένα υδρογόνο από τα βιομόρια του οργανισμού, προκαλώντας σημαντικές βλάβες, όπως είναι η λιπιδική υπεροξείδωση (Vlachogianni & Valavanidis, 2011). Επιπλέον, το Ο 2 - μπορεί να μετατραπεί σε υδροξυπεροξειδική ρίζα ( ΗΟ 2 ), η οποία επίσης παρουσιάζει 23

24 ΕΙΣΑΓΩΓΗ μεγαλύτερη δραστικότητα από το Ο - 2 και μπορεί επίσης να προσβάλλει βιολογικές μεμβράνες και λιπίδια χαμηλής πυκνότητας (LDL), συμβάλλοντας στην έναρξη της λιπιδικής υπεροξείδωσης (Bedwell et al., 1989). Η παραγωγή Ο - 2 έχει συσχετιστεί με την έκθεση υδρόβιων οργανισμών σε περιβαλλοντικούς ρύπους και την επαγωγή φαινομένων οξειδωτικής καταπόνησης (Dailianis, 2009; Livingstone, 2001) (Εικόνα 7). Από την άλλη το ΝΟ συντίθεται από ένα σύνολο ενζύμων, που γενικά ονομάζονται ΝΟ συνθετάσες. Η λεγόμενη επαγώγιμη μορφή ή inos φαίνεται να είναι ο κύριος υπεύθυνος για τη σύνθεση ΝΟ στα μακροφάγα (Prabhkar et al., 1997) και στα αιμοκύτταρα των μυδιών (Conte and Ottaviani, 1995; Franchini et al., 1995). - Εικόνα 7. Παραγωγή σουπεροξειδικών ανιόντων Ο 2 και άλλων ROS με την επίδραση ξενοβιοτικών ουσιών (πηγή: metabolomics/enzyme-explorer/cell-signaling-enzymes/superoxide- dismutase.html). Το NO παρουσιάζει σημαντική δράση, προστατεύοντας τα κύτταρα από οξειδωτικές βλάβες και εξουδετερώνοντας τις ελεύθερες ρίζες (Fang, 1997). Παρόλα αυτά, η υπερδιέγερση της NO συνθετάσης, παρουσία υψηλών συγκεντρώσεων. O - 2, έχει ως συνέπεια την παραγωγή υδροξυλικών ριζών (HO ) και υπεροξυνιτρικών 24

25 ΕΙΣΑΓΩΓΗ [ONOO ], μία πιο σταθερή ρίζα με εντονότερη αντιβακτηριακή δράση (Gonzalez- Parraga et al., 2003; Rosen et al., 1995; Thorpe et al., 2004). Πολλές κατηγορίες περιβαλλοντικών ρύπων μπορούν να προκαλέσουν την ενδοκυτταρική παραγωγή ROS, όπως διάφορα μέταλλα μέσω της αντίδρασης Fenton (Fe +2 /H 2 O 2, περιλαμβάνουν την αντίδραση οργανικών ενώσεων παρουσία υπεροξειδίου του υδρογόνου και ιόντων σιδήρου διαμέσου σχηματισμού ριζών υδροξυλίου και σε συνθήκες απουσίας φωτός) και αρκετές οργανικές ουσίες που μεταβολίζονται, παράγοντας ρίζες οξυγόνου (Winston & Di Giulio, 1991). Η ανισορροπία που δημιουργείται μεταξύ της παραγωγής των ROS και της εξουδετέρωσής τους από τους αντιοξειδωτικούς μηχανισμούς των κυττάρων ονομάζεται οξειδωτικό stress (Davies, 1995). Το οξειδωτικό stress έχει μελετηθεί αρκετά, τόσο σε χερσαίους όσο και σε υδρόβιους οργανισμούς (Ames et al., 1993; Imlay and Linn, 1988; Livingstone, 2001; Stadtman and Berlett, 1997) Παραγωγή σουπεροξειδικών ανιόντων ( Ο 2 - ) Κατά την είσοδο παθογόνων μικροοργανισμών ή ξένων σωματιδίων στον οργανισμό, τα φαγοκύτταρα παράγουν δραστικές μορφές οξυγόνου, όπως το σουπεροξειδικό ανιόν (Εικόνα 8), μέσω την αναπνευστικής έκρηξης, προκειμένου να εξουδετερώσουν τα ξένα σωματίδια πριν προκαλέσουν κυτταρικές βλάβες (Noel et al., 1993; Winston et al., 1996). Όπως προαναφέρθηκε κατά τη διαδικασία της αναπνευστικής έκρηξης η NADPH οξειδάση καταλύει την οξείδωση του μοριακού οξυγόνου σε σουπεροξειδικό ανιόν. Το ανιόν του σουπεροξειδίου είναι ιδιαίτερα σημαντικό, καθώς το προϊόν του από την αναγωγή του οξυγόνου από ένα e - σχηματίζει την ρίζα σουπεροξειδίου (Ο 2 - ). Επομένως μπορεί να ενεργήσει ως οξειδωτικό μέσο (και μερικές φορές ως αναγωγικό μέσο), πιθανότατα όμως να είναι περισσότερο επιβλαβής, λόγω του σχηματισμού υπεροξειδίου του υδρογόνου και ριζών υδροξυλίου που ακολουθούν (Elstner, 1987; Halliwell & Gutteridge, 1999). 25

26 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Εικόνα 8. Κατά Lewis διαμόρφωση ηλεκτρονίων των σουπεροξειδίων. Τα έξι εξωτερικά ηλεκτρόνια κάθε ατόμου οξυγόνου είναι μαύρου χρώματος. Ένα ζεύγος μοιράζεται στην μέση. Το ασύζευκτο ηλεκτρόνιο και το επιπρόσθετο ηλεκτρόνιο παρέχει το αρνητικό φορτίο (κόκκινο χρώμα) (πηγή: Παραγωγή οξειδίων του αζώτου ( ΝΟ) Τα ΝΟ παίζουν σημαντικό ρόλο σε μία ποικιλία βιολογικών διεργασιών, συμπεριλαμβανομένου της ομοιόστασης, της πίεσης, της ανοσορύθμισης (αμυντικών μηχανισμών), καθώς και στο μηχανισμό σηματοδότησης των κυττάρων. Τα ΝΟ είναι πολύ ασταθή και έχουν χρόνο ημίσιας ζωής μόνο 1 έως 40 δευτερόλεπτα. Η ταχεία αποικοδόμηση τους σε άλλες ενώσεις οξειδίου του αζώτου καθιστά δύσκολο τον ακριβή προσδιορισμό τους. Η ποσοτικοποίηση των ΝΟ σε βιολογικά δείγματα παρέχει πολύτιμες πληροφορίες όσον αφορά την in vivo παραγωγή τους, τη βιοδιαθεσιμότητα και το μεταβολισμό τους (Bryan & Grisham, 2007). Τα ΝΟ οξειδώνονται σε νιτρώδη (ΝΟ 2 -, είναι σταθερό και μη πτητικό προϊόν διάσπασης της ΝΟ) και σε νιτρικά (ΝΟ 3 - ), η συγκέντρωση των οποίων μπορεί να προσδιοριστεί Πρόκληση λιπιδικής υπεροξείδωσης στα αιμοκύτταρα Οι βιολογικές μεμβράνες αποτελούνται από λιπίδια και πρωτεΐνες, η αναλογία των οπoίων διαφέρει ανάλογα με τις βιολογικές λειτουργίες που επιτελούν. Τα λιπίδια αποτελούνται από λιπαρά οξέα, ακυλογλυκερόλες, γλυκεροφωσφολιπίδια και στεροειδή (Halliwell & Gutteridge, 1999). Τα γλυκεροφωσφολιπίδια, τα οποία αποτελούνται από εστέρες της γλυκερόλης με φωσφορικό οξύ και λιπαρά οξέα (πολυακόρεστα λιπαρά οξέα, PUFAs) αφθονούν στις κυτταρικές μεμβράνες των ζωικών οργανισμών. Κατά τη διαδικασία του οξειδωτικού stress, οι ελεύθερες ρίζες αφαιρούν ένα υδρογόνο από τα PUFAs προκαλώντας την υπεροξείδωση των λιπιδίων. Η 26

27 ΕΙΣΑΓΩΓΗ υπεροξείδωση λιπιδίων είναι η διαδικασία κατά την οποία ελεύθερες ρίζες «κλέβουν» ηλεκτρόνια από τα λιπίδια στις κυτταρικές μεμβράνες, με αποτέλεσμα την καταστροφή των κυττάρων. Αυτή η διαδικασία εξελίσσεται με ένα μηχανισμό αλυσιδωτής αντίδρασης, κατά τον οποίο επηρεάζονται πολυακόρεστα λιπαρά οξέα με πολλαπλούς διπλούς δεσμούς (π.χ. ομάδες μεθυλενίου, -CH 2 -) (Εικόνα 9). Τα τελικά προϊόντα της λιπιδικής υπεροξείδωσης έχουν την ικανότητα να προκαλούν σημαντικές βλάβες τόσο στη λειτουργία των μεμβρανικών δομών όσο και στην λειτουργία άλλων βιομορίων, όπως οι πρωτεΐνες και το DNA (Wolff & Dean, 1986). Εικόνα 9. Μηχανισμός λιπιδικής υπεροξείδωσης (πηγή: Εκτίμηση του βαθμού βλάβης του DNA στα αιμοκύτταρα Το γενετικό υλικό εκτίθεται συνεχώς τόσο σε εξωγενείς όσο και ενδογενείς παράγοντες, οι οποίοι μπορεί να προκαλέσουν διαταραχή της ακεραιότητάς του, 27

28 ΕΙΣΑΓΩΓΗ οδηγώντας σε μεταλλάξεις, χρωμοσωμικές ανωμαλίες και άλλες αρνητικές επιπτώσεις για τον οργανισμό (Vock et al., 1999; Wood et al., 2001). Η παρουσία ξενοβιοτικών ενώσεων στο περιβάλλον μπορεί να προκαλέσει βλάβη στο γενετικό υλικό είτε άμεσα με την επαγωγή φαινομένων απόπτωσης ή/και νέκρωσης, είτε έμμεσα εξαιτίας της αλληλεπίδρασής τους με τις ελεύθερες ρίζες οξυγόνου και την αναστολή της δράσης των ενζύμων επιδιόρθωσης (Lee et al., 2003). Για τον προσδιορισμό του βαθμού βλάβης του γενετικού υλικού στα αιμοκύτταρα των μυδιών χρησιμοποιείται συνήθως η τεχνική αλκαλικής ηλεκτροφορητικής ανάλυσης Κομητών (Comet Assay/Alkaline Single Cell Electrophoresis) (Danellakis et al. 2011; Srut et al., 2011). Η μέθοδος βασίζεται στο γεγονός ότι οι πυρήνες έχουν χαρακτηριστική μορφή κομητών, η κεφαλή των οποίων αποτελείται από άθικτο γενετικό υλικό, ενώ η ουρά τους αποτελείται από τα θραύσματα. Η δοκιμασία comet assay πήρε το όνομά της από τους κομήτες που αποκτούν, αποτελούμενοι από το κατεστραμμένο τους DNA, εξαιτίας της μετανάστευσης των σπασμένων DNA τμημάτων τους κατά τη διάρκεια της ηλεκτροφόρησης. Συγκεκριμένα η τεχνική αυτή ανιχνεύει μονόκλωνα τμήματα DNA (single-strand DNA breaks/alkali labile sites) μέσω του προσδιορισμού της μετανάστευσής τους από το πυρηνικό DNA (Singh et al. 1988). Το μέγεθος της ουράς του κομήτη αντανακλά την έκταση της βλάβης του DNA σε σχέση με τη κεφαλή του κομήτη. Ο μηχανισμός βασίζεται στην απώλεια της υπερπεριέλιξης των βρόχων των νουκλεοτιδίων, με αποτέλεσμα να καθίστανται ελεύθερα όταν εκτείνονται προς την άνοδο της ηλεκτροφόρησης. Η μέθοδος απαιτεί ένα μικρό αριθμό των κυττάρων, στα οποία δεν απαιτείται ενεργή διαίρεση, προκειμένου να πραγματοποιηθεί η εκτίμηση της βλάβης του γενετικού τους υλικού (Banakou et al, 2010; Danellakis et al., 2011; Farbain et al., 1995; Klaude et al., 1996; Lee & Steinert, 2003; Tice et al., 2000; Tsarpali et al., 2012; Vincent-Hubert et al., 2011). 28

29 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΣΚΟΠΟΣ Η Δικλοφενάκη (Diclofenac ή DCF, µη στεροειδή αντιφλεγμονώδης φαρμακευτική ουσία) αποτελεί μια από τις πιο διαδεδομένες φαρμακευτικές ενώσεις που ανιχνεύεται σε παράκτια ύδατα και μπορεί να επιφέρει ακόμα και σε μικρές περιβαλλοντικές συγκεντρώσεις, διαταραχές. Δεδομένο ότι βιοσυσσωρεύεται στους υδρόβιους οργανισμούς έχει χαρακτηριστεί ως «δυνητικά επικίνδυνα ένωση», με τις σχετικές αρνητικές συνέπειες (κατηγορία ΙΙΑ) και την εντοπίζουμε στη λίστα με τις ουσίες προτεραιότητας (Οδηγία 2013/39/ΕΕ). Όπως αναφέρθηκε η τοξικότητα του DCF στους υδρόβιους οργανισμούς, όπως ιχθύες και δίθυρα μαλάκια, έχει αποδειχθεί από μελέτες τόσο in vivo όσο και in vitro (Bueno et al., 2013; Chen et al., 2014;bEricson et al., 2010; Klosterhaus et al., 2013; Li et al., 2012; McEneff et al., 2014; Schwaiger et al., 2004). Λόγω λοιπόν, των δυσμενών επιπτώσεων του DCF, αποτελεί αναγκαία η ανάπτυξη μιας οικονομικής και αξιόλογης μεθόδου αποδόμησης του, ώστε να ελαττωθούν οι τοξικές περιβαλλοντικές επιπτώσεις του φαρμάκου. Μια από αυτές τις μεθόδους, η επεξεργασία με υπερήχους υψηλής συχνότητας, διερευνάται εδώ, με την οποία έχει ήδη πιστοποιηθεί ότι η DCF αποδομείται (Madhavan et al, 2010; Naddeo et al., 2010). Λαμβάνοντας υπόψιν τη σημασία ανάπτυξης κατάλληλης μεθοδολογίας για την επεξεργασία ουσιών με σημαντικό περιβαλλοντικό αντίκτυπο, καθώς και τη γνώση της φυσιολογίας και της συμπεριφοράς υδρόβιων οργανισμών που χρησιμοποιούνται σε οικοτοξικολογικές μελέτες, ο στόχος της παρούσας εργασίας ήταν η διερεύνηση των κυτταροτοξικών, οξειδωτικών και γενοτοξικών επιπτώσεων της DCF σε απομονωμένα αιμοκύτταρα της αιμολέμφου του είδους Mytilus galloprovincialis, καθώς και η συμβολή των υπερήχων στην μείωση των αρνητικών επιπτώσεών της. Επιπλέον, έχοντας γνώση του μηχανισμού της αναπνευστικής έκρηξης που επάγεται στα αιμοκύτταρα (Dailianis, 2009), διερευνήθηκε η ικανότητα του φαρμάκου να επάγει τις επιπτώσεις του μέσω της διαδικασίας ενεργοποίησης της NADPH οξειδάσης και ΝΟ συνθετάσης, τα οποία θεωρούνται σημαντικά ένζυμα στην ανοσοβιολογική άμυνα των μυδιών. 29

30 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 2. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 2.1 Αντιδραστήρια και ουσίες Η σύσταση των διαλυμάτων που χρησιμοποιήθηκαν κατά τη διάρκεια των πειραματικών διαδικασιών φαίνεται στον Πίνακα 2. Πίνακας 2. Σύσταση διαλυμάτων που χρησιμοποιήθηκαν κατά τη διάρκεια της πειραματικής διαδικασίας. Διάλυμα saline buffer ph=7.3 Σε 100 ml 0,477g HEPES, 2,548g NaCl, 1,306g MgSO 4, 0,075g KCl, 0,147g CaCl 2 Διάλυμα ουδέτερου ερυθρού (neutral red) 0,02 g Neutral Red σε 1 ml DMSO (stock solution) Διάλυμα χρώσης Alseve (ALS buffer) 140 μl από stock solution σε ΝR 6,86 ml ALS 20,8 g/l glucose, 8 g/l Sodium citrate, 3,36 g/l EDTA, 22,5 g/l NaCl Διάλυμα TCA-TBA σε HCl 0,25N 100 ml: 1,5g TCA (trichloroacetic acid), 0,375 TBA (thiobarbituric acid) ΒΗΤ 0,02% v/v 0,02g BHTσε 1mL αιθανόλης 10 ml HCl 0,25N 0,250ml HCl 37% σε 10 ml 2d H 2 O 70% methanol 10 ml 2M KOH Εxtraction fluid (2M KOH- DMSO) 5% phosphoric acid 1% soulphanilic acid in 5% phosphoric acid 0,1% NEM (N-naphylethylene diamine) σε 5% phosphoric acid Tris solution ph=7,5 6 ml 2M KOH, 7 ml DMSO 40 mm Tris-acetate, 1 mm Na 4 EDTA Kenny's salt ph=7,4 0,4 mm NaCl, 9 mm KCl, 0,7 mm K 2 HPO 4, 2 mm NaHCO 3 Normal melting point (NMP) in TAE solution (2% NMP) Διάλυμα λύσης κυττάρων ph=10 Electrophoresis solution ph>12 (1000 ml) DAPI 5 mg ml -1 2,5 mm NaCl, 100 mm Na 2 -EDTA, 10 mm Tris, 1% sarcosinate N-Lanroylsacosin natrium salt, 1% TRITON X 100, 10% DMSO 1 mm Na 2 -EDTA, 300 mm NaOH Διάλυμα acetic acid ethanol 1 % v/v acetic acid and 50 % v/v ethanol Τα αντιδραστήρια που χρησιμοποιήθηκαν για τη διεξαγωγή των πειραμάτων παρατίθενται στον Πίνακα 3. 30

31 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Πίνακας 3. Αντιδραστήρια και ουσίες που χρησιμοποιήθηκαν κατά τη διάρκεια των πειραμάτων. Χρωστική Neutral Red Ethanol καθαρότητας 96% Acetic acid (οξικό οξύ) καθαρότητας 96% TRITON X-100 DTNB [5,5 -dithio-bis(2-nitrobenzoic acid)] EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid) καθαρότητας 99% KCl TBA (θειοβαρβιτουρικό οξύ) BHT (βουτυλιωμένο υδροξυτολουόλιο) HEPES [4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid ] TRIS [tris(hydroxymethyl)aminomethane] καθαρότητας 99.9 % AppliChem, BioChemica Chemica Synthesis Services, Germany D(+) Sucrose Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Nitroblue tetrazolium (NBT) Sarcosinate-N-Lautoylsarcosine sodium salt Methanol καθαρότητας 99.8% DPI (Diphenyleneiodonium chloride) L-NAME (N G -nitro-l-arginine methyl ester) Agarose for routine use (normal melting point agarose /NMP) Agarose type VII (low melting point agarose/lmp) DAPI (4,6-Diamidine-2 -phenylindole dihydrochloride) HCl 37% Merck KGaA, Darmstadt, TCA (τριχλωροξικό οξύ) καθαρότητας 99.5% Germany 2.2 Συλλογή μυδιών και διατήρηση τους Μύδια περίπου ενός έτους συλλέχθηκαν από μυδοκαλλιέργεια της βόρειας πλευράς του Κορινθιακού κόλπου (κόλπος Κοντίνοβα, Γαλαξίδι, Ελλάδα) (Εικόνα 10). Αφού τα μύδια μεταφέρθηκαν στον εργαστηριακό χώρο, διατηρήθηκαν σε ενυδρεία, τα οποία περιείχαν ανακυκλώσιμο και φιλτραρισμένο τεχνητό θαλασσινό νερό, αλατότητας 35-37, για 7 ημέρες στους 15 ο C, έτσι ώστε να εγκλιματιστούν στις εργαστηριακές συνθήκες. Κατά την περίοδο εγκλιματισμού, τα μύδια δεν τρέφονταν, ενώ κατά τη διάρκεια της πειραματικής διαδικασίας τρέφονταν καθημερινά με εμπλουτισμένη τροφή Myspat (Inve Aquaculture NV, Belgium, 30 mg/άτομο). 31

32 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Εικόνα 10. Περιοχή δειγματοληψίας των μυδιών, κόλπος Κοντίνοβα. 2.3 Συλλογή αιμολέμφου μυδιών Προετοιμασία κυτταροκαλλιεργειών Η συλλογή και η συντήρηση της αιμολέμφου πραγματοποιήθηκε με τροποποίηση της μεθόδου που περιγράφτηκε από τους Cao και συν. (2003). Συγκεκριμένα, πραγματοποιήθηκε συλλογή αιμολέμφου από τον εμπρόσθιο προσαγωγό μυ 10 ατόμων (1-2 ml/άτομο), με χρήση αποστειρωμένης σύριγγας με βελόνα μεγέθους 26G x ½ (Εικόνα 11). Ακολούθησε φυγοκέντρηση της αιμολέμφου (150 x g για 10 λεπτά, σε θερμοκρασία δωματίου), συλλογή των αιμοκυττάρων και φιλτράρισμα της αιμολέμφου διαμέσου αποστειρωμένων φίλτρων whatman (0,22 μm). Εν συνεχεία ακολουθούσε επαναιώρηση των κυττάρων στο αποστειρωμένο υπερκείμενο, προκειμένου να ετοιμαστούν οι καλλιέργειες των αιμοκυττάρων που θα χρησιμοποιηθούν κατά τη διάρκεια των πειραμάτων (Toufexi et al., 2013). 32

33 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Εικόνα 11. Συλλογή αιμολέμφου από τον εμπρόσθιο προσαγωγό μυ του μυδιού (πηγή: Νταϊλιάνης Στέφανος). 2.4 Προετοιμασία διαλυμάτων DCF και πειραματική διαδικασία υπερήχησης Πριν την έναρξη της πειραματικής διαδικασίας, παρασκευάστηκαν υδατικά διαλύματα DCF (τελικής συγκέντρωσης 2, 2.5, 5 και 10 mg L -1 ). Στη συνέχεια 350 και 500 ml των παραπάνω διαλυμάτων επεξεργάστηκαν με διάφορες συνθήκες υπερήχων (συχνότητες 582 και 862 khz, πυκνότητα ισχύος των υπερήχων 133 και 167 W), με τη χρήση κατάλληλου συστήματος (Meinhardt Ultraschalltechnik, Leipzig, Γερμανία) (Εικόνα 12). Το συγκεκριμένο σύστημα αποτελείται από αισθητήρα διαμέτρου 75 mm, μια γεννήτρια και έναν ενισχυτή. Επίσης ο κύλινδρος περιεκτικότητας 2 λίτρων είναι γυάλινος με διπλό τοίχωμα, το οποίο επιτρέπει ανάμεσα την κυκλοφορία νερού ψύξης του συστήματος. Η πειραματική διαδικασία της υπερήχησης πραγματοποιήθηκε σε απόλυτο σκοτάδι και σε θερμοκρασία δωματίου. Κατά τη διάρκεια της διαδικασίας πραγματοποιούνταν μετρήσεις της θερμοκρασίας του διαλύματος του DCF με ψηφιακό θερμόμετρο (Oakton Temp 5 Acorn Series, Eutech Instruments Ltd., Σιγκαπούρη). 33

34 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Εικόνα 12. Σύστημα υπερήχων Meinhardt Ultraschalltechnik, Leipzig, Γερμανία (πηγή: Manariotis et al., 2001). Κατά τη διάρκεια της διαδικασίας, συλλέγονταν κατά τακτά χρονικά διαστήματα (10, 15, 20, 30, 45, 60, 90, 120 και 150 min) δείγματα του διαλύματος DCF, προκειμένου να πραγματοποιηθεί προσδιορισμός της συγκέντρωσης της ουσίας με τη χρήση UV-φασματοφωτόμετρου [(Specord 210/Plus, Analytic Jena, Γερμανία, μήκος κύματος 276 nm, το οποίο αντιστοιχεί στο μήκος κύματος μέγιστης απορρόφησης της ουσίας (Rizzo et al., 2009)]. Ο προσδιορισμός της συγκέντρωσης της ουσίας σε κάθε περίπτωση βασίστηκε σε πρότυπη καμπύλη της DCF (Διάγραμμα 1). 34

35 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Διάγραμμα 1. Πρότυπη καμπύλη του DCF καμπύλης στα 276 nm Ιn vitro έκθεση αιμοκυττάρων σε διαφορετικές συγκεντρώσεις DCF Περίπου 1 ml (10 6 κύτταρα) κυτταρικού αιωρήματος εκτέθηκε για 1 h σε διαφορετικές συγκεντρώσεις DCF (συγκέντρωση αρχικού διαλύματος 2 mg L -1 ) (DCF-treated κύτταρα). Συγκεκριμένα, τα αιμοκύτταρα εκτέθηκαν σε περιβαλλοντικά ανιχνεύσιμες συγκεντρώσεις της ουσίας (5, 10 και 100 ng L 1 DCF), καθώς και σε μεγαλύτερες συγκεντρώσεις (1, 10 και 20 μg L -1 ), οι οποίες έχουν αναφερθεί σε επιβαρυμένα οικοσυστήματα (Santos et al., 2010; Parolini et al., 2011; Lolic et al., 2015). Παράλληλα, αιμοκύτταρα εκτέθηκαν σε κατάλληλους όγκους υδατικού διαλύματος της ουσίας (υδατικό διάλυμα DCF, όγκου 350 ml και αρχικής συγκέντρωσης 2 mg L 1 ) το οποίο είχε προηγουμένως υποστεί επεξεργασία με υπερήχους για συνολικό διάστημα 120 min, υπό κατάλληλες συνθήκες (ηλεκτρική πυκνότητα ισχύος 167W και συχνότητα 862 khz) (US DCF-treated κύτταρα), προκειμένου να εκτιμηθεί η επίδραση της διαδικασίας στις επιπτώσεις των συγκεντρώσεων της ουσίας που αναφέρθηκαν παραπάνω. Μετά το τέλος της έκθεσης, τα αιμοκύτταρα χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό α) της κυτταροτοξικής δράσης της ουσίας (μέθοδος ουδέτερου ερυθρού/neutral Red uptake, β) των επιπέδων των σουπεροξειδικών ανιόντων ( Ο 2 - ) και των οξειδίων του αζώτου (ΝΟ, με τη μορφή των νιτρωδών ιόντων), γ) των επιπέδων της μηλονικής διαλδεϋδης (MDA), και δ) της βλάβης του γενετικού υλικού των εκτιθέμενων αιμοκυττάρων (DNA damage), με τη μέθοδο Comet. 35

36 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ H παραπάνω διαδικασία έκθεσης των αιμοκυττάρων στο διάλυμα της ουσίας (μη- επεξεργασμένο διάλυμα DCF) επαναλήφθηκε με τη χρήση κυττάρων που είχαν προηγουμένων επωαστεί για 15 min είτε με τον ειδικό αναστολέα της NADPH οξειδάσης (DPI 10 μμ) είτε με τον αναστολέα της ΝΟ συνθετάσης (L-NAME 10 μμ). Λόγω της προετοιμασίας των αναστολέων σε DMSO, πραγματοποιήθηκε επιπλέον έκθεση των αιμοκυττάρων σε DMSO (κύτταρα αναφοράς). Στη συνέχεια, ακολούθησε έκθεση σε διαφορετικές συγκεντρώσεις της ουσίας σε κάθε περίπτωση και προετοιμασία των δειγμάτων για προσδιορισμό των σουπεροξειδικών ανιόντων και των οξειδίων του αζώτου, καθώς και των επιπέδων της μηλονικής διαλδεϋδης Εκτίμηση βιωσιμότητας κυττάρων Η εκτίμηση της βιωσιμότητας των κυττάρων (DCF-treated & US DCF-treated κύτταρα) πραγματοποιήθηκε με τη χρήση της χρωστικής ουδέτερο ερυθρό (Νeutral red), σύμφωνα με τη μέθοδο των Gomez-Mendikute και συν. (2002). Η συγκεκριμένη μέθοδος παρέχει μια ποσοτική εκτίμηση των βιώσιμων κυττάρων μιας καλλιέργειας και βασίζεται στην ικανότητα αυτών των κυττάρων να προσλαμβάνουν και να ενσωματώνουν μόρια της χρωστικής Neutral red (Πίνακας 4) στο εσωτερικό των λυσοσωμάτων τους (Εικόνα 13). Πίνακας 4. Χαρακτηριστικά Neutral red χρωστικής. Neutral red IUPAC name: toluylene red Other names: 3-Amino-7-dimethylamino-2-methylphenazine hydrochloride Properties Molecular formula C 15 H 17 ClN 4 Molar mass g/mol Melting point 290 C 36

37 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ L N Εικόνα 13. Αντιπροσωπευτικό δείγμα αιμοκυττάρων με χρώση ουδέτερου ερυθρού (μεγέθυνση 1000x). Ν: πυρήνας, L: λυσοσώματα. Σύμφωνα με την πειραματική διαδικασία, μετά το τέλος της έκθεσης των αιμοκυττάρων, ακολούθησε φυγοκέντρηση (150 x g, 10 λεπτά), απομάκρυνση του υπερκειμένου και επαναιώρηση των κυττάρων σε διάλυμα ALS. Μετά από παραμονή 45 min σε απόλυτο σκοτάδι, ακολούθησε αφαίρεση του υπερκειμένου και προσθήκη 500 ml διαλύματος ALS που περιείχε % w/v της χρωστικής NR. Μετά από παραμονή 2 h, τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν (150 g, 10 min, x 2), έγινε απομάκρυνση του υπερκειμένου και προσθήκη διαλύματος ακετόνης-αιθανόλης. Τέλος πραγματοποιήθηκε μέτρηση των δειγμάτων σε μήκος κύματος 550. Ο προσδιορισμός του πρωτεϊνικού περιεχομένου των δειγμάτων σε κάθε περίπτωση πραγματοποιήθηκε με τη μέθοδο των Georgiou και συν. (2008), βάσει γνωστών συγκεντρώσεων αλβουμίνης (BSA). Τα αποτελέσματα (Μ.Ο. ± η τυπική απόκλιση) 6 διαφορετικών μετρήσεων και εκφράζονται ως OD 550nm /mg πρωτεΐνης Προσδιορισμός σουπεροξειδικών ανιόντων ( Ο 2 - ) Η εκτίμηση της παραγωγής σουπεροξειδικών ανιόντων πραγματοποιήθηκε μέσω ανίχνευσης του ανιόντος υπεροξειδίου, με τη χρήση nitroblue tetrazolium (NBT) (Πίνακας 5) και του υπολογισμού της οπτικής απορρόφησης του μορίου NBTdiformazan στα 620 nm (Pipe, 1992). Συγκεκριμένα το NBT (nitroblue tetrazolium) μετατρέπεται σε NBT-diformazan, υπό την επίδραση σουπεροξειδικών ανιόντων (Εικόνα 14). 37

38 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Πίνακας 5. Χαρακτηριστικά NBΤ. Nitro blue tetrazolium chloride Properties Molecular formula C 40 H 30 Cl 2 N 10 O 6 Molar mass Appearance g/mol yellow crystalline powder Melting point 200 C Εικόνα 14. Αντίδραση μέτρησης σουπεροξειδικών ανιόντων με χρήση nitroblue tetrazolium (NBT) (πηγή: biotech.aua.gr). Συγκεκριμένα σύμφωνα με την μέθοδο, τα αιμοκύτταρα (DCF-treated & US DCF-treated κύτταρα) που εκτέθηκαν σε υποθανατογόνες συγκεντρώσεις (5, 10 και 100 ng L 1 DCF) φυγοκεντρήθηκαν (150 x g, 10 min, 4 C) και τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε 1 ml ρυθμιστικού διαλύματος salin buffer, που περιέχει 1 mg ml -1 ΝΒΤ. Ακολούθησε επώαση για 2 ώρες στο σκοτάδι, φυγοκέντρηση των δειγμάτων (150 x g για 10 min στους 4 C) και πλύση τους (300 μl TBS; 0,05 Μ Tris- HCl σε 2% NaCI, pη 7.6) εις διπλούν, με σκοπό την απομάκρυνση του εξωκυττάριου NBT. Ακολούθησε προσθήκη 300 μl 70% μεθανόλης και επώαση 10 min, 38

39 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ φυγοκέντρηση των δειγμάτων (150 x g, 10 min, στους 4 C) και μετά από παραμονή 5 min σε θερμοκρασία δωματίου προκειμένου να γίνει πλήρης απομάκρυνση της μεθανόλης, πραγματοποιήθηκε προσθήκη 1 ml διαλύματος 2 Μ ΚΟΗ/ DMSO. Στη συνέχεια, τα δείγματα επωάστηκαν για 30 min, φυγοκεντρήθηκαν και πραγματοποιήθηκε προσδιορισμός σε μήκος κύματος 620 nm της οπτικής απορρόφησης του μορίου NBT-diformazan. Τα αποτελέσματα (Μ.Ο. ± η τυπική απόκλιση) 6 διαφορετικών μετρήσεων εκφράζονται ως OD 620nm /mg πρωτεΐνης Προσδιορισμός παραγωγής οξειδίων του αζώτου (ΝΟ, με τη μορφή NO 2 - ) Η παραγωγή ΝΟ υπολογίστηκε στα αιμοκύτταρα των μυδιών βάσει γνωστής μεθόδου (Dailianis, 2009) που βασίζεται στο πρωτόκολλο αντίδρασης Griess (Εικόνα 14). Η αντίδραση Griess μέσω του σουλφανιλικού οξέος και της διαμίνης ΝΕΜ (Nnaphyl-ethylene diamine), υπό όξινες συνθήκες ποσοτικοποιεί τα νιτρώδη (NO 2 ), τα οποία αποτελούν προϊόν που προκύπτει από την αποικοδόμηση του ΝΟ. Το σύστημα αντιδραστηρίων Griess βασίζεται στην χημική αντίδραση που φαίνεται στην Εικόνα 15, η οποία χρησιμοποιεί σουλφανιλαμίδη και Ν-1-ναφυλεθυλενιδιαμινικό διϋδροχλωρίδιο (NED) υπό όξινες συνθήκες. Εικόνα 15. Χημικές αντιδράσεις τη μέτρησης των NO 2 - (πηγή: promega.com). με την χρήση της Griess Σύμφωνα με την μέθοδο, τα δείγματα των αιμοκυττάρων (DCF-treated & US DCF-treated κύτταρα) που εκτέθηκαν σε υποθανατογόνες συγκεντρώσεις (5, 10 και 100 ng L 1 DCF) φυγοκεντρήθηκαν (150 x g, 10 min), και μετά από απομάκρυνση 39

40 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ του υπερκειμένου επωάστηκαν με 500 μl διαλύματος 1% sulphanilic acid- 5% phosphoric acid. Ακολούθησε παραμονή σε σκοτάδι σε θερμοκρασία δωματίου για 10 min και στη συνέχεια προστέθηκαν 500 μl διαλύματος 0.1% N-naphylethylenediamine (ΝΕΜ) - 5% phosphoric acid και περεταίρω επώαση 15 min. Ακολούθησε φυγοκέντρηση των δειγμάτων και φωτομετρικός προσδιορισμός των νιτρωδών ιόντων σε μήκος κύματος 540 nm. Τα αποτελέσματα (Μ.Ο. ± η τυπική απόκλιση) 6 διαφορετικών μετρήσεων, εκφράζονται ως nmol NO/mg πρωτεΐνης, μετά από προσδιορισμό της συγκέντρωσης των νιτρωδών ιόντων, βάσει βαθμονομημένης καμπύλης ΝaNO Προσδιορισμός επιπέδων λιπιδικής υπεροξείδωσης Ο προσδιορισμός των επιπέδων υπεροξείδωσης των λιπιδίων πραγματοποιήθηκε μέσω σχηματισμού θειοβαρβιτουρικών ενώσεων (TBARs), ποσοτικά εκφρασμένες ως ισοδύναμα μηλονικής διαλδεϋδης (MDA) (Εικόνα 16), σύμφωνα με τη μέθοδο που περιγράφτηκε από τους Vlahogianni και Valavanidis (2007). Η MDA αποτελεί έναν αξιόπιστο τρόπο μέτρησης του δείκτη οξειδωτικής βλάβης των κυτταρικών μεμβρανών και επομένως και του οξειδωτικού stress (Banakou & Dailianis, 2010; Giannapas et al., 2012). Τo MDA και άλλες δραστικές ουσίες θειοβαρβιτουρικού οξέος (TBARS) συμπυκνώνονται με δύο ισοδύναμά του για να δώσουν ένα φθορίζον κόκκινο παράγωγο που μπορεί να προσδιοριστεί φασματοφωτομετρικά. Εικόνα 16. Αντίδραση ενός μορίου μηλονικής διαλδεΰδης με δύο μόρια TBA. Το προϊόν απορροφά ισχυρά στα 535 nm και προσδιορίζεται φωτομετρικά. H αντίδραση πραγματοποιείτε σε συνθήκες με ph~2-3, καθότι πιο όξινες συνθήκες, παρεμποδίζουν την ανάπτυξη του χρώματος του προϊόντος (πηγή: promega.com). 40

41 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Σύμφωνα με την μέθοδο, τα δείγματα των αιμοκυττάρων (DCF-treated & US DCF-treated κύτταρα) που εκτέθηκαν σε υποθανατογόνες συγκεντρώσεις (5, 10 και 100 ng L 1 DCF) φυγοκεντρήθηκαν (150 x g, 10 min), και μετά από απομάκρυνση του υπερκειμένου ακολούθησε προσθήκη 1 ml TCA-TBA HCl 0.25N & 10 μl ΒΗΤ 0,02%v/v. Ακολούθησε θέρμανση των δειγμάτων στους ο C για 15 min και μετά από παραμονή τους σε θερμοκρασία δωματίου, ακολούθησε φυγοκέντρηση (1000 x g, 10 min) και μέτρηση της απορρόφησης σε μήκος κύματος 535 nm. Ο προσδιορισμός των συγκεντρώσεων του MDA πραγματοποιήθηκε με τη χρήση κατάλληλου μοριακού συντελεστή (ε= M 1 cm 1 ) (Wills, 1969). Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως nmol MDA/mg πρωτεΐνης, και είναι ο Μ.Ο. ± η τυπική απόκλιση (SD) 6 διαφορετικών μετρήσεων Εκτίμηση του βαθμού βλάβης του DNA στα αιμοκύτταρα των μυδιών (Comet Assay/Alkaline Single Cell Electrophoresis) Για τον προσδιορισμό του βαθμού βλάβης του γενετικού υλικού στα αιμοκύτταρα των μυδιών χρησιμοποιήθηκε η τεχνική ανάλυσης Κομητών (Comet Assay/Alkaline Single Cell Electrophoresis), σύμφωνα με το πρωτόκολλο των Jha και συν. (2005). Η μέθοδος βασίζεται στην ενσωμάτωση των κυττάρων σε αγαρόζη επάνω σε αντικειμενοφόρο πλάκα, τη λύση τους σε περιβάλλον υψηλής συγκέντρωσης αλάτων και την ηλεκτροφόρηση των δειγμάτων υπό αλκαλικές συνθήκες (Binelli et al., 2009; Kumaravel et al., 2006; Ritter & Kendel, 2009). Συγκεκριμένα, τα δείγματα των αιμοκυττάρων (DCF-treated & US DCF-treated κύτταρα) που εκτέθηκαν σε υποθανατογόνες συγκεντρώσεις (5, 10 και 100 ng L 1 DCF) φυγοκεντρήθηκαν (150 x g, 10 min), και μετά από απομάκρυνση του υπερκειμένου, ακολούθησε επαναιώρηση των κυττάρων σε 180 μl διαλύματος Kenny s που περιείχε 1 % w/v low-melting-point agarose (LMA) (Kenny s salt solution; 0.4 M NaCl, 9 mm KCl, 0.7 mm K 2 HPO 4, 2 mm NaHCO 3 ). Ακολούθησε άμεση εναπόθεση κάθε κυτταρικού αιωρήματος σε αντικειμενοφόρους πλάκες (100 μl/αντικειμενοφόρο), οι οποίες είχαν εμβαπτιστεί σε 200 μl 0,2% NMP (normalmelting-point-agarose)/ TAE (40 mm Tris-acetate, 1 mm EDTA). Ακολούθησε τοποθέτηση καλυπτρίδας και πολυμερισμός της αγαρόζης. Έπειτα, πραγματοποιήθηκε απομάκρυνση της καλυπτρίδας από όλα τα δείγματα και λύση τους με κατάλληλο διάλυμα (2,5 M NaCl, 100 mm EDTA, 10 mm Tris base, 1% Sarcosinate-N- Lautoylsarcosine sodium salt, 1% Triton X-100, 10% DMSO, ph 10), στους 4 C για 41

42 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 1 h. Ακολούθησε πλύση των δειγμάτων με απεσταγμένο νερό, τοποθέτησή τους σε συσκευή οριζόντιας ηλεκτροφόρησης, μέσα σε ηλεκτροφορητικό διάλυμα (0,075 M NaOH, 1 mm EDTA, ph > 12). Μετά από παραμονή τους για 20 min, προκειμένου να επιτευχθεί αποδιάταξη του DNA, πραγματοποιήθηκε ηλεκτροφόρηση (25V/cm, 300 ma για 15 min), και εξουδετέρωση με διάλυμα 0.4 M TRIS, ph= 7,5. Στην συνέχεια, ακολούθησε χρώση των πυρήνων με την προσθήκη χρωστικής DAPI (5 mg ml 1 ανά αντικειμενοφόρο πλάκα) και έλεγχος των δειγμάτων για την ανίχνευση του ποσοστού βλάβης του DNA, μέσω κατάλληλου συστήματος (MetaCyte CometScan system (MetaSystems, Altlussheim, Γερμανία), αποτελούμενο από μικροσκόπιο φθορισμού (AxioImager Z1, Carl Zeiss, Jena, Γερμανία), κάμερα CCD (M4+; JAI AS, Glostrup/Κοπεγχάγη, Δανία) και λογισμικό Metafer. Για τον προσδιορισμό του βαθμού βλάβης του γενετικού υλικού επιλέχθηκαν μόνο οι κομήτες που πληρούσαν τα κριτήρια που ανέπτυξαν οι Ritter και Knebel (2009) (Εικόνα 17). Μετρήθηκαν τουλάχιστον 100 πυρήνες ανά αντικειμενοφόρο πλάκα. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως το ποσοστό του γενετικού υλικού που αντιστοιχεί στην ουρά του κομήτη (% DNA in tail), καθώς και με ως απόλυτες τιμές γνωστών (Tail Moment/ TM και Tail Moment/Olive, OM), και αποτελούν τον μέσο όρο ± τυπική απόκλιση από 4 επαναλήψεις σε κάθε περίπτωση (Ν=2 x 2). 42