Πανεπιστήμιο Θεσσαλίας Τμήμα Βιοχημείας & Βιοτεχνολογίας Χειμερινό Ακαδημαϊκό Εξάμηνο 2016_17

HTML
DOWNLOAD

Μέγεθος: px

Εμφάνιση ξεκινά από τη σελίδα:

Download "Πανεπιστήμιο Θεσσαλίας Τμήμα Βιοχημείας & Βιοτεχνολογίας Χειμερινό Ακαδημαϊκό Εξάμηνο 2016_17"

Ανάργυρος Λύκος
8 χρόνια πριν
Προβολές:

1 Πανεπιστήμιο Θεσσαλίας Τμήμα Βιοχημείας & Βιοτεχνολογίας Χειμερινό Ακαδημαϊκό Εξάμηνο 2016_17 10 ΚΥΤΤΑΡΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΕΣ Χρήσεις των κυτταροκαλλιεργειών με σημαντικές προεκτάσεις στην αντιμετώπιση της ανθρώπινης παθοφυσιολογίας Αμανατιάδου Π. Έλσα, PhD

2 Διάλεξη 1η 2/17

3 Χρήσεις των κυτταροκαλλιεργειών με σημαντικές προεκτάσεις στην αντιμετώπιση της ανθρώπινης παθοφυσιολογίας Α. Χρήση κυτταροκαλλιεργειών στην παραγωγή μονοκλωνικών αντισωμάτων (Υβριδικές κυτταρικές σειρές β λεμφοκυττάρων-καρκινικών κυττάρων, Χρήση μονοκλωνικών αντισωμάτων στη Μοριακή ανίχνευση - Διάγνωση - Θεραπεία) Β. Χρήση κυτταροκαλλιεργειών κατά το σχεδιασμό και την ανάπτυξη νέων φαρμάκων (Έλεγχος υποψήφιων φαρμάκων, Μελέτες μοριακού μηχανισμού δράσης, Μελέτες βιοσυμβατότητας, Μελέτες πρόσληψης και διαπερατότητας) Γ. Χρήση κυτταροκαλλιεργειών στο καινοτόμο πεδίο της κυτταρικής θεραπείας (Bλαστικά κύτταρα, Aναγεννητική ιατρική, ips κύτταρα) 3/17

ie/biotechnology/what-is-a-monoclonal-antibody/ 2 βαριές και 2 ελαφριές αλυσίδες ενωμένες με δισουφιδικές γέφυρες (~150kDa) Μονοκλωνικά

4 Μονοκλωνικά αντισώματα Αντισώματα -ανοσοσφαιρίνες (immunoglobulins, Igs) Είτε στην επιφάνεια των Β-λεμφοκυττάρων είτε σε διαλυτή μορφή στην κυκλοφορία IgG ισότυπος: ~80% των ανθρώπινων αντισωμάτων 2 βαριές και 2 ελαφριές αλυσίδες ενωμένες με δισουφιδικές γέφυρες (~150kDa) Μονοκλωνικά αντισώματα: μονοδύναμα αντισώματα που αναγνωρίζουν και προσδένονται στον ίδιο επίτοπο και παράγονται από ένα κλώνο Β-λεμφοκυττάρων Υψηλή εξειδίκευση με την οποία προσδένονται στο αντιγόνο-στόχο (Targeted therapies) 4/17

5 Μονοκλωνικά αντισώματα - Εξέλιξη Ανάπτυξη του πρώτου μονοκλωνικού αντισώματος με τη μέθοδο υβριδωμάτων (Kohler G, Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature 1975;256(5517):495-7) Έγκριση κυκλοφορίας του πρώτου μονοκλωνικού αντισώματος το 1986 (muromonab-cd3, ενάντια στην απόρριψη μοσχεύματος νεφρού) Έγκριση κυκλοφορίας του πρώτου ανθρώπινου μονοκλωνικού αντισώματος το 2002 (adalimumab, TNF, ενάντια στη ρευματοειδή αρθρίτιδα) Τα ανθρωποποιημένα μονοκλωνικά αντισώματα ανέρχονται αυτή τη στιγμή στη μεγαλύτερη κατηγορία βιοτεχνολογικών προϊόντων σε κλινικές μελέτες Περίπου 30 μονοκλωνικά αντισώματα έχουν εγκριθεί από τον FDA για ανθρώπινη χρήση σε ασθένειες όπως ο καρκίνος, χρόνιες φλεγμονώδεις νόσους, καρδιαγγειακές παθήσεις κ.ά. 5/17

6 Μέθοδοι παραγωγής μονοκλωνικών αντισωμάτων Η τεχνoλογία των υβριδωμάτων Χρήση διαγονιδιακών ζώων Έκφραση σε E. Coli (scfv, Fab) Τεχνική phage display Από τις μεγαλύτερες προκλήσεις στη θεραπευτική χρήση των μονοκλωνικών αντισωμάτων είναι η ανθρώπινη ανοσολογική απόκριση και η φτωχή φαρμακοκινητική των αντισωμάτων ποντικού μετά τη χορήγηση σε ανθρώπους 6/17

Τεχνολογία Yβριδωμάτων Ανοσοποίηση πειραματόζωου με αντιγόνο Απομόνωση Β-λεμφοκυττάρων από το σπλήνα του ζώου Σύντηξη των Β-λεμφοκυττάρων με μια αθάνατη κυτταρική σειρά μυελώματος που δε φέρει το

7 Τεχνολογία Yβριδωμάτων Ανοσοποίηση πειραματόζωου με αντιγόνο Απομόνωση Β-λεμφοκυττάρων από το σπλήνα του ζώου Σύντηξη των Β-λεμφοκυττάρων με μια αθάνατη κυτταρική σειρά μυελώματος που δε φέρει το γονίδιο HGPRT (φωσφοριβοσυλτρανσφεράση της γουανίνηςυποξανθίνης) και δεν παράγει άλλες ανοσοσφαιρίνες Κύτταρα υβριδώματος καλλιεργούνται in vitro σε θρεπτικό μέσο επιλογής HAT (περιέχει υποξανθίνηαμινοπτερίνη-θυμιδίνη) Πληθυσμός υβριδικών κυττάρων αραιώνεται για την επιλογή μοναδιαίων κυττάρων- κλώνων που παράγουν ένα συγκεκριμένο, ειδικό αντίσωμα Screening εκατοντάδων κλώνων για τη σύνδεση με τον επιθυμητό επίτοπο επιβεβαίωση αναγνώρισης από το μονοκλωνικό αντίσωμα Θετικά υβριδώματα μπορούν να αποθηκευτούν σε υγρό άζωτο (κρυοσυντήρηση) 7/17

8 Τεχνολογία Υβριδωμάτων Θρεπτικό μέσο επιλογής υβριδωμάτων: HAT medium (υποξανθίνη-αμινοπτερίνηθυμιδίνη) Η επιτυχής σύζευξη των κυττάρων οδηγεί στην παραγωγή υβριδωμάτων που εκφράζουν το ένζυμο HGPRT (ιδιότητα των Β-λεμφοκυττάρων) και άρα μπορούν να αναπτυχθούν παρουσία αμινοπτερίνης. Είναι επίσης αθάνατα λόγω της σύζευξης με τα κύτταρα μυελώματος (μεταμορφωμένα) 8/17

Παραγωγή μονοκλωνικών αντισωμάτων σε διαγονιδιακά ζώα Τεχνολογία XenoMouse Hybridoma: Ενδογενείς γενετικοί τόποι ανοσοσφαιρινών ποντικού (Ig, ελαφριές και βαριές αλυσίδες) απενεργοποιούνται σε

9 Παραγωγή μονοκλωνικών αντισωμάτων σε διαγονιδιακά ζώα Τεχνολογία XenoMouse Hybridoma: Ενδογενείς γενετικοί τόποι ανοσοσφαιρινών ποντικού (Ig, ελαφριές και βαριές αλυσίδες) απενεργοποιούνται σε εμβρυονικά κύτταρα ποντικού (ομόζυγα) (προκύπτει γένος ποντικού που δε μπορεί να παράγει αντισώματα) Τεχνητά χρωμοσώματα (ζύμη) που κωδικοποιούν ανθρώπινες ανοσοσφαιρίνες μεταφέρονται σε εμβρυονικά κύτταρα ποντικού (προκύπτει γένος ποντικού που μπορεί να παράγει αντισώματα ανθρώπου και ποντικού) Από τη διασταύρωση των δύο μπορεί να προκύψει το γένος Xenomouse (παράγει μόνο ανθρώπινα αντισώματα) Ακολουθεί η μέθοδος των υβριδωμάτων 9/17

10 Μονοκλωνικά αντισώματα: Προσεγγίσεις στην αντιμετώπιση του καρκίνου.. a) Targeting monoclonal antibodies to the tumour can result in the destruction of the tumour cells by antibody-dependent cellular cytotoxicity or complement-dependent cytotoxicity. b) Similarly, targeting cytokines or immunomodulatory molecules either by bispecific scfv or antibody ligand fusion proteins to the tumour modulates the immune response against the tumour. In addition, antibody ligand fusion proteins can induce apoptosis to targeted cells as well as bystander cells by, for example, presenting FasL. c) A more direct approach to kill the targeted cell is the conjugation of cytotoxic drugs (D), toxins (T) or radionucleotides to the monoclonal antibodies. The direct targeting approach requires the homogenous expression of antigen in the tumour cell population; depending on the radionucleotides used, however, radioimmunoconjugates can exert bystander effects and kill surrounding cells which do not express the antigen. d) The antibody-directed enzyme prodrug therapy (ADEPT) approach specifically aims at causing bystander effects by targeting enzymes to the tumour cell and delivering a prodrug that is converted to a chemotherapeutic by the targeted enzyme. 10/17

Κυτταροκαλλιέργειες: Σχεδιασμός και ανάπτυξη νέων φαρμάκων Φάρμακο: η αμιγής φαρμακολογικά δραστική ουσία ή σύνθεση ουσιών φυσικής, ημισυνθετικής, τεχνητής ή βιοσυνθετικής προέλευσης που με τη

11 Κυτταροκαλλιέργειες: Σχεδιασμός και ανάπτυξη νέων φαρμάκων Φάρμακο: η αμιγής φαρμακολογικά δραστική ουσία ή σύνθεση ουσιών φυσικής, ημισυνθετικής, τεχνητής ή βιοσυνθετικής προέλευσης που με τη χορήγησή της στον οργανισμό αποκαθιστά, βελτιώνει ή τροποποιεί παθοφυσιολογικές διαταραχές ή ενίοτε συμβάλλει στην ιατρική διάγνωση Φάρμακο: Αποτελεσματικότητα Τοξικότητα ΒΑΣΙΚΗ ΠΡΟΫΠΟΘΕΣΗ κατά τον έλεγχο και την ανάπτυξη νέων χημικών ή βιολογικών θεραπευτικών παραγόντων είναι ο προσδιορισμός της πιθανής κυτταροτοξικότητάς τους στον άνθρωπο Αστέριος Σ. Τσιφτσόγλου, Μοριακή και Κλινική Φαρμακολογία, ΑΠΘ, Υπηρεσία Δημοσιευμάτων, Θεσσαλονίκη /17

Κυτταροκαλλιέργειες: Σχεδιασμός και ανάπτυξη νέων φαρμάκων Ανάπτυξη νέων φαρμάκων: Ακαδημαϊκός χώρος vs φαρμακευτικές βιομηχανίες Εστιασμένη έρευνα vs μεγάλης κλίμακας έλεγχος

(μέθοδος ανάλυσης υψηλής απόδοσης): πιάτα πολλών οπών, αυτοματοποιημένη/ρομποτική επεξεργασία και παρατήρηση του αποτελέσματος, συλλογής και επεξεργασίας των αποτελεσμάτων

12 Κυτταροκαλλιέργειες: Σχεδιασμός και ανάπτυξη νέων φαρμάκων Ανάπτυξη νέων φαρμάκων: Ακαδημαϊκός χώρος vs φαρμακευτικές βιομηχανίες Εστιασμένη έρευνα vs μεγάλης κλίμακας έλεγχος (screen) Βασική προσέγγιση: Έκθεση των κυτταροκαλλιεργειών στον παράγοντα και μέθοδοι προσδιορισμού της επίδρασης στην κυτταρική ανάπτυξη και επιβίωση High throughput screening (μέθοδος ανάλυσης υψηλής απόδοσης): πιάτα πολλών οπών, αυτοματοποιημένη/ρομποτική επεξεργασία και παρατήρηση του αποτελέσματος, συλλογής και επεξεργασίας των αποτελεσμάτων 12/17

13 Κυτταροκαλλιέργειες: Σχεδιασμός και ανάπτυξη νέων φαρμάκων Μοντέλα που χρησιμοποιούνται στον έλεγχο τοξικότητας φαρμάκων αποτελούν: καλλιέργειες οργάνων και διατομές ιστών τους, οργανοτυπικές καλλιέργειες (πολλοί διαφορετικοί τύποι κυττάρων με στόχο την προσομοίωση της in vivo ετερογένειας), κυτταροκαλλιέργειες, 3Dκυτταροκαλλιέργειες Κυτταροκαλλιέργειες (πρωτογενείς ή μεταμορφωμένες) που αναπτύσσονται στην επιφάνεια πλαστικών υποδοχέων (2D) αποτελούν βασικό μοντέλο στον προκλινικό έλεγχο τοξικότητας νέων φαρμάκων (+) Αφθονία μοντέλων για την προσομοίωση διαφορετικών ιστών Ευκολία συντήρησης και χειρισμού κυττάρων Μικρό κόστος σε σχέση με in vivo έλεγχο (πειραματόζωα) Ευρεία εμπορική διάθεση αντιδραστηρίων για την αξιολόγηση της κυτταροτοξικότητας Τροποποίηση της γονιδιακής και πρωτεϊνικής έκφρασης Δυνατότητα αναλύσεων υψηλής απόδοσης Χαμηλό κόστος αναλωσίμων 13/17

14 Συνήθεις in vitro μέθοδοι στον έλεγχο τοξικότητας φαρμάκων 14/17

15 Συνήθεις in vitro μέθοδοι στον έλεγχο τοξικότητας φαρμάκων 15/17

Kelm JM, Hierlemann A, Frey O: 3D spherical microtissues and microfluidic technology for multi-tissue

16 Συνεχής εξέλιξη εφαρμογών και καινοτομία.. Παράδειγμα: Kim JY, Fluri DA, Marchan R, Boonen K, Mohanty S, Singh P, Hammad S, Landuyt B, Hengstler JG, Kelm JM, Hierlemann A, Frey O: 3D spherical microtissues and microfluidic technology for multi-tissue experiments and analysis. Journal of Biotechnology : /17

ΣΗΜΑΝΤΙΚΟ: Η χρήση των κυτταροκαλλιεργειών διευρύνεται συνεχώς και εμφανίζει καινοτομία εφαρμογών με τελικό στόχο τον άνθρωπο (Διαφάνειες: 2, 7-8, 12-13!

17 ΣΗΜΑΝΤΙΚΟ: Η χρήση των κυτταροκαλλιεργειών διευρύνεται συνεχώς και εμφανίζει καινοτομία εφαρμογών με τελικό στόχο τον άνθρωπο (Διαφάνειες: 2, 7-8, 12-13!) Επόμενη Διάλεξη: Χρήσεις των κυτταροκαλλιεργειών με σημαντικές προεκτάσεις στην αντιμετώπιση της ανθρώπινης παθοφυσιολογίας : Χρήση κυτταροκαλλιεργειών στο καινοτόμο πεδίο της κυτταρικής θεραπείας ΕΠΙΣΗΣ: Σύντομη ανασκόπηση των διαλέξεων 1-6 (!) Μαζί σας: χαρτί μιλιμετρέ και χαρτί ημιλογαριθμικό

Σχετικά έγγραφα

ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΗΣ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ

ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΗΣ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ Καθώς η επιστημονική γνώση και κατανόηση αναπτύσσονται, ο μελλοντικός σχεδιασμός βιοτεχνολογικών προϊόντων περιορίζεται μόνο από τη φαντασία μας Βιοτεχνολογία