ΑΣΚΗΣΗ: ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΠΛΑΣΜΙΔΙΑΚΟΥ DNA

Transcript

1 ΑΣΚΗΣΗ: ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΠΛΑΣΜΙΔΙΑΚΟΥ DNA

2 ΑΣΚΗΣΗ: ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΠΛΑΣΜΙΔΙΑΚΟΥ DNA Σκοπός της άσκησης Εισαγωγή στις βασικές βιολογικές ιδιότητες των πλασμιδίων Η κατανόηση της μεθοδολογίας που χρησιμοποιείται στη διαδικασία απομόνωσης πλασμιδιακού DNA από βακτήρια. Η εξοικείωση με τη χρήση επιτραπέζιας φυγοκέντρου ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΥΠΟΒΑΘΡΟ 1. ΒΙΟΛΟΓΙΚΕΣ ΙΔΙΟΤΗΤΕΣ ΤΩΝ ΠΛΑΣΜΙΔΙΩΝ Το γενετικό υλικό των οργανισμών, από τα βακτήρια μέχρι τον άνθρωπο και με την εξαίρεση ορισμένων μόνο ιών, αποτελείται από δεσοξυριβονουκλεϊκό οξύ (DNA). Το γονιδίωμα των βακτηρίων είναι οργανωμένο σε ένα κυκλικό δίκλωνο μόριο DNA που είναι ο φορέας των γενετικών πληροφοριών για τη διαβίωση και τον πολλαπλασιασμό του βακτηρίου και για παράδειγμα στο Escherichia coli έχει μήκος περίπου 4,6 x 10 6 ζεύγη βάσεων. Εκτός από αυτό το χρωμοσωμικόdna, στα βακτήρια περιέχονται επίσης και μικρότερα μόρια δίκλωνου DNA, που συνήθως βρίσκονται σε κυκλική μορφή και ονομάζονται πλασμίδια (Εικόνα 1). Το μέγεθος των πλασμιδίων κυμαίνεται από μία μέχρι εκατοντάδες κιλοβάσεις (kbp), αποτελώντας μόλις το 1-2 % του βακτηριακού DNA. Βακτηριακό χρωμοσωμικό DNA Πλασμίδια Εικόνα 1. Το γενετικό υλικό των βακτηρίων.

3 Ο όρος πλασμίδιο περιγράφηκε το 1952 από τον Αμερικανό μοριακό βιολόγο Joshua Lederberg. Βασικό χαρακτηριστικό των πλασμιδίων είναι ότι περιέχουν αυτόνομη περιοχή έναρξης αντιγραφής του DNA (origin of replication, ori), επομένως είναι ικανά να αντιγράφονται ανεξάρτητα από το βακτηριακό χρωμόσωμα, γι αυτό και ονομάζονται και ρεπλικόνια (replicons). Η ολοκλήρωση όμως της αντιγραφής του πλασμιδιακού DNA γίνεται χρησιμοποιώντας τη μηχανή αντιγραφής του βακτηριακού κυττάρου-ξενιστή, δηλαδή οι απαραίτητες πρωτεΐνες για την αντιγραφή, π.χ. DNA πολυμεράση, ελικάσες κλπ, δεν κωδικοποιούνται από το πλασμίδιο αλλά από το βακτηριακό χρωμόσωμα. Τα πλασμίδια δεν περιέχουν απαραίτητα γονίδια για τη φυσιολογική ανάπτυξη και πολλαπλασιασμό των βακτηρίων αλλά περιέχουν βοηθητικά γονίδια που μπορούν όμως να δώσουν σημαντικό πλεονέκτημα για την επιβίωση των βακτηρίων κάτω από ορισμένες συνθήκες, όπως γονίδια που προσδίδουν ανθεκτικότητα σε αντιβιοτικά, γονίδια που συμμετέχουν στον καταβολισμό πολύπλοκων οργανικών ουσιών, γονίδια που ελέγχουν την παραγωγή εντεροτοξινών και βακτηριοτοξινών, την ανθεκτικότητα σε βαρέα μέταλλα κ.α. Η μεταφορά DNA, τόσο πλασμιδιακού όσο και χρωμοσωμικού, μεταξύ των βακτηρίων μπορεί να γίνει με τρεις διαφορετικούς τρόπους γενετικού ανασυνδυασμού: με τις διαδικασίες του μετασχηματισμού (transformation), της σύζευξης (conjugation) και της μεταγωγής (transduction). Στο μετασχηματισμό μικρά κομμάτια δίκλωνου DNA, αφού ελευθερωθούν από τα κύτταρα-δότες στο θρεπτικό υπόστρωμα του περιβάλλοντος, προσροφούνται στην επιφάνεια των κυττάρων-δεκτών και εισέρχονται στο εσωτερικό τους (βλέπε και άσκηση «Βακτηριακός μετασχηματισμός»). Στη σύζευξη, ένα μονόκλωνο μόριο DNA μεταφέρεται στο κύτταρο-δέκτη με το οποίο ο δότης βρίσκεται σε άμεση επαφή. Στη μεταγωγή ένα μικρό δίκλωνο μόριο DNA μεταφέρεται από το δότη στο δέκτη με κάποιο βακτηριοφάγο (βακτηριακός ιός) Ταξινόμηση των πλασμιδίων Υπάρχουν πολλοί τρόποι κατηγοριοποίησης των πλασμιδίων. 1. Με βάση τα ενδογενή χαρακτηριστικά τους, τα πλασμίδια μπορεί να διακρίνονται σε: α. Συζευκτικά (conjucative) και μη συζευκτικά (non conjucative), ανάλογα με το αν

4 περιέχουν τα γονίδια που είναι υπεύθυνα για τη βακτηριακή σύζευξη. Με τη βακτηριακή σύζευξη ένα βακτηριακό κύτταρο-δότης ενώνεται με ένα κύτταρο-δέκτη μέσω μιας γέφυρας σύζευξης (φυλετικό ινίδιο), μέσω της οποίας επιτυγχάνεται η μεταφορά πλασμιδιακού, πρωτίστως, DNA. Παραδείγματα συζευκτικών πλασμιδίων αποτελούν το πλασμίδιο F, πολλά πλασμίδια R και αρκετά πλασμίδια Col. Τα μη συζευκτικά πλασμίδια, όπως πολλά πλασμίδια R και τα περισσότερα πλασμίδια Col, δεν μπορούν να ενεργοποιήσουν τη διαδικασία της βακτηριακής σύζευξης από μόνα τους, επομένως μεταφέρονται μόνο με τη βοήθεια συζευκτικών πλασμιδίων. β. Πλασμίδια που έχουν ικανότητα ενσωμάτωσης (integration) στο βακτηριακό χρωμόσωμα ή όχι. 2. Με βάση τη λειτουργία τους τα πλασμίδια διακρίνονται σε: α. Πλασμίδια γονιμότητας (πλασμίδια F, από τον αγγλικό όρο fertility). Είναι ικανά να πυροδοτήσουν τη διαδικασία της βακτηριακής σύζευξη καθώς περιέχουν τα γονίδια που είναι υπεύθυνα για το σχηματισμό του φυλετικού ινιδίου. Π.χ. το πλασμίδιο F του Escherichia coli. β. Πλασμίδια με παράγοντες ανθεκτικότητας (πλασμίδια R, από τον αγγλικό όρο resistance). Τα πλασμίδια αυτά περιέχουν γονίδια που προσδίδουν στα βακτήρια ανθεκτικότητα σε συγκεκριμένα αντιβιοτικά ή άλλες δηλητηριώδεις για τα βακτήρια ουσίες. Π.χ. το πλασμίδιο RK2 του Klebsiella aerogenes που παρουσιάζει αντίσταση στα αντιβιοτικά αμπικιλίνη, καναμυκίνη και τετρακυκλίνη. Τα βακτήρια επομένως που περιέχουν τέτοια πλασμίδια έχουν τη δυνατότητα να αναπτύσσονται σε θρεπτικό μέσο που περιέχει το αντιβιοτικό για το οποίο έχουν ανθεκτικότητα ενώ όλα τα υπόλοιπα βακτήρια θα πεθαίνουν. H ιδιότητα αυτή των πλασμιδίων χρησιμοποιείται ευρέως στις βιολογικές επιστήμες καθώς αποτελεί ένα σύστημα επιλογής συγκεκριμένου βακτηριακού πληθυσμού. γ. Τοξικά πλασμίδια (πλασμίδια Col). Τα πλασμίδια αυτά μπορεί να παράγουν ουσίες που είναι τοξικές για άλλα βακτήρια (βακτηριοτοξίνες) ή και για ανώτερους ευκαρυωτικούς οργανισμούς (εντεροτοξίνες που προσβάλλουν ζώα, τον άνθρωπο κ.λ.π.). Π.χ. το πλασμίδιο ColE1 του Escherichia coli που παράγει βακτηριοτοξίνη έναντι άλλων στελεχών του Escherichia coli. δ. Καταβολικά / αποικοδομητικά πλασμίδια. Τα πλασμίδια αυτά παράγουν ένζυμα

5 που μπορούν να αποικοδομήσουν μεγάλη ποικιλία πολύπλοκων οργανικών ουσιών. Π.χ. τα πλασμίδια TOL (τολουένιο), CAM (καμφορά), OCT (οκτάνιο) του Pseumonodas putida. ε. Παθογενετικά πλασμίδια. Τα πλασμίδια αυτά περιέχουν τα γονίδια vir που καθιστούν τα βακτήρια που τα φέρουν παθογόνα. Π.χ. το πλασμίδιο Ti του Agrobacterium tumefaciens που προκαλεί ογκογένεση στα φυτά. 3. Με βάση τον αριθμό τους (copy number) μέσα στο βακτηριακό κύτταρο τα πλασμίδια διακρίνονται σε αυτά που διατηρούνται σε πολλαπλά αντίγραφα (high copy number, relaxed plasmids) και σε αυτά που βρίσκονται στο βακτηριακό κύτταρο σε περιορισμένο αριθμό αντιγράφων (low copy number, stringent plasmids). Ο διπλασιασμός των τελευταίων υπόκειται σε αυστηρό έλεγχο, γενικά ακολουθεί το διπλασιασμό του βακτηριακού χρωμοσώματος και αυτή η σύνδεση είναι που διατηρεί σταθερό το μικρό αριθμό των πλασμιδίων αυτών μέσα στο βακτήριο. Επιπρόσθετα, τα πλασμίδια αυτά συνήθως εκφράζουν και παράγοντες που ελέγχουν το σωστό καταμερισμό των αντιγράφων στα νέα θυγατρικά κύτταρα κατά τη διχοτόμηση του βακτηριακού κυττάρου. Αντίθετα, τα πλασμίδια που διατηρούνται σε πολλαπλά αντίγραφα μέσα στο βακτηριακό κύτταρο αντιγράφονται ανεξάρτητα από το βακτηριακό χρωμόσωμα και με μεγαλύτερη συχνότητα. Γενικά τα συζευκτικά πλασμίδια έχουν μεγάλο μέγεθος και διατηρούνται σε ένα έως τρία αντίγραφα σε κάθε κύτταρο, ενώ τα μη συζευκτικά πλασμίδια είναι μικρά και βρίσκονται σε πολλά αντίγραφα σε κάθε κύτταρο. Είναι προφανές ότι ο αριθμός των αντιγράφων του πλασμιδίου μέσα στο βακτηριακό κύτταρο είναι ένας σημαντικός παράγοντας σε ένα πείραμα απομόνωσης πλασμιδιακού DNA, καθώς αν πρόκειται για low copy πλασμίδιο τότε είναι αναμενόμενο να προκύψει μικρή ποσότητα DNA, κάτι που πρέπει να αντισταθμιστεί με μεγαλύτερο όγκο αρχικής βακτηριακής καλλιέργειας. 4. Με βάση τη δυνατότητα να συνυπάρχουν στον ίδιο ξενιστή, τα πλασμίδια διακρίνονται σε συμβατά και μη συμβατά. Γενικά πλασμιδιακή ασυμβατότητα ονομάζεται η αδυναμία για συνύπαρξη δύο διαφορετικών πλασμιδίων στο ίδιο βακτηριακό κύτταρο. Συνήθως τα μη συμβατά πλασμίδια ακολουθούν το ίδιο σύστημα αντιγραφής και επομένως ανταγωνίζονται κατά τον διπλασιασμό τους. Έχουν προσδιοριστεί τουλάχιστον 30 ομάδες ασυμβατότητας στο E. coli και 13 ομάδες στο S. aureus.

6 5. Με βάση το εύρος των βακτηριακών κυττάρων-ξενιστών, τα πλασμίδια μπορεί να έχουν μικρό ή μεγάλο εύρος πιθανών ξενιστών. Η ιδιότητά τους αυτή εξαρτάται από την περιοχή έναρξης της αντιγραφής τους. Τα περισσότερα φυσικά πλασμίδια έχουν περιορισμένο εύρος ξενιστών, για παράδειγμα το πλασμίδιο ColE1 και τα παράγωγά του μπορούν να μεγαλώσουν μόνο στο E. coli και στα συγγενικά βακτήρια όπως η Salmonella. Αντίθετα άλλα πλασμίδια, όπως τα RP4 και RSF1010, μπορούν να διατηρούνται και να αντιγράφονται σε μια πληθώρα ξενιστών όπως E. coli, Pseudomonas, Rhizobium, Agrobacteriumκ.ά. Αυτά τα ευρέως φάσματος πλασμίδια περιέχουν περιοχή έναρξης αντιγραφής που μπορεί να λειτουργήσει σε πολλά βακτηριακά είδη, ένα χαρακτηριστικό που τα καθιστά ιδανικά μοντέλα για πειράματα γενετικής μηχανικής Δομή του βακτηριακού γονιδιώματος Αντίθετα με το γονιδίωμα των ευκαρυωτικών οργανισμών που οργανώνεται σε ινίδια χρωματίνης, το γονιδίωμα των βακτηρίων οργανώνεται σε απλούστερες δομές. Τα βακτηριακά χρωμοσώματα έχουν μήκος μερικών εκατομμυρίων νουκλεοτιδίων και περιέχουν μερικές χιλιάδες γονίδια. Για να χωρέσει στο βακτηριακό κύτταρο, το βακτηριακό χρωμόσωμα πρέπει να συμπυκνωθεί τουλάχιστον 1000 φορές. Αυτό προϋποθέτει την αναδίπλωση του χρωμοσωμικού DNA σε υπερελικωμένες δομές που έχουν τη μορφή βρόχων (Εικόνα 2). Ο αριθμός των βρόχων διαφέρει ανάλογα με το μέγεθος του βακτηριακού χρωμοσώματος και το είδος του βακτηρίου, για παράδειγμα το E. coli έχει βρόχους ο καθένας από τους οποίους περιέχει ζεύγη Ο σχηματισμός βρόχων συμπυκνώνει το DNA περίπου 10 φορές Οι υπερελικώσεις συμπυκνώνουν ακόμα περισσότερο το DNA Βρόχοι Κυκλικό χρωμοσωμικό DNA Χρωμοσωμικό βακτηριακό DNA σε μορφή βρόχων με συνδεδεμένες πρωτεΐνες Υπερελικωμένο χρωμοσωμικό DNA Εικόνα 2. Βαθμοί συμπύκνωσης του βακτηριακού χρωμοσωμικούdna.

7 βάσεων. Οι αναδιπλώσεις αυτές σχηματίζονται γύρω από έναν «πυρήνα» που συνίσταται κυρίως από RNA. Το βακτηριακό χρωμόσωμα, όπως και το ευκαρυωτικό γονιδίωμα, παρουσιάζει τη χαρακτηριστική μορφή «κομπολογιού με χάντρες», όπου η υπερελίκωση του DNA φαίνεται να προκαλείται από τη δράση ιόντων μαγνησίου, μικρού μοριακού βάρους πολυαμινών, δομικών πρωτεϊνών αλλά και πιθανώς από μία βακτηριακή ιστόνη. Τα πλασμίδια από την άλλη μεριά δεν είναι συνδεδεμένα με πρωτεΐνες, έτσι αποτελούνται από γυμνό DNA. Περιέχουν συνήθως γονίδια. Υπό φυσιολογικές συνθήκες το πλασμιδιακό DNA επίσης βρίσκεται σε υπερελικωμένη μορφή, η οποία προκύπτει από την εισαγωγή περιελίξεων στη δίκλωνη κυκλική έλικα του DNA. Κατά την αντιγραφή του πλασμιδίου η υπερελικωμένη αυτή μορφή, που σε αυτή τη στερεοδιαμόρφωση δεν είναι προσβάσιμη από την DNA πολυμεράση, με τη δράση τοποϊσομερασών και ενδονουκλεασών μετατρέπεται σε ανοιχτό, κυκλικό μόριο DNA ώστε να επιτευχθεί η αντιγραφή του (Εικόνα 3). Οι διαφορετικές αυτές στερεοδιαμορφώσεις του πλασμιδιακού DNA μπορούν να διακριθούν σε ένα πήκτωμα αγαρόζης. Υπερελικωμένο DNA Β DNA γυράση Ενδονουκλεάση Τοποϊσομεράση Ενδονουκλεάση DNA λιγάση Χαλαρό κυκλικό DNA Ανοιχτό κυκλικό DNA Εικόνα 3. Πιθανές διαμορφώσεις του πλασμιδιακού DNA και τα ένζυμα που τις διαμεσολαβούν.

8 1.4. Σημασία - χρήσεις των πλασμιδίων Τα οφέλη που αποκομίζουν τα βακτήρια από την παρουσία των πλασμιδίων είναι πολλαπλά: Τα πλασμίδια παρέχουν έναν άμεσο τρόπο ανταπόκρισης και προσαρμογής των βακτηριακών κυττάρων σε απρόσμενες και ίσως αντίξοες μεταβολές των συνθηκών ζωής τους. Διασπορά γονιδίων με τελικό σκοπό την επιβίωση σε αντίξοες συνθήκες. Περισσότερα βακτήρια για παράδειγμα γίνονται ικανά να επιβιώνουν σε μολυσμένα εδάφη και νερά ή γίνονται ανθεκτικά στα χορηγούμενα αντιβιοτικά. Τα πλασμίδια επομένως συμμετέχουν στη διασπορά της γενετικής πληροφορίας στο περιβάλλον και γι αυτόν ακριβώς το λόγο έχουν βρει ευρύτατο φάσμα εφαρμογών και στη σύγχρονη βιολογική έρευνα, καθώς αποτελούν σημαντικό εργαλείο σε πολλές διαφορετικές διαδικασίες: Είναι άριστοι φορείς κλωνοποίησης που χρησιμεύουν για τον πολλαπλασιασμό, τη λειτουργική ανάλυση και την έκφραση συγκεκριμένων γονιδίων (βλέπε και ασκήσεις «Κλωνοποίηση γονιδίων» και «Βακτηριακός μετασχηματισμός»). Χρησιμοποιούνται στη γονιδιακή θεραπεία σαν φορείς που θα διαμεσολαβήσουν την ένθεση ενός θεραπευτικού γονιδίου σε προεπιλεγμένες χρωμοσωμικές θέσεις του ανθρώπινου γονιδιώματος. Χρησιμοποιούνται ευρέως για την παραγωγή σε μεγάλη ποσότητα συγκεκριμένων πρωτεϊνών, π.χ. ινσουλίνη, αντιβιοτικά, αυξητική ορμόνη, εμβόλια κ.ά. Χρησιμοποιούνται για τη δημιουργία γενετικά τροποποιημένων φυτών κ.ά. 2. Απομόνωση πλασμιδιακού DNA Για να μπορέσουν να χρησιμοποιηθούν τα πλασμίδια πρέπει πρώτα να απομονωθούν σε καθαρή μορφή- από τα βακτηριακά κύτταρα. Γενικά για την απομόνωση του DNA (κάθε είδους DNA, από πλασμιδιακό μέχρι ευκαρυωτικό) έχει αναπτυχθεί ένας μεγάλος αριθμός μεθοδολογιών όπως η εκχύλιση με οργανικούς διαλύτες, ο μαγνητικός διαχωρισμός, η φυγοκέντρηση σε κλίση πυκνότητας χλωριούχου καισίου, η εξαλάτωση, η χρήση ανιοντοανταλλακτικών ρητινών και πιο πρόσφατα η χρήση εμπορικών kits που βασίζονται στην τεχνολογία του διοξειδίου του πυριτίου.

9 Όποια μεθοδολογία και αν ακολουθηθεί, τα βασικά βήματα που πρέπει να επιτευχθούν προκειμένου να απομονωθεί με επιτυχία το DNA είναι η λύση των κυττάρων, ο διαχωρισμός του DNA από τα υπόλοιπα συστατικά του κυττάρου (RNA, πρωτεΐνες, πολυσακχαρίτες, λιπίδια) και τέλος η αποτελεσματική έκλουσή του σε καθαρή μορφή. Πιο συγκεκριμένα: Η λύση των κυττάρων γίνεται συνήθως με χρήση απορρυπαντικών όπως το SDS (Sodium Dodecyl Sulfate), TritonX-100 κ.ά., τα οποία διαλύουν τις μεμβράνες και αποδιατάσσουν τις πρωτεΐνες. Συχνά στο διάλυμα λύσης προστίθενται και ένζυμα που βοηθούν στην αποικοδόμηση των κυτταρικών συστατικών όπως για παράδειγμα η πρωτεϊνάση Κ, που καταστρέφει γλυκοπρωτεΐνες και απενεργοποιεί RNάσες/DNάσες. Με αυτή τη διαδικασία και μετά από φυγοκέντρηση απομακρύνονται τα λιπίδια και τα κυτταρικά υπολείμματα. Οι πρωτεΐνες μετουσιώνονται με τη χρήση οργανικών διαλυτών (π.χ. φαινόλης), χαοτροπικών αλάτων ή πρωτεασών όπως η πρωτεϊνάση Κ. Ακολούθως η μετουσιωμένη πρωτεΐνη διαχωρίζεται από το κυτταρικό εκχύλισμα. Το RNA απομακρύνεται με την προσθήκη RΝΑάσης, η οποία το αποικοδομεί ταχέως. Τέλος, το DNA καθιζάνει / εκλούεται με την προσθήκη κατάλληλων διαλυμάτων όπως αιθανόλη, νερό κ.ά., ανάλογα με τη μεθοδολογία που ακολουθείται. Η απομόνωση πλασμιδιακού DNA απαιτεί ιδιαίτερη προσοχή καθώς προϋποθέτει επιπλέον και το διαχωρισμό του πλασμιδίου από το χρωμοσωμικό DNA. Το κλειδί για το σωστό διαχωρισμό των δύο ειδών DNA είναι το διαφορετικό τους μέγεθος και η μέθοδος λύσης των βακτηριακών κυττάρων που ακολουθείται και ονομάζεται αλκαλική λύση. Η μέθοδος της αλκαλικής λύσης περιλαμβάνει ένα διάλυμα λύσης υψηλού ph που περιέχει SDS, για την αποδιάταξη των πρωτεϊνών, και υδροξείδιο του νατρίου (NaOH), το οποίο αποδιατάσσει το χρωμοσωμικό DNA, το πλασμιδιακό DNA, πρωτεΐνες, και μερικώς το RNA. Είναι σημαντικό το βήμα αυτό να γίνεται γρήγορα γιατί παρατεταμένη επώαση με τους αποδιατακτικούς παράγοντες μπορεί να οδηγήσει σε μη αντιστρεπτή αποδιάταξη του πλασμιδιακού DNA. Στη συνέχεια προστίθεται ένα διάλυμα ουδετεροποίησης, που συνήθως περιέχει οξικό κάλιο (CH 3 COOK), το οποίο εξουδετερώνει τη δράση του NaOH και έτσι το υπερελικωμένο, μικρό πλασμιδιακό DNA επαναδιατάσσεται γρήγορα και

10 παραμένει σε διαλυτή μορφή ενώ το χρωμοσωμικό DNA, που είναι πολύ μεγάλο για να μπορέσει να επαναδιαταχθεί σωστά, παραμένει σε σύμπλεγμα με πρωτεΐνες, SDS και λιπίδια και έτσι μπορεί να απομακρυνθεί από το εκχύλισμα. Είναι επίσης σημαντικό στο βήμα αυτό να μην ανακινείται έντονα το δείγμα με vortex γιατί το χρωμοσωμικό DNAμπορεί να σπάσει σε μικρότερα κομμάτια, τα οποία είναι δυνατό να επαναδιαταχθούν και να παραμείνουν σε διαλυτή μορφή μαζί με το πλασμιδιακό DNA. Για τις ανάγκες της παρούσας εργαστηριακής άσκησης η απομόνωση του πλασμιδιακού DNA θα πραγματοποιηθεί με τη χρήση εμπορικά διαθέσιμων kits. Για το σκοπό αυτό η υδατική φάση του προηγούμενου βήματος μεταφέρεται σε μικρές στήλες όπου το πλασμιδιακό DNA δεσμεύεται ειδικά μέσω μιας κατιονικής γέφυρας- σε μεμβράνες που αποτελούνται από διοξείδιο του πυριτίου (Εικόνα 4). Τα απαραίτητα ιόντα για το σχηματισμό αυτής της κατιονικής γέφυρας παρέχονται από το χαοτροπικό άλας που περιέχεται στο διάλυμα ουδετεροποίησης. Τα εναπομείναντα κυτταρικά Εικόνα 4. Το αρνητικά φορτισμένο DNA δεσμεύεται ειδικά στην επίσης αρνητικά φορτισμένη μεμβράνη πυριτίου μέσω μιας κατιονικής γέφυρας. Η κατιονική αυτή γέφυρα αποτελείται από ιόντα Na + που τα παρέχει το συνοδευτικό ρυθμιστικό διάλυμα. συστατικά απομακρύνονται με διαδοχικά στάδια έκπλυσης. Τελικά το πλασμιδιακό DNA εκλούεται σε μικρό όγκο ρυθμιστικού διαλύματος χαμηλού άλατος ή H 2 O. Τα πλεονεκτήματα αυτής της τεχνολογίας είναι ότι αποτελεί απλή και ταχύτερη διαδικασία από άλλες μεθόδους απομόνωσης DNA, είναι αρκετά αυτοματοποιημένη και παράγει αξιόπιστα και αναπαραγώγιμα αποτελέσματα.

11 3. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ ΑΠΟΜΟΝΩΣΗΣ ΠΛΑΣΜΙΔΙΑΚΟΥ DNΑ 3.1. Υλικά και όργανα Στερεή καλλιέργεια E. Coli με το πλασμίδιο ενδιαφέροντος Αποστειρωμένο θρεπτικό υλικό LB (Luria Bertani) εμποτισμένο με κατάλληλο αντιβιοτικό Αποστειρωμένες οδοντογλυφίδες Αποστειρωμένοι δοκιμαστικοί σωλήνες Αποστειρωμένες πιπέτες (10 ml και 5 ml) και μικροπιπέτες των 1000 μl και 200 μl. Αποστειρωμένα σωληνάκια eppendorf και αποστειρωμένα ρύγχη μικροπιπετών 1000 μl και 200 μl Μαρκαδόρος μόνιμης γραφής Εμπορικά διαθέσιμο kit απομόνωσης πλασμιδιακού DNA που περιέχει τα διαλύματα λύσης, ουδετεροποίησης, έκλουσης Επιτραπέζια φυγόκεντρος Μικροβιολογικός αναδευτήρας στους 37 C Λύχνος Bunsen Αλκοόλη εμπορίου Χρονόμετρο Γάντια 3.2. Πειραματική πορεία Σημείωση: Η σειρά και οι όγκοι των διαλυμάτων που χρησιμοποιούνται για την απομόνωση του πλασμιδιακού DNA μπορεί να αλλάζουν ανάλογα με το διαθέσιμο kit. Η συγκεκριμένη πειραματική πορεία αναφέρεται στο kit της εταιρείας Macherey-Nagel. 1. Κάθε ομάδα φοιτητών έχει παρασκευάσει, στην σχετική άσκηση παρασκευής διαλυμάτων, διάλυμα θρεπτικού μέσου LB (Luria-Bertani), ph=7, το οποίο έχει αποστειρωθεί σε διάταξη υγρής αποστείρωσης και αποθηκευτεί σε θερμοκρασία

12 δωματίου ή στους +4 C μέχρι την χρήση του. Βεβαιωθείτε ότι το θρεπτικό μέσο είναι σε θερμοκρασία δωματίου πριν τη χρήση του. Ανάβετε το λύχνο Bunsen και φροντίζετε να δουλεύετε πάντα κοντά στη φλόγα ώστε να εξασφαλίσετε άσηπτες συνθήκες. Τοποθετείτε 9ml θρεπτικού μέσου σε ένα αποστειρωμένο δοκιμαστικό σωλήνα και στη συνέχεια προσθέτετε την κατάλληλη ποσότητα αντιβιοτικού (στην παρούσα άσκηση προσθέτετε 9 μl αμπικιλίνης αρχικής συγκέντρωσης 50 mg/ml). Με μια αποστειρωμένη οδοντογλυφίδα εμβολιάζετε το θρεπτικό μέσο με μια μοναδική αποικία E. coli από τη στερεή καλλιέργεια που θα σας δοθεί από τους επιβλέποντες της άσκησης. Αφήνετε την υγρή καλλιέργεια να επωαστεί υπό ανάδευση Ο/Ν (overnight, δηλαδή για περίπου 16 ώρες) σε ανακινούμενο επωαστικό θάλαμο σε θερμοκρασία 37 C και ταχύτητα 220 rpm. 2. Μεταφέρετε 2 ml από την πυκνή πλέον υγρή καλλιέργεια σε ένα σωληνάκι eppendorf των 2 ml και σημαίνετε το σωληνάκι με μαρκαδόρο μόνιμης γραφής. Φυγοκεντρείτε το σωληνάκι σε επιτραπέζια φυγόκεντρο για 1 min σε rpm σε θερμοκρασία δωματίου ώστε τα βακτηριακά κύτταρα να καταβυθιστούν στο ίζημα. Με προσοχή απορρίπτετε το υπερκείμενο διάλυμα. 3. Επαναλάβετε το βήμα Προσθέτετε στο ίζημα των βακτηριακών κυττάρων 250 μl διαλύματος επαναδιαλυτοποίησης. Το διάλυμα αυτό συνήθως περιέχει Tris, EDTA, γλυκόζη και RNάση. Το EDTA εμποδίζει τη δράση των DNασών ώστε να μη καταστραφεί το πλασμίδιο ενώ η γλυκόζη ρυθμίζει την οσμωτική πίεση. Η RNάση χρησιμεύει για την υδρόλυση του RNA. Φροντίζετε να επαναδιαλύσετε καλά το ίζημα μέχρις ότου το διάλυμα να είναι ομοιογενές χωρίς συσσωματώματα κυττάρων. 5. Προσθέτετε 250 μl διαλύματος λύσης και αναδεύετε το σωληνάκι απαλά 6-8 φορές με το χέρι σας. Παρατηρήστε ότι το διάλυμα αποκτά υψηλό ιξώδες (γίνεται παχύρευστο). Αφήνετε το σωληνάκι για 5min σε θερμοκρασία δωματίου. 6. Προσθέτετε 300 μl διαλύματος ουδετεροποίησης και αναδεύετε το σωληνάκι απαλά 6-8 φορές με το χέρι σας. Παρατηρήστε το σχηματισμό ενός θολού λευκού σύννεφου που περιέχει το χρωμοσωμικό DNA ενώ το πλασμιδιακό DNA βρίσκεται στο διαυγές διάλυμα. Σημείωση: Η ήπια ανάδευση είναι πολύ σημαντική στα βήματα 5 και 6 ώστε να μην κομματιαστεί το χρωμοσωμικό DNA και να είναι αποτελεσματική η απομάκρυνσή του

13 στα μετέπειτα βήματα. 7. Φυγοκεντρείτε το σωληνάκι για 6 min σε rpm σε θερμοκρασία δωματίου για να καθιζάνουν στο ίζημα όλα τα βακτηριακά κατάλοιπα. 8. Μεταφέρετε το διαυγές υπερκείμενο διάλυμα (μέγιστος όγκος 750 μl) σε μια στήλη πυριτίου την οποία έχετε προσαρμόσει σε ένα σωληνάκι eppendorf των 2 ml από το οποίο έχετε κόψει το καπάκι. Σημαίνετε τη στήλη με μαρκαδόρο μόνιμης γραφής. 9. Φυγοκεντρείτε για 1 min σε rpm σε θερμοκρασία δωματίου για να δεσμευτεί το πλασμιδιακό DNA στο φίλτρο πυριτίου της στήλης. Απορρίπτετε το υγρό από το σωληνάκι και επανατοποθετείτε σε αυτό τη στήλη. 10. Επαναλαμβάνετε τα βήματα 8 και 9 σε περίπτωση που το υπερκείμενο διάλυμα του βήματος 7 είναι περισσότερο από 750 μl. 11. Προσθέτετε στη στήλη 600 μl διαλύματος πλύσης που περιέχει 70% αλκοόλη για την απομάκρυνση των αλάτων από το DNA. 12. Φυγοκεντρείτε για 1 min σε rpm σε θερμοκρασία δωματίου. Απορρίπτετε το υγρό από το σωληνάκι και επανατοποθετείτε σε αυτό τη στήλη. 13. Φυγοκεντρείτε ξανά την άδεια στήλη για 2 min σε rpm σε θερμοκρασία δωματίου για να απομακρυνθούν πλήρως τα υπολείμματα του αλκοολικού διαλύματος. 14. Τοποθετείτε τη στήλη σε ένα καθαρό σωληνάκι eppendorf από το οποίο έχετε κόψει το καπάκι. Σημαίνετε το σωληνάκι με μαρκαδόρο μόνιμης γραφής. Σημείωση: Ο λόγος για τον οποίο κόβονται τα καπάκια από τα σωληνάκια eppendorf που χρησιμοποιείτε στην άσκηση είναι για να μην αποκοπούν βιαίως κατά τη φυγοκέντρηση και προκαλέσουν βλάβη στο μηχάνημα. 15. Προσθέτετε στη στήλη 30 μl διαλύματος έκλουσης το οποίο έχετε προηγουμένως θερμάνει στους 37 C. Επωάζετε για 5 min σε θερμοκρασία δωματίου και στη συνέχεια φυγοκεντρείτε για 1 min σε rpm σε θερμοκρασία δωματίου. Σημείωση: Φροντίζετε να ρίξετε το διάλυμα έκλουσης ακριβώς πάνω στο φίλτρο και όχι στα τοιχώματα της στήλης. Καθώς είναι πολύ μικρός ο όγκος του προστιθέμενου διαλύματος υπάρχει κίνδυνος να μείνει στα τοιχώματα της στήλης και έτσι να μην ανακτηθεί το DNA από το φίλτρο. 16. Προαιρετικό: Για καλύτερη ανάκτηση του πλασμιδιακού DNA το βήμα 15 επαναλαμβάνεται.

14 17. Απορρίπτετε τη στήλη. Το πλασμιδιακό DNA φυλάσσεται στο σωληνάκι eppendorf στους 4 C ή στους -20 C. 4. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ S.Β. Primrose, R.Μ. Twyman and R.W. Old. Principles of Gene Manipulation, Sixth edition. Blackwell Science Ltd, Molecular Biology Problem Solver: A Laboratory Guide. Edited by Alan S. Gerstein. Wiley-Liss Inc., S. Harisha. Biotechnology Procedures and Experiments Handbook. Infinity Science Press LLC, 2007.