«ΒΙΟΧΗΜΙΚΕΣ ΚΑΙ ΜΕΤΑΒΟΛΙΚΕΣ ΑΝΤΙ ΡΑΣΕΙΣ ΤΗΣ ΤΣΙΠΟΥΡΑΣ (Sparus aurata) ΚΑΤΑ ΤΟΝ ΕΓΚΛΙΜΑΤΙΣΜΟ ΤΗΣ ΣΕ ΙΑΦΟΡΕΣ ΘΕΡΜΟΚΡΑΣΙΕΣ»

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥ ΩΝ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗ Υ ΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΙ Υ ΑΤΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΩΝ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑΣ ΖΩΩΝ Κωνσταντίνος Φειδάντσης Βιολόγος «ΒΙΟΧΗΜΙΚΕΣ ΚΑΙ ΜΕΤΑΒΟΛΙΚΕΣ ΑΝΤΙ ΡΑΣΕΙΣ ΤΗΣ ΤΣΙΠΟΥΡΑΣ (Sparus aurata) ΚΑΤΑ ΤΟΝ ΕΓΚΛΙΜΑΤΙΣΜΟ ΤΗΣ ΣΕ ΙΑΦΟΡΕΣ ΘΕΡΜΟΚΡΑΣΙΕΣ» ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ, 27

2 Επιβλέπων Βασίλειος Μιχαηλίδης, Αναπληρωτής Καθηγητής Τριµελής Εξεταστική Επιτροπή Βασίλειος Μιχαηλίδης, Αναπληρωτής Καθηγητής Αντιγόνη Λάζου, Καθηγήτρια Ευθυµία Αντωνοπούλου, Λέκτορας Η έγκριση της παρούσης διπλωµατικής εργασίας υπό του Τµήµατος Βιολογίας της Σχολής Θετικών Επιστηµών του Αριστοτελείου Πανεπιστηµίου Θεσσαλονίκης δεν υποδηλοί αποδοχή των γνωµών του συγγραφέος (Ν.5343/1932, αρθρ. 22, παρ. 2)

3 Στην οικογένεια µου

4 Ευχαριστίες Ευχαριστώ θερµά τον επιβλέποντά µου, Αναπληρωτή Καθηγητή κ. Βασίλειο Μιχαηλίδη για την εµπιστοσύνη που µου έδειξε αναθέτοντας µου τη συγκεκριµένη εργασία, για την καθοδήγηση και τη στήριξη του σε όλη τη διάρκεια του µεταπτυχιακού µου. Ευχαριστώ την Καθηγήτρια κ. Αντιγόνη Λάζου για όλες τις χρήσιµες συµβουλές, τόσο σε γνωστικό όσο και σε τεχνικό επίπεδο, καθώς και για την τιµή που µου έκανε να συµµετέχει στην τριµελή µου επιτροπή. Ευχαριστώ την Λέκτορα κ. Ευθυµία Αντωνοπούλου κυρίως σαν φίλη και φυσικά για όλη την βοήθεια που µου πρόσφερε στα πλαίσια του µεταπτυχιακού µου ως διδάσκουσα στο τµήµα. Ευχαριστώ την Επίκουρη Καθηγήτρια κ. Αλεξάνδρα Στάικου για όλη την στήριξη και βοήθεια της. Ευχαριστώ τον Ανδρέα, την Άννα, την Τάρα, την Dana και την Θωµαΐδα για όλη τη βοήθεια και για τις ώρες που περάσαµε µαζί στο εργαστήριο. Ανυποµονώ για καινούρια πειράµατα παιδιά. Το µεγαλύτερο ευχαριστώ, το οφείλω στην οικογένεια µου, στην οποία και αφιερώνω αυτή τη δουλειά.

5 «Το να είναι κάποιος βιολόγος δεν είναι επάγγελµα, αλλά τρόπος ζωής» Ernst Mayr Στο εξώφυλλο το έργο «Ψάρια» του M.C. Escher σε ακουαρέλα

6 Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1 A.1. ΘΕΡΜΟΚΡΑΣΙΑ ΚΑΙ ΖΩΑ 1 A.2. ΚΛΙΜΑΤΙΚΕΣ ΑΛΛΑΓΕΣ ΚΑΙ ΘΕΡΜΙΚΑ ΟΡΙΑ ΟΡΓΑΝΙΣΜΩΝ 2 A.3. ΕΠΙ ΡΑΣΗ ΤΗΣ ΘΕΡΜΟΚΡΑΣΙΑΣ ΣΤΟ ΕΠΙΠΕ Ο ΤΩΝ ΟΡΓΑΝΙΣΜΩΝ 4 A.4. ΕΠΙ ΡΑΣΗ ΤΗΣ ΘΕΡΜΟΚΡΑΣΙΑΣ ΣΕ ΚΥΤΤΑΡΙΚΟ ΕΠΙΠΕ Ο 5 A.4.1. Τα αποτελέσµατα της θερµοκρασίας στις πρωτεΐνες 5 A.4.2. Αποτελέσµατα της θερµοκρασίας στα λιπίδια και τις µεµβρανικές λειτουργίες 6 A.4.3. Αλληλεπιδράσεις θερµοκρασίας - ph 7 A.4.4. Επίδραση της θερµοκρασίας στα νουκλεϊκά οξέα (DNA-RNA) 8 A.4.5. Επίδραση της θερµοκρασίας στην τριτοταγή δοµή του t-rna 8 A.4.6. Επίδραση της θερµοκρασίας στον κυτταρικό σκελετό 9 A.5. ΘΕΡΜΙΚΗ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΤΩΝ ΨΑΡΙΩΝ 9 Α.5.1. Επιδράσεις της θερµοκρασίας στα ψάρια 9 A.5.2. Προσαρµογές των ψαριών στη θερµοκρασία 11 Α Ρύθµιση της θερµοκρασίας του σώµατος µέσω της συµπεριφοράς τους 11 Α Μείωση του µεταβολικού ρυθµού και των φυσιολογικών λειτουργιών 11 Α οµικές και µεταβολικές αλλαγές στο µυϊκό σύστηµα 12 Α Αύξηση της σύνθεσης των ακόρεστων λιπαρών οξέων 12 Α Μηχανισµοί διατήρησης της δραστικότητας των ενζύµων 13 Α Μεταβολές στο ρυθµό µεταφοράς ιόντων και µεταβολιτών στα επιθήλια 15 Α Παραγωγή αντιψυκτικών ουσιών 15 Α Αναδιοργάνωση της µορφολογίας των ιστών και του κυττάρου 16 Α Μεταβολές στη γονιδιακή έκφραση 17

7 A.6. ΠΡΩΤΕΪΝΕΣ ΘΕΡΜΙΚΟΥ ΠΛΗΓΜΑΤΟΣ (HEAT SHOCK PROTEINS - HSPS) 18 Α.6.1. Γενικά για τις hsps 18 Α.6.2. Ο φυσιολογικός ρόλος, η δοµή των hsps και η χρήση τους ως δείκτες στρες 18 A.7. ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΟΥΜΕΝΕΣ ΑΠΟ ΜΙΤΟΓΟΝΑ ΠΡΩΤΕΪΝΙΚΕΣ ΚΙΝΑΣΕΣ (MITOGEN ACTIVATED PROTEIN KINASES MAPKs) 25 Α.7.1. Γενικά για τις MAPKs 25 Α.7.2. p38 MAPK 28 Α.7.3. c-jun N-terminal kinase (JNK) 29 A.8. ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ 32 A.9. ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΟΥ ΕΙ ΟΥΣ 34 A.9.1. Συστηµατική κατάταξη 34 A.9.2. Εξάπλωση 34 A.9.3. Βιολογία, µορφολογία και αναπαραγωγή 35 B. ΜΕΘΟ ΟΛΟΓΙΑ 37 Β.1. Βιολογικό υλικό 37 Β.2. Πειραµατική διαδικασία 38 Β.3. Μέθοδοι ανάλυσης 38 Β.4. Στατιστική επεξεργασία 39 Γ. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 4 Γ.1. ΕΠΙ ΡΑΣΗ ΤΗΣ ΘΕΡΜΟΚΡΑΣΙΑΣ ΣΤΗ ΘΝΗΣΙΜΌΤΗΤΑ 4 Γ.2. ΕΠΙ ΡΑΣΗ ΤΗΣ ΘΕΡΜΟΚΡΑΣΙΑΣ ΣΤΗΝ ΕΚΦΡΑΣΗ ΤΩΝ HSP7 ΚΑΙ HSP9 42 Γ.2.1. Ερυθρός µυς hsp7 42 Γ.2.2. Ερυθρός µυς hsp9 43 Γ.2.3. Λευκός µυς hsp7 44 Γ.2.4. Λευκός µυς hsp9 45 Γ.2.5. Καρδιά hsp7 46 Γ.2.6. Καρδιά hsp9 47 Γ.2.7. Ήπαρ hsp7 48 Γ.2.8. Ήπαρ hsp9 49 Γ.3. ΕΠΙ ΡΑΣΗ ΤΗΣ ΘΕΡΜΟΚΡΑΣΙΑΣ ΣΤΗ ΦΩΣΦΟΡΥΛΙΩΣΗ ΤΗΣ ΚΙΝΑΣΗΣ p38 MAPK 5 Γ.3.1. Ερυθρός µυς φωσφορυλιωµένη p38 MAPK 51 Γ.3.2. Λευκός µυς φωσφορυλιωµένη p38 MAPK 52

8 Γ.3.3. Καρδιά φωσφορυλιωµένη p38 MAPK 53 Γ.3.4. Ήπαρ φωσφορυλιωµένη p38 MAPK 54 Γ.4. ΕΠΙ ΡΑΣΗ ΤΗΣ ΘΕΡΜΟΚΡΑΣΙΑΣ ΣΤΗ ΦΩΣΦΟΡΥΛΙΩΣΗ ΤΩΝ ΚΙΝΑΣΩΝ JNKs 55 Γ.4.1. Ερυθρός µυς φωσφορυλιωµένη p46 JNK MAPK 56 Γ.4.2. Λευκός µυς φωσφορυλιωµένη p46 JNK MAPK 57 Γ.4.3. Καρδιά φωσφορυλιωµένη p46 JNK MAPK 58 Γ.4.4. Ήπαρ φωσφορυλιωµένη p46 JNK MAPK 59. ΣΥΖΗΤΗΣΗ 6 Ε. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ 72 ΣΤ. ΠΕΡΙΛΗΨΗ 73 ABSTRACT 74 Ζ. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 75 Η. ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ 87

9 Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ A.1. ΘΕΡΜΟΚΡΑΣΙΑ ΚΑΙ ΖΩΑ Οι ζωικοί οργανισµοί µπορούν να ζήσουν σε ποικιλία περιβαλλόντων µε θερµοκρασία σώµατος που εκτείνεται σε ένα ευρύ φάσµα από τους -2 C στις θάλασσες της Ανταρκτικής και Αρκτικής εώς τους 5 C σε θερµές πηγές και στις ερήµους (κάποια υδρόβια αρθρόποδα µπορούν να διαβιώσουν σε θερµοκρασίες 49 C και κάποια ψάρια στους 44 C). Ορισµένα ζώα µπορούν να επιβιώσουν και σε πιο ακραίες θερµοκρασίες, όπως για παράδειγµα κάποιοι πολύχαιτοι οι οποίοι ζουν σε υποθαλάσσιες θερµές πηγές στις οποίες η θερµοκρασία ξεπερνάει τους 8 C και κάποια πολικά θηλαστικά και πτηνά τα οποία αντέχουν σε θερµοκρασίες των -8 C (Kay 1998). Για την συντριπτική πλειοψηφία των ζώων, το εύρος της θερµοκρασίας στο οποίο µπορούν να επιβιώσουν είναι πολύ πιο στενό από τα παραπάνω παραδείγµατα (Hochachka & Somero 22). Οι περισσότεροι ζωικοί οργανισµοί προσαρµόζουν τη θερµοκρασία του σώµατός τους µε τη θερµοκρασία του άµεσου περιβάλλοντος. Αντίθετα, τα πτηνά και τα θηλαστικά ρυθµίζουν τη θερµοκρασία του σώµατός τους και τη διατηρούν σχετικά σταθερή, ανεξάρτητα από τις διακυµάνσεις της θερµοκρασίας του άµεσου περιβάλλοντος τους. Μια παλαιότερη ταξινόµηση των ζώων ανάλογα µε τη θερµοκρασία του σώµατος τους ήταν τα ψυχρόαιµα και τα θερµόαιµα ζώα. Αυτό το σύστηµα κατατάσσει τα πουλιά και τα θηλαστικά στα θερµόαιµα και όλα τα υπόλοιπα ζώα στα ψυχρόαιµα. Μια πιο σύγχρονη ταξινόµηση είναι σε εξώθερµα (ποικιλόθερµα) και ενδόθερµα (οµοιόθερµα) ζώα. Ενδόθερµα ζώα είναι εκείνα που έχουν την ικανότητα να διατηρούν υψηλή θερµοκρασία σώµατος µε εσωτερική παραγωγή θερµότητας, ενώ αντίθετα τα εξώθερµα ζώα εξαρτώνται από εξωτερικές πηγές θερµότητας (Kay 1998, Willmer et al. 2, Hochachka & Somero 22). Αν και τα θηλαστικά και τα πτηνά θεωρούνται ότι είναι τα µόνα συνεχώς ενδόθερµα ζώα, υπάρχουν εξαιρέσεις µεταξύ τους. Επιπλέον, η ενδοθερµία είναι ένα φαινόµενο που παρατηρείται και σε άλλες τάξεις ζώων, π.χ. µεγάλα ερπετά και ψάρια που κολυµπούν γρήγορα µπορούν να είναι µερικώς ενδόθερµα, να διατηρούν δηλαδή σταθερές θερµοκρασίες σε ορισµένα τµήµατα του σώµατός τους, καθώς και σε ορισµένα έντοµα κατά την περίοδο της δραστηριότητάς τους (Willmer et al. 2). Λόγω της ύπαρξης, τόσο µεταξύ των σπονδυλωτών όσο και των ασπόνδυλων, ειδών τα οποία κατά τη διάρκεια της δραστηριότητάς τους έχουν ικανότητα εσωτερικής παραγωγής θερµότητας, αλλά δε χαρακτηρίζονται πάντα από διατήρηση σταθερής θερµοκρασίας σώµατος, χρησιµοποιείται ο όρος ετεροθερµία. Τα ετερόθερµα ζώα είναι δυνητικά ενδόθερµα, δηλαδή µπορούν να ελέγχουν τη θερµοκρασία τους, όχι όµως απαραίτητα σε όλη τη διάρκεια του κύκλου ζωής τους (Willmer et al. 2, Hochachka & Somero 22). 1

10 A.2. ΚΛΙΜΑΤΙΚΕΣ ΑΛΛΑΓΕΣ ΚΑΙ ΘΕΡΜΙΚΑ ΟΡΙΑ ΟΡΓΑΝΙΣΜΩΝ Οι κλιµατικές αλλαγές των τελευταίων δεκαετιών και η υπερθέρµανση των ωκεανών λόγω της αύξησης της µέσης παγκόσµιας θερµοκρασίας του πλανήτη έχουν ως αποτέλεσµα διακυµάνσεις των ορίων της θερµοκρασίας σε πολλά χερσαία και υδάτινα οικοσυστήµατα. Οι διακυµάνσεις αυτές ασκούν σηµαντική επίδραση σε όλα τα επίπεδα οργάνωσης των βιολογικών συστηµάτων των ζωικών οργανισµών (Willmer et al. 2). Στα υδάτινα οικοσυστήµατα, κυρίαρχη οµάδα των οποίων είναι τα ψάρια, οι διακυµάνσεις αυτές προκαλούν µεταβολές σε όλες τις βιολογικές και φυσιολογικές λειτουργίες των ποικιλόθερµων ζώων, όπως η αναπαραγωγή, η ανάπτυξη, η αύξηση, η θνησιµότητα και τέλος η γεωγραφική κατανοµή τους, παρόλο που το νερό παρουσιάζει µεγαλύτερη θερµοχωρητικότητα από τον αέρα ο οποίος µπορεί να παρουσιάσει µεγάλες αλλαγές στη θερµοκρασία. (Willmer et al. 2, Pörtner 21). Στα πλαίσια αυτής της υπερθέρµανσης καθίσταται αναγκαίος ο προσδιορισµός των θερµικών ορίων των ψαριών τόσο σε κυτταρικό επίπεδο όσο και σε επίπεδο οργανισµού. Επειδή τα ψάρια είναι ποικιλόθερµα ζώα, η θερµοκρασία του σώµατος τους είναι παρόµοια µε αυτή του περιβάλλοντος τους και ο εγκλιµατισµός τους στην ηµερήσια και εποχική θερµοκρασία του βιοτόπου τους, µπορεί να επηρεάσει την απόκριση τους στις θερµοκρασιακές αλλαγές. Γι αυτό το λόγο είναι πολύ σηµαντικό να γνωρίζουµε τον τρόπο µε τον οποίο ζωικοί οργανισµοί µε διαφορετικό θερµικό ιστορικό, αποκρίνονται στον ίδιο στρεσσογόνο παράγοντα (Werner et al. 26). Στα ψάρια η παραγωγή της θερµότητας βασίζεται σε περιβαλλοντικές πηγές και η ευχέρεια της δραστηριότητας τους περιορίζεται περισσότερο από αυτή των οµοιόθερµων ζώων, τα οποία διατηρούν τη θερµοκρασία του σώµατος τους µε τη βοήθεια της µεταβολικής ενέργειας που προέρχεται από τον κυτταρικό και µιτοχονδριακό µεταβολισµό (Pörtner 21). Πρόσφατες συγκριτικές µελέτες σε θαλάσσιους ποικιλόθερµους οργανισµούς έδειξαν ότι τα όρια ανοχής στις αλλαγές της θερµοκρασίας σχετίζονται άµεσα µε την αεροβική οξειδωτική ικανότητα του οργανισµού, η οποία παίζει θεµελιώδη ρόλο στην προσαρµογή του στις νέες αυτές συνθήκες. Η µείωση της αεροβικής ικανότητας οφείλεται στην προοδευτική υποξία στα σωµατικά υγρά, εξαιτίας της µείωσης της µερικής πίεσης του οξυγόνου (PO 2 ) αλλά και στην περιορισµένη ικανότητα του κυκλοφορικού συστήµατος και των µηχανισµών ανταλλαγής αερίων, µε τελικό αποτέλεσµα την µετάβαση σε µια κατάσταση µειωµένης αεροβικής ικανότητας. Σε υψηλές θερµοκρασίες οι υπερβολικές απαιτήσεις για οξυγόνο έχουν ως αποτέλεσµα ανεπαρκή ποσά οξυγόνου στα σωµατικά υγρά, ενώ σε χαµηλές θερµοκρασίες η περιορισµένη αεροβική ικανότητα των µιτοχονδρίων οδηγεί σε ανεπαρκή αερισµό. Οι θερµοκρασίες (χαµηλή και υψηλή), από τις οποίες ξεκινά η µετάβαση προς µια κατάσταση µειωµένης αεροβικής ικανότητας του οργανισµού, αποκαλούνται θερµοκρασίες pejus T p Ι και T p ΙΙ (Temperature pejus = getting worse = χείριστη θερµοκρασία). Οι θερµοκρασίες αυτές σηµατοδοτούν την έναρξη αντιστοίχων ορίων θερµοκρασίας στα οποία µειώνεται η παροχή οξυγόνου στον οργανισµό (Pörtner 21, Pörtner 22, Pörtner et al. 24). 2

11 Περαιτέρω µείωση ή αύξηση της θερµοκρασίας πέρα από τις T c Ι (ελάχιστη κρίσιµη θερµοκρασία critical minimal temperature) και T c ΙΙ (µέγιστη κρίσιµη θερµοκρασία critical maximum temperature) (Temperature critical = κρίσιµη θερµοκρασία) έχει ως αποτέλεσµα την απώλεια της αεροβικής ικανότητας και τη µετάβαση σε αναερόβιο µεταβολισµό των µιτοχονδρίων, ο οποίος συνεπάγεται την προοδευτική µείωση του ενεργειακού αποθέµατος των κυττάρων. Οι T c είναι θερµοκρασίες έναρξης του αναερόβιου µεταβολισµού και υποδεικνύουν την ανισορροπία ανάµεσα στην παροχή οξυγόνου και τις απαιτήσεις σε αυτό, καθώς και τα εξαιρετικά χαµηλά επίπεδα οξυγόνου στους ιστούς (Εικόνα 1). Σε τέτοιες συνθήκες, προσαρµογές που αφορούν στην πυκνότητα των µιτοχονδρίων και στις λειτουργικές τους ιδιότητες και η παραγωγή πρωτεϊνών θερµικού πλήγµατος (Heat Shock Proteins) και αντιοξειδωτικών καθορίζουν τα χρονικά περιορισµένα όρια ανοχής των οργανισµών και δεν είναι συµβατές µε τη ζωή (Kay 1998, Frederich & Pörtner 2, Pörtner 21, Pörtner 22, Pörtner et al. 24). Γενικά, η µετάβαση σε περισσότερο πολύπλοκες (λειτουργικά και δοµικά) δοµές κατά τη διάρκεια της εξέλιξης έχει µειώσει τα όρια ανοχής των οργανισµών στις µεταβολές της θερµοκρασίας. Η περιορισµένη παροχή οξυγόνου συνεισφέρει στο οξειδωτικό stress και προκαλεί είτε ανεπαρκή λειτουργία των µοριακών δοµών είτε µετουσίωση, που οδηγούν βραχυπρόθεσµα ή µακροπρόθεσµα στο θάνατο (Pörtner 22). Εύρος θερµοκρασιών στις οποίες ο οργανισµός εκδηλώνει την µέγιστη αερόβια ικανότητα Tp: Temperature pejus «Χείριστη θερµοκρασία» Πέρα της θερµοκρασίας αυτής ο οργανισµός παρουσιάζει διάφορες Βιοχηµικές και φαινοτυπικές αλλαγές, όπως και αλλαγές στην συµπεριφορά του Μεταβολικός ρυθµός Tc TpI TpII Tc: Temperature critical, «Κρίσιµη Θερµοκρασία» Τιµή της θερµοκρασίας στην οποία ο οργανισµός ενεργοποιεί διάφορους µηχανισµούς (έκφραση γονιδίων, hsp, ένταση του µεταβολισµού) για να αποφύγει τον θάνατο» Tc Θερµοκρασία o C Εικόνα 1: Γενικό σχήµα των διαδικασιών που παρατηρούνται κατά την διάρκεια του εγκλιµατισµού και της προσαρµογής σε υψηλές θερµοκρασίες, λαµβάνωντας υπ οψην την ιεραρχία των θερµικών ορίων αντοχής και των σχετικών µε αυτά µηχανισµών (Portner et al. 25) 3

12 A.3. ΕΠΙ ΡΑΣΗ ΤΗΣ ΘΕΡΜΟΚΡΑΣΙΑΣ ΣΤΟ ΕΠΙΠΕ Ο ΤΩΝ ΟΡΓΑΝΙΣΜΩΝ Η θερµοκρασία επηρεάζει τον κύκλο ανάπτυξης των ποικιλόθερµων ζώων. Όσο γρηγορότερα αναπτύσσονται τα ζώα τόσο γρηγορότερα ενδέχεται να ωριµάσουν γενετικά και να παράγουν απογόνους. Μπορεί επίσης να αυξηθεί ο όγκος του σώµατός τους, µε αποτέλεσµα να αυξάνεται και ο αριθµός ή ο όγκος του σώµατος των απογόνων. Μια συνέπεια του ταχύτερου ρυθµού ανάπτυξης είναι ότι δεν αποκλείεται να προκύπτουν περισσότερες γενιές κατά τη διάρκεια ενός έτους. Το κατά πόσο εφικτό είναι αυτό εξαρτάται από τις περιβαλλοντολογικές ενδείξεις που χρησιµοποιούν τα ζώα για να εισέλθουν σε διαφορετικά στάδια της ζωής τους (Willmer et al. 2). Η θερµοκρασία καθορίζει επίσης το χρόνο κατά τον οποίο τα ζώα παρουσιάζουν µεγαλύτερη δραστηριότητα. Οι ευνοϊκά υψηλές θερµοκρασίες συνεπάγονται επίσης µικρότερη θνησιµότητα και υποθανατηφόρα καταπόνηση, µεγαλύτερη ελευθερία κινήσεων και καθυστέρηση στην παραγωγή απογόνων. Οι εποχικές αλλαγές στη θερµοκρασία µπορούν να αποτελούν σηµαντική ένδειξη για άλλους σταθµούς στη ζωή των ειδών, όπως η επώαση των αβγών, η έναρξη αναζήτησης συντρόφου και η αναπαραγωγή. Σε δυσχερείς περιβαλλοντικές συνθήκες, για παράδειγµα, η αναπαραγωγή ενδέχεται να καθυστερήσει (Willmer et al. 2, Hochachka & Somero 22). Επίσης το φύλο είναι δυνατό να καθορισθεί από τη θερµοκρασία. Στις χελώνες, καθοριστικός παράγοντας είναι η θερµοκρασία της επώασης των αβγών στις υψηλότερες θερµοκρασίες παρατηρείται αύξηση τόσο του ρυθµού ανάπτυξης όσο και του µεγέθους των εµβρύων (Willmer et al. 2). Οι υψηλότερες θερµοκρασίες ευνοούν τη γέννηση θηλυκών, ενώ οι χαµηλότερες τη γέννηση αρσενικών χελωνών. Το αντίθετο ισχύει για τους αλιγάτορες από αβγά που επωάζονται σε θερµοκρασίες µικρότερες των 3 C προκύπτουν θηλυκά και από αβγά που επωάζονται σε 34 C προκύπτουν αρσενικά. Από µέσες θερµοκρασίες προέρχονται και τα δύο φύλα σε διάφορες αναλογίες (Σκλαβούνου 21). Η µετανάστευση είναι, µαζί µε τη χειµερία νάρκη, ένας εναλλακτικός τρόπος προφύλαξης από δυσχερείς περιβαλλοντικές συνθήκες και είναι µια διαδικασία που ενεργοποιείται κυρίως από την παροχή τροφής και την φωτοπερίοδο και έµµεσα από τη θερµοκρασία. Η µετανάστευση σε γενικές γραµµές περιλαµβάνει µαζική µετατόπιση των ζώων σε διαφορετικούς βίοτοπους. Αν και το ενεργειακό κόστος για τη µετανάστευση είναι συνήθως µικρότερο για τα ψάρια, οι µεγαλύτερες αποστάσεις καλύπτονται από τα πουλιά (Willmer et al. 2). Για παράδειγµα, η κατανοµή του πλαγκτόν σε διαφορετικά βάθη αλλάζει σηµαντικά κατά τη διάρκεια της ηµέρας. Η κάθετη µετανάστευση των ασπόνδυλων είναι µια αντίδραση στο ψύχος του χειµώνα ή στα χαµηλά επίπεδα υγρασίας κατά τις ξηρές περιόδους. Η κατάδροµη µετανάστευση των χελιών και η ανάδροµη µετανάστευση των σολοµοειδών για ανεύρεση τροφής και αναπαραγωγή (Willmer et al. 2). Οι σηµερινές µεταναστευτικές διαδροµές έχουν διαµορφωθεί από την περίοδο του τελευταίου παγετώνα και εξακολουθούν να 4

13 µεταβάλλονται. Οι πορείες και οι προορισµοί µπορεί να ποικίλλουν ανά έτος, ορισµένες φορές ως αποτέλεσµα κλιµατικών αλλαγών που επηρεάζουν τα αποθέµατα τροφής (Willmer et al. 2). A.4. ΕΠΙ ΡΑΣΗ ΤΗΣ ΘΕΡΜΟΚΡΑΣΙΑΣ ΣΕ ΚΥΤΤΑΡΙΚΟ ΕΠΙΠΕ Ο A.4.1. Επίδραση της θερµοκρασίας στις πρωτεΐνες Οι πρωτεΐνες αποτελούν ένα από τα πιο ευαίσθητα στη θερµοκρασία συστατικά του κυττάρου. Η µεγάλη αυτή θερµική ευαισθησία τους οφείλεται βασικά στο ρόλο που παίζουν οι ασθενείς δεσµοί και κυρίως οι δισουλφιδικοί (S-S) στη σταθεροποίηση της πρωτεϊνικής δοµής και στα πολυάριθµα συµπλέγµατα, τα οποία δηµιουργούνται µεταξύ των πρωτεϊνών και των κυτταρικών συστατικών. Οι ανώτερες διαµορφώσεις της δοµής µιας πρωτεΐνης (δευτεροταγής, τριτοταγής και τεταρτοταγής) σταθεροποιούνται σε µεγάλο βαθµό από ασθενείς αλληλεπιδράσεις, οι οποίες επηρεάζονται από αλλαγές της θερµοκρασίας (Somero 1997). Οι δεσµοί υδρογόνου, οι ιοντικές αλληλεπιδράσεις και οι δεσµοί van der Waals αποσταθεροποιούνται σε υψηλές θερµοκρασίες, µε αποτέλεσµα την απώλεια της τρισδιάστατης δοµής και την αναστολή της λειτουργικότητας των πρωτεϊνών (µετουσίωση). Η αύξηση της θερµοκρασίας µέχρι µια τιµή έχει ως αποτέλεσµα την αύξηση της δραστικότητας των πρωτεϊνών, αλλά η αύξηση της θερµοκρασίας πέρα από αυτή την τιµή οδηγεί σε αναστολή της λειτουργίας τους (Somero 1997). Η θερµοκρασία επηρεάζει και το ρυθµό των κινητικών ενζυµικών αντιδράσεων. Ένας δείκτης φυσιολογικής δραστηριότητας είναι ο συντελεστής θερµοκρασίας (Q 1 ), ο οποίος ορίζεται ως η ποσοστιαία αύξηση στην ταχύτητα της αντίδρασης ή µιας φυσιολογικής διεργασίας όταν η θερµοκρασία αυξηθεί κατά 1 C Η τιµή του Q 1 για τις περισσότερες βιολογικές και χηµικές αντιδράσεις είναι συνήθως µεταξύ 2 και 3 και είναι περίπου σταθερή σε πλατιά όρια θερµοκρασιών. Αύξηση της θερµοκρασίας κατά 1 C µπορεί να διπλασιάσει την ταχύτητα µιας αντίδρασης, ενώ σε αντίθετη περίπτωση πτώση της θερµοκρασίας κατά 1 C υποδιπλασιάζει την ταχύτητα της αντίδρασης. Σε υψηλές θερµοκρασίες οι οποίες µπορεί να έχουν θανάσιµα αποτελέσµατα, η τιµή του Q 1 µπορεί να είναι και µικρότερη του 1, γεγονός που υποδηλώνει ότι αυξήσεις στη θερµοκρασία µπορεί να είναι επιβλαβείς στη λειτουργία του κυττάρου και να επιφέρουν ανεπανόρθωτες βλάβες. Αντίθετα σε σχετικά χαµηλές θερµοκρασίες, η τιµή του Q 1 µπορεί να είναι αρκετά µεγαλύτερη του 3, γεγονός που υποδηλώνει τη δυσκολία στη χρησιµοποίηση της ενέργειας για τις βιολογικές αντιδράσεις. Συνεπώς, οι αλλαγές της θερµοκρασίας έχουν πολύπλοκες επιδράσεις στις µεταβολικές αντιδράσεις και µπορούν να οδηγήσουν σε αλλαγές της σχετικής δραστικότητας διαφόρων µεταβολικών οδών, καθώς και του συνολικού µεταβολικού ρυθµού (Hochachka & Somero 22, Pörtner 22). 5

14 A.4.2. Επίδραση της θερµοκρασίας στα λιπίδια και τις µεµβρανικές λειτουργίες Οι κυτταρικές µεµβράνες και κυρίως τα λιπιδικά τους τµήµατα είναι ιδιαίτερα ευαίσθητα σε αλλαγές της θερµοκρασίας. Αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι η θερµοκρασία έχει ισχυρή επίδραση στις φυσικές ιδιότητες των λιπιδίων τα οποία αποτελούν δοµικά το ½ της µεµβράνης, τα οποία µε τη σειρά τους επιδρούν στις πρωτεΐνες της µεµβράνης. Ο κυτταρικός θάνατος σε υψηλές θερµοκρασίες οφείλεται κυρίως σε διακοπές της µεµβρανικής λειτουργίας, και ιδιαίτερα σε ευαίσθητες περιοχές, όπως οι συνάψεις. Σε φυσιολογικές θερµοκρασίες, δηλαδή σε θερµοκρασίες που είναι κοντά στη θερµοκρασία εγκλιµατισµού, τα µεµβρανικά λιπίδια βρίσκονται σε µια σχετικά ρευστή, υγρή κρυσταλλική φάση, στην οποία οι κεφαλές των πολικών οµάδων των λιπιδίων είναι προσανατολισµένες προς τα έξω, µε κατεύθυνση στο υδάτινο µέσο, ενώ οι µη πολικές ακυλ-αλυσίδες είναι προσανατολισµένες εσωτερικά, σχηµατίζοντας την τυπική λιπιδική διπλοστοιβάδα. Σε τέτοιες συνθήκες, οι µη πολικές ακυλ-αλυσίδες είναι κινητικά ενεργές (Somero 1997, Willmer et al. 2, Hochachka & Somero 22). Σε ακραίες θερµοκρασίες, αλλαγές στη λιπιδική δοµή µπορούν να οδηγήσουν σε άλλες φάσεις την κυτταρική µεµβράνη, όπως στην εξαγωνική ή στην κυβική φάση στην οποία παρουσιάζεται αυξηµένη κινητικότητα των ακυλ-αλυσίδων. Τα λιπίδια στην εξαγωνική φάση σχηµατίζουν κυλίνδρους, µε τα εσωτερικά τους κανάλια να είναι γεµάτα νερό. Οι αλλαγές αυτές στις υψηλές θερµοκρασίες έχουν ως αποτέλεσµα τη µετατροπή του κυλινδρικού σχήµατος της µεµβράνης σε κωνικό σχήµα, το οποίο δεν επιτρέπει τη σωστή διάταξη των λιπιδίων (Hazel 1997, Willmer et al. 2). Είναι προφανές ότι η δηµιουργία της εξαγωνικής φάσης και η διατήρησή της µπορούν να δυσχεραίνουν ή και να διακόψουν τη διαπερατότητα της µεµβράνης, µε αποτέλεσµα την κατάρρευση της κυτταρικής δοµής στις υψηλές θερµοκρασίες (Εικόνα 2). Η µείωση της θερµοκρασίας µπορεί να οδηγήσει σε µια άλλη φάση που ονοµάζεται φάση γέλης ή gel φάση, µε αποτέλεσµα τη δηµιουργία ασθενών δεσµών µεταξύ των φωσφολιπιδίων, τη µείωση της ρευστότητάς τους και τον περιορισµό της κινητικότητας των πρωτεϊνών στο λιπιδικό στρώµα (Somero 1997, Hochachka & Somero 22). Αυτό έχει ως αποτέλεσµα την αναστολή της λειτουργίας της αντλίας Na/K-ATPάσης µε συνέπεια την εκπόλωση της µεµβράνης, η οποία ενεργοποιεί τις µεµβρανικές φωσφολιπάσες, οι οποίες προκαλούν την υδρόλυση των λιπιδίων, γεγονός που οδηγεί στην καταστροφή της µεµβράνης και στο θάνατο του κυττάρου (Somero 1997). Σε αντίθεση µε τη µείωση της θερµοκρασίας, αύξηση της θερµοκρασίας εγκλιµατισµού στο χρυσόψαρο (Carassius auratus), αυξάνει τη λειτουργική και θερµική σταθερότητα της αντλίας Na/K-ATPάσης (Willmer et al. 2, Hochachka & Somero 22). Η gel φάση µπορεί να συνυπάρχει µε την υγρή φάση, γεγονός το οποίο προκαλεί τη ρήξη της µεµβράνης λόγω της δηµιουργίας ρηγµάτων στα σηµεία ένωσης των δύο φάσεων από τα οποία γίνεται ανεξέλεγκτη µετατόπιση νερού και ηλεκτρολυτών (Hochachka & Somero 22) (Εικόνα 2). 6

15 Εικόνα 2: Τα αποτελέσµατα της αύξησης της θερµοκρασίας στη φάση και το σχηµατισµό των φωσφολιπιδίων στις βιολογικές µεµβράνες (Hazel 1997). Γενικότερα, αλλαγές στη ρευστότητα της µεµβράνης και στη σύνθεση των συστατικών στοιχείων της συνδέονται άµεσα όχι µόνο µε αλλαγές στις λειτουργίες της, όπως η µεµβρανική διαπερατότητα, η ενεργητική ή παθητική µεταφορά, αλλά και µε νευρικές ή νευροµυϊκές λειτουργίες, µε τη λειτουργία των µιτοχονδρίων, την ενζυµική δραστικότητα και τη δοµική σταθερότητα των πρωτεϊνών (Somero 1997). A.4.3. Αλληλεπιδράσεις θερµοκρασίας - ph Η επίδραση της θερµοκρασίας στην τιµή του ph των σωµατικών υγρών (αίµα, κυτταρόπλασµα) παίζει σηµαντικό ρόλο στη θερµική βιολογία ενός οργανισµού. Σε ποικίλους οργανισµούς οι αλλαγές της θερµοκρασίας του σώµατος συνοδεύονται από αλλαγές στο ph. Για την πλειοψηφία των οργανισµών, οι τιµές του ph στα εξωτερικά και ενδοκυτταρικά υγρά µειώνονται µε την αύξηση της θερµοκρασίας (Somero 1997, Hochachka & Somero 22). Η στενή ρύθµιση του ενδοκυτταρικού ph σε όλους τους τύπους των κυττάρων αντικατοπτρίζει το µεγάλο αριθµό των λειτουργιών και διεργασιών που εξαρτώνται από το ph (Somero 1997, Hochachka & Somero 22): το ενδοκυτταρικό ph επιδρά κυρίως στο µεταβολισµό (γλυκονεογένεση, γλυκόλυση, κατανάλωση και παραγωγή ιόντων Η + ), στον κυτοσκελετό (πολυµερισµός τουµπουλίνης), στη µυϊκή σύσπαση, στη ρύθµιση του όγκου του κυττάρου (µεταβολές ωσµωτικής πίεσης), και στους δευτερογενείς µηνύτορες (camp, ιόντα Ca ++ ), ενεργοποιώντας µονοπάτια επαγωγής σήµατος, και κατ επέκταση ελέγχοντας την ενεργοποίηση ή την καταστολή ενζύµων ή µεταβολικών παραγόντων και άλλων τελεστικών µορίων στο κύτταρο (Somero 1997). Πιο συγκεκριµένα µικρές αλλαγές στην τιµή του ph µπορεί να επιφέρουν σηµαντικές βλάβες στη δοµή και τη λειτουργία των ενζύµων. Τα ένζυµα αποτελούνται από αµινοξέα τα οποία ενώνονται µεταξύ τους µε ασθενείς ιοντικούς δεσµούς. Αλλαγές στο ph µεταβάλλουν την ιονική κατάσταση των χηµικών οµάδων που συµµετέχουν στους δεσµούς, µε αποτέλεσµα τη ρήξη των δεσµών αυτών µε επακόλουθη ρήξη της δοµής του ενζύµου (Kay 1998). 7

16 A.4.4. Επίδραση της θερµοκρασίας στα νουκλεϊκά οξέα (DNA- RNA) Τα νουκλεϊκά οξέα, και κυρίως το RNA, επηρεάζονται κυρίως από τις χαµηλές θερµοκρασίες. Τα ζεύγη βάσεων τα οποία είναι υπεύθυνα για τη σταθεροποίηση της δοµής των νουκλεϊκών οξέων, ενδυναµώνουν όταν η θερµοκρασία ελαττώνεται. Όταν όµως η ελάττωση της θερµοκρασίας είναι πολύ µεγάλη, τότε η δευτεροταγής δοµή των νουκλεϊκών οξέων, η οποία είναι µια εξώθερµη διαδικασία και ευνοείται από την ελάττωση της θερµοκρασίας, γίνεται υπερβολικά σταθερή, µε αποτέλεσµα τη διακοπή φυσιολογικών λειτουργιών των νουκλεϊκών οξέων, όπως είναι η µετάφραση και η µεταγραφή. Συµπεραίνουµε, ότι σε αντίθεση µε τις πρωτεΐνες, των οποίων η δοµή αποσταθεροποιείται σε χαµηλές θερµοκρασίες, στα νουκλεϊκά οξέα συµβαίνει το ακριβώς αντίθετο (Hochachka & Somero 22). A.4.5. Επίδραση της θερµοκρασίας στην τριτοταγή δοµή του t- RNA Η θερµοκρασία στην οποία παρατηρείται αποδιοργάνωση της δοµής του DNA είναι συνήθως µεγαλύτερη από εκείνη στην οποία ένας οργανισµός µπορεί να επιβιώσει. Αντίθετα, η δοµή του t-rna µπορεί εύκολα να αλλοιωθεί µε τις αλλαγές της θερµοκρασίας. Τα µόρια του t-rna είναι µεταφορείς των αµινοξέων και η αλλαγή της τριτοταγούς δοµής τους µπορεί να έχει σαν αποτέλεσµα την αναστολή της ενζυµικής αντίδρασης που καταλύεται από το ένζυµο αµινοακυλ-trnaσυνθετάση, το οποίο είναι υπεύθυνο για τη σύνδεση των αµινοξέων µε τα αντίστοιχα t-rna µόρια. Η αντίδραση που καταλύεται από το ένζυµο αυτό είναι η ακόλουθη: αµινοξύ + ATP + trna αµινοακυλ - trna + AMP + Ppi Κάθε αµινοξύ συνδέεται µε ένα µόριο t-rna και η αντίδραση αυτή καταλύεται από την αντίστοιχη αµινοακυλ-trna-συνθετάση. Το ένζυµο αυτό έχει τρεις διαφορετικές θέσεις σύνδεσης, µία για κάθε υπόστρωµα. Η απώλεια της ικανότητας του ενζύµου να αναγνωρίσει ένα από αυτά τα υποστρώµατα έχει σαν αποτέλεσµα τη λανθασµένη µετάφραση του µορίου m-rna και τη µεταβολή στην πρωτοταγή δοµή των πρωτεϊνών, που µπορεί να καταστεί θανατηφόρα για τον οργανισµό (Willmer et al. 2, Hochachka & Somero 22). Επίσης, οι αλλαγές της θερµοκρασίας µπορούν να µεταβάλλουν µε τέτοιο τρόπο τη δοµή των αµινοακυλ-trna-συνθετασών, ώστε τα ένζυµα αυτά να αναγνωρίζουν διαφορετικά µόρια ως υποστρώµατα t-rna (Willmer et al. 2, Hochachka & Somero 22). 8

17 A.4.6. Επίδραση της θερµοκρασίας στον κυτταρικό σκελετό Η διατήρηση του σχήµατος των κυττάρων, η κινητικότητά τους, καθώς και η κίνηση των χρωµοσωµάτων στηρίζονται στην ύπαρξη των πρωτεϊνικών δοµών που αποτελούν τον κυτταρικό σκελετό. Τα κύρια δοµικά στοιχεία του κυτταρικού σκελετού είναι τα µικροσωληνάρια, τα µικροϊνίδια και τα ενδιάµεσα ινίδια, που αποτελούνται από διάφορες δοµικές πρωτεΐνες. Αλλαγές στη θερµοκρασία είναι δυνατό να µεταβάλουν τη δοµή των στοιχείων αυτών, µε αποτέλεσµα µεταβολές στο σχήµα του κυττάρου, αναστολή της διαίρεσής του, καθώς και απώλεια της ικανότητάς του για κίνηση. Μελέτες ανοσοφθορισµού έχουν δείξει ότι η έκθεση των κυττάρων σε χαµηλές θερµοκρασίες έχει ως αποτέλεσµα αποπολυµερισµό των µικροσωληναρίων, εξαφάνιση των µικροσωληναρίων που αποτελούν τη µιτωτική άτρακτο, µε αποτέλεσµα αναστολή της κυτταρικής διαίρεσης (Willmer et al. 2, Hochachka & Somero 22). A.5. ΘΕΡΜΙΚΗ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΤΩΝ ΨΑΡΙΩΝ Α.5.1. Επιδράσεις της θερµοκρασίας στα ψάρια Οι µεγάλες µάζες του νερού προσφέρουν ένα σχετικά σταθερό περιβάλλον, όσον αφορά την παράµετρο της θερµοκρασίας. Το γεγονός αυτό σε συνδυασµό µε άλλες φυσικοχηµικές παραµέτρους του νερού, επηρεάζουν τη θερµοκρασία των ζώων που ζουν σε αυτό, µε αποτέλεσµα η θερµοκρασία του σώµατος των υδρόβιων εξώθερµων οργανισµών, να είναι ίδια µε τη θερµοκρασία του νερού στο οποίο και διαβιούν (Kay 1998). Η θερµική βιολογία των ψαριών κυριαρχείται από περιορισµούς, οι οποίοι αφορούν κυρίως στην αναπνοή σε υδάτινο περιβάλλον. Εξαιτίας της περιορισµένης διαλυτότητας του οξυγόνου στο νερό, τα ψάρια πρέπει να αυξήσουν τις αναπνευστικές τους επιφάνειες κατά 4 φορές σε σχέση µε τα ζώα της ξηράς, έτσι ώστε να µπορούν να χρησιµοποιούν µια ισοδύναµη ποσότητα οξυγόνου (Block 1991). Η υψηλή θερµική χωρητικότητα του νερού, συνδυαζόµενη µε υψηλά επίπεδα θερµικής διάχυσης, διασφαλίζουν την εξισορρόπηση του κορεσµένου µε οξυγόνο αίµατος των βραγχίων µε τη θερµοκρασία του νερού γιατί όλη µεταβολική θερµότητα που παράγεται σε έναν οργανισµό, χάνεται εύκολα και άµεσα στο υδάτινο περιβάλλον. Σε ένα τυπικό ψάρι, η παραγόµενη από το µεταβολισµό θερµότητα µεταφέρεται µέσω του αίµατος στα βράγχια, από όπου και χάνεται στο περιβάλλον. Αυτό συµβαίνει γιατί για να γίνει η ανταλλαγή των αερίων, ιδιαίτερα σε κατάσταση κίνησης των ψαριών, θα πρέπει ο ρυθµός εµποτισµού των βραγχίων να αυξηθεί. Γι αυτό το λόγο τα βράγχια πρέπει να έχουν λεπτή δοµή και να αιµατώνονται από µεγάλο αριθµό αγγείων (Kay 1998). Η ροή του αίµατος από το κέντρο του σώµατος προς τα βράγχια, µε σκοπό τη µεταφορά του CO 2, προκαλεί ταυτόχρονα και µεταφορά θερµότητας, που διασκορπίζεται στο νερό λόγω της διαφοράς θερµοκρασίας µεταξύ αίµατος και νερού (Kay 1998). Κάτω από αυτές τις συνθήκες είναι αδύνατο ένα ψάρι να διατηρήσει σταθερή τη θερµοκρασία του σώµατός του. 9

18 Εποµένως, η θερµοκρασία των ιστών διαφέρει κατά,5-1 C από τη θερµοκρασία του περιβάλλοντος νερού. Μεταβολές στη θερµοκρασία του σώµατος των ψαριών έχουν αντίκτυπο στη φυσιολογία τους σε δύο κυρίως τοµείς: Η θερµοκρασία καθορίζει το ρυθµό των χηµικών αντιδράσεων και πτώση της θερµοκρασίας κατά λίγους βαθµούς έχει ως αποτέλεσµα την επιβράδυνση του ρυθµού των αντιδράσεων. Η θερµοκρασία υπαγορεύει το σηµείο της ισορροπίας ανάµεσα στο σχηµατισµό και τη διάσπαση των µη ιοντικών δυνάµεων, οι οποίες σταθεροποιούν τόσο µακροµοριακές δοµές (βιολογικές µεµβράνες και αλληλεπιδράσεις υποµονάδων των πρωτεϊνών) όσο και µοριακές δοµές (πρωτεΐνες και νουκλεϊκά οξέα) µεγάλης φυσιολογικής σηµασίας, καθώς και την πρόσδεση των ligands στις πρωτεΐνες. Όλα τα εν ζωή µέλη των τάξεων Άγναθα, Χονδριχθύες και Οστεϊχθύες είναι ποικιλόθερµοι οργανισµοί και η θερµοκρασία του σώµατός τους καθορίζεται από τα θερµικά χαρακτηριστικά του περιβάλλοντος στο οποίο διαβιούν. Παρόλα αυτά, υπάρχουν και κάποιες εξαιρέσεις. Κάποια ψάρια, όπως ο τόνος και ο καρχαρίας, µπορούν να διατηρούν κάποια τµήµατα του σώµατος τους, σε διαφορετικές θερµοκρασίες από κάποια άλλα (Kay 1998). Τα τµήµατα του σώµατος που διατηρούν υψηλότερη θερµοκρασία από αυτή του περιβάλλοντος νερού, είναι κυρίως οι κολυµβητικοί µυς και τµήµατα του πεπτικού σωλήνα. Αυτό επιτυγχάνεται λόγω της παρουσίας ανταλλακτών θερµότητας (heat exchangers) οι οποίοι εντοπίζονται µεταξύ των οργάνων τα οποία έχουν υψηλότερη θερµοκρασία και των βραγχίων. Η βασική αρχή µε την οποία λειτουργούν οι ανταλλακτές θερµότητας είναι η εξής: το ψυχρότερο αρτηριακό αίµα το οποία φτάνει στα όργανα από τα βράγχια ρέει παράλληλα µε το θερµότερο φλεβικό αίµα το οποίο φεύγει από τα παραπάνω όργανα. Η θερµότητα µεταφέρεται από το φλεβικό αίµα στο αρτηριακό και τελικά συσσωρεύεται στα όργανα (Willmer et al. 2). Η ταχύτητα µε την οποία αλλάζει η θερµοκρασία του σώµατος των ψαριών, κατά τη µετακίνησή τους από ένα θερµικό περιβάλλον σε κάποιο άλλο, εξαρτάται βασικά από το µέγεθός τους και διαφέρει, για παράδειγµα, από 1min για µια Alosa pseudoharengus 3g έως 13min για µια πέστροφα 3,6kg. Η θερµοκρασία του σώµατος µπορεί να διαφέρει σηµαντικά από τη θερµοκρασία του περιβάλλοντος για ένα µικρό σχετικά χρονικό διάστηµα, εξαιτίας της θερµικής αδράνειας, η οποία οφείλεται στη θερµοχωρητικότητα των ιστών και σε ποικίλους φυσιολογικούς παράγοντες (Hazel 1997). 1

19 A.5.2. Προσαρµογές των ψαριών στη θερµοκρασία Για να αντιµετωπίσουν τις αλλαγές της θερµοκρασίας, τα ψάρια διαθέτουν µία ποικιλία στρατηγικών προσαρµογής. Οι στρατηγικές αυτές περιλαµβάνουν διάφορους φυσιολογικούς µηχανισµούς, που έχουν ως στόχο τον εγκλιµατισµό των ζώων στις νέες συνθήκες. Α Ρύθµιση της θερµοκρασίας του σώµατος µέσω της συµπεριφοράς τους Τα ψάρια έχουν την ικανότητα να ρυθµίζουν τη θερµοκρασία του σώµατός τους ξεκινώντας τη θερµορυθµιστική συµπεριφορά τους ανταποκρινόµενα σε ερεθίσµατα από τους περιφερικούς και κεντρικούς υποδοχείς. Η επεξεργασία και η ολοκλήρωση του ερεθίσµατος λαµβάνει χώρα στο πρόσθιο τµήµα του υποθαλάµου. Ενδοκυτταρικές καταγραφές των νευρώνων του Lepomis cyanellus έδειξαν την ύπαρξη ευαίσθητων στη θερµοκρασία µονάδων, οι οποίες ανταποκρίνονται κυρίως στην αύξηση της θερµοκρασίας. Ενδοκρανιακές ενέσεις νορεπινεφρίνης στα χρυσόψαρα οδήγησαν σε επιλογή χαµηλότερης θερµοκρασίας νερού, γεγονός το οποίο κατέδειξε ότι η νορεπινεφρίνη αποτελεί µία σηµαντική θερµορυθµιστική παράµετρο που οδηγεί σε µετακίνηση σε περιβάλλον χαµηλής θερµοκρασίας (Crawshaw 198). Στο ίδιο ψάρι, ο αριθµός των συναπτοσωµικών µεµβρανών στον εγκέφαλο, αυξάνεται κατά τον εγκλιµατισµό του σε υψηλές θερµοκρασίες (25 o C), ενώ παραµονή του σε χαµηλότερες θερµοκρασίες (5 o C) διατηρεί τον αριθµό των συναπτοσωµικών µεµβρανών (Willmer et al. 2). Τα πελαγικά ψάρια, όπως το Marone saxatilis, καταλαµβάνουν προοδευτικά βαθύτερες θέσεις στη στήλη του νερού κατά τους καλοκαιρινούς µήνες, για να εντοπίσουν την κατάλληλη για αυτά θερµοκρασία. Οι ετήσιες µεταναστεύσεις του Marone saxatilis και του Myoxocephalus octodecemspinosus θεωρούνται κινήσεις εντοπισµού µιας ζώνης νερού, κατάλληλης για τη θερµοκρασία του σώµατός τους (Coutant 1986). Α Μείωση του µεταβολικού ρυθµού και των φυσιολογικών λειτουργιών Τα ψάρια έχουν την ικανότητα να µειώνουν το µεταβολικό τους ρυθµό και τις φυσιολογικές τους λειτουργίες σε ακραίες περιβαλλοντικές θερµοκρασίες, εισερχόµενα σε µια λανθάνουσα κατάσταση. Ο δείκτης Q 1 για την κατανάλωση οξυγόνου για κάποια ζώα, παρουσιάζει µειωµένη τιµή στην περιοχή των θερµοκρασιών της µέγιστης δραστηριότητας αυτών των ζώων. Το φαινόµενο αυτό έχει ερµηνευθεί ως ένα προσαρµοστικό µέσο για τον έλεγχο της µεταβολικής οµοιόστασης (Willmer et al. 2). Τα αµερικανικά χέλια (Anguilla rostrata) είναι δραστήρια και τρέφονται τακτικά σε θερµοκρασίες από 13 C έως 17 C, αλλά σε θερµοκρασίες κάτω των 8 C παύουν να τρέφονται και θάβονται στη λάσπη. Η λανθάνουσα αυτή κατάσταση µειώνει το µεταβολικό ρυθµό. Τόσο, λοιπόν, στα αµερικανικά χέλια όσο και στα Fundulus heteroclitus, ο δείκτης 11

20 Q 1 για την κατανάλωση οξυγόνου αυξάνεται δραµατικά σε χαµηλές θερµοκρασίες, δείχνοντας έτσι µια µεταβολική ύφεση. Το ενεργειακό απόθεµα που προκύπτει από τη λανθάνουσα κατάσταση κατά τη διάρκεια του χειµώνα θεωρείται απαραίτητο για την ολοκλήρωση του κύκλου ζωής τους (Walsh et al. 1983). Α οµικές και µεταβολικές αλλαγές στο µυϊκό σύστηµα Μία από τις δραστηριότητες που επηρεάζονται από τη θερµοκρασία είναι η κίνηση. ιάφορες µελέτες έχουν γίνει στα ψάρια, προκειµένου να γίνουν κατανοητοί οι µηχανισµοί εκείνοι που διατηρούν τη δραστηριότητα του µυϊκού συστήµατος παρά τις αλλαγές της θερµοκρασίας του σώµατός τους. Κάποιες από αυτές έχουν δείξει ότι τόσο η αναλογία µεταξύ των ερυθρών µυών (οξειδωτικών) και των λευκών µυών (γλυκολυτικών), όσο και η δραστικότητα ορισµένων ενζύµων του µεταβολισµού, µεταβάλλονται σε χαµηλές θερµοκρασίες (Pörtner 22). Ειδικότερα, στο χρυσόψαρο ο αριθµός των ερυθρών µυών και το µέγεθός τους αυξάνει σε σύγκριση µε τους λευκούς µύες κατά τον εγκλιµατισµό του σε χαµηλές θερµοκρασίες. Ταυτόχρονα, οι δραστικότητες ορισµένων ενζύµων, που είναι δείκτες οξειδωτικής ικανότητας των µυών, αυξάνουν στο χρυσόψαρο κάτω από τις ίδιες συνθήκες. Τέτοια ένζυµα είναι η µυονηµατική ATPάση, η αφυδρογονάση του ηλεκτρικού οξέος και η οξειδάση του κυτοχρώµατος c, (Johnston & Temple 22). Αυτό έχει σαν αποτέλεσµα την βελτίωση της σύσπασης των µυών, µε επακόλουθο την αυξηµένη µέγιστη ταχύτητα κολύµβησης σε χαµηλές θερµοκρασίες (Willmer et al. 2). Αντίθετα, παρατηρείται µείωση της δραστικότητας της αφυδρογονάσης του γαλακτικού οξέος, που είναι δείκτης του ρυθµού αναερόβιας οξείδωσης των υδατανθράκων µέσω της γλυκόλυσης, καθώς και αύξηση της µυοσφαιρίνης (Johnston & Temple 22, Pörtner 22). Μελέτες στον κυπρίνο (Cyprinus carpio) έδειξαν ότι η µέγιστη ισοµετρική τάση ήταν 1,3 έως και 2 φορές µεγαλύτερη στους 7 C σε σύγκριση µε τους 23 C, καθώς και ότι η V max (µέγιστη ταχύτητα ενζυµικής αντίδρασης) αύξανε κατά 1,5 φορές κατά τον εγκλιµατισµό του στη χαµηλή θερµοκρασία. Στο ίδιο είδος, η µέγιστη ενεργειακή απόδοση ήταν 26,5W/kg και 18 W/kg σε αντίστοιχες θερµοκρασίες εγκλιµατισµού 8 C και 23 C. Τα στοιχεία αυτά δείχνουν ότι ο εγκλιµατισµός ορισµένων ειδών ψαριών σε χαµηλές θερµοκρασίες συνεπάγεται αύξηση της οξειδωτικής ικανότητας του µυϊκού συστήµατος, προκειµένου να διατηρήσουν σταθερή µυϊκή δραστηριότητα στις θερµοκρασίες αυτές (Lee & Cossins 1988). Α Αύξηση της σύνθεσης των ακόρεστων λιπαρών οξέων Μία από τις κύριες µεταβολές, που παρατηρούνται στους ιστούς των ψαριών κατά τον εγκλιµατισµό τους σε χαµηλές θερµοκρασίες, είναι η αύξηση της σύνθεσης των λιπαρών οξέων και η ποιοτική µεταβολή διάφορων βιολογικών δοµών (µεµβράνες, πολυενζυµικά συστήµατα) όσον αφορά στη σύστασή τους σε λιπαρά οξέα. Από µελέτες που έχουν γίνει, προκειµένου να διαπιστωθεί η τάξη των λιπαρών οξέων που συντίθενται στους ιστούς, βρέθηκε ότι ο ρυθµός σύνθεσης των ακόρεστων λιπαρών οξέων (Unsaturated Fatty Acids) υπερτερεί αυτού των κορεσµένων λιπαρών οξέων (Saturated Fatty Acids) (Willmer et al. 2). 12

21 Μία από τις σηµαντικές βιολογικές λειτουργίες των ακόρεστων λιπαρών οξέων είναι η ενεργοποίηση των βιολογικών συστηµάτων, στα οποία τα λιπίδια είναι απαραίτητα τόσο για τη δοµή των συστηµάτων αυτών, όσο και για τη λειτουργία τους (Hochachka & Somero 22). Ένα από τα ενζυµικά συστήµατα είναι αυτό της αφυδρογονάσης του ηλεκτρικού οξέος. Η δραστικότητα του ενζύµου αυτού αυξάνει στους µύες των ψαριών όταν εγκλιµατίζονται σε χαµηλές θερµοκρασίες. Ηλεκτροφορητικές µελέτες που έγιναν στο πρωτεϊνικό και λιπιδικό τµήµα του ενζυµικού αυτού συστήµατος έδειξαν αύξηση του ποσοστού των ακόρεστων λιπαρών οξέων στο λιπιδικό τµήµα. Αντίθετα, το πρωτεϊνικό τµήµα παραµένει αµετάβλητο κατά την περίοδο του εγκλιµατισµού (Hazel & Laundrey 1988). Η παρουσία των ακόρεστων λιπαρών οξέων έχει ως αποτέλεσµα την ενεργοποίηση, σε µεγαλύτερο βαθµό, του πρωτεϊνικού τµήµατος του ενζυµικού συστήµατος. Η µεταβολή στη σύσταση των λιπιδίων του ενζυµικού συστήµατος της αφυδρογονάσης του ηλεκτρικού οξέος είναι υπεύθυνη για την παρατηρούµενη αύξηση της δραστικότητας του ενζύµου αυτού στους µύες των ψαριών σε χαµηλές θερµοκρασίες (Hazel & Laundrey 1988). Μία άλλη σηµαντική βιολογική λειτουργία των ακόρεστων λιπαρών οξέων είναι η διατήρηση των λειτουργιών των κυτταρικών µεµβρανών σε χαµηλές θερµοκρασίες. Τα ψάρια αποφεύγουν τις επιβλαβείς επιπτώσεις των χαµηλών θερµοκρασιών, χάρη στην ικανότητα που έχουν να αυξάνουν το ποσοστό των ακόρεστων λιπαρών οξέων στο λιπιδικό τµήµα των µεµβρανών. Ο λόγος των ακόρεστων προς τα κορεσµένα λιπαρά οξέα (UFA/SFA) αυξάνει κατά µέσο όρο 1,5 φορές για πτώση της θερµοκρασίας κατά 2 C, και αυτό συµβαίνει εξαιτίας των αυξηµένων ποσοστών πολυακόρεστων λιπαρών οξέων (PUFA), κυρίως σε δραστήρια κατά το χειµώνα είδη. Η αύξηση των ακόρεστων λιπαρών οξέων αποτρέπει, σε χαµηλές θερµοκρασίες, τη σταδιακή µεταβολή της φυσικής κατάστασης των κυτταρικών µεµβρανών από τη ρευστή κατάσταση στην κρυσταλλική. Το αποτέλεσµα είναι να διατηρούνται οι δεσµοί λιπιδίων-λιπιδίων και λιπιδίωνπρωτεϊνών, και συνεπώς οι λειτουργίες των µεµβρανών (Hazel 199, Hazel & Williams 199, Willmer et al. 2). Το παραπάνω φαινόµενο είναι µια πολύ καλή απόδειξη της θερµικής προσαρµογής των µεµβρανών. Ένα χαρακτηριστικό παράδειγµα είναι η σύσταση των κυτταρικών µεµβρανών σε ένα είδος ψαριού στην Ανταρκτική, το Notothenia, στην πέρκας Perca fluviatilis και στο Trichogaster leeri. Στο πρώτο οι µεµβράνες είναι πιο ρευστές σε σχέση µε το δεύτερο και το τρίτο είδος (Hochachka & Somero 22). Α Μηχανισµοί διατήρησης της δραστικότητας των ενζύµων Η µείωση της θερµοκρασίας του συστήµατος κατά τη διάρκεια µίας ενζυµικής αντίδρασης οδηγεί σε µείωση της ταχύτητας της αντίδρασης όταν η συγκέντρωση του ενζύµου διατηρείται σταθερή. Προκειµένου η ταχύτητα να διατηρηθεί σε σταθερά επίπεδα, όταν η θερµοκρασία µειώνεται θα πρέπει να αυξηθεί η συγκέντρωση του ενζύµου (Hochachka & Somero 22). 13

22 Η στρατηγική αυτή παρατηρείται κυρίως στα κύτταρα ψαριών των βορείων γεωγραφικών πλατών. Η δραστικότητα του κυτοχρώµατος c των µιτοχονδρίων στους µύες του χρυσόψαρου έχει βρεθεί ότι αυξάνει κατά 66% όταν το ψάρι εγκλιµατίζεται σε χαµηλές θερµοκρασίες (Hochachka & Somero 22). Αύξηση της συγκέντρωσης του ίδιου ενζύµου έχει βρεθεί και στο ψάρι Lepomis cyanellus κατά τον εγκλιµατισµό του από τους 25 C στους 5 C (Hochachka & Somero 22). Στα ψάρια αυτά οι αλλαγές στη δραστικότητα των ενζύµων συνοδεύεται και από αύξηση του όγκου και της πυκνότητας των µιτοχιονδρίων. Παρόµοιες αλλαγές έχουν αναφερθεί στα είδη Carassius auratus, Carassius carassius, Morone saxatilis, Platichthys flesus, Esox niger, Anguilla anguilla, Cyprinus carpio και Micropterus dolomieui (Guderley 199). Στα ερυρθοκύτταρα της πέστροφας που εγκλιµατίζεται σε χαµηλές θερµοκρασίες παρατηρείται αύξηση της δραστικότητας του ενζύµου Na/K-ATPάσης. Στο σηµείο αυτό πρέπει να τονιστεί ότι η αύξηση της δραστικότητας των ενζύµων δεν αποδίδεται στην αύξηση της συγκέντρωσης τους, αλλά σε αλλαγή του λιπιδικού µικροπεριβάλλοντος τους (Willmer et al. 2, Hochachka & Somero 22). Ένας πιθανός µηχανισµός αύξησης της συγκέντρωσης των ενζύµων σε χαµηλές θερµοκρασίες εγκλιµατισµού είναι η µετατόπιση του σηµείου ισορροπίας µεταξύ του ρυθµού σύνθεσης και αποικοδόµησης των µορίων των ενζύµων. Έχει βρεθεί ότι οι χαµηλές θερµοκρασίες προκαλούν αφενός µεν µείωση του ρυθµού αποικοδόµησης των πρωτεϊνών, µε αποτέλεσµα ο λόγος του ρυθµού σύνθεσης των πρωτεϊνών προς το ρυθµό αποικοδόµησής τους να αυξάνει σε χαµηλές θερµοκρασίες, αφετέρου δε αύξηση του ρυθµού σύνθεσης. Χρησιµοποιώντας ραδιοεπισηµασµένα αµινοξέα, βρέθηκε ότι ο ρυθµός ενσωµάτωσης των αµινοξέων αυτών στις πρωτεΐνες είναι µεγαλύτερος στους ιστούς που έχουν εγκλιµατισθεί σε χαµηλές θερµοκρασίες παρά στους ιστούς που έχουν εγκλιµατισθεί σε υψηλότερες θερµοκρασίες. Παράλληλα, βρέθηκε ότι η δραστικότητα του ενζύµου αµινοακυλοτρανσφεράση, που συµµετέχει στη διαδικασία της πρωτεϊνοσύνθεσης, αυξάνει σε χαµηλές θερµοκρασίες, γεγονός που επιβεβαιώνει την εκδοχή ότι η πρωτεϊνοσύνθεση είναι ένας βασικός παράγοντας αύξησης της συγκέντρωσης των ενζύµων σε χαµηλές θερµοκρασίες (Willmer et al. 2, Hochachka & Somero 22). Ένας άλλος µηχανισµός διατήρησης της δραστικότητας των ενζύµων που παρατηρείται στα πολικά ψάρια, αντίθετα µε τα ψάρια των εύκρατων ζωνών, είναι η αύξηση της καταλυτικής ικανότητας των ενζύµων ανά ενεργό κέντρο, δηλαδή η αύξηση του αριθµού των moles του υποστρώµατος που µετατρέπονται σε προϊόν ανά mol ενζύµου ανά δευτερόλεπτο (k cat ) (Di Prisco et al. 1991). Σε υψηλες θερµοκρασίες, η καταλυτική ικανότητα των ενζύµων µειώνεται λόγω µετουσίωσης των ενζύµων, αλλά αυξάνει η ικανότητα σύνδεσης τους µε το υπόστρωµα (Willmer et al. 2). Ειδικότερα, η µείωση της θερµοκρασίας του κυττάρου οδηγεί σε µείωση της ενέργειας ενεργοποίησης, µε αποτέλεσµα να αυξάνει η καταλυτική ικανότητα, η οποία µεταβάλλεται αντιστρόφως ανάλογα µε τη θερµοκρασία του σώµατος. Η αύξηση της καταλυτικής ικανότητας αντικατοπτρίζεται στις τιµές της k cat, οι οποίες 14

23 αυξάνουν για ένζυµα σε Τελεόστεους που είναι εγκλιµατισµένοι σε χαµηλές παρά σε υψηλές θερµοκρασίες (Hochachka & Somero 22). Α Μεταβολές στο ρυθµό µεταφοράς ιόντων και µεταβολιτών στα επιθήλια Μία από τις λειτουργίες που µεταβάλλονται στα ψάρια, ως αντιστάθµισµα στις χαµηλές θερµοκρασίες, είναι αυτή της µεταφοράς των ιόντων και µεταβολιτών µέσω των επιθηλίων, καθώς και οι λειτουργίες της πέψης (Willmer et al. 2). Ένα σύστηµα που έχει µελετηθεί εκτενώς είναι αυτό του επιθηλίου του λεπτού εντέρου των ψαριών. Στο σύστηµα αυτό τα ιόντα Na µπαίνουν από τον αυλό του εντέρου στα επιφανειακά κύτταρα του επιθηλίου µε διευκολυνόµενη διάχυση. Αντίθετα, η είσοδος των ιόντων Na από τη βάση των κυττάρων αυτών στα κύτταρα του ορογόνου υµένα γίνεται µε ενεργό µεταφορά. Κατά τη µεταφορά αυτή δηµιουργείται ένα δυναµικό που κυµαίνεται από 2mV έως 3mV. Η τιµή του δυναµικού αυτού όµως αυξάνεται σε ορισµένα είδη ψαριών κατά τον εγκλιµατισµό τους σε χαµηλές θερµοκρασίες (Hochachka & Somero 22). Τα στοιχεία αυτά δείχνουν ότι ο εγκλιµατισµός συνοδεύεται από µία αύξηση του ρυθµού µεταφοράς των ιόντων µέσω του εντερικού τους επιθηλίου. Το γεγονός αυτό έχει µεγάλη σηµασία, εφόσον η πρόσληψη διαφόρων µεταβολιτών από το ίδιο επιθήλιο γίνεται παρουσία των ιόντων αυτών. Για παράδειγµα, η πρόσληψη της γλυκόζης από τα επιθηλιακά κύτταρα του εντέρου γίνεται µέσω ενός µεταφορέα πρωτεϊνικής φύσεως (περµεάση) που έχει δύο θέσεις σύνδεσης, µία για τη γλυκόζη και µία για τα ιόντα Na. Αύξηση της µεταφοράς των ιόντων Na µέσω του επιθηλίου µπορεί να επιταχύνει την πρόσληψη γλυκόζης από τα κύτταρα του επιθηλίου (Hochachka & Somero 22). Ο ρυθµός πρόσληψης της γλυκόζης από τα επιθηλιακά κύτταρα επηρεάζεται και από τη δοµή του µεταφορέα της γλυκόζης. Έχει βρεθεί ότι σε χαµηλές θερµοκρασίες εγκλιµατισµού γίνεται σύνθεση µίας ισοµορφής του µεταφορέα, η οποία έχει µεγαλύτερη συγγένεια για τα ιόντα Na από την ισοµορφή που συναντάται στο επιθήλιο του εντέρου των ψαριών που έχουν εγκλιµατιστεί σε υψηλότερες θερµοκρασίες (Willmer et al. 2). Α Παραγωγή αντιψυκτικών ουσιών Η ωσµωτική πίεση των υγρών του σώµατος διαφόρων ψαριών που ζουν στις πολικές περιοχές είναι περίπου 3-4mOsm και αντιστοιχεί σε σηµείο πήξης περίπου -,6 C έως -1,9 C, ενώ η θερµοκρασία του θαλάσσιου νερού είναι χαµηλότερη από το σηµείο πήξης των σωµατικών τους υγρών. To φαινόµενο αυτό είναι γνωστό και ως θερµική υστέρηση (Hazel 1997). Από σειρά πειραµάτων που έχουν γίνει, προκειµένου να εξακριβωθεί η φύση των παραγόντων που µειώνουν το σηµείο πήξης των σωµατικών υγρών, βρέθηκε ότι οι παράγοντες αυτοί είναι γλυκοπρωτεΐνες οι οποίες ονοµάζονται αντιψυκτικές γλυκοπρωτεΐνες (Antifreeze glycoprotein AFGP, οι οποίες χαρακτηρίζονται και ως πρωτεϊνες θερµικής υστέρησης thermal hysteresis proteins - THPs), που 15

24 χαρακτηρίζονται ως ειδικές αντιψυκτικές ουσίες. Οι γλυκοπρωτεΐνες σε χαµηλές συγκεντρώσεις αποτελούν εµπόδιο στο σχηµατισµό πάγου και έχουν την ικανότητα να ελαττώνουν το σηµείο πήξης των σωµατικών υγρών, χωρίς να επηρεάζουν το σηµείο τήξης τους (DeVries 1982, Hochachka & Somero 22). Στα ψάρια της Ανταρκτικής βρέθηκαν οχτώ γλυκοπρωτεΐνες, των οποίων το µοριακό βάρος κυµαίνεται από 2.6 έως 34.. Οι γλυκοπρωτεΐνες αποτελούνται από επαναλαµβανόµενες µονάδες αµινοξέων (ala-ala-thr), στα οποία είναι συνδεδεµένοι κάποιοι δισακχαρίτες. Ανάλογα µε τον αριθµό επανάληψης των δοµικών τους µονάδων, οι γλυκοπρωτεΐνες αυτές διακρίνονται σε διάφορες κατηγορίες (DeVries 1988). Κύρια λειτουργία των αντιψυκτικών αυτών πρωτεϊνών είναι η αναστολή ανάπτυξης του κρυσταλλικού πλέγµατος του πάγου µε τη σύνδεση τους µε δεσµούς υδρογόνου µε τις ελεύθερες πολικές οµάδες του νερού του κρυσταλλικού πλέγµατος. Με τον τρόπο αυτό καλύπτουν τις ελεύθερες πλευρές του πλέγµατος αυτού και έτσι, αναστέλλεται η απορρόφηση ελεύθερων µορίων νερού από το κρυσταλλικό πλέγµα και εποµένως αποτρέπεται ο σχηµατισµός πάγου (Willmer et al. 2). Α Αναδιοργάνωση της µορφολογίας των ιστών και του κυττάρου Η αναδιοργάνωση της αρχιτεκτονικής των ιστών και του κυττάρου συνεισφέρει στον εγκλιµατισµό µέσω διαφόρων φυσιολογικών λειτουργιών. Η υπερτροφία του ήπατος και του καρδιακού µυ είναι προσαρµογές που συναντώνται σε χαµηλές θερµοκρασίες. Για παράδειγµα, η µάζα και το πρωτεϊνικό περιεχόµενο σχεδόν διπλασιάζονται κατά τον εγκλιµατισµό του γατόψαρου από τους 25 C στους 15 C. Το πρακτικό αποτέλεσµα του ευρήµατος αυτού είναι ότι η συνολική µεταβολική ικανότητα του ιστού µπορεί να αυξάνει κατά τον εγκλιµατισµό σε χαµηλές θερµοκρασίες, παρά το γεγονός ότι η δραστικότητα των ενζύµων δε µεταβάλλεται (Kent et al. 1988). Επιπρόσθετα, ο εγκλιµατισµός του κυπρίνου από τους 3 C στους 1 C συνοδεύεται από αύξηση του µέσου µήκους και εύρους των λάχνων κατά µήκος του λεπτού εντέρου, µε αποτέλεσµα µία αύξηση της τάξης του 58% στη βλεννώδη επιφάνειά του (Lee & Cossins 1988). Παροµοίως, αλλαγές στην κυτταρική µορφολογία παίζουν βασικό ρόλο στον εγκλιµατισµό των ψαριών σε διάφορες θερµοκρασίες. Για παράδειγµα, το κλάσµα του κυτταρικού όγκου που καταλαµβάνεται από µιτοχόνδρια αυξάνει από 2,9 σε 4,5% στον ερυθρό µυ στο λαβράκι, κατά τον εγκλιµατισµό του από τους 25 C στους 5 C, γεγονός το οποίο, σε συνδυασµό µε την αύξηση της µάζας του ερυθρού µυ, αυξάνει το συνολικό όγκο των µιτοχονδρίων από 2,5 σε 6,7cm 3 ανά 1g σωµατικού βάρους. Η αύξηση του µιτοχονδριακού όγκου αφενός αυξάνει την οξειδωτική ικανότητα του ιστού, αφετέρου µειώνει τις αποστάσεις για τη διάχυση του οξυγόνου και άλλων µεταβολιτών (Hazel 1997). 16

25 Α Μεταβολές στη γονιδιακή έκφραση Οι περισσότερες από τις φυσιολογικές προσαρµογές, που είναι υπεύθυνες για τον εγκλιµατισµό των ψαριών σε διαφορετικές θερµοκρασίες, οφείλονται σε µεταβολές της έκφρασης γονιδίων. Η σύνθεση των πρωτεϊνών θερµικού πλήγµατος (hsps) αποτελεί µία περίπτωση ρύθµισης της θερµοκρασίας µέσω της γονιδιακής έκφρασης. Οι hsps συντίθενται κατά τη διάρκεια απότοµου θερµικού stress και επιτρέπουν σε ένα κύτταρο, και κατ επέκταση στον οργανισµό, να ανεχτεί έκθεση σε θερµοκρασίες, οι οποίες σε άλλες περιπτώσεις θα ήταν θανατηφόρες. Η κύρια δράση τους είναι να βοηθούν τη διαµερισµατοποίηση των πρωτεϊνών και να επιδιορθώνουν λάθη στην αναδίπλωσή τους (Willmer et al. 2). Η µεταφορά της πέστροφας (Oncorhynchus mykiss) από τους 22 C στους 28 C οδηγεί σε άµεση σύνθεση των 27-, 7-, και 87-kDa hsp και σε ανοχή στην έκθεση σε θερµοκρασία 32 C. Επιπρόσθετα, τόσο η έκφραση της hsp 9 στα κύτταρα του εγκεφάλου, όσο και η θερµοκρασία σύνθεσής της (32 C έναντι 28 C) είναι µεγαλύτερη στο Gillicthys miribalis κατά τον εγκλιµατισµό του το καλοκαίρι σε σχέση µε το χειµώνα. Στα ψάρια της Ανταρκτικής η σύνθεση των hsp s ξεκινάει σε θερµοκρασίες γύρω στους 8 C (Hazel 1997). Ο εγκλιµατισµός σε διάφορες θερµοκρασίες οδηγεί σε µεταβολές της σχετικής αναλογίας αλλοενζύµων ή ισοενζύµων µιας συγκεκριµένης πρωτεΐνης, η οποία εκφράζεται σε δεδοµένη θερµοκρασία. Με τον τρόπο αυτό διατηρείται σταθερή η ταχύτητα κατάλυσης της αντίστοιχης ενζυµικής αντίδρασης και παρέχεται η δυνατότητα στα κύτταρα να διατηρήσουν ένα σταθερό µεταβολικό ρυθµό. Η έκφραση του ισοενζύµου Β 4 της LDH σε ιστούς ήπατος του Fundulus heteroclitus αποτελεί ένα παράδειγµα πολυµορφισµού. ύο αλλοένζυµα (LDH-B 4 a και LDH-B 4 b ) ποικίλλουν σε συχνότητα, όσον αφορά στο γεωγραφικό πλάτος. Το b εντοπίζεται στα βόρεια γεωγραφικά πλάτη, σε θερµοκρασίες γύρω στους 1 C, ενώ το a συναντάται σε νότιους πληθυσµούς, σε θερµοκρασίες περίπου 25 C. Επιπρόσθετα, στους 1 C, ο λόγος V max /K m είναι 1,5-2 φορές µεγαλύτερος για το b σε σχέση µε το a αλλοένζυµο, και αυτό δείχνει ότι το αλλοένζυµο των βόρειων γεωγραφικών πλατών είναι καλύτερος καταλύτης σε χαµηλές θερµοκρασίες (Place & Powers 1979, Willmer et al. 2). Ένα παρόµοιο φαινόµενο παρατηρείται και για την οικογένεια των ψαριών Notothennidae και τις ισοµορφές του ενζύµου A 4 -LDH, στα βόρεια και σε µικρότερα γεωγραφικά πλάτη. Η µόνη αλλαγή, τουλάχιστον στα αλλοένζυµα LDH-B είναι η αντικατάσταση µιας σερίνης από µια αλανίνη (Hochachka & Somero 22). ύο ισοµορφες χοληνεστεράσης έχουν παρατηρηθεί και σε πέστροφες που ζουν στους 17 C και στους 2 C αντίστοιχα. Πέστροφες που ζουν στους 12 C παρουσιάζουν και τις 2 ισοµορφές του ενζύµου (Willmer et al. 2). Η επαγωγή ισοενζύµων, τα οποία είναι κατάλληλα να λειτουργήσουν σε υψηλές ή χαµηλές θερµοκρασίες, αποτελεί έναν καλά µελετηµένο µηχανισµό εγκλιµατισµού. Σύνθεση τέτοιων ενζυµικών µορφών έχει αναφερθεί για την ακετυλοτρανσφεράση, για την κινάση του πυροσταφυλικού οξέος, την αφυδρογονάση του µηλικού οξέος, τη συνθετάση του κιτρικού οξέος και για την αφυδρογονάση της 6-φωσφορικής γλυκόζης. 17

26 A.6. ΠΡΩΤΕΪΝΕΣ ΘΕΡΜΙΚΟΥ ΠΛΗΓΜΑΤΟΣ (HEAT SHOCK PROTEINS HSPS) Α.6.1. Γενικά για τις hsps Μία από τις µεγαλύτερες ανακαλύψεις στη βιοχηµεία και κυτταρική βιολογία στα τέλη του προηγούµενου αιώνα ήταν ότι κάποιες από τις πρωτεΐνες που είναι γνωστές ως µοριακές νταντάδες, διαδραµατίζουν σηµαντικό ρόλο στην αναδίπλωση και διαµερισµατοποίηση των πρωτεϊνών σε όλους τους τύπους των κυττάρων. Οι µοριακές νταντάδες κωδικοποιούνται από ένα µεγάλο αριθµό γονιδίων και διαφέρουν σηµαντικά σε µέγεθος, το οποίο εκφράζεται σε kilodaltons (kda). Οι πρώτες µοριακές νταντάδες ανακαλύφθηκαν στη Drosophila melanogaster και ήταν αυτές που επάγονται από υψηλές θερµοκρασίες και γι αυτό το λόγο ονοµάστηκαν πρωτεΐνες θερµικού πλήγµατος (heat shock proteins και µε το ακρωνύµιο τους hsps) (Iwama 1998, Lewis et al. 1999, Hochachka & Somero 22). Οι hsps οµαδοποιούνται σε οικογένειες ανάλογα µε το µοριακό τους βάρος (Morimoto et al. 1994) : 1. hsp9, 2. hsp7, 3. hsp6, 4. hsp4, 5. hsp2-3 ή πρωτεΐνες χαµηλού µοριακού βάρους (LMW-Low molecular Weight) και 6. άλλες πρωτεΐνες για τις οποίες ελάχιστα είναι γνωστά για τη δοµή και τη λειτουργία τους. Α.6.2. Ο φυσιολογικός ρόλος, η δοµή των hsps και η χρήση τους ως δείκτες στρες Οι hsps διαδραµατίζουν ένα πολύ σηµαντικό ζωτικό ρόλο στη διατήρηση της φυσιολογικής κυτταρικής οµοιόστασης, προστατεύοντας το κύτταρο από ποικίλους περιβαλλοντικούς και φυσιολογικούς παράγοντες όπως είναι η θερµοκρασία (Schlesinger, 199, Dietz 1994, Currie & Tufts1997), η υποξία, η ανοξία (Mestril et al.1994, Myrmell et al. 1994) η ισχαιµία, τα ιόντα των βαρέων µετάλλων (Sanders et al. 1991, Bauman et al. 1993, Williams et al. 1996). Οι οργανικοί ρυπαντές (Sanders 199), η υπεριώδης ακτινοβολία (Nipple & Bachofen 1997), η αιθανόλη, η νικοτίνη, η κορτιζόλη και οι κατεχολαµίνες (Fabri et al. 1998, Mommsen et al. 1999) και κάποιοι ιικοί παράγοντες και µοριακές τοξίνες (Chiang et al. 1989, Beckmann et al. 199, Shi & Thomas 1992, Hendrick & Hartl 1993, Yu 1995). Γι αυτούς τους λόγους οι hsps αποτελούν πολύ καλούς δείκτες στρες. Η κυτταρική απόκριση στις υψηλές θερµοκρασίες η οποία και ονοµάζεται απόκριση στο θερµικό στρες (Heat shock response HSR) έχει µελετηθεί εντατικά από το 1962 που περιγράφηκε και χαρακτηρίζεται από την επιλεκτική ενίσχυση της έκφρασης των πρωτεϊνών θερµικού πλήγµατος και είναι ταχύτατη (Hochachka & Somero 22, Werner et al. 26) Αυτό συµβαίνει σε ένα µεγάλο αριθµό ειδών 18

27 (περίπου το 99% του συνόλου) τα οποία ανήκουν σε όλα τα µεγάλα φυλογενετικά δένδρα, δεδοµένου ότι οι hsps ανήκουν σε µια οµάδα υψηλά διατηρηµένων πρωτεϊνών, παρουσιάζοντας ένα ασυνήθιστα υψηλό βαθµό οµοιότητας σε επίπεδο αλληλουχίας αµινοξέων (Parsell & Lindquist 1993) (η hsp7 είναι η πιο υψηλά διατηρηµένη σε σχέση µε τις άλλες hsps) (Lewis et al. 1999), τόσο σε λειτουργικό όσο και σε δοµικό επίπεδο (Hochachka & Somero 22, Lund & Tufts 23, Murtha & Keller 23). Π.χ. η ακολουθία του heat shock factor (hsf) του zebrafish (Danio rerio) παρουσιάζει υψηλή οµολογία µε την αντίστοιχη των θηλαστικών (Rabergh et al. 2). Παρ όλη την καθολική παρουσία αυτών των πρωτεϊνών στα ζώα, υπάρχουν κάποια χαρακτηριστικά παραδείγµατα απουσίας των hsps σε κάποιους οργανισµούς. Ένα στενόθερµο κνιδάριο, το οποίο είναι προσαρµοσµένο στα κρύα νερά, η Hydra oligactis δεν επάγει καµιά hsp σε έκθεση σε θερµικό στρες. Αντί αυτού µετακινείται µακριά από τα νερά στα οποία παρατηρείται το θερµικό στρες. Ένα δεύτερο χαρακτηριστικό παράδειγµα της απουσίας των hsps παρατηρείται στο στενόθερµο ανταρκτικό ψάρι Trematomus bernacchii. Σε αυτά τα ακραία στενόθερµα, φαίνεται ότι η απόκριση σε θερµικό στρες, χάθηκε εξαιτίας της εξέλιξης εκατοµµυρίων χρόνων σε ένα κρύο θερµικά σταθερό περιβάλλον (Willmer et al. 2, Hochachka & Somero 22). Οι hsps (και κυρίως οι hsp6, hsp7 και hsp9) διαδραµατίζουν ένα «κρυοπροστατευτικό ρόλο» (π.χ. συµβάλλοντας στην επανάκτηση των λειτουργικών διαµορφώσεων των µετουσιωµένων πρωτεΐνών) κάτω από συνθήκες στρες ενώ παράλληλα προσδιορίζουν και τα ανώτερα θερµικά όρια ανοχής των οργανισµών (Hochachka & Somero 22). Έχει αποδειχθεί µια στενή σχέση µεταξύ της έκφρασης των hsps και της θερµοανθεκτικότητας (αυξηµένη αντίσταση στην υψηλή θερµοκρασία) (Tomanek & Somero 1999). Μελέτες στα ψάρια έχουν δείξει ότι η εµφάνιση και αποικοδόµηση των hsps βρίσκονται σε µια στενή προσωρινή σχέση µε την επαγωγή και εξαφάνιση της θερµοανθεκτικότητας αντίστοιχα, αν και οι αισθητήρες του θερµικού στρες και η ρύθµιση της επαγωγής των hsps δεν έχει πλήρως κατανοηθεί (Basu et al. 22). Οι πρωτεΐνες αυτές είναι απαραίτητες για την ενεργοποίηση ορµονικών πυρηνικών υποδοχέων (Iwama et al. 1998, Werner et al. 26) (και ιδιαίτερα η hsp9, η οποία εµπλέκεται στη ρύθµιση περισσότερων των 1 σηµατοδοτικών µορίων, στη σύνδεση του οιστρογόνου µε τον υποδοχέα του) (Rendell & Currie 25) και συνεργάζονται µε σηµατοδοτικά µόρια του κυτταρικού κύκλου (Werner et al. 26), τα οποία ρυθµίζουν την αύξηση και την ανάπτυξη αλλά και των µονοπατιών του κυτταρικού θανάτου (Nollen & Morimoto 22). Τα υψηλά κυτταρικά επίπεδα των hsps, σε απόκριση σε υψηλές θερµοκρασίες (γεγονός που έχει αναφερθεί σε πολλά είδη ψαριών), µπορούν να αλλάξουν την συνολική απόκριση σε άλλα σήµατα (Nollen & Morimoto 22), και έχει αποδειχθεί επίσης ότι σχετίζονται µε χαµηλές συγκεντρώσεις των ενεργειακών µεταβολικών αποθηκών (Viant et al. 23). Επειδή οι hsps συµµετέχουν σε πολλά σηµατοδοτικά µονοπάτια, είναι απαραίτητη η µελέτη της διανοµής τους στο κύτταρο, για την καλύτερη κατανόηση των παραπάνω µονοπατιών αλλά και των αλληλεπιδράσεων µεταξύ πρωτεϊνών (Rendell & Currie 25). Κάτω από µη στρεσσογόνες συνθήκες ορισµένες hsp s διευκολύνουν τη σωστή αναδίπλωση των νεοσχηµατιζόµενων πρωτεϊνών κατά τη 19

28 µετάφραση και την επακόλουθη διαµερισµατοποίησή τους (Hartl 1996, Hochachka & Somero 22). Η ένταση του στρεσσογόνου ερεθίσµατος, και στη συγκεκριµένη περίπτωση της θερµοκρασίας, εξαρτάται από την θερµοκρασία, το ρυθµό του ερεθίσµατος και τη διάρκεια αυτού (Hochachka & Somero 22). Με άλλα λόγια : Ένταση του θερµικού στρες : θερµοκρασία x ρυθµός του ερεθίσµατος x διάρκεια της έκθεσης σε αυτή τη θερµοκρασία Η αναδίπλωση των πρωτεϊνών στο κύτταρο απαιτεί συνεργασία µεταξύ διαφορετικών πρωτεϊνών θερµικού πλήγµατος όπως είναι οι hsp7 και hsp9 και κάποιοι τύποι συνεργατικών µε τις παραπάνω πρωτεϊνών, όπως είναι και η Hdj-1, ένα µέλος της οικογένειας των hsp4. Οι συνεργατικές µε τις hsps πρωτεΐνες, ενεργοποιούν τις ΑΤΡασες των hsp s, οι οποίες απαιτούν την υδρόλυση του ΑΤΡ για τη λειτουργία τους. Οι hsp7, hsp9 και Hdj-1 διαδραµατίζουν σηµαντικό ρόλο στην αναδίπλωση πολυπεπτιδίων και την επιδιόρθωση βλαβών από υψηλές θερµοκρασίες σε πρωτεΐνες. (Halpin et al. 22, Hochachka & Somero 22). Υπάρχουν και άλλες hsp s χαµηλού µοριακού βάρους (16-24 kda) οι οποίες έχουν µελετηθεί εκτενώς. Η hsp7 είναι η πρωτεΐνη που εκφράζεται συχνότερα σε συνθήκες θερµικού πλήγµατος. Βοηθάει στην αναδίπλωση νεοσχηµατισµένων πολυπεπτιδικών αλυσίδων και παρεµβαίνει στην επιδιόρθωση και αποικοδόµηση των λανθασµένα αναδιπλωµένων και µετουσιωµένων πρωτεϊνών (Kiang & Tsokos 1998). Γι αυτό το λόγο και η hsp7 χρησιµοποιείται ευρέως ως βιοδείκτης του στρες (Enes et al. 26). Η hsp9 υποστηρίζει κυρίως δοµικά στοιχεία του κυτταρικού σκελετού, ένζυµα και υποδοχείς στεροειδών ορµονών (Csermely et al. 1998, Pearl & Prodromou 2. Young et al. 21). Οι hsp7 σε γενικές γραµµές αποτελούνται από την αµινοτελική περιοχή της ΑΤΡασης 44-kDa, την περιοχή σύνδεσης µε τα πεπτίδια 18-kDa και την καρβοξυτελική περιοχή 1-kDa. Η περιοχή σύνδεσης µε τα πεπτίδια αποτελείται από δύο δοµικές µονάδες, µία αποτελούµενη από 8 αντιπαράλληλα β-πτυχωτά φύλλα, µε µια υδροφοβική σπηλιά στην επάνω πλευρά και µια περιοχή α-έλικας, επάνω από την πρώτη (Εικόνα 3) (Wegele et al.24). 2

29 Εικόνα 3: Κρυσταλλική δοµή της hsp7 A. Συνδεόµενη περιοχή της hsp7 B. Περιοχή της ΑΤΡασης και C. Σύνδεση της GrpE στην hsp7 (Wegele et al.24) Οι hsp9 αποτελούνται από 3 κύριες περιοχές: την υψηλά διατηρηµένη αµινοτελική περιοχή της ΑΤΡασης, µια µεσσαία περιοχή και την καρβοξυτελική περιοχή διµερισµού. Η αµινοτελική περιοχή αποτελείται από β-πτυχωτά φύλλα, αντιπαράλληλα στα οποία βρίσκεται µια οµάδα α-ελίκων. Η µεσαία περιοχή αποτελείται από τρία τµήµατα. Το πρώτο αποτελείται από ένα sandwich τριών στρωµάτων α-β-α, το οποίο ακολουθεί το δεύτερο τµήµα που αποτελείται από µικρές α-έλικες και το τρίτο τµήµα που φέρει την δοµή του πρώτου (α-β-α sandwich). Η µεσαία περιοχή συµµετέχει στη σύνδεση µε τα υποστρώµατα της hsp9. η καρβοξυτελική περιοχή φέρει µια περιοχή υψηλού διµερισµού (Εικόνα 4) (Wegele et al. 24). 21

30 Εικόνα 4: Κρυσταλλική δοµή της hsp9 Α. Περιοχή της ΑΤΡασης Β. Μεσαία περοχή της hsp9 και C. Σύνδεση της Hop στην hsp9 (Wegele et al. 24) Η σύνδεση µεµονωµένα της hsp7 και της hsp9 είναι πιθανόν να κρατάει τις µερικώς ξεδιπλωµένες πρωτεΐνες σε µία µέση κατάσταση αναδίπλωσης, παρεµποδίζοντας το περαιτέρω ξεδίπλωµα και τη µετουσίωση τους. Παρόλα τα παραπάνω, η οµάδα των hsp7, hsp9, Hdj-1 και ΑΤΡ, δεν µπορούν να επιδιορθώσουν βλάβες σε πρωτεΐνες που έχουν µετουσιωθεί σε πολύ µεγάλο βαθµό (Εικόνα 5) (Hochachka & Somero 22). Εικόνα 5: ύο µεγάλα µονοπάτια για τις ξεδιπλωµένες ή µερικώς ξεδιπλωµένες πρωτεΐνες. Αν και η άµεση σύνδεση της hsp7 µε τις ξεδιπλωµένες πρωτεΐνες και η µεταφορά µερικών από αυτές στην hsp9 είναι γενικά αποδεκτή διαδικασία, δεν είναι ακόµα ξεκάθαρο σε τι βαθµό η hsp9 αλληλεπιδρά άµεσα µε τις ξεδιπλωµένες πρωτεΐνες (Wegele et al. 24). 22

31 Εκτός από περιπτώσεις στρες, είναι γενικά αποδεκτό, ότι οι hsp7 και hsp9 σε κύτταρα θηλαστικών, προϋπάρχουν στο κυτταρόπλασµα και σε µικρότερη ποσότητα στον πυρήνα, σε µη στρεσσογόνες συνθήκες (Rendell & Currie 25). Στις ίδιες συνθήκες η hsp7 έχει ανιχνευθεί και σε άλλους οργανισµούς όπως οι σαλαµάνδρες, οι χελώνες και τα ψάρια (Das et al. 1994). Ανάλυση των γονιδίων των πρωτεϊνών θερµικού πλήγµατος και η σύγκριση των ρυθµιστικών στοιχείων του θερµικού στρες από µια ποικιλία οργανισµών οδήγησε στην ταυτοποίηση ενός παλινδροµικού στοιχείου του θερµικού στρες (heat shock element hse) που έχει την ακόλουθη ακολουθία βάσεων: CNNGAANNTTCNNG (Bienz & Pelham 1987) και βρίσκεται στον προαγωγέα των γονιδίων των hsp (Murtha & Keller 23). Έχει αποδειχθεί ότι η επαγωγή των hsps είναι αποτέλεσµα της σύνδεσης ενός ενεργοποιηµένου µεταγραφικού παράγοντα θερµικού στρες (heat shock transcription factor hsf) σε µία ακολουθία hse των hsp γονιδίων (Morimoto et al. 1992). Στη µαγιά και στη δροσόφιλα υπάρχει ένας hsf, σε αντίθεση µε τους 2 ή περισσότερους που έχουν αναφερθεί στην τοµάτα, στους ανθρώπους, στα ποντίκια και στα κοτόπουλα. Μόνο ένας από αυτούς, ο hsf1 που φέρει µια συνδεόµενη µε το DNA περιοχή περίπου 1 αµινοξέων στο αµινοτελικό άκρο, είναι ικανός να ρυθµίζει τα hsp γονίδια (Εικόνα 6). Εικόνα 6: Ρύθµιση της µεταγραφής του γονιδίου των hsp s από τον hsf (Cambridge University Press) Τη συνδεόµενη µε το DNA περιοχή, ακολουθεί µια άλλη περιοχή, η οποία περιλαµβάνει 3 επαναλήψεις φερµουάρ λευκίνης και είναι υπεύθυνη για τον τριµερισµό του hsf1. Οι δύο αυτές περιοχές είναι πολύ υψηλά διατηρηµένες σε πολλούς οργανισµούς. Στη δροσόφιλα και τους ανώτερους ευκαρυώτες, υπάρχει και ένα επιπλέον φερµουάρ λευκίνης 4 στο καρβοξυτελικό άκρο (Iwama et al. 1998) (Εικόνα 7). 23

32 Εικόνα 7: ιάγραµµα της δοµής του hsf (Iwama et al. 1998) Σε φυσιολογικά ευκαρυωτικά κύτταρα ο hsf1 συνυπάρχει στο κυτταρόπλασµα σαν ένα ανενεργό µονοµερές συνδεδεµένο µε τις hsp7 και hsp9 (Zou et al. 1998). Κατά την επιβολή στρεσσογόνων συνθηκών, ο hsf1 απελευθερώνεται από τις hsp7 και hsp9, οι οποίες πλέον δρουν ως µοριακές νταντάδες προλαµβάνοντας την µετουσίωση των πρωτεϊνών (Morimoto et al. 1996). Μετά την απελευθέρωση του, ο hsf1 ενεργοποιείται µε φωσφορυλίωση και τριµερισµό, και µπορεί πλέον να ενεργοποιήσει τα hsp γονίδια. H διαδιακασία αυτή είτε περιλαµβάνει αλληλεπίδραση µε άλλα µεταγραφικά µόρια όπως είναι ο HSBP (heat-shock factor binding protein) (Sarge et al. 1993) και / ή µε φωσφορυλίωση συγκεκριµένων αµινοξικών κατάλοιπων σερίνης στον hsf1 (Xia & Voellmy 1997). Κυρίως η hsp7 διαδραµατίζει σηµαντικό ρόλο στην διατήρηση του hsf1 στην ανενεργό του κατάσταση απουσία στρες ρυθµίζοντας αρνητικά τη µεταγραφική δραστικότητα του hsf1 µε µικρή επίδραση στη σύνδεση του DNA ή επαγωγή της φωσφορυλιωµένης κατάστασης του, και στην ενεργοποίηση του παρουσία στρεσσογόνου παράγοντα. (Shi et al. 1998, Zou et al. 1998). Φαίνεται ότι η hsp9 επηρεάζει τη λειτουργική κατάσταση του hsf1 δρώντας ως καταπιεστής της λειτουργίας του (Hochachka & Somero 22). Με άλλα λόγια, µια άλλη λειτουργία των hsps είναι ο έλεγχος της σύνθεσης τους, διαµεσολαβώντας στην δραστικότητα του hsf1 (Morimoto 1998). Πρέπει να επισηµανθεί ότι κατά την διάρκεια του στρες, δεν αυξάνεται η ποσότητα του hsf1 που παράγεται, αλλά η ρύθµισή της δραστικότητας του σε ένα µετα-µεταγραφικό επίπεδο που περιλαµβάνει ολιγοµερισµό, µετατόπιση και υπερφωσφορυλίωση (Baler et al. 1993, Cotto et al. 1996). Συγκεκριµένα, η κυτταρική απόκριση είναι αποτέλεσµα µιας µεταγραφικής ενεργοποίησης, η οποία περιλαµβάνει την απελευθέρωση του hsf από τις hsp7 και hsp9 (Morimoto et al. 1996), τη µετατόπιση και την εντόπιση του στον πυρήνα των κυττάρων, όπου τελικά και τριµερίζεται. Ο τριµερισµένος hsf τελικά συνδέεται µε το hse (Westwood et al. 1991). Η µεταγραφική ενεργοποίηση του hsf γίνεται µε φωσφορυλίωση από µέλη των ενεργοποιούµενων από µιτογόνα πρωτεϊνικών κινασών (Morimoto 1998). Επειδή τα hsp γονίδια δεν περιέχουν ιντρόνια, το mrna µεταφράζεται άµεσα σε πρωτεΐνες, µέσα σε ελάχιστα λεπτά από την έκθεση του οργανισµού σε θερµικό στρες (Iwama et al. 1998, Iwama et al. 23). Στο σηµείο αυτό πρέπει να τονιστεί ότι στα ψάρια η θερµοκρασία η οποία επάγει τη σύνθεση των hsp δεν είναι γενετικά σταθερή, αλλά διαφέρει ανάλογα µε 24

33 τον εγκλιµατισµό ή την εξελικτική ιστορία του ψαριού. Πρόσφατες έρευνες στο είδος Gillicthys mirabilis έδειξαν ότι η θερµοκρασία ενεργοποίησης του hsf σχετίζεται µε την προηγούµενη θερµοκρασία εγκλιµατισµού του ψαριού (Dietz & Somero 1992, Dietz 1994). Τα ψάρια προσφέρουν ένα πολύ καλό µοντέλο µελέτης των hsp s, όσον αφορά τη ρύθµιση τους και τη λειτουργική τους σηµασία γιατί (Basu et al. 22): 1. γιατί είναι χορδωτά µε πολύπλοκα συστήµατα οργάνων 2. υπάρχει πολλή πληροφορία για τη φυσιολογία τους σε σχέση µε το στρες και 3. µπορούν να διατηρηθούν πολύ εύκολα σε εργαστηριακές συνθήκες Τα τελευταία χρόνια όµως υποστηρίζεται από πολλούς ερευνητές ότι οι ενεργοποιούµενες από µιτογόνα πρωτεϊνικές κινάσες (Μitogen activated protein kinases MAPKs) µεσολαβούν για την επαγωγή και άλλων πρωτεϊνών θερµικού πλήγµατος µεγαλύτερου µοριακού βάρους. A.7. ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΟΥΜΕΝΕΣ ΑΠΟ ΜΙΤΟΓΟΝΑ ΠΡΩΤΕΪΝΙΚΕΣ ΚΙΝΑΣΕΣ (MITOGEN ACTIVATED PROTEIN KINASES MAPKs) Α.7.1. Γενικά για τις MAPKs Τα σηµατοδοτικά µονοπάτια των ενεργοποιούµενων από µιτογόνα πρωτεϊνικών κινασών (MAPKs) παίζουν σηµαντικό ρόλο στη ρύθµιση της γονιδιακής έκφρασης (Yang et al. 23) και σε πληθώρα άλλων φυσιολογικών λειτουργιών στα ευκαρυωτικά κύτταρα όπως η οργάνωση του κυτταρικού σκελετού, η οµοιόσταση του µεταβολισµού, η κυτταρική αύξηση και η απόπτωση (Seger & Krebs 1995, Robinson & Cobb 1997, Widmann et al. 1999). Η µεταφορά σηµάτων από το εξωκυτταρικό περιβάλλον στο εσωτερικό του κυττάρου γίνεται µε µια πληθώρα υποδοχέων της κυτταρικής επιφάνειας όπως οι GPCRs (G-protein coupled receptors), οι RTKs (Receptor tyrosine kinases) και οι υποδοχείς κυτοκίνης. Οι υποδοχείς αυτοί ενεργοποιούν ακολουθίες από ενεργοποιούµενες από µιτογόνα πρωτεϊνικες κινασες (MAPKs) οι οποίες δρουν ως µόρια-µεταφορείς πληροφορίας στο εσωτερικό του κυττάρου. Με αυτό τον τρόπο οι MAPKs µεταφέρουν σήµατα από την πλασµατική µεµβράνη (Khodolenko 23), τα οποία µπορεί να είναι ορµόνες, αυξητικοί παράγοντες, κυτοκίνες και περιβαλλοντικά ερεθίσµατα (Farooq & Zhou 24), σε κρίσιµους κυτταρικούς στόχους, αποµακρυσµένους από την µεµβράνη, όπως για παράδειγµα στους µεταγραφικούς παράγοντες (Khodolenko 23). Ένας από τους κύριους µηχανισµούς οι οποίοι επηρεάζουν τις αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση, συµβαίνει µέσω των MAPKs οι οποίες αυξάνουν την δραστικότητα των µεταγραφικών παραγόντων και καταστέλλουν την δραστικότητα των συγγενικών γονιδίων στόχων. Πολυάριθµοι µεταγραφικοί παράγοντες και οι ρυθµιστικές τους πρωτείνες σε θηλαστικά, έχουν αναγνωριστεί ως στόχοι διαφορετικών ακολουθιών MAPK (Yang et al. 23). Στα κύτταρα των θηλαστικών υπάρχουν τέσσερις µεγάλες 25

34 οµάδες MAPKs (Lewis et al. 1998, Kyriakis & Avruch 21) οι οποίες είναι µια οικογένεια υψηλά διατηρηµένων ενζυµικών πρωτεϊνών (Leal et al. 26). Αυτές είναι οι : 1. ρυθµιζόµενη από εξωκυτταρικό σήµα κινάση (extracellular signal regulated kinase ERK) 2. c-jun N-terminal kinase (JNK) 3. p38 4. ρυθµιζόµενη από εξωκυτταρικό σήµα κινάση-5 [ERK5 Big MAP kinase 1 (BMK1)] Αυτές οι οµάδες περιλαµβάνουν µεγάλο αριθµό γονιδιακών προϊόντων και ισοµορφών τους τα οποία προκύπτουν από εναλλακτική συρραφή των πρώιµων mrna (pre-mrnas). Για παράδειγµα 1 ισοµορφές JNKs εκφράζονται στα κύτταρα, οι οποίες προέρχονται από 3 Jnk γονίδια (Jnk1, Jnk2 και Jnk3) (Gupta et al. 1996). Σε αντίθεση µε την ERK η οποία ενεργοποιείται κυρίως από µιτογόνα ερεθίσµατα όπως οι ορµόνες και οι αυξητικοί παράγοντες, οι JNKs και η p38 ενεργοποιούνται από στρεσσογόνα ερεθίσµατα, όπως η υπεροσµωτικότητα και το θερµικό στρες (Lewis et al. 1998, Kyriakis & Avruch 21). Οι κινάσες αυτές µπορούν να κατηγοριοποιηθούν και να αποτελέσουν µια ανεξάρτητη οµάδα, τις ενεργοποιούµενες από στρεσσογόνα πρωτεϊνικές κινάσες (Stress activated protein kinases SAPKs) (Hashimoto et al. 2, Hochachka & Somero 22). Oι JNKs και η p38 ονοµάζονται αντιπροσωπευτικά και SAPK 1 και SAPK 2 αντίστοιχα (Hashimoto et al. 2). Τόσο η p38, όσο και οι JNKs αποτελούν επίσης στόχο µικρών GTPασών πρωτεϊνών της οικογένειας Rho, των Rac. Οι Rac λειτουργούν ως αισθητήρες αλλαγών στον κυτταρικό σκελετό. Οι αλλαγές στον κυτοσκελετό έχουν σαν αποτέλεσµα τη ενεργοποίηση των συγκεκριµένων πρωτεϊνών µε φωσφορυλίωση τους (Hochachka & Somero 22). Η ERK5 ενεργοποιείται τόσο από µιτογόνα όσο και από στρεσσογόνα ερεθίσµατα (Kyriakis & Avruch 21). Όλες οι MAPKs αποτελούνται από ένα οµοδιµερές το οποίο περιέχει την ακολουθία ΤΧΥ-, όπου Τ και Υ, θρεονίνη και τυροσίνη, και όπου Χ, γλουταµίνη, προλίνη ή γλυκίνη, στις ERK, JNK και p38 αντίστοιχα (Farooq & Zhou 24). Οι MAPKs ενεργοποιούνται από φωσφορυλίωση της Thr και Tyr ( pτχpυ-)από τις κινάσες των MAP κινασών (ΜAPKΚ) οι οποίες µε τη σειρά τους ενεργοποιούνται από φωσφορυλίωση της Ser/Thr από τις κινάσες των κινασών των ΜΑΡ κινασών (ΜΑΡΚΚΚ) (Hochachka & Somero 22, Yang et al. 23, Khodolenko 23, Cowan & Storey 23). Η ενεργοποίηση των τελευταίων γίνεται στην κυτταρική µεµβράνη ενώ των ΜΑΡΚΚs και ΜΑΡΚs στο κυτταρόπλασµα (Khodolenko 23). Τα σηµατοδοτικά µονοπάτια ΜΑΡΚ είναι µε άλλα λόγια µια ακολουθία που αποτελείται από τρία επίπεδα (ΜΑΡΚ, ΜΑΡΚΚ και ΜΑΡΚΚΚ) που υπόκεινται σε ρυθµιστικό έλεγχο µέσα στην ακολουθία µέσω πολλαπλών µηχανισµών. Οι µηχανισµοί αυτοί περιλαµβάνουν πρότυπα συγκεκριµένης έκφρασης ΜΑΡΚ για κάθε ιστό ή όργανο, ειδίκευση του ερεθίσµατος που ενεργοποιεί τις ΜΑΡΚs αλλά και του υποστρώµατος αυτών σε κάθε κυτταρικό τύπο, τροποποίηση των ΜΑΡΚ αποκρίσεων µέσω ενεργοποιητών, ανασταλτικών παραγόντων, αλληλεπιδράσεων µε άλλες 26

35 πρωτεΐνες, µηχανισµούς θετικής και αρνητικής ανάδρασης και επίδραση µε άλλα ΜΑΡΚ και άλλα σηµατοδοτικά µονοπάτια (Εικόνα 1) (Cowan & Storey 23). Οι ενεργοποιηµένες ΜΑΡΚs χαρακτηρίζονται από την παρουσία τους τόσο στον πυρήνα όσο και στο κυτταρόπλασµα, όπου και αντιδρούν µε τα υποστρώµατα τους (Αggeli et al. 21). Αµέσως µόλις ενεργοποιηθούν, οι MAPKs µπορούν απευθείας να φωσφορυλιώσουν πρωτείνες οι οποίες περιέχουν το ελάχιστο µοτίβο φωσφορυλίωσης Ser/Thr-Pro (Yang et al. 23). H φωσφορυλίωση µπορεί να γίνει είτε στον πυρήνα είτε στο κυτταρόπλασµα και πολλοί από τους στόχους µπορεί να είναι µεταγραφικοί παράγοντες όπως οι Egr-1, c-jun, c-fos και ATF2, και µεταγραφικοί συνενεργοποιητές (Hochachka & Somero 22, Yang et al. 23, Farooq & Zhou 24) (Εικόνα 8). Εικόνα 8: Οργάνωση των ΜΑΡΚ ακολουθιών στα θηλαστικά στην οποία υπάρχουν 3 επίπεδα (ΜΑΡΚΚΚ, ΜΑΡΚΚ και ΜΑΡΚ). (Cowan & Storey 23) Η ενεργοποίηση των µεταγραφικών παραγόντων έχει σαν άµεσο αποτέλεσµα την γονιδιακή µεταγραφή σηµαντικών κυτταρικών πρωτεϊνών και κυτοκινών αλλά και ΜΚΡs (mitogen activated protein kinase phosphatases). Οι ΜΚΡs είναι µια οικογένεια πρωτεϊνικών φωσφατασών οι οποίες απενεργοποιούν τις MAPKs είτε αποφωσφορυλιώνοντας την τυροσίνη, είτε τη θρεονίνη, είτε και τις δυο, προσφέροντας έτσι ένα µηχανισµό αρνητικής ανάδρασης στη δραστικότητα των MAPKs (Tamura et al. 22). Οι ΜΚΡ1 και 2 δεν είναι ειδικές και αποφωσφορυλιώνουν τις ERKs, τις JNKs και την p38 (Chu et al. 1996), ενώ η ΜΚΡ3 είναι ειδική µόνο για τις ERK1 και 2, και η φωσφατάση Μ3/6 για τις JNKs και την p38. Οι ΜΚΡs διαχωρίζονται επίσης ανάλογα µε την ενδοκυτταρική τους θέση (Muda 27

36 et al. 1996). Άλλες βρίσκονται µόνο στο κυτταρόπλασµα (ΜΚΡ3) και άλλες µόνο στον πυρήνα (ΜΚΡ1) (Εικόνα 9) (Cowan & Storey 23). Ενεργή ΜΑΡΚ Ανενεργή ΜΑΡΚ Ενεργή ΜΑΡΚ Ανενεργή ΜΑΡΚ Εικόνα 9: Μοντέλο της επαγώµενης από το υπόστρωµα καταλυτικής δραστικότητας.των ΜΚΡ. Απουσία υποστρώµατος, η DSP περιοχή της ΜΚΡ βρίσκεται σε ανενεργή κατάσταση. Σύνδεση της ΜΚΒ περιοχής της ΜΚΡ στην ενεργοποιηµένη ΜΑΡΚ, έχει σαν αποτέλεσµα την αύξηση των αλληλεπιδράσεων µεταξύ των DSP και ΜΚΒ και µετάβαση της ΜΚΡ σε ενεργό κατάσταση. Αυτό έχει σαν τελικό αποτέλεσµα την απενεργοποίηση της ΜΑΡΚ (Farooq & Zhou 24). Οι MAPKs φωσφορυλιώνουν και ενεργοποιούν πρωτεϊνικές κινάσες στις οποίες συµπεριλαµβάνονται η ριβοσωµική κινάση S6 (Ribosomal S6 kinase RSK), η αλληλεπιδρώσα µε τη MAPK κινάση [MAPK interacting kinase (MNK)], η κινάση η ενεργοποιούµενη από µιτογόνα και στρεσσογόνα ερεθίσµατα (mitogen and stress activated kinase MSK), οι ΜΑΡΚΑΡs και η MLCK, πολλές από τις οποίες ρυθµίζουν τη γονιδιακή έκφραση µέσω φωσφορυλίωσης των ιστονών και µεταγραφικών ρυθµιστικών πρωτεινών (Lewis et al. 1998, Kyriakis & Avruch 21, Hochachka & Somero 22). ύο υποστρώµατα της p38, οι MAPKAPK-2 και -3, φωσφορυλιώνουν και ενεργοποιούν ένα µικρό µέλος της οικογένειας των hsps, την hsp27 (Joyeux-Faure et al. 23). Α.7.2. p38 MAPK Η p38 (Εικόνα 1) ενεργοποιείται από περιβαλλοντικό στρες όπως η θερµότητα, το οσµωτικό και οξειδωτικό στρες, η ιονίζουσα ακτινοβολία, αλλά και από κυτοκίνες και τον TNF (tumor necrosis factor) (New & Han 1998). Οι MAPKKs οι οποίες δρουν πάνω στην p38 περιλαµβάνουν τις ΜΚΚ 3 και 6 (Chan-Hui & Weaver 1998, Hashimoto et al. 2). Οι MAPKKs αυτές έχουν επιλεκτική επίδραση σε διαφορετικές ισοµορφές της p38, οι οποίες µε τη σειρά τους ενεργοποιούνται από τις MEKKs, MLKs και ASK1. Οι GTP, συµπεριλαµβανοµένων των Racs, Rhos και Cdc42s είναι υπεύθυνες για τη µεταβίβαση του στρεσσογόνου ερεθίσµατος στις MAPKKΚs του συγκεκριµένου µονοπατιού. Οι πέντε ισοµορφές της p38 (p38α, p38β, p38γ, p38δ και p38-2) διαφέρουν ανάλογα µε την ειδικότητα του υποστρώµατος τους. Η α και η β ισοµορφή είναι υπεύθυνες για την ενεργοποίηση των 28

37 hsp25 και 27και της ΜΑΡΚΑΡ2. Η γ και η δ ισοµορφή ενεργοποιούν τον ATF2, και η p38-2 τον ATF2 και Sap-1a (Stein et al. 1997). Άλλοι µεταγραφικοί παράγοντες οι οποίοι επηρεάζονται από την οικογένεια p38 είναι οι Stat1, Max/Myc, MEF-2A/C, Elk-1 και CREB µέσω της ενεργοποίησης της MSK-1. Γι αυτούς τους λόγους και η οικογένεια p38 συµµετέχει στην κυτταρική κινητικότητα, την µεταγραφή και την αναδόµηση της χρωµατίνης (Kyriakis & Avruch 21). Άλλα υποστρώµατα της p38 περιλαµβάνουν τον ATF2 και CHOP για τη ρύθµιση της γονιδιακής έκφρασης, και τις ΜΑΡΚΑΡΚ3, ΜΑΡΚΑΡΚ5 και Mnk1 (Zhu & Lobie 2). Εικόνα 1: Η Κρυσταλλική δοµή της p38 ( Α.7.3. c-jun N-terminal kinase (JNK) Υπάρχουν τρεις τύποι JNKs, οι JNK1, JNK2 και JNK3. Οι δύο πρώτες είναι γονιδιακά προϊόντα εναλλακτικής συρραφής και εκφράζονται σε πολλούς ιστούς, ενώ η τελευταία εκφράζεται κυρίως στον εγκέφαλο (Davis 2). Οι JNKs (Εικόνα 11) αποκρίνονται σε µια ποικιλία στρεσσογόνων σηµάτων όπως είναι η θερµότητα, το οσµωτικό στρες, οι κυτοκίνες, η ισχαιµία και η υπεριώδης (UV) ακτινοβολία (Irving & Bamford 22). Οι JNKs ενεργοποιούνται µε διπλή φωσφορυλίωση στο µοντέλο Thr-Pro-Tyr από τις JNKΚ1 και JNKΚ2, επίσης γνωστές ως ΜΑΡΚΚ4 (ΜΚΚ4) και ΜΚΚ7 (Hashimoto et al. 2, Tournier et al. 1999). Οι ΜΚΚ4 και ΜΚΚ7 ενεργοποιούνται από τις ΜΑΡΚΚΚs MEKKs 1-4 και ASK, οι οποίες µε τη σειρά τους ενεργοποιούνται από τις GTP συνδεόµενες πρωτεΐνες της οικογένειας Rho (Racs, Rhos και Cdc42s) (Teramoto et al. 1996). Οι MLKs µπορούν να ενεργοποιηθούν και από µια άλλη κινάση, την GCK (germinal center kinase), και εξαιτίας αυτού του γεγονότος οι JNKs ενεργοποιούνται ανεξάρτητα από την παρουσία των GTPασών (Yuasa et al. 1998). Οι JNKs είναι ενεργές ως διµερή, και µε αυτή τη µορφή µετατοπίζονται εκατέρωθεν της πυρηνικής µεµβράνης. Οι JNKs είναι υπεύθυνες για τη φωσφορυλίωση µεταγραφικών παραγόντων όπως οι AP-1, ATF-2, Elk-1, Myc, Smad3, ο ογκοκαταστάλτης p53, NFAT4, DPC4 και η MADD, µια 29

38 πρωτεΐνη κυτταρικού θανάτου. Ο επιλεκτικός έλεγχος των µεταγραφικών παραγόντων έρχεται σε αντίθεση µε τις ERK και p38 ΜΑΡΚs, οι οποίες φωσφορυλιώνουν στόχους τόσο εντός όσο και εκτός του πυρήνα (Hoeflich & Woodgett 21). Οι µεταγραφικοί παράγοντες που ρυθµίζονται από τις JNKs βοηθούν στη ρύθµιση της γονιδιακής έκφρασης σε απόκριση σε ποικιλία κυτταρικών ερεθισµάτων όπως είναι το στρες, οι αυξητικοί παράγοντες και οι κυτοκίνες. Η ενεργοποίηση της JNK σηµατοδότησης σε γενικές γραµµές έχει σαν αποτέλεσµα την απόπτωση, αν και έχει αποδειχθεί ότι προωθεί την κυτταρική επιβίωση κάτω από συγκεκριµένες συνθήκες, και διαδραµατίζει και σηµαντικό ρόλο στην τύχη του κυττάρου κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης (Cowan & Storey 23). Εικόνα 11: Κρυσταλλική δοµή της C-Jun N-terminal kinase ( Εκτός από την ακολουθία Ser/Thr-Pro, είναι πλέον σαφές ότι σε πολλές περιπτώσεις επιπλέον στοιχεία είναι απαραίτητα για να καθορίσουν το υπόστρωµα των MAPKs. Αυτές οι περιοχές ονοµάζονται docking domains και τυπικά χωρίζονται σε δυό κατηγορίες (Sharrocks et al. 2, Enslen & Davis 21): 1. η D περιοχή η οποία χαρακτηρίζεται από την παρουσία ενός συµπλέγµατος από βασικά αµινοξέα το οποίο ακολουθείται από από ένα LxL µοτίβο και / ή µία υδροφοβική τριπλέτα 2. ένα µικρό πεπτίδιο το οποίο περιλαµβάνει την ακολουθία FxF η οποία και έπεται τυπικά της ακολουθίας Ser/Thr-Pro. Η φωσφορυλίωση των µεταγραφικών παραγόντων από τα σηµατοδοτικά µονοπάτια των MAPKs, ρυθµίζει τη δραστικότητα τους µε πολλούς τρόπους (Εικόνα 12) (Yang et al. 23): 1. την ενδοκυτταρική τους θέση πολλοί µεταγραφικοί παράγοντες παραµένουν µόνιµα στον πυρήνα αλλά υπάρχουν και άλλοι οι οποίοι µετακινούνται µεταξύ του κυτταροπλάσµατος και του πυρήνα. Τα σηµατοδοτικά µονοπάτια των MAPKs είτε διεγείρουν την µετατόπιση των µεταγραφικών παραγόντων στον πυρήνα προοθώντας την δραστικότητα τους, είτε τους εξάγουν από τον πυρήνα και τους απενεργοποιούν (Hood & Silver 1999, Yang et al. 23). 3

39 2. τα επίπεδα των πρωτεινών ένας δεύτερος σηµαντικός µηχανισµός για τη ρύθµιση της λειτουργίας του µεταγραφικού παραγόντα είναι και ο έλεγχος της ποσότητας του παράγοντα αυτού. Αυτό γίνεται είτε ρυθµίζοντας τα επίπεδα της γονιδιακής έκφρασης του µεταγραφικού παράγοντα είτε τη σταθερότητα των πρωτεινών (Whitmarsh & Davis 1996, Kato et al. 1997, Yang et al. 23, Farooq & Zhou 24). 3. τη σύνδεση τους µε το DNA η σύνδεση των µεταγραφικών παραγόντων µε τους εκκινητές γονιδίων µπορεί να ρυθµιστεί είτε θετικά είτα αρνητικά µε φωσφορυλίωση. Αυτό συµβαίνει µε άµεση φωσφορυλίωση της συνδεόµενης µε το DNA περιοχής. Εναλλακτικά, η σύνδεση µε το DNA µπορεί να ρυθµίζεται έµµεσα µε φωσφορυλίωση (Yang et al. 23). 4. την αλληλεπίδραση τους µε ρυθµιστικές πρωτείνες πρόσφατες έρευνες δείχνουν ότι οι MAPKs, εκτός από το ρόλο τους στη φωσφορυλίωση των µεταγραφικών παραγόντων, µπορεί να είναι και τµήµατα συµπλεγµάτων µεταγραφικής ενεργοποίησης σε εκκινητές γονιδίων (Yang et al. 23). Εικόνα 12: Τα σηµατοδοτικά µονοπάτια των ΜΑΡ κινασών ρυθµίζουνµε ποικίλους τρόπους τη µεταγραφή. Με την ενεργοποίηση τους οι µεταγραφικοί παράγοντες αλλάζουν τη διαµόρφωση τους και ρυθµίζουν τις λειτουργίες τους όπως τη σύνδεση τους µε το DNA και την αλληλεπίδραση τους µε συνενεργοποιητές ή αναστολείς,οι οποίες όµως υπόκεινται και στην άµεση δράση των ΜΑΡ κινασών (Yang et al. 23) 31

40 A.8. ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ Στην εργασία αυτή µελετήθηκαν οι βιοχηµικές αντιδράσεις της τσιπούρας σε διαφορετικές θερµοκρασίες θαλασσινού νερού. Η µελέτη αυτή αποβλέπει στην κατανόηση των φυσιολογικών και βιοχηµικών µηχανισµών της τσιπούρας σε µια ενδεχόµενη αύξηση της θερµοκρασίας της θάλασσας λόγω της αύξησης της µέσης παγκόσµιας θερµοκρασίας της γης.. Επιπλέον, η έκταση και η διάρκεια των µεταβολών αυτών θα δώσουν χρήσιµες πληροφορίες για τα θερµικά όρια ανοχής της τσιπούρας στις αλλαγές της θερµοκρασίας, που πιστεύεται ότι θα βοηθήσουν σε περαιτέρω προγράµµατα διαχείρισης αυτού του πολύ εµπορικού καλλιεργούµενου είδους. Για το σκοπό της εργασίας µελετήθηκαν πρωτεΐνες που επάγονται από το θερµικό στρες σε τέσσερις ιστούς (καρδιά, ήπαρ, λευκός και ερυθρός µυς) της τσιπούρας µετά από εγκλιµατισµό των ατόµων στις θερµοκρασίες 18 C, 22 C, 24 C, 26 C και 3 C αλλά και η ποσοστιαία θνησιµότητα τους σε αυτές τις θερµοκρασίες. Οι πρωτεΐνες που προσδιορίστηκαν ήταν οι πρωτεΐνες θερµικού πλήγµατος hsp7 και hsp9, και 2 MAPKs: η φωσφορυλιωµένη µορφή της p38 (phospho p38) και η φωσφορυλιωµένη µορφή της p46 JNK (phospho p46 jnk). Η επιλογή της τσιπούρας για τη συγκεκριµένη εργασία έγινε για τους παρακάτω λόγους ( 1. Ένα από τα καλύτερα µελετηµένα και περισσότερο διαδεδοµένα είδη είναι η τσιπούρα, η οποία καλλιεργείται µε µεγαλη επιτυχία στην Ελλάδα, η οποία από την δεκαετία του 199 κατέχει την πρώτη θέση σε παραγωγή τσιπούρας, λαυρακίου και γόνου αυτών στην Ευρώπη (Εικόνα 13). 2. Η τσιπούρα είναι ψάρι µεγάλης εµπορικής αξίας στις αγορές της Μεσογείου και των ακτών του Ατλαντικού Ωκεανού (Εικόνα 13). 9 8 Θαλάσσια αλιευτική παραγωγή (τόνοι) Έτος Εικόνα 13: Η θαλάσσια αλιευτική παραγωγή της τσιπούρας στις ελληνικές θάλασσες από το 1982 ως το 23. (ΕΣΥΕ ) 32

41 3. Είναι ψάρι ευρύαλο και ευρύθερµο. Γενικά προσαρµόζεται εύκολα στην αιχµαλωσία, είναι ανθεκτικό σε διάφορους χειρισµούς και γι αυτό είναι κατάλληλο και για εντατική καλλιέργεια 33

42 A.9. ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΟΥ ΕΙ ΟΥΣ A.9.1. Συστηµατική κατάταξη Sparus aurata Linnaeus, 1758 Το είδος του ιχθύος που µελετήθηκε στην παρούσα εργασία είναι η τσιπούρα (Sparus aurata) (Εικόνες 14 & 15). Η τσιπούρα ανήκει στην οικογένεια των Sparidae και στην τάξη Perciformes των Ακτινοπτερυγωτών. Η οικογένεια των Sparidae περιλαµβάνει 18 γένη και 58 είδη. Το γένος Sparus περιλαµβάνει 5 είδη, τα οποία είναι τα εξής: Sparus aurata, Sparus pagrus, Sparus pagurus, Sparus chrenbergi και Sparus caeruleostictus (Miller & Loates 1997). Η συστηµατική κατανοµή του Sparus aurata είναι η ακόλουθη: Φύλο: Chordata Υποφύλο: Gnathostomata Υπερκλάση: Pisces Κλάση: Osteichthyes Υποκλάση: Actinopterygii Ανθυποκλάση: Teleostei Υπερτάξη: Acanthopterygii Τάξη: Perciformes Υποτάξη: Percoidei Οικογένεια: Sparidae Γένος: Sparus Είδος: Sparus aurata Εικόνες 14 & 15: Εξωτερική µορφολογία της τσιπούρας ( Τα αρχαιότερα απολιθώµατα της οικογένειας χρονολογούνται στο Κάτω Τριτογενές και Κάτω Ηώκαινο (Bauchot & Hureau 199). A.9.2. Εξάπλωση Η τσιπούρα απαντά στο βορειοανατολικό και κεντρικό ανατολικό Ατλαντικό Ωκεανό, στη Μεσόγειο και στη Μαύρη Θάλασσα (Εικόνα 16). Είναι βενθοπελαγικός οργανισµός, που απαντά σε υφάλµυρα και θαλασσινά νερά, σε εύρος βάθους από 1-34

43 15 µέτρα. Κατοικεί σε θαλάσσιες πεδιάδες καθώς και αµµώδη υποστρώµατα, κυρίως σε βάθη των 3 µέτρων, αλλά τα ενήλικα άτοµα απαντούν και σε µεγαλύτερα βάθη των 15 µέτρων. Ζει µοναχικά είτε σχηµατίζει µικρά κοπάδια ( Εικόνα 16: Παγκόσµιος χάρτης κατανοµής της τσιπούρας ( A.9.3. Βιολογία, µορφολογία και αναπαραγωγή Όσον αφορά στη µορφολογία της, αναγνωρίζεται εύκολα από το οβάλ σώµα της, από το αρκετά υψωµένο στη βάση του κεφαλιού προφίλ της ράχης, και από το στρογγυλεµένο προφίλ του κεφαλιού. Το ρύγχος της είναι κοντό και δυνατό, το στόµα σκληρό, µε δυνατές σιαγόνες και γερά δόντια [4-6 εµπρόσθιοι κυνόδοντες (canines) και σειρές γοµφίων (molars)] (Εικόνα 17) (Perosino 1989, Miller & Loates 1997) Εικόνα 17: Μορφολογία της άνω και κάτω γνάθου της τσιπούρας ( Το ραχιαίο πτερύγιο είναι µακρύ και λίγο ανεπτυγµένο, λεπτοί και µυτεροί οι δύο λοβοί του ραχιαίου, ενώ τα πτερύγια του στήθους είναι λεπτά και µακριά. Η ράχη 35

44 είναι γαλαζωπή µε κίτρινες αποχρώσεις, και τα πλευρά ασηµένια µε χρυσές αποχρώσεις και καστανές ραβδώσεις κατά µήκος. Η κοιλιά έχει χρώµα λευκόασηµένιο. Χαρακτηριστικό και διακριτικό γνώρισµα της τσιπούρας είναι η χρυσοκίτρινη λωρίδα που διακρίνεται εύκολα στo ρύγχος της, ανάµεσα στα µάτια και µια χρυσοκόκκινη κηλίδα που διακρίνεται στα βραγχιακά επικαλύµµατά της (Εικόνα 18) (Perosino 1989, Miller & Loates 1997). Το µήκος του µπορεί να φτάσει τα 7 εκατοστά, το βάρος του τα 17 κιλά και η µέγιστη (αναφερόµενη) ηλικία τα 11 έτη ( Εικόνα 18: Εξωτερική µορφολογία της τσιπούρας (Φωτογραφία: Κ.Φειδάντσης ) Η τσιπούρα ανήκει σε τροφικό επίπεδο 2,8 και άνω και είναι θηρευτής που τρέφεται κυρίως µε µακροπανίδα, η οποία αποτελείται κατά βάση από ζωοβένθος. Η δίαιτα του συνίσταται από άλλα ψάρια, φυτοπλανκτό, καλαµάρια, αµφίποδα, βενθικά κωπήποδα, καβούρια, ισόποδα και άλλα βενθικά καρκινοειδή, οστρακόδερµα, δίθυρα µαλάκια, γαστερόποδα και άλλα µαλάκια, ασκίδια, πολύχαιτους και άλλους σκώληκες, αβγά ψαριών και προνύµφες αυτών, κλαδοκερωτά και άλλα πλανκτικά καρκινοειδή ( Όσον αφορά την αναπαραγωγή τους, οι τσιπούρες παρουσιάζουν το φαινόµενο της πρωτανδρίας. Στο τρίτο έτος της ηλικίας τους, τα αρσενικά γίνονται θηλυκά. Η γονιµοποίηση είναι εξωτερική και οι γονείς δεν φροντίζουν τα γονιµοποιηµένα ωάρια. Η αναπαραγωγική περίοδος για το είδος αυτό παρατηρείται τους µήνες Νοέµβριο και εκέµβριο ( Κατά τη διάρκεια της άνοιξης, οι τσιπούρες εγκαταλείπουν τη θάλασσα και παραµένουν όλο το καλοκαίρι σε υφάλµυρες λιµνοθάλασσες. Το φθινόπωρο επιστρέφουν στη θάλασσα για αναπαραγωγή ( 36

45 B. ΜΕΘΟ ΟΛΟΓΙΑ Β.1. Βιολογικό υλικό Για την εκτέλεση του πειράµατος χρησιµοποιήθηκαν 5 δεξαµενές χωρητικότητας 5lt. Τα ψάρια που τοποθετήθηκαν σε αυτές ήταν τσιπούρες (Sparus aurata) 2 ετών, µέσου βάρους 224,5gr και µέσου µήκους (total length) 24,2cm. Τα ψάρια αυτά προσφέρθηκαν από ιχθυογεννητικό σταθµό της εταιρίας ΙΑΣ. Α.Ε. στην περιοχή της Λαµίας. Από εκεί µεταφέρθηκαν στο Αριστοτέλειο Πανεπιστήµιο Θεσσαλονίκης µέσα σε πλαστικά βαρέλια µε συνεχή παροχή οξυγόνου. Αφού µεταφέρθηκαν στο εργαστήριο, αφέθηκαν στις δεξαµενές για να εγκλιµατιστούν για ένα χρονικό διάστηµα περίπου 2 εβδοµάδων πριν την έναρξη της πειραµατικής διαδικασίας. Το νερό στα ενυδρεία περνούσε συνεχώς από φίλτρα µε συνεχή ανακύκλωση ενώ υπήρχε διαρκής παροχή οξυγόνου (O 2 ) µε αντλίες αέρα. Τα πρωτεϊνικά απορρίµµατα και τα υποπροϊόντα του µεταβολισµού των ψαριών αποµακρυνόταν από τα ενυδρεία από τις συσκευές schimmer (Εικόνες 19 & 2). Εικόνες 19 & 2: εξαµενές στις οποίες τοποθετήθηκαν τα προς µελέτη ψάρια και τα φίλτρα µε τα οποία είναι εφοδιασµένες οι δεξαµενές (Φωτογραφία: Κ.Φειδάντσης) Η αλατότητα στα ενυδρεία, καθώς και οι άλλοι φυσικοχηµικοί παράγοντες όπως η αµµωνία, τα νιτρικά και το διαλυµένο στο νερό οξυγόνο, µετρούνταν σε καθηµερινή βάση ώστε να εξασφαλιστούν σταθερές συνθήκες (Πίνακας 1). Σε όλα τα ενυδρεία η αλατότητα διατηρήθηκε κατά την εκτέλεση του πειράµατος σε τιµές από 29 µέχρι 31 ppt. Χορήγηση τροφής (υπό µορφή pellets) γινόταν ανά τρεις ηµέρες. Οι µέσοι όροι των παραπάνω παραµέτρων παρατίθενται στον παρακάτω πίνακα: Πίνακας 1. Μέσοι όροι τιµών των φυσιολογικών παραµέτρων του θαλασσινού νερού Θερµοκρασία Αλατότητα (g/l) Ph O 2 (mg/l) NH 3 (mg/l) - NO 2 (mg/l) - NO 3 (µg/l) 18 o C 29 7,8 7,9,2,2 <12,5 22(±,8) o C 29,1 7,74 7,7,2,3 <12,5 24(±,5) o C 29,21 7,71 7,6,2, (±,4) o C 29,62 7,68 7,2,3,5 15 3(±,7) o C 3,26 7,61 6,9,3,

46 Β.2. Πειραµατική διαδικασία Οι θερµοκρασίες που επιβάλαµε στις δεξαµενές (µε τη χρησιµοποίηση ηλεκτρικών αντιστάσεων) κατά την έναρξη της πειραµατικής διαδικασίας ήταν οι παρακάτω: 22 ο C, 24 ο C, 26 ο C και 3 ο C. Στο δεξαµενή µάρτυρα (control) η θερµοκρασία διατηρήθηκε στα φυσιολογικά επίπεδα των 17,5-18 ο C. Στη συνέχεια και από την ηµέρα της επιβολής της θερµοκρασίας λαµβάναµε 3 δείγµατα από κάθε δεξαµενή την πρώτη, την πέµπτη και την δέκατη ηµέρα, ενώ την ηµέρα της επιβολής των θερµοκρασιών, πήραµε δείγµατα µάρτυρα (control). Κατά τη δειγµατοληψία, θανατωνόταν 6 ψάρια από κάθε δεξαµενή. Η θανάτωση γινόταν µε χτύπηµα στο κεφάλι. Στη συνέχεια, και πάντα πάνω σε πάγο, µε µαχαίρι κοβόταν η σπονδυλική στήλη και µε κατά µήκος τοµή στην κοιλιακή επιφάνεια λαµβανόταν ο καρδιακός µύς και το ήπαρ, ενώ έπειτα από αφαίρεση της επιδερµίδας του ζώου ελήφθησαν δείγµατα λευκού και ερυθρού µυ. Οι ιστοί τοποθετήθηκαν άµεσα σε σωλήνες τύπου eppendorf, καταψύχθηκαν σε υγρό άζωτο και αποθηκεύτηκαν στην υπερκατάψυξη µέχρι και τις περαιτέρω αναλύσεις και προσδιορισµούς. Β.3. Μέθοδοι ανάλυσης Ο ιστός (µια ποσότητα περίπου 45-5 mg) οµογενοποιήθηκε σε σκόνη και στη συνέχεια προστέθηκε ψυχρό διάλυµα λύσης σε αναλογία 3ml/gr (β-glycerophosphate 2mM, NaF 5mM, EDTA 2mM, Hepes 2mM, Na 3 VO 4,2mM και benzamidine 1mM, ph 7) στο οποίο προηγουµένως είχαν προστεθεί οι ακόλουθοι αναστολείς: Leupeptin 2µM, trans-epoxysuccinyl-l-leucylamido-(4-guanidino) butane (E64) 1µM, dithiotreitol (DTT) 5mM, phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) 3µM, triton X-1 1% vol/vol και pepstatin 12mM. Τα δείγµατα µε το διάλυµα λύσης διατηρήθηκαν σε πάγο για 3 λεπτά και έπειτα φυγοκεντρήθηκαν (στα 1.g για 1 λεπτά και στους 4 ο C). Το υπερκείµενο από κάθε δείγµα τοποθετήθηκε σε υδατόλουτρο που βράζει για 3 λεπτά µε,33vol SDS-PAGE sample buffer (Tris-HCl 33 mm, Glycerol 13% vol/vol, DTT 133mM, SDS 1% wt/vol και bromophenol blue,2%wt/vol, ph 6,8). Η συγκέντρωση της πρωτεΐνης προσδιορίστηκε µε τη µέθοδο Bio-Rad Protein Assay (Bio-Rad, Hercules, CA) Kατόπιν τα δείγµατα αποθηκεύτηκαν στην κατάψυξη (-2 ο C) µέχρι την διαδικασία της ηλεκτρόφορησης. Ίσες ποσότητες πρωτεΐνης (1µg για τις κινάσες και 5µg για τις hsps) διαχωρίστηκαν σε gel 1% (wt/vol) ακρυλαµίδης και,275% (wt/vol) bisακρυλαµίδης και στη συνέχεια µεταφέρθηκαν ηλεκτροφορητικά σε µεµβράνη νιτροκυτταρίνης (,45µm, Schleicher & Schuell, Keene, NH) µε τη µέθοδο της ηλεκτροµεταφοράς (Transfer). Για την ηλεκτροµεταφορά χρησιµοποιήθηκε transfer buffer 1x (Tris- HCl 3,3gr/lt, Glycine 144g) το οποίο αραιώνεται ως εξής: 1 V transfer buffer 1x: 2 V µεθανόλη: 7 V ddh 2 O. Οι µη ειδικές περιοχές στις µεµβράνες δεσµεύτηκαν µε blocking buffer [5%wt/vol άπαχο γάλα σε TBST (Tris-HCl 2mM, ph 7,7, NaCl 137mM και Tween 2,1% (vol/vol)] για 3 45 λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου. Στη συνέχεια ξεπλύθηκαν 3 φορές για 5 λεπτά µε TBST και επωάστηκαν ολονύχτια σε ψυχρό 38

47 θάλαµο µε 1 ο αντίσωµα. Τα 1 α αντισώµατα που χρησιµοποιήθηκαν ήταν τα ακόλουθα: µονοκλωνικό αντίσωµα ποντικού 7 kda και µονοκλωνικό αντίσωµα ποντικού 9 kda (Sigma), µονοκλωνικό αντίσωµα ποντικού phospho-sapk-jnk (Thr 183 Tyr 185 ) και πολυκλωνικό αντίσωµα κουνελιού phospho-p38 MAP κινάση (Thr 18 Tyr 182 ) (Cell Signaling). Την επόµενη µέρα και αφού οι µεµβράνες ξεπλύθηκαν 3 φορές για 5 λεπτά µε TBST, επωάστηκαν µε 2 ο αντίσωµα (αραίωση 1/7 mouse για τις hsps και JNKs και 1/2 rabbit για τις κινάσες) για 1 ώρα σε θερµοκρασία δωµατίου. Στη συνέχεια ξεπλύθηκαν 3 φορές για 5 λεπτά µε TBST και οι µπάντες των πρωτεϊνών ανιχνεύτηκαν µε εµφανιστικό µέσο ECL µε έκθεση σε φιλµ Fuji Medical X-Ray. Η ανάλυση των αποτελεσµάτων των φιλµ και η ποσοτικοποίηση τους έγινε µε µέτρηση της πυκνότητας µε laser-scanning (µε το λογισµικό GelPro Analyser, GraphPad) και η γραφική απεικόνιση των αποτελεσµάτων µε το λογισµικό SigmaPlot 1.. Β.4. Στατιστική επεξεργασία Η στατιστική επεξεργασία των αποτελεσµάτων έγινε µε το στατιστικό πρόγραµµα InStat 3. της Graphpad Software. Στο συγκεκριµένο πρόγραµµα επιλέξαµε σύγκριση του µέσου όρου των τιµών κάθε δειγµατοληψίας µε αυτή του µάρτυρα. Τα στατιστικά σηµαντικά (Ρ<,5) αποτελέσµατα σηµειώνονται µε αστερίσκο. 39

48 Γ. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Γ.1. Επίδραση της θερµοκρασίας στη θνησιµότητα Στο διάγραµµα 1 φαίνoνται τα αποτελέσµατα της ποσοστιαίας θνησιµότητας των ατόµων τσιπούρας σε όλη τη διάρκεια της πειραµατικής διαδικασίας και στις τέσσερις πειραµατικές θερµοκρασίες. 3 % Θνησιµότητα o C 24 o C 26 o C 3 o C ιάγραµµα 1: Ποσοστιαία θνησιµότητα ατόµων τσιπούρας κατά τη διάρκεια της πειραµατικής διαδικασίας στους 22 o C, 24 o C, 26 o C και 3 o C. Κατά την δειγµατοληψίες που έγιναν µετά την λήψη των ψαριών από το ενυδρείο και τη επιβολή θερµοκρασιών στις υπόλοιπες δεξαµενές, παρατηρήθηκαν µεγαλύτερες θνησιµότητες στους 3 ο C, κυρίως στο δεύτερο µισό της πειραµατικής διαδικασίας. Τα άτοµα από αυτή τη δεξαµενή παρατηρήθηκε να είναι πιο νωθρά από τα υπόλοιπα, προβάλλοντας την µικρότερη αντίσταση κατά την διαδικασία της θανάτωσης. Στις υπόλοιπες θερµοκρασίες (22 ο C, 24 ο C και 26 ο C), δεν παρατηρήθηκαν τα φαινόµενα τα αντίστοιχα των 3 ο C. Ένα άλλο φαινόµενο το οποίο παρατηρήθηκε κατά την διαδικασία της θανάτωσης και της αφαίρεσης του δέρµατος για τη λήψη ιστών λευκού και ερυθρού µυ, είναι η ευκολία µε την οποία γινόταν αυτή η διαδικασία σε άτοµα που προερχόταν από τη δεξαµενή στην οποία επιβλήθηκε η θερµοκρασία των 3 ο C. Συγκεκριµένα, το διάγραµµα δείχνει τη θνησιµότητα των ψαριών κατά τη διάρκεια του εγκλιµατισµού τους στις διαφορετικές θερµοκρασίες που επιβάλαµε κατά τη διάρκεια της πειραµατικής διαδικασίας. Στις θερµοκρασίες 22 ο C και 24 ο C δεν παρατηρήθηκε καθόλου θνησιµότητα. Κατά τον εγκλιµατισµό τους σε θερµοκρασία 26 ο C, η θνησιµότητα φαίνεται να αυξάνεται την πέµπτη ηµέρα του εγκλιµατισµού τους και τελικά να ανέρχεται σε ποσοστό περίπου 5% την τελευταία 4

49 ηµέρα της πειραµατικής διαδικασίας. Στους 3 ο C η θνησιµότητα των ψαριών αρχίζει την τρίτη ηµέρα του εγκλιµατισµού τους, φτάνει στα τελικά επίπεδα της θνησιµότητας των 26 ο C την πέµπτη ηµέρα του εγκλιµατισµού τους και στη συνέχεια παρουσιάζει µια αύξηση στο 17% την έβδοµη ηµέρα και περίπου στο 25% την δέκατη ηµέρα της πειραµατικής διαδικασίας. 41

50 Γ.2. Επίδραση της θερµοκρασίας στην έκφραση των hsp7 και hsp9 H έκφραση των hsp7 και hsp9 εξετάσθηκε στον ερυθρό και λευκό µυ, στην καρδιά και στο ήπαρ. Στην οικογένεια των hsp7 και των hsp9, αναγνωρίστηκε µία ζώνη. Γ.2.1. Ερυθρός µυς hsp7 Στην εικόνα 21 δίνονται τα επίπεδα της hsp7 στον ερυθρό µυ της τσιπούρας στις τέσσερις θερµοκρασίες της πειραµατικής διαδικασίας. A 22 o C 1 η ηµέρα 22 ο C 5 η ηµέρα 22 ο C 1 η ηµέρα 24 o C 1 η ηµέρα 24 o C 5 η ηµέρα 24 ο C 1 η ηµέρα 26 o C 1 η ηµέρα 26 o C 5 η ηµέρα 26 ο C 1 η ηµέρα µαρτυρας 3 o C 1 η ηµέρα 3 o C 5 η ηµέρα 3 ο C 1 η ηµέρα B Hsp 7 (αυθαίρετες µονάδες) o C 24 o C Hsp 7 (αυθαίρετες µονάδες) o C 3 o C Εικόνα 21: Α. Blots της hsp7 Β. Ιστόγραµµα µε τα επίπεδα της hsp7 στον ερυθρό µυ της τσιπούρας κατά τον εγκλιµατισµό της σε διαφορετικές θερµοκρασίες (3 δείγµατα) Στον ερυθρό µυ της τσιπούρας, τα επίπεδα της hsp7 αυξάνουν σε όλη τη διάρκεια της πειραµατικής διαδικασίας στους 24 ο C, 26 ο C και 3 ο C, ενώ διατηρούνται στα επίπεδα του µάρτυρα στη θερµοκρασία των 22 ο C. 42

51 Γ.2.2. Ερυθρός µυς hsp9 Στην εικόνα 22 δίνονται τα επίπεδα της hsp9 στον ερυθρό µυ της τσιπούρας στις τέσσερις θερµοκρασίες της πειραµατικής διαδικασίας. A 22 o C 1 η ηµέρα 22 ο C 5 η ηµέρα 22 ο C 1 η ηµέρα 24 o C 1 η ηµέρα 24 o C 5 η ηµέρα 24 ο C 1 η ηµέρα 26 o C 1 η ηµέρα 26 o C 5 η ηµέρα 26 ο C 1 η ηµέρα 3 o C 1 η ηµέρα 3 o C 5 η ηµέρα 3 ο C 1 η ηµέρα B Hsp 9 (αυθαίρετες µονάδες) Hsp 9 (αυθαίρετες µονάδες) o C 24 o C o C 3 o C Εικόνα 22: Α. Blots της hsp9 Β. Ιστόγραµµα µε τα επίπεδα της hsp9 στον ερυθρό µυ της τσιπούρας κατά τον εγκλιµατισµό της σε διαφορετικές θερµοκρασίες (3 δείγµατα) Σε αναλογία µε τα επίπεδα της hsp7 στον ερυθρό µυ της τσιπούρας, παρόµοιες αλλαγές παρατηρήθηκαν και στα επίπεδα της hsp9 στον ίδιο ιστό κατά τον εγκλιµατισµό των ψαριών στις ίδιες θερµοκρασίες. Στους 22 o C την πρώτη ηµέρα παρατηρείται µια αύξηση επί 2 σε σχέση µε τα επίπεδα του µάρτυρα, ενώ την πέµπτη και τη δέκατη ηµέρα τα επίπεδα µειώνονται σε αυτά του µάρτυρα. Στους 24 o C παρατηρείται ανάλογη αύξηση την πρώτη ηµέρα, ενώ τις υπόλοιπες τα επίπεδα παραµένουν στις ίδιες περίπου τιµές. Στους 26 o C και στους 3 o C τα επίπεδα της hsp9 αυξάνουν σε τετραπλάσιο και τριπλάσιο επίπεδο σε σχέση µε αυτά του µάρτυρα την πρώτη ηµέρα και παραµένουν σχετικά υψηλά. 43

52 Γ.2.3. Λευκός µυς hsp7 Στην εικόνα 23 δίνονται τα επίπεδα της hsp7 στο λευκό µυ της τσιπούρας στις τέσσερις θερµοκρασίες της πειραµατικής διαδικασίας A 22 ο C 1 η ηµέρα 22 ο C 5 η ηµέρα 22 ο C 1 η ηµέρα 24 ο C 1 η ηµέρα 24 ο C 5 η ηµέρα 24 ο C 1 η ηµέρα 26 ο C 1 η ηµέρα 26 ο C 5 η ηµέρα 26 ο C 1 η ηµέρα 3 ο C 1 η ηµέρα 3 ο C 5 η ηµέρα 3 ο C 1 η ηµέρα B Hsp 7 (αυθαίρετες µονάδες) o C 24 o C Hsp 7 (αυθαίρετες µονάδες) o C 3 o C Εικόνα 23: Α. Blots της hsp7 Β. Ιστόγραµµα µε τα επίπεδα της hsp7 στο λευκό µυ της τσιπούρας κατά τον εγκλιµατισµό της σε διαφορετικές θερµοκρασίες (3 δείγµατα) Σε αντίθεση µε τον ερυθρό µυ της τσιπούρας, στον οποίο τα επίπεδα της hsp7 αυξάνουν σε όλη τη διάρκεια της πειραµατικής διαδικασίας στους 24 ο C, 26 ο C και 3 ο C, ενώ διατηρούνται στα επίπεδα του µάρτυρα στη θερµοκρασία των 22 ο C, στο λευκό µυ παρατηρείται αύξηση των επιπέδων της hsp7 από την πρώτη ηµέρα του εγκλιµατισµού των ψαριών στους 22 ο C σε διπλάσιες τιµές σε σχέση µε αυτές του µάρτυρα. Την πέµπτη ηµέρα παρατηρείται ακόµα µεγαλύτερη αύξηση. Τα επίπεδα της hsp7 παραµένουν αυξηµένα στις υπόλοιπες τρεις θερµοκρασίες της πειραµατικής διαδικασίας. 44

53 Γ.2.4. Λευκός µυς hsp9 Στην εικόνα 24 δίνονται τα επίπεδα της hsp9 στο λευκό µυ της τσιπούρας στις τέσσερις θερµοκρασίες της πειραµατικής διαδικασίας. A 22 ο C 1 η ηµέρα 22 ο C 5 η ηµέρα 22 ο C 1 η ηµέρα 24 ο C 1 η ηµέρα 24 ο C 5 η ηµέρα 24 ο C 1 η ηµέρα µάρτυαρς 26 ο C 1 η ηµέρα 26 ο C 5 η ηµέρα 26 ο C 1 η ηµέρα 3 ο C 1 η ηµέρα 3 ο C 5 η ηµέρα 3 ο C 1 η ηµέρα B Hsp 9 (αυθαίρετες µονάδες) Hsp 9 (αυθαίρετες µονάδες) o C 24 o C o C 3 o C Εικόνα 24: Α. Blots της hsp9 Β. Ιστόγραµµα µε τα επίπεδα της hsp9 στο λευκό µυ της τσιπούρας κατά τον εγκλιµατισµό της σε διαφορετικές θερµοκρασίες (3 δείγµατα) Όπως και στον ερυθρό µυ, έτσι και στο λευκό, σε αναλογία µε τα επίπεδα της hsp7, παρόµοιες αλλαγές παρατηρήθηκαν και στα επίπεδα της hsp9 στον ίδιο ιστό κατά τον εγκλιµατισµό των ψαριών στις ίδιες θερµοκρασίες. Από την πρώτη ηµέρα της πειραµατικής διαδικασίας παρατηρούνται αυξήσεις στα επίπεδα των πρωτεϊνών. Στους 22 ο C, 24 ο C και 26 ο C οι µέγιστες τιµές των επιπέδων της hsp9 παρατηρούνται κατά τη δέκατη ηµέρα της πειραµατικής διαδικασίας σε αντίθεση µε τους 3 ο C στους οποίους τα ανώτατα επίπεδα της hsp9 παρατηρούνται κατά την πέµπτη ηµέρα της πειραµατικής διαδικασίας. 45

54 Γ.2.5. Καρδιά hsp7 Στην εικόνα 25 δίνονται τα επίπεδα της hsp7 στην καρδιά της τσιπούρας στις τέσσερις θερµοκρασίες της πειραµατικής διαδικασίας. A 22 ο C 1 η ηµέρα 22 ο C 5 η ηµέρα 22 ο C 1 η ηµέρα 24 ο C 1 η ηµέρα 24 ο C 5 η ηµέρα 24 ο C 1 η ηµέρα 26 ο C 1 η ηµέρα 26 ο C 5 η ηµέρα 26 ο C 1 η ηµέρα 3 ο C 1 η ηµέρα 3 ο C 5 η ηµέρα 3 ο C 1 η ηµέρα B Hsp 7 (αυθαίρετες µονάδες) Hsp 7 (αυθαίρετες µονάδες) o C 24 o C o C 3 o C Εικόνα 25: Α. Blots της hsp7 B. Ιστόγραµµα µε τα επίπεδα της hsp7 στην καρδιά της τσιπούρας κατά τον εγκλιµατισµό της σε διαφορετικές θερµοκρασίες (3 δείγµατα) Στην καρδιά τα επίπεδα της hsp7 αυξάνουν σε όλη τη διάρκεια της πειραµατικής διαδικασίας και στις τέσσερις θερµοκρασίες (στους 22 ο C, 24 ο C, 26 ο C και 3 ο C). Στους 22 ο C και 24 ο C, τα επίπεδα της hsp7 αυξάνουν την πρώτη ηµέρα (x1,5) και στη συνέχεια διατηρούνται σε επίπεδα παρόµοια µε αυτά του µάρτυρα. Στους 26 ο C και 3 ο C τα επίπεδα της πρωτεΐνης αυξάνουν από την πρώτη ηµέρα (x2 και x3 αντίστοιχα σε σχέση µε τα επίπεδα του µάρτυρα), και παραµένουν υψηλά σε όλη τη διάρκεια της πειραµατικής διαδικασίας. 46

55 Γ.2.6. Καρδιά hsp9 Στην εικόνα 26 δίνονται τα επίπεδα της hsp9 στην καρδιά της τσιπούρας στις τέσσερις θερµοκρασίες της πειραµατικής διαδικασίας. A 22 ο C 1 η ηµέρα 22 ο C 5 η ηµέρα 22 ο C 1 η ηµέρα 24 ο C 1 η ηµέρα 24 ο C 5 η ηµέρα 24 ο C 1 η ηµέρα 26 ο C 1 η ηµέρα 26 ο C 5 η ηµέρα 26 ο C 1 η ηµέρα 3 ο C 1 η ηµέρα 3 ο C 5 η ηµέρα 3 ο C 1 η ηµέρα B Hsp 9 (αυθαίρετες µονάδες) Hsp 9 (αυθαίρετες µονάδες) o C 24 o C o C 3 o C Εικόνα 26: Α: Blots της hsp9 B. Ιστόγραµµα µε τα επίπεδα της hsp9 στην καρδιά της τσιπούρας κατά τον εγκλιµατισµό της σε διαφορετικές θερµοκρασίες (3 δείγµατα) Στην καρδιά, στους 22 ο C και 24 ο C, τα επίπεδα της hsp9 διπλασιάζονται την πρώτη ηµέρα σε σχέση µε τα επίπεδα του µάρτυρα, αυξάνουν ακόµα περισσότερο την πέµπτη ηµέρα της πειραµατικής διαδικασίας και την τελευταία ηµέρα ελαττώνονται στα επίπεδα του µάρτυρα. Στους 26 ο C και 3 ο C τα επίπεδα της hsp9 αυξάνουν από την πρώτη ηµέρα της πειραµατικής διαδικασίας, και παρουσιάζουν ακόµα µεγαλύτερες τιµές τη δέκατη ηµέρα. 47

56 Γ.2.7. Ήπαρ hsp7 Στην εικόνα 27 δίνονται τα επίπεδα της hsp7 στο ήπαρ της τσιπούρας στις τέσσερις θερµοκρασίες της πειραµατικής διαδικασίας. A 22 ο C 1 η ηµέρα 22 ο C 5 η ηµέρα 22 ο C 1 η ηµέρα 24 ο C 1 η ηµέρα 24 ο C 5 η ηµέρα 24 ο C 1 η ηµέρα 26 ο C 1 η ηµέρα 26 ο C 5 η ηµέρα 26 ο C 1 η ηµέρα 3 ο C 1 η ηµέρα 3 ο C 5 η ηµέρα 3 ο C 1 η ηµέρα B Hsp 7 (αυθαίρετες µονάδες) o C 1 24 o C Hsp 7 (αυθαίρετες µονάδες) o C 1 3 o C Εικόνα 27: A. Blots hsp7 B. Ιστόγραµµα µε τα επίπεδα της hsp7 στο ήπαρ της τσιπούρας κατά τον εγκλιµατισµό της σε διαφορετικές θερµοκρασίες (3 δείγµατα) Στο ήπαρ τα επίπεδα της hsp7 παραµένουν στα ίδια επίπεδα µε αυτά του µάρτυρα στους 22 ο C και 24 ο C. Στους 26 ο C και 3 ο C παρατηρείται µια αύξηση των επιπέδων της συγκεκριµένης πρωτεΐνης κυρίως την πρώτη ηµέρα (x1,5 σε σχέση µε τα επίπεδα του µάρτυρα) του εγκλιµατισµού των ψαριών σε αυτές τις θερµοκρασίες. Στις ίδιες θερµοκρασίες, την πέµπτη και δέκατη ηµέρα της πειραµατικής διαδικασίας, τα επίπεδα της hsp7 παραµένουν χαµηλότερα από αυτά του µάρτυρα. 48

57 Γ.2.8. Ήπαρ hsp9 Στην εικόνα 28 δίνονται τα επίπεδα της hsp9 στο ήπαρ της τσιπούρας στις τέσσερις θερµοκρασίες της πειραµατικής διαδικασίας. A 22 ο C 1 η ηµέρα 22 ο C 5 η ηµέρα 22 ο C 1 η ηµέρα 24 ο C 1 η ηµέρα 24 ο C 5 η ηµέρα 24 ο C 1 η ηµέρα 26 ο C 1 η ηµέρα 26 ο C 5 η ηµέρα 26 ο C 1 η ηµέρα 3 ο C 1 η ηµέρα 3 ο C 5 η ηµέρα 3 ο C 1 η ηµέρα B Hsp 9 (αυθαίρετες µονάδες) Hsp 9 (αυθαίρετες µονάδες) o C 6 24 o C o C 6 3 o C Εικόνα 28: Α. Blots της hsp9 B. Ιστόγραµµα µε τα επίπεδα της hsp9 στο ήπαρ της τσιπούρας κατά τον εγκλιµατισµό της σε διαφορετικές θερµοκρασίες (3 δείγµατα) Τα επίπεδα της hsp9 στο ήπαρ αυξάνουν κυρίως την πρώτη ηµέρα του εγκλιµατισµού τους στους 22 ο C και 24 ο C. Στους 26 ο C και 3 ο C τα επίπεδα της hsp9 διπλασιάζονται σε σχέση µε αυτά του µάρτυρα την πρώτη ηµέρα της πειραµατικής διαδικασίας. Παραµένουν περίπου στα ίδια επίπεδα σε όλη τη διάρκεια της πειραµατικής διαδικασίας µε εξαίρεση την πέµπτη ηµέρα στους 26 ο C όπου τα επίπεδα της hsp9 είναι χαµηλότερα σε σχέση µε αυτά του µάρτυρα. 49

58 Γ.3. Επίδραση της θερµοκρασίας στη φωσφορυλίωση της κινάσης p38 MAPK Η ενεργοποίηση και φωσφορυλίωση της p38 MAPK προσδιορίστηκε στις τέσσερις διαφορετικές θερµοκρασίες εγκλιµατισµού στον ερυθρό και λευκό µυ, στην καρδιά και στο ήπαρ. Κοντά στο µοριακό βάρος που αναµένεται η φωσφορυλιωµένη p38, λαµβάναµε δύο µπάντες µε σχετικό µοριακό βάρος (relative molecular weight) 44kDa και 41kDa σε όλα τα δείγµατα τα οποία αναλύσαµε. Για να ανιχνευθεί η φωσφορυλιωµένη p38 χρησιµοποιήθηκε σαν µάρτυρα πρωτεΐνη από θηλαστικό (Εικόνα 29). Οι µετρήσεις που πήραµε όσον αφορά τη φωσφορυλιωµένη p38 στην τσιπούρα είναι αυτές που ταυτοποιήθηκαν µε τη χρήση του δείγµατος από το θηλαστικό στο ίδιο µοριακό βάρος (44kDa), και όχι οι µπαντες που εµφανίζονται σε µικρή απόσταση σε µικρότερο µοριακό βάρος (41kDa). τσιπούρα τσιπούρα θηλαστικό phospho p38 MAPK Εικόνα 29: Η phospho p38 σε ηλεκτροφόρηση σε SDS-PAGE πολυακρυλαµίδης από πρωτεΐνες τσιπούρας (Sparus aurata) και επίµυ (Ratus norvegicus της φυλής Wistar) 5

59 Γ.3.1. Ερυθρός µυς φωσφορυλιωµένη p38 MAPK Στην εικόνα 3 δίνονται τα επίπεδα της φωσφορυλιωµένης p38 MAPK στον ερυθρό µυ της τσιπούρας στις τέσσερις θερµοκρασίες της πειραµατικής διαδικασίας. A 22 ο C 1 η ηµέρα 22 ο C 5 η ηµέρα 22 ο C 1 η ηµέρα 24 ο C 1 η ηµέρα 24 ο C 5 η ηµέρα 24 ο C 1 η ηµέρα 26 ο C 1 η ηµέρα 26 ο C 5 η ηµέρα 26 ο C 1 η ηµέρα 3 ο C 1 η ηµέρα 3 ο C 5 η ηµέρα 3 ο C 1 η ηµέρα B p-p38 (αυθαίρετες µονάδες) o C 24 o C p-p38 (αυθαίρετες µονάδες) o C o C Εικόνα 3: Α. Blots της phospho p38 B. Ιστόγραµµα µε τα επίπεδα της phospho p38 στον ερυθρό µυ της τσιπούρας κατά τον εγκλιµατισµό της σε διαφορετικές θερµοκρασίες (3 δείγµατα) Στον ερυθρό µυ τα επίπεδα της φωσφορυλιωµένης p38 αυξάνουν σε όλη τη διάρκεια της πειραµατικής διαδικασίας και στις τέσσερις θερµοκρασίες (στους 22 ο C και 24 ο C παρατηρείται µια σταδιακή αύξηση σε όλη τη διάρκεια της πειραµατικής διαδικασίας ενώ στους 26 ο C και 3 ο C τα υψηλότερα επίπεδα παρατηρούνται την πρώτη και δέκατη ηµέρα της πειραµατικής διαδικασίας, ενώ την πέµπτη ηµέρα παρατηρείται µια σχετική µείωση σε επίπεδα λίγο µεγαλύτερα από αυτά του µάρτυρα). 51

60 Γ.3.2. Λευκός µυς φωσφορυλιωµένη p38 MAPK Στην εικόνα 31 δίνονται τα επίπεδα της φωσφορυλιωµένης p38 MAPK στο λευκό µυ της τσιπούρας στις τέσσερις θερµοκρασίες της πειραµατικής διαδικασίας. A 22 ο C 1 η ηµέρα 22 ο C 5 η ηµέρα 22 ο C 1 η ηµέρα 24 ο C 1 η ηµέρα 24 ο C 5 η ηµέρα 24 ο C 1 η ηµέρα 26 ο C 1 η ηµέρα 26 ο C 5 η ηµέρα 26 ο C 1 η ηµέρα 3 ο C 1 η ηµέρα 3 ο C 5 η ηµέρα 3 ο C 1 η ηµέρα B p-p38 (αυθαίρετες µονάδες) o C 8 24 o C p-p38 (αυθαίρετες µονάδες) o C 8 3 o C Εικόνα 31: Α. Blots της phospho p38 B. Ιστόγραµµα µε τα επίπεδα της phospho p38 στο λευκό µυ της τσιπούρας κατά τον εγκλιµατισµό της σε διαφορετικές θερµοκρασίες (3 δείγµατα) Στο λευκό µυ τα επίπεδα της φωσφορυλιωµένης p38 αυξάνουν σε όλη τη διάρκεια της πειραµατικής διαδικασίας και στις τέσσερις θερµοκρασίες (στους 22 ο C, 24 ο C, 26 ο C και 3 ο C). Στους 22 ο C παρατηρείται µια σταδιακή αύξηση των επιπέδων της φωσφορυλιωµένης p38 σε αντίθεση µε τις υπόλοιπες θερµοκρασίες στις οποίες παρατηρείται µια 8πλάσια αύξηση από την πρώτη κιόλας ηµέρα της πειραµατικής διαδικασίας και διατήρηση αυτών των επιπέδων και την πέµπτη και δέκατη ηµέρα της πειραµατικής διαδικασίας. 52

61 Γ.3.3. Καρδιά φωσφορυλιωµένη p38 MAPK Στην εικόνα 32 δίνονται τα επίπεδα της φωσφορυλιωµένης p38 MAPK στην καρδιά της τσιπούρας στις τέσσερις θερµοκρασίες της πειραµατικής διαδικασίας. A 22 ο C 1 η ηµέρα 22 ο C 5 η ηµέρα 22 ο C 1 η ηµέρα 24 ο C 1 η ηµέρα 24 ο C 5 η ηµέρα 24 ο C 1 η ηµέρα 26 ο C 1 η ηµέρα 26 ο C 5 η ηµέρα 26 ο C 1 η ηµέρα 3 ο C 1 η ηµέρα 3 ο C 5 η ηµέρα 3 ο C 1 η ηµέρα B p-p38 (αυθαίρετες µονάδες) o C 4 24 o C p-p38 (αυθαίρετες µονάδες) 4 26 o C o C Εικόνα 32: Α. Blots της phospho p38 B. Ιστόγραµµα µε τα επίπεδα της phospho p38 στην καρδιά της τσιπούρας κατά τον εγκλιµατισµό της σε διαφορετικές θερµοκρασίες (3 δείγµατα) Στην καρδιά τα επίπεδα της φωσφορυλιωµένης p38 αυξάνουν την πέµπτη και την πρώτη ηµέρα του εγκλιµατισµού των ψαριών σε θερµοκρασίες 22 ο C και 24 ο C αντίστοιχα. Στους 26 ο C την πρώτη ηµέρα της πειραµατικής διαδικασίας παρατηρείται διπλάσια αύξηση των επιπέδων της φωσφορυλιωµένης p38, ενώ την πέµπτη και δέκατη ηµέρα τα επίπεδα της συγκεκριµένης πρωτεΐνης παραµένουν σα αυτά του µάρτυρα. Στους 3 ο C τα επίπεδα της φωσφορυλιωµένης p38 παραµένουν αυξηµένα σε όλη τη διάρκεια της πειραµατικής διαδικασίας. 53

62 Γ.3.4. Ήπαρ φωσφορυλιωµένη p38 MAPK Στην εικόνα 33 δίνονται τα επίπεδα της φωσφορυλιωµένης p38 MAPK στο ήπαρ της τσιπούρας στις τέσσερις θερµοκρασίες της πειραµατικής διαδικασίας. A 22 ο C 1 η ηµέρα 22 ο C 5 η ηµέρα 22 ο C 1 η ηµέρα 24 ο C 1 η ηµέρα 24 ο C 5 η ηµέρα 24 ο C 1 η ηµέρα 26 ο C 1 η ηµέρα 26 ο C 5 η ηµέρα 26 ο C 1 η ηµέρα 3 ο C 1 η ηµέρα 3 ο C 5 η ηµέρα 3 ο C 1 η ηµέρα B p38 (αυθαίρετες µονάδες) p38 (αυθαίρετες µονάδες) ο C ο C 3 ο C ο C Εικόνα 33: Α. Blots της phospho p38 B. Ιστόγραµµα µε τα επίπεδα της phospho p38 στo ήπαρ της τσιπούρας κατά τον εγκλιµατισµό της σε διαφορετικές θερµοκρασίες (3 δείγµατα) Στο ήπαρ τα επίπεδα της φωσφορυλιωµένης p38 αυξάνουν ήδη από την πρώτη ηµέρα του εγκλιµατισµού των ψαριών στους 22 ο C, αλλά τα επίπεδα της στους 24 ο C είναι χαµηλά συγκριτικά µε αυτά του µάρτυρα. Στους 26 ο C παρατηρείται σηµαντική αύξηση την 1 η ηµέρα της πειραµατικής διαδικασίας, ενώ στους 3 ο C παρατηρείται σηµαντική αύξηση των επιπέδων της φωσφορυλιωµένης p38 σε όλη τη διάρκεια της πειραµατικής διαδικασίας, και στις 3 ηµέρες της δειγµατοληψίας. 54

63 Γ.4. Επίδραση της θερµοκρασίας στη φωσφορυλίωση των κινασών JNKs Η ενεργοποίηση και φωσφορυλίωση των JNKs προσδιορίστηκε στις τέσσερις διαφορετικές θερµοκρασίες εγκλιµατισµού στον ερυθρό και λευκό µυ, στην καρδιά και στο ήπαρ. Ως χρησιµοποιήθηκε πρωτεΐνη από θηλαστικό (εκχύλισµα από καρδιακά µυοκύτταρα), και αυτή είναι η πρωτεΐνη που τελικά µετρήθηκε ποσοτικά Στην τσιπούρα ανιχνεύθηκαν 4 διαφορετικές πρωτεΐνες µε σχετικό µοριακό βάρος (relative molecular weight) 69kDa, 57kDa, 46kDa και 37kDa. Από αυτές η ζώνη των 46kDa αντιστοιχεί στην ισοµορφή της φωσφορυλιωµένης p46 JNK που εκφράζεται στα θηλαστικά. Η ισοµορφή p54 JNK των θηλαστικών από ότι φαίνεται δεν εκφράζεται στην τσιπούρα. (Εικόνα 34). τσιπούρα τσιπούρα θηλαστικό θηλαστικό Πρωτεΐνη 69kDa Πρωτεΐνη 57kDa Phospho p54 JNK Phospho p46 JNK Πρωτεΐνη 37kDa Εικόνα 34: Οι JNKs σε ηλεκτροφόρηση σε SDS-PAGE πολυακρυλαµίδης από πρωτεΐνες τσιπούρας (Sparus aurata) και επίµυ (Ratus norvegicus της φυλής Wistar) 55