Effects of endocrine disrupting chemicals on sex steroid levels of mussels Mytilus galloprovincialis.

Transcript

1 8ο Πανελλήνιο Συμποσιο Ωκεανογραφίας & Αλιείας 451 Επιδραση ενδοκρινικων διαταρακτων στα επίπεδα φυλετικων στεροειδων ορμονων σε μυδια Mytilus galloprovincialis. Προκαταρκτικα αποτελεσματα. Α. Τσαγκάρη, Α. Λυσσιμάχου, Ε. Στρογγυλούδη, Ε. Κώτου, Ε. Παπαθανασίου. ΕΛ.ΚΕ.ΘΕ., 46,7 Λεωφ. Αθηνών-Σουνίου, Ανάβυσσoς Περιληψη Η παρούσα μελέτη προσπάθησε να εντοπίσει μεταβολές στα επίπεδα φυλετικών στεροειδών ορμονών σε μύδια Mytilus galloprovincialis που εκτέθηκαν σε χημικές ενώσεις που έχουν αναγνωριστεί ως ενδοκρινικοί διαταράκτες. Τα αποτελέσματα έδειξαν μια τάση αύξησης των επιπέδων οιστραδιόλης και προγεστερόνης σε μύδια που εκτέθηκαν στο εργαστήριο σε nonylphenol και μια τάση μείωσης σε μύδια που εκτέθηκαν εργαστηριακά σε ΤΒΤ ενώ αντίστοιχη τάση δεν παρατηρήθηκε σε μύδια από περιοχές στο πεδίο που θεωρήθηκαν επιβαρυμένες με ΤΒΤ. Effects of endocrine disrupting chemicals on sex steroid levels of mussels Mytilus galloprovincialis. Preliminary results C. Tsangaris, A. Lyssimahou, E. Stroggyloudi, E. Cotou, E. Papathanassiou Abstract The current study attempted to assess sex steroid level changes in mussels Mytilus galloprovincialis exposed to recognised endocrine disrupting chemicals. A significant increase in estradiol levels and a slight increase in progesterone levels were found in mussels exposed in the laboratory to nonylphenol. When mussels were exposed to TBT, estradiol and progesterone levels tended to decrease whereas a similar trend was not recorded in mussels collected from field sites suspected of TBT contamination. Keywords: endocrine disrupting chemicals, sex steroids, Mytilus galloprovincialis, TBT, nonylphenol

2 452 8ο Πανελλήνιο Συμποσιο Ωκεανογραφίας & Αλιείας Εισαγωγη Τις τελευταίες δεκαετίες το θέμα της ενδοκρινικής διαταραχής από χημικές ενώσεις κατασκευασμένες από τον άνθρωπο αποτελεί προτεραιότητα για την έρευνα κυρίως λόγω των επιπτώσεων που μπορεί να έχει στην αναπαραγωγική ικανότητα των οργανισμών. Μια μεγάλη ποικιλία χημικών ενώσεων που εισέρχονται στο θαλάσσιο περιβάλλον όπως ΤΒΤ, PCBs, αλκυλφαινόλες και διάφορα φυτοφαρμάκα έχουν αναγνωριστεί ως ενδοκρινικοί διαταράκτες και υπάρχουν αρκετές αναφορές αλλαγής φύλου και επιπτώσεων στο αναπαραγωγικό σύστημα θαλασσίων οργανισμών που συνδέονται με τέτοιου είδους ρύπους (Mills & Chichester, 2005). Οι ενδοκρινικοί διαταράκτες δρούν ως μιμητές ή ανταγωνιστές των ενδογενών ορμονών είτε επηρεάζουν τη σύνθεση και το μεταβολισμό αυτών ή των υποδοχέων τους (Mills & Chichester, 2005). Κατά συνέπεια πολλοί ενδοκρινικοί διαταράκτες έχουν την ικανότητα να μεταβάλουν τα επίπεδα των φυλετικών στεροειδών ορμονών. Αν και τα μύδια χρησιμοποιούνται ευρέως ως οργανισμοί δείκτες για την εκτίμηση των επιδράσεων της ρύπανσης, οι μελέτες ενδοκρινικής διαταραχής από χημικούς ρύπους σε μύδια είναι λίγες (Grammo et al, 1989, Morcillo et al, 1999, Devier et al, 2003, Aarab et al, 2004). Η παρούσα μελέτη έχει σκοπό να εξετάσει επιδράσεις δύο γνωστών χημικών διαταρακτών (nonylphenol και ΤΒΤ) στα επίπεδα φυλετικών στεροειδών ορμονών στα μύδια Mytilus galloprovincialis. Υλικα και μεθοδοι Εργαστηριακή έκθεση μυδιών σε ενδοκρινικούς διαταράκτες. Τα μύδια συλλέχθηκαν από μυδοτροφείο στα Μέγαρα (Β.Δ. Σαρωνικός) και εγκλιματίστηκαν στο εργαστήριο σε δεξαμενές 2l σε συνθετικό θαλασσινό νερό (35, 18±1 C) με αερισμό για 7 ημέρες. Στη συνέχεια τα μύδια εκτέθηκαν σε nonylphenol (100 μg.l -1 ) για 10 ημέρες και σε ΤΒΤ (0,7 μg.l -1 Sn) για 7 και 14 ημέρες. Οι συγκεντρώσεις έκθεσης θεωρήθηκαν αντιπροσωπευτικές υψηλών επιπέδων nonylphenol και ΤΒΤ σε επιβαρυμένα περιβάλλοντα (Kvestac et al, 1994, Elgethun et al, 2000) και ταυτόχρονα υποθανάτιες βάσει τιμών LC50 σε μύδια (Grammo et al, 1989, Thain, 1983). Η nonylphenol και το ΤΒΤ προστέθηκαν στο νερό ως μητρικά διαλύματα 4-n-Nonylphenol και ΤΒΤCl σε ακετόνη. Δεξαμενές χωρίς προσθήκη nonylphenol ή ΤΒΤ καθώς και δεξαμενές με προσθήκη ακετόνης αποτελούσαν τους μάρτυρες. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν. Η αλλαγή του νερού γινόταν ανά δύο μέρες και οι οργανισμοί σιτίζονταν καθημερινά. Τα πειράματα έγιναν Δεκέμβριο, Οκτώβριο και Μάϊο. Δειγματοληψία πεδίου. Συλλέχθηκαν μύδια από σταθμούς στον Πειραιά (λιμάνι, Σ1) και στον Σκαραμαγκά (αμμοβολή πλοίων, Σ2) όπου αναμενόταν επιβάρυνση με ΤΒΤ, ένωσης που χρησιμοποιείται στα υφαλοχρώματα των πλοίων. Στο λιμάνι του Πειραιά έχουν ήδη αναφερθεί πολύ υψηλές συγκεντρώσεις ΤΒΤ στο ίζημα (Tselentis et al, 1999). Ως σταθμοί αναφοράς επιλέχθηκαν ένα μυδοτροφείο στα Μέγαρα (Σ3) και ένα ιχθυοτροφείο μακριά από ανθρωπογενείς επιδράσεις στην Κορινθία (Σ4). Οι δειγματοληψίες πραγματοποιήθηκαν Οκτώβριο και Μάϊο. Ανάλυση στεροειδών ορμονών. Η ανάλυση οιστραδιόλης, προγεστερόνης και τεστοστερόνης έγινε σε ολόκληρο το σώμα των μυδιών με μέθοδο ραδιοανοσολογίας (RIA) και χρήση εμπορικά διαθέσιμων RIA kits από την ICN Pharmaceuticals. Η εκχύλιση των ορμονών έγινε σύμφωνα με τους Morcillo et al (1999) με μικρές τροποποιήσεις. Τα επίπεδα τεστοστερόνης ήταν κατώ από το όριο ανίχνευσης της μεθόδου που χρησιμοποιήθηκε (24pg/g). Αποτελεσματα-Συζητηση Τα επίπεδα οιστραδιόλης (4-2,4 ng/g ww) και προγεστερόνης (0,1-2,2 ng/g ww) που μετρήθηκαν στην παρούσα μελέτη είναι συγκρίσιμα με

3 8ο Πανελλήνιο Συμποσιο Ωκεανογραφίας & Αλιείας 453 nonylphenol 0,3 0,2 0,1 Δεκέμβριος * * Μάρτυρας Μάρτυρας ακετόνη nonylphenol 0,9 0,9 0,8 0,8 Δεκέμβριος Μάρτυρας Μάρτυρας ακετόνη nonylphenol tbt 2, Προγεστερόνη(ng/gww) 0,16 0, Μάρτυρας Μάρτυρας ακετόνη TBT Μάρτυρας Μάρτυρας ακετόνη TBT Εικόνα 1. Επίπεδα οιστραδιόλης και προγεστερόνης σε ολόκληρο το σώμα μυδιών μετά από έκθεση σε nonylphenol (100 μg.l-1) για 10 ημέρες (Δεκέμβριος) και μετά από έκθεση σε ΤΒΤ (0,7 μg.l-1 Sn) για 7 () και 14 ημέρες (). *σημαντική διαφορά από μάρτυρα, One Way Anova, Tukey Test, P<5. αυτά που έχουν βρεθεί σε μύδια από παράκτιες περιοχές στην Πορτογαλία (Reis-Henriques et al, 1990) και στην Ισπανία (Morcillo et al, 1999). Τα επίπεδα των ορμονών κυμαίνονταν εποχιακά και ήταν μέγιστα τον Οκτώβριο (Εικόνες 1, 2), διακύμανση που σύμφωνα με τους Reis-Henriques & Coimbra (1990) συνδέεται με τον αναπαραγωγικό κύκλο των μυδιών. Η έκθεση των μυδιών σε nonylphenol, ουσία με αναγνωρισμένη οιστρογόνο δράση, έδειξε σημαντική αύξηση στα επίπεδα οιστραδιόλης και μικρή αύξηση στα επίπεδα προγεστερόνης σε σχέση με τους μάρτυρες (Εικονα 1). Τα αποτελέσματα συμφωνούν με προηγούμενη μελέτη που έχει δείξει αυξημένα επίπεδα οιστραδιόλης στο πλάσμα ψαριών μετά από έκθεση σε nonylphenol (Giesy et al, 2000). Αντίθετα η έκθεση σε ΤΒΤ, ουσία με ανδρογόνο δράση, έδειξε μια τάση μείωσης των επιπέδων οιστραδιόλης και προγεστερόνης και στα δύο πειραματα που πραγματοποιήθηκαν αν και οι διαφορές σε σχέση με τους μάρτυρες δεν ήταν στατιστικά σημαντικές (Εικονα 1). Οι τάσεις που παρατηρήθηκαν συμφωνούν με προηγούμενες μελέτες

4 454 8ο Πανελλήνιο Συμποσιο Ωκεανογραφίας & Αλιείας 3,0 2,0 Σ2 Σ1 Σ3 Σ4 Εικόνα 2. Επίπεδα οιστραδιόλης και προγεστερόνης σε ολόκληρο το σώμα μυδιών από παράκτιες περιοχές στον Σαρωνικό κόλπο τον Οκτώβριο και τον Μάϊο. Σ1: Πειραιάς, Σ2: Σκαραμαγκάς, Σ3: Μέγαρα, Σ4: Κορινθία Σ2 Σ1 Σ3 Σ4 που αναφέρουν μειωμένα επίπεδα οιστραδιόλης σε χτένια (Morcillo and Porte, 2000) και προγεστερόνης σε μύδια (Devier et al 2003) και χτένια (Siah et al, 2003) υπό την επίδραση ΤΒΤ. Οι μεταβολές αυτές βρέθηκαν σε αυξημένες συγκεντρώσεις ΤΒΤ στο σώμα των οργανισμών ενώ σε χαμηλότερες συγκεντρώσεις ΤΒΤ οι μεταβολες των επιπεδων ορμονών ήταν ενδιάμεσες και μη σημαντικές (Siah et al, 2003). Είναι πιθανόν οι συγκεντρώσεις ΤΒΤ στο σώμα των μυδιών στη παρούσα μελέτη να μην ήταν αρκετά υψηλές ώστε να επιφέρουν σημαντικές μεταβολές στα επίπεδα των φυλετικών ορμονών. Τα επίπεδα οιστραδιόλης και προγεστερόνης των μυδιών από διαφορετικούς σταθμούς στο πεδίο δεν παρουσίασαν διαφορές (Εικόνα 2) αν και οι σταθμοί στον Πειραιά και Σκαραμαγκά θεωρήθηκαν επιβαρυμένοι με ΤΒΤ. Όπως έδειξαν και τα εργαστηριακά πειράματα, διαφορετικοί ενδοκρινικοί διαταράκτες επιδρούν με διαφορετικό τρόπο στα επίπεδα των φυλετικών ορμονών οπότε στο περιβάλλον η ταυτόχρονη παρουσία διαφορετικών ρύπων κάνει την ερμηνεία των αποτελεσμάτων δύσκολη. Επιπλέον στο πεδίο φυσικοί περιβαλλοντικοί παράγοντες επηρεάζουν τις αντιδράσεις των οργανισμών. Περαιτέρω έρευνα με ταυτόχρονη χημική ανάλυση ΤΒΤ αλλά και άλλων ενδοκρινικών διαταρακτών στο σώμα των μυδιών, θα μπορούσε να διευκρινίσει αν τα επίπεδα των ορμονών σε μύδια στο πεδίο σχετίζονται με την παρουσία αυτών των χημικών ενώσεων στο περιβάλλον. Συνολικά, η παρούσα μελέτη δίνει προκαταρκτικά δεδομένα για την επίδραση ενδοκρινικών διαταρακτών στα επίπεδα φυλετικών στεροειδών ορμονών σε μύδια που δείχνουν τάση αύξησης των επιπέδων οιστραδιόλης και προγεστερόνης μετά από έκθεση σε nonylphenol και τάση μείωσης μετά από έκθεση σε ΤΒΤ και δινούν μία ένδειξη πίθανης ενδοκρινικής διαταραχής από nonylphenol και TBT σε μύδια. Περαιτέρω έρευνα είναι απαραίτητη ώστε να επισημανθούν σαφείς μεταβολές στα επίπεδα των φυλετικών στεροειδών ορμονών υπό την επίδραση ενδοκρινικών διαταρακτών και να διευκρινιστεί η σημασία των μεταβολών αυτών στη φυσιολογία των οργανισμών. Ευχαριστιες Η παρούσα μελέτη χρηματοδοτήθηκε από την Ε.Ε στα πλαίσια του προγράμματος BEEP: Biological Effects of Environmental Pollution in Marine Coastal Ecosystems (EVK3-CT ). Βιβλιογραφια Aarab, N., Minier, C., Lemaire, S., Unruh, E., Hansen, P-D., Larsen, B. K., Andersen, O-K., Narbonne, J-F Biochemical and histological responses in mussel (Mytilus edulis) exposed to North Sea oil and to a mixture of North Sea oil and alkylphenols. Marine Environmental Research, 58:

5 8ο Πανελλήνιο Συμποσιο Ωκεανογραφίας & Αλιείας 455 Devier, M-H., Augagneur, S., Budzinski, H., Mora, P., Narbonne, J-F., Garrigues, P Microcosm tributyltin bioaccumulation and multibiomarker assessment in the blue mussel Mytilus edulis. Environmental Toxicology and Chemistry 22: Elgethun, K., Neumann, C., Blake, P Butyltins in shellfish, finfish, water and sediment from the Coos Bay estuary (Oregon, USA) Chemosphere, 41: Giesy, J.P., Pierens, S.L., Snyder, E.M., Miles-Richardson, S., Kramer, V.J., Snyder, S.A., Nichols, K.M., Villeneuve, D.A Effects of 4- nonylphenol on fecundity and biomarkers of estrogenicity in fathead minnows (Pimephales promelas) Environmental Toxicology and Chemistry 19: Grammo, Ǻ., Ekelund, R., Magnusson, K., Beggren, M Lethal and sublethal toxicity of 4-nonylphenol to the common mussel (Mytilus edulis L.). Environmental Pollution, 59: Kvetak, R., Terzi, S., Ahel, M Input and distribution of alkylphenol polyethoxylates in a stratified estuary. Marine Chemistry 46: Mills, L. J., Chichester, C Review of evidence: Are endocrine-disrupting chemicals in the aquatic environment impacting fish populations? Science of the Total Environment, 343: 1-34 Morcillo, Y. Porte, C Evidence of endocrine disruption in clams Ruditapes decussata- transplanted to a tributyltin polluted environment. Environmental Pollution 107: Morcillo, Y., Albalat, A., Porte, C Mussels as sentinels of organotin pollution: bioaccumulation and effects on p450- mediated aromatase activity. Environmental Toxicology and Chemistry 18: Reis-Henriques, M. A., Coimbra, J Variations in the levels of progesterone in Mytilus edulis during the annual reproductive cycle. Comparative Biochemistry and Physiology, A. Vol. 95A: Reis-Henriques, M. A., Le Guellec, D., Remy-Martin, J. P. Adessi, G. L Studies of endogenous steroids from the marine mollusc Mytilus edulis L. By gas chromatography and mass spectrometry. Comparative Biochemistry and Physiology, A. Vol. 95B: Siah, A. Pellerin, J., Amiard, J. C. Pelletier, E., Viglino, L Delayed gametogenesis and progesterone levels in soft-shell clams (Mya arenaria) in relation to in situ contamination to organotins and heavy metals in the St. Lawrence River (Canada). Comparative Biochemistry and Physiology Part C, 135: Thain, J. E The acute toxicity of bis (tributiltin) oxide to the adults and larvae of some marine organisms. International Council for the Exploration of the Sea Commun. Meet. 28:1-4 Tselentis, B. S., Maroulakou, M., Lascourreges, J. F., Szpunar, J., Smith, V. Donard, O. F. X Organotins in sediments and biological tissues from Greek coastal areas: Preliminary results Marine Pollution Bulletin, 38: