ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΚΤΗΝΙΑΤΡΙΚΗΣ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΚΤΗΝΙΑΤΡΙΚΗΣ ΜΕΛΕΤΗ ΤΩΝ ΜΕΤΑΒΟΛΩΝ ΤΩΝ IFN-γ και IL-4 ΣΤΑ Τ-ΛΕΜΦΟΚΥΤΤΑΡΑ ΤΟΥ ΠΕΡΙΦΕΡΙΚΟΥ ΑΙΜΑΤΟΣ ΣΕ ΣΚΥΛΟΥΣ ΜΕ ΑΣΥΜΠΤΩΜΑΤΙΚΗ ΚΑΙ ΣΥΜΠΤΩΜΑΤΙΚΗ ΛΕΪΣΜΑΝΙΩΣΗ (Leishmania infantum, syn. chagasi), ΚΑΘΩΣ ΚΑΙ ΠΡΙΝ ΚΑΙ ΜΕΤΑ ΤΗΝ ΑΝΤΙΛΕΪΣΜΑΝΙΚΗ ΘΕΡΑΠΕΙΑ ΜΕ ΜΙΛΤΕΦΟΣΙΝΗ ΚΑΙ ΑΛΛΟΠΟΥΡΙΝΟΛΗ ΔΗΜΗΤΡΙΟΣ Θ. ΜΑΤΡΑΛΗΣ ΚΤΗΝΙΑΤΡΟΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2013

2

3 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΚΤΗΝΙΑΤΡΙΚΗΣ ΜΕΛΕΤΗ ΤΩΝ ΜΕΤΑΒΟΛΩΝ ΤΩΝ IFN-γ και IL-4 ΣΤΑ Τ-ΛΕΜΦΟΚΥΤΤΑΡΑ ΤΟΥ ΠΕΡΙΦΕΡΙΚΟΥ ΑΙΜΑΤΟΣ ΣΕ ΣΚΥΛΟΥΣ ΜΕ ΑΣΥΜΠΤΩΜΑΤΙΚΗ ΚΑΙ ΣΥΜΠΤΩΜΑΤΙΚΗ ΛΕΪΣΜΑΝΙΩΣΗ (Leishmania infantum, syn. chagasi), ΚΑΘΩΣ ΚΑΙ ΠΡΙΝ ΚΑΙ ΜΕΤΑ ΤΗΝ ΑΝΤΙΛΕΪΣΜΑΝΙΚΗ ΘΕΡΑΠΕΙΑ ΜΕ ΜΙΛΤΕΦΟΣΙΝΗ ΚΑΙ ΑΛΛΟΠΟΥΡΙΝΟΛΗ ΔΗΜΗΤΡΙΟΣ Θ. ΜΑΤΡΑΛΗΣ ΚΤΗΝΙΑΤΡΟΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΠΟΥ ΕΚΠΟΝΗΘΗΚΕ ΣΤΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΠΑΡΑΣΙΤΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΙ ΠΑΡΑΣΙΤΙΚΩΝ ΝΟΣΗΜΑΤΩΝ ΤΟΥ ΤΜΗΜΑΤΟΣ ΚΤΗΝΙΑΤΡΙΚΗΣ ΤΗΣ ΣΧΟΛΗΣ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΟΥ ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟΥ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Η. ΠΑΠΑΔΟΠΟΥΛΟΣ ΑΝΑΠΛ. ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ Σ. ΦΡΥΔΑΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΜΕΛΟΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ Ε.ΠΑΠΑΔΟΓΙΑΝΝΑΚΗΣ ΕΠΙΜΕΛΗΤΗΣ ΜΕΛΟΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ Ζ.ΠΟΛΥΖΩΠΟΥΛΟΥ ΑΝΑΠΛ. ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΜΕΛΟΣ Σ. ΚΡΗΤΑΣ ΑΝΑΠΛ. ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΜΕΛΟΣ Ε. ΣΑΡΙΔΟΜΙΧΕΛΑΚΗΣ ΑΝΑΠΛ. ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΜΕΛΟΣ Α. ΔΙΑΚΟΥ ΕΠΙΚ. ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΜΕΛΟΣ

4

5 Στους γονείς μου, ως ελάχιστο δείγμα ευγνωμοσύνης για ότι μου έχουν προσφέρει

6

7 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΡΟΛΟΓΟΣ...5 ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΕΣ...7 ΜΕΡΟΣ ΠΡΩΤΟ: Α. ΣΥΝΤΟΜΗ ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ ΤΗΣ ΛΕΪΣΜΑΝΙΩΣΗΣ ΤΟΥ ΣΚΥΛΟΥ 1. Εισαγωγή Επιζωοτιολογικά δεδομένα Παθογένεια Κλινική εικόνα Εργαστηριακά ευρήματα Διάγνωση 20 7.Θεραπεία-Πρόληψη 23 Β. ΣΥΝΤΟΜΗ ΑΝΟΣΟΛΟΓΙΚΗ ΥΠΟΜΝΗΣΗ 1. CD4 και CD8 θετικά λεμφοκύτταρα Οι κυτταροκίνες IL-4 και IFΝ-γ 33 Γ. ΑΝΟΣΟΑΠΑΝΤΗΣΗ ΤΟΥ ΣΚΥΛΟΥ ΣΤΗ ΜΟΛΥΝΣΗ ΑΠΟ ΤΗ L. infantum 1. Μη ειδική ανοσοαπάντηση Ειδική ανοσοαπάντηση 41 Κυτταρική ανοσία 41 Χυμική ανοσία 45 1

8 Δ. ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ ΤΩΝ ΜΕΘΟΔΩΝ ΜΕΤΡΗΣΗΣ ΤΩΝ ΠΑΡΑΓΟΜΕΝΩΝ ΚΥΤΤΑΡΟΚΙΝΩΝ ΑΠΟ ΤΑ ΜΟΝΟΠΥΡΗΝΑ ΤΟΥ ΠΕΡΙΦΕΡΙΚΟΥ ΑΙΜΑΤΟΣ (PBMC) ΣΚΥΛΩΝ ΜΕ ΛΕΪΣΜΑΝΙΩΣΗ 49 ΜΕΡΟΣ ΔΕΥΤΕΡΟ: ΔΙΚΗ ΜΑΣ ΕΡΕΥΝΑ YΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 1. Ζώα-συγκρότηση ομάδων-ιστορικό Γενική κλινική εξέταση Εργαστηριακές εξετάσεις Αιματολογικές εξετάσεις Βιοχημικές εξετάσεις Εξέταση του ούρου Παρασιτολογική εξέταση κοπράνων Κυτταρολογική εξέταση οπού λεμφογαγγλίου Ορολογική εξέταση (ΙFA) για την ανίχνευση αντισωμάτων κατά της L.infantum PCR σε οπό λεμφογαγγλίου Ορολογικές εξετάσεις για την ανίχνευση μικροοργανισμών που τυχόν συνυπάρχουν με την CanL Καλλιέργεια-ανοσοδιέγερση των λεμφοκυττάρων και σήμανση των ενδοκυττάριων κυτταροκινών-μονοκλωνικά αντισώματα Κυτταρομετρία ροής και αξιολόγηση του αποτελέσματος Στατιστική ανάλυση 75 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 1. Μέτρηση των CD4+, CD8+ T-λεμφοκυττάρων και του μεταξύ τους λόγου στο περιφερικό αίμα του σκύλου Μέτρηση των θετικών στις ενδοκυττάριες κυτταροκίνες IFN-γ και IL-4, CD4+ και CD8+ T-λεμφοκυττάρων στο περιφερικό αίμα του σκύλου 90 2

9 ΣΥΖΗΤΗΣΗ 111 ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ 123 ΠΕΡΙΛΗΨΗ 125 SUMMARY 129 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ ΠΙΝΑΚΩΝ 133 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 155 3

10 4

11 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Στη χώρα μας, η λεϊσμανίωση από τη Leishmania infantum (συν. chagasi) είναι ένα από τα συχνότερα και σπουδαιότερα παρασιτικά νοσήματα του σκύλου. Η ουσιαστική απουσία ταχέων και αξιόπιστων τεχνικών προσδιορισμού της ανοσοαπάντησης του σκύλου στο συγκεκριμένο πρωτόζωο, ώστε να μπορεί να γίνει με αντικειμενικότερο τρόπο η εκτίμησή της, για την πρόγνωση και την εξέλιξη του νοσήματος, ήταν το βασικό κίνητρο της παρούσας έρευνας. Για το σκοπό αυτό μετρήθηκαν, για πρώτη φορά, έμμεσα οι ενδοκυττάριες κυτταροκίνες ΙFN-γ και ΙL-4 στα CD4+ και CD8+ λεμφοκύτταρα του περιφερικού αίματος σκύλων μολυσμένων με τη L. infantum, ώστε να μπορεί να εκτιμηθεί η ανοσοαπάντηση, αφού όπως είναι γνωστό η ΙFN-γ ενεργοποιεί την κυτταρική, ενώ η IL-4 τη χυμική ανοσία. Στο πρώτο μέρος της μελέτης επιχειρείται μια σύντομη ανασκόπηση της λεϊσμανίωσης στο σκύλο, της κυτταρικής και της χυμικής ανοσίας και της ανοσοαπάντησης του σκύλου στη λεϊσμάνια, δίνοντας ιδιαίτερη έμφαση στους λεμφοκυτταρικούς υποπληθυσμούς CD4+ και CD8+ και τις ενδοκυττάριες κυτταροκίνες ΙFN-γ και IL-4. Στο δεύτερο μέρος, αναφέρονται τα υλικά και οι μέθοδοι που χρησιμοποιήθηκαν και τα αποτελέσματα, που συνοδεύονται από λεπτομερείς, συγκεντρωτικούς πίνακες και γραφήματα. Τη συζήτηση των αποτελεσμάτων, που στηρίχθηκε κυρίως στα δεδομένα της πρόσφατης βιβλιογραφίας, ακολουθούν τα συμπεράσματα και ο κατάλογος των βιβλιογραφικών πηγών που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα διατριβή. Από τη θέση αυτή αισθάνομαι την ανάγκη να εκφράσω τις ειλικρινείς μου ευχαριστίες στον τέως Καθηγητή της Παθολογίας των Ζώων Συντροφιάς στην Κτηνιατρική Σχολή του Α.Π.Θ. και διπλωματούχο του ECVD, Αλέξανδρο Φ. Κουτίνα για την εμπιστοσύνη που έδειξε αναθέτοντάς μου την έρευνα αυτή και την αμέριστη συμπαράστασή του κατά την εκπόνησής της. Το ίδιο θερμά ευχαριστώ τον αναπληρωτή Καθηγητή Παρασιτολογίας του τμήματος Κτηνιατρικής της Σχολής Επιστημών Υγείας του Α.Π.Θ. κ. Ηλία Παπαδόπουλο, που ανέλαβε να ολοκληρώσει το έργο του κ. Α. Κουτίνα μετά την συνταξιοδότησή του, όπως εξάλλου τον κ. Μανώλη Παπαδογιαννάκη, Επιμελητή του Τομέα της Κτηνιατρικής Δημόσιας Υγείας της Εθνικής Σχολής Δημόσιας Υγείας, στον οποίο ανήκε και η 5

12 πατρότητα του θέματος και τον κ. Σταύρο Φρύδα, Καθηγητή Παρασιτολογίας του τμήματος Κτηνιατρικής της Σχολής Επιστημών Υγείας του Α.Π.Θ., για την πολύτιμη βοήθεια, τις εύστοχες υποδείξεις και τις πολύτιμες συμβουλές αναφορικά με την ερμηνεία των αποτελεσμάτων. Θα ήθελα επίσης να ευχαριστήσω θερμά τον Καθηγητή του Τομέα Κτηνιατρικής Δημόσιας Υγείας και Κοσμήτορα της Εθνικής Σχολής Δημόσιας Υγείας (Ε.Σ.Δ.Υ.) κ. Βασίλειο Κοντό, για την εργαστηριακή υποστήριξη της διατριβής αυτής, τις πολύτιμες συμβουλές του και την άμεση ανταπόκρισή του σε οποιοδήποτε πρόβλημα προέκυπτε κατά την διάρκεια της εκπόνησής της. Ευχαριστώ την Καθηγήτρια του Τομέα Επιδημιολογίας και Βιοστατιστικής της Ε.Σ.Δ.Υ. κ. Αναστασία Ρουμελιώτου για την ευγενική παραχώρηση του εργαστηρίου της κυτταρομετρίας ροής και ιδιαίτερα την τεχνολόγο κ. Μαρία Ταμαμίδου, του ίδιου εργαστηρίου, που με βοήθησε να κατανοήσω την κυτταρομετρία ροής και χωρίς την τεχνική βοήθεια της οποίας, θα ήταν αδύνατη η ολοκλήρωση της μελέτης αυτής. Θα ήταν παράλειψη αν δεν εξέφραζα τις ευχαριστίες μου στον Καθηγητή του Τομέα Παρασιτολογίας, Εντομολογίας και Τροπικών Νοσημάτων της Ε.Σ.Δ.Υ κ. Ν. Βακάλη και ιδιαίτερα τον επιστημονικό συνεργάτη και μοριακό βιολόγο Δρ. Γ. Σπανάκο, για την πολύτιμη βοήθεια με τις μοριακές εξετάσεις, καθώς και τον Επιμελητή του Τομέα Επιδημιολογίας και Βιοστατιστικής κ. Ε. Κτενά, για την στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων της μελέτης αυτής. Θα ήθελα επίσης να ευχαριστήσω την συνεργάτη μου και Διδάκτορα της Κτηνιατρικής Σχολής του Α.Π.Θ., Καλλή Ίριδα για την βοήθεια που μου προσέφερε με τη βιβλιογραφία της μελέτης αυτής. Τέλος, ευχαριστώ θερμά τη συζυγό μου Κατερίνα, για την κατανόηση και την ψυχολογική στήριξη που μου προσέφερε κατά την συγγραφή του εν λόγω πονήματος, καθώς και για την ανεκτίμητη βοήθειά της στην μορφοποίηση και λογοτεχνική επεξεργασία του κειμένου. 6

13 ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΕΣ ΑLB: Alboumins, λευκωματίνες ΑIDS: Acquired Immunodificiency Syndrome, σύνδρομο επίκτητης ανοσοανεπάρκειας ALP: Alkaline Phosphate, αλκαλική φωσφατάση ALT: Alaninoaminotransferase, αλανινοαμινοτρανσφεράση ΑPC: Antigen-Presenting-Cells, αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα (ΑΠΚ) BUN: Blood Urea Nitrogen, άζωτο ουρίας CD: Clusters of differentiation, ομάδες διαφοροποίησης Ca: Calcium, ασβέστιο CanL: Canine Leishmaniasis, λεϊσμανίωση του σκύλου (ΛΣ) CICs: Circulating Immune Complexes, κυκλοφορούντα ανοσοσύμπλοκα CTL: Cytotoxic T-Lymphocytes, κυτταροτοξικά Τ-λεμφοκύτταρα CREA: Creatinine, κρεατινίνη DDCs: Dendritic cells, δενδριτικά κύτταρα DNA: Deoxyribonucleic acid, δεσοξυριβονουκλεϊκό οξύ DTH: Delated Type Hypersensitivity, καθυστερημένου τύπου αντίδραση υπερευαισθησίας DAT: Direct Agglutination Test, δοκιμή άμμεσης αιμοσυγκόλησης ELISA: Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, δοκιμή ενζυμοσυνδεόμενης ανοσοπροσρόφησης GLU: Glucose, γλυκόζη HCT: Haematocrite, αιματοκρίτης Ηb: Haemoglobin, αιμοσφαιρίνη inos: indusible Nitric Oxide Synthase, συνθάση του νιτρικού οξέος ΙFAT: Immunofluoroscent Antibody Test, έμμεσος ανοσοφθορισμός Ιg: Immunoglubin, ανοσοσφαιρίνη 7

14 IL: Interleukine, ιντερλευκίνη IFN: Interferon, ιντερφερόνη Iono: Ionomycin, ιονομυκίνη ΙTAM: Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motifs, ανοσοϋποδοχείς ενεργοποίησης Κ: Potassium, κάλιο KCs: Keratinocytes, κερατινοκύτταρα LCF: Leishmania Chemotactic Factor, χημειοτακτικός παράγοντας της λεϊσμάνια LCs: Langerhans Cells, κύτταρα του Langerhans LSA: Leishmania Soluble Antigen, διαλυτό αντιγόνο της λεϊσμάνια MHC: Major Histocompatibility Complex, μείζον σύμπλεγμα ιστοσυμβατότητας min: minute, λεπτό της ώρας Νa: Sodium, νάτριο ΝΚ: Νatural killers, κύτταρα φυσικοί φονείς RNA: Ribonoucleic acid, ριβονουκλεϊκό οξύ RT-PCR: Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction, αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης αντίστροφης μεταγραφής PBMCs: Peripheral Blood Mononuclear Cells, μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος PCR: Polymerase Chain Reaction, αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης PE: Phycoerythrin, φυκοερυθρίνη PHA: Phytohaemaglutinin, φυτική λεκτίνη PMA: phorbol-12-myristate-13-acetate PLT: Platelets, αιμοπετάλια TCR: T-cell receptor, υποδοχέας των Τ- λεμφοκυττάρων Τh: T-helper, βοηθητικά Τ-λεμφοκύτταρα TNF-α: Tumor Necrosis Factor α, παράγοντας νέκρωσης όγκων-α 8

15 ΤP: Total Proteins, ολικές πρωτεΐνες Τ reg : T-regulatory cells, ρυθμιστικά Τ-λεμφοκύτταρα UPC: Urine Protein/Creatinine ratio, λόγος πρωτεϊνών/κρεατινίνης στο ούρο WBC: White Blood Cells, αριθμός λευκών αιμοσφαιρίων WHO: World Health Organisation, Παγκόσμιος Οργανισμός Υγείας 9

16 10

17 ΜΕΡΟΣ ΠΡΩΤΟ Α. ΣΥΝΤΟΜΗ ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ ΤΗΣ ΛΕΪΣΜΑΝΙΩΣΗΣ ΤΟΥ ΣΚΥΛΟΥ ΠΟΥ ΟΦΕΙΛΕΤΑΙ ΣΤΗ L. infantum (συν. chagasi) 1. Εισαγωγή Η λεϊσμανίωση του σκύλου (CanL) είναι πολυσυστηματικό παρασιτικό νόσημα που οφείλεται στο ενδοκυτταρικό πρωτόζωο Leishmania infantum (συν. chagasi) (Sarcomastigofora, Kinetoplastida, Trypanosomatidae) (Molyneux και Ashford 1983, Euzeby 1986, Sellon 1992, WHO 1996, Slappendel και Ferrer 1998, Mauricio και συν 2001) και παρουσιάζει παγκόσμια εξάπλωση, με εξαίρεση την Ωκεανία και την Ανταρκτική (Locksley κα Scott 1991, Dereure και συν 1999). Στην Ελλάδα, όπως εξάλλου και σε άλλες παραμεσόγειες χώρες, η νόσος έχει ενδημικό χαρακτήρα (Kontos και Spais 1989, Koutinas και συν 1999, Solano-Gallego και συν 2009). Η L.infantum μπορεί να προσβάλλει και άλλα είδη της οικογένειας των Canidae (Hervas και συν 1996, Beck και συν 2008), το άλογο (Sales και συν 1998, Muller και συν 2009), τη γάτα (Οzon και συν 1998, Maroli και συν 2007, Martin-Santchez 2007, Maia και συν 2008), το πρόβατο (Van der Lugt 1992) και πιθανόν τα τρωκτικά (Papadogiannakis και συν 2010). To διφασικό αυτό πρωτόζωο, ως ασπόνδυλους ξενιστές, έχει τα αρθρόποδα των γενών Phlebotomus (Ευρώπη, Ασία, Β. Αφρική) και Lutzomyia (Λατινική Αμερική), που φιλοξενούν τις μετακυκλικές προμαστιγοφόρες μορφές του παρασίτου, οι οποίες έχουν μήκος μm και κινούνται με τη βοήθεια μαστιγίου (Μolyneyx και Killick-Kendrick 1987). Οι σπονδυλωτοί ξενιστές και ιδιαίτερα τα θηλαστικά, φέρουν την αμαστιγοφόρο του μορφή (2-5μm x 1,5-2μm) (Χαραλαμπίδης 2003, Βaneth και συν 2008). Στις παραμεσόγειες χώρες τo πρωτόζωο μεταδίδεται με τα νύγματα των μολυσμένων θηλυκών σκνιπών (Phlebotomus sp.), που είναι μικρά έντομα με μήκος 3mm (Killick Kendrick 1999). Οι σκνίπες μολύνονται όταν, κατά τη απομύζηση αίματος από μολυσμένους από λεϊσμανίωση σκύλους, προσλάβουν τις αμαστιγοφόρες μορφές. Αυτές στη συνέχεια θα μετατραπούν σε προμαστιγοφόρες στον πεπτικό σωλήνα, θα πολλαπλασιαστούν με δυαδική διχοτόμηση, θα μεταναστεύσουν στο φάρυγγα και τα στοματικά μόρια, για να ακολουθήσει στη συνέχεια νέος ενοφθαλμισμός και μόλυνση άλλων σκύλων (Ferrer 1992, Volf και συν 11

18 2008). Στο σπονδυλωτό ξενιστή, η προμαστιγοφόρος μορφή χάνει το μαστίγιο και μετατρέπεται στην ωοειδή, ακίνητη αμαστιγοφόρο μέσα στα μακροφάγα του δέρματος και των σπλάχνων, όπου και πολλαπλασιάζεται (Killick-Kendrick 2002, Volf και συν 2008). Η αμαστιγοφόρος μορφή χαρακτηρίζεται από την παρουσία του ραβδοειδή κινητοπλάστη, ενός πλούσιου σε DNA μιτοχόνδριου (Κillick-Kendrick και συν 2002). Η L.infantum έχει αποδειχθεί ότι μπορεί να μεταδοθεί και με τη μετάγγιση αίματος (Οwens και συν 2001, de Freitas και συν 2006), με τη συνουσία (Silva και συν 2009), καθώς και από τις μολυσμένες σκύλες στα έμβρυα (Rosypal και συν 2005). Το ίδιο μπορεί να λεχθεί και για τη μετάδοση του παρασίτου ύστερα από δήγμα άρρωστου σκύλου (Αlvar και συν 2008) και στους τοξικομανείς ανθρώπους με τις μολυσμένες σύριγγες (Cruz και συν 2002). H μετάδοση του παρασίτου από άλλα αιματοφάγα αρθρόποδα (π.χ. Rhipicephalus sanguineus, ψύλλοι), εκτός από τις σκνίπες, δεν έχει επιβεβαιωθεί και συνεπώς έχει αμφίβολη επιδημιολογική σημασία (Coutinho και συν 2005, Coutinho και Linardi 2007, Fereira και συν 2009). Στη χώρα μας μέχρι σήμερα έχουν ταυτοποιηθεί 12 είδη φλεβοτόμων (σκνιπών) (P. neglectus, P.perfiliewi, P.sergenti, P.tobbi, P.simici, P.papatasi, P.balcanicus, P. alexandri, P.mascitti, Sergentomyia dentate, S.minuta, S.theodori), από τους οποίους οι κύριοι υπεύθυνοι για τη μετάδοση του παρασίτου θεωρούνται οι P.tobbi και P.neglectus που δραστηριοποιούνται από τις αρχές Μαΐου μέχρι και το Νοέμβριο (Chaniotis και συν 1994, Χαραλαμπίδης 2003). 2. Eπιζωοτιολογικά δεδομένα Στην Ελλάδα και τις άλλες παραμεσόγειες χώρες η CanL έχει ενζωοτικό χαρακτήρα, αν και ο πραγματικός αριθμός των μολυσμένων σκύλων είναι δύσκολο να εκτιμηθεί επειδή ο χρόνος επώασης ποικίλλει από λίγους μήνες μέχρι και επτά χρόνια (Κοντός 1986, Ferrer 1992, Slappendel και Ferrer 1998), ο αριθμός των ασυμπτωματικών ζώων είναι μεγάλος και οι διάφορες ορολογικές δοκιμές δεν είναι 100 ευαίσθητες (Killick Kendrick και συν 1994, Leontides και συν 2002, Baneth 2005). Με τις μοριακές τεχνικές ανίχνευσης του γενετικού υλικού της L.infantum στους διάφορους ιστούς έχει βρεθεί ότι ο αριθμός των μολυσμένων σκύλων στις ενζωοτικές περιοχές της νόσου ξεπερνά κατά πολύ τα άρρωστα (συμπτωματικά) ζώα (Baneth και συν 2008, Sollano-Gallego και συν 2009). Σε πειραματικές μολύνσεις έχει διαπιστωθεί ότι οι 12

19 σκύλοι μπορούν να παραμείνουν ασυμπτωματικοί μέχρι και πέντε χρόνια (Killick Kendrick 1994). Σε επιδημιολογική μελέτη με 100 σκύλους που έγινε στη Μαγιόρκα της Ισπανίας, βρέθηκε ότι το 13 των ζώων παρουσίαζαν συμβατά με την CanL συμπτώματα, η οροθετικότητα ήταν 26, ενώ με την PCR στο μυελό των οστών, σε ιστοτεμάχια δέρματος και υλικό απόξεσης του επιπεφυκότα το ποσοστό έφτασε το 63 (Sollano- Gallego και συν 2001). Σε ανάλογη μελέτη που έγινε στη χώρα μας σε 73 κυνηγητικούς και κλινικά υγιείς σκύλους, το 12,3 ήταν οροθετικoί, ενώ με την PCR στο αίμα και το μυελό των οστών το ποσοστό των θετικών ζώων έφτασε το 63 (Leondides και συν 2002). Τέλος, σε μελέτη που έγινε στη Νάπολη της Ιταλίας, το ποσοστό των PCR θετικών σκύλων έφτασε να είναι 97,3, ενώ το αντίστοιχο των οροθετικών ήταν 75,7. (Οliva και συν 2006). Όταν οι συνθήκες στο περιβάλλον είναι ευνοϊκές (π.χ. μεγάλος αριθμός φλεβοτόμων και αδέσποτων σκύλων, αυξημένες θερμοκρασίες λόγω υπερθέρμανσης του πλανήτη), η νόσος εξαπλώνεται γρήγορα, γεγονός που φαίνεται να εξηγεί τη σημαντική αύξηση των μολυσμένων σκύλων στις χώρες της βόρειας Ευρώπης, χωρίς να μπορεί να αμφισβητηθεί η επιδημιολογική σημασία της επίσκεψης των σκύλων αυτών σε χώρες της νότιας Ευρώπης, όπως εξάλλου και οι αθρόες εισαγωγές νεαρών αδέσποτων σκύλων από τις περιοχές αυτές (Teske και συν 2002, Shaw και συν 2009). 3. Παθογένεια Το συγκεκριμένο πρωτόζωο ασκεί την παθογόνο του δράση μέσω της εξουδετέρωσης των λυτικών ενζύμων του ξενιστή στην περιοχή του νύγματος του φλεβοτόμου, της μεταβολής του ph και του ιοντικού φορτίου στα κύτταρα του δέρματος, της καταστροφής των μακροφάγων κυττάρων και της ελευθέρωσης οξέων και ενζύμων που προκαλούν βλάβη στους ιστούς του ξενιστή (π.χ. έλκη στο δέρμα και τους βλεννογόνους) (Hozmuller και συν 2006), της μακροχρόνιας ενεργοποίησης των κυτταροτοξικών Τ-λεμφοκυττάρων από τις κυτταροκίνες που εκκρίνονται από άλλα ενεργοποιημένα ανοσοκύτταρα (Βaneth και συν 2008), της πρόκλησης αντίδρασης υπερευαισθησίας, και κυρίως μέσω της δημιουργίας ανοσοσυμπλόκων (circulating immune complexes ή CICs), που προσκολλούμενα στη βασική μεμβράνη, το ενδοθήλιο ή το επιθήλιο διαφόρων οργάνων (π.χ. νεφροί, ίριδα, αρθρικός υμένας) ενεργοποιούν το συμπλήρωμα, με αποτέλεσμα την πρόκληση αλλοιώσεων (Lopez και συν 1996, Vamvakidis και συν 2000, Font και συν 13

20 2004, Ginel και συν 2008, Peña και συν 2008). Επιπλέον, τα ανοσοσύμπλοκα ευνοούν την φαγοκυττάρωση και την παραγωγή αυτοαντισωμάτων, ενώ με το σάλιο των σκνιπών, που ενοφθαλμίζεται στο χόριο του δέρματος κατά την απομύζηση του αίματος και περιέχει πεπτίδια με αναισθητικές, αντιπηκτικές, αγγειοδιασταλτικές και ανοσοκατασταλτικές ιδιότητες, εξασφαλίζεται σε μεγάλο βαθμό η εγκατάσταση της μόλυνσης (Koutinas και συν 1999, Rutten 2003, Reis και συν 2009). 4. Κλινική εικόνα Η κλινική εικόνα της CanL παρουσιάζει τόσο μεγάλη ποικιλομορφία, ώστε η διαφορική διάγνωση από τις άλλες συστημικές και τοπικές παθήσεις να παρουσιάζει αρκετές δυσκολίες (Kontos και Koutinas 1993, Ferrer 1997, Koutinas και συν 1999, Βaneth και συν 2008). Σε διάφορες επιζωοτιολογικές και κλινικές μελέτες έχει διαπιστωθεί ότι στους σκύλους με λεϊσμανίωση συχνά συνυπάρχουν ταυτόχρονα και άλλες παθολογικές καταστάσεις όπως π.χ. η ερλιχίωση η αναπλάσμωση, η πιροπλάσμωση, η ηπατοζωονόσος και η διροφιλαρίωση (Kontos και Κoutinas 1997, Τarantino και συν 2001, Μylonakis και συν 2004, Roura και συν 2005, Μylonakis και συν 2008, Mekuzas και συν 2009, Saridomichelakis 2009, Tabar και συν 2009). Tα συχνότερα αίτια προσκόμισης των προσβεβλημένων από τη L.infantum σκύλων είναι η μειωμένη όρεξη, η εύκολη κόπωση, η προοδευτική απώλεια του σωματικού βάρους, οι δερματικές και οφθαλμικές αλλοιώσεις, τα συμπτώματα της χρόνιας νεφρικής ανεπάρκειας, η επίσταξη, η ονυχογρύπωση και η χωλότητα (Ciaramella και συν 1997, Κoutinas και συν 1999, Baneth και συν 2005). Σε μοριακές μελέτες με την τεχνική της αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο (real-time PCR), βρέθηκε ότι υπάρχει θετικός συσχετισμός μεταξύ του παρασιτικού φορτίου των λεμφογαγγλίων, του σπλήνα, του δέρματος ή/και του μυελού των οστών των προσβλημένων σκύλων και της κλινικής εικόνας (Reis και συν 2009). Στην ίδια μελέτη το αυξημένο παρασιτικό φορτίο και ιδιαίτερα του σπλήνα και του μυελού των οστών, βρέθηκε ότι αποτελεί σημαντικό δείκτη της κλινικής εικόνας των μολυσμένων σκύλων. Οι φυλές Rottweiler, German sheperd, boxer, Doberman pincher και foxhound φαίνεται να παρουσιάζουν ιδιαίτερη προδιάθεση (Gaskin 2002, Μiranda και συν 2008), ενώ στην Ibizian hound συμβαίνει ακριβώς το αντίθετο (Solano-Gallego και συν 2000). Η CanL εμφανίζεται συχνότερα στους νεαρούς ενήλικους (<3 ετών) και μεσήλικους σκύλους 14

21 (8-10 ετών) (Αmela και συν 1995, de Azevedo 2008, Miranda και συν 2008), ενώ ως προς το φύλο, υπάρχει διχογνωμία με ορισμένους ερευνητές να υποστηρίζουν την προδιάθεση των αρσενικών (Ciaramella και συν 1997, Ζaffaroni και συν 1999, Ζivicnjak και συν 2005) και με άλλους των θηλυκών σκύλων (Κoutinas και συν 1999, Μiró και συν 2007). H γενικευμένη περιφερική λεμφoγαγγλιομεγαλία είναι αρκετά συχνή (93,5) από την αρχή της εξέλιξης της νόσου (Alvar και συν 2004, Baneth 2008), με τα διογκωμένα λεμφογάγγλια να φτάνουν μέχρι και έξι φορές το φυσιολογικό τους μέγεθος (Lima και συν 2004). Στο τελικό όμως στάδιο της νόσου και ιδιαίτερα στους νεφροπαθείς σκύλους, τα λεμφογάγγλια συνήθως επανακτούν το φυσιολογικό τους μέγεθος ή είναι υποπλαστικά (Κoutinas και συν 1999). Η εξίσου συχνή σπληνομεγαλία, που συνήθως γίνεται αντιληπτή απεικονιστικά και όχι κατά την ψηλάφηση της κοιλιακής κοιλότητας, όπως συμβαίνει με άλλες παθολογικές καταστάσεις που εμφανίζουν διόγκωση του σπληνός (π.χ. ερλιχίωση, πιροπλάσμωση, λέμφωμα, στροφή σπληνός), συνοδεύεται από μεταβολές της αρχιτεκτονικής δομής του οργάνου, περισπληνίτιδα, κοκκιώματα και ατροφία των λεμφικών θυλακίων (Koutinas και συν 1999, Santana και συν 2008, Sollano-Gallego και συν 2009). Και οι δύο παραπάνω παθολογικές καταστάσεις οφείλονται κατά κύριο λόγο στην αντιδραστική υπερπλασία του λεμφοειδή ιστού (Giunchetti και συν 2008). Oι δερματικές αλλοιώσεις, που αποτελούν τη συχνότερη ορατή κλινική εκδήλωση της CanL, εμφανίζονται στο 50 μέχρι και το 90 των περιστατικών (Ferrer και συν 1988, Κoutinas και συν 1993, Alvar και συν 2004), ενώ το ποσοστό αυτό ενδέχεται να είναι ακόμη πιο υψηλό, όπως βρέθηκε σε μελέτες βιοψιών δέρματος μολυσμένων σκύλων (Solano-Gallego και συν 2004, Papadogiannakis και συν 2005). Από αυτές η συχνότερη και εντυπωσιακότερη είναι η αποφολιδωτική δερματίτιδα, που ενδέχεται να εντοπίζεται σε συγκεκριμένη περιοχή (π.χ. κεφαλή) ή να είναι γενικευμένη και διάχυτη (Κoutinas και συν 1993, Papadogiannakis και συν 2005, Gross και συν 2005). Λιγότερο συχνή είναι η ονυχογρύπωση και η ελκώδης δερματίτιδα, που συνήθως εντοπίζεται στα χείλη των πτερυγίων των αυτιών, τις οστέινες προεξοχές, τα βλεννογονοδερματικά όρια και τα πελματικά φύματα (Koutinas και συν 1993, Solano-Gallego και συν 2009), ενώ στις σπανιότερες περιλαμβάνονται η οζώδης και η φλυκταινώδης δερματίτιδα, η υπερκεράτωση του ακρορινίου και των πελματικών φυμάτων και η παρονυχία (Ferrer και συν 1988, Koutinas και συν 1993, Βlavier και συν 2001, Solano-Gallego και συν 2009). To παρασιτικό φορτίο του δέρματος παρουσιάζει άμεσο συσχετισμό με συγκεκριμένες περιοχές του δέρματος (π.χ. πτερύγια των αυτιών), με την έκκριση τοπικών κυτταροκινών 15

22 (π.χ. IL-10, TGF-1) και χημειοκινών (π.χ. CCD, CC14) και με κυκλοφορούντα ανοσοκύτταρα (Guerra και συν 2009, Menezes-Sousa και συν 2011, Μenezes-Sousa και συν 2012). Τα τυπικά ιστολογικά ευρήματα είναι η ορθοκερατική ή παρακερατική υπερκεράτωση, η ακάνθωση και η φλεγμονή του δέρματος και περιστασιακά του υποδόριου ιστού (Ferrer 1990, Koutinas και συν 2010). Τέλος, οι τυπικές δερματικές αλλοιώσεις της CanL ενδέχεται να υπερκαλύπτονται από αυτές που οφείλονται σε συνυπάρχουσες (π.χ. σαρκοκοπτική ψώρα, υποθυροειδισμός, ατοπική δερματίτιδα, εξελκωμένα νεοπλάσματα) ή επιπλέκουσες (π.χ. πυώδη δερματίτιδα, δερματοφυτίαση, δερματίτιδα από Malassezia και δεμοδήκωση) παθήσεις του δέρματος (Koutinas και συν 1993, Cortese και συν 1999, Mozos και συν 1999, Blavier και συν 2001, Catone και συν 2003, Cafarchia και συν 2008, Τabar και συν 2009). Η επίσταξη, που ενδέχεται να απειλήσει τη ζωή του ζώου, εμφανίζεται σε λιγότερα περιστατικά της νόσου (5-15), και μπορεί να είναι αμφοετερόπλευρη ή μονόπλευρη, έντονη ή ήπια και συνεχής ή διαλείπουσα (Koutinas και συν 1999, Βlavier και συν 2001). Η επίσταξη προκαλείται από το συνδυασμό της λεμφοπλασμοκυτταρικής ή/και κοκκιωματώδους ρινίτιδας, της θρομβοκυτταροπάθειας και του αυξημένου ιξώδους του αίματος λόγω της υπερσφαιριναιμίας (Juttner και συν 2001, Petanides και συν 2008). Στις ενδημικές περιοχές της νόσου, η επίσταξη πρέπει να διαφοροποιείται από εκείνη που προκαλείται από τη μονοκυτταρική ερλιχίωση (Ehrlichia canis) και το αφροδίσιο μεταδοτικό νεόπλασμα (Μylonakis και συν 2008). Oι οφθαλμικές αλλοιώσεις είναι συχνό κλινικό εύρημα (16-80,5), ενώ είναι σαφώς λιγότερα τα περιστατικά που προσκομίζονται με μοναδικό πρόβλημα τα συμπτώματα από τους οφθαλμούς (3,7-16 ) (Ciaramella και συν 1997, Koutinas και συν 1999, Νaranjo και συν 2005, Peña και συν 2008). Στις συχνά προκαλούμενες οφθαλμικές παθήσεις περιλαμβάνονται η ξηρή κερατοεπιπεφυκίτιδα, η πρόσθια ραγοειδίτιδα, η πυώδης επιπεφυκίτιδα, η βλεφαρίτιδα (ελκώδης, οζώδης, αποφολιδωτική), η επιπολής και βαθιά κερατίτιδα και η επισκληρίτιδα (Peña και συν 2008). Συγκεκριμένα, η από ανοσοσύμπλοκα προκαλούμενη πρόσθια ραγοειδίτιδα μπορεί να προκαλέσει οίδημα του κερατοειδή χιτώνα και συμφόρηση του βολβικού επιπεφυκότα, ενώ ενδέχεται να εξελιχθεί σε γλαύκωμα κλειστής γωνίας και πανοφθαλμίτιδα. με αποτέλεσμα την τύφλωση του ζώου (Roze και συν 2002, Νaranjo και συν 2005, Peña και συν 2008). Οι αλλοιώσεις του αμφιβληστροειδή χιτώνα, που οφείλονται στη νεφρικής προέλευσης αρτηριακή υπέρταση 16

23 ή την κοκκιωματώδη χοριοαμφιβληστροειδίτιδα, εμφανίζονται αρκετά σπανιότερα (Cortadellas και συν 2006, Peña και συν 2008). Η πρωτεϊνουρική νεφροπάθεια μπορεί να είναι το μοναδικό εύρημα της CanL σε αρκετά κλινικά περιστατικά (Koutinas και συν 1999, Costa και συν 2003, Plevraki και συν 2006). Η από ανοσοσύμπλοκα σπειραματονεφρίτιδα, που είναι κυρίως μεμβανοϋπερπλαστική ή/και μεσαγγειοϋπερπλαστική και η πρωτογενής ή δευτερογενής διάμεση νεφρίτιδα συνιστούν την παθολογοανατομική βάση της νεφροπάθειας από τη λεϊσμάνια, που εκτός από την ασυμπτωματική πρωτεϊνουρία μπορούν να οδηγήσουν σε χρόνια νεφρική ανεπάρκεια (oυραιμικό ή/και νεφρωσικό σύνδρομο) (Costa και συν 2003), με αποτέλεσμα το θάνατο των μολυσμένων σκύλων (Koutinas και συν 1999, Plevraki και συν 2006, Solano-Gallego και συν 2009, Vulpiani και συν 2011, Pardali και συν 2012). Επισημαίνεται ότι στην CanL η αμυλοείδωση του νεφρού αποτελεί σπάνιο εύρημα (Poli και συν 1991, Costa και συν 2003, Αresu και συν 2012). Eπειδή η νεφροπάθεια παίζει σημαντικό ρόλο στην εξέλιξη και πρόγνωση της μόλυνσης από τη L.infantum, αποτέλεσε το βασικό κριτήριο της κλινικής σταδιοποίησης της CanL, που επιχειρήθηκε από τη Leishvet (Solano-Gallego και συν 2009). Στα περισσότερα περιστατικά, μοναδική ένδειξη της λεϊσμανιακής νεφροπάθειας αποτελεί η ασυμπτωματική πρωτεϊνουρία. Η παραπάνω νεφροπάθεια, ανάλογα με τη σοβαρότητά της, μπορεί να οδηγήσει σε απώλεια των μυϊκών μαζών, καχεξία ή ακόμη και σε αρτηριακή θρομβοεμβολή (Κοutinas και συν 1999). Η όχι τόσο συχνή στην κλινική πράξη και κυρίως ασυμπτωματική χρόνια ηπατίτιδα της CanL, έχει πιθανότατα ανοσολογικό χαρακτήρα και κάτω από ορισμένες προϋποθέσεις (π.χ κίρρωση ή ίνωση του ήπατος) ενδέχεται να προκαλέσει οξεία ή χρόνια ηπατική ανεπάρκεια (Ferrer 1992, Rallis και συν 2005). Η ηπατομεγαλία, που δεν είναι συχνό κλινικό εύρημα, οφείλεται στο συνδυασμό της φλεγμονώδους αντίδρασης, της υπερτροφίας/υπερπλασίας των ηπατικών κυττάρων ή πιθανότατα της παθητικής συμφόρησης του ήπατος (Rallis και συν 2005, Guinchetti και συν 2008). Το ίδιο σπάνια είναι και η χρόνια πυοκοκκιωματώδης/κοκκιωματώδης κολίτιδα, που συνήθως είναι ασυμπτωματική (Ferrer και συν 1991, Αdamama-Moraitou και συν 2007), ενώ έχει παρατηρηθεί και μηχανικός ειλεός εξαιτίας της παρουσίας ευμεγέθων κοκκιωμάτων στο λεπτό έντερο, ή το σύνδρομο δυσαπορρόφησης λόγω χρόνιας εντερίτιδας, αν και σε πολύ λίγα περιστατικά. Σε πρόσφατη μελέτη στην οποία εξετάσθηκε ιστολογικά ο πεπτικός σωλήνας συμπτωματικών και ασυμπτωματικών λεϊσμανιακών σκύλων, βρέθηκε ότι οι τυπικές, αν και ήπιες, αλλοιώσεις της νόσου παρουσιάζονται σε όλο το μήκος του, σε 17

24 συνδυασμό με υψηλό παρασιτικό φορτίο, κυρίως στο κόλον (Pinto και συν 2011). Η πολυμυΐτιδα των μασητήριων και των σκελετικών μυών, που είναι σχετικά συχνή στους σκύλους με CanL, παρουσιάζει προοδευτική εξέλιξη και μπορεί να οδηγήσει σε μυϊκή ατροφία (Koutinas και συν 1999). Η τελευταία οφείλεται σε λεμφοπλασμοκυτταρική ή/και κοκκιωματώδη ενδομυϊκή και περιμυϊκή φλεγμονή, ακολουθούμενη από μη αναγεννητικές, νεκρωτικές ή αναγεννητικές μεταβολές των μυϊκών ινών που προκαλούνται από την παρουσία των αμαστιγοφόρων μορφών του παρασίτου, την εναπόθεση ανοσοσυμπλόκων και σπανιότερα από την ουδετεροφιλική αγγειΐτιδα (Vamvakidis και συν 2000, Kassabalis και συν 2013). Σπανιότερα μπορεί να προκληθεί οστεομυελίτιδα (Slappendel 1988, Buracco και συν 1997, Αgut και συν 2003), ελκώδης ή μη, μόνο ή πολυαρθρίτιδα (Agut και συν 2003, Soubasis και συν 2013), οζίδια ή έλκη στη γλώσσα (Lamothe και συν 2002, Foglia Manzillo και συν 2005, Viegas και συν 2012), διάμεση πνευμονία (Gonçalves και συν 2003), περικαρδίτιδα (Font και συν 1993, Solano-Gallego και συν 2009), μυοκαρδίτιδα (Torrent και συν 2005, Lopez-Peña και συν 2009) και μηνιγγοεγκεφαλίτιδα, η οποία θα μπορούσε να εξηγήσει τα διάφορα νευρολογικά συμπτώματα που εκδηλώνονται στην CanL (π.χ. επιληπτικές κρίσεις, παραπληγία) και συνδέεται με την κοκκιωματώδη ή/και ουδετεροφιλική μηνιγγίτιδα, κοκκιώματα του ΚΝΣ και αγγειΐτιδα ή έμφρακτα του εγκεφάλου (Garcia-Alonso και συν 1996, Font και συν 2004, Guttadauro 2004, Jose-Lopez και συν 2012). 5. Εργαστηριακά ευρήματα Η αναιμία, που αποτελεί ένα από τα συχνότερα εργαστηριακά ευρήματα της CanL, είναι κατά βάση μη αναγεννητική, ορθόχρωμη και ορθοκυτταρική λόγω του χρόνιου φλεγμονώδους χαρακτήρα της νόσου, ή/και της προκαλούμενης χρόνιας νεφρικής ανεπάρκειας (Ferrer 1992, Koutinas και συν 1999, Βaneth και συν 2005). Eνδέχεται όμως να οφείλεται και στη χρόνια ή οξεία αιμορραγία (π.χ. επίσταξη, δερματικά έλκη) (Koutinas και συν 1999, Βlavier και συν 2001), σε αυτοαντισώματα κατά των ερυθρών αιμοσφαιρίων (Karagianni και συν 2012) ή ενδεχομένως στην καταστολή του μυελού των οστών (Lobetti 2002). Τα αίτια της θρομβοκυτταροπενίας στην CanL αποτελούν η υπερπλαστική σπληνομεγαλία, η χρόνια φλεγμονή και η παραγωγή αντιαιμοπεταλιακών αντισωμάτων που μπορούν να εμφανιστούν σε διάφορους συνδυασμούς (Terrazzano και συν 2006, Cortese και συν 2009). Η πρόκληση αιμορραγικών αλλοιώσεων μπορεί να 18

25 οφείλεται στη συνύπαρξη θρομβοκυτταροπάθειας (Petanides και συν 2008), ή/και στη μείωση των παραγόντων της πήξης του αίματος (Moreno 1999, Ciaramella και συν 2005). Τέλος, δεν είναι λίγα τα ζώα εκείνα που εμφανίζουν λευκοκυττάρωση, πιθανά λόγω της χρόνιας φλεγμονής ή λευκοπενία, εξαιτίας της καταστολής του μυελού των οστών (Ciaramella και συν 1997, Slappendel και Ferrer 1998, Koutinas και συν 1999). Το ίδιο συχνή με την αναιμία είναι και η πολυκλωνική β και γ υπερσφαιριναιμία (Βaneth και συν 2005, Paltrienieri και συν 2010), λόγω ενεργοποίησης της χυμικής ανοσίας (Mur και Verde 1995) που ενδέχεται να οδηγήσει σε αύξηση του ιξώδους του αίματος (Petanides και συν 2008). Στην αρχή αυξάνονται οι β1 και β2, ενώ στη συνέχεια και με βραδύτερο ρυθμό οι β3 και γ σφαιρίνες (Noli 1999, Βlavier και συν 2001, Martinez- Subiela και συν 2002). H υπερσφαιριναιμία συνήθως συνοδεύεται από υπολευκωματιναιμία που οφείλεται στην πρωτεϊνουρία της χρόνιας σπειραματονεφρίτιδας, τη μείωση της όρεξης του ζώου ή σπανιότερα τη χρόνια ηπατική ανεπάρκεια (Koutinas και συν 1999, Rallis και συν 2005, Plevraki και συν 2006). Στην ανοσοηλεκτροφόρηση κυριαρχούν οι ανοσοσφαιρίνες IgG που συμμετέχουν στην παραγωγή των κυκλοφορούντων ανοσοσυμπλόκων (Αlmeida και συν 2005, Ιniesta και συν 2005, Carson και συν 2010). Η υπερ-γαμμασφαιριναιμία αποτελεί και σημαντικό δείκτη της ανοσοαπάντησης του σκύλου (Reis και συν 2006). Στους νεφροπαθείς σκύλους με λεϊσμανίωση ενδέχεται να διαπιστωθεί σημαντική αύξηση της συγκέντρωσης της ουρίας και της κρεατινίνης στον ορό του αίματος (αζωθαιμία), υπερφωσφαταιμία και διαταραχές των ηλεκτρολυτών και της οξεοβασικής ισορροπίας (Plevraki και συν 2006). Σχετικά σπανιότερα διαπιστώνεται αύξηση της δραστηριότητας των ηπατικών και των μυϊκών ενζύμων, προφανώς λόγω της χρόνιας ηπατίτιδας (Rallis και συν 2005) και της πολυμυΐτιδας (Vamvakidis και συν 2000) αντίστοιχα. H ανάλυση του ούρου των νεφροπαθών σκύλων δείχνει σταθερά την παρουσία σημαντικής πρωτεϊνουρίας (UPC 1, ως ανώτερη φυσιολογική τιμή θεωρείται το 0,5) (Grauer 2005), μαζί με αρκετούς υελώδεις και υελοκοκκιώδεις κυλίνδρους στο ίζημα, εξαιτίας της υποκείμενης σπειραματονεφρίτιδας (Poli και συν 1991, Κοutinas και συν 2001, Plevraki και συν 2006). H UPC και η ενζυμουρία έχουν προταθεί ως οι πιο ειδικές δοκιμές για τον έλεγχο της προσβολής των νεφρών (Palacio και συν 1995, Palacio και συν 1997). 19

26 6. Διάγνωση Η κυτταρολογική εξέταση επιχρισμάτων από οπό λεμφογγαγγλίου (τεχνική παρακέντησης με λεπτή βελόνα ή FNA) ή το μυελό των οστών (μυελοκέντηση) ύστερα από χρώση Giemsa, για την ανεύρεση των αμαστιγοφόρων μορφών της L.infantum μέσα και έξω από τα μακροφάγα είναι απλή, έχει ελάχιστο κόστος και είναι απόλυτα ειδική για τη διάγνωση της CanL (Saridomichelakis και συν 2005). Ταυτόχρονα όμως αξιολογούνται και οι τυχόν μεταβολές στους ιστούς, όπως η λεμφοπλασμοκυτταρική, η πυοκοκκιωματώδης/κοκκιωματώδης φλεγμονή, η αντιδραστική υπερπλασία του λεμφοειδή ιστού (Peña και συν 2008, Paltrinieri και συν 2010) και η μυελοειδής υπερπλασία και ερυθροειδής υποπλασία του μυελού των οστών (Mylonakis και συν 2005). Η εξέταση αυτή μπορεί να γίνει και σε δερματικές αλλοιώσεις (βλατίδες, οζίδια, έλκη, φλύκταινες) (Ordeix και συν 2005), στο αρθρικό υγρό, το περιφερικό αίμα και στο υλικό παρακέντησης του σπλήνα ή του ήπατος με την τεχνική FNA (Barrouin-Melo και συν 2006, Giunchetti 2008, Paltrinieri 2010). Στους ασυμπτωματικούς σκύλους τα δείγματα πρέπει να λαμβάνονται από τα λεμφογάγγλια, το σπλήνα ή το μυελό των οστών επειδή στους παραπάνω ιστούς υπάρχει μεγαλύτερη πιθανότητα να ανιχνευθεί το παράσιτο (Saridomichelakis και συν 2005, Giunchetti και συν 2008). Στις κυτταρολογικές εξετάσεις επιχρισμάτων αίματος, πολύ σπάνια ανευρίσκονται οι αμαστιγοφόρες μορφές της L.infantum (Foglia-Manzillo και συν 2005). Τα κυριότερα μειονεκτήματα της κυτταρολογικής εξέτασης είναι η μικρή ευαισθησία λόγω του χαμηλού παρασιτικού φορτίου (ασυμπτωματικοί σκύλοι) και η απαιτούμενη εμπειρία του εξεταστή (Saridomichelakis και συν 2005, Μoreira και συν 2007). Oι αμαστιγοφόρες μορφές της L. infantum μπορούν να εντοπιστούν και στις ιστολογικές τομές βιοψιών από διάφορα όργανα, με ή χωρίς μακροσκοπικές αλλοιώσεις (Ferrer 2002, Moreira και συν 2007). Πρόκειται για ένα αξιόπιστο διαγνωστικό μέσο, ιδιαίτερα σε περιπτώσεις αμφιβολίας στη διάγνωση, αν και η αναγνώριση των αμαστιγοφόρων μορφών του παρασίτου είναι πιο δύσκολη από ότι στην κυτταρολογική εξέταση (Saridomichelakis και συν 2007, de Queiroz και συν 2011). Παρά τη χρησιμοποίηση ειδικών χρώσεων, η διαγνωστική αξία της ιστοπαθολογικής εξέτασης στην CanL είναι περιορισμένη. Θα πρέπει πάντοτε να εγείρεται υποψία της νόσου όταν παρατηρείται πυοκοκκιωματώδης/κοκκιωματώδης ή/και λεμφοπλασμοκυτταρική φλεγμονή (Koutinas και συν 1993, dos Santos και συν 2004, Peña και συν 2008, Santoro και συν 2008). Η ανίχνευση της L.infantum είναι ευκολότερη με τις ανοσοϊστοχημικές 20

27 τεχνικές στις οποίες χρησιμοποιούνται ειδικά μονοκλωνικά αντισώματα (Gradoni και συν 2000, Χavier και συν 2006, Μaia και συν 2008) ή με την τεχνική του άμεσου ανοσοφθορισμού (Saridomichelakis και συν 2009). Η απομόνωση και καλλιέργεια του παρασίτου ύστερα απο ενοφθαλμισμό οπού λεμφαγαγγλίου ή υλικού από το σπλήνα ή το μυελό των οστών σε ειδικά υποστρώματα (Maia και συν 2008) και η ξενοδιαγνωστική μέθοδος, χρησιμοποιούνται κυρίως για ερευνητικούς σκοπούς και όχι στην κλινική πράξη, επειδή έχουν μικρότερη ευαισθησία, απαιτούν εξειδικευμένα εργαστήρια και έχουν υψηλό κόστος (Strauss Ayali και συν 2004, Βarrouin-Melo και συν 2006, Μiró και συν 2008). Oι μοριακές τεχνικές, που παρουσιάζουν την μεγαλύτερη διαγνωστική ειδικότητα και ευαισθησία, έχουν ιδιαίτερη αξία στους ασυμπτωματικούς σκύλους, καθώς και για την παρακολούθηση των υπό θεραπεία συμπτωματικών και των αιμοδοτών σκύλων (Mathis και Deplages 1995, Maia και συν 2008). Στις περισσότερες μοριακές τεχνικές ανιχνεύονται οι αλληλουχίες μικρών υπομονάδων του rrna του παρασίτου ή/και το DNA του κινητοπλάστη (Muller και συν 2003). Η τελευταία παρουσιάζει τη μεγαλύτερη ευαισθησία (Gomez και συν 2008, Μiró και συν 2008), ώστε να μπορούν να ανιχνευθούν ακόμη και πολύ μικρές ποσότητες του DNA του παρασίτου σε διάφορα βιολογικά υλικά τα οποία, κατά σειρά μειούμενης ευαισθησίας είναι ο μυελός των οστών, τα λεμφογάγγλια, το δέρμα, οι βλενογόννοι, η στοιβάδα λευκοκυττάρων-αιμοπεταλίων του αιματοκρίτη και το περιφερικό αίμα (Gradoni και συν 2002, Μaia και συν 2009). Οι πλέον χρησιμοποιούμενες τεχνικές PCR είναι η συμβατική (conventional ή traditional), η ένθετη (nested) και η ποσοτική (real-time) (Paltrinieri και συν 2010). Στην πρώτη, το DNA του παρασίτου ενισχύεται με ειδικούς εκκινητές (μικρές συμπληρωματικές αλληλουχίες που στοχεύουν στις αλληλουχίες του DNA της Leishmania) (Lachaud και συν 2002, Muller και συν 2003, Cortes και συν 2004). Η ένθετη PCR, στην οποία γίνονται δύο συνεχείς δοκιμές με την ταυτόχρονη χρησιμοποίηση ενός ή δύο εκκινητών, έχει μεγαλύτερη ευαισθησία αλλά μικρότερη ειδικότητα από τη συμβατική επειδή τα πολλά στάδια αυξάνουν τον κίνδυνο επιμόλυνσης με εξωγενές DNA (Roura και συν 1999, Fisa και συν 2001). Τέλος, στην ποσοτική PCR (real-time PCR) χρησιμοποιούνται φθορίζοντες ανιχνευτές για την ποσοτικοποίηση του αριθμού των αντιγράφων DNA του παρασίτου, ξεκινώντας από κάποιο που έχει προκαθοριστεί, εξασφαλίζοντας έτσι τη μεγαλύτερη δυνατή ανίχνευση, ακόμη και όταν ο αριθμός των παρασίτων είναι πολύ μικρός (Franchino και συν 2006, Μanna και συν 2009α). Αν και θεωρείται η καλύτερη μοριακή διαγνωστική επιλογή, θα 21

28 πρέπει να γίνεται σε κατάλληλο εργαστήριο και από έμπειρο προσωπικό (Paltrinieri και συν 2010). H PCR μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί και για την ταυτοποίηση των διαφόρων στελεχών του παρασίτου (Quaresma και συν 2009). Με τις ορολογικές τεχνικές ανιχνεύονται τα ειδικά κατά της Leishmania sp. αντισώματα, για την εμφάνιση των οποίων απαιτείται χρονικό διάστημα από ενός μέχρι 22 μηνών από τη στιγμή της φυσικής μόλυνσης (Moreno και συν 2002). Η υψηλή συγκέντρωση των ΙgG αντισωμάτων στον ορό του αίματος συνδέεται άμεσα με το μεγάλο παρασιτικό φορτίο και την εκδήλωση των συμπτωμάτων της νόσου (Reis συν 2006). Στο σημείο αυτό θα πρέπει να αναφερθεί ότι σε ορισμένους σκύλους και ιδιαίτερα στους ασυμπτωματικούς, η παρουσία χαμηλού τίτλου αντισωμάτων έχει περιορισμένη διαγνωστική αξία, ώστε να χρειάζεται παραπέρα διερεύνηση με κυτταρολογική, ιστοπαθολογική ή/και PCR εξέταση (Miró και συν 2008). Στις χρησιμοποιούμενες στην πράξη ορολογικές τεχνικές, περιλαμβάνονται ο έμμεσος ανοσοφθορισμός (IFAT), η ανοσοενζυμική δοκιμασία (ELISA) και οι ανοσοχρωματογραφικές τεχνικές (Μaia και συν 2008, Sollano-Gallego 2009, Paltrinieri και συν 2010). Η ανοσοαποτύπωση κατά Western (Western Blot), αν και παρουσιάζει μεγάλη ειδικότητα, δεν χρησιμοποείται παρά ελάχιστα λόγω της χαμηλής τυποποίησης και του υψηλού κόστους. Με τις συνηθέστερες ορολογικές τεχνικές ενδέχεται να εμφανισθούν ψευδώς θετικά αποτελέσματα λόγω διασταυρούμενης αντίδρασης με τα αντισώματα κατά του Trypanosoma cruzi ή άλλων ειδών της λεϊσμάνια, (Ferreira και συν 2007), αν και αυτό δεν ισχύει για την Ευρώπη και για την ELISA όταν χρησιμοποιούνται τα va2, rk9, rk26, rk39 ανασυνδυασμένα πεπτίδια (Boarino 2005, Porrozzi και συν 2007). Τέλος, αν και η IFA αποτελεί την τεχνική επιλογής για τη διάγνωση της νόσου στους συμπτωματικούς σκύλους (OIE 2008, Solano-Gallego και συν 2009), για τις επιδημιολογικές μελέτες προτιμάται η PCR, επειδή αποσκοπεί να εντοπίσει όλους τους μολυσμένους σκύλους (Leontides και συν 2002, Mettler και συν 2005, Miró και συν 2008). Aν και η ειδικότητα της ELISA έχει αυξηθεί με τη χρησιμοποίηση των ανασυνδυασμένων πεπτιδίων (π.χ. Κ9, Κ26, Κ39), η ευαισθησία της δεν ξεπερνά την IFA (Porrozzi και συν 2007). Επειδή οι συμπτωματικοί σκύλοι παρουσιάζουν καταστολή της κυτταρικής ανοσίας, σε σύγκριση με τους ασυμπτωματικούς (Βaneth και συν 2008), με τον προσδιορισμό της έκφρασης των κυτταροκινών IFΝ-γ, IL-4, IL-10, IL-12 και του TNF-α και τη μέτρηση των λεμφοκυτταρικών υποπληθυσμών CD4+ και CD8+ στο περιφερικό αίμα με την κυτταρομετρία ροής, εκτιμάται ακριβέστερα η ανοσοαπάντηση και ενδεχομένως η 22

29 βαρύτητα του νοσήματος και η αποτελεσματικότητα της αντιλεϊσμανιακής θεραπείας, επειδή κάποιες κυτταροκίνες εκφράζουν την κυτταρική, ενώ άλλες τη χυμική ανοσία (dos Santos και συν 2008). 7. Θεραπεία-Πρόληψη Αν και τα τελευταία χρόνια έχει σημειωθεί μεγάλη προόδος στη διάγνωση της CanL, δεν συμβαίνει το ίδιο και με τη θεραπεία. Τα φάρμακα που χρησιμοποιούνται σήμερα κατά της L.infantum βελτιώνουν την κλινική και εργαστηριακή εικόνα των συμπτωματικών σκύλων, χωρίς όμως να οδηγούν, τουλάχιστον τις περισσότερες φορές, σε παρασιτολογική ίαση (Βaneth και Shaw 2002, Noli και συν 2005, Miró και συν 2008). Η αντιλεϊσμανιακή θεραπεία αποσκοπεί βασικά στην κλινική ίαση των συμπτωματικών σκύλων, τη βελτίωση της ποιότητας ζωής τους (Solano-Gallego και συν 2009), τον περιορισμό της μόλυνσης των σκνιπών και κατά συνέπεια τη μείωση της συχνότητας εμφάνισης της CanL σε μια συγκεκριμένη γεωγραφική περιοχή (Miró και συν 2008). Οι σκύλοι μετά τη θεραπεία εφόδου συχνά παραμένουν φορείς του παρασίτου με αποτέλεσμα η νόσος να υποτροπιάζει (Κoutinas και συν 2001, Ιkeda-Garcia 2007). Στα φάρμακα που χρησιμοποιούνται συχνότερα στη θεραπεία της CanL, περιλαμβάνονται η αντιμονιακή μεγλουμίνη, η αλλοπουρινόλη, η μιλτεφοσίνη και η αμφοτερικίνη Β (Miró και συν 2008, Oliva και συν 2010). Η αντιμονιακή μεγλουμίνη ανήκει στα φάρμακα πρώτης επιλογής και αναστέλλει τη δράση των ενζύμων που καταλύουν την οξείδωση του γλυκογόνου και των λιπαρών οξέων στο παράσιτο (Baneth και Shaw 2002). Aπό τις παρενέργειες που μπορεί να προκληθούν, συχνότερες είναι η ανορεξία, οι γαστρεντερικές διαταραχές και η φλεγμονή στο σημείο της έγχυσης (Alvar και συν 2004). Η νεφροτοξικότητα της αντιμονιακής μεγλουμίνης, αν και θα μπορούσε να εμφανισθεί σε ζώα με μειωμένη σπειραματική διήθηση λόγω της χρόνιας σπειραματονεφρίτιδας, είναι αμφισβητίσιμη στο σκύλο (Tassi και συν 1994, Valladeras και συν 1996, Slappendel και Τeske 1997, Ikeda Garcia και συν 2007, Solano-Gallego και συν 2009). Αν και η συνήθης οδός χορήγησής της είναι η υποδόρια (Solano-Gallego και συν 2009), μπορεί να χορηγηθεί ενδοφλέβια ή ενδομυϊκά (Alvar και συν 2004), αν και υπάρχει κίνδυνος πρόκλησης θρομβοφλεβίτιδας και μυΐτιδας αντίστοιχα (Slappendel 1988, Baneth και Shaw 2002). Επιπλέον, έχει παρατηρηθεί εμφάνιση ανθεκτικών στελεχών της L.infantum στην αντιμονιακή μεγλουμίνη (Carrio και Portus 2002, Gradoni και συν 2003, 23

30 Lamothe 2004, Solano-Gallego 2009). Τελευταία, χρησιμοποιείται εξίσου επιτυχώς η μιλτεφοσίνη, που ανήκει στις αλκυλοφωσφοχολίνες και δρα καταστρέφοντας την κυτταρική μεμβράνη του παρασίτου (Sindermann 2006). Εκτός από την άμεση λεϊσμανιοκτόνο της δράση, έχει διαπιστωθεί ότι ενεργοποιεί τα Τ-λεμφοκύτταρα και τα μακροφάγα με αποτέλεσμα την παραγωγή μικροβιοκτόνων ελεύθερων ριζών και μονοξειδίου του αζώτου από τα τελευταία (Murray και Delph-Etienne 2000). Στα πλεονεκτήματά της περιλαμβάνονται η από το στόμα χορήγηση και η χαμηλή τοξικότητα, αν και σπάνια ενδέχεται να εκδηλωθούν παροδικές γαστρενετρικές διαταραχές (Manna και συν 2008, Miró και συν 2008, Mateo και συν 2009). H αλλοπουρινόλη είναι ανάλογο της υποξανθίνης, που αναστέλλει την δραστηριότητα της ξανθίνης-οξειδάσης, με αποτέλεσμα τη μείωση της συγκέντρωσης του ουρικού οξέος στο πλάσμα του αίματος και το ούρο (Plump 2011). Δρα λεϊσμανιοστατικά αναστέλλoντας την σύνθεση των πρωτεϊνών του παρασίτου λόγω της ενσωμάτωσής της στο RNA (Cavaliero και συν 1999). Χρησιμοποιείται ευρέως στην αντιλεϊσμανιακή θεραπεία σε συνδυασμό συνήθως με άλλα φάρμακα (Denerolle και Bourdoiseau 1999, Manna και συν 2008, Μiró και συν 2008). Η υποτροπή της νόσου είναι συχνή μετά τη διακοπή της χορήγησής της και η πλήρης ίαση είναι σπάνια όταν χρησιμοποιείται ως μονοθεραπεία (Lester 1996). Η κυριότερη παρενέργεια της αλλοπουρινόλης είναι η ξανθινική κρυσταλλουρία, που μπορεί να εξελιχθεί σε ουρολιθίαση με πιθανό αποτέλεσμα την έμφραξη της ουρήθρας (Βaneth και Shaw 2002). Το θεραπευτικό πρωτόκολλο πρώτης επιλογής περιλαμβάνει το συνδυασμό της αντιμονιακής μεγλουμίνης στη δόση των mg/Kg ΣΒ, υποδόρια μια φορά το 24ωρο για 4-8 εβδομάδες, με την αλλοπουρινόλη στη δόση των 10mg/Kg ΣΒ, από το στόμα κάθε 12 ώρες, για 6 μήνες ή και περισσότερο και συγκεκριμένα μέχρι ο τίτλος των ειδικών αντισωμάτων γίνει αρνητικός ή πέσει πολύ χαμηλά (Solano-Gallego και συν 2009, Oliva και συν 2010). Δεύτερη θεραπευτική επιλογή, που είναι εξίσου αποτελεσματική με την πρώτη, είναι ο συνδυασμός της μιλτεφοσίνης στη δόση των 2mg/Kg ΣΒ, από το στόμα κάθε 24 ώρες για 4 εβδομάδες, με την αλλοπουρινόλη στο ίδιο με το παραπάνω δοσολογικό σχήμα (Μiró και συν 2008). Οι υπό θεραπεία σκύλοι πρέπει να υποβάλλονται συχνά σε αιματολογικές και βιοχημικές εξετάσεις και ταυτόχρονα πρέπει να τους γίνεται ανάλυση ούρων (Solano-Gallego και συν 2009). Η αμφοτερικίνη Β είναι επίσης αποτελεσματική ως φάρμακο κατά της L.infantum, αφού παρουσιάζει λεϊσμανιοκτόνο δράση αλληλεπιδρώντας με την εργοστερόλη της κυτταρικής μεμβράνης του παρασίτου (Davidson 1998, Oliva και συν 2010). Πρόκειται 24

31 για ισχυρό αντιλεϊσμανιακό φάρμακο (Berman 1997, Lamothe 2001, Vulpiani και συν 2011) που χορηγείται ενδοφλέβια και με βραδύ ρυθμό, επειδή διαφορετικά ενδέχεται να προκληθεί έντονος μυϊκός τρόμος, πυρετός, ναυτία και έμετος (Rubin και συν 1989), στη δόση των 0,1-1 mg/kg ΣΒ δύο φορές την εβδομάδα και για δύο μήνες (Lamothe 2001, Sollano-Gallego και συν 2009). Το φάρμακο μπορεί να χορηγηθεί και υποδόρια (Malik και συν 1996). H λιποσωμική αμφοτερικίνη Β μειώνει τις πιθανότητες εμφάνισης νεφροτοξίκωσης αλλά ταυτόχρονα αυξάνει το κόστος της θεραπείας (Ηiemenz και Walsh 1996). Η μορφή αυτή έχει χρησιμοποιηθεί για τη θεραπεία της CanL, στη δόση των 3mg/Kg ΣΒ κάθε 24 ώρες, για πέντε συνεχείς ημέρες με καλά αποτελέσματα, αν και παρατηρήθηκε υποτροπή της νόσου 6 μήνες μετά τη διακοπή της χορήγησής της (Οliva και συν 1995). Σε ότι αφορά πάντως την χρησιμοποίησή της για την θεραπεία της CanL, είναι καλύτερα να αποτελεί την τελική λύση και μόνο σε περίπτωση αποτυχίας των υπολοίπων φαρμάκων, μια και είναι το φάρμακο επιλογής για την σπλαχνική λεϊσμανίωση του ανθρώπου στην Ευρώπη, ιδιαίτερα όταν ο ασθενής είναι ανοσοκατασταλμένος. Στα άλλα αντιλεϊσμανιακά φάρμακα που έχουν χρησιμοποιηθεί μέχρι σήμερα στην CanL, περιλαμβάνονται η πενταμιδίνη, που δρα κατά του παρασίτου μέσω της επίδρασής της στην βιοσύνθεση της πολυαμίνης και στην λειτουργία της μεμβράνης των μιτοχονδρίων (Poli και συν 1997), η αμινοσιδίνη, της οποίας η αντιλεϊσμανιακή δράση οφείλεται στην αναστολή της σύνθεσης του RNA, της πρωτεϊνοσύνθεσης και της διαταραχής της διαπερατότητας της κυτταρικής μεμβράνης (Rhalem και συν 1999, Αθανασίου 2004), ο συνδυασμός μετρονιδαζόλης σπιραμυκίνης (Pennisi και συν 2005), η ενροφλοξασίνη, μόνη της ή σε συνδυασμό με την μετρονιδαζόλη, η οποία αυξάνει την ικανότητα των μακροφάγων για παραγωγή ΝΟ (Bianciardi και συν 2004) και η μαρβοφλοξασίνη της οποίας η αντιλεϊσμανιακή δραστηριότητα οφείλεται στην αύξηση της παραγωγής TNF-α και NO (Vouldoukis και συν 2006, Rougier και συν 2008). Τα τελευταία χρόνια ερευνάται ο ρόλος ενός αναστολέα D2 της δοπαμίνης, της δομπεριδόνης στη θεραπεία της CanL (Gómez-Ochoa και συν 2009, Linas και συν 2011, Gómez-Ochoa και συν 2012 ), που προκαλεί αύξηση της έκκρισης της προλακτίνης από την υπόφυση, παίζοντας καθοριστικό ρόλο στην ανάπτυξη και λειτουργία του ανοσοποιητικού συστήματος, ενεργώντας όπως οι κυτταροκίνες (Chaves Rueda και συν 2005). Συγκεκριμένα, η προλακτίνη διεγείρει την κυτταρικού τύπου Th1 ανοσοαπάντηση αυξάνοντας την έκφραση της IFN-γ από τα Τ-λεμφοκύτταρα και τα φυσικά κυτταροκτόνα (ΝΚ), διεγείροντας με τον τρόπο αυτό την φαγοκυτταρική δραστηριότητα των 25

32 μακροφάγων, των ουδετεροφίλων και των ΝΚ κυττάρων (Plocinski και συν 2007), ενώ παράλληλα αυξάνει την αντιγονοπαρουσιαστική ικανότητα των μακροφάγων και των δενδριτικών κυττάρων στα λεμφοκύτταρα (Μatera και συν 2001). Η αποφυγή των νυγμάτων των φλεβοτόμων είναι θεμελιώδους σημασίας όχι μόνο στην πρόληψη της CanL (Otrando και συν 2007, Ferroglio και συν 2008), αλλά και της αντίστοιχης νόσου του ανθρώπου (Mazloumi και συν 2002, Maroli και συν 2010). Προς την κατεύθυνση αυτή τα τελευταία χρόνια έχουν γίνει ενδιαφέρουσες μελέτες σχετικές με την εντομοαπωθητική δράση των εντομοκτόνων φαρμάκων και ειδικότερα των πυρεθρινοειδών (Foglia-Manzillo και συν 2006, Quinell και Courtenay συν 2009). Η περμεθρίνη και η δελταμεθρίνη, που ανήκουν στα πυρεθρινοειδή και κυκλοφορούν σε τρείς διαφορετικές φαρμακοτεχνικές μορφές (περιλαίμιο, εκνέφωση, επίχυση) εμποδίζουν τις σκνίπες να τραφούν με το αίμα του σκύλου αποπροσανατολίζοντάς τες, ή τις αναγκάζουν να παραμένουν στο δέρμα για μεγαλύτερο χρονικό διάστημα, με αποτέλεσμα να προσλαμβάνουν την τοξική δόση του φαρμάκου και να πεθαίνουν (Killick-Kendrick 1999, Mencke και συν 2003). Τα περιλαίμια με δελταμεθρίνη έχουν υψηλή εντομοαπωθητική (72-90) (Foglia-Μanzillo και συν 2006, Ferroglio και συν 2008), αλλά μικρότερη εντομοκτόνο δράση (30-67) (Alvar και συν 2004). Στα σκευάσματα επίχυσης (spot-on), η εντομοαπωθητική δράση της περμεθρίνης που περιέχουν είναι υψηλή (88,9-97,7), αλλά η εντομοκτόνος (23-67) δεν ξεπερνά εκείνη των περιλαιμίων (Μaroli και συν 2010). Τέλος, στα σκευάσματα εκνέφωσης (spray), η εντομοαπωθητική δράση της περμεθρίνης φθάνει μέχρι το 71,4, ενώ η εντομοκτόνος είναι υποδεκαπλάσια (Mercier και συν 2003, Μοlina και συν 2006). Η χρήση των διάφορων εντομοκτόνων (π.χ. DDT) για τον έλεγχο του πληθυσμού των σκνιπών στο περιβάλλον αμφισβητείται σε μεγάλο βαθμό, όχι μόνο εξαιτίας των τεχνικών δυσκολιών αλλά κυρίως για λόγους δημόσιας υγείας και για τον κίνδυνο ανάπτυξης φαρμακοαντοχής των σκνιπών (Amalraj και συν 1999). Επειδή ένα αντιλεϊσμανιακό εμβόλιο στο σκύλο θα μπορούσε να ελέγξει ή ακόμη και να εξαλήψει την CanL στις ενδημικές περιοχές (Dye 1996, Gradoni 2001), έχουν παραχθεί δύο τύποι εμβολίων υπομονάδων όπως το Leishmune (Fort Dodge, Animal Health) που κυκλοφορεί στη Βραζιλία και το Canileish (Virbac) στην Ευρώπη. H αποτελεσματικότητα του πρώτου θεωρείται υψηλή (98), μέσω της αποτροπής μόλυνσης των σκνιπών στους εμβολιασμένους σκύλους και της παρεμβολής του στον βιολογικό κύκλο του παρασίτου (Νοgueira και συν 2005, Saraiva και συν 2006, Borja-Cabrera και 26

33 συν 2008). Το δεύτερο εμβόλιο, που πήρε άδεια κυκλοφορίας στην Ε.Ε το 2011 και ήδη κυκλοφορεί και στην Ελλάδα, φαίνεται να περιορίζει τον κίνδυνο εκδήλωσης των συμπτωμάτων στους ήδη μολυσμένους σκύλους και την πιθανότητα μόλυνσης των υπόλοιπων ζώων. Το αποτέλεσμα αυτό επιτυγχάνεται μέσω της αύξησης του αριθμού των Τ-λεμφοκυττάρων που παράγουν IFN-γ, καθώς και της ικανότητας των μακροφάγων να μειώνουν το ενδοκυτταρικό παρασιτικό φορτίο. Οι ανοσοαπαντήσεις που προαναφέρθηκαν είναι άμεσα συνδεδεμένες με την παραγωγή του ΝΟ, που αποτελεί έναν από τους κύριους μηχανισμούς εξουδετέρωσης του παρασίτου (Μοreno και συν 2012). 27

34 28

35 Β. ΣΥΝΤΟΜΗ ΑΝΟΣΟΛΟΓΙΚΗ ΥΠΟΜΝΗΣΗ 1. CD4 και CD8 θετικά λεμφοκύτταρα Τα Τ-λεμφοκύτταρα αναπτύσσονται στο θύμο αδένα και οι πρόδομες μορφές τους διαφοροποιούνται κατά την μετάβασή τους από τη φλοιώδη στη μυελώδη ουσία του οργάνου (Tizard 2008). Τα παρθένα λεμφοκύτταρα, που έχουν ωριμάσει στο θύμο αδένα, χωρίς να έχουν έρθει σε επαφή με αντιγόνα, ανήκουν σε διαφορετικούς υποπληθυσμούς, η αναγνώριση και διάκριση των οποίων βασίζεται στην έκφραση συγκεκριμένων επιφανειακών πρωτεϊνικών μορίων (Feldman 2000, Abbas και Lichtman 2007). Με τις εξελιγμένες διαγνωστικές τεχνικές (π.χ. κυτταρομετρία ροής), και τα ειδικά μονοκλωνικά αντισώματα συγκροτήθηκαν διάφορες ομάδες διαφοροποίησης (clusters of differentation ή CD) που εκφράζουν συγκεκριμένους συνδυασμούς πρωτεϊνικών μορίων και αντιπροσωπεύουν διαφορετικούς υποπληθυσμούς λεμφοκυττάρων, με διαφορετικές λειτουργίες (Affolter 2000, Janeway και συν 2008), ώστε να επιτυγχάνεται η ανοσοφαινοτυπική διαφοροποίηση των λεμφοκυτταρικών υποπληθυσμών. Οι συνηθέστεροι από τους υποπληθυσμούς αυτούς είναι οι CD4 και CD8, που αντιπροσωπεύουν τα βοηθητικά και κυτταροτοξικά Τ-λεμφοκύτταρα, αντίστοιχα (Moore και συν 1998, Feldman 2000). Eπισημαίνεται ότι τα μόρια αυτά, εκτός από τα λεμφοκύτταρα, εκφράζονται και σε άλλα είδη κυτταρικών υποπληθυσμών που συμμετέχουν στη φλεγμονώδη αντίδραση (Αbbas και Lichtman 2007). Tα CD4+ T- βοηθητικά λεμφοκύτταρα (Τh0) διαφοροποιούνται σε Τh1 και Τh2, μέσω των κυτταροκινών που εκκρίνονται στα αρχικά στάδια της in vivo ανοσοαπάντησης (Αbbas και συν 2007, Dorhoi και Κaufmann 2009). Ως προς το ρόλο των CD21+ Β-λεμφοκυττάρων στην CanL, διαπιστώθηκε ότι ο αριθμός τους είναι μικρότερος στους συμπτωματικούς σε σύγκριση με τους ασυμπτωματικούς σκύλους (Reis και συν 2006). Tέλος, επισημαίνεται ότι στην CanL ο αριθμός των CD4+ λεμφοκυττάρων είναι μεγαλύτερος στους ασυμπτωματικούς σε σύγκριση με συμπτωματικούς σκύλους (Coura-Wital και συν 2011). Καθένα από τα ώριμα αβ + T-λεμφοκύτταρα, τα οποία αποτελούν σημαντικό υποπληθυσμό των Τ-λεμφοκυττάρων, εκφράζει μόνο ένα από τα δύο μόρια, δηλαδή ή τα CD4+ (βοηθητικά ή Τh) ή τα CD8+ (κυτταροτοξικά ή CTL) λεμφοκύτταρα (Milstein και συν 2011). Τα γδ+, που αποτελούν και αυτά με τη σειρά τους άλλο υποπληθυσμό των Τ- λεμφοκυττάρων, εκφράζουν το γδ υποδοχέα και απαντούν σε μικρά ποσοστά στο 29

36 περιφερικό αίμα του σκύλου. Από τα γδ + T-λεμφοκύτταρα, μικρός μόνο αριθμός εκφράζουν μόνο το CD8, και ακόμη λιγότερα εκφράζουν το CD4 μόριο (Janeway και Τravers 2008). Τα αβ+ Τ-λεμφοκύτταρα, εκτός από το CD3, εκφράζουν και ένα άλλο διαμεμβρανικό πρωτεϊνικό μόριο, που βρίσκεται κοντά στον υποδοχέα TCR (T-cell receptor), ο οποίος είναι μόριο που βρίσκεται στην επιφάνεια των Τ-λεμφοκυττάρων και είναι υπεύθυνος για την αναγνώριση αντιγόνων που παρουσιάζονται μαζί με το MHC (Major Histocompatibility Complex), αλλά δεν αποτελεί τμήμα αυτού (Guy και Vignali 2009) (Σχήμα 1). Το διαμεμβρανικό αυτό μόριο ονομάζεται επικουρικό μόριο (accessory molecule) CD4 και CD8 (Βarber και συν 1989, Μiceli και Parnes 1993, Day 2012). O υποδοχέας TCR περιλαμβάνει ειδικούς ανοσοϋποδοχείς ενεργοποίησης (ΙΤΑΜS) (Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motifs), που είναι υπεύθυνοι για την διαβίβαση των ενδοκυτταρικών σημάτων (Reth και συν 2004) και των οποίων η ποικιλομορφία και ο αριθμός παίζει καθοριστικό ρόλο στην ενεργοποίηση των Τ- λεμφοκυττάρων (Holst και συν 2008). Η διάκριση των T-λεμφοκυττάρων στους δύο παραπάνω υποπληθυσμούς βασίζεται στο είδος του επικουρικού πρωτεϊνικού μορίου που εκφράζουν. Τα επικουρικά αυτά μόρια θα καθορίσουν την τάξη του MHC-μορίου που αναγνωρίζεται από τα T-λεμφοκύτταρα και η βασική λειτουργία του οποίου είναι ο σχηματισμός συμπλέγματος με αντιγονικά πεπτίδια των επεξεργασμένων πρωτεϊνικών αντιγόνων από τα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα (ΑΠΚ) και η παρουσίαση στην επιφάνεια τους (Janeway και συν 2008, Day 2012) (Σχήμα 1). Τα MHC μόρια κλάσης Ι κωδικοποιούν γλυκοπρωτεΐνες που εκφράζονται στην επιφάνεια σχεδόν όλων των εμπύρηνων κυττάρων (κυρίως των λεμφοκυττάρων), ενώ τα μόρια της κλάσης ΙΙ κωδικοποιούν ετεροδιμερείς γλυκοπρωτεΐνες που εκφράζονται κυρίως στην επιφάνεια των ΑΠΚ (μακροφάγα, δενδριτικά, ώριμα Β-κύτταρα και επιθηλιακά κύτταρα θύμου) (Tizard 2008). Tο σύμπλεγμα πεπτίδιο/ MHC-Ι μόριο αναγνωρίζεται από τα CD8+ κυτταροτοξικά, ενώ το σύμπλεγμα πεπτίδιο/mhc-ιι μόριο από τα CD4+ βοηθητικά Τ-λεμφοκύτταρα (Janeway και συν 2008). Στο σκύλο το μόριο CD4 συνιστά μια πρωτεϊνική αλυσίδα που αποτελείται από τα στενά συνδεδεμένα μεταξύ τους τμήματα D1, D2, D3 και D4, με το ενδοπλασματικό του τμήμα του να συνδέεται με την κινάση της τυροσίνης (Janeway και συν 2008). Τα CD4+ λεμφοκύτταρα παραπέρα διακρίνονται στους υποπληθυσμούς Τh1 και Th2 ανάλογα με τις κυτταροκίνες που εκκρίνουν. Συγκεκριμένα, τα Th1 λεμφοκύτταρα εκκρίνουν κυρίως την ιντερλευκίνη 2 (IL-2), την ιντερφερόνη γ (IFN-γ) και τον α-παράγοντα νέκρωσης των 30

37 όγκων (TNF-α), ευνοώντας με τον τρόπο αυτό την αντίδραση υπερευαισθησίας καθυστερημένου τύπου, μέσω της οποίας ενεργοποιούνται τα μακροφάγα που τελικά θα καταστρέψουν το ενδοκυττάριο πρωτόζωο (Scott και συν 1988, Gumy και συν 2004). Τα Th2 λεμφοκύτταρα εκκρίνουν κυρίως τις ιντερλευκίνες IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 και IL-13 και βασικά ρυθμίζουν της παραγωγή αντισωμάτων από τα Β-λεμφοκύτταρα, τη μεταβολή του τύπου των ανοσοσφαιρινών που τα απαρτίζουν και την φλεγμονώδη αντίδραση των ιστών απέναντι στους εξωκυττάριους μικροοργανισμούς (Αffolter 2000a). Σήμερα, αν και υποστηρίζεται ότι στους περισσότερους σκύλους που εμφανίζουν τη νόσο (CanL) κυριαρχεί η διχοτομική Th1/Th2 ανοσοαπάντηση, εξακολουθεί να ισχύει ότι η ανοσοπροστασία απέναντι στο παράσιτο επιτυγχάνεται μέσω μιας ισχυρής Th1 ανοσοαπάντησης, ενώ αντίθετα η αντίστοιχη τύπου Τh2 ευνοεί την εγκατάσταση της συμπτωματικής μορφής της νόσου (Βaneth και συν 2008, Solano-Gallego και συν 2009). Ο ρόλος της ειδικής ανοσοαπάντησης απέναντι στο παράσιτο είναι σημαντικός, με καθοριστική την ενεργοποίηση των μακροφάγων για την εξουδετέρωση της L.infantum μέσω της έκκρισης της IFN-γ από τα Τ-λεμφοκύτταρα (Baneth και Sollano-Gallego 2012) Το CD8 μόριο είναι ετεροδιμερής πρωτεΐνη αποτελούμενη από τις αλυσίδες α και β που συνδέονται μεταξύ τους με δισουλφιδικό δεσμό, έχουν παρόμοια δομή (CD8αβ+) και αυξάνει κατά 100 φορές την ευαισθησία των T-λεμφοκυττάρων απέναντι στο MHC-I μόριο (Gorman και συν 1994, Janeway και συν 2008). Tα CD8+ Τ-λεμφοκύτταρα τουλάχιστον στον άνθρωπο και στον ποντικό, διακρίνονται στους υποπληθυσμούς Τc1/Tc2, που λειτουργούν ανάλογα με τις κυτταροκίνες που εκκρίνουν όπως συμβαίνει με τα CD4+ Τ-λεμφοκύτταρα (Carter και Dutton 1996, Affolter 2000α,β). Κύριες λειτουργίες των CD8+ T-λεμφοκυττάρων είναι η αναγνώριση των ενδογενών αντιγόνων που παρουσιάζονται με το μόριο MHC-Ι και η καταστροφή των κυττάρων-στόχων με την απελευθέρωση ενζύμων όπως η περφορίνη (Affolter 2000a, Brown και συν 2002). 31

38 Παρθένο CD4 + Τ-λεμφοκυττταρο Αντιγόνο Παρθένο CD8 + Τ-λεμφοκυττταρο Αντιγόνο ΑΠΚ ΑΠΚ Βοηθητικό Τ-λεμφοκύτταρο Κυτταροτοξικό Τ-λεμφοκύτταρο Σχήμα 1: Σχηματική παράσταση σύνδεσης των ΑΠΚ με το TCR μέσω των μορίων MCH I και ΙΙ, και διαφοροποίηση των Τ-λεμφοκυττάρων σε κυτταροτοξικά (CD8+) ή βοηθητικά (CD4+) (Wikipedia τροποποιημένο) 32

39 2. Οι κυτταροκίνες IFN-γ και IL-4 Κατά τη διάρκεια της ανοσοαπάντησης τα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος επικοινωνούν μεταξύ τους εκκρίνοντας πολλές και διάφορες πρωτεΐνες, που ονομάζονται κυτταροκίνες και παίζουν το ρόλο ειδικών μεταβιβαστών των ενδοκυτταρικών σημάτων (Frydas και συν 2004, Smith-Garvin και συν 2009). Πρόκειται για χαμηλού μοριακού βάρους (<30 kda) πρωτεΐνες, που παράγονται από διάφορα ανοσοϊκανά ή μη κύτταρα, σε απάντηση επαγωγικών ερεθισμάτων, που διεγείρουν ή αναστέλλουν στη συνέχεια τη λειτουργία τους με αυτοκρινή, παρακρινή, ή ενδοκρινή τρόπο (Abbas και συν 2007, Day 2012). Κατά την αυτοκρινή δράση, η κυτταροκίνη προσδένεται σε ειδικούς υποδοχείς του κυττάρου που την εκκρίνει, κατά την παρακρινή, σε εκείνους των παρακείμενων κυττάρων και στην ενδοκρινή σε υποδοχείς περισσότερο απομακρυσμένων κυττάρων (Abbas και συν 2007). Στις κυριότερες δραστηριότητες των κυτταροκινών περιλαμβάνονται η πλειοτροπική δράση, κατά την οποία οι κυτταροκίνες συνδέονται με περισσότερους από έναν υποδοχείς, η πλεοναστική, όπου παρατηρούνται κοινές αλυσίδες μεταξύ των κυτταροκινών και η ειδική δράση τους, κατά την οποία ο υποδοχέας της κάθε κυτταροκίνης παρουσιάζει διαφορετικά μόρια μετάδοσης των ενδοκυττάριων σημάτων (Janeway και Τravers 2008). Οι κυτταροκίνες ελέγχουν την ένταση και τη διάρκεια της ανοσοαπάντησης με τη διέγερση ή την αναστολή της ενεργοποίησης, του πολλαπλασιασμού και της διαφοροποίησης των διαφόρων κυττάρων, τη ρύθμιση της παραγωγής αντισωμάτων και την έκκριση άλλων κυτταροκινών (Αbbas και συν 2007). Ενώ διαφορετικές κυτταροκίνες μπορούν να παράγονται και να δρούν σε διαφορετικά κύτταρα, ένα και μόνο κύτταρο μπορεί να συνθέσει παραπάνω από μία κυτταροκίνες (Day 2012). Από λειτουργική άποψη, οι κυτταροκίνες διακρίνονται (α) στους μεσολαβητές της φυσικής ανοσίας που εκκρίνονται από τα μονοπύρηνα φαγοκύτταρα ύστερα από την δράση διαφόρων παθογόνων παραγόντων (ιντερφερόνες τύπου Ι, TNF, IL-1, IL-6), (β) τους παράγοντες που ρυθμίζουν την ενεργοποίηση, τον πολλαπλασιασμό και την διαφοροποίηση των λεμφοκυττάρων που παράγονται μετά την αναγνώριση του αντιγόνου από τα Τ λεμφοκύτταρα (IL-2, IL-4), (γ) τους παράγοντες που ρυθμίζουν τη φλεγμονή και ενεργοποιούν τα μη ειδικά, αλλά ανοσοδραστήρια κύτταρα (IFN-γ, IL-5, IL-10, IL-12) και (δ) τους παράγοντες που διεγείρουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων του αιμοποιητικού συστήματος και τη διαφοροποίηση των λευκοκυττάρων σε μακροφάγα και κοκκιοκύτταρα (IL-3, IL-7, GCGF και MCGF) (Abbas και Lichtman 2001). Οι 33

40 κυτταροκίνες παίζουν σημαντικό ρυθμιστικό ρόλο στην ανοσοαπάντηση του οργανισμού μέσω της ενεργοποίησης, της μετακίνησης και του πολλαπλασιασμού των ανοσοκυττάρων (Alexander και Hilton 2004, Smith και Garvin 2009), της διέγερσης ή της καταστολής της φλεγμονώδους αντίδρασης κατά των μικροοργανισμών (Κindt και συν 2006) και της διαφοροποίησης των Τ-λεμφοκυττάρων (Lu και Rudensky 2009). Τέλος, από τις κυριότερες κυτταροκίνες που παράγονται από τα μονοπύρηνα κύτταρα του περιφερικού αίματος (PBMC) φυσικά μολυσμένων σκύλων από τη L.infantum είναι οι IFN-γ και IL-4, που ενεργοποιούν την κυτταρική και τη χυμική ανοσία, αντίστοιχα (Panaro και συν 2009). H κυτταροκίνη IL-4 παρουσιάζει συμπαγή σφαιρική δομή που σταθεροποιείται με τρεις δισουλφιδικούς δεσμούς (Walter και συν 1992). Η παραγωγή της IL-4 αποτελεί το βασικό κριτήριο κατάταξης των CD4+ T-λεμφοκυττάρων στον λειτουργικό υποπληθυσμό Th2, ενώ η παραγωγή της IFN-γ στον αντίστοιχο Th1 (Schoenborn 2007, Τizard 2008). H IL-4 διεγείρει και διαφοροποιεί τα Β-λεμφοκυττάρα σε πλασμοκύτταρα με αποτέλεσμα την ενεργοποίηση της χυμικής ανοσίας, αυξάνει την έκφραση των μορίων MHC-ΙΙ πάνω στην κυτταρική μεμβράνη των Β-λεμφοκυττάρων και των μακροφάγων, οπότε ενισχύεται η αντιγονοπαρουσιαστική τους ικανότητα, ανενεργοποιεί τα Th1 λεμφοκύτταρα, τα μακροφάγα και τα δενδριτικά κύτταρα, μειώνει την έκκριση των ΙFN-γ και της IL-12, και τέλος υπερεκκρίνεται στην αλλεργική αντίδραση (Aster και συν 2009). Η κυτταροκίνη IFN-γ, που είναι και το μοναδικό μέλος των τύπου ΙΙ ιντερφερονών (Gray 1982), αποτελείται από ένα πυρήνα με 6α έλικες και μια εκτεταμένη αλληλουχία στην C-τερματική περιοχή (Ealick και συν 1991). Η ΙFN-γ βασικά παράγεται από τα φυσικά κυτταροκτόνα (ΝΚ) στη μη ειδική ανοσοαπάντηση, ενώ στην ειδική από τα Τh1 CD4+ και τα Tc1 CD8+ Τ- λεμφοκύτταρα (Schoenborn 2007). Η IFΝ-γ διεγείρει την δραστηριότητα των ΝΚ κυττάρων, αυξάνει την αντιγονοπαρουσιαστική ικανότητα των μακροφάγων, ενεργοποιεί τη συνθάση του ΝΟ (inos) για την παραγωγή ΝΟ, αυξάνει την παραγωγή των IgG2a και IgG3 από τα πλασμοκύτταρα, ενεργοποιεί επιλεκτικά τα Τh1 Τ- λεμφοκύτταρα, διεγείροντας έτσι την κυτταρική ανοσία, ενώ ταυτόχρονα καταστέλλει τα Τh2 αμβλύνοντας τη χυμική ανοσία και τέλος αυξάνει την έκφραση των MHC-II μορίων πάνω στα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα (Schroder 2004, Schoenborn 2007). Η έκκριση της IFN-γ από τα ανοσοδιεγερμένα λεμφοκύτταρα με μη ειδικά, όπως Concanavalin A (ConA) και phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA)/ionomycin (iono) ή ειδικά όπως το Leishmania Soluble Antigen (LSA) αντιγόνα, έχει συσχετιστεί με την 34

41 αντίσταση ή την ευαισθησία των μολυσμένων από την L.infantum σκύλων, καθώς και των σκύλων στους οποίους έχει γίνει αντιλεϊσμανιακός εμβολιασμός, στο να εκδηλώσουν την CanL (Manna και συν 2006, Carillo και συν 2007). Τα PBMC του 67 των συμπτωματικών σκύλων που είχαν ανοσοδιεγερθεί με LSA παρήγαγαν την IFN-γ σε μεγάλη ποσότητα, όχι μόνο στην αρχή, αλλά και καθόλη την διάρκεια της εξέλιξης της CanL, γεγονός που φαίνεται να δείχνει ότι η έκκρισή της δεν αρκεί για να προλάβει την εκδήλωση της νόσου και συνεπώς δεν αποτελεί καλό δείκτη αντίστασης των σκύλων απέναντι στο πρωτόζωο (Travi και συν 2009). Το αντίθετο ακριβώς διαπιστώθηκε στην πειραματική μελέτη των Carrillo και συν (2007), γεγονός που θα μπορούσε να συσχετιστεί με τον μικρό αριθμό του υποπληθυσμού των CD4+ λεμφοκυττάρων. Τα αποτελέσματα και τα συμπεράσματα ανάλογων μελετών ως προς την IL-4 έδειξαν ότι μπόρεσε να ανιχνευθεί μόνο στα ανοσοδιεγερμένα με μιτογόνα PBMC μολυσμένων σκύλων ανεξάρτητα αν ήταν συμπτωματικοί ή όχι (Manna και συν 2006, Carrillo και συν 2007, Μaia και Campino 2012). Αναφορικά με την IL-10 θα μπορούσε να υποστηριχθεί ότι (Boggiatto και συν 2010), όπως και στον άνθρωπο (Nylén και Sacks 2007), η έκφρασή της είναι αυξημένη στα ανοσοδιεγερμένα με μιτογόνα PBMC των συμπτωματικών αλλά και ασυμπτωματικών λεϊσμανιακών σκύλων (Carrillo και Moreno 2009). Δεν παρατηρήθηκε όμως το ίδιο και σε πρόσφατα απομονωμένα PBMC ασυμπτωματικών (Chamizo και συν 2005) και συμπτωματικών σκύλων (Carrillo και συν 2007). Ο ρόλος της IL-4 σε σχέση με την αυξημένη ευαισθησία των σκύλων απέναντι στην L.infantum είναι πιο ξεκάθαρος με βάση τις μελέτες που έγιναν σε δείγματα από το δέρμα (Brachelente και συν 2005) και το μυελό των οστών (Quinell και συν 2001) των συμπτωματικών σκύλων. Με τη μέθοδο ELISA ανιχνεύθηκαν αυξημένα επίπεδα της IL-4 στο υπερκείμενο υγρό κυτταροκαλλιεργειών περιφερικών μονοκυττάρων (PBMC) διεγερμένων με ανασυνδυασμένη πρωτεϊνάση της κυστεΐνης του παρασίτου L. chagasi συμπτωματικών σκύλων, σε αντίθεση με τους ασυμπτωματικούς (Pinheiro και συν 2005). Παρόλα αυτά, η IL-4 ανιχνεύθηκε σε ασυμπτωματικούς σκύλους, μετά από διέγερση με το διαλυτό αντιγόνο της L.infantum (LSA) (Chamizo και συν 2005). Τα αντικρουόμενα αυτά αποτελέσματα πιθανότατα οφείλονται στη σύγκριση διαφορετικών κυτταρικών πληθυσμών ή υποπληθυσμών, παρασιτικών φορτίων ή οργάνων/ιστών, τα διαφορετικά κριτήρια ταξινόμησης ή ομαδοποίησης των μολυσμένων σκύλων, τις διαφορετικές τεχνικές μέτρησης των κυτταροκινών (ΕLISA, PCR, κυτταρομετρία ροής), τη διαφορετική χρονική στιγμή κατά την οποία γινόταν η εκτίμηση της μόλυνσης και στις υφιστάμενες διαφορές μεταξύ πειραματικής και φυσικής μόλυνσης (Baneth και συν 2008, Panaro και συν 2009). 35

42 Συνεπώς και με βάση τα σημερινά δεδομένα, είναι παράτολμο να υποστηριχθεί ότι οι κυτταροκίνες, όπως εξάλλου και ο ανοσοφαινότυπος των λεμφοκυττάρων που τις εκκρίνουν, αποτελούν αξιόπιστους δείκτες της εξέλιξης της CanL, ιδιαίτερα όταν οι εξετάσεις γίνονται στο αίμα, που δεν ευνοεί τον πολλαπλασιασμό και την επιβίωση του παρασίτου. 36

43 Γ. Η ΑΝΟΣΟΑΠΑΝΤΗΣΗ ΤΟΥ ΣΚΥΛΟΥ ΣΤΗ ΜΟΛΥΝΣΗ ΑΠΟ ΤΗ L.infantum 1. Μη ειδική ανοσοαπάντηση Η μη ειδική ανοσοαπάντηση συνιστά την πρώτη γραμμή άμυνας του οργανισμού απέναντι στο παράσιτο. Μετά την είσοδό του παρασίτου στο σκύλο, ο οργανισμός προσπαθεί να την υπερνικήσει, μέσω της κλωνοποίησης στο φαγολυσόσωμα των μακροφάγων και της παραγωγής λιποφωσφογλυκανών που εμποδίζουν την ωρίμανση του φαγοσώματος (Sacks και Sher 2002). Η μη ειδική ανοσοαπάντηση ξεκινά με τον ενοφθαλμισμό των μετακυκλικών μορφών του παρασίτου στο χόριο του δέρματος. Εκεί ανιχνεύονται από τα ανοσοκύτταρα, αναγνωρίζοντας συγκεκριμένους αντιγονικούς επίτοπους (PAMPs), μέσω των ειδικών υποδοχέων που διαθέτουν (PRRs, όπως Toll-like) (Stafford και συν 2002). Σύμφωνα με τα αποτελέσματα πειραματικών μελετών της CanL, έχει βρεθεί ότι το σάλιο των σκνιπών παρεμβαίνει στην ανοσοαπάντηση του σκύλου περιορίζοντας τη διάρκεια του χρόνου επώασης του νοσήματος μέσω των αγγειενεργών, αντιπηκτικών και ανοσορυθμιστικών παραγόντων που περιέχει (Rutten 2003). Στον ποντικό επίσης βρέθηκε ότι οι παράγοντες αυτοί διευκολύνουν τη ενεργοποίηση της χυμικής και την καταστολή της κυτταρικής ανοσίας (Kamhawi 2000). Αν και τα περισσότερα από τα παράσιτα που ενοφθαλμίζονται καταστρέφονται από τους παράγοντες του συμπληρώματος, εκείνα που καταφέρνουν τελικά να επιβιώσουν εισέρχονται σε ασφαλή κύτταρα-στόχους, καταστέλλουν τη σύνθεση του ενεργού οξυγόνου ή των ενδιαμέσων προϊόντων του αζώτου, τροποποιούν τις εκκρινόμενες προστατευτικές κυτταροκίνες και αναστέλλουν την έκφραση των συνδιεγερτικών μορίων από τα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα (ΑΠΚ) με αποτέλεσμα τη μη ενεργοποίηση των ειδικών Τ-λεμφοκυττάρων (Bogdan και Rollinghoff 1998, Brandonisio και συν 2000, Olivier και συν 2005). Στην συνέχεια προσκολλούνται στα μακροφάγα καθώς και τα δενδριτικά κύτταρα του χορίου και τα κύτταρα του Langerhans (LCs) της επιδερμίδας κυρίως μέσω των υποδοχέων του συμπληρώματος Ι (CD35) και ΙΙΙ (CD11b/CD18) της κυτταρικής τους μεμβράνης (Rosenthal και συν 1996). Αμέσως μετά την φαγοκυττάρωση, τα παράσιτα εισέρχονται μέσα στο φαγόσωμα που μεταμορφώνεται σε παρασιτοφόρο 37

44 κενοτόπιο, όπου η προμαστιγοφόρος μορφή του παρασίτου μετατρέπεται σε αμαστιγοφόρο (Lang και συν 1994, Beverley και Turco 1998). Τα ουδετερόφιλα και τα μακροφάγα είναι τα πρώτα κύτταρα που καταφθάνουν στην περιοχή του ενοφθαλμισμού του παρασίτου (Peters και συν 2008) και μάλιστα μέσα σε 3,5 μόλις ώρες (Santos-Gomes και συν 2000). Η προσαγωγή των ουδετεροφίλων στο σημείο του νύγματος επιτυγχάνεται μέσω του ειδικού χημειοτακτικού παράγοντα LCF (Leishmania Chemotactic Factor) που εκκρίνεται από το παράσιτο (van Zandbergen και συν 2002) και της ενεργοποίησης των Toll-like υποδοχέων (TLRs) των δενδριτικών κυττάρων με αποτέλεσμα την έκκριση της κυτταροκίνης IL-8 (Luster 2002). Η φαγοκυττάρωση των αποπτωτικών ουδετεροφίλων που ακολουθεί διευκολύνει την είσοδο του παρασίτου στα μακροφάγα, που αποτελούν και τον κύριο στόχο του (Meagher και συν 1992, Αga και συν 2002, Laskay και συν 2008). Τα ουδετερόφιλα μπορούν, ως ένα βαθμό, να εξουδετερώσουν το παράσιτο, αποτελώντας έτσι τον πρώτο αμυντικό φραγμό απέναντι στην εγκατάσταση της πρωτοζωϊκής αυτής μόλυνσης (Van Zandebergen και συν 2004, Mc Farlane και συν 2008). Τα μακροφάγα παίζουν πρωτεύοντα ρόλο στη μη ειδική ανοσοαπάντηση, όχι μόνο επειδή φαγοκυτταρώνουν τα παράσιτα, αλλά και λόγω των αντιγονοπαρουσιαστικών τους ιδιοτήτων και της ταυτόχρονης έκφρασης των συνδιεγερτικών μορίων όπως τα Β7-1 και Β7-2 (Moll 1993, Tapia και συν 1994, Pinelli 1999a, Βueno και συν 2005, Abbas και συν 2007). Οι μετακυκλικές προμαστιγοφόρες μορφές του παρασίτου προσπαθούν να αποφύγουν την ενεργοποίηση των μακροφάγων μέσω κυρίως της σύνδεσής τους με ειδικούς υποδοχείς (CRI, PS), ενώ στη διαδικασία αυτή παίζει σημαντικό ρόλο και η έκκριση της IL-10 (Wanderlay και συν 2006, Kima 2007, Ueno και συν 2009). Η αλληλεπίδραση των δενδριτικών κυττάρων με το παράσιτο είναι σύνθετη και σημαντική για την εξέλιξη της μόλυνσης, με την ενεργοποίησή τους να εξαρτάται μεταξύ των άλλων, από το στάδιο της CanL και το συγκεκριμένο στέλεχος του παρασίτου (Nylén 2010). Στην CanL τα δενδριτικά κύrτταρα είναι τα κύρια ΑΠΚ, λόγω της ικανότητάς τους να μεταφράζουν τα ενδοκυτταρικά σήματα της μη ειδικής ανοσοαπάντησης και να τα μετατρέπουν στα αντίστοιχα της επίκτητης (Banchereau και συν 2000, Steinman και συν 2003, Reis and Sousa 2006), ενώ ταυτόχρονα πρωτοστατούν στην αναγνώριση του παρασίτου εκκρίνοντας, αποκλειστικά την IL-12 (Gorak και συν 1998, Sousa και συν 1999, Ritter και συν 2004, Ιezzi και συν 2006). Τα δενδριτικά κύτταρα, που προέρχονται από τον μυελό των οστών, μεταναστεύουν με το αίμα και τη λέμφο από το χόριο στα επιχώρια λεμφογάγγλια, όπου παρουσιάζουν τα παρασιτικά αντιγόνα στα Τ-λεμφοκύτταρα 38

45 και ρυθμίζουν τις αντιδράσεις τους (Day 2012). Tέλος, το παράσιτο δεν αναστέλλει την έκκριση της IL-12 από τα δενδριτικά κύτταρα, όπως συμβαίνει με τα μακροφάγα (Sousa και συν 1999), ενώ η αντιφλεγμονώδης αντίδραση στο σημείο του νύγματος των σκνιπών και οι ανοσοκατασταλτικές επιδράσεις των αποπτωτικών δενδριτικών κυττάρων φαίνεται ότι αναστέλλουν την αρχική ανοσoαπάντηση (Ribeiro-Gomes και συν 2012). Παράλληλα με τα μακροφάγα, τα κύτταρα του Langerhans (LCs) μεταναστεύουν πιθανότατα από την επιδερμίδα ή φθάνουν στο χόριο με την κυκλοφορία του αίματος για να παραλάβουν τα παράσιτα μέσω των κυτταροκινών IL-1β και TNF-α ή άλλων επιφανειακών μορίων του παρασίτου και να τα μεταφέρουν στα λεμφοκύτταρα των επιχώριων λεμφογαγγλίων (Moll 1993, Saint-Andre Marchal και συν 1997). Τα κύτταρα του Langerhans αναπτύσσουν ισχυρές αντιγονοπαρουσιαστικές ιδιότητες προκειμένου να ενεργοποιήσουν όχι μόνο τα ειδικά αλλά και τα παρθένα Τ-λεμφοκύτταρα (Kripke και συν 1990, Μoll 1993, Kautz-Neu και συν 2011). Στο σημείο του ενοφθαλμισμού του παρασίτου τα παρθένα Τ-λεμφοκύτταρα έρχονται σε επαφή με τα μολυσμένα μακροφάγα και τα παραμένοντα κύτταρα του Langerhans, που τους παρουσιάζουν τα αντιγόνα του παρασίτου, ενώ τα ειδικά Τ-λεμφοκύτταρα με τις κυτταροκίνες που εκκρίνουν ρυθμίζουν την παραπέρα αντιλεϊσμανιακή δράση των μακροφάγων (Moll 1996, Saint-Andre Marchal και συν 1997, Fondevila και συν 1997). Τα φυσικά κυτταροκτόνα (ΝΚ) περιορίζουν τη μόλυνση στο δέρμα, μέσω της καταστροφής των μολυσμένων κυττάρων και της έκκρισης IFN-γ, που προφανώς περιορίζει το παρασιτικό φορτίο (Becker και συν 2003, Νylén 2010, Haeberlein και συν 2010). Τα ενεργοποιημένα ΝΚ κύτταρα διευκολύνουν την ωρίμανση των δενδριτικών κυττάρων (Piccioli και συν 2002), ο αυξημένος αριθμός των οποίων στο αίμα συσχετίζεται θετικά με την αρχική προστασία απέναντι στο παράσιτο (Pereira και συν 2009), στην οποία σημαντικό ρόλο παίζει και η IL-12 (Haiberlein και συν 2010). Η παρουσία των αμαστιγοφόρων μορφών της L.infantum μέσα στους ινοβλάστες, του χορίου των λεϊσμανιακών σκύλων (Rodriguez και συν 1996, Bogdan και συν 2000), φαίνεται να επιβεβαιώνει τον ήδη γνωστό ανοσοπροστατευτικό τους ρόλο (Buckley και συν 2001), μέσω της έκκρισης συγκεκριμένων χημειοκινών (χημειοτακτικές κυτταροκίνες) και της παραγωγής διαφόρων συστατικών της θεμέλιας ουσίας, που τελικά επηρεάζουν την ειδική ανοσοαπάντηση και ευνοούν την εγκατάσταση της χρόνιας φλεγμονής (Hallé και συν 2009). Τα ενεργοποιημένα κερατινοκύτταρα (ΚCs) δημιουργούν ευνοϊκό περιβάλλον για τη διαφοροποίηση και ενεργοποίηση των λευκοκυττάρων, ενώ παράλληλα μπορούν να 39

46 συμπεριφερθούν ως αντιγονοπαρουσιαστικά, ικανά να επεξεργάζονται τα διάφορα αντιγόνα και να ρυθμίζουν την ανοσοαπάντηση, παίζοντας κατά κύριο λόγο διεγερτικό ρόλο (Yager 1993). Στην αποφολιδωτική δερματίτιδα της CanL τα κερατινοκύτταρα εκφράζουν σαφώς το MHC-II, με ταυτόχρονη παρουσία μικρού αριθμού παρασίτων στο χόριο, ενώ στην οζώδη δερματίτιδα συμβαίνει ακριβώς το αντίθετο, με αντίστροφη τη σχέση ως προς τον αριθμό των παρασίτων (Fondevila και συν 1997, Papadogiannakis και συν 2005). Στη μη ειδική ανοσοαπάντηση υπεισέρχονται και τα Τ-ρυθμιστικά λεμφοκύτταρα (Treg), που αποτελούν το 5-10 των CD4+ Τ-λεμφοκυττάρων του αίματος, καταστέλλοντας τη φλεγμονή και την κυτταρική ανοσία και ρυθμίζοντας τον πολλαπλασιασμό των Th2 λεμφοκυττάρων, όπως αποδείχθηκε σε στελέχη ποντικών που ήταν ευαίσθητα ή ανθεκτικά στη λεϊσμανίωση (Μendez και συν 2004, Belkaid και Tarbell 2009). Τα Treg λεμφοκύτταρα μπορούν επίσης να εκκρίνουν την IL-10, η οποία στον άνθρωπο τουλάχιστον, θεωρείται ότι ευνοεί την εκδήλωση των συμπτωμάτων της νόσου και την παράταση του χρόνου ανάρρωσης (Nylen 2010). Τα γδ+ λεμφοκύτταρα που συνιστούν υποπληθυσμό των Τ-λεμφοκυττάρων στον οποίο εκφράζεται ο γδ υποδοχέας, είναι λίγα στο περιφερικό αίμα και δεν έχουν ξεκάθαρο ρόλο, αν και πιστεύεται ότι συμβάλλουν στην μη ειδική ανοσοαπάντηση (Cannon και συν 1998, Satoscar και συν 1997α). Ο λόγος γδ/αβ Τ-λεμφοκυττάρων βρέθηκε να είναι αυξημένος στην επιδερμίδα και το χόριο των μολυσμένων με L. infantum σκύλων, των ανθρώπων και των αρουραίων (Cannon και συν 1998), όπως επίσης και στο αίμα μολυσμένων σκύλων (Moreno και συν 1999). Τα γδ+ Τ-λεμφοκύτταρα στο σκύλο δεν εκφράζουν τα μόρια CD4 και CD8 αλλά μπορούν να εκκρίνουν τις Th1 και Th2 κυτταροκίνες και δρώντας σε συνδυασμό με τα αβ+ Τ-λεμφοκύτταρα φαίνεται ότι συμμετέχουν και στους δύο τύπους της ανοσοαπάντησης (Day 2012). Τα βοηθητικά τύπου 3 λεμφοκύτταρα (Th3) πιθανόν να έχουν ανοσοκατασταλτικό ρόλο, μέσω της έκκρισης του παράγοντα TGF-β (Day 2012), αν και ο ακριβής τους ρόλος, όπως εξάλλου και εκείνος των Treg κυττάρων, παραμένει αδιευκρίνιστος στην CanL. 40

47 2.Ειδική ανοσοαπάντηση Η ειδική ανοσοαπάντηση παίζει πολύ σημαντικό ρόλο στην ευαισθησία του ξενιστή απέναντι στη λεϊσμάνια. Σε μελέτες που έγιναν σε ποντικούς, ύστερα από πειραματική μόλυνση με τη L.major, διαπιστώθηκε ότι ένα ευαίσθητο στέλεχός τους, που τυπικά παρουσιάζει τύπου Th2 ανοσοαπάντηση, εκδήλωσε τη νόσο. Η Τh2 ανοασοαπάντηση είναι το αποτέλεσμα της έκκρισης ειδικών κυτταροκινών, όπως η IL-4 και η IL-10, και της αυξημένης παραγωγής αντισωμάτων. Άλλα στελέχη του ποντικού, που ανοσοανταποκρίθηκαν με διαφορετικές κυτταροκίνες, όπως οι τυπικές της αντίδρασης τύπου Τh1, IFN-γ και η IL-12, παρουσιάζονται ανθεκτικά απέναντι στη μόλυνση (Scott και συν 1988, Gumy και συν 2004). Αντίθετα, στην πειραματική σπλαχνική λεϊσμανίαση διαπιστώθηκe μικτού τύπου Τh1/Th2 ανοσοαπάντηση, η ισορροπία της οποίας φαίνεται να είναι σημαντική για τον έλεγχο του πολλαπλασιασμού του παρασίτου, την εξέλιξη της νόσου ή της ίασης (Κaye και συν 1991, Μiralles και συν 1994). H διχοτομική Τh1/Th2 ανοσοαπάντηση φαίνεται ότι έχει ιδιαίτερη σημασία και στην CanL (Baneth και συν 2008, Panaro και συν 2009). 2α. Κυτταρική ανοσία Στις ενζωοτικές περιοχές της CanL έχει διαπιστωθεί ότι μέχρι και το 50 των σκύλων παρουσιάζει κυτταρική ανοσοαπάντηση στην ενδοδερμική δοκιμή με λεϊσμανίνη (Μοntenegro test) (Cardoso και συν 1998, Ferrer και συν 2000), που είναι θετική στους ανθεκτικούς σκύλους αλλά αρνητική σε εκείνους που προσκομίζονται με βαριά κλινική εικόνα (Sollano-Gallego και συν 2009). Η ειδική ανοσοαπάντηση, που περιλαμβάνει ένα κυτταρικό και ένα χυμικό σκέλος, ξεκινά με την ανοσοδιέγερση των Τh1 και Th2 λεμφοκύτταρων ύστερα από τη μόλυνση τoυ σκύλου με τη L. infantum, με την εξέλιξη της λοίμωξης να εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από το αν το συγκεκριμένο ζώο θα παρουσιάσει κυρίως τύπου Th1, Th1/Th2 ή Th2 ανοσοαπάντηση (Pinelli και συν 1995, Βaneth και συν 2008, Maia και Campino 2012). Συγκεκριμένα, τα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα παρουσιάζουν τα αντιγόνα της Leishmania στα παρθένα Τ-λεμφοκύτταρα των επιχώριων λεμφογαγγλίων, που διεγείρονται, πολλαπλασιάζονται και στη συνέχεια διαφοροποιούνται σε ειδικά Τ- 41

48 λεμφοκύτταρα (Killick-Kendrick 1992). Για να πολλαπλασιαστούν όμως τα πρώτα θα πρέπει προηγουμένως οι υποδοχείς τους (TCR) να συνδεθούν με το σύμπλεγμα MHC-IIλεϊσμανιακό αντιγόνο και στη συνέχεια με τα συνδιεγερτικά μόρια που εκφράζονται από τα ΑΠΚ (Janeway και Travers 2008). Η ειδική ανοσοαπάντηση ξεκινά από τα επιχώρια λεμφογάγγλια, με τα ενεργοποιημένα λεμφοκύτταρα να επαναφέρονται στο σημείο ενοφθαλμισμού του παρασίτου (Luster 2002). Η έκφραση των συνδιεγερτικών μορίων από τα μακροφάγα ενεργοποιεί τα CD4+ Th1-λεμφοκύτταρα με αποτέλεσμα ο σκύλος να παραμένει ασυμπτωματικός φορέας ή να εκδηλώνει ήπια συμπτώματα. Σε αντίθετη περίπτωση, ενεργοποιούνται τα CD4+ Th2-λεμφοκύτταρα, οπότε το ζώο πιθανότατα θα αρρωστήσει (Ghersetich και συν 1999, Baneth και συν 2008). Η συμπτωματική μορφή της CanL είχε συνδεθεί με ανοσολογικές διαταραχές που αφορούν τα Τ-λεμφοκύτταρα και περιλαμβάνουν την απουσία της καθυστερημένης αντίδρασης υπερευαισθησίας (DTH) στα αντιγόνα του παρασίτου, τις μεταβολές του αριθμού των λεμφοκυτταρικών υποπληθυσμών στο περιφερικό αίμα και την αναστολή έκκρισης των ανοσοπροστατευτικών κυτταροκινών IFN-γ και IL-2 (Pinelli και συν 1994, Μartinez- Moreno 1995, de Luna και συν 1999, Barbieri 2006). Eπίσης, οι συμπτωματικοί σκύλοι παρουσιάζουν υψηλό τίτλο αντισωμάτων, που όμως δεν φαίνεται να έχει ανοσοπροστατευτικό ρόλο (Αbranches και συν 1991, Pinelli και συν 1994). Σε πρόσφατες μελέτες, που αφορούσαν την έκκριση των κυτταροκινών από τους μολυσμένους σκύλους, υποστηρίζεται ότι μπορεί να εμφανίζουν μικτή Τh1/Th2 ανοσοαπάντηση, ανεξάρτητα αν είναι συμπτωματικοί ή όχι (Βaneth και συν 2008, Panaro και συν 2009). Σε σκύλους με τη συμπτωματική μορφή της CanL, στους οποίους οι υποπληθυσμοί των Τ-λεμφοκυττάρων στο περιφερικό αίμα μετρήθηκαν με την κυτταρομετρία ροής, βρέθηκε ότι ο αριθμός των CD4+ Τ-λεμφοκυττάρων ήταν μειωμένος, αλλά αποκαταστάθηκε μετά το τέλος της αντιλεϊσμανιακής θεραπείας (Moreno και συν 1999, Guerra και συν 2009, Papadogiannakis και συν 2010, Maia και Campino 2012). Ο αριθμός των CD4+ Τ-λεμφοκυττάρων βρέθηκε να είναι αυξημένος και στους μολυσμένους σκύλους με χαμηλό παρασιτικό φορτίο (Reis και συν 2006). Σε άλλη όμως μελέτη, δεν διαπιστώθηκε να υπάρχει σημαντική διαφορά μεταξύ των κλινικά υγιών και των άρρωστων σκύλων, ως προς τον αριθμό των CD4+ Τ-λεμφοκυττάρων (Αlexander-Pires και συν 2010). Επιπλέον, έχει βρεθεί ότι η κλινική εικόνα και ο βαθμός παρασιτισμού του μυελού των οστών παρουσιάζουν αρνητικό συσχετισμό με τον αριθμό των CD21+ και CD14+ λεμφοκυττάρων, όπως εξάλλου και με την έκφραση των MHC-II μορίων (Reis και 42

49 συν 2006). Στα λεμφογάγγλια, ο αριθμός των CD8+ λεμφοκυττάρων βρέθηκε να είναι σημαντικά μικρότερος στους άρρωστους σκύλους που υποβλήθηκαν σε αντιλεϊσμανιακή θεραπεία σε σύγκριση με τους ασυμπτωματικούς, ενώ ο αριθμός των CD4+ λεμφοκυττάρων ήταν υψηλότερος σε σύγκριση με τους κλινικά υγιείς σκύλους (Μiranda και συν 2007, Alexandre-Pires και συν 2010). Αλλοι όμως ερευνητές υποστηρίζουν ότι ο αυξημένος αριθμός των CD4+ λεμφοκυττάρων στα λεμφογάγγλια αντανακλά τον περιορισμό της μόλυνσης, ενώ των CD8+ τη διασπορά του παρασίτου (Giunchetti και συν 2008). Η ανθεκτικότητα του σκύλου στη φυσική μόλυνση από το παράσιτο φαίνεται να έχει άμεση σχέση με την αποτελεσματική ενεργοποίηση της κυτταρικής ανοσίας και την παραγωγή των προστατευτικών κυτταροκινών IL-2, IL-12, IFN-γ και TNF-α (Pinelli και συν 1994b, Ruitenberg και συν 2001, Ferrer 2002, Βaneth 2005). Οι τελευταίες ενεργοποιούν τα μακροφάγα, τα οποία μέσω της παραγωγής μονοξειδίου του αζώτου (ΝΟ) τελικά εξουδετερώνουν το παράσιτο με το μηχανισμού της απόπτωσης (Kemp και συν 1996, Pinelli και συν 1999, Pinelli και συν 2000, Holzmuller και συν 2006). Η διαδικασία της απόπτωσης διαχωρίζεται σε τέσσερα στάδια (απόφαση, εκτέλεση, αποδόμηση, φαγοκυττάρωση) και χαρακτηρίζεται από την συρίκνωση της χρωματίνης (Εlmore 2007). Αναλυτικότερα, ο υποκείμενος μηχανισμός εστιάζεται στην αυξημένη σύνθεση του ενζύμου επαγώγιμη συνθετάση του μονοξειδίου του αζώτου (inos) στα μακροφάγα (Vouldoukis και συν 1996, Sisto και συν 2001) από τις Th1 κυτταροκίνες, και ιδιαίτερα την IFN-γ (Zafra συν 2008). Aυξημένη παραγωγή ΝΟ και ταυτόχρονη αντιλεϊσμανιακή δραστηριότητα διαπιστώθηκε και στα μακροφάγα σκύλων που ανοσοδιεγέρθηκαν με νεκρά προμαστιγοφόρα της L.infantum (Panaro και συν 2001). Η ταυτόχρονη έκφραση των IFN-γ, TNF-α, αλλά και IL-2, δείχνει ότι και η τελευταία παίζει κάποιο ρόλο στην καθυστέρηση της εκδήλωσης των συμπτωμάτων της νόσου (Santos Gomes και συν 2002). Σε πρόσφατη μελέτη διαπιστώθηκε ότι ο αριθμός των αποπτωτικών κυττάρων παρουσιάζει άμεσο συσχετισμό με το παρασιτικό φορτίο και τον βαθμό έντασης της κλινικής εικόνας των λεϊσμανιακών σκύλων (Vercosa και συν 2012). Στο σημείο αυτό πρέπει να αναφερθεί η σημασία της λοιμογόνου δύναμης του παρασίτου στην ειδική ανοσοαπάντηση. Ένας από τους σημαντικότερους παράγοντες που συνεισφέρουν στη διατήρηση του παρασίτου είναι η πρωτεολυτική δράση της επιφανειακής γλυκοπρωτεΐνης gp63 (Santos-Gomez και Αbranches 1996, Hsiao και συν 2008). Η gp63 παίζει σημαντικό ρόλο στην έκφραση των γονιδίων των μακροφάγων, μέσω της αδρανοποίησης ορισμένων λειτουργιών τους, όπως η 43

50 παραγωγή κυτταροκινών (Gregory και συν 2005), ενώ ταυτόχρονα διασφαλίζει την επιβίωση και τον πολλαπλασιασμού του παρασίτου, αναστέλλοντας την ενεργοποίηση των MAP κινασών (Mitogen-activated Protein kinases) (Hallé και συν 2009). Μειωμένη έκκριση της IFN-γ από τα μη ανοσοδιεγερμένα μονοπύρηνα του περιφερικού αίματος (PBMC), αλλά και από εκείνα που διεγέρθηκαν με διαλυτό λεϊσμανιακό αντιγόνο (Leishmania Soluble Antigen ή LSA), σε μολυσμένους από τη L.infantum σκύλους έχει συσχετιστεί με την ασυμπτωματική λοίμωξη (Manna και συν 2006, Carrillo και συν 2007). Σε άλλη, πειραματική αυτή τη φορά μελέτη, με συμπτωματικούς σκύλους, η έκκριση της IFN-γ στα PMBC που είχαν διεγερθεί με το LSA στην αρχή της εξέλιξης της νόσου αυξήθηκε, γεγονός που δείχνει ότι η κυτταροκίνη αυτή δεν μπορεί να προλάβει την εκδήλωση των συμπτωμάτων της CanL (Τravi και συν 2009). Σχετικά πρόσφατα, διάφορες κυτταροκίνες και ιδιαίτερα οι IL-4, IL-12, IL-10 και IFN-γ, προσδιορίστηκαν σε διάφορους ιστούς και όργανα ασυμπτωματικών σκύλων στους οποίους οι ΙL-2 και IL-12 ήταν αυξημένες στα λεμφογάγγλια(barbosa και συν 2011). Τα PBMC των συμπτωματικών σκύλων διαπιστώθηκε ότι παράγουν μικτού τύπου κυτταροκίνες (Th1/Th2), ενώ τα λεμφογάγγλια κυρίως τύπου Th1 (IL-2 και ΙFN-γ) (Barbosa και συν 2011). Επίσης παρατηρήθηκε ότι στους ασυμπτωματικούς σκύλους, η έκφραση των κυτταροκινών IFN-γ και TNF-β1 από το ήπαρ ήταν αυξημένη, ενώ ταυτόχρονα εκείνη των κυτταροκινών IL-4 και ΤNF-α ήταν μηδενική (Corrêa και συν 2007). Τέλος, βρέθηκε ότι και η IL-12 αυξάνει την έκφραση της IFN-γ στα PBMC των συμπτωματικών σκύλων, ανεξάρτητα από το αν μολύνθηκαν με πειραματικό ή φυσικό τρόπο (Strauss-Ayali και συν 2005). O ρόλος της IL-12 έχει επίσης ευρέως μελετηθεί στον ποντικό όπου η μειωμένη παραγωγή της ή υπομονάδων της (IL12R) φαίνεται να συνδέονται με ευαισθησία στη μόλυνση από τη L.major στελεχών τα οποία παρουσιάζουν γενετικά ανθεκτικότητα, με αποτέλεσμα να εμφανίζουν ανοσαπάντηση τύπου Th2 (Μattner και συν 1996, Chakir και συν 2003). Η ευαισθησία και η ανθεκτικότητα στην CanL, φαίνεται ότι έχει και γενετικό υπόβαθρο. Σε μελέτες πάνω στον πολυμορφισμό του γονιδίου S1c11c1 (Solute carrier family 11 member a1) του σκύλου (πρώην NRAMP1), που κωδικοποιεί την φέρουσα τον σίδηρο πρωτεΐνη και ελέγχει την κλωνοποίηση των παρασίτων και την ενεργοποίηση των μακροφάγων, διαπιστώθηκε ότι οι ευαίσθητοι σκύλοι παρουσιάζουν πολυμορφισμό και μεταλλάξεις στο συγκεκριμένο γονίδιο, όπως και ότι η συμπτωματική μορφή της CanL συνδέεται με το γενότυπο DLADRB1 (Quinell και συν 2003). Ο πολυμορφισμός αυτός πιθανότατα συνδέεται και με την προδιάθεση που φαίνεται να παρουσιάζει η φυλή boxer 44

51 στην CanL (Αltet και συν 2002, Sanchez-Robert και συν 2005, Sanchez-Robert και συν 2008). Συμπερασματικά, η καταστολή της κυτταρικής ανοσίας στα προχωρημένα στάδια της CanL, μπορεί να οφείλεται στη μειωμένη έκφραση των συνδιεγερτικών μορίων από τα μακροφάγα, το μειωμένο αριθμό CD4+ λεμφοκυττάρων και τη μειωμένη έκφραση της IFN-γ από τα PBMC (Βarbieri 2006). 2β. Χυμική ανοσία. Η μόλυνση του σκύλου από τη L.infantum μπορεί να παραμείνει ασυμπτωματική ή να εξελιχθεί σε ήπια ή βαριά νόσο (Βarbieri 2006). H εκδήλωση των συμπτωμάτων συνδέεται με τις παρατηρούμενες ανοσολογικές μεταβολές στα Τ- λεμφοκύτταρα, αν και ο ρόλος των τύπου Th2 κυτταροκινών δεν έχει διευκρινισθεί απόλυτα (De Luna 1999, Pinelli 1999, Sollano-Gallego και συν 2000, Santos-Gomes και συν 2002). Έχει διαπιστωθεί ότι η έκκριση της IL-10 αυξάνεται στα προχωρημένα στάδια της CanL (Boggiattο και συν 2010), όπως συμβαίνει και στον άνθρωπο (Ghalib και συν 1993), επειδή προφανώς ευθύνεται για την ενεργοποίηση των Τreg λεμφοκυττάρων που παίζουν βασικό ρόλο στη καταστολή της κυτταρικής ανοσίας (Murphy και συν 2001, Βelkaid και Τarbell 2009), αναστέλλοντας την έκκριση των Th1 κυτταροκινών (Τrinchieri 2007, Panaro και συν 2009) και συντελώντας έτσι στην αύξηση του παρασιτικού φορτίου (Silvestre και συν 2007, Lage και συν 2007). Αντίθετα, ο ρόλος της IL-4 στην ενεργοποίηση της χυμικής ανοσίας στην CanL φαίνεται ότι είναι πιο ξεκάθαρος, αφού δε μπόρεσε να ανιχνευθεί στα μονοκύτταρα του περιφερικού αίματος (PBMC) των ασυμπτωματικών σκύλων (Chamizo και συν 2005), αλλά βρέθηκε να είναι αυξημένη στους συμπτωματικούς (Quinell και συν 2001, Pinheiro και συν 2005, Barbieri 2006). Σε σχετικά πρόσφατη μελέτη στα PBMC με την τεχνική της ημιποσοτικής ανάστροφης PCR δεν βρέθηκε να υπάρχει σημαντική διαφορά ως προς τις κυτταροκίνες IL-4, ΤNF-α, IL-10 και IFN-γ μεταξύ των ασυμπτωματικών και των συμπτωματικών σκύλων τους πρώτους τέσσερις μήνες από τη στιγμή της διάγνωσης, για να αυξηθούν σημαντικά στη συνέχεια οι τρείς πρώτες τους επόμενους μήνες (Panaro και συν 2009). Σε μελέτη με πειραματικά μολυσμένους σκύλους, παρατηρήθηκε αύξηση της IL-4 στα κύτταρα του σπλήνα ένα μήνα μετά την μόλυνση (Strauss-Ayali και συν 2007). 45

52 Τέλος, σύμφωνα με ορισμένους ερευνητές διαπιστώθηκε ότι η IL-6 αποτελεί δείκτη ενεργού μόλυνσης (Lima και συν 2007) και η IL-18 ανιχνεύεται μόνο στους ασυμπτωματικούς σκύλους (Quinell και συν 2001, Chamizo και συν 2005), ενώ για άλλους οι παραπάνω κυτταροκίνες δεν έχουν σημαντικό ρόλο στην ανοσοαπάντηση του σκύλου (Pinelli και συν 1994, Manna και συν 2006, Carrillo και συν 2007). Oι συμπτωματικοί σκύλοι παράγουν υψηλότερα επίπεδα IgG αντισωμάτων σε σχέση με τους κλινικά υγιείς (Almeida και συν 2005, Ιniesta και συν 2005), ενώ ταυτόχρονα έχει παρατηρηθεί θετική συσχέτιση μεταξύ της αυξημένης παραγωγής IgG αντισωμάτων και της καταστολής της ειδικής κυτταρικής ανοσοαπάντησης (Rhalem και συν 1999, Fernadez-Perez και συν 2003). Σε μία άλλη μελέτη καταγράφηκε θετική συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων των IgG ανοσοσφαιρινών, της κλινικής εικόνας και του παρασιτικού φορτίου ορισμένων ιστών, όπως ο μυελός των οστών και ο σπλήνας (Reis και συν 2006). Σύμφωνα με πρόσφατες μελέτες και στις δύο μορφές της CanL οι δύο κύριοι υπότυποι της IgG (IgG1, IgG2) παράγονται το ίδιο (Day 2007, Boggiatto και συν 2010, Carson και συν 2010). Αντίθετα, σε προηγούμενες μελέτες η αυξημένη έκφραση της ΙgG1 είχε συνδεθεί με την εμφάνιση των συμπτωμάτων της νόσου (Nieto και συν 1999) και της ΙgG2 με την ασυμπτωματική μόλυνση (Cardoso και συν 2007). Στους συμπτωματικούς και σε μικρότερο βαθμό στους ασυμπτωματικούς σκύλους, οι εκκρινόμενες από τα Th2 λεμφοκύτταρα κυτταροκίνες και ιδιαίτερα η IL-4, διεγείρουν τα Β-λεμφοκύτταρα που παράγουν άφθονα αντισώματα, ενώ παράλληλα καταστέλλουν την δραστηριότητα των Th1 λεμφοκυττάρων με τη μείωση της ανταπόκρισής τους στην IL-12 (Jones και συν 1998). Η ενεργοποίηση αυτή έχει ως αποτέλεσμα την υπερπαραγωγή IgG κυρίως αντισωμάτων (Bourdoiseau και συν 1997a, Boggiatto και συν 2010), που όχι μόνο δεν προστατεύουν το ζώο από το παράσιτο, αλλά αντίθετα συντελούν στη δημιουργία ανοσοσυμπλόκων που εναποτίθενται στα αγγειώδη σπειράματα, τον αρθρικό υμένα, την ίριδα, τα αγγεία κλπ, προκαλώντας αντίστοιχες παθήσεις (Ciaramella και συν 1997, Abranches και συν 1998, Slappendel και Ferrer 1998, Koutinas και συν 1999). Ενώ η συγκέντρωση των αντισωμάτων IgA στην πλειονότητα των αρρώστων λεϊσμανιακών σκύλων είναι υψηλή, στους ασυμπτωματικούς, καθώς και σε εκείνους που υποβλήθηκαν σε αντιλεϊσμανιακή θεραπεία, βρέθηκε να είναι χαμηλή (Rodrigeuz-Cortez και συν 2007a, Rodrigeuz-Cortez 2007b), ενώ ενδέχεται να αποτελεί σημαντικό δείκτη παρασιτισμού στην CanL (Reis και συν 2006). Τέλος, έχει διαπιστωθεί σημαντική αύξηση της συγκέντρωσης των IgE ανοσοσφαιρινών σε μολυσμένους σκύλους που ζουν σε ενζωοτικές 46

53 περιοχές της CanL, αν και η σημασία του ευρήματος αυτού παραμένει αδιευκρίνιστη (Iniesta και συν 2005). Συμπερασματικά, θα μπορούσε να λεχθεί ότι η εκδήλωση και εξέλιξη της CanL είναι το αποτέλεσμα σύνθετων αλληλεπιδράσεων μεταξύ των σκνιπών (π.χ. επαναλαμβανόμενα δήγματα από μολυσμένες σκνίπες), του παρασίτου (π.χ. λοιμογόνος δύναμη) και του σκύλου (γενετικό και ανοσολογικό υποστρώμα, συνυπάρχουσες παθήσεις), με κατάληξη την έντονη χυμική ανοσοαπάντηση και την ταυτόχρονη καταστολή της κυτταρικής ανοσίας (Maia και Campino 2012). Οι μολυσμένοι σκύλοι εκδηλώνουν την νόσο όταν ο πολλαπλασιασμός του παρασίτου οδηγεί σε δυσλειτουργία και καταστροφή των οργάνων, ή εμφανίζονται ανθεκτικοί όταν τελικά εξουδετερώνουν το παράσιτο και παραμένουν κλινικά υγιείς. Ενδέχεται όμως ορισμένοι συμπτωματικοί σκύλοι με λεϊσμανίωση να αυτοϊώνται, καθώς και κάποιοι από τους ανθεκτικούς να αρρωστήσουν, στην περίπτωση που η κυτταρική τους ανοσία διαταραχθεί για διάφορους λόγους (Saridοmichelakis 2009, Bogiatto και συν 2010). Στους ανθεκτικούς όμως στην CanL σκύλους, που κατά κανόνα είναι ασυμπτωματικοί, ο τίτλος των αντιλεϊσμανιακών αντισωμάτων είναι χαμηλός, ενώ τόσο η δοκιμή της in vitro ανοσοδιέγερσης όσο και η ενδοδερμική δοκιμή με λεϊσμανίνη (Montenegro test) είναι θετικές (Μaia και Campino 2008). Στους σκύλους με συμπτωματική λεϊσμανίωση (CanL), η L.infantum φαίνεται να προκαλεί μικτού τύπου Th1/Th2 ανοσοαπάντηση, η οποία τελικά στον άρρωστο σκύλο μπορεί να οδηγήσει σε καταστροφή διαφόρων οργάνων και ιστών μέσω διαφόρων παθογενετικών μηχανισμών, όπως η πυοκοκιωματώδης φλεγμονή (π.χ. οζώδης δερματίτιδα, οστεομυελίτιδα), η εναπόθεση ανοσοσυμπλόκων (π.χ. σπειραματονεφρίτιδα) και η παραγωγή αυτοαντισωμάτων (π.χ. πολυμυοσίτιδα). 47

54 48

55 Δ. TΕΧΝΙΚΕΣ ΜΕΤΡΗΣΗΣ ΤΗΣ ΕΚΚΡΙΣΗΣ Ή ΤΗΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ ΤΩΝ ΚΥΤΤΑΡΟΚΙΝΩΝ ΑΠΟ ΤΑ ΜΟΝΟΠΥΡΗΝΑ ΚΥΤΤΑΡΑ ΤΟΥ ΠΕΡΙΦΕΡΙΚΟΥ ΑΙΜΑΤΟΣ ΣΤΟ ΣΚΥΛΟ. Στις τεχνικές που χρησιμοποιούνται για την μέτρηση της παραγωγής κυτταροκινών περιλαμβάνονται (α) η μέτρηση των πεπτιδίων στο υπερκείμενο υγρό καλλιεργειών με ELISA (Chiswick και συν 2012), (β) η μέτρηση του mrna των γονιδίων που εκφράζουν με RT-PCR στα PBMC (Chamizo και συν 2001, Saldarriaga και συν 2006) και (γ) η κυτταρομετρία ροής (Papadogiannakis και συν 2009) (α) Αρχικά γίνεται απομόνωση των μονοπύρηνων του περιφερικού αίματος (PBMCs) με φυγοκέντριση και χρησιμοποίηση ficoll-hypaque, σύμφωνα με το πρωτόκολλο που έχει ήδη περιγραφεί (Boyum 1968). Στη συνέχεια, τα PBMCs σε συγκέντρωση 1x10 6 κύτταρα/ml καλλιεργούνται και επωάζονται με 5μg/ml phytohaemagglutinin (PHA), 10 μg/ml leishmanial soluble antigen (LSA) ή μόνο με το καλλιεργητικό μέσο. Το υπερκείμενο υγρό της καλλιέργειας (supernatant) συλλέγεται μετά από 48 ή 72 ώρες, φυγοκεντρείται και φυλάσσεται στους -80 ο C μέχρι να χρησιμοποιηθεί για τον προσδιορισμό των κυτταροκινών. Η μέτρηση των κυτταροκινών γίνεται στο υπερκείμενο υγρό της καλλιέργειας και βασίζεται στην τεχνική της αναστολής της κυτταροτοξικής δράσης του ιού της φυσαλιδώδους στοματίτιδας (VSV) σε κύτταρα νεφρού σκύλου (Madin-Darby κύτταρα ΑΤCCCCL34 (MDCK2) (Pinelli και συν 1995). Συγκεκριμένα, σε πλάκες 96 κυψελών επίπεδης βάσης, τοποθετείται ποσότητα 50μl του υπερκείμενου υγρού της καλλιέργειας σε διπλάσιες αραιώσεις. Στη συνέχεια, προστίθενται τα MDCK2 κύτταρα, σε πυκνότητα 1x10 5 κυττάρων/κυψέλη σε καλλιεργητικό μέσο RPΜI 1640, και επωάζονται κατά την διάρκεια της νύχτας (overnight) στους 37 ο C και σε ατμόσφαιρα 5 CO 2. Την επομένη ημέρα απομακρύνεται το υπερκείμενο υγρό των καλλιεργειών και προστίθεται ποσότητα 50μl του ιού VSV σε συγκέντρωση 10 5 pfu/ml στα προσκολλημένα κύτταρα σε κάθε κυψέλη της πλάκας. Μετά από 24 ώρες, που στα μολυσμένα κύτταρα (στα οποία δεν υπάρχει επίδραση της IFN-γ) εμφανίζεται το πλήρες τοξικό αποτέλεσμα της δράσης του ιού, όλα τα κύτταρα βάφονται με προσθήκη ποσότητας 50μl 0.75 crystal violet σε 0.9 formaldehyde για 15 min. Η μέτρηση της IFN-γ και της IL-4 εκφράζεται σε πρότυπες μονάδες (standard units)/ml που αντιστοιχούν στη αντίστροφη μέγιστη αραίωση που προστατεύει το 50 της μιας στοιβάδας κυττάρων στις κυψέλες, όπως αυτό εκτιμάται 49

56 με γυμνό οφθαλμό. Η μέτρηση του TNF-α γίνεται στο υπερκείμενο υγρό της καλλιέργειας με την εφαρμογή της κυτταροτοξικής μεθόδου και τη χρησιμοποίηση της ευαίσθητης στον TNF-α κυτταρικής γραμμής L929 (Brazis και συν 2000). (β) Και στην μέθοδο αυτή σε πρώτη φάση γίνεται απομόνωση των μονοπύρηνων του περιφερικού αίματος (PBMCs), η οποία επιτυγχάνεται φυγοκεντρώντας ηπαρινισμένο δείγματος αίματος. Για τον προσδιορισμό της έκφρασης των κυτταροκινών χρησιμοποιήθηκαν διάφοροι διεγέρτες, που όπως είναι γνωστό ενεργοποιούν τα PBMC. Στην συνέχεια τα PBMC καλλιεργούνται σε RPMI και με την προσθήκη άλλων μέσων (fetal calf serum, L-glutamine, penicillin, streptomycin, mercaptoethanol). Ακολουθεί η διέγερση των PBMC (ConA, lipopolysaccharide, 0.05 Staphylococcus aureus extract), η έκπλυση των κυττάρων με PBS και η προσθήκη του RNAlater για την διατήρηση του RNA. Στην συνέχεια, τα δείγματα διαλύοταν με RNA lysis buffer (RLT). Τέλος, το RNA εκλούεται σε νερό ελεύθερο νουκλεάσης και μετά από ειδική επεξεργασία (θέρμανση 95 0 C, ψύξη, προσθήκη RNase-free DNase και DNAse) αποθηκεύεται στους C μέχρι να χρησιμοποιηθεί. Η ιδανική επίδοση επιτεύχθηκε επιλέγοντας συγκεντρώσεις των εκκινητών που παρείχαν το χαμηλότερο και το υψηλότερο σήμα που παράχθηκε από την PCR. Xρησιμοποιώντας αντιδραστήρια RT-PCR ενός βήματος και διαλύματα του RNA, έγινε εφικτό να παραχθεί μια σταθερή καμπύλη και να υπολογιστεί η αποτελεσματικότητα της αντίδρασης για τα γονίδια στόχο και το 18S rrna. Kάθε δείγμα δοκιμάζεται για την έκφραση του mrna της κυτταροκίνης ως ενδογενής σταθεροποιητής μαζί με το μίγμα της RT-PCR. Το τελικό βήμα της μεθόδου αποτελεί η μέτρηση των κυτταροκινών σε ειδικό αυτοματοποιημένο φθοριόμετρο. (γ) Η κυτταρομετρία ροής (Flow-cytometry-FC) είναι μια αυτοματοποιημένη, πολυπαραμετρική και ποσοτική μέθοδος μέτρησης και ανάλυσης των σημάτων σκεδασμού και φθορισμού που παράγονται, καθώς μία μονήρης κυτταρική διάταξη διέρχεται μπροστά από μία φωτεινή δέσμη, κατά κύριο λόγο LASER (Shapiro 1988, Parks και Ηerzenberg 1989, Marti και συν 2001). Τα κυτταρόμετρα ροής θεωρούνται αυτοματοποιημένα μικροσκόπια ανοσοφθορισμού, τα οποία πλεονεκτούν σε σχέση με τα τελευταία, στο ότι μπορούν και εξετάζουν τα κύτταρα με πολύ υψηλό ρυθμό, γεγονός που επιτρέπει τη μελέτη πολύ μικρών κυτταρικών πληθυσμών, ενώ ταυτόχρονα οι υπό μελέτη κυτταρικές παράμετροι μετρούνται σε κάθε κύτταρο και παρέχεται η δυνατότητα απομόνωσης και διαχωρισμού ομάδων κυττάρων με συγκεκριμένα χαρακτηριστικά (Darzynkiewicz και Crissman 1990, Αffolter 2000). 50

57 Το κυτταρόμετρο ροής διαθέτει ως βασικό στοχείο ένα υδροδυναμικό σύστημα που επιτρέπει στα κύτταρα την μονήρη διαταξή τους, πάνω στην οποία προσπίπτει η δέσμη LASER και καταμετρούνται οι ερευνόμενες παραμέτροι, σε κάθε κύτταρο χωριστά (McCoy 2002). Aπό την παραπάνω πρόσπτωση προκαλείται σκεδασμός του φωτός, που μπορεί να είναι ευθύγραμμος (FCS) και δίνει πληροφορίες σχετικά με το μέγεθος των κυττάρων ή πλάγιος (SSC), που έχει άμεση σχέση με την περιεκτικότητά τους σε κοκκία (Parks και Ηerzenberg 1989, Παπαδογιαννάκης και συν 2005). Η δίοδος των παραπάνω φωτεινών σημάτων μέσα από ένα ιδιαίτερα πολύπλοκο σύστημα φακών, κατόπτρων και φίλτρων, επιτρέπει τον διαχωρισμό και την εκτροπή τους προς τις θέσεις των φωτοανιχνευτών, που τα μετατρέπουν στη συνέχεια σε ηλεκτρικούς παλμούς. Οι ηλεκτρικοί παλμοί υποβάλλονται σε ενίσχυση (γραμμική ή λογαριθμική) με τελικό αποτέλεσμα την ψηφιοποίηση των σημάτων και την προβολή τους στην οθόνη του ηλεκτρονικού υπολογιστή του κυτταρόμετρου (McCoy 2002, Πατεράκης 2003). Η παρουσίαση και η ανάλυση των σημάτων μπορεί να γίνει υπό μορφή ιστογράμματος ή στικτογράμματος (dot plot), τα οποία χρησιμοποιούνται για την επεξεργασία δεδομένων που προέρχονται από απλές σημάνσεις και περιμετρικού διαγράμματος (contour plot) που αφορά πολλαπλές κυτταρικές σημάνσεις (Affolter 2000). Η σήμανση των κυττάρων μπορεί να γίνει με άμεσο ή έμμεσο ανοσοφθορισμό, με μονή, διπλή ή πολλαπλή σήμανση και με μάρτυρες (Affolter 2000). Η μέτρηση των ενδοκυττάριων κυτταροκινών IFN-γ και IL-4 στα Τ- λεμφοκύτταρα του περιφερικού αίματος του σκύλου με κυτταρομετρία ροής, όπως εφαρμόστηκε στην εργασία αυτή και περιγράφεται αναλυτικά στο κεφάλαιο υλικά και μέθοδοι, είναι μία απλή και αξιόπιστη τεχνική, που εκτιμά αντικειμενικότερα την ανοσοαπάντηση και πλεονεκτεί στο ότι η μέτρηση των κυτταροκινών γίνεται σε κάθε τύπο ανοσοκυττάρου (CD4+, CD8+), σε κάθε κύτταρο ξεχωριστά και εξουδετερώνοντας τυχόν εξωγενείς παράγοντες που ενδέχεται να επηρεάσουν την παραγωγή τους (Sewell και συν 1997, Παπαδογιαννάκης και συν 2005, Papadogiannakis και συν 2009). Η κυτταρομετρία ροής έχει χρησιμοποιηθεί και σε άλλες μελέτες, αλλά μόνο για την μέτρηση των CD4+ και CD8+ λεμφοκυτταρικών υποπληθυσμών (Moreno και συν 1999) και όχι για την μέτρηση των ενδοκυττάριων κυτταροκινών. Αντίθετα, οι τεχνικές μέτρησης που βασίζονται στην απομόνωση των μονοπύρηνων του περιφερικού αίματος, στην καλλιέργεια, την διέγερση και την μέτρηση της πρωτεΐνης ή του m-rna στο υπερκείμενο υγρό της καλλιέργειας μειονεκτούν στο ότι δεν μπορεί να υπολογιστεί η επιμέρους συμμετοχή του κάθε 51

58 κυτταρικού υποπληθυσμού, τα χρησιμοποιούμενα αντιδραστήρια ενδέχεται να συμμετέχουν στην παραγωγή κυτταροκινών και η μέτρηση του m-rna δεν αντανακλά την παραγόμενη ποσότητα πρωτεΐνης που κωδικοποιεί (Μuller και Sinigaglia 1995, Pedersen και συν 2002). 52

59 ΜΕΡΟΣ ΔΕΥΤΕΡΟ ΔΙΚΗ ΜΑΣ ΕΡΕΥΝΑ ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 1. Ζώα, συγκρότηση ομάδων, ιστορικό Στη μελέτη αυτή, που ήταν στιγμιαία, τυφλή και με μάρτυρες χρησιμοποιήθηκαν 60 συνολικά σκύλοι, που προσκομίσθηκαν στο Αττικό Νοσοκομείο Ζώων, αφού προηγουμένως εξασφαλίσθηκε η συγκατάθεση των ιδιοκτητών τους, από τους οποίους οι 40 ήταν θετικοί στη L.infantum ενώ οι 20 αρνητικοί και κλινικά υγιείς. Οι 29 σκύλοι ήταν αρσενικοί (48,3) και οι 31 θηλυκοί (51,7). Οι 15 (25) ανήκαν σε αμιγείς, ενώ οι 45 (75) ήταν ακαθόριστης φυλής. Όλα τα ζώα εμβολιάζονταν κάθε χρόνο για τη νόσο του Carré, την παρβοεντερίτιδα, την λεπτοσπείρωση, την λοιμώδη ηπατίτιδα και τη λύσσα, ενώ τους χορηγούνταν ευρέως φάσματος ανθελμινθικά φάρμακα σε τακτικά χρονικά διαστήματα. Πρέπει επίσης να επισημανθεί ότι στους μολυσμένους σκύλους που επιλέχθηκαν για τη μελέτη δεν είχε χορηγηθεί κανενός είδους αντιλεϊσμανιακή αγωγή. Ολοι οι σκύλοι που χρησιμοποιήθηκαν διατρέφονταν με ξηρού τύπου βιομηχανοποιημένη τροφή. Για το σκοπό της μελέτης οι σκύλοι αυτοί χωρίστηκαν στις ομάδες Λ1, Λ2, Λ3 και Μ. Η ομάδα Λ1 περιελάμβανε 20 ασυμπτωματικούς μολυσμένους από τη L. infantum σκύλους, η ομάδα Λ2 20 συμπτωματικούς και η ομάδα Λ3, 5 ζώα της ομάδας Λ2, που επιλέχθηκαν τυχαία και υποβλήθηκαν σε αντιλεϊσμανιακή από το στόμα θεραπεία με μιλτεφοσίνη (Milteforan, Virbac, 2mg/Kg/ημέρα) και αλλοπουρινόλη (Zylapour, Farmanik, 10mg/Kg/12ωρο) για 30 συνεχείς ημέρες. Η ομάδα Μ περιελάμβανε τους 20 μάρτυρες (Σχήμα 2). Επισημαίνεται ότι οι ασυμπτωματικοί σκύλοι (Λ1) δεν παρουσίαζαν κανένα σύμπτωμα ή εργαστηριακή διαταραχή που να υποδηλώνει, έστω και στο ελάχιστο, τη νόσο. Η διάγνωση ή ο αποκλεισμός της CanL τέθηκε με την κυτταρολογική εξέταση FNA σε οπό λεμφογαγγλίου, την ορολογική εξέταση στον ορό του αίματος (IFA) και την μοριακή εξέταση (nested-pcr) σε οπό λεμφογαγγλίου στις ομάδες Λ2 και Μ, ενώ στη Λ1 με τις IFA και PCR. Από τους 20 σκύλους της ομάδας Λ1, οι 12 ήταν θηλυκoύ γένους και οι 8 αρσενικού, με τους 7 να ανήκουν σε αμιγείς φυλές και τους 13 να είναι ακαθόριστης φυλής. Η ηλικία τους κυμαίνοταν από 2 μέχρι 6 έτη (μ.ο. 3,3 έτη) και το σωματικό τους βάρος από 15 μέχρι 53

60 44 Kg (μ.ο. 25,1 Kg) (Πίνακας 1). Από τους 20 σκύλους της ομάδας Λ2 οι 10 ήταν θηλυκοί και οι 10 αρσενικοί, οι 3 ανήκαν σε αμιγείς φυλές, ενώ οι 17 ήταν ακαθόριστης φυλής, με την ηλικία τους να κυμαίνεται από 3 μέχρι 7 έτη (μ.ο. 4,6 έτη) και το σωματικό τους βάρος από 16 ως 39 Kg (μ.ο. 24,2 Kg) (Πίνακας 2). Η ομάδα Λ3 αποτελούνταν από τα ζώα Ν Ο 8, 9, 10, 11, 12 της ομάδας Λ2 από τα οποία τα 3 ήταν θηλυκά και τα 2 αρσενικά, τα 4 ακαθόριστης και το 1 αμιγούς φυλής, με την ηλικία τους να κυμαίνεται από 3 μέχρι 5 έτη (μ.ο. 4 έτη) και το σωματικό τους βάρος από 18 μέχρι 29 Kg (μ.ο. 23,4 Kg) (Πίνακας 2). Tέλος, από τους 20 σκύλους της ομάδας Μ, οι 11 ήταν αρσενικοί και οι 9 θηλυκοί, οι 5 ανήκαν σε αμιγείς φυλές και οι 15 ήταν ακαθόριστης φυλής, ενώ η ηλικία τους κυμαίνονταν από 2 μέχρι 7 έτη (μ.ο. 3,1 έτη) και το σωματικό τους βάρος από 9 μέχρι 42 Kg (μ.ο. 23 Kg) (Πίνακας 3). Από την στατιστική επεξεργασία των ομάδων της μελέτης δεν προέκυψαν μεταξύ τους διαφορές σε ότι αφορά το φύλο, την ηλικία και το Σ.Β. Μ n=20 Mάρτυρες ΣΚΥΛΟΙ (n =60) Λ1 n=20 Aσυμπτωματικοί Λ2 n=20 Συμπτωματικοί Λ3 n=5 Σκύλοι της Λ2, υπό 30ήμερη θεραπεία Σχήμα 2: Ομαδοποίηση των ζώων της μελέτης 54

61 Πίνακας 1: Φύλο, φυλή, ηλικία και σωματικό βάρος των σκύλων της ομάδας Λ1(ασυμπτωματικοί) α/α Φυλή Φύλο Ηλικία (έτη) ΣΒ (Kg) Λ1.1 Ακαθόριστη 2 21 Λ1.2 Ακαθόριστη 3 22 Λ1.3 Ακαθόριστη 4 27 Λ1.4 French bulldog 4 17 Λ1.5 Ακαθόριστη 2 19 Λ1.6 Dobermann pincher 6 39 Λ1.7 Ακαθόριστη 5 25 Λ1.8 Ακαθόριστη 3 23 Λ1.9 Ακαθόριστη 6 15 Λ1.10 English pointer 3 24 Λ1.11 German shepherd 4 43 Λ1.12 Ακαθόριστη 2 18 Λ1.13 Cocker spaniel 6 16 Λ1.14 Ακαθόριστη 3 19 Λ1.15 Ακαθόριστη 2 21 Λ1.16 Rottweiler 3 44 Λ1.17 Ακαθόριστη 2 22 Λ1.18 Ακαθόριστη 3 18 Λ1.19 Ακαθόριστη 3 41 Λ1.20 Boxer

62 Πίνακας 2: Φύλο, φυλή, ηλικία και σωματικό βάρος των σκύλων της ομάδας Λ2 (συμπτωματικοί) α/α Φυλή Φύλο Ηλικία (έτη) Σ.Β (Kg) Λ2.1 Ακαθόριστη 3 22 Λ2.2 Aκαθόριστη 5 25 Λ2.3 Ακαθόριστη 6 19 Λ2.4 Ακαθόριστη 3 16 Λ2.5 German shepherd 4 39 Λ2.6 Ακαθόριστη 5 21 Λ2.7 Ακαθόριστη 4 24 Λ2.8* Ακαθόριστη 4 22 Λ2.9* Ακαθόριστη 3 23 Λ2.10* Pit bull 4 29 Λ2.11* Ακαθόριστη 4 25 Λ2.12* Ακαθόριστη 5 18 Λ2.13 Ακαθόριστη 4 17 Λ2.14 Dobermann pincher 7 31 Λ2.15 Ακαθόριστη 6 34 Λ2.16 Ακαθόριστη 5 29 Λ2.17 Ακαθόριστη 4 24 Λ2.18 Ακαθόριστη 4 23 Λ2.19 Ακαθόριστη 6 26 Λ2.20 Ακαθόριστη 7 18 * Ζώα της ομάδας Λ3 (30ήμερη αντιλεϊσμανιακή θεραπεία) 56

63 Πίνακας 3: Φύλο, φυλή, ηλικία και σωματικό βάρος των σκύλων της ομάδας Μ (μάρτυρες) α/α Φυλή Φύλο Ηλικία (έτη) Σ.Β (Kg) M1 M2 Miniature Schnauzer Dobermann pincher M3 Ακαθόριστη 3 15 M4 Samoyed 5 38 M5 Boxer 3 29 M6 Ακαθόριστη 2 32 M7 Ακαθόριστη 2 21 M8 Ακαθόριστη 2 14 M9 Ακαθόριστη 2 12 M10 Ακαθόριστη 3 17 M11 German wirehaired pointer 3 33 M12 Ακαθόριστη 2 16 M13 Ακαθόριστη 2 25 M14 Ακαθόριστη 3 17 M15 Ακαθόριστη 4 24 M16 Ακαθόριστη 3 22 M17 Ακαθόριστη 3 23 M18 Ακαθόριστη 3 21 M19 Ακαθόριστη 4 22 M20 Ακαθόριστη

64 Τα συχνότερα αίτια προσκόμισης των σκύλων της ομάδας Λ2 στο Αττικό Νοσοκομείο Ζώων (Παιανία, Αττική), ήταν σε φθίνουσα σειρά η μείωση της όρεξης ή η ανορεξία (9/20, 45), η προοδευτική απώλεια του σωματικού βάρους (8/20, 40) και η ατροφία των μασητήριων μυών (7/20, 35). Στα λιγότερα συχνά αίτια προσκόμισης περιλαμβάνονταν η αποφολιδωτική δερματίτιδα (4/20, 20) και η επίσταξη (3/20, 15), η ονυχογρύπωση (3/20, 15) κ.α. (Πίνακας 4). Τα συχνότερα εργαστηριακά ευρήματα των σκύλων της ομάδας Λ2 ήταν η αναιμία (18/20, 90), η πρωτεϊνουρία διήθησης 16/20 (80), η υπερπρωτεϊναιμία (16/20, 80), η υπερσφαιριναιμία (13/20, 65) και η θρομβοκυτταροπενία (8/20, 40). Στα λιγότερο συχνά περιλαμβάνονταν η υπεργάμμασφαιριναιμία (7/20, 35), η αζωθαιμία (3/20, 15) (στη περίπτωση της μελέτης μας οι αζωθαιμικοί σκύλοι παρουσίαζαν αυξημένη τόσο την κρεατινίνη όσο και το άζωτο ουρίας), η λευκοκυττάρωση (2/20, 10), η λευκοπενία (1/20, 5) και η θρομβοκυττάρωση (1/20, 5) (Πίνακας 5). 2. Κλινική εξέταση Ύστερα από τη λήψη του ιστορικού κάθε σκύλος ξεχωριστά υποβάλλονταν σε λεπτομερή κλινική εξέταση, που αρχικά περιλάμβανε τη θερμομέτρηση, την επισκόπηση των ορατών βλεννογόνων, την ακρόαση των πνευμόνων και της καρδιάς, τη θρεπτική κατάσταση, τη λήψη σφυγμού, την ψηλάφηση των υποδόριων λεμφογαγγλίων και της κοιλιακής κοιλότητας και το επίπεδο της συνείδησης. Στη συνέχεια εξετάζονταν προληπτικά όλα εκείνα τα όργανα που είναι γνωστό ότι προσβάλλονται στη CanL (π.χ. δέρμα, νύχια, οφθαλμοί, ακρορίνιο και μυκτήρες, αρθρώσεις, μασητήριοι μύες) (Πίνακας 4). Η βαθμόγηση της έντασης καθεμιάς από τις παθολογικές καταστάσεις έγινε με υποκειμενικό τρόπο από δύο διαφορετικούς εξεταστές, οι οποίοι πάντοτε ήταν οι ίδιοι και με βάση την κλίμακα από 0 3 (0: απουσία, 1: ήπιου βαθμού, 2: μέτριου βαθμού, 3: έντονου βαθμού). Στην περίπτωση εκείνη που ο ένας εξεταστής βαθμολογούσε κάποιο σύμπτωμα με μηδέν και ο άλλος με +1, ο σκύλος αποκλείοταν από τη μελέτη. To τελικό αποτέλεσμα διαμορφώθηκε από το μέσο όρο των δύο βαθμολογήσεων, χωρίς στρογγυλοποίηση. 58

65 Πίνακας 4: Κλινικά ευρήματα των σκύλων της ομάδας Λ2 (συμπτωματικοί) Λ2.1 1,3,4 Λ2.2 1,2,7 Λ2.3 1,3,6 Λ2.4 1,4,5,7 Λ2.5 2,9 Λ2.6 1,2,3 Λ2.7 1,5 Λ2.8 4,10,13 Λ2.9 1,3,9 Λ2.10 1,2,6,14 Λ2.11 1,7,13 Λ2.12 1,5,9 Λ2.13 1,2,8 Λ2.14 1,3,6 Λ2.15 4,6,12 Λ2.16 1,8,10,11 Λ2.17 1,2,5,8 Λ2.18 1,3,10 Λ2.19 1,2,3 Λ2.20 4,11,12 1. Περιφερική λεμφογαγγλιομεγαλία 16/20 ( 80) 2. Επιπεφυκίτιδα 7/20 ( 35) 3. Ατροφία μασητήριων μυών 7/20 (35) 4. Ωχρότητα ορατών βλεννογόνων 5/20 (25) 5. Σπληνομεγαλία 4/20 (20) 6. Αποφολιδωτική δερματίτιδα 4/20 (20) 7. Επίσταξη 3/20 (15) 8. Καχεξία 3/20 (10) 9. Πολυαρθρίτιδα 3/20 (15) 10. 0νυχομεγαλία, Ονυχογρύπωση 3/20 (15) 11. Υπερκεράτωση ακρορρινίου και πελματικών φυμάτων 2/20 (10) 12. Πυρετός 2/20 (10) 13. Ιριδοκυκλίτιδα 2/20 (10) 14. Ηπατομεγαλία 1/20 (5) Στις παρενθέσεις αναγράφονται ο απόλυτος αριθμός και η εκατοστιαία αναλογία () κάθε συμπτώματος ή παθολογικής κατάστασης 59

66 Πίνακας 5: Εργαστηριακά ευρήματα των σκύλων της ομάδας Λ2 Λ2.1 1,2,7,9,10 Λ2.2 1,6,7,9 Λ2.3 1,6,7,10 Λ2.4 1,2,6,7 Λ2.5 3,6,7,9 Λ2.6 1,5,9 Λ2.7 6,7,9,10 Λ2.8 1,2,7,8,9,10 Λ2.9 1,6,7,9 Λ2.10 1,2,4,6,7,10 Λ2.11 1,2,6,9 Λ2.12 1,2,6,7,9 Λ2.13 1,6,7,9 Λ2.14 1,7,8,9 Λ2.15 1,6,9,10 Λ2.16 1,6,9 Λ2.17 1,2,3,6,9,10 Λ2.18 1,2,6 Λ2.19 1,6,7,8,9 Λ2.20 1,6,9 1. Αναιμία 18/20 (90) ( HCT< 37) 2. Θρομβοκυτταροπενία 8/20 (40 ) ( PLT< /μl) 3. Λευκοκυττάρωση 2/20 (10) ( WBC >17.000/μl) 4. Λευκοπενία 1/20 (5) (WBC <5.500/μl) 5. Θρομβοκυττάρωση 1/20 (5) (PLT > /μl) 6. Υπερπρωτειναιμία 16/20 (80) (TP>7,6g/dl) 7. Υπερσφαιριναιμία 13/20 (65) (GLOB>4,1g/dl) 8. Αζωθαιμία 3/20 (15) (CREA>1,6mg/dl BUN>27mg/dl) 9. Σπειραματική πρωτεϊνουρία 16/20 (80) 10. Υπεργάμμα-σφαιριναιμία 7/20 (35) (γ-σφαιρίνες>18,5) *Στις παρενθέσεις αναγράφονται οι ανώτερες και κατώτερες τιμές αναφοράς ανάλογα με την περίπτωση *Στη μελέτη μας οι αζωθαιμικοί σκύλοι είχαν αυξημένες την Bun και την Crea 60

67 Εργαστηριακές εξετάσεις Όλες οι εργαστηριακές εξετάσεις, με εξαίρεση την PCR και την κυτταρομετρία ροής, γίνοταν στα Ελληνικά Κτηνιατρικά Εργαστηρία Α.Ε. 3.1 Αιματολογικές εξετάσεις Από τη σφαγίτιδα φλέβα κάθε σκύλου λαμβάνονταν 9 ml αίματος, με βελόνα διαμέτρου 21G και μήκους 2,5 cm (Shangai Int. Holding Corp. GmbH, Hamburg- GERMANY) και σύριγγα των 10 ml. Δύο ml του δείγματος μεταγγιζόταν αμέσως σε φιαλίδιο με αιθυλενοδιαμινοτετραοξεικό κάλιο ως αντιπηκτικό (Pottasium-EDTA) ενώ η υπόλοιπη ποσότητα φυγοκεντρούνταν (1600 g x 15 min) για το διαχωρισμό του ορού από το πήγμα αίματος. Η γενική εξέταση αίματος, που γινόταν σε αυτόματο αιματολογικό αναλυτή (ABX HORIBA-PENDRA 20, France), περιελάμβανε τον αιματοκρίτη (HCT, ), τη συγκέντρωση της αιμοσφαιρίνης (Hb, g/μl), τον αριθμό των λευκών αιμοσφαιρίων (WBC/μL ), το λευκοκυτταρικό τύπο και τον αριθμό των αιμοπεταλίων (PLT/μL) και έγινε σε όλες τις ομάδες σκύλων της μελέτης (Μ, Λ1, Λ2). Οι σκύλοι των ομάδων Μ και Λ1 είχαν φυσιολογικές γενικές αίματος. Στις αιματολογικές διαταραχές των ζώων της ομάδας Λ2 περιλαμβάνονταν η αναιμία (18/20, 90), η θρομβοκυτταροπενία (8/20, 40), η λευκοκυττάρωση (2/20, 10), η λευκοπενία (1/20, 5) και η θρομβοκυττάρωση (1/20, 5) (Πίνακας 5). Επιπλέον παρασκευάζονταν απλά επιχρίσματα, καθώς και επιχρίσματα από τη στοιβάδα των λευκών αιμοσφαιρίων-αιμοπεταλίων της στήλης του αιματοκρίτη σε σωληνάριο Windrobe (buffy coat), τα οποία χρωματίζοταν με την τεχνική Giemsa, μικροσκοπούνταν με καταδυτικό φακό (x 1000) για τυχόν παρουσία μοριδίων της E.canis στο κυτταρόπλασμα των μεγάλων μονοπύρηνων και ελέγχονταν για την τυχόν παρουσία μεροζωϊδίων της Bαbesia sp. στα ερυθρά αιμοσφαίρια, γαμετοκυττάρων του Hepatozoon canis στο κυτταρόπλασμα των ουδετερόφιλων και μοριδίων του Αnaplasma platys στα αιμοπετάλια. Ταυτόχρονα, στα επιχρίσματα αυτά εκτιμούνταν η μορφολογία των ερυθρών και των λευκών αιμοσφαιρίων και ο αριθμός, το μέγεθος και η τυχόν παρουσία συσσωματωμάτων αιμοπεταλίων ή γιγαντοαιμαπεταλίων. Στις παραπάνω αιματολογικές 61

68 εξετάσεις δεν διαπιστώθηκαν παθολογικά ευρήματα σε κανένα σκύλο των τριών ομάδων Μ, Λ1 και Λ Βιοχημικές εξετάσεις στο ορό του αίματος Στον ορό του αίματος μετρήθηκε η συγκέντρωση των ολικών πρωτεϊνών (TP), των λευκωματινών (ALB), του αζώτου ουρίας (BUN), της κρεατινίνης (CREA), της γλυκόζης (GLU), της αλκαλικής φωσφατάσης (ALP), της αλανινοαμινοτρανσφεράσης (ALT), του καλίου (Κ), του νατρίου (Νa) του ασβεστίου (Ca), ενώ παράλληλλα γινόταν και ηλεκτροφόρηση των πρωτεϊνών σε ειδικό βιοχημικό αναλυτή με τα κατάλληλα αντιδραστήρια (ABX HORIBA-PENDRA 400, France). Οι σκύλοι των ομάδων Μ και Λ1 δεν παρουσίαζαν βιοχημικές διαταραχές. Από τις βιοχημικές διαταραχές των σκύλων της ομάδας Λ2 οι σπουδαιότερες ήταν η υπερπρωτεϊναιμία (16/20, 80), η υπερσφαιριναιμία (13/20, 65), η υπερ-γαμμασφαιριναιμία (7/20, 35) και η αζωθαιμία (3/20, 15). 3.3 Ανάλυση ούρου Από τους σκύλους όλων των ομάδων λαμβάνοταν με κυστοκέντηση δείγμα ούρου (5-10ml) στο οποίο μετρούνταν το ειδικό βάρος με ιατρικό διαθλασίμετρο (Eickemeyer, Germany), ενώ παράλληλα εμβαπτιζόταν ειδική χρωματομετρική ταινία (Uri-check, VEDA LAB, France) για τον έλεγχο του ph και την τυχόν παρουσία γλυκόζης, κετονικών σωμάτων, πρωτεϊνών και άλλων βιοχημικών παραμέτρων. Επιπλέον, η πρωτεϊνουρία εκτιμούνταν και ημιποσοτικά με την θολωσιμετρική κατά Heller τεχνική (Hurley και Vaden 1995, Finco 1995). Σε περίπτωση που η μία από τις δύο τεχνικές (stick, Heller) ήταν θετική και η άλλη αρνητική ο σκύλος αποκλείοταν από τη μελέτη. Για την εξέταση του ιζήματος, 5ml ούρων φυγοκεντρούνταν (500g x 5 min) και αφού απορρίπτονταν το υπερκείμενο υγρό, ακολουθούσε μικροσκοπική εξέταση μιας σταγόνας του ιζήματος για πιθανή κυλινδρουρία (>2κύλινδροι/οπτικό πεδίο, x 100), πυουρία (λευκά αιμοσφαίρια > 6/οπτικό πεδίο x 400), αιματουρία (ερυθρά αιμοσφαίρια >6 οπτικό πεδίο, x 400) και σημαντική βακτηριδουρία (Di Bartola 2000). Επιπλέον και προκειμένου να αποκλειστεί το ενδεχόμενο της ασυμπτωματικής ουρολοίμωξης, γινόταν καλλιέργεια σε αιματούχο άγαρ. Επισημαίνεται ότι στην ανάλυση του ούρου των σκύλων της ομάδας Λ2 βρέθηκε 62

69 διαφόρου βαθμού πρωτεϊνουρία διήθησης (16/20, ζώα 80), ενώ το ειδικό βάρος ήταν φυσιολογικό στους 18/20 (90) σκύλους, ενώ 2/20 (10) παρουσίαζαν ισοσθενουρία. Οι υπόλοιπες παράμετροι του ούρου δεν παρουσίαζαν παθολογικά ευρήματα. Οι σκύλοι των ομάδων Μ και Λ1 δεν παρουσίαζαν παθολογικά ευρήματα από το ούρο. Σε κάθε περίπτωση η καλλιέργεια ήταν αρνητική. 3.4 Παρασιτολογική εξέταση σε δείγμα κοπράνων Δείγματα κοπράνων που λαμβάνονταν απευθείας από το απευθυσμένο εξετάζοταν μικροσκοπικά για αναπαραγωγικά στοιχεία παρασίτων με την απλή μέθοδο (Χαραλαμπίδης και Διάκου 2001). Τα αποτελέσματα όλων των σκύλων των ομάδων Μ, Λ1 και Λ2 ήταν αρνητικά. 3.5 Μικροσκοπική εξέταση οπού λεμφογαγγλίου Κατά την μικροσκοπική εξέταση με καταδυτικό φακό (x 1000) των χρωματισμένων με την τεχνική Giemsa επιχρισμάτων από οπό ιγνυακού λεμφογαγγλίου ύστερα από παρακέντηση με λεπτή βελόνα (FNA) αναζητούνταν, εκτός από τις αμαστιγοφόρες μορφές της L.infantum, και τυχόν ενδοκυτταρικά μορίδια της E.canis (Mylonakis και συν 2003). Η εκτίμηση του παρασιτικού φορτίου γινόταν με βάση την ημιποσοτική κλίμακα 0-6 (0: απουσία παρασίτων στα 1000 οπτικά πεδία, 1: 1-10 παράσιτα/1000 πεδία, 2: 1-10 παράσιτα/100 πεδία, 3: 1 10 παράσιτα/10 πεδία, 4: 1-10 παράσιτα/πεδίο, 5: παράσιτα/πεδίο και 6: >100 παράσιτα/πεδίο). Η μικροσκοπική εξέταση του οπού του λεμφογαγγλίου έγινε σε όλες τις ομάδες τις μελέτης (Μ, Λ1 και Λ2) (Πίνακας 6, 7). 3.6 Ορολογική εξέταση με την τεχνική του έμμεσου ανοσοφθορισμού (IFA) για την ανίχνευση αντισωμάτων κατά της L. infantum. Ο τίτλος των ειδικών κατά της L.infantum IgG αντισωμάτων προσδιοριζόταν στο ορό του αίματος με την τεχνική του έμμεσου ανοσοφθορισμού (IFA) (Shaw και Voller 1964). Αναλυτικότερα, σε ειδική αντικειμενοφόρο πλάκα τοποθετούνταν 10μl εναιωρήματος αντιγόνου του παρασίτου, που παρέμενε σε θερμοκρασία δωματίου για αρκετές ώρες, 63

70 ώστε να προσκολληθεί σταθερά. Κάθε δείγμα ορού αραιωνόταν διαδοχικά με ρυθμιστικό διάλυμα φυσιολογικού ορού (PBS Bioline) με αρχική την 1:50 και τελική την 1:3200. Ακολουθούσε επώαση σε κλίβανο με αυξημένη σχετική υγρασία στους 37 ο C για 30 min και έκπλυση με διπλή εμβάπτιση σε PBS για πέντε min κάθε φορά και στέγνωμα σε θερμοκρασία δωματίου αφού είχε προηγηθεί μία τελευταία έκπλυση με δισαπεσταγμένο νερό. Στην συνέχεια τοποθετούνταν 20μl (1/32) συζεύγματος (Αnti-dog IgG-FITC, Sigma) με PBS και η επανάληψη της προαναφερθείσας διαδικασίας. Τέλος, κάθε παρασκεύασμα καλυπτόταν με γλυκερίνη και ειδικές καλυπτρίδες και εξετάζοταν σε μικροσκόπιο υπεριώδους ακτινοβολίας (x 400) μέσα σε σκοτεινό θάλαμο. Τον τίτλο του κάθε δείγματος, καθόριζε η μεγαλύτερη αραίωση στην οποία το αντιγόνο παρουσίαζε σαφή φθορισμό, η θετικότητα του οποίου, για το εργαστήριο που πραγματοποιήθηκαν οι ορολογικές εξετάσεις, έχει οριστεί να είναι ίση ή μεγαλύτερη του 1:200. Για την επιβεβαίωση του σωστού αποτελέσματος της ορολογικής εξέτασης (IFA) το ίδιο δείγμα εξεταζόταν ταυτόχρονα και με την ανοσοχρωματογραφική τεχνική (Snap test, IDEXX) (Gottstein και συν 1998) (Πίνακες 6,7). 3.7 nested-pcr σε οπό λεμφογαγγλίου Το προϊόν παρακέντησης του ιγνυακού λεμφογαγγλίου με την τεχνική FNA αραιωνόταν με μικρή ποσότητα φυσιολογικού ορού προκειμένου να ανιχνευθεί το DNA της L.infantum με την nested-pcr. Τα δείγματα διατηρούνταν στην κατάψυξη (-20 ο C) μέχρι να εξεταστούν, ενώ η συγκεκριμένη PCR γινόταν στο Εργαστήριο Παρασιτολογίας, Εντομολογίας και Τροπικών Νοσημάτων της Εθνικής Σχολής Δημόσιας Υγείας (Αθήνα) σύμφωνα με την αξιολογημένη μεθοδολογία (Spanakos και συν 2002). Το κάθε δείγμα πέπτοταν με 500μg πρωτεϊνάσης Κ σε ρυθμιστικό διάλυμα PCR (50Mμ KCL, 20Mm Tris-Cl ph 8,3, 2,5Mm Mgcl2, 0,5 Tween 20), και επωαζόταν στη συνέχεια στους 56 ο C για να επανενεργοποιηθεί η πρωτεϊνάση Κ, ύστερα από θέρμανση στους 95 ο C για 10 min. Ακολουθούσε η φυγοκέντρηση του διαλύματος στις 10000g για ένα min και η εκχύλιση του υπερκείμενου υγρού με phenol-chloroform-isoamylalcochol 25:24:1. Ως εκκινητές χρησιμοποιήθηκαν οι Lei 70L 5- CGAACCTCGGTTCGGTGTG-3 και Lei70R 5- CGCGGTGCTGGACACAGGGTA-3 σε τελικό όγκο 100μl που περιείχε ειδικό ρυθμιστικό διάλυμα PCR που αποτελούνταν από 1,5Mm MgCl2, 0,2 Μμ από κάθε δεοξυνουκλεοτίδιο 3U Taq-DNA polymerase και 100 pm από κάθε εκκινητή. Στη 64

71 συνέχεια το δείγμα, μαζί με το θετικό και αρνητικό μάρτυρα, τοποθετούνταν σε ηλεκτρονικό θερμοκυκλοποιητή, για να θερμανθεί διαδοχικά στους 94 ο C για ένα min, στους 72 o C για 1,5 min και στους 72 o C για 10 min. Το προϊόν διαχωριζόταν σε γέλη αγαρόζης 2 που περιείχε 0,5 μg/ml βρωμιούχου εθιδίου για την απεικόνιση του τμήματος αντιγραφής με τη βοήθεια της υπεριώδους ακτινοβολίας. Θετικό θεωρούνταν το δείγμα που είχε το ίδιο μοριακό μέγεθος με εκείνο του θετικού μάρτυρα (Πίνακες 6,7). Όλοι οι σκύλοι της ομάδας Μ ήταν αρνητικοί για τη L.infantum με την PCR από οπό λεμφογαγγλίου. 3.8 Ορολογικές εξετάσεις για την ανίχνευση άλλων μικροοργανισμών που θα μπορούσαν να συνυπάρχουν με την L.infantum Όλοι οι σκύλοι εξετάστηκαν ορολογικά για την E.canis με την τεχνική της ΙFA (Ristic και συν 1972). Στους ορούς γίνονταν οι αραιώσεις 1/50 και 1/100, με το αποτέλεσμα να θεωρείται θετικό όταν διακρινόταν σαφής φθορισμός στην αραίωση 1/100, αν και όσοι σκύλοι βρέθηκαν θετικοί στην αραίωση 1/50 αποκλείστηκαν από τη μελέτη. Η ίδια τεχνική, αλλά με άλλα αντιγόνα, εφαρμόστηκε και στον ορολογικό έλεγχο των σκύλων για B.canis. Η πιθανή μόλυνση από την Dirofilaria immitis ελέγχθηκε με την εμπορική ανοσοενζυμική τεχνική ELISA (Witness, Dirofilaria, Synbiotics) (McTier 1994). Επισημαίνεται ότι κανένας σκύλος της μελέτης αυτής δε βρέθηκε ορολογικά θετικός στην E. canis, τη B. canis ή την D. immitis. Επιπλέον, όταν κάποιο ζώο παρουσίαζε συμπτώματα ή/και εργαστηριακές διαταραχές που παρέπεμπαν σε άλλη πάθηση αποκλειόταν από την μελέτη. 65

72 Πίνακας 6: Αποτελέσματα ορολογικών και μοριακών εξετάσεων στoυς σκύλους της ομάδας Λ1 (ασυμπτωματικοί) α/α IFA Snap test Κυτταρολογική από οπό λεμφογαγγλίου nested PCR από οπό λεμφογαγγλίου Λ Λ Λ Λ Λ Λ Λ Λ Λ Λ Λ Λ Λ Λ Λ Λ Λ Λ Λ Λ Όριο τιμής διαχωρισμού, cut off value of titer : θετικό αποτέλεσμα 66

73 Πίνακας 7: Αποτελέσματα των ορολογικών, μοριακών και κυτταρολογικών εξετάσεων στους σκύλους της ομάδας Λ2 (συμπτωματικοί σκύλοι) α/α Τίτλος IFA Snap test Λ Λ Λ Λ Λ Λ Λ Λ2.8* Λ2.9* Λ2.10* Λ2.11* Λ2.12* Λ Λ Λ Λ Λ Λ Λ Λ Κυτταρολογική από οπό λεμφογαγγλίου nested PCR από οπό λεμφογαγγλίου * Σκύλοι της ομάδας Λ3 στους οποίους έγινε 30ήμερη αντιλεϊσμανιακή θεραπεία με μιλτεφοσίνη και αλλοπουρινόλη από το στόμα 67

74 4. Καλλιέργεια, ανοσοδιέγερση των CD4+ και CD8+ λεμφοκυττάρων και σήμανση των ενδοκυττάριων κυτταροκινών IL-4 και IFN-γ σ αυτά. Από κάθε σκύλο λαμβάνοταν δείγμα 10 ml αίματος χωρίς την προσθήκη αντιπηκτικού, με βελόνα 21G και 2.5 cm (Terumo, Belgium) και ειδική σύριγγα σωληνάριο (S-Monovette, Sarstedt, Germany). Από 4 ml του δείγματος αυτού μεταγγιζόταν αμέσως σε δύο φιαλίδια με ηπαρίνη λιθίου ως αντιπηκτικό και μεταφέρονταν στο Εργαστήριο Κυτταρομετρίας Ροής της Εθνικής Σχολής Δημόσιας Υγείας (Αθήνα) μέσα στις επόμενες 1 μέχρι 3 ώρες για παραπέρα επεξεργασία. Από κάθε δείγμα αίματος 0,5 ml προστίθονταν σε δύο ξεχωριστά πλαστικά σωληνάρια των 5 ml από πολυστυρένιο με στρόγγυλο πυθμένα και αεριζόμενο πώμα (σωληνάρια Α και Β), (Greiner Labortechnik, Gloucestershire, UK) μαζί με 0,5 ml του καλλιεργητικού υποστρώματος RPΜI 1640 (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD, USA) χωρίς να προστεθεί οτιδήποτε άλλο. Στα σωληνάρια Α περιέχονταν τα λεμφοκύτταρα που θα παρέμεναν σε φάση ηρεμίας. Στα σωληνάρια της ομάδας Β περιέχονταν εκείνα που θα υφίσταντο την in vitro ανοσοδιέγερση. Στα σωληνάρια Α προστίθονταν 3 μl monensin στη συγκέντρωση των 3 μmol/l. Η μη ειδική ανοσοδιέγερση των λεμφοκυττάρων γινόταν με τον παρακάτω τρόπο: Για τον προσδιορισμό της ενδοκυττάριας IFN-γ στα CD4+ T-λεμφοκύτταρα Σε κάθε σωληνάριο Β προστίθονταν από 3 μl phorbol-12-myristate-13-acetate ή PMA (Applichem, Darmstadt, Germany) στη συγκέντρωση των 10 ng/ml, 3 μl ιονομυκίνης στα 5 μmol/l (Applichem, Darmstadt, Germany) και 3 μl μονενσίνης στα 3 μmol/l (Sewell και συν 1997, Papadogiannakis και συν 2009). Για τον προσδιορισμό της ενδοκυττάριας IL-4 στα CD4+ T-λεμφοκύτταρα Σε κάθε Β σωληνάριο προστίθονταν από 3 μl PMA στη συγκέντρωση των 5 ng/ml, 3 μl ιονομυκίνης 2 μmol/l (Applichem, Darmstadt, Germany) και 3 μl μονενσίνης στα 3 μmol/l (Sewell και συν 1997, Papadogiannakis και συν 2009). 68

75 Για τον προσδιορισμό της ενδοκυττάριας IFN-γ στα CD8+Τ-λεμφοκύτταρα Σε κάθε Β σωληνάριο προστίθονταν από 3 μl PMA στη συγκέντρωση των 5 ng/ml, 3 μl ιονομυκίνης στα 5 μmol/l (Applichem, Darmstadt, Germany) και 3 μl μονενσίνης στα 3 μmol/l l (Sewell και συν 1997, Papadogiannakis και συν 2009). Για τον προσδιορισμό της ενδοκυττάριας IL-4 στα CD8+ T-λεμφοκύτταρα Σε κάθε Β σωληνάριο προστίθονταν από 3 μl PMA στη συγκέντρωση των 5 ng/ml, 3 μl ιονομυκίνης στο 1 μmol/l (Applichem, Darmstadt, Germany) και 3 μl μονενσίνης στα 3 μmol/l (Sewell και συν 1997, Papadogiannakis και συν 2009). Η ειδική ανοσοδιέγερση των λεμφοκυττάρων γίνονταν με τον παρακάτω τρόπο: Σε κάθε Β σωληνάριο προστίθονταν από 3 μl του Leishmania Soluble Antigen (LSA) στη συγκέντρωση των 10 μg/ml (Ινστιτούτο Pasteaur Αθηνών)(Sewell και συν 1997, Papadogiannakis και συν 2009). Στην ειδική διέγερση και προκειμένου να ανιχνευθεί η ενδοκυττάρια IFN-γ (CD4+ και CD8+ κύτταρα) και η ενδοκυττάρια IL-4 (CD4+ κύτταρα), τα σωληνάρια επωάζονταν για 6 ώρες στους 37 ο C και ατμόσφαιρα 5 CO 2. Στις ίδιες συνθήκες αλλά για 4 ώρες επωάζονταν τα σωληνάρια προκειμένου να ανιχνευθεί η ενδοκυττάρια IL-4 στα CD8+ λεμφοκύτταρα. Για την ειδική διέγερση με το LSA και σε κάθε περίπτωση, η επώαση διαρκούσε 6 ώρες, στις ίδιες με τις παραπάνω συνθήκες (Sewell και συν 1997, Papadogiannakis και συν 2009). Μετά την επώαση, λαμβάνονταν 100 μl από κάθε Α ή Β σωληνάριο και μεταφέρονταν σε 6 άλλα σωληνάρια. Αμέσως μετά προστίθονταν 20 μl από τα μονοκλωνικά αντισώματα επιφανείας των λεμφοκυττάρων του σκύλου και των ισοτυπικών μαρτύρων, (Rat anticanine CD4:FITC, Rat anticanine CD8:FITC, Rat IgG2α:FITC negative control, Rat IgG1:FITC negative control και mouse IgG1 anti-human CD69:RPE positive control), που επωάζονταν σε 69

76 θερμοκρασία περιβάλλοντος για 15 min. Τα λεμφοκύτταρα μονιμοποιούνταν με την προσθήκη 100μl σε κάθε σωληνάριο Leucoperm TM Reagent A (Cat. No. BUF09, Serotec, UK) και επωάζονταν για 15 min, για να ξεπλυθούν στη συνέχεια δύο φορές με PBS (2 ml) που περιήχε 0.1 sodium azide και 1 BSA σε 300g. Ακολουθούσε η προσθήκη 100μl Leucoperm TM Reagent B (Serotec, UK) και 20 μl από τα μονοκλωνικά κατά της IFN-γ (mouse IgG1:RPE) και της IL-4 (mouse IgG2a:RPE) αντισώματα (συγκεντρώσεις 100μg/ml) και η επώαση σε θερμοκρασία περιβάλλοντος για 20 min. Κατόπιν, τα λεμφοκύτταρα ξεπλένονταν δύο φορές με PBS (2ml) που περιήχε 0.1 αζίδιο του νατρίου (sodium azide) και 1 BSA σε 300g μονιμοποιούνταν και αραιώνονταν με διάλυμα φορμαλδεϋδης 8 (Beckman Coulter, Marseille, Cedex, France) προκειμένου να καταμετρηθούν στο κυτταρόμετρο ροής τύπου Coulter Epics XL-MCL τεσσάρων χρωμάτων, με τη βοήθεια ειδικού προγράμματος του ηλεκτρονικού υπολογιστή, που είναι ενσωματωμένος στο κυτταρόμετρο (Sewell και συν 1997, Papadogiannakis και συν 2009). H παραπάνω επεξεργασία των δειγμάτων γίνοταν σε σκοτεινό χώρο, και σε θερμοκρασία δωματίου, ενώ αυτά που δεν χρησιμοποιούταν αμέσως, αποθηκεύονταν σε διάλυμα παραφορμαλδεύδης 0,5 (500μl) στους 4ºC μέχρι να καταμετρηθούν μέσα στις επόμενες 24h. Αναλυτικότερα, τα μονοκλωνικά αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη αυτή ήταν τα παρακάτω: Rat anticanine CD8:FITC, Subclass IgG1, Cat. Number MCA 1039F, Serotec, U.K Rat anticanine CD4:FITC, Subclass IgG2a, Cat. Number MCA 1038F, Serotec, U.K Mouse anti-bovine IL-4:RPE, Clone CC303, Subclass IgG2a, Cat. Number MCA 1820PE, Serotec, U.K. ( Pedersen και συν 2002) Mouse anti-bovine IFN-γ:RPE, Clone CC302, Subclass IgG1, Cat. Number MCA 1783PE, Serotec, U.K. (Collins και συν 1999) Rat IgG2α negative control:fitc Rat IgG1 negative control:fitc 70

77 Mouse IgG1 negative control:fitc, Cat. Number MCA 928F, Serotec, U.K. Mouse IgG2a negative control:rpe, Cat. Number MCA 929PE, Serotec, U.K. Mouse IgG1 negative control:rpe, Cat. Number MCA 928PE, Serotec, U.K. Mouse anticanine CD3:FITC, Cat. Number MCA 1774F, Serotec, U.K. Mouse IgG1 antihuman CD69:PE, Cat. Number IM 1943, Beckman Coulter, U.S.A 5. Κυτταρομετρία ροής και αξιολόγηση του αποτελέσματος H κυτταρομετρία ροής, για την οποία χρησιμοποιήθηκε το κυτταρόμετρο ροής Coulter Epics-XL-MCL τεσσάρων χρωμάτων, υπέστη μικρές τροποποιήσεις για τις ανάγκες της μελέτης. Για τα αποθηκεύσιμα δεδομένα (Listmode data) στις μετρήσεις χρησιμοποιήθηκε δείγμα αίματος που πάρθηκε από φυσιολογικό σκύλο και εξετάστηκε αμέσως, ύστερα από την απαραίτητη κατεργασία. Συγκεκριμένα, σε 100μl ολικού αίματος προστίθονταν τα μονοκλωνικά αντισώματα CD3, CD4 και CD8 σε αραίωση 1:100. Ακολουθούσε επώαση στους 25 0 C σε σκοτεινό θάλαμο για λεπτά. Στη συνέχεια λύνονταν τα ερυθρά αιμοσφαίρια με διάλυμα Immunoprep A, B και C (Beckman Coulter, U.S.A) προσθέτοντας 600, 265 και 100μl αντίστοιχα, χωρίς αντιστάθμιση χρώματος. Η τελευταία εφαρμόστηκε στα Listmode data χρησιμοποιώντας το Color Compensation Toolbox μέσα στο πρόγραμμα WinList Version 3.0 για ανάλυση κυτταρομετρίας ροής (Verity, Topsham, ME, USA). Η καταμέτρηση των CD4+ IFN-γ+ και CD4+IL-4+ όπως εξάλλου και των CD8+IFNγ+ και CD8+IL-4+ λεμφοκυττάρων απαιτούσε τη χάραξη της περιοχής D2 του τεταρτομοριοποιημένου στικτογράμματος (Σχήματα 3 και 4). 71

78 Σχήμα 3: Στικτόγραμμα (dot plot) χωρισμένο σε τεταρτημόρια για την καταμέτρηση των CD8+IL4+ Τ-λεμφοκυττάρων Περιοχή D1: CD8-IL4+ Περιοχή D2: CD8+IL4+, 2,7 Περιοχή D3: κυτταρικά υπολείματα (debris) Περιοχή D4: CD8+IL-4- Συνολικός αριθμός CD8+ : D2 + D4= 2,7 + 18,8= 21,5 72

79 Σχήμα 4: Στικτόγραμμα (dot plot) χωρισμένο σε τεταρτημόρια για την καταμέτρηση των CD8+INF-γ+ Τ-λεμφοκυττάρων Περιοχή D1: CD8-IFN-γ+ Περιοχή D2: CD8+IFN-γ+, 1,4 Περιοχή D3: κυτταρικά υπολείματα Περιοχή D4: CD8+IFN-γ- Συνολικός αριθμός CD8+: D2 + D4= 1,4 + 20,3=21,7 73

80 Οι περιοχές χάραξης (gating) ιχνογραφήθηκαν γύρω από ζωντανά κύτταρα έχοντας ως βάση τον πρόσθιο (FSC) και τον πλάγιο (SSC) σκεδασμό, για να αποκλειστεί η καταμέτρηση των κυτταρικών υπολειμμάτων (debris). Για την ανίχνευση του φωτός που σκεδάζεται από τα κύτταρα, στοιχειοθετήθηκαν και τα σήματα FL-1 (FITC) και FL-2 (PE) από τον ανιχνευτή πλάγιου σκεδασμού. Για κάθε δείγμα, συνολικός αριθμός μετρήσεων εντάχθηκε στις περιοχές των μικρών λεμφοκυττάρων του στικτογράμματος, ώστε να διαφαίνεται ο πρόσθιος και ο πλάγιος σκεδασμός τους. Η σχετική πυκνότητα φθορισμού των λεμφοκυττάρων αναλύθηκε σε λογαριθμική κλίμακα, επειδή η κυτταρική διαπερατότητα θα μπορούσε να καταλήξει σε μη ειδική χρώση (Prussin and Metcalfe 1995). Ως αρνητικοί μάρτυρες χρησιμοποιήθηκαν ισοτυπικά μονοκλωνικά αντισώματα και συγκεκριμένα τα Rat IgG2α FITC, Rat IgG2α RPE, Mouse IgG1 FITC, Mouse IgG2a FITC και Mouse IgG1 RPE. Η παραπάνω καταμέτρηση γίνονταν όχι μόνο στα ανοσοδιεγερμένα (PMA/iono ή LSA) αλλά και στα λεμφοκύτταρα που βρισκόταν σε ηρεμία. Τα θετικά στις κυτταροκίνες IFN-γ και IL-4 CD4+ ή CD8+ Τ-λεμφοκύτταρα μετρήθηκαν με βάση περιοχές που προκαθορίστηκαν να έχουν τα χαμηλότερα όρια θετικότητας για τις κυτταροκίνες αυτές και χωρίς να έχει προηγηθεί ανοσοδιέγερση.τα αποτελέσματα εκφράζονταν ως το εκατοστιαίο ποσοστό () των θετικών για κάθε κυτταροκίνη (IFN-γ, IL-4) CD4+ ή CD8+ λεμφοκυττάρων, μέσα στην περιοχή χάραξής τους. Το αντιγόνο επιφανείας CD69 με το οποίο προσδιορίζεται η πρόωρη ενεργοποίηση των κυττάρων, μετρήθηκε επίσης πάνω σε μονιμοποιημένα και διαπερατά λεμφοκύτταρα, για τον προσδιορισμό του βαθμού ενεργοποίησης των CD4+ και CD8+ κυττάρων με τη χρησιμοποίηση ειδικού μονοκλωνικού αντισώματος ανθρώπινης προέλευσης (Mouse IgG1 antihuman CD69:PE). 74

81 6. Στατιστική ανάλυση Oι παράμετροι που συγκρίθηκαν μεταξύ τους ήταν οι λεμφοκυτταρικοί υποπληθυσμοί CD4+, CD8+ και ο μεταξύ τους λόγος, καθώς και οι ενδοκυττάριες κυτταροκίνες CD4+IL-4+, CD8+IL-4+, CD4+IFN-γ+, CD8+IFN-γ+ στις ομάδες Μ, Λ1 και Λ2 σε φάση ηρεμίας και ύστερα από μη ειδική (PMA/iono) και ειδική (LSA) ανοσοδιέγερση. Οι ίδιες παράμετροι συγκρίθηκαν και στην ομάδα Λ3, πριν και μετά την από το στόμα αντιλεϊσμανιακή θεραπεία με μιλτεφοσίνη και αλλοπουρινόλη για 30 ημέρες. Μέθοδος ανάλυσης: Πέραν της περιγραφής των δεδομένων, ως μέθοδος στατιστικής ανάλυσης, χρησιμοποιήθηκε αρχικά αυτή του Kolmogorov-Smirnov-test για τον έλεγχο της κανονικότητας των κατανομών των υπό ανάλυση μεταβλητών, όπου ανάλογα του αποτελέσματος του ελέγχου επιλέγεται και η κατάλληλη στατιστική μέθοδο ανάλυσης (Κτενάς 1999). Από τον συνολικό έλεγχο των μεταβλητών βρέθηκε η κατανομή τους να είναι κανονική, με εξαίρεση ελαχίστων περιπτώσεων, με αποτέλεσμα να χρησιμοποιηθούν στη συνέχεια δύο μέθοδοι ανάλυσης (παραμετρικοί και μη παραμετρικοί έλεγχοι). Στις περιπτώσεις που οι κατανομές των μεταβλητών βρέθηκαν να κατανέμονται κανονικά, ως μέθοδο στατιστικής ανάλυσης χρησιμοποιήθηκε η ανάλυση διακύμανσης (Κτενάς 2003) (παραμετρική μέθοδος) για πιθανές διαφοροποιήσεις των υπό μέτρηση δεδομένων μεταξύ των διαφόρων κατηγοριών. Στις περιπτώσεις που οι κατανομές δεν ήταν κανονικές, εφαρμόστηκε ο αντίστοιχος έλεγχος κατά Kruskall Walis (Κτενάς 2003) (μη παραμετρική μέθοδος), για το ερώτημα περί διαφοροποίησης των κατηγοριών του υπό μέτρηση χαρακτηριστικού. Στην περίπτωση που το μέγεθος του δείγματος ήταν αρκετά μικρό, χρησιμοποιήθηκε το Wilcoxon Signed Ranks test (Κτενάς 2003), όπως στην περίπτωση των μετρήσεων που αφορούσαν τους σκύλους της ομάδας Λ3, πριν και μετά την από το στόμα αντιλεϊσμανιακή θεραπεία με μιλτεφοσίνη και αλλοπουρινόλη. Ακόμη χρησιμοποιήθηκε η ανάλυση διακύμανσης με επαναλαμβανόμενες μετρήσεις (παραμετρική μέθοδος αλλά με εξαρτημένες παρατηρήσεις), στην περίπτωση που οι κατανομές ήταν κανονικές. Τέλος χρησιμοποιήθηκε και η ανάλυση συσχέτισης, ποσοτικών μεταβλητών για τη διαπίστωση του πόσο δυνατά συνδέονται μεταξύ τους (αρνητικά ή θετικά) οι υπό ανάλυση μεταβλητές (Kτενάς 2003). 75

82 Σε όλες τις συγκρίσεις το επίπεδο σημαντικότητας που υιοθετήθηκε ήταν το 5 (P 0,05) 76

83 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 1. Μέτρηση των CD4+, CD8+ T-λεμφοκυττάρων και υπολογισμός του λόγου CD4+/CD8+ στο περιφερικό αίμα Στην ομάδα Μ και χωρίς να έχει προηγηθεί ανοσοδιέγερση (φάση ηρεμίας), των κλινικά υγιών αυτών σκύλων, το ποσοστό των CD4+ λεμφοκυττάρων κυμάνθηκε από 28,8 μέχρι 49,4 (μ.ο 40,2), και των CD8+ από 12,5 μέχρι 22,9 (μ.ο 17,1), με το λόγο CD4+/CD8+ να είναι 2,4. Ύστερα από την in vitro μη ειδική ανοσοδιέγερση με ΡΜΑ/iono το ποσοστό των CD4+ κυμάνθηκε από 27,5 μέχρι 47 (μ.ο 36,5) και των CD8+ από 8,5 μέχρι 22 (μ.ο 13,3 ), ενώ ο λόγος τους ήταν 2,7. Στην ειδική ανοσοδιέγερση με LSA το ποσοστό των CD4+ κυμάνθηκε από 28,5 μέχρι 47 (μ.ο 38,3), ενώ των CD8+ από 11,7 μέχρι 25 (μ.ο 17,1) με το λόγο τους να είναι 2,3 (Πίνακας 8, Διαγράμματα 1, 2 και 3, Πίνακες Παραρτήματος 1, 2 και 3). Πίνακας 8: Eκατοστιαία αναλογία () των CD4+ και CD8+ λεμφοκυττάρων και ο μεταξύ τους λόγος, χωρίς ή ύστερα από τη μη ειδική (PMA/iono) και ειδική (LSA) in vitro ανοσοδιέγερση, στους σκύλους της ομάδας των μαρτύρων (ομάδα Μ). Σκύλοι ομάδας Μ CD4+ () CD8+ () CD4+/CD8+ n=20 μ.ο-εύρος τιμών μ.ο-εύρος τιμών Xωρίς ανοσοδιέγερση (φάση ηρεμίας) 40,2 (28,8-49,4) 17,1(12,5-22,9) 2,4 Ανοσοδιέγερση με PMA / iono 36,5 (27,5-47) 13,3 (8,5-22) 2,7 Ανοσοδιέγερση με LSA 38,3 (28,5-47) 17,1 (11,7-25) 2,3 *Επισημαίνεται ότι κάθε τιμή εκφράζει το μέσο όρο τεσσάρων μετρήσεων όλων των προσδιορισθέντων παραμέτρων της μελέτης 77

84 Στους ασυμπτωματικούς (ομάδα Λ1), αλλά οροθετικούς στη L.infantum σκύλους, το ποσοστό των CD4+ Τ-λεμφοκυττάρων στη φάση ηρεμίας κυμάνθηκε από 22,3 μέχρι 49,9 (μ.ο 41), ενώ στα CD8+ από 11,6 μέχρι 24,3 (μ.ο 19,1) με το λόγο τους να είναι 2,15. Ύστερα από μη ειδική διέγερση με ΡΜΑ/iono το ποσοστό των CD4+ κυμάνθηκε από 29,9 μέχρι 43,2 (μ.ο 34,5) και των CD8+ από 7,3 μέχρι 19,9 (μ.ο 12,5 ενώ ο λόγος ήταν 2,9. Στην ειδική ανοσοδιέγερση με LSA το ποσοστό των CD4+ κυμαινόταν από 22,7 μέχρι 42,2 (μ.ο 36,9) και των CD8+ από 10 μέχρι 19,9 (μ.ο 15,2) με το λόγο τους να είναι 2,5 (Πίνακας 9, Διαγράμματα 1, 2 και 3, Πίνακας Παραρτήματος 4, 5 και 6). Πίνακας 9: Eκατοστιαία αναλογία () των CD4+ και CD8+ λεμφοκυττάρων και ο μεταξύ τους λόγος, χωρίς ή ύστερα από μη ειδική (PMA/iono) και ειδική (LSA) in vitro ανοσοδιέγερση, στην ομάδα των ασυμπτωματικών σκύλων (ομάδα Λ1). Σκύλοι ομάδας Λ1 CD4+ () CD8+ () CD4+/CD8+ n=20 μ.ο-εύρος τιμών μ.ο-εύρος τιμών Χωρίς ανοσοδιέγερση (φάση ηρεμίας) 41 (22,3-49,9) 19,1 (11,6-24,3) 2,15 Ανοσοδιέγερση με PMA / Iono 34,5 (29,9-43,2) 12,5 (7,3-19,9) 2,9 Ανοσοδιέγερση με LSA 36,9 (22,7-42,2) 15,2 (11,6-24,3) 2,5 Στην ομάδα Λ2 των συμπτωματικών σκύλων, το ποσοστό των CD4+ λεμφοκυττάρων σε φάση ηρεμίας κυμάνθηκε από 25,2 μέχρι 40,1 (μ.ο 33,3) και στα CD8+ από 18 μέχρι 32,1 (μ.ο 25) με το λόγο τους να βρίσκεται στο 1,4. Στα ανοσοδιεγερμένα λεμφοκύτταρα με ΡΜΑ/iono το ποσοστό των CD4+ κυμάνθηκε από 21,1 μέχρι 38,8 78

85 (μ.ο 27,7), των CD8+ από 14,3 μέχρι 30,7 (μ.ο 19,6) και ο λόγος τους ήταν 1,4. Στα ανοσοδιεγερμένα με LSA λεμφοκύτταρα οι αντίστοιχες τιμές ήταν από 22,2 μέχρι 37,5 (μ.ο 30,7), 14,7 μέχρι 28,9 (μ.ο 24,4) και ο λόγος ήταν 1,3 (Πίνακας 10, Διαγράμματα 1, 2 και 3, Πίνακας Παραρτήματος 7, 8 και 9). Πίνακας 10: Eκατοστιαία αναλογία () των CD4+ και CD8+ λεμφοκυττάρων και ο μεταξύ τους λόγος, χωρίς ή ύστερα από μη ειδική (PMA/iono) και ειδική (LSA) in vitro ανοσοδιέγερση, στην ομάδα των συμπτωματικών σκύλων (ομάδα Λ2). Σκύλοι ομάδας Λ2 n=20 CD4+() μ.ο-εύρος τιμών CD8+() μ.ο-εύρος τιμών CD4+/CD8+ Χωρίς ανοσοδιέγερση 33,3 (25,2-40,1) 25 (18-32,1) 1,4 (φάση ηρεμίας) Ανοσοδιέγερση με PMA/iono 27,7 (21,1-38,8) 19,6 (14,3-30,7) 1,4 Ανοσοδιέγερση με LSA 30,7 (22,2-37,5) 24,4 (14,7-28,9) 1,3 79

86 , , ,1 19,1 25 CD4+ CD Μ Λ1 Λ2 Διάγραμμα 1: Εκατοστιαία αναλογία () των CD4+ και CD8+ λεμφοκυττάρων του περιφερικού αίματος στη φάση ηρεμίας, στους σκύλους των ομάδων Μ, Λ1, Λ2 80

87 ,5 34, , ,6 CD4 CD ,3 12, Μ Λ1 Λ2 Διάγραμμα 2: Εκατοστιαία αναλογία () των CD4+ και CD8+ λεμφοκυττάρων του περιφερικού αίματος ύστερα από in vitro ανοσοδιέγερση με PMA/iono, στους σκύλους των ομάδων Μ, Λ1, Λ2 81

88 ,3 36, ,1 15,2 30,7 24,4 CD4 CD Μ Λ1 Λ2 Διάγραμμα 3: Εκατοστιαία αναλογία () των CD4+ και CD8+ λεμφοκυττάρων του περιφερικού αίματος ύστερα από in vitro ανοσοδιέγερση με LSA, στους σκύλους των ομάδων Μ, Λ1, Λ2 82

89 Στην ομάδα Μ, το ποσοστό τόσο των CD4+, όσο και των CD8+, σε φάση ηρεμίας ήταν σημαντικά μεγαλύτερο (P=0,001 και P=0,001 αντίστοιχα) από εκείνο μετά από μη ειδική (PMA/iono) ανοσοδιέγερση. Επίσης το ποσοστό των CD4+ σε φάση ηρεμίας ήταν σημαντικά μεγαλύτερο (P=0,02) από εκείνο μετά από την ειδική (LSA) ανοσοδιέγερση. Αυτό δεν παρατηρήθηκε στα CD8+ (P=0,936). Στην ομάδα Λ1, το ποσοστό τόσο των CD4+, όσο και των CD8+, σε φάση ηρεμίας ήταν σημαντικά μεγαλύτερο (P=0,002 και P=0,002 αντίστοιχα) από εκείνο μετά από μη ειδική (PMA/iono) ανοσοδιέγερση. Επίσης το ποσοστό των CD4+ και των CD8+ σε φάση ηρεμίας ήταν σημαντικά μεγαλύτερο (P=0,002 και P= 0,015 αντίστοιχα) από εκείνο μετά από την ειδική (LSA) ανοσοδιέγερση. Στην ομάδα Λ2, το ποσοστό τόσο των CD4+, όσο και των CD8+, σε φάση ηρεμίας ήταν σημαντικά μεγαλύτερο (P=0,001 και P=0,002 αντίστοιχα) από εκείνο μετά από μη ειδική (PMA/iono) ανοσοδιέγερση. Επίσης το ποσοστό των CD4+ σε φάση ηρεμίας ήταν σημαντικά μεγαλύτερο (P=0,01) από εκείνο μετά από την ειδική (LSA) ανοσοδιέγερση. Αυτό δεν παρατηρήθηκε στα CD8+ (P=0,196). Από τις συγκρίσεις που έγιναν μεταξύ των τριών αυτών ομάδων (Μ, Λ1 και Λ2), προέκυψε ότι το ποσοστό των CD4+ Τ-λεμφοκυττάρων στους σκύλους της ομάδας Λ2 ήταν μικρότερο, των CD8+ μεγαλύτερο και ο λόγος των CD4+/CD8+ μικρότερος σε σύγκριση με με εκείνα των σκύλων τόσο της ομάδας Μ, όσο και της ομάδας Λ1 και στις τρεις πειραματικές συνθήκες. Μεταξύ των ομάδων Μ και Λ1 δεν παρατηρήθηκαν ουσιαστικές διαφορές, με μόνη εξαίρεση τα CD8+ σε φάση ηρεμίας (Πίνακας 11, 12 και 13). Πίνακας 11: Αποτελέσματα της στατιστικής ανάλυσης των συγκρίσεων μεταξύ του ποσοστού των CD4+, CD8+ και του λόγου CD4+/CD8+ στο περιφερικό αίμα των σκύλων των ομάδων Μ, Λ1 και Λ2 (φάση ηρεμίας) Συγκρίσεις των Ομάδων CD4+ CD8+ CD4+/CD8+ Λ2 με Λ1 Ρ=0,001 Ρ=0,001 Ρ=0,001 Λ2 με Μ Ρ=0,001 Ρ=0,002 Ρ=0,005 Λ1 με Μ Ρ=0,964 Ρ=0,045 Ρ=0,783 83

90 Πίνακας 12: Αποτελέσματα της στατιστικής ανάλυσης των συγκρίσεων μεταξύ του ποσοστού των CD4+, CD8+ και του λόγου CD4+/CD8+ στο περιφερικό αίμα των σκύλων των ομάδων Μ, Λ1 και Λ2 (in vitro ανοσοδιέγερση με PMA/iono) Συγκρίσεις των Ομάδων CD4+ CD8+ CD4+/CD8+ Λ2 με Λ1 Ρ=0,001 Ρ=0,001 Ρ=0,005 Λ2 με Μ Ρ=0,008 Ρ=0,001 Ρ=0,005 Λ1 με Μ Ρ=0,157 Ρ=0,437 Ρ=0,685 Πίνακας 13: Αποτελέσματα της στατιστικής ανάλυσης των συγκρίσεων μεταξύ του ποσοστού των CD4+, CD8+ και του λόγου CD4+/CD8+ στο περιφερικό αίμα των σκύλων των ομάδων Μ, Λ1 και Λ2 (in vitro ανοσοδιέγερση με LSA) Συγκρίσεις των Ομάδων CD4+ CD8+ CD4+/CD8+ Λ2 με Λ1 Ρ=0,005 Ρ=0,001 Ρ=0,001 Λ2 με Μ Ρ=0,001 Ρ=0,001 Ρ=0,001 Λ1 με Μ Ρ=0,295 Ρ=0,081 Ρ=0,201 Στην ομάδα Λ3 και λίγο πριν ξεκινήσει η αντιλεϊσμανιακή θεραπεία, το ποσοστό των CD4+ λεμφοκυττάρων στη φάση ηρεμίας κυμάνθηκε από 28,5 μέχρι 32,3 (μ.ο 30,5) και των CD8+ από 21,4 μέχρι 27,3 (μ.ο 25,7), με τον λόγο τους να βρίσκεται στο 1,18. (Πίνακας Παραρτήματος 10, Διάγραμμα 4). Υστερα από μη ειδική ανοσοδιέγερση με PMA/iono οι αντίστοιχες τιμές ήταν 25,5 μέχρι 27,5 (μ.ο 26,3), 17,3 μέχρι 18,7 (μ.ο. 18) και 1,45 (Πίνακας Παραρτήματος 11, Διάγραμμα 5), ενώ στην ειδική διέγερση με LSA 29,4 μέχρι 30,5 (μ.ο 30), 23,2 μέχρι 27,7 (μ.ο 26,4) και 1,12 (Πίνακας Παραρτήματος 12, Διάγραμμα 6). 84

91 Στην ίδια ομάδα (Λ3) και ύστερα από την 30ήμερη αντιλεϊσμανιακή θεραπεία με μιλτεφοσίνη και αλλοπουρινόλη, το ποσοστό των CD4+ στη φάση της ηρεμίας κυμάνθηκε από 32,2 μέχρι 37,2 (μ.ο 35,2) και των CD8+ από 16,3 μέχρι 19,2 (μ.ο 17,7), με τον λόγο τους να βρίσκεται στο 1,96 (Πίνακας Παραρτήματος 13, Διάγραμμα 4). Υστερα από μη ειδική ανοσοδιέγερση με PMA/iono οι αντίστοιχες τιμές ήταν από 28,4 μέχρι 31,3 (μ.ο 30,1), 14,5 μέχρι 16 (μ.ο. 15,3) και 1,96 (Πίνακας Παραρτήματος 14, Διάγραμμα 5), ενώ στην ειδική διέγερση με LSA από 33,2 μέχρι 36,2 (μ.ο 34,5), 18,9 μέχρι 22,2 (μ.ο 19,9) και 1,75 (Πίνακας Παραρτήματος 15, Διάγραμμα 6). 85

92 ,5 35,2 25, ,7 ΠΡΙΝ ΤΗ ΘΕΡΑΠΕΙΑ ΜΕΤΑ ΤΗ ΘΕΡΑΠΕΙΑ ,18 1,96 CD4+ CD8+ CD4+/CD8+ Διάγραμμα 4: Eκατοστιαία αναλογία () των CD4+ και CD8+ λεμφοκυττάρων του περιφερικού αίματος στη φάση της ηρεμίας και του μεταξύ τους λόγου στους σκύλους της ομάδας Λ3, πριν και μετά την αντιλεϊσμανιακή από το στόμα θεραπεία με μιλτεφοσίνη και αλλοπουρινόλη 86

93 ,3 30, ,3 ΠΡΙΝ ΤΗ ΘΕΡΑΠΕΙΑ ΜΕΤΑ ΤΗ ΘΕΡΑΠΕΙΑ ,45 1,96 CD4+ CD8+ CD4+/CD8+ Διάγραμμα 5: Eκατοστιαία αναλογία () των CD4+ και CD8+ λεμφοκυττάρων του περιφερικού αίματος και του μεταξύ τους λόγου στους σκύλους της ομάδας Λ3, πριν και μετά την αντιλεϊσμανιακή από το στόμα θεραπεία με μιλτεφοσίνη και αλλοπουρινόλη και ύστερα από την in vitro ανοσοδιέγερση με PMA/iono 87

94 ,5 26,4 19,9 ΠΡΙΝ ΤΗ ΘΕΡΑΠΕΙΑ ΜΕΤΑ ΤΗ ΘΕΡΑΠΕΙΑ ,12 1,75 CD4+ CD8+ CD4+/CD8+ Διάγραμμα 6: Eκατοστιαία αναλογία () των CD4+ και CD8+ λεμφοκυττάρων του περιφερικού αίματος και του μεταξύ τους λόγου στους σκύλους της ομάδας Λ3, πριν και μετά την αντιλεϊσμανιακή από το στόμα θεραπεία με μιλτεφοσίνη και αλλοπουρινόλη και ύστερα από την vitro ανοσοδιέγερση με LSA 88

95 Από τις συγκρίσεις που έγιναν στην ομάδα Λ3, διαπιστώθηκε σημαντική μείωση του CD8+ λεμφοκυτταρικού υποπληθυσμού και αύξηση του λόγου CD4+/CD8+, μετά από την 30ήμερη από το στόμα αντιλεϊσμανιακή θεραπεία με μιλτεφοσίνη και αλλοπουρινόλη, σε φάση ηρεμίας και ύστερα από ανοσοδιέγερση με PMA/iono καθώς και LSA. Η παραπάνω θεραπεία φαίνεται ότι επηρέασε και τον υποπληθυσμό των CD4+ λεμφοκυττάρων, που ήταν αυξημένος σημαντικά, όχι όμως τόσο όσο τα CD8+, ανεξάρτητα από το είδος της ανοσοδιέγερσης. (Πίνακας 14). Πίνακας 14: Aποτελέσματα της στατιστικής ανάλυσης των συγκρίσεων μεταξύ του ποσοστού των CD4+ και των CD8+ Τ-λεμφοκυττάρων καθώς και του λόγου CD4+/CD8+, σε φάση ηρεμίας και ύστερα από ανοσοδιέγερση με PMA/iono ή LSA, στο περιφερικό αίμα των σκύλων της ομάδας Λ3, πριν και μετά την 30ήμερη αντιλεϊσμανιακή θεραπεία με μιλτεφοσίνη και αλλοπουρινόλη ΣΥΓΚΡΙΣH των ομάδων Χωρίς ανοσοδιέγερση PMA/iono CD4+ CD8+ CD4+/CD8+ P<0,05 P<0,05 P<0,05 P<0,05 P<0,05 P<0,05 LSA P<0,05 P<0,05 P<0,05 89

96 2. Μέτρηση των θετικών στις ενδοκυττάριες κυτταροκίνες IFN-γ και IL- 4 CD4+ και CD8+ Τ-λεμφοκυττάρων στο περιφερικό αίμα των σκύλων 2.α Στους σκύλους της ομάδας των μαρτύρων (ομάδα Μ) και χωρίς να προηγηθεί ανοσοδιέγερση (φάση ηρεμίας), το ποσοστό των CD4+IL4+ λεμφοκυττάρων κυμάνθηκε από 0,2 μέχρι 0,78 (μ.ο 0,49) και των CD8+IL4+ από 0,15 μέχρι 1,36 (μ.ο 0,78). Ύστερα από τη μη ειδική ανοσοδιέγερση με ΡΜΑ/iono το ποσοστό των CD4+IL4+ λεμφοκυττάρων κυμάνθηκε από 0,27 μέχρι 1,3 (μ.ο 0,68) και των CD8+IL-4+ από 0,54 μέχρι 1,31 (μ.ο 0,84). Στην ειδική ανοσοδιέγερση με LSA το ποσοστό των CD4+IL4+ λεμφοκυττάρων κυμάνθηκε από 0,29 μέχρι 0,81 (μ.ο 0,58), ενώ εκείνο των CD8+IL4+ από 0,27 μέχρι 1,5 (μ.ο 0,63) (Πίνακας 15, Πίνακες Παραρτήματος 1, 2, 3 και 17). Στις CD4+IL4+ συγκρίσεις μεταξύ των ανοσοδιεγερμένων κυττάρων με μη ειδικό (P=0,027) ή ειδικό τρόπο (P=0,011) και των λεμφοκυττάρων σε φάση ηρεμίας, σημαντική διαφορά διαπιστώθηκε υπέρ των πρώτων. Η διαφορά ήταν όμως σημαντική και στη σύγκριση μεταξύ των CD8+IL-4+ λεμφοκυττάρων με την ανοσοδιέγερση με PMA/iono να υπερτερεί έναντι εκείνης με LSA (P=0,048) (Πίνακες 23, 24, Διαγράμματα 9, 10). Το ποσοστό των CD4+IFN-γ+ λεμφοκυττάρων στη φάση ηρεμίας κυμάνθηκε από 0,3 μέχρι 1,55 (μ.ο 0,76), και των CD8+IFNγ+ από 0,53 μέχρι 1,45 (μ.ο 0,92). Στα ανοσοδιεγερμένα με ΡΜΑ/iono λεμφοκύτταρα το ποσοστό των CD4+IFN-γ+ κυμάνθηκε από 0,91 μέχρι 4,15 (μ.ο 2,23) και των CD8+IFN-γ+ από 0,85 μέχρι 3,77 (μ.ο 1,77), ενώ στην ειδική ανοσοδιέγερση με LSA οι αντίστοιχες τιμές ήταν από 0,26 μέχρι 1,03 (μ.ο 0,58) και από 0,35 μέχρι 1,12 (μ.ο 0,6) (Πίνακας 15, Πίνακες Παραρτήματος 1, 2, 3 και 16) Η διαφορά τόσο μεταξύ των CD4+IFN-γ+ (P=0,001), όσο και μεταξύ των CD8+IFNγ+ (P=0,001) λεμφοκυττάρων ύστερα από ανοσοδιέγερση με LSA ή PMA/iono ήταν σημαντική, με την δεύτερη να υπερτερεί της πρώτης, όπως άλλωστε διαπιστώθηκε και στη σύγκριση μεταξύ της ανοσοδιέγερσης με PMA/iono και της φάσης ηρεμίας (P=0,001) Σημαντική, αλλά αντίστροφα τη φορά αυτή, ήταν η διαφορά μεταξύ της ανοσοδιέγερσης με το LSA και της φάσης της ηρεμίας (Πίνακες 21, 22, Διαγράμματα 7, 8). 90

97 Πίνακας 15: Eκατοστιαία αναλογία () των θετικών στην IL-4 και IFN-γ, CD4+ και CD8+ λεμφοκυττάρων, χωρίς ή ύστερα από μη ειδική (PMA/iono) και ειδική (LSA) in vitro ανοσοδιέγερση στην ομάδα των μαρτύρων (ομάδα Μ). Σκύλοι ομάδας Μ n=20 Χωρίς ανοσοδιέγερση (φάση ηρεμίας) Ανοσοδιέγερση με PMA / iono CD4+IL4+ CD8+IL4+ CD4+IFN-γ+ CD8+IFN-γ+ μ.ο-εύρος τιμών μ.ο-εύρος τιμών μ.ο-εύρος τιμών μ.ο-εύρος τιμών 0,49 (0,2-0,78) 0,78 (1,15-1,36) 0,76 (0,3-1,55) 0,92 (0,53-1,45) 0,68 (0,27-1,3) 0,84 (0,54-1,31) 2,23 (0,91-4,15) 1,77 (0,85-3,77) Ανοσοδιέγερση με LSA 0,58 (0,3-0,81) 0,63 (0,27-1,5) 0,58 (0,26-1,03) 0,6 (0,35-1,12) 2.β Στην ομάδα Λ1 των ασυμπτωματικών αλλά οροθετικών στη L.infantum/chagasi σκύλων, το ποσοστό των CD4+IL4+ λεμφοκυττάρων, χωρίς ανοσοδιέγερση, κυμάνθηκε από 0,18 μέχρι 0,95 (μ.ο 0,52), και των CD8+IL4+ από 0,25 μέχρι 1,43 (μ.ο 0,73). Στα ανοσοδιεγερμένα λεμφοκύτταρα με ΡΜΑ/iono το ποσοστό των CD4+IL4+ κυμάνθηκε από 0,20 μέχρι 1,00 (μ.ο 0,57) και των CD8+ IL4+ από 0,13 μέχρι 1,86 (μ.ο 0,66), ενώ στα ανοσοδιεγερμένα με LSA λεμφοκύτταρα, οι αντίστοιχες τιμές ήταν 0,26 μέχρι 1,21 (μ.ο 0,60), και 0,13 μέχρι 1,55 (μ.ο 0,71) (Πίνακας 16, Πίνακες Παραρτήματος 4, 5, 6 και 19). Σημαντική διαφορά προέκυψε μεταξύ των υπερτερούντων αριθμητικά ανοσοδιεγερμένων CD4+IL-4+ λεμφοκυττάρων με PMA/iono (P=0,001) ή LSA (P=0,002) και των αντίστοιχων που βρίσκονταν στη φάση ηρεμίας. Tο ίδιο παρατηρήθηκε και στην μη ειδική (PMA/iono) των CD8+IL-4+ λεμφοκυττάρων (P=0,029) και την ειδική (LSA) (P=0,019) αλλά σε αντίστροφη σχέση (Πίνακες 23, 24, Διαγράμματα 9,10). Το ποσοστό των CD4+INF-γ+ λεμφοκυττάρων στη φάση της ηρεμίας κυμάνθηκε από 0,31 μέχρι 2,15 (μ.ο 0,89), και των CD8+IFNγ+ από 0,44 μέχρι 1,57 (μ.ο 0,79). Στα ανοσοδιεγερμένα με ΡΜΑ/iono λεμφοκύττρα το ποσοστό των CD4+IFN-γ+ κυμάνθηκε από 1,3 μέχρι 4,47 (μ.ο 2,68) και στα CD8+INF-γ+ από 0,77 μέχρι 91

98 3.99 (μ.ο 2,31), ενώ στα ανοσοδιεγερμένα με LSA οι αντίστοιχες τιμές ήταν από 0,56 μέχρι 2,7 (μ.ο 1,59) και από 0,56 μέχρι 2,74 (μ.ο 1,4) (Πίνακας 16, Πίνακας Παραρτήματος 4, 5, 6 και 18). Σημαντική ήταν η διαφορά κατά την σύγκριση των CD4+IFN-γ+ (P=0,001) ή των CD8+IFN-γ+ (P=0,001) λεμφοκυττάρων στην ανοσοδιέγερση με LSA και PMA/iono, με τη δεύτερη να υπερτερεί της πρώτης. Το ίδιο σημαντική ήταν και η διαφορά στη σύγκριση μεταξύ της ανοσοδιέγερσης PMA/iono (P=0,009 και 0,001 αντίστοιχα) ή LSA (P=0,009 και P=0,002 αντίστοιχα) και της φάσης ηρεμίας, με την πρώτη να υπερτερεί της δεύτερης (Πίνακες 21, 22, Διαγραμμάτα 7, 8). Πίνακας 16: Eκατοστιαία αναλογία () των θετικών στην IL-4 και IFN-γ, CD4+ και CD8+ λεμφοκυττάρων, χωρίς ή ύστερα από μη ειδική (PMA/iono) και ειδική (LSA) in vitro ανοσοδιέγερση στην ομάδα των ασυμπτωματικών σκύλων (ομάδα Λ1). Σκύλοι ομάδας Λ1 n=20 Χωρίς ανοσοδιέγερση (φάση ηρεμίας) Ανοσοδιέγερση με PMA / iono CD4+IL4+ CD8+IL4+ CD4+IFN-γ CD8+IFN-γ+ μ.ο-εύρος τιμών μ.ο-εύρος τιμών μ.ο-εύρος τιμών μ.ο-εύρος τιμών 0,52 (0,18-0,95) 0,73 (025-1,43) 0,89 (0,31-2,15) 0,79 (0,44-1,57) 0,57 (0,2-1) 0,66 (0,13-1,86) 2,68 (1,3-4,47) 2,31 (0,77-3,99) Ανοσοδιέγερση με LSA 0,6 (0,26-1,21) 0,71 (0,13-1,55) 1,59 (0,56-2,7) 1,4 (0,56-2,74) 2.γ Στην ομάδα των συμπτωματικών σκύλων (Ομάδα Λ2) τα CD4+IL4+ λεμφοκύτταρα στη φάση της ηρεμίας κυμάνθηκαν από 0,54 μέχρι 2,34 (μ.ο 1,43 ), και τα CD8+IL4+ από 0,82 μέχρι 6,61 (μ.ο 3,09). Τα ανοσοδιεγερμένα με ΡΜΑ/iono CD4+IL4+ λεμφοκύτταρα κυμάνθηκαν από 0,86 μέχρι 4,51 (μ.ο 2,33) και τα CD8+IL-4+ από 1,03 μέχρι 5,56 (μ.ο 3,65). Τα ανοσοδιεγερμένα με LSA 92

99 CD4+IL4+ λεμφοκύτταρα κυμάνθηκαν από 0,97 μέχρι 8,51 (μ.ο 3,24) και τα CD8+IL4+ από 1,77 μέχρι 9,66 (μ.ο 4,58) (Πίνακας 17, Πίνακες Παραρτήματος 7, 8, 9 και 21). Στη σύγκριση μεταξύ των CD4+IL-4+ λεμφοκυττάρων, ύστερα από ανοσοδιέγερση με LSA και με PMA/iono, διαπιστώθηκε σημαντική διαφορά με την πρώτη να υπερτερεί της δεύτερης (P=0,038). Το ίδιο σημαντική ήταν και η διαφορά μεταξύ των λεμφοκυττάρων σε φάση ηρεμίας και των ανοσοδιεγερμένων λεμφοκυττάρων τόσο με την ειδική (LSA) (P=0,002) όσο και τη μη ειδική (PMA/iono) (P=0,001) ανοσοδιέγερση, με τη δεύτερη να υπερτερεί της πρώτης και στις δύο συγκρίσεις (Πίνακας 23, Διάγραμμα 9) Παρόμοια ήταν και τα αποτελέσματα στις συγκρίσεις μεταξύ ανοσοδιεγερμένων (μη ειδική και ειδική) CD8+IL-4+ λεμφοκυττάρων και εκείνων σε φάση ηρεμίας (P=0,008 και P=0,003 αντίστοιχα). Επίσης το ποσοστό των διεγερμένων με ειδικό τρόπο (LSA) CD8+IL-4+ λεμφοκυττάρων ήταν σημαντικά μεγαλύτερο (P=0,049) από εκείνο των λεμφοκυττάρων που διεγέρθηκαν με μη ειδικό τρόπο (PMA/iono). Επισημαίνεται ότι τα CD8+IL-4+ λεμφοκύτταρα ήταν πολύ περισσότερα από τα CD4+IL-4+ (P=0,025) μετά από ειδική ανοσοδιέγερση με το LSA (Πίνακας 24, Διάγραμμα 10, Σχήμα 5) Τα ποσοστά των CD4+INF-γ+ λεμφοκυττάρων στη φάση ηρεμίας κυμάνθηκαν από 0,68 μέχρι 2,27 (μ.ο 1,62), και των CD8+INFγ+ από 0,51 μέχρι 3,92 (μ.ο 1,92). Στα ανοσοδιεγερμένα με ΡΜΑ/iono λεμφοκύτταρα τα CD4+INF-γ+ κυμάνθηκαν από 2,37 μέχρι 7,94 (μ.ο 3,84) και τα CD8+INF-γ+ από 2,75 μέχρι 8,7 (μ.ο 4,9), ενώ οι αντίστοιχες τιμές στην ανοσοδιέγερση με LSA ήταν 0,85 μέχρι 7,44 (μ.ο 3,37), και 1,67 μέχρι 6,66 (μ.ο 4,3 ) (Πίνακας 17, Πίνακες Παραρτήματος 7, 8, 9 και 20). Τόσο στην ανοσοδιέγερση με PMA/iono (P=0,001) όσο και με LSA (P=0,001), τα ανοσοδιεγερμένα CD4+IFN-γ λεμφοκύτταρα υπερτερούσαν σημαντικά των λεμφοκυττάρων σε φάση ηρεμίας (Διάγραμμα 7). Παρόμοια σημαντικότητα διαπιστώθηκε και από τις ανάλογες συγκρίσεις των CD8+IFN-γ+ λεμφοκυττάρων (P=0,001) (Πίνακες 21, 22, Διάγραμμα 8). 93

100 Πίνακας 17: Eκατοστιαία αναλογία () των θετικών στην IL-4 και INF-γ, CD4+ και CD8+ λεμφοκυττάρων, χωρίς ή ύστερα από μη ειδική (PMA/iono) και ειδική (LSA) in vitro ανοσοδιέγερση στην ομάδα των συμπτωματικών σκύλων (ομάδα Λ2). Σκύλοι ομάδας Λ2 n=20 CD4+IL4+ CD8+IL4+ CD4+IFN-γ+ CD8+IFN-γ+ μ.ο-εύρος τιμών μ.ο-εύρος τιμών μ.ο-εύρος τιμών μ.ο-εύρος τιμών Χωρίς ανοσοδιέγερση 1,43 (0,54-2,34) 3,09 (0,82-6,61) 1,62 (0,68-2,27) 1,92 (0,51-3,92) Ανοσοδιέγερση με PMA / iono 2,33 (0,86-4,51) 3,65 (1,03-5,56) 3,84 (2,33-7,94) 4,9 (2,75-8,7) Ανοσοδιέγερση με LSA 3,24 (0,97-8,51) 4,58 (1,77-9,66) 3,37 (0,85-7,44) 4,3 (1,67-6,66) Από τη στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων της παρούσας μελέτης, σε συγκριτική μεταξύ των ομάδων Μ, Λ1, Λ2 βάση προέκυψε ότι μεταξύ των ομάδων Λ2 και Μ και των Λ1 και Λ2 και για όλους τους κυτταρικούς πληθυσμούς που μετρήθηκαν (CD4+IL-4+, CD4+IFN-γ+, CD8+IL-4+, CD8+IFN-γ+) παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά υπέρ των σκύλων της ομάδας Λ2 (συμπτωματικά ζώα), αλλά όχι και μεταξύ των ασυμπτωματικών ζώων (Λ1) και των μαρτύρων (Μ), με εξαίρεση υπέρ των πρώτων, την ειδική με LSA ανοσοδιέγερση στον CD4+ΙΝF-γ+ λεμφοκυτταρικό υποπληθυσμό (Πίνακες 18, 19 και 20). 94

101 Πίνακας 18: Aποτελέσματα της στατιστικής ανάλυσης των συγκρίσεων μεταξύ του ποσοστού των CD4+IL-4+ και IFN-γ+ και των CD8+IL-4+ και IFN-γ+ λεμφοκυττάρων στο περιφερικό αίμα των σκύλων των ομάδων Μ, Λ1 και Λ2 (φάση ηρεμίας) Συγκρίσεις CD4+IL4+ CD4+IFNγ+ CD8+IL4+ CD8+IFNγ+ των ομάδων Λ2 με Λ1 Ρ=0.001 Ρ=0.002 Ρ=0.001 Ρ=0.009 Λ2 με Μ Ρ=0.006 Ρ=0.003 Ρ=0.001 Ρ=0.001 Λ1 με Μ Ρ=0.726 Ρ=0.305 Ρ=0.847 Ρ=0.424 Πίνακας 19: Aποτελέσματα της στατιστικής ανάλυσης των συγκρίσεων μεταξύ του ποσοστού των CD4+IL-4+ και IFN-γ+ και των CD8+IL-4+ και IFN-γ+ λεμφοκυττάρων στο περιφερικό αίμα των σκύλων των ομάδων Μ, Λ1 και Λ2 (in vitro ανοσοδιέγερση με PMA/iono). Συγκρίσεις των ομάδων CD4+IL4+ CD4+IFNγ+ CD8+IL4+ CD8+IFNγ+ Λ2 με Λ1 Ρ=0,001 Ρ=0,002 Ρ=0,001 Ρ=0,0015 Λ2 με Μ Ρ=0,001 Ρ=0,001 Ρ=0,001 Ρ=0,005 Λ1 με Μ Ρ=0,594 Ρ=0,298 Ρ=0,473 Ρ=0,168 95

102 Πίνακας 20: Aποτελέσματα της στατιστικής ανάλυσης των συγκρίσεων μεταξύ του ποσοστού των CD4+IL-4+ και IFN-γ+ και των CD8+IL-4+ και IFN-γ+ λεμφοκυττάρων στο περιφερικό αίμα των σκύλων των ομάδων Μ, Λ1 και Λ2 (in vitro ανοσοδιέγερση με LSA) Συγκρίσεις CD4+IL4+ CD4+IFNγ+ CD8+IL4+ CD8+IFNγ+ των ομάδων Λ2 με Λ1 Ρ=0,001 Ρ=0,001 Ρ=0,002 Ρ=0,007 Λ2 με Μ Ρ=0,001 Ρ=0,002 Ρ=0.001 Ρ=0,0055 Λ1 με Μ Ρ=0,955 Ρ=0,012 Ρ=0,844 Ρ=0,716 Πίνακας 21: Aποτελέσματα της στατιστικής ανάλυσης των συγκρίσεων μεταξύ του ποσοστού των CD4+IFN-γ+ λεμφοκυττάρων στο περιφερικό αίμα των σκύλων των ομάδων Μ, Λ1 και Λ2 σε φάση ηρεμίας και μετά από in vitro ανοσοδιέγερση με PMA/iono και LSA CD4+IFN-γ+ Ομάδα Μ Ομάδα Λ1 Ομάδα Λ2 Μη ανοσοδιεγερμένα-μη ειδική ανοσοδιέγερση (PMA/iono) Μη ανοσοδιεγερμένα-ειδική ανοσοδιέγερση (LSA) Ειδική ανοσοδιέγερση (LSA)-Μη ειδική ανοσοδιέγερση (PMA/iono) P=0,001 P=0,009 P=0,001 P=0,001 P=0,009 P=0,001 P=0,001 P=0,001 P=0,22 96

103 Πίνακας 22: Aποτελέσματα της στατιστικής ανάλυσης των συγκρίσεων μεταξύ του ποσοστού των CD8+IFN-γ+ λεμφοκυττάρων στο περιφερικό αίμα των σκύλων των ομάδων Μ, Λ1 και Λ2 σε φάση ηρεμίας και μετά από in vitro ανοσοδιέγερση με PMA/iono και LSA CD8+IFN-γ+ Ομάδα Μ Ομάδα Λ1 Ομάδα Λ2 Μη ανοσοδιεγερμένα-μη ειδική ανοσοδιέγερση (PMA/iono) Μη ανοσοδιεγερμένα-ειδική ανοσοδιέγερση (LSA) Ειδική διέγερση (LSA)-Μη ειδική ανοσοδιέγερση (PMA/iono) P=0,001 P=0,009 P=0,001 P=0,001 P=0,002 P=0,001 P=0,001 P=0,001 P=0,065 Πίνακας 23: Aποτελέσματα της στατιστικής ανάλυσης των συγκρίσεων μεταξύ του ποσοστού των CD4+IL-4+ λεμφοκυττάρων στο περιφερικό αίμα των σκύλων των ομάδων Μ, Λ1 και Λ2 σε φάση ηρεμίας και μετά από in vitro ανοσοδιέγερση με PMA/iono και LSA CD4+IL-4+ Oμάδα Μ Ομάδα Λ1 Ομάδα Λ2 Μη ανοσοδιεγερμένα-μη ειδική ανοσοδιέγερση (PMA/iono) Μη ανοσοδιεγερμένα-ειδική ανοσοδιέγερση (LSA) Ειδική ανοσοδιέγερση (LSA)-Μη ειδική ανοσοδιέγερση (PMA/iono) P=0,027 P=0,001 P=0,001 P=0,011 P=0,002 P=0,002 P=0,152 P=0,063 P=0,038 97

104 Πίνακας 24: Aποτελέσματα της στατιστικής ανάλυσης των συγκρίσεων μεταξύ του ποσοστού των CD8+IL-4+ λεμφοκυττάρων στο περιφερικό αίμα των σκύλων των ομάδων Μ, Λ1 και Λ2 σε φάση ηρεμίας και μετά από in vitro ανοσοδιέγερση με PMA/iono και LSA CD8+IL-4+ Ομάδα Μ Ομάδα Λ1 Ομάδα Λ2 Μη διεγερμένα-μη ειδική διέγερση (PMA/iono) Μη διεγερμένα-ειδική διέγερση (LSA) Ειδική διέγερση (LSA)-Μη ειδική διέγερση (PMA/iono) P=0,514 P=0,029 P=0,008 P=0,08 P=0,019 P=0,003 P=0,048 P=0,133 P=0,049 98

105 Σχήμα 5: Γράφημα, στο οποίο απεικονίζεται η σημαντική αύξηση της έκκρισης της κυτταροκίνης IL-4 από τα CD8+ λεμφοκύτταρα των συμπτωματικών σκύλων (ομάδα Λ2) μετά από ειδική ανοσοδιέγερση. 99

106 ΜΑΡΤΥΡΕΣ ΑΣΥΜΠΤΩΜΑΤΙΚΟΙ ΣΥΜΤΩΜΑΤΙΚΟΙ CD4+IFN-γ+ 3,84 2,68 3,37 1,62 2,23 0,76 0,89 1,38 0,58 φάση ηρεμίας PMA/iono LSA Διάγραμμα 7: Συγκριτικό ιστόγραμμα του μέσου όρου του ποσοστού των CD4+IFN-γ+ λεμφοκυττάρων στο περιφερικό αίμα των σκύλων των oμάδων Μ, Λ1 και Λ2, πριν και μετά την in vitro ανοσοδιέγερση με PMA/iono ή LSA 100

107 ΜΑΡΤΥΡΕΣ ΑΣΥΜΠΤΩΜΑΤΙΚΟΙ ΣΥΜΤΩΜΑΤΙΚΟΙ 4,9 4,3 CD8+IFN-γ+ 0,92 0,79 1,92 1,77 2,31 1,4 0,6 φάση ηρεμίας PMA/iono LSA Διάγραμμα 8: Συγκριτικό ιστόγραμμα του μέσου όρου του ποσοστού των CD8+IFN-γ+ λεμφοκυττάρων στο περιφερικό αίμα των σκύλων των oμάδων Μ, Λ1 και Λ2, πριν και μετά την in vitro ανοσοδιέγερση με PMA/iono ή LSA 101

108 ΜΑΡΤΥΡΕΣ ΑΣΥΜΠΤΩΜΑΤΙΚΟΙ ΣΥΜΤΩΜΑΤΙΚΟΙ 3,24 CD4+IL4+ 2,33 1,43 0,490,52 0,68 0,58 0,58 0,61 φάση ηρεμίας PMA/iono LSA Διάγραμμα 9: Συγκριτικό ιστόγραμμα του μέσου όρου του ποσοστού των CD4+IL4+ λεμφοκυττάρων στο περιφερικό αίμα των σκύλων των oμάδων Μ, Λ1 και Λ2, πριν και μετά την in vitro ανοσοδιέγερση με PMA/iono ή LSA 102

109 ΜΑΡΤΥΡΕΣ ΑΣΥΜΠΤΩΜΑΤΙΚΟΙ ΣΥΜΤΩΜΑΤΙΚΟΙ 4,58 CD8+IL4+ 3,65 3,09 0,78 0,73 0,84 0,66 0,63 0,71 φάση ηρεμίας PMA/iono LSA Διάγραμα 10: Συγκριτικό ιστόγραμμα του μέσου όρου του ποσοστού των CD8+IL4+ λεμφοκυττάρων στο περιφερικό αίμα των σκύλων των oμάδων Μ, Λ1 και Λ2, πριν και μετά την in vitro ανοσοδιέγερση με PMA/iono ή LSA 103

110 Πριν από την έναρξη της αντιλεϊσμανιακής θεραπείας στους σκύλους της ομάδας Λ3, τα CD4+IFN-γ+ λεμφοκύτταρα στη φάση ηρεμίας κυμάνθηκαν από 0,98 μέχρι 1,97 (μ.ο 1,53), και τα CD8+IFNγ+ από 1,32 μέχρι 1,82 (μ.ο 1,55) (Πίνακας Παραρτήματος 10, Διαγράμματα 11, 12). Ύστερα από μη ειδική ανοσοδιέγερση με ΡΜΑ/iono το ποσοστό των CD4+IFN-γ+ λεμφοκυττάρων κυμάνθηκε από 2,56 μέχρι 5,95 (μ.ο 3,92) και των CD8+IFN-γ+ από 2,87 μέχρι 8,7 (μ.ο 5,47) (Πίνακας Παραρτήματος 11, Διαγράμματα 11, 12). Στην ανοσοδιέγερση με LSA οι αντίστοιχες τιμές ήταν από 1,78 μέχρι 5,53 (μ.ο 3,18) και από 1,67 μέχρι 6,26 (μ.ο 4,51) (Πίνακας Παραρτήματος 12, Διαγράμματα 11, 12). Τα CD4+IL4+ λεμφοκύτταρα στη φάση ηρεμίας κυμάνθηκαν από 1,07 μέχρι 1,57 (μ.ο 1,34), και τα CD8+IL4+ από 1,29 μέχρι 4,66 (μ.ο 2,73) (Πίνακας Παραρτήματος 10, Διαγράμματα 13, 14). Στα ανοσοδιεγερμένα με ΡΜΑ/iono λεμφοκύτταρα τα CD4+IL4+ κυμάνθηκαν από 1,03 μέχρι 3,12 (μ.ο 1,94) και τα CD8+ IL4+ από 1,03 μέχρι 5,21 (μ.ο 2,95) (Πίνακας Παραρτήματος 11, Διαγράμματα 13, 14), ενώ στην ανοσοδιέγερση με LSA οι αντίστοιχες τιμές ήταν από 1,71 μέχρι 7,55 (μ.ο 3,22) και από 2,29 μέχρι 8,56 (μ.ο 4,82) (Πίνακας Παραρτήματος 12, Διαγράμματα 13,14). Στους σκύλους της ομάδας Λ3, και αμέσως μετά την 30ήμερη από το στόμα αντιλεϊσμανιακή θεραπεία με μιλτεφοσίνη και αλλοπουρινόλη, τα CD4+IFN-γ+ λεμφοκύτταρα στη φάση ηρεμίας κυμάνθηκαν από 0,87 μέχρι 1,9 (μ.ο 1,52), και τα CD8+IFNγ+ από 1,27 μέχρι 1,9 (μ.ο 1,63) (Πίνακας Παραρτήματος 13, Διαγράμματα 11, 12). Ύστερα από μη ειδική ανοσοδιέγερση με ΡΜΑ/iono το ποσοστό των CD4+IFN-γ+ λεμφοκυττάρων κυμάνθηκε από 2,58 μέχρι 5,79 (μ.ο 4,16) και των CD8+IFN-γ+ από 3,45 μέχρι 8,45 (μ.ο 5,99) (Πίνακας Παραρτήματος 14, Διαγράμματα 11, 12). Στην ανοσοδιέγερση με LSA οι αντίστοιχες τιμές ήταν από 1,84 μέχρι 4,42 (μ.ο 2,87) και από 2,87 μέχρι 5,12 (μ.ο 3,82) (Πίνακας Παραρτήματος 15, Διαγράμματα 11, 12). Τα CD4+IL4+ λεμφοκύτταρα σε φάση ηρεμίας κυμάνθηκαν από 1,02 μέχρι 1,51 (μ.ο 1,24), ενώ στα CD8+IL4+ από 1,13 μέχρι 2,45 (μ.ο 1,71) (Πίνακας Παραρτήματος 13, Διάγραμμα 13, 14). Στα ανοσοδιεγερμένα με ΡΜΑ/iono λεμφοκύτταρα τα CD4+IL4+ κυμάνθηκαν από 0,8 μέχρι 1,76 (μ.ο 1,25) και τα CD8+ IL4+ από 0,8 μέχρι 2,87 (μ.ο 1,76) (Πίνακας Παραρτήματος 14, Διαγράμματα 13, 14), ενώ στην ανοσοδιέγερση με LSA οι 104

111 αντίστοιχες τιμές ήταν από 1,13 μέχρι 2,44 (μ.ο 1,57) και από 1,21 μέχρι 3,32 (μ.ο 2,33) (Πίνακας Παραρτήματος 15, Διαγράμματα 13, 14) ,92 4,16 CD4+IFΝγ ,53 1,52 3,18 2,87 ΠΡΙΝ ΤΗ ΘΕΡΑΠΕΙΑ ΜΕΤΑ ΤΗ ΘΕΡΑΠΕΙΑ 1 0 φάση ηρεμίας PMA /iono LSA Διάγραμμα 11: Μέσος όρος του ποσοστού των CD4+IFΝ-γ+ λεμφοκυττάρων στη φάση ηρεμίας και ύστερα από in vitro ανοσοδιέγερση με PMA/iono ή LSA, λίγο πριν και αμέσως μετά την 30ήμερη από το στόμα αντιλεϊσμανιακή αγωγή με μιλτεφοσίνη και αλλοπουρινόλη, στο περιφερικό αίμα των σκύλων της ομάδας Λ3 105

112 6 5,47 5,99 CD8+IFΝγ ,51 3, ,55 1,63 ΠΡΙΝ ΤΗ ΘΕΡΑΠΕΙΑ ΜΕΤΑ ΤΗ ΘΕΡΑΠΕΙΑ 1 0 φάση ηρεμίας PMA /iono LSA Διάγραμμα 12: Μέσος όρος του ποσοστού των CD8+IFΝ-γ+ λεμφοκυττάρων στη φάση ηρεμίας και ύστερα από in vitro ανοσοδιέγερση με PMA/iono ή LSA, λίγο πριν και αμέσως μετά την 30ήμερη από το στόμα αντιλεϊσμανιακή αγωγή με μιλτεφοσίνη και αλλοπουρινόλη, στο περιφερικό αίμα των σκύλων της ομάδας Λ3 106

113 6 5 CD4+IL ,22 ΠΡΙΝ ΤΗ ΘΕΡΑΠΕΙΑ 2 1 1,34 1,24 1,94 1,25 1,57 ΜΕΤΑ ΤΗ ΘΕΡΑΠΕΙΑ 0 φάση ηρεμίας PMA /ΙΟΝΟ LSA Διάγραμμα 13: Μέσος όρος του ποσοστού των CD4+IL-4+ λεμφοκυττάρων στη φάση ηρεμίας και ύστερα από in vitro ανοσοδιέγερση με PMA/iono ή LSA, λίγο πριν και αμέσως μετά την 30ήμερη από το στόμα αντιλεϊσμανιακή αγωγή με μιλτεφοσίνη και αλλοπουρινόλη, στο περιφερικό αίμα των σκύλων της ομάδας Λ3 107

114 6 CD8+IL4+ 5 4, ,73 2,95 ΠΡΙΝ ΤΗ ΘΕΡΑΠΕΙΑ 2 1,71 1,76 2,33 ΜΕΤΑ ΤΗ ΘΕΡΑΠΕΙΑ 1 0 φάση ηρεμίας PMA /iono LSA Διάγραμμα 14: Μέσος όρος του ποσοστού των CD8+IL-4+ λεμφοκυττάρων στη φάση ηρεμίας και ύστερα από in vitro ανοσοδιέγερση με PMA/iono ή LSA, λίγο πριν και αμέσως μετά την 30ήμερη από το στόμα αντιλεϊσμανιακή αγωγή με μιλτεφοσίνη και αλλοπουρινόλη, στο περιφερικό αίμα των σκύλων της ομάδας Λ3 108

115 Στην ομάδα Λ3 παρατηρήθηκε σημαντική μείωση στους λεμφοκυτταρικούς υποπληθυσμούς CD4+IL-4+ και CD8+IL-4+ μετά την 30ήμερη αντιλεϊσμανιακή θεραπεία με μιλτεφοσίνη και αλλοπουρινόλη, χωρίς να επηρεαστεί η έκφραση της IFN-γ (Πίνακας 25). Πίνακας 25: Aποτελέσματα της στατιστικής ανάλυσης των συγκρίσεων μεταξύ του ποσοστού των CD4+IL-4+ ή IFN-γ+ και των CD8+IL-4+ ή IFN-γ+ λεμφοκυττάρων σε φάση ηρεμίας και ύστερα από ανοσοδιέγερση με PMA/iono ή LSA στο περιφερικό αίμα των σκύλων της ομάδας Λ3, πριν και μετά την αντιλεϊσμανιακή θεραπεία με μιλτεφοσίνη και αλλοπουρινόλη ΣΥΓΚΡΙΣH των ομάδων Χωρίς ανοσοδιέγερση CD4+IL4+ CD4+IFNγ+ CD8+IL4+ CD8+IFNγ+ P=0,041 P=0,893 P=0,008 P=0,08 PMA/iono P=0,043 P=0,138 P=0,043 P=0,08 LSA P=0,043 P=0,686 P=0,043 P=0,5 109

116 110

117 ΣΥΖΗΤΗΣΗ Από τη στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων της παρούσας μελέτης και ύστερα από τις συγκρίσεις μεταξύ των ομάδων Λ2, Λ1, Μ και για όλους τους κυτταρικούς πληθυσμούς που μετρήθηκαν με την κυτταρομετρία ροής (CD4+IL-4+, CD4+IFN-γ+, CD8+IL-4+, CD8+IFN-γ+), προέκυψε σημαντική διαφορά υπέρ των σκύλων της ομάδας Λ2 (συμπτωματικά), αλλά όχι μεταξύ των ασυμπτωματικών σκύλων (Λ1) και των μαρτύρων (Μ), με εξαίρεση την ανοσοδιέγερση με LSA του CD4+ΙΝF-γ+ λεμφοκυτταρικού υποπληθυσμού, όπου παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά υπέρ των ασυμπτωματικών σκύλων. Επίσης διαπιστώθηκε ότι στους συμπτωματικούς λεϊσμανιακούς σκύλους, μειώνεται ο αριθμός των βοηθητικών (CD4+), αυξάνεται ο αντίστοιχος των κυτταροτοξικών (CD8+) Τ-λεμφοκυττάρων, ενώ ταυτόχρονα μειώνεται σημαντικά και ο λόγος CD4+/CD8+, σε σύγκριση με τους ασυμπτωματικούς και τους σκύλους μάρτυρες. O CD8+IL-4+ λεμφοκυτταρικός υποπληθυσμός φαίνεται να παίζει σημαντικό ρόλο στην ανοσοπαθογένεια των συμπτωματικών σκύλων. Το ιστορικό, η κλινική εικόνα και τα εργαστηριακά ευρήματα των συμπτωματικών σκύλων της ομάδας Λ2 ήταν τα τυπικά της CanL (Ciaramella και συν 1997, Κoutinas και συν 1999, Sollano-Gallego και συν 2009). Το συχνότερο κλινικό εύρημα στην ομάδα αυτή ήταν η περιφερική λεμφογαγγλιομεγαλία (16/20, 80) και ακολουθούσαν η επιπεφυκίτιδα (7/20, 35), η ατροφία των κροταφιτών μυών (7/20, 35), η αποφολιδωτική δερματίτιδα (4/20, 20), η ωχρότητα των ορατών βλεννογόνων (5/20, 25), η σπληνομεγαλία (4/20, 20), η απίσχναση (3/20, 15), η επίσταξη (3/20, 15), η πολυαρθρίτιδα (3/20, 15), η ονυχομεγαλία και ονυχογρύπωση (3/20, 15), η ιριδοκυκλίτιδα (2/20, 10), ο πυρετός (2/20, 10), η υπερκεράτωση του ακρορινίου και των πελματικών φυμάτων (2/20, 10) και η ηπατομεγαλία (1/20, 5). Σε άλλη μελέτη που αφορούσε στην CanL και έγινε στη χώρα μας, τα συχνότερα κλινικά ευρήματα ήταν η περιφερική λεμφογαγγλιομεγαλία (80,8), η επιπεφυκίτιδα (42,3), η ατροφία των κροταφιτών μυών (30,8), η σπληνομεγαλία (19,2), η επίσταξη (15,4), η κακή θρεπτική κατάσταση, η ιριδοκυκλίτιδα και η ηπατομεγαλία (3,85) (Παπαδογιαννάκης, 2003). Σε ανάλογη μελέτη διαπιστώθηκε περιφερική λεμφογαγγλιομεγαλία (92,9), υπερκεράτωση των πελματικών φυμάτων (71,4), αποφολιδωτική δερματίτιδα (58,5) επιπεφυκίτιδα (56,3), σπληνομεγαλία (13), επίσταξη (10,7), πολυαρθρίτιδα (10,7) και 111

118 ηπατομεγαλία (10,7) (Κουτίνας 2006). Σε πιο πρόσφατη μελέτη το ποσοστό των συμπτωματικών σκύλων με περιφερική λεμφογαγγλιομεγαλία ήταν 72, με αποφολιδωτική δερματίτιδα 46,7, με επίσταξη 17,3 και με ηπατομεγαλία 12 (Συμεωνίδου 2009). Από την σύγκριση των παραπάνω μελετών αναφορικά με τα κλινικά ευρήματα της CanL, δεν διαπιστώθηκαν σημαντικές διαφορές μεταξύ τους. Στους σκύλους της δικής μας μελέτης η αναιμία ήταν το συχνότερο εργαστηριακό εύρημα (18/20, 90), και έπονταν η πρωτεϊνουρία διήθησης (16/20, 80), η υπερπρωτεϊναιμία (16/20, 80), η υπερσφαιριναιμία (13/20, 65), η θρομβοκυτταροπενία (8/20, 40), η υπεργάμμασφαιριναιμία (7/20, 35), η αζωθαιμία (3/20, 15), η λευκοκυττάρωση (2/20, 10), η λευκοπενία (1/20, 5) και η θρομβοκυττάρωση (1/20, 5). Ανάλογα ήταν και τα εργαστηριακά ευρήματα των παραπάνω μελετών, με την αναιμία να εμφανίζει ποσοστό 43/56 (76,8), την θρομβοκυτταροπενία 21/56 (37,5) και την υπερπρωτεϊναιμία 36/56 (64,3) στην μελέτη του Κουτίνα (2006), ενώ τα αντίστοιχα αποτελέσματα ήταν 21/26 (80,8), 7/26 (26,9) και 20/26 (76,9) σε εκείνη του Παπαδογιαννάκη (2003). Η επιβεβαίωση της κλινικής διάγνωσης της νόσου στην ομάδα Λ2, της διάγνωσής της στη Λ1 (ασυμπτωματικοί σκύλοι) και ο αποκλεισμός της στην ομάδα Μ (μάρτυρες) βασίστηκε στην κυτταρολογική εξέταση των επιχρισμάτων από οπό λεμφογγαγγλίου (ανεύρεση αμαστιγοφόρων), των ορολογικών δοκιμών IFA και ELISA (ανίχνευση ειδικών αντισωμάτων) και της μοριακής τεχνικής nested-pcr (ανίχνευση DNA) (Sollano-Gallego και συν 2009) (Πίνακες 6, 7). Για την μέτρηση των κυτταροκινών στα λεμφοκύτταρα του σκύλου το πρόβλημα της μη διαθεσιμότητας στο εμπόριο ειδικών μονοκλωνικών αντισωμάτων, λύθηκε με τη χρησιμοποίηση αντιστοίχων που προέρχονται από άλλα ζωϊκά είδη, αφού είναι γνωστό ότι υπάρχει διασταυρούμενη αντίδραση με ορισμένες κυτταροκίνες του σκύλου, τουλάχιστον για τα μονοκλωνικά αντισώματα mouse anti-bovine IL-4 και mouse anti-bovine IFN-γ που χρησιμοποιήθηκαν στη δική μας μελέτη για τον προσδιορισμό της IL-4 και της IFN-γ, αντίστοιχα (Collins και συν 1999, Pedersen και συν 2002). Στα πλεονεκτήματα της τροποποιημένης τεχνικής με την οποία μετρήθηκαν οι ενδοκυττάριες κυτταροκίνες IFN-γ και IL-4 στο σκύλο (Papadogiannakis και συν 2009), και έχει ήδη χρησιμοποιηθεί στον άνθρωπο, περιλαμβάνονται η ταχύτητα στην εκτέλεση, ο μικρός όγκος ολικού αίματος που απαιτείται και κυρίως η μη ανάγκη διαχωρισμού των κυττάρων που θα μπορούσε να επηρεάσει τους κυτταρικούς πληθυσμούς, την 112

119 ενεργοποίησή τους και σε τελική ανάλυση την έκκριση των κυτταροκινών (Sewell και συν 1997). Η επεξεργασία των δειγμάτων του αίματος γινόταν μέσα σε 2-4 ώρες από την αιμοληψία, επειδή έχει διαπιστωθεί, τουλάχιστον στον άνθρωπο, ότι έπειτα από 4 ώρες μεταβάλλεται η παραγωγή των κυτταροκινών (αυξημένη παραγωγή TNF-α) (Sewell και συν 1997). Για την ανοσοδιέγερση των λεμφοκυττάρων επιλέχθηκαν η phorbol-12- myristate-13-acetate (PMA) και η ιονομυκίνη, επειδή οι ανοσοδιεγέρτες αυτοί υπερτερούν απέναντι στη φυτική λεκτίνη (φυτοαιμογλουτινίνη, phytohaemagglutinin ή PHA) (North και συν 1996). Η επώαση των κυττάρων για την μέτρηση των ενδοκυττάριων κυτταροκινών IFN-γ και IL-4 διαρκούσε 4 με 6 ώρες, χρόνος που απαιτείται για την περισσότερη δυνατή ενδοκυτταρική παραγωγή των IFN-γ και IL-4, όπως εξάλλου και την έκφραση των μορίων CD4+ και CD8+, επιτρέποντας με τον τρόπο αυτό τον σαφή διαχωρισμό των αντίστοιχων λεμφοκυττάρων κατά την διαδικασία χάραξης στο κυτταρόμετρο ροής (Παπαδογιαννάκης και συν 2005). Επισημαίνεται ότι η επιμήκυνση του χρόνου επώασης μειώνει τη συγκέντρωση των κυτταροκινών αυτών και δυσκολεύει τον καθορισμό της περιοχής των λεμφοκυττάρων (Papadogiannakis και συν 2009). Επειδή είναι γνωστό ότι στο σκύλο το μόριο CD4 εκτός από τα Τ-λεμφοκύτταρα εκφράζεται και από τα ουδετερόφιλα (Moore και συν 1998) και για την αποφυγή πιθανής σύγχυσης στην επιλογή της προς χάραξη περιοχής στο κυτταρόμετρο ροής, έγινε διπλή σήμανση (CD3+CD4+) και χρώση των CD4+ λεμφοκυττάρων, παρά το ό,τι τα ουδετερόφιλα συγκεντρώνονται σε τελείως διαφορετικό σημείο από τα λεμφοκύτταρα. Η ανοσολογική μελέτη των Τ-λεμφοκυττάρων σε κυτταρικό επίπεδο παρουσιάζει ιδιαίτερο ενδιαφέρον (Muller και Sinigaglia 1995). H in vitro κλωνοποίηση των Τ- λεμφοκυττάρων και στη συνέχεια η μέτρηση των κυτταροκινών τους με τις τεχνικές ELISA και Northern analysis, όχι μόνο δεν επιτρέπει την ταυτόχρονη επεξεργασία μεγάλου αριθμού δειγμάτων, αλλά επιδρώντας μέσω της πολυπλοκότητας του in vitro περιβάλλοντος πάνω στο είδος και τη διαφοροποίηση των εκκρινόμενων κυτταροκινών μπορεί να οδηγήσει σε λανθασμένα ή αμφιλεγόμενα αποτελέσματα (Paul και Seder 1994). Στα κυριότερα μειονεκτήματα των άλλων τεχνικών που αναπτύχθηκαν για την μέτρηση των κυτταροκινών ανά κύτταρο, όπως η ELISPOT, η in situ υβριδοποίηση (hybridization), η περιορισμένη αραίωση (limiting dilution) και η PCR, περιλαμβάνονται η υψηλή εξειδίκευση και η δυσκολία στη αξιολόγηση του αποτελέσματος (Muller και Sinigaglia 113

120 1995). Τα προβλήματα αυτά φαίνεται να ξεπερνούνται με την κυτταρομετρία ροής για τον προσδιορισμό της ανά κύτταρο παραγωγής των ενδοκυττάριων κυτταροκινών, όπως έχει εφαρμοσθεί με επιτυχία στον άνθρωπο (Jung και συν 1993, Prussin και Metcalfe 1995), τον ποντικό (Assenmacher και συν 1994, Openshaw και συν 1995) και την αγελάδα (Sopp και Howard 2001), αλλά όχι το σκύλο. Η έλλειψη ειδικών μονοκλωνικών αντισωμάτων, το υψηλό κόστος και ο απαιτούμενος ειδικός εργαστηριακός εξοπλισμός, δεν επέτρεψαν μέχρι τώρα, την ευρεία χρησιμοποίηση της κυτταρομετρίας ροής στο σκύλο (Παπαδογιαννάκης 2007, Papadogiannakis και συν 2009) Τα τελευταία χρόνια διατίθενται στο εμπόριο μονοκλωνικά αντισώματα που αν και είναι ειδικά κατά των κυτταροκινών IFN-γ και IL-4 της αγελάδας, εμφανίζουν διασταυρούμενη αντίδραση με τις αντίστοιχες κυτταροκίνες του σκύλου (Pedersen και συν 2002). Στη παρούσα μελέτη πάρθηκαν τα απαραίτητα μέτρα για την αποφυγή της ακαταλληλότητας των μονοκλωνικών αντισωμάτων ως προς την ενδοκυττάρια σήμανση των κυτταροκινών και της καταστροφής, κατά τη διαδικασία μονιμοποίησης των λεμφοκυττάρων, ορισμένων αντιγονικών επιτόπων (Papadogiannakis και συν 2009). Στο σημείο αυτό θα πρέπει να επισημανθεί ότι τα αντισώματα αυτά έχουν δοκιμαστεί στον άνθρωπο και με διαφορετική τεχνική κυτταρομετρίας ροής δηλαδή σε μονοκύτταρα που απομονώθηκαν από το περιφερικό (PBMC) και όχι σε ολικό αίμα (Pedersen και συν 2002). Επειδή τα μη ανοσοδιεγερμένα Τ-λεμφοκύτταρα του περιφερικού αίματος εκκρίνουν από ελάχιστη ως μηδενική ποσότητα κυτταροκινών, είναι απαραίτητη η in vitro διέγερσή τους με PMA/iono ή LSA, για την ενεργοποίηση των αντίστοιχων γονιδίων (Schauer και συν 1996, Prussin 1997), αφού προηγηθεί η χρησιμοποίηση της μονενσίνης που αποτελεί ίσως τον καλύτερο αναστολέα της ενδοκυττάριας μεταφοράς των κυτταροκινών (Tartakoff 1983, Jung και συν 1993). Στην έρευνά μας, η προσθήκη της μονενσίνης, στις κυτταροκαλλιέργειες, είχε σκοπό να εμποδίσει την έξοδο των πρόσφατα συντεθειμένων κυτταροκινών από τη συσκευή του Golgi, αναγκάζοντάς τες να παραμείνουν μέσα στο κύτταρο και να μην εκκριθούν (Jung και συν 1993). Πρόκειται για λιπόφιλο μεταβολίτη του Streptomyces cinnamonensis που μέσω της δέσμευσης των ιόντων Na +, K + και H +, αλλάζει την πολικότητα της κυτταρικής μεμβράνης, με αποτέλεσμα την διακοπή της μεταφοράς των πρωτεϊνών από τη συσκευή του Golgi προς την κυτταρική μεμβράνη, χωρίς όμως να επηρεάζεται η σύνθεσή τους (Tartacoff 1983). Η χρησιμοποίηση επομένως της μονενσίνης αποτρέπει τη μεταφορά των κυτταροκινών IFN-γ και IL-4 από τη συσκευή 114

121 του Golgi προς την κυτταρική μεμβράνη και την έκκρισή τους, αναγκάζοντάς τις να παραμείνουν μέσα στο κύτταρο (Jung και συν 1993). H συγκέντρωση της μονενσίνης στα 3 μmol/l (Papadogiannakis και συν 2009) δεν τροποποιεί τα αντιγόνα επιφανείας των κυττάρων, επιτρέποντας την ταυτόχρονη ανίχνευση των ενδοκυτταρικών και μεμβρανικών αντιγόνων όπως εξάλλου έχει διαπιστωθεί και στον άνθρωπο (Jung και συν 1993). Στον τελευταίο, για να εκκριθεί η μέγιστη ποσότητα των IL-4 και IFN-γ από τα Τ- λεμφοκύτταρα ύστερα από την ανοσοδιέγερσή τους με PMA/iono, χρειάζεται να επωαστούν 4 με 6 ώρες (Sewell και συν 1997). Ανάλογος χρόνος είναι και ο χρόνος που απαιτείται για τα Τ-λεμφοκύτταρα του σκύλου (Papadogiannakis και συν 2009), αν και η μείωση της έκφρασης των μορίων CD4 και CD8 στην επιφάνεια των Τ-λεμφοκυττάρων, για μέχρι και 6 ώρες μετά τη ανοσοδιέγερσή τους, γίνεται με διαφορετικό τρόπο από ό,τι στον ανθρώπο (Pelchen και συν 1993, Nakayama και Nakauchi 1993), με τα CD4 και τα CD8 να μειώνοται τις πρώτες 2 και 4 ώρες αντίστοιχα, για να σταθεροποιηθούν στη συνέχεια μέχρι την 6 η ώρα (Papadogiannakis και συν 2009). Στον άνθρωπο, ακόμη και με την μη ειδική ανοσοδιέγερση με PMA/iοno, η προοδευτική μείωση των CD4 και CD8 αντιγόνων δυσκολεύει αρκετά την ταυτοποίηση των ανοσολεμφοκυττάρων (Sewell και συν 1997), σε αντίθεση με τον ποντικό (Pala και συν 2000) και πιθανότατα το σκύλο (Παπαδογιαννάκης 2007). Με βάση τα μέχρι σήμερα επιστημονικά δεδομένα, φαίνεται ότι η μη ειδική ανοσοδιέγερση ενεργοποιεί τα Τ-λεμφοκύτταρα για να εκκρίνουν τις κυτταροκίνες χωρίς όμως να ενεργοποιούνται τα γονίδια που τις εκφράζουν, γεγονός που αντανακλά τη φυσιολογική δυνατότητα παραγωγής τους από τα κύτταρα (Prussin 1997). Για την επιβεβαίωση της ενεργοποίησης των CD4+ και CD8+ λεμφοκυττάρων, ως θετικός μάρτυρας χρησιμοποιήθηκε το μονοκλωνικό αντίσωμα CD69 του ανθρώπου που παρουσιάζει διασταυρούμενη αντίδραση με το αντίστοιχο μόριο του σκύλου (Papadogiannakis και συν 2009). Πρόκειται για διαμεμβρανική τύπου ΙΙ γλυκοπρωτεΐνη που κωδικοποιείται από γονίδια των ΝΚ κυττάρων και δρα ως υποδοχέας της μεταβίβασης των μηνυμάτων (Ziegler και συν 1994, Marzio και συν 1999). Η ενεργοποίηση των λεμφοκυττάρων αυξάνει τον αυτοφθορισμό και την μη ειδική δέσμευση των αντισωμάτων (Pala και συν 2000). Για να αποκλειστούν και οι ψευδώς θετικές αντιδράσεις, ως αρνητικοί μάρτυρες χρησιμοποιήθηκαν τα ισοτυπικά controls mouse IgG1 RPE και mouse IgG2a RPE για τα μονοκλωνικά αντισώματα mouse anti-bovine IFN-γ και mouse antibovine IL-4, αντίστοιχα. Στη μελέτη μας, το πρόβλημα του καθορισμού του σημείου διαχωρισμού μεταξύ των θετικά και αρνητικά χρωματισμένων κυττάρων, αν και ιδιαίτερα 115

122 δύσκολο όταν το θετικό σήμα είναι εξασθενημένο, ξεπεράσθηκε με τη θέσπιση ως σημείου θετικότητας, το ανώτερο όριο του αρνητικού μάρτυρα (Schauer και συν 1996). Τέλος, επισημαίνεται ότι το σύζευγμα της φυκοερυθρίνης (phycoerythrin ή PE) με τα μονοκλωνικά αντισώματα κατά των κυτταροκινών IL-4 και IFN-γ περνά μέσα από τη διαπερατή κυτταρική μεμβράνη των CD4+ και CD8+ λεμφοκυττάρων, για να σημάνει τις αντίστοιχες κυτταροκίνες μέσα στο κυτταρόπλασμα (Papadogiannakis και συν 2009). Παρόμοια τεχνική εφαρμόσθηκε στον άνθρωπο (Prussin 1997) και την αγελάδα (Sopp και Howard 2001). Στην ομάδα των μαρτύρων (Μ) της δικής μας μελέτης και χωρίς να προηγηθεί in vitro ανοσοδιέγερση, το ποσοστό των CD4+ λεμφοκυττάρων ήταν 40, ενώ των CD8+ 17, με τον μεταξύ τους λόγο (CD4+/CD8+) να βρίσκεται στο 2,4 (Πίνακας 8, Διάγραμμα 1), όπως εξάλλου διαπιστώθηκε και σε παρόμοια μελέτη των Papadogiannakis και συν (2010). Η μικρή, αλλά στατιστικά σημαντική αύξηση των CD8+ Τ- λεμφοκυττάρων στους ασυμπτωματικούς σκύλους (ομάδα Λ1) (Πίνακας 9), θα μπορούσε, κάτω από ορισμένες προϋποθέσεις, να θεωρηθεί στοιχείο ανθεκτικότητας απέναντι στη L.infantum, αφού τα ζώα αυτά φαίνεται ότι διατηρούν τα CD4+ και CD8+ Τ- λεμφοκυττάρα, όπως και τον μεταξύ τους λόγο CD4+/CD8+), μέσα στα φυσιολογικά όρια, σε αντίθεση με εκείνα που τελικά θα νοσήσουν (Guerra και συν 2009). Συνεπώς, ενδέχεται η διαταραχή της ομοιοστασίας των Τ-λεμφοκυτταρικών υποπληθυσμών να ευνοεί την εκδήλωση των συμπτωμάτων και την εξέλιξη της λοίμωξης από τη L.infantum. Το γεγονός ότι μετά τη μη ειδική (PMA/iono) ή ειδική (LSA) ανοσοδιέγερση τα CD4+ και τα CD8+ Τ-λεμφοκυττάρα στους σκύλους των ομάδων Μ, Λ1 και Λ2 μειώθηκαν ελάχιστα σε σύγκριση με τα μη ανοσοδιεγερμένα θα μπορούσε να αποδοθεί στο μηχανισμό της απόπτωσης κατά την 4ωρη ή 6ωρη διαδικασία της ανοσοδιέγερσης και ενδεχομένως στην έστω και μικρή διακύμανση της κατανομής τους στα διαφορετικά φιαλίδια που χρησιμοποιήθηκαν στις μετρήσεις (Sewell και συν 1997). Επιπλέον, τα σημαντικά χαμηλότερα, ύστερα από την ειδική με το LSA ανοσοδιέγερση, ποσοστά των CD4+ και CD8+ λεμφοκυττάρων και του μεταξύ τους λόγου (CD4+/CD8+), συγκρινόμενα με τα αντίστοιχα της μη ειδικής διέγερσης (PMA/iono) ήταν αναμενόμενα, επειδή με το LSA διεγείρονται μόνο όσα ανοσολεμφοκύτταρα φέρουν τον ειδικό υποδοχέα (TCR) του παρασίτου έναντι των αντιγόνων της L.infantum (Ghersetich και συν 1999, Janeway και Travers 2008, Βaneth και συν 2008). 116

123 Στη στατιστική σύγκριση των μη ανοσοδιεγερμένων CD4+ και CD8+ λεμφοκυττάρων μεταξύ των ομάδων Μ και Λ2 και η διαπίστωση σημαντική διαφοράς υπέρ της πρώτης (Πίνακας 17) υποδηλώνει ότι οι συμπτωματικοί σκύλοι (ομάδα Λ2) στην CanL αδυνατούν να διατηρήσουν σε φυσιολογικά επίπεδα τα CD4+ και CD8+ Τ-λεμφοκυττάρα, όπως εξάλλου και τον μεταξύ τους λόγο (CD4+/CD8+), σε αντίθεση με ότι συμβαίνει στους ασυμπτωματικούς σκύλους (ομάδα Λ1), η σύγκριση των οποίων με τα άρρωστα ζώα της ομάδας Λ2 έδωσε το ίδιο στατιστικό αποτέλεσμα. Σύμφωνα με τα παραπάνω αποτελέσματα της μελέτης μας, η διασπορά του παρασίτου στο σώμα του ζώου με επακόλουθο την εκδήλωση των συμπτωμάτων φαίνεται να σχετίζεται με την μείωση του ποσοστού των CD4+ και την αύξηση των CD8+ Τ- λεμφοκυττάρων στο περιφερικό αίμα, όπως εξάλλου διαπιστώθηκε και από άλλους ερευνητές (Μοreno και συν 1999, Guarga και συν 2002, Reis και συν 2006, Guerra και συν 2009). Το αντίθετο αποτέλεσμα στο οποίο κατέληξε ανάλογη μελέτη των Alexandre- Pires και συν (2010) θα μπορούσε ίσως να εξηγηθεί από το ότι η ταξινόμηση των σκύλων σε συμπτωματικούς, ασυμπτωματικούς και μάρτυρες, βασίστηκε στην ορολογική με IFA εξέταση και όχι στην PCR, που έχει μεγαλύτερη διαγνωστική ευαισθησία (Miró και συν 2008). Το ίδιο ισχύει και για τη μελέτη των Miranda και συν (2007), αφού τα 2/3 των μαρτύρων τους που βρέθηκαν θετικοί στην ενδοδερμική δοκιμή με λεϊσμανίνη (Montenegro test) θα έπρεπε κανονικά να είχαν καταταχθεί στην ομάδα των ασυμπτωματικών σκύλων (Sollano-Gallego και συν 2009). Στο περιφερικό αίμα σκύλων με χαμηλό παρασιτικό φορτίο ο αριθμός των CD4+ T-λεμφοκυττάρων ήταν αυξημένος (Reis και συν 2006), όπως εξάλλου διαπιστώθηκε και στη δική μας μελέτη. Αν και πρόκειται για διαφορετικούς ιστούς και όργανα, τα αποτελέσματα της έρευνας των Giunchetti και συν (2008) σύμφωνα με την οποία ο αριθμός των CD8+ T-λεμφοκύτταρων ήταν αυξημένος στα λεμφογάγγλια των συμπτωματικών σκύλων και εκείνης των Papadogiannakis και συν (2005) που έγινε στο δέρμα λεϊσμανιακών σκύλων με αποφολιδωτική δερματίτιδα, ο βαθμός έντασης της οποίας συσχετιζόταν θετικά με το παρασιτικό φορτίο, φαίνεται ότι ενισχύουν τη σημασία των δικών μας αποτελεσμάτων. Θα μπορούσε συνεπώς να υποστηριχθεί ότι η αύξηση του αριθμού των CD4+ λεμφοκυττάρων ενδέχεται να σχετίζεται με τον έλεγχο της πρωτοζωϊκής αυτής μόλυνσης, μέσω της μείωσης του αριθμού ή της εξουδετέρωσης των παρασίτων, ενώ η αύξηση των CD8+ συνδέεται με τη διατήρηση του παρασιτικού φορτίου και ενδεχομένως την εκδήλωση συμπτωμάτων στο μέλλον (Giuncetti και συν 2008, Μaia και Campino 2012). 117

124 Στους μάρτυρες (ομάδα Μ), η μη διαπίστωση σημαντικής διαφοράς των CD4+IL-4+ λεμφοκύτταρων ύστερα από μη ειδική (PMA/iono) και ειδική ανοσοδιέγερση (LSA) σε αντίθεση με τα CD8+IL-4+ λεμφοκύτταρα, στα οποία η μη ειδική ανοσοδιέγερση υπερτερούσε της ειδικής (Ρ < 0,05), θα μπορούσε να εξηγηθεί από το ό,τι οι φυσιολογικοί σκύλοι στην μη ειδική διέγερση φαίνεται να εκκρίνουν την IL-4 κατά κύριο λόγο μέσω των CD8+ και όχι των CD4+ λεμφοκυττάρων. Το γεγονός όμως ότι στα ζώα της ίδιας ομάδας τα ανοσοδιεγερμένα με μη ειδικό τρόπο (PMA/iono) CD4+IL-4+ λεμφοκύτταρα υπερτερούσαν αριθμητικά των μη διεγερμένων, σε συνδυασμό με τη μη σημαντική διαφορά στη σύγκριση με τα CD8+IL-4+ λεμφοκύτταρα, υποδηλώνει ότι οι φυσιολογικοί σκύλοι, στην αρχή τουλάχιστον της ανοσοδιέγερσης και ανεξάρτητα από τον τύπο της, παράγουν την IL-4 κυρίως μέσω των CD4+ και όχι των CD8+ λεμφοκυττάρων. Στον άνθρωπο, όπως και τον ποντικό, έχει βρεθεί ότι η IL-4 ανιχνεύεται δυσκολότερα και όχι πάντοτε, σε μικρό αριθμό λεμφοκυττάρων ύστερα από την κυτταρική ανοσοδιέγερση, σε αντίθεση με την IFN-γ (Pala και συν 2000). Η διαπίστωση ότι στο σκύλο η IL-4 ανιχνεύεται ευκολότερα, αν και πάλι σε λίγα κύτταρα, και στους δύο λεμφοκυτταρικούς υποπληθυσμούς, θα μπορούσε να ερμηνευθεί ότι εκκρίνει την IL-4 σε μεγαλύτερη ποσότητα σε σύγκριση με τον ποντικό και τον άνθρωπο (Παπαδογιαννάκης 2007). Η σημαντική υπερίσχυση των CD4+IFN-γ+, αλλά και των CD8+IFN-γ+ λεμφοκυττάρων, στην ανοσοδιέγερση με PMA/iono σε σύγκριση με την ειδική (LSA) στους κλινικά υγιείς και οροαρνητικούς σκύλους (ομάδα Μ), ως προς την ενδοκυτταρική έκκριση της IFN-γ υποδηλώνει ότι αυτή εξασφαλίζεται εξίσου και από τους δύο λεμφοκυτταρικούς υποπληθυσμούς. Αν και στην κτηνιατρική βιβλιογραφία δεν υπάρχει ανάλογη με την παρούσα μελέτη, σε μελέτες που έγιναν μετά από πειραματική μόλυνση και στις οποίες το mrna των κυτταροκινών ΙFN-γ και IL-4 μετρήθηκε με την τεχνική RT-PCR στα μονοπύρηνα του περιφερικού αίματος (PBMC) σε βάθος χρόνου, σε κλινικά υγιείς σκύλους, διαπιστώθηκε ότι ήταν χαμηλές ή μη ανιχνεύσιμες, ανεξάρτητα από το αν προηγήθηκε ανοσοδιέγερση με κονκαναβαλίνη Α (ConA), LSA, ή δεν έγινε καθόλου (Chamizo και συν 2005, Travi και συν 2009). Σε ανάλογη μελέτη βρέθηκε ότι στο υπερκείμενο υγρό καλλιεργειών PBMC σκύλων που είχαν ανοσοδιεγερθεί με ανασυνδιασμένη πρωτεϊνάση της κυστεΐνης της L.infantum/chagasi και oι κυτταροκίνες μετρήθηκαν με την τεχνική της ELISA, η έκκριση της IL-4 στους μάρτυρες ήταν και πάλι χαμηλή (Pinheiro και συν 2005). Τέλος, σε πειραματική μελέτη όπου μετρήθηκαν οι κυτταροκίνες στα PBMC υγιών σκύλων με τη βοήθεια της RT-PCR, η έκφραση της IFN-γ 118

125 βρέθηκε χαμηλή και κυρίως μετά από τη ανοσοδιέγερση με την ConA (Santos-Gomez και συν 2002). Με βάση τα αποτελέσματα των μελετών αυτών αλλά και της δικής μας, φαίνεται ότι η έκκριση των κυτταροκινών IFN-γ και IL-4, από τα PBMC κλινικά υγιών σκύλων σε φάση ηρεμίας είναι από ελάχιστη μέχρι μηδενική επειδή προφανώς απουσιάζει το κατάλληλο αντιγονικό ερέθισμα (Τizard 2008). Το ίδιο αποτέλεσμα βρέθηκε στο δέρμα (Brachelente και συν 2005) και στο μυελό των οστών των κλινικά υγιών σκύλων (Quinell και συν 2001). Ως προς τους ασυμπτωματικούς, αλλά μολυσμένους από τη L.infantum σκύλους (ομάδα Λ1) και λαμβάνοντας υπόψη τα αντίστοιχα δεδομένα της ομάδας των μαρτύρων, θα μπορούσε να υποστηριχθεί ότι ένα μικρό ποσοστό των CD4+ και CD8+λεμφοκυττάρων παρουσιάζει ειδικότητα ως προς τα αντιγόνα του παρασίτου ύστερα από την ανοσοδιέγερση με LSA, γεγονός που θα μπορούσε να εξηγήσει τη μη σημαντική διαφορά μεταξύ της μη ειδικής και ειδικής ανοσοδιέγερσης. Δεν μπορεί να υποστηριχθεί όμως το ίδιο και για την IFN-γ αφού τα CD4+IFN-γ+ και τα CD8+IFN-γ+ λεμφοκύτταρα υπερτερούσαν αριθμητικά ύστερα από την ανοσοδιέγερση με PMA/iono σε σύγκριση με την ειδική (LSA) γεγονός που υποδηλώνει ότι η έκκρισή της IFN-γ από τα Τ- λεμφοκύτταρα είναι περιορισμένη. Σε πειραματική μόλυνση σκύλων με τη L.infantum, η έκφραση της IFN-γ στα ασυμπτωματικά ζώα ήταν χαμηλή, όχι μόνο στα μη ανοσοδιεγερμένα PBMC, αλλά και σε εκείνα που είχαν διεγερθεί με το LSA (Travi και συν 2009), όπως εξάλλου διαπιστώθηκε και στη δική μας μελέτη. Στην ανάλογη όμως πειραματική μελέτη διαπιστώθηκε ότι τα λεμφοκύτταρα των ασυμπτωματικών σκύλων ύστερα από μη ειδική ανοσοδιέγερση με ConA παράγουν περισσότερη ΙFN-γ και IL-4 σε σύγκριση με τα μη διεγερμένα (Chamizo και συν 2005). Αντίστοιχα ήταν και τα αποτελέσματα της δική μας μελέτης. Στην προαναφερθείσα μελέτη των Chamizo και συν (2005), η αυξημένη παραγωγή των IL-4 και IFN-γ από τα ανοσοδιεγερμένα με LSA λεμφοκύτταρα σε σύγκριση με τα μη ανοσοδιεγερμένα ήταν ανάλογη με τη δικής μας, όπως εξάλλου και η χαμηλή IL-4 που διαπιστώθηκε ύστερα από την ειδική ανοσοδιέγερση με την ανασυνδυασμένη πρωτεϊνάση της κυστεΐνης του παρασίτου στα PBMC ασυμπτωματικών σκύλων που είχαν μολυνθεί φυσικά (Pinheiro και συν 2005). Τα εντυπωσιακότερα όμως αποτελέσματα της δικής μας μελέτης προέκυψαν από τους συμπτωματικούς σκύλους της ομάδας Λ2 στους οποίους η σημαντική διαφορά που 119

126 παρατηρήθηκε και στους δύο λεμφοκυτταρικούς υποπληθυσμούς αναφορικά με την IL-4 (CD4+IL-4+ και CD8+IL-4+), υποδηλώνει την ολοένα και μεγαλύτερη εξειδίκευση των λεμφοκυττάρων απέναντι στα αντιγόνα του παρασίτου και ιδιαίτερα των CD8+, κατά την την εξέλιξης της νόσου. Δεν ισχύει ομως το ίδιο και για την IFN-γ, όπου τα CD4+IFN-γ+ και CD8+IFN-γ+ λεμφοκύτταρα των σκύλων της ομάδας Λ2 δε διέφεραν σημαντικά μεταξύ τους, ενώ δεν παρατηρήθηκαν διαφορές και μεταξύ ανοσοδιεγερμένων με PMA/iono και με LSA, τόσο στα CD4+, όσο και στα CD8+. Σε πειραματικές μελέτες, τόσο η IFN-γ (Travi και συν 2009) όσο και η IL-4 (Pinheiro και συν 2005), ήταν επίσης αυξημένες στα PBMC σκύλων που είχαν εκδηλώσει τα συμπτώματα της CanL, όπως εξάλλου και στο μυελό των οστών κλινικών περιστατικών (Quinell και συν 2001). Tα ευρήματα αυτά επιβεβαιώνουν τη δική μας διαπίστωση για την ύπαρξη πιθανού θετικού συσχετισμού μεταξύ της αυξημένης IL-4 στο αίμα και της εκδήλωσης των συμπτωμάτων της νόσου. Τα παραπάνω δείχνουν ότι στο σκύλο ενδέχεται να μην είναι πολύ ξεκάθαρη η διχοτομική ανοσοαπάντηση, γεγονός που υποδηλώνεται έμμεσα από τα αποτελέσματα της ομάδας Λ3 στην οποία η θεραπεία με το συνδυασμό μιλτεφοσίνης και αλλοπουρινόλης, αν και διήρκησε μόνο 30 ημέρες, αύξησε το ποσοστό των CD4+ ενώ παράλληλα μείωσε τα CD8+ λεμφοκύτταρα, με αποτέλεσμα την αύξηση του λόγου CD4+/CD8+, όπως εξάλλου έχει διαπιστωθεί και από άλλους ερευνητές (Μοreno και συν 1999, Guarga και συν 2002, Guerra και συν 2009, Papadogiannakis και συν 2010). Επιπρόσθετα, η σχετική αποκατάσταση της ομοιοστασίας των κυτταροκινών ΙFN-γ και IL-4 που εκφράσθηκε με τη σημαντική μείωση του ποσοστού των λεμφοκυττάρων που εκκρίνουν την IL-4 και τη μη σημαντική μεταβολή όμως του αντίστοιχου της IFN-γ, διαπιστώθηκε και σε ανάλογη μελέτη ύστερα από την ίδια αντιλεϊσμανιακή θεραπεία σε συμπτωματικούς σκύλους που είχαν μολυνθεί φυσικά, αν και η μέτρηση έγινε στα PMBC με τη μοριακή τεχνική RT-PCR (Manna και συν 2008). Η μείωση του παρασιτικού φορτίου και η βελτίωση της κλινικής εικόνας των σκύλων που επιτυγχάνεται με την αντιλεϊσμανιακή θεραπεία ενδεχομένως μετατοπίζει την μεταβολή της ανοσοαπάντησης των συμπτωματικών σκύλων προς εκείνη των ασυμπτωματικών. Μέχρι σήμερα δεν έχουν δημοσιευτεί μελέτες που αναφέρονται στην ενδοκυττάρια εντόπιση και μέτρηση των κυτταροκινών IFN-γ και IL-4 στους λεμφοκυτταρικούς υποπληθυσμούς CD4+ και CD8+ στο περιφερικό αίμα των λεϊσμανιακών σκύλων, ενώ οι περισσότερες αφορούν στην ποσοτικοποίηση του mrna στο υπερκείμενο υγρό καλλιεργειών PBMC ύστερα από την μέτρησή του με RT-PCR. Παρά τις διαφορές ως 120

127 προς την τεχνική μέτρησης των κυτταροκινών και τους διαφορετικούς τρόπους ανοσοδιέγερσης, η έρευνα των Travi και συν (2009) σε κλινικά περιστατικά της νόσου κατέληξε στα ίδια με τα δικά μας συμπεράσματα. Στην πειραματική μελέτη των Chamizo και συν (2005) η έκφραση της IL-4 ήταν υψηλότερη από τα μη διεγερμένα κύτταρα των μη μολυσμένων, σε σύγκριση με τους ασυμπτωματικούς σκύλους, ενώ η διέγερση με το LSA προκάλεσε μειωμένη έκφραση της IL-4 και της ΙFN-γ στην ίδια ομάδα. Σε άλλη πειραματική μελέτη των Carrrillo και συν (2007) βρέθηκε αυξημένη έκφραση της IFN-γ στους ασυμπτωματικούς σε σύγκριση με τους συμπτωματικούς μετά την LSA ανοσοδιέγερση, ενώ στους συμπτωματικούς σκύλους η παραγωγή της IL-4 ήταν χαμηλότερη μετά από την ειδική ανοσοδιέγερση (LSA) σε σύγκριση με τα μη διεγερμένα κύττταρα. Οι διαφορές αναφορικά με τις μελέτες αυτές θα μπορούσαν, μεταξύ άλλων, να αποδοθούν στον πειραματικό τους χαρακτήρα, στη διαφορετική τεχνική μέτρησης και στο νεαρό της ηλικίας των σκύλων που χρησιμοποιήθηκαν (Carrillo και συν 2007) αφού είναι γνωστό ότι το ανοσοποιητικό τους σύστημα διαφέρει από εκείνο των ενηλίκων που χρησιμοποιήθηκαν στη δική μας μελέτη (Cossarizza και συν 1996, Cancro και συν 2009). Ενδιαφέρουσα είναι επίσης η διαπίστωση ότι και μέχρι 4 μήνες από την διάγνωση της CanL δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές μεταξύ ασυμπτωματικών και συμπτωματικών σκύλων ως προς την έκφραση του mrna της IL-4, η διαφορά εμφανίζεται τους επόμενους 4 μήνες, εξαιτίας της σημαντικής αύξησης της συγκεριμένης κυτταροκίνης στην ομάδα των συμπτωματικών λεϊσμανιακών σκύλων (Panaro και συν 2009). Κάτι ανάλογο παρατηρήθηκε και στη δική μας μελέτη, όπου στα συμπτωματικά ζώα διαπιστώθηκε υψηλή έκφραση της IL-4, όπως και σε εκείνη των Pinheiro και συν (2005), στις οποίες η έκφραση της IL-4 ήταν υψηλότερη στους συμπτωματικούς σε σύγκριση με τους μη μολυσμένους και τους ασυμπτωματικούς σκύλους. Στο σημείο αυτό πρέπει να αναφερθεί ότι στους συμπτωματικούς σκύλους της μελέτης μας παρατηρήθηκε επίσης σημαντική αύξηση της έκφρασης της IFN-γ σε σύγκριση με τους ασυμπτωματικούς σκύλους, όπως και στις αντίστοιχες μελέτες στα PBMC των Poot και συν (2006), Sanchez- Robert και συν (2008) και Panaro και συν (2009), το οποίο επιβεβαιώνει την διχοτομική ανοσοαπάντηση Th1/Th2 κατά την εξέλιξη της μόλυνσης από το παράσιτο. Η αυξημένη αυτή έκφραση της IFN-γ στους σκύλους που εμφάνιζαν κλινικά συμπτώματα, δείχνει ότι τα μολυσμένα μακροφάγα φαίνεται να μην ανταποκρίνονται στην ενεργοποίηση της IFN-γ (Olivier και Gregory 2008). Τέλος, στο μυελό των οστών (Quinell και συν 2001), παρατηρήθηκε αυξημένη έκφραση των κυτταροκινών IL-4 και IFN-γ στους 121

128 συμπτωματικούς, σε σύγκριση με τους κλινικά υγιείς και μη μολυσμένους σκύλους, όπως εξάλλου παρατηρήθηκε και στη δική μας μελέτη. Πρέπει επίσης να αναφερθεί ότι καθαρή διχοτομική ανοσοαπάντηση (Th1/Th2) παρατηρείται και στον ποντικό, στην περίπτωση της μόλυνσης από την Leishmania major, όπως ερευνήθηκε μέσω της έκφρασης των κυτταροκινών από τα λεμφογάγγλια, (Wilson και συν 2005), ή από εσωτερικά όργανα, όπως ο σπλήνας και το ήπαρ (Rolão και συν 2007, Μaia και συν 2009), των ευαίσθητων σε σύγκριση με τα ανθεκτικά στελέχη. Τα αποτελέσματα της μέτρησης του mrna των κυτταροκινών στο ήπαρ (Alves και συν 2009), το σπλήνα (Correa και συν 2007, Lage και συν 2007, Strauss-Ayali και συν 2007), όπως επίσης και το δέρμα (Βrachelente και συν 2005) σε ασυμπτωματικούς και συμπτωματικούς λεϊσμανιακούς σκύλους δεν θα μπορούσαν να συγκριθούν αξιόπιστα με τα δικά μας, ανεξάρτητα από το αν συμφωνούν ή διαφωνούν, επειδή δεν αφορούσαν στον ίδιο ιστό. Προφανώς, η ανοσοαπάντηση των διαφόρων οργάνων είναι διαφορετική απέναντι στο παράσιτο, με βάση τουλάχιστον τα συμπεράσματα από τη μέτρηση των ενδοκυττάριων κυτταροκινών, IFN-γ και IL-4, που είναι γνωστό ότι ελέγχουν σημαντικά την ενεργοποίηση της κυτταρικής και της χυμικής ανοσίας αντίστοιχα. Ερευνώντας το ρόλο των βοηθητικών (Th1) και των κυτταροτοξικών (Th2) Τ- λεμφοκυτταρικών υποπληθυσμών σε διάφορους ιστούς και όργανα των μολυσμένων με την L.infantum σκύλων, είναι πολύ σημαντικό να διαφοροποιηθούν οι ανοσοπαθογεννετικοί μηχανισμοί που αναπτύσονται κατά την διαδικασία της μόλυνσης. Οι περισσότερες μελέτες που αφορούν τα PBMC δείχνουν ότι η κυτταρική ανοσία είναι άμεσα συνδεδεμένη με την ενεργοποίηση των Th1 που παράγουν IFN-γ, IL-2 και ΤΝF-α Τ-λεμφοκύτταρων, ενώ οι συμπτωματικοί σκύλοι χαρακτηρίζονται από την διχοτομική ανοσοαπάντηση τύπου Th1/Th2. Παρά την διαθεσιμότητα αρκετών φαρμάκων για την θεραπεία της λεϊσμανίωσης, η αποτελεσματικότητά τους δεν είναι πάντα επαρκής, με αποτέλεσμα η παρασιτολογική ίαση να είναι σπάνια και οι υποτροπές της νόσου συχνές. Νέες θεραπείες που θα στοχεύουν στο ίδιο το παράσιτο, καθώς και στη ανοσοαπάντηση του ξενιστή θα πρέπει να ερευνηθούν στο μέλλον. 122

129 ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Τα συμπεράσματα που προκύπτουν από την παρούσα μελέτη θα μπορούσαν να συνοψισθούν ως εξής : Η μέτρηση των ενδοκυττάριων κυτταροκινών IFN-γ και IL-4 στους λεμφοκυτταρικούς πληθυσμούς του περιφερικού αίματος σκύλων με την τεχνική της κυτταρομετρίας ροής, είναι εφικτή με απλό, γρήγορο και αξιόπιστο τρόπο. Η συγκεκριμένη τεχνική υπερτερεί των άλλων μεθόδων (ΕLISA για πρωτεΐνες, RT-PCR για το mrna των κυτταροκινών), επειδή απαιτεί μικρή ποσότητα δείγματος αίματος, δεν χρειάζεται διαχωρισμό κυττάρων που ενδέχεται να διαταράσσει την έκφραση των κυτταροκινών και η μέτρηση των κυτταροκινών γίνεται ξεχωριστά για κάθε λεμφοκύτταρο των CD4+ και CD8+ ανοσοϋπότυπων, χωρίς να παρεμβάλλονται οι παράγοντες εκείνοι που θα μπορούσαν να επηρεάσουν την παραγωγή ή έκκρισή τους. Η διαταραχή της ομοιοστασίας των λεμφοκυτταρικών υποπληθυσμών CD4+ και CD8+ φαίνεται να παίζει σημαντικό ρόλο στην εξέλιξη της μόλυνσης και την πιθανή εκδήλωση συμπτωμάτων. Το συμπέρασμα αυτό συνάγεται από τα παρακάτω: Το ποσοστό των CD4+ T-λεμφοκυττάρων στους κλινικά υγιείς και μη μολυσμένους από τη λεϊσμάνια, όπως επίσης και στους ασυμπτωματικούς λεϊσμανιακούς σκύλους είναι πολύ μεγαλύτερο από εκείνο των CD8+, σε σύγκριση με τα αντίστοιχα των συμπτωματικών όπου τα CD4+ μειώνονται και τα CD8+ αυξάνονται. Επίσης, ο λόγος CD4+/CD8+ παρουσιάζεται μειωμένος στους συμπτωματικούς σκύλους, σε σύγκριση με τους ασυμπτωματικούς και τους σκύλους μάρτυρες. Το ποσοστό των CD4+ και CD8+ Τ-λεμφοκυττάρων που παράγουν IL-4 φάση ηρεμίας ή ύστερα από την in vitro ανοσοδιέγερση με PMA/iono ή LSA είναι πολύ χαμηλό, όχι μόνο στους αρνητικούς στη λεϊσμάνια και κλινικά υγιείς, αλλά και τους ασυμπτωματικούς λεϊσμανιακούς σκύλους, σε σύγκριση με τους συμπτωματικούς. Το ποσοστό των CD4+ και CD8+ Τ-λεμφοκυττάρων που παράγουν IFN-γ σε φάση ηρεμίας είναι χαμηλό, στους μάρτυρες και τους ασυμπτωματικούς σκύλους. Το ποσοστό αυτό αυξάνει σημαντικά στους τελευταίους, σε σύγκριση με τους κλινικά υγιείς και μη μολυσμένους, μετά την ειδική ανοσοδιέγερση με LSA των CD4+, διαπίστωση που 123

130 ενδέχεται να συνδέει την ενεργοποίηση των CD4+Th1 T-λεμφοκυττάρων με την ασυμπτωματική μόλυνση. Αυξημένη έκφραση της IFN-γ διαπιστώθηκε και στους συμπτωματικούς μολυσμένους σκύλους από αμφότερους τους λεμφοκυτταρικούς ανοσοϋπότυπους, ιδιαίτερα όταν ανοσοδιεγερθούν με μη ειδικό (PMA/iono) ή ειδικό (LSA) τρόπο, σε σύγκριση με τους ασυμπτωματικούς και τους μη μολυσμένους υγιείς σκύλους, που υποδηλώνει έμμεσα ότι η παραγωγή IFN-γ από μόνη της ενδέχεται να μην επαρκεί για την αποτροπή της εξέλιξης της μόλυνσης και της εκδήλωσης της νόσου. Στους συμπτωματικούς σκύλους, το ποσοστό των CD4+Τ-λεμφοκυττάρων που παράγουν IL-4 είναι υψηλό, ανεξάρτητα από το αν προηγηθεί ή όχι in vitro ανοσοδιέγερση και αν αυτή είναι ειδική ή όχι, σε σύγκριση με τους μη μολυσμένους και τους ασυμπτωματικούς σκύλους. Το ποσοστό αυτό αυξάνει ακόμη περισσότερο στα CD8+ λεμφοκύτταρα όταν διεγείρονται με το LSA, γεγονός που φαίνεται να δείχνει το σημαντικό ρόλο που παίζουν τα κύτταρα αυτά στη διεργασία της χυμικής ανοσίας με πιθανό αποτέλεσμα την εκδήλωση των συμπτωμάτων της νόσου, μέσω της αυξημένης παραγωγής IL-4. Στο σκύλο είναι πολύ πιθανό να υπάρχουν δύο διαφορετικοί λειτουργικοί υποπληθυσμοί των CD8+ λεμφοκυττάρων (Tc1 και Tc2), καθόσο διαπιστώθηκε ότι η IL-4 εκτός από τα CD4+ παράγονταν και από τα CD8+ Τ-λεμφοκύτταρα, όπως συμβαίνει στον ποντικό και τον άνθρωπο. Έμμεσα, πλην όμως σαφώς, στους σκύλους που εκδηλώνουν την CanL, φαίνεται η επικράτηση του διχοτομικού (Th1/Th2) τύπου ανοσοαπάντησης, επειδή παρατηρείται υψηλό ποσοστό των CD4+ και των CD8+ λεμφοκυτταρικών υποπληθυσμών που εκκρίνουν IFN-γ και IL-4. Η θεραπευτική αγωγή με μιλτεφοσίνη και αλλοπουρινόλη, προκαλεί σχετική αποκατάσταση της ομοιοστασίας του ανοσοφαινότυπου των σκύλων με CanL, που εκφράζεται με την μείωση του αριθμού των CD8+ T-λεμφοκυττάρων, την αύξηση των CD4+, την αύξηση του λόγου CD4+/CD8+, καθώς και την ταυτόχρονη μείωση του ποσοστού και των δύο λεμφοκυτταρικών υποπληθυσμών (CD4+, CD8+) που παράγουν IL-4. Η διαπίστωση αυτή, σε συνδυασμό με τις μη σημαντικές μεταβολές στην έκφραση της IFN-γ και την σαφή βελτίωση της κλινικής εικόνας των σκύλων μετά το τέλος της προαναφερόμενης θεραπευτικής αγωγής, φαίνεται να υποδηλώνει το ρόλο που ενδέχεται να παίζει η IL-4 στην εξέλιξη της μόλυνσης. 124

131 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Στη λεϊσμανίωση του σκύλου (CanL), που οφείλεται στο ενδοκυτταρικό πρωτόζωο Leishmania infantum (συν. chagasi), οι ανοσοπαθογεννητικοί μηχανισμοί που είναι υπεύθυνοι για την ανθεκτικότητα ή την ευαισθησία των μολυσμένων σκύλων και την εξέλιξη της προκαλούμενης νόσου παραμένουν αδιευκρίνιστοι σε αρκετά σημεία. Η εκδήλωση κλινικών συμπτωμάτων και η εξέλιξη της λεϊσμανίωσης αποτελεί τη συνέπεια της σύνθετης αλληλεπίδρασης μεταξύ του παρασίτου και του γενετικού και ανοσολογικού υπόβαθρου του ξενιστή. Οι ανθεκτικοί σκύλοι αναπτύσσουν χαμηλούς τίτλους αντιλεϊσμανιακών αντισωμάτων, χαμηλό παρασιτικό φορτίο και ισχυρή καθυστερημένου τύπου αντίδραση υπερευαισθησίας στο δέρμα. Αντίθετα, τα ευαίσθητα ζώα χαρακτηρίζονται από καταστολή της κυτταρικής ανοσίας, ισχυρή χυμική ανοσοαπάντηση και εκδήλωση χαρακτηριστικών της νόσου κλινικών συμπτωμάτων. Από τους περισσότερους ερευνητές υποστηρίζεται ότι η ενεργοποίηση των CD4+Th1 λεμφοκυττάρων εμποδίζει το μολυσμένο ζώο να εξελιχθεί σε συμπτωματικό, σε αντίθεση με ότι συμβαίνει όταν ενεργοποιηθούν τα CD4+Th2 λεμφοκύτταρα, περίπτωση στην οποία το παράσιτο διασπείρεται στους διάφορους ιστούς, για να εκδηλωθούν στη συνέχεια τα ανάλογα συμπτωμάτα. Οι Th1 λεμφοκυτταρικοί υποπληθυσμοί, μέσω της επιλεκτικής παραγωγής των κυτταροκινών IFN-γ, ΙL-2 και ΤΝF-α, ευνοούν την αντίδραση υπερευαισθησίας καθυστερημένου τύπου και την ενεργοποίηση των μακροφάγων κυττάρων με αποτέλεσμα την ενδοκυττάρια καταστροφή του παρασίτου. H παραγωγή όμως των κυτταροκινών IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 και της IL-13 από τους Th2 υποπληθυσμούς θα διεγείρει τη χυμική αντίδραση από τα Β-λεμφοκύτταρα, την μεταβολή του τύπου των παραγόμενων ανοσοσφαιρινών και τη φλεγμονώδη αντίδραση απέναντι στα εναποτιθέμενα στους ιστούς κυκλοφορούντα ανοσοσύμπλοκα από τα παραγόμενα αυτοαντισώματα, πιθανότατα λόγω μοριακού μιμιτισμού. Στην συγκριτική αυτή μελέτη, επιχειρήθηκε η εκτίμηση της ανοσοαπάντησης των σκύλων που έχουν μολυνθεί από τη L. infantum απέναντι στο υπεύθυνο παράσιτο, μέσω της παραγωγής των ενδοκυττάριων κυτταροκινών IFN-γ και IL-4 από τους παραπάνω λεμφοκυτταρικούς υποπληθυσμούς, με αποτέλεσμα την ενεργοποίηση της κυτταρικής και χυμικής ανοσίας, αντίστοιχα. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκε η τεχνική της 125

132 κυτταρομετρίας ροής σε δείγματα από το περιφερικό αίμα των εν λόγω σκύλων. Η μέτρηση των ενδοκυττάριων κυτταροκινών IFN-γ και IL-4 στα Τ- λεμφοκύτταρα του περιφερικού αίματος του σκύλου με κυτταρομετρία ροής, όπως εφαρμόστηκε στην εργασία αυτή, είναι μία απλή και αξιόπιστη τεχνική που εκτιμά αντικειμενικότερα την ανοσοαπάντηση και πλεονεκτεί στο ότι η μέτρηση των κυτταροκινών γίνεται σε κάθε τύπο ανοσοκυττάρου (CD4+, CD8+) και σε κάθε κύτταρο ξεχωριστά και εξουδετερώνοντας τυχόν εξωγενείς παράγοντες που ενδέχεται να επηρεάσουν την παραγωγή τους. Η μελέτη αυτή, που ήταν στιγμιαία, τυφλή και με μάρτυρες, περιελάμβανε 4 ομάδες ζώων. Συνολικά χρησιμοποιήθηκαν 60 σκύλοι από τους οποίους οι 40 παρουσίαζαν μόλυνση από τη L.infantum, ενώ οι 20 ήταν κλινικά υγιείς και αρνητικοί σε αυτή. Τα τελευταία αυτά ζώα χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες (ομάδα Μ). Οι μολυσμένοι σκύλοι χωρίστηκαν στην ομάδα Λ1, που περιελάμβανε 20 ασυμπτωματικά, αλλά θετικά στη L.infantum ζώα, τόσο ορολογικά (IFA) όσο και μοριακά (PCR) και την ομάδα Λ2, που περιελάμβανε 20 συμπτωματικά ζώα στα οποία η νόσος επιβεβαιώθηκε παρασιτολογικά (κυτταρολογική εξέταση λεμφογαγγλίου), ορολογικά και μοριακά. Τέλος, η ομάδα Λ3 αποτελούνταν από 5 άρρωστα ζώα της ομάδας Λ2 που υποβλήθηκαν σε αντιλεϊσμανιακή θεραπεία από το στόμα με το συνδυασμό μιλτεφοσίνης (Μilteforan, Virbac) και αλλοπουρινόλης (Zylapour, Farmanik) για τριάντα συνεχείς ημέρες. Τα αποτελέσματα της κυτταρομετρίας ροής στους Τ-λεμφοκυτταρικούς υποπληθυσμούς έδειξαν ότι στους κλινικά υγιείς (ομάδα Μ) και τους ασυμπτωματικούς σκύλους (ομάδα Λ1), το ποσοστό των CD4+, ήταν αυξημένο σε σύγκριση με τους συμπτωματικούς (ομάδα Λ2) στους οποίους τα CD8+ ήταν αυξημένα και τα CD4+ μειωμένα. Επίσης, ο λόγος CD4+/CD8+ ήταν μειωμένος στους συμπτωματικούς σε σύγκριση με τους ασυμπτωματικούς και τους σκύλους μάρτυρες. Η σχέση αυτή αποκαταστάθηκε μερικώς μετά το τέλος της 30ήμερης από το στόμα αντιλεϊσμανιακής θεραπείας με μιλτεφοσίνη και αλλοπουρινόλη (ομάδα Ομάδα Λ3). Η έκφραση της IFN-γ αυξήθηκε σημαντικά στoυς λεμφοκυτταρικούς υποπληθυσμούς CD4+ και CD8+ των συμπτωματικών ζώων (ομάδα Λ2), ανεξάρτητα από το αν η ανοσοδιέγερση ήταν μη ειδική (PMA/iono) ή ειδική (LSA). Αντίθετα, η έκφραση της IL-4 ήταν χαμηλή στους μάρτυρες (ομάδα Μ) και τα ασυμπτωματικά ζώα (ομάδα Λ1) ανεξάρτητα και πάλι από τον τρόπο της ανοσοδιέγερσής τους. Η έκφραση όμως της IL-4 βρέθηκε να είναι σημαντικά μεγαλύτερη και στους δύο Τ-λεμφοκυτταρικούς υποπληθυσμούς (CD4+, CD8+) των συμπτωματικών ζώων όταν η ανοσοδιέγερση έγινε με το LSA σε σύγκριση με 126

133 την PMA/iono και τα μη ανοσοδιεγερμένα κύτταρα. Το εύρημα αυτό φαίνεται να υποδηλώνει ότι στη πλειονότητα των CD4+ και των CD8+ λεμφοκυττάρων, η ανοσοαπάντηση προς τα αντιγόνα του παρασίτου της Leishmania infantum γίνεται κυρίως μέσω της IL-4. Τέλος, επισημαίνεται ότι τα ποσοστά των θετικών στην IL-4 CD8+ λεμφοκυττάρων ήταν σημαντικά μεγαλύτερα από τα αντίστοιχα των CD4+IL-4+ κυττάρων τόσο χωρίς, όσο και μετά από την in vitro ανοσοδιέγερση με PMA/iono ή LSA. Στους σκύλους της ομάδας Λ3 και μετά την αντιλεϊσμανιακή θεραπεία, παρατηρήθηκε σχετική αποκατάσταση της ομοιοστασίας του ανοσοφαινότυπου των ζώων αυτών, που εκφράσθηκε με την μείωση του αριθμού των CD8+ T-λεμφοκυττάρων, την αύξηση των CD4+, την αύξηση του λόγου CD4+/CD8+ και την ταυτόχρονη μείωση του ποσοστού και των δύο λεμφοκυτταρικών υποπληθυσμών (CD4+, CD8+) που παράγουν IL

134 128

135 Changes of IFN-γ and IL-4 cytokine expression in the CD4+ and CD8+ lymphocytic subpopulations of the peripheral blood of Leishmania infantum (syn. chagasi) infected dogs, as well as before and after antileismanial chemotherapy with miltefosin and allopourinol. ARISTOTLE UNIVERSITY OF THESSALONIKI SCHOOL OF MEDICAL SCIENCES, DEPARTMENT OF VETERINARY MEDICINE LABORATORY OF PARASITOLOGY AND PARASITIC DISEASES Doctoral Thesis By Dimitrios Matralis SUMMARY Canine leishmaniosis (CanL), caused by the intracellular protozoan parasite Leishmania infantum, is a systemic disease with zoonotic potential and a high prevalence among the canine population of the Mediterranean countries. Leishmania transmission primarly occurs via the bite of phlebotomine infected sandflies belonging to one of two genuses: Phlebotomus (Old World) and Lutzomyia (New World). Sandflies inoculate the 129

136 promastigotes into canine hosts. Promastigotes are internalized by phagotic cells of the immune system (macrophages, dendritic cells and neutrofils), and begin differentiation process into amastigotes in the host. Clinical manifestation can range from self- healing cutaneous lesions to fatal disseminated visceral disease. The sophisticated and delicate interaction between the cellular and humoral immune system of the canine host, will dictate the resistance or susceptibility to the infection as well as the progression and outcome of the disease when is finally established. The effective function of cellular immunity and CD4+Th1 lymphocytes in particular, directs to the resistance of the infected dogs culminating in the killing of Leishmania amastigotes by the activated macrophages. Through a variety of complicated mechanisms and notably the down-regulation of the expression of co-stimulatory molecules B7.1 and B7.2 CD8+ lymphocytes by the infected macrophages, the parasite modulates the immune system of the dog for its own benefit. However, the exact mechanisms by which the complicated interactions of numerous cytokines and chemokines play their role, still remains unclear. In the symptomatic disease that may follow, humoral (Th2) dominates over cellular immunity (Th1), leading eventually to antibody overproduction and dissemination of parasite to internal organs. In this study, we investigated the changes of IL-4 and IFN-γ expression of CD4+ and CD8+ lymphocytes in the peripheral blood of naturally infected dogs, taking into consideration their clinical status and the effect of the antileishmanial treatment, as selected criteria. The technique described in this study for the detection of intracellular cytokines IFN-γ and IL- 4 in canine lymphocytes of the peripheral blood by flow cytometry, is both quick, reliable and practical because it counts not only the CD4+ and CD8+ lymphocytic subpopulation but also their functional ones, tagged by intracellular IFN-γ and IL-4 antibodies, in each individual cell, thus permitting the indirect evaluation of cellular and humoral immune response to leishmanial antigens, respectively. Furthermore, the evaluation of the immune response of five randomly selected symptomatic dogs that had undergone a 30-day antileishmanial therapy, was attepted. Clinical appearence and evolution of leishmaniasis is the result of the interaction between the parasite and the immunological and genetic background of the host. It is widely accepted that the resistant dogs develop low levels of anti-leishmania antibodies, parasite load and a positive delayed-type of hypersensitive response to leishmanial antigens in the skin. On the other hand susceptible dog characterized by humoral response, depression of cellular response and finally the appearance of clinical signs. Previous 130

137 studies had suggested that cellular immune response in Leishmania infected dogs is associated with Th1 activation via the secretion of IFN-γ, ΙL-2 and TNF-α, while the cytokine pattern of the overt disease is characterized by a mixed Th1/Th2 response. For the design of this, cross-sectional, blind and controlled study, a total of 40 leishmanial dogs were allocated into to two groups. Twenty breed, sex, age-matced and clinically healthy dogs, that had been tested negative for L.infantum with IFA serology and PCR, served as controls (group M). Group L1 included 20 asymptomatic, but IFA and PCR positive for Leishmania dogs, belonging to various breeds and ranging in age from 1 to 7 years, and group L2 20 symptomatic dogs which were breed, sex and age matched and had a history, clinical picture and clinicopathological profile typical of CanL. The diagnosis of the disease was confirmed by lymph node cytology coupled with a positive IFA and PCR result. Finally, Group L3 contained 5 dogs, selected randomly from group L2 and treated with oral miltefosin and allopourinol for 30 days. Peripheral blood was collected (5mL) from each of the dog in lithium heparin vials and transported to the laboratory of the National School of Public Health (Athens, Greece) within 1 to 3 h for flow cytometry. In summary, blood aliquots of 0.5 ml were added into plastic tubes with 0.5 ml RPMI 1640 culture medium. To increase the chances for cytokine detection intracellularly monensin was added to all cultures at 3 μmol/l concentration. For the in vitro activation of CD4+ and CD8+ lymphocytes, phorbol-12- myristate-13-acetate (PMA) was added at a final concentration of 10 ng/ml, ionomycin (Applichem, Darmstadt, Germany) at the concentration of 2 μmol/l as well as the Leishmania Soluble Antigen (LSA). The tubes were subsequently incubated at 37 C in a humid 5 CO 2 atmosphere for 4 to 6 h. Monoclonal antibodies specific for canine CD4 and CD8 cell surface antigens (rat anti-canine CD4:FITC and rat anti-canine CD8:FITC) were added along with appropriate isotypic negative (rat IgG2a: FITC and rat IgG1: FITC) (Serotec) and positive (mouse anti-human CD69:RPE) as controls and incubated at room temperature for 15 min. After the fixation and washing of the cells appropriate monoclonal antibodies specific for bovine IFN-γ and IL-4 along with appropriate isotypic negative controls (mouse IgG2a:RPE and mouse IgG1:RPE; Serotec), at a concentration of 100 μg/ml, were added and incubated at room temperature for 20 min. Samples were subsequently washed twice with PBS and analyzed with flow cytometry in a Coulter Epics-XL-MCL 4-color cytometer on its attached WinList Version 3.0 software. Results 131

138 were expressed as the percentage of cytokine positive CD4+ or CD8+ cells within the gating for lymphocytes area. The T-lymphocytic subpopulations flow cytometry results revealed an increased number of CD4+ T-lymphocytes in the clinically healthy (Group M) and the asymptomatic dogs (Group L1) in comparison to the symptomatic ones (Group L2), in which the CD8+ subpopulation was increased whereas the CD4+ one decreased. The CD4+/CD8+ ratio was partly restored after a 30-day antileishmanial therapy with oral miltefosin and allopourinol. The expression of IFN-γ was high in both lymphocytic subpopulations of the symptomatic dogs (Group L2), regardless of the type of the in vitro immunostimulation applied (PMA/iono or LSA). In contrast, IL-4 was hardly detected in both control (Group M) and asymptomatic dogs (Group L1), despite the non specific (PMA/iono) or specific (LSA) immunostimulation. Finally, the expression of IL-4 was increased in CD4+ and CD8+ lymphocytic subpopulations of symptomatic dogs (Group L2), especially with the help of specific immunostimulation (LSA). In conclusion, the high proportion of CD4+ and CD8+ that express IL-4 and IFN-γ in dogs with overt CanL suggests the existence of the Th1/Th2 dichotomy. Also, CD8+IL4+ T-lymphocytes appear to play a significant role in the initiation of humoral immunity, the progression of Leishmania infection and evolution to clinical disease in which the various tissues are mainly injured by such pathomechanisms, as granulomatous inflammation, immune-complex deposition and autoantibody production. Αlthough a variety of drugs are available for the treatment of leishmaniasis, their efficacy remains subpar. In most cases parasites are never completely eliminated and disease recrudescence is very common. Current treatment options, based solely on chemotherapy, are not always effective. The goals to determine the immune parameters that characterize the diffirent clinical stages of the disease in infected animals are: CD4+ lymphoproliferation responses, cytokine production profile and antibody responses. Since the evolution of leishmaniasis and clinical appearance is associated with a complex interaction between the parasite and host immune response, the knowledge of the cytokine and phenotypic cell profiles in different tissues and organs of dogs infected with L. infantum is very important for the design of a vaccine or an immunotherapy. Novel treatment options that target the parasite and work with the host immune response should be considered. 132

139 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ ΠΙΝΑΚΩΝ 133

140 Πίνακας 1 : Εκατοστιαία αναλογία () των λεμφοκυτταρικών υποπληθυσμών CD4+, CD8+ και των ενδοκυττάριων κυτταροκινών IFN-γ και IL-4 στο περιφερικό αίμα των σκύλων της ομάδας Μ (φάση ηρεμίας) α/α CD4+IL-4+ CD8+IL-4+ CD4+IFN-γ+ CD8+IFN-γ+ CD4+ CD8+ CD4+/CD8+ Μ1 0,57 0,66 0,75 0,89 32,09 15,94 2,01 Μ2 0,59 1,33 0,91 1,2 41,42 12,47 3,32 Μ3 0,51 0,83 1,55 0,89 42,17 13,12 3,21 Μ4 0,31 0,6 0,41 0,55 39,43 15,42 2,55 Μ5 0,69 0,53 0,52 0,62 33,92 12,61 2,68 Μ6 0,71 0,56 0,7 0,79 42,23 20,02 2,11 Μ7 0,46 0,88 0,79 0,9 47,89 18,88 2,53 Μ8 0,41 0,73 0,72 0,98 39,93 17,53 2,27 Μ9 0,44 1,03 0,31 1,15 49,36 18,56 2,65 Μ10 0,78 0,54 0,81 1,1 48,95 19,38 2,52 Μ11 0,57 0,99 0,91 0,94 44,43 19,55 2,27 Μ12 0,78 1,28 0,55 0,86 43,87 18,45 2,37 Μ13 0,43 0,46 1,03 0,86 28,79 12,86 2,23 Μ14 0,7 0,93 0,71 0,82 41,78 22,89 1,82 Μ15 0,43 0,52 0,83 1, ,26 1,97 Μ16 0,55 0,77 0,75 0,53 39,95 18,67 2,13 Μ17 0,18 1,36 1,02 1,45 46,84 14,52 3,22 Μ18 0,2 0,75 0,39 0,64 31,02 16,84 1,84 Μ19 0,28 0,15 0,3 1,37 46,15 16,5 2,79 Μ20 0,24 0,85 1,2 0,86 37,13 15,62 2,37 Μ.ο 0,49 0,78 0,75 0,92 40,21 17,10 2,44 134

141 Πίνακας 2: Εκατοστιαία αναλογία () των λεμφοκυτταρικών υποπληθυσμών CD4+, CD8+ και των ενδοκυττάριων κυτταροκινών IFN-γ και IL-4 στο περιφερικό αίμα των σκύλων της ομάδας Μ (in vitro ανοσοδιέγερση με PMA/iono) α/α CD4+IL-4+ CD8+IL-4+ CD4+IFN-γ+ CD8+IFN-γ+ CD4+ CD8+ CD4+/CD8+ Μ1 0,27 0,55 2,71 1,01 28,75 10,23 2,81 Μ2 0,61 0,56 1,93 2,37 32,74 10,24 3,19 Μ3 0,58 0,55 4,15 2,91 36,75 10,13 3,62 Μ4 0,8 0,62 1,69 1,45 34,51 12,52 2,75 Μ5 0,54 0,77 0,91 0,97 30,11 8,55 3,52 Μ6 0,69 0,69 1,99 0,96 34,43 11,98 2,87 Μ7 0,59 0,72 2,63 2,63 37,76 13,22 2,85 Μ8 0,86 1,16 3,09 2,61 34,71 14,96 2,32 Μ9 1,3 1,31 1,82 1,49 47,03 14,24 3,31 Μ10 0,72 0,79 1,76 1,64 42,6 13,88 3,06 Μ11 0,46 0,54 2,32 1,47 36,72 13,61 2,69 Μ12 0,59 1,26 3,63 3,77 40,79 12,96 3,14 Μ13 0,87 1,23 2,21 1,01 40,23 14,07 2,85 Μ14 0,47 1,09 1,49 1,28 38,23 18,73 2,04 Μ15 0,68 0,91 2,75 3,34 40,1 22, Μ16 0,65 0,59 2,04 1,29 33,65 11, Μ17 0,83 1,26 3,49 2,59 37,32 11,47 3,25 Μ18 0,44 0,81 1,26 0,88 27,48 15,2 1,81 Μ19 0,79 0,92 1,05 0,95 44,64 15,3 2,91 Μ20 0,76 0,55 1,74 0,85 32,07 11,65 2,75 Μ.ο 0,67 0,84 2,23 1,77 36,53 13,32 2,68 135

142 Πίνακας 3: Εκατοστιαία αναλογία () των λεμφοκυτταρικών υποπληθυσμών CD4+, CD8+ και των ενδοκυττάριων κυτταροκινών IFN-γ και IL-4 στο περιφερικό αίμα των σκύλων της ομάδας Μ (in vitro ανοσοδιέγερση με LSA) α/α CD4+IL-4+ CD8+IL-4+ CD4+IFN-γ+ CD8+IFN-γ+ CD4+ CD8+ CD4+/CD8+ Μ1 0,6 0,43 0,26 0,44 29,63 18,8 1,57 Μ2 0,3 0,89 0,71 0,46 35,6 15,87 2,24 Μ3 0,63 1,5 1,03 0,8 38,66 11,72 3,29 Μ4 0,41 0,47 0,41 0,53 39,72 16,14 2,46 Μ5 0,68 0,68 0,62 0,79 32,7 11,84 2,76 Μ6 0,72 0,58 0,67 0,63 41,05 19,75 2,07 Μ7 0,62 0,64 0,59 0,52 41,61 20,1 2,07 Μ8 0,71 0,58 0,51 0,47 33,29 15,22 2,18 Μ9 0,66 0,36 0,61 0,69 47,04 15,09 3,11 Μ10 0,72 0,59 0,43 0,6 44,38 19,74 2,24 Μ11 0,79 0,8 0,78 0,64 42,19 21,9 1,92 Μ12 0,6 0,8 0,61 0,71 40,51 18,36 2,21 Μ13 0,55 0,77 0,68 1,12 33,36 12,87 2,59 Μ14 0,81 0,52 0,53 0,78 38,27 24,96 1,54 Μ15 0,55 0,55 0,45 0,51 44,38 22,71 1,95 Μ16 0,77 0,82 0,92 0,48 36,82 17,09 2,15 Μ17 0,29 0,27 0,46 0,47 38,16 14,37 2,65 Μ18 0,29 0,49 0,45 0,57 28,52 15,12 1,89 Μ19 0,51 0,36 0,4 0,35 43,18 13,93 3,09 Μ20 0,41 0,52 0,6 0,39 36,62 15,84 2,31 Μ.ο 0,58 0,63 0,58 0,6 38,28 17,07 2,31 136

143 Πίνακας 4 : Εκατοστιαία αναλογία () των λεμφοκυτταρικών υποπληθυσμών CD4+, CD8+ και των ενδοκυττάριων κυτταροκινών IFN-γ και IL-4 στο περιφερικό αίμα των σκύλων της ομάδας Λ1 (φάση ηρεμίας) α/α CD4+ IL4+ CD8+ IL4+ CD4+ IFNγ+ CD8+ IFNγ+ CD4+ CD8+ CD4+/CD8+ Λ1.1 0,53 1,25 0,72 1,13 35,13 14,89 2,35 Λ1.2 0,49 0,54 0,35 0,69 22,29 11,64 1,91 Λ1.3 0,27 1,06 0,54 1,06 33,97 16,66 2,03 Λ1.4 0,4 0,25 0,33 0,4 43,83 17,8 2,46 Λ1.5 0,33 0,38 0,31 0,8 42,21 23,88 1,77 Λ1.6 0,9 0,42 1,53 1,12 29,9 13,02 2,29 Λ1.7 0,83 0,55 0,67 0,45 48,83 19,92 2,45 Λ1.8 0,32 0,53 0,88 1,3 44,38 24,33 1,82 Λ1.9 0,18 1,43 1,01 1,57 46,86 18,73 2,5 Λ1.10 0,95 0,37 0,65 0,44 40,35 19,94 2,02 Λ1.11 0,72 0,7 1,33 0,55 37,43 18,85 1,98 Λ1.12 0,56 0,73 0,68 0,44 39,98 19,44 2,05 Λ1.13 0,58 0,88 0,92 0,6 35,62 21,2 1,69 Λ1.14 0,63 0,51 0,33 0,52 47,23 22,32 2,12 Λ1.15 0,37 0,75 0,58 0,6 45,68 19,95 2,28 Λ1.16 0,39 0,69 0,61 0,97 46,91 21,07 2,22 Λ1.17 0,48 1,24 1,18 1,13 47,78 22,53 2,12 Λ1.18 0,49 0,75 1,47 0,79 49,87 21,2 2,35 Λ1.19 0,37 0,78 2,15 1,3 42,25 17,19 2,63 Λ1.20 0,68 0,96 1,6 0,73 39,1 16,83 2,32 Μ.ο 0,52 0,73 0,89 0,79 40,98 19,06 2,15 137

144 Πίνακας 5: Εκατοστιαία αναλογία () των λεμφοκυτταρικών υποπληθυσμών CD4+, CD8+ και των ενδοκυττάριων κυτταροκινών IFN-γ και IL-4 στο περιφερικό αίμα των σκύλων της ομάδας Λ1 ( in vitro ανοσοδιέγερση με PMA/iono) α/α CD4+ IL4+ CD8+ IL4+ CD4+ IFNγ+ CD8+IFN-γ+ CD4+ CD8+ CD4+/CD8+ Λ1.1 0,72 0,54 1,37 1,09 36,43 14,12 2,58 Λ1.2 0,61 0,36 1,87 1,57 32,41 15,06 2,15 Λ1.3 0,67 0,51 1,3 2,64 30,07 12,41 2,42 Λ1.4 0,2 0,56 4,34 2,46 29,9 10,1 2,96 Λ1.5 0,41 0,13 1,07 2,62 34,77 19,92 1,74 Λ1.6 0,25 0,51 2,4 3,56 34,79 10,21 3,4 Λ1.7 0,97 0,41 3,14 2,37 28,34 7,34 3,86 Λ1.8 0,6 1,01 2,99 3,57 39,4 16,74 2,35 Λ1.9 0,88 1,86 3,36 2,61 37,16 9,62 3,86 Λ1.10 0,65 0,56 2,59 1,22 30,99 13,72 2,26 Λ1.11 0,71 0,49 1,51 1,17 30,91 12,07 2,56 Λ ,74 1,88 0,77 30,28 10,71 2,82 Λ1.13 0,24 0,41 1,67 1,5 33,07 11,7 2,82 Λ1.14 0,23 0,63 2,74 2,03 39,54 13,43 2,94 Λ1.15 0,28 0,94 2,95 2,47 38,25 14,67 2,6 Λ1.16 0,62 0,58 2,2 1,66 35,5 13,06 2,71 Λ1.17 0,87 1,49 3,81 3,4 43,21 17,1 2,52 Λ1.18 0,84 0,66 3,59 3,08 34,74 8,7 3,99 Λ1.19 0,51 0,48 4,47 2,46 34,81 9,93 3,5 Λ1.20 0,29 0,42 4,4 3,99 35,29 9,51 3,71 Μ.ο 0,57 0,66 2,68 2,31 34,49 12,51 2,88 138

145 Πίνακας 6: Εκατοστιαία αναλογία () των λεμφοκυτταρικών υποπληθυσμών CD4+, CD8+ και των ενδοκυττάριων κυτταροκινών IFN-γ και IL-4 στο περιφερικό αίμα των σκύλων της ομάδας Λ1 (in vitro ανοσοδιέγερση με LSA) α/α CD4+IL4+ CD8+ IL4+ CD4+ IFNγ+ CD8+IFNγ+ CD4+ CD8+ CD4+/CD8+ Λ1.1 1,21 0,74 0,94 2,18 36,28 15,01 2,41 Λ1.2 0,51 0,34 1,76 1,38 22,69 11,64 1,94 Λ1.3 0,79 0,81 1,76 1,32 33,97 16,66 2 Λ1.4 0,54 1,38 1,4 0,56 40,74 14,88 2,73 Λ1.5 1,16 0,23 0,76 1,6 38,28 19,9 1,92 Λ1.6 0,63 0,69 2,7 2,74 39,35 18,62 2,11 Λ1.7 0,34 0,13 1,22 0,98 37,57 16,52 2,27 Λ1.8 0,81 1,07 2,42 1,18 36,82 17,09 2,15 Λ1.9 0,64 0,71 1,9 0,86 35,85 15,43 2,32 Λ1.10 0,87 0,7 1,82 0,88 37,51 18,24 2,05 Λ1.11 0,33 0,31 1,2 0,72 38,16 14,49 2,65 Λ1.12 0,26 0,25 1,2 1,02 33,35 13,39 2,49 Λ1.13 0,3 0,26 1,06 1,12 34,71 16,93 2,05 Λ1.14 0,42 0,44 0,56 0,74 36,98 16,07 2,3 Λ1.15 0,36 0,46 1,24 1,64 40,02 15,72 2,54 Λ1.16 0,46 0,53 1,28 0,84 39,44 17,02 2,31 Λ1.17 0,71 1,55 2,28 2,04 42,21 10,29 3,99 Λ1.18 0,41 1,44 2,26 1,94 37,21 9,97 3,73 Λ1.19 0,79 1,51 2,32 0,84 38,59 10,16 3,79 Λ1.20 0,58 0,67 1,74 1,42 37,85 15,98 2,36 Μ.ο 0,60 0,71 1,59 1,4 36,87 15,20 2,50 139

146 Πίνακας 7: Εκατοστιαία αναλογία () των λεμφοκυτταρικών υποπληθυσμών CD4+, CD8+ και των ενδοκυττάριων κυτταροκινών IFN-γ και IL-4 στο περιφερικό αίμα των σκύλων της ομάδας Λ2 (φάση ηρεμίας) α/α CD4+IL4+ CD8+IL4+ CD4+IFNγ+ CD8+IFNγ+ CD4+ CD8+ CD4+/CD8+ Λ2.1 1,28 3,58 1,47 1,14 38,98 21,48 1,81 Λ2.2 1,28 6,61 1,15 1,22 39,18 32,11 1,22 Λ2.3 1,07 3,02 1,99 3,92 33,48 17,97 1,86 Λ2.4 0,94 1,7 0,68 0,51 25,18 22,81 1,11 Λ2.5 0,54 0,82 1,54 2,61 32,33 20,42 1,58 Λ2.6 1,61 2,4 2,27 2,24 40,07 21,64 1,85 Λ2.7 1,49 3,61 1,56 1,92 34,49 22,54 1,53 Λ2.8 1,11 1,18 1,97 1,82 28,53 26,28 1,09 Λ2.9 1,07 1,29 1,88 1,79 32,28 21,39 1,51 Λ2.10 1,35 3,31 1,55 1,48 30,09 26,53 1,13 Λ2.11 1,62 4,66 1,26 1,34 31,54 27,02 1,17 Λ2.12 1,57 3,22 0,98 1,32 30,18 27,27 1,11 Λ2.13 1,44 2,95 1,62 2,1 30,08 27,77 1,08 Λ2.14 1,52 3,16 1,53 1,85 31,06 27,91 1,11 Λ2.15 1,36 4,32 2,11 2,41 29,92 28,85 1,04 Λ2.16 2,12 2,41 1,91 3,2 33,86 27,65 1,23 Λ2.17 2,01 3,74 1,82 1,67 34,12 25,43 1,34 Λ2.18 2,34 3,55 1,71 2,1 39,08 26,79 1,46 Λ2.19 1,39 3,2 1,58 1,82 33,99 26,54 1,28 Λ2.20 1,55 3,01 1,92 2,08 37,28 22,09 1,69 Μ.ο 1,43 3,08 1,62 1,92 33,28 25,02 1,36 140

147 Πίνακας 8: Εκατοστιαία αναλογία () των λεμφοκυτταρικών υποπληθυσμών CD4+, CD8+ και των ενδοκυττάριων κυτταροκινών IFN-γ και IL-4 στο περιφερικό αίμα των σκύλων της ομάδας Λ2 (in vitro ανοσοδιέγερση με PMA/iono) α/α CD4+IL4+ CD8+IL4+ CD4+IFNγ+ CD8+IFNγ+ CD4+ CD8+ CD4+/CD8+ Λ2.1 3,58 4,88 7,94 4,56 33,48 18,68 1,79 Λ2.2 2,1 5,36 3,66 6,8 38,8 30,66 1,26 Λ2.3 3,28 5,27 2,37 4,82 30,37 14,27 2,12 Λ2.4 0,86 3,05 2,47 2,97 23,85 20,24 1,17 Λ2.5 1,03 3,02 2,44 7,71 21,14 19,81 1,06 Λ2.6 4,51 2,77 6,11 2,75 31,31 17,37 1,8 Λ2.7 1,97 2,95 4,11 5,48 29,29 17,48 1,67 Λ2.8 1,21 1,11 2,56 5,31 25,49 18,38 1,37 Λ2.9 1,03 1,03 3,74 8,7 26,14 18,7 1,39 Λ2.10 3,12 3,85 5,95 4,21 26,39 17,29 1,53 Λ2.11 2,25 5,21 4,77 6,3 25,86 18,25 1,42 Λ2.12 2,1 3,55 2,61 2,87 27,54 17,6 1,56 Λ2.13 2,93 3,12 4,1 5,93 23,51 19,33 1,22 Λ2.14 2,2 3,95 2,89 4,33 24,69 18,71 1,32 Λ2.15 1,85 5,56 3,65 4,71 21,08 17,25 1,22 Λ2.16 2,24 3,13 3,78 5,88 31,92 24,67 1,29 Λ2.17 2,33 4,45 2,96 2,99 26,49 20,96 1,26 Λ2.18 2,85 3,82 3,35 4,89 24,99 20,14 1,24 Λ2.19 2,1 4,13 2,37 2,75 31,89 25,39 1,26 Λ2.20 3,24 2,86 5,11 4,12 30,09 17,43 1,73 Μ.ο 2,33 3,65 3,84 4,90 27,71 19,63 1,43 141

148 Πίνακας 9: Εκατοστιαία αναλογία () των λεμφοκυτταρικών υποπληθυσμών CD4+, CD8+ και των ενδοκυττάριων κυτταροκινών IFN-γ και IL-4 στο περιφερικό αίμα των σκύλων της ομάδας Λ2 (in vitro ανοσοδιέγερση με LSA) α/α CD4+IL4+ CD8+IL4+ CD4+IFNγ+ CD8+IFNγ+ CD4+ CD8+ CD4+/CD8+ Λ2.1 8,51 9,66 5,52 6,66 36,5 21,66 1,68 Λ2.2 3,65 6 1,77 5,23 34,65 25,1 1,38 Λ2.3 1,73 4 3,72 4,82 23,92 14,71 1,61 Λ2.4 0,97 2,73 0,85 2,04 22,17 20,33 1,09 Λ2.5 1,44 1,77 2,24 2,57 30,74 22,47 1,36 Λ2.6 6,39 4,28 7,44 5,86 37,5 22,68 1,65 Λ2.7 3,56 4,39 3,52 4,12 30,84 21,44 1,44 Λ2.8 1,71 4,2 1,82 4,75 30,25 27,59 1,11 Λ2.9 2,29 2,29 3,15 1,67 30,45 23,17 1,21 Λ2.10 7,55 8,56 5,53 6,26 29,4 26,98 1,09 Λ2.11 2,65 5,13 1,78 5,25 30,52 27,71 1,1 Λ2.12 1,93 3,92 3,62 4,62 29,67 26,66 1,11 Λ2.13 1,23 2,24 2,95 2,5 29,86 27,31 1,1 Λ2.14 7,51 8,66 4,52 5,66 29,22 28,95 1,01 Λ2.15 2,55 4,95 1,87 4,18 32,89 28,07 1,17 Λ2.16 1,75 3,5 3,72 4,11 31,61 27,84 1,14 Λ2.17 0,99 2,79 0,98 2,13 31,07 23,26 1,34 Λ2.18 3,43 4,12 3,25 3,81 31,34 25,55 1,23 Λ2.19 1,72 4,1 3,71 4,81 31,21 24,41 1,29 Λ ,33 5,48 4,99 30,64 22,06 1,39 Μ.ο 3,24 4,58 3,37 4,30 30,72 24,39 1,27 142

149 Πίνακας 10 : Εκατοστιαία αναλογία () των λεμφοκυτταρικών υποπληθυσμών CD4+, CD8+ και των ενδοκυττάριων κυτταροκινών IFN-γ και IL-4 στο περιφερικό αίμα των σκύλων της ομάδας Λ3 πριν την 30ήμερη αντιλεϊσμανιακή θεραπεία με μιλτεφοσίνη και αλλοπουρινόλη (φάση ηρεμίας) α/α CD4+IL4+ CD8+IL4+ CD4+IFNγ+ CD8+IFNγ+ CD4+ CD8+ CD4+/CD8+ Λ2.8 1,11 1,18 1,97 1,82 28,53 26,28 1,09 Λ2.9 1,07 1,29 1,88 1,79 32,28 21,39 1,51 Λ2.10 1,35 3,31 1,55 1,48 30,09 26,53 1,13 Λ2.11 1,62 4,66 1,26 1,34 31,54 27,02 1,17 Λ2.12 1,57 3,22 0,98 1,32 30,18 27,27 1,11 Μ.ο 1,34 2,73 1,53 1,55 30,52 25,69 1,18 143

150 Πίνακας 11 : Εκατοστιαία αναλογία () των λεμφοκυτταρικών υποπληθυσμών CD4+, CD8+ και των ενδοκυττάριων κυτταροκινών IFN-γ και IL-4 στο περιφερικό αίμα των σκύλων της ομάδας Λ3 πριν την 30ήμερη αντιλεϊσμανιακή θεραπεία με μιλτεφοσίνη και αλλοπουρινόλη (in vitro ανοσοδιέγερση με PMA/iono) α/α CD4+IL4+ CD8+IL4+ CD4+IFNγ+ CD8+IFNγ+ CD4+ CD8+ CD4+/CD8+ Λ2.8 1,21 1,11 2,56 5,31 25,49 18,38 1,37 Λ2.9 1,03 1,03 3,74 8,7 26,14 18,7 1,39 Λ2.10 3,12 3,85 5,95 4,21 26,39 17,29 1,53 Λ2.11 2,25 5,21 4,77 6,3 25,86 18,25 1,42 Λ2.12 2,1 3,55 2,61 2,87 27,54 17,6 1,56 M.o 1,94 2,95 3,92 5,47 26,28 18,04 1,45 144

151 Πίνακας 12 : Εκατοστιαία αναλογία () των λεμφοκυτταρικών υποπληθυσμών CD4+, CD8+ και των ενδοκυττάριων κυτταροκινών IFN-γ και IL-4 στο περιφερικό αίμα των σκύλων της ομάδας Λ3 πριν την 30ήμερη αντιλεϊσμανιακή θεραπεία με μιλτεφοσίνη και αλλοπουρινόλη (in vitro ανοσοδιέγερση με LSA) α/α CD4+IL4+ CD8+IL4+ CD4+IFNγ+ CD8+IFNγ+ CD4+ CD8+ CD4+/CD8+ Λ2.8 1,71 4,2 1,82 4,75 30,25 27,59 1,11 Λ2.9 2,29 2,29 3,15 1,67 30,45 23,17 1,21 Λ2.10 7,55 8,56 5,53 6,26 29,4 26,98 1,09 Λ2.11 2,65 5,13 1,78 5,25 30,52 27,71 1,1 Λ2.12 1,93 3,92 3,62 4,62 29,67 26,66 1,11 Μ.ο 3,22 4,82 3,18 4,51 30,05 26,42 1,12 145

152 Πίνακας 13: Εκατοστιαία αναλογία () των λεμφοκυτταρικών υποπληθυσμών CD4+, CD8+ και των ενδοκυττάριων κυτταροκινών IFN-γ και IL-4 στο περιφερικό αίμα των σκύλων της ομάδας Λ3 μετά από 30ήμερη αντιλεϊσμανιακή θεραπεία με μιλτεφοσίνη και αλλοπουρινόλη (φάση ηρεμίας) α/α CD4+IL4+ CD8+IL4+ CD4+IFNγ+ CD8+IFNγ+ CD4+ CD8+ CD4+/CD8+ 8 1,05 1,21 1,85 1,88 32,17 16, ,02 1,13 1,9 1,9 35,33 17,29 2, ,21 1,9 1,73 1,65 36,49 19,15 1,9 11 1,44 2,45 1,25 1,48 34,82 17,12 1, ,51 1, ,27 37,19 18,53 2 Μ.ο 1,24 1,71 1,52 1,63 35,2 17,67 1,96 146

153 Πίνακας 14 : Εκατοστιαία αναλογία () των λεμφοκυτταρικών υποπληθυσμών CD4+, CD8+ και των ενδοκυττάριων κυτταροκινών IFN-γ και IL-4 στο περιφερικό αίμα των σκύλων της ομάδας Λ3 μετά από 30ήμερη αντιλεϊσμανιακή θεραπεία με μιλτεφοσίνη και αλλοπουρινόλη (in vitro ανοσοδιέγερση με PMA/iono) α/α CD4+IL4+ CD8+IL4+ CD4+IFNγ+ CD8+IFNγ+ CD4+ CD8+ CD4+/CD ,8 0,80 2,58 5,92 30,19 15,41 1,96 9 0,93 0,99 3,93 8,45 29,54 14,78 1, ,44 2,11 5,79 5,06 31,26 15, ,76 2,87 5,22 7,11 28,45 14,54 1, ,53 2,03 3,31 3,45 30,87 15,98 1,93 Μ.ο 1,29 1,76 4,16 5,99 30,06 15,26 1,96 147

154 Πίνακας 15: Εκατοστιαία αναλογία () των λεμφοκυτταρικών υποπληθυσμών CD4+, CD8+ και των ενδοκυττάριων κυτταροκινών IFN-γ και IL-4 στο περιφερικό αίμα των σκύλων της ομάδας Λ3 μετά από 30ήμερη αντιλεϊσμανιακή θεραπεία με μιλτεφοσίνη και αλλοπουρινόλη (in vitro ανοσοδιέγερση με LSA) α/α CD4+IL4+ CD8+IL4+ CD4+IFNγ+ CD8+IFNγ+ CD4+ CD8+ CD4+/CD8+ 8 1,2 2,73 1,91 3,88 34,1 22,18 1,53 9 1,13 1,21 3,23 3,91 33,2 20,03 1, ,44 3,32 4,42 5,12 33,43 19,27 1, ,85 2,45 1,84 3,42 35,74 18,91 1, ,27 1,97 2,98 2,87 36,22 19,37 1,86 Μ.ο 1,57 2,33 2,87 3,84 34,53 19,95 1,73 148

155 ΜΑΡΤΥΡΕΣ CD4+IFΝ-γ+ 2,23 UNSTIM PMA/IONO LSA 0,76 UNSTIM PMA/IONO 0,58 LSA ΜΑΡΤΥΡΕΣ CD8+IFΝ-γ+ UNSTIM PMA/IO LSA 0,92 1,77 0,6 UNSTIM PMA/IONO LSA Πίνακας 16: Συγκριτικό ιστόγραμμα του μέσου όρου των CD4+ και CD8+IFN-γ Τ- λεμφοκυττάρων της ομάδας των μαρτύρων (Μ), πριν και μετά την ανοσοδιέγερση με PMA/iono και LSA 149

156 ΜΑΡΤΥΡΕΣ CD4+IL4+ UNSTIM PMA/IONO LSA 0,49 UNSTIM 0,68 PMA/IONO 0,58 LSA ΜΑΡΤΥΡΕΣ CD8+IL4+ UNSTIM PMA/IONO LSA 0,79 UNSTIM 0,84 PMA/IONO 0,63 LSA Πίνακας 17: Συγκριτικό ιστόγραμμα του μέσου όρου των CD4+ και CD8+IL-4 Τ- λεμφοκυττάρων της ομάδας των μαρτύρων (Μ), πριν και μετά την ανοσοδιέγερση με PMA/iono και LSA 150

157 ΑΣΥΜΠΤΩΜΑΤΙΚΟΙ ΣΚΥΛΟΙ CD4+IFΝ-γ+ 2,68 0,89 1,59 UNSTIM PMA/IONO LSA ΑΣΥΜΠΤΩΜΑΤΙΚΟΙ ΣΚΥΛΟΙ CD8+IFΝ-γ+ 0,79 UNSTIM 2,31 PMA/IONO 1,4 LSA Πίνακας 18: Συγκριτικό ιστόγραμμα του μέσου όρου των CD4+ και CD8+IFN-γ Τ- λεμφοκυττάρων της ομάδας των ασυμπτωματικών σκύλων (Λ1), πριν και μετά την ανοσοδιέγερση με PMA/iono και LSA 151

158 ΑΣΥΜΠΤΩΜΑΤΙΚΟΙ ΣΚΥΛΟΙ CD4+IL4+ 0,52 UNSTIM 0,58 PMA/IONO 0,61 LSA ΑΣΥΜΠΤΩΜΑΤΙΚΟΙ ΣΚΥΛΟΙ CD8+IL4+ 0,74 0,66 0,71 UNSTIM PMA/IONO LSA Πίνακας 19: Συγκριτικό ιστόγραμμα του μέσου όρου των CD4+ και CD8+IL-4 Τ- λεμφοκυττάρων της ομάδας των ασυμπτωματικών σκύλων (Λ1), πριν και μετά την ανοσοδιέγερση με PMA/iono και LSA 152

159 ΣΥΜΠΤΩΜΑΤΙΚΟΙ ΣΚΥΛΟΙ CD4+IFΝ-γ+ 3,84 1,62 3,37 UNSTIM PMA/IONO LSA ΣΥΜΠΤΩΜΑΤΙΚΟΙ ΣΚΥΛΟΙ CD8+IFΝ-γ+ 4,9 4,3 1,92 UNSTIM PMA/IONO LSA Πίνακας 20: Συγκριτικό ιστόγραμμα του μέσου όρου των CD4+ και CD8+ΙΝF-γ+ Τ- λεμφοκυττάρων της ομάδας των συμπτωματικών σκύλων (Λ2), πριν και μετά την ανοσοδιέγερση με PMA/iono και LSA 153

160 ΣΥΜΠΤΩΜΑΤΙΚΟΙ ΣΚΥΛΟΙ CD4+IL4+ 3,24 1,43 2,33 UNSTIM PMA/IONO LSA ΣΥΜΠΤΩΜΑΤΙΚΟΙ ΣΚΥΛΟΙ CD8+IL4+ 3,1 3,65 4,58 UNSTIM PMA/IONO LSA Πίνακας 21: Συγκριτικό ιστόγραμμα του μέσου όρου των CD4+ και CD8+IL-4+ Τ- λεμφοκυττάρων της ομάδας των συμπτωματικών σκύλων (Λ2), πριν και μετά την ανοσοδιέγερση με PMA/iono και LSA 154