Α. Παπαδοπούλου, E. Ρίζος, Α. Αγγελή Τµήµα Χηµικών Μηχανικών, Αριστοτέλειο Πανεπιστήµιο, Θεσσαλονίκη

Transcript

1 AΠΟΙΚΟ ΟΜΗΜΕΝΟ ΚΟΛΛΑΓΟΝΟ ΩΣ ΕΝΕΣΙΜΟ ΝΑΝΟ-ΥΛΙΚΟ ΣΤΗΝ ΒΙΟΪΑΤΡΙΚΗ ΜΗΧΑΝΙΚΗ: ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΦΥΣΙΚΗΣ ΣΥΜΠΕΡΙΦΟΡΑΣ ΚΑΙ ΡΕΟΛΟΓΙΚΩΝ Ι ΙΟΤΗΤΩΝ ΖΕΛΑΤΙΝΗΣ ΤΥΠΟΥ Β ΣΕ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΚΕΣ ΣΥΝΘΗΚΕΣ ΚΑΙ ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΣΤΗΝ ΟΣΤΕΟΑΡΘΡΙΤΙ Α Α. Παπαδοπούλου, E. Ρίζος, Α. Αγγελή Τµήµα Χηµικών Μηχανικών, Αριστοτέλειο Πανεπιστήµιο, Θεσσαλονίκη ΠΕΡΙΛΗΨΗ Η παρούσα εργασία αναφέρεται στη µελέτη της φυσικής συµπεριφοράς και των ρεολογικών ιδιοτήτων ζελατίνης τύπου Β υπό διάφορους συνδυασµούς συνθηκών, αρχικά σε υδατικά διαλύµατα, µεταβάλλοντας τη συγκέντρωση της πρωτεΐνης, το ph και την περιεκτικότητα του διαλύµατος σε NaCl. Πρωτίστως όµως επικεντρώνεται στη µελέτη των µηχανικών ιδιοτήτων του συγκεκριµένου τύπου ζελατίνης υπό φυσιολογικές συνθήκες διαλύµατος (DMEM) και θερµοκρασίας (~37 o C) καθώς και στις πιθανές εφαρµογές του στη θεραπεία της οστεοαρθρίτιδας, η οποία έγκειται στη διόρθωση της σύστασης του αρθρικού υγρού / επιφάνειας χόνδρου. Από πειραµατικά δεδοµένα που αφορούν κυρίως οπτικές παρατηρήσεις προκύπτουν ορισµένα συµπεράσµατα, όπως η ιδιαίτερη ευαισθησία του βιοϋλικού σε µικροβιακή επιµόλυνση, για αυτό και κρίνεται απαραίτητη η προσθήκη µικρής ποσότητας αζιδίου του νατρίου (NaN 3, ~0.1% wt) ως βιοκτόνο. Επιπλέον, σε ακραίες τιµές ph παρατηρείται αυξηµένη αποικοδόµηση της ζελατίνης και µείωση της ικανότητας της να σχηµατίσει gel. Από την άλλη, η προσθήκη ορισµένης ποσότητας χλωριούχου νατρίου (NaCl) δε φαίνεται να επιδρά σηµαντικά στις διαµοριακές αλληλεπιδράσεις µεταξύ αλυσίδων ζελατίνης παρά µόνο σε εξαιρετικά όξινες συνθήκες. ιαπιστώνεται ακόµη, ότι πιθανόν η σταθερή δοµή τριπλής έλικας του συγκεκριµένου υλικού αποσταθεροποιείται σε φυσιολογικές συνθήκες, δηλαδή στους 37 o C, προκαλώντας κατάρρευση του gel. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Το κολλαγόνο αποτελεί ένα από τα κυριότερα βιοπολυµερή του ανθρώπινου οργανισµού, απαρτίζοντας το 70% της πρωτεΐνης που συνθέτει δέρµα, τένοντες, κόκκαλα. Οποιαδήποτε µορφή κολλαγόνου εκτός του φυσικού του περιβάλλοντος αναφέρεται ως ζελατίνη ή αποικοδοµηµένο κολλαγόνο, καθώς προκύπτει από τη µερική υδρόλυση του φυσικού κολλαγόνου και δεν απαντάται η ίδια στη φύση. Η ζελατίνη κυρίως προέρχεται από δέρµα και κόκκαλα θηλαστικών (χοιροειδή, βοοειδή), ενώ πρόσφατα άρχισε να αποµονώνεται και ένα διαφορετικό είδος ζελατίνης από δέρµα ψαριών [1]. Ανάλογα µε τις συνθήκες αποµόνωσης και την προέλευση η ζελατίνη διακρίνεται σε τρεις κατηγορίες: ζελατίνη τύπου Α, ζελατίνη τύπου Β και ζελατίνη από ψάρι. Στη συγκεκριµένη περίπτωση µελετάται η ζελατίνη τύπου Β µε bloom number ~225 g. Η ζελατίνη τύπου Β αποµονώνεται κυρίως από δέρµα και κόκκαλα βοοειδών υπό αλκαλικές συνθήκες. Η εν λόγω διεργασία προσδίδει στη ζελατίνη ισοηλεκτρικό σηµείο περίπου ίσο µε 5 (± 0.3) [2]. Ο όρος bloom number εκφράζει την ικανότητα της πρωτεΐνης να σχηµατίζει σταθερό gel όταν βρίσκεται διαλυµένη σε κάποιο µέσο και µετράται σε γραµµάρια. Η ελάχιστη συγκέντρωση που απαιτείται ώστε να σχηµατιστεί gel έχει βρεθεί ίση µε 0.5% wt. Επιπλέον, οι στερεοί κόκκοι ζελατίνης όταν τοποθετηθούν για αρκετές ώρες σε κρύο νερό (4 o C) έχουν την ικανότητα να διογκώνονται απορροφώντας νερό. Το στάδιο της διόγκωσης της ζελατίνης παίζει µεγάλο ρόλο, ιδιαίτερα στην περίπτωση υψηλών συγκεντρώσεων ζελατίνης, καθώς επιτρέπει τη διάλυση µε ήπια θερµική επεξεργασία στους 40 o C [1]. Οι παράγοντες που επηρεάζουν το σχηµατισµό της έλικας στο µόριο της ζελατίνης, όταν βρίσκεται διαλυµένη σε κάποιο διαλύτη είναι: συγκέντρωση της ζελατίνης, αύξηση της οποίας οδηγεί και σε αύξηση της ικανότητας σχηµατισµού σταθερού gel. Το ποσοστό ανάκτησης της τριπλής έλικας στη ζελατίνη συγκριτικά µε το µητρικό µόριο κολλαγόνου έχει αποδειχθεί ότι εξαρτάται επίσης από το ρυθµό και τη θερµοκρασία όπου λαµβάνει χώρα η ανάπτυξη των δεσµών υδρογόνου για το σχηµατισµό της τελικής δοµής έλικας της πρωτεΐνης. Πιο συγκεκριµένα, σε υψηλότερες θερµοκρασίες (>20 o C) ο σχηµατισµός της τριπλής έλικας πραγµατοποιείται µε πιο αργό ρυθµό µε αποτέλεσµα την ανάκτηση δοµών µε ιδιότητες όµοιες µε του φυσικού µορίου του κολλαγόνου συγκριτικά µε την ωρίµανση του gel σε χαµηλότερες θερµοκρασίες [3] µοριακό βάρος: υψηλά µοριακά βάρη ευνοούν το σχηµατισµό σταθερής έλικας κατά τη διαµόρφωση της πρωτεΐνης στο χώρο [1] πηγή προέλευσης της ζελατίνης, η οποία καθορίζει και τα ποσοστά αµινοξέων στο µόριο της εκάστοτε ζελατίνης. Ειδικότερα τα αµινοξέα προλίνη και υδροξυπρολίνη σταθεροποιούν το µόριο της ζελατίνης για το σχηµατισµό gel. Στη προερχόµενη από θηλαστικά ζελατίνη το ποσοστό των δύο κύριων αµινοξέων αποτελεί το 25% wt [1] ph: σε σχετικά υψηλές συγκεντρώσεις η επίδραση του ph στην περιοχή δε επηρεάζει σηµαντικά το σχηµατισµό gel [1]

2 ιονική ισχύς: προσθήκη NaCl έως 0.10 Μ δεν παίζει σπουδαίο ρόλο στο σχηµατισµό γέλης [1]. Αντιθέτως, υψηλές συγκεντρώσεις άλατος φαίνεται να επιδρούν αρνητικά στη σταθεροποίηση της ζελατίνης και την ανάπτυξη της τρισδιάστατης δοµής [1,4] Η ζελατίνη ανήκει στην κατηγορία των πρωτεϊνών που σχηµατίζουν φυσικά gel. Φυσικά χαρακτηρίζονται εκείνα τα gel στα οποία η διεργασία µετατροπής µεταξύ των δύο καταστάσεων, της στερεής (gel) και της υγρής (διάλυµα) είναι αντιστρεπτή και πραγµατοποιείται µε µείωση ή αύξηση της θερµοκρασίας αντίστοιχα. Η µελέτη των µηχανικών ιδιοτήτων του συγκεκριµένου πολυµερούς παρουσιάζει ιδιαίτερο ενδιαφέρον καθώς επιτρέπει τη συλλογή αξιόπιστων πληροφοριών σχετικά µε το σηµείο τήξης και την ιξωδοελαστικότητα του υλικού, δηλαδή την ικανότητα να αντιστέκεται στην παραµόρφωση, κάτω από την άσκηση δύναµης συναρτήσει της θερµοκρασίας. Πιο συγκεκριµένα, κατά τη ρεολογική ανάλυση ενδιαφέρουν κυρίως δύο συντελεστές: ο συντελεστής αποθήκευσης ή δυναµική ακαµψία, G (Pa), ο οποίος εκφράζει την ικανότητα του υλικού να αποθηκεύει ενέργεια την οποία και απελευθερώνει κατά την παραµόρφωση, και ο συντελεστής απώλειας, G (Pa), ο οποίος εκφράζει την ικανότητα του υλικού να χάνει ενέργεια υπό µορφή θερµότητας κατά τη διάρκεια της ασκούµενης παραµόρφωσης. Οι δύο συντελεστές συνδέονται µεταξύ τους µε έναν συντελεστή απόσβεσης που δίνεται από τη σχέση (1) [5]: G '' tanδ = (1) G ' Το σηµείο τήξης της ζελατίνης ισούται µε τη θερµοκρασία όπου η τιµή του συντελεστή απόσβεσης τείνει στο 1, δηλαδή ισχύει η σχέση: G = G. Μέρος της διάταξης που χρησιµοποιείται για τη µέτρηση των µηχανικών ιδιοτήτων απεικονίζεται στο Σχήµα 1. Επιπροσθέτως, η εν λόγω εργασία διεξάγεται προκειµένου να µελετηθεί η εφαρµογή της ζελατίνης στο σχηµατισµό βιοσυµβατών υλικών για τη θεραπεία της οστεοαρθρίτιδας και ειδικότερα την αποκατάσταση της σύστασης του αρθρικού υγρού / επιφάνειας του χόνδρου. Άρθρωση ονοµάζεται κάθε σηµείο όπου δύο ή περισσότερα οστά έρχονται σε επαφή επιτρέποντας την ελεύθερη αλλά και εντός ορίων κίνησή τους. Η εξωτερική επιφάνεια των οστών καλύπτεται από ένα σκληρό αλλά και ολισθηρό στρώµα ιστό, το χόνδρο, ο οποίος απορροφά τυχόν κραδασµούς και επιτρέπει την οµοιόµορφη κατανοµή του φορτίου στην άρθρωση. Η οστεοαρθρίτιδα αποτελεί εκφυλιστική ασθένεια που προσβάλει τις αρθρώσεις. Στην περίπτωση της οστεοαρθρίτιδας η επιφάνεια του χόνδρου γίνεται τραχεία και φθείρεται µε αποτέλεσµα οι δύο επιφάνειες των οστών να έρχονται σε άµεση επαφή κατά την κίνηση. Ο οργανισµός προσπαθώντας να αποκαταστήσει τη φυσιολογική λειτουργία του χόνδρου ενεργοποιεί την παραγωγή µεγαλύτερων ποσοτήτων αρθρικού υγρού µε αποτέλεσµα να προκαλείται οίδηµα στην περιοχή που πάσχει από οστεοαρθρίτιδα. Στις µέρες µας η αύξηση του ορίου ηλικίας έχει οδηγήσει και σε εξαιρετικά αυξηµένα ποσοστά ατόµων που πάσχουν από τη συγκεκριµένη ασθένεια. Από την άλλη µεριά, δυστυχώς, τα µέχρι στιγµής χρησιµοποιούµενα φάρµακα επικεντρώνονται στην ανακούφιση του πόνου και την προσωρινή µόνο αποκατάσταση της φυσιολογικής λειτουργίας της άρθρωσης [6]. Για αυτό το λόγο κρίνεται επιτακτική η ανάγκη ανάπτυξης προηγµένων ενέσιµων υλικών που θα στοχεύουν στη θεραπεία της πάθησης χωρίς τη µεσολάβηση επεµβατικών µεθόδων και την αποφυγή της ταλαιπωρίας των ασθενών από µια µετεγχειρητική περίοδο. Τα βασικά στάδια του πειραµατικού µέρους που ακολουθεί η παρούσα εργασία είναι: παρασκευή υδατικών διαλυµάτων ζελατίνης σε τρεις διαφορετικές συγκεντρώσεις πρωτεΐνης, περιοχή ph µεταξύ 2.0 και 10.0 και προσθήκη NaCl µε βάση τις περιεκτικότητες άλατος που συναντώνται σε φυσιολογικές συνθήκες παρασκευή δείγµατος ζελατίνης πολύ υψηλής συγκέντρωσης σε DMEM, το οποίο είναι πλούσιο σε ανόργανα άλατα, αµινοξέα και βιταµίνες προσοµοιάζοντας σε µεγάλο βαθµό τις ιδιότητες των φυσιολογικών υγρών στο σώµα συλλογή οπτικών παρατηρήσεων όσον αφορά τη συµπεριφορά των υλικών που παρασκευάστηκαν σε δύο θερµοκρασίες (25 o C και 37 o C) µέτρηση των µηχανικών ιδιοτήτων της ζελατίνης σε ρεόµετρο

3 Σχήµα 1: Πειραµατική διάταξη µέτρησης µηχανικών ιδιοτήτων (προσαρµοσµένο από [5]) ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Για τη διεξαγωγή των πειραµάτων χρησιµοποιήθηκαν τα εξής αντιδραστήρια: Ζελατίνη τύπου Β (~225g Bloom number, Sigma Aldrich Co. LLC., USA), Αζίδιο του Νατρίου (NaN 3, Sigma Aldrich Co. LLC., USA), Απεσταγµένο νερό, Χλωριούχο Νάτριο (NaCl), Πυκνό διάλυµα υδροχλωρικού οξέος (HCl, 37% w/w, ChemLab, Belgium, Europe), Υδροξείδιο του Νατρίου (NaOH, ChemLab, Belgium, Europe), ιάλυµα αιθανόλης (Καθαρότητα 99.8%, Sigma Aldrich Co. LLC., USA), DMEM (Dulbecco s Modified Eagle Medium, Sigma Aldrich Co. LLC., USA), Ρυθµιστικά διαλύµατα ph 4.0, 7.0 και 10.0 (20 o C) (Fluka Analytical, Sigma Aldrich Co. LLC., USA). Επιπλέον, για τη διάλυση της ζελατίνης χρησιµοποιήθηκε θερµαντική πλάκα µε µαγνητική ανάδευση (Snijders 34532, Gemini BV, Netherlands, Europe), για τη µέτρηση του ph πεχάµετρο της Metrohm 744 (Switzerland, Europe), ενώ η µέτρηση των µηχανικών ιδιοτήτων έγινε µε ρεόµετρο AR-G2 (TA Instruments, USA). Το πρώτο πειραµατικό µέρος περιελάµβανε την παρασκευή δειγµάτων ζελατίνης σε συγκεντρώσεις 0.1, 2.0 και 5.0% wt σε υδατικό µέσο. Αρχικά έγινε σχολαστικός καθαρισµός των σκευών που επρόκειτο να χρησιµοποιηθούν µε απορρυπαντικό, απεσταγµένο νερό και τέλος, µε αιθανόλη, προκειµένου να περιοριστεί η πιθανότητα βακτηριακής επιµόλυνσης των δειγµάτων. Έπειτα προετοιµάστηκαν υδατικά διαλύµατα συγκεκριµένου ph µε την προσθήκη αραιών διαλυµάτων HCl ή NaOH αντίστοιχα. Ακολούθησε υπολογισµός και ζύγιση των κατάλληλων ποσοτήτων ζελατίνης και υδατικού διαλύµατος καθορισµένου ph ( ). Τα δείγµατα παρέµειναν 1 2 µέρες στο ψυγείο (4 o C) ώστε η ζελατίνη να διογκωθεί σε µεγαλύτερους κόκκους µε την απορρόφηση νερού και να διευκολυνθεί η διάλυσή της στο υδατικό µέσο. Η διάλυση της ζελατίνης πραγµατοποιήθηκε µε ήπια θέρµανση (έως 52 o C) και µαγνητική ανάδευση µε κυλινδρικό µαγνήτη (12*4.5 mm). Το φιαλίδιο σταθεροποιούνταν σε ποτήρι ζέσεως µε νερό και σε κάποιο ύψος από τον πυθµένα του ποτηριού ώστε να µην έρχεται σε άµεση επαφή µε τη θερµαντική πλάκα. Παράλληλα, καθ όλη τη διάρκεια της διάλυσης της ζελατίνης παρακολουθούνταν η θερµοκρασία του νερού, όπου ήταν τοποθετηµένο το φιαλίδιο, µε θερµόµετρο, και ρυθµιζόταν µε το διακόπτη ώστε να αποφευχθούν µεγάλες διακυµάνσεις. Η συγκεκριµένη πειραµατική διάταξη διάλυσης της ζελατίνης φαίνεται στο Σχήµα 2. Ο απαιτούµενος χρόνος για την πλήρη διάλυση της πρωτεΐνης εξαρτάται, όπως αναµένεται, από τη συγκέντρωση της τελευταίας. Για αυτό το λόγο για συγκεντρώσεις 2.0 και 5.0 % wt απαιτούνταν περίπου 2 ώρες ενώ για τη µικρότερη συγκέντρωση 30 λεπτά ήταν αρκετά. Στη συνέχεια, γινόταν µέτρηση και ρύθµιση του ph στην επιθυµητή περιοχή µε την προσθήκη αραιών διαλυµάτων HCl ή/και NaOH 0.4 Μ, 0.2 Μ και 0.1 Μ. Με βάση την προστιθέµενη ποσότητα οξέος ή βάσης υπολογιζόταν η τελική συγκέντρωση της ζελατίνης στο δείγµα. Τέλος, αφού τα δείγµατα παρέµειναν περίπου 1 µέρα σε θερµοκρασία δωµατίου (~20 o C), τοποθετούνταν στο ψυγείο για την αποφυγή ανάπτυξης µικροβίων, το σχηµατισµό πιο σταθερού gel και την αποκατάσταση ισορροπίας στο σύστηµα της πρωτεΐνης. Σε αυτό το σηµείο πρέπει να επισηµανθεί ότι τα δείγµατα µε ph µεγαλύτερο του 6.0 (6.0, 8.0, 10.0) περιείχαν NaN 3 σε περιεκτικότητα 0.1% wt ως συντηρητικό και βιοκτόνο. Σε χαµηλότερες τιµές ph (2.0, 4.0) η χρήση του συγκεκριµένου δηλητηρίου θεωρήθηκε µη ασφαλής λόγω πιθανότητας έκλυσης επικίνδυνων αερίων. Το δεύτερο µέρος αποσκοπούσε στη συλλογή οπτικών παρατηρήσεων σχετικά µε την επίδραση της ιονικής ισχύος στη ζελατίνη. Επιλέχτηκαν τρεις συγκεντρώσεις άλατος (NaCl), 0.30 Μ, 0.15 Μ και 0.05 Μ. Αρχικά παρασκευάστηκαν δύο υδατικά διαλύµατα 0.3 Μ NaCl µε και χωρίς NaN 3, ενώ οι µικρότερες συγκεντρώσεις άλατος προέκυψαν µε διαδοχικές αραιώσεις του αρχικού διαλύµατος. Η µεσαία περιεκτικότητα (0.15 Μ) αποτελεί τη φυσιολογική περιεκτικότητα NaCl της εξωκυττάριας µήτρας στα περισσότερα είδη κυττάρων. Η µεγαλύτερη συγκέντρωση (0.30 Μ) απαντάται µόνο σε ειδικές περιπτώσεις, όπως στη σπονδυλική στήλη, ενώ η µικρότερη συγκέντρωση σε NaCl παρατίθεται συγκριτικά. Επιπλέον, οι συγκεντρώσεις ζελατίνης ήταν 0.5, 2.0, 5.0 % wt, καθώς συγκέντρωση ζελατίνης 0.1% wt στάθηκε αδύνατο να σχηµατίσει gel ακόµα και µετά το πέρας δύο µηνών στους 4 o C. Η πειραµατική διαδικασία που ακολουθήθηκε ήταν παρόµοια µε του πρώτου πειραµατικού µέρους. ιαφορές σηµειώθηκαν στη θέρµανση κατά τη διάλυση της ζελατίνης, όπου γινόταν σε χαµηλότερες θερµοκρασίες (έως 42 o C). Επιπλέον, στην περίπτωση των δειγµάτων µε 0.05 Μ NaCl η τοποθέτηση στο ψυγείο γινόταν την ίδια µέρα µε τη διάλυση της ζελατίνης αφού πρώτα παρέµεναν λίγη ώρα σε

4 θερµοκρασία δωµατίου. Η παραπάνω αλλαγή κρίθηκε σκόπιµη λόγω της µικρής περιεκτικότητας NaN 3 (~0.02% wt) στα συγκεκριµένα δείγµατα. Επιπροσθέτως, παρασκευάσθηκε µε τον ίδιο τρόπο δείγµα ζελατίνης πολύ υψηλής συγκέντρωσης (25.0 % wt) µε διαλύτη DMEM προκειµένου να συλλεχθούν ορισµένες αρχικές πληροφορίες σχετικά µε τη συµπεριφορά του βιοϋλικού σε φυσιολογικές συνθήκες διαλύµατος και θερµοκρασίας (ph 7.1 και Τ 37 o C). Το συγκεκριµένο δείγµα παρουσίασε ιδιαίτερη δυσκολία κατά τη διάλυση της ζελατίνης καθώς απαιτήθηκαν περισσότερες από 15 ώρες και θερµοκρασίες έως και 65 o C. Σχήµα 2: Πειραµατική διάταξη διάλυσης της ζελατίνης Σχήµα 3: είγµα ζελατίνης 2% wt πριν και µετά τη ρύθµιση του ύψους της γεωµετρίας Στο σηµείο αυτό επισηµαίνεται ότι για τη µέτρηση και ρύθµιση του ph, το πεχάµετρο θα έπρεπε πρώτα να βαθµονοµηθεί στην αντίστοιχη περιοχή, δηλαδή σε ph: για την όξινη περιοχή ενώ σε ph: για τη βασική περιοχή. Για τη βαθµονόµηση του πεχαµέτρου χρησιµοποιούνταν πρότυπα ρυθµιστικά διαλύµατα. Προκειµένου να διαπιστωθεί η συµπεριφορά της ζελατίνης σε διάφορες συνθήκες ph και ιονικής ισχύος σε θερµοκρασία δωµατίου (~25 o C) και σε φυσιολογική θερµοκρασία (~37 o C), τα δείγµατα µε συγκέντρωση ζελατίνης 5.0% wt, µετά την παραµονή τους για αρκετό καιρό σε περίπου 4 o C, τοποθετήθηκαν σε υδατόλουτρο πρώτα στους 25 o C, όπου και παρέµειναν για 30 λεπτά. Έπειτα την συλλογή οπτικών παρατηρήσεων τα δείγµατα τοποθετήθηκαν και πάλι στο υδατόλουτρο στους 37 o C για 30 λεπτά ενώ τέλος, έγιναν και πάλι κάποιες οπτικές παρατηρήσεις. Τέλος, πραγµατοποιήθηκαν ορισµένες µετρήσεις (Temperature ramp step) ρεολογικών ιδιοτήτων σε ρεόµετρο (AR G2, TA Instruments). Πιο συγκεκριµένα µελετήθηκαν τα µέτρα αποθήκευσης (G, Pa) και απώλειας (G, Pa) συναρτήσει αυξανόµενης της θερµοκρασίας από τους 5 o C στους 40 o C µε ρυθµό 1 o C/min καθώς και ο συντελεστής απόσβεσης (tanδ). Οι µετρήσεις ελήφθησαν υπό σταθερή συχνότητα (0.1 Hz) και ένταση ασκούµενης δύναµης από τη γεωµετρία 3%. Η γεωµετρία που χρησιµοποιήθηκε ήταν η 25 mm steel plate , Sand-blasted St-steel parallel plate. Στην πλάκα του ρεοµέτρου, της οποίας η θερµοκρασία είχε ήδη ρυθµιστεί στους 5 o C, τοποθετήθηκαν δύο λεπτά κοµµάτια γέλης από δείγµα 2.0% wt ζελατίνης µε ph=7.86 (33 o C), 0.1% NaN 3 και χωρίς την προσθήκη NaCl. Το κενό µεταξύ πλάκας και γεωµετρίας ρυθµίστηκε προσεκτικά στα 215 µm, το οποίο έδωσε όγκο δείγµατος περίπου 0.11 ml. Πριν την έναρξη της µέτρησης το δείγµα έµεινε για 10 λεπτά σε ηρεµία µεταξύ της γεωµετρίας και της πλάκας του ρεοµέτρου στους 5 o C. Στο Σχήµα 3 απεικονίζεται η πλάκα του ρεοµέτρου µε το δείγµα πριν και µετά τη ρύθµιση του ύψους της γεωµετρίας. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΉΤΗΣΗ Το ισοηλεκτρικό σηµείο της ζελατίνης τύπου Β, όπως έχει ήδη αναφερθεί, είναι κοντά σε ph=5.0. Μετά τη διάλυση της ζελατίνης παρατηρούνταν έντονη τάση να οδηγήσει το ph του διαλύµατος όσο πιο κοντά γίνεται στο ισοηλεκτρικό της σηµείο, γεγονός που εξηγείται και από την εγγενή ανάγκη ενός συστήµατος να επέλθει σε θερµοδυναµική ισορροπία. Η επίδραση στο ph του αρχικού διαλύµατος γίνεται εντονότερη αυξανόµενης της συγκέντρωσης της ζελατίνης. Επιπλέον, όσο µεγαλύτερη η συγκέντρωση της πρωτεΐνης τόσο δυσκολότερη καθίσταται η ρύθµιση του ph στην επιθυµητή τιµή, απαιτώντας προσθήκη µεγαλύτερων ποσοτήτων οξέος ή βάσης. Η προσθήκη διαλυµάτων οξέος ή βάσης επέφερε αλλαγές και στην τελική συγκέντρωση ζελατίνης, για αυτό και κατά την παρασκευή των δειγµάτων υπολογίζονταν υψηλότερες συγκεντρώσεις 5%-10% από την επιθυµητή τιµή ανάλογα µε τη συγκέντρωση και την επιθυµητή τελική τιµή στο ph. Για παράδειγµα, αν οι επιθυµητές τελικές τιµές συγκέντρωσης της ζελατίνης και ph ήταν 5.0% wt και 10.0% wt αντίστοιχα, η αρχική συγκέντρωση ζελατίνης έφτανε τα 5.5% wt.

5 Επιπλέον, παρατηρήθηκε έντονο το πρόβληµα της εξάτµισης κατά τη ρύθµιση του ph ειδικότερα στα δείγµατα µικρότερης συγκέντρωσης της ζελατίνης (0.1 και 0.5% wt), λόγω, πιθανώς, των λιγότερων αλληλεπιδράσεων που αναπτύσσονται µεταξύ ζελατίνης και νερού. Η συγκεκριµένη παρατήρηση προέκυψε µέσω ζύγισης της µάζας του διαλύµατος πριν και µετά τη ρύθµιση του ph στην εκάστοτε τιµή. Από οπτικές παρατηρήσεις των δειγµάτων προέκυψε ότι για όλες τις τιµές ph και ιονικής ισχύος, η κατάρρευση του gel έχει ήδη ξεκινήσει από τους 25 o C, ενώ στους 37 o C όλα τα δείγµατα είχαν µετατραπεί σε νευτωνικά ρευστά. Ειδικότερα στις εξαιρετικά όξινες συνθήκες (ph 2.0) παρατηρήθηκε αυξηµένη ευαισθησία και κατά συνέπεια, κατάρρευση του gel του υλικού ακόµα και στη θερµοκρασία δωµατίου. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει το δείγµα υψηλότερης συγκέντρωσης (25.0% wt ζελατίνη) το οποίο, ενώ παρέµεινε στερεό και αµετάβλητο στους 25 o C, στους 37 o C µετατράπηκε σε ρευστό εξαιρετικά υψηλού ιξώδους. Επιπροσθέτως, η προσθήκη άλατος στα υδατικά διαλύµατα ζελατίνης δε φάνηκε στις περισσότερες περιπτώσεις να βοηθά το σχηµατισµό σταθερότερου gel. Πιο συγκεκριµένα, σε τιµές ph 2.0 χωρίς την προσθήκη άλατος ο σχηµατισµός gel σε δείγµατα 5.0% wt ζελατίνη παρατηρήθηκε ότι απαιτεί τουλάχιστον 2 µέρες σε θερµοκρασία ~20 o C, ενώ µε την προσθήκη άλατος ο αντίστοιχος χρόνος περιορίστηκε σε λίγες µόνο ώρες. Αντίθετη επίδραση της ιονικής ισχύος παρατηρήθηκε σε δείγµατα µε συγκέντρωση ζελατίνης 0.5% wt και ph 8.0, όπου η προσθήκη άλατος φάνηκε να προκαλεί αποσταθεροποίηση του υλικού και αδυναµία στο σχηµατισµό gel. Το τελευταίο συµφωνεί µε τη βιβλιογραφία, όπου αναφέρεται πως η προσθήκη NaCl σε υδατικά διαλύµατα ζελατίνης εµποδίζει την ανάπτυξη δεσµών υδρογόνου και µειώνει την ικανότητα της πρωτεΐνης να σχηµατίσει σταθερή γέλη. Στο σηµείο αυτό παρατίθενται τα αποτελέσµατα µέτρησης µηχανικών ιδιοτήτων (G, G, tanδ) συναρτήσει της θερµοκρασίας, όπως ελήφθησαν από το ρεόµετρο. Στο Σχήµα 4 φαίνονται οι καµπύλες του µέτρου αποθήκευσης (G ) και απώλειας (G ) καθώς και ο λόγος αυτών των δύο µέτρων, ο οποίος εκφράζει το συντελεστή απόσβεσης (tanδ). Αν και η µέτρηση πραγµατοποιήθηκε σε εύρος θερµοκρασίας 5 o C 40 o C στο Σχήµα 4 παρατίθενται θερµοκρασίες µέχρι και ~32 o C οπότε και έχει καταρρεύσει πλήρως το υλικό. Σε υψηλότερες θερµοκρασίες, όπου το υλικό έχει πλέον µετατραπεί σε νευτωνικό ρευστό, χάνεται η στενή επαφή µεταξύ γεωµετρίας και δείγµατος µε αποτέλεσµα την ύπαρξη αυξηµένου θορύβου και τη λήψη τιµών µε υψηλό σφάλµα. Σύµφωνα µε το Σχήµα 4 οι συντελεστές G και G εµφανίζουν πλατό µέχρι τη θερµοκρασία των 22 o C που σηµαίνει ότι το υλικό µέχρι αυτή τη θερµοκρασία έχει την ικανότητα να διατηρεί πλήρως την ακαµψία του και τις ιδιότητες του gel. Μετά το πέρας των 22 o C παρατηρείται σταδιακή µείωση των δύο µέτρων όπως και η τάση τους να αποκτήσουν την ίδια τιµή. Η µείωση αντιστοιχεί στη σταδιακή κατάρρευση του υλικού και τη µετατροπή του σε νευτωνικό υγρό. Το σηµείο όπου το G εξισώνεται µε το G, ή, µε άλλα λόγια όπου το tanδ τείνει να πάρει την τιµή 1, χαρακτηρίζεται ως το σηµείο τήξης της ζελατίνης. Στη συγκεκριµένη περίπτωση το σηµείο τήξης προκύπτει ίσο µε 30.2 o C σε τιµές G =7.02 Pa, G =7.58 Pa και tanδ= G, G (Pa) tanδ 0,1 G' (Pa) G'' (Pa) tan(delta) 1 0, Temperature ( o C) Σχήµα 4: Μέτρηση των συντελεστών G, G και tanδ συναρτήσει της θερµοκρασίας για δείγµα 2.0% wt ζελατίνης και ph=7.86 (33 o C)

6 ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Η ζελατίνη, ή αλλιώς αποικοδοµηµένο κολλαγόνο, αποτελεί ένα ιδιαίτερα ευαίσθητο υλικό σε µεταβολές της θερµοκρασίας και του ph. Σε εξαιρετικά όξινες συνθήκες και πολύ υψηλές θερµοκρασίες παρατηρείται αυξηµένη αποικοδόµηση του υλικού µέσω της καταστροφής της δοµής τριπλής έλικας της πρωτεΐνης. Επιπλέον, ιδιαίτερη ευαισθησία εµφανίζει η ζελατίνη και στη µικροβιακή επιµόλυνση. Για αυτό και η προσθήκη NaN 3 κρίνεται απαραίτητη προκειµένου να επιµηκυνθεί ο χρόνος ζωής των δειγµάτων, ο οποίος χωρίς την ύπαρξη του βιοκτόνου κυµαίνεται µεταξύ ηµερών ακόµα και σε σχετικά χαµηλή θερµοκρασία ~ 4 o C, που αντιστοιχεί σε τυπική θερµοκρασία ψυγείου. Η µικροβιακή επιµόλυνση παρατηρείται ότι ευνοείται και από την ύπαρξη άλατος (NaCl) στα διαλύµατα ζελατίνης, ειδικότερα για συγκεντρώσεις NaCl 0.30Μ και 0.15Μ, καθώς τα βακτήρια αισθάνονται πως βρίσκονται στο φυσικό τους περιβάλλον. Η ικανότητα των διαλυµάτων ζελατίνης να σχηµατίσουν γέλη όπως και η θερµοκρασία όπου συµβαίνει αυξάνονται αυξανόµενης της συγκέντρωσης της ζελατίνης, ενώ παράλληλα µειώνεται ο χρόνος που απαιτείται. Όµως πιθανόν η σταθερή δοµή του συγκεκριµένου βιοϋλικού να αποσταθεροποιείται σε φυσιολογικές συνθήκες θερµοκρασίας, δηλαδή στους 37 o C ακόµα και σε πολύ υψηλές συγκεντρώσεις πρωτεΐνης, 25.0% wt, καθώς κατά τη διάρκεια των πειραµάτων δεν παρατηρήθηκε κάποιος συνδυασµός συνθηκών που να ευνοεί το σχηµατισµό σταθερού gel σε αυτή τη θερµοκρασία. Στο σηµείο αυτό αξίζει να σηµειωθεί ότι αν και η φυσιολογική θερµοκρασία του χόνδρου είναι 33 o C, τα διάφορα πειράµατα διεξάγονται στους 37 o C, καθώς αποτελεί την τυπική θερµοκρασία που αποκτά η άρθρωση κατά την κίνηση ή τη µηχανική καταπόνηση. Σηµειώνεται µάλιστα ότι 40 λεπτά περπάτηµα αρκούν ώστε να προκαλέσει άνοδο της θερµοκρασίας κατά 4 o C (33 o C 37 o C) [7]. Τέλος, επισηµαίνεται ότι η ζελατίνη αποτελεί ένα πλήρως βιοσυµβατό πολυµερές µε αποτέλεσµα την ευρεία χρήση του σε πληθώρα εφαρµογών από τη βιοµηχανία τροφίµων έως τη βιοϊατρική µηχανική. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ [1]. Djabourov, M., Nishinary, K. and Ross-Murphy, S.B., Physical Gels from Biological and Synthetic Polymers. Cambridge: Cambridge University Press. [2]. Gelatin Manufacturers Institute of America (GMIA), Gelatin Handbook. [3]. Djabourov, M. and Papon, P., Influence of thermal treatments on the structure and stability of gelatin gels. Polymer, 24(5), p [4]. Haug, I.J., Draget, K.I and Smidsrød, O., Physical and rheological properties of fish gelatin compared to mammalian gelatin. Food Hydrocolloids, 18, p [5]. Somwangthanaroj, A., Rheology and Polymer Characterization, [pdf]. Available at: < [Accessed 10 March 2015]. [6]. Osteoarthritis (OA), Arthritis Research UK. [online] Available at: < [Accessed 20 November 2014]. [7]. Abdel-Sayed, P., Vogel, A., Moghadam, M.N. and Pioletti, D.P., Cartilage self-heating contributes to chondrogenic expression. European Cells and Materials, 26, p